JPH06169762A - 安定化リボザイム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】下記の式（Ｉ）で表される安定化リボザイム。 【化１】 （式（Ｉ）中、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵはそれぞれ（アデニ
ン、グアニン、シトシン及びウラシル）モノリボヌクレ
オチドを表し、網掛けのＡ、Ｇ及びＣはそれぞれ（アデ
ニン、グアニン及びシトシン）モノデオキシリボヌクレ
オチドを表し、網掛けのＸは（アデニン、グアニン、シ
トシン又はチミンいずれか）任意のモノデオキシリボヌ
クレオチドを表し、ｓはチオリン酸エステル結合〔−Ｏ
−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｓ
Ｈ）−Ｏ−〕を表し、ｍ及びｎはそれぞれ異ってもよい
１又は２以上の整数を表し、*は相補的なヌクレオチド
間の塩基対を表す。） 【効果】従来のリボザイムと同様にＲＮＡ分解活性を維
持しながら、かつＲＮＡ分解酵素等に対して抵抗性を有
する、新規な安定化リボザイムを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、安定化リボザイムに関
するものであり、更に詳しくは、標的ＲＮＡを特異的に
切断するリボザイムの機能は維持したまま、リボザイム
を人為的に改変して安定化分子もしくは構造とした安定
化リボザイムに関するものであり、これは医薬、動物
薬、農薬あるいは試薬等に有効に利用されうるものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】従来、すべての酵素はタンパク質から構
成されていると確信されていたが、１９８１年に酵素活
性を有するＲＮＡ分子、すなわちリボザイムが発見さ
れ、従来の酵素に関する概念は打ち破られた。この画期
的発見はコロラド大学のチェック（T. Chech）らによっ
てなされたもので、原生動物のテトラヒメナのリボソー
ムＲＮＡ（ｒＲＮＡ）前駆体はタンパク質の力を借りず
に、遺伝情報を伝達する上で不必要なイントロン（ＩＶ
Ｓ）をセルフスプライシングで取り除くことが証明され
た（Cell ,Vol.31, p.147-157(1982);Nature ,Vol.308,
p.820-825(1984))。その後、ホスホジエステル結合を
セルフスプライシングする触媒機能を有するＲＮＡ分子
が次々と見出されているほか、他のＲＮＡ分子を切断す
るＲＮＡ分子(リボザイム)も見つかっている。

【０００３】このような中で、最近、ハセロフ(J. Hase
loff)とジャーラック(W.L.Gerlach)は、数種の植物ウイ
ルスのリボザイムの間で共通に保存されている塩基配列
に着目し、標的ＲＮＡ結合領域を除くリボザイム分子の
大きさがわずか２４塩基で構成された短鎖リボザイム
を、遺伝子操作技術及び酵素の手法を用いて構築するこ
とに成功した（Nature ,Vol.334,p.585-591(1988)；特
表平3-502638号公報）。また、大塚らは非自己のＲＮＡ
分子の切断を触媒する活性な短鎖リボザイムを化学合成
で調製している（特開平２−１９５８８３号公報）。

【０００４】図１は短鎖リボザイムの構造と作用部位を
説明するものである。リボザイムは、標的であるＲＮＡ
分子の塩基配列を認識して塩基対を形成する結合領域Ｃ
と、２４個の特定の塩基配列を有する領域Ｂ（Ａ、Ｇ又
はＵを丸印で囲った触媒活性部位を含む）から構成され
ており、標的ＲＮＡは標的ＲＮＡ中のＡ領域（ＧＵＣ）
に隣接する位置（図１中、矢印で示す）で切断される。
なお、このＡ領域の配列はＧＵＣのみではなく、他の配
列でも切断されることが知られている。

【０００５】リボザイムは、リボザイムの核酸塩基配列
に基づいてリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを合成
し、これをプラスミドに挿入し、更にこの組換えプラス
ミドを形質転換して得られるクローンを適当な制限酵素
で切断してリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を
取得し、これを鋳型としてイン・ビトロ（in vitro）で
転写することにより、あるいは化学的合成法によってリ
ボヌクレオチドを順次連結することにより得られること
は前記の文献中に記載されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】自然界にはＲＮＡ分解
酵素が広く分布している。リボザイムはこのＲＮＡ分解
酵素によって容易に分解を受け失活するので、安定性に
問題がある。本発明は、リボザイムの特異的なＲＮＡ分
解活性を維持したままで、ＲＮＡ分解酵素の攻撃に対し
抵抗性を有する安定な修飾リボザイム、すなわち安定化
リボザイムを提供し、医薬、動物薬、農薬あるいは試薬
等に有効に利用することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明者らはリボザイムを安定化する種々の修飾方
法を検討した結果、リボザイムのリン酸エステル結合
〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−〕の一又は二以上
を、チオリン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（Ｏ
Ｈ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕とす
ることにより、あるいはそれに加えて、リボザイムを構
成する分子もしくは構造の非触媒領域（図１において、
Ａ、Ｇ又はＵを丸印で囲った部位以外の領域）内で、構
成するモノリボヌクレオチドの一又は二以上を、それに
相当するモノデオキシリボヌクレオチドに置換すること
により、リボザイムはその特異的なＲＮＡ分解活性を維
持したままで、ＲＮＡ分解酵素の攻撃に対して抵抗性を
有する安定な修飾リボザイム、すなわち安定化リボザイ
ムとなることを見出し、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は下記の（１）〜（５）
に関するものである。 （１）次式（Ｉ）で表される安定化リボザイム。

【化２】 （式（Ｉ）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵはそれぞれアデニン
モノリボヌクレオチド、グアニンモノリボヌクレオチ
ド、シトシンモノリボヌクレオチド、ウラシルモノリボ
ヌクレオチドを表し、網掛けのＡ、網掛けのＧ及び網掛
けのＣはそれぞれアデニンモノデオキシリボヌクレオチ
ド、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド、シトシン
モノデオキシリボヌクレオチドを表し、網掛けのＸはア
デニンモノデオキシリボヌクレオチド、グアニンモノデ
オキシリボヌクレオチド、シトシンモノデオキシリボヌ
クレオチド、チミンモノデオキシリボヌクレオチドのい
ずれか任意のモノデオキシリボヌクレオチドを表し、ｓ
はチオリン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）
−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕を表し、
ｍ及びｎはそれぞれ異ってもよい１又は２以上の以上の
整数を表し、*は相補的なヌクレオチド間の塩基対を表
す。）

【０００９】（２）核酸塩基の活性基及び５'−水酸基
が保護基で保護され、３'−水酸基は架橋構造を介して
担体に結合しているモノデオキシリボヌクレオシド（固
相）から、（ａ）５'−水酸基の保護基をはずしたの
ち、固相を洗浄し、（ｂ）核酸塩基の活性基並びに２'
−及び５'−水酸基が保護基で保護されたリボヌクレオ
シド−３'−Ｏ−（β−シアノエチル）ホスホアミダイ
ト又は核酸塩基の活性基並びに５'−水酸基が保護基で
保護されたデオキシリボヌクレオシド−３'−Ｏ−（β
−シアノエチル）ホスホアミダイトを反応させ、次いで
固相を洗浄し、（ｃ）未反応の５'−水酸基をアセチル
化したのち固相を洗浄する工程、及び酸化剤で酸化した
のち固相を洗浄する工程を、任意の順序で行い、（ｄ）
以下、（ａ）〜（ｃ）を繰り返し、（ｅ）固相をアルカ
リ処理して、３'−水酸基と担体のあいだの結合を切
り、（ｆ）他の保護基をはずす、ことを特徴とする上記
（１）の安定化リボザイムの製造方法。

【００１０】（３）酸化剤がヨウ素及び／又はテトラエ
チルチウラムジサルファイドを含むものである上記
（２）の製造方法。

【００１１】（４）標的ＲＮＡを上記（１）の安定化リ
ボザイムと反応させることを特徴とする、標的ＲＮＡの
切断又は不活化方法。

【００１２】（５）上記（１）の安定化リボザイムを有
効成分とする医薬、動物薬、農薬又は試薬。

【００１３】本発明の式（Ｉ）で表される安定化リボザ
イムは、３'−又は５'−末端の水酸基がリン酸化された
ものであっても、遊離のものであってもどちらでもよ
い。また、式（Ｉ）で表される安定化リボザイムのチオ
リン酸エステル結合には、Ｒ型及びＳ型の立体異性体が
存在するが、いずれでもよく、ＲＳ混合型であってもよ
い。

【００１４】本発明の安定化リボザイムの製造方法は、
いわゆる固相化学合成法のうちの、ベータシアノエチル
ホスホアミダイト法に基礎を置くものであるが、メチル
ホスホアミダイトを用いた場合もチオフェノールによる
処理を追加するだけで同様に安定化リボザイムの製造が
可能である。

【００１５】核酸塩基の活性基としては例えばアミノ基
があり、この保護基としては例えば、ベンゾイル基、ア
ニソイル基、イソブチリル基等がある。固相から５'−
水酸基の保護基をはずすには、ジクロロ酢酸又はトリク
ロロ酢酸のジクロロメタン溶液等を用いることができ
る。２'−水酸基の保護基には例えば、ｔ−ブチルジメ
チルシリル基等があり、また５'−水酸基の保護基には
例えば、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル
基、トリチル基等がある。

【００１６】未反応の５'−水酸基のアセチル化は１−
メチルイミダゾールもしくはジメチルアミノピリジンを
含む無水酢酸等によって、行うことができる。固相の洗
浄は、通常、アセトニトリルを用いて行う。

【００１７】酸化剤としては、リン酸エステル結合を生
成させるときは、ヨウ素、水、ピリジン及びテトラヒド
ロフラン含有液等を用い、チオリン酸エステル結合を生
成させるときは、テトラエチルチウラムジサルファイ
ド、３Ｈ，１，２−ベンゾジチオール−１，１−ジオキ
サイド等を用いる。

【００１８】固相から目的の安定化リボザイムを切り出
すにはアルカリ溶液、例えば１５〜３０％アンモニア等
が用いられる。このようにして合成した安定化リボザイ
ムは、逆相、イオン交換等のカラムクロマトグラフィ
ー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル
電気泳動等の通常、核酸の精製によく用いられる方法の
一つ、又はそれらの組合せにより精製する。

【００１９】本発明の安定化リボザイムは標的ＲＮＡを
切断又は不活化するので、医薬、動物薬、農薬等として
有効に利用される。標的ＲＮＡとしては、種々病原性の
ウィルス由来のＲＮＡ、ガン遺伝子由来のＲＮＡ、細胞
の増殖・分化に関係する遺伝子由来のＲＮＡ等がある。
切断又は不活化の反応は、適宜好適な条件を選べばよい
が、例えば、５〜５００ｍＭのマグネシウム又はマンガ
ンイオンの存在下、ｐＨ８．０±３．０、温度２０〜７
０℃で行うとよい。

【００２０】医薬としては例えば、エイズ、白血病、各
種悪性腫瘍、流行性結膜炎等の治療用医薬がある。動物
薬としては例えば、牛、豚、ニワトリ、イヌ、ネコ等の
各種ウィルス病の治療用動物薬がある。農薬としては例
えば、タバコモザイク病、イネ萎縮病、キュウリモザイ
ク病等の各種植物ウィルス病に対する農薬等がある。試
薬としては例えば、ＲＮＡ分析用やＲＮＡプロセシシン
グ用等の研究用生化学試薬や診断薬等がある。

【００２１】

【実施例】以下実施例により、本発明を詳細に説明す
る。 実施例１ 次式（II）で表される安定化リボザイムの合
成

【化３】 （式（II）中、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、網掛けのＡ、網掛けの
Ｇ、網掛けのＣ、ｓ及び* は、式（I）と同じ意味を示
す。）

【００２２】ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（アプライドバイ
オシステムズ社製、３８０Ｂ型）にｄＣ−ＣＰＧカラム
（シトシン量:１μｍｏｌ）を装着した後、バージョン
１．３４のプログラムを用いて、以下の（1）〜（5）の
手順で、式（II）の安定化リボザイムを合成した。

【００２３】（1）２％(ｗ／ｖ)トリクロル酢酸のジク
ロルメタン溶液を１．６ｍｌ／ｍｉｎで５０秒間カラム
に流して、５'−水酸基のジメトキシトリチル基を外
す。 （2）アセトニトリルでカラムを洗浄した後、５’−Ｏ
−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−Ｎ²−イソ
ブチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノエチルホスホア
ミダイトのアセトニトリル溶液（７７／ｍｌ）及び４％
（ｗ／ｖ）テトラゾールのアセトニトリル溶液の１：１
（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで１０秒間給液
し、３０秒間保持し、縮合反応を起こさせてホスファイ
ト結合を形成させる。 （3）アセトニトリルでカラムを洗浄後、１０％（ｖ／
ｖ）無水酢酸及び１０％（ｖ／ｖ）２，６−ルチジンを
含むテトラヒドロフラン溶液と１６％（ｖ／ｖ）１−メ
チルイミダゾールを含むテトラヒドロフラン溶液の１：
１（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで２０秒間流
し、未反応の５'−水酸基をアセチル化する。 （4）アセトニトリルで洗浄後、１５％テトラエチルチ
ウラムジサルファイドを含むアセトニトリル溶液を１.
６ ml／minで２３秒間流し、１５分間放置し、ホスファ
イト結合をチオリン酸結合に酸化し、再びアセトニトリ
ルで洗浄する。 （5）上記の（1）〜（4）の工程を、式（II）に示した
３’側からの３番目以降の核酸塩基配列に従って繰り返
す。

【００２４】ここで、手順（2）のアミダイト試薬は、
Ａの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−
ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−Ｎ⁶−ベンゾ
イル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホ
スホアミダイト、Ｇの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシ
ン−Ｎ²−イソブチリル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルア
ミノシアノエチルホスホアミダイト、Ｃの場合、５’−
Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチ
ルシリル−シチジン−Ｎ⁴−ベンゾイル−Ｎ，Ｎ’−ジ
イソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、Ｕ
の場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ
−ブチルジメチルシリル−ウリジン−Ｎ，Ｎ’−ジイソ
プロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、網掛け
のＡの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシア
デノシン−Ｎ⁶−ベンゾイル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピ
ルアミノシアノエチルホスホアミダイト、網掛けのＧの
場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシグアノシ
ン−Ｎ²−イソブチリル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルア
ミノシアノエチルホスホアミダイト、網掛けのＣの場
合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシシチジン−
Ｎ⁴−ベンゾイル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノシ
アノエチルホスホアミダイトを用い、アミダイト試薬の
糖部分がデオキシリボースの場合は上述と同じ条件のも
の、リボースの場合は、アミダイト試薬のアセトニトリ
ル溶液（７７ｍｇ／ｍｌ）と４％（ｗ／ｖ）テトラゾー
ルのアセトニトリル溶液の１：１（容量比）混合液を用
い、１．５ｍｌ／ｍｉｎで１０秒間給液した後、１０分
間保持して反応させた。また、チオリン酸結合ではな
く、ホスファイト結合を形成させる場合は、手順（4）
の「１５％テトラエチルチウラムジサルファイドを含む
アセトニトリル溶液を１．６ｍｌ／ｍｉｎで２３秒間流
し、１５分間放置」する代わりに、「３％（ｗ／ｖ）ヨ
ウ素、２０％(ｖ／ｖ)ピリジン、及び２％（ｖ／ｖ）Ｈ
₂Ｏを含むテトラヒドロフラン溶液を１．６ml/minで２
５秒間流し、２０秒間放置」し、ホスファイト結合をホ
スフェート結合に酸化した。

【００２５】すべてのアミダイト試薬の反応を終えた
後、５'−水酸基の保護基を手順（1）と同様の方法で除
去し、３０％アンモニアとエタノールの３：１（容量
比）混合液を１８秒間流し、１５分間保持したのちカラ
ムから合成物を切り出した。この切り出しの操作は更に
３回繰り返した。次に合成物を、５５℃で８時間処理
し、核酸塩基及びリン酸基の保護基を外した。アンモニ
アとエタノールを減圧して除去後、適当量の水に溶解
し、波長２６０ｎｍの吸光度を測定した。水を減圧除去
した後、波長２６０ｎｍの吸光度が１０となるように１
Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒド
ロフラン溶液（以下ＴＢＡＦと略す）に溶解し、室温で
１２時間保持し、２'−水酸基の保護基を除去した。加
えたＴＢＡＦと同容量の０．１Ｍトリエチルアンモニウ
ム−酢酸緩衝液（以下ＴＥＡＡと略す）を加え、凍結乾
燥した。

【００２６】次に、凍結乾燥物をＯＰＣカラム（アプラ
イドバイオシステムズ社製）で精製した。すなわち、カ
ラムを先ず、５ｍｌのアセトニトリル、次いで５ｍｌの
２ＭのＴＥＡＡの順で洗浄し、これに予めＴＥＡＡ１ｍ
ｌで溶解した凍結乾燥物溶解液を１〜２滴／秒の速さで
流し、通過液を再び同様にカラムに流して目的物を吸着
させた。５ｍｌのＴＥＡＡ、続いて１０ｍｌの脱イオン
水の順でカラムを洗浄後、５０％（ｖ／ｖ）アセトニト
リル１．８ｍｌを１〜２滴／秒で流し、目的物を溶出し
た。

【００２７】溶出液は更にＦＰＬＣ（ファルマシア社
製）で精製した。すなわち、カラムはＰｅｐＲＰＣ Ｈ
Ｒ１０／１０、カラム温度は４０℃、流速は２ｍｌ／ｍ
ｉｎとし、移動相は初期濃度が１０％（ｖ／ｖ）のアセ
トニトリルを含むＴＥＡＡとして、カラムに溶出液を負
荷後、移動相中のアセトニトリル濃度を１時間かけて１
０％（ｖ／ｖ）から６０％（ｖ／ｖ）に直線的に増加さ
せ、目的物を溶出した。なお、目的物の溶出位置は２５
４ｎｍの吸光度を測定し、モニターした。

【００２８】実施例２ 次式（III）で表される安定化
リボザイムの合成

【化４】 （式（III）中、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、網掛けのＡ、網掛け
のＧ、網掛けのＣ、ｓ及び* は、式（Ｉ）と同じ意味を
示す。）

【００２９】実施例１と同様にして、ＤＮＡ／ＲＮＡ合
成装置（アプライドバイオシステムズ社製、３８０Ｂ
型）にｄＣ−ＣＰＧカラム（シトシン量：１μｍｏｌ）
を装着し、バージョン１．３４のプログラムを用いて、
式（Ｖ）の安定化リボザイムを合成し、ＯＰＣカラム及
びＦＰＬＣにより精製した。

【００３０】比較例 次式（IV）で表されるリボザイム
の合成

【化５】 （式（IV）中、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ及び* は、式（Ｉ）と同
じ意味を示す。）

【００３１】実施例１と同様にして、ＤＮＡ／ＲＮＡ合
成装置（アプライドバイオシステムズ社製、３８０Ｂ
型）にＣ−ＣＰＧカラム（シトシン量：１μｍｏｌ）を
装着し、バージョン１．３４のプログラムを用いて、式
（IV）の安定化リボザイムを合成し、ＯＰＣカラム及び
ＦＰＬＣにより精製した。

【００３２】試験例１ 安定化リボザイムの純度試験 実施例１及び２で合成した安定化リボザイム（式（II）
及び式（III）の化合物）、並びに比較のため合成した
リボザイム（式（IV）の化合物）をそれぞれ０．３〜
３．０μｇとり、それぞれに１０×カイネーションバッ
ファー（１００ｍＭ 塩化マグネシウム及び１００ｍＭ
メルカプトエタノールを含む５００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液、ｐＨ７．６）１．０μｌ、［γ−³²Ｐ］ＡＴ
Ｐ（３７０メガベクレル／ｍｌで１８５テラベクレル／
ｍｍｏｌのものの５倍希釈液）０．５μｌ、Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ（宝酒造）０．５μｌ及び精製水を
加えて全量をそれぞれ１０μｌとし、３７℃で３０分間
反応させた。このようにして、５'−末端をリン酸化し
て³²Ｐで標識した後、７０℃で１０分間加熱処理して、
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。これを２
０％アクリルアミドゲル中、１８００ボルトの電圧で約
３時間電気泳動し、オートラジオグラフィーで分析した
（図２）。³²Ｐで標識した安定化リボザイム又は合成リ
ボザイムは、いずれも核酸塩基配列から計算される大き
さと一致し、不純物をほとんど含まないことが分かっ
た。

【００３３】 試験例２ 安定化リボザイムの血清中での安定性試験 実施例１及び２で合成した安定化リボザイム（式（II）
及び式（III）の化合物）、並びに比較のため合成した
リボザイム（式（IV）の化合物）を各２．４μｇとり、
それぞれに１０×カイネーションバッファー（１００ｍ
Ｍ 塩化マグネシウム及び１００ｍＭ メルカプトエタノ
ールを含む５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ
７．６）６μｌ、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（３７０メガベク
レル／ｍｌで１８５テラベクレル／ｍｍｏｌのものの５
倍希釈液）３．０μｌ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（宝酒造）１．０μｌ及び精製水を加え、それぞれ全量
を６０μｌとし、３７℃で３０分間反応させた。このよ
うにして、５’−末端をリン酸化して³²Ｐで標識した
後、７０℃で１０分間加熱処理してＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを失活させた。この³²Ｐで標識した安定化リ
ボザイム又は合成リボザイム溶液をそれぞれ１０μｌと
り、それぞれに反応停止液（９Ｍ尿素、５０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０．１％キシレンシアノール及び０．１％ブロモ
フェノールブルーを含む）１０μｌを加え、反応時間０
のサンプルとした。残りの各安定化リボザイム又はリボ
ザイム溶液５０μｌに対し、精製水で１％の濃度に希釈
した牛血清５．５μｌを加えて３７℃に保温した。保温
開始後５分、１時間、３時間、６時間後にそれぞれ１０
μｌずつをサンプリングシし、同量の反応停止液に加
え、分析するまで−８０℃に保存した。分析時、これら
のサンプルを室温で融解後、２０％ポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動を行ない、イメージアナライザを用い
て分析した（図３）。

【００３４】その結果、合成リボザイムの分解（比較：
□印で示す。)は反応３時間後で約８０％、６時間後に
約９０％であるのに対し、本発明の式（II）の安定化リ
ボザイムの分解（△印で示す。)は、３時間後で約５
％、６時間後で約１０％であるに過ぎず、牛血清に対し
てかなり安定であることが分かった。

【００３５】 試験例３ 安定化リボザイムの標的ＲＮＡ切断活性 標的となるＲＮＡ（５’末端を³²Ｐ標識した５’−ＧＣ
ＣＧＵＣＣＣＣＣＧ−３’）１７．４μＭを基質とし、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）２０μｌ中、実施例１もしくは２で合成
した安定化リボザイム（式（II）又は（III）の化合
物）又は比較のため合成したリボザイム（式（IV）の化
合物）を０．７８８μＭの濃度で、３７℃で反応させ
た。反応開始後、５、１０及び２０分後に５μｌずつを
サンプリングし、それぞれに反応停止液（９Ｍ尿素、５
０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール、及び
０．１％ブロモフェノールブルーを含む）５μｌを加え
て、分析するまで−８０℃に保存した。分析時、これら
のサンプルを室温で融解後、２０％ポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動を行なった（図４）。図４の結果か
ら、本発明の式（II）で表される安定化リボザイムは、
標的ＲＮＡ切断能を維持していることが分かる。

【００３６】

【発明の効果】本発明は、従来のリボザイムよりＲＮＡ
分解酵素等に対して抵抗性を有する、新規な安定化リボ
ザイムを提供する。また、本発明の安定化リボザイムは
配列特異的に標的ＲＮＡを切断し、不活化することがで
きるので、ＲＮＡが原因で起こる病気の治療用医薬、動
物薬あるいは農薬に広く応用される。更に、ＲＮＡを切
断する制限酵素として診断薬、生化学試薬等の試薬とし
ても応用できるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】リボザイムの２次構造と標的ＲＮＡの切断箇所
を示す模式図である。

【図２】本発明の安定化リボザイム（比較：合成リボザ
イム）のポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。

【図３】本発明の安定化リボザイム（比較：合成リボザ
イム）を牛血清とともに反応させたときの安定化リボザ
イムの経時変化を示すグラフである。

【図４】標的ＲＮＡに本発明の安定化リボザイムを反応
させたときの、反応物の経時変化を示すポリアクリルア
ミドゲル電気泳動図である。

【符号の説明】

図１において、 大きな文字のＡ ：標的ＲＮＡ中のＧ
ＵＣ領域 大きな文字のＢ ：リボザイム中の触媒活性部位を含む
２４個の特定の塩基配列を有する領域 大きな文字のＣ ：標的ＲＮＡと塩基対を形成するリボ
ザイム中の結合領域 矢印 ：標的ＲＮＡの切断部位 Ａ、Ｇ又はＵを丸印で囲ったもの：触媒活性部位 図２において、 II ：式(II)の化合物 III：式(III)の化合物 IV ：式(IV)の化合物 ↓ ：電気泳動方向 図３において、 △ ：式(II)の化合物 ○ ：式(III)の化合物 □ ：式(IV)の化合物

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 多比良 和誠 茨城県つくば市東１丁目１番３号工業技術 院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 西川 諭 茨城県つくば市東１丁目１番３号工業技術 院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 前田 英勝 茨城県つくば市東１丁目１番３号工業技術 院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 嶋山 隆 東京都新宿区西新宿二丁目１番１号 日立 化成工業株式会社内 (72)発明者 井筒 浩 茨城県つくば市和台48番日立化成工業株式 会社筑波開発研究所内 (72)発明者 大川 淳 兵庫県神戸市西区室谷２丁目２番３号長瀬 産業株式会社研究開発センター内 (72)発明者 岡部 宗一 兵庫県神戸市西区室谷２丁目２番３号長瀬 産業株式会社研究開発センター内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式（Ｉ）で表される安定化リボザイム。 【化１】 （式（Ｉ）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵはそれぞれアデニン
   モノリボヌクレオチド、グアニンモノリボヌクレオチ
   ド、シトシンモノリボヌクレオチド、ウラシルモノリボ
   ヌクレオチドを表し、網掛けのＡ、網掛けのＧ及び網掛
   けのＣはそれぞれアデニンモノデオキシリボヌクレオチ
   ド、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド、シトシン
   モノデオキシリボヌクレオチドを表し、網掛けのＸはア
   デニンモノデオキシリボヌクレオチド、グアニンモノデ
   オキシリボヌクレオチド、シトシンモノデオキシリボヌ
   クレオチド、チミンモノデオキシリボヌクレオチドのい
   ずれか任意のモノデオキシリボヌクレオチドを表し、ｓ
   はチオリン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）
   −Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕を表し、
   ｍ及びｎはそれぞれ異ってもよい１又は２以上の整数を
   表し、*は相補的なヌクレオチド間の塩基対を表す。）
2. 【請求項２】核酸塩基の活性基及び５'−水酸基が保護
   基で保護され、３'−水酸基は架橋構造を介して担体に
   結合しているモノデオキシリボヌクレオシド（固相）か
   ら、（ａ）５'−水酸基の保護基をはずしたのち、固相
   を洗浄し、（ｂ）核酸塩基の活性基並びに２'−及び５'
   −水酸基が保護基で保護されたリボヌクレオシド−３'
   −Ｏ−（β−シアノエチル）ホスホアミダイト又は核酸
   塩基の活性基並びに５'−水酸基が保護基で保護された
   デオキシリボヌクレオシド−３'−Ｏ−（β−シアノエ
   チル）ホスホアミダイトを反応させ、次いで固相を洗浄
   し、（ｃ）未反応の５'−水酸基をアセチル化したのち
   固相を洗浄する工程、及び酸化剤で酸化したのち固相を
   洗浄する工程を、任意の順序で行い、（ｄ）以下、
   （ａ）〜（ｃ）を繰り返し、（ｅ）固相をアルカリ処理
   して、３'−水酸基と担体のあいだの結合を切り、
   （ｆ）他の保護基をはずす、ことを特徴とする請求項１
   の安定化リボザイムの製造方法。
3. 【請求項３】酸化剤がヨウ素及び／又はテトラエチルチ
   ウラムジサルファイドを含むものである請求項２記載の
   製造方法。
4. 【請求項４】標的ＲＮＡを請求項１に記載の安定化リボ
   ザイムと反応させることを特徴とする、標的ＲＮＡの切
   断又は不活化方法。
5. 【請求項５】請求項１に記載の安定化リボザイムを有効
   成分とする医薬、動物薬、農薬又は試薬。