MX2011006895A

MX2011006895A - Pasta de papel de fibra mejorada.

Info

Publication number: MX2011006895A
Application number: MX2011006895A
Authority: MX
Inventors: Ramy Abraham Azer
Original assignee: Papyrus Technology Pty Ltd
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2011-10-06
Also published as: EP2376706A4; RU2011128123A; JP2012513545A; CN102333920A; CA2748088A1; EG26631A2; US20120152473A1; AU2009329834A1; EP2376706A1; AU2009329834B2; WO2010071945A1; EP2376706B1; US8784609B2

Abstract

Pasta de papel de fibra para uso en la fabricación de papel y productos basados en papel, la pasta de papel de fibra consiste esencialmente de tejido de peciolo de planta, en donde las fibras de peciolo longitudinalmente alineadas de forma sustancial se han cortado de forma generalmente lateral para formar 5 fibras con una distribución de longitud de fibra tal que al menos 95% de las fibras tienen sustancialmente la misma longitud de fibra predeterminada.

Description

DIAGNOSIS Y TRATAM IENTO DEL CANC ER UTILIZANDO EL ANTICU ERPO ANTI-LGR7 Campo de la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos que unen la proteína LGR7 , métodos para diagnosticar y tratar el cáncer, y agentes anticáncer.

Antecedentes de la Invención La molécula LG R7 es una proteína codificada por el gen de Ensembl I D ENSG000001 71 509 en 4q32 en el cromosoma humano. Con base en las características de su secuencia de aminoácido, la molécula se clasifica como un miembro de la familia LG R de la familia de la proteína receptora de hormona de siete transmembranas acoplada a la proteína G (familia G PCR rica en Leucina; más adelante, designada como la familia LG R) ( Documento no relacionado con patente 1 ), y se registró como N M_021 634/N P_067647 en RefSeq. U na secuencia en la cual Leu en la posición 70 del aminoácido se sustituye con Met también se ha reportado (Documento de Patente 1 ). Además, se han reportado tres variantes de empalme. En LG R7.1 (AY899848.1 ), se i nserta el exón 6a entre los exones 6 y 7 y el exón 1 5a se inserta entre los exones 1 5 y 16. LGR7.2 (AY899849.1 ) tiene una estructura de gen de la cual se eliminan los exones 1 2 y 1 3. En LGR7.1 0 (AY899850.1 ), se elimina el exón 3. Se clasifican los miembros de la familia LGR en tres grupos: el primer grupo incluye los receptores de hormona FSHR (LGR1 ), LHCGR (LGR2), y TSHR (LGR3); el segundo grupo incluye LGR4, LGR5, y LGR6 cuyos ligandos son desconocidos; y el tercer grupo incluye LGR7 y LGR8 cuyos ligandos son relaxina, péptido similar a insulina 3 (INSL3), y tal (Documento no relacionado con patente 2). En todos los casos, los ligandos son dos péptidos heterogéneos y transducen principalmente señales mediadas por cAMP en las células. La familia LGR tiene una estructura que comprende una región de proteína de siete transmembranas y un dominio extracelular de terminal N largo, y el dominio extracelular tiene 9 a 17 repeticiones ricas en leucina (LRRs) que comprende aproximadamente 25 residuos de aminoácido. LGR7 tiene diez LRRs (Documento no relacionado con patente 1). También tiene un dominio LDL-A en la terminal N inmediatamente antes de LRR, que no se encuentra en otras moléculas de la familia LGR (Documento no relacionado con patente 3). Se ha reportado que LDL-A es necesario para la transducción de señal, y se involucra en el tráfico de membrana de LGR7 (Documento no relacionado con patente 4). Se conoce del análisis de TSHR y tal que en moléculas de la familia LGR, el LRR extracelular se une con alta afinidad a un ligando que además une al segundo dominio de bucle extracelular, de tal modo causando la transducción de señal acoplada a la proteína G (Documento no relacionado con patente 5). Se conocen las relaxinas como ligandos que unen a LGR7, e incluyen Relaxina 2 y Relaxina 3 humanas. La Relaxina 2 tiene capacidad de unión mayor, y se desea que funcione como un ligando de LGR7 in vivo (Documentos no relacionados con patente 6 y 7).

Hay un informe sobre la asociación de la relaxina (ligando) con el carcinoma de tiroides y cáncer de próstata (Documento no relacionado con patente 8). Con respecto al cáncer de próstata, se reportó que el crecimiento independiente de andrógeno es promovido en la línea celular del cáncer de próstata LNCaP introducida con p53 que tiene mutación del aminoácido R a H en la posición 273 (Documento no relacionado con patente 9). Puesto que el nivel de relaxina H2 se eleva en estas células, se sugiere que la expresión de relaxina H2 está involucrada en la progresión del cáncer de próstata. Se muestra que p53 R273H une directamente al promotor de relaxina H2 e induce la expresión PSA vía un receptor andrógeno. Sin embargo, todavía no hay artículos que reportan la asociación entre LGR7 y el cáncer.

Por otra parte, algunos documentos de patente han reportado una expresión de gen LGR7 mayor en cáncer uterino y cáncer ovárico que en tejidos normales, y la asociación entre LGR7 y el cáncer. Sin embargo, no es conocido si los cánceres que expresan LGR7 pueden tratarse utilizando anticuerpos, y ninguno de los documentos demuestran un efecto anticáncer mediado por anticuerpo (Documentos de Patente 2 a 5).

Incluso entre cánceres ováricos, el adenocarcinoma de células claras se conoce como un tipo de cáncer que es menos eficaz mediante quimioterapia (Documentos no relacionados con patente 10 y 11). Sugiyama y colaboradores reportó que la relación de respuesta hacia la quimioterapia utiliza compuestos de cisplatina y taxano, que es un método terapéutico estándar, es 72.5% en adenocarcinoma serosa, y tan bajo como 11.1% en adenocarcinoma de células claras (Documento no relacionado con patente 10). Mientras tanto, el número de pacientes con adenocarcinoma de células claras se ha incrementado estos últimos años. De acuerdo con Nihon Sanfujinka Gakkai-shi vol. 57, No. 11, P. 1711 (2005), el adenocarcinoma de células claras representa el 22% de todos los cánceres ováricos en Japón. Esto es altamente diferente del número (6%) reportado en 1998 FIGO Annual Report en ultramar. Además, de acuerdo con el reporte por la Japan Society of Obstetrics and Gynecology, el relación de adenocarcinoma de células claras en todos los tumores malignos epiteliales en cánceres ováricos fue de 4% en 1971 a 1977, aproximadamente 10% en 1978 a 1983, pero mayor del 20% en 2002, y un continuo aumentando. Por lo tanto, es deseable desarrollar métodos terapéuticos contra el adenocarcinoma de células claras.

[Documentos de la Técnica Anterior] [Documentos de Patente] [Documento de Patente 1] WO 9948921 [Documento de Patente 2] US 2005107595 [Documento de Patente 3] WO 2003016487 [Documento de Patente 4] WO 2003093827 [Documento de Patente 5] WO 2005107396 [Documentos no relacionados con patente] [Documento no relacionado con patente 1] Hsu, S. Y. y colaboradores, olec. Endocr., 14, 1257-1271 (2000) [Documento no relacionado con patente 2] Hsueh A. J. W. y colaboradores, Journal of Endocrinology, 187, 333-338 (2005) [Documento no relacionado con patente 3] Bathgate RA. y colaboradores, Pharmacol Rev, 58, 7-31 (2006) [Documento no relacionado con patente 4] Kern A. y colaboradores, Endocrinology, 148, 1181-1194 (2007) [Documento no relacionado con patente 5] Kristiansen K., Pharmacology & Therapeutics, 103, 21-80 (2004) [Documento no relacionado con patente 6] Halls M. L. y colaboradores, British Journal of Pharmacology, 150, 677-691 (2007) [Documento no relacionado con patente 7] Van Der Westhuizen, E. T. y colaboradores, Current Drug Targets, 8, 91-104 (2007) [Documento no relacionado con patente 8] Hombach-Klonisch S. y colaboradores, American Journal of Pathology, 169, 617-632 (2006) [Documento no relacionado con patente 9] Vinall R. L. y colaboradores, Oncogene, 25, 2082-2093 (2006) [Documento no relacionado con patente 1 0] Sugiyama T y colaboradores Cáncer, 88, 2584 (2000) [Documento no relacionado con patente 1 1 ] Enomoto T y colaboradores Proceedings of ASCO. 2003; 1797 , Chicago Breve Descripción de la Invención Problemas a Solucionarse por la I nvención U n objetivo de la presente invención es proporcionar nuevos anticuerpos que unan a la proteína LG R7, nuevos métodos para d iagnosticar el cáncer, nuevos métodos para tratar el cáncer, y nuevos inhibidores del crecimiento celular y agentes anticáncer. Medios para Solucionar los Problemas Los presentes i nventores descubrieron que no sólo el gen LGR7 sino también la proteína LG R7 están expresados altamente en células de adenocarcinoma de células claras del cáncer ovárico . No ha habido ningún informe con respecto a que LGR7 está estrechamente vinculado a solamente un tipo de carci noma entre cánceres ováricos - adenocarcinoma de cél ulas claras.

Además, los presentes inventores produjeron anticuerpos monoclonales contra la proteína LG R7.

Los presentes inventores midieron las actividades de citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpos (ADCC) de los anticuerpos anti-LGR7 , y descubrieron que los anticuerpos anti-LGR7 tienen células que expresan LG R7 contra actividad de ADCC. Los presentes inventores también midieron las actividades de citotoxicidad mediada por célula dependiente de complemento (CDC), y descubrieron que los anticuerpos anti-LGR7 tienen células que expresan LGR7 contra actividad de CDC. Además, el efecto de regresión de tumor de los anticuerpos anti-LGR7 se demostró administrándole al ratón modelo el tumor en xenoinjerto. Con base en los resultados anteriores, los presentes inventores descubrieron que los anticuerpos anti-LGR7 son efectivos para la diagnosis, prevención, y tratamiento del adenocarcinoma ovárico de células claras primario o metastásico, y así completando la presente invención. Más específicamente, los presentes inventores descubrieron que los anticuerpos anti-LGR7 son útiles como herramientas para el tratamiento y diagnosis de cánceres que expresan altamente LGR7 tal como adenocarcinoma ovárico de células claras, y así completar la presente invención.

Específicamente, la presente invención proporciona anticuerpos de unión a proteína LGR7. Además, la presente invención proporciona anticuerpos de unión a proteína LGR7 que tienen actividad citotóxica contra células que expresan la proteína LGR7. Preferiblemente, la actividad citotóxica es actividad de ADCC. La presente invención también proporciona anticuerpos anti-LGR7 unidos con una sustancia citotóxica.

Además, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de unión a proteína LGR7 como un ingrediente activo. La presente invención también proporciona inhibidores del crecimiento celular que comprende un anticuerpo de unión a proteína LGR7 como un ingrediente activo. La presente invención proporciona agentes anticáncer que comprenden un anticuerpo de unión a proteína LGR7 como un ingrediente activo.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de unión a proteína LGR7 y un portador farmacéuticamente aceptable. Más específicamente, la presente invención proporciona las invenciones de [1] a [23] a continuación: [1] Un anticuerpo que une a una proteína LGR7 y que tiene actividad inhibidora del crecimiento celular contra células que expresan la proteína LGR7. [2] El anticuerpo de [1], en donde la actividad inhibidora del crecimiento celular es actividad citotóxica. [3] El anticuerpo de [2], en donde la actividad citotóxica es actividad de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos. [4] El anticuerpo de [2], en donde la actividad citotóxica es actividad de citotoxicidad dependiente de complemento. [5] El anticuerpo de cualquiera de [1] a [4], que es un anticuerpo al cual se une una sustancia citotóxica. [6] El anticuerpo de [5], que es un anticuerpo que tiene una actividad de internalización. [7] El anticuerpo de cualquiera de [1] a [6], que es un anticuerpo que suprime el crecimiento de células cancerosas. [8] El anticuerpo de [7], en donde las células cancerosas son células cancerosas ováricas de células claras. [9] Un anticuerpo de cualquiera de (1) (29) a continuación: (1) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 5 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 6 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 7 como CDR3 (cadena pesada de 22DA6); (2) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10 como CDR1 , la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 11 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12 como CDR3 (cadena ligera de 22DA6); (3) un anticuerpo que comprende la cadena H de (1) y la cadena L de (2) (22DA6); (4) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17 como CDR3 (cadena pesada de 22DA7); (5) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 20 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 21 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 22 como CDR3 (cadena ligera de 22DA7); (6) un anticuerpo que comprende la cadena H de (4) y la cadena L de (5) (22DA7); (7) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 25 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 26 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 27 como CDR3 (cadena pesada de 22DA17); (8) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 30 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 31 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 32 como CDR3 (cadena ligera de 22DA17); (9) un anticuerpo que comprende la cadena H de (7) y la cadena L de (8) (22DA17); (10) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 35 como CDR1 , la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 36 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 37 como CDR3 (cadena pesada de 22DA22); (11) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 40 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 41 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 42 como CDR3 (cadena ligera de 22DA22); (12) un anticuerpo que comprende la cadena H de (10) y la cadena L de (11) (22DA22); (13) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 45 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 46 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 47 como CDR3 (cadena pesada de 22DA23); (14) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 50 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 51 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 52 como CDR3 (cadena ligera de 22DA23); (15) un anticuerpo que comprende la cadena H de (13) y la cadena L de (14) (22DA23); (16) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 55 como CDR1 , la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 56 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 57 como CDR3 (cadena pesada de 22DA24); (17) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 60 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 61 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 62 como CDR3 (cadena ligera de 22DA24); (18) un anticuerpo que comprende la cadena H de (16) y la cadena L de (17) (22DA24); (19) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 65 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 66 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 67 como CDR3 (cadena pesada de 22SD7); (20) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 70 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 71 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 72 como CDR3 (cadena ligera de 22SD7); (21) un anticuerpo que comprende la cadena H de (19) y la cadena L de (20) (22SD7); (22) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 75 como CDR1 , la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 76 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 77 como CDR3 (cadena pesada de 22SD11); (23) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 80 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 81 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 82 como CDR3 (cadena ligera de 22SD11); (24) un anticuerpo que comprende la cadena H de (22) y la cadena L de (23) (22SD11); (25) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 85 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 86 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 87 como CDR3 (cadena pesada de 22SD48); (26) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 90 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 91 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 92 como CDR3 (cadena ligera de 22SD48); (27) un anticuerpo que comprende la cadena H de (25) y la cadena L de (26) (22SD48); (28) un anticuerpo que tienen la actividad equivalente como el anticuerpo de cualquiera de (1) a (27); (29) un anticuerpo que reconoce el mismo epítope reconocido por el anticuerpo de cualquiera de (1) a (27). [10] El anticuerpo de [1] a [9], que tiene una región constante humana. [11] El anticuerpo de [10], que es un anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, o anticuerpo humano. [12] El anticuerpo de cualquiera de [1] a [11], que es un anticuerpo deficiente de fucosa. [13] Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de [1] a [12] como un ingrediente activo. [14] Un inhibidor del crecimiento celular que comprende el anticuerpo de cualquiera de [1] a [12] como un ingrediente activo. [15] Un agente anticáncer que comprende el anticuerpo de cualquiera de [1] a [12] como un ingrediente activo. [16] El agente anticáncer de [15], en donde el cáncer a tratarse es cáncer ovárico. [17] El agente anticáncer de [16], en donde el cáncer ovárico es adenocarcinoma de células claras. [18] Un método para diagnosticar cáncer, que comprende detectar una proteína LGR7 o un gen que codifica una proteína LGR7. [19] Un método para diagnosticar cáncer, que comprende detectar una proteína LGR7. [20] El método de diagnóstico de [19], en donde la proteína LGR7 se detecta utilizando un anticuerpo que une a la proteína LGR7. [21] Un método para diagnosticar cáncer, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra recolectada de un sujeto; y (b) detectar una proteína LGR7 contenida en la muestra de (a) utilizando un anticuerpo que une a la proteína LGR7. [22] Un método para diagnosticar cáncer, que comprende las etapas de: (a) administrar a un sujeto un anticuerpo que tiene actividad de unión hacia una proteína LGR7 y que es etiquetada con un radioisótopo; y (b) detectar la acumulación del radioisótopo. [23] El método de diagnóstico de cualquiera de [1 8] a [22], en donde el cáncer a diagnosticarse es cáncer ovárico. [24] El método de diagnóstico de [23], en donde el cáncer ovárico es adenocarcinóma de células claras.

Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 -1 muestra el perfil de la expresión de LGR7 ( 1 55271 5_a_at) en diez casos de cánceres ováricos incluyendo los siguientes tipos de tejido: carcinoma de células claras (cuatro casos), adenocarcinóma seroso (dos casos), adenocarcinóma endometrioide (tres casos), y carcinosarcoma (un caso), así como diez tipos de tejidos normales, cuatro tipos de tejidos fetales, cuatro tipos de líneas cel ulares de cáncer ovárico, y 87 casos de cáncer ovárico incluyendo tres casos de cáncer de células claras de los datos de expresión U 1 33 Pl us 2.0 publicados por la I nternational Genomics Consortium (I GC). Las letras indicadas bajo los nombres de la muestra de I GC se refieren respectivamente a lo siguiente: C, adenocarci nóma de células claras ; E , adenocarcinóma endometrioide; S , adenocarci nóma seroso; M, adenocarcinóma mucinoso; O, otros cánceres; y B, cistadenoma seroso benigno de bajo grado de riesgo maligno. J HOC-5, MCAS , RMG-1 , RM UG-S, y TKY-nu son l íneas celulares de cáncer ovárico, y entre ellos, RMG-1 es una l ínea celular derivada de adenocarcinóma de células claras.

La figura 1 -2 muestra el perfil de expresión de LG R7 ( 1 55271 5_a_at).

La figura 1-3 muestra el perfil de expresión de LGR7 (1552715_a_at).

La figura 2 presenta una fotografía que muestra el resultado para detectar la expresión LGR7 en HA-LGR7/BaF3#48 y HA-LGR7/DG44#24 sometiendo Usados de célula a electroforesis de SDS-PAGE, y Western blotting utilizando un anticuerpo anti-HA (HA-7). Fila 1: BaF3; fila 2: HA-LGR7/BaF3#48; fila 3: DG44; y fila 4: HA-LGR7/DG44#24.

La figura 3 muestra los resultados de medir la actividad de ADCC por la liberación de Cr utilizando HA-LGR7/DG44 como la célula objetivo y NK92mFcR3 como la célula efectora.

La figura 4 muestra los resultados de medir la citotoxicidad dependiente de complemento utilizando HA-LGR7/DG44 como la célula objetivo, y haciéndola reaccionar con un anticuerpo anti-LGR7 junto con un complemento de conejo bebé. La intensidad de la actividad de CDC se definió por la proporción de células de incorporación de 7-AAD a células reaccionadas con cada anticuerpo.

La figura 5 muestra los resultados para determinar el número de células viables utilizando HA-LGR7/DG44 como la célula objetivo, y haciéndola reaccionar con Mab-ZAP (anticuerpo anti-ratón etiquetado con saporina) y cada anticuerpo monoclonal, y después realizando el ensayo WST8. Un valor mayor en el eje vertical indica un número mayor de células viables.

La figura 6 muestra que la reacción cruzada de 22DA17 y 22DA23 con LGR7 de ratón basada en el análisis de FACS de HA-ml_GR7/BaF3. El eje vertical indica los valores promedio geométricos.

La figura 7 muestra los resultados del análisis de FACS de competición utilizando los anticuerpos biotinilados Bio-22DA17 y Bio-22DA22. Si los anticuerpos reconocen diferentes epítopes se determinaron observando la competición para el epítope por un anticuerpo no etiquetado. Se encontró que 22DA12 y 22DA22 son anticuerpos que reconocen diferentes epítopes de los de otros anticuerpos. Las líneas continuas indican los resultados de hacer reaccionar anticuerpos biotinilados, y los picos sombreados indican los resultados de hacer reaccionar un anticuerpo antiratón de reconocimiento de FITC.

La figura 8 muestra el resultado de una prueba de eficacia de fármaco utilizando un modelo de xenoinjerto de ratón. En la gráfica, el volumen de tumor después de la administración del anticuerpo es graficado contra los días después del trasplante de tumor. La línea continua muestra el resultado del grupo administrado con PBS (control negativo). La línea discontinua con cuadrados muestra el resultado del grupo administrado con 10 mg/kg del anticuerpo FTKODA23, y la línea discontinua con triángulos muestra el resultado del grupo administrado con 2 mg/kg del anticuerpo FTKODA23.

Modo Para Realizar la Invención LGR7 En la presente invención, LGR7 es una proteína de miembro de la familia LGR de transmembrana-siete. La secuencia de aminoácido de LGR7 humano y la que codifica de la secuencia de gen se describen en la accesión de NCBI números NP_067647 (SEC ID NO: 1) y NM_021634 (SEC ID NO: 2), respectivamente. LGR7 usado en la presente invención puede ser variantes o mutantes de empalme. En la presente invención, la "proteína LGR7" se refiere a la proteína longitud completa y un fragmento de la misma. En la presente, "fragmento" se refiere a un polipéptido que comprende cualquier región de la proteína LGR7, y no necesariamente tiene la función de la proteína LGR7 que ocurre naturalmente. Un ejemplo del fragmento es un fragmento que comprende un dominio extracelular de la proteína LGR7. Los dominios extracelulares de la proteína LGR7 corresponden a las posiciones 1 a 404, 462 a 485, 549 a 581, y 648 a 661 en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1. Las regiones de transmembrana corresponden a las posiciones 405 a 427, 439 a 461, 486 a 508, 529-548, 582 a 604, 625-647, y 662 a 681 en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1.

Preparación de los Anticuerpos anti-LGR7 El origen, tipo, forma, y tal de un anticuerpo anti-LGR7 usado en la presente invención no se limitan, siempre y cando se unan a la proteína LGR7. Más específicamente, pueden utilizarse anticuerpos conocidos tal como anticuerpos de animales no humanos (por ejemplo, anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, y anticuerpos de camello), anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, y similares. En la presente invención, un anticuerpo monoclonal o policlonal puede utilizarse, pero es preferible un anticuerpo monoclonal. La unión entre un anticuerpo y la proteína LGR7 es preferiblemente específica. Cuando un anticuerpo anti-LGR7 usado en la presente invención es un anticuerpo que reconoce LGR7 humano, puede reconocer específicamente LGR7 humano, o puede al mismo tiempo reconocer LGR7 derivado de otro animal (por ejemplo, LGR7 de ratón).

Un anticuerpo anti-LGR7 usado en la presente invención puede obtenerse como un anticuerpo policlonal o monoclonal utilizando medios conocidos. El anticuerpo anti-LGR7 usado en la presente invención es preferiblemente un anticuerpo monoclonal derivado de mamífero particularmente. Los anticuerpos monoclonales derivados de mamífero incluyen anticuerpos producidos por un hibridoma y anticuerpos producidos por un huésped transformado con un vector de expresión que contiene un gen de anticuerpo utilizando un método de ingeniería genética.

Básicamente, pueden prepararse hibridomas que producen anticuerpos monoclonales utilizando técnicas sabidas como sigue. Primero, la inmunización es realizada por un método de inmunización convencional utilizando la proteína LGR7 como el antígeno de sensibilización. Son preparados los hibridomas fusionando las células inmunes obtenidas de un animal inmunizado con una célula parental conocida utilizando un método de fusión celular convencional. Después, puede seleccionarse un hibridoma que produce un anticuerpo anti-LGR7 de los hibridomas por análisis para una célula que produce el anticuerpo de interés utilizando un método de análisis convencional.

Específicamente, se preparan anticuerpos monoclonales, por ejemplo, como se muestra a continuación. Primero, la proteína LGR7 a utilizarse como el antígeno de sensibilización para producir un anticuerpo puede obtenerse expresando el gen LGR7. La secuencia de nucleótido del gen LGR7 se describió en el número de acceso de NCBI NM_021634 (SEC ID NO: 2), etc. Es decir, una secuencia de gen que codifica LGR7 se inserta en un vector de expresión conocido, y células hospedadoras adecuadas se transforman con este vector, y después la proteína LGR7 humana de interés puede purificarse de las células hospedadoras o sobrenadantes de cultivo utilizando un método conocido. Puede también utilizarse una LGR7 proteína que ocurre naturalmente purificada. Además, como se utiliza en la presente invención, una proteína de fusión obtenida fusionando un polipéptido parcial deseado de la proteína LGR7 con un diferente polipéptido puede también utilizarse como el inmunógeno. Por ejemplo, un fragmento Fe del anticuerpo, tag de péptido, o tal pueden utilizarse para producir una proteína de fusión como el inmunógeno. Puede prepararse un vector que expresa la proteína de fusión fusionando los genes que codifican dos o más fragmentos del polipéptido deseados, e inserta el gen de fusión en un vector de expresión. Se describen métodos para preparar proteínas de fusión en Molecular Cloning, 2a ed. (Sambrook J y colaboradores, Molecular Cloning 2a ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).

Así puede utilizarse una proteína LGR7 purificada como un antígeno de sensibilización para uso en la inmunización de un mamífero. Puede también utilizarse un péptido parcial LGR7 como el antígeno de sensibilización. Por ejemplo, los siguientes péptidos pueden utilizarse como el antígeno de sensibilización: un péptido obtenido mediante síntesis química basada en la secuencia de aminoácido de LGR7 humano; un péptido obtenido insertando una porción del gen LGR7 en un vector de expresión y expresándola; y un péptido obtenido por la degradación de proteasa de la proteína LGR7.

No hay limitación particular en la región y tamaño de LGR7 a utilizarse como el péptido parcial. Puede seleccionarse una región preferida de las secuencias de aminoácidos que constituyen los dominios extracelulares de LGR7 (posiciones 1 a 404, 462 a 485, 549 a 581, y 648 a 661 en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1). El número de aminoácidos que constituye un péptido a utilizarse como el antígeno de sensibilización es preferiblemente por lo menos tres o más, por ejemplo, cinco o más, o seises o más. Más específicamente, un péptido que tiene ocho a 50 residuos, preferiblemente diez a 30 residuos puede utilizarse como el antígeno de sensibilización.

No hay limitación particular en el mamífero a inmunizarse con el antígeno de sensibilización. Para obtener un anticuerpo monoclonal por un método de fusión celular, el animal a inmunizarse es seleccionado preferiblemente considerando la compatibilidad con la célula parental usada para la fusión celular. En general, los roedores son animales preferibles para la inmunización. Más específicamente, un ratón, rata, hámster, o conejo pueden utilizarse como el animal a inmunizarse. Alternativamente, un mono o tal puede utilizarse como el animal a inmunizarse.

Los animales anteriormente mencionados pueden inmunizarse con el antígeno de sensibilización utilizando un método conocido. En un método general, por ejemplo, un mamífero puede inmunizarse por inyección intraperitoneal o subcutánea de un antígeno de sensibilización. Más específicamente, el antígeno de sensibilización se administra al mamífero varias veces cada cuatro a 21 días. El antígeno de sensibilización se diluye en una relación de dilución adecuada en salina amortiguada con fosfato (PBS), salina fisiológica, o tal, y utiliza para inmunización. El antígeno de sensibilización puede administrarse junto con un adyuvante. Por ejemplo, el antígeno de sensibilización puede prepararse mezclando y emulsionando con adyuvante completo de Freund. Además, un portador adecuado puede utilizarse en inmunización con el antígeno de sensibilización. Particularmente, cuando un péptido parcial de bajo peso molecular se utiliza como el antígeno de sensibilización, es deseable unir el péptido del antígeno de sensibilización a una proteína de portador tal como albúmina, hemocianina de lapa calífomiana, y utiliza este para inmunización.

Por otra parte, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales mediante inmunización del ADN. La inmunización del ADN es un método que confiere estimulación inmune administrando en un animal inmunizado un ADN de vector construido en una forma que permita a un gen que codifica de proteína del antígeno (por ejemplo, SEC ID NO: 2) ser expresado en el animal inmunizado, y que expresa el antígeno de inmunización en el cuerpo del animal inmunizado. Comparado con métodos de inmunización generales por los cuales un antígeno de proteína es administrado, las siguientes ventajas pueden esperarse de la inmunización del ADN: - puede proporcionarse estimulación inmune mientras se conserve la estructura de una proteína de membrana tal como LGR7; y - no hay necesidad de purificar el antígeno de inmunización. Por otra parte, sin embargo, es difícil combinar la inmunización del ADN con medios estimulantes inmunes tal como un adyuvante. Se predijo que puesto que LGR7 tiene la característica estructural de una conformación de transmembrana-siete, será difícil inducir una inmunorespuesta a LGR7 in vivo mientras conserva su estructura que ocurre naturalmente. Debido a tal característica estructural, fue un resultado inesperado haber obtenido realmente por los anticuerpos monoclonales de inmunización de ADN que unen a LGR7, que es una proteína que pertenece a la familia LGR para la cual la producción del anticuerpo es difícil.

Para obtener un anticuerpo monoclonal de la presente invención mediante inmunización de ADN, un ADN que expresa la proteína LGR7 primero se administra a un animal a inmunizarse. Puede sintetizarse el ADN que codifica LGR7 por métodos conocidos tal como PCR. Se inserta el ADN obtenido en un vector de expresión adecuado y administra al animal a inmunizarse. Un vector de expresión comercialmente disponible tal como pcADN3.1 puede utilizarse como el vector de expresión. Pueden utilizarse métodos generalmente usados para administrar el vector en el cuerpo. Por ejemplo, la inmunización del ADN puede realizarse utilizando una pistola de genes para tirar partículas de oro adsorbidas con el vector de expresión en las células.

Así se inmuniza un mamífero, y se observa un incremento en el nivel de un anticuerpo deseado en el suero. Entonces, se recolectan las células inmunes del mamífero y someten a fusión celular. En particular, pueden utilizarse células de bazo preferiblemente como las células inmunes.

Se utiliza una célula de mieloma de mamífero como una célula a fusionarse con el inmunocito anteriormente mencionado. Las células de mieloma comprenden preferiblemente un marcador de selección adecuado para análisis. Un marcador de selección confiere las características a las células para que su supervivencia (o no puede sobrevivir) bajo una condición de cultivo específica. La deficiencia de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (más adelante abreviada como deficiencia de HGPRT), y deficiencia de timidina cinasa (más adelante abreviada como deficiencia de TK) se conocen como marcadores de selección. Las células que tienen deficiencia de HGPRT o TK tienen sensibilidad de hipoxantina-aminopterina-timidina (más adelante abreviada como sensibilidad de HAT). Las células sensibles a HAT no pueden realizar la síntesis del ADN en un medio de selección de HAT, y por lo tanto mueren. Sin embargo, cuando las células son fusionadas con células normales, pueden continuar para sintetizar el ADN utilizando la trayectoria de recuperación de las células normales, y por lo tanto pueden crecer en el medio de selección de HAT.

Las células deficientes de HGPRT y deficientes de TK pueden seleccionarse en un medio que contiene 6-azaguanina o 8-tioguanina (más adelante abreviado como 8AG), y 5'- bromodeoxiuridina, respectivamente. Las células normales son eliminadas puesto que incorporan estos análogos de pirimidina en el ADN. Por otra parte, las células que son deficientes en estas enzimas pueden sobrevivir en el medio de selección, puesto que no pueden incorporar estos análogos de pirimidina. Alternativamente, un marcador de selección designado como G418 resistente proporciona resistencia 2 a antibióticos tipo desoxistreptamina (análogos de gentamicina) del gen de resistencia a neomicina. Se conocen varios tipos de células de mieloma que son adecuados para fusión celular. Por ejemplo, las células de mieloma incluyendo las siguientes células pueden utilizarse para producir los anticuerpos monoclonales de la presente invención: P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550); P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7); NS-1 (Kohler. G. and ilstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519); PC-11 (Margulies. D.H. y colaboradores, Cell (1976) 8, 405-415); SP2/0 (Shulman, M. y colaboradores, Nature (1978) 276, 269-270); FO (de St. Groth, S. F. y colaboradores, J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21); S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323); y R210 (Galfre, G. y colaboradores, Nature (1979) 277, 131- 133).

La fusión celular de los inmunocitos anteriormente mencionados con células de mieloma es esencialmente realizada de acuerdo con un método conocido, por ejemplo, el método de Kohler and Milstein y colaboradores (Kohler. G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Más específicamente, la fusión celular anteriormente mencionada puede realizarse en un medio de cultivo nutricional estándar en presencia de, por ejemplo, un acelerador de fusión celular. Un acelerador de fusión celular puede ser, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), virus de Sendai (HVJ), o similares. Si se desea, puede agregarse un agente auxiliar tal como dimetilsulfóxido para mejorar adicionalmente la eficacia de la fusión.

La relación de inmunocitos a células de mieloma usada puede establecerse en su discreción. Por ejemplo, el número de inmunocitos se ajusta preferiblemente de una a diez veces de las células de mieloma. Como un medio a utilizarse para la fusión celular anteriormente mencionada, por ejemplo, medio de RPMI1640 y medio de MEM, que son apropiados para el crecimiento de la línea celular de mieloma anteriormente mencionada, u otro medio estándar a utilizarse para este tipo de cultivo celular puede utilizarse. Por otra parte, una solución de suplemento de suero tal como suero de becerro fetal puede agregarse al medio.

Se realiza la fusión celular mediante la mezcla de cantidades predeterminadas de los inmunocitos y células de mieloma anteriormente mencionados en el medio anteriormente mencionado, agregando y mezclando con una solución de PEG precalentada a aproximadamente 37°C, para formar las células fusionadas deseadas (hibridomas). En el método de fusión celular, por ejemplo, PEG con un peso molecular promedio de aproximadamente 1000 a 6000 puede agregarse generalmente en una concentración de 30 a 60% (p/v). Posteriormente, el agente para la fusión celular o similares que es desfavorable para el crecimiento de hibridomas puede eliminarse sucesivamente agregando un medio apropiado tal como los listados antes, eliminando el sobrenadante después de la centrifugación , y repitiendo estas etapas.

Los hibridomas obtenidos de este modo pueden seleccionarse utilizando un apropiado medio de selección para los marcadores de selección llevados por los mielomas usados para la fusión celular. Por ejemplo, las células que tienen deficiencias de HGPRT y TK pueden seleccionarse cultivándolas en un medio de HAT (un medio que contiene hi poxantina , aminopterina , y timidina). Más específicamente, cuando las células de mieloma Sensibles a HAT se utilizan para la fusión celular, las células que se fusionan exitosamente con células normales pueden hacerse crecer selectivamente en el medio de HAT. El cultivar que utiliza el medio de HAT anteriormente mencionado se conti núa por un periodo suficiente de tiempo para eliminar las células con excepción del hibridoma de interés (células no fusionadas). Más específicamente, el hibridoma de interés puede seleccionarse, normalmente cultivando por varios días a varias semanas. Posteriormente, los hibridomas que producen el anticuerpo de interés pueden ser analizados y un solo aislado realizando un método de dilución limitante estándar. Alternativamente, un anticuerpo que reconoce LGR7 puede prepararse utilizando el método descrito en la Publicación de Patente Internacional No. WO 03/104453.

El análisis para un anticuerpo de interés y clonación puede realizarse adecuadamente por un método de selección basado en reacciones antígeno-anticuerpo conocidas. Por ejemplo, un antígeno está unido a un portador tal como gránulos hechos de poliestireno o similares, o una microplaca de 96 pozos comercialmente disponibles o tal, y se hacen reaccionar con el sobrenadante de cultivo de un hibridoma. A continuación, después de enjuagar lejos el portador, un anticuerpo secundario etiquetado con una enzima, o tal se hace reaccionar. Si el anticuerpo de interés que reacciona con el antígeno de sensibilización se contiene en el sobrenadante de cultivo, el anticuerpo secundario unirá al portador vía el anticuerpo. Finalmente, si o no el anticuerpo de interés está presente en el sobrenadante de cultivo puede determinarse detectando el anticuerpo secundario unido al portador. Un hibridoma que produce un anticuerpo deseado que tiene capacidad de unión hacia el antígeno puede clonarse utilizando el método de dilución limitante o tal. En la presente, como un antígeno, el antígeno usado para la inmunización, o una proteína LGR7 que es sustancialmente idéntica además puede utilizarse adecuadamente. Por ejemplo, una línea celular que expresa LGR7, un dominio extracelular de LGR7, o un oligopéptido que comprende una secuencia de aminoácido parcial que constituye el dominio puede utilizarse como el antígeno.

Alternativamente, en vez de utilizar el método anterior para obtener el hibridoma inmunizando un animal no humano con un antígeno, el anticuerpo de interés puede obtenerse sensibilizando linfocitos humanos con el antígeno. Más específicamente, primero, los linfocitos humanos son sensibilizados por la proteína LGR7 ¡n vitro. Después, los linfocitos inmunosensibilizados están fusionados con un miembro de fusión adecuado. Por ejemplo, las células de mieloma derivadas de humano que pueden dividirse indefinidamente pueden utilizarse como el miembro de fusión (ver Publicación Kokoku de Solicitud de Patente Japonesa No. (JP-B) H01-59878 (solicitud de patente japonesa examinada, aprobada publicada para oposición)). El anticuerpo anti-LGR7 obtenido por este método es un anticuerpo humano que tiene la actividad para unir a la proteína LGR7.

Alternativamente, un anticuerpo humano anti-LGR7 puede obtenerse administrando la proteína LGR7 que sirve como un antígeno a un animal transgénico que tiene el repertorio completo de los genes del anticuerpo humano, o inmunizando tal animal con un ADN construido para expresar LGR7 en el animal. Las células que producen el anticuerpo del animal inmunizado pueden inmortalizarse por fusión celular con un miembro de fusión adecuado o tratamiento tal como infección del virus de Epstein-Barr. Un anticuerpo humano contra la proteína LGR7 puede aislarse de las células inmortalizadas obtenidas de este modo (ver Publicaciones Internacionales W094/25585, W093/12227, WO92/03918, y WO94/02602). Mediante clonación adicional las células inmortalizadas, es posible clonar células que producen un anticuerpo que tiene la especificidad de reacción de interés. Cuando se utiliza un animal transgénico como el animal inmunizado, el sistema inmune del animal reconoce LGR7 humano como una sustancia extranjera. Así, un anticuerpo humano contra LGR7 humano puede obtenerse fácilmente.

Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales producidos de este modo pueden pasarse y cultivarse en un medio estándar. Alternativamente, los hibridomas pueden almacenarse por un largo periodo en nitrógeno líquido.

Los hibridomas pueden cultivarse de acuerdo con un método estándar, y el anticuerpo monoclonal de interés puede obtenerse de los sobrenadantes de cultivo. Alternativamente, los hibridomas pueden hacerse crecer administrándolos a un mamífero compatible, y los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse como su ascitis. El método anterior es adecuado para obtener anticuerpos altamente purificados.

En la presente invención, un anticuerpo codificado por un gen de anticuerpo clonado de células que producen anticuerpos puede utilizarse. El gen de anticuerpo clonado puede incorporarse en un vector adecuado y después introducir en un huésped para expresar el anticuerpo. Los métodos para aislar un gen de anticuerpo, introducir el gen en un vector, y transformar células hospedadoras se han establecido (ver por ejemplo, Vandamme, A. M. y colaboradores, Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775).

Por ejemplo, un ADNc que codifica la región variable (región V) de un anticuerpo anti-LGR7 puede obtenerse de células de hibridoma produciendo el anticuerpo anti-LGR7. Generalmente, para lograr esto, primero, el ARN total se extrae del hibridoma. Por ejemplo, los siguientes métodos pueden utilizarse como métodos para extraer el ARNm de las células: el método de ultracentrifugación de guanidina (Chirgwin, J. M. y colaboradores, Biochemistry (1979) 18, 5294-5299); y el método de AGPC (Chomczynski, P. y colaboradores, Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159).

El ARNm extraído puede purificarse utilizando un kit de purificación de ARNm (fabricado por GE Healthcare Biosciences) o similares. Alternativamente, los kits tal como el kit de QuickPrep mRNA Purification (fabricado por GE Healthcare Biosciences) para la extracción directa del ARNm total de las células están comercialmente disponibles. El ARNm total puede obtenerse de un hibridoma utilizando tal kit. Un ADNc que codifica la región V del anticuerpo puede sintetizarse del ARNm obtenido utilizando una transcriptasa inversa. Una secuencia arbitraria de 15 a 30 bases seleccionadas de una secuencia común a los genes del anticuerpo de ratón puede utilizarse como un cebador. Específicamente, un ADNc que codifica la región V del anticuerpo puede obtenerse utilizando los cebadores que tienen las secuencias de ADN de las SEC ID NOS.: 97 a 100. Un ADNc puede sintetizarse utilizando el kit de AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis (fabricado por Seikagaku Corporation), etc. Alternativamente, el kit de 5*-Ampli FINDER RACE (fabricado por Clontech) y el método 5'-RACE que utiliza PCR (Frohman, M. A. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. y colaboradores, Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) pueden utilizarse para sintetizar y amplificar el ADNc. Adicionalmente, durante el proceso de síntesis de ADNc, los sitios de enzima de restricción adecuados mencionados más adelante pueden introducirse en ambos extremos del ADNc.

El fragmento de ADNc de interés se purifica del producto de PCR obtenido y después ligado a un ADN de vector. El vector recombinante se prepara así, e introduce en Escherichia Coli (E. coli) y similares, y seleccionan las colonias. Después, un vector recombinante deseado puede prepararse del E. col¡ formador de colonias. La secuencia de nucleótido del ADNc puede verificarse por un método conocido tal como el método de terminación de cadena de didesoxinucleótido.

Además, una biblioteca de ADNc puede utilizarse para obtener un gen que codifica una región de variable de anticuerpo. Primero, los ADNcs se sintetizan utilizando ARNms extraídos de las células que producen anticuerpos como un molde para obtener una biblioteca de ADNc. Se utiliza un kit comercialmente disponible adecuadamente para la síntesis de la biblioteca de ADNc. En práctica, la cantidad de ARNms obtenida de solamente pocas células es muy pequeña; así, el rendimiento es bajo si los ARNms se purifican directamente. Por lo tanto, la purificación se realiza generalmente después de la adición de un ARN de portador que claramente no contiene un gen de anticuerpo. Alternativamente, cuando cierta cantidad de ARNs puede extraerse, los ARNs de células que producen anticuerpos por sí mismos pueden extraerse eficientemente. Por ejemplo, la adición del ARN del portador no es necesario en algunos casos cuando os ARNs se extraen de 10 o más, o 30 o más, o preferiblemente 50 o más células que producen anticuerpos.

El gen de anticuerpo es amplificado por el método de PCR utilizando la biblioteca de ADNc obtenida como un molde. Se conocen los cebadores para amplificar un gen de anticuerpo por el método de PCR. Por ejemplo, es posible diseñar cebadores para amplificar un gen de anticuerpo humano basado en la descripción del artículo (J. Mol. Biol. (1991), 222, 581-597), y similares. Estos cebadores tienen diferentes secuencias de nucleótido que dependen de la subclase de ¡nmunoglobulina. Por lo tanto, deben tomarse todas las posibilidades en consideración cuando el método de PCR se realiza utilizando una biblioteca de ADNc de subclase desconocida como un molde.

Específicamente, por ejemplo, cuando el objetivo es obtener un gen que codifica IgG humano, uno puede utilizar cebadores capaces de amplificar genes que codifican ?1 a ?5 como la cadena pesada, y cadenas ? y ? como la cadena ligera. Para amplificar un gen de región variable de IgG, un cebador que hibridiza a una porción que corresponde a la región de bisagra se utiliza generalmente como el cebador del extremo 3'. Mientras tanto, un cebador para la subclase individual puede utilizarse como el cebador del extremo 5'.

Los productos de PCR producidos por los cebadores de amplificación del gen para cada subclase de cadena pesada o ligera se hacen en bibliotecas independientes. Utilizando las bibliotecas así sintetizadas, las inmunoglobulinas que comprende una combinación de cadenas pesada y ligera pueden reconstruirse. El anticuerpo de interés puede identificarse utilizando la actividad de unión de una ¡nmunoglobulina reconstruida hacia LGR7 como un indicador.

Por ejemplo, cuando el objetivo es obtener un anticuerpo contra LGR7, es más preferible que la unión entre el anticuerpo y LGR7 sea específica. Un anticuerpo de unión a LGR7 puede identificarse, por ejemplo, por las siguientes etapas: (1) poner en contacto LGR7 con un anticuerpo que comprende una región V codificada por un ADNc obtenido; (2) detectar la unión entre LGR7 y el anticuerpo; y (3) seleccionar un anticuerpo que une a LGR7.

Se conoce un método para detectar la unión entre un anticuerpo y LGR7. Más específicamente, un anticuerpo de prueba se hace reaccionar con LGR7 inmovilizado sobre un portador, y después se hace reaccionar un anticuerpo etiquetado que reconoce el anticuerpo. Si el anticuerpo etiquetado en el portador se detecta después de lavarse, después puede verificarse la unión entre el anticuerpo de prueba y LGR7. Las proteínas enzimáticamente activas tal como peroxidasa y ß-galactosidasa, o sustancias fluorescentes tal como FITC pueden utilizarse para el etiquetado. Puede utilizarse un espécimen fijo de células que expresan LGR7 para evaluar la actividad de unión del anticuerpo.

Alternativamente, para un método de análisis de anticuerpo basado en la actividad de unión, puede utilizarse un método de filtrado basado en vector de bacteriófago. Cuando se obtienen genes de anticuerpo pues como bibliotecas de las subclases de cadena pesada y cadena ligera de células que expresan anticuerpos policlonales como se menciona anteriormente, son ventajosos los métodos que exhiben fagos. Los genes que codifican regiones variables de las cadenas pesada y ligera pueden hacerse en un gen de Fv de cadena sencilla (scFv) ligando los genes vía secuencias de enlace adecuadas. Los fagos que expresan un scFv en su superficie pueden obtenerse insertando un gen que codifica el scFv en un vector de fagómido. El ADN que codifica un scFv que tiene actividad de unión de interés puede recolectarse entrando en contacto con el fago con un antígeno de interés, y después recolectando el fago de unión al antígeno. El scFv que tiene la actividad de unión de interés puede enriquecerse repitiendo esta operación como sea necesario.

Un polinucleótido que codifica el anticuerpo de la presente invención puede codificar un anticuerpo de longitud completa o una porción del anticuerpo. "Una porción de un anticuerpo" se refiere a cualquier porción de una molécula de anticuerpo. Más adelante, el término "fragmento de anticuerpo" puede utilizarse para referirse a una porción de un anticuerpo. Un fragmento de anticuerpo preferido de la presente invención comprende la región de determinación de complementariedad (CDR) de un anticuerpo. Más preferiblemente, un fragmento de anticuerpo de la presente invención comprende todos los tres CDRs que constituyen una región variable.

Se obtiene un ADNc que codifica la región V de un anticuerpo anti-LGR7 de interés, este ADNc se digiere con enzimas de restricción que reconocen los sitios de la enzima de restricción insertados a ambos extremos del ADNc. Una enzima de restricción preferida reconoce y digiere una secuencia de nucleótido que sea menos probable aparezca en la secuencia de nucleótido que constituye el gen de anticuerpo. Además, de insertar una sola copia del fragmento digerido en un vector en la dirección correcta, es preferible una enzima de restricción que proporciona extremos adhesivos. Un ADNc que codifica la región V del anticuerpo anti-LGR7, que se ha digerido como se describe anteriormente, se inserta en un vector de expresión adecuado para obtener el vector de expresión de anticuerpo. En esta etapa, puede obtenerse un anticuerpo quimérico fusionando un gen que codifica la región constante del anticuerpo (región C) con el gen anteriormente mencionado que codifica la región V en el marco. En la presente, "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo cuyas regiones constantes y variables se derivan de diferentes orígenes. Por lo tanto, además de los anticuerpos quiméricos de intraespecies tal como anticuerpos quiméricos de ratón-humano, los anticuerpos quiméricos intraespecies humano- humano también se incluyen en los anticuerpos quiméricos de la presente invención. Un vector de expresión de anticuerpo quimérico puede también construirse insertando el gen de región V en un vector de expresión en el cual se ha introducido un gen que codifica la región constante.

Más específicamente, por ejemplo, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción para una enzima de restricción que digiere el gen de región V puede colocarse en el extremo 5' de una ADN que codifica una región constante del anticuerpo deseada (región C) en un vector de expresión. El vector de expresión del anticuerpo quimérico es construido digiriendo los dos vectores utilizando la misma combinación de enzimas de restricción, y fusionándolas en el marco.

Para producir un anticuerpo anti-LGR7 usado en la presente invención, el gen del anticuerpo puede incorporarse en un vector de expresión para expresarlo bajo la regulación de una región de control de expresión. La región reguladora de expresión para la expresión del anticuerpo incluye, por ejemplo, un mejorador o promotor. Después, transformando las células hospedadoras adecuadas con este vector de expresión, pueden obtenerse células recombinantes que llevan el ADN que expresa el anticuerpo anti-LGR7.

Para expresar un gen del anticuerpo, una ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo (cadena H) y un ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo (cadena L) pueden incorporarse separadamente en vectores de expresión. Una molécula del anticuerpo que comprende la cadena H y la cadena L puede expresarse simultáneamente transfectando (co- transfectando) los vectores que incorporan la cadena H y cadena L en la misma célula hospedadora. Alternativamente, los ADNs que codifica la cadena H y cadena L pueden incorporarse en un solo vector de expresión para transformar una célula hospedadora con el vector (ver Publicación de Patente Internacional No. WO 94/11523).

Se conocen muchas combinaciones de vectores hospedadores y expresión para introducir un gen del anticuerpo aislado en un huésped apropiado para producir el anticuerpo. Ninguno de estos sistemas de expresión pueden aplicarse a la presente invención. Cuando se utilizan células eucarióticas como un huésped, pueden utilizarse células de animales, células de plantas, y células fungicidas. Más específicamente, las células de animales que pueden utilizarse en la presente invención son, por ejemplo, las siguientes células: (1) células de mamífero tal como CHO, COS, mieloma, riñón de hámster bebé (BHK), HeLa, Vero, HEK293, Ba/F3, HL-60, Jurkat, y células SK-HEP1; (2) células de anfibio tal como Xenopus oocytes; y (3) células de insecto tal como sf9, sf21, Tn5.

Además, como un sistema de célula de planta, un sistema de expresión de gen del anticuerpo utiliza células derivadas del género Nicotiana tal como se conoce Nicotiana tabacum. Las células cultivadas Callus pueden utilizarse para transformar las células de plantas.

Además, las siguientes células pueden utilizarse como células fungicidas; levaduras: el género Saccharomyces, por ejemplo, Saccharomyces Cerevisiae, y el género Pichia, por ejemplo, Pichia pastoris; y hongos filamentosos: el género Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger.

Se conocen sistemas de expresión de gen del anticuerpo que utilizan células procarióticas también. Por ejemplo, cuando se utilizan células bacterianas, células E. coli, células Bacillus subtilis, y tales pueden utilizarse en la presente invención.

Para células de mamífero, los genes del anticuerpo pueden expresarse operativamente colocando el gen del anticuerpo justo detrás de un promotor efectivo comúnmente usado, y una señal de polyA en el lado corriente abajo 3" del gen del anticuerpo. Un ejemplo de tal promotor/mejorador es el promotor/mejorador temprano inmediato del citomegalovirus humano.

Otros promotores/mejoradores que pueden utilizarse para la expresión del anticuerpo incluyen promotores/mejoradores virales, o promotores/mejoradores derivados de células de mamífero tal como el factor de alargamiento humano 1a (HEF1a). Los ejemplos específicos de virus cuyos promotores/mejoradores pueden utilizarse incluyen retrovirus, virus de polioma, adenovirus, y virus del simio 40 (SV40).

Cuando se utiliza un promotor/mejorador de SV40, el método de Mulligan y colaboradores (Nature (1979) 277, 108) puede utilizarse. Un promotor/mejorador de HEF1a puede utilizarse fácilmente para expresar un gen de interés por el método de Mizushima y colaboradores (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).

En el caso de £. coli, el anticuerpo puede expresarse operativamente colocando el gen del anticuerpo con una secuencia de señal para la secreción corriente abajo de un promotor efectivo comúnmente usado. Los ejemplos de tal promotor incluyen el promotor lacZ y el promotor araB. Para el promotor lacZ, puede utilizarse el método de Ward y colaboradores, (Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427). Alternativamente, puede utilizarse el promotor araB para expresar un gen de interés por el método de Better y colaboradores (Science (1988) 240, 1041-1043).

Puede utilizarse la secuencia de señal de pelB para secreción (Lei, S. P. y colaboradores, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) para la producción del anticuerpo en el periplasma de E. coli. Después del aislamiento del anticuerpo producido en el periplasma, el anticuerpo puede redoblarse utilizando un desnaturalizante de proteína como clorhidrato de guanidina o urea de modo que el anticuerpo tenga la actividad de unión deseada.

Cuando se produce el anticuerpo utilizando células de animales, es deseable utilizar una secuencia de señal de un anticuerpo de gen de cadena pesada o ligera como la secuencia de señal necesaria para la secreción al exterior de las células. Alternativamente, pueden utilizarse secuencias de señal poseídas por las proteínas secretoras tal como IL-3 e IL-6.

Un origen de replicación derivado de SV40, un poliomavirus, adenovirus, virus de papiloma bovino (BPV), o tal puede utilizarse e insertarse en un vector de expresión. Además, un marcador de selección puede insertarse en el vector de expresión para incrementar el número de copia del gen en el sistema de célula hospedadora. Más específicamente, pueden utilizarse los siguientes marcadores de selección: gen de aminoglucósido de transferasa (APH); gen de timidina cinasa (TK); Gen de fosforibosiltransferasa de guanina en xantina de E. coli (Ecogpt); y gen de dihidrofolato reductasa (dhfr), etc.

El anticuerpo de interés es producido introduciendo estos vectores de expresión en células hospedadoras, y después cultivando las células hospedadoras transformadas in vitro o in vivo. Las células hospedadoras se cultivan de acuerdo con métodos conocidos. Por ejemplo, pueden utilizarse DMEM, EM, RPMI 1640, o IMDM como el medio de cultivo líquido, y puede utilizarse un suplemento basado en suero tal como suero de becerro fetal (FCS) en combinación.

El anticuerpo expresado y producido como se describe anteriormente puede purificarse utilizando métodos conocidos usados convencionalmente para la purificación de proteína solos o en una combinación adecuada. Por ejemplo, el anticuerpo puede separarse y purificarse adecuadamente seleccionando y combinando una columna de afinidad tal como una columna de proteína A, una columna de cromatografía, un filtro, ultrafiltración, desalado, diálisis, y tal (Anticuerpos: A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Además de las células hospedadoras anteriores, también pueden utilizarse animales transgénicos para producir un anticuerpo recombinante. Es decir, puede obtenerse el anticuerpo de un animal en el cual se introduzca el gen que codifica el anticuerpo de interés. Por ejemplo, puede insertarse el gen del anticuerpo en marco en un gen que codifique una proteína producida inherentemente en leche para construir un gen fusionado. Puede utilizarse ß-caseína de cabra o tal, por ejemplo, como la proteína secretada en leche. Un fragmento de ADN que contiene el gen fusionado insertado con el gen del anticuerpo se inyecta en un embrión de cabra, y después este embrión se introduce en una cabra hembra. Pueden obtenerse los anticuerpos deseados como una proteína fusionada con la proteína de leche de la leche producida por la cabra transgénica nacida de la cabra que recibió al embrión (o progenie de la misma). Para incrementar el volumen de leche que contiene el anticuerpo deseado producido en la cabra transgénica, puede utilizarse hormonas en la cabra transgénica cuanto sea necesario (Ebert, K. M. y colaboradores, Bio/Technology (1994) 12, 699- 702).

Las regiones del anticuerpo C derivadas del animal no humano pueden utilizarse para las regiones C de un anticuerpo recombinante de la presente invención. Por ejemplo, pueden utilizarse Cy1, Cy2a, Cy2b, Cy3, Cp, C6, Cal , Ca2 y Ce para la región C de cadena H del anticuerpo de ratón, y pueden utilizarse CK y CX para la región C de la cadena L. Además, pueden utilizarse anticuerpos de animales con excepción de ratones tal como ratas, conejos, cabras, ovejas, camellos, y monos. Se conocen sus secuencias. Además, la región C puede modificarse para mejorar la estabilidad de los anticuerpos o su producción.

En la presente invención, cuando se administran los anticuerpos a humanos, pueden utilizarse anticuerpos genéticamente recombinantes que se han modificado artificialmente con el fin de reducir la xenoantigenicidad contra humanos, o similares. Los ejemplos de los anticuerpos genéticamente recombinantes incluyen anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Pueden producirse estos anticuerpos modificados utilizando métodos conocidos.

Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo cuyas regiones variables y regiones constantes son de diferentes orígenes. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo de ratón y las regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo humano es un anticuerpo quimérico de intraespecies ratón-humano. Puede producirse un vector recombinante que expresa un anticuerpo quimérico ligando un ADN que codifica una región variable del anticuerpo de ratón a un ADN que codifica una región constante del anticuerpo humano, y después insertándola en un vector de expresión. Se cultivan las células recombinantes que se han transformado con el vector, y se expresa el ADN incorporado para obtener el anticuerpo quimérico producido en el cultivo. Se utilizan regiones C humanas para las regiones C de anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados.

Por ejemplo, pueden utilizarse Cy1, Cy2a, Cy2b, Cy3, C 4, Ci, C5, Cal, Ca2 y Ce como una región C de cadena H. Pueden utilizarse CK y C como una región C de cadena L. Se conocen las secuencias de aminoácidos de estas regiones C y las secuencias de nucleótido que las codifican. Además, puede modificarse la región C del anticuerpo humano para mejorar la estabilidad de un anticuerpo o su producción.

Generalmente, un anticuerpo quimérico consiste de la región V de un anticuerpo derivado de un animal no humano, y la región C derivada de un anticuerpo humano. Por otra parte, un anticuerpo humanizado consiste de la región que determina la complementariedad (CDR) de un anticuerpo derivado de un animal no humano, y la región de marco (FR) y región C derivada de un anticuerpo humano. Puesto que la antigenicidad de un anticuerpo humanizado en el cuerpo humano se reduce, es útil un anticuerpo humanizado como un ingrediente activo para agentes terapéuticos de la presente invención.

La región variable del anticuerpo comprende generalmente tres regiones de determinación de complementariedad (CDRs) separadas por cuatro regiones de marco (FRs). La CDR es una región que determina sustancialmente la especificidad de unión de un anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos de CDRs son altamente diferentes. Por otra parte, las secuencias de aminoácidos que constituyen FR son a menudo altamente homologas incluso entre los anticuerpos con diferentes especificidades de unión. Por lo tanto, generalmente, se dice que la especificidad de unión de un cierto anticuerpo puede transferirse a otro anticuerpo injertando la CDR.

Un anticuerpo humanizado también se llama un anticuerpo humano reconfigurado. Específicamente, los anticuerpos humanizados preparados injertando la CDR de un anticuerpo de animal no humano tal como un anticuerpo de ratón a un anticuerpo humano y tal se conocen. Las tecnologías de ingeniería genética comunes para obtener anticuerpos humanizados también se conocen.

Específicamente, por ejemplo, se conoce la PCR de extensión de traslape como un método para injertar una CDR del anticuerpo de ratón a un FR humano. En la PCR de extensión de traslape, se agrega una secuencia de nucleótido que codifica una CDR del anticuerpo de ratón a injertarse a los cebadores para sintetizar una FR del anticuerpo humano. Los cebadores se preparan para cada una de las cuatro FRs. Se dice generalmente que cuando se injerta una CDR de ratón a una FR humana, seleccionando una FR humana que es altamente homóloga a una FR de ratón es ventajosa para mantener la función de CDR. Es decir, es generalmente preferible utilizar una FR humana que comprende una secuencia de aminoácido altamente homóloga a la secuencia de aminoácido de la FR adyacente a la CDR de ratón a injertarse.

Se diseñan secuencias de nucleótido a ligarse de modo que se conecten entre sí en el marco. Se sintetiza FRs humanas individualmente utilizando los cebadores respectivos. A consecuencia, se obtienen productos en los cuales el ADN que codifica la CDR de ratón se une a los ADNs que codifican la FR individual. Las secuencias de nucleótido que codifican la CDR de ratón de cada producto se diseñan de modo que se traslapan entre sí. Después, las regiones de CDR de traslape de los productos sintetizadas utilizan un gen del anticuerpo humano como el molde se hibridiza para la reacción de síntesis de hebra complementaria. Por esta reacción, las FRs humanas se ligan con las secuencias de las CDR de ratón.

La longitud completa del gen de región V, en la cual tres CDRs y cuatro FRs se ligan finalmente, se amplifica utilizando los cebadores que se hibridizan a sus extremos 5' y 3' y que tienen secuencias de reconocimiento de enzima de restricción adecuadas. Un vector para la expresión del anticuerpo humano puede producirse insertando el ADN obtenido como se describe anteriormente y un ADN que codifica una región del anticuerpo C humano en un vector de expresión de modo que se ligue en el marco. Después de transfectar este vector en un huésped para establecer las células recombinantes, se cultivan las células recombinantes, y el ADN que codifica el anticuerpo humanizado se expresa para producir el anticuerpo humanizado en el cultivo de células (ver, Publicación de Patente Europea No. EP 239,400, y Publicación de Patente Internacional No. WO 96/02576).

Por medición cualitativa o cuantitativa y evaluando la actividad de unión al antígeno del anticuerpo humanizado producido como se describe anteriormente, uno puede seleccionar adecuadamente las FRs del anticuerpo humano que permiten que las CDRs formen un sitio de unión el antígeno favorable cuando se liga a través de CDRs. Cuanto sea necesario, pueden sustituirse residuos del aminoácido en una FR para que las CDRs de un anticuerpo humano rediseñado forme un sitio de unión antígeno apropiado. Por ejemplo, las mutaciones de la secuencia de aminoácido pueden introducirse en FRs aplicando el método de PCR usado para fusionar una CDR de ratón con una FR humana. Más específicamente, las mutaciones de la secuencia de nucleótido parciales pueden introducirse en cebadores que se hibridizan en la secuencia de FR. Las mutaciones de la secuencia de nucleótido se introducen en FRs sintetizadas utilizando tales cebadores. Las secuencias de FR muíante que tienen las características deseadas pueden seleccionarse midiendo y evaluando la actividad del anticuerpo mutante sustituido con aminoácido para unir al antígeno por el método anteriormente mencionado (Sato, K. y colaboradores, Cáncer Res. 1993, 53, 851-856).

También se conocen métodos para obtener anticuerpos humanos. Por ejemplo, se sensibilizan linfocitos humanos in vitro con un antígeno deseado o células que expresan un antígeno deseado. Después, puede obtenerse el anticuerpo humano deseado que tiene la actividad para unir al antígeno fusionando un linfocito sensibilizado con una célula de mieloma humano (ver JP-B H01-59878). Por ejemplo, U266 y similares pueden utilizarse como la célula de mieloma humano que sirve como el miembro de fusión.

Además, puede obtenerse un anticuerpo humano deseado inmunizando un animal transgénico que tiene el repertorio completo de genes del anticuerpo humano con un antígeno deseado (ver Publicaciones Internacionales Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, y WO 96/33735). Además, se conocen las tecnologías para obtener un anticuerpo humano por desplazamiento utilizando una biblioteca de anticuerpo humano. Por ejemplo, puede expresarse una región V del anticuerpo humano en la superficie de un fago como un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) por el método de exhibición de fago, y puede seleccionarse un fago que une al antígeno. Puede determinarse la secuencia de ADN que codifica la región V del anticuerpo humano que une al antígeno analizando los genes del fago seleccionado. Después de que se determinó la secuencia de ADN del scFv que une al antígeno, puede prepararse un vector de expresión fusionando en la misma fase que la secuencia de región V con la secuencia de una región C del anticuerpo humano deseada, y después insertando esta en un vector de expresión adecuado. Se introduce el vector de expresión en células de expresión adecuadas tal como las descritas antes, y puede obtenerse el anticuerpo humano expresando el gen que codifica el anticuerpo humano. Estos métodos se conocen ya (Publicaciones Internacionales Nos. WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, y WO 95/15388).

Por lo tanto, en una modalidad preferida, los anticuerpos usados en la presente invención incluyen un anticuerpo que comprende una región constante humana.

Los anticuerpos de la presente invención no se limitan a anticuerpos bivalentes representados por IgG, sino incluyen anticuerpos monovalentes y anticuerpos multivalentes representados por IgM, siempre y cuando se unan a la proteína LGR7. El anticuerpo multivalente de la presente invención incluye un anticuerpo multivalente que tenga los mismos sitios de enlace al antígeno, y un anticuerpo multivalente que tenga sitios de enlace al antígeno parcial o totalmente diferentes. El anticuerpo de la presente invención no se limita a la molécula del anticuerpo entera, sino incluye anticuerpos de bajo peso molecular (minicuerpos) y los productos modificados de los mismos, siempre y cuando se unan a la proteína LGR7.

Un anticuerpo de bajo peso molecular contiene un fragmento del anticuerpo que carece de una porción de un anticuerpo entero (por ejemplo, IgG entero). Siempre y cuando tenga la capacidad de unir el antígeno LGR7, son permitidas las eliminaciones parciales de una molécula del anticuerpo. Los fragmentos del anticuerpo de la presente invención contienen preferiblemente una región variable de cadena pesada (VH) y/o una región variable de cadena ligera (VL). Además, los fragmentos del anticuerpo de la presente invención contienen preferiblemente una CDR. La secuencia de aminoácido de VH o VL puede tener sustituciones, eliminaciones, adiciones, e inserciones. Además, siempre y cuando tenga la capacidad de unir el antígeno LGR7, pueden eliminare VH y/o VL parcialmente. La región variable puede quimerizarse o humanizarse. Los ejemplos específicos de los fragmentos del anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. Los ejemplos específicos de anticuerpos de bajo peso molecular incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv (Fv de cadena sencilla), diacuerpo, sc(Fv)2 ((Fv)2 de cadena sencilla), y scFv-Fc. Los multímeros de estos anticuerpos (por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros, y polímeros) también se incluye en los anticuerpos de bajo peso molecular de la presente invención.

Los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse tratando un anticuerpo con una enzima para producir fragmentos del anticuerpo. Las enzimas conocidas que producen fragmentos del anticuerpo son, por ejemplo, papaína, pepsina, y plasmina. Alternativamente, los genes que codifican estos fragmentos del anticuerpo pueden construirse, introducirse en vectores de expresión, y después expresarse en células hospedadoras apropiadas (ver, por ejemplo, Co, . S. y colaboradores, J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. and Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. y colaboradores, Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669; and Bird, R. E. y colaboradores, TIBTECH (1991) 9, 132-137).

Las enzimas digestivas dividen sitios específicos de un fragmento del anticuerpo, y producen fragmentos del anticuerpo con las siguientes estructuras específicas. Cuando las tecnologías de ingeniería genética se utilizan en tales fragmentos enzimáticos obtenidos del anticuerpo, cualquier porción del anticuerpo puede eliminarse.

Digestión de papaína: F(ab)2 o Fab Digestión de pepsina: F(ab')2 o Fab' Digestión de plasmina: Facb Por lo tanto, los anticuerpos de bajo peso molecular de la presente invención pueden ser fragmentos del anticuerpo que carecen de cualquier región, siempre y cuando tengan afinidad de unión a LGR7. Además, de acuerdo con la presente invención, los anticuerpos mantienen deseablemente su actividad efectora, particularmente en el tratamiento de enfermedades proliferativas de célula tal como cáncer. Más específicamente, los anticuerpos de bajo peso molecular preferidos de la presente invención tienen afinidad de unión a LGR7 y función efectora. La función efectora del anticuerpo incluye actividad de ADCC y actividad de CDC. Particularmente de manera preferible, los anticuerpos terapéuticos de la presente invención tienen actividad de ADCC y/o actividad de CDC como función efectora.

Un diacuerpo se refiere a un fragmento del anticuerpo bivalente construido por fusión del gen (Hollinger P. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); EP 404,097; WO 93/11161; y tal). Un diacuerpo es un dímero compuesto por dos cadenas de polipéptido. Generalmente, en cada cadena de polipéptido que constituye el dímero, VL y VH son ligados por un enlace dentro de la misma cadena. El enlace en un diacuerpo es generalmente bastante corto para evitar la unión entre VL y VH. Específicamente, los residuos del aminoácido que constituyen el enlace son, por ejemplo, cinco residuos más o menos. Por lo tanto, VL y VH que son codificados por la misma cadena de polipéptido no pueden formar un fragmento de región variable de cadena sencilla, y forman un dímero con otro fragmento de variable región de cadena sencilla. A consecuencia, los diacuerpos tienen dos sitios de enlace al antígeno. scFv puede obtenerse ligando la región V de cadena H y la región V de cadena L de un anticuerpo. En scFv, la región V de cadena H y la región V de cadena L se ligan vía un enlace, preferiblemente un enlace de péptido (Huston, J. S. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 1988, 85, 5879-5883). La región V de cadena H y la región V de cadena L de scFv pueden derivarse de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente. El enlace de péptido para ligar las regiones V no es particularmente limitado. Por ejemplo, cualquier péptido de cadena sencilla consiste de 3 a 25 residuos o puede utilizarse como el enlace. Más específicamente, por ejemplo, los enlaces de péptido descritos más adelante o tales pueden utilizarse.

Los métodos de PCR tal como los descritos antes pueden utilizarse para ligar las regiones V de ambas cadenas. Para la ligadura de las regiones V por métodos de PCR, primero, un ADN entero o ADN que codifica una secuencia de aminoácido parcial deseada seleccionada de los siguientes ADNs pueden utilizarse como un molde: una secuencia de ADN que codifica cadena H o región V de cadena H del anticuerpo; y una secuencia de ADN que codifica la cadena L o región V de cadena L del anticuerpo.

Los ADNs que codifican las regiones V de cadena H y cadena L son amplificados individualmente por métodos de PCR utilizando un par de cebadores que tengan secuencias que corresponden a las secuencias de ambos extremos del ADN a amplificarse. Después, se prepara un ADN que codifica la porción del enlace de péptido. El ADN que codifica el enlace de péptido puede también sintetizarse utilizando PCR. El extremo 5' de los cebadores usados, se agregan secuencias del nucleótido que puedan ligarse a cada uno de los productos de amplificación de región V sintetizados individualmente. Después, la reacción de PCR se realiza utilizando "el ADN de región V de cadena H", "ADN del enlace de péptido", y "ADN de región V de cadena L", y los cebadores para el montaje de PCR.

Los cebadores para el montaje de PCR consisten de la combinación de un cebador que es hibridizado al extremo 5' del "ADN de región V de cadena H" y un cebador que es hibridizado al extremo 3' del "ADN de región V de cadena L". Es decir, los cebadores para el montaje de PCR son un conjunto de cebadores que pueden amplificar un ADN que codifica la secuencia de longitud completa de scFv a sintetizarse. Por otra parte, se agregan secuencias de nucleótido que pueden ligarse a cada ADN de región V al "ADN del enlace de péptido". Así, se ligan estos ADNs, y produce el scFv de longitud completa finalmente como un producto de amplificación utilizando los cebadores para el montaje de PCR. Una vez que se construye el ADN que codifica el scFv, puede obtenerse la expresión vectores que contienen el ADN, y células recombinantes transformadas por estos vectores de expresión de acuerdo con métodos convencionales. Además, pueden obtenerse los scFvs cultivando las células recombinantes resultantes y expresando el ADN que codifica el scFv.

El scFv-Fc es un anticuerpo de bajo peso molecular producido fusionando un dominio de Fe a un scFV que comprende la región V de cadena H y la región V de cadena L de un anticuerpo (Cellular & Molecular Immunology 2006; 3: 439-443). Siempre y cuando no hay limitación particular en el origen del scFv usado para scFv-Fc, por ejemplo, puede utilizarse scFv derivado de IgM. Además, siempre y cuando no hay limitación particular en el origen de Fe, por ejemplo, pueden utilizarse IgG de ratón (lgG2a de ratón y tal) e IgG humano (lgG1 humano y tal). Por lo tanto, en una modalidad preferida, los ejemplos de scFv-Fc incluyen un scFv-Fc producido ligando el fragmento de scFv de un anticuerpo de IgM a CH2 (por ejemplo, Cy2) y a CH3 (por ejemplo, Cy3) de lgG2a de ratón con la región de bisagra (??) de lgG2a de ratón, y un scFv-Fc producido ligando el fragmento de scFv de un anticuerpo de IgM a CH2 y CH3 de lgG1 humano con la región de bisagra de lgG1 humano. el sc(Fv)2 es un minicuerpo preparado ligando dos VHs y dos VLs con enlaces o tal para formar una cadena sencilla (Hudson y colaboradores, J. Immunol. Methods 1999; 231: 177- 189). Puede producirse el sc(Fv)2, por ejemplo, uniendo scFvs con un enlace.

Por otra parte, son preferidos los anticuerpos en los cuales dos VHs y dos VLs se colocan en orden de VH, VL, VH, y VL ([VH]-enlace-[VL]-enlace-[VH]-enlace-[VL]), a partir del lado N- terminal de un polipéptido de cadena sencilla.

El orden de los dos VHs y los dos VLs no se limita particularmente al arreglo anteriormente mencionado, y pueden colocarse en cualquier orden. Los ejemplos incluyen los siguientes arreglos: [VL]-enlace-[VH]-enlace-[VH]-enlace-[VL] [VH]-enlace-[VL]-enlace-[VL]-enlace-[VH] [VH]-enlace-[VH]-enlace-[VL]-enlace-[VL] [VL]-enlace-[VL]-enlace-[VH]-enlace-[VH] [VL]-enlace-[VH]-enlace-[VL]-enlace-[VH] Puede introducirse cualquier enlace de péptido arbitrario por ingeniería genética, y enlaces sintéticos (ver, por ejemplo, los descritos en Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996) o pueden utilizarse tales como enlaces para ligar las regiones variables del anticuerpo. En la presente invención, son preferibles los enlaces de péptido. La longitud de los enlaces de péptido no es particularmente limitada, y puede seleccionarse adecuadamente por los expertos en la técnica de acuerdo con el propósito. La longitud de los residuos de aminoácido que componen un enlace de péptido es generalmente 1 a 100 aminoácidos, preferiblemente 3 a 50 aminoácidos, más preferiblemente 5 a 30 aminoácidos, y particularmente de manera preferible 12 a 18 aminoácidos (por ejemplo, 15 aminoácidos).

Puede utilizarse cualquier secuencia de aminoácido que compone enlaces de péptido, siempre y cuando no inhiba la actividad de unión del scFv. Los ejemplos de las secuencias de aminoácidos usadas en enlaces de péptido incluyen: Ser Gly-Ser Gly-Gly-Ser Ser-Gly-Gly Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID NO: 101) Ser-Gly-Gly-Gly (SEC ID NO: 102) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID NO: 103) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEC ID NO: 104) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID NO: 105) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEC ID NO: 106) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID NO: 107) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEC ID NO: 108) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID NO: 101 ))n (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEC ID NO: 102))n en las cuales n es un número entero de 1 o mayor.

Pueden seleccionarse las secuencias de aminoácidos de los enlaces de péptido apropiadamente por los expertos en la técnica de acuerdo con el propósito. Por ejemplo, n, que determina la longitud de los enlaces de péptido, es generalmente 1 a 5, preferiblemente 1 a 3, más preferiblemente 1 ó 2.

Por lo tanto, una modalidad particularmente preferida de sc(Fv)2 en la presente invención es, por ejemplo, el siguiente sc(Fv)2: [VH]-enlace de péptido (15 aminoác¡dos)-[VL]-enlace del péptido (15 aminoác¡dos)-[VH]-enlace de péptido (15 aminoácidos)-[VL].

Alternativamente, pueden utilizarse enlaces químicos sintéticos (agentes de reticulación de producto químico) para ligar las regiones V. Los agentes de reticulación usados rutinariamente para reticular compuestos de péptido y tales pueden utilizarse en la presente invención. Por ejemplo, se conocen los siguientes agentes de reticulación de producto químico. Estos agentes de reticulación están comercialmente disponibles: Succinimida de N-hidroxi (NHS); suberato de disuccinimidilo (DSS); suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS3); ditiobis(propionato de succinimidilo) (DSP); dithiobis(propionato de sulfosuccinimidilo) (DTSSP); bis(succcinato de succinimidilo) de etilenglicol (EGS); bis(succcinato de sulfosuccinimidilo) de etilenglicol (sulfo- EGS); tartrato de disuccinimidilo (DST); tartrato de disulfosuccinimidilo (sulfo-DST); bis[2-(succinímidoxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES); y bis[2-(sulfosuccinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfo- BSOCOES).

Generalmente, se requieren tres enlaces para ligar cuatro regiones variables de anticuerpo. Los enlaces múltiples a utilizarse pueden todos ser del mismo tipo o diferentes tipos. En la presente invención, un minicuerpo preferido es un diacuerpo o un sc(Fv)2. Puede obtenerse tal minicuerpo tratando un anticuerpo con una enzima, tal como papaína o pepsina, para generar fragmentos de anticuerpo, o construyendo ADNs que codifiquen estos fragmentos de anticuerpo, introduciéndolos en vectores de expresión, y después expresándolos en células hospedadoras apropiadas (ver, por ejemplo, Co, M. S. y colaboradores, J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, . and Hor itz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. y colaboradores, Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; and Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132- 137).

Los anticuerpos de la presente invención incluyen no sólo anticuerpos monovalentes sino también anticuerpos multivalentes. Los anticuerpos multivalentes de la presente invención incluyen anticuerpos multivalentes cuyos sitios de enlace al antígeno son todos los mismos y anticuerpos multivalentes cuyos sitios de enlace al antígeno son parcial o totalmente diferentes.

Pueden también utilizarse anticuerpos unidos a varios tipos de moléculas tal como polietilenglicol (PEG) como anticuerpos modificados. Por otra parte, pueden unirse los agentes quimioterapéuticos, péptidos tóxicos, o sustancias citotóxicas tal como sustancias químicas radiactivas a los anticuerpos. Pueden obtenerse tales anticuerpos modificados (más adelante referidos como conjugados de anticuerpo) sometiendo los anticuerpos obtenidos a modificación química. Se establecen métodos para modificar anticuerpos ya en este campo. Además, como se describe más adelante, pueden también obtenerse tales anticuerpos en la forma molecular de un anticuerpo biespecífico diseñado utilizando tecnologías de ingeniería genética para reconocer no sólo las proteínas LGR7, sino también agentes quimioterapéuticos, péptidos tóxicos, sustancias citotóxicas tal como sustancias químicas radiactivas, o tales. Estos anticuerpos se incluyen en los "anticuerpos" de la presente invención.

Los agentes quimioterapéuticos que se unen a los anticuerpos anti-LGR7 para conducir la actividad citotóxica incluyen los siguientes: azaribina, anastrozol, azacitidina, bleomicina, bortezomib, briostatina-1 , busulfán, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clorambucil, cisplatina, irinotecan, carboplatina, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicina, daunomicina-glucurónido, daunorubicina, dexametasona, dietilstilbestrol, doxorubicina, doxorubicina-glucurónido, epirubicina, estradiol de etinilo, estramustina, etopósido, etopósido-glucurónido, floxuridina, fludarabina, flutamida, fluorouracilo, fluoximesterona, gemcitabina, caproato de hidroxiprogesterona, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, leucovorina, lomustina, mecloretamina, acétate de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalán, mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicina, mitomicina, mitotano, fenilbutirato, prednisona, procarbazina, paclitaxel, pentostatina, semustina streptozocina, tamoxifen, taxanos, taxol, propionato de testosterona, talidomida, tioguanina, tiotepa, teniposida, topotecan, mostaza de uracilo, vinblastina, vinorelbina, y vincristina.

En la presente invención, los agentes quimioterapéuticos preferidos son agentes quimioterapéuticos de bajo peso molecular. Los agentes quimioterapéuticos de bajo peso molecular son poco probables que interfieran con la función del anticuerpo incluso después unir a los anticuerpos. En la presente invención, los agentes quimioterapéuticos de bajo peso molecular tienen generalmente un peso molecular de 100 a 2000, preferiblemente 200 a 1000. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos demostrados en la presente son todos los agentes quimioterapéuticos de bajo peso molecular. Los agentes quimioterapéuticos de la presente invención incluyen profármacos que se convierten a agentes quimioterapéuticos activos in vivo. La activación del profármaco puede ser conversión enzimática o conversión no enzimática.

Por otra parte, puede modificarse el anticuerpo con un péptido tóxico. Los ejemplos de péptidos tóxicos incluyen los siguiente: Cadena de toxina de difteria A (Langone J. J., y colaboradores, Methods in Enzymology, 93,307-308,1983); Exotoxina de pseudomonas (Nature Medicine, 2, 350-353, 1996); Cadena de ricina A (Fulton R. J., y colaboradores, J. Biol. Chem., 261, 5314-5319, 1986; Sivam G., y colaboradores, Cáncer Res., 47, 3169-3173, 1987; Cumber A. J. y colaboradores, J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak E. J., y colaboradores, Cáncer Res., 50, 7519-7562, 1990; Gheeite V., y colaboradores, J. Immunol. Methods, 142, 223-230, 1991); Cadena de ricina desglicosilada A (Thorpe P. E., y colaboradores. Cáncer Res., 47, 5924-5931, 1987); Cadena de Abrin A (Wawrzynczak E. J., y colaboradores, Br. J. Cáncer, 66, 361-366, 1992; Wawrzynczak E. J., y colaboradores, Cáncer Res., 50, 7519-7562, 1990; Sivam G., y colaboradores, Cáncer Res., 47, 3169-3173, 1987; Thorpe P. E., y colaboradores, Cáncer Res., 47, 5924-5931, 1987); Gelonina (Sivam G., y colaboradores, Cáncer Res., 47, 3169-3173, 1987; Cumber A. J. y colaboradores, J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak E. J., y colaboradores. Cáncer Res., 50, 7519-7562, 1990; Bolognesi A., y colaboradores, Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); Proteína antiviral de Pokeweed de semillas (PAP-s) (Bolognesi A., y colaboradores, Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); Briodina (Bolognesi A., y colaboradores, Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); Saporina (Bolognesi A., y colaboradores, Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); Momordina (Cumber A. J., y colaboradores, J. Immunol. ethods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak E. J., y colaboradores, Cáncer Res., 50, 7519-7562, 1990; Bolognesi A., y colaboradores, Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); Momorcocina (Bolognesi A., y colaboradores, Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); Diantina 32 (Bolognesi A., y colaboradores, Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); Diantina 30 (Stirpe F., Barbieri L., carta de FEBS 195,1-8,1986); odeccina (Stirpe F., Barbieri L., carta de FEBS 195,1-8,1986); Viscumina (Stirpe F., Barbieri L., carta de FEBS 195,1-8,1986); Volkesina (Stirpe F., Barbieri L., carta de FEBS 195,1-8,1986); Dodecandrina (Stirpe F., Barbieri L., carta de FEBS 195, 1-8, 1986); Tritina (Stirpe F., Barbieri L., carta de FEBS 195,1-8,1986); Luffina (Stirpe F., Barbieri L, carta de FEBS 195, 1-8, 1986); y Tricokirina (Casellas P., y colaboradores, Eur. J. Biochem. 176, 581-588, 1988; Bolognesi A., y colaboradores, Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992).

En la presente invención, "sustancia química radiactiva" se refiere a una sustancia química que contiene un radioisótopo. No hay limitación particular en el radioisótopo. Puede utilizarse cualquier radioisótopo, y por ejemplo, pueden utilizarse 32P, 14C, 25l, 3H, 131l, 186Re y 188Re.

En otra modalidad, puede combinarse uno o dos o más de los agentes quimioterapéuticos de bajo peso molecular y péptidos tóxicos y utilizarse para modificación del anticuerpo. La unión entre un anticuerpo anti-LGR7 y el agente quimioterapéutico de bajo peso molecular anteriormente mencionado puede ser unión covalente o unión no covalente. Se conocen los métodos para producir anticuerpos unidos a estos agentes quimioterapéuticos.

Además, las proteínas farmacológicamente activas o toxinas del péptido pueden unirse a anticuerpos por tecnologías de recombinación de gen. Específicamente, por ejemplo, es posible construir un vector recombinante fusionando un ADN que codifica el péptido tóxico anteriormente mencionado con un ADN que codifica un anticuerpo anti-LGR7 de la presente invención en el marco, e insertando este en un vector de expresión. Se introduce este vector en células hospedadoras adecuadas, se cultivan las células transformadas obtenidas, y expresa el ADN incorporado. Así, de anticuerpo anti-LGR7 unido al péptido tóxico puede obtenerse como una proteína de fusión. Cuando se obtiene un anticuerpo como una proteína de fusión, la proteína o toxina farmacológicamente activa se fusiona generalmente en la C-terminal del anticuerpo. Puede insertarse un enlace de péptido entre el anticuerpo y la proteína o toxina farmacológicamente activa.

Además, el anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico se refiere a un anticuerpo que lleva las regiones variables que reconocen diferentes epítopes dentro de la misma molécula del anticuerpo. El anticuerpo biespecífico puede tener sitios de unión al antígeno que reconocen diferentes epítopes en una molécula LGR7. Dos moléculas de tal anticuerpo biespecífico pueden unirse a una molécula de LGR7. A consecuencia, puede esperarse una acción citotóxica fuerte.

Alternativamente, el anticuerpo biespecífico puede^ ser un anticuerpo en cuál un sitio de unión al antígeno reconoce LGR7, y el otro sitio de unión al antígeno reconoce una sustancia citotóxica. Específicamente, las sustancias citotóxicas incluyen agentes quimioterapéuticos, péptidos tóxicos y sustancias químicas radiactivas. Tal anticuerpo biespecífico une a las células que expresan LGR7, y al mismo tiempo, captura sustancias citotóxicas. Esto permite a las sustancias citotóxicas actuar directamente en células que expresan LGR7. Por lo tanto, los anticuerpos biespecífico que reconocen sustancias citotóxicas dañan específicamente células tumorales y eliminan la proliferación celular tumoral.

Además, en la presente invención, pueden combinarse anticuerpos biespecífico que reconocen antígenos con excepción de LGR7. Por ejemplo, es posible combinar anticuerpos biespecífico que reconocen antígenos distintos a LGR7 que se expresan específicamente en la superficie de células cancerosas objetivo como LGR7.

Se conocen métodos para producir anticuerpos biespecífico. Por ejemplo, pueden ligarse dos tipos de anticuerpos que reconocen diferentes antígenos para preparar un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos a ligarse pueden ser mitades de moléculas cada una tiene una cadena L o cadena H, o pueden ser cuartos de moléculas que consisten de solamente una cadena H. Alternativamente, pueden prepararse células híbridas que producen un anticuerpo biespecífico fusionando los hibridomas que producen diferentes anticuerpos monoclonales. Pueden también prepararse anticuerpos de biespecífico por tecnologías de ingeniería genética.

Pueden utilizarse métodos conocidos para medir la actividad de unión al antígeno de los anticuerpos (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Por ejemplo, pueden utilizarse un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un inmunoensayo de enzima (EIA), un radioinmunoensayo (RIA), o un fluoroinmunoensayo.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos con una cadena de azúcar modificada. Se conoce que la actividad citotóxica de un anticuerpo puede incrementarse modificando su cadena de azúcar. Los anticuerpos conocidos que modifican cadenas de azúcar incluyen los siguientes: anticuerpos con glicosilación modificada (por ejemplo, WO 99/54342); anticuerpos deficientes en fucosa unidos a cadenas de azúcar (por ejemplo, WO 00/61739, WO 02/31140, WO2006/067913, etc.); anticuerpos que tienen una cadena de azúcar con GIcNAc de bisección (por ejemplo, WO 02/79255), etc.

Cuando se utilizan anticuerpos de la presente invención para terapia, son preferiblemente anticuerpos que tienen actividad citotóxica.

En la presente invención, la actividad citotóxica incluye, por ejemplo, actividad de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). En la presente invención, la actividad de CDC se refiere a actividad citotóxica mediada por sistema de complemento. La actividad de ADCC se refiere a la actividad de dañar una célula objetivo cuando se une un anticuerpo específico a su antígeno de superficie celular. Se une una célula que lleva el receptor Fc (célula inmune, o tal) a la porción de Fe del anticuerpo vía el receptor Fcy y daña la célula objetivo.

Puede probarse un anticuerpo anti-LGR7 de la presente invención para ver si tiene actividad de ADCC o actividad de CDC utilizando métodos conocidos (por ejemplo, Current Protocols in Immunology, Capítulo 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E. Coligan y colaboradores, John Wiley & Sons, Inc., (1993) y similares).

Primero, específicamente, se preparan células efectoras, solución de complemento, y células objetivo. (1) Preparación de células efectoras Se elimina el bazo de un ratón CBA/N o similares, y aislan las células del bazo en medio RPMI1640 (fabricado por invitrogen). Después de lavarse en el mismo medio que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS, fabricado por HyClone), se ajusta la concentración celular a 5 x 106/ml para preparar las células efectoras. (2) Preparación de solución de complemento Se diluyó el complemento del conejo bebé (fabricado por CEDARLANE) diez veces en un medio de cultivo (fabricado por Invitrogen) que contiene 10% de FBS para preparar una solución de complemento. (3) Preparación de células objetivo Pueden etiquetarse radiactivamente las células objetivo incubando células que expresan la proteína LGR7 con 0.2 mCi de cromato de sodio-51Cr (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences) en un medio de DME que contiene 10% de FBS durante una hora a 37°C. Para células que expresan la proteína LGR7, se puede utilizar células transformadas con un gen LGR7, células cancerosas ováricas, o tales. Después del etiquetado radiactivo, se lavaron las células tres veces en medio RPMI1640 con 10% de FBS, y pueden prepararse las células objetivo ajustando la concentración celular a 2 x 105/ml.

Puede medirse la actividad de ADCC o actividad de CDC por el método descrito más adelante. En el caso de la medida de la actividad de ADCC, se agregaron la célula objetivo y el anticuerpo anti-LGR7 (50 µ? de cada uno) a una placa de fondo en U de 96 pozos (fabricada por Becton Dickinson), y se hizo reaccionar durante 15 minutos en hielo. Posteriormente, se agregaron 100 µ? de células efectoras e incubaron en una incubadora de dióxido de carbono durante cuatro horas. Se ajustó la concentración final del anticuerpo a 0 ó 10 pg/ml. Después de cultivar, se recolectaron 100 µ? del sobrenadante, y midió la radiactividad con un contador gamma (COBRAII AUTO-GAMMA, MODELO D5005, fabricado por Packard Instrument Company). Puede calcularse la actividad citotóxica (%) utilizando los valores medidos de acuerdo con la ecuación: (A - C)/(B - C) x 100, en donde A representa la radiactividad (CPM) en cada muestra, B representa la radiactividad (cpm) en una muestra donde se ha agregado 1% de NP-40 (fabricado por Nacalai Tesque), y C representa la radiactividad (cpm) de una muestra que contiene las células objetivo solamente.

Siempre y cuando, en el caso de la medición de la actividad de CDC, se agregaron 50 µ? de la célula objetivo y 50 µ? de un anticuerpo anti-LGR7 a una placa de fondo plano de 96 pozos (fabricada por Becton Dickinson), y se hizo reaccionar durante 15 minutos en hielo. Posteriormente, se agregaron 100 µ? de la solución de complemento, e incubaron en una incubadora de dióxido de carbono durante cuatro horas. Se ajustó la concentración final del anticuerpo a 0 ó 3 µ9/???. Después de la incubación, se recolectaron 100 µ? de sobrenadante, y midió la radiactividad con un contador gamma. Puede calcularse la actividad citotóxica de la misma manera como en la determinación de actividad de ADCC.

Por otra parte, en el caso de medir la actividad citotóxica de un conjugado del anticuerpo, se agregaron 50 µ? de célula objetivo y 50 µ? de un conjugado del anticuerpo anti-LGR7 a una placa de fondo plano de 96 pozos (fabricada por Becton Dickinson), y se hizo reaccionar durante 15 minutos en hielo. Esto después se incuba en una incubadora de dióxido de carbono durante una a cuatro horas. Se ajustó la concentración final del anticuerpo a 0 ó 3 pg/ml. Después de cultivar, se recolectaron 100 µ? de sobrenadante, y midió la radiactividad con un contador gamma. Puede calcularse la actividad citotóxica de la misma manera como en la determinación de actividad de ADCC.

Otra modalidad de los anticuerpos usados en la presente invención es un anticuerpo que tiene actividad de internalización. En la presente invención, el "anticuerpo que tiene actividad de internalización" se refiere a un anticuerpo que se transporta en una célula (en el citoplasma, vesículas, otros orgánulos, y tales) al unirse a LGR7 en la superficie celular.

Puede confirmarse si o no un anticuerpo tiene actividad de internalización utilizando los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede confirmarse la actividad de internalización por el método de poner en contacto un anticuerpo anti-LGR7 unido por una sustancia etiquetada con células que expresan LGR7 y determinar si la sustancia etiquetada está incorporada en las células, o el método de poner en contacto un anticuerpo anti-LGR7 unido por una sustancia citotóxica con células que expresan LGR7 y determinar si o no está inducida la muerte celular en células que expresan LGR7. Más específicamente, si o no puede comprobarse que un anticuerpo tiene actividad de internalización, por ejemplo, por el método descrito en los ejemplos más adelante.

Puede utilizarse un anticuerpo que tiene actividad de internalización para una composición farmacéutica tal como un agente anticáncer, por ejemplo, uniéndolo con la sustancia citotóxica anteriormente mencionada.

Puede utilizarse cualquier anticuerpo que reconozca LGR7 como el anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, pueden ejemplificarse los anticuerpos de (1) a (29) descritos más adelante como los anticuerpos preferidos. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, anticuerpos de bajo peso molecular, anticuerpos de animal, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, o anticuerpos humanos. (1) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 5 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 6 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 7 como CDR3 (cadena pesada de 22DA6); (2) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 11 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12 como CDR3 (cadena ligera de 22DA6); (3) un anticuerpo que comprende la cadena H de (1) y la cadena L de (2) (22DA6); (4) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17 como CDR3 (cadena pesada de 22DA7); (5) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO. 20 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 21 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 22 como CDR3 (cadena ligera de 22DA7); (6) un anticuerpo que comprende la cadena H de (4) y la cadena L de (5) (22DA7); (7) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 25 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 26 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 27 como CDR3 (cadena pesada de 22DA17); (8) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 30 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 31 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 32 como CDR3 (cadena ligera de 22DA17); (9) un anticuerpo que comprende la cadena H de (7) y la cadena L de (8) (22DA17); (10) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 35 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 36 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 37 como CDR3 (cadena pesada de 22DA22); (11) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 40 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 41 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 42 como CDR3 (cadena ligera de 22DA22); (12) un anticuerpo que comprende la cadena H de (10) y la cadena L de (11) (22DA22); (13) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 45 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 46 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 47 como CDR3 (cadena pesada de 22DA23); (14) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 50 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 51 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 52 como CDR3 (cadena ligera de 22DA23); (15) un anticuerpo que comprende la cadena H de (13) y la cadena L de (14) (22DA23); (16) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 55 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 56 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 57 como CDR3 (cadena pesada de 22DA24); (17) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 60 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 61 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 62 como CDR3 (cadena ligera de 22DA24); (18) un anticuerpo que comprende la cadena H de (16) y la cadena L de (17) (22DA24); (19) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 65 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 66 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 67 como CDR3 (cadena pesada de 22SD7); (20) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 70 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 71 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 72 como CDR3 (cadena ligera de 22SD7); (21) un anticuerpo que comprende la cadena H de (19) y la cadena L de (20) (22SD7); (22) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 75 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 76 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 77 como CDR3 (cadena pesada de 22SD11); (23) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 80 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 81 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 82 como CDR3 (cadena ligera de 22SD11); (24) un anticuerpo que comprende la cadena H de (22) y la cadena L de (23) (22SD11); (25) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 85 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 86 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 87 como CDR3 (cadena pesada de 22SD48); (26) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 90 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 91 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 92 como CDR3 (cadena ligera de 22SD48); (27) un anticuerpo que comprende la cadena H de (25) y la cadena L de (26) (22SD48); (28) un anticuerpo que tienen actividad equivalente como el anticuerpo de cualquiera de (1) a (27); (29) un anticuerpo que reconoce el mismo epítope reconocido por el anticuerpo de cualquiera de (1) a (27).

En la presente invención, "que tiene actividad equivalente como un anticuerpo de la presente invención" medido que tiene actividad de unión hacia LGR7 y/o actividad citotóxica contra células que expresan LGR7 que son equivalentes a las de un anticuerpo de la presente invención.

Un método para introducir mutaciones en los polipéptidos es uno de los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica para preparar polipéptidos que son funcionalmente equivalentes a cierto polipéptido. Por ejemplo, los expertos en la técnica pueden preparar un anticuerpo funcionalmente equivalente a un anticuerpo de la presente invención introduciendo mutaciones apropiadas en el anticuerpo utilizando mutagénesis dirigida al sitio (Hashimoto-Gotoh, T. y colaboradores (1995) Gene 152, 271- 275; Zoller, J, and Smith, . (1983) Methods Enzymol. 100, 468- 500; Kramer, W. y colaboradores (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) y similares. Pueden también ocurrir mutaciones del aminoácido naturalmente. De esta manera, los anticuerpos de la presente invención también comprenden anticuerpos que comprenden secuencias de aminoácidos con uno o más mutaciones del aminoácido en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos de la presente invención, y que son funcionalmente equivalentes a los anticuerpos de la presente invención.

El número de aminoácidos a transformarse en tales mutantes se considera generalmente ser 50 aminoácidos o menos, preferiblemente 30 aminoácidos o menos, y más preferiblemente 1 0 aminoácidos o menos (por ejemplo , 5 ami noácidos o menos).

Es deseable que los residuos del aminoácido sean transformados en aminoácidos en los cuales se conservan las propiedades de las cadenas laterales del aminoácido . Por ejemplo , se han establecido las siguientes categorías dependiendo de las propiedades de la cadena lateral del ami noácido : aminoácidos hidrofóbicos (A, I , L, M , F , P , W, Y, y V); aminoácidos hidrofílicos (R, D , N , C , E , Q, G , H , K, S , y T); aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (G , A, V, L, I , y P); aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen hidróxido (S , T e Y) ; aminoácidos q ue tienen cadenas laterales que contienen azufre (C y M); aminoácidos que tienen ácido carboxílico y cadenas laterales que contienen amida (D, N, E, y Q); aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas (R, K, y H); y aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen el anillo aromático (H, F, Y y W) (están representados los aminoácidos por códigos de una letra entre paréntesis).

Los polipéptidos que comprende una secuencia de aminoácido modificada, en la cual se elimina uno o más residuos del aminoácido en cierta secuencia de aminoácido, agrega, y/o sustituye con otros aminoácidos, se conocen para conservar sus actividades biológicas originales (Mark, D. F. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666; Zoller, M. J. & Smith, . Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500; Wang, A. y colaboradores, Science 224, 1431- 1433; Dalbadie-McFarland, G. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413). Es decir, se dice generalmente que, en una secuencia de aminoácido que constituye cierto polipéptido, es altamente probable mantenerse la actividad del polipéptido cuando los aminoácidos clasificados en el mismo grupo se sustituyen mutuamente. En la presente invención, la sustitución anteriormente mencionada entre los aminoácidos dentro del mismo grupo del aminoácido se refiere como sustitución conservadora.

Por otra parte , la presente invención también proporciona anticuerpos que unen al mismo epítope unido por un anticuerpo anti-LGR7 descrito en la presente invención . Más específicamente, la presente invención se relaciona con anticuerpos que reconocen el mismo epítope reconocido por el anticuerpo 22 DA6, 22DA7. 22DA1 7, 22DA22 , 22DA23, 22DA24, 22SD7 , 22SD1 1 , o 22SD48, y al uso de tales anticuerpos. Pueden obtenerse estos anticuerpos, por ejemplo , por métodos descritos más adelante.

Si un anticuerpo de prueba comparte un epítope con cierto anticuerpo puede determinarse por su competición para el mismo ep ítope. Es detectada la com petición entre anticuerpos por ensayo de bloqueo cruzado y similares. Por ejemplo , el ensayo de EL ISA competitivo es un ensayo de bloq ueo cruzado preferido.

Más específicamente, en el ensayo de bloqueo cruzado , se preincuban los pozos de la placa de m icrotítulo cubiertos con una proteína LGR7 en presencia o ausencia de un anticuerpo de competencia de candidato , y además se agregó un anticuerpo anti-LGR7 de la presente invención . La cantidad del anticuerpo anti-LGR7 de la presente invención que une a la prote ína LG R7 en un pozo se correlaciona indi rectamente con la capacidad de unión del anticuerpo competente de candidato (anticuerpo de prueba) que compite para unir al mismo epítope. Es decir, cuanto más alta es la afinidad de un anticuerpo de prueba al mismo epítope, más baja es la unión del anticuerpo anti-LG R7 de la presente invención a un pozo cubierto con la proteína LG R7, y más alta es la unión del anticuerpo de prueba a u n pozo cubierto con la proteína LGR7.

Puede medirse fácilmente la cantidad de anticuerpo unido al pozo etiquetando el anticuerpo por adelantado. Por ejemplo, puede medirse un anticuerpo etiquetado con biotina util izando un conjugado de avidina/peroxidasa y un sustrato adecuado . El ensayo de bloqueo cruzado utiliza una etiqueta de enzima tal como peroxidasa , se refiere particularmente como ensayo de ELISA com petitivo. Puede etiquetarse el anticuerpo con otra sustancia de etiquetado que pueda detectarse o medirse. Más específicamente, se conocen los radioetiquetados, etiquetas fl uorescentes y similares.

Alternativamente, el ensayo de FACS competitivo es también un ensayo de bloqueo cruzado preferible .

Específicamente, en el ensayo de ELISA competitivo, en vez de utiliza r la proteína LG R7 para cubrir los pozos de una placa de microtítulo , se utilizan células que expresan la prote ína LGR7. Esto se preincuba en presencia o ausencia de u n anticuerpo competitivo candidato, después se ag rega al mismo un anticuerpo anti-LG R7 etiq uetado con biotina de la presente invención , y puede utilizarse un conjugado de streptavid ina/fluoresce ína para detectar la competición entre los anticuerpos. El ensayo de bloqueo cruzado que util iza citometría de flujo se refiere particularmente como el ensayo de FACS competitivo. Puede etiquetarse el anticuerpo con otra sustancia de etiquetado fluorescente que pueda detectarse o medirse.

Alternativamente , cuando un anticuerpo de prueba tiene una región constante derivada de una especie con excepción de la del anticuerpo anti-LGR7 de la presente invención , puede med irse cada anticuerpo unido al pozo por un anticuerpo etiquetado que reconozca su región constante . Alternativamente , incluso cuando los anticuerpos se derivan de la misma especie , si sus clases son diferentes, pueden medirse cada anticuerpo unido al pozo con un anticuerpo que reconozca su clase.

Si un anticuerpo cand idato puede bloquear la unión del anticuerpo anti-LGR7 por al menos 20% , preferiblemente por lo menos 30% , y más preferiblemente por lo menos 50% comparado con la actividad de unión obtenida en una prueba control realizada en ausencia del anticuerpo com petente candidato, después el anticuerpo competente candidato une esencial mente al mismo ep ítope como el anticuerpo anti-LG R7 de la presente invención, o compite con el anticuerpo anti-LGR7 de la invención para unir al mismo epítope. Cuando se determina el epítope, puede sustituirse la región constante de un anticuerpo de la presente invención con la misma reg ión constante como la del anticuerpo de prueba .

Composiciones farmacéuticas Desde un diferente punto de vista, la presente invención proporciona las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de unión a proteína LGR7 como ingrediente activo. Además, la presente invención se relaciona con los inhibidores del crecimiento celular, particularmente agentes anticáncer, que comprenden un anticuerpo de unión a proteína LGR7 como ingrediente activo. Preferiblemente, los inhibidores del crecimiento celular y agentes anticáncer de la presente invención se administran a un sujeto que sufre o puede sufrir de cáncer. Debido a que el nivel de expresión de LGR7 es muy bajo en células normales excepto en el cerebro pero es aumentado en las células cancerosas, se pretende que el efecto citotóxico específico a célula de cáncer se pueda obtener por la administración de un anticuerpo anti-LGR7.

No existe ninguna limitación particular en los anticuerpos anti-LGR7 usados en las composiciones farmacéuticas (por ejemplo, agentes anticáncer) de la presente invención, y pueden ser cualquier anticuerpo anti-LGR7. Por ejemplo, se pueden utilizar los anticuerpos anti-LGR7 descritos anteriormente.

En la presente invención, "comprende un anticuerpo de unión a LGR7 como ingrediente activo" significa que comprende un anticuerpo anti-LGR7 como ingrediente activo primario, y no excite ninguna limitación en la relación de contenido del anticuerpo anti-LGR7.

Cuando la enfermedad tratada por una composición farmacéutica de la presente invención es cáncer, el cáncer tratado no está particularmente limitado; sin embargo, el cáncer ovárico es preferido, y el adenocarcinoma de células claras ováricas es particularmente preferido. El cáncer puede ser lesiones primarias o metastáticas.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de manera oral o parenteral a un paciente. Preferiblemente, la administración es la administración parenteral. Específicamente, el método de administración es, por ejemplo, administración por inyección, administración transnasal, administración transpulmonar, o administración transdérmica. Los ejemplos de administración por inyección incluyen las administraciones sistémicas y locales de una composición farmacéutica de la presente invención por inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, o similares. Un método de administración adecuado se puede seleccionar de acuerdo con la edad y síntomas del paciente. La dosificación se puede seleccionar, por ejemplo, dentro del intervalo de 0.0001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal en cada administración. Alternativamente, por ejemplo, la dosificación para cada paciente se puede seleccionar dentro del intervalo de 0.001 a 100,000 mg/peso corporal. Sin embargo, la composición farmacéutica de la presente invención no se limita a estas dosis.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular de acuerdo con los métodos convencionales (por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, última edición, ark Publishing Company, Easton, U.S. A), y pueden también contener los portadores y aditivos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos, excipientes, agentes colorantes, perfumes, conservadores, estabilizadores, amortiguadores, agentes de suspensión, agentes de isotonización, aglutinantes, desintegrantes, lubricantes, agentes promotores de fluidez, y agentes saborizantes; y otros portadores usados comúnmente pueden ser utilizados adecuadamente. Los ejemplos específicos de portadores incluyen ácido silícico anhidro ligero, lactosa, celulosa cristalina, manitol, almidón, calcio de carmelosa, sodio de carmelosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, dietilaminoacetato de polivinilacetal, polividona, gelatina, triglicérido de ácido graso de cadena media, aceite de ricino endurecido con polioxietileno 60, sacarosa, carboximetilcelulosa, almidón de maíz, sal inorgánica, y similares.

La presente invención también proporciona los métodos para dañar o inhibir la proliferación de las células de expresión de LGR7 por el contacto de las células de expresión de LGR7 con un anticuerpo de unión a proteína LGR7.

No existe ninguna limitación particular en los anticuerpos usados en los métodos de la presente invención, pero por ejemplo, los anticuerpos descritos anteriormente pueden ser utilizados. Las células unidas por los anticuerpos anti-LGR7 no están particularmente limitadas mientras sean células que expresan LGR7. Las células de expresión de LGR7 en la presente invención son preferiblemente células cancerosas. Preferiblemente, son células cancerosas ováricas. Los métodos de la presente invención se pueden aplicar a las lesiones primarias y metastáticas de estos cánceres. Las células cancerosas aún más preferibles son células cancerosas ováricas primarias y metastáticas.

En la presente invención, se realiza el "contacto", por ejemplo, agregando el anticuerpo al medio de cultivo de las células de expresión de LGR7 cultivadas in vitro. Alternativamente, en la presente invención, el "contacto" es realizado administrando a un animal no humano en el cual las células que expresaban LGR7 se han trasplantado, o a un animal que tenga de manera endógena las células cancerosas de expresión de LGR7.

El siguiente método se utiliza adecuadamente como método para evaluar o medir el daño celular inducido en las células de expresión de LGR7 poniéndolas en contacto con un anticuerpo anti-LGR7. Los ejemplos de un método para evaluar o medir la actividad citotóxica en un tubo de prueba incluyen los métodos para medir la actividad de citotoxicidad mediada por las células dependientes de anticuerpos (ADCC) mencionada anteriormente, la actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), y similares. Independientemente de si un anticuerpo anti-LGR7 tiene la actividad ADCC o la actividad CDC se puede medir por los métodos conocidos (por ejemplo, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E. Coligan y colaboradores, John Wiley & Sons, Inc., (1993) y similares). Para las mediciones de la actividad, un anticuerpo de unión que tiene el mismo isotipo que un anticuerpo anti-LGR7 pero que no tiene ninguna actividad citotóxica, puede utilizarse como anticuerpo de control de una manera similar al anticuerpo anti-LGR7, y se puede determinar que la actividad está presente cuando el anticuerpo anti-LGR7 muestra una actividad citotóxica más fuerte que el anticuerpo de control.

El isotipo de un anticuerpo es definido por la secuencia de su región constante de cadena H en la secuencia de aminoácido del anticuerpo. El isotipo de un anticuerpo es determinado finalmente in vivo por el intercambio de clase que se presenta de las recombinaciones genéticas en los cromosomas que ocurren durante ia maduración de las células B de producción de anticuerpo. La diferencia de isotipo se refleja en la diferencia de funciones fisiológicas y patológicas de los anticuerpos. Específicamente, por ejemplo, la intensidad de la actividad citotóxica se conoce como afectada por el isotipo del anticuerpo además del nivel de expresión de antígeno. Por lo tanto, al medir la actividad dañina para la célula descrita anteriormente, un anticuerpo del mismo isotipo que el anticuerpo de prueba se utiliza preferiblemente como control.

Para evaluar o medir in vivo la actividad dañina para las células, por ejemplo, las células cancerosas de expresión de LGR7 se trasplantan de manera intradérmica o subcutánea a un animal de prueba no humano, y entonces un anticuerpo de prueba es administrado diariamente de manera intravenosa o intraperitoneal o en un intervalo de algunos días, a partir del día de trasplante o al día siguiente. La citotoxicidad se puede determinar por la medición diaria del tamaño de tumor. De una manera similar a la evaluación en un tubo de prueba, la citotoxicidad se puede determinar administrando un anticuerpo de control que tiene el mismo isotipo, y observando que el tamaño de tumor en el grupo administrado con el anticuerpo anti-LGR7 es significativamente más pequeño que el tamaño de tumor en el grupo administrado con el anticuerpo de control. Al utilizar un ratón como animal de prueba no humano, es adecuado utilizar un ratón inmunodeficiente (nu/nu) cuyo timo se ha hecho genéticamente defectuoso para que pierda su función del linfocito T. El uso de tal ratón puede eliminar la participación de los linfocitos T en los animales de prueba al evaluar o medir la citotoxicidad del anticuerpo administrado.

Además, la presente invención proporciona los métodos de diagnóstico del cáncer que comprenden la detección de una proteína LGR7 o de un gen que codifica la proteína LGR7. Aunque la expresión de LGR7 se eleva significativamente en varios tejidos cancerosos o líneas celulares de cáncer, la expresión de LGR7 en las células normales es muy baja. Por lo tanto, LGR7 es útil como marcador para la detección específica de cáncer.

En una modalidad de los métodos de la presente invención, el cáncer es diagnosticado detectando la proteína LGR7 en una muestra. Preferiblemente, se detecta un dominio extracelular de la proteína LGR7. La detección de la proteína LGR7 se realiza preferiblemente utilizando un anticuerpo que reconozca la proteína LGR7.

Un ejemplo específico de los métodos de diagnóstico de la presente invención es un método de diagnóstico del cáncer que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una muestra recolectada de un sujeto; y (b) detectar una proteína LGR7 contenida en la muestra recolectada utilizando un anticuerpo de unión a proteína LGR7.

En la presente invención, la "detección" incluye la detección cuantitativa y cualitativa. Las siguientes mediciones son ejemplos de la detección cualitativa: medición para determinar simplemente sin importar si la proteína LGR7 está presente: medición para determinar independientemente de si una cantidad predeterminada o mayor de la proteína LGR7 está presente; y medición para comparar la cantidad de la proteína LGR7 con la de otra muestra (por ejemplo, una muestra de control, etc.).

Por otra parte, la detección cuantitativa incluye la medición de la concentración de proteína LGR7, cantidad de proteína LGR7, y similares.

La muestra de prueba de la presente invención no está particularmente limitada mientras sea una muestra que contiene posiblemente la proteína LGR7. Más específicamente, una muestra recolectada del cuerpo de un organismo tal como un mamífero es preferible. Una muestra recolectada de un ser humano es más preferible. Los ejemplos específicos de la muestra de prueba incluyen sangre, fluido intersticial, plasma, fluido extravascular, fluido cerebroespinal, fluido sinovial, fluido pleural, suero, linfa, saliva, orina, tejido, ascitis, y lavado intraperitoneal. Preferiblemente, la muestra se obtiene de una muestra de prueba tal como un espécimen de tejido o células fijos recolectados del cuerpo de un organismo, o medio de cultivo líquido de las células.

El cáncer que se diagnosticará por la presente invención no está particularmente limitado y puede ser cualquier clase de cáncer. Los ejemplos específicos incluyen el cáncer ovárico. En la presente invención, las lesiones primarias y metastáticas de estos cánceres pueden ser diagnosticadas. En la presente Invención, el cáncer ovárico primario y el cáncer ovárico metastático son cánceres particularmente preferidos.

En la presente invención, si la proteína LGR7 se detecta en una muestra de prueba, su nivel se utiliza como indicador para la diagnosis del cáncer. Específicamente, si la cantidad de la proteína LGR7 detectada en una muestra de prueba es mayor que la presente en un control negativo o un individuo sano, indica que el paciente tiene cáncer o es muy probable que sufra de cáncer en el futuro. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método de diagnóstico del cáncer que comprende las siguientes etapas: (1) detectar el nivel de la expresión de LGR7 en una muestra de prueba recolectada de un sujeto; y (2) indicar que el sujeto tiene cáncer cuando el nivel de la expresión de LGR7 detectado en (1) es más alto que el detectado en un control.

En la presente invención, el "control" se refiere a una muestra que sirve como estándar para la comparación, e incluye un control negativo y una muestra biológica de un individuo sano. Un control negativo puede ser obtenido recolectando las muestras biológicas de individuos sanos y mezclándolas cuando sea necesario. El nivel de la expresión de LGR7 en el control se puede detectar paralelamente al nivel de la expresión de LGR7 en una muestra biológica de un sujeto. Alternativamente, el nivel de la expresión de LGR7 en las muestras biológicas de una pluralidad de individuos sanos se puede detectar previamente, y el nivel estándar de la expresión en individuos sanos se puede determinar estadísticamente. Más específicamente, por ejemplo, puede utilizarse un valor estándar de las desviaciones estándar (S.D.) promedio de ± 2 o desviaciones estándar (S.D.) promedio de ± 3. Estadísticamente, la desviación estándar (S.D.) promedio de ± 2 incluye los valores de 80% de los individuos sanos, y la desviación estándar (S.D.) promedio de ± 3 incluye los valores de 90% de los individuos sanos.

Alternativamente, el nivel de la expresión de LGR7 en el control se puede establecer utilizando una curva característica de operación de receptor (ROC). Una curva ROC es una gráfica que muestra la sensibilidad de detección en el eje vertical y el índice de falso positivo (es decir, "especificidad 1") en el eje horizontal. En la presente invención, una curva ROC puede ser obtenida trazando los cambios en el índice de sensibilidad y del falso positivo cuando varia continuamente el valor estándar para determinar el nivel de la expresión de LGR7 en una muestra biológica.

El "valor estándar" para obtener una curva ROC es un valor numérico usado temporalmente para el análisis estadístico. Generalmente, el "valor estándar" para obtener una curva ROC varía continuamente dentro de un intervalo que cubre todos los valores estándar que pueden ser seleccionados. Por ejemplo, el valor estándar puede variar entre el máximo y mínimo de los valores medidos de LGR7 en la población que se analizará.

Con base en la curva ROC obtenida, pueden ser seleccionados los valores estándar previstos para la sensibilidad de detección y exactitud deseada. Un valor estándar establecido estadísticamente por una curva ROC y similares, también es llamado "valor límite". En los métodos de detección de cáncer basados en el valor límite, en la etapa (2) mencionada anteriormente, el nivel de la expresión de LGR7 detectado en (1) se comparan con el valor límite. Además, el sujeto es detectado con cáncer cuando el nivel de la expresión de LGR7 detectado en (1) es más alto que el valor límite.

En la presente invención, el nivel de la expresión de LGR7 se puede determinar por cualquier método. Más específicamente, es posible determinar el nivel de la expresión de LGR7 evaluando la cantidad de ARNm LGR7, la cantidad de la proteína LGR7, y la actividad biológica de la proteína LGR7. La cantidad de ARNm LGR7 o proteína se puede determinar por los métodos descritos en la presente.

En la presente invención, cualquier especie animal que expresa una proteína LGR7 puede ser el sujeto. Por ejemplo, se conoce que muchos mamíferos no humanos tal como chimpancé (Pan troglodytes) (ENSPTRG00000016551 ), mono Rhesus (Macaca mulatta) (ENSMMUG00000004647), ratón (Mus musculus) (ENSMUSG00000034009), rata (Rattus norvegicus) (ENSRNOG00000024120), cobayo (Cavia porcellus) (ENSCPOG00000015517), perro (Canis familiaris) (ENSCAFG00000008672), pollo (Gallus gallus) (ENSGALG00000009429) y similares expresan la proteína LGR7.

Así, estos animales se incluyen en los sujetos de la presente invención. El humano es un sujeto particularmente preferido. No hace falta decir que cuando un animal no humano se utiliza como sujeto, ta proteína LGR7 de la especie animal será detectada.

No existe ninguna limitación particular en el método para detectar la proteína LGR7 contenida en una muestra de prueba; sin embargo, la detección por un método inmunológico ejemplificado más adelante utilizando el anticuerpo anti-LGR7 es preferible: radioinmunoanálisis (RIA); inmunoensayo enzimático (EIA); fluoroinmunoanálisis (FIA); inmunoensayo de luminescencia (LIA); inmunoprecipitación (IP); inmunoensayo turbidimétrico (TIA); Western Blotting (WB); inmunohistoquímica (IHC); y inmunodifusión radial simple (SRID).

De estas técnicas, el método de inmunohistoquímica (IHC) comprende la etapa de detectar la proteína LGR7 en una sección de los tejidos o células fijos recolectados de un paciente que sufre de cáncer, y es uno de los análisis inmunológicos preferibles para los métodos de diagnóstico de cáncer. Los métodos inmunológicos mencionados anteriormente tal como el método de inmunohistoquímica (IHC) son conocidos por los expertos en la técnica.

Es decir, debido a que LGR7 es una proteína de membrana cuya expresión se aumenta específicamente en células cancerosas, las células o tejidos cancerosos pueden ser detectados por un anticuerpo anti-LGR7. El análisis inmunohistológico mencionado anteriormente detecta las células cancerosas contenidas en las células o tejidos recolectados del cuerpo.

En otra modalidad preferida, es posible detectar los tejidos de cáncer in vivo utilizando un anticuerpo anti-LGR7. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para detectar el cáncer que comprende las etapas de: (1) administrar a un sujeto un anticuerpo de unión a proteína LGR7 etiquetado con una sustancia de etiquetado tal como un radioisótopo; y (2) detectar la acumulación de la sustancia de etiquetado. Para rastrear el anticuerpo administrado en el cuerpo, el anticuerpo puede ser etiquetado para poderlo detectar. Por ejemplo, es posible supervisar el comportamiento in vivo de un anticuerpo etiquetado con una sustancia fluorescente o luminiscente, o un radioisótopo. Un anticuerpo etiquetado con una sustancia fluorescente o luminiscente se puede observar utilizando un endoscopio o laparoscopio. Con el radioisótopo, la ubicación del anticuerpo puede ser reflejada rastreando la radiactividad. En la presente invención, la ubicación del anticuerpo anti-LGR7 in vivo representa la presencia de células cancerosas.

Un núclido de emisión de positrón puede utilizarse como radioisótopo para etiquetar el anticuerpo para la detección del cáncer in vivo. Por ejemplo, el anticuerpo se puede etiquetar con un núclido de emisión de positrón tal como 18F, 55Co, 64Cu, 66Ga, 68Ga, 76Br, 89Zr y 124l. Un método conocido (Acta Oncol. 32, 825-830, 1993) puede utilizarse para etiquetar el anticuerpo anti-LGR7 con un núclido de emisión de positrón.

Después de administrar el anticuerpo anti-LGR7 etiquetado con un núclido de emisión de positrón a un humano o animal, la radiación emitida por el radionúclido es medida fuera del cuerpo por un dispositivo de tomografía de emisión de positrón (PET), y esta se convierte a una imagen utilizando una técnica de tomografía automatizada. El PET es un dispositivo para la recolección de datos no invasiva con respecto al comportamiento in vivo y similares de un fármaco. La intensidad de radiación puede ser reflejada cuantitativamente por PET como fuerza de señal. Utilizando el PET según lo descrito anteriormente, es posible detectar una molécula de antígeno que se expresa altamente en un cáncer específico sin la recolección de una muestra del paciente. El anticuerpo anti-LGR7 se puede etiquetar con un núclido de breve duración utilizando un núclido de emisión de positrón tal como 1C, 3N, 150, 18F, 45Ti, y similares, además de los núclidos mencionados anteriormente.

Está progresando la investigación y desarrollo de la producción de núclidos de breve duración utilizando los núclidos mencionados anteriormente por un ciclotrón médico, las técnicas de fabricación para los compuestos etiquetados con los núclidos de breve duración, y similares. Un anticuerpo anti-LG 7 se puede etiquetar con varios radioisótopos utilizando estas técnicas. El anticuerpo anti-LGR7 administrado a un paciente se acumula en las lesiones primarias y metastáticas con base en la especificidad del anticuerpo anti-LGR7 para cada sitio del tejido patológico. Si el anticuerpo anti-LGR7 es etiquetado con un núclido de emisión de positrón, determinando la radiactividad, la presencia de las lesiones primarias y metastáticas se puede detectar basado en la ubicación de la radiactividad. Para las aplicaciones de diagnóstico, el valor de actividad de un nivel de la emisión de partícula gamma o positrón de 25 a 4000 keV puede utilizarse adecuadamente. Además, si un núclido adecuado se selecciona y se administra en una gran cantidad, los efectos terapéuticos pueden también ser esperados. Para obtener un efecto anticáncer por la radiación, puede utilizarse un núclido que proporciona un nivel de emisión de partícula gamma o positrón de 70 a 700 keV.

En otra modalidad de los métodos de la presente invención, se detecta la expresión de gen LGR7. No existe ninguna limitación particular en el gen detectado en la presente invención; sin embargo, el ARNm es preferible. En la presente invención, la "detección" incluye la detección cuantitativa y cualitativa. Los ejemplos de la detección cualitativa incluyen las siguientes operaciones de medición: medición para determinar simplemente sin importar si ARNm LGR7 está presente; medición para determinar independientemente de si una cantidad predeterminada o mayor de ARNm LGR7 está presente; y medición para comparar la cantidad de ARNm LGR7 con la de otra muestra (por ejemplo, una muestra de control, y similares) Por otra parte, la detección cuantitativa incluye la medición de la concentración de ARNm LGR7, la cantidad de ARNm LGR7, y similares.

Cualquier muestra que contenga posiblemente ARNm LGR7 puede utilizarse como muestra de prueba de la presente invención. Una muestra recolectada del cuerpo de un organismo tal como un mamífero es preferible. Una muestra recolectada de un humano es más preferible. Los ejemplos específicos de la muestra de prueba incluyen sangre, fluido intersticial, plasma, fluido extravascular, fluido cerebroespinal, fluido sinovial, fluido pleural, suero, linfa, saliva, orina, tejidos, ascitis, y lavado intraperitoneal. Como muestra preferible, la muestra de prueba de la presente invención incluye una muestra obtenida de una muestra de prueba tal como un espécimen de tejidos o células fijos recolectados del cuerpo de un organismo, o un medio de cultivo celular.

Al utilizar las muestras obtenidas de muestras de prueba tal como un espécimen de tejidos o células fijos recolectados del cuerpo de un organismo, o un medio de cultivo celular, el método de hibridación in situ puede utilizarse adecuadamente. El método de hibridación in situ se ha desarrollado como un medio para determinar la presencia o distribución de las moléculas específicas de ADN y ARN en las células y tejidos, y su intensidad de expresión. El principio es que el método utiliza la característica de la formación compleja específica de una secuencia especificada de ácido nucléico en una célula por un ácido nucléico de sonda que tiene una secuencia de nucleótido complementaria a la misma. El método de hibridación in situ se utiliza para la detección de ADN, ARN, y similares en las células, debido a que si la sonda se etiqueta con un radioisótopo (Rl) o una sustancia antigénica (hapteno) previamente, entonces el sitio de hibridación puede ser distinguido detectando la etiqueta. Una etiqueta de Rl puede utilizarse adecuadamente como la etiqueta de sonda. Un ejemplo más adecuado es el uso de las etiquetas fluorescentes que utilizan sustancias no radiactivas tal como haptenos incluyendo biotina, digoxigenina, y similares. Un ejemplo particularmente adecuado es el uso de un método de detección por hibridación in situ de fluorescencia llamado FISH.

Los ejemplos de los cánceres que se diagnosticarán incluyen el adenocarcinoma de células claras del cáncer ovárico. En la presente invención, las lesiones primarias y metastáticas de estos cánceres pueden ser diagnosticadas.

Cualquier especie animal que expresa la proteína LGR7 puede utilizarse como sujeto de la presente invención. Por ejemplo, se conoce que varios mamíferos distintos a los humanos tal como ratones, ratas, monos Rhesus, y chimpancés expresan LGR7. Un sujeto particularmente preferido es el humano. Al utilizar una especie animal no humana como sujeto, el ARNm LGR7 de la especie animal será detectado.

Una modalidad específica de los métodos de detección es descrita más adelante. Primero, una muestra se prepara de un sujeto. Entonces, el ARNm LGR7 contenido en la muestra se detecta. En la presente invención, el ADNc sintetizado del ARNm puede también ser detectado. En la presente invención, cuando un ARNm LGR7 o ADNc de codificación de LGR7 se detecta en la muestra de prueba, se determina que el cáncer puede ser posible. Por ejemplo, cuando la cantidad de ARNm LGR7 o ADNc de codificación de LGR7 detectada en la muestra de prueba es mayor que la detectada en un control negativo o un individuo sano, esto indica que el sujeto tiene cáncer o alta posibilidad de sufrir cáncer en el futuro.

Los métodos para detectar el ARNm se conocen. Más específicamente, los métodos tal como Northern Blotting, RT- PCR, y matriz ADN pueden utilizarse en la presente invención.

Los métodos de detección mencionados anteriormente de la presente invención se pueden automatizar utilizando varios dispositivos de detección automáticos. Con la automatización, es posible probar una gran cantidad de muestras en un breve periodo de tiempo.

La presente invención también proporciona un agente o kit de diagnóstico para la diagnosis del cáncer que comprende un reactivo para detectar la proteína LGR7 en una muestra de prueba. El agente de diagnóstico de la presente invención contiene por lo menos un anticuerpo anti-LGR7.

El kit para la diagnosis del cáncer puede ser preparado combinando el agente de diagnóstico de cáncer de la presente invención con otro componente usado para detectar LGR7. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un kit para la diagnosis del cáncer que contiene un anticuerpo de unión a LGR7 y un reactivo que detecta la unión entre el anticuerpo y LGR7. El kit puede también incluir una muestra de control que comprende una muestra biológica que contiene LGR7. El kit de la presente invención se puede también acompañar por las instrucciones que explican el procedimiento de medición.

Todas las referencias de la técnica anterior citadas en la presente son incorporadas por referencia en esta descripción.

Ejemplos En la presente más adelante, la presente invención será descrita específicamente con referencia a los ejemplos, pero el alcance técnico de la presente invención no se debe interpretar como limitada a los mismos.

Ejemplo 1 Análisis de expresión de ARNm LGR7 humano por Affymetrix U133 más la matriz 2.0 El ARN total fue extraído de los especímenes quirúrgicos de diez casos de cáncer ovárico que fueron recolectados después de obtener los consentimientos escritos en la University of Tokyo Hospital (Japón), y almacenados por congelamiento. En la presente, las muestras quirúrgicas fueron incrustadas en un compuesto de OCT, y estas fueron rebanadas y disueltas en TRIZOL (Invitrogen), y entonces el ARN total fue extraído de acuerdo con el método descrito en el manual anexado al producto. Al mismo tiempo, los especímenes teñidos con HE fueron preparados para confirmar que una parte cancerosa es incluida. Los tipos de tejido de los diez casos de cáncer ovárico son como sigue: carcinomas de células claras (cuatro casos), adenocarcinoma seroso (dos casos), adenocarcinoma de endometrio (tres casos), y carcinosarcoma (un caso). El análisis de expresión fue realizado por Affymetrix U-133 más la matriz 2.0 utilizando estos ARNs totales, y fueron seleccionados los genes que muestran una alta expresión específicamente en el adenocarcinoma ovárico de células claras. Como controles, fueron utilizados los ARNs totales derivados de los tejidos normales (Clontech) y las líneas celularés de cáncer ovárico (compradas de ATCC, JCRB, y Riken).

Los conjuntos de sonda fueron reducidos a 11761 conjuntos que tienen un nivel de expresión de 200 o más en por lo menos uno de cuatro casos de adenocarcinoma ovárico de células claras, que fueron utilizados como un estándar para seleccionar las moléculas objeto adecuadas para el tratamiento del adenocarcinoma de células claras. Después, comparando el tercer nivel de expresión más alto entre los cuatro casos de adenocarcinoma ovárico de células claras, y el nivel de expresión más alto entre el ovario normal, sangre periférica, médula, y órganos importantes (hígado, riñón, pulmón, estómago, intestino, y páncreas), los conjuntos de sonda fueron reducidos adicionalmente a 197 conjuntos que mostraron una relación de 1.8 o más. De ellos, LGR7 fue seleccionada como la molécula que mostró el valor más alto de la relación anterior y que no reportó relacionarse con el adenocarcinoma ovárico de células claras. Al hacer esta selección, los datos de expresión de 87 casos de cáncer ovárico que incluyen tres casos adenocarcinoma de células claras descritos por el International Genomics Consortium (IGC) fueron tomados en consideración. La figura 1 mostró una gráfica que indica los niveles de señal de la sonda de LGR7 1552715 en los cánceres ováricos, líneas celulares de cáncer ovárico, y tejidos normales. El significado de los nombres de muestra se muestra en la tabla 1.

Entre cánceres ováricos, LGR7 se expresa específicamente en el adenocarcinoma de células claras, y así los agentes antitumores que se dirigen a la LGR7 humana objeto son efectivos para este tipo de cáncer.

Tabla 1 Hígado fetal tejido normal hígado fetal Colon fetal tejido normal colon fetal Ovary3Ca tejido aislado de adenocarcinoma cáncer ovárico ovárico de células claras Ovary5Ca tejido aislado de adenocarcinoma cáncer ovárico ovárico de células claras Ovary7Ca tejido aislado de adenocarcinoma cáncer ovárico ovárico de células claras Ovaryl 9Ca tejido aislado de adenocarcinoma cáncer ovárico ovárico de células claras Ovary9Ca tejido aislado de adenocarcinoma cáncer ovárico ovárico de endometrio Ovary13Ca tejido aislado de adenocarcinoma cáncer ovárico ovárico de endometrio Ovary17Ca tejido aislado de adenocarcinoma cáncer ovárico ovárico de endometrio Ovaryl Ca tejido aislado de adenocarcinoma cáncer ovárico seroso ovárico Ovaryl 5Ca tejido aislado de adenocarcinoma cáncer ovárico seroso ovárico Ovaryl 1 Ca tejido aislado de carcinosarcoma cáncer ovárico ovárico CP_JHOC_5 línea celular de adenocarcinoma cáncer ovárico ovárico de células claras CP_MCAS línea celular de adenocarcinoma cáncer ovárico mucinoso ovárico CP_RMG_1 línea celular de adenocarcinoma ovárico de células cáncer ovárico claras CP_RMUG_S línea celular de adenocarcinoma cáncer ovárico mucinoso ovárico CP_TKY_nu línea celular de adenocarcinoma no cáncer ovárico diferenciado ovárico Ejemplo 2 Establecimiento de las células que expresan LGR7 humana integral El ADNc de LGR7 humana integral fue aislado con el método de PCR utilizando el ADNc QUICK-CLONE de útero humano (Clontech) basado en el número de acceso de NCBI NP_067647 (SEC ID NO: 1, secuencia de aminoácido) y N _021634 (SEC ID NO: 2, secuencia de nucleótido). Este fue clonado en el pGEM-T Easy (Promega), y una secuencia de etiqueta de HA fue agregada a la terminal N. Entonces, este fue clonado en el vector de pMCN2i para la expresión en células de mamífero.

La introducción del gen en la línea celular DG44 derivada de ovario de hámster chino fue realizada utilizando BioRad GenePulser para obtener la línea celular de expresión de HA- LGR7 HA-LGR7/DG#24. La introducción en Ba/F3 que es una célula pro-B de ratón fue realizada para obtener la línea celular de expresión de HA-LGR7 HA-LGR/BaF3#48. La expresión de LGR7 fue confirmada por Western Blotting utilizando el anticuerpo HA-7 (Sigma) contra la etiqueta de HA (figura 2).

Además, un vector en donde se inserta el gen de LGR7 fue construido para la inmunización de ADN. El vector de expresión pMCN permite la expresión de un gen insertado bajo el promotor CMV de ratón (acceso No. U68299), y tiene un gen de resistencia de neomicina incorporado como un marcador de resistencia de fármaco. El gen de LGR7 fue clonado en pMCN utilizando un método convencional para preparar el vector de expresión de LGR7 pMCN-LGR7.

Ejemplo 3 Preparación de los anticuerpos monoclonales anti-LGR7 por la inmunización de ADN La inmunización de ADN por la introducción del gen en ratones fue realizada utilizando el método GeneGun Partióle. El método fue realizado de acuerdo con el manual de Bio-Rad. Las cápsulas para la inmunización de ADN fueron preparadas mezclando las partículas de oro de 1 mm (Bio-Rad) y ADN de pMCN-LGR7, y recubriendo el interior de un tubo con la mezcla. La introducción del gen fue realizada disparando las cápsulas recubiertas con el ADN de pMCN-LGR7 en la piel abdominal de los ratones hembra MRL/1pr de seis semanas de edad utilizando una pistola Helios Gene (Bio-Rad) a una presión de 200 a 300 psi. Se desea que el gen introducido en los queratinocitos, células Langerhans, y células dendríticas cutáneas en la piel exprese la proteína LGR7, y que así las células lleguen a ser células de presentación de antigeno e induzcan la inmunidad (Methods 31, 232-242 (2003); inmunización con ADN a través de la piel). La inmunización de ADN fue realizada seis veces en intervalos de una semana. Para la inmunización final, 1 x 106 células de la línea celular BaF3 HA-LGR/BaF3#48 que expresa LGR7 fueron diluidas en PBS y después administradas en la vena de la cola. La medición del título de anticuerpo fue realizada por el análisis FACS utilizando las células HA-LGR7/DG#24. Los sueros de los ratones inmunizados fueron comparados basados en su reactividad a la proteína LGR7 expresada en la superficie de la membrana celular de las células HA-LGR7/DG#24. El ratón que mostró la reactividad más alta fue sometido a la inmunización final y a la fusión celular. Las células del bazo fueron aisladas tres días después de la inmunización final, y mezcladas a una relación de 2:1 con las células de mieloma de ratón P3-X63Ag8U1 (P3U1, compradas de ATCC). La fusión celular fue realizada gradualmente agregando PEG1500 (Roche Diagnostics), y las células de hibridoma fueron preparadas. La concentración de PEG1500 fue diluida cuidadosamente agregando el medio RPMI 1640 (Gibco BRL), y entonces PEG 500 fue eliminado por centrifugación. Después, las células de hibridoma fueron suspendidas en un medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS, 1x de suplemento de medio de HAT (SIGMA), y 0.5x de suplemento de clonación de hibridoma de H1 BM-Condimed (Roche Diagnostics) (más adelante, medio HAT), e inoculadas en una placa de cultivo de 96 pozos en 200 ml/pozo. La concentración celular al momento de la inoculación fue diluida de acuerdo con el número de las células P3U1 usadas, y las células de hibridoma fueron cultivadas durante aproximadamente una semana en medio HAT en la placa de cultivo de 96 pozos a 37°C bajo 5% de C02. El análisis de los hibridomas que secretan un anticuerpo en el sobrenadante de cultivo fue realizado por citometría de flujo.

Ejemplo 4 Preparación de sLGRTFc Un fragmento que contiene los aminoácidos de las posiciones 1 a 555 de la proteína LGR7 fue amplificado por PCR, y un vector fue construido para expresar este fragmento como una proteína de fusión con una proteína humana de Fe (secuencia de nucleótido, SEC ID NO: 95; secuencia de aminoácido, SEC ID NO: 96). El vector construido fue introducido en las células DG44, y las células que pueden expresar la proteína de fusión sLGR7Fc fueron seleccionadas como una cepa resistente a neomicina. La cepa celular obtenida fue sometida al cultivo a gran escala, y el sobrenadante de cultivo fue recolectado, y la proteína sLGR7Fc fue purificada. La proteína sLGR7Fc que fue purificada por afinidad como una proteína de fusión de Fe utilizando una columna de Proteína A, fue utilizada como antígeno para la inmunización de proteína y para el análisis de hibridomas.

Ejemplo 5 Producción de los anticuerpos anti-LGR7 por la inmunización de la proteína sLGR7Fc 50 mg de la proteína sLGR7Fc purificada por afinidad fueron mezclados con el adyuvante completo de Freund, y estos fueron inmunizados subcutáneamente en los ratones. Entonces, los anticuerpos fueron inducidos por la inmunización subcutánea de ratones dos veces con una mezcla de 50 mg de la proteína sLGR7Fc y del adyuvante incompleto de Freund. 25 mg de la proteína sLGR7Fc fueron inyectados en la vena de la cola del ratón que mostró la reactividad más alta a la proteína LGR7. Después de tres días, el bazo fue retirado del ratón, y sometido a la fusión celular con la línea celular de mieloma de ratón P3 X63Ag8U.1, y los hibridomas fueron preparados como en el ejemplo 3.

Ejemplo 6 Evaluación de la actividad de unión por FACS (citometría de flujo) La unión de los hibridomas obtenidos a las células humanas LGR7/DG44 fue evaluada por la citometría de flujo. La línea celular que expresa LGR7 humano suspendida en amortiguador de FACS (2% FBS/PBS/0.05% NaN3) fue diluida a 1 x 106 células/ml utilizando el amortiguador de FACS, y ésta se convirtió en alícuota en una placa de fondo redondeado de 96 pozos Falcon 353910 a 50 ml/pozo. El sobrenadante de cultivo de hibridoma diluido a una concentración adecuada fue agregado a los pozos que contienen las células, y este fue hecho reaccionar durante 60 minutos en hielo. Después, las células fueron enjuagadas una vez con amortiguador de FACS. Como un anticuerpo secundario, un fragmento F(ab')2 de cabra anti-lgG Fcg-FITC de ratón (Beckman Coulter) fue agregado a los pozos que contienen las células, y éste se hizo reaccionar durante 30 minutos en hielo. Después de la reacción, el sobrenadante fue eliminado por centrifugación, y las células fueron suspendidas en 100 mi de amortiguador de FACS, y sometidas a citometría de flujo. El FACS Calibur (Becton Dickinson) fue utilizado para la citometría de flujo. Una selección de la población celular viable fue establecida utilizando una dispersión frontal/transferencia en mancha de dispersión lateral, y un histograma FL1 fue producido para las células incluidas en la población, y su actividad de unión fue evaluada.

Los sobrenadantes de hibridoma fueron se hicieron reaccionar con las células DG44 que expresaron LGR7 y las células madre DG44, respectivamente. Así, los hibridomas que reaccionan específicamente con las células de expresión de LGR7 fueron obtenidos. Los hibridomas de los pozos fueron hechos en clones simples por el método de dilución de limitación. El isotipo de cada anticuerpo fue analizado utilizando un kit de isotipificación de anticuerpo monoclonal de ratón IsoStrip® (Roche Diagnostics). Por lo tanto, el isotipo de 22DA6, 22DA7, 22DA11, 22DA12, 22DA23, y 22DA24 es lgG1; y el isotipo de 22DA4, 22DA10, 22SD7, 22SD25, 22SD31, y 22SD48 es lgG2a; y el isotipo de 22DA17 y 22DA20 es lgG2b. El cultivo de expansión de un solo hibridoma de clonación fue realizado, y entonces el anticuerpo fue purificado del sobrenadante de cultivo utilizando una columna de proteína G de acuerdo con el manual. El anticuerpo purificado fue sometido a la cuantificación de proteína por el análisis de proteína DC, etc.

Ejemplo 7 Medición de la actividad ADCC de los anticuerpos monoclonales anti-LGR7 Las actividades ADCC de los anticuerpos monoclonales anti- LGR7 humanos contra las células DG44 que expresan de manera forzada LGR7 fueron evaluadas por el método de liberación de cromo. Las células objetivo fueron cultivadas durante algunas horas en una solución de cultivo complementada con Chromium-51 (CHO-S SFM II, fabricado por Invitrogen). Entonces, la solución de cultivo fue eliminada, y las células fueron enjuagadas con un medio de cultivo. Las células fueron suspendidas en un medio de cultivo nuevo, y este fue agregado a una placa de fondo redondeado de 96 pozos a 1 x 104 células por pozo. Después, el anticuerpo fue agregado a las concentraciones finales de 1 mg/ml o 0.1 mg/ml, y las células efectoras (células recombinantes (WO2008/093688) producidas por la expresión forzada de una proteína quimérica que comprende el dominio extracelular del receptor Fc-gamma 3 de ratón (NM_010188) y la transmembrana y los dominios intracelulares de la cadena gamma humana (NM_004106) en NK-92 (ATCC, CRL-2407)), fueron agregadas a cada pozo a aproximadamente cinco veces la cantidad de las células objeto. La placa fue dejada en reposo durante cuatro horas a 37°C en una incubadora con 5% de C02. Posteriormente, la placa fue centrifugada, y una cantidad fija del sobrenadante fue recolectada de cada pozo. La radiactividad fue medida utilizando un contador gamma Wallac 1480, y el índice de liberación de cromo específico (%) fue determinado utilizando la siguiente ecuación: índice de liberación de cromo específica (%) = (A-C) x 100/(B-C) donde A representa la radiactividad en cada pozo; B representa el valor promedio de la radiactividad liberada en el medio durante la lisis celular con Nonidet P-40 a una concentración final de 1 % ; y C representa el valor promedio de la radiactividad cuando se agrega el medio solo.

Por lo tanto, según lo indicado en la figura 3, los anticuerpos monoclonales anti-LGR7 humana usados en la prueba , particularmente 22DA6, 22DA7, 22DA1 7, 22DA22 , 22DA23, 22DA24, 22SD7, 22SD25, y 22SD38 indujeron actividades ADCC muy fuertes contra las células de expresión de LG R7 humana. El resultado indica que la terapia con el anticuerpo anti-tumor que se dirige a LGR7 humana es muy útil. Ejemplo 8 Medición de la actividad CDC de los anticuerpos monoclonales anti-LGR7 La actividad CDC fue medida utilizando el grado de absorción 7-AAD por las células en las cuales la lesión celular ha ocurrido como un indicador.

Las células DG44 de expresión dé LG R7 se hicieron reaccionar con los anticuerpos monoclonales a una concentración de 1 0 mg/ml a 4°C durante 30 minutos. Después, el complemento de conejo bebé (Cedarlane Laboratories) fue agregado a las mismas a una concentración final de 1 0% , y la reacción fue realizada adicionalmente durante 90 minutos a 37°C. Después de agregar 7-AAD (Beckman Coulter) a una concentración final de 1 mg/ml , este se dejo reposar durante 1 0 minutos a temperatura ambiente . Después de lo anterior, las células fueron enj uagadas con amortiguador de FACS , y entonces la relación de las células en las cuales ha ocurrido la lesión celular fue evaluada por FACS Calibur. El valor de "% de FL3" muestra la relación de las células teñidas con 7-AAD en las cuales ha ocurrido la lesión celular. Según lo indicado en la figura 4, los múltiples anticuerpos anti-LGR7 mostraron actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) contra las células DG44 que expresan HA-LGR7.

Ejemplo 9 Clonación de los genes de antígeno Fueron determinadas las secuencias de los genes de región variable de anticuerpo de los nueve hibridomas, 22DA6, 22DA7 , 22DA1 7 , 22DA22 , 22DA23, 22DA24, 22SD7 , 22SD1 1 , y 22SD48, que mostraron la actividad ADCC y la actividad CDC. Los genes de anticuerpo fueron amplificados por el método de RT-PCR utilizando ARNs totales extraídos de los hibridomas que producen los anticuerpos anti-LGR7. El ARN total fue extraído de 1 x 1 07 células de hibridoma utilizando el kit miniatura RNeasy Plant (QIAGEN ). Una biblioteca RACE fue construida utilizando 1 mg de ARN total y el kit de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech). Utilizando los oligonucleótidos sintéticos complementarios a las secuencias de región constante de lgG 1 de ratón , M HC-lgG1 (SEC I D NO : 97 , GGGCCAGTGGATAGACAGATG), MHC-lgG2a (SEC I D NO : 98, CAGGGGCCAGTGGATAGACCGATG), M HC-lgG2b (SEC I D N O: 99 , CAGGGGCCAGTGGATAGACTGATG), o un oligonucleótido sintético complementario a la secuencia de nucleotido de región constante de cadena de ratón , kappa (SEC I D N O : 1 00, GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG), un fragmento de gen de extremo 5' fue amplificado del gen que codifica el anticuerpo producido por el hibridoma. La reacción de transcripción inversa fue realizada a 42°C durante 1.5 horas. 50 ml de la solución de PCR contuvo 5 ml de 10x de amortiguador de PCR Advantage 2, 5 ml de 10x de mezcla Universal Primer A, 0.2 mM de dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, y dTTP), 1 ml de mezcla de Advantage 2 Polymerase (todos manufacturados por Clontech), 2.5 ml de producto de reacción de transcripción inversa, y 10 pmol del oligonucleótido sintético MHC-lgG1, HC-lgG2a, MHC-lgG2b, o kappa. La reacción de PCR fue realizada como sigue: reacción a una temperatura inicial de 94°C durante 30 segundos; cinco ciclos de 94°C durante cinco segundos y 72°C durante tres minutos; cinco ciclos de 94°C durante cinco segundos, 70°C durante diez segundos, y 72°C durante tres minutos; y después 25 ciclos de 94°C durante cinco segundos, 68°C durante diez segundos, y 72°C durante tres minutos. Finalmente, el producto de reacción fue calentado a 72°C durante siete minutos. Cada producto de PCR fue purificado de gel de agarosa utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (fabricado por QIAGEN). Entonces, el producto de PCR fue clonado en el vector pGEM-T Easy (fabricado por Promega), y su secuencia de nucleótido fue determinada.

Para 22DA6, las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena H se muestran en la SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4, respectivamente; y las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena L se muestran en la SEC ID NO: 8 y SEC ID NO: 9, respectivamente. Además, para 22DA6, la SEC ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena pesada, SEC ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena pesada, SEC ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO: 10 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena ligera, SEC ID NO: 11 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena ligera, y SEC ID NO: 12 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena ligera.

Para 22DA7, las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena H se muestran en la SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: 14, respectivamente; y las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena L se muestran en la SEC ID NO: 18 y SEC ID NO: 19, respectivamente. Además, para 22DA7, la SEC ID NO: 15 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena pesada, SEC ID NO: 16 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena pesada, SEC ID NO: 17 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO: 20 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena ligera, SEC ID NO: 21 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena ligera, y SEC ID NO: 22 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena ligera.

Para 22DA17, las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena H se muestran en la SEC ID NO: 23 y SEC ID NO: 24, respectivamente; y las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena L se muestran en la SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 29, respectivamente. Además, para 22DA17, SEC ID NO: 25 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena pesada, SEC ID NO: 26 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena pesada, SEC ID NO: 27 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO: 30 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena ligera, SEC ID NO: 31 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena ligera, y SEC ID NO: 32 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena ligera.

Para 22DA22, las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena H se muestran en la SEC ID NO: 33 y SEC ID NO: 34, respectivamente; y las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena L se muestran en la SEC ID NO: 38 y SEC ID NO: 39, respectivamente. Además, para 22DA22, la SEC ID NO: 35 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena pesada, SEC ID NO: 36 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena pesada, SEC ID NO: 37 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO: 40 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena ligera, SEC ID NO: 41 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena ligera, y SEC ID NO: 42 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena ligera.

Para 22DA23, las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena H se muestran en la SEC ID NO: 43 y SEC ID NO: 44, respectivamente; y las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena L se muestran en la SEC ID NO: 48 y SEC ID NO: 49, respectivamente. Además, para 22DA23, SEC ID NO: 45 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena pesada, SEC ID NO: 46 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena pesada, SEC ID NO: 47 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO: 50 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena ligera, SEC ID NO: 51 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena ligera, y SEC ID NO: 52 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena ligera.

Para 22DA24, las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena H se muestran en la SEC ID NO: 53 y SEC ID NO: 54, respectivamente; y las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena L se muestran en la SEC ID NO: 58 y SEC ID NO: 59, respectivamente. Además, para 22DA24, SEC ID NO: 55 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena pesada, SEC ID NO: 56 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena pesada, SEC ID NO: 57 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO: 60 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena ligera, SEC ID NO: 61 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena ligera, y SEC ID NO: 62 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena ligera.

Para 22SD7, las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena H se muestran en la SEC ID NO: 63 y SEC ID NO: 64, respectivamente; y las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena L se muestran en la SEC ID NO: 68 y SEC ID NO: 69, respectivamente. Además, para 22SD7, SEC ID NO: 65 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena pesada, SEC ID NO: 66 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena pesada, SEC ID NO: 67 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO: 70 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena ligera, SEC ID NO: 71 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena ligera, y SEC ID NO: 72 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena ligera.

Para 22SD11, las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena H se muestran en la SEC ID NO: 73 y SEC ID NO: 74,. respectivamente; y las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena L se muestran en la SEC ID NO: 78 y SEC ID NO: 79, respectivamente. Además, para 22SD11, SEC ID NO: 75 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena pesada, SEC ID NO: 76 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena pesada, SEC ID NO: 77 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO: 80 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena ligera, SEC ID NO: 81 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena ligera, y SEC ID NO: 82 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena ligera.

Para 22SD48, las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena H se muestran en la SEC ID NO: 83 y SEC ID NO: 84, respectivamente; y las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de cadena L se muestran en la SEC ID NO: 88 y SEC ID NO: 89, respectivamente. Además, para 22SD48, SEC ID NO: 85 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena pesada, SEC ID NO: 86 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena pesada, SEC ID NO: 87 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena pesada, SEC ID NO: 90 muestra la secuencia de aminoácido de CDR1 de cadena ligera, SEC ID NO: 91 muestra la secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena ligera, y SEC ID NO: 92 muestra la secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena ligera.

Ejemplo 10 Efecto de muerte celular por la internalización de Mab-Zap Mab-Zap (fabricado por Advanced Targeting Systems) que es un anticuerpo secundario unido a una toxina llamada saporina fue utilizado para evaluar la capacidad de muerte celular contra las células de expresión de LGR7. Para el modelo de desarrollo de un anticuerpo farmacéutico, el mecanismo de acción es que un anticuerpo unido a una toxina o similares se une a una célula objeto, y se incorpora a la célula, y después mata la célula objeto por la acción de la toxina conjugada. Las células BaF3 hechas para expresar HA-LGR7 fueron utilizadas. 100 ng del anticuerpo y 100 ng de Mab-Zap fueron agregados a cada pozo. Después de la incubación a 37°C en una incubadora con 5% de C02 durante tres días, el número de células viables fue determinado por el análisis WST8 utilizando el reactivo de análisis de viabilidad celular SF (Nakalai Tesque). Los resultados se muestran en la figura 5. Comparados con un anticuerpo de control del mismo isotipo, los valores del análisis WST8 fueron claramente más bajos para las células co-tratadas con Mab-ZAP, y el efecto de la muerte celular se puede confirmar en todos los anticuerpos analizados. Esto muestra que los anticuerpos etiquetados con una toxina o radioisótopo pueden ser incorporados en las células y matar estas células.

Ejemplo 11 Reactividad de los anticuerpos monoclonales anti-LGR7 a LGR7 de ratón La LGR7 de ratón (secuencia de nucleótido, SEC ID NO: 93; secuencia de aminoácido, SEC ID NO: 94) fue insertada en un vector de expresión. La reactividad cruzada hacia LGR7 de ratón fue evaluada por la citometría de flujo utilizando la línea celular de expresión forzada de HA-mlGR7/BaF3 obtenida por la introducción del gen en las células BaF3. Según lo mostrado en la figura 6, fue encontrado que 22DA17 y 22DA23 exhiben la reactividad cruzada hacia LGR7 de ratón.

Ejemplo 12 Clasificación de epítope por el análisis FACS de competencia Los epítopes fueron clasificados por el análisis FACS de competencia. Los anticuerpos biotinilados utilizando el kit de etiquetado de proteína con biotina (Roche) de acuerdo con el manual . El análisis de FACS de competencia es un método en el cual un exceso de una cantidad de anticuerpo sin etiqueta se hace reaccionar previamente, un anticuerpo biotinilado se hace reaccionar, y el anticuerpo biotinilado se detecta posteriormente con una estreptavidina etiquetada con FITC. Cuando los anticuerpos reconocen el mismo epítope, el anticuerpo biotinilado no puede tener acceso al antígeno debido a que el anticuerpo sin etiquetar oculta el epítope, y el pico se mueve a la izquierda en el análisis FACS . Cuando el anticuerpo sin etiquetar y el anticuerpo biotinilados del mismo anticuerpo se hacen reaccionan para que la competencia ocurra y el cambio se mueva a la izquierda con respecto a cuándo se hace reacciona un anticuerpo anti-ratón etiquetado con F ITC. Por otra parte, cuando los anticuerpos reconocen los diferentes epítopes, la unión puede ocurrir sin la competencia con el anticuerpo sin etiquetar, y el cambio a la izquierda es así pequeño. Varios anticuerpos fueron biotinilados y el análisis de competencia fue realizado. Algunos de los resultados se muestran en la figura 7. Del análisis FACS de competencia utilizando los anticuerpos biotinilados Bio-22DA1 7 y Bio-22DA22 , fue encontrado que 22DA1 2 y 22DA22 son los anticuerpos que reconocen los epítopes diferentes de los de otros anticuerpos.

Ejemplo 13 Producción de un anticuerpo quimérico de lgG2a de ratón con lgG2a CH y CL de ratón Como métodos para mejorar la actividad ADCC de un anticuerpo, se conocen los métodos para modificar cadenas de azúcar de anticuerpo. El documento WO2006/067913 y similares describen la producción de anticuerpos que llevan una cadena de azúcar que no incluye fucosa de núcleo a-1,6 utilizando las células CHO en las cuales se elimina el gen transportador de fucosa (CHO_FTKO).

Las regiones variables de cadena H y cadena L del gen de anticuerpo del anticuerpo monoclonal anti-LGR7 humana 22DA23 clonado según lo descrito en el ejemplo 9, fueron amplificadas respectivamente por PCR. Fueron ligadas respectivamente a Cg2a de región C de cadena H y Ck de región C de cadena L de un anticuerpo de ratón, y estas fueron insertadas en un vector de expresión para las células de mamífero para que puedan expresarse como una molécula quimérica de lgG2a de ratón. El vector obtenido fue transfectado en la célula CHO deficiente del transportador de fucosa CHO_FTKO para establecer una cepa resistente a neomicina.

Las células fueron cultivadas en RPM 1-1640/10% de FBS de IgG ultrabajo (lnvitrogen)/500 mg/ml de Geneticin en presencia de penicilina/estreptomicina, y el anticuerpo quimérico de lgG2a de ratón fue purificado del sobrenadante de cultivo utilizando una columna de proteína A de acuerdo con el manual. El anticuerpo purificado 22DA23-mlgG2a/FTPKO fue sometido a una prueba de eficacia de fármaco utilizando un modelo de xenoinjerto ratón.

Ejemplo 14 Prueba de eficacia de fármaco utilizando un modelo de xenoinjerto ratón El anticuerpo purificado 22DA23-mlgG2a/FTPKO (FTKODA23) fue sometido a una prueba de eficacia de fármaco en ratones. Una pieza de aproximadamente 3 mm2 del tumor pasado in vivo RMG-1 fue trasplantado de manera subcutáneo en los ratones hembra Scid de siete semanas de edad (Clea, Japón). Diez días después del trasplante, fueron formados los grupos de acuerdo con el volumen del tumor y peso corporal, y fueron sujetados a examen. Para el tumor pasado in vivo RMG-1, fue utilizado un tumor aislado 42 días después del trasplante subcutáneo de las células cultivadas RMG-1 en 107 células/cuerpo. Un grupo incluyó seis ratones, y el anticuerpo FTKODA23 fue administrado a los ratones una vez por semana a 2 mg/kg o 10 mg/kg. PBS(-) fue administrado al grupo de control. La primera administración fue realizada diez días después del trasplante, la segunda administración 17 días después del trasplante, la tercera administración 24 días después del trasplante, y la cuarta administración 31 días después del trasplante. El volumen de tumor fue medido dos veces por semana, y la medición final fue realizada una semana después de la cuarta administración. Una gráfica que muestra los cambios del volumen de tumor se presenta en la figura 8. Fueron comparados los volúmenes de tumor del grupo de control y del grupo administrado con el anticuerpo. La TG I (inhi bición de crecimiento de tumor) fue de 37% en promedio en el grupo de administración de 1 0 mg/kg y del 33% en promedio en el grupo de administración de 2 mg/kg, y el efecto de retroceso de tumor fue confirmado.

Apl icabil idad Ind ustrial Los anticuerpos anti-LGR7 de la presente invención pueden exhibir los efectos anticáncer por la actividad de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos y por la actividad de citotoxicidad dependiente de complemento hacia las células de expresión de LGR7. Además, cuando están conjugados con una toxina (sustancia de daño celular), pueden causar daño celular a las células de expresión de LGR7 , así son útiles para la diagnosis, prevención , y tratamiento de varios cánceres primarios y metastáticos.

Los anticuerpos específicos a proteína LGR7 de la presente invención se expresan específicamente, particularmente , en el adenocarcinoma de células claras del cáncer ovárico, y pueden utilizarse así como agentes para diagnosticar el adenocarcinoma de células claras. Los agentes de diagnóstico de la presente invención son útiles para la diagnosis de cánceres primarios y metastáticos. Más específicamente, la posibilidad del cáncer puede ser evaluada detectando la proteína LG R7 contenida en una muestra biológica recolectada de un paciente. Alternativamente, la presencia del adenocarcinoma ovárico de células claras puede ser determinada in vivo detectando la ubicación de las células de expresión de LGR7 in vivo.

Además, los anticuerpos anti-LGR7 que tienen actividad citotóxica de la presente invención son útiles para la prevención y tratamiento de los cánceres que expresan la proteína LGR7. Más específicamente, la presente invención proporciona agentes citotóxicos e inhibidores del crecimiento celular contra las células cancerosas del adenocarcinoma ovárico de células claras. Los agentes citotóxicos e inhibidores del crecimiento celular contra las células cancerosas de la presente invención se pueden aplicar a los cánceres primarios y metastáticos.

Además, los anticuerpos anti-LGR7 que tienen actividad citotóxica de la presente invención pueden utilizarse como fármacos terapéuticos para el carcinoma ovárico de células claras. En la presente invención, los anticuerpos anti-LGR7 son útiles como fármacos terapéuticos contra cánceres primarios y metastáticos.

Además, los genes que codifican los anticuerpos de la presente invención y las células recombinantes transformadas con los genes pueden utilizarse para preparar los anticuerpos recombinantes que tienen los efectos mencionados anteriormente o efectos más preferibles.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que une a una proteína LGR7 y que tiene actividad inhibidora del crecimiento celular contra las células que expresan la proteína LGR7.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la actividad inhibidora del crecimiento celular es la actividad citotóxica.

3. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde la actividad citotóxica es la actividad de citotoxicidad mediada por células dependientes de los anticuerpos.

4. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde la actividad citotóxica es la actividad de citotoxicidad dependiente de complemento.

5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un anticuerpo al cual se une una sustancia citotóxica.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, que es un anticuerpo que tiene una actividad de internalización.

7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que sea un anticuerpo que suprime el crecimiento de las células cancerosas.

8. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde las células cancerosas son células de cáncer ovárico de células claras.

9. Un anticuerpo de cualquiera de los siguientes incisos (1) a (29): (1) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 5 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 6 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 7 como CDR3 (cadena pesada de 22DA6); (2) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 11 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12 como CDR3 (cadena ligera de 22DA6); (3) un anticuerpo que comprende la cadena H de (1) y la cadena L de (2) (22DA6); (4) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17 como CDR3 (cadena pesada de 22DA7); (5) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 20 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 21 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 22 como CDR3 (cadena ligera de 22DA7); (6) un anticuerpo que comprende la cadena H de (4) y la cadena L de (5) (22DA7); (7) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 25 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 26 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 27 como CDR3 (cadena pesada de 22DA17); (8) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 30 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 31 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 32 como CDR3 (cadena ligera de 22DA17); (9) un anticuerpo que comprende la cadena H de (7) y la cadena L de (8) (22DA17); (10) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 35 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 36 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 37 como CDR3 (cadena pesada 22DA22); (11) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 40 como CDR1 , la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 41 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 42 como CDR3 (cadena ligera de 22DA22); (12) un anticuerpo que comprende la cadena H de (10) y la cadena L de (11) (22DA22); (13) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 45 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 46 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 47 como CDR3 (cadena pesada de 22DA23); (14) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 50 como CDR1 , la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 51 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 52 como CDR3 (cadena ligera de 22DA23); (15) un anticuerpo que comprende la cadena H de (13) y la cadena L de (14) (22DA23); (16) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 55 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 56 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 57 como CDR3 (cadena pesada 22DA24); (17) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 60 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 61 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 62 como CDR3 (cadena ligera de 22DA24); (18) un anticuerpo que comprende la cadena H de (16) y la cadena L de (17) (22DA24); (19) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 65 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 66 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 67 como CDR3 (cadena pesada 22SD7); (20) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 70 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 71 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 72 como CDR3 (cadena ligera de 22SD7); (21) un anticuerpo que comprende la cadena H de (19) y la cadena L de (20) (22SD7); (22) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 75 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 76 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 77 como CDR3 (cadena pesada de 22SD11); (23) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 80 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 81 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 82 como CDR3 (cadena ligera de 22SD11); (24) un anticuerpo que comprende la cadena H de (22) y la cadena L de (23) (22SD11); (25) un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 85 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 86 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 87 como CDR3 (cadena pesada 22SD48); (26) un anticuerpo que comprende una cadena L que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 90 como CDR1, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 91 como CDR2, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 92 como CDR3 (cadena ligera de 22SD48); (27) un anticuerpo que comprende la cadena H de (25) y la cadena L de (26) (22SD48); (28) un anticuerpo que tiene una actividad equivalente al anticuerpo de (1) a (27); (29) un anticuerpo que reconoce el mismo epítope reconocido por el anticuerpo de (1) a (27).

10. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que tiene una región constante humana.

11. El anticuerpo de la reivindicación 10, que es un anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, o anticuerpo humano.

12. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es un anticuerpo deficiente de fucosa.

13. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como ingrediente activo.

14. Un inhibidor del crecimiento celular que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como ingrediente activo.

15. Un agente anticáncer que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como ingrediente activo.

16. El agente anticáncer de la reivindicación 15, en donde el cáncer que se tratará es cáncer ovárico.

17. El agente anticáncer de la reivindicación 16, en donde el cáncer ovárico es adenocarcinoma de células claras.

18. Un método para diagnosticar el cáncer, que comprende la detección de una proteína LGR7 o un gen que codifica una proteína LGR7.

19. Un método para diagnosticar el cáncer, que comprende la detección de una proteína LGR7.

20. El método de diagnóstico de la reivindicación 19, en donde la proteína LGR7 se detecta utilizando un anticuerpo que se une a la proteína LGR7.

21. Un método para diagnosticar el cáncer, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra recolectada de un sujeto; y (b) detectar una proteína LGR7 contenida en la muestra de (a) utilizando un anticuerpo que se une a la proteína LGR7.

22. Un método para diagnosticar el cáncer, que comprende las etapas de: (a) administrar a un sujeto un anticuerpo que tiene la actividad de unión hacia una proteína LGR7 y que se etiqueta con un radioisótopo; y (b) detectar la acumulación del radioisótopo.

23. El método de diagnóstico de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en donde el cáncer que se diagnosticará es cáncer ovárico.

24. El método de diagnóstico de la reivindicación 23, en donde el cáncer ovárico es adenocarcinoma de células claras.