JPH06169762A - 安定化リボザイム - Google Patents
安定化リボザイムInfo
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- JPH06169762A JPH06169762A JP25824192A JP25824192A JPH06169762A JP H06169762 A JPH06169762 A JP H06169762A JP 25824192 A JP25824192 A JP 25824192A JP 25824192 A JP25824192 A JP 25824192A JP H06169762 A JPH06169762 A JP H06169762A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】下記の式(I)で表される安定化リボザイム。
【化1】
(式(I)中、A、G、C及びUはそれぞれ(アデニ
ン、グアニン、シトシン及びウラシル)モノリボヌクレ
オチドを表し、網掛けのA、G及びCはそれぞれ(アデ
ニン、グアニン及びシトシン)モノデオキシリボヌクレ
オチドを表し、網掛けのXは(アデニン、グアニン、シ
トシン又はチミンいずれか)任意のモノデオキシリボヌ
クレオチドを表し、sはチオリン酸エステル結合〔−O
−P(=S)(OH)−O−又は−O−P(=O)(S
H)−O−〕を表し、m及びnはそれぞれ異ってもよい
1又は2以上の整数を表し、*は相補的なヌクレオチド
間の塩基対を表す。) 【効果】従来のリボザイムと同様にRNA分解活性を維
持しながら、かつRNA分解酵素等に対して抵抗性を有
する、新規な安定化リボザイムを提供する。
ン、グアニン、シトシン及びウラシル)モノリボヌクレ
オチドを表し、網掛けのA、G及びCはそれぞれ(アデ
ニン、グアニン及びシトシン)モノデオキシリボヌクレ
オチドを表し、網掛けのXは(アデニン、グアニン、シ
トシン又はチミンいずれか)任意のモノデオキシリボヌ
クレオチドを表し、sはチオリン酸エステル結合〔−O
−P(=S)(OH)−O−又は−O−P(=O)(S
H)−O−〕を表し、m及びnはそれぞれ異ってもよい
1又は2以上の整数を表し、*は相補的なヌクレオチド
間の塩基対を表す。) 【効果】従来のリボザイムと同様にRNA分解活性を維
持しながら、かつRNA分解酵素等に対して抵抗性を有
する、新規な安定化リボザイムを提供する。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、安定化リボザイムに関
するものであり、更に詳しくは、標的RNAを特異的に
切断するリボザイムの機能は維持したまま、リボザイム
を人為的に改変して安定化分子もしくは構造とした安定
化リボザイムに関するものであり、これは医薬、動物
薬、農薬あるいは試薬等に有効に利用されうるものであ
る。
するものであり、更に詳しくは、標的RNAを特異的に
切断するリボザイムの機能は維持したまま、リボザイム
を人為的に改変して安定化分子もしくは構造とした安定
化リボザイムに関するものであり、これは医薬、動物
薬、農薬あるいは試薬等に有効に利用されうるものであ
る。
【0002】
【従来の技術】従来、すべての酵素はタンパク質から構
成されていると確信されていたが、1981年に酵素活
性を有するRNA分子、すなわちリボザイムが発見さ
れ、従来の酵素に関する概念は打ち破られた。この画期
的発見はコロラド大学のチェック(T. Chech)らによっ
てなされたもので、原生動物のテトラヒメナのリボソー
ムRNA(rRNA)前駆体はタンパク質の力を借りず
に、遺伝情報を伝達する上で不必要なイントロン(IV
S)をセルフスプライシングで取り除くことが証明され
た(Cell ,Vol.31, p.147-157(1982);Nature ,Vol.308,
p.820-825(1984))。その後、ホスホジエステル結合を
セルフスプライシングする触媒機能を有するRNA分子
が次々と見出されているほか、他のRNA分子を切断す
るRNA分子(リボザイム)も見つかっている。
成されていると確信されていたが、1981年に酵素活
性を有するRNA分子、すなわちリボザイムが発見さ
れ、従来の酵素に関する概念は打ち破られた。この画期
的発見はコロラド大学のチェック(T. Chech)らによっ
てなされたもので、原生動物のテトラヒメナのリボソー
ムRNA(rRNA)前駆体はタンパク質の力を借りず
に、遺伝情報を伝達する上で不必要なイントロン(IV
S)をセルフスプライシングで取り除くことが証明され
た(Cell ,Vol.31, p.147-157(1982);Nature ,Vol.308,
p.820-825(1984))。その後、ホスホジエステル結合を
セルフスプライシングする触媒機能を有するRNA分子
が次々と見出されているほか、他のRNA分子を切断す
るRNA分子(リボザイム)も見つかっている。
【0003】このような中で、最近、ハセロフ(J. Hase
loff)とジャーラック(W.L.Gerlach)は、数種の植物ウイ
ルスのリボザイムの間で共通に保存されている塩基配列
に着目し、標的RNA結合領域を除くリボザイム分子の
大きさがわずか24塩基で構成された短鎖リボザイム
を、遺伝子操作技術及び酵素の手法を用いて構築するこ
とに成功した(Nature ,Vol.334,p.585-591(1988);特
表平3-502638号公報)。また、大塚らは非自己のRNA
分子の切断を触媒する活性な短鎖リボザイムを化学合成
で調製している(特開平2−195883号公報)。
loff)とジャーラック(W.L.Gerlach)は、数種の植物ウイ
ルスのリボザイムの間で共通に保存されている塩基配列
に着目し、標的RNA結合領域を除くリボザイム分子の
大きさがわずか24塩基で構成された短鎖リボザイム
を、遺伝子操作技術及び酵素の手法を用いて構築するこ
とに成功した(Nature ,Vol.334,p.585-591(1988);特
表平3-502638号公報)。また、大塚らは非自己のRNA
分子の切断を触媒する活性な短鎖リボザイムを化学合成
で調製している(特開平2−195883号公報)。
【0004】図1は短鎖リボザイムの構造と作用部位を
説明するものである。リボザイムは、標的であるRNA
分子の塩基配列を認識して塩基対を形成する結合領域C
と、24個の特定の塩基配列を有する領域B(A、G又
はUを丸印で囲った触媒活性部位を含む)から構成され
ており、標的RNAは標的RNA中のA領域(GUC)
に隣接する位置(図1中、矢印で示す)で切断される。
なお、このA領域の配列はGUCのみではなく、他の配
列でも切断されることが知られている。
説明するものである。リボザイムは、標的であるRNA
分子の塩基配列を認識して塩基対を形成する結合領域C
と、24個の特定の塩基配列を有する領域B(A、G又
はUを丸印で囲った触媒活性部位を含む)から構成され
ており、標的RNAは標的RNA中のA領域(GUC)
に隣接する位置(図1中、矢印で示す)で切断される。
なお、このA領域の配列はGUCのみではなく、他の配
列でも切断されることが知られている。
【0005】リボザイムは、リボザイムの核酸塩基配列
に基づいてリボザイムRNAをコードするDNAを合成
し、これをプラスミドに挿入し、更にこの組換えプラス
ミドを形質転換して得られるクローンを適当な制限酵素
で切断してリボザイムRNAをコードするDNA断片を
取得し、これを鋳型としてイン・ビトロ(in vitro)で
転写することにより、あるいは化学的合成法によってリ
ボヌクレオチドを順次連結することにより得られること
は前記の文献中に記載されている。
に基づいてリボザイムRNAをコードするDNAを合成
し、これをプラスミドに挿入し、更にこの組換えプラス
ミドを形質転換して得られるクローンを適当な制限酵素
で切断してリボザイムRNAをコードするDNA断片を
取得し、これを鋳型としてイン・ビトロ(in vitro)で
転写することにより、あるいは化学的合成法によってリ
ボヌクレオチドを順次連結することにより得られること
は前記の文献中に記載されている。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】自然界にはRNA分解
酵素が広く分布している。リボザイムはこのRNA分解
酵素によって容易に分解を受け失活するので、安定性に
問題がある。本発明は、リボザイムの特異的なRNA分
解活性を維持したままで、RNA分解酵素の攻撃に対し
抵抗性を有する安定な修飾リボザイム、すなわち安定化
リボザイムを提供し、医薬、動物薬、農薬あるいは試薬
等に有効に利用することを目的とする。
酵素が広く分布している。リボザイムはこのRNA分解
酵素によって容易に分解を受け失活するので、安定性に
問題がある。本発明は、リボザイムの特異的なRNA分
解活性を維持したままで、RNA分解酵素の攻撃に対し
抵抗性を有する安定な修飾リボザイム、すなわち安定化
リボザイムを提供し、医薬、動物薬、農薬あるいは試薬
等に有効に利用することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明者らはリボザイムを安定化する種々の修飾方
法を検討した結果、リボザイムのリン酸エステル結合
〔−O−P(=O)(OH)−O−〕の一又は二以上
を、チオリン酸エステル結合〔−O−P(=S)(O
H)−O−又は−O−P(=O)(SH)−O−〕とす
ることにより、あるいはそれに加えて、リボザイムを構
成する分子もしくは構造の非触媒領域(図1において、
A、G又はUを丸印で囲った部位以外の領域)内で、構
成するモノリボヌクレオチドの一又は二以上を、それに
相当するモノデオキシリボヌクレオチドに置換すること
により、リボザイムはその特異的なRNA分解活性を維
持したままで、RNA分解酵素の攻撃に対して抵抗性を
有する安定な修飾リボザイム、すなわち安定化リボザイ
ムとなることを見出し、本発明を完成した。
め、本発明者らはリボザイムを安定化する種々の修飾方
法を検討した結果、リボザイムのリン酸エステル結合
〔−O−P(=O)(OH)−O−〕の一又は二以上
を、チオリン酸エステル結合〔−O−P(=S)(O
H)−O−又は−O−P(=O)(SH)−O−〕とす
ることにより、あるいはそれに加えて、リボザイムを構
成する分子もしくは構造の非触媒領域(図1において、
A、G又はUを丸印で囲った部位以外の領域)内で、構
成するモノリボヌクレオチドの一又は二以上を、それに
相当するモノデオキシリボヌクレオチドに置換すること
により、リボザイムはその特異的なRNA分解活性を維
持したままで、RNA分解酵素の攻撃に対して抵抗性を
有する安定な修飾リボザイム、すなわち安定化リボザイ
ムとなることを見出し、本発明を完成した。
【0008】すなわち、本発明は下記の(1)〜(5)
に関するものである。 (1)次式(I)で表される安定化リボザイム。
に関するものである。 (1)次式(I)で表される安定化リボザイム。
【化2】 (式(I)中、A、G、C、及びUはそれぞれアデニン
モノリボヌクレオチド、グアニンモノリボヌクレオチ
ド、シトシンモノリボヌクレオチド、ウラシルモノリボ
ヌクレオチドを表し、網掛けのA、網掛けのG及び網掛
けのCはそれぞれアデニンモノデオキシリボヌクレオチ
ド、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド、シトシン
モノデオキシリボヌクレオチドを表し、網掛けのXはア
デニンモノデオキシリボヌクレオチド、グアニンモノデ
オキシリボヌクレオチド、シトシンモノデオキシリボヌ
クレオチド、チミンモノデオキシリボヌクレオチドのい
ずれか任意のモノデオキシリボヌクレオチドを表し、s
はチオリン酸エステル結合〔−O−P(=S)(OH)
−O−又は−O−P(=O)(SH)−O−〕を表し、
m及びnはそれぞれ異ってもよい1又は2以上の以上の
整数を表し、*は相補的なヌクレオチド間の塩基対を表
す。)
モノリボヌクレオチド、グアニンモノリボヌクレオチ
ド、シトシンモノリボヌクレオチド、ウラシルモノリボ
ヌクレオチドを表し、網掛けのA、網掛けのG及び網掛
けのCはそれぞれアデニンモノデオキシリボヌクレオチ
ド、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド、シトシン
モノデオキシリボヌクレオチドを表し、網掛けのXはア
デニンモノデオキシリボヌクレオチド、グアニンモノデ
オキシリボヌクレオチド、シトシンモノデオキシリボヌ
クレオチド、チミンモノデオキシリボヌクレオチドのい
ずれか任意のモノデオキシリボヌクレオチドを表し、s
はチオリン酸エステル結合〔−O−P(=S)(OH)
−O−又は−O−P(=O)(SH)−O−〕を表し、
m及びnはそれぞれ異ってもよい1又は2以上の以上の
整数を表し、*は相補的なヌクレオチド間の塩基対を表
す。)
【0009】(2)核酸塩基の活性基及び5'−水酸基
が保護基で保護され、3'−水酸基は架橋構造を介して
担体に結合しているモノデオキシリボヌクレオシド(固
相)から、(a)5'−水酸基の保護基をはずしたの
ち、固相を洗浄し、(b)核酸塩基の活性基並びに2'
−及び5'−水酸基が保護基で保護されたリボヌクレオ
シド−3'−O−(β−シアノエチル)ホスホアミダイ
ト又は核酸塩基の活性基並びに5'−水酸基が保護基で
保護されたデオキシリボヌクレオシド−3'−O−(β
−シアノエチル)ホスホアミダイトを反応させ、次いで
固相を洗浄し、(c)未反応の5'−水酸基をアセチル
化したのち固相を洗浄する工程、及び酸化剤で酸化した
のち固相を洗浄する工程を、任意の順序で行い、(d)
以下、(a)〜(c)を繰り返し、(e)固相をアルカ
リ処理して、3'−水酸基と担体のあいだの結合を切
り、(f)他の保護基をはずす、ことを特徴とする上記
(1)の安定化リボザイムの製造方法。
が保護基で保護され、3'−水酸基は架橋構造を介して
担体に結合しているモノデオキシリボヌクレオシド(固
相)から、(a)5'−水酸基の保護基をはずしたの
ち、固相を洗浄し、(b)核酸塩基の活性基並びに2'
−及び5'−水酸基が保護基で保護されたリボヌクレオ
シド−3'−O−(β−シアノエチル)ホスホアミダイ
ト又は核酸塩基の活性基並びに5'−水酸基が保護基で
保護されたデオキシリボヌクレオシド−3'−O−(β
−シアノエチル)ホスホアミダイトを反応させ、次いで
固相を洗浄し、(c)未反応の5'−水酸基をアセチル
化したのち固相を洗浄する工程、及び酸化剤で酸化した
のち固相を洗浄する工程を、任意の順序で行い、(d)
以下、(a)〜(c)を繰り返し、(e)固相をアルカ
リ処理して、3'−水酸基と担体のあいだの結合を切
り、(f)他の保護基をはずす、ことを特徴とする上記
(1)の安定化リボザイムの製造方法。
【0010】(3)酸化剤がヨウ素及び/又はテトラエ
チルチウラムジサルファイドを含むものである上記
(2)の製造方法。
チルチウラムジサルファイドを含むものである上記
(2)の製造方法。
【0011】(4)標的RNAを上記(1)の安定化リ
ボザイムと反応させることを特徴とする、標的RNAの
切断又は不活化方法。
ボザイムと反応させることを特徴とする、標的RNAの
切断又は不活化方法。
【0012】(5)上記(1)の安定化リボザイムを有
効成分とする医薬、動物薬、農薬又は試薬。
効成分とする医薬、動物薬、農薬又は試薬。
【0013】本発明の式(I)で表される安定化リボザ
イムは、3'−又は5'−末端の水酸基がリン酸化された
ものであっても、遊離のものであってもどちらでもよ
い。また、式(I)で表される安定化リボザイムのチオ
リン酸エステル結合には、R型及びS型の立体異性体が
存在するが、いずれでもよく、RS混合型であってもよ
い。
イムは、3'−又は5'−末端の水酸基がリン酸化された
ものであっても、遊離のものであってもどちらでもよ
い。また、式(I)で表される安定化リボザイムのチオ
リン酸エステル結合には、R型及びS型の立体異性体が
存在するが、いずれでもよく、RS混合型であってもよ
い。
【0014】本発明の安定化リボザイムの製造方法は、
いわゆる固相化学合成法のうちの、ベータシアノエチル
ホスホアミダイト法に基礎を置くものであるが、メチル
ホスホアミダイトを用いた場合もチオフェノールによる
処理を追加するだけで同様に安定化リボザイムの製造が
可能である。
いわゆる固相化学合成法のうちの、ベータシアノエチル
ホスホアミダイト法に基礎を置くものであるが、メチル
ホスホアミダイトを用いた場合もチオフェノールによる
処理を追加するだけで同様に安定化リボザイムの製造が
可能である。
【0015】核酸塩基の活性基としては例えばアミノ基
があり、この保護基としては例えば、ベンゾイル基、ア
ニソイル基、イソブチリル基等がある。固相から5'−
水酸基の保護基をはずすには、ジクロロ酢酸又はトリク
ロロ酢酸のジクロロメタン溶液等を用いることができ
る。2'−水酸基の保護基には例えば、t−ブチルジメ
チルシリル基等があり、また5'−水酸基の保護基には
例えば、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル
基、トリチル基等がある。
があり、この保護基としては例えば、ベンゾイル基、ア
ニソイル基、イソブチリル基等がある。固相から5'−
水酸基の保護基をはずすには、ジクロロ酢酸又はトリク
ロロ酢酸のジクロロメタン溶液等を用いることができ
る。2'−水酸基の保護基には例えば、t−ブチルジメ
チルシリル基等があり、また5'−水酸基の保護基には
例えば、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル
基、トリチル基等がある。
【0016】未反応の5'−水酸基のアセチル化は1−
メチルイミダゾールもしくはジメチルアミノピリジンを
含む無水酢酸等によって、行うことができる。固相の洗
浄は、通常、アセトニトリルを用いて行う。
メチルイミダゾールもしくはジメチルアミノピリジンを
含む無水酢酸等によって、行うことができる。固相の洗
浄は、通常、アセトニトリルを用いて行う。
【0017】酸化剤としては、リン酸エステル結合を生
成させるときは、ヨウ素、水、ピリジン及びテトラヒド
ロフラン含有液等を用い、チオリン酸エステル結合を生
成させるときは、テトラエチルチウラムジサルファイ
ド、3H,1,2−ベンゾジチオール−1,1−ジオキ
サイド等を用いる。
成させるときは、ヨウ素、水、ピリジン及びテトラヒド
ロフラン含有液等を用い、チオリン酸エステル結合を生
成させるときは、テトラエチルチウラムジサルファイ
ド、3H,1,2−ベンゾジチオール−1,1−ジオキ
サイド等を用いる。
【0018】固相から目的の安定化リボザイムを切り出
すにはアルカリ溶液、例えば15〜30%アンモニア等
が用いられる。このようにして合成した安定化リボザイ
ムは、逆相、イオン交換等のカラムクロマトグラフィ
ー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル
電気泳動等の通常、核酸の精製によく用いられる方法の
一つ、又はそれらの組合せにより精製する。
すにはアルカリ溶液、例えば15〜30%アンモニア等
が用いられる。このようにして合成した安定化リボザイ
ムは、逆相、イオン交換等のカラムクロマトグラフィ
ー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル
電気泳動等の通常、核酸の精製によく用いられる方法の
一つ、又はそれらの組合せにより精製する。
【0019】本発明の安定化リボザイムは標的RNAを
切断又は不活化するので、医薬、動物薬、農薬等として
有効に利用される。標的RNAとしては、種々病原性の
ウィルス由来のRNA、ガン遺伝子由来のRNA、細胞
の増殖・分化に関係する遺伝子由来のRNA等がある。
切断又は不活化の反応は、適宜好適な条件を選べばよい
が、例えば、5〜500mMのマグネシウム又はマンガ
ンイオンの存在下、pH8.0±3.0、温度20〜7
0℃で行うとよい。
切断又は不活化するので、医薬、動物薬、農薬等として
有効に利用される。標的RNAとしては、種々病原性の
ウィルス由来のRNA、ガン遺伝子由来のRNA、細胞
の増殖・分化に関係する遺伝子由来のRNA等がある。
切断又は不活化の反応は、適宜好適な条件を選べばよい
が、例えば、5〜500mMのマグネシウム又はマンガ
ンイオンの存在下、pH8.0±3.0、温度20〜7
0℃で行うとよい。
【0020】医薬としては例えば、エイズ、白血病、各
種悪性腫瘍、流行性結膜炎等の治療用医薬がある。動物
薬としては例えば、牛、豚、ニワトリ、イヌ、ネコ等の
各種ウィルス病の治療用動物薬がある。農薬としては例
えば、タバコモザイク病、イネ萎縮病、キュウリモザイ
ク病等の各種植物ウィルス病に対する農薬等がある。試
薬としては例えば、RNA分析用やRNAプロセシシン
グ用等の研究用生化学試薬や診断薬等がある。
種悪性腫瘍、流行性結膜炎等の治療用医薬がある。動物
薬としては例えば、牛、豚、ニワトリ、イヌ、ネコ等の
各種ウィルス病の治療用動物薬がある。農薬としては例
えば、タバコモザイク病、イネ萎縮病、キュウリモザイ
ク病等の各種植物ウィルス病に対する農薬等がある。試
薬としては例えば、RNA分析用やRNAプロセシシン
グ用等の研究用生化学試薬や診断薬等がある。
【0021】
【実施例】以下実施例により、本発明を詳細に説明す
る。 実施例1 次式(II)で表される安定化リボザイムの合
成
る。 実施例1 次式(II)で表される安定化リボザイムの合
成
【化3】 (式(II)中、A、G、U、C、網掛けのA、網掛けの
G、網掛けのC、s及び* は、式(I)と同じ意味を示
す。)
G、網掛けのC、s及び* は、式(I)と同じ意味を示
す。)
【0022】DNA/RNA合成装置(アプライドバイ
オシステムズ社製、380B型)にdC−CPGカラム
(シトシン量:1μmol)を装着した後、バージョン
1.34のプログラムを用いて、以下の(1)〜(5)の
手順で、式(II)の安定化リボザイムを合成した。
オシステムズ社製、380B型)にdC−CPGカラム
(シトシン量:1μmol)を装着した後、バージョン
1.34のプログラムを用いて、以下の(1)〜(5)の
手順で、式(II)の安定化リボザイムを合成した。
【0023】(1)2%(w/v)トリクロル酢酸のジク
ロルメタン溶液を1.6ml/minで50秒間カラム
に流して、5'−水酸基のジメトキシトリチル基を外
す。 (2)アセトニトリルでカラムを洗浄した後、5’−O
−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−N2−イソ
ブチル−N,N−ジイソプロピルアミノエチルホスホア
ミダイトのアセトニトリル溶液(77/ml)及び4%
(w/v)テトラゾールのアセトニトリル溶液の1:1
(容量比)混合液を1.5ml/minで10秒間給液
し、30秒間保持し、縮合反応を起こさせてホスファイ
ト結合を形成させる。 (3)アセトニトリルでカラムを洗浄後、10%(v/
v)無水酢酸及び10%(v/v)2,6−ルチジンを
含むテトラヒドロフラン溶液と16%(v/v)1−メ
チルイミダゾールを含むテトラヒドロフラン溶液の1:
1(容量比)混合液を1.5ml/minで20秒間流
し、未反応の5'−水酸基をアセチル化する。 (4)アセトニトリルで洗浄後、15%テトラエチルチ
ウラムジサルファイドを含むアセトニトリル溶液を1.
6 ml/minで23秒間流し、15分間放置し、ホスファ
イト結合をチオリン酸結合に酸化し、再びアセトニトリ
ルで洗浄する。 (5)上記の(1)〜(4)の工程を、式(II)に示した
3’側からの3番目以降の核酸塩基配列に従って繰り返
す。
ロルメタン溶液を1.6ml/minで50秒間カラム
に流して、5'−水酸基のジメトキシトリチル基を外
す。 (2)アセトニトリルでカラムを洗浄した後、5’−O
−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−N2−イソ
ブチル−N,N−ジイソプロピルアミノエチルホスホア
ミダイトのアセトニトリル溶液(77/ml)及び4%
(w/v)テトラゾールのアセトニトリル溶液の1:1
(容量比)混合液を1.5ml/minで10秒間給液
し、30秒間保持し、縮合反応を起こさせてホスファイ
ト結合を形成させる。 (3)アセトニトリルでカラムを洗浄後、10%(v/
v)無水酢酸及び10%(v/v)2,6−ルチジンを
含むテトラヒドロフラン溶液と16%(v/v)1−メ
チルイミダゾールを含むテトラヒドロフラン溶液の1:
1(容量比)混合液を1.5ml/minで20秒間流
し、未反応の5'−水酸基をアセチル化する。 (4)アセトニトリルで洗浄後、15%テトラエチルチ
ウラムジサルファイドを含むアセトニトリル溶液を1.
6 ml/minで23秒間流し、15分間放置し、ホスファ
イト結合をチオリン酸結合に酸化し、再びアセトニトリ
ルで洗浄する。 (5)上記の(1)〜(4)の工程を、式(II)に示した
3’側からの3番目以降の核酸塩基配列に従って繰り返
す。
【0024】ここで、手順(2)のアミダイト試薬は、
Aの場合、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−
t−ブチルジメチルシリル−アデノシン−N6−ベンゾ
イル−N,N’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホ
スホアミダイト、Gの場合、5’−O−ジメトキシトリ
チル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−グアノシ
ン−N2−イソブチリル−N,N’−ジイソプロピルア
ミノシアノエチルホスホアミダイト、Cの場合、5’−
O−ジメトキシトリチル−2’−O−t−ブチルジメチ
ルシリル−シチジン−N4−ベンゾイル−N,N’−ジ
イソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、U
の場合、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−t
−ブチルジメチルシリル−ウリジン−N,N’−ジイソ
プロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、網掛け
のAの場合、5’−O−ジメトキシトリチルデオキシア
デノシン−N6−ベンゾイル−N,N’−ジイソプロピ
ルアミノシアノエチルホスホアミダイト、網掛けのGの
場合、5’−O−ジメトキシトリチルデオキシグアノシ
ン−N2−イソブチリル−N,N’−ジイソプロピルア
ミノシアノエチルホスホアミダイト、網掛けのCの場
合、5’−O−ジメトキシトリチルデオキシシチジン−
N4−ベンゾイル−N,N’−ジイソプロピルアミノシ
アノエチルホスホアミダイトを用い、アミダイト試薬の
糖部分がデオキシリボースの場合は上述と同じ条件のも
の、リボースの場合は、アミダイト試薬のアセトニトリ
ル溶液(77mg/ml)と4%(w/v)テトラゾー
ルのアセトニトリル溶液の1:1(容量比)混合液を用
い、1.5ml/minで10秒間給液した後、10分
間保持して反応させた。また、チオリン酸結合ではな
く、ホスファイト結合を形成させる場合は、手順(4)
の「15%テトラエチルチウラムジサルファイドを含む
アセトニトリル溶液を1.6ml/minで23秒間流
し、15分間放置」する代わりに、「3%(w/v)ヨ
ウ素、20%(v/v)ピリジン、及び2%(v/v)H
2Oを含むテトラヒドロフラン溶液を1.6ml/minで2
5秒間流し、20秒間放置」し、ホスファイト結合をホ
スフェート結合に酸化した。
Aの場合、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−
t−ブチルジメチルシリル−アデノシン−N6−ベンゾ
イル−N,N’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホ
スホアミダイト、Gの場合、5’−O−ジメトキシトリ
チル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−グアノシ
ン−N2−イソブチリル−N,N’−ジイソプロピルア
ミノシアノエチルホスホアミダイト、Cの場合、5’−
O−ジメトキシトリチル−2’−O−t−ブチルジメチ
ルシリル−シチジン−N4−ベンゾイル−N,N’−ジ
イソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、U
の場合、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−t
−ブチルジメチルシリル−ウリジン−N,N’−ジイソ
プロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、網掛け
のAの場合、5’−O−ジメトキシトリチルデオキシア
デノシン−N6−ベンゾイル−N,N’−ジイソプロピ
ルアミノシアノエチルホスホアミダイト、網掛けのGの
場合、5’−O−ジメトキシトリチルデオキシグアノシ
ン−N2−イソブチリル−N,N’−ジイソプロピルア
ミノシアノエチルホスホアミダイト、網掛けのCの場
合、5’−O−ジメトキシトリチルデオキシシチジン−
N4−ベンゾイル−N,N’−ジイソプロピルアミノシ
アノエチルホスホアミダイトを用い、アミダイト試薬の
糖部分がデオキシリボースの場合は上述と同じ条件のも
の、リボースの場合は、アミダイト試薬のアセトニトリ
ル溶液(77mg/ml)と4%(w/v)テトラゾー
ルのアセトニトリル溶液の1:1(容量比)混合液を用
い、1.5ml/minで10秒間給液した後、10分
間保持して反応させた。また、チオリン酸結合ではな
く、ホスファイト結合を形成させる場合は、手順(4)
の「15%テトラエチルチウラムジサルファイドを含む
アセトニトリル溶液を1.6ml/minで23秒間流
し、15分間放置」する代わりに、「3%(w/v)ヨ
ウ素、20%(v/v)ピリジン、及び2%(v/v)H
2Oを含むテトラヒドロフラン溶液を1.6ml/minで2
5秒間流し、20秒間放置」し、ホスファイト結合をホ
スフェート結合に酸化した。
【0025】すべてのアミダイト試薬の反応を終えた
後、5'−水酸基の保護基を手順(1)と同様の方法で除
去し、30%アンモニアとエタノールの3:1(容量
比)混合液を18秒間流し、15分間保持したのちカラ
ムから合成物を切り出した。この切り出しの操作は更に
3回繰り返した。次に合成物を、55℃で8時間処理
し、核酸塩基及びリン酸基の保護基を外した。アンモニ
アとエタノールを減圧して除去後、適当量の水に溶解
し、波長260nmの吸光度を測定した。水を減圧除去
した後、波長260nmの吸光度が10となるように1
Mテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒド
ロフラン溶液(以下TBAFと略す)に溶解し、室温で
12時間保持し、2'−水酸基の保護基を除去した。加
えたTBAFと同容量の0.1Mトリエチルアンモニウ
ム−酢酸緩衝液(以下TEAAと略す)を加え、凍結乾
燥した。
後、5'−水酸基の保護基を手順(1)と同様の方法で除
去し、30%アンモニアとエタノールの3:1(容量
比)混合液を18秒間流し、15分間保持したのちカラ
ムから合成物を切り出した。この切り出しの操作は更に
3回繰り返した。次に合成物を、55℃で8時間処理
し、核酸塩基及びリン酸基の保護基を外した。アンモニ
アとエタノールを減圧して除去後、適当量の水に溶解
し、波長260nmの吸光度を測定した。水を減圧除去
した後、波長260nmの吸光度が10となるように1
Mテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒド
ロフラン溶液(以下TBAFと略す)に溶解し、室温で
12時間保持し、2'−水酸基の保護基を除去した。加
えたTBAFと同容量の0.1Mトリエチルアンモニウ
ム−酢酸緩衝液(以下TEAAと略す)を加え、凍結乾
燥した。
【0026】次に、凍結乾燥物をOPCカラム(アプラ
イドバイオシステムズ社製)で精製した。すなわち、カ
ラムを先ず、5mlのアセトニトリル、次いで5mlの
2MのTEAAの順で洗浄し、これに予めTEAA1m
lで溶解した凍結乾燥物溶解液を1〜2滴/秒の速さで
流し、通過液を再び同様にカラムに流して目的物を吸着
させた。5mlのTEAA、続いて10mlの脱イオン
水の順でカラムを洗浄後、50%(v/v)アセトニト
リル1.8mlを1〜2滴/秒で流し、目的物を溶出し
た。
イドバイオシステムズ社製)で精製した。すなわち、カ
ラムを先ず、5mlのアセトニトリル、次いで5mlの
2MのTEAAの順で洗浄し、これに予めTEAA1m
lで溶解した凍結乾燥物溶解液を1〜2滴/秒の速さで
流し、通過液を再び同様にカラムに流して目的物を吸着
させた。5mlのTEAA、続いて10mlの脱イオン
水の順でカラムを洗浄後、50%(v/v)アセトニト
リル1.8mlを1〜2滴/秒で流し、目的物を溶出し
た。
【0027】溶出液は更にFPLC(ファルマシア社
製)で精製した。すなわち、カラムはPepRPC H
R10/10、カラム温度は40℃、流速は2ml/m
inとし、移動相は初期濃度が10%(v/v)のアセ
トニトリルを含むTEAAとして、カラムに溶出液を負
荷後、移動相中のアセトニトリル濃度を1時間かけて1
0%(v/v)から60%(v/v)に直線的に増加さ
せ、目的物を溶出した。なお、目的物の溶出位置は25
4nmの吸光度を測定し、モニターした。
製)で精製した。すなわち、カラムはPepRPC H
R10/10、カラム温度は40℃、流速は2ml/m
inとし、移動相は初期濃度が10%(v/v)のアセ
トニトリルを含むTEAAとして、カラムに溶出液を負
荷後、移動相中のアセトニトリル濃度を1時間かけて1
0%(v/v)から60%(v/v)に直線的に増加さ
せ、目的物を溶出した。なお、目的物の溶出位置は25
4nmの吸光度を測定し、モニターした。
【0028】実施例2 次式(III)で表される安定化
リボザイムの合成
リボザイムの合成
【化4】 (式(III)中、A、G、U、C、網掛けのA、網掛け
のG、網掛けのC、s及び* は、式(I)と同じ意味を
示す。)
のG、網掛けのC、s及び* は、式(I)と同じ意味を
示す。)
【0029】実施例1と同様にして、DNA/RNA合
成装置(アプライドバイオシステムズ社製、380B
型)にdC−CPGカラム(シトシン量:1μmol)
を装着し、バージョン1.34のプログラムを用いて、
式(V)の安定化リボザイムを合成し、OPCカラム及
びFPLCにより精製した。
成装置(アプライドバイオシステムズ社製、380B
型)にdC−CPGカラム(シトシン量:1μmol)
を装着し、バージョン1.34のプログラムを用いて、
式(V)の安定化リボザイムを合成し、OPCカラム及
びFPLCにより精製した。
【0030】比較例 次式(IV)で表されるリボザイム
の合成
の合成
【化5】 (式(IV)中、A、G、U、C及び* は、式(I)と同
じ意味を示す。)
じ意味を示す。)
【0031】実施例1と同様にして、DNA/RNA合
成装置(アプライドバイオシステムズ社製、380B
型)にC−CPGカラム(シトシン量:1μmol)を
装着し、バージョン1.34のプログラムを用いて、式
(IV)の安定化リボザイムを合成し、OPCカラム及び
FPLCにより精製した。
成装置(アプライドバイオシステムズ社製、380B
型)にC−CPGカラム(シトシン量:1μmol)を
装着し、バージョン1.34のプログラムを用いて、式
(IV)の安定化リボザイムを合成し、OPCカラム及び
FPLCにより精製した。
【0032】試験例1 安定化リボザイムの純度試験 実施例1及び2で合成した安定化リボザイム(式(II)
及び式(III)の化合物)、並びに比較のため合成した
リボザイム(式(IV)の化合物)をそれぞれ0.3〜
3.0μgとり、それぞれに10×カイネーションバッ
ファー(100mM 塩化マグネシウム及び100mM
メルカプトエタノールを含む500mMTris−HC
l緩衝液、pH7.6)1.0μl、[γ−32P]AT
P(370メガベクレル/mlで185テラベクレル/
mmolのものの5倍希釈液)0.5μl、T4ポリヌ
クレオチドキナーゼ(宝酒造)0.5μl及び精製水を
加えて全量をそれぞれ10μlとし、37℃で30分間
反応させた。このようにして、5'−末端をリン酸化し
て32Pで標識した後、70℃で10分間加熱処理して、
T4ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。これを2
0%アクリルアミドゲル中、1800ボルトの電圧で約
3時間電気泳動し、オートラジオグラフィーで分析した
(図2)。32Pで標識した安定化リボザイム又は合成リ
ボザイムは、いずれも核酸塩基配列から計算される大き
さと一致し、不純物をほとんど含まないことが分かっ
た。
及び式(III)の化合物)、並びに比較のため合成した
リボザイム(式(IV)の化合物)をそれぞれ0.3〜
3.0μgとり、それぞれに10×カイネーションバッ
ファー(100mM 塩化マグネシウム及び100mM
メルカプトエタノールを含む500mMTris−HC
l緩衝液、pH7.6)1.0μl、[γ−32P]AT
P(370メガベクレル/mlで185テラベクレル/
mmolのものの5倍希釈液)0.5μl、T4ポリヌ
クレオチドキナーゼ(宝酒造)0.5μl及び精製水を
加えて全量をそれぞれ10μlとし、37℃で30分間
反応させた。このようにして、5'−末端をリン酸化し
て32Pで標識した後、70℃で10分間加熱処理して、
T4ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。これを2
0%アクリルアミドゲル中、1800ボルトの電圧で約
3時間電気泳動し、オートラジオグラフィーで分析した
(図2)。32Pで標識した安定化リボザイム又は合成リ
ボザイムは、いずれも核酸塩基配列から計算される大き
さと一致し、不純物をほとんど含まないことが分かっ
た。
【0033】 試験例2 安定化リボザイムの血清中での安定性試験 実施例1及び2で合成した安定化リボザイム(式(II)
及び式(III)の化合物)、並びに比較のため合成した
リボザイム(式(IV)の化合物)を各2.4μgとり、
それぞれに10×カイネーションバッファー(100m
M 塩化マグネシウム及び100mM メルカプトエタノ
ールを含む500mM Tris−HCl緩衝液、pH
7.6)6μl、[γ−32P]ATP(370メガベク
レル/mlで185テラベクレル/mmolのものの5
倍希釈液)3.0μl、T4ポリヌクレオチドキナーゼ
(宝酒造)1.0μl及び精製水を加え、それぞれ全量
を60μlとし、37℃で30分間反応させた。このよ
うにして、5’−末端をリン酸化して32Pで標識した
後、70℃で10分間加熱処理してT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼを失活させた。この32Pで標識した安定化リ
ボザイム又は合成リボザイム溶液をそれぞれ10μlと
り、それぞれに反応停止液(9M尿素、50mM ED
TA、0.1%キシレンシアノール及び0.1%ブロモ
フェノールブルーを含む)10μlを加え、反応時間0
のサンプルとした。残りの各安定化リボザイム又はリボ
ザイム溶液50μlに対し、精製水で1%の濃度に希釈
した牛血清5.5μlを加えて37℃に保温した。保温
開始後5分、1時間、3時間、6時間後にそれぞれ10
μlずつをサンプリングシし、同量の反応停止液に加
え、分析するまで−80℃に保存した。分析時、これら
のサンプルを室温で融解後、20%ポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動を行ない、イメージアナライザを用い
て分析した(図3)。
及び式(III)の化合物)、並びに比較のため合成した
リボザイム(式(IV)の化合物)を各2.4μgとり、
それぞれに10×カイネーションバッファー(100m
M 塩化マグネシウム及び100mM メルカプトエタノ
ールを含む500mM Tris−HCl緩衝液、pH
7.6)6μl、[γ−32P]ATP(370メガベク
レル/mlで185テラベクレル/mmolのものの5
倍希釈液)3.0μl、T4ポリヌクレオチドキナーゼ
(宝酒造)1.0μl及び精製水を加え、それぞれ全量
を60μlとし、37℃で30分間反応させた。このよ
うにして、5’−末端をリン酸化して32Pで標識した
後、70℃で10分間加熱処理してT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼを失活させた。この32Pで標識した安定化リ
ボザイム又は合成リボザイム溶液をそれぞれ10μlと
り、それぞれに反応停止液(9M尿素、50mM ED
TA、0.1%キシレンシアノール及び0.1%ブロモ
フェノールブルーを含む)10μlを加え、反応時間0
のサンプルとした。残りの各安定化リボザイム又はリボ
ザイム溶液50μlに対し、精製水で1%の濃度に希釈
した牛血清5.5μlを加えて37℃に保温した。保温
開始後5分、1時間、3時間、6時間後にそれぞれ10
μlずつをサンプリングシし、同量の反応停止液に加
え、分析するまで−80℃に保存した。分析時、これら
のサンプルを室温で融解後、20%ポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動を行ない、イメージアナライザを用い
て分析した(図3)。
【0034】その結果、合成リボザイムの分解(比較:
□印で示す。)は反応3時間後で約80%、6時間後に
約90%であるのに対し、本発明の式(II)の安定化リ
ボザイムの分解(△印で示す。)は、3時間後で約5
%、6時間後で約10%であるに過ぎず、牛血清に対し
てかなり安定であることが分かった。
□印で示す。)は反応3時間後で約80%、6時間後に
約90%であるのに対し、本発明の式(II)の安定化リ
ボザイムの分解(△印で示す。)は、3時間後で約5
%、6時間後で約10%であるに過ぎず、牛血清に対し
てかなり安定であることが分かった。
【0035】 試験例3 安定化リボザイムの標的RNA切断活性 標的となるRNA(5’末端を32P標識した5’−GC
CGUCCCCCG−3’)17.4μMを基質とし、
25mM MgCl2を含む50mMトリス−塩酸緩衝液
(pH8.0)20μl中、実施例1もしくは2で合成
した安定化リボザイム(式(II)又は(III)の化合
物)又は比較のため合成したリボザイム(式(IV)の化
合物)を0.788μMの濃度で、37℃で反応させ
た。反応開始後、5、10及び20分後に5μlずつを
サンプリングし、それぞれに反応停止液(9M尿素、5
0mM EDTA、0.1%キシレンシアノール、及び
0.1%ブロモフェノールブルーを含む)5μlを加え
て、分析するまで−80℃に保存した。分析時、これら
のサンプルを室温で融解後、20%ポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動を行なった(図4)。図4の結果か
ら、本発明の式(II)で表される安定化リボザイムは、
標的RNA切断能を維持していることが分かる。
CGUCCCCCG−3’)17.4μMを基質とし、
25mM MgCl2を含む50mMトリス−塩酸緩衝液
(pH8.0)20μl中、実施例1もしくは2で合成
した安定化リボザイム(式(II)又は(III)の化合
物)又は比較のため合成したリボザイム(式(IV)の化
合物)を0.788μMの濃度で、37℃で反応させ
た。反応開始後、5、10及び20分後に5μlずつを
サンプリングし、それぞれに反応停止液(9M尿素、5
0mM EDTA、0.1%キシレンシアノール、及び
0.1%ブロモフェノールブルーを含む)5μlを加え
て、分析するまで−80℃に保存した。分析時、これら
のサンプルを室温で融解後、20%ポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動を行なった(図4)。図4の結果か
ら、本発明の式(II)で表される安定化リボザイムは、
標的RNA切断能を維持していることが分かる。
【0036】
【発明の効果】本発明は、従来のリボザイムよりRNA
分解酵素等に対して抵抗性を有する、新規な安定化リボ
ザイムを提供する。また、本発明の安定化リボザイムは
配列特異的に標的RNAを切断し、不活化することがで
きるので、RNAが原因で起こる病気の治療用医薬、動
物薬あるいは農薬に広く応用される。更に、RNAを切
断する制限酵素として診断薬、生化学試薬等の試薬とし
ても応用できるものである。
分解酵素等に対して抵抗性を有する、新規な安定化リボ
ザイムを提供する。また、本発明の安定化リボザイムは
配列特異的に標的RNAを切断し、不活化することがで
きるので、RNAが原因で起こる病気の治療用医薬、動
物薬あるいは農薬に広く応用される。更に、RNAを切
断する制限酵素として診断薬、生化学試薬等の試薬とし
ても応用できるものである。
【図1】リボザイムの2次構造と標的RNAの切断箇所
を示す模式図である。
を示す模式図である。
【図2】本発明の安定化リボザイム(比較:合成リボザ
イム)のポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。
イム)のポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。
【図3】本発明の安定化リボザイム(比較:合成リボザ
イム)を牛血清とともに反応させたときの安定化リボザ
イムの経時変化を示すグラフである。
イム)を牛血清とともに反応させたときの安定化リボザ
イムの経時変化を示すグラフである。
【図4】標的RNAに本発明の安定化リボザイムを反応
させたときの、反応物の経時変化を示すポリアクリルア
ミドゲル電気泳動図である。
させたときの、反応物の経時変化を示すポリアクリルア
ミドゲル電気泳動図である。
図1において、 大きな文字のA :標的RNA中のG
UC領域 大きな文字のB :リボザイム中の触媒活性部位を含む
24個の特定の塩基配列を有する領域 大きな文字のC :標的RNAと塩基対を形成するリボ
ザイム中の結合領域 矢印 :標的RNAの切断部位 A、G又はUを丸印で囲ったもの:触媒活性部位 図2において、 II :式(II)の化合物 III:式(III)の化合物 IV :式(IV)の化合物 ↓ :電気泳動方向 図3において、 △ :式(II)の化合物 ○ :式(III)の化合物 □ :式(IV)の化合物
UC領域 大きな文字のB :リボザイム中の触媒活性部位を含む
24個の特定の塩基配列を有する領域 大きな文字のC :標的RNAと塩基対を形成するリボ
ザイム中の結合領域 矢印 :標的RNAの切断部位 A、G又はUを丸印で囲ったもの:触媒活性部位 図2において、 II :式(II)の化合物 III:式(III)の化合物 IV :式(IV)の化合物 ↓ :電気泳動方向 図3において、 △ :式(II)の化合物 ○ :式(III)の化合物 □ :式(IV)の化合物
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 多比良 和誠 茨城県つくば市東1丁目1番3号工業技術 院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 西川 諭 茨城県つくば市東1丁目1番3号工業技術 院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 前田 英勝 茨城県つくば市東1丁目1番3号工業技術 院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 嶋山 隆 東京都新宿区西新宿二丁目1番1号 日立 化成工業株式会社内 (72)発明者 井筒 浩 茨城県つくば市和台48番日立化成工業株式 会社筑波開発研究所内 (72)発明者 大川 淳 兵庫県神戸市西区室谷2丁目2番3号長瀬 産業株式会社研究開発センター内 (72)発明者 岡部 宗一 兵庫県神戸市西区室谷2丁目2番3号長瀬 産業株式会社研究開発センター内
Claims (5)
- 【請求項1】式(I)で表される安定化リボザイム。 【化1】 (式(I)中、A、G、C、及びUはそれぞれアデニン
モノリボヌクレオチド、グアニンモノリボヌクレオチ
ド、シトシンモノリボヌクレオチド、ウラシルモノリボ
ヌクレオチドを表し、網掛けのA、網掛けのG及び網掛
けのCはそれぞれアデニンモノデオキシリボヌクレオチ
ド、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド、シトシン
モノデオキシリボヌクレオチドを表し、網掛けのXはア
デニンモノデオキシリボヌクレオチド、グアニンモノデ
オキシリボヌクレオチド、シトシンモノデオキシリボヌ
クレオチド、チミンモノデオキシリボヌクレオチドのい
ずれか任意のモノデオキシリボヌクレオチドを表し、s
はチオリン酸エステル結合〔−O−P(=S)(OH)
−O−又は−O−P(=O)(SH)−O−〕を表し、
m及びnはそれぞれ異ってもよい1又は2以上の整数を
表し、*は相補的なヌクレオチド間の塩基対を表す。) - 【請求項2】核酸塩基の活性基及び5'−水酸基が保護
基で保護され、3'−水酸基は架橋構造を介して担体に
結合しているモノデオキシリボヌクレオシド(固相)か
ら、(a)5'−水酸基の保護基をはずしたのち、固相
を洗浄し、(b)核酸塩基の活性基並びに2'−及び5'
−水酸基が保護基で保護されたリボヌクレオシド−3'
−O−(β−シアノエチル)ホスホアミダイト又は核酸
塩基の活性基並びに5'−水酸基が保護基で保護された
デオキシリボヌクレオシド−3'−O−(β−シアノエ
チル)ホスホアミダイトを反応させ、次いで固相を洗浄
し、(c)未反応の5'−水酸基をアセチル化したのち
固相を洗浄する工程、及び酸化剤で酸化したのち固相を
洗浄する工程を、任意の順序で行い、(d)以下、
(a)〜(c)を繰り返し、(e)固相をアルカリ処理
して、3'−水酸基と担体のあいだの結合を切り、
(f)他の保護基をはずす、ことを特徴とする請求項1
の安定化リボザイムの製造方法。 - 【請求項3】酸化剤がヨウ素及び/又はテトラエチルチ
ウラムジサルファイドを含むものである請求項2記載の
製造方法。 - 【請求項4】標的RNAを請求項1に記載の安定化リボ
ザイムと反応させることを特徴とする、標的RNAの切
断又は不活化方法。 - 【請求項5】請求項1に記載の安定化リボザイムを有効
成分とする医薬、動物薬、農薬又は試薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25824192A JP3103855B2 (ja) | 1992-09-28 | 1992-09-28 | 安定化リボザイム |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25824192A JP3103855B2 (ja) | 1992-09-28 | 1992-09-28 | 安定化リボザイム |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06169762A true JPH06169762A (ja) | 1994-06-21 |
JP3103855B2 JP3103855B2 (ja) | 2000-10-30 |
Family
ID=17317493
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP25824192A Expired - Lifetime JP3103855B2 (ja) | 1992-09-28 | 1992-09-28 | 安定化リボザイム |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3103855B2 (ja) |
-
1992
- 1992-09-28 JP JP25824192A patent/JP3103855B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP3103855B2 (ja) | 2000-10-30 |
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