JP2001083151A - ヒトインターロイキン−６受容体に対するキメラ抗体 - Google Patents

ヒトインターロイキン−６受容体に対するキメラ抗体

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトインターロイキン−６レセプターに対す
る新規な再構成ヒト抗体の提供。 【解決手段】 ヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域及びヒトIL−６Ｒに
対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域、並びに
ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域及びヒトIL−６Ｒに対するマウス
モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域、からなるキメラ抗
体。ヒトに投与した場合の免疫原性が低い。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトインターロイ
キン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に対するマウスモノクロ
ーナル抗体の可変領域（Ｖ領域）、ヒトＩＬ−６Ｒに対
するヒト／マウスキメラ抗体、ヒトライト鎖（Ｌ鎖）Ｖ
領域及びヒトヘビー鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域
（ＣＤＲ）がヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロー
ナル抗体のＣＤＲにより置き換えられている再構成（ｒ
ｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体の使用に関する。本発明はさ
らに、上記の抗体又はその部分をコードするＤＮＡを提
供する。本発明はさらに、前記ＤＮＡを含んで成るベク
ター、特に発現ベクター、並びに該ベクターにより形質
転換された宿主に関する。本発明はさらに、ヒトＩＬ−
６Ｒに対するキメラ抗体の製造方法、及びヒトＩＬ−６
Ｒに対する再構成ヒト抗体の製造方法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】インターロイキン−６（ＩＬ−６）は一
連の細胞により生産される多機能サイトカインである。
このものは免疫応答、急性期反応及び造血を調節し、そ
して宿主防御機構において中心的役割を演ずる。このも
のは広範な組織に作用して、標的細胞の性質に応じて成
長誘導効果、成長阻害効果及び分化誘導効果を発揮す
る。ＩＬ−６に対する特異的レセプター（ＩＬ−６Ｒ）
は、ＩＬ−６の多機能性に従ってリンパ系細胞及び非リ
ンパ系細胞上で発現される。ＩＬ−６遺伝子の異常発現
が種々の疾患、特に自己免疫疾患、メサンジウム細胞増
殖性糸球体腎炎、及び形質細胞腫／骨髄腫の発病に関与
することが示唆されている（Ｈｉｒａｎｏら、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１１，４４３−４４９，１９９０
の総説を参照のこと）。ヒト骨髄腫細胞はＩＬ−６を生
産しそしてＩＬ−６Ｒを発現することが観察される。実
験において、ＩＬ−６に対する抗体が骨髄腫細胞の試験
管内での増殖を阻害し、そしてそれ故にヒト骨髄腫の発
癌においてオートクリン調節ループが機能していること
が示された（Ｋａｗａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，
８３，１９８８）。
【０００３】ＩＬ−６Ｒは種々の動物細胞の表面に存在
し、そしてＩＬ−６に特異的に結合し、そして細胞表面
上のＩＬ−６Ｒ分子の数が報告されている（Ｔａｇａ
ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６，９６７，１９８
７）。さらに、ヒトＩＬ−６ＲをコードするｃＤＮＡが
クローン化され、そしてＩＬ−６Ｒの一次構造が報告さ
れている（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４
１，８２５，１９８８）。マウスのモノクローナル抗体
はヒトにおいて高度に免疫原性（「抗原性」という場合
もある）があり、そしてこの理由のため、ヒトにおける
それらの療法的価値は制限される。ヒトにおけるマウス
抗体の半減期は比較的短い。さらに、ヒト抗マウス抗体
は、予定された効果を妨害するのみならず、患者におけ
る不都合なアレルギー応答の危険をもたらす免疫応答を
惹起することなくして頻回投与することはできない。
【０００４】これらの問題を解決するため、ヒト型化
（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体の製造方法が開発された。
マウス抗体は２つの方法でヒト型化することができる。
より簡単な方法は、可変領域がもとのマウスモノクロー
ナル抗体に由来しそして定常領域が適当なヒト抗体に由
来するキメラ抗体を作製する方法である。得られるキメ
ラ抗体はもとのマウス抗体の完全な可変領域を含有し、
そしてもとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に
結合することを期待することができる。さらに、キメラ
抗体ではヒト以外に由来する蛋白質配列の比率が実質的
に減少しており、そしてそれ故にもとのマウス抗体に比
べて免疫原性が低いと予想される。キメラ抗体は抗原に
よく結合しそして免疫原性が低いが、マウス可変領域に
対する免疫応答がなお生ずる可能性がある（ＬｏＢｕｇ
ｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８４，４２２０−４２２４，１９８９）。
【０００５】マウス抗体をヒト型化するための第二の方
法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免
疫原性をさらに大幅に低下させるものである。この方法
においては、マウス抗体の可変領域からの相補性決定領
域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）をヒト可変領域に移
植して「再構成」（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト可変領域を
作製する。次に、これらの再構成ヒト可変領域をヒト定
常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型化抗体
のヒト以外の蛋白質配列に由来する部分はＣＤＲと極く
一部のフレームワーク（ＦＲ）のみである。ＣＤＲは超
可変蛋白質配列により構成されている。これらは種特異
的配列を示さない。これらの理由のため、マウスＣＤＲ
を担持する再構成ヒト抗体はもはやヒトＣＤＲを含有す
る天然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずであ
る。
【０００６】前記のごとく、再構成ヒト抗体は療法目的
のために有用であると予想されるが、ヒトＩＬ−６Ｒに
対する再構成ヒト抗体は知られていない。さらに、再構
成ヒト抗体の製造方法であって任意の特定の抗体に普遍
的に適用し得る方法は存在しない。従って、特定の抗原
に対する十分に活性な再構成ヒト抗体を作製するために
は種々の工夫が必要である。ヒトＩＬ−６Ｒに対するマ
ウスモノクローナル抗体、すなわちＰＭ１およびＭＴ１
８は作製されており（特願平２−189420）、そして本発
明者らはヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル
抗体ＡＵＫ１２−２０、ＡＵＫ６４−７及びＡＵＫ１４
６−１５を調製しているが、本発明者らはヒトＩＬ−６
Ｒに対する再構成ヒト抗体の作製を示唆する文献を知ら
ない。さらに、ヒト骨髄腫細胞株が移植されたヌードマ
ウスに、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル
抗体が注射された時腫瘍の増殖が顕著に阻害されること
を、本発明者らは見出した。このことは、骨髄腫の治療
のための療法剤として抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体が有用であ
ることを示唆している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明はヒトＩ
Ｌ−６Ｒに対する、免疫原性の低い抗体を提供しようと
するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】従って、本発明はヒトＩ
Ｌ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体を提供する。本発明は
また、該再構成ヒト抗体の作製の過程で有用なヒト／マ
ウスキメラ抗体を提供する。本発明はさらに、再構成ヒ
ト抗体の部分、並びに再構成ヒト抗体及びその部分並び
にキメラ抗体の製造のための発現系を提供する。さらに
具体的には、本発明は、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウス
モノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域；並びにヒトＩＬ−６
Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を提
供する。
【０００９】本発明はさらに、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、
及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体
のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに（２）ヒトＨ鎖
Ｃ領域、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロー
ナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；を含んで成
る、ヒトＩＬ−６Ｒに対するキメラ抗体を提供する。
【００１０】本発明はさらに、ヒトＩＬ−６Ｒに対する
マウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；並び
にヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体の
Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲを提供する。本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）、
及び（２）ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナ
ル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んで成る、ヒトＩＬ
−６Ｒに対する抗体の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び（２）ヒトＩＬ−６
Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣ
ＤＲ、を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再
構成ヒトＨ鎖Ｖ領域を提供する。
【００１１】本発明はさらに、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、
並びに（２）ヒトＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマ
ウスモノクローナル抗体のＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領
域、を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構
成ヒトＬ鎖；並びに（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモ
ノクローナル抗体のＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を
含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構成ヒト
Ｈ鎖を提供する。
【００１２】本発明はさらにまた、（Ａ）（１）ヒトＬ
鎖Ｃ領域、並びに（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−
６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを
含んで成るＬ鎖；並びに（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、
並びに（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対す
るマウスモノクローナル抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成る
Ｈ鎖；を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒ
ト抗体を提供する。
【００１３】本発明はまた、前記種々の抗体構成ポリペ
プチド、又はその部分をコードするＤＮＡに関する。本
発明はまた、上記ＤＮＡを含んで成るベクター、例えば
発現ベクターに関する。本発明はさらに、上記ベクター
により形質転換された宿主を提供する。本発明はさらに
また、ヒトＩＬ−６Ｒに対するキメラ抗体の製造方法、
及びヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体の製造方法
を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】マウスＶ領域をコードするＤＮＡ
のクローニング さらに詳しくは、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノク
ローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡをクローン化
するためには、遺伝子源として、ヒトＩＬ−６Ｒに対す
るモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製
することが必要である。この様なハイブリドーマとし
て、特願平２−189420号明細書にはモノクローナル抗体
ＰＭ１を生産するマウスハイブリドーマＰＭ１及び該抗
体の性質が記載されている。本明細書の参考例２にハイ
ブリドーマＰＭ１の作製方法を記載する。本発明者ら
は、それぞれがヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマＡＵＫ１２−２
０、ＡＵＫ６４−７及びＡＵＫ１４６−１５を作製して
いる。これらのハイブリドーマの作製方法は本明細書の
参考例３に記載されている。
【００１５】マウスモノクローナル抗体の可変領域をコ
ードする目的のＤＮＡをクローン化するためハイブリド
ーマ細胞を破壊し、そしてＣｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８，５２９４，１９７７に記載
されている常法により全ＲＮＡを得る。次に、この全Ｒ
ＮＡを用いて、Ｊ．Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，９３４，１９８９に記載されて
いる方法を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成する。
【００１６】次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法
を用いて前記ｃＤＮＡの有意義な部分の特異的増幅を行
う。マウスモノクローナル抗体のカッパ（κ）型Ｌ鎖Ｖ
領域の増幅のため、配列番号：１〜１１に示す１１種の
オリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐ
ａ Ｖａｒｉａｂｌｅ；ＭＫＶ）及び配列番号：１２に
示すオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｋａ
ｐｐａ Ｃｏｎｓｔａｎｔ；ＭＫＣ）をそれぞれ５′−
末端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用す
る。
【００１７】前記ＭＫＶプライマーはマウスカッパ型Ｌ
鎖リーダー配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイ
ズし、そして前記ＭＫＣプライマーはマウスカッパ型Ｌ
鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズす
る。マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の増幅のた
め、配列番号：１３〜２２に示す１０種のオリゴヌクレ
オチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｖａｒｉ
ａｂｌｅ；ＭＨＶ）及び配列番号：２３に示すオリゴヌ
クレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ ＨｅａｖｙＣｏｎ
ｓｔａｎｔ；ＭＨＣ）をそれぞれ５′−末端プライマー
及び３′−末端プライマーとして使用する。
【００１８】なお、５′−末端プライマーはその５′−
末端近傍に制限酵素ＳａｌＩ切断部位を提供する配列Ｇ
ＴＣＧＡＣを含有し、そして３′−末端プライマーはそ
の５′−末端近傍に制限酵素Ｘｍａｌ切断部位を提供す
るヌクレオチド配列ＣＣＣＧＧＧを含有する。これらの
制限酵素切断部位は可変領域をコードする目的のＤＮＡ
断片をクローニングベクターにサブクローニングするた
めに用いられる。
【００１９】次に増幅生成物を制限酵素ＳａｌＩ及びＸ
ｍａＩで切断させて、マウスモノクローナル抗体の目的
とする可変領域をコードするＤＮＡ断片を得る。他方、
プラスミドｐＵＣ１９のごとき適当なクローニングベク
ターを同じ制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩにより切断さ
せ、このｐＵＣ１９に前記ＤＮＡ断片を連結することに
より、マウスモノクローナル抗体の目的とする可変領域
をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを得る。クロ
ーン化されたＤＮＡの配列決定は任意の常法に従って行
うことができる。目的とするＤＮＡのクローン化及びそ
の配列決定を実施例１〜３に具体的に記載する。
【００２０】相補性決定領域（ＣＤＲ） 本発明はさらに、本発明の各Ｖ領域の超可変又は相補性
決定領域（ＣＤＲ）を提供する。Ｌ鎖及びＨ鎖の各対の
Ｖ領域は抗原結合部位を形成する。Ｌ鎖及びＨ鎖上のこ
の領域は同様の全般的構造を有しそして各領域は配列の
比較的保存された４個のフレームワーク領域を含み、そ
れらは３個の超可変領域又はＣＤＲにより連結されてい
る（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳＤｅｐｔ．Ｈｅａｌｔ
ｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ １９８
３）。
【００２１】前記４個のフレームワーク領域（ＦＲ）の
多くの部分はβ−シート構造をとり、ＣＤＲはループを
形成する。ＣＤＲはある場合にはβ−シート構造の一部
分を形成することもある。ＣＤＲはＦＲによって非常に
近い位置に保持され、そして他の領域のＣＤＲと共に抗
原結合部位の形成に寄与する。本発明は、ヒト型化抗体
の素材として有用なこれらのＣＤＲ、及びそれをコード
するＤＮＡをも提供する。これらのＣＤＲ領域は、Ｖ領
域の既知アミノ酸配列と照合することによって、Ｋａｂ
ａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎ
ｔｅｒｅｓｔ」の経験則から見出すことができ、実施例
４において具体的に説明する。
【００２２】キメラ抗体の作製 ヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構成ヒトＶ領域を設計
するに先立って、使用するＣＤＲが実際に抗原結合領域
を形成することを確かめる必要がある。この目的のた
め、キメラ抗体を作製した。さらに実施例１及び２に記
載される４種類のモノクローナル抗体のクローン化され
たＤＮＡのヌクレオチド配列から推定されるマウス抗ヒ
トＩＬ−６Ｒ抗体のアミノ酸配列を相互に、及び既知の
マウス及びヒトの抗体のＶ領域と比較した。４種類のモ
ノクローナル抗体のそれぞれについて、１セットの典型
的な機能的マウスＬ及びＨ鎖Ｖ領域がクローニングされ
た。しかしながら、４種類すべてのマウス抗ヒトＩＬ−
６Ｒ抗体は比較的異なるＶ領域を有していた。４種類の
抗体は相互に単に微小な相違ではなかった。クローン化
されたマウスＶ領域を用いて４種類のキメラ抗ヒトＩＬ
−６Ｒ抗体を作製した。
【００２３】キメラ抗体を作製するための基本的な方法
は、ＰＣＲ−クローン化ｃＤＮＡに見られるようなマウ
スリーダー配列及びＶ領域配列を、哺乳類細胞発現ベク
ター中にすでに存在するヒトＣ領域をコードする配列に
連結することを含んで成る。前記４種類のモノクローナ
ル抗体の内、モノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０から
のキメラ抗体の作製を実施例５に記載する。
【００２４】モノクローナル抗体ＰＭ−１からのキメラ
抗体の作製を実施例６に記載する。マウスＰＭ−１κＬ
鎖リーダー領域及びＶ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒ
トＬ鎖Ｃ領域をコードするヒトゲノムＤＮＡを含有する
発現ベクターにＰＣＲ法を用いてクローン化した。マウ
スＰＭ−１抗体（単に「ＰＭ−１抗体」又は「ＰＭ」と
いう場合もある）のＨ鎖リーダー及びＶ領域をコードす
るｃＤＮＡを、ヒトγ−１Ｃ領域をコードするゲノムＤ
ＮＡを含有する発現ベクターにＰＣＲ法を用いてサブク
ローン化した。
【００２５】特に設計されたＰＣＲプライマーを用い
て、マウスＰＭ−１抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡ
をそれらの５′−及び３′−末端において適当な塩基配
列を導入して（１）それらが発現ベクターに容易に挿入
されるように、且つ（２）それらが該発現ベクター中で
適切に機能するようにした。次に、これらのプライマー
を用いてＰＣＲにより増幅して得たマウスＰＭ−１抗体
のＶ領域を、所望のヒトＣ領域をすでに含有するＨＣＭ
Ｖ発現ベクター（図１）に挿入した。これらのベクター
は、種々の哺乳類細胞系における遺伝子操作された抗体
の一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現又は安定な発現の
ために適当である。
【００２６】マウスＰＭ−１抗体中に存在するＶ領域と
同じＶ領域を有するキメラＰＭ−1抗体（バージョン
ａ）の作製に加えて、キメラＰＭ−１抗体の第二のバー
ジョン（バージョンｂ）を作製した。キメラＰＭ−１抗
体（バージョンｂ）においては、Ｌ鎖Ｖ領域中の位置１
０７のアミノ酸がアスパラギンからリジンに変えられて
いる。マウスＰＭ−１抗体からのＬ鎖Ｖ領域と他のマウ
スＬ鎖Ｖ領域との比較において、位置１０７におけるア
ルギニンの存在は異常であることが注目された。
【００２７】マウスκＬ鎖Ｖ領域においては、位置１０
７の最も典型的アミノ酸はリジンである。マウスＰＭ−
１抗体のＬ鎖Ｖ領域中の位置１０７に非典型的なアミノ
酸であるアルギニンを有することの重要性を評価するた
め、位置１０７を典型的なアミノ酸であるリジンに変え
た。この変更は、ＰＣＲ−変異誘発法（Ｍ．Ｋａｍｍａ
ｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８７）１
７：５４０４）を用いてＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ
配列中に必要な変更を行うことにより達成された。
【００２８】キメラＰＭ−１抗体バージョン（ａ）はヒ
トＩＬ−６Ｒに結合する活性を示した。キメラＰＭ−１
抗体バージョン（ｂ）もバージョン（ａ）と同様にヒト
ＩＬ−６Ｒに結合する。同様に、他の２種類のモノクロ
ーナル抗体ＡＵＫ６４−７及びＡＵＫ１４６−１５から
キメラ抗体を作製した。４種類すべてのキメラ抗体はヒ
トＩＬ−６Ｒによく結合し、機能的測定において、正し
いマウスＶ領域がクローン化されそして配列が決定され
ていたことが示された。
【００２９】４種類のマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体か
ら、ヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体の設計及び
作製のための第一の候補としてマウスＰＭ−１抗体を選
択した。マウスＰＭ−１抗体の選択は主として、ヌード
マウスに移植されたヒト骨髄腫細胞に対するマウス抗ヒ
トＩＬ−６Ｒ抗体及びキメラ抗体の効果を研究して得ら
れた結果に基く。４種類のマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体
の内、ＰＭ−１抗体が最も強い抗腫瘍細胞活性を示し
た。又、キメラＰＭ−１抗体はキメラＡＵＫ１２−２０
抗体よりも強い抗腫瘍活性を示した。
【００３０】マウスモノクローナル抗体ＰＭ−１のＶ領
域と既知のマウス及びヒトの抗体のＶ領域との比較 マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒトモノクローナ
ル抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するため
には、マウスモノクローナル抗体のＦＲとヒトモノクロ
ーナル抗体のＦＲとの間に高い相同性が存在することが
望ましい。従って、マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖及びＨ鎖
のＶ領域を、ＯＷＬ（ｏｒ Ｌｅｅｄｓ）ｄａｔａｂａ
ｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓに見
出されるすべての既知マウス及びヒトのＶ領域と比較し
た。
【００３１】マウス抗体のＶ領域に関しては、ＰＭ−１
抗体のＬ鎖Ｖ領域はマウス抗体ｍｕｓｉｇｋｃｋｏ（Ｃ
ｈｅｎ，Ｈ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９
８７）２６２：１３５７９−１３５８３）のＬ鎖Ｖ領域
と最も類似しており、９３．５％の同一性（ｉｄｅｎｔ
ｉｔｙ）が存在した。ＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域はマウ
ス抗体ｍｕｓｉｇｖｈｒ２（Ｆ．Ｊ．Ｇｒａｎｔら、Ｎ
ｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９８７）１５：５４９
６）のＨ鎖Ｖ領域に最も類似しており、８４．０％の同
一性が存在した。マウスＰＭ−１抗体のＶ領域は既知マ
ウスＶ領域に高比率の同一性を示し、マウスＰＭ−１抗
体のＶ領域が典型的なマウスＶ領域であることが示され
る。このことはさらに、クローン化されたＤＮＡ配列が
正しいという間接的な証明を与える。一般に、Ｈ鎖Ｖ領
域間に比べてＬ鎖Ｖ領域間の方がより高い比率の同一性
が存在する。これはおそらく、Ｈ鎖Ｖ領域に比べてＬ鎖
Ｖ領域において一般的に観察されるより少ない量の多様
性のためであろう。
【００３２】ヒト抗体のＶ領域に関しては、マウスＰＭ
−１抗体のＬ鎖Ｖ領域は、ＲＥＩとも称されるヒト抗体
ｋｌｈｕｒｅ（Ｗ．Ｐａｌｍら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．（１９７５）３５６：１６７−１９１）のＬ鎖Ｖ
領域に最も類似しており、７２．２％の同一性が存在す
る。ＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域は、ヒト抗体ｈｕｍｉｇ
ｈｖａｐ (ＶＡＰ)(Ｈ．Ｗ．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ (１９８７) ２３８：７９１−７９３）に
最も類似しており、７１．８％の同一性が存在する。マ
ウスＰＭ−１抗体からの再構成抗体をいかに設計するか
を考えるためにヒトＶ領域との比較が最も重要である。
ヒトＶ領域への同一性の比率はマウスＶ領域への同一性
の比率より低い。これはマウスＰＭ−１抗体のＶ領域が
マウスＶ領域に類似しており、そしてヒトＶ領域には類
似していないことの間接的証明である。この証明にま
た、ヒト患者における免疫原性の問題を解決するために
マウスＰＭ−１のＶ領域をヒト型化する（ｈｕｍａｎｉ
ｚｅ）ことが最善であることを示す。
【００３３】マウスＰＭ−１抗体のＶ領域をさらに、E.
A. Kabatら、（1987）Sequences ofProteins of Immuno
logical Interest, Forth Edition, U.S. Department o
f Health and Human Services, U.S. Government Print
ing Officeにより定義される、ヒトＶ領域の異なるサブ
グループについてのコンセンサス配列と比較した。Ｖ領
域のＦＲ間で比較を行った。その結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲは
ヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩ（ＨＳＧＩ）のコンセ
ンサス配列からのＦＲに最も類似しており、７０．１％
の同一性が存在する。マウスＰＭ−１のＨ鎖Ｖ領域のＦ
ＲはヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループII（ＨＳＧII）のコ
ンセンサス配列からのＦＲに最も類似しており、５２．
９％の同一性が存在する。これらの結果は、既知のヒト
抗体との比較から得られた結果を支持している。ヒトＲ
ＥＩ中のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩ
に属し、そしてヒトＶＡＰ中のＨ鎖Ｖ領域はヒトＨ鎖Ｖ
領域のサブグループIIに属する。
【００３６】ヒト抗体中のＶ領域とのこれらの比較か
ら、再構成ヒトＰＭ−１抗体のＶ領域の設計の基礎とな
るヒトＶ領域を選択することが可能である。再構成ヒト
ＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループ
Ｉ（ＨＳＧＩ）に属するヒトＬ鎖Ｖ領域を使用し、そし
て再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計のためには
サブグループII（ＨＳＧII）に属するヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領
域を用いるのが最善であろう。
【００３７】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の設計 再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の設計における第一段階
は、設計の基礎となるヒト抗体Ｖ領域を選択することで
あった。マウスＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域中のＦＲは、サ
ブグループＩに属するヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域中のＦＲに最
も類似していた（表１）。前記のごとく、マウスＰＭ−
１抗体のＬ鎖Ｖ領域と既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較
において、それはヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩの１
構成員であるヒトＬ鎖Ｖ領域ＲＥＩに最も類似してい
た。従って、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計
においてＲＥＩからのＦＲを使用した。また、再構成ヒ
トＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料とし
てＲＥＩのＦＲを使用した。
【００３８】ＲＥＩに基くこれらのヒトＦＲ中には、も
とのヒトＲＥＩに比べて５個の相違が存在する（ｋａｂ
ａｔら、１９８７、によれば位置３９，７１，１０４，
１０５及び１０７；表２を参照のこと）。ＦＲ４中の３
個の変化（位置１０４，１０５及び１０７）は他のヒト
κＬ鎖からのＪ領域に基いており、そしてそれ故にヒト
からの逸脱を成すものではない（Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎ
ｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３２２：２１−２
５）。位置３９及び７１における２個の変化はラットＣ
ＡＭＰＡＴＨ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲ中に存在する
アミノ酸にもどる変化であった（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ
ら、１９８８）。
【００３９】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の２つ
のバージョンを設計した。第一のバージョン（バージョ
ン「ａ」）においては、ヒトＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰ
ＡＴＨ−１Ｈ抗体中に存在するＲＥＩに基くＦＲ（Ｒｉ
ｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）と同一であり、そしてマ
ウスＣＤＲはマウスＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域中のＣＤ
Ｒと同じであった。第二のバージョン（バージョン
「ｂ」）はバージョン「ａ」に基き、ヒトＦＲ３中の位
置７１におけるアミノ酸１個のみを異にする。Ｃ．Ｃｈ
ｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）１
９６：９０１−９１７により定義されるように、残基７
１はＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１の標準的（ｃａｎｏｎｉｃａ
ｌ）構造の部分である。この位置のアミノ酸はＬ鎖Ｖ領
域のＣＤＲ１ループの構造に直接影響すると予想され、
そしてそれ故に抗体結合に大きく影響するであろう。
【００４０】マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域におい
て、位置７１はチロシンである。再構成ヒトＰＭ−１抗
体のＬ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」の設計に使用した修
飾されたＲＥＩのＦＲにおいては位置７１はフェニルア
ラニンであった。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の
バージョン「ｂ」においては、位置７１のフェニルアラ
ニンがマウスＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域中に見出されるよ
うにチロシンに変えられている。表２は、マウスＰＭ−
１抗体のＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ
抗体中での使用のために修飾されたＲＥＩのＦＲ（Ｒｉ
ｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）及び再構成ヒトＰＭ−１
抗体のＬ鎖Ｖ領域の２種類のバージョンの、それぞれの
アミノ酸配列を示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】注：ＲＥＩのＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡ
ＴＨ−１Ｈ抗体中に見出されるものである（Ｒｉｅｃｈ
ｍａｎｎら、１９８８）。ＲＥＩのＦＲ中の５個の下線
を付したアミノ酸はヒトＲＥＩのアミノ酸配列（Ｐｌａ
ｍら、１９７５；０．Ｅｐｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ（１９７５）１４：４９４３−４９５２）から異な
るアミノ酸である。マウスＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域中
のＦＲはサブグループIIに属するヒトＨ鎖Ｖ領域に最も
類似している（表１）。前記のごとく、マウスＰＭ−１
抗体のＨ鎖Ｖ領域と既知のヒトＨ鎖Ｖ領域との比較にお
いて、これはヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループIIの１構成
員であるヒトＨ鎖Ｖ領域ＶＡＰに最も類似していた。ヒ
トＨ鎖Ｖ領域のサブグループIIの他の構成員であるヒト
Ｈ鎖Ｖ領域ＮＥＷを、再構成ヒトＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ
領域の作製のための出発材料として、及び再構成ヒトＰ
Ｍ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域の設計のための基礎として用い
た。
【００４３】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の６種
類のバージョンを設計した。６種類のバージョンのすべ
てにおいて、ヒトＦＲは再構成Ｄ１．３中に存在するＮ
ＥＷＦＲに基いており、そしてマウスＣＤＲはマウスＰ
Ｍ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域中のＣＤＲと同じである。ヒトＦ
Ｒ中の７個のアミノ酸残基（位置１，２７，２８，２
９，３０，４８及び７１；表３参照）は抗原結合に不都
合な影響を与える可能性を有するものと同定されてい
る。マウスＰＭ−１抗体のＶ領域のモデルにおいて、Ｈ
鎖Ｖ領域中の残基１はＣＤＲループの近くに位置する表
面残基である。
【００４４】残基２７，２８，２９、及び３０は、Ｃ．
Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４：８
７７−８８２により推定されるようにＨ鎖Ｖ領域のＣＤ
Ｒ１の標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造の部分であ
り、そして／又はＨ鎖Ｖ領域の第一構造ループの部分を
構成することがマウスＰＭ−１抗体Ｖ領域のモデルにお
いて観察される（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７）。残基
４８はマウスＰＭ−１抗体のＶ領域のモデルにおいて埋
った（ｂｕｒｉｅｄ）残基として観察された。埋った
（ｂｕｒｉｅｄ）残基の変化はＶ領域及びその抗原結合
部位の全体構造を破壊する可能性がある。残基７１は、
Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）により予想されるように
Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ２の標準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構
造の部分である。再構成ヒトＰＭ−１抗体の６種類のバ
ージョンはヒトＮＥＷのＦＲ中のこれら７つの位置のア
ミノ酸の変化の異る組合わせを含む（表３を参照のこ
と）。
【００４５】
【表３】
【００４６】注：ＮＥＷのＦＲには再構成ヒトＣＡＭＰ
ＡＴＨ−１Ｈ抗体の第一バージョン（Ｒｉｅｃｈｍａｎ
ｎら、１９８８）中に見出されるものである。
【００４７】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域をコードす
るＤＮＡの作製 再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のそれぞれ
の第一バージョンをコードするＤＮＡを新規なＰＣＲ利
用法を用いて作製した。要約すれば、適当なヒトＦＲを
すでに含有する再構成ヒトＶ領域をコードするプラスミ
ドをＰＣＲプライマーを用いて修飾し、ヒトＶ領域中に
存在するＣＤＲをマウスＰＭ−１抗体からのＣＤＲによ
り置換した。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコー
ドするＤＮＡの作製のための出発材料は、再構成ヒトＤ
１．３Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含有するプラス
ミドＤＮＡであった。この再構成ヒトＤ１．３Ｌ鎖Ｖ領
域はヒトＬ鎖Ｖ領域ＲＥＩ中に存在するＦＲに基いて作
製された。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコード
するＤＮＡの作製のための出発材料は再構成ヒトＤ１．
３Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡであった。この再構成
ヒトＤ１．３抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡはヒト
Ｈ鎖Ｖ領域ＮＥＷ（Ｗ．Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４−１５３６）の
ＦＲをコードするＤＮＡに基いて作製された。
【００４８】所望のヒトＦＲをコードするＤＮＡを含有
する出発プラスミドＤＮＡを選択した後、マウスＤ１．
３ＣＤＲに代るマウスＰＭ−１抗体ＣＤＲの置換を可能
にするようにＰＣＲプライマーを設計しそして合成し
た。各再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域につき、３種類の
プライマーはマウスＰＭ−１抗体ＣＤＲをコードするＤ
ＮＡ配列を含有し、そして２種類のプライマーは再構成
ヒトＶ領域をコードする全体ＤＮＡ配列を挟むように設
計されている。一連のＰＣＲ反応における５種類のＰＣ
Ｒプライマーの使用が、出発再構成ヒトＶ領域中に存在
するヒトＦＲをコードするＤＮＡ及びマウスＰＭ−１抗
体Ｖ領域中に存在するＣＤＲをコードするＤＮＡから成
るＰＣＲ生成物をもたらした（実施例７、並びに図７及
び図８を参照のこと）。ＰＣＲ生成物をクローン化し、
そして配列決定して、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及び
Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」の全体ＤＮＡ配列が正し
いアミノ酸配列をコードしていることを確認した。再構
成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の配列
を配列番号５５に示す。
【００４９】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の他のバー
ジョンをコードするＤＮＡは、公表されているＰＣＲ−
変異誘発法（Ｋａｍｍａｎら、１９８９）にわずかな変
更を加えた方法を用いて作製した。再構成ヒトＰＭ−１
抗体Ｖ領域の設計に関して記載したように、再構成ヒト
ＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の１つの追加のバージョン（バ
ージョン「ｂ」）をコードするＤＮＡを作製し、そして
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の５種類の追加のバ
ージョン（バージョン「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，
「ｅ」、及び「ｆ」をコードするＤＮＡを作製した。こ
れらの追加のバージョンは、第一バージョンからの一連
の微細な変化を含む。アミノ酸配列のこれらの微細な変
化はＰＣＲ変異誘発を用いてＤＮＡ配列の微細な変更を
行うことにより達成された。ＤＮＡ配列に必要な変化を
導入するＰＣＲプライマーが設計された。一連のＰＣＲ
反応に続き、ＰＣＲ生成物をクローン化し、そして配列
決定してＤＮＡ配列中の変化が計画通りに起っているこ
とを確認した。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域バー
ジョン「ｆ」の配列を配列番号５４に示す。
【００５０】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の種々のバ
ージョンのＤＮＡ配列を確認した後、再構成ヒトＰＭ−
１抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを、ヒトＣ領域をコー
ドするＤＮＡをすでに含有する哺乳類細胞発現ベクター
にサブクローニングした。すなわち、再構成ヒトＰＭ−
１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒトＬ鎖Ｃ領域
をコードするＤＮＡ配列に連結し、再構成ヒトＰＭ−１
抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒトγ−１Ｃ領域
をコードするＤＮＡ配列に連結した。再構成ヒトＰＭ−
１抗体のより高いレベルの発現を達成するため、図１に
示すようなＨＣＭＶ発現ベクターを修飾して、ＨＣＭＶ
プロモーター・エンハンサー領域をヒトエロンゲーショ
ンファクター（ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆ
ａｃｔｏｒ；ＨＥＦ−１α）プロモーター・エンハンサ
ーにより置き換えた（図１５を参照のこと）。
【００５１】次に再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域バージョン
（ａ）と、Ｈ鎖Ｖ領域バージョン（ａ）〜（ｆ）のすべ
ての組合せをヒトＩＬ−６Ｒへの結合について試験し、
そしてその結果、実施例１１に詳細に記載するように、
Ｌ鎖バージョン（ａ）とＨ鎖バージョン（ｆ）とを含ん
で成る再構成ヒト抗体がキメラＰＭ−１抗体（ａ）と同
じレベルでＩＬ−６Ｒに結合する能力を示した。
【００５２】発現のレベルを改良するための、再構成ヒ
トＰＭ−１抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡの変更 ＣＯＳ細胞中で生産される再構成ヒトＰＭ−１抗体の発
現レベルの検討において、再構成ヒトＨ鎖の発現が常
に、再構成ヒトＬ鎖又はキメラＬ鎖もしくはＨ鎖の発現
レベルに比べて約１０分の１であることが明らかになっ
た。低レベルの発現を生じさせる問題点は再構成ヒトＨ
鎖Ｖ領域にあるようであった。低レベルの発現が低レベ
ルの転写の結果であるか否かを特定するため、再構成ヒ
トＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各ベクターによ
り同時形質転換されたＣＯＳ細胞からＲＮＡを調製し
た。マウスＰＭ−１抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡのＰ
ＣＲクローニングについて記載したようにして一本鎖ｃ
ＤＮＡを合成した。再構成ヒトＬ鎖又はＨ鎖Ｖ領域をコ
ードするＤＮＡ配列の両端を挟むように設計されたＰＣ
Ｒプライマーを用いて、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域又は再構
成Ｈ鎖Ｖ領域に対応する前記一本鎖ｃＤＮＡからＰＣＲ
生成物を生成せしめた。
【００５３】再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ
について、２種類のＰＣＲ生成物が存在し、一方は予想
通り４０８bpの長さを有し、他方はより短い２９９bpの
ＰＣＲ生成物であった。正しいサイズのＰＣＲ生成物は
ＰＣＲ生成物の全生成量の約９０％を占め、そして短い
ＰＣＲ生成物は全生成量の約１０％を占めた。再構成ヒ
トＨ鎖Ｖ領域についてもやはり２種類のＰＣＲ生成物が
存在し、一方は予想通り４４４bpの長さを有し、そして
他方は３７０bpの長さの短いＰＣＲ生成物であった。し
かしながらこの場合、正しくない短い方のＰＣＲ生成物
がＰＣＲ生成物の全生成量の大部分、すなわち約９０％
を占めた。正しいサイズのＰＣＲ生成物はＰＣＲ生成物
の全生成量の約１０％に過ぎなかった。これらの結果
は、再構成ヒトＶ領域をコードするＲＮＡの幾らかが欠
失を含むことを示した。
【００５４】どの配列が除去されたかを決定するため、
短い方のＰＣＲ生成物をクローニングし、そして配列決
定した。ＤＮＡ配列から、Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のいずれ
についてもＤＮＡの特定の部分が欠けていることが明ら
かになった。除去された配列を挟むＤＮＡ配列の検討に
より、これらの配列はスプライスドナー−アクセプター
配列のコンセンサス配列（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ．Ｒ
ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８１）５
０：３４９−３８３）に相当することが明らかとなっ
た。再構成ヒトＨ鎖の低い発現レベルは、再構成ヒトＨ
鎖Ｖ領域の設計が、どちらかと言えば効果的なスプライ
スドナー−アクセプター部位を不注意に形成させたため
であると説明された。さらに、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域の
設計はどちらかと言えば非効果的なスプライスドナー−
アクセプター部位を不注意に形成させたようであった。
これらのスプライスドナー−アクセプター部位を除去す
るため、ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のそれぞ
れバージョン「ａ」及び「ｆ」をコードするＤＮＡ配列
のわずかな変更を前記のＰＣＲ−変異誘発法を用いて行
った。
【００５５】低下した発現レベルの原因は、再構成ヒト
Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域（配列番号：５４及び５５）の両者
のリーダー配列をコードするＤＮＡ中のイントロンの存
在であると考えられた。これらのイントロンはもとも
と、再構成ヒトＤ１．３抗体のＶ領域（Ｖｅｒｈｏｅｙ
ｅｎら、１９８８）をコードするＤＮＡの作製において
使用されたマウスμＨ鎖リーダー配列（Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１４：２
６８−２７０）をコードするＤＮＡに由来する。再構成
ヒトＤ１．３抗体をコードするＤＮＡは、マウス免疫グ
ロブリンプロモーターを用いる哺乳類細胞ベクターにお
いて発現されたためマウスリーダーイントロンの存在が
重要であった。
【００５６】リーダーイントロンは免疫グロブリンプロ
モーターからの発現のためには重要であるが、しかしＨ
ＣＭＶのごときウィルスプロモーターからの発現のため
には重要でない（Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８８）１６：６７１
３−６７２４）配列を含有している。再構成ヒトＰＭ−
１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖をコードするＤＮＡが免疫グロブリ
ンプロモーター以外のプロモーターを用いるベクターに
おいて発現される場合、リーダー配列中のイントロン
は、再構成ヒトＶ領域をコードするＤＮＡのＰＣＲ−ク
ローニングにより除去された（実施例１２を参照のこ
と）。
【００５７】低下した発現レベルの他の可能性のある原
因は、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする
ＤＮＡとヒトγ−１Ｃ領域をコードするＤＮＡとの間の
イントロン内の約１９０bpの非機能的ＤＮＡの存在であ
ると考えられた。再構成ヒトＢＩ−８Ｈ鎖Ｖ領域（Ｐ．
Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：
５２２−５２５）をコードするＤＮＡにもともと由来す
るＤＮＡ配列から再構成ヒトＰＭ−１Ｈ鎖Ｖ領域をコー
ドするＤＮＡを作製した。この最初の再構成ヒトＶ領域
をコードするＤＮＡはマウスＮＰのＨ鎖Ｖ領域（Ｍ．
Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ；Ｍ．Ｓ．Ｎ
ｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８３）２：
１３７３−１３７８）をコードするＤＮＡから作製され
た。再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡと、発現
ベクターに再構成ヒトＶ領域をコードするＤＮＡを連結
するためのＢａｍＨＩ部位との間のイントロン中に存在
する約１９０bpのこのストレッチは、再構成ヒトＶ領域
をコードするＤＮＡのＰＣＲクローニングの過程で除去
された。
【００５８】発現レベルを改良するために変形された再
構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域の最終バージ
ョンのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を配列番号：５７及
び５６に示す。これらのＤＮＡ配列は、表２に示した再
構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」、
並びに表３に示した再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域
のバージョン「ｆ」をコードする。ＨＥＦ−１α発現ベ
クター（図１５）に挿入された場合、これらのベクター
はトランスフェクトされたＣＯＳ細胞中で約２μｇ／ml
の抗体を一過性に生産する。より多量の再構成ヒトＰＭ
−１抗体を安定的に生産させるため、ｄｈｆｒ遺伝子を
組み込んだ新しいＨＥＦ−１α発現ベクターを作製した
（実施例１０及び図１１を参照のこと）。
【００５９】欠陥のある（ｃｒｉｐｐｌｅｄ）ＳＶ４０
プロモーターを連結したｄｈｆｒ遺伝子を、ヒトγ−１
Ｈ鎖を発現するＨＣＭＶベクターについて記載したのと
同様にして、ヒトγ−１Ｈ鎖を発現するＨＥＦ−１αベ
クターに導入した。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖を発現
するＨＥＦ−１αベクター及び再構成ヒトＰＭ−１抗体
Ｈ鎖を発現するＨＥＦ−１α−ｄｈｆｒベクターをＣＨ
Ｏ ｄｈｆｒ（−）細胞に同時形質転換した。安定に形
質転換されたＣＨＯ細胞系を、ヌクレオシドを含有せず
１０％のＦＣＳ及び５００μｇ／mlのＧ４１８を含有す
るＡｌｐｈａ−Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ）中で選択した。遺伝子増幅
工程に先立って、ＣＨＯ細胞系は１０μｇ／１０6 細胞
／日までの再構成ヒトＰＭ−１抗体を生産することが観
察された。
【００６０】マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２
０のＶ領域と既知のヒト抗体のＶ領域との比較 マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のカッパー
Ｌ鎖（κＬ）Ｖ領域のＦＲとヒトκＬ鎖Ｖ領域のサブグ
ループ（ＨＳＧ）Ｉ〜IVのＦＲとの相同性、及びマウス
モノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＨ鎖Ｖ領域のＦ
ＲとヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループ（ＨＳＧ）Ｉ〜III
のＦＲとの相同性を表４に示す。
【００６１】
【表４】
【００６２】表４に示した様に、マウスモノクローナル
抗体ＡＵＫ１２−２０のカッパーＬ鎖（κＬ）Ｖ領域
は、ヒトκＬ鎖Ｖ領域のサブグループ（ＨＳＧ）Ｉ〜IV
とそれぞれ同程度（６４〜６８％）の相同性を示す。タ
ンパクのＤａｔａ ｂａｓｅ“ＬＥＥＤＳ”の検索よ
り、ＨＳＧ−IVに属するヒト抗体Ｌｅｎ（Ｍ．Ｓｃｈｎ
ｅｉｄｅｒら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５６，５
０７−５５７，１９７５）のＬ鎖Ｖ領域が最も高い６８
％の相同性を示す。一方、マウスモノクローナル抗体Ｐ
Ｍ−１のヒト型化に用いられているヒト抗体ＲＥＩはＨ
ＳＧ−Ｉに属し、マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２
−２０のＬ鎖Ｖ領域とは、６２％の相同性を示す。また
マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＬ鎖のｃ
ａｎｏｎｉｃａｌ構造を調らべてみると（Ｃ．Ｃｈｏｔ
ｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）１９
６：９０１〜９１７）、特にＬ鎖ＣＤＲ２（Ｌ２）がＬ
ｅｎよりＲＥＩとよく一致する。
【００６３】上記により、マウスモノクローナル抗体Ａ
ＵＫ１２−２０のＬ鎖Ｖ領域のヒト型化に用いるヒト抗
体は必ずしもＨＳＧ−IVに属する抗体から選ぶ必要もな
く、マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＬ鎖
Ｖ領域のヒト型化には、マウスモノクローナル抗体ＰＭ
−１のＬ鎖Ｖ領域のヒト型化の場合と同様にＲＥＩを用
いる。
【００６４】表４に示す様に、ＡＵＫ１２−２０抗体の
Ｈ鎖Ｖ領域は、ヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループＩ（ＨＳ
Ｇ−Ｉ）と最も高い相同性を示す。また、Ｄａｔａ ｂ
ａｓｅ“ＬＥＥＤＳ”の検索により、やはりＨＳＧＩに
属するヒト抗体ＨＡＸ（Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｂ．Ｄ．ら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，２４９６−２５０１，１
９８７）がＡＵＫ１２−２０抗体のＨ鎖Ｖ領域に対して
約６６％の相同性を示す。そこで再構成ヒトＡＵＫ１２
−２０抗体のＨ鎖Ｖ領域の設計においては、ＨＳＧＩに
属するヒト抗体ＨＡＸのＦＲ、及び同様にＨＳＧＩに属
するＦＲを含有するヒト型化４２５抗体Ｈ鎖Ｖ領域（Ｋ
ｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ Ｃ．Ａ．，ら、Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４，７７３−７８３，
１９９１）のＦＲを用いる。ちなみに、ＡＵＫ１２−２
０抗体Ｈ鎖Ｖ領域はヒト型化４２５抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバ
ージョンａと約６４％の相同性を示す。
【００６５】再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領
域の設計 前記の理由により再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖
Ｖ領域のＦＲとしてＲＥＩのＦＲを使用し、表５に示す
ように再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領域を設
計した。
【００６６】
【表５】
【００６７】再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領
域の設計 前記の理由により、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ
鎖Ｖ領域の設計に再構成ヒトＶH ａ４２５のＦＲを用い
る。ところで、こうして設計した再構成ヒトＡＵＫ１２
−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのヌクレオチ
ド配列はスプライス供与配列とよく一致する配列を有す
ることが見出された。このことから、再構成ヒトＰＭ−
１抗体の場合と同様に異常なスプライシングが再構成ヒ
トＡＵＫ１２−２０抗体の発現においても起こる可能性
がある。このため、ヌクレオチド配列を部分的に変更す
ることにより、スプライス供与配列様の配列を除去し
た。この修正された配列をバージョンａと称する。さら
に、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバー
ジョンｂ〜ｄを設計した。バージョンａ〜ｄのアミノ酸
配列を表６に示す。
【００６８】
【表６】
【００６９】注：ヒトサブグループＩＶH 領域（ＨＳＧ
Ｉ）において１種類の共通アミノ酸が特定できない位置
はＸで示す。アンダーラインを付した２個のアミノ酸は
ＨＳＧＩコンセンサス配列中のアミノ酸と異る。ＲＶH
ｂ，ＲＶH ｃ及びＲＶH ｄについてはＲＶH ａと異るア
ミノ酸残基のみが示してある。さらに、ヒト抗体ＨＡＸ
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３９，２４９６−２５
０１，１９８７，ＳＬＥ患者由来Ｂ細胞由来のハイブリ
ドーマ２１／２８細胞の産生する抗体；そのアミノ酸配
列はこの文献中のＦｉｇ．６に記載されており、それを
コードするＤＮＡのヌクレオチド配列はＦｉｇ．４及び
５に記載されている）のＦＲを用いて再構成ヒトＡＵＫ
１２−２０抗体のＨ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」〜「ｄ」
を次の表７に示すように設計した。
【００７０】
【表７】
【００７１】注：ｓｌｅ１２２０Ｈａ中のアンダーライ
ンを付した２個の残基はＨＡＸのＦＲからの変化を示
す。ｓｌｅ１２２０Ｈｂ，ｓｌｅ１２２０Ｈｃ、及びｓ
ｌｅ１２２０ＨｄについてはＨＡＸのＦＲ中のアミノ酸
と異るＦＲ中のアミノ酸のみを示す。ヒトＩＬ−６Ｒに
対する本発明のキメラ抗体又は再構成ヒト抗体の製造の
ために任意の発現系、例えば真核細胞、例えば動物細
胞、例えば樹立された哺乳類細胞系、真糸状菌細胞、及
び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば細菌細胞、例えば
大腸菌細胞等を使用することができる。好ましくは、本
発明のキメラ抗体又は再構成抗体は哺乳類細胞、例えば
ＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞中で発現される。
【００７２】これらの場合、哺乳類細胞での発現のため
に有用な常用のプロモーターを用いることができる。例
えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（ｈｕｍａｎ
ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ
ｅａｒｌｙ；ＨＣＭＶ）プロモーターを使用するのが
好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクタ
ーの例には、ＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ1 、ＨＣＭＶ−Ｖ
L −ＨＣK 、ＨＣＭＶ−１２ｈ−g γ1 、ＨＣＭＶ−１
２κ−ｇκ等であって、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの
（図１を参照のこと）が含まれる。
【００７３】本発明のために有用なプロモーターの他の
具体例はヒト・エロンゲーション・ファクター１α（Ｈ
ＥＦ−１α）プロモーターである。このプロモーターを
含有する発現ベクターにはＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１及び
ＨＥＦ−１２ｋ−ｇκ（図８及び図９）、並びにＨＥＦ
−ＶH −ｇγ１及びＨＥＦ−ＶL −ｇκ（図１５）が含
まれる。宿主細胞系中での遺伝子増幅のため、発現ベク
ターはさらにｄｈｆｒ遺伝子を含有することができる。
ｄｈｆｒ遺伝子を含有する発現ベクターは例えばＤＨＦ
Ｒ−ΔＥ−ＰＭｈ−ｇγ1 （図１０）、ＤＨＦＲ−ΔＥ
−ＲＶｈ−ＰＭ１−ｆ（図１１）等である。
【００７４】要約すれば、本発明はまず、ヒトＩＬ−６
Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域及び
Ｈ鎖Ｖ領域、並びに該Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及
びＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを提供する。これら
は、ヒトＩＬ−６Ｒに対するヒト／マウスキメラ抗体及
び再構成ヒト抗体の作製のために有用である。モノクロ
ーナル抗体は、例えばＡＵＫ１２−２０、ＰＭ−１、Ａ
ＵＫ６４−７、及びＡＵＫ１４６−１５である。Ｌ鎖Ｖ
領域は例えば配列番号：２４，２６，２８又は３０に示
すアミノ酸配列を有し、そしてＨ鎖Ｖ領域は例えば配列
番号：２５，２７，２９，又は３１に示すアミノ酸配列
を有する。これらのアミノ酸配列は例えばそれぞれ配列
番号：２４〜３１に示すヌクレオチド配列によりコード
されている。
【００７５】本発明はまた、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域及び
マウスＬ鎖Ｖ領域；並びに（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域及びマ
ウスＨ鎖Ｖ領域：を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対す
るキメラ抗体に関する。マウスＬ鎖Ｖ領域及びマウスＨ
鎖Ｖ領域並びにこれらをコードするＤＮＡは前記の通り
である。前記ヒトＬ鎖Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域で
あることができ、そして例えばヒトＣκ領域である。前
記ヒトＨ鎖Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることが
でき、そして例えばヒトＣγ１領域である。
【００７６】キメラ抗体の製造のためには２種類の発現
ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のご
とき発現制御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域
及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発
現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のご
とき発現制御領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ
鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター
を作製する。次に、これらの発現ベクターにより哺乳類
細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転
換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養して
キメラ抗体を製造する。
【００７７】あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖
Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及び
ヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクタ
ーに導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質
転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又は
イン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産さ
せる。
【００７８】本発明はさらに、（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ
領域、及び（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに
対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んで
成るＬ鎖Ｖ領域、を含んで成るＬ鎖；並びに（Ｂ）
（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及び
ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＨ
鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体
を提供する。
【００７９】好ましい態様においては、前記Ｌ鎖ＣＤＲ
は配列番号２４，２６，２８及び３０のいずれかに示さ
れるアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列の範囲が表
９において定義されるアミノ酸配列を有し、前記Ｈ鎖Ｃ
ＤＲは配列番号２５，２７，２９及び３１に示されるア
ミノ酸配列であって該アミノ酸配列の範囲が表９におい
て定義されるアミノ酸配列を有し；前記ヒトＬ鎖ＦＲが
ＲＥＩに由来するものであり；前記ヒトＨ鎖ＦＲはＮＥ
Ｗ又はＨＧＳＩコンセンサス配列又はＨＡＸに由来する
ものであり；前記ヒトＬ鎖Ｃ領域はヒトＣκ領域であ
り；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域はヒトＣγ１である。
【００８０】好ましい態様においては、Ｌ鎖Ｖ領域は表
２においてＲＶL ａとして示されるアミノ酸配列を有
し、Ｈ鎖Ｖ領域は表３にＲＶH ａ、ＲＶH ｂ、ＲＶ
H ｃ、ＲＶ H ｄ、ＲＶH ｅ又はＲＶH ｆとして示される
アミノ酸配列を有する。アミノ酸配列ＲＶH ｆが最も好
ましい。
【００８１】再構成抗体の製造のためには、２種類の発
現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系の
ごとき発現制御領域による制御のもとに前に定義した再
構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベク
ター、及びエンハンサー／プロモーター系のごとき発現
制御領域のもとに前に定義した再構成ヒトＨ鎖をコード
するＤＮＡを含んで成るもう一つの発現ベクターを作製
する。次に、これらの発現ベクターを用いて哺乳類細胞
のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そしてこの形質転
換された細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して
再構成ヒト抗体を生産せしめる。
【００８２】あるいは、再構成ヒトＬ鎖をコードするＤ
ＮＡ及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを単一の発
現ベクターに導入し、そしてこのベクターを用いて宿主
を形質転換し、次にこの形質転換された宿主細胞をイン
−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とする再構成ヒ
ト抗体を生産せしめる。こうして生産されたキメラ抗体
又は再構成ヒト抗体は、常法に従って、例えばプロテイ
ンＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過等により単離、精製するこ
とができる。
【００８３】本発明のキメラＬ鎖又は再構成ヒトＬ鎖は
Ｈ鎖と組合わせることにより完全な抗体を作製するため
に使用することができる。同様に本発明のキメラＨ鎖又
は再構成ヒトＨ鎖はＬ鎖と組合わせることにより完全な
抗体を作製するために用いることができる。本発明のマ
ウスＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域、マウスＨ鎖Ｖ
領域、及び再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域は、本来、抗原である
ヒトＩＬ−６Ｒと結合する領域であり、それ自体とし
て、又は他の蛋白質との融合蛋白質として医薬、診断薬
等として有用であると考えられる。また、本発明のＬ鎖
Ｖ領域ＣＤＲ及びＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲも、本来、抗原であ
るヒトＩＬ−６Ｒと結合する部分であり、それ自体とし
て又は他の蛋白質との融合蛋白質として医薬、診断薬等
として有用であると考えられる。
【００８４】本発明のマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤ
ＮＡはキメラＬ鎖をコードするＤＮＡ又は再構成ヒトＬ
鎖をコードするＤＮＡの作製のために有用である。同様
にマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡはキメラＨ鎖を
コードするＤＮＡ又は再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮ
Ａの作製のために有用である。また、本発明のＬ鎖Ｖ領
域ＣＤＲをコードするＤＮＡは再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域を
コードするＤＮＡ及び再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮ
Ａの作製のために有用である。同様に本発明のＨ鎖Ｖ領
域ＣＤＲをコードするＤＮＡは再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域を
コードするＤＮＡ及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮ
Ａ作製のために有用である。
【００８５】
【実施例】次に、本発明を下記の実施例により具体的に
説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるもの
ではない。実施例１ ．ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナ
ル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローン化 ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体の可
変領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローン化し
た。
【００８６】１．全ＲＮＡの調製 ハイブリドーマＡＵＫ１２−２０からの全ＲＮＡを、Ｃ
ｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，
５２９４（１９７９）により記載されている方法に従っ
て調製した。すなわち、２．１×１０8 個のハイブリド
ーマＡＵＫ１２−２０の細胞を２０mlの４Ｍグアニジン
チオシアネート（Ｆｕｌｋａ）中で完全にホモジナイズ
させた。ホモジネートを遠心管中の５．３Ｍ塩化セシウ
ム溶液層上に重層し、次にこれをＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ
４０ローター中で３１，０００rpm にて２０℃で２４時
間遠心分離することによりＲＮＡを沈澱させた。
【００８７】ＲＮＡ沈澱物を８０％エタノールにより洗
浄し、そして１mM ＥＤＴＡ及び０．５％ ＳＤＳを含
有する10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）１５０μｌ
中に溶解し、そしてそれにＰｒｏｔｅｎａｓｅ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ）を０．５mg／mlとなるように添加した
後、３７℃にて２０分間インキュベートした。混合物を
フェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＲＮＡを
エタノールで沈澱させた。次に、ＲＮＡ沈澱物を１mM
ＥＤＴＡを含有する10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５）２００μｌに溶解した。
【００８８】２．一本鎖ｃＤＮＡの合成 Ｊ．Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，７，９３４（１９８９）により記載されている方法
に従って一本鎖ｃＤＮＡを合成するため、前記のように
して調製した全ＲＮＡの約５μｇを40mM ＫＣｌ, 6mM
ＭｇＣｌ2 ，１０mMジチオスレイトール、０．５mM ｄ
ＡＴＰ，０．５mM ｄＧＴＰ，０．５mMｄＣＴＰ，０．
５mM ｄＴＴＰ，３５μＭ ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマ
ー（Ａｍｅｒｓｈａｍ），４８ユニットのＲＡＶ−２逆
転写酵素（ＲＡＶ−２：Ｒｏｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｄ ｖｉｒｕｓ２；Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び２５ユニッ
トのヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）を含有する５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）緩
衝液１０μｌに溶解し、そしてこの反応混合物を３７℃
にて６０分間インキュベートしそして次のポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）法のために直接使用した。
【００８９】３．抗体可変領域をコードする遺伝子のＰ
ＣＲ法による増幅 Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＰＨＣ−
２（Ｔｅｃｈｎｅ）を用いてＰＣＲ法を行った。 （１）マウスＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の増幅 ＰＣＲ法に使用するプライマーは、配列番号：１〜１１
に示すＭＫＶ（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐａ Ｖａｒｉａｂ
ｌｅ）プライマー（マウスカッパ型Ｌ鎖リーダー配列と
ハイブリダイズする）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）、及び配
列番号：１２に示すＭＫＣ（ＭｏｕｓｅＫａｐｐａ Ｃ
ｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（マウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領
域とハイブリダイズする）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）であ
った。
【００９０】まず、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．
３）, ５０mM ＫＣｌ ０．１mMｄＡＴＰ，０．１mM
ｄＧＴＰ，０．１mM ｄＣＴＰ，０．１mM ｄＴＴＰ，
１．５mM ＭｇＣｌ2 ，２．５ユニットのＤＮＡポリメ
ラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ），０．２５μＭのそれぞれのＭＫＶプライ
マー、３μＭのＭＫＣプライマー及び一本鎖ｃＤＮＡ合
成の反応混合物１μｌを含有するＰＣＲ溶液１００μｌ
を９４℃の初期温度にて１．５分間そして次に９４℃に
て１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間、こ
の順序で加熱した。この温度サイクルを２５回反復した
後、反応混合物をさらに７２℃にて１０分間インキュー
ベートした。
【００９１】（２）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤ
ＮＡの増幅 ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１３〜２２
に示すＭＨＶ（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｖａｒｉａｂ
ｌｅ）プライマー１〜１０（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）、及
び配列番号：２３に示すＭＨＣ（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖ
ｙ Ｃｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅ
ｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９
１）を使用した。前記３．（１）においてＬ鎖Ｖ領域遺
伝子の増幅について記載したのと同じ方法により増幅を
行った。
【００９２】４．ＰＣＲ生成物の精製および断片化 前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を
ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ生成物精製キット（ＱＩＡＧＥＮ
Ｉｎｃ．ＵＳ）を用いて精製し、そして１０mM Ｍｇ
Ｃｌ2 及び１５０mM ＮａＣｌを含有する１００mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．６）中で１０ユニットの制限酵
素ＳａｌＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いて３７℃にて
３時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロ
ロホルムで抽出し、そしてＤＮＡをエタノール沈澱によ
り回収した。次に、ＤＮＡ沈澱物を１０ユニットの制限
酵素ＸｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）により３７℃にて２時間消化し、そして生ずるＤＮ
Ａ断片を、低融点アガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ，米国）を用いるアガロースゲル電気泳動に
より分離した。
【００９３】約４５０bp長のＤＮＡ断片を含有するアガ
ロース片を切り取りそして６５℃にて５分間溶融せし
め、そしてこれと同容積の２mM ＥＤＴＡ及び２００mM
ＮａＣｌを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５）を加えた。この混合物をフェノール及びクロロ
ホルムにより抽出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈
澱により回収し、そして１mM ＥＤＴＡを含有する１０
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解した。こうし
て、マウスカッパ型Ｌ鎖可変領域をコードする遺伝子を
含んで成るＤＮＡ断片、及びマウスＨ鎖可変領域をコー
ドする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片を得た。上記ＤＮ
Ａ断片はいずれもその５′−末端にＳａｌＩ接着末端を
有しそしてその３′−末端にＸｍａＩ接着末端を有す
る。
【００９４】５．連結及び形質転換 上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域を
コードする遺伝子を含んで成るＳａｌＩ−ＸｍａＩＤＮ
Ａ断片約０．３μｇを、プラスミドｐＵＣ１９をＳａｌ
Ｉ及びＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１
９ベクター約０．１μｇと、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．４），１０mM ＭｇＣｌ2 ，１０mMジチオスレ
イトール、１mMスペルミジン、１mM ＡＴＰ，０．１μ
ｇ／mlのウシ血清アルブミン及び２ユニットＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
を含有する反応混合物中で、１６℃にて１６時間反応さ
せ連結した。
【００９５】次に、７μｌの上記連結混合物を大腸菌Ｄ
Ｈ５αのコンピテント細胞２００μｌに加え、そしてこ
の細胞を氷上で３０分間、４２℃にて１分間そして再び
氷上で１分間静置した。次いで８００μｌのＳＯＣ培地
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）を加え、３７℃にて１
時間インキュベートした後、２×ＹＴ寒天培地（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９８９）上にこの大腸菌をまき、３７℃
にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
【００９６】この形質転換体を、５０μｇ／mlのアンピ
シリンを含有する２×ＹＴ培地５ml中で３７℃にて一夜
培養し、そしてこの培養物から、アルカリ法（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒ
ｅｓｓ，１９８９）に従ってプラスミドＤＮＡを調製し
た。こうして得られた、ハイブリドーマＡＵＫ１２−２
０に由来するマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺
伝子を含有するプラスミドをｐ１２−ｋ２と命名した。
上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマＡＵＫ１２−
２０に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を
含有するプラスミドをＳａｌＩ−ＸｍａＩ ＤＮＡ断片
から作成し、そしてｐ１２−ｈ２と命名した。
【００９７】実施例２．マウスモノクローナル抗体のＶ
領域をコードするＤＮＡのクローン化 実施例１に記載したのと実質上同じ方法をハイブリドー
マＰＭ１，ＡＵＫ６４−７及びＡＵＫ１４６−１５に適
用して下記のプラスミドを得た：ハイブリドーマＰＭ１
由来のカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有す
るプラスミドｐＰＭ−ｋ３；ハイブリドーマＰＭ１由来
のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミド
ｐＰＭ−ｈ１；ハイブリドーマＡＵＫ６４−７由来のカ
ッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラス
ミドｐ６４−ｋ４；ハイブリドーマＡＵＫ６４−７由来
のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミド
ｐ６４−ｈ２；
【００９８】ハイブリドーマＡＵＫ１４６−１５由来の
カッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラ
スミドｐ１４６−ｋ３；及びハイブリドーマＡＵＫ１４
６−１５由来のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有す
るプラスミドＰ１４６−ｈ１。なお、上記プラスミドを
含有する大腸菌株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍ
ａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｉｍｉｔｅｄに、ブ
ダペスト条約に基づいて、１９９１年２月１１日に寄託
され、そして表８に示す受託番号を有する。
【００９９】
【表８】
【０１００】実施例３．ＤＮＡの塩基配列の決定 前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列
を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ TMＶｅｒｓｉｏｎ２．０キット
（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ、米国）
を用いて決定した。まず、前記のようにして得られたプ
ラスミド約３μｇを０．２Ｎ ＮａＯＨにより変性し、
配列決定用プライマーとアニールさせ、そしてキット添
付の処方に従って35Ｓ−ｄＡＴＰにより標識した。次
に、標識されたＤＮＡを、８Ｍ尿素を含有する６％ポリ
アクリルアミドゲルにて電気泳動した後、ゲルを１０％
メタノール及び１０％酢酸により固定し、乾燥し、そし
てオートラジオグラフィーにかけることにより塩基配列
を決定した。各プラスミドのｃＤＮＡコード領域の塩基
配列を配列番号：２４〜３１に示す。
【０１０１】実施例４．ＣＤＲの決定 Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の全般的構造は、互いに類似性を
有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つ
の超可変領域、即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連
結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較
的良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸
配列の可変性は極めて高い（Kabat, E.A. ら、「Sequen
ces of Proteins of Immunological Interest 」US Dep
t. Health and Human Services, 1983）。ヒトＩＬ−６
Ｒに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域の上記
のアミノ酸配列に基き、そしてＫａｂａｔらの報告に従
ってＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体の各
Ｖ領域のＣＤＲを表９に示す如く決定した。
【０１０２】
【表９】
【０１０３】実施例５．クローン化されたｃＤＮＡの発
現の確認（１）発現プラスミドの作製 ＰＣＲ法によりクローン化されたＡＵＫ１２−２０抗体
のκＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域をコードするｃＤＮＡからキ
メラＬ鎖／Ｈ鎖をコードするＤＮＡを作製した。マウス
ＡＵＫ１２−２０のＶ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒ
トサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のエンハンサー及
びプロモーターを含有する哺乳類細胞発現ベクター（Ｈ
ＣＭＶ発現ベクターと称する）（図１．実施例８）中で
ヒトＣ領域をコードするＤＮＡに容易に連結するために
は、ＡＵＫ１２−２０抗体のＶ領域をコードするマウス
ｃＤＮＡ配列の５′−末端及び３′−末端に便利な制限
酵素切断部位を導入することが必要であった。
【０１０４】５′−末端及び３′−末端へのこれらの修
飾はＰＣＲ法を用いて行った。２セットのＰＣＲプライ
マーを設計しそして合成した。マウスＬ鎖Ｖ領域及びＨ
鎖Ｖ領域の両方について、リーダー配列の始めをコード
するＤＮＡにハイブリダイズし、効率的な翻訳のために
必須のＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ.,Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１９６：９４７−９５０，１９８７）を維持しそ
してＨＣＭＶ発現ベクターへのクローニングのためのＨ
ｉｎｄIII 部位を形成するために、Ｌ鎖Ｖ領域後方プラ
イマー（配列番号：３２）、及びＨ鎖Ｖ領域後方プライ
マー（配列番号：３３）を調製した。前方ＰＣＲ−プラ
イマーは、Ｊ領域の末端をコードするＤＮＡにハイブリ
ダイズし、Ｃ領域へのスプライシングのために必須のＤ
ＮＡ配列を維持しそしてＨＣＭＶ発現ベクターでのヒト
Ｃ領域への連結のためのＢａｍＨＩ部位を形成するよう
に、Ｌ鎖Ｖ領域前方プライマー（配列番号３４）、及び
Ｈ鎖Ｖ領域前方プライマー（配列番号３５）を調製し
た。
【０１０５】ＰＣＲによる増幅に続き、ＰＣＲ生成物を
ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、ヒトκ鎖又
はγ−１鎖Ｃ領域ＤＮＡを含有するＨＣＭＶベクターに
クローン化し、そして塩基配列を決定してＰＣＲ法によ
る増幅中にエラーが生じなかったことを確認した。得ら
れる発現ベクターをＨＣＭＶ−１２ｋ−ｇｋ及びＨＣＭ
Ｖ−１２ｈ−ｇγ１と称する。ＨＣＭＶ発現ベクターの
構造を図１に示す。プラスミドＨＣＭＶ−ＶL −ＨＣκ
において、ＶL 領域は任意のマウスＬ鎖Ｖ領域コード配
列であることができる。この例において、ＡＵＫ１２−
２０κＬ鎖Ｖ領域を挿入することによりＨＣＭＶ−１２
ｋ−ｇｋを得た。プラスミドＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ１
において、ＶH領域は任意のマウスＨ鎖Ｖ領域コード配
列であることができる。この例においてはＡＵＫ１２−
２０のＨ鎖Ｖ領域を挿入してＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１
を得た。
【０１０６】ＣＯＳ細胞での一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎ
ｔ）発現 キメラＡＵＫ１２−２０抗体のＣＯＳ細胞での一過性発
現を見るため、前記発現ベクターをＣＯＳ細胞において
試験した。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓａｒ装置（ＢｉｏＲａ
ｄ）を用いる電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉ
ｏｎ）によりＤＮＡをＣＯＳ細胞に導入した。すなわ
ち、ＣＯＳ細胞を１×１０7 個／mlになるようにｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢ
Ｓ）に懸濁し、この細胞浮遊液０．８mlにＤＮＡ（各プ
ラスミドについ１０μｇ）を加えた。１，９００ボルト
（Ｖ）、２５マイクロファラッド（μＦ）の電気容量に
てパルスを与えた。
【０１０７】室温にて１０分間の回復期間の後、エクレ
トロポレーションした細胞を、１０％のウシ胎児血清を
含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）８mlに加えた。７
２時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠
心分離して細胞破片を除去し、そして無菌条件下で４℃
にて短時間、又は−２０℃にて長時間貯蔵した。
【０１０８】酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるキメ
ラ抗体の定量 トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の培養上清をＥＬＩ
ＳＡにより測定して、キメラ抗体が生産されていること
を確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤ
ギの抗ヒトＩｇＧ（Ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）
（Ｓｉｇｍａ）によりコートした。ブロックした後、Ｃ
ＯＳ細胞からの培養上清を段階希釈しそして各ウエルに
加えた。インキュベーション及び洗浄の後、アルカリホ
スファターゼ−結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的、
Ｓｉｇｍａ）を加えた。インキュベーション及び洗浄の
後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反
応を停止しそして４０５nmにおける吸光度を測定した。
標準として精製ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。
【０１０９】ヒトＩＬ−６Ｒへの結合能を確認するため
の酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ） トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの培地をＥＬＩ
ＳＡにより測定して、生産されたキメラ抗体が抗原に結
合し得るか否かを決定した。抗原への結合の検出のた
め、プレートをＭＴ１８マウスモノクローナル抗体（参
考例１）でコートした。１％ ＢＳＡでブロックした
後、可溶性組換えヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）を加え
た。洗浄した後、ＣＯＳ細胞からの培養上清を段階希釈
し、そして各ウエルに加えた。インキュベーション及び
洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇ
Ｇを加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩
衝液を加えた。インキュベーションの後、反応を停止
し、そして４０５nmにおける吸光度を測定した。
【０１１０】この結果を図２に示した。キメラ抗体ＡＵ
Ｋ１２−２０をコードする遺伝子のＣＯＳ細胞へのトラ
ンスフェクションを実施した。このＣＯＳ細胞の培養上
清サンプルは、ＩＬ−６Ｒに対する強い結合能を示し、
図２に○（オープンサークル）で示す如く、サンプルの
希釈度（抗体の濃度）依存的に４０５nmにおける吸光度
が変化し、サンプル中にＩＬ−６Ｒレセプターに対する
抗体が含まれていることが確認された。
【０１１１】ヒトＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害す
る能力の測定 トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの培養上清を測
定して培地中に存在する抗体が、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６
との結合を阻害するか否かを調べるために、ビオチン化
ＩＬ−６との競合的結合阻害能を調べた。プレートをＭ
Ｔ１８マウスモノクローナル抗体（参考例１）でコート
した。ブロッキングの後、可溶性組換ヒトＩＬ−６Ｒ
（ＳＲ３４４）を加えた。洗浄した後、ＣＯＳ細胞から
のサンプルを段階希釈し、そしてビオチン化ＩＬ−６と
共に各ウエルに加えた。
【０１１２】洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合
ストレプトアビジンを加えた。インキュベーション及び
洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの
後、反応を停止し、そして吸光度を４０５nmにて測定し
た。精製マウスＡＵＫ１２−２０モノクローナル抗体を
陽性対照として用いた。無関係の抗体を発現するＣＯＳ
細胞からの培地を陰性対照として用いた。
【０１１３】この結果を図３に示した。キメラ抗体ＡＵ
Ｋ１２−２０をコードする遺伝子でトランスフェクトし
たＣＯＳ細胞の培養上清は、最高、及び２番目に高いサ
ンプル濃度でＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害した。
すなわち、図３に●で示す如く、サンプル希釈度（抗体
の濃度）依存的に４０５nmにおける吸光度が変化し、サ
ンプル中の抗体がＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害し
ていることが認められた。これは陽性対照の吸光度の抗
体濃度依存的変化（○）にほぼ一致することからも確認
出来た。なお、陰性対照（△）は阻害活性が全く認めら
れなかった。
【０１１４】実施例６．クローン化ｃＤＮＡの発現の確
認（２）（キメラＰＭ−１抗体の作製） 発現ベクターの作製 キメラＰＭ−１抗体を発現するベクターを作製するた
め、それぞれマウスＰＭ−１κＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコ
ードするｃＤＮＡクローンｐＰＭ−ｋ３及びｐＰＭ−ｈ
１をＰＣＲ法により変形し、そしてＨＣＭＶ発現ベクタ
ー（図１を参照のこと）に導入した。Ｌ鎖Ｖ領域のため
の後方プライマーｐｍｋ−ｓ（配列番号：３８）及びＨ
鎖Ｖ領域のための後方プライマーｐｍｈ−ｓ（配列番
号：４０）を、リーダー配列の最初をコードするＤＮＡ
にハイブリダイズし且つＫｏｚａｋコンセンサス配列及
びＨｉｎｄIII 制限部位を有するように設計した。Ｌ鎖
Ｖ領域のための前方プライマーｐｍｋ−ａ（配列番号：
３６）及びＨ鎖Ｖ領域のための前方プライマーｐｍｈ−
ａ（配列番号：３９）を、Ｊ領域の末端をコードするＤ
ＮＡ配列にハイブリダイズし且つスプライスドナー配列
及びＢａｍＨＩ制限部位を有するように設計した。
【０１１５】κＬ鎖Ｖ領域のため、２種類の前方プライ
マーを合成した。ほとんどのκＬ鎖においては、位置１
０７のリジンが保存されているが、マウスＰＭ−１κＬ
鎖においては位置１０７がアスパラギンである。キメラ
ＰＭ−１抗体の抗原結合活性に対するこの変化の効果を
検討するため、前方プライマーｐｍｋ−ｂ（配列番号：
３７）を、位置１０７がアスパラギンからリジンに変る
ように設計した。ＰＣＲ反応に続き、ＰＣＲ生成物を精
製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化し、そしてｐ
ＵＣ１９ベクター（Ｙａｎｉｓｈｅ−Ｐｅｒｒｏｎら、
Ｇｅｎｅ（１９８５）３３：１０３−１０９）にサブク
ローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、ＨｉｎｄIII −
ＢａｍＨＩ断片を切出し、そしてＨ鎖Ｖ領域については
発現ベクターＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ１にクローン化し
てＨＣＭＶ−ＰＭｈ−ｇγ１を得、そしてＬ鎖Ｖ領域に
ついてはＨＣＭＶ−ＶL −ＨＣκにクローン化してＨＣ
ＭＶ−ＰＭｋａ−ｇｋ及びＨＣＭＶ−ＰＭｋｂ−ｇｋを
得た。
【０１１６】ＣＯＳ細胞のトランスフェクション キメラＰＭ−１抗体の一過性発現を観察するため、前記
発現ベクターをＣＯＳ細胞において試験した。ＨＣＭＶ
−ｐｍｈ−ｇγ１と、ＨＣＭＶ−ｐｍｋａ−ｇｋ又はＨ
ＣＭＶ−ｐｍｋｂ−ｇｋのいずれかとを、Ｇｅｎｅ Ｐ
ｕｌｓａｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポ
レーションによりＣＯＳ細胞に同時形質転換した。ＤＮ
Ａ（プラスミド当り１０μｇ）を、ＰＢＳ中１×１０7
細胞／mlの０．８mlのアリコートに加え、１，９００
Ｖ，２５μＦの容量にてパルスを与えた。室温にて１０
分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理され
た細胞を、１０％のγ−グロブリン不含有ウシ胎児血清
を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ）
に加えた。７２時間のインキュベーションの後、培養上
清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、そして無
菌条件下で４℃にて短期間貯蔵し、又は−２０℃にて長
期間貯蔵した。
【０１１７】キメラＰＭ−１抗体の発現及び分析 ３日間の一過性発現の後、ＣＯＳ細胞からの培地を集
め、そしてキメラＰＭ−１抗体について試験した。培地
をまずＥＬＩＳＡにより分析して、トランスフェクトさ
れたＣＯＳ細胞によりヒト様抗体が生産されたか否かを
決定した。このアッセイにおいて標準として既知量の精
製ヒトＩｇＧを用いることにより、ＣＯＳ細胞からの培
地中に存在するヒト様抗体（この場合、キメラＰＭ−１
抗体）の量を推定することが可能である。ヒト抗体の検
出のため、プレートをヤギ抗−ヒトＩｇＧ（全体分子、
Ｓｉｇｍａ）によりコートした。ブロッキングの後、Ｃ
ＯＳ細胞からのサンプルを段階希釈し、そして各ウェル
に加えた。インキュベーション及び洗浄の後、アルカリ
ホスフェターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的、
Ｓｉｇｍａ）を加えた。インキュベーション及び洗浄の
後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反
応を停止し、そして４０５nmでの吸光度を測定した。標
準として精製ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を加えた。
【０１１８】キメラＰＭ−１抗体をコードする遺伝子を
担持するベクターによりトランスフェクトされたＣＯＳ
細胞からの培地はヒト様抗体の発現について陽性であ
り、そしておよその量が上記のようにして測定された。
次に、キメラＰＭ−１抗体をコードする遺伝子を担持す
るベクターによりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞か
らの同じ培地をヒトＩＬ−６Ｒに結合する能力について
測定した。抗原への結合の測定のため、プレートを、ヒ
トＩＬ−６Ｒに対する抗体であるＭＴ１８マウスモノク
ローナル抗体（参考例１）によりコートした。ブロッキ
ングの後、可溶性ヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）を加え
た。洗浄した後、サンプルを段階希釈し、そして各ウエ
ルに加えた。インキュベーション及び洗浄の後、アルカ
リホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異
的；Ｓｉｇｍａ）を添加した。インキュベーション及び
洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの
後、反応を停止し、そして４０５nmでの吸光度を測定し
た。この測定のために標準品は存在しなかった。
【０１１９】２個のサンプルの内の１つは、マウスＰＭ
−１抗体中に見られるＶ領域と同一のＶ領域を有するキ
メラ抗体（キメラＰＭ−１ａ抗体、図４）をコードする
遺伝子によるトランスフェクトからのサンプルであっ
た。他の１つのサンプルはＬ鎖Ｖ領域中の位置１０７に
前記のような１個のアミノ酸変化を有するキメラ抗体
（キメラＰＭ−１ｂ抗体、図４）をコードする遺伝子に
よるトランスフェクションからのものであった。いずれ
のサンプルも、サンプルの希釈により減少するＩＬ−６
Ｒに対する強い結合を示した。すなわち、作製されたキ
メラＰＭ−１抗体は機能的であり、そしてその抗原によ
く結合することができる。
【０１２０】最も重要なことは、機能的キメラＰＭ−１
抗体の証明は、正しいマウスＰＭ−１Ｖ領域がクローン
化されそして配列決定されたことの直接の証拠である。
Ｌ鎖Ｖ領域中の位置１０７にいずれのアミノ酸を有する
キメラ抗体も抗原ＩＬ−６Ｒによく結合した。マウスＰ
Ｍ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域中の位置１０７は抗原結合のた
めにあまり重要ではなく、そしてこの位置におけるアス
パラギン及びリジンのいずれも満足に機能するようであ
る。マウスＰＭ−１抗体はそのＬ鎖Ｖ領域のこの位置に
アスパラギンを有するので、キメラＰＭ−１抗体を用い
るその後のすべての研究は、マウスＰＭ−１抗体に見出
されるそれと同じバージョンａを用いて行った。
【０１２１】より多量のＰＭ−１抗体を安定に生産する
ために、ｄｈｆｒ遺伝子を含有する新たなＨＣＭＶ発現
ベクターを作製した。キメラＰＭ−１抗体のより高い発
現レベルを達成するための第一段階は、ベクターＨＣＭ
Ｖ−ＶH −ＨＣγ1 （図１）を変形して、このベクター
が欠陥のある（ｃｒｉｐｐｌｅｄ）ＳＶ４０プロモータ
ーエンハンサーにより発現されるｄｈｆｒ遺伝子を含有
するようにすることであった。ＳＶ４０エンハンサー要
素をｐＳＶ２−ｄｈｆｒベクター（Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａ
ｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８１）
１：８５４−８６４）から除去し、そしてＳＶ４０プロ
モーターによって発現されるｎｅｏ遺伝子の代りに「欠
陥のある」ＳＶ４０プロモーターにより発現されるｄｈ
ｆｒ遺伝子をＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ1 に挿入した。次
に、この新しいＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ1 −ｄｈｆｒベ
クターにマウスＰＭ−１Ｖ領域を挿入した。この改良さ
れた発現ベクターの作製を実施例１０に詳細に記載す
る。
【０１２２】ＣＨＯ ｄｈｆｒ（−）細胞（Ｇ．Ｕｒｌ
ａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９８０）７７：４２１６−４２２０）を２種類
のプラスミドＤＮＡすなわちキメラＰＭ−１ａＬ鎖を発
現するためのＨＣＭＶ−ＶL−ＨＣκベクター（ＨＣＭ
Ｖ−ＰＭｋａ−ｇｋ）及びキメラＰＭ−１ Ｈ鎖を発現
するためのＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ1 −ｄｈｆｒベクタ
ー（ＤＨＦＲ−△Ｅ−ＰＭｈ−ｇγ１；実施例１０）に
より同時形質転換した。ＤＮＡ（各プラスミドにつき１
０μｇ／ml）をＰＢＳ中１×１０7 細胞／mlの０．８ml
のアリコートに加えた。１９００Ｖの電圧２５μＦの電
気容量でパルスを与えた。
【０１２３】室温にて１０分間の回復期間の後、エレク
トロポレーション処理された細胞を、ヌクレオシド及び
１０％ ＦＣＳを含有するＡｌｐｈａ Ｍｉｎｉｍａｌ
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ培地（α−ＭＥ
Ｍ）１０mlに加えた。一夜のインキュベーションの後、
培地を、ヌクレオシドを含有せず１０％ ＦＣＳ及び５
００μｇ／mlのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ）を含有するα−
ＭＥＭに変えて、ｄｈｆｒ+ 及びｎｅｏ+ 形質転換細胞
の選択を行った。選択の後、選択されたクローンを用い
て遺伝子増幅を行った。２×１０-8Ｍメソトレキセート
（ＭＴＸ）中での１ラウンドの増幅の後、約３．９μｇ
／１０6 細胞／日のキメラＰＭ−１ａの抗体を生産する
細胞系（ＰＭ１ｋ３−７）を選択した。
【０１２４】ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害
するキメラ抗体の能力についてのＥＬＩＳＡ測定 トランスフェクトされたＣＯＳ細胞において又は安定な
ＣＨＯ細胞系において生産された抗体を測定して、それ
らが、ＩＬ−６Ｒへのビオチン化ＩＬ−６の結合と競争
するか否かを決定した。プレートをマウス抗体ＭＴ１８
によりコートした。ブロッキングの後、可溶性組換えヒ
トＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）を加えた。洗浄の後、ＣＯ
Ｓ細胞からのサンプルを段階希釈し、そしてビオチン化
ＩＬ−６と一緒に各ウエルに加えた。洗浄の後、アルカ
リホスファターゼ結合ストレプトアビジンを加えた。イ
ンキュベーション及び洗浄後、基質緩衝液を加えた。イ
ンキュベーションの後、反応を停止させ、そして４０５
nmにおける吸光度を測定した。結果を図５に示す。
【０１２５】実施例７．再構成ヒトＰＭ−１抗体の作製 より迅速に且つより効率的にＣＤＲ移植を達成するた
め、ＰＣＲによる逐次ＣＤＲ移植法を開発した。この方
法はＰＣＲ変異誘発法（Ｋａｍｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄ．Ｒｅｓ．１７：５４０４，１９８９）に基く。
ＣＤＲ移植のための選択されたヒトＦＲをコードするＤ
ＮＡを含有する鋳型ＤＮＡを調製するために、適当な再
構成ヒトＶ領域をコードするＤＮＡを便利なベクターに
再クローニングする必要があった。プラスミドａｌｙｓ
１１及びＦ１０のＤＮＡはそれぞれ再構成ヒトＤ１．３
のＬ鎖及びＨ鎖をコードしており、ヒトＲＥＩからのＦ
ＲをコードするＤＮＡ及びＮＥＷからのＦＲをコードす
るＤＮＡをそれぞれ含有する。
【０１２６】再構成ヒトＤ１．３のＬ鎖Ｖ領域をコード
するＤＮＡ配列を含有する約５００bpのＮｃｏＩ−Ｂａ
ｍＨ１断片をａｌｙｓ１１から切り出し、そしてＨｉｎ
ｄIII 及びＢａｍＨＩで開裂されたｐＢＲ３２７にサブ
クローニングしてプラスミドＶｌ−ｌｙｓ−ｐＢＲ３２
７を得た。このＶｌ−ｌｙｓ−ｐＢＲ３２７からのＨｉ
ｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片を、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍ
ＨＩにより開裂されたｐＵＣ１９に挿入してプラスミド
Ｖｌ−ｌｙｓ−ｐＵＣ１９を得た。
【０１２７】再構成ヒトＤ１．３のＨ鎖Ｖ領域をコード
するＤＮＡ配列を含有する約７００bpのＮｃｏＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片をＦ１０から切り出し、そしてＨｉｎｄIII
−ＮｃｏＩアダプターを用いてｐＢＲ３２７のＨｉｎｄ
III −ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、Ｖｈ−ｌ
ｙｓ−ｐＢＲ３２７を得た。次に、このプラスミドから
ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片を切り出し、そしてＨｉ
ｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより開裂されたｐＵＣ１９に
サブクローニングしてＶｈ−ｌｙｓ−ｐＵＣ１９を得
た。
【０１２８】なお、プラスミドａｌｙｓ１１及び再構成
ヒトＤ１．３のＬ鎖Ｖ領域ＦＲをコードするＤＮＡ配列
はヒト型化ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体（Ｎａｔｕｒｅ
３３２：３２３−３２７（１９８８))のそれと同じであ
る。鋳型として使用した、プラスミドＦ１０中の再構成
ヒトＤ１．３のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列は、
Ｖ．Ｖｅｒｈｏｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３７：１５３
４−１５３６（１９８８）のＦｉｇ．２に記載されてい
る。
【０１２９】図６は、再構成ヒトＰＭ−１のＨ鎖Ｖ領域
の第一バージョンをコードするＤＮＡの作製のために使
用されたプライマー及びＰＣＲ反応を模式的に示す。後
方プライマーＡ（ＡＰＣＲ１；配列番号：４１）及び前
方プライマーＥ（ＡＰＣＲ４；配列番号：４２）は、こ
のベクター上のＤＮＡ配列にハイブリダイズする。ＡＰ
ＣＲ１及びＡＰＣＲ４はｐＵＣ１９ベクターのために特
に設計されたが、ユニバーサルＭ１３配列プライマーを
使用することもできる。
【０１３０】ＣＤＲ１移植／変異誘発プライマーＢ（ｐ
ｈｖ−１；配列番号：４３）、ＣＤＲ２移植プライマー
Ｃ（ｐｈｖ−２；配列番号：４４）、及びＣＤＲ３移植
プライマーＤ（ｐｈｖ−３；配列番号：４５）は４０〜
６０bpの長さを有し、マウスＰＭ−１のＨ鎖Ｖ領域のＣ
ＤＲをコードするＤＮＡ及び該ＣＤＲをコードするＤＮ
Ａを挟む鋳型ＤＮＡ中のヒトＦＲをコードするＤＮＡ配
列から成る。第一のＰＣＲ反応において前方プライマー
ＡＰＣＲ４及び後方プライマーＤを用いた。マウスＰＭ
−１のＣＤＲ３配列をコードするＤＮＡを含有する第一
ＰＣＲ生成物を精製し、そして第二ＰＣＲ反応において
後方プライマーとしてのプライマーＣと共に前方プライ
マーとして使用した。
【０１３１】同様にして、マウスＰＭ−１のＣＤＲ２及
びＣＤＲ３をコードするＤＮＡを含有する第二ＰＣＲ生
成物、並びにマウスＰＭ−１の３個すべてのＣＤＲをコ
ードするＤＮＡを含有する第三ＰＣＲ生成物をそれぞれ
次のＰＣＲ段階のプライマーとして使用した。完全な再
構成ヒトＰＭ−１ Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを有
する第四ＰＣＲ生成物を精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａ
ｍＨＩにより消化し、そしてさらに分析するためにｐＵ
Ｃ１９にサブクローニングした。
【０１３２】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコー
ドするＤＮＡの作製のために３種類の変異誘発プライマ
ーｐｈｖ−１，ｐｈｖ−２及びｐｈｖ−３を合成した。
これらは８Ｍ尿素を含有する１２％ポリアクリルアミド
ゲル上で精製した。変異誘発プライマーｐｈｖ−１は、
マウスＰＭ−１抗体のＣＤＲ１の移植のためのみならず
ヒトＦＲ１中の位置２７及び３０におけるそれぞれのＳ
ｅｒからＴｙｒへ、及びＳｅｒからＴｈｒへの変異のた
めに設計された。各１００μｌのＰＣＲ反応物は典型的
には１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mM
ＫＣｌ，１．５mM ＭｇＣｌ2 ，２５０μＭ ｄＮＴ
Ｐ，５０ngの鋳型ＤＮＡ（Ｖｈ−ｌｙｓ−ｐＵＣ１
９），２．５ｕのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）、及びプライマーを含有した。
【０１３３】１μＭずつのｐｈｖ−３プライマー及びＡ
ＰＣＲ４プライマーを含む第一のＰＣＲ反応を行い、９
４℃にて１．５分間の最初の変性の後、９４℃にて１分
間、３７℃にて１分間及び７２℃にて１分間の３０サイ
クルを反復した。アニーリング段階と合成段階の間の変
温時間は２．５分間であった。最終サイクルの完了の
後、７２℃にて１０分間の最終伸長反応を行った。５２
３bpのＰＣＲ生成物を１．６％低融点アガロースゲルを
用いて精製し、そして次に第二のＰＣＲ反応におけるプ
ライマーとして使用した。
【０１３４】第二のＰＣＲ反応において約１μｇの精製
された第一ＰＣＲ生成物及び２５ｐｍｏｌｅの変異誘発
プライマーｐｈｖ−２をプライマーとして使用した。Ｐ
ＣＲ条件は第一のＰＣＲ反応について記載したのと同じ
であった。同様にして、第二のＰＣＲ反応からの６６５
bpのＰＣＲ生成物をプライマーｐｈｖ−１と共に第三の
ＰＣＲ反応において使用し、そして第三のＰＣＲ反応か
らの７３７bpのＰＣＲ生成物をプライマーＡＰＣＲ１と
共に第四のＰＣＲ反応において使用した。第四のＰＣＲ
反応からの１．１７２kbのＰＣＲ生成物を精製し、Ｈｉ
ｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化し、そして次に再構成ヒ
トＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域を含有する約７００bpの断片
をｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングした。配列決
定した４個のクローンの内２個が正しいアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ配列を有しており、そしてｐＵＣ−Ｒ
Ｖｈ−ＰＭ１ａと命名した。
【０１３５】再構成ＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の他のバー
ジョンをコードするＤＮＡを作製するため５種類の変異
誘発ＰＣＲプライマーを合成した。各ＰＣＲ反応は前記
の反応条件と本質的に同じ条件下で行われた。バージョ
ン「ｂ」のため、変異誘発プライマーｐｈｖ−ｍ４（Ｖ
ａｌ−７１→Ａｒｇ−７１）（番号はＫａｂａｔらによ
る；表４参照）（配列番号：４６）及びＡＰＣＲ４を、
鋳型ＤＮＡとしてのｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ａと共に第
一ＰＣＲ反応において使用した。この第１ＰＣＲ反応か
らのＰＣＲ生成物を精製し、そしてプライマーＡＰＣＲ
１と共に第二ＰＣＲ反応における前方プライマーとして
使用した。第二ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を１．６
％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII
及びＢａｍＨＩにより消化し、そしてｐＵＣ１９にてサ
ブクローニングしてｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂを得た。
【０１３６】同様にして、変異誘発プライマーｐｈｖ−
ｎｍ（Ａｓｐ−１→Ｇｌｎ−１）（配列番号：４７）及
び鋳型ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂを用いてバージョン
「ｃ」をコードするＤＮＡ（ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１
ｃ）を得、変異誘発プライマーｐｈｖ−ｍ６（Ｉｌｅ−
４８→Ｍｅｔ−４８）（配列番号：４８）及び鋳型ｐＵ
Ｃ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂを用いてバージョン「ｄ」をコー
ドするＤＮＡ（ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｄ）を得、変異
誘発プライマーｐｈｖ−ｎｍ及び鋳型ｐＵＣ−ＲＶｈ−
ＰＭ１ｃを用いてバーション「ｅ」をコードするＤＮＡ
（ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｅ）を得、そして変異誘発プ
ライマーｐｈｖ−ｍ７（Ｔｈｒ−２８→Ｓｅｒ−２８、
及びＰｈｅ−２９→Ｉｌｅ−２９）（配列番号：４９）
及び鋳型ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂを用いてバージョン
「ｆ」をコードするＤＮＡ（ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１
ｆ）を得た。再構成Ｈ鎖Ｖ領域バーション「ｆ」のアミ
ノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配列
番号５４に示す。
【０１３７】図７は、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領
域の第一バージョンをコードするＤＮＡの作製において
使用したプライマー及びＰＣＲ反応を模式的に示す。再
構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の第一バージョンをコ
ードするＤＮＡの作製のため、ＣＤＲ１移植プライマー
ｐｋｖ−１（配列番号：５０）、ＣＤＲ２移植プライマ
ーｐｋｖ−２（配列番号：５１）及びＣＤＲ３移植プラ
イマーｐｋｖ−３（配列番号：５２）を合成し、そして
８Ｍ尿素を含有する１２％ポリアクリルアミドゲル上で
精製した。前記のようにしてＰＣＲ反応を行った。第一
ＰＣＲ反応物は1 μＭずつのｐｋｖ−３プライマー及び
ＡＰＣＲ４プライマーを含有した。第一ＰＣＲ反応から
の３５０bpのＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロース
ゲルを用いて精製し、そして第二ＰＣＲ反応における前
方プライマーとして使用した。
【０１３８】第二ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を精製
し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で消化し、そしてＣＤ
Ｒ３が移植されたＤＮＡを含有する５００bp断片をＤＮ
Ａ配列決定のためにｐＵＣ１９ベクターにサブクローニ
ングした。正しい配列を有するプラスミドＤＮＡを同定
し、そして次のＰＣＲ反応における鋳型ＤＮＡとして使
用した。第三ＰＣＲ反応において２５ｐｍｏｌｅの変異
誘発プライマーｐｋｖ−２及びＡＰＣＲ４を使用した。
第三ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を精製し、そしてプ
ライマーｐｋｖ−１と共に第四ＰＣＲ反応におけるプラ
イマーとして使用した。同様にして、第四ＰＣＲ反応か
らのＰＣＲ生成物をＡＰＣＲ１プライマーと共に第五Ｐ
ＣＲ反応におけるプライマーとして使用した。
【０１３９】第五ＰＣＲ反応からの９７２bpのＰＣＲ生
成物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII により消化
し、そしてＤＮＡ配列決定のためにｐＵＣ１９にサブク
ローニングした。ＣＤＲ２領域において問題点が認識さ
れ、さらに２回のＰＣＲ反応が必要であった。第六ＰＣ
Ｒ反応及び第七ＰＣＲ反応において、ｐＵＣ１９ベクタ
ーにクローニングされた第五ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生
成物を鋳型ＤＮＡをして使用した。第六ＰＣＲ反応にお
いてプライマーはｐｋｖ−２及びＡＰＣＲ４であった。
第六ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を精製し、そしてＡ
ＰＣＲ１プライマーと共に第七ＰＣＲ反応におけるプラ
イマーとして使用した。第七ＰＣＲ反応からのＰＣＲ精
製物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII により消化
し、そして５００bp ＤＮＡ断片をＤＮＡ配列決定のた
めにｐＵＣ１９にサブクローニングした。配列決定した
５個のクローンの内２個のクローンが正しいＤＮＡ配列
を有していた。このクローンをｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１
ａと称する。この配列を配列番号：５５に示す。
【０１４０】再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ鎖Ｖ領域の他のバ
ージョンをコードするＤＮＡの作製のため、変異誘発プ
ライマーｐｖｋ−ｍ１（配列番号：５３）を合成した。
ＰＣＲ反応は本質的に前記の通りであった。第一ＰＣＲ
反応において、変異誘発プライマーｐｋｖ−ｍ１（Ｐｈ
ｅ−７１→Ｔｙｒ−７１）及びＡＰＣＲ４プライマーを
鋳型ＤＮＡとしてのｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ａと共に使
用した。第一ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を精製し、
そしてＡＰＣＲ１プライマーと共に第二ＰＣＲ反応にお
けるプライマーとして使用した。第二ＰＣＲ反応からの
ＰＣＲ生成物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII に
より消化し、そしてＤＮＡ配列決定のためにｐＵＣ１９
にサブクローニングした。このクローンをｐＵＣ−ＲＶ
１−ＰＭ１ｂと命名した。
【０１４１】実施例８．遺伝子操作された抗体を哺乳類
細胞中で、発現させるためのヒトサイトメガロウイルス
前期（ＨＣＭＶ）プロモーターを用いるベクターの作製
（図１） キメラＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ断
片及びキメラＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤ
ＮＡ断片を、それぞれ、哺乳類細胞中でヒトκＬ鎖又は
ヒトγ−１Ｈ鎖を発現するように設計されたＨＣＭＶ発
現ベクター（図１を参照のこと）ＨＣＭＶ−ＶL −ＫＣ
κ及びＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ１にまず挿入した。該Ｈ
ＣＭＶ発現ベクターの作製のための詳細な記載は、Ｍａ
ｅｄａら、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９９１）２：１２４−１３
４；Ｃ．Ａ．Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ（１９９１）４：７７
３−７８３に公表されている。両ベクターはｐＳＶ２ｎ
ｅｏ（Ｐ．Ｊ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８２）１：３２７
−３４１）に基礎を置き、そして免疫グロブリンＬ鎖又
はＨ鎖の高レベルの転写のためにヒトサイトメガロウイ
ルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及びエンハンサー（Ｍ．
Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１
−５３０）を含有する。
【０１４２】Ｌ鎖発現ベクターはヒトＣκ領域（Ｔ．
Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｔｓら、Ｃａｒｒ．ＴＯＰ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８４）１１４：１
６６−１７１）をコードするゲノムＤＮＡを含有し、そ
してＨ鎖発現ベクターはヒトＣγ１領域（Ｎ．Ｔａｋａ
ｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ（１９８２）２９：６７１−６
７９）をコードするゲノムＤＮＡを含有する。これらの
ＨＣＭＶ発現ベクターは多能であり、そして種々の哺乳
類細胞タイプにおける一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発
現及び安定な発現のために使用することができる。
【０１４３】実施例９．遺伝子操作された抗体を哺乳類
細胞中で発現させるためのヒトエロンゲーションファク
ター１α（ＨＥＦ−１α）プロモーターを使用するベク
ターの作製（図８及び図９） ヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・フ
アクター１α（ＨＥＦ−１α）は最も豊富な蛋白質の１
つである。これはほとんどの細胞で発現される。ヒトＥ
Ｆ−１αプロモーター−エンハンサーの転写活性はＳＶ
４０前期プロモーター−エンハンサーのそれに比べて約
１００倍である（Ｄ．Ｗ．Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ（１９９
０）９１：２１７−２２３；及びＴ．Ｕｅｔｓｕｋｉ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：５
７９１−５７９８）。２．５kbのＨＥＦ−１αプロモー
ター−エンハンサー領域は、該遺伝子の５′−末端に接
する約１．５kbのＤＮＡ、第一エクソン中の３３bp、第
一イントロン中の９４３bp、及び第二エクソンの最初の
部分の１０bpから成る。
【０１４４】この後２．５kbのＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲ
Ｉ断片をプラスミドｐＥＦ３２１−ＣＡＴ（Ｄ．Ｗ．Ｋ
ｉｍら、Ｇｅｎｅ（１９９０）９１：２１７−２２３；
及びＴ．Ｕｅｔｓｕｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
（１９８９）２６４：５７９１−５７９８）から切り出
し、そしてｐｄＫＣＲベクター（Ｍ．Ｔｓｕｃｈｉｙａ
ら，Ｅｍｂｏ Ｊ．（１９８７）６：６１１−６１
６）、Ｋ．Ｏ′Ｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．３，１５
２７−１５３１，（１９８１）、（Ｒ．Ｆｕｋｕｎａｇ
ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
Ｖａｌ．８１，５０８６−５０９０（１９８４))にク
ローニングして、ＳＶ４０前期プロモーター−エンハン
サーを含有する約３００bpのＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ
断片を置き換えてｐＴＥＦ−１を得た。
【０１４５】ｐＴＥＦ−１をＥｃｏＲＩで消化し、Ｋｌ
ｅｎｏｗポリメラーゼでフィルーインし、そしてＨｉｎ
ｄIII リンカーに連結した。次に、この修飾されたｐＴ
ＥＦ−１ベクターＤＮＡから約１．６kbのＨｉｎｄIII
−ＳｍａＩ断片を切り出した。ＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ
１をＥｃｏＲＩにより部分消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメ
ラーゼによりフィルーインし、そして自己連結すること
により、実施例５において作製したＨＣＭＶ−１２ｈ−
ｇγ１からプラスミドＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１（ΔＥ
２）を作製した。
【０１４６】プラスミドＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１（Δ
Ｅ２）をＥｃｏＲＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラー
ゼでフィルーインし、そしてＨｉｎｄIII で消化した。
ヒトγ−１Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列を含有する約
７kbの断片を、ＨＥＦ−１αプロモーター−エンハンサ
ーを含有する前記の１．６kb ＨｉｎｄIII −ＳｍａＩ
断片に連結してＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１を得た。このベ
クター中のＨＥＦ−１αプロモーター・エンハンサー領
域は、５′−領域に接する３８０bpのＤＮＡを除き、ｐ
ＴＥＦ−１中のそれと同一であった。ＨｉｎｄIII −Ｂ
ａｍＨＩ断片として存在するこのＨ鎖Ｖ領域は、他のＨ
鎖Ｖ領域と容易に交換することができる。
【０１４７】再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ
を含有するＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩＤＮＡ断片をｐＵ
Ｃ−ＲＶｈ−ＰＭ１ａ，ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂ，ｐ
ＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｃ，ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｄ，
ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｅ及びｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１
ｆ（実施例７）から切り出し、そして前記のプラスミド
ＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部
位に挿入して、それぞれ発現ベクターＲＶｈ−ＰＭ１
ａ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｂ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｃ，ＲＶｈ−Ｐ
Ｍ１ｄ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｅ、及びＲＶｈ−ＰＭ１ｆを得
た。発現ベクターＲＶｈ−ＰＭ１ａ，ＲＶｈ−ＰＭ１
ｂ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｃ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｅ、及びＲＶｈ
−ＰＭ１ｆ、並びにＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１は、それぞ
れ再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン
「ａ」，「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」及び「ｆ」、
並びにマウスＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮ
Ａを有する。
【０１４８】Ｌ鎖発現ベクターＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋを
作製するため、ＨＥＦ−１αプロモーター−エンハンサ
ー領域を含有する約３．０kbのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII
断片をＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１ら切り出し、そして実施
例５において作製したＨＣＭＶ−Ｌ鎖発現ベクターＨＣ
ＭＶ−１２ｋ−ｇｋからの約７．７kbのＰｖｕＩ−Ｈｉ
ｎｄIII 断片に連結してＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋを得た。
Ｈ鎖発現ベクターＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１の場合と同様
に、ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片として存在するＨＥ
Ｆ−１２ｋ−ｇｋ中のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡは
他のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡと容易に交換するこ
とができる。なお、プラスミドＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１
は、ＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１（図８）のＥＦ１αプロモ
ーター領域（ＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII 断片）によりＨＣ
ＭＶ−ｐｍｈ−ｇγ１のＨＣＨＶプロモーター領域（Ｐ
ｖｕＩ−ＨｉｎｄIII 断片）を置き換えることにより作
製したものである。
【０１４９】再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ
を含有するＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩＤＮＡ断片をｐＵ
Ｃ−ＲＶ１−ＰＭ１ａ及びｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ｂ
（実施例７）から切り出し、そしてＨＥＦ−１２ｋ−ｇ
ｋのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位に挿入し、それぞれ
発現ベクターＲＶ１−ＰＭ１ａ及びＲＶ１−ＰＭ１ｂを
得た。発現ベクターＲＶ１−ＰＭ１ａ及びＲＶ１−ＰＭ
１ｂ、並びにＨＥＦ−ＰＭK −ｇｋはそれぞれ再構成ヒ
トＬ鎖Ｖ領域「ａ」及び「ｂ」、並びにマウスＰＭ−１
Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを有する。なお、プラ
スミドＨＥＦ−ＰＭK −ｇｋは、ＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋ
（図９）のＥＦ１αプロモーター領域（ＰｖｕＩ−Ｈｉ
ｎｄIII 断片) によりＨＣＭＶ−ｐｍｋａ−ｇｋのＨＣ
ＭＶプロモーター領域（ＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII 断片）
を置き換えることにより作製したものである。
【０１５０】実施例１０．遺伝子操作された抗体をＣＨ
Ｏ細胞中で高レベルで発現させるための、欠陥ＳＶ４０
プロモーター−エンハンサー配列に連結されたジヒドロ
フォレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を用いるベ
クターの作製（図１０及び図１１） ＳＶ４０前期プロモーターからエンハンサー配列を除去
するため、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（Ｓ．Ｓｕｂ
ｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９
８１）１：８５４−８６４）（ＡＴＣＣ３３６９４）を
ＳｐｈＩ及びＰｖｕIIで消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラ
ーゼでフィルーインし、そして自己連結してｐＳＶ２−
ｄｈｆｒ−ΔＥを得た（図１０）。ＨＣＭＶプロモータ
ー、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及びヒトγ−１Ｃ領
域をコードするＤＮＡを含有する約３．７kbのＥｃｏＲ
Ｉ断片を、ＥｃｏＲＩによる部分消化によりＨＣＭＶ−
ＰＭｈ−ｇγ１から切り出した。この断片を、ＥｃｏＲ
Ｉ−消化ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ΔＥに連結してＤＨＦＲ
−ΔＥ−ＰＭｈ−ｇγ１を得た。
【０１５１】ＨＥＦ−１αプロモーター−エンハンサー
を用いるＨ鎖発現ベクターに基いて類似のベクターを作
製した（図１１を参照のこと）。ＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇ
γ１に由来する約３．７kbのＥｃｏＲＩ断片を、Ｅｃｏ
ＲＩ−消化ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ΔＥと連結してＤＨＦ
Ｒ−ΔＥ−１２ｈ−ｇγ１を得た。ＤＨＦＲ−ΔＥ−１
２ｈ−ｇγ１中のｄｈｆｒ配列に続くＢａｍＨＩ部位
を、ＢａｍＨＩによる部分消化、Ｋｌｅｎｏｗポリメラ
ーゼによるフィルーイン及び自己連結により除去した。
ｄｈｆｒ ｃＤＮＡを含有する約４kbのＰｖｕＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片をこの修飾されたＤＨＦＲ−ΔＥ−１２ｈ−
ｇγ１から切り出し、そして実施例１２において作製し
たＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−４からの約３kbのＰｖｕＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片に連結してＤＨＦＲ−ΔＥ−ＲＶｈ−ＰＭｌ
ｆを得た。上記の改良されたプラスミドは本発明の再構
成ヒトＰＭ−１抗体の製造のために使用することができ
る。
【０１５２】実施例１１．再構成ヒトＰＭ−１抗体の種
々のバージョンの発現及び分析 再構成ヒトＰＭ−１抗体のＬ鎖及びＨ鎖を発現する各Ｈ
ＥＦ−１αベクターをＣＯＳ細胞に同時形質転換（ｃｏ
−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）した。標準対照としてキメラＰ
Ｍ−１抗体のＬ鎖及びＨ鎖を発現する各ＨＥＦ−１αベ
クターもＣＯＳ細胞に同時形質転換した。３日後，形質
転換されたＣＯＳ細胞からの培地を集め、そしてＥＬＩ
ＳＡにより（１）上清中に存在するヒトＩｇＧ抗体の量
について、及び（２）ＩＬ−６Ｒに結合するそのＩｇＧ
の能力について分析した。次に、同じサンプルをさら
に、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＩＬ−６ＲへのヒトＩＬ−
６の結合を阻害する該抗体の能力について試験した。
【０１５３】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖を発現する２
種類のベクターの一方（ＲＶ１−ＰＭ１ａ又はＲＶ１−
ＰＭ１ｂ）及びキメラＰＭ−１抗体Ｈ鎖を発現するベク
ター（ＨＣＭＶ−ＰＭｈ−ｇγ１）によりＣＯＳ細胞を
同時形質転換することにより、再構成ヒトＰＭ−１抗体
Ｌ鎖Ｖ領域の２種類のバージョンの評価を行った。細胞
をまた、キメラＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各
ベクター（ＨＣＭＶ−ＰＭｋａ−ｇｋ及びＨＣＭＶ−Ｐ
Ｍｈ−ｇγ１）により同時形質転換した。未精製のＣＯ
Ｓ細胞上清を用いるデーターは、ヒトＩＬ−６Ｒへの結
合についての測定において、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ
鎖のバージョン「ａ」がキメラＰＭ−１抗体Ｌ鎖と同等
であることを示した。
【０１５４】しかしながら、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ
鎖のバージョン「ｂ」はヒトＩＬ−６Ｒへの結合能を実
質的に保持しなかった。これらの結果から、ＦＲ３中の
位置７１のフェニルアラニン（ＣＡＭＰＡＨＴＨ−１Ｈ
のために修飾されたヒトＲＥＩ中に存在する）からチロ
シン（天然ヒトＲＥＩ及びマウスＰＭ−１抗体中に存在
する）への変化は機能的抗原結合部位の形成に対して非
常に有害であることが結論された。再構成ヒトＰＭ−１
抗体Ｈ鎖Ｖ領域の種々のバージョンを評価する次の実績
において、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージ
ョン「ａ」を常に用いた。
【０１５５】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖の発現する６
種類のベクターの１つ（ＲＶｈ−ＰＭ１ａ，ＲＶｈ−Ｐ
Ｍ１ｂ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｃ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｄ，ＲＶｈ
−ＰＭ１ｅ又はＲＶｈ−ＰＭ１ｆ）及び再構成ヒトＰＭ
−１抗体Ｌ鎖のバージョン「ａ」を発現するベクター
（ＲＶ１−ＰＭ１ａ）によりＣＯＳ細胞を同時形質転換
することにより、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の
６種類のバージョンを評価した。細胞を、キメラＰＭ−
１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各ベクター（ＨＥＦ−Ｐ
Ｍｋ−ｇｋ及びＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１）によっても同
時形質転換した。未精製のＣＯＳ細胞上清を用いた予備
データーが示すところによれば、ヒトＩＬ−６Ｒへの結
合についての測定において、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ
鎖のバージョン「ａ」及び再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖
のバージョン「ｆ」は、キメラＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ
鎖と同等であった。
【０１５６】この予備データーを確認するため、キメラ
ＰＭ−１抗体及び再構成ヒトＰＭ−１抗体をＣＯＳ細胞
上清から濃縮そしてプロテインＡを用いて精製した。す
なわち、ＣＯＳ細胞からの培地を１００ｋｄカットオフ
限外濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮した。濃縮
した培地をプロテインＡアガロース（ＡｆｆｉＧｅｌＰ
ｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳIIキット、ＢｉｏＲａｄ）
を用いて精製した。要約すれば、濃縮された培地を、５
ベッドボリウムの結合緩衝液により平衡化されたプロテ
インＡアガロースカラムに適用した。このカラムを１５
ベッドボリウムの結合緩衝液で洗浄し、そして次に５ベ
ッドボリウムの溶出緩衝液で溶出を行った。そしてマイ
クロコンセントレーター（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０，
Ａｍｉｃｏｎ）を用いて溶出液を濃縮し、溶出緩衝液を
ＰＢＳに置換した。
【０１５７】キメラＰＭ−１抗体、及び再構成ヒトＬ鎖
Ｖ領域のバージョン「ａ」と再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域のバ
ージョン「ａ」，「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」又は
「ｆ」とから成る再構成ヒトＰＭ−１抗体の精製された
サンプルの分析を行った。Ｌ鎖の「ａ」バージョン＋Ｈ
鎖の「ｆ」バージョンが明らかに最良の再構成ヒトＰＭ
−１抗体であった。このものは、キメラＰＭ−１抗体と
同様にヒトＩＬ−６Ｒに結合する（図１３）。これはま
た、マウス抗体及びキメラ抗体と同様に、ヒトＩＬ−６
がヒトＩＬ−６Ｒに結合するのを阻害する（図１４）。
【０１５８】実施例１２．発現レベルを改良するための
再構成ヒトＰＭ−１Ｖ領域の修正 再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域（配列番
号：５４及び５５）のリーダー配列をコードするＤＮＡ
配列内のイントロンを除去するため、Ｖ領域をコードす
るｃＤＮＡをＰＣＲプライマーを用いて再クローニング
した。Ｌ鎖及びＨ鎖の発現ベクターＲＶ１−ＰＭ１ａ及
びＲＶｈ−ＰＭ１ｆをＣＯＳ細胞に同時形質転換した。
４８時間後、全ＲＮＡを調製し（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８：５２９４
−５２９９）、そしてマウス抗体Ｖ領域のＰＣＲクーロ
ニングについて記載したようにして一本ｃＤＮＡ合成の
ために５μｇの全ＲＮＡを用いた。３種類のＰＣＲプラ
イマーを設計し、そして合成した。ＬＥＶ−Ｐ１（配列
番号：６０）及びＨＥＶ−Ｐ１（配列番号：５８）はス
プライスドナー配列及びＢａｍＨＩ部位を含有し、そし
てそれぞれＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域のための前方プライマ
ーとして使用した。
【０１５９】ＨＥＶ−Ｐ２（配列番号：５９）はＨｉｎ
ｄIII 部位及びＡＴＧ開始コドンの前のＫｏｚａｋコン
センサス配列を含有し、そしてＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域の
ための後方プライマーとして使用した。１００μｌずつ
のＰＣＲ反応物は２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
８），１０mM ＫＣｌ，１０mM （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4，
２mM ＭｇＳＯ4 ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０，０．１μｇのＢＳＡ，２５０μＭ ｄＮＴＰ，２．
５ｕのＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ．Ｌａｂ
ｓ，Ｕ．Ｋ．）、５０％の一本ｃＤＮＡ合成反応物並び
に１００ｐｍｏｌｅずつの前方プライマー及び後方プラ
イマーを含有した。
【０１６０】各ＰＣＲチューブは５０μｌの鉱油で覆
い、そして９４℃にて１．５分間の最初の変性の後、９
４℃にて１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分
間のサイクル反応を３０回行い、そして次に７２℃にて
１０分間インキュベートした。Ｌ鎖Ｖ領域を含有する４
０８bpのＰＣＲ生成物及びＨ鎖Ｖ領域を含有する４４４
bpのＰＣＲ生成物を、２．０％低融点アガロースゲルを
用いて精製し、そしてＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII によ
り消化し、そしてｐＵＣ１９ベクターにサブクローニン
グし、それぞれｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ａ−３及びｐＵ
Ｃ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−３を得た。
【０１６１】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ
領域のＤＮＡ配列は不適切なスプライスドナー部位及び
アクセプター部位を含有することが明らかになった（配
列番号：５４及び５５を参照のこと）。Ｌ鎖Ｖ領域内の
これらの部位は高頻度には使用されない（ｍＲＮＡの約
１０％）が、Ｈ鎖Ｖ領域内のこれらの部位は高頻度で使
用される（ｍＲＮＡの約９０％）。この異常なスプライ
シングが再構成ヒトＰＭ−１抗体の低レベルの発現をも
たらした。Ｖ領域の異常なスプライシングを回避するた
め、スプライス−ドナー部位をＰＣＲ法により除去し
た。Ｈ鎖Ｖ領域について、後方プライマーＮＥＷ−ＳＰ
１（配列番号：６１）及び前方プライマーＮＥＷ−ＳＰ
２（配列番号６２）を合成した。このプライマーはＤＮ
Ａ配列ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＧＡをＤＮＡ配列ＴＧＧ Ｇ
ＴＴ ＣＧＣに変える。ＰＣＲ反応の条件はｃＤＮＡの
クローニングについて前記した通りであったが、鋳型Ｄ
ＮＡは５０ngのｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−３であり、
そしてプライマーはＨＥＶ−Ｐ２とＮＥＷ−ＳＰ２、又
はＨＥＦ−Ｐ１とＮＥＷ−ＳＰ１のいずれかであった。
【０１６２】２個のＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を２
％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そしてＰＣＲ
連結反応において使用した。０．５μｇの第一ＰＣＲ生
成物を含有する９８μｌのＰＣＲ反応物及び５ユニット
のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを９４℃にて２分間、
５０℃にて２分間及び７２℃にて５分間インキュベート
し、そして次に１００ｐｍｏｌｅずつのＨＥＶ−Ｐ１プ
ライマー及びＨＥＶ−Ｐ２プライマーを加えた。ＰＣＲ
チューブを３０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて１
分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間の２５サ
イクルのＰＣＲにかけ、そして次に７２℃にて１０分間
インキュベートした。
【０１６３】同様にして、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖
Ｖ領域中のスプライス−ドナー領域をＰＣＲプライマー
ＲＥＩ−ＳＰ１（配列番号：６３）及びＲＥＩ−ＳＰ２
（配列番号：６４）を用いて除去した。該プライマーは
ＤＮＡ配列ＣＡＧ ＧＴＡＡＧＧをＤＮＡ配列ＣＡＧ
ＧＡＡ ＡＧＧに変える。両ＰＣＲ生成物、すなわちＬ
鎖Ｖ領域についての４０８bpのＤＮＡ断片及びＨ鎖Ｖ領
域についての４４４bpのＤＮＡ断片を２．０％低融点ア
ガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII及びＢａｍ
ＨＩにより消化し、そして配列決定のためｐＵＣ１９に
サブクローニングしてｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ａ−４及
びｐＵＣ−ＲＶｈ−ＲＭ１ｆ−４を得た。
【０１６４】ＲＶｈ−ＰＭ１ｆのＨｉｎｄIII −Ｂａｍ
ＨＩ断片を、ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−４のＨｉｎｄ
III −ＢａｍＨＩ領域と置き換えることにより、ＲＶｈ
−ＰＭ１ｆ−４を得た。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ
領域のイントロンが除去されたバージョン「ａ」の配列
を配列番号５７に示し、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ
領域のイントロンが除去されたバージョン「ｆ」の配列
を配列番号５６に示す。
【０１６５】実施例１３．再構成ヒトＡＵＫ１２−２０
抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの作製 再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードす
るＤＮＡの作製の工程を図１６に示す。鋳型となるヒト
抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子は、制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII 及びＢａｍＨＩ部位を用いてｐＵＣ１９ベクター
に組み込まれている。８個のＰＣＲプライマー（Ａ〜
Ｈ）を準備し、第１のＰＣＲにより、Ｖ領域をコードす
る遺伝子を４つの領域に分けて増幅させる。プライマー
Ａ及びＨは、ｐＵＣ１９ベクター上のＤＮＡ配列と相補
性を持つ。プライマーＢ，Ｃ及びＤは、それぞれ移植す
るＣＤＲ領域の遺伝子配列を有する４０〜６０bpのプラ
イマーである。
【０１６６】プライマーＥ，Ｆ及びＧは、それぞれプラ
イマーＢ，Ｃ及びＤの５′側１５〜２０bpのＤＮＡ配列
と相補性を持つ。４個の第１ＰＣＲは、それぞれプライ
マーＡとＥ、ＢとＦ、ＣとＧ、及びＤとＨを用いる。Ｐ
ＣＲ生成物Ａ−ＥはＦＲ１をコードし、Ｂ−ＦはＣＤＲ
１とＦＲ２をコードする。Ａ−Ｅ断片の３′側とＢ−Ｆ
断片の５′側は１５〜２０bpの相補性を持つので、後
に、これら断片を連結することが可能となる。同様に、
Ｂ−Ｆ断片は、ＣＤＲ２及びＦＲ３をコードするＣ−Ｇ
断片とも相補性を持つ。そして、Ｃ−Ｇ断片はさらに、
ＣＤＲ３とＦＲ４をコードするＤ−Ｈ断片とも相補性を
持つ。こうしてこれら４種の断片は、互いの相補性によ
り連結が可能となる。
【０１６７】ＰＣＲ反応液中にてこれら４つの断片の連
結反応を行った後、プライマーＡ及びＨを加える事によ
り、正しく４つの断片が連結したものが、この第２のＰ
ＣＲによって増幅してくる。こうして得られた第２のＰ
ＣＲ生成物は、３つの移植されたＣＤＲを有し、Ｈｉｎ
ｄIII 及びＢａｍＨＩの消化後、ｐＵＣ１９ベクターに
サブクローニングする。さらに具体的には、鋳型として
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」を
コードするＤＮＡがプラスミドｐＵＣ１９に挿入されて
いるプラスミドｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ａ−４を用い
た。前記プライマーＡ〜Ｈは次の配列を有する。
【０１６８】
【表１０】
【０１６９】ＣＤＲ移植用の後方プライマー１２２０−
Ｌ１，１２２０−Ｌ２及び１２２０−Ｌ３については、
８Ｍ尿素を含む１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて
精製後使用した。１００μｌずつのＰＣＲ反応物は２０
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．８），１０mM ＫＣｌ，
１０mM (ＮＨ4)2 ＳＯ4 ，２mM ＭｇＳＯ4 ，０．１
％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，０．１μｇのＢＳＡ，
２５０μｍ ｄＮＴＰ，５ｕのＶｅｎｔ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（ＢｉｏＬａｂｓ．Ｕ．Ｋ．），５０ngのｐＵＣ
−ＲＶｌ−ＰＭ１ａ−４ ＤＮＡ、そして各１００ｐｍ
ｏｌｅｓの前方及び後方プライマーを含有した。各ＰＣ
Ｒチューブは５０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて
１．５分間の最初の変性の後、９４℃にて１分間、５０
℃にて１分間及び７２℃にて１分間の反応を３０サイク
ル行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベート
した。
【０１７０】２５２bp（Ａ−Ｅ），９６bp（Ｂ−Ｆ），
１３０bp（Ｃ−Ｇ）及び１２３bp（Ｄ−Ｈ）の各ＰＣＲ
生成物を２．０％の低融点アガロース（ＦＭＣ，Ｂｉ
ｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＵＳＡ）ゲルを用いて精製し
た。すなわち、各ＤＮＡ断片を含有するアガロース片を
切り取りそして６５℃にて５分間溶融せしめ、そしてこ
れと同容積の２mM ＥＤＴＡ及び２００mMＮａＣｌを含
有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）を加え
た。この混合物をフェノール及びクロロホルムにより抽
出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈澱により回収
し、そして１mM ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解し、そしてＰＣＲ連結反応
において使用した。
【０１７１】次に、０．２μｇの各第１のＰＣＲ生成物
及び５ユニットのＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを含有
する９８μｌのＰＣＲ反応液を９４℃にて２分間、５０
℃にて２分間及び７２℃にて５分間インキュベートし、
連結反応を行った。そして次に、各１００ｐｍｏｌｅの
Ａ（ＲＥＶＥＲＳＥ）及びＨ（ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ）プ
ライマーを加えて反応液を１００μｌとした後、これを
５０μｌの鉱油でおおい、そして９４℃にて１分間、５
０℃にて１分間及び７２℃にて１分間の反応を３０サイ
クル行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベー
トした。
【０１７２】マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２
０のＬ鎖のＣＤＲが移植されたＬ鎖Ｖ領域をコードする
ＤＮＡを含有する５５８bpの第２ＰＣＲの生成物を２．
０％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そしてＢａ
ｍＨＩ及びＨｉｎｄIII により消化後、ｐＵＣ１９ベク
ターにサブクローニングし、塩基配列を確認し、ｐＵＣ
−ＲＶL −１２２０ａを得た。得られたＬ鎖Ｖ領域のア
ミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配
列表７１に示す。次いで、Ｌ鎖発現ベクターを構築する
ため、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領域を含
有するＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を上記プラ
スミドｐＵＣ−ＲＶL −１２２０ａから切り出し、Ｌ鎖
発現ベクターＨＥＦ−１２κ−ｇκのＨｉｎｄIII −Ｂ
ａｍＨＩ部位に挿入し、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗
体Ｌ鎖Ｖ領域バージョンａの発現ベクターであるＲＶL
−１２２０ａを得た。
【０１７３】実施例１４．再構成ヒトＡＵＫ１２−２０
抗体Ｌ鎖の発現及び分析 ＣＯＳ細胞での一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現 再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖を発現するベクタ
ーＲＶL −１２２０ａ及びキメラＡＵＫ１２−２０抗体
Ｈ鎖を発現するベクター、ＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１（実
施例５）によりＣＯＳ細胞を同時形質転換することによ
り、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖バージョン
「ａ」の評価を行った。すなわち、ＣＯＳ細胞を１×１
０7 個／mlになるようにｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆ
ｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に懸濁し、この細胞浮
遊液０．８mlにＤＮＡ（各プラスミドについて１０μ
ｇ）を加えた。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓａｒ装置（ＢｉｏＲ
ａｄ）を用い１，９００ボルト（Ｖ）、２５マイクロフ
ァラッド（μＦ）の電気容量にてパルスを与えた。
【０１７４】室温にて１０分間の回復期間の後、エクレ
トロポレーションした細胞を、１０％のウシ胎児血清
（γ−グロブリン不含）を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩ
ＢＣＯ）２０mlに加えた。７２時間のインキュベーショ
ンの後、培養上清を集め、遠心分離して細胞破片を除去
し、そして無菌条件下で４℃にて短時間、又は−２０℃
にて長時間貯蔵した。
【０１７５】酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるヒト
様抗体の定量 トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の培養上清をＥＬＩ
ＳＡにより測定して、キメラ抗体が生産されていること
を確認した。ヒト様抗体を検出するため、プレートをヤ
ギの抗ヒトＩｇＧ（Ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）
（Ｓｉｇｍａ）によりコートした。ブロックした後、Ｃ
ＯＳ細胞からの培養上清を段階希釈しそして各ウエルに
加えた。プレートのインキュベーション及び洗浄の後、
アルカリホスファターゼ−結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ
鎖特異的、Ｓｉｇｍａ）を加えた。インキュベーション
及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。さらにインキュベ
ーションした後、反応を停止しそして４０５nmにおける
吸光度を測定した。標準として精製ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇ
ｍａ）を用いた。
【０１７６】ヒトＩＬ−６Ｒへの結合能を確認するため
の酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ） トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの上清をＥＬＩ
ＳＡにより測定して、生産されたヒト様抗体が抗原ＩＬ
−６Ｒに結合し得るか否かを決定した。抗原への結合の
検出のため、プレートをＭＴ１８マウスモノクローナル
抗体（参考例１）でコートした。１％ ＢＳＡでブロッ
クした後、可溶性組換えヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）
をプレートに加えた。プレートを洗浄した後、ＣＯＳ細
胞からの培養上清を段階希釈し、そして該プレートの各
ウエルに加えた。インキュベーション及び洗浄の後、ア
ルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧをウエル
に加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝
液を加えた。インキュベーションの後、反応を停止し、
そして４０５nmにおける吸光度を測定した。
【０１７７】この結果を図１７に示す。再構成ヒトＡＵ
Ｋ１２−２０抗体Ｌ鎖バージョン「ａ」とキメラＡＵＫ
１２−２０抗体Ｈ鎖の組み合せによるヒト様抗体は、キ
メラＡＵＫ１２−２０抗体と同様にヒトＩＬ−６Ｒに対
する強い結合能を示し、サンプルの希釈度依存的に４０
５nmにおける吸光度が変化し、サンプル中にＩＬ−６Ｒ
に対する抗体が含まれていることが確認された。また、
この結果は、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖のバ
ージョン「ａ」がキメラＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖と同
様に抗原結合能を持つことを示している。
【０１７８】実施例１５．ヒトサブグループＩ（ＨＳＧ
Ｉ）コンセンサス配列を用いた再構成ヒトＡＵＫ１２−
２０抗体Ｈ鎖遺伝子の構築 実施例１３で示した方法と同様にして、ＡＵＫ１２−２
０抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲをヒトサブグループＩのコン
センサス配列をＦＲとして有する再構成ヒトＶ H ａ４２
５（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４，７７３−７８３，１９９
１）に移植した。まず、再構成ヒトＶHａ４２５（上記
文献中、Ｆｉｇ３）をコードするＨｉｎｄIII −Ｂａｍ
ＨＩ ＤＮＡ断片をプラスミドＨＣＭＶ−ＲＶHa−４２
５−γ１から切り出し、ｐＵＣ１９ベクターのＨｉｎｄ
III −ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、ｐＵＣ−
ＲＶH −４２５ａを得た。
【０１７９】これを鋳型ＤＮＡとして使用した。ＰＣＲ
に用いる８個のプライマー（Ａ１〜Ｈ１）を合成した。
プライマー１２２０−Ｈ１は、ＣＤＲ１の移植及びＴｈ
ｒ−２８からＳｅｒ−２８の変更を誘導する様にデザイ
ンし、プライマー１２２０−Ｈ３はＣＤＲ３の移植及び
Ｓｅｒ−９４からＡｒｇ−９４への変異を誘導する様に
デザインした。プライマー１２２０−Ｈ１，１２２０−
Ｈ２及び１２２０−Ｈ３は、それぞれ８Ｍ尿素を含む１
２％ポリアクリルアミドゲルを用いて精製後、使用し
た。各プライマーのヌクレオチド配列は次の通りであ
る。
【０１８０】
【表１１】
【０１８１】ＰＣＲの条件は、鋳型ＤＮＡとしてｐＵＣ
−ＲＶH −４２５ａを使用し、Ｈ鎖ＣＤＲ移植用プライ
マーとして上記のものを使用した以外は実施例１３に記
載したのと同じであった。Ａ１とＥ１、Ｂ１とＦ１、Ｃ
１とＧ１、及びＤ１とＨ１のプライマー対を用いて第１
ＰＣＲ反応を行い、それぞれ１８６bp（Ａ１−Ｅ１），
７５bp（Ｂ１−Ｆ１），１７３bp（Ｃ１−Ｇ１）及び１
０５bp（Ｄ１−Ｈ１）の各第１ＰＣＲ生成物を２．０％
の低融点アガロースゲルにて精製し、次の第２ＰＣＲ連
結反応において使用した。
【０１８２】実施例１３にて示した条件に従い、各０．
２μｇの上記第１ＰＣＲ生成物を用いて第２ＰＣＲ（Ｐ
ＣＲ連結反応を含む）を行い、マウスＡＵＫ１２−２０
抗体のＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲが移植されたヒトＨ鎖Ｖ領域を
含有する４９５bpのＰＣＲ生成物を得、これを２．０％
低融点アガロースゲルを用いて精製した。そしてＢａｍ
ＨＩ及びＨｉｎｄIII により消化後、得られたＢａｍＨ
Ｉ−ＨｉｎｄIII 断片をｐＵＣ１９ベクターにサブクロ
ーニングし、塩基配列を確認して、ｐＵＣ−ＲＶH −１
２２０ａを得た。
【０１８３】ところで、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗
体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列を調らべた結果、
スプライスの供与配列とよく一致する配列が見い出され
た。この事は、再構成ヒトＰＭ−１抗体の作成時に問題
となった異常なスプライシングを引き起す可能性があ
る。そこで、この配列をＰＣＲ法により変異させた。変
異誘導プライマーとして、ＳＧＩ−ＳＰ１（配列番号９
７）及びＳＧＩ−ＳＰ２（配列番号９８）を合成した。
このプライマーは、ＤＮＡ配列ＡＡＧ ＧＴＧＡＧＣを
ＤＮＡ配列ＡＡＡ ＧＴＣ ＡＧＣに変える。ＰＣＲ反
応の条件は、前記条件と同様に行い、鋳型ＤＮＡは５０
ngのｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ａであり、そしてプライ
マーはＳＧＩ−ＳＰ１とＵＮＩＶＥＲＳＡＬ（配列番号
８２）、またはＳＧＩ−ＳＰ２とＲＥＶＥＲＳＥ（配列
番号８３）のいずれかであった。
【０１８４】２個のＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を２
％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そしてＰＣＲ
連結反応において使用した。各０．２μｇの第１ＰＣＲ
生成物及び５ｕのＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを含有
する９８μｌのＰＣＲ反応液を９４℃にて２分間、５０
℃にて２分間、及び７２℃にて５分間インキュベートし
連結反応を行った。そして次に１００ｐｍｏｌｅずつの
ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ及びＲＥＶＥＲＳＥプライマーを加
え、５０μｌの鉱油でおおった後、９４℃にて１分間、
５０℃にて１分間そして７２℃にて１分間の第２ＰＣＲ
を３０サイクル行い、そして次に７２℃にて１０分間イ
ンキュベートした。第２ＰＣＲで得られた４９５bpのＤ
ＮＡ断片を２．０％低融点アガロースゲルを用いて精製
し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、これを
ｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングした後、塩基配
列を確認して、ｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ａ−２を得
た。
【０１８５】次いで、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体
Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含有するＨｉｎｄIII
−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を上記ｐＵＣ−ＲＶH −１２
２０ａ−２より切り出し、Ｈ鎖発現ベクターＨＥＦ−１
２ｈ−ｇγ１のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ部位に導入
し、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖のバージョン
ａの発現ベクターであるＲＶH −１２２０ａを得た。
【０１８６】再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領
域の他のバージョン（ｂ〜ｄ）をコードするＤＮＡを作
成するために２組の変異誘発ＰＣＲプライマーを合成し
た。各ＰＣＲ反応は前記の反応条件と本質的に同じ条件
下で行われた。バージョン「ｂ」をコードするＤＮＡの
作成のため、２種の第１ＰＣＲにおいて、ＵＮＩＶＥＲ
ＳＡＬプライマー（配列番号８２）及び変異誘発プライ
マー１２２０Ｈ−ｍ１ａ（配列番号７８）、あるいは、
ＲＥＶＥＲＳＥプライマー（配列番号８３）と変異誘発
プライマー１２２０Ｈ−ｍ１ｂ（配列番号７９）の各Ｐ
ＣＲプライマー、並びに鋳型ＤＮＡとしてのｐＵＣ−Ｒ
ＶH −１２２０ａを用いた。それぞれ２０２bp及び３２
３bpの第１ＰＣＲ生成物を２．０％低融点アガロースゲ
ルを用いて精製後、前記の反応条件と同様に第２ＰＣＲ
（ＰＣＲ連結反応を含む）を行い、４９５bpの生成物
（バージョン「ｂ」）を得た。これをＨｉｎｄIII −Ｂ
ａｍＨＩにより消化し、そして、ｐＵＣ１９ベクターに
サブクローニングし、ｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｂを得
た。
【０１８７】同様にして、変異誘発プライマー１２２０
Ｈ−ｍ２ａ（配列番号８０）、１２２０Ｈ−ｍ２ｂ（配
列番号８１）及びこの生成物を鋳型ｐＵＣ−ＲＶH −１
２２０ａを用いてＰＣＲ生成物（バージョン「ｃ」をコ
ードするＤＮＡ）を得、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで
消化し、ｐＵＣ１９ベクターのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨ
Ｉ部位に挿入してｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｃを得た。
さらに、変異誘発プライマー１２２０Ｈ−ｍ１ａ（配列
番号７８）、１２２０Ｈ−ｍ１ｂ（配列番号７９）及び
鋳型としてのｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｃを用いてＰＣ
Ｒ生成物（バージョンｄ）を得、これをＨｉｎｄIII 及
びＢａｍＨＩで消化してｐＵＣ１９ベクターのＨｉｎｄ
III −ＢａｍＨＩ部位に挿入することによりｐＵＣ−Ｒ
ＶH −１２２０ｄを得た。
【０１８８】なお、プラスミドｐＵＣ−ＲＶH −１２２
０ｂ中にコードされているの再構成ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域
バージョン「ｂ」のアミノ酸配列及びそれをコードする
ヌクレオチド配列を配列番号８４に示し、ｐＵＣ−ＲＶ
H −１２２０ｄ中にコードされている再構成ヒトＨ鎖Ｖ
領域バージョン「ｄ」のアミノ酸配列及びそれをコード
するヌクレオチド配列を配列表８５に示す。
【０１８９】次いで、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体
Ｈ鎖の各バージョンの発現ベクターを構築するために、
再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードす
るＤＮＡを含むＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片をｐＵＣ
−ＲＶH −１２２０ｂ，ｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｃ、
及びｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｄより切り出し、Ｈ鎖発
現ベクターＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１のＨｉｎｄIII −Ｂ
ａｍＨＩ部位に挿入して、各バージョンの発現ベクター
ＲＶH −１２２０ｂ，ＲＶH −１２２０ｃ、及びＲＶH
−１２２０ｄをそれぞれ得た。
【０１９０】実施例１６．再構成ヒトＡＵＫ１２−２０
抗体の種々のバージョンの発現及び分析 再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖を発現する４種類
のベクターの１つ（ＲＶH −１２２０ａ，ＲＶH −１２
２０ｂ，ＲＶH −１２２０ｃ、またはＲＶH −１２２０
ｄ）及び再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖を発現す
るベクターＲＶ L −１２２０ａによりＣＯＳ細胞を同時
形質転換することにより、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０
抗体Ｈ鎖Ｖ領域の４種類のバージョンを評価した。
【０１９１】比較のため、ＣＯＳ細胞をキメラＡＵＫ１
２−２０抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各ベクター（ＨＥ
Ｆ−１２ｈ−ｇγ１及びＨＥＦ−１２κ−ｇκ）によっ
ても同時形質転換した。ヒトＩＬ−６Ｒへの結合につい
ての測定において、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ
鎖と再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖のバージョン
「ｂ」、あるいは再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖
と再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖のバージョン
「ｄ」との組み合せによる再構成ヒト１２−２０抗体
は、キメラＡＵＫ１２−２０抗体と同等の結合活性を示
した。これらの結果を図１８及び図１９に示す。
【０１９２】実施例１７．ヒト抗体ＨＡＸを用いた再構
成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖遺伝子の構築 マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＨ鎖Ｖ領
域と最も相同性の高いヒト抗体は、タンパクデータベー
ス“Ｌｅｅｄｓ”の検索により、ＨＡＸであった（Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３９，２４９６−２５０１，
１９８７，ＳＬＥ患者由来Ｂ ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ ２１／２８の産生する抗体、遺伝子配列はＦｉ
ｇ．４，５に、アミノ酸配列はＦｉｇ．６に記載）。再
構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計を、Ｈ
ＡＸ抗体のＦＲ領域とマウスモノクローナル抗体ＡＵＫ
１２−２０のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲを用いて行った。
【０１９３】マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２
０のＨ鎖Ｖ領域の第一バージョン（Ｓｌｅ１２２０Ｈ
ａ）のＣＤＲを含む再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ
鎖Ｖ領域をコードする全ＤＮＡは化学合成にて作成し
た。すなわち、全長４３９bpのＳｌｅ１２２０Ｈａをコ
ードするＤＮＡを各々２１bpの重複部位を有する９０〜
９４bpの長さの６本のオリゴヌクレオチド（ｓｌｅ１２
２０ｈ１〜６；それぞれ、配列番号８６〜９１）に分け
て設計した。オリゴヌクレオチドの設計にあたり、２次
構造の検索を行ない、構造上に問題のある部位に関し
て、アミノ酸置換がおきない様に、コドンの第３塩基を
変換した。これらのオリゴヌクレオチドの相互関係及び
２本鎖合成ＤＮＡの完成までの過程を図２０に示す。
【０１９４】ＰＣＲ法を用いて図２０に示す反応を行
う。すなわち６本の合成オリゴヌクレオチドを同一ＰＣ
Ｒ反応チューブに加え、第１のＰＣＲ反応を行う。これ
により、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリング伸長
を行うことができ、さらに、４つのオリゴヌクレオチ
ド、または、全長のオリゴヌクレオチドを得ることがで
きる。次に、末端プライマーＡ（配列番号９２）及びＢ
（配列番号９３）を加え、第２のＰＣＲ反応を行うこと
で、正しく全長を有するオリゴヌクレオチドのみを増幅
することができる。得られた生成物を精製し、ＢａｍＨ
Ｉ及びＨｉｎｄIIIにより消化後、ｐＵＣ１９ベクター
にサブクローニングしてシークエンスを行う。
【０１９５】具体的には、１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH８．３），５０mM ＫＣｌ，０．１mM ｄＡＴＰ，
０．１mM ｄＧＴＰ，０．１mM ｄＣＴＰ，０．１mM
ｄＴＴＰ，１．５mM ＭｇＣｌ2 及び２．５ｕのＤＮＡ
ポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ Ｃｅｔｕｓ）並びに各オリゴヌクレオチド５ｐｍ
ｏｌｅを含有する９８μｌの反応混合物を９４℃１．５
分間の変性後、９４℃３分間、５０℃２分間、７２℃５
分間の反応を３サイクル行い、次に７２℃にて１０分間
インキュベートした。
【０１９６】反応液に５０μＭの末端プライマーＡおよ
びＢを１μｌずつ加え、８０μｌの鉱油で覆い、９４℃
１．５分間の変性後、９４℃にて１分間、５０℃にて１
分間、７２℃１分間の反応を３０サイクル行い、続いて
７２℃で１０分間インキュベートした。４３９bpのＰＣ
Ｒ生成物を１．５％の低融点アガロースゲルを用いて精
製し、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII により消
化後、ｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングして、塩
基配列を確認した。得られたクローンをｐＵＣ−ＲＶH
−ｓｌｅ１２２０Ｈａとした。このプラスミド中にコー
ドされている再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体のＨ鎖Ｖ
領域バージョン「ａ」のアミノ酸配列及びそれをコード
するヌクレオチド配列を配列番号９４に示す。
【０１９７】次いで、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０（ｓ
ｌｅ１２２０Ｈａ）抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子
を含有するＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片をｐ
ＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈａより切出し、Ｈ鎖発
現ベクターＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１のＨｉｎｄIII −Ｂ
ａｍＨＩ部位に導入し、ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈａを
得た。
【０１９８】再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領
域の他のバージョン（「ｂ」〜「ｄ」）を作成するた
め、２つの変異誘発プライマーｓｌｅ１２２０Ｈｍ１
（配列番号９５）、及びｓｌｅ１２２０Ｈｍ２（配列番
号９６）を合成した。各ＰＣＲ反応では、実施例１３で
示されているＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ及び反応液
組成を用いた。各ＰＣＲ反応では、バージョン「ｂ」及
びバージョン「ｃ」については、鋳型としてのｐＵＣ−
ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈａ，５０ｐｍｏｌｅの変異誘
発プライマーｓｌｅ１２２０Ｈｍ１またはｓｌｅ１２２
０Ｈｍ２及び５０ｐｍｏｌｅの末端プライマーＢを含有
する反応混合物を９４℃１．５分間の変性の後、９４℃
１分、５０℃１分、７２℃１分の３０サイクルの反応に
かけ、次に７２℃で１０分間インキュベートした。
【０１９９】２３５bpまたは１７８bpの生成物を１．５
％の低融点アガロースゲルを用いて精製し、第２のＰＣ
Ｒ反応のプライマーとして使用した。すなわち、５０ｐ
ｍｏｌｅの末端プライマーＡと、０．２μｇのＰＣＲ生
成物を加え、ｐＵＣ−ＲＶH−ｓｌｅ１２２０Ｈａを鋳
型として、第２ＰＣＲ反応を行い、４３９bpの生成物を
１．５％低融点アガロースゲルで精製、ＢａｍＨＩ及び
ＨｉｎｄIII で消化後ｐＵＣ１９ベクターにサブクロー
ニングして、それぞれ構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ
鎖Ｖ領域バージョン「ｂ」又は「ｃ」をコードするプラ
スミドｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｂ又はｐＵＣ
−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｃを得た。
【０２００】再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領
域バージョン「ｄ」をコードするＤＮＡは次の様にして
作製した。鋳型としてのｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２
０Ｈｂを用いた。変異誘導プライマーｓｌｅ１２２０Ｈ
ｍ２及び末端プライマーＢを５０ｐｍｏｌｅずつ用いて
第１のＰＣＲ反応を３０サイクル行った。得られた１７
８bpのＰＣＲ生成物を１．６％の低融点アガロースゲル
により精製し、第２のＰＣＲのプライマーとして用い
た。このプライマーと５０ｐｍｏｌｅの末端プライマー
Ａを用いて第２のＰＣＲを行い、４３９bpのＤＮＡ断片
を得た。これを、精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII
にて消化後ｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングし、
ヌクレオチド配列を確認し、ｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１
２２０Ｈｄを得た。
【０２０１】次いで、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体
Ｈ鎖の各バージョンの発現ベクターを構築するため、再
構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする
ＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片をｐＵＣ−
ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｂ，ｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ
１２２０Ｈｃ、およびｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０
Ｈｄより切り出し、Ｈ鎖発現ベクターＨＥＦ−１２ｈ−
ｇγ１のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ部位に挿入して、各
発現ベクター、ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｂ，ＲＶH −
ｓｌｅ１２２０ＨｃおよびＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｄ
をそれぞれ得た。
【０２０２】分 析 再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖を発現する４種類
のベクターのうちの１つ（ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈ
ａ，ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｂ，ＲＶH −ｓｌｅ１２
２０ＨｃまたはＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｄ）および、
再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖を発現するベクタ
ーＲＶL −１２２０ａを用いてＣＯＳ細胞を同時形質転
換することにより、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ
鎖Ｖ領域の４種類のバージョンを、ＩＬ−６ＲへのＩＬ
−６の結合を阻害する能力について評価した。この結果
を図２１〜２４に示す。なお、これらの結果は、生産さ
れた抗体をプロテインＡによって精製した後に得られた
ものである。
【０２０３】上記のごとく、本発明によれば、キメラＬ
鎖もしくは再構成Ｌ鎖又はキメラＨ鎖もしくは再構成Ｈ
鎖のＶ領域、そして特にＦＲ中の１個又は複数個のアミ
ノ酸を他のアミノ酸に置換してもなおヒトＩＬ−６Ｒに
結合する能力を維持している。従って本発明は、その本
来の性質を維持している限り、１個又は複数のアミノ酸
が他のアミノ酸により置換されている、キメラ抗体及び
再構成ヒト抗体、キメラＬ鎖及び再構成Ｌ鎖、キメラＨ
鎖及び再構成Ｈ鎖、再構成Ｌ鎖Ｖ領域、並びに再構成Ｈ
鎖Ｖ領域、並びにこれらをコードするＤＮＡをも包含す
る。
【０２０４】参考例 本発明において使用される出発ハイブリドーマは次の様
にして作製された。参考例１ ．ハイブリドーマ ＭＴ１８の作製 ヒトＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマを作製するため、免疫原として、細胞表
面にヒトＩＬ−６Ｒを発現するマウスＴ細胞を次の様に
して作製した。すなわち、Ｙ．Ｈｉｒａｔａら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１４３，２９００−２９０６
（１９８９）に開示されているプラスミドｐＺｉｐｎｅ
ｏ ＩＬ−６Ｒを常法に従ってマウスＴ細胞系ＣＴＬＬ
−２（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２１４）にトランスフェクト
し、生ずる形質転換体を常法に従ってＧ４１８を用いて
スクリーニングすることにより細胞あたり約３０，００
０個のヒトＩＬ−６Ｒを発現する細胞株を得た。この細
胞株をＣＴＢＣ３と称する。
【０２０５】ＣＴＢＣ３細胞を常法に従ってＲＰＭＩ１
６４０中で培養し、そして培養細胞をＰＢＳ緩衝液によ
り４回洗浄し、そして１×１０7 個の細胞をＣ５７ＢＬ
／６マウスに腹腔内注射して免疫感作した。この免疫感
作は１週間に１回６週間にわたって行った。この免疫感
作されたマウスから脾臓細胞を得、そして常法に従って
ポリエチレングリコールを用いて骨髄腫Ｐ３Ｕ１細胞を
融合せしめ、そして融合した細胞を次の様にしてスクリ
ーニングした。ＩＬ−６Ｒ陰性ヒトＴ細胞系ＪＵＲＫＡ
Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８１６３）を、プラスミドｐＺ
ｉｐｎｅｏ ＩＬ−６Ｒにより同時トランスフェクト
し、そして形質転換された細胞をスクリーニングして、
細胞当り約１００，０００個のＩＬ−６Ｒを発現する細
胞系を得た。この細胞系をＮＪＢＣ８と命名した。
【０２０６】ＮＰ−４０で細胞溶解したＮＪＢＣ８を認
識するがしかしＮＰ−４０で細胞溶解したＪＵＲＫＡＴ
を認識しない抗体を生産するハイブリドーマ細胞系をク
ローン化しそしてＭＴ１８と命名した。ハイブリドーマ
ＭＴ１８は、工業技術院微生物工業技術研究所にブダペ
スト条約のもとに１９９０年７月１０日に微工研条寄第
２９９９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２９９９）として寄託さ
れた。
【０２０７】参考例２．ハイブリドーマＰＭ１の作製 ヒトＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマを作製するため、抗原として、ヒトＩＬ
−６Ｒを次の様にして抽出した。３×１０9 個のヒト骨
髄腫細胞（ＩＬ−６Ｒ生産細胞）を１mlの１％ジギトニ
ン、１０mMトリエタノールアミン緩衝液（pH７．４），
０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び１mM ＰＭＳＦ（フェニルメ
チルスルホニルフルオリド；和光純薬）中で溶解した。
他方、参考例１において調製したハイブリドーマＭＴ１
８により生産されたＭＴ１８抗体を、ブロムシアンで活
性化されたセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に
常法に従って結合させた。このＭＴ１８抗体結合セファ
ロース４Ｂを前記の細胞溶解物を混合することにより、
セファロース４Ｂ上のＭＴ１８抗体に前記可溶化したＩ
Ｌ−６Ｒを結合させた。セファロース４Ｂに非特異的に
結合した物質を洗浄除去し、そしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ
４ＢにＭＴ１８抗体を介して結合したＩＬ−６Ｒを免疫
原として使用した。
【０２０８】前記の免疫原を用いてＢＡＬＢ／ｃマウス
を１週間に１回４週間にわたり腹腔内に免疫感作した。
次に、この免疫感作されたマウスから脾臓細胞を得、そ
して常法に従ってポリエチレングリコールを用いて骨髄
腫細胞Ｐ３Ｕ１と融合せしめた。融合した細胞を次のよ
うにしてスクリーニングした。まず、培養上清及び０．
０１mlのＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）を混合して上清中の免疫グロブリンをＰｒｏｔ
ｅｉｎＧセファロースに吸着せしめた。他方、 35Ｓ−メ
チオニンにより内部標識された１０11個のＵ２６６細胞
を溶解し、そしてＭＴ１８結合セファロース４Ｂを用い
てＩＬ−６Ｒをアフィニティ精製した。
【０２０９】次に、35Ｓ−メチオニンで標識されたＩＬ
−６Ｒを、免疫グロブリンが結合している上記のＰｒｏ
ｔｅｉｎＧセファロースにより免疫沈降せしめ、そして
沈澱をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。その結果、Ｉ
Ｌ−６Ｒに特異的に結合する抗体を生産する１個のハイ
ブリドーマクローンを単離し、そしてＰＭ１と命名し
た。ハイブリドーマＰＭ１は工業技術院微生物工業技術
研究所にブダペスト条約のもとに１９９０年７月１０日
に、微工研条寄第２９９８号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２９９
８）として寄託された。
【０２１０】参考例３．ハイブリドーマＡＵＫ１２−２
０，ＡＵＫ６４−７及びＡＵＫ１４６−１５の作製 免疫原として可溶性ＩＬ−６Ｒ（ＳＲ ３４４）を、Ｙ
ａｓｕｋａｗａ，Ｋ．らの、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０
８，６７３−６７６，１９９０、に記載されている方法
に従って調製した。すなわち、Ｎ−末端から３４５番目
のコドンが終止コドンにより置換されているＩＬ−６Ｒ
をコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＣＥｄ
ｈｆｒ３４４をＣＨＯ（５Ｅ２７）細胞にトランスフェ
クトし、そのトランスフェクトされた細胞を無血清培地
（ＳＦ−０培地、三光純薬）中で培養し、そして得られ
る上清をＨＦ−Ｌａｂｌ系（東ソー）により濃縮しそし
てＢｌｕｅ−５ＰＷカラム及びＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷカ
ラムにより精製した。精製された可溶性ＩＬ−６ＲはＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示した。
【０２１１】雌性ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊマウス（日
本クレア）に、１回の免疫原量を１０μｇ／マウスとし
てＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント（Ｂａｃｔｏ Ａｄ
ｊｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｈ３７Ｒａ，Ｄｉｆ
ｃｏ）と共に皮下注射し、そしてそれぞれ最初の注射の
２週間及び３週間後に、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバ
ント（Ｂａｃｔｏ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｉｎｃｏｍｐｌ
ｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ，Ｄｉｆｃｏ）と共に同量の免疫
原を第二回及び第三回追加免疫として皮下注射した。最
終免疫感作（第四回注射）は第三回注射の１週間後に、
アジュバントを使わないで尾静脈内に行った。
【０２１２】免疫感作されたマウスから血清試料を採取
し、希釈緩衝液により段階的に希釈し、そしてＧｏｌｄ
ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｙ，１１７，５３−６０，１９８１、に
記載されている方法に従ってＥＬＩＳＡ法により分析し
た。すなわち、ＳＲ３４４（０．１μｇ／ml）によりコ
ートされたプレートを１％ＢＳＡによりブロックし、そ
して前記の希釈された試料をそれに加えた。ＳＲ３４４
に結合したマウスＩｇＧをヤギの抗−マウスＩｇＧ／ア
ルカリホスファターゼ（Ａ／Ｐ）（ＺＹＭＥＤ）及びア
ルカリホスファターゼ用基質（Ｓｉｇｍａ−１０４）を
用いて測定した。
【０２１３】血清中の抗−ＳＲ３４４抗体の増加を確認
した後、最終免疫感作から３日後に、５匹のＢＡＬＢ／
ｃマウスから脾臓細胞を得た。脾臓細胞及び骨髄細胞株
（Ｐ３Ｕ１）を２５：１の比率で混合し、ＰＥＧ１５０
０を用いて融合し、そして２０００個のウエル中で０．
７〜１．１×１０6 細胞／ウエルの細胞濃度で培養し
た。ウエルからの上清を、ＳＲ３４４に結合するそれら
の能力について（Ｒ３４４認識アッセイと称する第一次
スクリーニング）、及びＳＲ３４４とＩＬ−６Ｒとの結
合を阻害するそれらの能力について（１Ｌ−６／ｓ１Ｌ
６Ｒ結合阻害アッセイ（ＲＢＩＡ）による）スクリーニ
ングした。第一次スクリーニングが２４０個の陽性ウエ
ルをもたらし、そして第二次スクリーニングが３６個の
陽性ウエルをもたらした。
【０２１４】上記のＳＲ３４４認識アッセイは次の様に
して行った。ヤギの抗マウスＩｇ（Ｃａｐｐｅｌ）（１
μｇ／ml）によりコートされたプレート（ＭａｘｉＳｏ
ｒｐ，Ｎｕｎｃ）を１％ＢＳＡによりブロックし、そし
て１００μｌ／ウエルのハイブリドーマ培養上清をそれ
に添加し、次に室温にて１時間インキュベートした。プ
レートを洗浄した後、２０ｎｇ／mlのＳＲ３４４をウエ
ルに加え、そして室温にて１時間インキュベーションを
行った。上清に由来する固定化された抗体により捕捉さ
れたＳＲ３４４の量を、ラビット抗ＳＲ３４４ＩｇＧ
（＃２，５μｇ／ml）、ヤギの抗ラビットＩｇＧ−アル
カリホスファターゼ（Ａ／Ｐ）（１：３０００，Ｔａｇ
ｏ）及び基質（１mg／ml，Ｓｉｇｍａ−１０４）の添
加、並びにそれに続く４０５−６００nmでの吸光度の測
定により定量した。
【０２１５】前記のＲＢＩＡは次の様にして行った。Ｍ
Ｔ１８抗体でコートしたプレートを１００ｎｇ／mlのＳ
Ｒ３４４（１００μｌ／ウエル）で満たし、そして室温
にて１時間インキュベーョンを行った。プレートを洗浄
した後、５０μｌ／ウエルのハイブリドーマ培養上清及
び５０μｌ／ウエルのビオチン−ＩＬ−６結合体（２０
ｎｇ／ml）をそれぞれのウエルに同時に加え、そしてウ
エルを室温にて１時間インキュベートした。ストレプト
アビジン−Ａ／Ｐ（１：７０００，ＰＩＥＲＣＥ）及び
対応する基質（Ｓｉｇｍａ−１０４）を添加し、４０５
−６００nmでの吸光度を測定することにより、ＳＲ３４
４に結合したビオチン−ＩＬ−６の量を測定した。
【０２１６】最後に、限界希釈法を２回反復することに
より陽性クローンを純化し、そしてＳＲ３４４とＩＬ−
６との結合を阻害する３個のハイブリドーマクローン、
すなわちＡＵＫ１２−２０，ＡＵＫ１４６−１５及びＡ
ＵＫ６４−７；並びにＳＲ３４４とＩＬ−６との結合を
阻害しないハイブリドーマクローンＡＵＫ１８１−６を
得た。
【０２１７】
【発明の効果】本発明はヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成
ヒト抗体を提供し、この抗体においてはヒト抗体のＶ領
域のＣＤＲがヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロー
ナル抗体のＣＤＲにより置き換えられている。この再構
成ヒト抗体の大部分がヒト抗体に由来し、そしてＣＤＲ
は抗原性が低いから、本発明の再構成ヒト抗体はヒトに
対する抗原性が低く、そしてそれ故に療法用として期待
される。
【０２１８】
【表１２】
【０２１９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha <120> Chimeric Antibody against human interleukin-6 receptor <150> <151> <160> 114 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 1 actagtcgac atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg 40
【０２２０】 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 2 actagtcgac atggagwcag acacactcct gytatgggt 39
【０２２１】 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 3 actagtcgac atgagtgtgc tcactcaggt cctggsgttg 40
【０２２２】 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 4 actagtcgac atgaggrccc ctgctcagwt tyttggmwtc ttg 43
【０２２３】 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 5 actagtcgac atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc 40
【０２２４】 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 6 actagtcgac atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrgg 37
【０２２５】 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 7 actagtcgac atgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g 41
【０２２６】 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 8 actagtcgac atgtggggay ctktttycmm tttttcaatt g 41
【０２２７】 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 9 actagtcgac atggtrtccw casctcagtt ccttg 35
【０２２８】 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 10 actagtcgac atgtatatat gtttgttgtc tatttct 37
【０２２９】 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 11 actagtcgac atggaagccc cagctcagct tctcttcc 38
【０２３０】 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 12 ggatcccggg tggatggtgg gaagatg 27
【０２３１】 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 13 actagtcgac atgaaatgca gctgggtcat sttcttc 37
【０２３２】 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 14 actagtcgac atgggatgga gctrtatcat sytctt 36
【０２３３】 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 15 actagtcgac atgaagwtgt ggttaaactg ggttttt 37
【０２３４】 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 16 actagtcgac atgractttg ggytcagctt grttt 35
【０２３５】 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 17 actagtcgac atggactcca ggctcaattt agttttcctt 40
【０２３６】 <210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 18 actagtcgac atggctgtcy trgsgctrct cttctgc 37
【０２３７】 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 19 actagtcgac atggratgga gckggrtctt tmtctt 36
【０２３８】 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 20 actagtcgac atgagagtgc tgattctttt gtg 33
【０２３９】 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 21 actagtcgac atggmttggg tgtggamctt gctattcctg 40
【０２４０】 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 22 actagtcgac atgggcagac ttacattctc attcctg 37
【０２４１】 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 23 ggatcccggg ccagtggata gacagatg 28
【０２４２】 <210> 24 <211> 393 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (1)...(60) <221> mat peptide <222> (61)...(393) <223> Clone:p12-k2 <400> 24 atg gag tca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca 48 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5 ggt tcc act ggt gac att gtg ctg aca cag tct cct gct tcc tta ggt 96 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Gly 1 5 10 gta tct ctg ggg cag agg gcc acc atc tca tgc agg gcc agc aaa agt 144 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser 15 20 25 gtc agt aca tct ggc tat agt tat atg cac tgg tac caa cag aaa cca 192 Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 gga cag aca ccc aaa ctc ctc atc tat ctt gca tcc aac cta gaa tct 240 Gly Gln Thr Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 ggg gtc cct gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc acc 288 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 ctc aac atc cat cct gtg gag gag gag gat gct gca acc tat tac tgt 336 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 80 85 90 cag cac agt agg gag aat ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg 384 Gln His Ser Arg Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 95 100 105 gaa ata aaa 393 Glu Ile Lys 110
【０２４３】 <210> 25 <211> 405 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (1)...(57) <221> mat peptide <222> (58)...(405) <223> Clone:p12-h2 <400> 25 atg gga tgg agc ggg atc ttt ctc ttc ctt ctg tca gga act gca ggt 48 Met Gly Trp Ser Gly Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly -15 -10 -5 gtc cac tct gag atc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg atg aag 96 Val His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys -1 5 10 cct ggg gct tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 15 20 25 act agc tat tac ata cac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt 192 Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 30 35 40 45 gag tgg att gga tat att gat cct ttc aat ggt ggt act agc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 50 55 60 cag aaa ttc aag ggc aag gcc aca ttg act gtt gac aaa tct tcc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 65 70 75 aca gcc tac atg cat ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc 336 Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 tat tac tgt gca agg ggg ggt aac cgc ttt gct tac tgg ggc caa ggg 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 95 100 105 act ctg gtc act gtc tct gca 405 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115
【０２４４】 <210> 26 <211> 381 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (1)...(60) <221> mat peptide <222> (61)...(381) <223> Clone:pPM-k3 <400> 26 atg gtg tcc tca gct cag ttc ctt ggt ctc ctg ttg ctc tgt ttt caa 48 Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln -20 -15 -10 -5 ggt acc aga tgt gat atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctg tct 96 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 1 5 10 gcc tct ctg gga gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac 144 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 15 20 25 att agc agt tat tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act att 192 Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile 30 35 40 aaa ctc ctg atc tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca 240 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 45 50 55 60 agg ttc agt ggc agt ggg tct gga aca gat tat tct ctc acc att aac 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn 65 70 75 aac ctg gag caa gaa gac att gcc act tac ttt tgc caa cag ggt aac 336 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn 80 85 90 acg ctt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aat 381 Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 95 100 105
【０２４５】 <210> 27 <211> 411 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (1)...(54) <221> mat peptide <222> (55)...(411) <223> Clone:pPM-h1 <400> 27 atg aga gtg ctg att ctt ttg tgg ctg ttc aca gcc ttt cct ggt atc 48 Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile -15 -10 -5 ctg tct gat gtg cag ctt cag gag tcg gga cct gtc ctg gtg aag cct 96 Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro -1 5 10 tct cag tct ctg tcc ctc acc tgc act gtc act ggc tac tca atc acc 144 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 15 20 25 30 agt gat cat gcc tgg agc tgg atc cgg cag ttt cca gga aac aaa ctg 192 Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu 35 40 45 gag tgg atg ggc tac ata agt tac agt ggt atc act acc tac aac cca 240 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro 50 55 60 tct ctc aaa agt cga atc tct atc act cga gac aca tcc aag aac cag 288 Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75 ttc ttc cta cag ttg aat tct gtg act act ggg gac acg tcc aca tat 336 Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ser Thr Tyr 80 85 90 tac tgt gca aga tcc cta gct cgg act acg gct atg gac tac tgg ggt 384 Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 95 100 105 110 caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 411 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115
【０２４６】 <210> 28 <211> 393 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (1)...(60) <221> mat peptide <222> (61)...(393) <223> Clone:p64-k4 <400> 28 atg gag tca gac aca ctc ctg cta tgg gtg ctg ctg ctc tgg gtt cca 48 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5 ggt tcc aca ggt gac att gtg ttg atc caa tct cca gct tct ttg gct 96 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Ile Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala -1 5 10 gtg tct cta ggg cag agg gcc acc ata tcc tgc aga gcc agt gaa agt 144 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 15 20 25 gtt gat agt tat ggc aat agt ttt atg cac tgg tac cag cag aaa cca 192 Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 gga cag cca ccc aaa ctc ctc atc tat cgt gca tcc aac cta gaa tct 240 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 ggg atc cct gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct agg aca gac ttc acc 288 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 65 70 75 ctc acc att aat cct gtg gag gct gat gat gtt gca acc tat tac tgt 336 Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 80 85 90 cag caa agt aat gag gat cct ccc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg 384 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 95 100 105 gag ctg aaa 393 Glu Leu Lys 110
【０２４７】 <210> 29 <211> 417 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (1)...(57) <221> mat peptide <222> (58)...(417) <223> Clone:p64-h2 <400> 29 atg gga tgg agc ggg gtc ttt atc ttc ctc ctg tca gta act gca ggt 48 Met Gly Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly -15 -10 -5 gtc cac tcc cag gtt caa ttg cag cag tct gga gct gag ttg atg aag 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys -1 5 10 cct ggg gcc tca gtg aag atc tcc tgc aag gct act ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 agt agt tat tgg ata gtg tgg ata aag cag agg cct gga cat ggc ctt 192 Ser Ser Tyr Trp Ile Val Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 30 35 40 45 gag tgg att gga gag att tta cct gga acc ggt agt act aac tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn 50 55 60 gag aaa ttc aag ggc aag gcc aca ttc act gca gat aca tct tcc aac 288 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 65 70 75 aca gcc tac atg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcc gtc 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 tat tac tgt gca agt cta gac agc tcg ggc tac tat gct atg gac tat 384 Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 95 100 105 tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 417 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 110 115 120
【０２４８】 <210> 30 <211> 381 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (1)...(60) <221> mat peptide <222> (61)...(381) <223> Clone:p146-k3 <400> 30 atg gtg tcc aca cct cag ttc ctt ggt ctc ctg ttg atc tgt ttt caa 48 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Ile Cys Phe Gln -20 -15 -10 -5 ggt acc aga tgt gat atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctg tct 96 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser -1 5 10 gcc tct ctg gga gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac 144 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 15 20 25 att agt aat tat tta aac tgg tat caa cag aaa cca gat gga act gtt 192 Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 30 35 40 aaa ctc ctg atc tac tat aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca 240 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 45 50 55 60 agg ttc agt ggc agt ggg tct gga aca gat tat tct ctc acc att agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 65 70 75 aac ctg gag caa gaa gat att gcc agt tac ttt tgc caa cag ggt tat 336 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr 80 85 90 acg cct ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ttg gaa atc aaa 381 Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 95 100 105
【０２４９】 <210> 31 <211> 402 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (1)...(51) <221> mat peptide <222> (52)...(402) <223> Clone:p146-h1 <400> 31 atg gag ctg gat ctt tat ctt att ctg tca gta act tca ggt gtc tac 48 Met Glu Leu Asp Leu Tyr Leu Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly Val Tyr -15 -10 -5 tca cag gtt cag ctc cag cag tct ggg gct gag ctg gca aga cct ggg 96 Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly -1 5 10 15 gct tca gtg aag ttg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt act aac 144 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn 20 25 30 tac tgg gtg cag tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt ctg gaa tgg 192 Tyr Trp Val Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 att ggg tct att tat cct gga gat ggt gat act agg aac act cag aag 240 Ile Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Asn Thr Gln Lys 50 55 60 ttc aag ggc aag gcc aca ttg act gca gat aaa tcc tcc atc aca gcc 288 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala 65 70 75 tac atg caa ctc acc agc ttg gca tct gag gac tct gcg gtc tat tac 336 Tyr Met Gln Leu Thr Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 80 85 90 95 tgt gca aga tcg act ggt aac cac ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc 384 Cys Ala Arg Ser Thr Gly Asn His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 act ctc aca gtc tcc tca 402 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115
【０２５０】 <210> 32 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 32 acaaagcttc caccatggag tcagacacac tcctg 35
【０２５１】 <210> 33 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 33 ggctaagctt ccaccatggg atggagcggg atcttt 36
【０２５２】 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 34 cttggatcca ctcacgtttt atttccagct tggtc 35
【０２５３】 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 35 gttggatcca ctcacctgca gagacagtta ccagag 36
【０２５４】 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 36 cttggatcca ctcacgattt atttccagct tggtc 35
【０２５５】 <210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 37 cttggatcca ctcacgtttt atttccagct tggtc 35
【０２５６】 <210> 38 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 38 acaaagcttc caccatggtg tcctcagctc agttcc 36
【０２５７】 <210> 39 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 39 tgttagatct actcacctga ggagacagtg actgaggtt 39
【０２５８】 <210> 40 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 40 gtctaagctt ccaccatgag agtgctgatt cttttg 36
【０２５９】 <210> 41 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 41 tacgcaaacc gcctctc 17
【０２６０】 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 42 gagtgcacca tatgcggt 18
【０２６１】 <210> 43 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 43 accgtgtctg gctacacctt caccagcgat catgcctgga gctgggtgag acagc 55
【０２６２】 <210> 44 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 44 tgagtggatt ggatacatta gttatagtgg aatcacaacc tataatccat 50 ctctcaaatc cag 63
【０２６３】 <210> 45 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 45 tattattgtg caagatccct agctcggact acggctatgg actactgggg tcaa 54
【０２６４】 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 46 gtgacaatgc tgagagacac cagcaag 27
【０２６５】 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 47 ggtgtccact ccgatgtcca actg 24
【０２６６】 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 48 ggtcttgagt ggatgggata cattagt 27
【０２６７】 <210> 49 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 49 gtgtctggct actcaattac cagcatcat 29
【０２６８】 <210> 50 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 50 tgtagagcca gccaggacat cagcagttac ctgaactggt accagcag 48
【０２６９】 <210> 51 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 51 atctactaca cctccagact gcactctggt gtgccaagca ga 42
【０２７０】 <210> 52 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 52 acctactact gccaacaggg taacacgctt ccatacacgt tcggccaagg 50
【０２７１】 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 53 agcggtaccg actacacctt caccatc 27
【０２７２】 <210> 54 <211> 706 <212> DNA <213> Mouse and Human <220> <221> Hind III site <222> (1)...(6) <221> intron <222> (54)...(135) <221> intron/aberrant splicing <222> (258)...(348) <221> intron <222> (506)...(706) <221> Bam HI site <222> (701)...(706) <223> Gene coding for H chain V region version (f) of reshaped human PM- 1 antibody against human IL-6R <400> 54 aagcttc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct 49 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala -15 -10 aca g gtaaggggct cacagtagca ggcttgaggt ctggacatat atatgggtga 103 Thr -5 caatgacatc cactttgcct ttctctccac ag gt gtc cac tcc cag gtc caa 155 Gly Val His Ser Gln Val Gln 1 ctg cag gag agc ggt cca ggt ctt gtg aga cct agc cag acc ctg agc 203 Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser 5 10 15 ctg acc tgc acc gtg tct ggc tac tca att acc agc gat cat gcc tgg 251 Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp 20 25 30 35 agc tgg gtg aga cag cca cct gga cga ggt ctt gag tgg att gga tac 299 Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr 40 45 50 att agt tat agt gga atc aca acc tat aat cca tct ctc aaa tcc aga 347 Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg 55 60 65 gtg aca atg ctg aga gac acc agc aag aac cag ttc agc ctg aga ctc 395 Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu 70 75 80 agc agc gtg aca gcc gcc gac acc gcg gtt tat tat tgt gca aga tcc 443 Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 85 90 95 cta gct cgg act acg gct atg gac tac tgg ggt caa ggc agc ctc gtc 491 Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 100 105 110 115 aca gtc tcc tca g gtgagtcctt acaacctctc tcttctattc agcttaaata 544 Thr Val Ser Ser gattttactg catttgttgg gggggaaatg tgtgtatctg aatttcaggt catgaaggac 604 tagggacacc ttgggagtca gaaagggtca ttgggagccc gggctgatgc agacagacat 664 cctcagctcc cagacttcat ggccagagat ttatagggat cc 706
【０２７３】 <210> 55 <211> 506 <212> DNA <213> Mouse and Human <220> <221> Hind III site <222> (1)...(6) <221> intron <222> (54)...(135) <221> intron/aberrant splicing <222> (268)...(376) <221> intron <222> (469)...(506) <221> Bam HI site <222> (501)...(506) <223> Gene coding for L chain V region version (a) of reshaped human PM- 1 antibody against human IL-6R <400> 55 aagcttc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct 49 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala -15 -10 aca g gtaaggggct cacagtagca ggcttgaggt ctggacatat atatgggtga 103 Thr -5 caatgacatc cactttgcct ttctctccac ag gt gtc cac tcc gac atc cag 155 Gly Val His Ser Asp Ile Gln 1 atg acc cag agc cca agc agc ctg agc gcc agc gtg ggt gac aga gtg 203 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 5 10 15 acc atc acc tgt aga gcc agc cag gac atc agc agt tac ctg aat tgg 251 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp 20 25 30 35 tac cag cag aag cca ggt aag gct cca aag ctg ctg atc tac tac acc 299 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr 40 45 50 tcc aga ctg cac tct ggt gtg cca agc aga ttc agc ggt agc ggt agc 347 Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 55 60 65 ggt acc gac ttc acc ttc acc atc agc agc ctc cag cca gag gac atc 395 Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile 70 75 80 gct acc tac tac tgc caa cag ggt aac acg ctt cca tac acg ttc ggc 443 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly 85 90 95 caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa c gtgagtagaa tttaaacttt 488 Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 gcttcctcag ttggatcc 506
【０２７４】 <210> 56 <211> 438 <212> DNA <213> Mouse and Human <220> <221> Hind III site <222> (1)...(6) <221> Bam HI site <222> (432)...(438) <223> Gene excluding intron coding for H chain V region version (f) of r eshaped human PM-1 antibody against human IL-6R <400> 56 aagcttccac c atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca 50 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr -15 -10 gct aca ggt gtc cac tcc cag gtc caa ctg cag gag agc ggt cca ggt 98 Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly -5 1 5 10 ctt gtg aga cct agc cag acc ctg agc ctg acc tgc acc gtg tct ggc 146 Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 15 20 25 tac tca att acc agc gat cat gcc tgg agc tgg gtt cgc cag cca cct 194 Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro 30 35 40 gga cga ggt ctt gag tgg att gga tac att agt tat agt gga atc aca 242 Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr 45 50 55 acc tat aat cca tct ctc aaa tcc aga gtg aca atg ctg aga gac acc 290 Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr 60 65 70 agc aag aac cag ttc agc ctg aga ctc agc agc gtg aca gcc gcc gac 338 Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 75 80 85 90 acc gcg gtt tat tat tgt gca aga tcc cta gct cgg act acg gct atg 386 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met 95 100 105 gac tac tgg ggt caa ggc agc ctc gtc aca gtc tcc tca g gtgagtggat 436 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 cc 438
【０２７５】 <210> 57 <211> 402 <212> DNA <213> Mouse and Human <220> <221> Hind III site <222> (1)...(6) <221> Bam HI site <222> (397)...(402) <223> Gene excluding intron coding for L chain V region version (a) of r eshaped human PM-1 antibody against human IL-6R <400> 57 aagcttccac c atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca 50 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr -15 -10 gct aca ggt gtc cac tcc gac atc cag atg acc cag agc cca agc agc 98 Ala Thr Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser -5 1 5 10 ctg agc gcc agc gtg ggt gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc agc 146 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 15 20 25 cag gac atc agc agt tac ctg aat tgg tac cag cag aag cca gga aag 194 Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 30 35 40 gct cca aag ctg ctg atc tac tac acc tcc aga ctg cac tct ggt gtg 242 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val 45 50 55 cca agc aga ttc agc ggt agc ggt agc ggt acc gac ttc acc ttc acc 290 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr 60 65 70 atc agc agc ctc cag cca gag gac atc gct acc tac tac tgc caa cag 338 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 75 80 85 90 ggt aac acg ctt cca tac acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc 386 Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 95 100 105 aaa c gtgagtggat cc 402 Lys
【０２７６】 <210> 58 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 58 taaggatcca ctcacctgag gagactgtga cgaggc 36
【０２７７】 <210> 59 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 59 atcaagcttc caccatggga tggagctgta tc 32
【０２７８】 <210> 60 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 60 aatggatcca ctcacgtttg atttccacct 30
【０２７９】 <210> 61 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 61 catgcctgga gctgggttcg ccagccacct gga 33
【０２８０】 <210> 62 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 62 tccaggtggc tggcgaaccc agctccaggc atg 33
【０２８１】 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 63 cagcagaagc caggaaaggc tccaaagctg 30
【０２８２】 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 64 cagctttgga gcctttcctg gcttctgctg 30
【０２８３】 <210> 65 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 65 acctgtagag ccagcaagag tgttagtaca tctggctata gttatatgca 50 ctggtaccag cagaag 66
【０２８４】 <210> 66 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 66 gctggctcta caggt 15
【０２８５】 <210> 67 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 67 aagctgctga tctaccttcc atccaccctg gaatctggtg tgccaagc 48
【０２８６】 <210> 68 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 68 gtagatcagc agctt 15
【０２８７】 <210> 69 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 69 gctacctact actgccagca cagtagggag accccataca cgttcggc 48
【０２８８】 <210> 70 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 70 ctggcagtag gtagc 15
【０２８９】 <210> 71 <211> 414 <212> DNA <213> Mouse and Human <220> <221> Hind III site <222> (1)...(6) <221> Bam HI site <222> (408)...(414) <223> Gene excluding intron coding for L chain V region version (a) of r eshaped human AUK12-20 antibody against human IL-6R <400> 71 aagcttccac c atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca 50 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr -15 -10 gct aca ggt gtc cac tcc gac atc cag atg acc cag agc cca agc agc 98 Ala Thr Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser -5 -1 1 5 10 ctg agc gcc agc gtg ggt gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc agc 146 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 15 20 25 aag agt gtt agt aca tct ggc tat agt tat atg cac tgg tac cag cag 194 Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln 30 35 40 aag cca gga aag gct cca aag ctg ctg atc tac ctt gca tcc aac ctg 242 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu 45 50 55 gaa tct ggt gtg cca agc aga ttc agc ggt agc ggt agc ggt acc gac 290 Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 60 65 70 ttc acc ttc acc atc agc agc ctc cag cca gag gac atc gct acc tac 338 Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 90 tac tgc cag cac agt agg gag aac cca tac acg ttc ggc caa ggg acc 386 Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr 95 100 105 aag gtg gaa atc aaa cgtgagtgga tcc 414 Lys Val Glu Ile Lys 110
【０２９０】 <210> 72 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 72 ggttattcat tcactagtta ttacatacac tgggttagac aggcc 45
【０２９１】 <210> 73 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 73 agtgaatgaa taaccgctag ctttaca 27
【０２９２】 <210> 74 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 74 gagtgggtgg gctatattga tcctttcaat ggtggtacta gctataatca 50 gaagttcaag ggcagggtt 69
【０２９３】 <210> 75 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 75 atagcccacc cactc 15
【０２９４】 <210> 76 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 76 gggggtaacc gctttgctta ctggggacag ggtacc 36
【０２９５】 <210> 77 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 77 agcaaagcgg ttaccccctc tggcgcagta gtagac 36
【０２９６】 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 78 caaggttacc atgaccgtgg acacctctac 30
【０２９７】 <210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 79 cacggtcatg gtaaccttgc ccttgaactt 30
【０２９８】 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 80 gggctcgaat ggattggcta tattgatcct 30
【０２９９】 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 81 aggatcaata tagccaatcc attcgagccc 30
【０３００】 <210> 82 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 82 gtaaaacgag gccagt 16
【０３０１】 <210> 83 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 83 aacagctatg accatga 17
【０３０２】 <210> 84 <211> 433 <212> DNA <213> Mouse and Human <220> <221> Hind III site <222> (1)...(6) <221> Bam HI site <222> (427)...(433) <223> Gene excluding intron coding for H chain V region version (b) of r eshaped human antibody AUK12-20 antibody against human IL-6R <400> 84 aagcttgccg ccacc atg gac tgg acc tgg cgc gtg ttt tgc ctg ctc gcc 51 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala -15 -10 gtg gct cct ggg gcc cac agc cag gtg caa cta gtg cag tcc ggc gcc 99 Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala -5 -1 1 5 gaa gtg aag aaa ccc ggt gct tcc gtg aaa gtc agc tgt aaa gct agc 147 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 10 15 20 25 ggt tat tca ttc act agt tat tac ata cac tgg gtt aga cag gcc cca 195 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro 30 35 40 ggc caa ggg ctc gag tgg gtg ggc tat att gat cct ttc aat ggt ggt 243 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly 45 50 55 act agc tat aat cag aag ttc aag ggc aag gtt acc atg acc gtg gac 291 Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Val Asp 60 65 70 acc tct aca aac acc gcc tac atg gaa ctg tcc agc ctg cgc tcc gag 339 Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu 75 80 85 gac act gca gtc tac tac tgc gcc aga ggg ggt aac cgc ttt gct tac 387 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr 90 95 100 105 tgg gga cag ggt acc ctt gtc acc gtc agt tca ggtgagtgga tcc 433 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115
【０３０３】 <210> 85 <211> 433 <212> DNA <213> Mouse and Human <220> <221> Hind III site <222> (1)...(6) <221> Bam HI site <222> (427)...(433) <223> Gene excluding intron coding for H chain V region version (d) of r eshaped human AUK12-20 antibody against human IL-6R <400> 85 aagcttgccg ccacc atg gac tgg acc tgg cgc gtg ttt tgc ctg ctc gcc 51 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala -15 -10 gtg gct cct ggg gcc cac agc cag gtg caa cta gtg cag tcc ggc gcc 99 Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala -5 -1 1 5 gaa gtg aag aaa ccc ggt gct tcc gtg aaa gtc agc tgt aaa gct agc 147 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 10 15 20 25 ggt tat tca ttc act agt tat tac ata cac tgg gtt aga cag gcc cca 195 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro 30 35 40 ggc caa ggg ctc gaa tgg att ggc tat att gat cct ttc aat ggt ggt 243 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly 45 50 55 act agc tat aat cag aag ttc aag ggc aag gtt acc atg acc gtg gac 291 Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Val Asp 60 65 70 acc tct aca aac acc gcc tac atg gaa ctg tcc agc ctg cgc tcc gag 339 Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu 75 80 85 gac act gca gtc tac tac tgc gcc aga ggg ggt aac cgc ttt gct tac 387 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr 90 95 100 105 tgg gga cag ggt acc ctt gtc acc gtc agt tca ggtgagtgga tcc 433 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115
【０３０４】 <210> 86 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 86 gataagcttg ccgccaccat ggactggacc tggagggtct tcttcttgct 50 ggctgtagct ccaggtgctc actcccaggt gcagcttgtg 90
【０３０５】 <210> 87 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 87 cactcccagg tgcagcttgt gcagtctgga gctgaggtga agaagcctgg 50 ggcctcagtg aaggtttcct gcaaggcttc tggatactca 90
【０３０６】 <210> 88 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 88 tgcaaggctt ctggatactc attcactagt tattacatac actgggtgcg 50 ccaggccccc ggacaaaggc ttgagtggat gggatatatt 90
【０３０７】 <210> 89 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 89 cttgagtgga tgggatatat tgaccctttc aatggtggta ctagctataa 50 tcagaagttc aagggcagag tcaccattac cgtagacaca 90
【０３０８】 <210> 90 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 90 gtcaccatta ccgtagacac atccgcgagc acagcctaca tggagctgag 50 cagcctgaga tctgaagaca cggctgtgta ttactgtgcg 90
【０３０９】 <210> 91 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 91 acggctgtgt attactgtgc gagagggggt aaccgctttg cttactgggg 50 ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagg tgagtggatc cgac 94
【０３１０】 <210> 92 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 92 gataagcttg ccgcc 15
【０３１１】 <210> 93 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 93 gtcggatcca ctcac 15
【０３１２】 <210> 94 <211> 433 <212> DNA <213> Mouse and Human <220> <221> Hind III site <222> (1)...(6) <221> Bam HI site <222> (427)...(433) <223> Gene coding for H chain V region version (a) of reshaped human sle AUK12-20 antibody against human IL-6R <400> 94 aagcttgccg ccacc atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct 51 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala -15 -10 gta gct cca ggt gct cac tcc cag gtg cag ctt gtg cag tct gga gct 99 Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala -5 -1 1 5 gag gtg aag aag cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gct tct 147 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 10 15 20 25 gga tac tca ttc act agt tat tac ata cac tgg gtg cgc cag gcc ccc 195 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro 30 35 40 gga caa agg ctt gag tgg atg gga tat att gac cct ttc aat ggt ggt 243 Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly 45 50 55 act agc tat aat cag aag ttc aag ggc aga gtc acc att acc gta gac 291 Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp 60 65 70 aca tcc gcg agc aca gcc tac atg gag ctg agc agt ctg aga tct gaa 339 Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu 75 80 85 gac acg gct gtg tat tac tgt gcg aga ggg ggt aac cgc ttt gct tac 387 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr 90 95 100 105 tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca ggtgagtgga tcc 433 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115
【０３１３】 <210> 95 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 95 aggcttgagt ggattggata tattgac 27
【０３１４】 <210> 96 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 96 aagttcaagg gcaaggtcac cattacc 27
【０３１５】 <210> 97 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 97 ggtgcttccg tgaaagtcag ctgtaaagct 30
【０３１６】 <210> 98 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <400> 98 agctttacag ctgactttca cggaagcacc 30
【０３１７】 <210> 99 <211> 130 <212> PRT <213> Mouse <221> sig peptide <222> (-20)...(-1) <221> mat peptide <222> (1)...(111) <223> Clone:p12-k2 <400> 99 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Gly 1 5 10 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser 15 20 25 Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 Gly Gln Thr Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 80 85 90 Gln His Ser Arg Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 95 100 105 Glu Ile Lys 110
【０３１８】 <210> 100 <211> 135 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (-19)...(-1) <221> mat peptide <222> (1)...(116) <223> Clone:p12-h2 <400> 100 Met Gly Trp Ser Gly Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly -15 -10 -5 Val His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys -1 5 10 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 15 20 25 Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 30 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 50 55 60 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 65 70 75 Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 95 100 105 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115
【０３１９】 <210> 101 <211> 127 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (-20)...(-1) <221> mat peptide <222> (1)...(107) <223> Clone:pPM-k3 <400> 101 Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln -20 -15 -10 -5 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 1 5 10 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 15 20 25 Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile 30 35 40 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 45 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn 65 70 75 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn 80 85 90 Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 95 100 105
【０３２０】 <210> 102 <211> 137 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (-18)...(-1) <221> mat peptide <222> (1)...(119) <223> Clone:pPM-h1 <400> 102 Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile -15 -10 -5 Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro -1 5 10 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 15 20 25 30 Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu 35 40 45 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75 Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ser Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 95 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115
【０３２１】 <210> 103 <211> 131 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (-20)...(-1) <221> mat peptide <222> (1)...(111) <223> Clone:p64-k4 <400> 103 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Ile Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala -1 5 10 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 15 20 25 Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 65 70 75 Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 80 85 90 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 95 100 105 Glu Leu Lys 110
【０３２２】 <210> 104 <211> 139 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (-19)...(-1) <221> mat peptide <222> (1)...(120) <223> Clone:p64-h2 <400> 104 Met Gly Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly -15 -10 -5 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys -1 5 10 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 Ser Ser Tyr Trp Ile Val Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 30 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn 50 55 60 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 65 70 75 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 110 115 120
【０３２３】 <210> 105 <211> 127 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (-20)...(-1) <221> mat peptide <222> (1)...(107) <223> Clone:p146-k3 <400> 105 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Ile Cys Phe Gln -20 -15 -10 -5 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser -1 5 10 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 15 20 25 Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 30 35 40 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 45 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr 80 85 90 Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 95 100 105
【０３２４】 <210> 106 <211> 134 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> sig peptide <222> (-17)...(-1) <221> mat peptide <222> (1)...(117) <223> Clone:p146-h1 <400> 106 Met Glu Leu Asp Leu Tyr Leu Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly Val Tyr -15 -10 -5 Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly -1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn 20 25 30 Tyr Trp Val Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Asn Thr Gln Lys 50 55 60 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala 65 70 75 Tyr Met Gln Leu Thr Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 80 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Thr Gly Asn His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115
【０３２５】 <210> 107 <211> 138 <212> PRT <213> Mouse and Human <220> <221> leader <222> (-19)...(-1) <221> FR1 <222> (1)...(30) <221> CDR1 <222> (31)...(36) <221> FR2 <222> (37)...(50) <221> CDR2 <222> (51)...(66) <221> FR3 <222> (67)...(98) <221> CDR3 <222> (99)...(108) <221> FR4 <222> (109)...(119) <223> Amino acid sequence of H chain V region version (f) of reshaped hu man antibody PM-1 against human IL-6R <400> 107 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -15 -10 -5 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg 1 5 10 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile 15 20 25 Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly 30 35 40 45 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn 50 55 60 Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp 95 100 105 Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115
【０３２６】 <210> 108 <211> 126 <212> PRT <213> Mouse and Human <220> <221> leader <222> (-19)...(-1) <221> FR1 <222> (1)...(23) <221> CDR1 <222> (24)...(34) <221> FR2 <222> (35)...(49) <221> CDR2 <222> (50)...(56) <221> FR3 <222> (57)...(88) <221> CDR3 <222> (89)...(97) <221> FR4 <222> (98)...(117) <223> Amino acid sequence of L chain V region version (a) of reshaped hu man antibody PM-1 against human IL-6R <400> 108 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -15 -10 -5 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 1 5 10 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile 15 20 25 Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 30 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser 65 70 75 Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr 80 85 90 Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 95 100 105
【０３２７】 <210> 109 <211> 138 <212> PRT <213> Mouse and Human <220> <221> leader <222> (-19)...(-1) <221> FR1 <222> (1)...(30) <221> CDR1 <222> (31)...(36) <221> FR2 <222> (37)...(50) <221> CDR2 <222> (51)...(66) <221> FR3 <222> (67)...(98) <221> CDR3 <222> (99)...(108) <221> FR4 <222> (109)...(119) <223> Amino acid sequence of H chain V region version (f) of reshaped hu man PM-1 antibody against human IL-6R <400> 109 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -15 -10 -5 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg 1 5 10 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile 15 20 25 Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly 30 35 40 45 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn 50 55 60 Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp 95 100 105 Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115
【０３２８】 <210> 110 <211> 126 <212> PRT <213> Mouse and Human <220> <221> leader <222> (-19)...(-1) <221> FR1 <222> (1)...(23) <221> CDR1 <222> (24)...(34) <221> FR2 <222> (35)...(49) <221> CDR2 <222> (50)...(56) <221> FR3 <222> (57)...(88) <221> CDR3 <222> (89)...(97) <221> FR4 <222> (98)...(107) <223> Amino acid sequence of L chain V region version (a) of reshaped hu man PM-1 antibody against human IL-6R <400> 110 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -15 -10 -5 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 1 5 10 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile 15 20 25 Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 30 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser 65 70 75 Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr 80 85 90 Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 95 100 105
【０３２９】 <210> 111 <211> 130 <212> PRT <213> Mouse and Human <220> <221> leader <222> (-19)...(-1) <221> FR1 <222> (1)...(23) <221> CDR1 <222> (24)...(38) <221> FR2 <222> (39)...(53) <221> CDR2 <222> (54)...(60) <221> FR3 <222> (61)...(92) <221> CDR3 <222> (93)...(101) <221> FR4 <222> (102)...(111) <223> Amino acid sequence of L chain V region version (a) of reshaped hu man AUK12-20 antibody against human IL-6R <400> 111 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -15 -10 -5 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala -1 1 5 10 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val 15 20 25 Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly 50 55 60 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe 65 70 75 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 80 85 90 His Ser Arg Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys 110
【０３３０】 <210> 112 <211> 135 <212> PRT <213> Mouse and Human <220> <221> leader <222> (-19)...(-1) <221> FR1 <222> (1)...(30) <221> CDR1 <222> (31)...(35) <221> FR2 <222> (36)...(49) <221> CDR2 <222> (50)...(66) <221> FR3 <222> (67)...(98) <221> CDR3 <222> (99)...(105) <221> FR4 <222> (106)...(116) <223> Amino acid sequence of H chain V region version (b) of reshaped hu man AUK12-20 antibody against human IL-6R <400> 112 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 15 20 25 Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 50 55 60 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn 65 70 75 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 95 100 105 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115
【０３３１】 <210> 113 <211> 135 <212> PRT <213> Mouse and Human <220> <221> leader <222> (-19)...(-1) <221> FR1 <222> (1)...(30) <221> CDR1 <222> (31)...(35) <221> FR2 <222> (36)...(49) <221> CDR2 <222> (50)...(66) <221> FR3 <222> (67)...(98) <221> CDR3 <222> (99)...(105) <221> FR4 <222> (106)...(116) <223> Amino acid sequence of H chain V region version (d) of reshaped hu man AUK12-20 antibody against human IL-6R <400> 113 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 15 20 25 Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 50 55 60 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn 65 70 75 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 95 100 105 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115
【０３３２】 <210> 114 <211> 135 <212> PRT <213> Mouse and Human <220> <221> leader <222> (-19)...(-1) <221> FR1 <222> (1)...(30) <221> CDR1 <222> (31)...(35) <221> FR2 <222> (36)...(49) <221> CDR2 <222> (50)...(66) <221> FR3 <222> (67)...(98) <221> CDR3 <222> (99)...(105) <221> FR4 <222> (106)...(116) <223> Amino acid sequence of H chain V region version (a) of reshaped hu man AUK12-20 antibody against human IL-6R <400> 114 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 15 20 25 Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 30 35 40 45 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 50 55 60 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser 65 70 75 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 95 100 105 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の抗体ペプチドの発現のために
有用な、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモ
ーター／エンハンサー系を含んで成る発現ベクターを示
す。
【図２】図２は、ヒトＩＬ−６Ｒに結合する本発明のキ
メラ抗体ＡＵＫ１２−２０の能力の確認のためのＥＬＩ
ＳＡの結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ヒトＩＬ−６ＲへのヒトＩＬ−６の結
合を阻害する本発明のキメラ抗体ＡＵＫ１２−２０の能
力の確認のためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフであ
る。
【図４】図４は、ヒトＩＬ−６Ｒへの本発明のキメラ抗
体ＰＭ１ａ及びＰＭ１ｂの結合についてのＥＬＩＳＡの
結果を示すグラフである。
【図５】図５は、ヒトＩＬ−６ＲへのヒトＩＬ−６の結
合を阻害する本発明のキメラ抗体ＰＭ１ａ及びＰＭ１ｂ
の能力を試験するＥＬＩＳＡの結果を示すグラフであ
る。
【図６】図６は、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の
第一バージョン（バージョン「ａ」）の作製のダイアグ
ラムである。
【図７】図７は、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の
第一バージョン（バージョン「ａ」）の作製のダイアグ
ラムである。
【図８】図８は、Ｈ鎖の発現のために有用な、ヒト・エ
ロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１α）プロ
モーター／エンハンサーを含んで成る発現プラスミドＨ
ＥＦ−１２ｈ−ｇγ１の作製の過程を示す。
【図９】図９は、Ｌ鎖の発現のために有用な、ＨＥＦ−
１αプロモーター／エンハンサー系を含んで成る発現プ
ラスミドＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋの作製の過程を示す。
【図１０】図１０は、Ｈ鎖の発現のために有用な、増幅
のための欠陥ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー配列
に連結されたジヒドロフォレートレダクターゼ（ｄｈｆ
ｒ）及びＨＣＭＶプロモーター／エンハンサーを含んで
成る発現プラスミドＤＨＦＲ−ＰＭｈ−ｇγ１の作製の
過程を示す。
【図１１】図１１は、Ｈ鎖の発現のために有用な、増幅
のための欠陥ＳＶ４０−プロモーター／エンハンサー配
列に連結されたｄｈｆｒ遺伝子及びＥＦ１αプロモータ
ー／エンハンサーを含んで成る発現プラスミドＤＨＦＲ
−ΔＥ−ＲＶｈ−ＰＭ１−ｆの作製の過程を示す。
【図１２】図１２は、ヒトＩＬ−６Ｒへの結合について
の再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン
「ａ」及び「ｂ」の能力を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ヒトＩＬ−６Ｒへの結合について
の再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン
「ｆ」＋再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン
「ａ」の能力を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結
合を阻害する再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバー
ジョン「ｆ」＋再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バー
ジョン「ａ」の能力を示すグラフである。
【図１５】図１５は、それぞれＬ鎖及びＨ鎖の発現のた
めに有用な、ヒトＥＦＩ−αプロモーター／エンハンサ
ーを含んで成る発現プラスミドＨＥＦ−ＶL −ｇｋ及び
ＨＥＦ−ＶH −ｇγ１を示す。
【図１６】図１６は、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体
Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」をコードするＤＮＡの作製
の過程を示す。
【図１７】図１７は、ヒトＩＬ−６Ｒに結合する再構成
ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領域の能力の確認のた
めのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。図中、標準
ＡＵＫ１２−２０（キメラ）はキメラＡＵＫ１２−２０
抗体をＣＨＯ細胞により大量に製造して精製したものに
ついての結果を示す。
【図１８】図１８は、ヒトＩＬ−６Ｒに結合する再構成
ヒトＡＵＫ１２−２０抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ
鎖バージョン「ｂ」）の能力についてのＥＬＩＳＡの結
果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、ヒトＩＬ−６Ｒに結合する再構成
ヒトＡＵＫ１２−２０抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ
鎖バージョン「ｄ」）の能力についてのＥＬＩＳＡの結
果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体
Ｈ鎖Ｖ領域の化学合成の過程を示す。
【図２１】図２１は、ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結
合を阻害する再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体（Ｌ鎖バ
ージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ａ」）の能力につい
てのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結
合を阻害する再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体（Ｌ鎖バ
ージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ｂ」）の能力につい
てのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図２３】図２３は、ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結
合を阻害する再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体（Ｌ鎖バ
ージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ｃ」）の能力につい
てのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図２４】図２４は、ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結
合を阻害する再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体（Ｌ鎖バ
ージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ｄ」）の能力につい
てのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ０７Ｋ 16/28 // Ｃ０７Ｋ 16/28 19/00 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ベンディッグ，メアリー マーガレット イギリス国，ロンドン エヌダブリュ６ １ティーエックス，ウエスト ハンプステ ッド，ソレント ロード 64 (72)発明者 ジョーンズ，スティーブン タレン イギリス国，ハートフォードシャイヤー ダブリュディー７ ８エイチエー，ラッド レッド，ザ クローズ 10 (72)発明者 サルダナ，ホセ ウィリアム イギリス国，ミドルセックス イーエヌ１ １ティーイー，エンフィールド，リンカ ーン ウェイ 22

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトインターロイキン−６受容体（ヒト
    IL−6R）に対するマウスモノクローナル抗体の軽鎖（Ｌ
    鎖）可変領域（Ｖ領域）を含んで成る診断用試薬。
  2. 【請求項２】 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナ
    ル抗体の重鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域を含んで成る診断用試薬。
  3. 【請求項３】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトＬ鎖Ｖ領
    域を含んで成る診断用試薬。
  4. 【請求項４】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトＨ鎖Ｖ領
    域を含んで成る診断用試薬。
  5. 【請求項５】 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナ
    ル抗体のＬ鎖Ｖ領域と他の蛋白質との融合蛋白質を含ん
    で成る診断用試薬。
  6. 【請求項６】 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナ
    ル抗体のＨ鎖Ｖ領域と他の蛋白質との融合蛋白質を含ん
    で成る診断用試薬。
  7. 【請求項７】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトＬ鎖Ｖ領
    域と他の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る診断用試
    薬。
  8. 【請求項８】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトＨ鎖Ｖ領
    域と他の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る診断用試
    薬。
  9. 【請求項９】 ヒトIL−6Rに対するマウスＬ鎖Ｖ領域と
    ヒトＬ鎖Ｃ領域とから成るキメラＬ鎖を含んで成る診断
    用試薬。
  10. 【請求項１０】 ヒトIL−6Rに対するマウスＨ鎖Ｖ領域
    とヒトＨ鎖Ｃ領域とから成るキメラＨ鎖を含んで成る診
    断用試薬。
  11. 【請求項１１】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化Ｌ鎖を含
    んで成る診断用試薬。
  12. 【請求項１２】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化Ｈ鎖を含
    んで成る診断用試薬。
  13. 【請求項１３】 ヒトIL−6Rに対するマウスＬ鎖Ｖ領域
    とヒトＬ鎖Ｃ領域とから成るキメラＬ鎖と他の蛋白質と
    から成る融合蛋白質を含んで成る診断用試薬。
  14. 【請求項１４】 ヒトIL−6Rに対するマウスＨ鎖Ｖ領域
    とヒトＨ鎖Ｃ領域から成るキメラＨ鎖と他の蛋白質とか
    ら成る融合蛋白質を含んで成る診断用試薬。
  15. 【請求項１５】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化Ｌ鎖と他
    の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る診断用試薬。
  16. 【請求項１６】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化Ｈ鎖と他
    の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る診断用試薬。
  17. 【請求項１７】 ヒトIL−6Rに対するヒト−マウスキメ
    ラ抗体を含んで成る診断用試薬。
  18. 【請求項１８】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化抗体を含
    んで成る診断用試薬。
  19. 【請求項１９】 ヒトインターロイキン−６受容体（ヒ
    トIL−6R）に対するマウスモノクローナル抗体の軽鎖
    （Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）を含んで成る医薬。
  20. 【請求項２０】 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクロー
    ナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域を含んで成る医薬。
  21. 【請求項２１】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトＬ鎖Ｖ
    領域を含んで成る医薬。
  22. 【請求項２２】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトＨ鎖Ｖ
    領域を含んで成る医薬。
  23. 【請求項２３】 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクロー
    ナル抗体のＬ鎖Ｖ領域と他の蛋白質との融合蛋白質を含
    んで成る医薬。
  24. 【請求項２４】 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクロー
    ナル抗体のＨ鎖Ｖ領域と他の蛋白質との融合蛋白質を含
    んで成る医薬。
  25. 【請求項２５】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトＬ鎖Ｖ
    領域と他の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る医薬。
  26. 【請求項２６】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトＨ鎖Ｖ
    領域と他の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る医薬。
  27. 【請求項２７】 ヒトIL−6Rに対するマウスＬ鎖Ｖ領域
    とヒトＬ鎖Ｃ領域とから成るキメラＬ鎖を含んで成る医
    薬。
  28. 【請求項２８】 ヒトIL−6Rに対するマウスＨ鎖Ｖ領域
    とヒトＨ鎖Ｃ領域とから成るキメラＨ鎖を含んで成る医
    薬。
  29. 【請求項２９】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化Ｌ鎖を含
    んで成る医薬。
  30. 【請求項３０】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化Ｈ鎖を含
    んで成る医薬。
  31. 【請求項３１】 ヒトIL−6Rに対するマウスＬ鎖Ｖ領域
    とヒトＬ鎖Ｃ領域とから成るキメラＬ鎖と他の蛋白質と
    から成る融合蛋白質を含んで成る医薬。
  32. 【請求項３２】 ヒトIL−6Rに対するマウスＨ鎖Ｖ領域
    とヒトＨ鎖Ｃ領域から成るキメラＨ鎖と他の蛋白質とか
    ら成る融合蛋白質を含んで成る医薬。
  33. 【請求項３３】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化Ｌ鎖と他
    の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る医薬。
  34. 【請求項３４】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化Ｈ鎖と他
    の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る医薬。
  35. 【請求項３５】 ヒトIL−6Rに対するヒト−マウスキメ
    ラ抗体を含んで成る医薬。
  36. 【請求項３６】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化抗体を含
    んで成る医薬。
  37. 【請求項３７】 抗腫瘍剤である、請求項１９〜３６の
    いずれか１項に記載の医薬。
  38. 【請求項３８】 抗骨髄腫剤である請求項３７に記載の
    医薬。
  39. 【請求項３９】 抗多発性骨髄腫剤である請求項３８に
    記載の医薬。
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