CN102105597B

CN102105597B - 利用核酸微阵列的分析方法

Info

Publication number: CN102105597B
Application number: CN200980128809.XA
Authority: CN
Inventors: 氏原大; 金原秀行; 稻泽让治; 井本逸势
Original assignee: Fujifilm Corp; Tokyo Medical and Dental University NUC
Current assignee: Fujifilm Corp; Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority date: 2008-05-27
Filing date: 2009-05-27
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2029-05-27
Also published as: US9034796B2; WO2009145346A2; JP2010004873A; EP2297337B1; US20110105357A1; EP2297337A2; WO2009145346A3; CN102105597A

Abstract

一种借助于核酸微阵列的分析法，所述核酸微阵列具有在其上固定第一探针核酸的样点(X 1)，所述方法包括：容许待测样品的标记的样品核酸(A 1)与第一探针核酸杂交；对样点(X 1)提供标记的鉴定核酸(B)，所述鉴定核酸(B)具有能够与第一探针核酸的至少一部分杂交的序列并用与标记的样品核酸(A 1)不同的标记物标记，并容许所述标记的鉴定核酸(B)在所有样点处与至少所述第一探针核酸杂交；测量标记的样品核酸(A 1)的标记量值(F 1)；和测量标记的鉴定核酸(B)的标记量值(Fc 1)。

Description

利用核酸微阵列的分析方法

技术领域

本发明涉及增加利用核酸微阵列的分析中的测量值可靠性的方法。

背景技术

作为利用染色体作为目标检测过量、缺失、扩增等基因组DNA异常拷贝数的方法，存在由Joe Gray，Dan Pinkel，O-P Kallioniemi等开发的基因组CGH法。通常，这存在多种问题，因为染色体异常不能被检测，除非该异常位于涵盖5-10Mb以上的大区域内，需要进行分析的技能等(J.Inazawa和M.Minaguchi，Rinsho Kensa(Clinical Inspection(临床检验))，49，497-502(2005))。

存在这样的阵列CGH法，其作为工具，可以检测发生在几十kb到若干Mb水平上的基因组结构异常，分辨率高于由染色体分析可以分析得到的分辨率(D.Pinkel等，Nat.Genet.(自然遗传学)，20，207-211(1998)，以及I.Imoto和J.Inazawa，Saibo Kogaku(Cell Engineering(细胞工程))，23，355-361(2004))。阵列CGH方法使用这样的阵列，其中将基因组DNA的片段，诸如BAC(细菌人工染色体)克隆，YAC(酵母人工染色体)克隆，PAC(P1-来源的人工染色体)或基于这些BAC，YAC，PAC等制备的DNAs或寡核苷酸排列在固体基板上，这通过将它们点样在该基板上完成。另外，存在通过从由患者等采集的作为待测样品使用的异常细胞和由健康人采集的作为标准样品使用的正常细胞提取靶DNA样品来检测相对基因拷贝数的方法，用各自不同的标记物(荧光物质等)对它们进行标记，容许它们同时与核酸微阵列上的探针相接触，由此容许它们通过杂交进行相互作用，利用扫描仪等读取由相互作用的靶核酸产生的荧光信号，和比较正常细胞和异常细胞来源的靶核酸的信号强度比。

当样品和标准品用各自不同的标记化合物来标记并容许其在进行利用核酸微阵列的分析中与核酸微阵列杂交时，由不同样点(点样量等)等或由杂交差异导致的、微阵列批次之间产生的数据差异几乎不存在。然而，由于标记不同，所以标记效率差异、关于个体标记的检测系统的差异等倾向于对结果施加影响，并且其伴随着总是需要为一种待测样品制备标准品的复杂性。为了排除标记差异，当使用这样的方法时该问题不存在，在所述方法中，标准品和待测样品用相同的标记化合物来标记并容许分别与两种或多种核酸阵列进行杂交，并在它们之间进行评估。然而，该方法产生一个问题，即其中曾经通过同时进行杂交解决的由于样点差异引起的数据波动在进行分别的标记中再次产生。作为用于解决这些问题的方法，存在这样的方法，其中通过在微阵列上新装配用于校正和内标使用的样点来校正阵列之间的差异，但是它不能校正分开的样点之间的差异(例如，JP-A-2004-028695)。

发明概述

本发明待解决的问题是提供能够在进行利用核酸微阵列的测量法中同时解决以下问题的方法，所述问题为：利用两种或多种标记物来标记待测样品和标准品的方法的问题，其中标记物之间的差异对数据施加影响，和其中当利用一种标记物来标记待测样品和标准品时个体样点之间的差异对数据施加影响的问题。

当利用一种标记物进行核酸微阵列测量时，作为提高数据准确性的测量之一，存在这样的策略，其中阵列之间的差异通过在阵列上合成寡核苷酸探针被降至尽可能低，如在基因芯片(GeneChip)的情形中，阵列之间的杂交差异通过以这样的方式设计序列被降至尽可能低，所述方式使所谓的探针Tm值变得等价，且标记步骤中的差异也通过安排校正样点来降低，但是该校正方法非常复杂且在一个样点具有两种或多种序列的核酸微阵列的情形中特别难以通过该策略进行比较(例如，JP-A-2004-028695)。

因此，通过本发明发现当容许在阵列上全部样点中和不同阵列之间的相似样点上具有基本相同结合能力的核酸，即具有能够与全部样点上探针核酸的至少一部分杂交的序列的鉴定核酸，与待测样品和标准品共存时，可以检测探针核酸样点之间的差异，且鉴定核酸的结合量通过分别进行杂交来检测。另外，能够利用结合量作为指标校正样点之间的差异，由此导致本发明的实现。

例如，通过容许由Cy 3标记的标准品和由Cy 5标记的鉴定核酸共存，在第一阵列板上进行杂交。在另一方面，在第二阵列板上，由Cy 3标记的待测样品和由Cy 5标记的鉴定核酸的混合物与该阵列上的探针核酸杂交。当通过比较标准品和待测样品发现差异时，可能通过利用鉴定核酸进行其校正来消除样点之间的差异。

在该情形中，理想的是由Cy 5标记的鉴定核酸是具有同一序列的核酸，且理想的是它们的制备是同一的。另外，作为用于校正样点之间差异的方法，可以是任何具有以下限制条件的计算法，所述限制条件为校正可以理论上利用任何计算法进行。优选地，标准品和待测样品通过利用获自鉴定核酸的荧光值计算标准品和待测样品的荧光值比来比较。

理想的是将标记的鉴定核酸和标准品和待测样品加入到同一溶液中并通过乙醇沉淀法等浓缩该溶液的体积，并且即使在其不能进行时，理想的是将核酸浓度浓缩到尽可能高。

即，本发明由以下部分组成。

(1)一种借助于核酸微阵列的分析法，所述核酸微阵列具有在其上固定第一探针核酸的样点(X 1)，所述方法包括：

容许待测样品的标记的样品核酸(A 1)与固定在所述样点(X 1)上的第一探针核酸杂交；

对所述样点(X 1)提供标记的鉴定核酸(B)，所述鉴定核酸(B)具有能够与第一探针核酸的至少一部分杂交的序列并用与标记的样品核酸(A 1)不同的标记物标记，并容许所述标记的鉴定核酸(B)在所有样点处与至少所述第一探针核酸杂交；

测量在样点(X 1)上杂交的标记的样品核酸(A 1)的标记量值(F 1)；和

测量在样点(X 1)上杂交的标记的鉴定核酸(B)的标记量值(Fc 1)。

(2)如上(1)中所述的分析法，

其中容许标记的样品核酸(A 1)进行杂交和容许标记的鉴定核酸(B)进行杂交是同时进行的，且

测量杂交的标记的样品核酸(A 1)的量和测量杂交的鉴定核酸(B)的量是同时进行的。

(3)如上(1)或(2)中所述的分析法，

其中固定在样点(X 1)上的第一探针核酸的量基于标记量值(Fc 1)检测，且标记量值(F 1)基于该检测的量来校正。

(4)如上(1)-(3)中任一项所述的分析法，还包括：

对样点(X n)提供与标记的样品核酸(A 1)相同或不同的标记的样品核酸(A n)，在所述样点(X n)上固定有具有固定在样点(X 1)上的第一探针核酸的基本相同序列的第n探针核酸，和容许所述标记的样品核酸(A n)与固定在样点(X n)上的第n探针核酸杂交，所述样点(X n)存在于样点(X 1)的同一个核酸微阵列或另一个核酸微阵列上；

对样点(X n)提供标记的鉴定核酸(B)，并容许所述标记的鉴定核酸(B)与至少第n探针核酸杂交；

测量在样点(X n)上杂交的标记的样品核酸(A n)的标记量值(F n)；和

测量在样点(X n)上杂交的标记的鉴定核酸(B)的标记量值(Fc n)。

(5)如上(4)中所述的分析法，还包括：

通过比较标记量值(Fc 1)和(Fc n)，计算样点(X 1)和样点(X n)处的标记量值的系数。

(6)如上(4)或(5)中所述的分析法，

其中标记的样品核酸(A 1)和标记的样品核酸(A n)通过标记获自不同样品的核酸来制备。

(7)如上(1)-(6)中任一项所述的分析法，

其中在与标记化合物混合前，另外将与标记的鉴定核酸(B)的同种相同的未标记的核酸加入至标记的鉴定核酸(B)的杂交中。

(8)如上(4)-(7)中任一项所述的分析法，

其中与样点(X n)上的标记的样品核酸(A n)的杂交量相对应的校正的标记量值通过利用下式(1)计算：

式(1)；标记的样品核酸(A n)的校正的标记量值＝标记量值(Fc 1)/标记量值(Fc n)x第n标记的样品核酸(A n)的标记量值(F n)(n是2以上的整数)。

(9)如上(1)-(8)中任一项所述的分析法，

其中标记的样品核酸(A 1)和标记的鉴定核酸(B)的至少一种标记通过荧光进行。

(10)如上(1)-(9)中任一项所述的分析法，

其中使用BAC-DNA微阵列作为核酸微阵列。

(11)如上(1)-(10)中任一项所述的分析法，

其中两个或多个同种样点(X n)存在于不同的核酸微阵列中，且各核酸微阵列之间的第n探针核酸的排列和第n探针核酸点样量在各核酸微阵列之间不同。

(12)如上(1)-(11)中任一项所述的分析法，

其中使用与样品的核酸不同并具有在第一和第n探针核酸上序列的核酸作为标记的鉴定核酸(B)。

(13)如上(1)-(12)中任一项所述的分析法，

其中使用含有重复序列的核酸作为标记的鉴定核酸(B)。

(14)如上(1)-(13)中任一项所述的分析法，

其中使用Cot-1 DNA作为标记的鉴定核酸(B)。

(15)如上(1)-(12)中任一项所述的分析法，

其中使用载体来源的核酸作为标记的鉴定核酸(B)。

(16)如上(1)-(15)中任一项所述的分析法，

其中标记量值(F 1)和(Fc 1)中的标记量值(Fc 1)由数字数据提供。

(17)引起计算机执行用于如上(5)-(16)中任一项所述的分析法的过程的程序，所述过程包括：

基于标记的鉴定核酸(B)的标记量值(Fc 1)和标记量值(Fc n)校正第n标记的样品核酸(A n)的标记量值(F n)(n是2以上的整数)。

(18)计算机可读介质，其存储有引起计算机执行用于如上(5)-(16)中任一项所述的分析法的过程的程序，所述过程包括：

(19)计算样品间基因表达量或样品间基因拷贝数的方法，其通过利用如上(1)-(16)中任一项所述的分析法进行。

(20)用于如上(1)-(16)中任一项所述的分析法的试剂盒，所述试剂盒包括：

核酸微阵列，其具有许多样点，在每个样点上固定有探针核酸；和

鉴定核酸，其具有能够与核酸微阵列上全部样点处探针核酸的至少各自一部分杂交的序列。

附图简述

图1是本发明原理的示意图。在该示意图中，为了简化仅显示其中样品来源的标记样品核酸的种类为两种的情形。另外，样点数通过将其简化为16样点/核酸微阵列来显示。A1-A4和a1-a4显示基本相同的探针核酸。在下文中，一组B1-B4和b1-b4，一组C1-C4和c1-c4以及一组D1-D4和d1-d4分别显示相同的探针核酸；

图2是当使用雌性DNA作为待测样品和雄性DNA作为标准品进行核酸微阵列，并且不使用标记的鉴定核酸时进行比较的结果；

图3是当使用雌性DNA作为待测样品和雄性DNA作为标准品进行核酸微阵列，并且使用标记的鉴定核酸校正标记量值时进行比较的结果；

图4显示其中使用雌性DNA作为待测样品和雄性DNA作为标准品，并使用标记的鉴定核酸进行校正的情形和其中通过不使用标记的鉴定核酸而不进行校正的情形之间的对数比差异；

图5显示其中使用雌性DNA作为待测样品和雄性DNA作为标准品，并使用标记的鉴定核酸进行校正的情形和其中通过不使用标记的鉴定核酸而不进行校正的情形之间差量；

图6是当未纯化的标记的样品核酸Cy 5-雌性和未纯化的标记的样品核酸Cy 5-雄性用作样品并且利用Cy 3-雌性作为标记的鉴定核酸校正时的结果；

图7A和7B是其中在荧光值中形成偏差的情形的实例。图7A是在Cy 3-雌性和Cy 5-Cot-1的核酸微阵列测试之后绘制的图像，和图7B是在Cy 3-雄性和Cy 5-Cot-1的核酸微阵列测试之后绘制的图像；

图8是这样的结果，其中以染色体顺序对利用图7A和7B中的样品雌性和标准品雄性的荧光值计算的对数比进行作图；

图9是这样的结果，其中对图8的结果进行校正；

图10是这样的结果，其中雌性作为待测样品和雄性作为标准品分别用作样品；

图11是利用比图10的情形更大量的Cot-1(8倍量)作为对其进行标记的物质获得的结果；

图12是这样的结果，其中在阵列1之间进行校正；

图13是这样的结果，其中在阵列2之间进行校正；

图14是这样的结果，其中阵列形式不同并不进行校正；

图15是这样的结果，其中阵列形式不同并进行校正；

图16是这样情形的结果，其中标记量值作为数字数据提供；和

图17是这样情形的结果，其中使用载体来源的核酸作为鉴定核酸。

实施方案说明

本发明涉及利用核酸微阵列分析核酸的方法，其特征在于

所述核酸微阵列具有样点(X 1)，在所述样点上(X 1)固定有包含与序列(a)互补的验证序列(a’)的第一探针核酸，且所述方法包括

容许待测样品的标记的样品核酸(A 1)与固定在样点(X 1)上的至少所述第一探针核酸杂交的步骤，

对所述样点(X 1)提供标记的鉴定核酸(B)，并由此容许其与标记的鉴定核酸(B)杂交的步骤，所述鉴定核酸(B)具有能够在全部样点处与第一探针核酸的至少一部分杂交并用与上述标记的样品核酸不同的标记物标记的序列，

测量在样点(X 1)上杂交的所述标记的样品核酸的标记量值(F 1)的步骤，和

测量在样点(X 1)上杂交的所述标记的鉴定核酸(B)的标记量值(Fc 1)的步骤。

上述分析法优选是利用核酸微阵列检验待测样品(A)中具有序列(a)的核酸的核酸分析法，其特征在于

所述核酸微阵列具有样点(X 1)，在所述样点(X 1)上固定有包含至少一个或多个与序列(a)互补的序列(a’)的第一探针核酸，且所述方法包括

容许通过标记(A)和鉴定核酸(B)制备的样品核酸(A 1)，在与用与(A)不同的标记物标记的核酸(B 1)共存的条件下，与固定在样点(X 1)上的所述第一探针核酸杂交的步骤，所述鉴定核酸(B)具有能够在全部样点处与所述第一探针核酸的至少一部分杂交的序列，

进一步容许通过用(A)的相同标记物标记标准品(C)制备的核酸(C 1)与(B 1)共存并与固定在具有与样点(X 1)相同序列的样点(X 1’)上的所述探针核酸杂交的步骤，

测量在样点(X 1)上杂交的所述标记的样品核酸的标记量值(Fa 1)的步骤，

测量在样点(X 1)上杂交的所述标记的鉴定核酸(B)的标记量值(Fb 1)的步骤，

测量在样点(X 1’)上杂交的包含所述序列(c)的核酸的标记量值(Fc 1)的步骤，和

测量在样点(X 1’)上杂交的所述标记的鉴定核酸(B)的标记量值(Fb 1’)的步骤。

当比较待测序列(a)的量和(X 1’)处的标记量值(Fc 1)以进行仅通过任选样点(X 1)上的标记量值(Fa 1)测量时，标记的鉴定核酸(B)的标记量值(Fb1，Fb 1’)用于校正的应用使得可能检测所述样点处的误差，诸如由在该样点上固定的探针核酸量引起的误差。

当使用标记的鉴定核酸(B)的该标记量值时，可以判断所述样点的异常，例如由其与指定值(Fc 1)的比较判断，样点间误差可以通过验证两个或更多样点之间标记的鉴定核酸(B)的标记量值来检测，且其也变为可能校正该误差。

本发明可以使用这样的核酸阵列，其中优选地，将具有两种或更多序列的探针核酸点样在一个位置上。

根据本发明，样品核酸(A)的量可以，进一步优选地通过以下步骤来确定：当杂交溶液含有核酸时，对一个阵列使用含有待测样品(A)和鉴定核酸(B)的溶液，所述鉴定核酸(B)具有能够在全部样点处与探针核酸的至少一部分杂交的序列，随后利用标准核酸(C)和标记的鉴定核酸(B)对另一个阵列进行阵列测试，利用由此检测的标记的鉴定核酸(B)的标记量值校正(A)的标记量值和(C)的标记量值，并比较(A)的标记量值和(C)的标记量值。就此而言，所述另一个阵列意指相同类型的阵列，即其上点样有相同类型探针的阵列。

在该情形中，作为进行比较和校正的目标的样点不特别受限，但是理想的是它们是相同类型的样点(通过点样相同探针制备的样点，即具有与固定的探针核酸的目标相同的序列(a’)的样点)。

通过本发明，由探针核酸量差异和杂交差异引起的标记量值的变化可以例如被校正。就此而言，当术语“标记量值”用于本发明中时，它包括获自由标记的核酸和探针核酸杂交产生的复合物，诸如双链核酸等的标记化合物的标记量。

关于通过应用含有标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)的杂交溶液容许标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)进行杂交来检测标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)的标记量的步骤，所述含有标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)的杂交溶液通过将各自的核酸标记到微阵列上的样点而制备，更用于说明地，理想的是该步骤包括以下步骤(a)-(e)。

(a)通过用标记化合物标记核酸获得标记的样品核酸(A)的步骤。

(b)通过用与步骤(a)不同的标记化合物标记鉴定核酸获得标记的鉴定核酸(B)的步骤，所述鉴定核酸包含能够在全部样点处与探针核酸的至少一部分杂交的序列，

(c)制备含有在步骤(a)中获得的标记的样品核酸(A)和在步骤(b)中获得的标记的鉴定核酸(B)的杂交溶液的步骤。

(d)将步骤(c)中获得的杂交溶液应用于核酸微阵列并由此容许杂交溶液中的标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)与探针核酸杂交的步骤。

(e)读取与探针核酸杂交的标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)的各自量并由此获得标记量值的步骤。

就此而言，在步骤(d)和步骤(e)之间，理想的是进一步包括用清洗液清洗杂交的阵列的步骤。

而且，在步骤(c)中添加标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)中，这些可以同时或单独添加。

另外，其还可以包括以下步骤。

(a”)获得标记的标准核酸(C)的步骤。

(c”)制备含有标记的标准核酸(C)和上述步骤(b)中获得的标记的鉴定核酸(B)的杂交溶液的步骤。

(d”)进行与相同类型但不同于上述步骤(d)的阵列杂交的步骤。

(e”)获得上述(d”)中杂交的标记的标准核酸(C)和标记的鉴定核酸(B)的各自标记量值，利用由此检测的标记的鉴定核酸(B)的标记量值校正((A)的标记量值和)(C)的标记量值，和通过比较(A)的标记量值和(C)的标记量值确定(A)的量的步骤。

杂交可以利用可商购的进行杂交的设备或可以仅进行温度控制的设备来进行。理想的是在30℃～50℃的范围内，更优选在35℃～45℃的范围内的温度下进行杂交。

另外，理想的是将杂交时间设置为16～100小时，更优选24～80小时，进一步优选40～72小时。

在杂交后，任选进行清洗等。关于清洗条件，清洗的影响随频率增加而变得很高，且可能使用具有调整过的离子强度的清洗液，诸如2 x SSC，2x SSC/50％甲酰胺，2 x SSC/0.1％ SDS，1 x SSC等，或通常用于进行Southern印迹，northern印迹等杂交实验的分散剂，表面活性剂等清洗液。关于温度，优选设置为15℃～70℃，更优选25℃～50℃，且需要将溶液体积调节到杂交条件的等价水平。

优选的是，校正通过在核酸微阵列之间或在杂交区域之间点样相同探针核酸制备的样点中的标记量值的方法，其包括以下步骤(1)或(1’)和(2)。

(1)通过进行以下步骤(a1)-(f1)获得核酸微阵列的步骤，在所述核酸微阵列中标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)与样点上的探针核酸杂交：

(a1)通过用标记化合物标记样品核酸获得标记的样品核酸(A)的步骤。

(b1)通过用与步骤(a)不同的标记化合物标记鉴定核酸获得标记的鉴定核酸(B)的步骤，所述鉴定核酸包含能够在全部样点处与探针核酸的至少一部分杂交的序列(所述鉴定核酸可以与样品核酸互补)，

(c1)制备含有在步骤(a1)中获得的标记的样品核酸(A)和在步骤(b1)中获得的标记的鉴定核酸(B)的杂交溶液的步骤。

(d1)通过将步骤(c1)中获得的杂交溶液应用于核酸微阵列上来进行杂交的步骤。

(e1)用清洗液清洗在步骤(d1)中获得的核酸微阵列的步骤。

(f1)由通过步骤(e1)获得的核酸微阵列读取与探针核酸杂交的标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)的各自量并由此获得标记量值的步骤。

(1’)通过进行以下步骤(a1’)-(g1’)获得核酸微阵列的步骤，其中标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)与核酸微阵列上的探针核酸杂交。

(a1’)通过用标记化合物标记核酸获得标记的样品核酸(A)的步骤。

(b1’)通过用与步骤(a)不同的标记化合物标记鉴定核酸获得标记的鉴定核酸(B)的步骤，所述鉴定核酸包含能够在全部样点处与探针核酸的至少一部分杂交的序列(所述鉴定核酸可以与所述核酸互补)，

(c1’)制备含有在步骤(b1’)中获得的标记的鉴定核酸(B)的杂交溶液的步骤。

(d1’)通过混合在步骤(a1’)中获得的标记的样品核酸(A)和在步骤(c1’)中获得的标记的鉴定核酸(B)来制备含有标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)的杂交溶液的步骤。

(e1’)通过将步骤(d1’)中获得的溶液应用于核酸微阵列上来进行杂交的步骤。

(f1’)用清洗液清洗通过步骤(e1’)获得的核酸微阵列的步骤。

(g1’)由通过步骤(f1’)获得的核酸微阵列读取与探针核酸杂交的标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)的各自量并由此获得标记量值的步骤。

(2)通过对由至少两份待测样品获得的各个核酸进行步骤(1)或(1’)来计算待测样品之间基因表达量或待测样品基因拷贝数，由此获得与所用待测样品种类数相对应的核酸微阵列，或与所用待测样品种类数相对应的杂交区域，并通过使用标记的鉴定核酸(B)的标记量值校正源自所用待测样品的标记的样品核酸(A)的标记量值中的至少一种的步骤。

在该情形中，理想的是至少一种待测样品是上述具有已知量的标准品(C)。由此，可以更精确地测量其他待测样品。

在本发明的标记量值校正法中，通过容许标记的样品核酸(A1)和标记的鉴定核酸(B)与第一样点同时杂交获得各自的标记量值，并且点样与上述样点相同的探针核酸，但是更用于说明地，通过容许与上述标记的样品核酸(A1)不同，但是以与上述标记的样品核酸(A1)比较标记量值为目的制备的标记的标准核酸(An；n是2以上的整数)，和标记的鉴定核酸(B)与和不同于上述样点的第n样点同时杂交获得各自标记量值，使用通过容许与第一样点和第n样点杂交获得的各个标记的鉴定核酸(B)的标记量值的比作为所述样点之间的系数，并且与第n样点杂交的标记的样品核酸(An)的校正的标记量值通过使在所述样点处测量的标记的样品核酸(A’)的标记量值乘以所述系数获得。

能够计算点样相同探针核酸的两个或更多样点中的标记的样品核酸(A)的标记量值和标记的鉴定核酸(B)的标记量值的至少之一的平均值或平均值偏差。

用于说明地，在固定有具有与同一核酸阵列或不同阵列上存在的样点(X1)相同的相同序列(a’)的探针核酸的n样点(Xn)的情形中，理想的是包括通过在以上(1)-(6)项中任一项所述的方法获得与n样点杂交的所述标记的鉴定核酸(B)的标记量值的步骤和计算通过对n个所述标记的鉴定核酸(B)的标记量值取平均值或对其平均值取偏差获得的数值的步骤。

更用于说明地，当由与源自第一待测样品的标记的样品核酸(A1)和标记的鉴定核酸(B)杂交的第一样点获得的标记的鉴定核酸(B)的标记量值被作为Fc 1，且源自第n待测样品和标记的鉴定核酸(B)的标记的样品核酸(An)的标记量值作为Fc n时，理想的是通过利用以下数值表达式(1)计算校正第n标记的样品核酸(An)后的校正的标记量值来进行校正。

式(1)；第n标记的样品核酸(An)的校正的标记量值＝Fc 1/Fc n x第n标记的样品核酸(An)的标记量值(n是2以上的整数)

本发明的原理利用图1描述。就此而言，由于该图用于描述本发明的原理并且因此非常简化，所以仅作为实例说明本发明的要旨，其不包括本发明的全部上述范围，因此本发明不受该图的局限。

在图1中，示意图是为了简化的目的，通过在利用核酸微阵列分析两种待测样品之间拷贝数的情形中对两个核酸微阵列进行成像制成的，其中在一个阵列上点样4种探针样品核酸(A-D或a-d)和相同的探针核酸1-4，总计16个样点。

将作为待测样品的细胞1-来源的标记的样品核酸(A)、标记的鉴定核酸(B)和杂交溶液的混合物包被在核酸微阵列1上并容许进行杂交。并且，将标准品-来源的标记的样品核酸(A)、标记的鉴定核酸(B)和杂交溶液的混合物包被在核酸微阵列2上并容许进行杂交。杂交和随后的清洗和干燥步骤后，读取核酸微阵列1和核酸微阵列2二者的标记量值。

关于核酸微阵列1上样点A1的标记的样品核酸(A)-来源的标记量值作为F 1，且关于相同样点A 1的标记的鉴定核酸(B)-来源的标记量值作为Fb 1。并且，关于核酸微阵列2上样点a1的标记的样品核酸(A)-来源的标记量值作为F 2，且关于相同样点a1的标记的鉴定核酸(B)-来源的标记量值作为Fb 2。校正核酸微阵列2上的标记的样品核酸(A)-来源的标记量值后的校正的标记量值F 2’可以，例如，通过下式来计算。在该情形中，可以从所述标记量值中减去或不减去本底标记量值。

F 2’＝Fb 1/Fb 2 x F 2

通过对全部样点如此进行来获得结果。即，核酸微阵列2的全部样点的校正通过校正基本相同的验证核酸与之结合的样点之间的组，诸如核酸微阵列1上的样点A2和核酸微阵列2上的样点a2的组，核酸微阵列1上的样点B1和核酸微阵列2上的样点b2的组，等来进行。接下来，核酸微阵列1和核酸微阵列2之间的比值通过下式来计算。

比值＝F 2’/F 1

当对所有样点组进行该计算时，获得拷贝数成为可能。

就此而言，在进行校正中，还理想的是通过以下步骤获得校正的标记的样品核酸(A)的标记量值：使用任选样点的标记的鉴定核酸(B)的标记量值与在两个或更多同种样点上测量的标记的鉴定核酸(B)的平均标记量值的比，作为所述样点上的系数，并用在所述样点处测量的标记的样品核酸(A)的标记量值除以所述系数。

根据本发明，待校正的样点可以针对任何样点进行校正，条件是它们是基本相同的验证核酸结合的样点。例如，可以举例在核酸微阵列之间位置对称的样点，即图1的样点A1和a1，样点B1和b1等之间的校正。并且，位置对称的样点的校正也可以在这样的条件下进行，即基本相同的探针核酸固定于其上。

另外，根据本发明，不同核酸微阵列之间的校正可以在这样的条件下进行，即探针核酸几乎相同。不同的核酸微阵列意指为不同目的生产的核酸微阵列或在具有不同排列、形状或密集度的样点中点样的核酸微阵列。

即，即使当两个或更多核酸微阵列中的探针核酸排列或探针核酸点样量在各核酸微阵列中不同时，评估可以通过本发明的方法对其进行校正来进行。

标记量值可以是进行数学处理后的数值。例如，校正可以在进行对由通过点样基本相同的探针核酸制备的样点获得的标记量值取平均值的步骤后进行。另外，理想的是使用荧光值作为标记量值。

作为标记量值，还可以使用由通过点样基本相同的探针核酸制备的样点计算的平均值。即，在校正前可以对标记量值进行取平均值处理。通过使用平均值，数据接近真实数据。另外，校正后的标记量值的平均值可以通过由点样基本相同的探针核酸制备的样点获得的标记量值来计算。取平均值也可以针对通过在校正后处理标记量值获得的数学值来计算。当以该方式处理时，例如，当基于通过校正核酸微阵列获得的比值计算通过点样基本相同的探针核酸制备的样点之间的平均值时，数据接近真实值，因此可以更准确地计算拷贝数，由此致使可能抑制所谓的假阳性的产生并致使可能急剧提高诊断和预防疾病的精确性。

另外，还可以使用通过除去基本相同种类的探针核酸组中的最大值和最小值获得的平均值，并且还可以使用其中从探针核酸组的平均标记量中除去某一阈值的样点标记量。

标记量值的校正可以与多种对照样点一起进行。例如，存在这样的方法，其中将在细胞之间具有相对恒定表达量的持家基因预先点样在核酸微阵列上，全部样品基于其杂交量来校正，并然后利用本发明的鉴定核酸进行各样点的校正。另外，通过在扩增或标记时预先添加内标核酸，各样点通过本发明鉴定核酸的校正可以在使用所述内标核酸校正扩增或标记后进行。

根据本发明，三个或更多核酸微阵列之间的校正也是可能的。例如，可以举例其中制备两种或更多种标准品和待测样品的情形。更用于说明地，通过以下步骤计算量：获得关于作为标准品的标记的样品核酸的标记量值和标记的鉴定核酸的标记量值的数据和关于两种或更多各待测样品的标记量值和鉴定核酸的标记量值的数据，利用本发明的方法校正各待测样品的标记量值和标准品的标记量值，和然后比较标准品和各待测样品的标记量值。通过执行这样的方法，当预先制备仅一种标准品辅助的核酸微阵列的结果时，可以执行许多种使用待测样品作为靶标的核酸微阵列，并且不需要准备在等价数量种类的待测样品中标记标准品的步骤，因此可以以此程度减少步骤数并且还可以缩短测试时期和诊断时期。此外，必需的试剂量也急剧减少，并且由此伴随着成本可以急剧降低。另外，可以通过使用两种或更多种标准品使结果更加清楚。

<核酸微阵列>

本文中使用的核酸微阵列是这样的核酸微阵列，其中探针核酸结合、固定在固体材料的表面上(所述表面用于本文中时也称为三维表面且纤维表面等也包括在其中，即在大形状的情形中，当其基本上是表面时，即使当其似乎内藏时，本文中将其称为表面)。对所述固体材料没有特别地限制，只要它是探针核酸可以结合的材料即可，如通常所用的载玻片等玻璃材料，以及塑性材料，碳化纤维，凝胶或溶胶，膜，金属等。对所述固体材料的形状，诸如平面状、突起物的尖端、颗粒状、毛细管的内部等也没有特别地限制。利用点样仪(spotter)生产的DNA微阵列和通过半导体技术生产的DNA芯片也包括在本发明的核酸微阵列中。

根据本发明，BAC-DNA阵列、寡核苷酸微阵列、c-DNA微阵列等可以用作核酸微阵列。另外，微阵列样点的排列可以改变，并且存在具有两个或更多阵列区并可以测量一个基盘上的两个或更多待测样品的多样品阵列，通过组合两个或更多阵列在一个基盘上复制大量样点的tiling阵列，等。

存在不同形状的微阵列，且可以举例其中反应效率通过形成三维结构提高的那些，其中核酸以颗粒状形状结合的那些，其中核酸结合在磁带等上的那些，以及其中核酸结合在CD等圆盘形状中的那些。

对BAC-DNA阵列没有特别的限制，且可以是任何阵列，条件是它在将哺乳动物等的插入物引入至BAC中的状态下基于DNA制成的，包括对其应用自身的那些和其中利用PCR等扩增技术扩增的那些。

<探针核酸>

探针核酸是包含预先已知其内含物的序列的核酸，且在微阵列的情形中，一般两种或更多探针核酸以样点的形式固定。

作为探针核酸，可以化学合成的核酸、cDNA、BAC(细菌人工染色体)、YAC(酵母人工染色体)等，和其中利用遗传工程技术扩增这些物质的那些。而且，通过化学修饰DNA、RNA等天然类型的核酸制备的核酸可以用作探针核酸。例如，可以使用PNA(肽核酸)，BNA(桥连核酸)，甲基膦酸酯型DNA，硫代磷酸酯型DNA，亚磷酰胺(phosphoramidite)型DNA，硼基磷酸酯(boranophosphate)型DNA等。另外，还可以使用嵌合型核酸。例如，可以使用在核酸中混合DNA结构部分和RNA结构部分的那些和其中混合天然型核酸和修饰型核酸的那些等。

关于将探针核酸结合到固体基板上的方法，可以使用下列方法：其中使用结合了以GeneChip为代表的光解吸基团的amidite单体并使用掩蔽剂来逐一化学合成核苷酸的方法，其中通过用喷墨法将amidite单体点样到固体基板上来化学合成需要的序列的方法，其中通过改变电极上溶液的pH并利用pH的改变释放保护基从而在基板上合成核酸的方法，其中将预先化学合成的核酸纯化并将其点样到基板上的方法，其中使用点样仪将cDNA进行点样的方法等。关于点样方法，可以使用喷墨法、针阵列法等。

理想的是探针核酸的尺寸为10b～10kb，优选50b～5kb，更优选100b～2kb。

样点

一般地，核酸微阵列具有两个或更多区域(样点)，其中大量并高密度地固定具有基本相同序列的探针核酸，并且本发明中可以使用的探针核酸的基本同种和等量的样点数可以是一个或更多，其与样点数无关。其可以响应于分析目的而任意选择。

探针核酸的固定量优选0.8～5μg/样点，更优选1.0～2.0μg/样点。

样点形状不受限，但是优选使用圆形。

样点的直径不受限，但是优选10μm～1000μm。

<待测样品>

根据本发明的待测样品是认为待用核酸微阵列分析的核酸(样品核酸)、含有核酸的细胞等，其意指全部被认为待用核酸微阵列分析且不受特别限制的那些。

例如，其是分析对象，即包括用于测量核酸表达量和存在量、基因组中拷贝数等的核酸，用于评估诊断等的细胞，但其还包括器官、个体等，因此其不局限于细胞本身。

作为可以被认作为待测样品的其他物质，用于利用其中预先已知或未知合成核酸等的存在量的物质来测试阵列和测量仪器等能力的那些也可以被认作为待测样品，且当将随后描述的鉴定核酸认作为测量对象时，也可能将其认作为待测样品。

作为待测样品，可以举例可以由具有某种疾病的患者或动物获得的核酸，可以由其获得核酸的细胞，等，并且包括所有包括细胞的那些。在狭义上，其意指核酸。例如，作为疾病，认为具有可能具有某些核酸信息的所有疾病，诸如癌症、遗传性疾病、炎症等归于此情形，而无其他特殊限制。

另外，还可以使用被施用LCM(激光捕获显微解剖)处理的待测癌症样品。

标准品意指所有这样的情形，其包括预先具有某种程度用于与待测样品比较的信息的上述核酸，可以由其获得核酸和其详细信息的细胞。即使在与一般存在量不同时，仍可能将其视为标准品，条件是信息可以通过与待测样品比较获得。例如，假设在具有CNV或某种嵌合体的患者中形成癌症，且当获自癌症细胞的核酸与获自除癌症细胞外的正常细胞的细胞比较时，认为所述CNV和某种嵌合体彼此抵消，因此不妨碍使用其作为标准品。

另外，即使在由具有完全不同来源的细胞等制备核酸的情形中，可能将其视为标准品，条件是它可以用作比较对象。

根据本发明，可以使用由待测样品中作为样品核酸提取的样品核酸和标准品二者，但是如前所述，理想的是使由待测样品提取的样品核酸和标准品与分别的阵列杂交。

根据本发明，理想的是使用癌症细胞-来源的核酸或源自正常细胞(不引起癌症的细胞)的核酸作为样品核酸。

核酸的纯化

根据本发明，理想的是在由待测样品或标准品制备核酸中进行纯化。在进行标记中，产生多种副反应并且细胞溶解产物中的蛋白、脂质、糖类等对标记反应施加影响并对本底噪声施加严重影响，因此当不进行纯化时，核酸微阵列的测量能力极大地降低。

作为纯化步骤，可以使用利用携带二氧化硅、纤维素衍生物等核酸吸附膜的柱体的方法、乙醇沉淀或异丙醇沉淀、苯酚-氯仿提取等。也有效使用的是通过固相提取柱体的方法，所述固相提取柱体利用离子交换树脂，连接有十八基基团等疏水性取代基的二氧化硅载体，具有大小排阻作用的树脂等，和通过层析法等的方法。其中，理想的是通过QuickGene系列(mfd.来自富士胶片公司(Fuji Photo Film))的纯化，其中柱体中保持有通过皂化三乙酸纤维素制备的核酸吸附多孔膜。这是因为通过使用QuickGene系列，可以利用低价机器半自动地制备核酸。另外，这与二氧化硅系统核酸吸附多孔膜相比非常薄，并适合于以小量进行核酸提取，因此在与其他方法比较中，可以获得具有明显高浓度的核酸。而且，这是适合于获得处于小量并具有高浓度标记的核酸的方法，因为在与可以以小液体体积进行纯化的乙醇沉淀法和异丙醇沉淀法的比较中，可以获得具有更高纯度的核酸。另外，因为当使用苯酚-氯仿提取法或其他多种沉淀法时对后继步骤具有不良影响，所以当由待测样品制备核酸时，也可以进行两个或更多纯化步骤，以提高纯度。

当由待测样品的纯化通过柱方法进行时，其中将含有二氧化硅作为主要成分的核酸吸附膜固定于柱体并且其回收的液体体积通常很大，并且获得的核酸的浓度变得非常稀。为了解决该问题，可能通过乙醇沉淀等除去所有的溶液或利用超滤柱等对其进行浓缩。

根据本发明，更理想的是不对由待测样品提取的核酸链长进行断裂，这来自于步骤简单且处理时期短的视角，但是对由待测样品提取的核酸链长进行断裂，即其缩短，可以通过进行酶处理、超声波处理、机械断裂处理、化学处理等来进行。另外，在进行这些处理后可以进行纯化步骤或省略纯化步骤。

另外，当进行纯化步骤时，根据本发明，核酸的纯度通过使用限制酶等核酸酶对其进行断裂和纯化由此获得的核酸而提高，而且，具有更高纯度和更高浓度的核酸可以通过在纯化时引入浓缩步骤，例如通过使用比核酸溶液体积小的回收液体体积来对其进行提取来获得，由此使其适合使用，因为获得靶核酸的效率变得良好。

作为用于酶处理的酶，理想的是使用限制酶或核酸酶。还可能使用两种或更多种限制酶。

根据本发明的机械断裂处理意指进行容器朝向某一方向的相对运动(然而，包括8字形等运动)。当在进行该处理中加入球诸如玻璃、不锈钢、氧化锆等时，处理进一步进展并进一步消化核酸，因此这些可以是适合使用的。另外，可以进行通过超声波处理的切断。

扣除法

本发明的方法还可以通过扣除法(subtraction method)增加核酸微阵列测量的准确性。所述扣除法是当目的基因的拷贝数或表达数中存在差异时，通过进行扣除的技巧减去基因中存在的差异而有效分离基因的方法。例如，可以使用PCR选择法、RDA(代表性差别分析)法，DsDD(双链体特异性直接消化(Duplex-specific Direct Digestion))法等。

具体地，在癌细胞的情形中，大量正常细胞与癌细胞一起包含在癌组织中，结果，核酸微阵列的性能在癌细胞的情形中显著降低，但是所述性能降低可以通过扣除法防止到某种程度。

<标记>

标记是容许可检测的物质结合核酸的行为，并且只要它是可检测的，任何物质可以被结合到本发明中。例如，可以包括荧光物质、无机化合物、酶、放射性同位素、色素等，且标记通过荧光进行是理想的。还可能对一份待测样品标记两种或更多物质。

荧光物质

作为荧光物质，尽管没有对其应用特别限定，可以使用异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy-染料、ALEXA、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、吖啶、DAPI、溴化乙锭、SYBRGreen、德克萨斯红、稀少金属荧光标记试剂、TAMRA、ROX等物质，条件是它们是可商购的或可以制备的，且优选，荧光标记可以通过cy-3或cy-5进行。

作为无机化合物，尽管没有对其待用原材料特别限定，可以提及例如由半导体无机材料制成的量子点。作为其实例，可以提及二氧化硅，CdTe，ZnSe或CdSe的纳米颗粒。该颗粒可以通过改变其颗粒直径而改变其产生的荧光波长，且其在直径2nm时变为蓝色，在直径3nm时变为绿色，在直径4nm时变为黄色和在直径5nm时变为红色。因此，可以检测其荧光，或可以直接检测其颗粒的存在。例如，作为用于直接检测颗粒存在的手段，可以使用AFM(原子力显微镜)或电子显微镜。

此外，还可以使用地高辛(digoxigenin)(DIG)、生物素等质。作为使用生物素的实例，其可以用于检测紫色显影，这可以在容许抗生物素蛋白结合于连接探针的生物素，将生物素连接的碱性磷酸酶与其连接并接着将氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸加入其中作为碱性磷酸酶的底物时观察到。

此外，可以对其进行非酶标记。例如，可以使用ULS阵列CGH标记试剂盒(ULS arrayCGH Labeling Kit)(由Kreatech Biotechnology BV制造)等。

直接标记法和间接标记法

作为标记方法，在本发明中可以使用直接标记法或间接标记法。所述直接标记法是这样的方法，其中当例如使用Cy-染料时，将核酸转化为单链并容许短链核酸与其杂交，并且将与Cy-染料结合的核苷酸衍生物与核苷酸一起与之混合，以上步骤均预先进行，然后在一个步骤中合成标记的核酸。尽管存在问题，因为当酶吸收非天然型核苷酸衍生物时的吸收效率比吸收天然型核苷酸的效率低，但是所述步骤是方便的且可以合适地用于本发明中。间接标记法是这样的方法，其中当例如使用Cy-染料时，将核酸转化为单链，并容许短链核酸与其杂交，并且将具有可结合Cy-染料的取代基的核苷酸衍生物如具有氨基烯丙基的核苷酸衍生物与天然型核苷酸一起与之混合，以上步骤均预先进行，并且首先通过合成具有这种取代基的核酸获得标记的核酸，并然后容许Cy-染料通过氨基烯丙基与之连接。尽管该方法的过程很复杂，但是氨基烯丙基结合的核苷酸衍生物的三维结构在结构上比在直接标记法中使用的Cy-染料结合的核苷酸衍生物更接近天然型核苷酸，且其吸收标记化合物的效率很高，因此这也可以合适地用于本发明中。

根据本发明，可以将随机引物法(引物延伸法)、切口平移法、PCR(聚合酶链式反应)法、末端标记法等用作将标记化合物引入核酸的方法。随机引物法可以特别适合地用于本发明中。

随机引物法是这样的方法，其中容许从几bp(碱基对)至十几bp的随机引物核酸与核酸杂交并且通过同时利用聚合酶进行扩增和标记来合成标记的核酸。切口平移法是这样的方法，其中通过容许DNA聚合酶在双链核酸被例如，DNA酶I切口时起作用来降解DNA，并同时通过DNA聚合酶活性合成标记的核酸。PCR法是这样的方法，其中通过制备两种引物和通过同时利用该引物经过PCR反应进行扩增和标记来获得标记的核酸。末端标记法在标记5’末端的情形中是这样的方法，其中将标记化合物引入至被碱性磷酸酶脱磷酸化的核酸的5’末端，这通过T4多核苷酸激酶的磷酸化反应来进行。用于标记3’末端的方法是这样的方法，其中通过末端转移酶将标记化合物加入至核酸的3’末端中。

染料交换法

染料交换法也可以用于本发明中。例如，在如本文中所述的染料交换法中，容许用Cy3标记源自标准细胞的核酸并用Cy5标记鉴定核酸的样品在第一核酸微阵列上杂交，并且容许用Cy3标记源自样品细胞的核酸并用Cy5标记鉴定核酸的样品在第二核酸微阵列上杂交。由获自第一和第二核酸微阵列的荧光值计算比例。接下来，容许用Cy5标记源自标准细胞的核酸并用Cy3标记鉴定核酸的样品在第三核酸微阵列上杂交，并且容许用Cy5标记源自样品细胞的核酸并用Cy3标记鉴定核酸的样品在第四核酸微阵列上杂交。由获自第三和第四核酸微阵列的荧光值计算比例。这是这样的方法，其中通过该方法校正由于标记化合物引起的酶引入效率差异。

酶活性的钝化

根据本发明，作为标记的样品核酸和标记的鉴定核酸，也可能使用包含它们的未纯化溶液。当使用这样的未纯化溶液时，酶等剩余在这些溶液中，因此理想的是在其制备后，钝化溶液中剩余的酶的活性。这是因为，例如，在标记源自具有Cy3的待测样品的标记的样品核酸和具有Cy5的标记的鉴定核酸的情形中，存在混合包含它们的未纯化溶液步骤，且当混合时该溶液中存在剩余的酶时，存在这样的可能性，即通过剩余的酶，标记的样品核酸进一步被Cy5标记，且标记的鉴定核酸进一步被Cy3标记，由此引起其对数据再现性施加影响的可能性。

根据本发明，任何可以钝化酶的方法可以用作酶钝化法，但是理想的是进行添加螯合剂和在60℃以上热处理的方法之一或二者。加热温度优选为60℃以上，更优选63℃以上。加热时期可以是1分钟以上，但最理想地，理想的是在65℃以上进行加热处理5分钟以上。

另外，在使用Klenow片段的标记法的情形中，可能利用涡流搅拌器等钝化酶的活性。

标记的核酸

标记的核酸意指结合标记化合物的核酸，且其可以是纯化的或未纯化的。

包含标记的核酸的纯化溶液

包含标记的核酸的纯化溶液意指通过对包含标记的核酸的溶液应用纯化步骤获得的核酸溶液。在该情形中，纯化步骤是在进行标记处理后去除未反应的标记化合物、酶等的步骤，但是由于其还包括去除对杂交无贡献的核酸和对随后的杂交施加影响的生物物质和化学物质的手段，因此在该步骤之前或之后的任何去除某些物质的情形被认为是纯化步骤。

包含标记的核酸的未纯化溶液

包含标记的核酸的未纯化溶液意指通过在对由待测样品提取的核酸溶液进行标记步骤后不进行纯化步骤获得的核酸溶液。在该情形中，纯化步骤是在进行标记处理后去除未反应的标记化合物、酶等的步骤，但是用于制备核酸溶液的纯化步骤不包括在其中。由于不进行纯化，所以该溶液为与通过标记步骤添加的多种未反应的化合物，诸如引物、酶、核苷酸、缓冲液中包含的离子等共存的核酸溶液。另外，在进行加热后，以钝化共存的酶为目的，对包含标记的核酸的未纯化溶液进行添加螯合剂等的处理的核酸溶液也在本发明中称为包含标记的核酸的未纯化溶液。

<鉴定核酸>

鉴定核酸是这样的核酸，其在全部目标样点上，具有能够杂交探针核酸的至少一部分的序列，可以检测目标样点中杂交能力异常，举例说明地，由固定在所述样点上的探针核酸的量引起的异常，并进一步用于校正异常样点之间的探针核酸点样量。因此，鉴定核酸可以是任何这样的核酸，其可以与固定于核酸微阵列上的全部样点的探针核酸杂交，且可以具有任何序列或链长。在该情形中，所有样点代表具有与同一溶液中的待测样品反应和标准品反应的可能性的所有样点且通常是单核酸微阵列上的所有样点。

另外，其可以是任何核酸，条件是它可以进行杂交，且可以使用DNA、RNA等野生型核酸或通过化学修饰DNA、RNA等野生型核酸制备的核酸。例如，可以使用PNA(肽核酸)、BNA(桥连核酸)、甲基膦酸酯型DNA、硫代磷酸酯型DNA、亚磷酰胺型DNA、硼基磷酸酯型DNA等。另外，还可以使用嵌合型核酸。例如，可以使用在核酸中混合DNA结构部分和RNA结构部分的那些和其中混合天然型核酸和修饰型核酸的那些。

作为标记的鉴定核酸(B)，可以使用例如，被认为在制造阵列时在所有样点中存在的核酸序列，诸如重复序列、载体、大肠杆菌(Escherichiacoli)基因组等，且理想的是使用与待测样品不同且在第一和第n探针核酸上具有序列的核酸。

作为载体，可以提及质粒、BAC、YAC、PAC、粘粒、病毒等病毒载体，且可以使用在制造阵列中使用的任何载体或具有与该载体相同序列的核酸。

重复序列可以作为鉴定核酸是理想的序列提及。重复序列也称为重复性序列(repetitive sequence)，其是每一定数量碱基对重复出现的限制酶识别区等序列，其实例包括重复一定模式的短核苷酸序列许多次的序列，诸如多聚d(AT)，多聚d(GC)等，和其中达到数千碱基对/单元的长序列重复许多次的序列，且已知这在人等较高等生命的基因组中高频出现。根据本发明，例如，可以合适地使用获自Invitrogen的Cot-1 DNA。

例如，在使用哺乳动物BAC-DNA的核酸微阵列的情形中理想的是使用Cot-1 DNA。Cot-1 DNA是这样的核酸，其通常用于在核酸微阵列测量时封闭获自哺乳动物的待测样品中的重复序列，并且在使用哺乳动物BAC探针的核酸微阵列的情形中，通常证明，重复序列包含在充分多BAC探针中。

例如，在使用在探针中具有重复序列的BAC-DNA的核酸微阵列的情形中，通过添加Cot-1 DNA经由非特异性杂交封闭靶核酸和探针核酸上存在的重复序列，防止靶核酸侧上存在的重复序列与探针核酸侧上存在的探针核酸的非特异性杂交，因此可以选择性检测源自特异性杂交的荧光值。根据本发明，发现通过标记至少其一部分来利用Cot-1 DNA(优选，与同种标记的鉴定核酸相同(即具有相同的序列)的未标记核酸，例如未标记的Cot-1 DNA一起)，可能增加特异性杂交的检测灵敏性和减小样点间的差异。

另外，具有与探针核酸中普遍存在的核酸序列结构部分基本互补的核酸序列的合成寡核苷酸可以用作鉴定核酸。

根据本发明，理想的是使用基于核酸的摩尔比为1以上的量的鉴定核酸。这是因为核酸微阵列的容量通过使用q以上的摩尔比而提高。

鉴定核酸的尺寸优选为20bp以上，更优选20bp～1Mbp，进一步优选100bp～500kb。

理想地，鉴定核酸的使用量设定为基于待测样品或标准品核酸的0.5～2倍摩尔。

标记的鉴定核酸(B)

标记的鉴定核酸(B)意指这样的鉴定核酸，其中标记化合物与鉴定核酸相连，且在纯化或未纯化时称为本发明中的标记的鉴定核酸。

作为标记的鉴定核酸，可以使用源自待测样品的核酸，源自正常细胞的核酸或包含重复序列的核酸，且使用Cot-1 DNA是理想的。

理想地，使用1摩尔以上的量的标记的鉴定核酸，更理想地以基于样品核酸(A)的3摩尔以上，最理想8摩尔以上的量对其进行使用。

包含标记的鉴定核酸的纯化溶液

包含标记的鉴定核酸的纯化溶液意指通过对包含标记的鉴定核酸(B)的溶液应用纯化步骤获得的包含标记的鉴定核酸的溶液。在该情形中，纯化步骤是在进行标记处理后去除未反应的标记化合物、酶等的步骤。

包含标记的鉴定核酸的未纯化溶液

包含标记的鉴定核酸的未纯化溶液意指通过不对包含标记的鉴定核酸(B)的溶液应用纯化步骤获得的包含标记的鉴定核酸的溶液。由于不进行纯化，所以该溶液为其中通过标记步骤添加的多种未反应的化合物，诸如引物、酶、核苷酸、缓冲液中包含的离子等共存的包含标记的鉴定核酸的溶液。另外，在进行加热后，以钝化剩余的酶为目的，对包含标记的鉴定核酸的未纯化溶液进行添加螯合剂等的处理的核酸溶液也在本发明中称为包含标记的鉴定核酸的未纯化溶液。

<封闭剂>

本文中所述的封闭剂用于减小杂交时的非特异性杂交的检测，且可以在制备杂交溶液时与标记的样品核酸(A)、标记的鉴定核酸(B)等一起加入。例如，其意指tRNA(转运RNA)、变性的鲑精DNA、多聚腺苷酸、多聚dA、脱脂乳等物质，所述物质主要具有降低核酸微阵列的本底噪声的功能，并且还可以使用通常市场上出售的封闭剂。

<杂交溶液组成>

本发明可以使用如下物质作为杂交溶液组成，例如，在使用BAC-DNA的核酸微阵列的情形中，具有增加核酸浓度作用和即使当通过增加的粘性而分割时保持一定程度面积的功能的硫酸葡聚糖，具有降低核酸的解链温度作用的甲酰胺和可以增加离子强度并具有保持pH恒定水平功能的溶液可以作为实例提及。

根据本发明，理想的是使用包含以下试剂的溶液。

聚乙二醇(PEG，JP-A-2000-325099)、硫酸葡聚糖等可以用作具有排除体积效应(excluded volume effect)的物质。

甲酰胺、甘油、甲醛、DMSO、DMF、GuSCN、碘等可以用作降低解链温度的化合物。

除SSC外，SSPE可以一般作为调节离子强度的溶液提及。除了这些以外，可以使用MES杂交缓冲液等。

<杂交溶液>

如本发明中所述的杂交溶液是其中混合上述试剂和封闭剂和其他试剂，标记的样品核酸和标记的鉴定核酸的溶液，是具有最优化标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)与核酸微阵列上的探针核酸的杂交的性质的溶液，是促进探针核酸与标记的样品核酸和标记的鉴定核酸之间具有高度序列一致性的杂交并且在另一方面具有抑制具有低序列一致性的杂交的作用的溶液。

除这些以外，如JP-A-2005-087109中所述，还可以将磷脂，Denhardt溶液(包含聚糖体、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白作为主要成分的溶液)，季铵盐，甜菜碱(Biochemistry(生物化学)，32，137-144(1993))，TMAC(四甲基氯化铵)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，82，1585-1588(1985))，市售的杂交溶液如ExpressHyb(Clontech)，PerfectHyb(TOYOBO)，ULTRAhyb(Amicon等)等用在本发明中作为杂交溶液组成之一。

还可以将表面活性剂加入至杂交溶液中。作为表面活性剂，还可以使用阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂。作为阴离子表面活性剂，理想地使用十二烷基硫酸钠。十二烷基硫酸钠可以有效抑制本底。除此之外，使用N-月桂基肌氨酸、十二烷基硫酸锂等。作为非离子表面活性剂，已知吐温(注册商标)、Triton X(注册商标)等，这些表面活性剂可以用在本发明中。

含有标记的样品核酸(A)和标记的鉴定核酸(B)的杂交溶液

如本发明中所述的含有标记的样品核酸和标记的鉴定核酸的杂交溶液意指这样的杂交溶液，其中加入至少一种标记的样品核酸和至少一种标记的鉴定核酸。

含有标记的样品核酸(A)、标记的鉴定核酸(B)和封闭剂的杂交溶液

如本发明中所述的含有标记的样品核酸、标记的鉴定核酸和封闭剂的杂交溶液意指这样的杂交溶液，其中加入至少一种标记的样品核酸、至少一种标记的鉴定核酸和至少一种封闭剂。

制备含有多种核酸的杂交溶液

制备不含有标记的样品核酸但含有其他核酸的杂交溶液可以由用户进行，但其可以由阵列的提供者等来制备并提供。当在该杂交溶液中包含标记的鉴定核酸(B)时，理想的是统一标记的鉴定核酸的浓度和类型、产物的批号等，从而使用户可以容易地进行具有高准确性的核酸微阵列测试。

即，理想的是还浓缩或纯化在上述步骤(a)中制备的标记的样品核酸(A)和在步骤(b)中制备的标记的鉴定核酸中的至少一种，并且理想的是还浓缩或纯化在步骤(c)中制备的杂交溶液。

浓缩

当预先对不含标记的样品核酸但含其他核酸的杂交溶液进行浓缩时，运行具有高准确性的核酸微阵列成为可能。即，认为可以进行具有更高准确性的测试，因为达到使核酸彼此杂交的频率变得很高。

纯化

如本发明中所述的术语“纯化”与提取、分离和分馏同义使用。

另外作为用于纯化的手段，可以包括使用携带二氧化硅、纤维素衍生物等核酸吸附膜的柱体、乙醇沉淀或异丙醇沉淀、酚-氯仿萃取的方法，和通过使用离子交换树脂、结合了十八烷基等疏水性取代基的二氧化硅载体或具有尺寸排阻作用的树脂的固相提取柱体、和通过层析的方法。

<用于读出杂交的方法>

用于读出核酸阵列上的杂交的方法可以是可以测量标记物的任何方法且不受限制。

另外，在放射性同位素的情形中可以使用X-射线胶片或BASS(富士胶片公司(Fuji Photo Film))。

使用荧光扫描仪的方法是最适合用于本发明的方法。这在使用荧光物质作为标记的核酸的标记化合物时合适地使用。作为荧光扫描仪，可以提及，例如FLA系列(由Fuji Photo Film生产)，GenePix系列(Axon仪器)，LS Reloaded(Tecan)等，然而不特别受限，条件是只要可以读取微阵列的设备。

另外，当核酸可以在不标记的条件下测量并可以进行校正等计算时，不能认为标记是必需条件。例如，可以考虑由SPR系统进行的测量。

<自动化>

关于本发明的方法，所有步骤可以通过手动进行，一些步骤可以利用自动化机器进行或全部步骤可以利用自动化机器进行。通过进行自动化，工人可以从繁重的工作中释放出来，劳动成本降低，并且可以通过减小由于熟练性差异引起的结果间差异而防止人为误差。

<数据的提供>

根据本发明，可能使用预先测量特定标准品的技术，并通过提供所述技术评估待测样品。结果，在无需总制备标准品的条件下单独进行待测样品杂交成为可能，因此有效进行测试成为可能。另外，还可能通过将它们作为标准品来使用关于待测样品的数据。

<程序>

当处理通过运行核酸微阵列测量获得的数据时，为了有效进行处理，可能进行利用程序的数据处理。

所述程序一般是以记录在计算机可读记录介质上的形式提供的。所述记录介质并不进行特别限制，条件是其可被计算机读取。本发明的记录介质包括便携型的和固定型的介质，例如，可以提及光盘(CD)，软盘(FD)、数字视频光盘(DVD)，硬盘，半导体存储器等等。

该发明的程序可以通过在上述记录介质上记录来进行流通并且也可以预先在计算机的记录装置上记录并通过网络传递给其它计算机的形式来进行流通。

用于本发明分析法的试剂盒包含具有许多其上分别固定了探针核酸的样点的核酸微阵列，和具有能够与核酸微阵列上全部样品处的探针核酸的至少各自一部分杂交的序列的鉴定核酸。所述鉴定核酸可以预先进行标记，或者可以由用户在使用时进行标记。此外，还优选提供鉴定核酸，作为控制离子强度或包含表面活性剂等的杂交溶液的组分。

实施例

以下将基于实施例进一步详细说明本发明。但本发明并不限于此。

就此而言，除非另外指出，术语％表示质量％。[比较实施例1]在利用未纯化标记的核酸作为样品并不使用鉴定核酸的情形中的核酸微阵列测试和分析。

<制备未纯化的标记的核酸>

将3μl(0.75μg)女性DNA G 1521(Promega生产)，8μl水(蒸馏水，无DNA酶和RNA酶，GIBCO生产)和BioPrime(R)阵列法CGH基因组标记系统的20μl的2.5x随机引物溶液(Invitrogen生产)放入1.7ml容量的微量管(铂管，BM Equipments生产)，并在封闭温箱BI-535A(BLOCKINCUBATOR BI-535A)(ASTEC生产)上于95℃进行加热处理5分钟。五分钟后，将微量管从封闭温箱中取出，在冰上进行10分钟快速冷却处理。通过向其中加入5μl份的BioPrime(R)阵列法CGH基因组标记系统的10x dCTP核苷酸混合物(由Invitrogen生产)，3μl的散装250nmolCy3-dCTP(GE Healthcare Bioscience(GE健康护理生物科学)生产)和1μl的BioPrime(R)阵列法CGH基因组标记系统(由Invitrogen生产)的Exo-Klenow片段，在封闭温箱BI-535A上于37℃进行扩增反应和标记反应2小时。2小时后，将微量管从温箱中取出，并通过在设置到65℃的封闭温箱BI-535A上进行加热处理来将包含在反应溶液中的Exo-Klenow片段灭活。

通过也对男性DNA进行上述操作，获得2种类型的未纯化的核酸。就此而言，也将Cy3-dCTP(GE Healthcare Bioscience(GE健康护理生物科学)生产)作为标记化合物用于男性DNA。

<制备含有Cot-1DNA的溶液(溶液A)>

将65μl份的Cot-1DNA(65μg，由Invitrogen生产)放入1.7ml容量微量管中，并向其中加入6.5μl的3M乙酸钠(pH 5.2)和167μl冷却至-20℃的乙醇，并混合，随后容许该混合物在-80℃静置10分钟。之后，使用TOMY SEIKO生产的离心机MX-300于4℃以15,000rpm进行离心30分钟。离心后，由于沉淀物堆积在离心管底部，弃去上清液同时小心不要吸出沉淀物。接下来，通过让离心管静置10分钟，同时打开其盖，除去残余的乙醇。十分钟后，向其中加入18μl 20％ SDS并让其静置30分钟。30分钟后，向其中加入20μl溶液(其通过混合和溶解1g硫酸葡聚糖(SIGMA(西格玛)生产)、5ml甲酰胺和1ml 20 x SSC和然后通过添加水将液体体积调节至7ml来制备)并通过搅拌充分混合。

就此而言，理想地，该步骤不由用户进行，而由试剂盒生产者预先制备。

<制备杂交溶液>

将20μl份的在<制备未纯化的标记的核酸>中制备的女性未纯化的标记的核酸、20μl为了符合实施例1的条件而添加的水和38μl溶液A放入1.7ml容量的微量管中并进行充分的搅拌(涡旋)处理。另外，以相同的方式，将在<制备未纯化的标记的核酸>中制备的20μl男性未纯化的标记的核酸、20μl为了符合实施例1的条件而添加的水和38μl溶液A放入1.7ml容量的微量管中并进行充分的搅拌(涡旋)处理。

<关于核酸阵列>

在大量培养市售BAC克隆后，BAC DNA可以通过利用离子交换柱(质粒微型试剂盒100(Plasmid Midi Kit 100)，产品目录号12145，QIAGEN生产)对其进行提取和纯化来获得。

其后，用四碱基识别酶RsaI，DpnI和HaeIII消化BAC DNA，然后通过加入衔接子进行连接。

接下来，通过利用具有衔接子的一个寡核苷酸的相同序列的引物的PCR方法对其进行扩增，获得长度为约1,000～3,000bp的探针DNA。

利用GENESHOT(NGK INSULATORS生产，Nagoya)，将由此获得的探针DNA点样在玻璃基板上

由此，获得具有总共1,600个样点的核酸微阵列，其中在玻璃基板上分别对由BAC克隆制备800个探针DNA种类的每一个点样两个样点，并且将其用于以下测试中。

<预处理核酸微阵列>

将约200ml的封闭溶液(由Matsunami Glass生产)置于玻璃容器中，将上述核酸微阵列浸没在其中，并利用SLIDE WASHER，SW-4(由JUJIFIELD生产)在上下移动载玻片的同时进行20分钟的封闭反应。在反应20分钟后，从封闭溶液中取出核酸微阵列并将其置于充以200ml水的容器中。使用SLIDE WASHER将其洗涤3分钟，并在3分钟后，再次将其置于充以200ml新鲜水的容器中，并使用SLIDE WASHER洗涤。3分钟后，将其置于充以200ml乙醇的容器中，并再次使用SLIDE WASHER来对其进行洗涤。3分钟后，取出核酸微阵列，并通过使用台式离心机微型离心干燥器(Spin Dryer mini)2350(由TOMY SEIKO生产)对其进行离心来干燥所述核酸微阵列。

在封闭后，将所述核酸微阵列浸入沸水中2分钟，随后将其浸入-20℃的70％乙醇2分钟，-20℃的85％乙醇2分钟，和-20℃的100％乙醇2分钟，接着，通过以离心干燥器离心1分钟来干燥核酸微阵列。

<杂交>

杂交可以基于“A Guidebook for Practical Use of Array CGH Diagnosis-Chromosomal Fine Structure Aberrancy to be Known Beforehand(关于实践应用阵列法CGH诊断的指南——预先已知的染色体微细结构异常)(以日文编写)”(Iyaku(Medicine and Drug)Journal(Iyaku(医学和药物)杂志))中所述的流程来进行。具体地，将在<制备杂交溶液>中制备的两种样品溶液在75℃分别进行16分钟的加热处理。随后在42℃进行预培养30分钟以上。将所述溶液中的每一种逐滴加入至各核酸微阵列板的每个板上，并以不形成气泡的方式将间隙盖玻片(24 x 50mm)(Matsunami Glass生产)置于其上。

将这两个核酸微阵列置于1号密封盒(Tight Box No.1)(CHOPLA生产)中，并将该密封盒置于恒温箱(HYBRIDIZATION INCUBATOR，HB-80，TAITEC生产)中以在37℃进行杂交16小时。在该情形中，为了防止核酸微阵列的干燥，将纸巾(kimtowel)置于密封盒中并将4ml 50％甲酰胺/2 xSSC溶液加入其上。

<洗涤核酸微阵列>

在进行杂交后，将各核酸微阵列置于充以45ml 2 x SSC溶液的SUMILON管中并浸没在其中直至盖玻片自然脱离核酸微阵列。接下来，将盖玻片脱离的各核酸微阵列置于充以45ml的50％甲酰胺/2 x SSC(pH7.0)溶液的50ml容量SUMILON管(Sumitomo Bakelite生产)，所述溶液已经预先加热至50℃。将其置于杂交温箱(HYBRIDIZATIONINCUBATOR)中，从而在50℃，通过以30转/分钟的速率摇动台架(stage)进行洗涤15分钟。接下来，将各核酸微阵列置于充以2 x SSC/0.1％ SDS(pH 7.0)溶液的SUMILON管中，所述溶液已经预先加热至50℃。将其置于恒温温箱中，从而在50℃，通过以30转/分钟的速率摇动台架进行洗涤30分钟。接下来，将各核酸微阵列置于充以45ml的2 x SSC溶液的50ml容量SUMILON管中并在室温下，通过以30转/分钟的速率摇动台架进行洗涤5分钟。洗涤后，各核酸微阵列通过利用微型离心干燥器2350进行离心1分钟来干燥。

<数据获取>

将由此洗涤的两个微阵列使用GenePix 4000B(由Axon Instruments生产)进行扫描。

<数据处理>

通过将未纯化的标记的核酸Cy3-女性-来源的荧光值视为FF，将其本底噪声视为BF，将未纯化的标记的核酸Cy3-男性-来源的荧光值视为FM，将其本底噪声视为BM，利用对数比＝Log₂{(FF-BF)/(FM-BM)}计算对数比(Log Ratio)。在该情形中，对所有样点计算对数比值。

就此而言，虽然在该比较实施例中减去本底噪声值，但是存在不必须减去的情形。

另外，从与X染色体相对应部分的对数比值中减去与常染色体相对应部分的对数比值的结果也可以计算为对数比的差。

由于女性具有2个X染色体且男性具有1个X染色体，对数比的差值理论上为1.0。

<结果>

对数比的图表显示在图2中。

[发明实施例1]在使用未纯化的标记的核酸作为样品和未纯化的标记的Cot-1 DNA作为鉴定核酸的情形中的核酸微阵列测试和分析

<制备未纯化的标记的核酸>

各未纯化的标记的样品核酸通过比较实施例1的<制备未纯化的标记的核酸>的相同方法，由女性-来源的核酸和男性-来源的核酸制备。

<制备未纯化的标记的鉴定核酸>

将0.75μg Cot-1 DNA，8μl的水，20μl的2.5x随机引物溶液置于1.7ml容量的微量管(铂管，由BM Equipment生产)中，并在95℃，在封闭温箱BI-535A中进行加热处理5分钟。5分钟后，取出微量管，并在冰上进行10分钟快速冷却处理。向其中加入5μl份的10 x dCTP核苷酸混合物，3μl的散装250nmol Cy5-dCTP(GE Healthcare Bioscience(GE健康护理生物科学)生产)和1μl的Exo-Klenow片段，在封闭温箱BI-535A上于37℃进行扩增反应和标记反应2小时。2小时后，将微量管从温箱中取出，并通过在设置到65℃的封闭温箱BI-535A上进行加热处理来将包含在反应溶液中的Exo-Klenow片段灭活。

<制备溶液A>

制备溶液A通过比较实施例1的相同方法进行。

<制备杂交溶液>

将20μl份的在<制备未纯化的标记的核酸>中制备的未纯化的标记的样品核酸Cy3-女性、20μl在<纯化未纯化的标记的鉴定核酸>中制备的未纯化的标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1 DNA和38μl溶液A放入1.7ml容量的微量管中并进行充分的搅拌(涡旋)处理。另外，以相同的方式，将20μl份的在<制备未纯化的标记的核酸>中制备的未纯化的标记的样品核酸Cy3-男性、20μl在<纯化未纯化的标记的鉴定核酸>中制备的未纯化的标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1 DNA和38μl溶液A放入1.7ml容量的微量管中并进行充分的搅拌(涡旋)处理。

<预处理核酸微阵列>

这通过比较实施例1的<预处理核酸微阵列>的相同方法进行。

<杂交>

杂交通过比较实施例1的<杂交>的相同方法进行。在该情形中，未纯化的标记的样品核酸Cy3-女性和未纯化的标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1DNA的混合物以及未纯化的标记的样品核酸Cy3-男性和未纯化的标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1 DNA的混合物分别用作样品。

<洗涤核酸微阵列>

洗涤核酸微阵列通过比较实施例1的<洗涤核酸微阵列>的相同方法进行。

<数据获取>

<数据处理>

通过将未纯化的标记的样品核酸Cy3-女性-来源的荧光值视为FF，将其本底噪声视为BF，将与未纯化的标记的样品核酸Cy3-女性同时杂交的未纯化的标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1 DNA的荧光值视为Fc1，将其本底噪声视为Bc1，将未纯化的标记的样品核酸Cy3-男性-来源的荧光值视为FM，将其本底噪声视为BM，将与未纯化的标记的样品核酸Cy3-男性同时杂交的未纯化的标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1 DNA的荧光值视为Fc2，将其本底噪声视为Bc2，通过下列公式计算校正后男性-来源的未纯化的标记的样品核酸的荧光值FM’

FM’＝(Fc1-Bc1)/(Fc2-Bc2)x(FM-BM)。对所有样点进行计算。在该情形中，校正后的女性-来源的未纯化的标记的样品核酸的荧光值FF’可以通过下式计算。

FF’＝(Fc2-Bc2)/(Fc1-Bc1)x(FF-BF)

就此而言，虽然在本发明实施例中减去本底噪声值，但是存在不必须减去的情形。

另外，对数比值可以通过下式计算

对数比(Log Ratio)＝Log₂{(FF-BF)/FM’}。该计算针对全部样点进行。

就此而言，当计算FF’时，对数比值可以利用

对数比＝Log₂{FF’/(FM-BM)}来计算。

对数比差通过以比较实施例1中相同的方式计算获得。

<结果>

对数比的绘图显示在图3中。

当比较实施例1的图2与发明实施例1的图3比较时，常染色体的标绘在通过未纯化的标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1 DNA进行校正的情形中一般在零点附近。

其对对数比差进行绘图的附图显示在图4中。就此而言，对数比差通过比较实施例1的相同方法获得。即，对数比差由X染色体结构部分对数比平均值和常染色体结构部分对数比平均值之间的差异计算。较大的该差值意味着作为核酸微阵列测量的优越性。当不进行校正时，其为0.38，且在进行校正时为0.55，因此通过校正将对数比差增大约0.17。首先，X染色体数在比较男性和女性时不同，因此必然存在与常染色体的不同。当该差异更清楚时，可以以更高的灵敏性理解拷贝数变化，并可以进行更正确的评判。即，对数比差显示鉴定核酸的应用效力的事实。

图5显示仅对与女性-来源的和男性-来源的常染色体结构部分相对应的部分的常染色体结构部分计算的差量平均值。在进行校正的情形中，差量为0.189，其与未校正的差量0.313相比是非常小的数值且接近真实值，因此显示出鉴定核酸的应用效力。

[发明实施例2]在使用未纯化的标记的核酸作为样品和未纯化的标记的鉴定核酸作为鉴定核酸的情形中的核酸微阵列测试和分析

<制备未纯化的标记的核酸>

各未纯化的标记的样品核酸通过比较实施例1的相同方法，由女性-来源的核酸和男性-来源的核酸制备。

<制备未纯化的标记的鉴定核酸>

在该发明实施例中，将女性-来源的未纯化的标记的核酸用作未纯化的标记的鉴定核酸。在该情形中，将Cy3用作标记化合物。

<制备溶液A>

制备溶液A通过比较实施例1的相同方法进行。

<制备杂交溶液>

将20μl份的在<制备未纯化的标记的核酸>中制备的未纯化的标记的样品核酸Cy5-女性、20μl在<纯化未纯化的标记的鉴定核酸>中制备的未纯化的标记的鉴定核酸Cy3-女性DNA和38μl溶液A放入1.7ml容量的微量管中并进行充分的搅拌(涡旋)处理。另外，以相同的方式，将20μl在<制备未纯化的标记的核酸>中制备的未纯化的标记的样品核酸Cy5-男性、20μl在<纯化未纯化的标记的鉴定核酸>中制备的未纯化的标记的鉴定核酸Cy3-女性DNA和38μl溶液A放入1.7ml容量的微量管中并进行充分的搅拌(涡旋)处理。

<预处理核酸微阵列>

这通过比较实施例1的<预处理核酸微阵列>的相同方法进行。

<杂交>

杂交通过比较实施例1的<杂交>的相同方法进行。在该情形中，未纯化的标记的样品核酸Cy5-女性和未纯化的标记的鉴定核酸Cy3-女性的混合物以及未纯化的标记的样品核酸Cy5-男性和未纯化的标记的鉴定核酸Cy3-女性的混合物分别用作样品。

<洗涤核酸微阵列>

这通过比较实施例1的<洗涤核酸微阵列>的相同方法进行。

<数据获取>

<数据处理>

通过将未纯化的标记的样品核酸Cy5-女性-来源的荧光值视为FF，将其本底噪声视为BF，将与未纯化的标记的样品核酸Cy5-女性同时杂交的未纯化的标记的鉴定核酸Cy3-女性DNA的荧光值视为Fc1，将其本底噪声视为Bc1，将未纯化的标记的样品核酸Cy5-男性-来源的荧光值视为FM，将其本底噪声视为BM，将与未纯化的标记的样品核酸Cy5-男性同时杂交的未纯化的标记的鉴定核酸Cy3-女性DNA的荧光值视为Fc2，将其本底噪声视为Bc2，通过下列公式计算校正后男性-来源的未纯化的标记的样品核酸的荧光值FM’

FM’＝(Fc1-Bc1)/(Fc2-Bc2)x(FM-BM)。对所有样点进行计算。

另外，对数比值可以通过下式计算

对数比＝Log₂{(FF-BF)/FM’}。该计算针对全部样点进行。

对数比差通过以比较实施例1中相同的方式计算获得。

<结果>

对数比的绘图显示在图6中。

当与图3中不使用鉴定核酸的情形比较时，常染色体和X染色体之间的区别非常清楚且对数比值也处于一定范围内，由此也显示出该发明实施例中鉴定核酸的应用效力。

[发明实施例3]当对数比明显变化时的校正实施例

<制备未纯化的标记的核酸>

<制备未纯化的标记的鉴定核酸>

利用Cot-1 DNA作为鉴定核酸制备未纯化的标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1 DNA。

<制备溶液A>

制备溶液A通过比较实施例1的相同方法进行。

<制备杂交溶液>

制备含有未纯化的标记的样品核酸和未纯化的标记的鉴定核酸的杂交溶液。即，制备含有未纯化的标记的样品核酸Cy3-女性和未纯化的标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1 DNA的杂交溶液，和含有未纯化的标记的样品核酸Cy3-男性和未纯化的标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1 DNA的杂交溶液。

<预处理核酸微阵列>

这通过比较实施例1的<预处理核酸微阵列>的相同方法进行。

在该情形中，将由BAC克隆制备的、以NGK INSULATORS点样的由800个基因，2样点/基因组成的1,600样点的微阵列用作核酸微阵列。

<杂交>

<洗涤核酸微阵列>

这通过比较实施例1的<洗涤核酸微阵列>的相同方法进行。

<数据获取>

将由此洗涤的两个核酸微阵列使用GenePix 4000B(由AxonInstruments生产)进行扫描。

<数据处理>

这通过发明实施例1的<数据处理>中的相同方法进行。

<结果>

由该发明实施例获得的扫描图像显示在图8中。右侧附图的右侧中垂直行的图像密度变得稀疏。

在不利用鉴定核酸进行校正的情形中的对数比绘图显示在图8中。

在利用鉴定核酸进行荧光值校正的情形中的对数比绘图显示在图9中。

当比较图8和图9时，在图8的情形中，认为源自图7B图像右侧垂直行的读数标记量的稀疏性是其原因，且该区域内的样点对数比值显示与真实值明显不同的数值。然而，与该数据相反，当评估图9的结果时，其中计算公式中包括通过鉴定核酸校正的数值，明显成功地减少数据波动。

因此，本发明的方法特别在数据明显变化时发挥其功效。

[发明实施例4]当杂交溶液中含有标记的鉴定核酸的结果

<制备未纯化的标记的核酸>

各未纯化的标记的样品核酸通过比较实施例1的相同方法，由女性-来源的核酸和男性-来源的核酸制备。就此而言，Cy3用于两种情形中。

<制备未纯化的标记的鉴定核酸>

通过发明实施例1的相同方法，利用Cy5作为标记化合物和Cot-1DNA作为鉴定核酸制备未纯化的标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1 DNA。

<制备含有标记的鉴定核酸的溶液(溶液B)>

将20μl份的在<制备未纯化的标记的鉴定核酸>中制备的Cy5-Cot-1DNA和65μl(65μg)Cot-1 DNA放入1.7ml容量的微量管中，并向其中加入8.5μl的3M乙酸钠(pH 5.2)和218μl冷却至-20℃的乙醇，并混合，随后容许该混合物在-80℃静置10分钟。之后，使用TOMY SEIKO生产的离心机MX-300于4℃以15,000rpm进行离心30分钟。离心后，由于沉淀物堆积在离心管底部，弃去上清液同时小心不要吸出沉淀物。接下来，通过让离心管静置10分钟，同时打开其盖，除去残余的乙醇。十分钟后，向其中加入18μl 20％ SDS并让其静置30分钟。30分钟后，向其中加入20μl溶液(其通过混合和溶解1g硫酸葡聚糖(SIGMA(西格玛)生产)、5ml甲酰胺和1ml 20 x SSC和然后通过添加水将液体体积调节至7ml制备)并充分混合该溶液以获得溶液B。

理想地，该步骤不用用户进行，而由试剂盒生产者预先制备。

<制备杂交溶液>

将20μl份的在<制备未纯化的标记的核酸>中制备的未纯化的标记的样品核酸Cy3-女性和58μl溶液B放入1.7ml容量的微量管中并进行充分的搅拌(涡旋)处理。另外，以相同的方式，将20μl在<制备未纯化的标记的核酸>中制备的未纯化的标记的样品核酸Cy3-男性和58μl溶液B放入1.7ml容量的微量管中并进行充分的搅拌(涡旋)处理。

<预处理核酸微阵列>

这通过比较实施例1的<预处理核酸微阵列>的相同方法进行。

<杂交>

<洗涤核酸微阵列>

这通过比较实施例1的<洗涤核酸微阵列>的相同方法进行。

<数据获取>

<数据处理>

这通过发明实施例1的<数据处理>中的相同方法进行。

<结果>

本发明实施例的对数比绘图显示在图10中。

对数比差变为0.644，其与图5(发明实施例1)的校正结果的数值0.547相比提高约0.1，这显示进一步提高的作为核酸微阵列的能力。认为其原因为进行纯化的影响，因为在本发明实施例的情形中，在混合未纯化的标记的鉴定核酸和杂交溶液后进行了乙醇沉淀，即纯化，而在发明实施例1的情形中将未纯化的标记的鉴定核酸直接加入至杂交溶液中并搅拌，且通过进行乙醇沉淀，杂交溶液的液体体积与本发明实施例1的情形相比减小20μl，即增加杂交溶液中核酸浓度的作用。另外，差量也变为0.134，其小于图6中的校正结果0.189，因此其作为核酸微阵列的能力进一步提高。认为这也是关于相同原因的理由。

[发明实施例5]利用标记的鉴定核酸的量依赖性

<制备未纯化的标记的核酸>

<制备未纯化的标记的鉴定核酸>

通过发明实施例1的相同方法，利用Cy5作为标记化合物和Cot-1DNA作为鉴定核酸制备未纯化的标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1 DNA。在该情形中，将3μg Cot-1 DNA用作Cot-1 DNA。

<制备含有标记的鉴定核酸的溶液>

这通过发明实施例3的<制备含有标记的鉴定核酸的溶液>中的相同方法进行。

<制备杂交溶液>

这通过发明实施例3的<制备杂交溶液>中的相同方法进行。

<预处理核酸微阵列>

这通过比较实施例1的<预处理核酸微阵列>的相同方法进行。

<杂交>

这通过发明实施例1的<杂交>中的相同方法进行。

<洗涤核酸微阵列>

这通过比较实施例1的<洗涤核酸微阵列>的相同方法进行。

<数据获取>

<数据处理>

这通过发明实施例1的<数据处理>中的相同方法进行。

<结果>

在利用鉴定核酸进行荧光值校正的情形中的对数比的绘图显示在图11中。与图10比较，常染色体进一步会聚在0。对数比差变为0.641，其在与这样的情形的结果(发明实施例4)数值0.644相比，几乎相同，在所述情形中使用利用0.75μg Cot-1 DNA作为初始材料制备的未纯化的标记的鉴定核酸。

[发明实施例6]不同阵列形式之间的校正

根据本发明，即使当阵列之间生产日、生产方法、生产批次、绘图模式、固定的探针核酸量等不同时，它们的校正可以在使用相同类型的探针核酸时进行。作为其实例，在阵列上具有不同绘图模式，即阵列形式的情形的发明实施例显示如下。

<阵列1>阵列1是这样的阵列，在其上对16个基因的每一个点样4个样点，总共64个样点。这是与比较实施例1等中使用的阵列相同的阵列。

<阵列2>阵列2是多重测试样品阵列，在其上对550个基因的每一个点样3个样点，并具有两个杂交区。就此而言，阵列2的杂交利用杂交仪来进行。

在该发明实施例中，利用鉴定核酸在这两种阵列中普遍的10种探针核酸之间进行比较。10种探针是20p11.22，20p12.3，20p11.21，21q22.3，22q12.2，Xp11.23，Xp12，Xq13.3，Xq24和Xq26.2。

利用女性DNA和男性DNA作为样品并利用Cot-1 DNA作为鉴定核酸，通过其它发明实施例的相同方法进行样品的标记、杂交和数据获取。就此而言，尽管阵列2是多重测试样品阵列，但是使用来自仅一个杂交区的数据。另外，尽管将相同探针的4个样点点样在阵列1上，但是它们中的3个用于比较。数据的评估通过利用3点的平均值举例说明对数比来进行。

图12是这样的情形的结果，在所述情形中，杂交针对阵列1的两个板进行，即第一阵列上的具有Cy5-Cot-1 DNA的Cy3-女性DNA，和第二阵列上的具有Cy5-Cot-1 DNA的Cy3-男性DNA，且它们的校正通过本发明的方法进行。如附图中所示，常染色体结构部分和X染色体结构部分彼此充分分开。

图13是这样的情形的结果，在所述情形中，杂交针对阵列2的两个板进行，即第一阵列上的具有Cy5-Cot-1 DNA的Cy3-女性DNA，和第二阵列上的具有Cy5-Cot-1 DNA的Cy3-男性DNA，且它们的校正通过本发明的方法进行。如附图中所示，常染色体结构部分和X染色体结构部分也在该情形中彼此充分分开。

图14是这样的情形的结果，在所述情形中，杂交针对利用阵列1和阵列2的两个板进行，即第一阵列上的具有Cy5-Cot-1 DNA的Cy3-男性DNA，和第二阵列上的具有Cy5-Cot-1 DNA的Cy3-女性DNA，且不进行它们的校正。如附图中所示，常染色体结构部分和X染色体结构部分不彼此分开。

图15是这样的情形的结果，在所述情形中，杂交针对利用阵列1和阵列2的两个板进行，即第一阵列上的具有Cy5-Cot-1 DNA的Cy3-男性DNA，和第二阵列上的具有Cy5-Cot-1 DNA的Cy3-女性DNA，且它们的校正通过本发明的方法进行。如附图中所示，常染色体结构部分和X染色体结构部分彼此充分分开。当与图14比较时，显示通过本发明使用鉴定核酸是明显有效的方法，因为即使在阵列形式不同时，也可以充分进行校正。另外，由于杂交在不同条件下进行，即通过盖玻片对阵列1进行手动静态杂交和通过杂交仪对阵列2进行搅拌型杂交，这些结果显示即使当杂交条件不同时，它们的校正可以通过使用本发明的方法充分进行。

[发明实施例7]采用提供数字数据形式的核酸微阵列

<制备未纯化的标记的核酸>，<制备未纯化的标记的鉴定核酸>，<制备含有Cot-1 DNA溶液>，<制备杂交溶液>，<预处理核酸微阵列>，<杂交>和<洗涤核酸微阵列>通过[本发明实施例1]的相同方法进行。在该情形中，Cy3-女性DNA，即假设正常细胞-来源的核酸，和标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1 DNA用作提供数字数据的数据的样品，这些核酸在核酸微阵列上杂交，并由其获得的数据用作数字数据提供应用的数据。在计算该数据那天之后的另一天，Cy3-男性DNA，即假设异常细胞-来源的核酸，和标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1 DNA(使用与上述标记的鉴定核酸Cy5-Cot-1DNA完全相同的样品)在核酸微阵列(其具有与上述核酸微阵列相同的探针和相同的探针排列)上杂交，并且利用该数据和上述数据，根据[本发明实施例1]的<数据处理>进行由这两种标记的鉴定核酸对Cy3-男性DNA标记量值的校正。

<结果>

该结果显示在图16中。常染色体结构部分的数据会聚在0点，且还充分发现X染色体结构部分的分离。

[发明实施例8]其中使用载体-来源的核酸作为鉴定核酸的情形中的核酸微阵列测试和分析

<制备未纯化的标记的核酸>

各未纯化的标记的样品核酸通过比较实施例1的相同方法，由女性-来源的核酸和男性-来源的核酸制备。在该情形中，女性和男性二者均用Cy3来标记。

<制备未纯化的标记的鉴定核酸>

在该发明实施例中，使用载体-来源的核酸作为鉴定核酸。

<制备鉴定核酸>

由RPCI-11中选择一个克隆并在LB培养基中，使用BE-43FL(TAITEC生产)37℃培养过夜，所述LB培养基已经增补了氯霉素至100mg/ml的浓度。使用由Qiagen制造的QIAamp微量制备试剂盒(QIAamp Miniprep kit)从其提取BAC。使用由Nippon Gene生产的限制酶NotI消化由此提取的BAC，并将其进行琼脂糖电泳。切去约7kb的片段，并将其使用MN制造的Nucleospin柱从琼脂糖中纯化。使用由Invitrogen生产的T4 DNA连接酶，在4℃将其连接一夜。由此，获得了pBAC108L。

将pBAC108L加入由Invitrogen生产的DH-10B化学感受态细胞中，容许在冰上静置30分钟后，将其在42℃加热30秒，接着再次在冰上静置2分钟。将其与600μL的SOC培养基混合，并且用分散片(spreader)将其分散在包含100mg/mL的氯霉素的LB培养基中。将其在37℃静置两夜，挑取如此生长的克隆，并接种到含100mg/ml氯霉素的LB培养基中。将其在37℃培养一夜后，使用QIAprep生产的QIAprep旋转小量制备试剂盒(QIAprep spin Miniprep kit)提取BAC DNA，从而获得BAC载体。通过利用Cy5对其进行标记，获得载体-来源的标记的鉴定核酸。

<制备溶液A>

制备溶液A通过比较实施例1的相同方法进行。

<制备杂交溶液>

将20μl份的通过发明实施例1的相同方法制备的未纯化的标记的样品核酸Cy3-女性、20μl通过发明实施例1的相同方法制备的未纯化的标记的鉴定核酸Cy3-女性DNA和38μl溶液A放入1.7ml容量的微量管中并进行充分的搅拌(涡旋)处理。另外，以相同的方式，将20μl在<制备未纯化的标记的核酸>中制备的未纯化的标记的样品核酸Cy3-男性、20μl在<制备鉴定核酸>中制备的载体-来源的标记的鉴定核酸和38μl溶液A放入1.7ml容量的微量管中并进行充分的搅拌(涡旋)处理。

<预处理核酸微阵列>

这通过比较实施例1的<预处理核酸微阵列>的相同方法进行。

<杂交>

杂交以与比较实施例1的<杂交>的相同方法进行。然而，在该情形中，使用由ALOKA生产的HS-300作为杂交装置。另外，未纯化的标记的样品核酸Cy3-女性与上述载体-来源的标记的鉴定核酸的混合物，和未纯化的标记的样品核酸Cy3-男性与上述载体-来源的标记的鉴定核酸的混合物分别用作两种类型的样品。

<洗涤核酸微阵列>

这通过比较实施例1的<洗涤核酸微阵列>的相同方法进行。

<数据获取>

<数据处理>

通过将未纯化的标记的样品核酸Cy3-女性-来源的荧光值视为FF，将与未纯化的标记的样品核酸Cy3-女性同时杂交的载体-来源的标记的鉴定核酸的荧光值视为Fc1，将未纯化的标记的样品核酸Cy3-男性-来源的荧光值视为FM，将与未纯化的标记的样品核酸Cy3-男性同时杂交的载体-来源的标记的鉴定核酸的荧光值视为Fc2，基于Log₂(FM/Fc2/FF·Fc1)计算数值并针对每一探针染色体进行排列。另外，对相同探针的数值取平均值并制成图表。

结果显示在图17中。Log₂(FM/Fc2/FF·Fc1)值在常染色体的情形中几乎会聚在±0.25内，并且在X染色体的情形中变为几乎0.6以上的差异，因此其可以以高灵敏性来检测。

工业适用性

尽管可能通过对标准品和待测样品使用相同标记物来除去由于不同标记物引起的差异，但是进一步使用借助于标记的鉴定核酸(B)的校正法已经导致可能除去核酸微阵列之间样点的差异和高度精确的核酸微阵列测量。另外，合适的校正可以通过是本发明的校正法来进行，即使当样点不同时，只要使用相同的探针即可。例如，即使当探针核酸的点样量和样点排列和数量不同时，其进一步变为可能校正由杂交后微小杂交条件引起的差异。

关于在执行校正中使用的标记的鉴定核酸(B)，还发现进一步良好的结果可以通过在其标记步骤中进一步增加其所需浓度而获得。

本申请基于2008年5月27日提交的日本专利申请JP 2008-138533和2009年5月26日提交的JP 2009-126780，通过参考将其全部内容引入本文，如同详述的那样。

Claims

1.一种用于非诊断目的的借助于核酸微阵列的分析法，所述核酸微阵列具有在其上固定第一探针核酸的样点X1，所述方法包括：

容许待测样品的标记的样品核酸A1与固定在所述样点X1上的第一探针核酸杂交；

对所述样点X1提供标记的鉴定核酸B，所述鉴定核酸B具有能够与所述第一探针核酸的至少一部分杂交的序列并用与标记的样品核酸A1不同的标记物标记，并容许所述标记的鉴定核酸B在所有样点处与至少所述第一探针核酸杂交；

测量在样点X1上杂交的标记的样品核酸A1的标记量值F1；和

测量在样点X1上杂交的标记的鉴定核酸B的标记量值Fc1，

其中所述方法还包括：

对样点X n提供与标记的样品核酸A1相同或不同的标记的样品核酸A n，在所述样点X n上固定有第n探针核酸，所述第n探针核酸具有与固定在样点X1上的第一探针核酸相同的序列，和容许所述标记的样品核酸A n与固定在样点X n上的第n探针核酸杂交，所述样点X n存在于样点X1的同一个核酸微阵列或另一个核酸微阵列上；

对样点X n提供标记的鉴定核酸B，并容许所述标记的鉴定核酸B与至少第n探针核酸杂交；

测量在样点X n上杂交的标记的样品核酸A n的标记量值F n；和

测量在样点X n上杂交的标记的鉴定核酸B的标记量值Fc n，

其中与样点X n上的标记的样品核酸A n的杂交量相对应的校正的标记量值通过利用下式1来计算：

式1；标记的样品核酸A n的校正的标记量值=标记量值Fc1/标记量值Fc n x第n标记的样品核酸A n的标记量值F n，其中n是2以上的整数。

2.根据权利要求1所述的分析法，

其中容许标记的样品核酸A1进行杂交和容许标记的鉴定核酸B进行杂交是同时进行的，且

测量杂交的标记的样品核酸A1的量和测量杂交的鉴定核酸B的量是同时进行的。

3.根据权利要求1所述的分析法，

其中固定在样点X1上的第一探针核酸的量基于标记量值Fc1检测，且标记量值F1基于检测的量来校正。

4.根据权利要求1所述的分析法，还包括：

通过比较标记量值Fc1和Fc n，计算样点X1和样点X n处的标记量值的系数。

5.根据权利要求1所述的分析法，

其中所述标记的样品核酸A1和标记的样品核酸A n通过标记获自不同样品的核酸来制备。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的分析法，

其中在与标记化合物混合前，另外将与标记的鉴定核酸B的同种相同的未标记的核酸加入至标记的鉴定核酸B的杂交中。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的分析法，

其中所述标记的样品核酸A1和标记的鉴定核酸B的至少一种标记通过荧光产生。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的分析法，

其中使用BAC-DNA微阵列作为核酸微阵列。

9.根据权利要求1-3中任一项所述的分析法，

其中两个或更多个同种样点X n存在于不同的核酸微阵列中，且各核酸微阵列之间的第n探针核酸的排列和第n探针核酸点样量在各核酸微阵列中不同。

10.根据权利要求1-3中任一项所述的分析法，

其中使用与样品的核酸不同并具有在第一和第n探针核酸上序列的核酸作为标记的鉴定核酸B。

11.根据权利要求1-3中任一项所述的分析法，

其中使用含有重复序列的核酸作为标记的鉴定核酸B。

12.根据权利要求1-3中任一项所述的分析法，

其中使用Cot-1DNA作为标记的鉴定核酸B。

13.根据权利要求1-3中任一项所述的分析法，

其中使用载体来源的核酸作为标记的鉴定核酸B。

14.根据权利要求1-3中任一项所述的分析法，

其中标记量值F1和Fc1中的标记量值Fc1由数字数据提供。

15.用于非诊断目的的计算样品间基因表达量或样品间基因拷贝数的方法，其通过利用根据权利要求1-3中任一项所述的分析法进行。