CN117843696A - 一种寡聚核苷酸引物的合成工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，属于核酸合成技术领域，包括如下步骤：第一步、将干燥氯甲基化聚苯乙烯树脂加入甲苯中，溶胀后，加入对二氨基偶氮苯，在70℃条件下搅拌反应，得到微球；在微球表面负载保护基得到固相载体；第二步、合成引物：在固相载体上完成引物的合成，得到引物粗产物；氨解反应：将含有引物粗产物的固相载体放入氨解液中，进行氨解；所述氨解在紫外光和可见光交替下进行；第三步、纯化引物。合成工艺中的氨基过程效率更高，氨解条件更加温和，引物合成过程中不易产生错误序列，且产物纯度比较高。
Description
技术领域
本发明属于核酸合成技术领域，具体涉及一种寡聚核苷酸引物的合成工艺。
背景技术
目前，oligoDNA的合成一般都采用固相亚磷酰胺三酯法，亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上，经过四步循环反应：脱保护、耦联、加帽、氧化，逐一将一个一个核苷酸单体连接上去，最终完成DNA链的合成。此法具有高效、快速偶联、起始反应物比较稳定的优点。
该方法的特点：
·第一个核苷酸是3’固定在固相载体上；
·每一个核苷酸依次连接上去；
·DNA合成的方向是3’→5’；
·合成是在疏水环境中进行。
在所有合成循环结束后，就得到一个目标DNA片段粗品，首先需经过氨解步骤，然后再通过各种方式进行纯化。其中氨解包括切割步骤：将合成好的寡聚核苷酸从固体载体(CPG)上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG上连接化合物与初始核苷间的酯键。
氨解的问题主要包括反应时间长，55℃反应需要16h，65℃反应需要8h，生产效率低，在高温高压的反应条件下进行氨解反应。气相氨解的优势在于反应快速高效、操作简单，但是存在对设备要求高、需要使用有毒气体、存在安全隐患、污染环境、对引物的结构破坏性较大的缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，以解决氨解反应速率慢的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，包括如下步骤：
第一步、将干燥氯甲基化聚苯乙烯树脂加入甲苯中，溶胀后，加入对二氨基偶氮苯，在70℃条件下搅拌反应，反应结束后，乙醇抽提、洗涤、干燥，得到微球；在微球表面负载保护基得到固相载体；
第二步、合成引物：在固相载体上完成引物的合成，得到引物粗产物；氨解反应：将含有引物粗产物的固相载体放入氨解液中，进行氨解；所述氨解在紫外光和可见光交替下进行；
第三步、纯化引物。
进一步地，所述氨解液包括有机胺、醇和碱性水溶液；有机胺、醇和碱性水溶液的用量质量比为5：1：0.1；有机胺包括二亚乙基三胺和三(2-氨基乙基)胺；醇包括甲醇和乙醇；碱性水溶液为1mol/L的氢氧化钠、1mol/L氢氧化钾水溶液。氨解液中的有机胺更加温和，并且氨解液中加入了适量的碱性水溶液，提供了充足的氢氧根离子，不仅可以提高反应速率，而且可以避免常规氨水作为氨解液时存在残留的情况。
进一步地，紫外光和可见光交替下进行：紫外光(UV＜366nm)照射10min；可见光(可见光＞400nm)照射10min。
进一步地，所述含有核酸的固相载体的制备方法为固相亚磷酰胺法，具体步骤如下：
采用脱保护剂对固相载体表面的保护基进行脱保护反应；将带有保护基的核酸片段与羟基进行偶联反应，得到偶联物；对偶联物进行氧化反应，得到氧化产物；对氧化产物进行盖帽反应，得到含有引物粗产物的固相载体。
进一步地，所述纯化包括HPLC纯化、OPC纯化、脱盐纯化。
进一步地，所述保护基为4,4′-二甲氧三苯甲基。(在微球表面负载保护基得到固相载体的步骤参照梁洪；李鹏；张竞；苏志国.聚苯乙烯基质RNA固相有机合成载体的制备与性能表征[J].过程工程学报,2009,9(04):770-775.中的氨甲基聚苯乙烯载体与间臂的偶联)。
进一步地，所述氯甲基化聚苯乙烯树脂的氯含量为4meq/gm；所述氯甲基化聚苯乙烯树脂的粒度为50-60μm。
进一步地，所述氯甲基化聚苯乙烯树脂和对二氨基偶氮苯的用量质量比为12：0.8-1。
进一步地，所述氨解温度为50-65℃。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，其中涉及的氨基过程效率更高，氨解条件更加温和，引物合成过程中不易产生错误序列，且产物纯度比较高。
本发明中的寡聚核苷酸引物的合成工艺采用固相合成，其中固相载体中引入了偶氮结构，利用自制的固相载体，结合紫外光照提高氨解过程中的效率。在光照条件下，使固相载体中偶氮苯中共价键的结构从反式变成顺式，这种异构化作用所产生的扭转力，可以提高引物脱离固相载体的效率，进而缩短。氨解过程时间，提高氨解效率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，包括如下步骤：
第一步、将6g干燥氯甲基化聚苯乙烯树脂(肽合成用Merrifield树脂-－进口杜笙(Tulsion)CMB-200)加入100mL甲苯中，溶胀12h后，加入0.5g对二氨基偶氮苯，在70℃条件下搅拌反应24h，反应结束后，用无水乙醇抽提，随后依次应0.1mol/L的氢氧化钠溶液、水洗至无氯离子，60℃真空干燥，得到微球；所述氯甲基化聚苯乙烯树脂的氯含量为4meq/gm；所述氯甲基化聚苯乙烯树脂的粒度为50-60μm；所述氯甲基化聚苯乙烯树脂和对二氨基偶氮苯的用量质量比为12：0.8。
在微球表面负载保护基得到固相载体；所述保护基为4,4′-二甲氧三苯甲基(在微球表面负载保护基得到固相载体的步骤参照梁洪；李鹏；张竞；苏志国.聚苯乙烯基质RNA固相有机合成载体的制备与性能表征[J].过程工程学报,2009,9(04):770-775.中的氨甲基聚苯乙烯载体与间臂的偶联)；
第二步、合成引物：在固相载体上完成引物的合成，采用脱保护剂对固相载体表面的保护基进行脱保护反应；将带有保护基的核酸片段与羟基进行偶联反应，得到偶联物；对偶联物进行氧化反应，得到氧化产物；对氧化产物进行盖帽反应，得到含有引物粗产物的固相载体；氨解反应：将含有引物粗产物的固相载体放入氨解液中，进行氨解；所述氨解在紫外光和可见光交替下进行，紫外光(UV＜366nm)照射10min；可见光(可见光＞400nm)照射10min。氨解温度为50℃，所述氨解液包括有机胺、醇和碱性水溶液；有机胺、醇和碱性水溶液的用量质量比为5：1：0.1；有机胺为二亚乙基三胺；醇为乙醇；碱性水溶液为1mol/L的氢氧化钠。
第三步、HPLC纯化引物。
实施例2
一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，包括如下步骤：
第一步、将6g干燥氯甲基化聚苯乙烯树脂(肽合成用Merrifield树脂--进口杜笙(Tulsion)CMB-200)加入100mL甲苯中，溶胀12h后，加入0.5g对二氨基偶氮苯，在70℃条件下搅拌反应24h，反应结束后，用无水乙醇抽提，随后依次应0.1mol/L的氢氧化钠溶液、水洗至无氯离子，60℃真空干燥，得到微球；所述氯甲基化聚苯乙烯树脂的氯含量为4meq/gm；所述氯甲基化聚苯乙烯树脂的粒度为50-60μm；所述氯甲基化聚苯乙烯树脂和对二氨基偶氮苯的用量质量比为12：0.9。
在微球表面负载保护基得到固相载体；所述保护基为4,4′-二甲氧三苯甲基(在微球表面负载保护基得到固相载体的步骤参照梁洪；李鹏；张竞；苏志国.聚苯乙烯基质RNA固相有机合成载体的制备与性能表征[J].过程工程学报,2009,9(04):770-775.中的氨甲基聚苯乙烯载体与间臂的偶联)；
第二步、合成引物：在固相载体上完成引物的合成，采用脱保护剂对固相载体表面的保护基进行脱保护反应；将带有保护基的核酸片段与羟基进行偶联反应，得到偶联物；对偶联物进行氧化反应，得到氧化产物；对氧化产物进行盖帽反应，得到含有引物粗产物的固相载体；氨解反应：将含有引物粗产物的固相载体放入氨解液中，进行氨解；所述氨解在紫外光和可见光交替下进行，紫外光(UV＜366nm)照射10min；可见光(可见光＞400nm)照射10min。氨解温度为55℃，所述氨解液包括有机胺、醇和碱性水溶液；有机胺、醇和碱性水溶液的用量质量比为5：1：0.1；有机胺为二亚乙基三胺；醇为乙醇；碱性水溶液为1mol/L的氢氧化钠。
第三步、HPLC纯化引物。
实施例3
一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，包括如下步骤：
第一步、将6g干燥氯甲基化聚苯乙烯树脂(肽合成用Merrifield树脂--进口杜笙(Tulsion)CMB-200)加入100mL甲苯中，溶胀12h后，加入0.5g对二氨基偶氮苯，在70℃条件下搅拌反应24h，反应结束后，用无水乙醇抽提，随后依次应0.1mol/L的氢氧化钠溶液、水洗至无氯离子，60℃真空干燥，得到微球；所述氯甲基化聚苯乙烯树脂的氯含量为4meq/gm；所述氯甲基化聚苯乙烯树脂的粒度为50-60μm；所述氯甲基化聚苯乙烯树脂和对二氨基偶氮苯的用量质量比为12：1。
在微球表面负载保护基得到固相载体；所述保护基为4,4′-二甲氧三苯甲基(在微球表面负载保护基得到固相载体的步骤参照梁洪；李鹏；张竞；苏志国.聚苯乙烯基质RNA固相有机合成载体的制备与性能表征[J].过程工程学报,2009,9(04):770-775.中的氨甲基聚苯乙烯载体与间臂的偶联)；
第二步、合成引物：在固相载体上完成引物的合成，采用脱保护剂对固相载体表面的保护基进行脱保护反应；将带有保护基的核酸片段与羟基进行偶联反应，得到偶联物；对偶联物进行氧化反应，得到氧化产物；对氧化产物进行盖帽反应，得到含有引物粗产物的固相载体；氨解反应：将含有引物粗产物的固相载体放入氨解液中，进行氨解；所述氨解在紫外光和可见光交替下进行，紫外光(UV＜366nm)照射10min；可见光(可见光＞400nm)照射10min。氨解温度为65℃，所述氨解液包括有机胺、醇和碱性水溶液；有机胺、醇和碱性水溶液的用量质量比为5：1：0.1；有机胺为二亚乙基三胺；醇为乙醇；碱性水溶液为1mol/L的氢氧化钠。
第三步、HPLC纯化引物。
对比例1
本对比例与实施例3相比，合成引物步骤中采用CPG固相载体(载量为35μmmol/g)。
对比例2
本对比例与对比例1相比，氨解反应步骤中采用浓氨水(浓度为26％)进行氨解。
对实施例1-实施例3和对比例1-对比例2进行性能测试，对实施例和对比例中氨解时长进行统计分析；
使用LTQ-XL质谱仪进行质谱分析；使用岛津LC-MS-2020高效液相色谱仪，进行纯度分析，结果如表1所示：
表1
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 |
| 时间/h | 2.51 | 2.52 | 2.50 | 7.6 | 8.2 |
| 纯度 | 98.6 | 98.2 | 98.7 | 95.5 | 95.1 |
由表1可以看出，按照本发明中提供的方法得到产物纯度高，并且氨解过程效率更高，氨解条件更加温和。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，其特征在于，包括如下步骤：
第一步、将干燥氯甲基化聚苯乙烯树脂加入甲苯中，溶胀后，加入对二氨基偶氮苯搅拌反应，反应结束后，经过抽提、洗涤、干燥，得到微球；在微球表面负载保护基得到固相载体；
第二步、合成引物：在固相载体上完成引物的合成，得到引物粗产物；氨解反应：将含有引物粗产物的固相载体放入氨解液中，进行氨解；所述氨解在紫外光和可见光交替下进行；
第三步、纯化引物。
2.根据权利要求1所述的一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，其特征在于，所述氨解液包括有机胺、醇和碱性水溶液；有机胺、醇和碱性水溶液的用量质量比为5：1：0.1；有机胺包括二亚乙基三胺和三(2-氨基乙基)胺；醇包括甲醇和乙醇；碱性水溶液为1mol/L的氢氧化钠、1mol/L氢氧化钾水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，其特征在于，紫外光和可见光交替下进行：紫外光照射10min；可见光照射10min。
4.根据权利要求1所述的一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，其特征在于，所述含有核酸的固相载体的制备方法为固相亚磷酰胺法，具体步骤如下：
采用脱保护剂对固相载体表面的保护基进行脱保护反应；将带有保护基的核酸片段与羟基进行偶联反应，得到偶联物；对偶联物进行氧化反应，得到氧化产物；对氧化产物进行盖帽反应，得到含有引物粗产物的固相载体。
5.根据权利要求1所述的一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，其特征在于，所述纯化包括HPLC纯化、OPC纯化、脱盐纯化。
6.根据权利要求1所述的一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，其特征在于，所述保护基为4,4′-二甲氧三苯甲基。
7.根据权利要求1所述的一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，其特征在于，所述氯甲基化聚苯乙烯树脂的氯含量为4meq/gm；所述氯甲基化聚苯乙烯树脂的粒度为50-60μm。
8.根据权利要求1所述的一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，其特征在于，所述氯甲基化聚苯乙烯树脂和对二氨基偶氮苯的用量质量比为12：0.8-1。
9.根据权利要求1所述的一种寡聚核苷酸引物的合成工艺，其特征在于，所述氨解温度为50-65℃。
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