JP2010004873A - 核酸マイクロアレイを用いた解析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】核酸マイクロアレイを用いた解析方法であって、該核酸マイクロアレイが第1のプローブ核酸が固定化されているスポット(X1)を有し、検体の標識試料核酸(A1)を、スポット(X1)に固定化された該プローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、前記標識試料核酸とは異なる標識で標識されている標識検証核酸(B)を、スポット(X1)に付与し、ハイブリダイズさせる工程、スポット(X1)にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値(F1)を測定する工程、及び、スポット(X1)上にハイブリダイズした該標識検証核酸(B)の標識量値(Fc1)を測定する工程を含む解析方法。
【選択図】なし
Description
染色体解析が解析可能な解像度より高く、数10kb〜数Mbレベルで起きたゲノム構造異常を検出できるツールとして、アレイCGH法がある(非特許文献2、3)。アレイCGH法は、ゲノムDNAの断片、例えば、BAC(Bacterial Artificial Chromosomes)クローンやYAC(Yeast Artificial Chromosomes)クローン、PAC(P1-derived Artificial Chromosomes)やこれらBAC、YAC、PAC等を基に作成したDNAやオリゴヌクレオチドを基板上にスポットし、固体基板上に配置したアレイを使用する。さらに患者等から採取した検体試料となる異常細胞および、健常人から採取した標準試料となる正常細胞から、標的となるDNAを抽出し、それぞれ異なった標識体(蛍光物質等)で標識し、核酸マイクロアレイ上のプローブと同時に接触させ、ハイブリダイゼーションを介して相互作用させ、相互作用した標的核酸が発する蛍光シグナルをスキャナーなどにより読み取り、正常細胞及び異常細胞由来の標的核酸の信号の強度比を比較することで、遺伝子の相対コピー数を検出する方法である。
ここで、Cy5で標識した検証核酸は同等の配列を持つ核酸であることが望ましく、調製が同じものであることが望ましい。また、スポット差を補正する方法としては、どのような計算方法を用いても論理的に補正できるのであれば、どのような計算方法でもかまわない。望ましくは、標準・検体の蛍光値を検証核酸の標識から得られる蛍光値を用いて比を取り、標準・検体を比較する。
標識検証核酸と標準・検体を同一の溶液に添加し、その溶液量をエタノール沈殿法などによって濃縮することが好ましく、実施できない場合にもできるだけ、核酸濃度を濃縮することが望ましい。
すなわち、本発明は、以下の構成よりなるものである。.
核酸マイクロアレイを用いた解析方法であって、
該核酸マイクロアレイが第1のプローブ核酸が固定化されているスポット(X1)を有し、
検体の標識試料核酸(A1)を、スポット(X1)に固定化された該プローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、前記標識試料核酸とは異なる標識で標識されている標識検証核酸(B)を、スポット(X1)に付与し、少なくとも前記第1のプローブ核酸とハイブリダイズさせる工程、
スポット(X1)にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値(F1)を測定する工程、及び、
スポット(X1)上にハイブリダイズした該標識検証核酸(B)の標識量値(Fc1)を測定する工程を含むことを特徴とする、解析方法。
2.
該標識試料核酸をハイブリダイゼーションさせる工程と、前記標識検証核酸(B)をハイブリダイゼーションさせる工程とが同時に行われ、かつ、
該ハイブリダイズした該標識試料核酸の量を測定する工程と、前記ハイブリダイズした検証核酸の量を測定する工程とが同時に行われることを特徴とする、1に記載の解析方法。
3.
前記(Fc1)に基づき、スポット(X1)における固定されたプローブ核酸の量を検知し、該検量値により前記(F1)を補正することを特徴とする、1または2に記載の解析方法。
4.
スポット(X1)と同じ核酸マイクロアレイ上または異なるアレイ上に存在する、スポット(X1)に固定化された前記第1のプローブと実質的に同一の配列を有する第nのプローブ核酸が固定化されたスポット(Xn)において、
前記標識試料核酸と同一または異なる標識試料核酸(An)を、スポット(Xn)に固定化された該第nのプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
前記標識検証核酸(B)を、スポット(Xn)に付与し、ハイブリダイズさせる工程、
スポット(Xn)にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値(Fn)を測定する工程、及び、
スポット(Xn)上にハイブリダイズした該標識検証核酸(B)の標識量値(Fcn)を測定する工程、
を含むことを特徴とする、1〜3のいずれかに記載の解析方法。
5.
標識量値(Fc1)と(Fcn)とを対比することでスポット(X1)とスポット(Xn)とにおける標識量値の係数を算出する工程を含むことを特徴とする、4に記載の解析方法。
6.
標識試料核酸(A1)と標識試料核酸(An)とが異なる試料から得られた核酸を標識したものであることを特徴とする4または5に記載の解析方法。
7.
前記標識検証核酸(B)をハイブリダイゼーションさせる工程において、更に、標識化合物を結合する前の標識検証核酸(B)と同一種の未標識核酸が添加されていることを特徴とする1〜6のいずれかの解析方法。
8.
スポット(Xn)における標識試料核酸(An)がハイブリダイズした量に相当する補正標識量値を、下記式(1)を用いて算出することを特徴とする、4〜7のいずれかの解析方法。
式(1) 標識試料核酸(An)の補正標識量値=前記(Fc1)÷前記(Fcn)×第nの標識試料核酸(An)の標識量値 (nは2以上の整数)
9.
標識試料核酸(A1)と標識検証核酸(B)における標識の少なくとも一方が蛍光によるものであることを特徴とする、1〜8のいずれかの解析方法。
10.
核酸マイクロアレイとして、BAC−DNAマイクロアレイを使用することを特徴とする、1〜9のいずれかの解析方法。
11.
複数の同種のスポット(Xn)が異なる核酸マイクロアレイに存在し、それぞれの核酸マイクロアレイ間のプローブ核酸の配置、プローブ核酸のスポット量が、それぞれの核酸マイクロアレイで異なっていることを特徴とする、1〜10のいずれかの解析方法。
12.
標識検証核酸(B)として、検体の核酸とは異なり、第1及び第nのプローブ核酸上の配列を持つ核酸を用いる1〜11のいずれかの解析方法。
13.
標識検証核酸(B)として、反復配列を含む核酸を使用することを特徴とする、1〜12のいずれかの解析方法。
14.
標識検証核酸(B)として、Cot−1 DNAを使用することを特徴とする、1〜13のいずれかの解析方法。
15.
標識検証核酸(B)として、ベクター由来の核酸を使用することを特徴とする、1〜12のいずれかの解析方法。
16.
標識量値(F1)および(Fc1)のうち、標識量値(Fc1)がデジタルデータにより供給されることを特徴とする、1〜15のいずれかの解析方法。
17.
5〜16のいずれかに記載の解析方法における、標識試料核酸(An)(nは2以上の整数)の標識量値(Fn)を、標識検証核酸(B)の標識量値(Fc1)及び標識量値(Fcn)を用いて補正するデータ処理をコンピュータに実行するためのプログラム。
18.
17に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
19.
1〜18の解析方法を用いて、検体間の遺伝子発現量もしくは検体間の遺伝子コピー数を計算する方法。
20.
プローブ核酸が固定化されているスポットを複数有する核酸マイクロアレイ、及び、該核酸マイクロアレイ上の全てのスポットにおいて少なくとも各プローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する検証核酸、を含む請求項1〜19のいずれかの解析方法用のキット。
補正を実施する際に用いている標識検証核酸(B)については、標識工程においてある望ましい濃度がより多くすることでより良い結果が得られることも見出した。
該核酸マイクロアレイが配列(a)と相補的なプローブ配列(a’)を含む第1のプローブ核酸が固定化されているスポット(X1)を有し、
検体の標識試料核酸(A1)を、スポット(X1)に少なくとも固定化された該第1のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
全てのスポットにおいて、少なくとも該第1のプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、前記標識試料核酸とは異なる標識で標識されている標識検証核酸(B)を、スポット(X1)に付与し、ハイブリダイズさせる工程、
スポット(X1)にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値(F1)を測定する工程、及び、
スポット(X1)上にハイブリダイズした該標識検証核酸(B)の標識量値(Fc1)を測定する工程を含むことを特徴とする、解析方法に関する。
該核酸マイクロアレイが(a)と相補的な配列(a’)を少なくとも一種類以上含む該第1のプローブ核酸が固定化されているスポット(X1)を有し、
(A)を標識した試料核酸(A1)と全てのスポットにおいて、少なくとも該第1のプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する検証核酸(B)を(A)とは別の標識で標識した核酸(B1)を共存させ、スポット(X1)に固定化された該第1のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
更に、標準(C)を(A)と同様の標識で標識した核酸(C1)と(B1)を共存させ、(X1)と同等の配列を持つスポット(X1‘)に固定化された該プローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
スポット(X1)にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値(Fa1)を測定する工程、及び、
スポット(X1)上にハイブリダイズした該標識検証核酸(B)の標識量値(Fb1)を測定する工程、
スポット(X1’)にハイブリダイズした該配列(c)を含む核酸の標識量値(Fc1)を測定する工程、及び、
スポット(X1’)上にハイブリダイズした該標識検証核酸(B)の標識量値(Fb1’)を測定する工程、
を含むことを特徴とする、核酸解析方法である。
この標識検証核酸(B)の標識量値を用いれば、例えば(Fc1)の設計値との対比から当該スポットの異常を判定することができるし、複数のスポットにおいて標識検証核酸(B)の標識量値を検証することで、スポット間における誤差を検知することもでき、また、誤差を補正することも可能となる。
本発明においては、更に好ましくは核酸を含むハイブリダイゼーション溶液として、検体の試料核酸(A)と、全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する標識検証核酸(B)と、を含有する溶液を1つのアレイに用い、次に標準の核酸(C)と標識検証核酸(B)を別のアレイに用い、アレイ実験を実施し、検出した標識検証核酸(B)の標識量値を用いて、(A)の標識量値および(C)の標識量値を補正し、(A)の標識量値と(C)の標識量値とを比較することで、(A)の量を確定することができる。ここで、別のアレイは、同種のアレイ、即ち同種のプローブがスポットされているアレイを指す。
(a)試料核酸を標識化合物で標識することにより、標識試料核酸(A)を得る工程。
(b)全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を含む検証核酸を工程(a)とは異なる標識化合物で標識することにより、標識検証核酸(B)を得る工程。
(c)工程(a)で得られた標識試料核酸(A)、工程(b)で得られた標識検証核酸(B)、を含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程。
(d)工程(c)で得られたハイブリダイゼーション溶液を、核酸マイクロアレイ上に塗布し、ハイブリダイゼーション溶液中の標識試料核酸(A)および標識検証核酸(B)とプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる工程。
(e)工程(d)で得られた核酸マイクロアレイから標識試料核酸(A)と標識検証核酸(B)のプローブ核酸へのハイブリダイゼーション量をそれぞれ読み取り、標識量値を得る工程。
ここで、工程(d)と工程(e)の間で、ハイブリダイズしたアレイを洗浄液で洗浄する工程をさらに含むことが好ましい。
また、工程(c)において、標識試料核酸(A)、標識検証核酸(B)を添加する際、同時でも別々に添加してもよい。
また、更に下記工程を含むこともできる。
(a”)標識した標準の核酸(C)を得る工程、
(c”)標識した標準の核酸(C)と上記(b)工程で得られた標識検証核酸(B)とを含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程、
(d”)前記(d)工程とは異なる同種のアレイに対してハイブリダイズさせる工程、
(e”)前記(d”)でハイブリダイズした標準の核酸(C)と標識検証核酸(B)それぞれの標識量値を得て、検出した標識検証核酸(B)の標識量値を用いて、((A)の標識量値および)(C)の標識量値を補正し、(A)の標識量値と(C)の標識量値とを比較することで、(A)の量を確定する工程。
また、ハイブリダイゼーションの時間は、16〜100時間とすることが好ましく、
24〜80時間以上とすることがより好ましく、40〜72時間とすることがさらに好ましい。
ハイブリダイズ後、適宜洗浄等を行う。洗浄の条件は、回数を増やすほど、洗浄効果が高く、また、洗浄液には、2×SSCや2×SSC/50%ホルムアミド、2×SSC/0.1%SDS、1×SSCなど、イオン強度を調整したものや、解離剤、界面活性剤など、一般的にサザンブロッドやコロニブロッド、ノーザンブロッドなど、ハイブリダイゼーション実験を実施する際に用いられる洗浄液を用いることが可能である。温度としては、15℃〜70℃が好ましく、25℃〜50℃の範囲に設定することがより好ましく、ハイブリ条件と同等の溶液量とする必要がある。
(a1)試料核酸を標識化合物で標識することにより、標識試料核酸(A)を得る工程。
(b1)全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を含む検証核酸を工程(a)とは異なる標識化合物で標識することにより、標識検証核酸(B)を得る工程(検証核酸は、試料核酸と相補的であってもかまわない。)。
(c1)工程(a1)で得られた標識試料核酸(A)及び工程(b)で得られた標識検証核酸(B)を含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程。
(d1)工程(c1)で得られた溶液を核酸マイクロアレイ上に塗布し、ハイブリダイゼーションを行う工程。
(e1)工程(d1)によって得られた核酸マイクロアレイを洗浄液によって洗浄する工程。
(f1)工程(e1)によって得られた核酸マイクロアレイから標識試料核酸(A)と標識検証核酸(B)のプローブ核酸へのハイブリダイゼーション量をそれぞれ読み取り、標識量値を得る工程。
(a1’)核酸を標識化合物で標識することにより、標識試料核酸(A)を得る工程。
(b1’) 全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を含む検証核酸を工程(a)とは異なる標識化合物で標識することにより、標識検証核酸(B)を得る工程(検証核酸は、核酸と相補的であってもかまわない)。
(c1’)工程(b1’)で得られた標識検証核酸(B)を含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程。
(d1’)工程(a1’)で得られた標識試料核酸(A)、工程(c1’)で得られた標識検証核酸(B)を含むハイブリダイゼーション溶液とを混合し、標識試料核酸(A)及び標識検証核酸(B)を含むハイブリダイゼーション溶液を調製する工程。
(e1’)工程(d1’)で得られた溶液を核酸マイクロアレイ上に塗布し、ハイブリダイゼーションを行う工程。
(f1’)工程(e1’)によって得られた核酸マイクロアレイを洗浄液によって洗浄する工程。
(g1’)工程(f1’)によって得られた核酸マイクロアレイから標識試料核酸(A)と標識検証核酸(B)のプローブ核酸へのハイブリダイゼーション量をそれぞれ読み取り、標識量値を得る工程。
ここで、検体の少なくとも1つが既知量である上記標準(C)であることが好ましい。これにより、他の検体がより正確に測定できる。
具体的には、第一のスポット(X1)と同じ核酸マイクロアレイ上または異なるアレイ上に存在する、同一の配列(a’)を有するプローブ核酸が固定化されたn個のスポット(Xn)において、請求項1〜6のいずれかに記載の方法でn個のスポット各々のハイブリダイズした該標識検証核酸(B)の標識量値を得る工程、
n個の該標識検証核酸(B)の標識量値から平均値もしくは平均値に対する偏差を行った数値を算出する工程、を含むことが好ましい。
式(1) 第nの標識試料核酸(An)の補正標識量値=Fc1÷Fcn×第nの標識試料核酸(An)の標識量値(nは2以上の整数)
図1では、簡略化のため、二種の検体間でのコピー数解析に核酸マイクロアレイを用いた場合で、一枚のアレイに4種のプローブ試料核酸(A〜Dまたはa〜d)と同一のプローブ核酸1〜4の16スポットをスポットした二枚の核酸マイクロアレイを想定として模式図を作成した。
F2’=Fb1/Fb2×F2
Ratio=F2’/F1
これをすべてのスポットの組に対して計算すると、コピー数を求めることが可能となる。
さらに、本発明では、プローブ核酸がおおよそ同一であれば、異なった核酸マイクロアレイ同士の補正を行うことができる。異なった核酸マイクロアレイとは、異なった目的で製造された核酸マイクロアレイ、異なったスポットの配置、形状、濃度でスポットされた核酸マイクロアレイのことを言う。
即ち、本発明の方法により補正することで、複数の核酸マイクロアレイ間のプローブ核酸の配置、プローブ核酸のスポット量が、それぞれの核酸マイクロアレイで異なっているような場合でも、評価を行うことが出来る。
また、実質的に同一種のプローブ核酸群の内、最大値と最小値を除いた平均値を使用することも出来るし、プローブ核酸群の平均標識量からある敷居値を除いたスポットの標識量を使用することも出来る。
本発明で言うところの、核酸マイクロアレイとは、固体材料表面(ここで言う、表面とは、3次元的表面も言い、繊維等の表面も含む、すなわち、大きな形状としては、内包されているように見えていたとしても、実質的に表面であれば、ここでは表面と呼ぶ。)にプローブ核酸を結合、固定化させ、並べたものを言う。固体材料としては、一般的に使用されるスライドガラスなどのガラス素材のほか、プラスチック材料、炭素繊維、ゲルやゾル、メンブレン、金属など、プローブ核酸が結合可能な材料であれば良く、特に限定はしない。固体材料の形状も、平面状、突起状物の頂上、粒子状、細管の内部など、特に限定しない。本発明での核酸マイクロアレイは、スポッターなどによって製造されたDNAマイクロアレイや半導体技術によって製造されたDNAチップも含むものとする。
本発明においては、核酸マイクロアレイとして、BAC−DNAアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、c−DNAマイクロアレイ等を使用することができる。
更に、マイクロアレイのスポットの配置は様々あり、アレイを複数エリアもち、複数の検体を1枚の基盤上で測定できる多検体アレイや、複数のアレイを組み合わせ、多くのスポットを1枚の基盤に再現したタイリングアレイなどがある。
マイクロアレイの形状には、様々有り、3次元構造をなすことにより、反応効率を上げたものや、粒子状に核酸を結合させたもの、テープ上に核酸を結合させたものなどや、CDのような円盤状に核酸を結合させたものなどが上げることもできる。
BAC-DNAアレイについては、BACにマンマリアン等のインサートを導入した状態のDNAを基に作成したものであればなんでも良く、そのものを貼り付けたものでもあり、また、PCR等の増幅技術を用いて増幅しているものも含んでおり、特に限定していない。
プローブ核酸は、予めどの配列が含まれているのか分かっている配列を含む核酸であって、マイクロアレイの場合は一般的にスポット状に複数固定されているものである。
プローブ核酸を固体基板上に搭載させる方法は、GeneChipを代表とする光脱離基を結合させたアミダイトモノマーを用い、マスクを使用して、一ヌクレオチドずつ化学合成する方法やインクジェット方式でアミダイトモノマーを固体基板上にスポットし、望んだ配列を化学合成する方法、電極上で溶液のpHを変化させそのpH変化を利用して保護基を脱離することにより基板上で核酸を合成する方法、あらかじめ化学合成した核酸を精製し基板上にスポットする方法、スポッターを用いてcDNAをスポットする方法などを用いることが出来る。スポット方式も、インクジェット方式、ピンアレイ方式などを用いることが出来る。
核酸マイクロアレイは一般に、実質的に同じ配列を有するプローブ核酸を多量に高い密度で固定化した領域(スポット)を複数有するが、本発明で使用することの出来る、実質的に同一種、同一量のプローブ核酸のスポット数は、1つ以上あれば良く、スポット数によらない。解析の目的に応じて任意に選択することが可能である。
プローブ核酸の固定量は、1スポットあたり、0.8〜5μgとすることが好ましく、1.0〜2.0μgのとすることがより好ましい。
スポット形状に制約はないが、円形を好ましく用いることができる。
スポット径に制約はないが、10μm〜1000μmが好ましい。
本発明での検体とは、核酸マイクロアレイを用いて解析したいと考える核酸(試料核酸)又は、核酸を含む細胞等であり、核酸マイクロアレイを用いて解析をしようとするものであれば全てを指し、特に限定するものはない。
例えば、核酸マイクロアレイを用いて、核酸の発現量や存在量、ゲノムの中のコピー数などを測定しようとしている核酸を含有している分析対象あるいは診断などの評価を行おうとしている細胞等のことであるが、同時に組織や、器官、一固体なども含まれ、細胞そのものに限定しているわけではない。
他に、検体として考えられるものとして、合成核酸等の存在量が予め分かっている、又は分かっていないものを使用し、アレイや測定機器の能力等を試験する際にもちいる物も検体として考えることができるし、後述する検証核酸も、測定対象とするのであれば検体と考えることも可能である。
検体は、ある疾患を持っていると考えられうる患者や、動物から取得できる核酸又は、核酸を取得できる細胞等が挙げられ、細胞を包括するものであれば全てを指す。狭義には核酸を指す。例えば、疾患としては、癌、遺伝病、感染症等、核酸になんらかの情報を持ちうると考えられる疾患が全て該当し、他に特に限定するものはない。
更に、癌検体はLCM(Laser Capture Microdissection)処理を行ったものを用いることもできる。
標準は、上記で検体と比較するために予めある程度の情報を持っている核酸や、核酸を取得することができる細胞や細部を包括するものであれば全てを指す。一般的な存在量と異なっていたとしても、検体を比較し、情報を得られることができれば、標準としてみなすことが可能である。例えば、CNVやなんらかのモザイクを持つ患者において、癌が発症したとして、癌細胞から得られた核酸と癌細胞以外の正常細胞から得られた細胞を比較したとした場合、CNVやなんらかのモザイクについては、相殺されるので標準として用いることになんら障害が無いと考えられる。
また、由来が全く異なる細胞等から取得した核酸についても、比較対象として用いることができれば、標準とみなすことが可能である。
本発明においては、試料核酸として検体から抽出した試料核酸や標準の核酸の何れも用いることができるが、前述のように、検体から抽出した試料核酸と、標準の核酸の双方を別々のアレイに対してハイブリダイズさせることが好ましい。
本発明では、試料核酸としてがん細胞由来の核酸または正常細胞(がん化していない細胞)由来の核酸を用いることが好ましい。
本発明では、検体や標準から核酸を調製する際には、精製を行うことが望ましい。標識の際に、様々な副反応が生じると共に、タンパクや脂質、糖など細胞溶解物が標識反応に影響を及ぼし、バックグラウンドノイズに大きな影響を与え、精製を行わなければ、核酸マイクロアレイの測定性能を著しく低下する。
更に、シリカ系核酸吸着性多孔質膜と比較して非常に薄く、少量での核酸抽出に適しており、他の方法と比較して非常に高濃度の核酸を得ることが出来る。また、少量液量での精製が可能なエタノール沈殿法やイソプロパノール沈殿法と比較して、より高純度の核酸を得ることが出来、少量かつ高濃度の標識核酸を得るのに適した方法である また、フェノール−クロロホルム抽出法やその他の種々の沈殿法を用いた場合、以降の工程に悪影響を及ぼしてしまうことから、検体から核酸を調製する場合、純度向上のため、複数回の精製工程を行うことも出来る。
検体からシリカを主成分とする核酸吸着性膜をカートリッジに固定化させたカラム法によって精製した場合、一般的にその回収液量が多く、得られる核酸の濃度が非常に薄くなってしまう。この問題を解決するためには、エタノール沈澱などで、溶液を全て除去してしまうか、限外濾過カラム等を用いて濃縮することなどが可能である。
また、精製工程を行った場合には、本発明では、制限酵素などの核酸分解酵素により、核酸を断片化し、得られた核酸を精製することによって、その精製度が増すと共に、精製時に濃縮工程を組み込むこと、例えば、核酸の溶液量よりもより少量の回収液量で抽出することで、より高純度かつ高濃度の核酸を得ることが出来、標識核酸を得るための効率が良くなることから好適に用いることが出来る。
酵素処理に使用する酵素としては、制限酵素または核酸分解酵素を用いることが好ましい。制限酵素の種類は、複数用いることも可能である。
本発明の方法は、サブトラクション法によって、核酸マイクロアレイ測定の精度を上げることも出来る。サブトラクション法とは、対象遺伝子のコピー数や発現に差がある場合、遺伝子の中に存在する違いを、引き算の要領で差し引きし、効率的に遺伝子を単離する方法である。例えば、PCR−Select法、RDA(representational difference analysis)法、DsDD(Duplex-specific Direct Digestion)法等を用いることが出来る。
特に、がん細胞の場合、がん組織の中には、がん細胞と共に多量の正常細胞が含まれており、その結果、がん細胞の場合、核酸マイクロアレイの性能が著しく低下するが、サブトラクション法によって、その性能低下をある程度防ぐことが出来る。
標識とは、検出可能な物質を核酸に対して結合させる行為であり、検出可能であれば、いかなるものも本発明に組み込むことが出来る。例えば、蛍光物質、無機化合物、酵素、放射性同位元素、色素などを含むことが出来、標識が蛍光によるものであることが好ましい。一つの検体に対し、複数標識することも可能である。
蛍光物質としては、特に使用は限定しないが、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Cy-dye、ALEXA、緑色蛍光タンパク質(GFP, Green Fluorescent Protein)、青色蛍光タンパク(BFP,)、黄色蛍光タンパク(YFP)、赤色蛍光タンパク(RFP)、Acridine、DAPI、Ethidium bromide、SYBR Green、Texas Red、希土類蛍光ラベル剤、TAMRA、ROXなど入手可能または作製可能な物質であれば全て使用でき、好ましくはcy-3、cy-5によって蛍光標識することができる。
無機化合物としては、特に使用する素材は限定しないが、例えば、半導体無機材料で出来た量子ドットを挙げることが出来る。その例としては、シリカ、CdTe、ZnSe、CdSeのナノ微粒子を挙げることが出来る。この微粒子は、その粒径を変えることで、発する蛍光波長を変化させることが出来、直径2nmでは青色、直径3nmでは緑色、4nmでは黄色、5nmでは赤色となる。この様に、蛍光を検出しても良いし、その粒子の存在を直接検出しても良い。例えば、粒子の存在を直接検出する手段として、AFM(原子間力顕微鏡)や電子顕微鏡を用いることが出来る。
さらに、ジゴキシゲニン(Digoxigein:DIG)、ビオチンなども利用することも出来る。ビオチンを利用した例としては、プローブに結合させたビオチンに、アビジンを結合させ、ここにビオチンを結合させたアルカリ性ホスファターゼを結合させ、アルカリ性ホスファターゼの基質であるニトロブルーテトラゾリウムと5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸を加えると紫色の発色が見られ検出に使用することが出来る。
また、非酵素的に標識することも出来る。例えば、ULS arrayCGH LabelingKit(Kreatech Biotechnology BV社)なども用いることが出来る。
標識法は、直接標識法、間接標識法いずれの標識法を本発明では用いても良い。直接標識法とは、例えば、Cy−dyeを用いる場合、核酸を一本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、Cy−dyeを結合させたヌクレオチド誘導体をヌクレオチドとともに混合しておき、一段階で標識核酸を合成する方法である。酵素が非天然型のヌクレオチド誘導体を取り込む際の取り込み効率が天然型のヌクレオチドよりも低いという問題点があるものの、工程が簡便であり、本発明でも好適に用いることが出来る。間接標識法とは、例えば、Cy−dyeを用いる場合、核酸を一本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、Cy−dyeが結合できる置換基を持ったヌクレオチド誘導体、例えば、アミノアリル基を持ったヌクレオチド誘導体と天然型のヌクレオチドとともに混合しておき、最初に、この置換基を持った核酸を合成し、次に、アミノアリル基を介してCy−dyeを結合させ、標識核酸を得る方法である。この方法は、工程が複雑な反面、アミノアリル基を結合させたヌクレオチド誘導体の立体構造が直説標的法で使用するCy−dyeを結合させたヌクレオチド誘導体よりも、天然型のヌクレオチドと構造的に近く、標識化合物の取り込み効率が高く、本発明でも好適に用いることが出来る。
ランダムプライマー法は、核酸に対して、数bp(塩基対)から十数bpのランダムなプライマー核酸をハイブリダイゼーションさせ、ポリメラーゼを用いて、増幅と標識とを同時に行い、標識核酸を合成する方法である。ニックトランスレーション法は、例えば、DnaseIでニックを入れた二本鎖核酸に、DNAポリメラーゼを作用させ、DNAを分解すると同時に、DNAポリメラーゼ活性により、標識核酸を合成する方法である。PCR法は、二種類のプライマーを準備し、そのプライマーを用いてPCR反応を行うことで、増幅と標識とを同時に行い、標識核酸を得る方法である。末端標識法は、5’末端を標識する方法では、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した核酸の5’末端に、T4 ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化反応で標識化合物を取り込ませる方法である。3’末端を標識する方法は、ターミナルトランスフェラーゼにより、標識化合物を核酸の3’末端に付加する方法である。
本発明では、ダイスワップ法を用いることもできる。本発明で言うところのダイスワップ法とは、例えば、一枚目の核酸マイクロアレイに対しては、標準細胞由来の核酸をCy3で検証核酸をCy5で標識した試料をハイブリダイゼーションさせ、二枚目の核酸マイクロアレイに対しては、検体細胞由来の核酸をCy3で検証核酸をCy5で標識した試料でハイブリダイゼーションさせる。一枚目と二枚目の核酸マイクロアレイから得られた蛍光値から比を算出する。次に、三枚目の核酸マイクロアレイに対しては、標準細胞由来の核酸をCy5で検証核酸をCy3で標識した試料をハイブリダイゼーションさせ、四枚目の核酸マイクロアレイに対しては、検体細胞由来の核酸をCy5で検証核酸をCy3で標識した試料でハイブリダイゼーションさせる。三枚目と四枚目の核酸マイクロアレイから得られた蛍光値から比を算出する。この様な方法で、標識化合物による酵素の取り込み効率の異なりを補正する方法である。
本発明では、標識試料核酸および標識検証核酸として、それらを含む未精製の溶液を使用することも可能である。その様な未精製溶液を用いる場合、それらの溶液中には、酵素などがそのまま残存しており、調製後、溶液中に残存する酵素の活性を失活させておくことが好ましい。これは、例えば、検体由来の標識試料核酸をCy3、標識検証核酸をCy5で標識した場合、両者を含む未精製溶液を混合する工程があり、この混合時に、溶液中に残存する酵素が存在していると、残存した酵素によって標識試料核酸がCy5、標識検証核酸がCy3でさらに標識される可能性があり、データの再現性に影響を与えてしまう可能性があるからである。
本発明では、酵素の失活方法として、酵素の失活が可能な方法であればどの様な方法でもかまわないが、キレート剤を添加する方法、60℃以上の加熱処理を行うことのいずれか一方もしくは両方を行うことが好ましい。加熱温度は、60℃以上が好ましく、63℃以上がさらに好ましい。加熱時間は、1分以上あれば良く、最も好ましくは、65℃以上で5分間以上の加熱処理を行うことが好ましい。
また、klenow fragmentを用いた標識方法であれば、ボルテックスミキサー等を用いて酵素の活性を失わせることも可能である。
標識核酸とは、標識化合物が結合した核酸のことを言い、精製していても精製していなくともよい。
標識核酸を含む精製した溶液とは、標識核酸を含む溶液に対して精製工程を行うことによって得た核酸溶液のことを言う。ここで、精製工程とは、標識処理を行った後の未反応の標識化合物や酵素などを取り除く工程のことであるが、ハイブリダイゼーションに寄与しない核酸や、その後のハイブリダイゼーションに対し影響を与えてしまう生体物質・化学物質を取り除くことも含んでおり、工程の前後で何らかの物質が除かれるのであれば、精製工程とする。
標識核酸を含む未精製の溶液とは、検体から抽出した核酸の溶液に対して標識工程を行った後に、精製工程を全く行わずに得た核酸溶液のことである。ここで、精製工程とは、標識処理を行った後の未反応の標識化合物や酵素などを取り除く工程のことであり、核酸の溶液を調製するための精製工程は含めない。精製を行わないので、標識工程によって添加した種々の未反応化合物、例えば、プライマー、酵素、ヌクレオチド、バッファー中に含まれるイオンなどが共存した標識核酸の溶液である。さらに、標識核酸を含む未精製の溶液に対して、共存する酵素を失活させる目的で、加熱やキレート剤添加などの処理を行った後の核酸溶液も本発明では標識核酸を含む未精製の溶液という。
検証核酸は、対象としている全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、対象としているスポットにおけるハイブリダイズ能力の異常、具体的には該スポットに固定化されているプローブ核酸の量に起因する異常を検知し、更にはプローブ核酸量の異常スポット間のスポット量を補正するために使用する核酸のことである。そのため、検証核酸は、核酸マイクロアレイ上の全スポットに固定化されているプローブ核酸とハイブリダイゼーション可能であればよく、どの様な配列、鎖長でも良い。ここで、全てのスポットとは、同一溶液の検体または標準が反応する可能性がある全スポットを表し、通常は単一の核酸マイクロアレイ上のスポット全てのことであるが、これに限定されない。
また、ハイブリダイゼーションが可能であれば、どの様な核酸でも良く、DNAやRNAの様な天然型の核酸や、DNAやRNAなどの天然型の核酸を化学修飾した核酸を使用しても良い。例えば、PNA(Peptide Nucleic Acid)、BNA(Bridged Nucleic Acid)、メチルホスホネート型DNA、ホスホロチオエート型DNA、ホスホロアミデート型DNA、ボラノホスフェート型DNAなどを用いることが出来る。また、キメラ型核酸を用いることも出来る。例えば、核酸内にDNA部分とRNA部分とが混合したものや天然型核酸と修飾型核酸とが混合したものを使用することが出来る。
標識検証核酸(B)としては、たとえば、反復配列やベクター、大腸菌のゲノムなど、アレイを作製する上で、全てのスポットに存在すると考えられる核酸配列であれば使用出来、検体の核酸とは異なり、第1及び第nのプローブ核酸上の配列を持つ核酸を用いることが好ましい。
ベクターとしては、プラスミド、BAC、YAC、PAC、コスミド、ウィルスなど種種のベクターが上げられ、アレイを作製するときに用いたベクターやこのベクターと同じ配列をもつ核酸であれば何を用いても構わない。
検証核酸として好ましい配列としては、反復配列が挙げられる。反復配列とは、リピート配列ともいい、ある塩基数ごとに制限酵素認識部位のように繰り返し出現する配列であり、短い塩基配列のパターンが何度も繰り返す配列、例えば、poly d(AT)やpoly d(GC)などや、一単位が数千塩基対に及ぶ長い配列が何度も繰り返す配列などをあげることが出来、ヒト等の高等生物中にはゲノム中に高頻度で出現することが知られている。本発明においては、例えばインビトロジェン社で販売されているCot−1 DNAを好適に用いることが出来る。
例えば、マンマリアンBAC-DNAを用いた核酸マイクロアレイの場合には、Cot−1 DNAを用いることが好ましい。Cot−1 DNAは、通常、核酸マイクロアレイ測定時にマンマリアン(哺乳類)から得られた検体の反復配列をブロックするために使用される核酸であり、マンマリアンBACプローブを用いた核酸マイクロアレイの場合、通常そのプローブには反復配列が実質的に多くのBACプローブに含まれている。
検証核酸の使用量は、検体または標準の核酸に対して、0.5〜2倍モルの範囲とすることが好ましい。
標識検証核酸(B)とは、検証核酸に対して標識化合物を結合させた検証核酸のことを言い、精製していても精製しなくても本発明では標識検証核酸と言う。
標識検証核酸(B)として、検体由来の核酸、正常細胞由来の核酸、反復配列を含む核酸、を使用することもでき、Cot−1 DNAを使用することがより好ましい。
標識検証核酸(B)を、試料核酸(A)の1モル倍以上用いることが好ましく、3モル倍以上用いることが更に好ましく、8モル倍以上用いることが最も好ましい。
標識検証核酸を含む精製した溶液とは、標識検証核酸(B)を含む溶液に対して、精製処理を行うことによって得た、標識検証核酸を含む溶液のことである。ここで、精製工程とは、標識処理を行った後の未反応の標識化合物や酵素などを取り除く工程のことである。
標識検証核酸を含む未精製の溶液とは、標識検証核酸(B)を含む溶液に対して、精製処理を行わずに得た標識検証核酸を含む溶液のことである。精製を行わないので、標識工程によって添加した種々の未反応化合物、例えば、プライマー、酵素、ヌクレオチド、バッファー中に含まれるイオンなどが共存した標識検証核酸を含む溶液である。さらに、残存する酵素を失活させる目的で、未精製標識検証核酸を含む溶液に対して、加熱やキレート剤添加などの処理を行った後の核酸も本発明では標識検証核酸を含む未精製の溶液という。
本発明で言うところのブロッキング剤とは、ハイブリダイゼーション時に非特異ハイブリダイゼーションの検出を低減するためのものであり、ハイブリダイゼーション溶液を調製する際に、標識試料核酸(A)、標識検証核酸(B)などとともに添加することができる。例えば、核酸マイクロアレイのバックグラウンドノイズを低減させる作用を主として有するtRNA(トランスファーRNA)、変性サケ精子DNAやpolyA、poly dA、スキムミルクなどのことであり、一般に販売されているブロッキング剤も用いることができる。
本発明はハイブリダイゼーション溶液の組成として次のものを使用出来る。例えば、BAC−DNAを用いた核酸マイクロアレイの場合、核酸濃度を高める作用や、粘性を上げることで仕切られていても面積をある程度保持できる機能を持った硫酸デキストラン、核酸の融解温度を下げる作用を持ったホルムアミド、イオン強度を上げることができ、pHを一定に保つための機能を持つ溶液を例として挙げることが出来る。
本発明では、下記の試薬を含む溶液を用いることが好ましい。
排除体積効果を持つ物質として、ポリエチレングリコール(PEG、特開2000−325099号公報)やデキストラン硫酸等を使用することが出来る。
融点を低下させる化合物として、ホルムアミド、グリセロール、ホルムアルデヒド、DMSO、DMF、GuSCN、ヨウ素などを使用することが出来る。
イオン強度を調整する溶液としては、SSCのほか、SSPEが一般的に上げられる。他に、MES hybridization bufferなどが用いられる。
本発明で言うところのハイブリダイゼーション溶液とは、上記試薬やブロッキング剤その他の試薬、標識試料核酸・検証核酸を混入した溶液のことであり、標識試料核酸(A)や標識検証核酸(B)が核酸マイクロアレイ上のプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを好適にする性質を持った溶液のことであり、プローブ核酸と標識試料核酸や標識検証核酸との配列の一致度が高いハイブリダイゼーションを促進し、その一方で、配列の一致度が低いハイブリダイゼーションを抑制する働きを持った溶液のことである。
本発明で言うところの標識試料核酸、標識検証核酸を含むハイブリダイゼーション溶液とは、少なくとも一種の標識試料核酸および少なくとも一種の標識検証核酸が混入したハイブリダイゼーション溶液のことである。
本発明で言うところの標識試料核酸、標識検証核酸、ブロッキング剤を含むハイブリダイゼーション溶液とは、少なくとも一種の標識試料核酸および少なくとも一種の標識検証核酸および少なくとも一種のブロッキング剤が混入したハイブリダイゼーション溶液のことである。
標識試料核酸を含まず、それ以外の核酸を含んだハイブリダイゼーション溶液の調製は、使用者が行っても良いが、アレイなどの提供元が作製し提供してもよい。このハイブリダイゼーション溶液に、標識検証核酸(B)が入っている場合には、標識検証核酸の濃度や種類、ロット番号などを統一しておくほうが好ましく、使用者は、精度の高い核酸マイクロアレイ実験が容易に行うことが可能となる。
即ち、上述した工程(a)で調製した標識試料核酸(A)、工程(b)で調製した標識検証核酸(B)の少なくともいずれか一つを濃縮もしくは精製することも好ましいし、工程(c)で調製したハイブリダイゼーション溶液を濃縮もしくは精製することも好ましい。
標識試料核酸を含まず、それ以外の核酸を含んだハイブリダイゼーション溶液は、濃縮を行っておくことによって精度が高い核酸マイクロアレイ測定を実施することが可能となる。すなわち、ハイブリダイゼーションを実施する核酸同士がであう確率が高くなり、より精度の高い実験を実施することが可能であると考えられる。
本発明で言うところの精製とは、抽出、分離、分取と同異義語の意味で使用している。
また、そのための手段として、シリカやセルロース誘導体などの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、イオン交換樹脂やオクタデシル基などの疎水性置換基を結合したシリカ担体やサイズ排除効果を示す樹脂を使用した固相抽出カートリッジ、クロマトグラフィーなどによる方法を含むことが出来る。
核酸マイクロアレイ上のハイブリダイゼーションを読み取る方法としては標識を測定できる方法であればどんなものでも良く、限定するものではない。
例えば、ラジオアイソトープであればX線フイルムやBASS(富士フイルム株式会社)を用いることができる。
本発明で最も好適に用いられる方法は、蛍光スキャナーを用いる方法である。標識核酸の標識化合物として蛍光物質を用いた場合に好適に用いられる。蛍光スキャナーとしては、例えば、FLAシリーズ(富士フイルム株式会社)やGenePixシリーズ(Axon Instruments)、LS Reloaded(テカン)、などがあげられ、マイクロアレイを読み込むことができる機器であれば特に限定はしない。
また、標識をしていなくとも核酸を測定でき、補正等の計算を実施することができるのであれば、標識することが必須の要件とはいえない。例えば、SPRシステムで測定することが考えられる。
本発明の方法は、すべての工程を手作業で行うこともできるし、部分的に自動化された機械で行うこともできるし、全工程を自動化された機械で行うこともできる。自動化を行うことにより、作業者は煩雑な作業から解放され、人件費を低減し、熟練度の違いによる結果の差異を減少させ、ヒューマンエラーを防ぐことが可能となる。
本発明では、別途標準を予め測定しておき、それを提供することで検体を評価するという手法もとることが可能である。この結果、常時標準を準備しなくとも、検体のみのハイブリダイゼーションを実施することが可能となり、効率よく実験を実施することができるようになる。また検体のデータを標準と考え使用することも可能である。
核酸マイクロアレイ測定を実施し得られたデータを処理する際、効率よく実施ため、プログラムを用いたデータ処理を実施することが可能である。
該プログラムは、通常コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録した形態で提供される。該記録媒体は、コンピュータが読み取り可能なものであれば特に限定されない。本発明の記録媒体は、可搬型または固定型の両方の媒体が含まれ、例えば、コンパクトディスク(CD)、フレキシブルディスク(FD)、デジタルビデオディスク(DVD)、ハードディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
本発明のプログラムは、上記記録媒体に記録されて流通させることも、コンピュータの記録装置に記録しておき、ネットワークを通じて他のコンピュータに転送する形態で流通させることもできる。
尚、特に記載が無い場合、%は質量%を表す。
1.7mLマイクロチューブ(プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社)にFemale DNA(Promega,G1521)を3μL(0.75μg)、水(Distilled Water DNAse,RNAse Free、GIBCO)を8μL、BioPrime(R) Array CGH Genomic Labeling Systemの2.5×Random Primers Solution(invitrogen)を20μL入れ、BLOCK INCUBATOR BI−535A(株式会社アステック)上にて、95℃で5分間熱処理を行った。5分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて10分間急冷処理を行った。BioPrime(R) Array CGH Genomic Labeling Systemの10×dCTP Nucleotide Mix(invitrogen)を5μL、Cy3−dCTP Bulk Pack 250nmol(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)を3μL、BioPrime(R) Array CGH Genomic Labeling SystemのExo−Klenow Fragment(invitrogen)を1μL添加し、37℃で2時間BLOCK INCUBATOR BI−535Aにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。2時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、65℃に設定したBLOCK INCUBATOR BI−535Aにて、加熱処理を行い、反応溶液中に含まれているExo−Klenow Fragmentを失活させた。
Cot−1 DNA 65μL(65μg、invitrogen)を1.7mLマイクロチューブに入れ、3M酢酸ナトリウム(pH5.2)を6.5μL、−20℃のエタノールを167μL添加し、混合後、10分間−80℃で放置した。その後、TOMY製遠心機MX−300を用いて、15000rpmで30分間、4℃で遠心を行った。遠心後、沈殿物が遠心チューブの底にたまるので、その沈殿物を吸い込まないように注意しながら、上清を除去した。次に、遠心チューブのフタを開けたまま10分間放置し、残存するエタノールを除去した。10分後、20%SDSを18μL添加し、30分間静置した。30分後、デキストラン硫酸(SIGMA)を1g、ホルムアミドを5mL、20xSSCを1mL混合し、溶解後、水を添加することで液量を7mLとしたもの)を20μL添加し、攪拌することで十分に混合させ、溶液Aを調製した。
なおこの工程は、ユーザーが行うのではなく、キット製造者があらかじめ調製しておくことが好ましい。
<未精製標識核酸の調製>で調製したFemaleの未精製標識核酸を20μL、実施例1と条件を一致させるために添加した水を20μL、溶液Aを38μL、1.7mLマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌(Vortex)処理を行った。また、同様に、<未精製標識核酸の調製>で調製したMaleの未精製標識核酸を20μL、実施例1と条件を一致させるために添加した水を20μL、溶液Aを38μL、1.7mLマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌(Vortex)処理を行った。
市販のBACクローンを大量培養後、イオン交換カラム(QIAGEN社、Plasmid Midi Kit 100 Cat.No.12145)を用いて抽出・精製しBAC DNAを得た。
その後、BAC DNAを4塩基認識酵素、RsaI、DpnI、HaeIIIで消化した後、アダプターを加えてライゲーションをおこなった。
次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、PCR法により増幅することにより、長さ1000〜3000bp程度のプローブDNAが得られた。
得られたプローブDNAをGENESHOT(日本ガイシ株式会社、名古屋)を使用し、ガラス基板へスポットした。
これにより、BACクローンから調製したプローブDNA800種をそれぞれ2つずつガラス基板上にスポットした、合計1600個のスポットを有する核酸マイクロアレイが得られ、以下の実験に用いた。
ブロッキング溶液(松浪硝子工業株式会社)を約200mL、ガラス容器に入れ、そこへ上記核酸マイクロアレイを入れ、20分間SLIDE WASHER,SW−4(十慈フィールド株式会社)を用いて、スライドガラスを上下に移動させながら、ブロッキング反応を行った。20分後、核酸マイクロアレイをブロッキング溶液から取り出し、水200mLを入れた容器の中に入れた。3分間、SLIDE WASHERを用いて洗浄し、3分後、再び新しい水を200mL入れた容器の中に入れ、SLIDE WASHERを用いて洗浄した。
3分後、エタノールを200mL入れた容器の中に移し、再びSLIDE WASHERを用いて洗浄した。3分後、核酸マイクロアレイを取り出し、卓上遠心機スピンドライヤーmini2350(トミー工業株式会社)を用いて遠心を行い、核酸マイクロアレイを乾燥させた。
ブロッキング後、沸騰水に核酸マイクロアレイを2分間浸し、ついで、−20℃の70%エタノールに2分間、−20℃の85%エタノールに2分間、−20℃の100%エタノールに2分間浸し、その後、スピンドライヤーで1分間の遠心を行うことで核酸マイクロアレイを乾燥させた。
ハイブリダイゼーションは、「アレイCGH診断活用ガイドブック 知っておきたい染色体微細構造異常症」(医薬ジャーナル社)に記載されているプロトコール通りに実施した。具体的には、<ハイブリダイゼーション溶液の調製>で調製した二種の試料溶液を、それぞれ75℃で16分間熱処理を行った。その後、42℃で30分以上熱処理を行った。それぞれの溶液を、一枚ずつ核酸マイクロアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス(24×50mm)(松浪硝子工業株式会社)を気泡が入らないように載せた。
この2枚の核酸マイクロアレイをタイトボックスNo.1(蝶プラ工業株式会社)に入れ、そのタイトボックスを37℃で16時間、恒温槽(HYBRIDIZATION INCUBATOR,HB−80、タイテック株式会社)中に入れて、ハイブリダイゼーションを行った。なお、核酸マイクロアレイの乾燥を防ぐために、タイトボックスの中にペーパータオル(キムタオル)を入れ、その上に4mLの50%ホルムアミド/2×SSC溶液を添加した。
ハイブリダイゼーションを行った後、それぞれの核酸マイクロアレイを2×SSCの溶液45mLを入れたスミロンチューブに入れ、カバーグラスが自然に核酸マイクロアレイから剥がれ落ちるまで浸した。次に、カバーグラスが外れたそれぞれの核酸マイクロアレイを、あらかじめ50℃に加熱した45mLの50%ホルムアミド/2×SSC(pH7.0)溶液を入れた50mLのスミロンチューブ(住友ベークライト株式会社)の中に入れた。これを、HYBRIDIZATION INCUBATORの中に入れ、50℃で1分間に30回転のスピードでステージを揺らし、15分間洗浄を行った。次に、あらかじめ50℃に加熱しておいた2×SSC/0.1%SDS(pH7.0)溶液を中に入れたスミロンチューブの中に、それぞれの核酸マイクロアレイに入れた。それを、恒温槽の中に入れ、50℃で1分間に30回転のスピードでステージを揺らし、30分間洗浄を行った。次に、45mLの2×SSC溶液を中に入れた50mLのスミロンチューブの中に、それぞれの核酸マイクロアレイを入れ、室温で1分間に30回転のスピードでステージを揺らすことで5分間洗浄を行った。洗浄後、スピンドライヤー−Mini MODEL2350で1分間の遠心を行うことで核酸マイクロアレイを乾燥させた。
洗浄した二枚のマイクロアレイは、GenePix 4000B(Axon Instruments)を用いて、スキャニングを行った。
未精製標識核酸Cy3−Female由来の蛍光値をFF、そのバックグラウンドノイズをBF、未精製標識核酸Cy3−Male由来の蛍光値をFM、そのバックグラウンドノイズをBMとすると、そのLogRatio値は、
LogRatio=Log2{(FF−BF)÷(FM−BM)}を用いて計算した。なお、すべてのスポットについてLogRatio値を計算した。
なお、本比較例では、バックグラウンドノイズの値を差し引いたが、差し引かなくてもよい場合もある。
また、LogRatio差として、X染色体に相当する部分のLogRatio値から、常染色体に相当する部分のLogRatio値を差し引いたものも計算した。
LogRatio差は、Femaleは2本のX染色体、Maleは1本のX染色体を持つので、その値は理論上、1.0となる。
図2に、LogRatioのグラフを示した。
比較例1の<未精製標識核酸の調製>と同様の方法で、Female由来の核酸、Male由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。
1.7mLマイクロチューブ(プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社)にCot−1 DNAを0.75μg、水を8μL、2.5×Random Primers Solutionを20μL入れ、BLOCK INCUBATOR BI−535A上にて、95℃で5分間熱処理を行った。5分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて10分間急冷処理を行った。10×dCTP Nucleotide Mixを5μL、Cy5−dCTP Bulk Pack 250nmol(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)を3μL、Exo−Klenow Fragmentを1μL添加し、37℃で2時間BLOCK INCUBATOR BI−535Aにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。2時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、65℃に設定したBLOCK INCUBATOR BI−535Aにて、加熱処理を行い、反応溶液中に含まれているExo−Klenow Fragmentを失活させた。
比較例1と同様の方法で、溶液Aの調製を行った。
<未精製標識核酸の調製>で調製した未精製標識試料核酸Cy3−Femaleを20μL、<未精製標識検証核酸の調製>で調製した未精製標識検証核酸Cy5−Cot−1 DNAを20μL、溶液Aを38μL、1.7mLマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌(Vortex)処理を行った。また、同様に、<未精製標識核酸の調製>で調製した未精製標識試料核酸Cy3−Maleを20μL、<未精製標識検証核酸の調製>で調製した未精製標識検証核酸Cy5−Cot−1 DNAを20μL、溶液Aを38μL、1.7mLマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌(Vortex)処理を行った。
比較例1の<核酸マイクロアレイの前処理>と同様の方法で行った。
比較例1の<ハイブリダイゼーション>と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。なお、試料としては、未精製標識試料核酸Cy3−Femaleと未精製標識検証核酸Cy5−Cot1 DNAとの混合物、未精製標識試料核酸Cy3−Maleと未精製標識検証核酸Cy5−Cot1 DNAとの混合物の、それぞれ二種を用いた。
比較例1の<核酸マイクロアレイの洗浄>と同様の方法で核酸マイクロアレイの洗浄を行った。
洗浄した二枚のマイクロアレイは、GenePix 4000B(Axon Instruments)を用いて、スキャニングを行った。
未精製標識試料核酸Cy3−Female由来の蛍光値をFF、そのバックグラウンドノイズをBF、未精製標識試料核酸Cy3−Femaleと同時にハイブリダイゼーションさせた未精製標識検証核酸Cy5−Cot1 DNAの蛍光値をFc1、そのバックグラウンドノイズをBc1、未精製標識試料核酸Cy3−Male由来の蛍光値をFM、そのバックグラウンドノイズをBM、未精製標識試料核酸Cy3−Maleと同時にハイブリダイゼーションさせた未精製標識検証核酸Cy5−Cot1 DNAの蛍光値をFc2、そのバックグラウンドノイズをBc2とすると、補正後のMale由来の未精製標識試料核酸の蛍光値FM’は、
FM’=(Fc1−Bc1)÷(Fc2−Bc2)×(FM−BM)で計算した。計算は、すべてのスポットに対して行った。なお、補正後のFemale由来の未精製標識試料核酸の蛍光値FF’を以下の式によって計算しても良い。
FF’=(Fc2−Bc2)÷(Fc1−Bc1)×(FF−BF)
LogRatio=Log2{(FF−BF)/FM’}で計算した。計算は、すべてのスポットに対して行った。
なお、FF’を計算した場合には、
LogRatio=Log2{FF’/(FM−BM)}を用いて、LogRatio値を計算することができる。
LogRatio差は、比較例1と同様に計算することで得た。
図3にLogRatioのプロットを示した。
比較例1の図2と実施例1の図3とを比較すると、未精製標識検証核酸Cy5−Cot−1 DNAによる補正を行ったものは、常染色体のプロットが全体的に0点付近であった。
図4に、LogRatioの差をプロットした図を示した。なお、LogRatioの差は、比較例1と同様の方法によって求めた。即ち、LogRatio差は、X染色体部分のLogRatioの平均値と常染色体部分のLogRatioの平均値との差から計算した。この差が大きいほど、核酸マイクロアレイ測定としては優れている。補正を行わない場合は、0.38、補正を行った場合には、0.55となり、補正を行うことによって、LogRatio差が約0.17増加した。そもそも、maleとfemaleを比較した際に、X染色体の本数は異なっており、常染色体と差がでるはずである。より差異が明確であれば、コピー数変化をより感度良く捉えることができ、より正しい判断をすることができる。つまり、LogRatioの差が大きいということは検証核酸を使用することの有効性を示しているものである。
図5に、Female由来、Male由来の常染色体部分に相当する部分の常染色体部分のみについて計算した分散の平均値を示した。補正ありの場合の分散は0.189となり、補正なしの分散の0.313と比較して数値が非常に小さく、真値に近づいており、検証核酸を使用することの有効性を示している。
比較例1と同様の方法で、Female由来の核酸、Male由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。なお、Female、MaleともにCy5で標識した。
本実施例では、Female由来の未精製標識核酸を未精製標識検証核酸として用いた。なお、標識化合物として、Cy3を使用した。
比較例1と同様の方法で、溶液Aの調製を行った。
<未精製標識核酸の調製>で調製した未精製標識試料核酸Cy5−Femaleを20μL、<未精製標識検証核酸の調製>で調製した未精製標識検証核酸Cy3−Female DNAを20μL、溶液Aを38μL、1.7mLマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌(Vortex)処理を行った。また、同様に、<未精製標識核酸の調製>で調製した未精製標識試料核酸Cy5−Maleを20μL、<未精製標識検証核酸の調製>で調製した未精製標識検証核酸Cy3−Female DNAを20μL、溶液Aを38μL、1.7mLマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌(Vortex)処理を行った。
比較例1の<核酸マイクロアレイの前処理>と同様の方法で行った。
比較例1の<ハイブリダイゼーション>と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。なお、試料としては、未精製標識試料核酸Cy5−Femaleと未精製標識検証核酸Cy3−Femaleとの混合物、未精製標識試料核酸Cy5−Maleと未精製標識検証核酸Cy3−Femaleとの混合物の、それぞれ二種を用いた。
比較例1の<核酸マイクロアレイの洗浄>と同様の方法で行った。
洗浄した二枚のマイクロアレイは、GenePix 4000B(Axon Instruments)を用いて、スキャニングを行った。
未精製標識試料核酸Cy5−Female由来の蛍光値をFF、そのバックグラウンドノイズをBF、未精製標識試料核酸Cy5−Femaleと同時にハイブリダイゼーションさせた未精製標識検証核酸Cy3−Female DNAの蛍光値をFc1、そのバックグラウンドノイズをBc1、未精製標識試料核酸Cy5−Male由来の蛍光値をFM、そのバックグラウンドノイズをBM、未精製標識試料核酸Cy5−Maleと同時にハイブリダイゼーションさせた未精製標識検証核酸Cy3−Female DNAの蛍光値をFc2、そのバックグラウンドノイズをBc2とすると、補正後のMale由来の未精製標識試料核酸の蛍光値FM’は、
FM’=(Fc1−Bc1)÷(Fc2−Bc2)×(FM−BM)で計算した。計算は、すべてのスポットに対して行った。
LogRatio=Log2{(FF−BF)/FM’}で計算した。計算は、すべてのスポットに対して行った。
LogRatio差は、比較例1と同様に計算することで得た。
図6にLogRatioのプロットを示した。
図3の検証核酸を使用しないものと比べて、常染色体、X染色体の区別がはっきりしており、また、LogRatio値も一定の範囲内に収束しており、本実施例でも検証核酸を使用することの有効性を示している。
比較例1と同様の方法で、Female由来の核酸、Male由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。
Cot−1 DNAを検証核酸として、実施例1と同様の方法で、未精製標識検証核酸Cy5−Cot−1 DNAを調製した。
比較例1と同様の方法で、溶液Aの調製を行った。
実施例1と同様の方法で未精製標識試料核酸および未精製標識検証核酸を含むハイブリダイゼーション溶液を調製した。すなわち、未精製標識試料核酸Cy3−Femaleと未精製標識検証核酸Cy5−Cot−1 DNAを含むハイブリダイゼーション溶液、および未精製標識試料核酸Cy3−Maleと未精製標識検証核酸Cy5−Cot−1
DNAを含むハイブリダイゼーション溶液を調製した。
比較例1の<核酸マイクロアレイの前処理>と同様の方法で行った。
なお、核酸マイクロアレイは、BACクローンから調製した遺伝子を日本ガイシ株式会社にてスポットした、800遺伝子を2スポットずつスポットした、1600スポットのマイクロアレイを使用した。
比較例1の<ハイブリダイゼーション>と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。なお、試料としては、未精製標識試料核酸Cy3−Femaleと未精製標識検証核酸Cy5−Cot−1 DNAとの混合物、未精製標識試料核酸Cy3−Maleと未精製標識検証核酸Cy5−Cot−1 DNAとの混合物の、それぞれ二種を用いた。
比較例1の<核酸マイクロアレイの洗浄>と同様の方法で行った。
洗浄した二枚の核酸マイクロアレイは、GenePix 4000B(Axon Instruments)を用いて、スキャニングを行った。
実施例1の<データ処理>と同様に行った。
本実施例でのスキャン画像を図8に示した。右図の右端の中で縦の列のイメージ画像の濃度が薄くなった。
図8に検証核酸を用いて補正しなかった場合のLogRatioのプロットを示した。
図9に検証核酸を使用して、蛍光値の補正を行った場合のLogRatioのプロットを示した。
図8と図9とを比較すると、図8の場合には、図7の右側のイメージ図の右端の縦の列に由来する読み取り標識量の薄さが原因と考えられ、この領域のスポットのLogRatio値が真値から大幅に異なる値を示している。しかし、このデータに対して、検証核酸による補正値を計算式に含めた図9の結果を見ると、見事にそのデータ変動を低減させることに成功している。
この様に、本発明の方法は、データが大きくばらついた際には、特にその威力を発揮する。
比較例1と同様の方法で、Female由来の核酸、Male由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。なお、標識化合物として、両方とも、Cy3を使用した。
Cy5を標識化合物とし、Cot−1 DNAを検証核酸として、実施例1と同様の方法で、未精製標識検証核酸Cy5−Cot−1 DNAを調製した。
<未精製標識検証核酸の調製>で調製したCy5−Cot−1 DNAを20μL、Cot−1 DNA 65μL(65μg)を1.7mLマイクロチューブに入れ、3M酢酸ナトリウム(pH5.2)を8.5μL、−20℃のエタノールを218μL添加し、混合後、10分間−80℃で放置した。その後、TOMY製遠心機MX−300を用いて、15000rpmで30分間、4℃で遠心を行った。遠心後、沈殿物が遠心チューブの底にたまるので、その沈殿物を吸い込まないように注意しながら、上清を除去した。次に、遠心チューブのフタを開けたまま10分間放置し、残存するエタノールを除去した。10分後、20%SDSを18μL添加し、30分間静置した。30分後、デキストラン硫酸(SIGMA)を1g、ホルムアミドを5mL、20xSSCを1mL混合し、溶解後、水を添加することで液量を7mLとしたものを20μL添加し、攪拌することで沈殿物を溶解すると共に、溶液を十分に混合させ、溶液Bを調製した
この工程は、ユーザーが行うのではなく、キット製造者があらかじめ調製しておくことが好ましい。
<未精製標識核酸の調製>で調製した未精製標識試料核酸Cy3−Femaleを20μL、溶液Bを58μL、1.7mLマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌(Vortex)処理を行った。また、同様に、<未精製標識核酸の調製>で調製した未精製標識試料核酸Cy3−Maleを20μL、溶液Bを58μL、1.7mLマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌(Vortex)処理を行った。
比較例1の<核酸マイクロアレイの前処理>と同様の方法で行った。
比較例1の<ハイブリダイゼーション>と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。なお、試料としては、未精製標識試料核酸Cy3−Femaleと未精製標識検証核酸Cy5−Cot1 DNAとの混合物、未精製標識試料核酸Cy3−Maleと未精製標識検証核酸Cy5−Cot1 DNAとの混合物の、それぞれ二種を用いた。
比較例1の<核酸マイクロアレイの洗浄>と同様の方法で行った。
洗浄した二枚の核酸マイクロアレイは、GenePix 4000B(Axon Instruments)を用いて、スキャニングを行った。
実施例1の<データ処理>と同様に行った。
図10に本実施例のLogRatioのプロットを示した。LogRatio差は、0.644となり、図5の補正ありの結果(実施例1)、0.547と比較して数値が約0.1良くなり、核酸マイクロアレイとしてより性能が良いものとなった。これは、実施例1の場合には、未精製標識検証核酸をそのままハイブリダイゼーション溶液に添加、攪拌したのみであるが、本実施例の場合には、未精製標識検証核酸とハイブリダイゼーション溶液とを混合後、エタノール沈殿、すなわち精製を行っており、精製を行ったことによる効果と、このエタノール沈殿を行うことにより、ハイブリダイゼーション溶液の液量が、実施例1の場合と比較して20μL少ない、すなわち、ハイブリダイゼーション溶液中の核酸濃度増加による効果が原因と考えている。また、分散も、0.134となり、図6の補正ありの結果0.189と比較して小さくなり、より核酸マイクロアレイとしての性能が良くなった。これも同様の原因が理由と考えている。
比較例1と同様の方法で、Female由来の核酸、Male由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。なお、標識化合物として、両方ともCy3を使用した。
Cy5を標識化合物とし、Cot−1 DNAを検証核酸として、実施例1と同様の方法で、未精製標識検証核酸Cy5−Cot−1 DNAを調製した。なお、Cot−1 DNAとして、3μgのCot−1 DNAを使用した。
実施例3の<標識検証核酸を含む溶液の調製>と同様の方法で行った。
実施例3の<ハイブリダイゼーション溶液の調製>と同様の方法で行った。
比較例1の<核酸マイクロアレイの前処理>と同様の方法で行った。
実施例3の<ハイブリダイゼーション>と同様の方法で行った。
比較例1の<核酸マイクロアレイの洗浄>と同様の方法で行った。
洗浄した二枚の核酸マイクロアレイは、GenePix 4000B(Axon Instruments)を用いて、スキャニングを行った。
実施例1の<データ処理>と同様に行った。
図11に検証核酸を使用して、蛍光値の補正を行った場合のLogRatioのプロットを示した。図10と比較して、常染色体がより0に収束している。LogRatio差は、0.641となり、0.75μgのCot−1 DNAを出発とした未精製標識検証核酸を用いた場合の結果(実施例4)の0.644と比較してほぼ同等となった。
本発明では、アレイ間で製造日、製造方法、製造ロット、プロットパターン、固定化プローブ核酸量などが異なっていても、同種のプローブ核酸を用いていれば、その補正を行うことが出来る。その一例として、アレイ上のプロットパターン、すなわち、アレイフォーマットが異なる場合の実施例を以下に示した。
<アレイ1> アレイ1は、16個の遺伝子を4つずつスポットした合計64スポットのアレイである。比較例1などで用いたアレイと同じアレイである。
<アレイ2> アレイ2は、550個の遺伝子を3つずつスポットし、二つのハイブリダイゼーション領域を持つ多検体アレイである。なお、アレイ2のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイザーを用いてハイブリダイゼーションを行った。
試料としてFemale DNAとMale DNAとを用い、検証核酸として、Cot−1 DNAを用い、他の実施例と同様の方法で、試料の標識化、ハイブリダイゼーション、データの取り込みを行った。なお、アレイ2は、多検体アレイであるが、一つのハイブリダイゼーション領域からのデータのみを使用した。また、アレイ1は4つの同一プローブをスポットしているが、比較にはその中の3つを用いた。データは、3点の平均を用い、LogRatioを図示することで評価を行った。
図13にアレイ2同士、すなわち一枚目のアレイにCy3−Female DNAとCy5−Cot−1 DNAを、二枚目のアレイにCy3−Male DNAとCy5−Cot−1 DNAとをハイブリダイゼーションさせ、本発明の方法によって補正した場合の結果である。図の様に、ここでも、十分に常染色体部分とX染色体部分とが分かれている。
図14にアレイ1とアレイ2とを用い、それらの間同士、すなわち一枚目のアレイにCy3−Male DNAとCy5−Cot−1 DNAを、二枚目のアレイにCy3−Female DNAとCy5−Cot−1 DNAとをハイブリダイゼーションさせ、補正を行わなかった場合の結果である。図の様に、常染色体部分とX染色体部分とが全く分かれていない。
図15にアレイ1とアレイ2とを用い、それらの間同士、すなわち一枚目のアレイにCy3−Male DNAとCy5−Cot−1 DNAを、二枚目のアレイにCy3−Female DNAとCy5−Cot−1 DNAとをハイブリダイゼーションさせ、本発明の方法によって補正した場合の結果である。図の様に、十分に常染色体部分とX染色体部分とが分かれている。図14比較すると、本発明による検証核酸を使用することは、非常に有効な方法であり、たとえ、アレイフォーマットが異なっていたとしても十分に補正を行うことが出来ることを示しているものである。更に、アレイ1は、カバーガラスによる手動での静置ハイブリダイゼーション、アレイ2は、ハイブリダイザーによる攪拌型ハイブリダイゼーションと異なるハイブリダイゼーション条件で行っており、これらの結果は、ハイブリダイゼーション条件が異なっていても、本発明の方法を用いることによって、十分に補正を行うことが出来ることを示しているものである。
[実施例1]と同様の方法で、<未精製標識核酸の調製>、<未精製標識検証核酸の調製>、<Cot−1 DNAを含む溶液の調製>、<ハイブリダイゼーション溶液の調製>、<核酸マイクロアレイの前処理>、<ハイブリダイゼーション>、<核酸マイクロアレイの洗浄>を行った。なお、試料は、デジタルデータ供給用のデータとして、正常細胞由来の核酸を想定したCy3−Female DNAと標識検証核酸Cy5−Cot−1 DNAとを使用し、核酸マイクロアレイ上でこれらの核酸をハイブリダイゼーションし、そこから得られたデータをデジタルデータ供給用のデータとした。このデジタルデータを計算した日と別の日に、異常細胞由来の核酸を想定したCy3−Male DNAと標識検証核酸Cy5−Cot−1 DNA(前記の標識検証核酸Cy5−Cot−1 DNAと全く同じものを使用)とを核酸マイクロアレイ(前記の核酸マイクロアレイと同じプローブ、同じプローブ配置をもつもの)上でハイブリダイゼーションし、このデータと前記のデータを用いて、標識検証核酸同士によるCy3−Male DNAの標識量値の補正を[実施例1]の<データ処理>に従って補正した。
<結果>
結果は図16に示した。常染色体部分のデータが0点に収束し、X染色体部分との分離も十分に見られた。
比較例1と同様の方法で、Female由来の核酸、Male由来の核酸から、それぞれ未精製標識試料核酸を調製した。なお、Female、MaleともにCy3で標識した。
本実施例では、ベクター由来の核酸を検証核酸として用いた。
<検証核酸の調整>
RPCI−11 vectorより1クローンを選択し、LB培地に100mg/mLになるようにクロラムフェニコールを添加し、BE−43FL(タイテック社製培養器)を用いて、37℃で1晩培養した。これをQIAgen社のQIAamp miniprep kitを用いてBACを抽出した。抽出したBACをニッポンジーン社の制限酵素NotIを用いて消化し、アガロース電気泳動に供した。7kb附近の断片を切り出し、MN社のNucleospinカラムを用いてアガロース中から精製した。これをインビトロジェン社 T4 DNA ligaseを用いて、4℃で1晩ligarionを実施し、pBAC108Lを取得した。
pBAC108Lをインビトロジェン社 DH−10Bケミカルコンピテントセルに加え、氷上で30分静置後、42℃で30秒加温し、再度氷上に2分静置した。これにSOC培地600μL添加し、100mg/mLクロラムフェニコール入り、LB寒天培地にスプレッターを用いて塗布した。37℃で2晩静置後、生育してきたコロニーをピックアップし、100mg/mLクロラムフェニコール入りLB培地に植菌した。これを37℃で1晩培養後、QIAgen社のQIAprep spin miniprep kitをいてBAC DNAを抽出し、BAC vectorを取得した。これをCy5を使用して標識し、ベクター由来の標識検証核酸を取得した。
比較例1と同様の方法で、溶液Aの調製を行った。
実施例1と同様の方法で調製した未精製標識試料核酸Cy3−Femaleを20μL、実施例1と同様の方法で調製した未精製標識検証核酸Cy3−Female DNAを20μL、溶液Aを38μL、1.7mLマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌(Vortex)処理を行った。また、同様に、<未精製標識核酸の調製>で調製した未精製標識試料核酸Cy3−Maleを20μL、<検証核酸の調整>で調製したベクター由来の標識検証核酸を20μL、溶液Aを38μL、1.7mLマイクロチューブの中に入れ、十分に攪拌(Vortex)処理を行った。
比較例1の<核酸マイクロアレイの前処理>と同様の方法で行った。
比較例1の<ハイブリダイゼーション>と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。但し、ハイブリダイゼーション装置としてアロカ社製 HS-300を用いた。また、試料としては、未精製標識試料核酸Cy3−Femaleと上記ベクター由来の標識検証核酸との混合物、未精製標識試料核酸Cy3−Maleとベクター由来の標識検証核酸との混合物の、それぞれ二種を用いた。
比較例1の<核酸マイクロアレイの洗浄>と同様の方法で行った。
洗浄した二枚のマイクロアレイは、GenePix 4000B(Axon Instruments)を用いて、スキャニングを行った。
未精製標識試料核酸Cy3−Female由来の蛍光値をFF、未精製標識試料核酸Cy3−Femaleと同時にハイブリダイゼーションさせたベクター由来の標識検証核酸の蛍光値をFc1、未精製標識試料核酸Cy3−Male由来の蛍光値をFM、未精製標識試料核酸Cy3−Maleと同時にハイブリダイゼーションさせたベクター由来の標識検証核酸の蛍光値をFc2とし、log2(FM/Fc2/FF×Fc1)で計算し、プローブの染色体ごとに並べた。また、同じプローブの値については平均化しグラフ化した。
結果を図17に示す。log2(FM/Fc2/FF×Fc1)の数値が常染色体はほぼ±0.25内に収まり、X染色体についてはほぼ0.6以上の差となり、高い感度で検出が出来た。
Claims (20)
- 核酸マイクロアレイを用いた解析方法であって、
該核酸マイクロアレイが第1のプローブ核酸が固定化されているスポット(X1)を有し、
検体の標識試料核酸(A1)を、スポット(X1)に固定化された該第1のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、前記標識試料核酸とは異なる標識で標識されている標識検証核酸(B)を、スポット(X1)に付与し、少なくとも前記第1のプローブ核酸とハイブリダイズさせる工程、
スポット(X1)にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値(F1)を測定する工程、及び、
スポット(X1)上にハイブリダイズした該標識検証核酸(B)の標識量値(Fc1)を測定する工程を含むことを特徴とする、解析方法。 - 該標識試料核酸をハイブリダイゼーションさせる工程と、前記標識検証核酸(B)をハイブリダイゼーションさせる工程とが同時に行われ、かつ、
該ハイブリダイズした該標識試料核酸の量を測定する工程と、前記ハイブリダイズした検証核酸の量を測定する工程とが同時に行われることを特徴とする、請求項1に記載の解析方法。 - 前記(Fc1)に基づき、スポット(X1)における固定された第1のプローブ核酸の量を検知し、該検知量により前記(F1)を補正することを特徴とする、請求項1または2に記載の解析方法。
- スポット(X1)と同じ核酸マイクロアレイ上または異なるアレイ上に存在する、スポット(X1)に固定化された前記第1のプローブと実質的に同一の配列を有する第nのプローブ核酸が固定化されたスポット(Xn)において、
前記標識試料核酸と同一または異なる標識試料核酸(An)を、スポット(Xn)に固定化された該第nのプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程、
前記標識検証核酸(B)を、スポット(Xn)に付与し、ハイブリダイズさせる工程、
スポット(Xn)にハイブリダイズした該標識試料核酸の標識量値(Fn)を測定する工程、及び、
スポット(Xn)上にハイブリダイズした該標識検証核酸(B)の標識量値(Fcn)を測定する工程、
を含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の解析方法。 - 標識量値(Fc1)と(Fcn)とを対比することでスポット(X1)とスポット(Xn)とにおける標識量値の係数を算出する工程を含むことを特徴とする、請求項4に記載の解析方法。
- 標識試料核酸(A1)と標識試料核酸(An)とが異なる試料から得られた核酸を標識したものであることを特徴とする請求項4または5に記載の解析方法。
- 前記標識検証核酸(B)をハイブリダイゼーションさせる工程において、更に、標識化合物を結合する前の標識検証核酸(B)と同一種の未標識核酸が添加されていることを特徴とする請求項1〜6のいずれかの解析方法。
- スポット(Xn)における標識試料核酸(An)がハイブリダイズした量に相当する補正標識量値を、下記式(1)を用いて算出することを特徴とする、請求項4〜7のいずれかの解析方法。
式(1) 標識試料核酸(An)の補正標識量値=前記(Fc1)÷前記(Fcn)×第nの標識試料核酸(An)の標識量値 (nは2以上の整数) - 標識試料核酸(A1)と標識検証核酸(B)における標識の少なくとも一方が蛍光によるものであることを特徴とする、請求項1〜8のいずれかの解析方法。
- 核酸マイクロアレイとして、BAC−DNAマイクロアレイを使用することを特徴とする、請求項1〜9のいずれかの解析方法。
- 複数の同種のスポット(Xn)が異なる核酸マイクロアレイに存在し、それぞれの核酸マイクロアレイ間のプローブ核酸の配置、プローブ核酸のスポット量が、それぞれの核酸マイクロアレイで異なっていることを特徴とする、請求項1〜10のいずれかの解析方法。
- 標識検証核酸(B)として、検体の核酸とは異なり、第1及び第nのプローブ核酸上の配列を持つ核酸を用いる請求項1〜11のいずれかの解析方法。
- 標識検証核酸(B)として、反復配列を含む核酸を使用することを特徴とする、請求項1〜12のいずれかの解析方法。
- 標識検証核酸(B)として、Cot−1 DNAを使用することを特徴とする、請求項1〜13のいずれかの解析方法。
- 標識検証核酸(B)として、ベクター由来の核酸を使用することを特徴とする、請求項1〜12のいずれかの解析方法。
- 標識量値(F1)および(Fc1)のうち、標識量値(Fc1)がデジタルデータにより供給されることを特徴とする、請求項1〜15のいずれかの解析方法。
- 請求項5〜16のいずれかに記載の解析方法における、標識試料核酸(An)(nは2以上の整数)の標識量値(Fn)を、標識検証核酸(B)の標識量値(Fc1)及び標識量値(Fcn)を用いて補正するデータ処理をコンピュータに実行するためのプログラム。
- 請求項17に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
- 請求項1〜16の解析方法を用いて、検体間の遺伝子発現量もしくは検体間の遺伝子コピー数を計算する方法。
- プローブ核酸が固定化されているスポットを複数有する核酸マイクロアレイ、及び、該核酸マイクロアレイ上の全てのスポットにおいて少なくとも各プローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有する検証核酸、を含む請求項1〜16のいずれかの解析方法用のキット。
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Cited By (1)
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WO2011030838A1 (ja) | 2009-09-10 | 2011-03-17 | 富士フイルム株式会社 | アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による核酸変異解析法 |
Families Citing this family (2)
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---|---|---|---|---|
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002052038A2 (en) * | 2000-12-27 | 2002-07-04 | Geneka Biotechnology Inc. | Method for normalizing the relative intensities of detection signals in hybridization arrays |
JP2004028695A (ja) * | 2002-06-24 | 2004-01-29 | Canon Inc | 含有量検定用標準プローブを持つdnaマイクロアレイ及び検出用キット |
WO2007097876A2 (en) * | 2006-02-15 | 2007-08-30 | Agilent Technologies, Inc. | Normalization probes for comparative genome hybridization arrays |
Family Cites Families (4)
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---|---|---|---|---|
US20050153290A1 (en) * | 2001-12-21 | 2005-07-14 | Van Beuningen Marinus Gerardus J. | Normalisation of microarray data based on hybridisation with an internal reference |
WO2004001412A1 (ja) | 2002-06-24 | 2003-12-31 | Canon Kabushiki Kaisha | 標準プローブを持つdnaマイクロアレイ及び該アレイを有するキット |
EP1722309A1 (en) | 2005-05-12 | 2006-11-15 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenschaften E.V. | Method of normalizing gene expression data |
US7660675B2 (en) * | 2006-07-24 | 2010-02-09 | Agilent Technologies, Inc. | Method and system for analysis of array-based, comparative-hybridization data |
-
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002052038A2 (en) * | 2000-12-27 | 2002-07-04 | Geneka Biotechnology Inc. | Method for normalizing the relative intensities of detection signals in hybridization arrays |
JP2004028695A (ja) * | 2002-06-24 | 2004-01-29 | Canon Inc | 含有量検定用標準プローブを持つdnaマイクロアレイ及び検出用キット |
WO2007097876A2 (en) * | 2006-02-15 | 2007-08-30 | Agilent Technologies, Inc. | Normalization probes for comparative genome hybridization arrays |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6013049148; PNAS Vol. 99, No. 11, 2002, pp.7554-7559 * |
JPN6013049152; Laboratory Investigation Vol. 82, No. 1, 2002, pp.47-60 * |
JPN6013049153; Human Molecular Genetics Vol. 12, 2003, pp.R145-R152 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011030838A1 (ja) | 2009-09-10 | 2011-03-17 | 富士フイルム株式会社 | アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による核酸変異解析法 |
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