JP2001083151A - ヒトインターロイキン−6受容体に対するキメラ抗体 - Google Patents
ヒトインターロイキン−6受容体に対するキメラ抗体Info
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Abstract
る新規な再構成ヒト抗体の提供。 【解決手段】 ヒト抗体L鎖C領域及びヒトIL−6Rに
対するマウスモノクローナル抗体のL鎖V領域、並びに
ヒト抗体のH鎖C領域及びヒトIL−6Rに対するマウス
モノクローナル抗体のH鎖V領域、からなるキメラ抗
体。ヒトに投与した場合の免疫原性が低い。
Description
キン−6受容体(IL−6R)に対するマウスモノクロ
ーナル抗体の可変領域(V領域)、ヒトIL−6Rに対
するヒト/マウスキメラ抗体、ヒトライト鎖(L鎖)V
領域及びヒトヘビー鎖(H鎖)V領域の相補性決定領域
(CDR)がヒトIL−6Rに対するマウスモノクロー
ナル抗体のCDRにより置き換えられている再構成(r
eshaped)ヒト抗体の使用に関する。本発明はさ
らに、上記の抗体又はその部分をコードするDNAを提
供する。本発明はさらに、前記DNAを含んで成るベク
ター、特に発現ベクター、並びに該ベクターにより形質
転換された宿主に関する。本発明はさらに、ヒトIL−
6Rに対するキメラ抗体の製造方法、及びヒトIL−6
Rに対する再構成ヒト抗体の製造方法を提供する。
連の細胞により生産される多機能サイトカインである。
このものは免疫応答、急性期反応及び造血を調節し、そ
して宿主防御機構において中心的役割を演ずる。このも
のは広範な組織に作用して、標的細胞の性質に応じて成
長誘導効果、成長阻害効果及び分化誘導効果を発揮す
る。IL−6に対する特異的レセプター(IL−6R)
は、IL−6の多機能性に従ってリンパ系細胞及び非リ
ンパ系細胞上で発現される。IL−6遺伝子の異常発現
が種々の疾患、特に自己免疫疾患、メサンジウム細胞増
殖性糸球体腎炎、及び形質細胞腫/骨髄腫の発病に関与
することが示唆されている(Hiranoら、Immu
nol.Today,11,443−449,1990
の総説を参照のこと)。ヒト骨髄腫細胞はIL−6を生
産しそしてIL−6Rを発現することが観察される。実
験において、IL−6に対する抗体が骨髄腫細胞の試験
管内での増殖を阻害し、そしてそれ故にヒト骨髄腫の発
癌においてオートクリン調節ループが機能していること
が示された(Kawanoら、Nature,332,
83,1988)。
し、そしてIL−6に特異的に結合し、そして細胞表面
上のIL−6R分子の数が報告されている(Taga
ら、J.Exp.Med.196,967,198
7)。さらに、ヒトIL−6RをコードするcDNAが
クローン化され、そしてIL−6Rの一次構造が報告さ
れている(Yamasakiら、Science,24
1,825,1988)。マウスのモノクローナル抗体
はヒトにおいて高度に免疫原性(「抗原性」という場合
もある)があり、そしてこの理由のため、ヒトにおける
それらの療法的価値は制限される。ヒトにおけるマウス
抗体の半減期は比較的短い。さらに、ヒト抗マウス抗体
は、予定された効果を妨害するのみならず、患者におけ
る不都合なアレルギー応答の危険をもたらす免疫応答を
惹起することなくして頻回投与することはできない。
(humanized)抗体の製造方法が開発された。
マウス抗体は2つの方法でヒト型化することができる。
より簡単な方法は、可変領域がもとのマウスモノクロー
ナル抗体に由来しそして定常領域が適当なヒト抗体に由
来するキメラ抗体を作製する方法である。得られるキメ
ラ抗体はもとのマウス抗体の完全な可変領域を含有し、
そしてもとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に
結合することを期待することができる。さらに、キメラ
抗体ではヒト以外に由来する蛋白質配列の比率が実質的
に減少しており、そしてそれ故にもとのマウス抗体に比
べて免疫原性が低いと予想される。キメラ抗体は抗原に
よく結合しそして免疫原性が低いが、マウス可変領域に
対する免疫応答がなお生ずる可能性がある(LoBug
lioら、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,84,4220−4224,1989)。
法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免
疫原性をさらに大幅に低下させるものである。この方法
においては、マウス抗体の可変領域からの相補性決定領
域(complementarity determi
ning region;CDR)をヒト可変領域に移
植して「再構成」(reshaped)ヒト可変領域を
作製する。次に、これらの再構成ヒト可変領域をヒト定
常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型化抗体
のヒト以外の蛋白質配列に由来する部分はCDRと極く
一部のフレームワーク(FR)のみである。CDRは超
可変蛋白質配列により構成されている。これらは種特異
的配列を示さない。これらの理由のため、マウスCDR
を担持する再構成ヒト抗体はもはやヒトCDRを含有す
る天然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずであ
る。
のために有用であると予想されるが、ヒトIL−6Rに
対する再構成ヒト抗体は知られていない。さらに、再構
成ヒト抗体の製造方法であって任意の特定の抗体に普遍
的に適用し得る方法は存在しない。従って、特定の抗原
に対する十分に活性な再構成ヒト抗体を作製するために
は種々の工夫が必要である。ヒトIL−6Rに対するマ
ウスモノクローナル抗体、すなわちPM1およびMT1
8は作製されており(特願平2−189420)、そして本発
明者らはヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル
抗体AUK12−20、AUK64−7及びAUK14
6−15を調製しているが、本発明者らはヒトIL−6
Rに対する再構成ヒト抗体の作製を示唆する文献を知ら
ない。さらに、ヒト骨髄腫細胞株が移植されたヌードマ
ウスに、ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル
抗体が注射された時腫瘍の増殖が顕著に阻害されること
を、本発明者らは見出した。このことは、骨髄腫の治療
のための療法剤として抗ヒトIL−6R抗体が有用であ
ることを示唆している。
L−6Rに対する、免疫原性の低い抗体を提供しようと
するものである。
L−6Rに対する再構成ヒト抗体を提供する。本発明は
また、該再構成ヒト抗体の作製の過程で有用なヒト/マ
ウスキメラ抗体を提供する。本発明はさらに、再構成ヒ
ト抗体の部分、並びに再構成ヒト抗体及びその部分並び
にキメラ抗体の製造のための発現系を提供する。さらに
具体的には、本発明は、ヒトIL−6Rに対するマウス
モノクローナル抗体のL鎖V領域;並びにヒトIL−6
Rに対するマウスモノクローナル抗体のH鎖V領域を提
供する。
及びヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体
のL鎖V領域を含んで成るL鎖;並びに(2)ヒトH鎖
C領域、及びヒトIL−6Rに対するマウスモノクロー
ナル抗体のH鎖V領域を含んで成るH鎖;を含んで成
る、ヒトIL−6Rに対するキメラ抗体を提供する。
マウスモノクローナル抗体のL鎖V領域のCDR;並び
にヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体の
H鎖V領域のCDRを提供する。本発明はさらに、
(1)ヒトL鎖V領域のフレームワーク領域(FR)、
及び(2)ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナ
ル抗体のL鎖V領域のCDR、を含んで成る、ヒトIL
−6Rに対する抗体の再構成ヒトL鎖V領域;並びに
(1)ヒトH鎖V領域のFR、及び(2)ヒトIL−6
Rに対するマウスモノクローナル抗体のH鎖V領域のC
DR、を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する抗体の再
構成ヒトH鎖V領域を提供する。
並びに(2)ヒトFR、及びヒトIL−6Rに対するマ
ウスモノクローナル抗体のCDRを含んで成るL鎖V領
域、を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する抗体の再構
成ヒトL鎖;並びに(1)ヒトH鎖C領域、並びに
(2)ヒトFR、及びヒトIL−6Rに対するマウスモ
ノクローナル抗体のCDRを含んで成るH鎖V領域、を
含んで成る、ヒトIL−6Rに対する抗体の再構成ヒト
H鎖を提供する。
鎖C領域、並びに(2)ヒトL鎖FR、及びヒトIL−
6Rに対するマウスモノクローナル抗体のL鎖CDRを
含んで成るL鎖;並びに(B)(1)ヒトH鎖C領域、
並びに(2)ヒトH鎖FR、及びヒトIL−6Rに対す
るマウスモノクローナル抗体のH鎖CDRを含んで成る
H鎖;を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する再構成ヒ
ト抗体を提供する。
プチド、又はその部分をコードするDNAに関する。本
発明はまた、上記DNAを含んで成るベクター、例えば
発現ベクターに関する。本発明はさらに、上記ベクター
により形質転換された宿主を提供する。本発明はさらに
また、ヒトIL−6Rに対するキメラ抗体の製造方法、
及びヒトIL−6Rに対する再構成ヒト抗体の製造方法
を提供する。
のクローニング さらに詳しくは、ヒトIL−6Rに対するマウスモノク
ローナル抗体のV領域をコードするDNAをクローン化
するためには、遺伝子源として、ヒトIL−6Rに対す
るモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製
することが必要である。この様なハイブリドーマとし
て、特願平2−189420号明細書にはモノクローナル抗体
PM1を生産するマウスハイブリドーマPM1及び該抗
体の性質が記載されている。本明細書の参考例2にハイ
ブリドーマPM1の作製方法を記載する。本発明者ら
は、それぞれがヒトIL−6Rに対するマウスモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマAUK12−2
0、AUK64−7及びAUK146−15を作製して
いる。これらのハイブリドーマの作製方法は本明細書の
参考例3に記載されている。
ードする目的のDNAをクローン化するためハイブリド
ーマ細胞を破壊し、そしてChirgwinら、Bio
chemistry 18,5294,1977に記載
されている常法により全RNAを得る。次に、この全R
NAを用いて、J.W.Larrickら、Biote
chnology,7,934,1989に記載されて
いる方法を用いて一本鎖cDNAを合成する。
を用いて前記cDNAの有意義な部分の特異的増幅を行
う。マウスモノクローナル抗体のカッパ(κ)型L鎖V
領域の増幅のため、配列番号:1〜11に示す11種の
オリゴヌクレオチドプライマー(Mouse Kapp
a Variable;MKV)及び配列番号:12に
示すオリゴヌクレオチドプライマー(Mouse Ka
ppa Constant;MKC)をそれぞれ5′−
末端プライマー及び3′−末端プライマーとして使用す
る。
鎖リーダー配列をコードするDNA配列とハイブリダイ
ズし、そして前記MKCプライマーはマウスカッパ型L
鎖C領域をコードするDNA配列とハイブリダイズす
る。マウスモノクローナル抗体のH鎖V領域の増幅のた
め、配列番号:13〜22に示す10種のオリゴヌクレ
オチドプライマー(Mouse Heavy Vari
able;MHV)及び配列番号:23に示すオリゴヌ
クレオチドプライマー(Mouse HeavyCon
stant;MHC)をそれぞれ5′−末端プライマー
及び3′−末端プライマーとして使用する。
末端近傍に制限酵素SalI切断部位を提供する配列G
TCGACを含有し、そして3′−末端プライマーはそ
の5′−末端近傍に制限酵素Xmal切断部位を提供す
るヌクレオチド配列CCCGGGを含有する。これらの
制限酵素切断部位は可変領域をコードする目的のDNA
断片をクローニングベクターにサブクローニングするた
めに用いられる。
maIで切断させて、マウスモノクローナル抗体の目的
とする可変領域をコードするDNA断片を得る。他方、
プラスミドpUC19のごとき適当なクローニングベク
ターを同じ制限酵素SalI及びXmaIにより切断さ
せ、このpUC19に前記DNA断片を連結することに
より、マウスモノクローナル抗体の目的とする可変領域
をコードするDNA断片を含むプラスミドを得る。クロ
ーン化されたDNAの配列決定は任意の常法に従って行
うことができる。目的とするDNAのクローン化及びそ
の配列決定を実施例1〜3に具体的に記載する。
決定領域(CDR)を提供する。L鎖及びH鎖の各対の
V領域は抗原結合部位を形成する。L鎖及びH鎖上のこ
の領域は同様の全般的構造を有しそして各領域は配列の
比較的保存された4個のフレームワーク領域を含み、そ
れらは3個の超可変領域又はCDRにより連結されてい
る(Kabat,E.A.ら、「Sequences
of Proteins ofImmunologic
al Interest」,USDept.Healt
h and Human Services 198
3)。
多くの部分はβ−シート構造をとり、CDRはループを
形成する。CDRはある場合にはβ−シート構造の一部
分を形成することもある。CDRはFRによって非常に
近い位置に保持され、そして他の領域のCDRと共に抗
原結合部位の形成に寄与する。本発明は、ヒト型化抗体
の素材として有用なこれらのCDR、及びそれをコード
するDNAをも提供する。これらのCDR領域は、V領
域の既知アミノ酸配列と照合することによって、Kab
at,E.A.ら、「Sequences of Pr
oteinsof Immunological In
terest」の経験則から見出すことができ、実施例
4において具体的に説明する。
するに先立って、使用するCDRが実際に抗原結合領域
を形成することを確かめる必要がある。この目的のた
め、キメラ抗体を作製した。さらに実施例1及び2に記
載される4種類のモノクローナル抗体のクローン化され
たDNAのヌクレオチド配列から推定されるマウス抗ヒ
トIL−6R抗体のアミノ酸配列を相互に、及び既知の
マウス及びヒトの抗体のV領域と比較した。4種類のモ
ノクローナル抗体のそれぞれについて、1セットの典型
的な機能的マウスL及びH鎖V領域がクローニングされ
た。しかしながら、4種類すべてのマウス抗ヒトIL−
6R抗体は比較的異なるV領域を有していた。4種類の
抗体は相互に単に微小な相違ではなかった。クローン化
されたマウスV領域を用いて4種類のキメラ抗ヒトIL
−6R抗体を作製した。
は、PCR−クローン化cDNAに見られるようなマウ
スリーダー配列及びV領域配列を、哺乳類細胞発現ベク
ター中にすでに存在するヒトC領域をコードする配列に
連結することを含んで成る。前記4種類のモノクローナ
ル抗体の内、モノクローナル抗体AUK12−20から
のキメラ抗体の作製を実施例5に記載する。
抗体の作製を実施例6に記載する。マウスPM−1κL
鎖リーダー領域及びV領域をコードするcDNAを、ヒ
トL鎖C領域をコードするヒトゲノムDNAを含有する
発現ベクターにPCR法を用いてクローン化した。マウ
スPM−1抗体(単に「PM−1抗体」又は「PM」と
いう場合もある)のH鎖リーダー及びV領域をコードす
るcDNAを、ヒトγ−1C領域をコードするゲノムD
NAを含有する発現ベクターにPCR法を用いてサブク
ローン化した。
て、マウスPM−1抗体のV領域をコードするcDNA
をそれらの5′−及び3′−末端において適当な塩基配
列を導入して(1)それらが発現ベクターに容易に挿入
されるように、且つ(2)それらが該発現ベクター中で
適切に機能するようにした。次に、これらのプライマー
を用いてPCRにより増幅して得たマウスPM−1抗体
のV領域を、所望のヒトC領域をすでに含有するHCM
V発現ベクター(図1)に挿入した。これらのベクター
は、種々の哺乳類細胞系における遺伝子操作された抗体
の一過性(transient)発現又は安定な発現の
ために適当である。
同じV領域を有するキメラPM−1抗体(バージョン
a)の作製に加えて、キメラPM−1抗体の第二のバー
ジョン(バージョンb)を作製した。キメラPM−1抗
体(バージョンb)においては、L鎖V領域中の位置1
07のアミノ酸がアスパラギンからリジンに変えられて
いる。マウスPM−1抗体からのL鎖V領域と他のマウ
スL鎖V領域との比較において、位置107におけるア
ルギニンの存在は異常であることが注目された。
7の最も典型的アミノ酸はリジンである。マウスPM−
1抗体のL鎖V領域中の位置107に非典型的なアミノ
酸であるアルギニンを有することの重要性を評価するた
め、位置107を典型的なアミノ酸であるリジンに変え
た。この変更は、PCR−変異誘発法(M.Kamma
nら、Nucl.Acids Res.(1987)1
7:5404)を用いてL鎖V領域をコードするDNA
配列中に必要な変更を行うことにより達成された。
トIL−6Rに結合する活性を示した。キメラPM−1
抗体バージョン(b)もバージョン(a)と同様にヒト
IL−6Rに結合する。同様に、他の2種類のモノクロ
ーナル抗体AUK64−7及びAUK146−15から
キメラ抗体を作製した。4種類すべてのキメラ抗体はヒ
トIL−6Rによく結合し、機能的測定において、正し
いマウスV領域がクローン化されそして配列が決定され
ていたことが示された。
ら、ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト抗体の設計及び
作製のための第一の候補としてマウスPM−1抗体を選
択した。マウスPM−1抗体の選択は主として、ヌード
マウスに移植されたヒト骨髄腫細胞に対するマウス抗ヒ
トIL−6R抗体及びキメラ抗体の効果を研究して得ら
れた結果に基く。4種類のマウス抗ヒトIL−6R抗体
の内、PM−1抗体が最も強い抗腫瘍細胞活性を示し
た。又、キメラPM−1抗体はキメラAUK12−20
抗体よりも強い抗腫瘍活性を示した。
域と既知のマウス及びヒトの抗体のV領域との比較 マウスモノクローナル抗体のCDRがヒトモノクローナ
ル抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するため
には、マウスモノクローナル抗体のFRとヒトモノクロ
ーナル抗体のFRとの間に高い相同性が存在することが
望ましい。従って、マウスPM−1抗体のL鎖及びH鎖
のV領域を、OWL(or Leeds)databa
se of protein sequencesに見
出されるすべての既知マウス及びヒトのV領域と比較し
た。
抗体のL鎖V領域はマウス抗体musigkcko(C
hen,H.T.ら、J.Biol.Chem.(19
87)262:13579−13583)のL鎖V領域
と最も類似しており、93.5%の同一性(ident
ity)が存在した。PM−1抗体のH鎖V領域はマウ
ス抗体musigvhr2(F.J.Grantら、N
ucl.AcidsRes.(1987)15:549
6)のH鎖V領域に最も類似しており、84.0%の同
一性が存在した。マウスPM−1抗体のV領域は既知マ
ウスV領域に高比率の同一性を示し、マウスPM−1抗
体のV領域が典型的なマウスV領域であることが示され
る。このことはさらに、クローン化されたDNA配列が
正しいという間接的な証明を与える。一般に、H鎖V領
域間に比べてL鎖V領域間の方がより高い比率の同一性
が存在する。これはおそらく、H鎖V領域に比べてL鎖
V領域において一般的に観察されるより少ない量の多様
性のためであろう。
−1抗体のL鎖V領域は、REIとも称されるヒト抗体
klhure(W.Palmら、Physiol.Ch
em.(1975)356:167−191)のL鎖V
領域に最も類似しており、72.2%の同一性が存在す
る。PM−1抗体のH鎖V領域は、ヒト抗体humig
hvap (VAP)(H.W.Schroederら、S
cience (1987) 238:791−793)に
最も類似しており、71.8%の同一性が存在する。マ
ウスPM−1抗体からの再構成抗体をいかに設計するか
を考えるためにヒトV領域との比較が最も重要である。
ヒトV領域への同一性の比率はマウスV領域への同一性
の比率より低い。これはマウスPM−1抗体のV領域が
マウスV領域に類似しており、そしてヒトV領域には類
似していないことの間接的証明である。この証明にま
た、ヒト患者における免疫原性の問題を解決するために
マウスPM−1のV領域をヒト型化する(humani
ze)ことが最善であることを示す。
A. Kabatら、(1987)Sequences ofProteins of Immuno
logical Interest, Forth Edition, U.S. Department o
f Health and Human Services, U.S. Government Print
ing Officeにより定義される、ヒトV領域の異なるサブ
グループについてのコンセンサス配列と比較した。V領
域のFR間で比較を行った。その結果を表1に示す。
ヒトL鎖V領域のサブグループI(HSGI)のコンセ
ンサス配列からのFRに最も類似しており、70.1%
の同一性が存在する。マウスPM−1のH鎖V領域のF
RはヒトH鎖V領域のサブグループII(HSGII)のコ
ンセンサス配列からのFRに最も類似しており、52.
9%の同一性が存在する。これらの結果は、既知のヒト
抗体との比較から得られた結果を支持している。ヒトR
EI中のL鎖V領域はヒトL鎖V領域のサブグループI
に属し、そしてヒトVAP中のH鎖V領域はヒトH鎖V
領域のサブグループIIに属する。
ら、再構成ヒトPM−1抗体のV領域の設計の基礎とな
るヒトV領域を選択することが可能である。再構成ヒト
PM−1抗体L鎖V領域の設計のためにはサブグループ
I(HSGI)に属するヒトL鎖V領域を使用し、そし
て再構成ヒトPM−1抗体H鎖V領域の設計のためには
サブグループII(HSGII)に属するヒト抗体H鎖V領
域を用いるのが最善であろう。
は、設計の基礎となるヒト抗体V領域を選択することで
あった。マウスPM−1抗体L鎖V領域中のFRは、サ
ブグループIに属するヒト抗体L鎖V領域中のFRに最
も類似していた(表1)。前記のごとく、マウスPM−
1抗体のL鎖V領域と既知ヒト抗体L鎖V領域との比較
において、それはヒトL鎖V領域のサブグループIの1
構成員であるヒトL鎖V領域REIに最も類似してい
た。従って、再構成ヒトPM−1抗体L鎖V領域の設計
においてREIからのFRを使用した。また、再構成ヒ
トPM−1抗体L鎖V領域の作製のための出発材料とし
てREIのFRを使用した。
とのヒトREIに比べて5個の相違が存在する(kab
atら、1987、によれば位置39,71,104,
105及び107;表2を参照のこと)。FR4中の3
個の変化(位置104,105及び107)は他のヒト
κL鎖からのJ領域に基いており、そしてそれ故にヒト
からの逸脱を成すものではない(L.Riechman
nら、Nature(1988)322:21−2
5)。位置39及び71における2個の変化はラットC
AMPATH−1抗体のL鎖V領域のFR中に存在する
アミノ酸にもどる変化であった(Riechmann
ら、1988)。
のバージョンを設計した。第一のバージョン(バージョ
ン「a」)においては、ヒトFRは再構成ヒトCAMP
ATH−1H抗体中に存在するREIに基くFR(Ri
echmannら、1988)と同一であり、そしてマ
ウスCDRはマウスPM−1抗体のL鎖V領域中のCD
Rと同じであった。第二のバージョン(バージョン
「b」)はバージョン「a」に基き、ヒトFR3中の位
置71におけるアミノ酸1個のみを異にする。C.Ch
othiaら、J.Mol.Biol.(1987)1
96:901−917により定義されるように、残基7
1はL鎖V領域のCDR1の標準的(canonica
l)構造の部分である。この位置のアミノ酸はL鎖V領
域のCDR1ループの構造に直接影響すると予想され、
そしてそれ故に抗体結合に大きく影響するであろう。
て、位置71はチロシンである。再構成ヒトPM−1抗
体のL鎖V領域のバージョン「a」の設計に使用した修
飾されたREIのFRにおいては位置71はフェニルア
ラニンであった。再構成ヒトPM−1抗体L鎖V領域の
バージョン「b」においては、位置71のフェニルアラ
ニンがマウスPM−1抗体L鎖V領域中に見出されるよ
うにチロシンに変えられている。表2は、マウスPM−
1抗体のL鎖V領域、再構成ヒトCAMPATH−1H
抗体中での使用のために修飾されたREIのFR(Ri
echmannら、1988)及び再構成ヒトPM−1
抗体のL鎖V領域の2種類のバージョンの、それぞれの
アミノ酸配列を示す。
TH−1H抗体中に見出されるものである(Riech
mannら、1988)。REIのFR中の5個の下線
を付したアミノ酸はヒトREIのアミノ酸配列(Pla
mら、1975;0.Eppら、Biochemist
ry(1975)14:4943−4952)から異な
るアミノ酸である。マウスPM−1抗体のH鎖V領域中
のFRはサブグループIIに属するヒトH鎖V領域に最も
類似している(表1)。前記のごとく、マウスPM−1
抗体のH鎖V領域と既知のヒトH鎖V領域との比較にお
いて、これはヒトH鎖V領域のサブグループIIの1構成
員であるヒトH鎖V領域VAPに最も類似していた。ヒ
トH鎖V領域のサブグループIIの他の構成員であるヒト
H鎖V領域NEWを、再構成ヒトPM−1抗体のH鎖V
領域の作製のための出発材料として、及び再構成ヒトP
M−1抗体のH鎖V領域の設計のための基礎として用い
た。
類のバージョンを設計した。6種類のバージョンのすべ
てにおいて、ヒトFRは再構成D1.3中に存在するN
EWFRに基いており、そしてマウスCDRはマウスP
M−1抗体H鎖V領域中のCDRと同じである。ヒトF
R中の7個のアミノ酸残基(位置1,27,28,2
9,30,48及び71;表3参照)は抗原結合に不都
合な影響を与える可能性を有するものと同定されてい
る。マウスPM−1抗体のV領域のモデルにおいて、H
鎖V領域中の残基1はCDRループの近くに位置する表
面残基である。
Chothiaら、Nature(1989)34:8
77−882により推定されるようにH鎖V領域のCD
R1の標準的(canonical)構造の部分であ
り、そして/又はH鎖V領域の第一構造ループの部分を
構成することがマウスPM−1抗体V領域のモデルにお
いて観察される(Chothiaら、1987)。残基
48はマウスPM−1抗体のV領域のモデルにおいて埋
った(buried)残基として観察された。埋った
(buried)残基の変化はV領域及びその抗原結合
部位の全体構造を破壊する可能性がある。残基71は、
Chothiaら(1989)により予想されるように
H鎖V領域のCDR2の標準(canonical)構
造の部分である。再構成ヒトPM−1抗体の6種類のバ
ージョンはヒトNEWのFR中のこれら7つの位置のア
ミノ酸の変化の異る組合わせを含む(表3を参照のこ
と)。
ATH−1H抗体の第一バージョン(Riechman
nら、1988)中に見出されるものである。
るDNAの作製 再構成ヒトPM−1抗体L鎖及びH鎖V領域のそれぞれ
の第一バージョンをコードするDNAを新規なPCR利
用法を用いて作製した。要約すれば、適当なヒトFRを
すでに含有する再構成ヒトV領域をコードするプラスミ
ドをPCRプライマーを用いて修飾し、ヒトV領域中に
存在するCDRをマウスPM−1抗体からのCDRによ
り置換した。再構成ヒトPM−1抗体L鎖V領域をコー
ドするDNAの作製のための出発材料は、再構成ヒトD
1.3L鎖V領域をコードするDNAを含有するプラス
ミドDNAであった。この再構成ヒトD1.3L鎖V領
域はヒトL鎖V領域REI中に存在するFRに基いて作
製された。再構成ヒトPM−1抗体H鎖V領域をコード
するDNAの作製のための出発材料は再構成ヒトD1.
3H鎖V領域をコードするDNAであった。この再構成
ヒトD1.3抗体H鎖V領域をコードするDNAはヒト
H鎖V領域NEW(W.Verhoeyenら、Sci
ence(1988)239:1534−1536)の
FRをコードするDNAに基いて作製された。
する出発プラスミドDNAを選択した後、マウスD1.
3CDRに代るマウスPM−1抗体CDRの置換を可能
にするようにPCRプライマーを設計しそして合成し
た。各再構成ヒトPM−1抗体V領域につき、3種類の
プライマーはマウスPM−1抗体CDRをコードするD
NA配列を含有し、そして2種類のプライマーは再構成
ヒトV領域をコードする全体DNA配列を挟むように設
計されている。一連のPCR反応における5種類のPC
Rプライマーの使用が、出発再構成ヒトV領域中に存在
するヒトFRをコードするDNA及びマウスPM−1抗
体V領域中に存在するCDRをコードするDNAから成
るPCR生成物をもたらした(実施例7、並びに図7及
び図8を参照のこと)。PCR生成物をクローン化し、
そして配列決定して、再構成ヒトPM−1抗体L鎖及び
H鎖V領域のバージョン「a」の全体DNA配列が正し
いアミノ酸配列をコードしていることを確認した。再構
成ヒトPM−1抗体L鎖V領域バージョン「a」の配列
を配列番号55に示す。
ジョンをコードするDNAは、公表されているPCR−
変異誘発法(Kammanら、1989)にわずかな変
更を加えた方法を用いて作製した。再構成ヒトPM−1
抗体V領域の設計に関して記載したように、再構成ヒト
PM−1抗体L鎖V領域の1つの追加のバージョン(バ
ージョン「b」)をコードするDNAを作製し、そして
再構成ヒトPM−1抗体H鎖V領域の5種類の追加のバ
ージョン(バージョン「b」,「c」,「d」,
「e」、及び「f」をコードするDNAを作製した。こ
れらの追加のバージョンは、第一バージョンからの一連
の微細な変化を含む。アミノ酸配列のこれらの微細な変
化はPCR変異誘発を用いてDNA配列の微細な変更を
行うことにより達成された。DNA配列に必要な変化を
導入するPCRプライマーが設計された。一連のPCR
反応に続き、PCR生成物をクローン化し、そして配列
決定してDNA配列中の変化が計画通りに起っているこ
とを確認した。再構成ヒトPM−1抗体H鎖V領域バー
ジョン「f」の配列を配列番号54に示す。
ージョンのDNA配列を確認した後、再構成ヒトPM−
1抗体V領域をコードするDNAを、ヒトC領域をコー
ドするDNAをすでに含有する哺乳類細胞発現ベクター
にサブクローニングした。すなわち、再構成ヒトPM−
1抗体L鎖V領域をコードするDNAをヒトL鎖C領域
をコードするDNA配列に連結し、再構成ヒトPM−1
抗体H鎖V領域をコードするDNAをヒトγ−1C領域
をコードするDNA配列に連結した。再構成ヒトPM−
1抗体のより高いレベルの発現を達成するため、図1に
示すようなHCMV発現ベクターを修飾して、HCMV
プロモーター・エンハンサー領域をヒトエロンゲーショ
ンファクター(human elongation f
actor;HEF−1α)プロモーター・エンハンサ
ーにより置き換えた(図15を参照のこと)。
(a)と、H鎖V領域バージョン(a)〜(f)のすべ
ての組合せをヒトIL−6Rへの結合について試験し、
そしてその結果、実施例11に詳細に記載するように、
L鎖バージョン(a)とH鎖バージョン(f)とを含ん
で成る再構成ヒト抗体がキメラPM−1抗体(a)と同
じレベルでIL−6Rに結合する能力を示した。
トPM−1抗体V領域をコードするDNAの変更 COS細胞中で生産される再構成ヒトPM−1抗体の発
現レベルの検討において、再構成ヒトH鎖の発現が常
に、再構成ヒトL鎖又はキメラL鎖もしくはH鎖の発現
レベルに比べて約10分の1であることが明らかになっ
た。低レベルの発現を生じさせる問題点は再構成ヒトH
鎖V領域にあるようであった。低レベルの発現が低レベ
ルの転写の結果であるか否かを特定するため、再構成ヒ
トPM−1抗体L鎖及びH鎖を発現する各ベクターによ
り同時形質転換されたCOS細胞からRNAを調製し
た。マウスPM−1抗体V領域をコードするDNAのP
CRクローニングについて記載したようにして一本鎖c
DNAを合成した。再構成ヒトL鎖又はH鎖V領域をコ
ードするDNA配列の両端を挟むように設計されたPC
Rプライマーを用いて、再構成ヒトL鎖V領域又は再構
成H鎖V領域に対応する前記一本鎖cDNAからPCR
生成物を生成せしめた。
について、2種類のPCR生成物が存在し、一方は予想
通り408bpの長さを有し、他方はより短い299bpの
PCR生成物であった。正しいサイズのPCR生成物は
PCR生成物の全生成量の約90%を占め、そして短い
PCR生成物は全生成量の約10%を占めた。再構成ヒ
トH鎖V領域についてもやはり2種類のPCR生成物が
存在し、一方は予想通り444bpの長さを有し、そして
他方は370bpの長さの短いPCR生成物であった。し
かしながらこの場合、正しくない短い方のPCR生成物
がPCR生成物の全生成量の大部分、すなわち約90%
を占めた。正しいサイズのPCR生成物はPCR生成物
の全生成量の約10%に過ぎなかった。これらの結果
は、再構成ヒトV領域をコードするRNAの幾らかが欠
失を含むことを示した。
短い方のPCR生成物をクローニングし、そして配列決
定した。DNA配列から、L鎖及びH鎖V領域のいずれ
についてもDNAの特定の部分が欠けていることが明ら
かになった。除去された配列を挟むDNA配列の検討に
より、これらの配列はスプライスドナー−アクセプター
配列のコンセンサス配列(Breathnach.R
ら、Ann.Rev.Biochem.(1981)5
0:349−383)に相当することが明らかとなっ
た。再構成ヒトH鎖の低い発現レベルは、再構成ヒトH
鎖V領域の設計が、どちらかと言えば効果的なスプライ
スドナー−アクセプター部位を不注意に形成させたため
であると説明された。さらに、再構成ヒトL鎖V領域の
設計はどちらかと言えば非効果的なスプライスドナー−
アクセプター部位を不注意に形成させたようであった。
これらのスプライスドナー−アクセプター部位を除去す
るため、ヒトPM−1抗体L鎖及びH鎖V領域のそれぞ
れバージョン「a」及び「f」をコードするDNA配列
のわずかな変更を前記のPCR−変異誘発法を用いて行
った。
L鎖及びH鎖V領域(配列番号:54及び55)の両者
のリーダー配列をコードするDNA中のイントロンの存
在であると考えられた。これらのイントロンはもとも
と、再構成ヒトD1.3抗体のV領域(Verhoey
enら、1988)をコードするDNAの作製において
使用されたマウスμH鎖リーダー配列(M.S.Neu
bergerら、Nature(1985)314:2
68−270)をコードするDNAに由来する。再構成
ヒトD1.3抗体をコードするDNAは、マウス免疫グ
ロブリンプロモーターを用いる哺乳類細胞ベクターにお
いて発現されたためマウスリーダーイントロンの存在が
重要であった。
モーターからの発現のためには重要であるが、しかしH
CMVのごときウィルスプロモーターからの発現のため
には重要でない(M.S.Neubergerら、Nu
cl.Acids Res.(1988)16:671
3−6724)配列を含有している。再構成ヒトPM−
1抗体L鎖及びH鎖をコードするDNAが免疫グロブリ
ンプロモーター以外のプロモーターを用いるベクターに
おいて発現される場合、リーダー配列中のイントロン
は、再構成ヒトV領域をコードするDNAのPCR−ク
ローニングにより除去された(実施例12を参照のこ
と)。
因は、再構成ヒトPM−1抗体H鎖V領域をコードする
DNAとヒトγ−1C領域をコードするDNAとの間の
イントロン内の約190bpの非機能的DNAの存在であ
ると考えられた。再構成ヒトBI−8H鎖V領域(P.
T.Jonesら、Nature(1986)321:
522−525)をコードするDNAにもともと由来す
るDNA配列から再構成ヒトPM−1H鎖V領域をコー
ドするDNAを作製した。この最初の再構成ヒトV領域
をコードするDNAはマウスNPのH鎖V領域(M.
S.Neubergerら、Nature;M.S.N
eubergerら、EMBO J.(1983)2:
1373−1378)をコードするDNAから作製され
た。再構成ヒトH鎖V領域をコードするDNAと、発現
ベクターに再構成ヒトV領域をコードするDNAを連結
するためのBamHI部位との間のイントロン中に存在
する約190bpのこのストレッチは、再構成ヒトV領域
をコードするDNAのPCRクローニングの過程で除去
された。
構成ヒトPM−1抗体L鎖及びH鎖V領域の最終バージ
ョンのDNA配列及びアミノ酸配列を配列番号:57及
び56に示す。これらのDNA配列は、表2に示した再
構成ヒトPM−1抗体L鎖V領域のバージョン「a」、
並びに表3に示した再構成ヒトPM−1抗体H鎖V領域
のバージョン「f」をコードする。HEF−1α発現ベ
クター(図15)に挿入された場合、これらのベクター
はトランスフェクトされたCOS細胞中で約2μg/ml
の抗体を一過性に生産する。より多量の再構成ヒトPM
−1抗体を安定的に生産させるため、dhfr遺伝子を
組み込んだ新しいHEF−1α発現ベクターを作製した
(実施例10及び図11を参照のこと)。
プロモーターを連結したdhfr遺伝子を、ヒトγ−1
H鎖を発現するHCMVベクターについて記載したのと
同様にして、ヒトγ−1H鎖を発現するHEF−1αベ
クターに導入した。再構成ヒトPM−1抗体L鎖を発現
するHEF−1αベクター及び再構成ヒトPM−1抗体
H鎖を発現するHEF−1α−dhfrベクターをCH
O dhfr(−)細胞に同時形質転換した。安定に形
質転換されたCHO細胞系を、ヌクレオシドを含有せず
10%のFCS及び500μg/mlのG418を含有す
るAlpha−Minimum Essential
Medium(α−MEM)中で選択した。遺伝子増幅
工程に先立って、CHO細胞系は10μg/106 細胞
/日までの再構成ヒトPM−1抗体を生産することが観
察された。
0のV領域と既知のヒト抗体のV領域との比較 マウスモノクローナル抗体AUK12−20のカッパー
L鎖(κL)V領域のFRとヒトκL鎖V領域のサブグ
ループ(HSG)I〜IVのFRとの相同性、及びマウス
モノクローナル抗体AUK12−20のH鎖V領域のF
RとヒトH鎖V領域のサブグループ(HSG)I〜III
のFRとの相同性を表4に示す。
抗体AUK12−20のカッパーL鎖(κL)V領域
は、ヒトκL鎖V領域のサブグループ(HSG)I〜IV
とそれぞれ同程度(64〜68%)の相同性を示す。タ
ンパクのData base“LEEDS”の検索よ
り、HSG−IVに属するヒト抗体Len(M.Schn
eiderら、Physiol.Chem.356,5
07−557,1975)のL鎖V領域が最も高い68
%の相同性を示す。一方、マウスモノクローナル抗体P
M−1のヒト型化に用いられているヒト抗体REIはH
SG−Iに属し、マウスモノクローナル抗体AUK12
−20のL鎖V領域とは、62%の相同性を示す。また
マウスモノクローナル抗体AUK12−20のL鎖のc
anonical構造を調らべてみると(C.Chot
hiaら、J.Mol.Biol.(1987)19
6:901〜917)、特にL鎖CDR2(L2)がL
enよりREIとよく一致する。
UK12−20のL鎖V領域のヒト型化に用いるヒト抗
体は必ずしもHSG−IVに属する抗体から選ぶ必要もな
く、マウスモノクローナル抗体AUK12−20のL鎖
V領域のヒト型化には、マウスモノクローナル抗体PM
−1のL鎖V領域のヒト型化の場合と同様にREIを用
いる。
H鎖V領域は、ヒトH鎖V領域のサブグループI(HS
G−I)と最も高い相同性を示す。また、Data b
ase“LEEDS”の検索により、やはりHSGIに
属するヒト抗体HAX(Stollar,B.D.ら、
J.Immunol.139,2496−2501,1
987)がAUK12−20抗体のH鎖V領域に対して
約66%の相同性を示す。そこで再構成ヒトAUK12
−20抗体のH鎖V領域の設計においては、HSGIに
属するヒト抗体HAXのFR、及び同様にHSGIに属
するFRを含有するヒト型化425抗体H鎖V領域(K
ettleborough C.A.,ら、Prote
in Engineering,4,773−783,
1991)のFRを用いる。ちなみに、AUK12−2
0抗体H鎖V領域はヒト型化425抗体H鎖V領域のバ
ージョンaと約64%の相同性を示す。
域の設計 前記の理由により再構成ヒトAUK12−20抗体L鎖
V領域のFRとしてREIのFRを使用し、表5に示す
ように再構成ヒトAUK12−20抗体L鎖V領域を設
計した。
域の設計 前記の理由により、再構成ヒトAUK12−20抗体H
鎖V領域の設計に再構成ヒトVH a425のFRを用い
る。ところで、こうして設計した再構成ヒトAUK12
−20抗体H鎖V領域をコードするDNAのヌクレオチ
ド配列はスプライス供与配列とよく一致する配列を有す
ることが見出された。このことから、再構成ヒトPM−
1抗体の場合と同様に異常なスプライシングが再構成ヒ
トAUK12−20抗体の発現においても起こる可能性
がある。このため、ヌクレオチド配列を部分的に変更す
ることにより、スプライス供与配列様の配列を除去し
た。この修正された配列をバージョンaと称する。さら
に、再構成ヒトAUK12−20抗体H鎖V領域のバー
ジョンb〜dを設計した。バージョンa〜dのアミノ酸
配列を表6に示す。
I)において1種類の共通アミノ酸が特定できない位置
はXで示す。アンダーラインを付した2個のアミノ酸は
HSGIコンセンサス配列中のアミノ酸と異る。RVH
b,RVH c及びRVH dについてはRVH aと異るア
ミノ酸残基のみが示してある。さらに、ヒト抗体HAX
(J.Immunology 139,2496−25
01,1987,SLE患者由来B細胞由来のハイブリ
ドーマ21/28細胞の産生する抗体;そのアミノ酸配
列はこの文献中のFig.6に記載されており、それを
コードするDNAのヌクレオチド配列はFig.4及び
5に記載されている)のFRを用いて再構成ヒトAUK
12−20抗体のH鎖V領域バージョン「a」〜「d」
を次の表7に示すように設計した。
ンを付した2個の残基はHAXのFRからの変化を示
す。sle1220Hb,sle1220Hc、及びs
le1220HdについてはHAXのFR中のアミノ酸
と異るFR中のアミノ酸のみを示す。ヒトIL−6Rに
対する本発明のキメラ抗体又は再構成ヒト抗体の製造の
ために任意の発現系、例えば真核細胞、例えば動物細
胞、例えば樹立された哺乳類細胞系、真糸状菌細胞、及
び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば細菌細胞、例えば
大腸菌細胞等を使用することができる。好ましくは、本
発明のキメラ抗体又は再構成抗体は哺乳類細胞、例えば
COS細胞又はCHO細胞中で発現される。
に有用な常用のプロモーターを用いることができる。例
えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期(human
cytomegalovirus immediate
early;HCMV)プロモーターを使用するのが
好ましい。HCMVプロモーターを含有する発現ベクタ
ーの例には、HCMV−VH −HCγ1 、HCMV−V
L −HCK 、HCMV−12h−g γ1 、HCMV−1
2κ−gκ等であって、pSV2neoに由来するもの
(図1を参照のこと)が含まれる。
具体例はヒト・エロンゲーション・ファクター1α(H
EF−1α)プロモーターである。このプロモーターを
含有する発現ベクターにはHEF−12h−gγ1及び
HEF−12k−gκ(図8及び図9)、並びにHEF
−VH −gγ1及びHEF−VL −gκ(図15)が含
まれる。宿主細胞系中での遺伝子増幅のため、発現ベク
ターはさらにdhfr遺伝子を含有することができる。
dhfr遺伝子を含有する発現ベクターは例えばDHF
R−ΔE−PMh−gγ1 (図10)、DHFR−ΔE
−RVh−PM1−f(図11)等である。
Rに対するマウスモノクローナル抗体のL鎖V領域及び
H鎖V領域、並びに該L鎖V領域をコードするDNA及
びH鎖V領域をコードするDNAを提供する。これら
は、ヒトIL−6Rに対するヒト/マウスキメラ抗体及
び再構成ヒト抗体の作製のために有用である。モノクロ
ーナル抗体は、例えばAUK12−20、PM−1、A
UK64−7、及びAUK146−15である。L鎖V
領域は例えば配列番号:24,26,28又は30に示
すアミノ酸配列を有し、そしてH鎖V領域は例えば配列
番号:25,27,29,又は31に示すアミノ酸配列
を有する。これらのアミノ酸配列は例えばそれぞれ配列
番号:24〜31に示すヌクレオチド配列によりコード
されている。
マウスL鎖V領域;並びに(2)ヒトH鎖C領域及びマ
ウスH鎖V領域:を含んで成る、ヒトIL−6Rに対す
るキメラ抗体に関する。マウスL鎖V領域及びマウスH
鎖V領域並びにこれらをコードするDNAは前記の通り
である。前記ヒトL鎖C領域は任意のヒトL鎖C領域で
あることができ、そして例えばヒトCκ領域である。前
記ヒトH鎖C領域は任意のヒトH鎖C領域であることが
でき、そして例えばヒトCγ1領域である。
ベクター、すなわちエンハンサー/プロモーター系のご
とき発現制御領域による制御のもとでマウスL鎖V領域
及びヒトL鎖C領域をコードするDNAを含んで成る発
現ベクター、並びにエンハンサー/プロモーター系のご
とき発現制御領域のもとでマウスH鎖V領域及びヒトH
鎖C領域をコードするDNAを含んで成る発現ベクター
を作製する。次に、これらの発現ベクターにより哺乳類
細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転
換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養して
キメラ抗体を製造する。
C領域をコードするDNA並びにマウスH鎖V領域及び
ヒトH鎖C領域をコードするDNAを単一の発現ベクタ
ーに導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質
転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又は
イン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産さ
せる。
領域、及び(2)ヒトL鎖FR、及びヒトIL−6Rに
対するマウスモノクローナル抗体のL鎖CDRを含んで
成るL鎖V領域、を含んで成るL鎖;並びに(B)
(1)ヒトH鎖C領域、及び(2)ヒトH鎖FR、及び
ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体のH
鎖CDRを含んで成るH鎖V領域、を含んで成るH鎖;
を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト抗体
を提供する。
は配列番号24,26,28及び30のいずれかに示さ
れるアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列の範囲が表
9において定義されるアミノ酸配列を有し、前記H鎖C
DRは配列番号25,27,29及び31に示されるア
ミノ酸配列であって該アミノ酸配列の範囲が表9におい
て定義されるアミノ酸配列を有し;前記ヒトL鎖FRが
REIに由来するものであり;前記ヒトH鎖FRはNE
W又はHGSIコンセンサス配列又はHAXに由来する
ものであり;前記ヒトL鎖C領域はヒトCκ領域であ
り;そして前記ヒトH鎖C領域はヒトCγ1である。
2においてRVL aとして示されるアミノ酸配列を有
し、H鎖V領域は表3にRVH a、RVH b、RV
H c、RV H d、RVH e又はRVH fとして示される
アミノ酸配列を有する。アミノ酸配列RVH fが最も好
ましい。
現ベクター、すなわちエンハンサー/プロモーター系の
ごとき発現制御領域による制御のもとに前に定義した再
構成ヒトL鎖をコードするDNAを含んで成る発現ベク
ター、及びエンハンサー/プロモーター系のごとき発現
制御領域のもとに前に定義した再構成ヒトH鎖をコード
するDNAを含んで成るもう一つの発現ベクターを作製
する。次に、これらの発現ベクターを用いて哺乳類細胞
のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そしてこの形質転
換された細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して
再構成ヒト抗体を生産せしめる。
NA及び再構成ヒトH鎖をコードするDNAを単一の発
現ベクターに導入し、そしてこのベクターを用いて宿主
を形質転換し、次にこの形質転換された宿主細胞をイン
−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とする再構成ヒ
ト抗体を生産せしめる。こうして生産されたキメラ抗体
又は再構成ヒト抗体は、常法に従って、例えばプロテイ
ンAアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過等により単離、精製するこ
とができる。
H鎖と組合わせることにより完全な抗体を作製するため
に使用することができる。同様に本発明のキメラH鎖又
は再構成ヒトH鎖はL鎖と組合わせることにより完全な
抗体を作製するために用いることができる。本発明のマ
ウスL鎖V領域、再構成ヒトL鎖V領域、マウスH鎖V
領域、及び再構成ヒトH鎖V領域は、本来、抗原である
ヒトIL−6Rと結合する領域であり、それ自体とし
て、又は他の蛋白質との融合蛋白質として医薬、診断薬
等として有用であると考えられる。また、本発明のL鎖
V領域CDR及びH鎖V領域CDRも、本来、抗原であ
るヒトIL−6Rと結合する部分であり、それ自体とし
て又は他の蛋白質との融合蛋白質として医薬、診断薬等
として有用であると考えられる。
NAはキメラL鎖をコードするDNA又は再構成ヒトL
鎖をコードするDNAの作製のために有用である。同様
にマウスH鎖V領域をコードするDNAはキメラH鎖を
コードするDNA又は再構成ヒトH鎖をコードするDN
Aの作製のために有用である。また、本発明のL鎖V領
域CDRをコードするDNAは再構成ヒトL鎖V領域を
コードするDNA及び再構成ヒトL鎖をコードするDN
Aの作製のために有用である。同様に本発明のH鎖V領
域CDRをコードするDNAは再構成ヒトH鎖V領域を
コードするDNA及び再構成ヒトH鎖をコードするDN
A作製のために有用である。
説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるもの
ではない。実施例1 .ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナ
ル抗体のV領域をコードするDNAのクローン化 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体の可
変領域をコードするDNAを次の様にしてクローン化し
た。
hirgwinら、Biochemistry,18,
5294(1979)により記載されている方法に従っ
て調製した。すなわち、2.1×108 個のハイブリド
ーマAUK12−20の細胞を20mlの4Mグアニジン
チオシアネート(Fulka)中で完全にホモジナイズ
させた。ホモジネートを遠心管中の5.3M塩化セシウ
ム溶液層上に重層し、次にこれをBeckman SW
40ローター中で31,000rpm にて20℃で24時
間遠心分離することによりRNAを沈澱させた。
浄し、そして1mM EDTA及び0.5% SDSを含
有する10mM Tris−HCl(pH7.5)150μl
中に溶解し、そしてそれにProtenase(Boe
hringer)を0.5mg/mlとなるように添加した
後、37℃にて20分間インキュベートした。混合物を
フェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてRNAを
エタノールで沈澱させた。次に、RNA沈澱物を1mM
EDTAを含有する10mM Tris−HCl(pH7.
5)200μlに溶解した。
y,7,934(1989)により記載されている方法
に従って一本鎖cDNAを合成するため、前記のように
して調製した全RNAの約5μgを40mM KCl, 6mM
MgCl2 ,10mMジチオスレイトール、0.5mM d
ATP,0.5mM dGTP,0.5mMdCTP,0.
5mM dTTP,35μM oligo dTプライマ
ー(Amersham),48ユニットのRAV−2逆
転写酵素(RAV−2:Rous associate
d virus2;Amersham)及び25ユニッ
トのヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤(Amersha
m)を含有する50mMTris−HCl(pH8.3)緩
衝液10μlに溶解し、そしてこの反応混合物を37℃
にて60分間インキュベートしそして次のポリメラーゼ
連鎖反応(PCR)法のために直接使用した。
CR法による増幅 Thermal Cycler Model PHC−
2(Techne)を用いてPCR法を行った。 (1)マウスL鎖V領域をコードする遺伝子の増幅 PCR法に使用するプライマーは、配列番号:1〜11
に示すMKV(Mouse Kappa Variab
le)プライマー(マウスカッパ型L鎖リーダー配列と
ハイブリダイズする)(S.T.Jonesら、Bio
technology,9,88,1991)、及び配
列番号:12に示すMKC(MouseKappa C
onstant)プライマー(マウスカッパ型L鎖C領
域とハイブリダイズする)(S.T.Jonesら、B
iotechnology,9,88,1991)であ
った。
3), 50mM KCl 0.1mMdATP,0.1mM
dGTP,0.1mM dCTP,0.1mM dTTP,
1.5mM MgCl2 ,2.5ユニットのDNAポリメ
ラーゼAmpliTaq(Perkin Elmer
Cetus),0.25μMのそれぞれのMKVプライ
マー、3μMのMKCプライマー及び一本鎖cDNA合
成の反応混合物1μlを含有するPCR溶液100μl
を94℃の初期温度にて1.5分間そして次に94℃に
て1分間、50℃にて1分間及び72℃にて1分間、こ
の順序で加熱した。この温度サイクルを25回反復した
後、反応混合物をさらに72℃にて10分間インキュー
ベートした。
NAの増幅 PCRのためのプライマーとして配列番号:13〜22
に示すMHV(Mouse Heavy Variab
le)プライマー1〜10(S.T.Jonesら、B
iotechnology,9,88,1991)、及
び配列番号:23に示すMHC(Mouse Heav
y Constant)プライマー(S.T.Jone
sら、Biotechnology,9,88,199
1)を使用した。前記3.(1)においてL鎖V領域遺
伝子の増幅について記載したのと同じ方法により増幅を
行った。
QIAGEN PCR生成物精製キット(QIAGEN
Inc.US)を用いて精製し、そして10mM Mg
Cl2 及び150mM NaClを含有する100mM T
ris−HCl(pH7.6)中で10ユニットの制限酵
素SalI(GIBCO BRL)を用いて37℃にて
3時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロ
ロホルムで抽出し、そしてDNAをエタノール沈澱によ
り回収した。次に、DNA沈澱物を10ユニットの制限
酵素XmaI(New England Biolab
s)により37℃にて2時間消化し、そして生ずるDN
A断片を、低融点アガロース(FMC Bio.Pro
ducts,米国)を用いるアガロースゲル電気泳動に
より分離した。
ロース片を切り取りそして65℃にて5分間溶融せし
め、そしてこれと同容積の2mM EDTA及び200mM
NaClを含有する20mM Tris−HCl(pH
7.5)を加えた。この混合物をフェノール及びクロロ
ホルムにより抽出し、そしてDNA断片をエタノール沈
澱により回収し、そして1mM EDTAを含有する10
mM Tris−HCl(pH7.5)に溶解した。こうし
て、マウスカッパ型L鎖可変領域をコードする遺伝子を
含んで成るDNA断片、及びマウスH鎖可変領域をコー
ドする遺伝子を含んで成るDNA断片を得た。上記DN
A断片はいずれもその5′−末端にSalI接着末端を
有しそしてその3′−末端にXmaI接着末端を有す
る。
コードする遺伝子を含んで成るSalI−XmaIDN
A断片約0.3μgを、プラスミドpUC19をSal
I及びXmaIで消化することにより調製したpUC1
9ベクター約0.1μgと、50mM Tris−HCl
(pH7.4),10mM MgCl2 ,10mMジチオスレ
イトール、1mMスペルミジン、1mM ATP,0.1μ
g/mlのウシ血清アルブミン及び2ユニットT4DNA
リガーゼ(New England Biolabs)
を含有する反応混合物中で、16℃にて16時間反応さ
せ連結した。
H5αのコンピテント細胞200μlに加え、そしてこ
の細胞を氷上で30分間、42℃にて1分間そして再び
氷上で1分間静置した。次いで800μlのSOC培地
(Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual,Sambrookら、C
old Spring Harbor Laborat
ory Press,1989)を加え、37℃にて1
時間インキュベートした後、2×YT寒天培地(Mol
ecular Cloning:A Laborato
ry Manual,Sambrookら、Cold
Spring Harbor Laboratory
Press,1989)上にこの大腸菌をまき、37℃
にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
シリンを含有する2×YT培地5ml中で37℃にて一夜
培養し、そしてこの培養物から、アルカリ法(Mole
cular Cloning:A Laborator
y Manual,Sambrookら、Cold S
pring Harbor LaboratoryPr
ess,1989)に従ってプラスミドDNAを調製し
た。こうして得られた、ハイブリドーマAUK12−2
0に由来するマウスカッパ型L鎖V領域をコードする遺
伝子を含有するプラスミドをp12−k2と命名した。
上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマAUK12−
20に由来するマウスH鎖V領域をコードする遺伝子を
含有するプラスミドをSalI−XmaI DNA断片
から作成し、そしてp12−h2と命名した。
領域をコードするDNAのクローン化 実施例1に記載したのと実質上同じ方法をハイブリドー
マPM1,AUK64−7及びAUK146−15に適
用して下記のプラスミドを得た:ハイブリドーマPM1
由来のカッパ型L鎖V領域をコードする遺伝子を含有す
るプラスミドpPM−k3;ハイブリドーマPM1由来
のH鎖V領域をコードする遺伝子を含有するプラスミド
pPM−h1;ハイブリドーマAUK64−7由来のカ
ッパ型L鎖V領域をコードする遺伝子を含有するプラス
ミドp64−k4;ハイブリドーマAUK64−7由来
のH鎖V領域をコードする遺伝子を含有するプラスミド
p64−h2;
カッパ型L鎖V領域をコードする遺伝子を含有するプラ
スミドp146−k3;及びハイブリドーマAUK14
6−15由来のH鎖V領域をコードする遺伝子を含有す
るプラスミドP146−h1。なお、上記プラスミドを
含有する大腸菌株は、National Collec
tions of Industrial and M
arine Bacteria Limitedに、ブ
ダペスト条約に基づいて、1991年2月11日に寄託
され、そして表8に示す受託番号を有する。
を、Sequenase TMVersion2.0キット
(U.S.Biochemical Corp、米国)
を用いて決定した。まず、前記のようにして得られたプ
ラスミド約3μgを0.2N NaOHにより変性し、
配列決定用プライマーとアニールさせ、そしてキット添
付の処方に従って35S−dATPにより標識した。次
に、標識されたDNAを、8M尿素を含有する6%ポリ
アクリルアミドゲルにて電気泳動した後、ゲルを10%
メタノール及び10%酢酸により固定し、乾燥し、そし
てオートラジオグラフィーにかけることにより塩基配列
を決定した。各プラスミドのcDNAコード領域の塩基
配列を配列番号:24〜31に示す。
有しており、それぞれ4つのフレームワーク部分が3つ
の超可変領域、即ち相補性決定領域(CDR)により連
結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較
的良く保存されているが、一方、CDR領域のアミノ酸
配列の可変性は極めて高い(Kabat, E.A. ら、「Sequen
ces of Proteins of Immunological Interest 」US Dep
t. Health and Human Services, 1983)。ヒトIL−6
Rに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域の上記
のアミノ酸配列に基き、そしてKabatらの報告に従
ってIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体の各
V領域のCDRを表9に示す如く決定した。
現の確認(1)発現プラスミドの作製 PCR法によりクローン化されたAUK12−20抗体
のκL鎖及びH鎖のV領域をコードするcDNAからキ
メラL鎖/H鎖をコードするDNAを作製した。マウス
AUK12−20のV領域をコードするcDNAを、ヒ
トサイトメガロウイルス(HCMV)のエンハンサー及
びプロモーターを含有する哺乳類細胞発現ベクター(H
CMV発現ベクターと称する)(図1.実施例8)中で
ヒトC領域をコードするDNAに容易に連結するために
は、AUK12−20抗体のV領域をコードするマウス
cDNA配列の5′−末端及び3′−末端に便利な制限
酵素切断部位を導入することが必要であった。
飾はPCR法を用いて行った。2セットのPCRプライ
マーを設計しそして合成した。マウスL鎖V領域及びH
鎖V領域の両方について、リーダー配列の始めをコード
するDNAにハイブリダイズし、効率的な翻訳のために
必須のDNA配列(Kozak,M.,J.Mol.Bi
ol.196:947−950,1987)を維持しそ
してHCMV発現ベクターへのクローニングのためのH
indIII 部位を形成するために、L鎖V領域後方プラ
イマー(配列番号:32)、及びH鎖V領域後方プライ
マー(配列番号:33)を調製した。前方PCR−プラ
イマーは、J領域の末端をコードするDNAにハイブリ
ダイズし、C領域へのスプライシングのために必須のD
NA配列を維持しそしてHCMV発現ベクターでのヒト
C領域への連結のためのBamHI部位を形成するよう
に、L鎖V領域前方プライマー(配列番号34)、及び
H鎖V領域前方プライマー(配列番号35)を調製し
た。
HindIII 及びBamHIにより消化し、ヒトκ鎖又
はγ−1鎖C領域DNAを含有するHCMVベクターに
クローン化し、そして塩基配列を決定してPCR法によ
る増幅中にエラーが生じなかったことを確認した。得ら
れる発現ベクターをHCMV−12k−gk及びHCM
V−12h−gγ1と称する。HCMV発現ベクターの
構造を図1に示す。プラスミドHCMV−VL −HCκ
において、VL 領域は任意のマウスL鎖V領域コード配
列であることができる。この例において、AUK12−
20κL鎖V領域を挿入することによりHCMV−12
k−gkを得た。プラスミドHCMV−VH −HCγ1
において、VH領域は任意のマウスH鎖V領域コード配
列であることができる。この例においてはAUK12−
20のH鎖V領域を挿入してHCMV−12h−gγ1
を得た。
t)発現 キメラAUK12−20抗体のCOS細胞での一過性発
現を見るため、前記発現ベクターをCOS細胞において
試験した。Gene Pulsar装置(BioRa
d)を用いる電気穿孔法(electroporati
on)によりDNAをCOS細胞に導入した。すなわ
ち、COS細胞を1×107 個/mlになるようにpho
sphate−buffered saline(PB
S)に懸濁し、この細胞浮遊液0.8mlにDNA(各プ
ラスミドについ10μg)を加えた。1,900ボルト
(V)、25マイクロファラッド(μF)の電気容量に
てパルスを与えた。
トロポレーションした細胞を、10%のウシ胎児血清を
含有するDMEM培地(GIBCO)8mlに加えた。7
2時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠
心分離して細胞破片を除去し、そして無菌条件下で4℃
にて短時間、又は−20℃にて長時間貯蔵した。
ラ抗体の定量 トランスフェクトされたCOS細胞の培養上清をELI
SAにより測定して、キメラ抗体が生産されていること
を確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤ
ギの抗ヒトIgG(Whole molecule)
(Sigma)によりコートした。ブロックした後、C
OS細胞からの培養上清を段階希釈しそして各ウエルに
加えた。インキュベーション及び洗浄の後、アルカリホ
スファターゼ−結合ヤギ抗−ヒトIgG(γ鎖特異的、
Sigma)を加えた。インキュベーション及び洗浄の
後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反
応を停止しそして405nmにおける吸光度を測定した。
標準として精製ヒトIgG(Sigma)を用いた。
の酵素免疫測定(ELISA) トランスフェクトされたCOS細胞からの培地をELI
SAにより測定して、生産されたキメラ抗体が抗原に結
合し得るか否かを決定した。抗原への結合の検出のた
め、プレートをMT18マウスモノクローナル抗体(参
考例1)でコートした。1% BSAでブロックした
後、可溶性組換えヒトIL−6R(SR344)を加え
た。洗浄した後、COS細胞からの培養上清を段階希釈
し、そして各ウエルに加えた。インキュベーション及び
洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIg
Gを加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩
衝液を加えた。インキュベーションの後、反応を停止
し、そして405nmにおける吸光度を測定した。
K12−20をコードする遺伝子のCOS細胞へのトラ
ンスフェクションを実施した。このCOS細胞の培養上
清サンプルは、IL−6Rに対する強い結合能を示し、
図2に○(オープンサークル)で示す如く、サンプルの
希釈度(抗体の濃度)依存的に405nmにおける吸光度
が変化し、サンプル中にIL−6Rレセプターに対する
抗体が含まれていることが確認された。
る能力の測定 トランスフェクトされたCOS細胞からの培養上清を測
定して培地中に存在する抗体が、IL−6RとIL−6
との結合を阻害するか否かを調べるために、ビオチン化
IL−6との競合的結合阻害能を調べた。プレートをM
T18マウスモノクローナル抗体(参考例1)でコート
した。ブロッキングの後、可溶性組換ヒトIL−6R
(SR344)を加えた。洗浄した後、COS細胞から
のサンプルを段階希釈し、そしてビオチン化IL−6と
共に各ウエルに加えた。
ストレプトアビジンを加えた。インキュベーション及び
洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの
後、反応を停止し、そして吸光度を405nmにて測定し
た。精製マウスAUK12−20モノクローナル抗体を
陽性対照として用いた。無関係の抗体を発現するCOS
細胞からの培地を陰性対照として用いた。
K12−20をコードする遺伝子でトランスフェクトし
たCOS細胞の培養上清は、最高、及び2番目に高いサ
ンプル濃度でIL−6RとIL−6の結合を阻害した。
すなわち、図3に●で示す如く、サンプル希釈度(抗体
の濃度)依存的に405nmにおける吸光度が変化し、サ
ンプル中の抗体がIL−6RとIL−6の結合を阻害し
ていることが認められた。これは陽性対照の吸光度の抗
体濃度依存的変化(○)にほぼ一致することからも確認
出来た。なお、陰性対照(△)は阻害活性が全く認めら
れなかった。
認(2)(キメラPM−1抗体の作製) 発現ベクターの作製 キメラPM−1抗体を発現するベクターを作製するた
め、それぞれマウスPM−1κL鎖及びH鎖V領域をコ
ードするcDNAクローンpPM−k3及びpPM−h
1をPCR法により変形し、そしてHCMV発現ベクタ
ー(図1を参照のこと)に導入した。L鎖V領域のため
の後方プライマーpmk−s(配列番号:38)及びH
鎖V領域のための後方プライマーpmh−s(配列番
号:40)を、リーダー配列の最初をコードするDNA
にハイブリダイズし且つKozakコンセンサス配列及
びHindIII 制限部位を有するように設計した。L鎖
V領域のための前方プライマーpmk−a(配列番号:
36)及びH鎖V領域のための前方プライマーpmh−
a(配列番号:39)を、J領域の末端をコードするD
NA配列にハイブリダイズし且つスプライスドナー配列
及びBamHI制限部位を有するように設計した。
マーを合成した。ほとんどのκL鎖においては、位置1
07のリジンが保存されているが、マウスPM−1κL
鎖においては位置107がアスパラギンである。キメラ
PM−1抗体の抗原結合活性に対するこの変化の効果を
検討するため、前方プライマーpmk−b(配列番号:
37)を、位置107がアスパラギンからリジンに変る
ように設計した。PCR反応に続き、PCR生成物を精
製し、HindIII 及びBamHIで消化し、そしてp
UC19ベクター(Yanishe−Perronら、
Gene(1985)33:103−109)にサブク
ローニングした。DNA配列決定の後、HindIII −
BamHI断片を切出し、そしてH鎖V領域については
発現ベクターHCMV−VH −HCγ1にクローン化し
てHCMV−PMh−gγ1を得、そしてL鎖V領域に
ついてはHCMV−VL −HCκにクローン化してHC
MV−PMka−gk及びHCMV−PMkb−gkを
得た。
発現ベクターをCOS細胞において試験した。HCMV
−pmh−gγ1と、HCMV−pmka−gk又はH
CMV−pmkb−gkのいずれかとを、Gene P
ulsar装置(BioRad)を用いてエレクトロポ
レーションによりCOS細胞に同時形質転換した。DN
A(プラスミド当り10μg)を、PBS中1×107
細胞/mlの0.8mlのアリコートに加え、1,900
V,25μFの容量にてパルスを与えた。室温にて10
分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理され
た細胞を、10%のγ−グロブリン不含有ウシ胎児血清
を含有するDulbecco′s Modified
Eagle Medium(DMEM)(GIBCO)
に加えた。72時間のインキュベーションの後、培養上
清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、そして無
菌条件下で4℃にて短期間貯蔵し、又は−20℃にて長
期間貯蔵した。
め、そしてキメラPM−1抗体について試験した。培地
をまずELISAにより分析して、トランスフェクトさ
れたCOS細胞によりヒト様抗体が生産されたか否かを
決定した。このアッセイにおいて標準として既知量の精
製ヒトIgGを用いることにより、COS細胞からの培
地中に存在するヒト様抗体(この場合、キメラPM−1
抗体)の量を推定することが可能である。ヒト抗体の検
出のため、プレートをヤギ抗−ヒトIgG(全体分子、
Sigma)によりコートした。ブロッキングの後、C
OS細胞からのサンプルを段階希釈し、そして各ウェル
に加えた。インキュベーション及び洗浄の後、アルカリ
ホスフェターゼ結合ヤギ抗−ヒトIgG(γ鎖特異的、
Sigma)を加えた。インキュベーション及び洗浄の
後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反
応を停止し、そして405nmでの吸光度を測定した。標
準として精製ヒトIgG(Sigma)を加えた。
担持するベクターによりトランスフェクトされたCOS
細胞からの培地はヒト様抗体の発現について陽性であ
り、そしておよその量が上記のようにして測定された。
次に、キメラPM−1抗体をコードする遺伝子を担持す
るベクターによりトランスフェクトされたCOS細胞か
らの同じ培地をヒトIL−6Rに結合する能力について
測定した。抗原への結合の測定のため、プレートを、ヒ
トIL−6Rに対する抗体であるMT18マウスモノク
ローナル抗体(参考例1)によりコートした。ブロッキ
ングの後、可溶性ヒトIL−6R(SR344)を加え
た。洗浄した後、サンプルを段階希釈し、そして各ウエ
ルに加えた。インキュベーション及び洗浄の後、アルカ
リホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトIgG(γ鎖特異
的;Sigma)を添加した。インキュベーション及び
洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの
後、反応を停止し、そして405nmでの吸光度を測定し
た。この測定のために標準品は存在しなかった。
−1抗体中に見られるV領域と同一のV領域を有するキ
メラ抗体(キメラPM−1a抗体、図4)をコードする
遺伝子によるトランスフェクトからのサンプルであっ
た。他の1つのサンプルはL鎖V領域中の位置107に
前記のような1個のアミノ酸変化を有するキメラ抗体
(キメラPM−1b抗体、図4)をコードする遺伝子に
よるトランスフェクションからのものであった。いずれ
のサンプルも、サンプルの希釈により減少するIL−6
Rに対する強い結合を示した。すなわち、作製されたキ
メラPM−1抗体は機能的であり、そしてその抗原によ
く結合することができる。
抗体の証明は、正しいマウスPM−1V領域がクローン
化されそして配列決定されたことの直接の証拠である。
L鎖V領域中の位置107にいずれのアミノ酸を有する
キメラ抗体も抗原IL−6Rによく結合した。マウスP
M−1抗体のL鎖V領域中の位置107は抗原結合のた
めにあまり重要ではなく、そしてこの位置におけるアス
パラギン及びリジンのいずれも満足に機能するようであ
る。マウスPM−1抗体はそのL鎖V領域のこの位置に
アスパラギンを有するので、キメラPM−1抗体を用い
るその後のすべての研究は、マウスPM−1抗体に見出
されるそれと同じバージョンaを用いて行った。
ために、dhfr遺伝子を含有する新たなHCMV発現
ベクターを作製した。キメラPM−1抗体のより高い発
現レベルを達成するための第一段階は、ベクターHCM
V−VH −HCγ1 (図1)を変形して、このベクター
が欠陥のある(crippled)SV40プロモータ
ーエンハンサーにより発現されるdhfr遺伝子を含有
するようにすることであった。SV40エンハンサー要
素をpSV2−dhfrベクター(S.Subrama
niら、Mol.Cell.Biol.(1981)
1:854−864)から除去し、そしてSV40プロ
モーターによって発現されるneo遺伝子の代りに「欠
陥のある」SV40プロモーターにより発現されるdh
fr遺伝子をHCMV−VH −HCγ1 に挿入した。次
に、この新しいHCMV−VH −HCγ1 −dhfrベ
クターにマウスPM−1V領域を挿入した。この改良さ
れた発現ベクターの作製を実施例10に詳細に記載す
る。
aubら、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA(1980)77:4216−4220)を2種類
のプラスミドDNAすなわちキメラPM−1aL鎖を発
現するためのHCMV−VL−HCκベクター(HCM
V−PMka−gk)及びキメラPM−1 H鎖を発現
するためのHCMV−VH −HCγ1 −dhfrベクタ
ー(DHFR−△E−PMh−gγ1;実施例10)に
より同時形質転換した。DNA(各プラスミドにつき1
0μg/ml)をPBS中1×107 細胞/mlの0.8ml
のアリコートに加えた。1900Vの電圧25μFの電
気容量でパルスを与えた。
トロポレーション処理された細胞を、ヌクレオシド及び
10% FCSを含有するAlpha Minimal
Essential Medium培地(α−ME
M)10mlに加えた。一夜のインキュベーションの後、
培地を、ヌクレオシドを含有せず10% FCS及び5
00μg/mlのG418(GIBCO)を含有するα−
MEMに変えて、dhfr+ 及びneo+ 形質転換細胞
の選択を行った。選択の後、選択されたクローンを用い
て遺伝子増幅を行った。2×10-8Mメソトレキセート
(MTX)中での1ラウンドの増幅の後、約3.9μg
/106 細胞/日のキメラPM−1aの抗体を生産する
細胞系(PM1k3−7)を選択した。
するキメラ抗体の能力についてのELISA測定 トランスフェクトされたCOS細胞において又は安定な
CHO細胞系において生産された抗体を測定して、それ
らが、IL−6Rへのビオチン化IL−6の結合と競争
するか否かを決定した。プレートをマウス抗体MT18
によりコートした。ブロッキングの後、可溶性組換えヒ
トIL−6R(SR344)を加えた。洗浄の後、CO
S細胞からのサンプルを段階希釈し、そしてビオチン化
IL−6と一緒に各ウエルに加えた。洗浄の後、アルカ
リホスファターゼ結合ストレプトアビジンを加えた。イ
ンキュベーション及び洗浄後、基質緩衝液を加えた。イ
ンキュベーションの後、反応を停止させ、そして405
nmにおける吸光度を測定した。結果を図5に示す。
め、PCRによる逐次CDR移植法を開発した。この方
法はPCR変異誘発法(Kammanら、Nucl.A
cid.Res.17:5404,1989)に基く。
CDR移植のための選択されたヒトFRをコードするD
NAを含有する鋳型DNAを調製するために、適当な再
構成ヒトV領域をコードするDNAを便利なベクターに
再クローニングする必要があった。プラスミドalys
11及びF10のDNAはそれぞれ再構成ヒトD1.3
のL鎖及びH鎖をコードしており、ヒトREIからのF
RをコードするDNA及びNEWからのFRをコードす
るDNAをそれぞれ含有する。
するDNA配列を含有する約500bpのNcoI−Ba
mH1断片をalys11から切り出し、そしてHin
dIII 及びBamHIで開裂されたpBR327にサブ
クローニングしてプラスミドVl−lys−pBR32
7を得た。このVl−lys−pBR327からのHi
ndIII −BamHI断片を、HindIII 及びBam
HIにより開裂されたpUC19に挿入してプラスミド
Vl−lys−pUC19を得た。
するDNA配列を含有する約700bpのNcoI−Ba
mHI断片をF10から切り出し、そしてHindIII
−NcoIアダプターを用いてpBR327のHind
III −BamHI部位にサブクローニングし、Vh−l
ys−pBR327を得た。次に、このプラスミドから
HindIII −BamHI断片を切り出し、そしてHi
ndIII 及びBamHIにより開裂されたpUC19に
サブクローニングしてVh−lys−pUC19を得
た。
ヒトD1.3のL鎖V領域FRをコードするDNA配列
はヒト型化CAMPATH−1H抗体(Nature
332:323−327(1988))のそれと同じであ
る。鋳型として使用した、プラスミドF10中の再構成
ヒトD1.3のH鎖V領域をコードするDNA配列は、
V.Verhoeyら、Science237:153
4−1536(1988)のFig.2に記載されてい
る。
の第一バージョンをコードするDNAの作製のために使
用されたプライマー及びPCR反応を模式的に示す。後
方プライマーA(APCR1;配列番号:41)及び前
方プライマーE(APCR4;配列番号:42)は、こ
のベクター上のDNA配列にハイブリダイズする。AP
CR1及びAPCR4はpUC19ベクターのために特
に設計されたが、ユニバーサルM13配列プライマーを
使用することもできる。
hv−1;配列番号:43)、CDR2移植プライマー
C(phv−2;配列番号:44)、及びCDR3移植
プライマーD(phv−3;配列番号:45)は40〜
60bpの長さを有し、マウスPM−1のH鎖V領域のC
DRをコードするDNA及び該CDRをコードするDN
Aを挟む鋳型DNA中のヒトFRをコードするDNA配
列から成る。第一のPCR反応において前方プライマー
APCR4及び後方プライマーDを用いた。マウスPM
−1のCDR3配列をコードするDNAを含有する第一
PCR生成物を精製し、そして第二PCR反応において
後方プライマーとしてのプライマーCと共に前方プライ
マーとして使用した。
びCDR3をコードするDNAを含有する第二PCR生
成物、並びにマウスPM−1の3個すべてのCDRをコ
ードするDNAを含有する第三PCR生成物をそれぞれ
次のPCR段階のプライマーとして使用した。完全な再
構成ヒトPM−1 H鎖V領域をコードするDNAを有
する第四PCR生成物を精製し、HindIII 及びBa
mHIにより消化し、そしてさらに分析するためにpU
C19にサブクローニングした。
ドするDNAの作製のために3種類の変異誘発プライマ
ーphv−1,phv−2及びphv−3を合成した。
これらは8M尿素を含有する12%ポリアクリルアミド
ゲル上で精製した。変異誘発プライマーphv−1は、
マウスPM−1抗体のCDR1の移植のためのみならず
ヒトFR1中の位置27及び30におけるそれぞれのS
erからTyrへ、及びSerからThrへの変異のた
めに設計された。各100μlのPCR反応物は典型的
には10mM Tris−HCl(pH8.3),50mM
KCl,1.5mM MgCl2 ,250μM dNT
P,50ngの鋳型DNA(Vh−lys−pUC1
9),2.5uのAmpliTaq(Perkin E
lmer Cetus)、及びプライマーを含有した。
PCR4プライマーを含む第一のPCR反応を行い、9
4℃にて1.5分間の最初の変性の後、94℃にて1分
間、37℃にて1分間及び72℃にて1分間の30サイ
クルを反復した。アニーリング段階と合成段階の間の変
温時間は2.5分間であった。最終サイクルの完了の
後、72℃にて10分間の最終伸長反応を行った。52
3bpのPCR生成物を1.6%低融点アガロースゲルを
用いて精製し、そして次に第二のPCR反応におけるプ
ライマーとして使用した。
された第一PCR生成物及び25pmoleの変異誘発
プライマーphv−2をプライマーとして使用した。P
CR条件は第一のPCR反応について記載したのと同じ
であった。同様にして、第二のPCR反応からの665
bpのPCR生成物をプライマーphv−1と共に第三の
PCR反応において使用し、そして第三のPCR反応か
らの737bpのPCR生成物をプライマーAPCR1と
共に第四のPCR反応において使用した。第四のPCR
反応からの1.172kbのPCR生成物を精製し、Hi
ndIII 及びBamHIで消化し、そして次に再構成ヒ
トPM−1抗体H鎖V領域を含有する約700bpの断片
をpUC19ベクターにサブクローニングした。配列決
定した4個のクローンの内2個が正しいアミノ酸配列を
コードするDNA配列を有しており、そしてpUC−R
Vh−PM1aと命名した。
ジョンをコードするDNAを作製するため5種類の変異
誘発PCRプライマーを合成した。各PCR反応は前記
の反応条件と本質的に同じ条件下で行われた。バージョ
ン「b」のため、変異誘発プライマーphv−m4(V
al−71→Arg−71)(番号はKabatらによ
る;表4参照)(配列番号:46)及びAPCR4を、
鋳型DNAとしてのpUC−RVh−PM1aと共に第
一PCR反応において使用した。この第1PCR反応か
らのPCR生成物を精製し、そしてプライマーAPCR
1と共に第二PCR反応における前方プライマーとして
使用した。第二PCR反応からのPCR生成物を1.6
%低融点アガロースゲルを用いて精製し、HindIII
及びBamHIにより消化し、そしてpUC19にてサ
ブクローニングしてpUC−RVh−PM1bを得た。
nm(Asp−1→Gln−1)(配列番号:47)及
び鋳型pUC−RVh−PM1bを用いてバージョン
「c」をコードするDNA(pUC−RVh−PM1
c)を得、変異誘発プライマーphv−m6(Ile−
48→Met−48)(配列番号:48)及び鋳型pU
C−RVh−PM1bを用いてバージョン「d」をコー
ドするDNA(pUC−RVh−PM1d)を得、変異
誘発プライマーphv−nm及び鋳型pUC−RVh−
PM1cを用いてバーション「e」をコードするDNA
(pUC−RVh−PM1e)を得、そして変異誘発プ
ライマーphv−m7(Thr−28→Ser−28、
及びPhe−29→Ile−29)(配列番号:49)
及び鋳型pUC−RVh−PM1bを用いてバージョン
「f」をコードするDNA(pUC−RVh−PM1
f)を得た。再構成H鎖V領域バーション「f」のアミ
ノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配列
番号54に示す。
域の第一バージョンをコードするDNAの作製において
使用したプライマー及びPCR反応を模式的に示す。再
構成ヒトPM−1抗体L鎖V領域の第一バージョンをコ
ードするDNAの作製のため、CDR1移植プライマー
pkv−1(配列番号:50)、CDR2移植プライマ
ーpkv−2(配列番号:51)及びCDR3移植プラ
イマーpkv−3(配列番号:52)を合成し、そして
8M尿素を含有する12%ポリアクリルアミドゲル上で
精製した。前記のようにしてPCR反応を行った。第一
PCR反応物は1 μMずつのpkv−3プライマー及び
APCR4プライマーを含有した。第一PCR反応から
の350bpのPCR生成物を1.5%低融点アガロース
ゲルを用いて精製し、そして第二PCR反応における前
方プライマーとして使用した。
し、BamHI及びHindIII で消化し、そしてCD
R3が移植されたDNAを含有する500bp断片をDN
A配列決定のためにpUC19ベクターにサブクローニ
ングした。正しい配列を有するプラスミドDNAを同定
し、そして次のPCR反応における鋳型DNAとして使
用した。第三PCR反応において25pmoleの変異
誘発プライマーpkv−2及びAPCR4を使用した。
第三PCR反応からのPCR生成物を精製し、そしてプ
ライマーpkv−1と共に第四PCR反応におけるプラ
イマーとして使用した。同様にして、第四PCR反応か
らのPCR生成物をAPCR1プライマーと共に第五P
CR反応におけるプライマーとして使用した。
成物を精製し、BamHI及びHindIII により消化
し、そしてDNA配列決定のためにpUC19にサブク
ローニングした。CDR2領域において問題点が認識さ
れ、さらに2回のPCR反応が必要であった。第六PC
R反応及び第七PCR反応において、pUC19ベクタ
ーにクローニングされた第五PCR反応からのPCR生
成物を鋳型DNAをして使用した。第六PCR反応にお
いてプライマーはpkv−2及びAPCR4であった。
第六PCR反応からのPCR生成物を精製し、そしてA
PCR1プライマーと共に第七PCR反応におけるプラ
イマーとして使用した。第七PCR反応からのPCR精
製物を精製し、BamHI及びHindIII により消化
し、そして500bp DNA断片をDNA配列決定のた
めにpUC19にサブクローニングした。配列決定した
5個のクローンの内2個のクローンが正しいDNA配列
を有していた。このクローンをpUC−RV1−PM1
aと称する。この配列を配列番号:55に示す。
ージョンをコードするDNAの作製のため、変異誘発プ
ライマーpvk−m1(配列番号:53)を合成した。
PCR反応は本質的に前記の通りであった。第一PCR
反応において、変異誘発プライマーpkv−m1(Ph
e−71→Tyr−71)及びAPCR4プライマーを
鋳型DNAとしてのpUC−RV1−PM1aと共に使
用した。第一PCR反応からのPCR生成物を精製し、
そしてAPCR1プライマーと共に第二PCR反応にお
けるプライマーとして使用した。第二PCR反応からの
PCR生成物を精製し、BamHI及びHindIII に
より消化し、そしてDNA配列決定のためにpUC19
にサブクローニングした。このクローンをpUC−RV
1−PM1bと命名した。
細胞中で、発現させるためのヒトサイトメガロウイルス
前期(HCMV)プロモーターを用いるベクターの作製
(図1) キメラPM−1抗体のL鎖V領域をコードするDNA断
片及びキメラPM−1抗体のH鎖V領域をコードするD
NA断片を、それぞれ、哺乳類細胞中でヒトκL鎖又は
ヒトγ−1H鎖を発現するように設計されたHCMV発
現ベクター(図1を参照のこと)HCMV−VL −KC
κ及びHCMV−VH −HCγ1にまず挿入した。該H
CMV発現ベクターの作製のための詳細な記載は、Ma
edaら、Human Antibodies and
Hybridomas(1991)2:124−13
4;C.A.Kettleboroughら、Prot
ein Engeneering(1991)4:77
3−783に公表されている。両ベクターはpSV2n
eo(P.J.Southern et al.,J.M
ol.Appl.Genet.(1982)1:327
−341)に基礎を置き、そして免疫グロブリンL鎖又
はH鎖の高レベルの転写のためにヒトサイトメガロウイ
ルス(HCMV)プロモーター及びエンハンサー(M.
Boshartら、Cell(1985)41:521
−530)を含有する。
H.Rabbittsら、Carr.TOP.Micr
obiol.Immunol.(1984)114:1
66−171)をコードするゲノムDNAを含有し、そ
してH鎖発現ベクターはヒトCγ1領域(N.Taka
hashiら、Cell(1982)29:671−6
79)をコードするゲノムDNAを含有する。これらの
HCMV発現ベクターは多能であり、そして種々の哺乳
類細胞タイプにおける一過性(transient)発
現及び安定な発現のために使用することができる。
細胞中で発現させるためのヒトエロンゲーションファク
ター1α(HEF−1α)プロモーターを使用するベク
ターの作製(図8及び図9) ヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・フ
アクター1α(HEF−1α)は最も豊富な蛋白質の1
つである。これはほとんどの細胞で発現される。ヒトE
F−1αプロモーター−エンハンサーの転写活性はSV
40前期プロモーター−エンハンサーのそれに比べて約
100倍である(D.W.Kimら、Gene(199
0)91:217−223;及びT.Uetsuki
ら、J.Biol.Chem.(1989)264:5
791−5798)。2.5kbのHEF−1αプロモー
ター−エンハンサー領域は、該遺伝子の5′−末端に接
する約1.5kbのDNA、第一エクソン中の33bp、第
一イントロン中の943bp、及び第二エクソンの最初の
部分の10bpから成る。
I断片をプラスミドpEF321−CAT(D.W.K
imら、Gene(1990)91:217−223;
及びT.Uetsukiら、J.Biol.Chem.
(1989)264:5791−5798)から切り出
し、そしてpdKCRベクター(M.Tsuchiya
ら,Embo J.(1987)6:611−61
6)、K.O′Haraら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA Vol.78,No.3,15
27−1531,(1981)、(R.Fukunag
aら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
Val.81,5086−5090(1984))にク
ローニングして、SV40前期プロモーター−エンハン
サーを含有する約300bpのHindIII −EcoRI
断片を置き換えてpTEF−1を得た。
enowポリメラーゼでフィルーインし、そしてHin
dIII リンカーに連結した。次に、この修飾されたpT
EF−1ベクターDNAから約1.6kbのHindIII
−SmaI断片を切り出した。HCMV−12h−gγ
1をEcoRIにより部分消化し、Klenowポリメ
ラーゼによりフィルーインし、そして自己連結すること
により、実施例5において作製したHCMV−12h−
gγ1からプラスミドHCMV−12h−gγ1(ΔE
2)を作製した。
E2)をEcoRIで消化し、Klenowポリメラー
ゼでフィルーインし、そしてHindIII で消化した。
ヒトγ−1C領域をコードするDNA配列を含有する約
7kbの断片を、HEF−1αプロモーター−エンハンサ
ーを含有する前記の1.6kb HindIII −SmaI
断片に連結してHEF−12h−gγ1を得た。このベ
クター中のHEF−1αプロモーター・エンハンサー領
域は、5′−領域に接する380bpのDNAを除き、p
TEF−1中のそれと同一であった。HindIII −B
amHI断片として存在するこのH鎖V領域は、他のH
鎖V領域と容易に交換することができる。
を含有するHindIII −BamHIDNA断片をpU
C−RVh−PM1a,pUC−RVh−PM1b,p
UC−RVh−PM1c,pUC−RVh−PM1d,
pUC−RVh−PM1e及びpUC−RVh−PM1
f(実施例7)から切り出し、そして前記のプラスミド
HEF−12h−gγ1のHindIII −BamHI部
位に挿入して、それぞれ発現ベクターRVh−PM1
a,RVh−PM1b,RVh−PM1c,RVh−P
M1d,RVh−PM1e、及びRVh−PM1fを得
た。発現ベクターRVh−PM1a,RVh−PM1
b,RVh−PM1c,RVh−PM1e、及びRVh
−PM1f、並びにHEF−PMh−gγ1は、それぞ
れ再構成ヒトPM−1抗体H鎖V領域バージョン
「a」,「b」,「c」,「d」,「e」及び「f」、
並びにマウスPM−1抗体H鎖V領域をコードするDN
Aを有する。
作製するため、HEF−1αプロモーター−エンハンサ
ー領域を含有する約3.0kbのPvuI−HindIII
断片をHEF−12h−gγ1ら切り出し、そして実施
例5において作製したHCMV−L鎖発現ベクターHC
MV−12k−gkからの約7.7kbのPvuI−Hi
ndIII 断片に連結してHEF−12k−gkを得た。
H鎖発現ベクターHEF−12h−gγ1の場合と同様
に、HindIII −BamHI断片として存在するHE
F−12k−gk中のL鎖V領域をコードするDNAは
他のL鎖V領域をコードするDNAと容易に交換するこ
とができる。なお、プラスミドHEF−PMh−gγ1
は、HEF−12h−gγ1(図8)のEF1αプロモ
ーター領域(PvuI−HindIII 断片)によりHC
MV−pmh−gγ1のHCHVプロモーター領域(P
vuI−HindIII 断片)を置き換えることにより作
製したものである。
を含有するHindIII −BamHIDNA断片をpU
C−RV1−PM1a及びpUC−RV1−PM1b
(実施例7)から切り出し、そしてHEF−12k−g
kのHindIII −BamHI部位に挿入し、それぞれ
発現ベクターRV1−PM1a及びRV1−PM1bを
得た。発現ベクターRV1−PM1a及びRV1−PM
1b、並びにHEF−PMK −gkはそれぞれ再構成ヒ
トL鎖V領域「a」及び「b」、並びにマウスPM−1
L鎖V領域をコードするDNAを有する。なお、プラ
スミドHEF−PMK −gkは、HEF−12k−gk
(図9)のEF1αプロモーター領域(PvuI−Hi
ndIII 断片) によりHCMV−pmka−gkのHC
MVプロモーター領域(PvuI−HindIII 断片)
を置き換えることにより作製したものである。
O細胞中で高レベルで発現させるための、欠陥SV40
プロモーター−エンハンサー配列に連結されたジヒドロ
フォレートレダクターゼ(dhfr)遺伝子を用いるベ
クターの作製(図10及び図11) SV40前期プロモーターからエンハンサー配列を除去
するため、プラスミドpSV2−dhfr(S.Sub
ramaniら、Mol.Cell.Biol.(19
81)1:854−864)(ATCC33694)を
SphI及びPvuIIで消化し、Klenowポリメラ
ーゼでフィルーインし、そして自己連結してpSV2−
dhfr−ΔEを得た(図10)。HCMVプロモータ
ー、H鎖V領域をコードするDNA及びヒトγ−1C領
域をコードするDNAを含有する約3.7kbのEcoR
I断片を、EcoRIによる部分消化によりHCMV−
PMh−gγ1から切り出した。この断片を、EcoR
I−消化pSV2−dhfr−ΔEに連結してDHFR
−ΔE−PMh−gγ1を得た。
を用いるH鎖発現ベクターに基いて類似のベクターを作
製した(図11を参照のこと)。HCMV−12h−g
γ1に由来する約3.7kbのEcoRI断片を、Eco
RI−消化pSV2−dhfr−ΔEと連結してDHF
R−ΔE−12h−gγ1を得た。DHFR−ΔE−1
2h−gγ1中のdhfr配列に続くBamHI部位
を、BamHIによる部分消化、Klenowポリメラ
ーゼによるフィルーイン及び自己連結により除去した。
dhfr cDNAを含有する約4kbのPvuI−Ba
mHI断片をこの修飾されたDHFR−ΔE−12h−
gγ1から切り出し、そして実施例12において作製し
たRVh−PM1f−4からの約3kbのPvuI−Ba
mHI断片に連結してDHFR−ΔE−RVh−PMl
fを得た。上記の改良されたプラスミドは本発明の再構
成ヒトPM−1抗体の製造のために使用することができ
る。
々のバージョンの発現及び分析 再構成ヒトPM−1抗体のL鎖及びH鎖を発現する各H
EF−1αベクターをCOS細胞に同時形質転換(co
−transfect)した。標準対照としてキメラP
M−1抗体のL鎖及びH鎖を発現する各HEF−1αベ
クターもCOS細胞に同時形質転換した。3日後,形質
転換されたCOS細胞からの培地を集め、そしてELI
SAにより(1)上清中に存在するヒトIgG抗体の量
について、及び(2)IL−6Rに結合するそのIgG
の能力について分析した。次に、同じサンプルをさら
に、ELISAにより、ヒトIL−6RへのヒトIL−
6の結合を阻害する該抗体の能力について試験した。
種類のベクターの一方(RV1−PM1a又はRV1−
PM1b)及びキメラPM−1抗体H鎖を発現するベク
ター(HCMV−PMh−gγ1)によりCOS細胞を
同時形質転換することにより、再構成ヒトPM−1抗体
L鎖V領域の2種類のバージョンの評価を行った。細胞
をまた、キメラPM−1抗体L鎖及びH鎖を発現する各
ベクター(HCMV−PMka−gk及びHCMV−P
Mh−gγ1)により同時形質転換した。未精製のCO
S細胞上清を用いるデーターは、ヒトIL−6Rへの結
合についての測定において、再構成ヒトPM−1抗体L
鎖のバージョン「a」がキメラPM−1抗体L鎖と同等
であることを示した。
鎖のバージョン「b」はヒトIL−6Rへの結合能を実
質的に保持しなかった。これらの結果から、FR3中の
位置71のフェニルアラニン(CAMPAHTH−1H
のために修飾されたヒトREI中に存在する)からチロ
シン(天然ヒトREI及びマウスPM−1抗体中に存在
する)への変化は機能的抗原結合部位の形成に対して非
常に有害であることが結論された。再構成ヒトPM−1
抗体H鎖V領域の種々のバージョンを評価する次の実績
において、再構成ヒトPM−1抗体L鎖V領域のバージ
ョン「a」を常に用いた。
種類のベクターの1つ(RVh−PM1a,RVh−P
M1b,RVh−PM1c,RVh−PM1d,RVh
−PM1e又はRVh−PM1f)及び再構成ヒトPM
−1抗体L鎖のバージョン「a」を発現するベクター
(RV1−PM1a)によりCOS細胞を同時形質転換
することにより、再構成ヒトPM−1抗体H鎖V領域の
6種類のバージョンを評価した。細胞を、キメラPM−
1抗体L鎖及びH鎖を発現する各ベクター(HEF−P
Mk−gk及びHEF−PMh−gγ1)によっても同
時形質転換した。未精製のCOS細胞上清を用いた予備
データーが示すところによれば、ヒトIL−6Rへの結
合についての測定において、再構成ヒトPM−1抗体L
鎖のバージョン「a」及び再構成ヒトPM−1抗体H鎖
のバージョン「f」は、キメラPM−1抗体L鎖及びH
鎖と同等であった。
PM−1抗体及び再構成ヒトPM−1抗体をCOS細胞
上清から濃縮そしてプロテインAを用いて精製した。す
なわち、COS細胞からの培地を100kdカットオフ
限外濾過装置(Amicon)を用いて濃縮した。濃縮
した培地をプロテインAアガロース(AffiGelP
rotein A MAPSIIキット、BioRad)
を用いて精製した。要約すれば、濃縮された培地を、5
ベッドボリウムの結合緩衝液により平衡化されたプロテ
インAアガロースカラムに適用した。このカラムを15
ベッドボリウムの結合緩衝液で洗浄し、そして次に5ベ
ッドボリウムの溶出緩衝液で溶出を行った。そしてマイ
クロコンセントレーター(Centricon 10,
Amicon)を用いて溶出液を濃縮し、溶出緩衝液を
PBSに置換した。
V領域のバージョン「a」と再構成ヒトH鎖V領域のバ
ージョン「a」,「b」,「c」,「d」,「e」又は
「f」とから成る再構成ヒトPM−1抗体の精製された
サンプルの分析を行った。L鎖の「a」バージョン+H
鎖の「f」バージョンが明らかに最良の再構成ヒトPM
−1抗体であった。このものは、キメラPM−1抗体と
同様にヒトIL−6Rに結合する(図13)。これはま
た、マウス抗体及びキメラ抗体と同様に、ヒトIL−6
がヒトIL−6Rに結合するのを阻害する(図14)。
再構成ヒトPM−1V領域の修正 再構成ヒトPM−1抗体L鎖及びH鎖のV領域(配列番
号:54及び55)のリーダー配列をコードするDNA
配列内のイントロンを除去するため、V領域をコードす
るcDNAをPCRプライマーを用いて再クローニング
した。L鎖及びH鎖の発現ベクターRV1−PM1a及
びRVh−PM1fをCOS細胞に同時形質転換した。
48時間後、全RNAを調製し(Chirgwinら、
Biochemistry(1979)18:5294
−5299)、そしてマウス抗体V領域のPCRクーロ
ニングについて記載したようにして一本cDNA合成の
ために5μgの全RNAを用いた。3種類のPCRプラ
イマーを設計し、そして合成した。LEV−P1(配列
番号:60)及びHEV−P1(配列番号:58)はス
プライスドナー配列及びBamHI部位を含有し、そし
てそれぞれL鎖及びH鎖のV領域のための前方プライマ
ーとして使用した。
dIII 部位及びATG開始コドンの前のKozakコン
センサス配列を含有し、そしてL鎖及びH鎖のV領域の
ための後方プライマーとして使用した。100μlずつ
のPCR反応物は20mM Tris−HCl(pH8.
8),10mM KCl,10mM (NH4 )2 SO4,
2mM MgSO4 ,0.1% Triton X−10
0,0.1μgのBSA,250μM dNTP,2.
5uのVent DNAポリメラーゼ(Bio.Lab
s,U.K.)、50%の一本cDNA合成反応物並び
に100pmoleずつの前方プライマー及び後方プラ
イマーを含有した。
い、そして94℃にて1.5分間の最初の変性の後、9
4℃にて1分間、50℃にて1分間及び72℃にて1分
間のサイクル反応を30回行い、そして次に72℃にて
10分間インキュベートした。L鎖V領域を含有する4
08bpのPCR生成物及びH鎖V領域を含有する444
bpのPCR生成物を、2.0%低融点アガロースゲルを
用いて精製し、そしてBamHI及びHindIII によ
り消化し、そしてpUC19ベクターにサブクローニン
グし、それぞれpUC−RV1−PM1a−3及びpU
C−RVh−PM1f−3を得た。
領域のDNA配列は不適切なスプライスドナー部位及び
アクセプター部位を含有することが明らかになった(配
列番号:54及び55を参照のこと)。L鎖V領域内の
これらの部位は高頻度には使用されない(mRNAの約
10%)が、H鎖V領域内のこれらの部位は高頻度で使
用される(mRNAの約90%)。この異常なスプライ
シングが再構成ヒトPM−1抗体の低レベルの発現をも
たらした。V領域の異常なスプライシングを回避するた
め、スプライス−ドナー部位をPCR法により除去し
た。H鎖V領域について、後方プライマーNEW−SP
1(配列番号:61)及び前方プライマーNEW−SP
2(配列番号62)を合成した。このプライマーはDN
A配列TGG GTG AGAをDNA配列TGG G
TT CGCに変える。PCR反応の条件はcDNAの
クローニングについて前記した通りであったが、鋳型D
NAは50ngのpUC−RVh−PM1f−3であり、
そしてプライマーはHEV−P2とNEW−SP2、又
はHEF−P1とNEW−SP1のいずれかであった。
%低融点アガロースゲルを用いて精製し、そしてPCR
連結反応において使用した。0.5μgの第一PCR生
成物を含有する98μlのPCR反応物及び5ユニット
のVent DNAポリメラーゼを94℃にて2分間、
50℃にて2分間及び72℃にて5分間インキュベート
し、そして次に100pmoleずつのHEV−P1プ
ライマー及びHEV−P2プライマーを加えた。PCR
チューブを30μlの鉱油で覆い、そして94℃にて1
分間、50℃にて1分間及び72℃にて1分間の25サ
イクルのPCRにかけ、そして次に72℃にて10分間
インキュベートした。
V領域中のスプライス−ドナー領域をPCRプライマー
REI−SP1(配列番号:63)及びREI−SP2
(配列番号:64)を用いて除去した。該プライマーは
DNA配列CAG GTAAGGをDNA配列CAG
GAA AGGに変える。両PCR生成物、すなわちL
鎖V領域についての408bpのDNA断片及びH鎖V領
域についての444bpのDNA断片を2.0%低融点ア
ガロースゲルを用いて精製し、HindIII及びBam
HIにより消化し、そして配列決定のためpUC19に
サブクローニングしてpUC−RV1−PM1a−4及
びpUC−RVh−RM1f−4を得た。
HI断片を、pUC−RVh−PM1f−4のHind
III −BamHI領域と置き換えることにより、RVh
−PM1f−4を得た。再構成ヒトPM−1抗体L鎖V
領域のイントロンが除去されたバージョン「a」の配列
を配列番号57に示し、再構成ヒトPM−1抗体H鎖V
領域のイントロンが除去されたバージョン「f」の配列
を配列番号56に示す。
抗体L鎖V領域をコードするDNAの作製 再構成ヒトAUK12−20抗体L鎖V領域をコードす
るDNAの作製の工程を図16に示す。鋳型となるヒト
抗体L鎖V領域をコードする遺伝子は、制限酵素Hin
dIII 及びBamHI部位を用いてpUC19ベクター
に組み込まれている。8個のPCRプライマー(A〜
H)を準備し、第1のPCRにより、V領域をコードす
る遺伝子を4つの領域に分けて増幅させる。プライマー
A及びHは、pUC19ベクター上のDNA配列と相補
性を持つ。プライマーB,C及びDは、それぞれ移植す
るCDR領域の遺伝子配列を有する40〜60bpのプラ
イマーである。
イマーB,C及びDの5′側15〜20bpのDNA配列
と相補性を持つ。4個の第1PCRは、それぞれプライ
マーAとE、BとF、CとG、及びDとHを用いる。P
CR生成物A−EはFR1をコードし、B−FはCDR
1とFR2をコードする。A−E断片の3′側とB−F
断片の5′側は15〜20bpの相補性を持つので、後
に、これら断片を連結することが可能となる。同様に、
B−F断片は、CDR2及びFR3をコードするC−G
断片とも相補性を持つ。そして、C−G断片はさらに、
CDR3とFR4をコードするD−H断片とも相補性を
持つ。こうしてこれら4種の断片は、互いの相補性によ
り連結が可能となる。
結反応を行った後、プライマーA及びHを加える事によ
り、正しく4つの断片が連結したものが、この第2のP
CRによって増幅してくる。こうして得られた第2のP
CR生成物は、3つの移植されたCDRを有し、Hin
dIII 及びBamHIの消化後、pUC19ベクターに
サブクローニングする。さらに具体的には、鋳型として
再構成ヒトPM−1抗体L鎖V領域バージョン「a」を
コードするDNAがプラスミドpUC19に挿入されて
いるプラスミドpUC−RV1−PM1a−4を用い
た。前記プライマーA〜Hは次の配列を有する。
L1,1220−L2及び1220−L3については、
8M尿素を含む12%ポリアクリルアミドゲルを用いて
精製後使用した。100μlずつのPCR反応物は20
mM Tris−HCl(pH8.8),10mM KCl,
10mM (NH4)2 SO4 ,2mM MgSO4 ,0.1
% Triton X−100,0.1μgのBSA,
250μm dNTP,5uのVent DNAポリメ
ラーゼ(BioLabs.U.K.),50ngのpUC
−RVl−PM1a−4 DNA、そして各100pm
olesの前方及び後方プライマーを含有した。各PC
Rチューブは50μlの鉱油で覆い、そして94℃にて
1.5分間の最初の変性の後、94℃にて1分間、50
℃にて1分間及び72℃にて1分間の反応を30サイク
ル行い、そして次に72℃にて10分間インキュベート
した。
130bp(C−G)及び123bp(D−H)の各PCR
生成物を2.0%の低融点アガロース(FMC,Bi
o.Products,USA)ゲルを用いて精製し
た。すなわち、各DNA断片を含有するアガロース片を
切り取りそして65℃にて5分間溶融せしめ、そしてこ
れと同容積の2mM EDTA及び200mMNaClを含
有する20mM Tris−HCl(pH7.5)を加え
た。この混合物をフェノール及びクロロホルムにより抽
出し、そしてDNA断片をエタノール沈澱により回収
し、そして1mM EDTAを含有する10mM Tris
−HCl(pH7.5)に溶解し、そしてPCR連結反応
において使用した。
及び5ユニットのVent DNAポリメラーゼを含有
する98μlのPCR反応液を94℃にて2分間、50
℃にて2分間及び72℃にて5分間インキュベートし、
連結反応を行った。そして次に、各100pmoleの
A(REVERSE)及びH(UNIVERSAL)プ
ライマーを加えて反応液を100μlとした後、これを
50μlの鉱油でおおい、そして94℃にて1分間、5
0℃にて1分間及び72℃にて1分間の反応を30サイ
クル行い、そして次に72℃にて10分間インキュベー
トした。
0のL鎖のCDRが移植されたL鎖V領域をコードする
DNAを含有する558bpの第2PCRの生成物を2.
0%低融点アガロースゲルを用いて精製し、そしてBa
mHI及びHindIII により消化後、pUC19ベク
ターにサブクローニングし、塩基配列を確認し、pUC
−RVL −1220aを得た。得られたL鎖V領域のア
ミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配
列表71に示す。次いで、L鎖発現ベクターを構築する
ため、再構成ヒトAUK12−20抗体L鎖V領域を含
有するHindIII −BamHIDNA断片を上記プラ
スミドpUC−RVL −1220aから切り出し、L鎖
発現ベクターHEF−12κ−gκのHindIII −B
amHI部位に挿入し、再構成ヒトAUK12−20抗
体L鎖V領域バージョンaの発現ベクターであるRVL
−1220aを得た。
抗体L鎖の発現及び分析 COS細胞での一過性(transient)発現 再構成ヒトAUK12−20抗体L鎖を発現するベクタ
ーRVL −1220a及びキメラAUK12−20抗体
H鎖を発現するベクター、HEF−12h−gγ1(実
施例5)によりCOS細胞を同時形質転換することによ
り、再構成ヒトAUK12−20抗体L鎖バージョン
「a」の評価を行った。すなわち、COS細胞を1×1
07 個/mlになるようにphosphate−buff
eredsaline(PBS)に懸濁し、この細胞浮
遊液0.8mlにDNA(各プラスミドについて10μ
g)を加えた。Gene Pulsar装置(BioR
ad)を用い1,900ボルト(V)、25マイクロフ
ァラッド(μF)の電気容量にてパルスを与えた。
トロポレーションした細胞を、10%のウシ胎児血清
(γ−グロブリン不含)を含有するDMEM培地(GI
BCO)20mlに加えた。72時間のインキュベーショ
ンの後、培養上清を集め、遠心分離して細胞破片を除去
し、そして無菌条件下で4℃にて短時間、又は−20℃
にて長時間貯蔵した。
様抗体の定量 トランスフェクトされたCOS細胞の培養上清をELI
SAにより測定して、キメラ抗体が生産されていること
を確認した。ヒト様抗体を検出するため、プレートをヤ
ギの抗ヒトIgG(Whole molecule)
(Sigma)によりコートした。ブロックした後、C
OS細胞からの培養上清を段階希釈しそして各ウエルに
加えた。プレートのインキュベーション及び洗浄の後、
アルカリホスファターゼ−結合ヤギ抗−ヒトIgG(γ
鎖特異的、Sigma)を加えた。インキュベーション
及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。さらにインキュベ
ーションした後、反応を停止しそして405nmにおける
吸光度を測定した。標準として精製ヒトIgG(Sig
ma)を用いた。
の酵素免疫測定(ELISA) トランスフェクトされたCOS細胞からの上清をELI
SAにより測定して、生産されたヒト様抗体が抗原IL
−6Rに結合し得るか否かを決定した。抗原への結合の
検出のため、プレートをMT18マウスモノクローナル
抗体(参考例1)でコートした。1% BSAでブロッ
クした後、可溶性組換えヒトIL−6R(SR344)
をプレートに加えた。プレートを洗浄した後、COS細
胞からの培養上清を段階希釈し、そして該プレートの各
ウエルに加えた。インキュベーション及び洗浄の後、ア
ルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトIgGをウエル
に加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝
液を加えた。インキュベーションの後、反応を停止し、
そして405nmにおける吸光度を測定した。
K12−20抗体L鎖バージョン「a」とキメラAUK
12−20抗体H鎖の組み合せによるヒト様抗体は、キ
メラAUK12−20抗体と同様にヒトIL−6Rに対
する強い結合能を示し、サンプルの希釈度依存的に40
5nmにおける吸光度が変化し、サンプル中にIL−6R
に対する抗体が含まれていることが確認された。また、
この結果は、再構成ヒトAUK12−20抗体L鎖のバ
ージョン「a」がキメラAUK12−20抗体L鎖と同
様に抗原結合能を持つことを示している。
I)コンセンサス配列を用いた再構成ヒトAUK12−
20抗体H鎖遺伝子の構築 実施例13で示した方法と同様にして、AUK12−2
0抗体H鎖V領域のCDRをヒトサブグループIのコン
センサス配列をFRとして有する再構成ヒトV H a42
5(Kettleboroughら、Protein
Engineering,4,773−783,199
1)に移植した。まず、再構成ヒトVHa425(上記
文献中、Fig3)をコードするHindIII −Bam
HI DNA断片をプラスミドHCMV−RVHa−42
5−γ1から切り出し、pUC19ベクターのHind
III −BamHI部位にサブクローニングし、pUC−
RVH −425aを得た。
に用いる8個のプライマー(A1〜H1)を合成した。
プライマー1220−H1は、CDR1の移植及びTh
r−28からSer−28の変更を誘導する様にデザイ
ンし、プライマー1220−H3はCDR3の移植及び
Ser−94からArg−94への変異を誘導する様に
デザインした。プライマー1220−H1,1220−
H2及び1220−H3は、それぞれ8M尿素を含む1
2%ポリアクリルアミドゲルを用いて精製後、使用し
た。各プライマーのヌクレオチド配列は次の通りであ
る。
−RVH −425aを使用し、H鎖CDR移植用プライ
マーとして上記のものを使用した以外は実施例13に記
載したのと同じであった。A1とE1、B1とF1、C
1とG1、及びD1とH1のプライマー対を用いて第1
PCR反応を行い、それぞれ186bp(A1−E1),
75bp(B1−F1),173bp(C1−G1)及び1
05bp(D1−H1)の各第1PCR生成物を2.0%
の低融点アガロースゲルにて精製し、次の第2PCR連
結反応において使用した。
2μgの上記第1PCR生成物を用いて第2PCR(P
CR連結反応を含む)を行い、マウスAUK12−20
抗体のH鎖V領域CDRが移植されたヒトH鎖V領域を
含有する495bpのPCR生成物を得、これを2.0%
低融点アガロースゲルを用いて精製した。そしてBam
HI及びHindIII により消化後、得られたBamH
I−HindIII 断片をpUC19ベクターにサブクロ
ーニングし、塩基配列を確認して、pUC−RVH −1
220aを得た。
体H鎖V領域をコードするDNA配列を調らべた結果、
スプライスの供与配列とよく一致する配列が見い出され
た。この事は、再構成ヒトPM−1抗体の作成時に問題
となった異常なスプライシングを引き起す可能性があ
る。そこで、この配列をPCR法により変異させた。変
異誘導プライマーとして、SGI−SP1(配列番号9
7)及びSGI−SP2(配列番号98)を合成した。
このプライマーは、DNA配列AAG GTGAGCを
DNA配列AAA GTC AGCに変える。PCR反
応の条件は、前記条件と同様に行い、鋳型DNAは50
ngのpUC−RVH −1220aであり、そしてプライ
マーはSGI−SP1とUNIVERSAL(配列番号
82)、またはSGI−SP2とREVERSE(配列
番号83)のいずれかであった。
%低融点アガロースゲルを用いて精製し、そしてPCR
連結反応において使用した。各0.2μgの第1PCR
生成物及び5uのVent DNAポリメラーゼを含有
する98μlのPCR反応液を94℃にて2分間、50
℃にて2分間、及び72℃にて5分間インキュベートし
連結反応を行った。そして次に100pmoleずつの
UNIVERSAL及びREVERSEプライマーを加
え、50μlの鉱油でおおった後、94℃にて1分間、
50℃にて1分間そして72℃にて1分間の第2PCR
を30サイクル行い、そして次に72℃にて10分間イ
ンキュベートした。第2PCRで得られた495bpのD
NA断片を2.0%低融点アガロースゲルを用いて精製
し、HindIII 及びBamHIにより消化し、これを
pUC19ベクターにサブクローニングした後、塩基配
列を確認して、pUC−RVH −1220a−2を得
た。
H鎖V領域をコードするDNAを含有するHindIII
−BamHI DNA断片を上記pUC−RVH −12
20a−2より切り出し、H鎖発現ベクターHEF−1
2h−gγ1のHindIII−BamHI部位に導入
し、再構成ヒトAUK12−20抗体H鎖のバージョン
aの発現ベクターであるRVH −1220aを得た。
域の他のバージョン(b〜d)をコードするDNAを作
成するために2組の変異誘発PCRプライマーを合成し
た。各PCR反応は前記の反応条件と本質的に同じ条件
下で行われた。バージョン「b」をコードするDNAの
作成のため、2種の第1PCRにおいて、UNIVER
SALプライマー(配列番号82)及び変異誘発プライ
マー1220H−m1a(配列番号78)、あるいは、
REVERSEプライマー(配列番号83)と変異誘発
プライマー1220H−m1b(配列番号79)の各P
CRプライマー、並びに鋳型DNAとしてのpUC−R
VH −1220aを用いた。それぞれ202bp及び32
3bpの第1PCR生成物を2.0%低融点アガロースゲ
ルを用いて精製後、前記の反応条件と同様に第2PCR
(PCR連結反応を含む)を行い、495bpの生成物
(バージョン「b」)を得た。これをHindIII −B
amHIにより消化し、そして、pUC19ベクターに
サブクローニングし、pUC−RVH −1220bを得
た。
H−m2a(配列番号80)、1220H−m2b(配
列番号81)及びこの生成物を鋳型pUC−RVH −1
220aを用いてPCR生成物(バージョン「c」をコ
ードするDNA)を得、HindIII 及びBamHIで
消化し、pUC19ベクターのHindIII −BamH
I部位に挿入してpUC−RVH −1220cを得た。
さらに、変異誘発プライマー1220H−m1a(配列
番号78)、1220H−m1b(配列番号79)及び
鋳型としてのpUC−RVH −1220cを用いてPC
R生成物(バージョンd)を得、これをHindIII 及
びBamHIで消化してpUC19ベクターのHind
III −BamHI部位に挿入することによりpUC−R
VH −1220dを得た。
0b中にコードされているの再構成ヒト抗体H鎖V領域
バージョン「b」のアミノ酸配列及びそれをコードする
ヌクレオチド配列を配列番号84に示し、pUC−RV
H −1220d中にコードされている再構成ヒトH鎖V
領域バージョン「d」のアミノ酸配列及びそれをコード
するヌクレオチド配列を配列表85に示す。
H鎖の各バージョンの発現ベクターを構築するために、
再構成ヒトAUK12−20抗体H鎖V領域をコードす
るDNAを含むHindIII −BamHI断片をpUC
−RVH −1220b,pUC−RVH −1220c、
及びpUC−RVH −1220dより切り出し、H鎖発
現ベクターHEF−12h−gγ1のHindIII −B
amHI部位に挿入して、各バージョンの発現ベクター
RVH −1220b,RVH −1220c、及びRVH
−1220dをそれぞれ得た。
抗体の種々のバージョンの発現及び分析 再構成ヒトAUK12−20抗体H鎖を発現する4種類
のベクターの1つ(RVH −1220a,RVH −12
20b,RVH −1220c、またはRVH −1220
d)及び再構成ヒトAUK12−20抗体L鎖を発現す
るベクターRV L −1220aによりCOS細胞を同時
形質転換することにより、再構成ヒトAUK12−20
抗体H鎖V領域の4種類のバージョンを評価した。
2−20抗体L鎖及びH鎖を発現する各ベクター(HE
F−12h−gγ1及びHEF−12κ−gκ)によっ
ても同時形質転換した。ヒトIL−6Rへの結合につい
ての測定において、再構成ヒトAUK12−20抗体L
鎖と再構成ヒトAUK12−20抗体H鎖のバージョン
「b」、あるいは再構成ヒトAUK12−20抗体L鎖
と再構成ヒトAUK12−20抗体H鎖のバージョン
「d」との組み合せによる再構成ヒト12−20抗体
は、キメラAUK12−20抗体と同等の結合活性を示
した。これらの結果を図18及び図19に示す。
成ヒトAUK12−20抗体H鎖遺伝子の構築 マウスモノクローナル抗体AUK12−20のH鎖V領
域と最も相同性の高いヒト抗体は、タンパクデータベー
ス“Leeds”の検索により、HAXであった(J.
Immunology 139,2496−2501,
1987,SLE患者由来B cell hybrid
oma 21/28の産生する抗体、遺伝子配列はFi
g.4,5に、アミノ酸配列はFig.6に記載)。再
構成ヒトAUK12−20抗体H鎖V領域の設計を、H
AX抗体のFR領域とマウスモノクローナル抗体AUK
12−20のH鎖V領域のCDRを用いて行った。
0のH鎖V領域の第一バージョン(Sle1220H
a)のCDRを含む再構成ヒトAUK12−20抗体H
鎖V領域をコードする全DNAは化学合成にて作成し
た。すなわち、全長439bpのSle1220Haをコ
ードするDNAを各々21bpの重複部位を有する90〜
94bpの長さの6本のオリゴヌクレオチド(sle12
20h1〜6;それぞれ、配列番号86〜91)に分け
て設計した。オリゴヌクレオチドの設計にあたり、2次
構造の検索を行ない、構造上に問題のある部位に関し
て、アミノ酸置換がおきない様に、コドンの第3塩基を
変換した。これらのオリゴヌクレオチドの相互関係及び
2本鎖合成DNAの完成までの過程を図20に示す。
う。すなわち6本の合成オリゴヌクレオチドを同一PC
R反応チューブに加え、第1のPCR反応を行う。これ
により、2つのオリゴヌクレオチドのアニーリング伸長
を行うことができ、さらに、4つのオリゴヌクレオチ
ド、または、全長のオリゴヌクレオチドを得ることがで
きる。次に、末端プライマーA(配列番号92)及びB
(配列番号93)を加え、第2のPCR反応を行うこと
で、正しく全長を有するオリゴヌクレオチドのみを増幅
することができる。得られた生成物を精製し、BamH
I及びHindIIIにより消化後、pUC19ベクター
にサブクローニングしてシークエンスを行う。
(pH8.3),50mM KCl,0.1mM dATP,
0.1mM dGTP,0.1mM dCTP,0.1mM
dTTP,1.5mM MgCl2 及び2.5uのDNA
ポリメラーゼAmpliTaq(Perkin Elm
er Cetus)並びに各オリゴヌクレオチド5pm
oleを含有する98μlの反応混合物を94℃1.5
分間の変性後、94℃3分間、50℃2分間、72℃5
分間の反応を3サイクル行い、次に72℃にて10分間
インキュベートした。
びBを1μlずつ加え、80μlの鉱油で覆い、94℃
1.5分間の変性後、94℃にて1分間、50℃にて1
分間、72℃1分間の反応を30サイクル行い、続いて
72℃で10分間インキュベートした。439bpのPC
R生成物を1.5%の低融点アガロースゲルを用いて精
製し、制限酵素BamHIおよびHindIII により消
化後、pUC19ベクターにサブクローニングして、塩
基配列を確認した。得られたクローンをpUC−RVH
−sle1220Haとした。このプラスミド中にコー
ドされている再構成ヒトAUK12−20抗体のH鎖V
領域バージョン「a」のアミノ酸配列及びそれをコード
するヌクレオチド配列を配列番号94に示す。
le1220Ha)抗体H鎖V領域をコードする遺伝子
を含有するHindIII −BamHI DNA断片をp
UC−RVH −sle1220Haより切出し、H鎖発
現ベクターHEF−12h−gγ1のHindIII −B
amHI部位に導入し、RVH −sle1220Haを
得た。
域の他のバージョン(「b」〜「d」)を作成するた
め、2つの変異誘発プライマーsle1220Hm1
(配列番号95)、及びsle1220Hm2(配列番
号96)を合成した。各PCR反応では、実施例13で
示されているVent DNAポリメラーゼ及び反応液
組成を用いた。各PCR反応では、バージョン「b」及
びバージョン「c」については、鋳型としてのpUC−
RVH −sle1220Ha,50pmoleの変異誘
発プライマーsle1220Hm1またはsle122
0Hm2及び50pmoleの末端プライマーBを含有
する反応混合物を94℃1.5分間の変性の後、94℃
1分、50℃1分、72℃1分の30サイクルの反応に
かけ、次に72℃で10分間インキュベートした。
%の低融点アガロースゲルを用いて精製し、第2のPC
R反応のプライマーとして使用した。すなわち、50p
moleの末端プライマーAと、0.2μgのPCR生
成物を加え、pUC−RVH−sle1220Haを鋳
型として、第2PCR反応を行い、439bpの生成物を
1.5%低融点アガロースゲルで精製、BamHI及び
HindIII で消化後pUC19ベクターにサブクロー
ニングして、それぞれ構成ヒトAUK12−20抗体H
鎖V領域バージョン「b」又は「c」をコードするプラ
スミドpUC−RVH −sle1220Hb又はpUC
−RVH −sle1220Hcを得た。
域バージョン「d」をコードするDNAは次の様にして
作製した。鋳型としてのpUC−RVH −sle122
0Hbを用いた。変異誘導プライマーsle1220H
m2及び末端プライマーBを50pmoleずつ用いて
第1のPCR反応を30サイクル行った。得られた17
8bpのPCR生成物を1.6%の低融点アガロースゲル
により精製し、第2のPCRのプライマーとして用い
た。このプライマーと50pmoleの末端プライマー
Aを用いて第2のPCRを行い、439bpのDNA断片
を得た。これを、精製し、BamHI及びHindIII
にて消化後pUC19ベクターにサブクローニングし、
ヌクレオチド配列を確認し、pUC−RVH −sle1
220Hdを得た。
H鎖の各バージョンの発現ベクターを構築するため、再
構成ヒトAUK12−20抗体H鎖V領域をコードする
DNAを含むBamHI−HindIII 断片をpUC−
RVH −sle1220Hb,pUC−RVH −sle
1220Hc、およびpUC−RVH −sle1220
Hdより切り出し、H鎖発現ベクターHEF−12h−
gγ1のHindIII−BamHI部位に挿入して、各
発現ベクター、RVH −sle1220Hb,RVH −
sle1220HcおよびRVH −sle1220Hd
をそれぞれ得た。
のベクターのうちの1つ(RVH −sle1220H
a,RVH −sle1220Hb,RVH −sle12
20HcまたはRVH −sle1220Hd)および、
再構成ヒトAUK12−20抗体L鎖を発現するベクタ
ーRVL −1220aを用いてCOS細胞を同時形質転
換することにより、再構成ヒトAUK12−20抗体H
鎖V領域の4種類のバージョンを、IL−6RへのIL
−6の結合を阻害する能力について評価した。この結果
を図21〜24に示す。なお、これらの結果は、生産さ
れた抗体をプロテインAによって精製した後に得られた
ものである。
鎖もしくは再構成L鎖又はキメラH鎖もしくは再構成H
鎖のV領域、そして特にFR中の1個又は複数個のアミ
ノ酸を他のアミノ酸に置換してもなおヒトIL−6Rに
結合する能力を維持している。従って本発明は、その本
来の性質を維持している限り、1個又は複数のアミノ酸
が他のアミノ酸により置換されている、キメラ抗体及び
再構成ヒト抗体、キメラL鎖及び再構成L鎖、キメラH
鎖及び再構成H鎖、再構成L鎖V領域、並びに再構成H
鎖V領域、並びにこれらをコードするDNAをも包含す
る。
にして作製された。参考例1 .ハイブリドーマ MT18の作製 ヒトIL−6Rに対するモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマを作製するため、免疫原として、細胞表
面にヒトIL−6Rを発現するマウスT細胞を次の様に
して作製した。すなわち、Y.Hirataら、J.I
mmunol.Vol.143,2900−2906
(1989)に開示されているプラスミドpZipne
o IL−6Rを常法に従ってマウスT細胞系CTLL
−2(ATCC TIB214)にトランスフェクト
し、生ずる形質転換体を常法に従ってG418を用いて
スクリーニングすることにより細胞あたり約30,00
0個のヒトIL−6Rを発現する細胞株を得た。この細
胞株をCTBC3と称する。
640中で培養し、そして培養細胞をPBS緩衝液によ
り4回洗浄し、そして1×107 個の細胞をC57BL
/6マウスに腹腔内注射して免疫感作した。この免疫感
作は1週間に1回6週間にわたって行った。この免疫感
作されたマウスから脾臓細胞を得、そして常法に従って
ポリエチレングリコールを用いて骨髄腫P3U1細胞を
融合せしめ、そして融合した細胞を次の様にしてスクリ
ーニングした。IL−6R陰性ヒトT細胞系JURKA
T(ATCC CRL 8163)を、プラスミドpZ
ipneo IL−6Rにより同時トランスフェクト
し、そして形質転換された細胞をスクリーニングして、
細胞当り約100,000個のIL−6Rを発現する細
胞系を得た。この細胞系をNJBC8と命名した。
識するがしかしNP−40で細胞溶解したJURKAT
を認識しない抗体を生産するハイブリドーマ細胞系をク
ローン化しそしてMT18と命名した。ハイブリドーマ
MT18は、工業技術院微生物工業技術研究所にブダペ
スト条約のもとに1990年7月10日に微工研条寄第
2999号(FERM BP−2999)として寄託さ
れた。
ハイブリドーマを作製するため、抗原として、ヒトIL
−6Rを次の様にして抽出した。3×109 個のヒト骨
髄腫細胞(IL−6R生産細胞)を1mlの1%ジギトニ
ン、10mMトリエタノールアミン緩衝液(pH7.4),
0.15M NaCl及び1mM PMSF(フェニルメ
チルスルホニルフルオリド;和光純薬)中で溶解した。
他方、参考例1において調製したハイブリドーマMT1
8により生産されたMT18抗体を、ブロムシアンで活
性化されたセファロース4B(Pharmacia)に
常法に従って結合させた。このMT18抗体結合セファ
ロース4Bを前記の細胞溶解物を混合することにより、
セファロース4B上のMT18抗体に前記可溶化したI
L−6Rを結合させた。セファロース4Bに非特異的に
結合した物質を洗浄除去し、そしてSepharose
4BにMT18抗体を介して結合したIL−6Rを免疫
原として使用した。
を1週間に1回4週間にわたり腹腔内に免疫感作した。
次に、この免疫感作されたマウスから脾臓細胞を得、そ
して常法に従ってポリエチレングリコールを用いて骨髄
腫細胞P3U1と融合せしめた。融合した細胞を次のよ
うにしてスクリーニングした。まず、培養上清及び0.
01mlのProteinGセファロース(Pharma
cia)を混合して上清中の免疫グロブリンをProt
einGセファロースに吸着せしめた。他方、 35S−メ
チオニンにより内部標識された1011個のU266細胞
を溶解し、そしてMT18結合セファロース4Bを用い
てIL−6Rをアフィニティ精製した。
−6Rを、免疫グロブリンが結合している上記のPro
teinGセファロースにより免疫沈降せしめ、そして
沈澱をSDS−PAGEにより分析した。その結果、I
L−6Rに特異的に結合する抗体を生産する1個のハイ
ブリドーマクローンを単離し、そしてPM1と命名し
た。ハイブリドーマPM1は工業技術院微生物工業技術
研究所にブダペスト条約のもとに1990年7月10日
に、微工研条寄第2998号(FERM BP−299
8)として寄託された。
0,AUK64−7及びAUK146−15の作製 免疫原として可溶性IL−6R(SR 344)を、Y
asukawa,K.らの、J.Biochem.10
8,673−676,1990、に記載されている方法
に従って調製した。すなわち、N−末端から345番目
のコドンが終止コドンにより置換されているIL−6R
をコードするcDNAを含有するプラスミドpECEd
hfr344をCHO(5E27)細胞にトランスフェ
クトし、そのトランスフェクトされた細胞を無血清培地
(SF−0培地、三光純薬)中で培養し、そして得られ
る上清をHF−Labl系(東ソー)により濃縮しそし
てBlue−5PWカラム及びPhenyl−5PWカ
ラムにより精製した。精製された可溶性IL−6RはS
DS−PAGEで単一バンドを示した。
本クレア)に、1回の免疫原量を10μg/マウスとし
てFreundの完全アジュバント(Bacto Ad
juvant Complete H37Ra,Dif
co)と共に皮下注射し、そしてそれぞれ最初の注射の
2週間及び3週間後に、Freundの不完全アジュバ
ント(Bacto Adjuvant Incompl
ete Freund,Difco)と共に同量の免疫
原を第二回及び第三回追加免疫として皮下注射した。最
終免疫感作(第四回注射)は第三回注射の1週間後に、
アジュバントを使わないで尾静脈内に行った。
し、希釈緩衝液により段階的に希釈し、そしてGold
smith,P.K.,Analytical Bio
chemisty,117,53−60,1981、に
記載されている方法に従ってELISA法により分析し
た。すなわち、SR344(0.1μg/ml)によりコ
ートされたプレートを1%BSAによりブロックし、そ
して前記の希釈された試料をそれに加えた。SR344
に結合したマウスIgGをヤギの抗−マウスIgG/ア
ルカリホスファターゼ(A/P)(ZYMED)及びア
ルカリホスファターゼ用基質(Sigma−104)を
用いて測定した。
した後、最終免疫感作から3日後に、5匹のBALB/
cマウスから脾臓細胞を得た。脾臓細胞及び骨髄細胞株
(P3U1)を25:1の比率で混合し、PEG150
0を用いて融合し、そして2000個のウエル中で0.
7〜1.1×106 細胞/ウエルの細胞濃度で培養し
た。ウエルからの上清を、SR344に結合するそれら
の能力について(R344認識アッセイと称する第一次
スクリーニング)、及びSR344とIL−6Rとの結
合を阻害するそれらの能力について(1L−6/s1L
6R結合阻害アッセイ(RBIA)による)スクリーニ
ングした。第一次スクリーニングが240個の陽性ウエ
ルをもたらし、そして第二次スクリーニングが36個の
陽性ウエルをもたらした。
して行った。ヤギの抗マウスIg(Cappel)(1
μg/ml)によりコートされたプレート(MaxiSo
rp,Nunc)を1%BSAによりブロックし、そし
て100μl/ウエルのハイブリドーマ培養上清をそれ
に添加し、次に室温にて1時間インキュベートした。プ
レートを洗浄した後、20ng/mlのSR344をウエ
ルに加え、そして室温にて1時間インキュベーションを
行った。上清に由来する固定化された抗体により捕捉さ
れたSR344の量を、ラビット抗SR344IgG
(#2,5μg/ml)、ヤギの抗ラビットIgG−アル
カリホスファターゼ(A/P)(1:3000,Tag
o)及び基質(1mg/ml,Sigma−104)の添
加、並びにそれに続く405−600nmでの吸光度の測
定により定量した。
T18抗体でコートしたプレートを100ng/mlのS
R344(100μl/ウエル)で満たし、そして室温
にて1時間インキュベーョンを行った。プレートを洗浄
した後、50μl/ウエルのハイブリドーマ培養上清及
び50μl/ウエルのビオチン−IL−6結合体(20
ng/ml)をそれぞれのウエルに同時に加え、そしてウ
エルを室温にて1時間インキュベートした。ストレプト
アビジン−A/P(1:7000,PIERCE)及び
対応する基質(Sigma−104)を添加し、405
−600nmでの吸光度を測定することにより、SR34
4に結合したビオチン−IL−6の量を測定した。
より陽性クローンを純化し、そしてSR344とIL−
6との結合を阻害する3個のハイブリドーマクローン、
すなわちAUK12−20,AUK146−15及びA
UK64−7;並びにSR344とIL−6との結合を
阻害しないハイブリドーマクローンAUK181−6を
得た。
ヒト抗体を提供し、この抗体においてはヒト抗体のV領
域のCDRがヒトIL−6Rに対するマウスモノクロー
ナル抗体のCDRにより置き換えられている。この再構
成ヒト抗体の大部分がヒト抗体に由来し、そしてCDR
は抗原性が低いから、本発明の再構成ヒト抗体はヒトに
対する抗原性が低く、そしてそれ故に療法用として期待
される。
有用な、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)プロモ
ーター/エンハンサー系を含んで成る発現ベクターを示
す。
メラ抗体AUK12−20の能力の確認のためのELI
SAの結果を示すグラフである。
合を阻害する本発明のキメラ抗体AUK12−20の能
力の確認のためのELISAの結果を示すグラフであ
る。
体PM1a及びPM1bの結合についてのELISAの
結果を示すグラフである。
合を阻害する本発明のキメラ抗体PM1a及びPM1b
の能力を試験するELISAの結果を示すグラフであ
る。
第一バージョン(バージョン「a」)の作製のダイアグ
ラムである。
第一バージョン(バージョン「a」)の作製のダイアグ
ラムである。
ロンゲーション・ファクター1α(HEF−1α)プロ
モーター/エンハンサーを含んで成る発現プラスミドH
EF−12h−gγ1の作製の過程を示す。
1αプロモーター/エンハンサー系を含んで成る発現プ
ラスミドHEF−12k−gkの作製の過程を示す。
のための欠陥SV40プロモーター/エンハンサー配列
に連結されたジヒドロフォレートレダクターゼ(dhf
r)及びHCMVプロモーター/エンハンサーを含んで
成る発現プラスミドDHFR−PMh−gγ1の作製の
過程を示す。
のための欠陥SV40−プロモーター/エンハンサー配
列に連結されたdhfr遺伝子及びEF1αプロモータ
ー/エンハンサーを含んで成る発現プラスミドDHFR
−ΔE−RVh−PM1−fの作製の過程を示す。
の再構成ヒトPM−1抗体L鎖V領域のバージョン
「a」及び「b」の能力を示すグラフである。
の再構成ヒトPM−1抗体H鎖V領域のバージョン
「f」+再構成ヒトPM−1抗体L鎖V領域バージョン
「a」の能力を示すグラフである。
合を阻害する再構成ヒトPM−1抗体H鎖V領域のバー
ジョン「f」+再構成ヒトPM−1抗体L鎖V領域バー
ジョン「a」の能力を示すグラフである。
めに有用な、ヒトEFI−αプロモーター/エンハンサ
ーを含んで成る発現プラスミドHEF−VL −gk及び
HEF−VH −gγ1を示す。
L鎖V領域バージョン「a」をコードするDNAの作製
の過程を示す。
ヒトAUK12−20抗体L鎖V領域の能力の確認のた
めのELISAの結果を示すグラフである。図中、標準
AUK12−20(キメラ)はキメラAUK12−20
抗体をCHO細胞により大量に製造して精製したものに
ついての結果を示す。
ヒトAUK12−20抗体(L鎖バージョン「a」+H
鎖バージョン「b」)の能力についてのELISAの結
果を示すグラフである。
ヒトAUK12−20抗体(L鎖バージョン「a」+H
鎖バージョン「d」)の能力についてのELISAの結
果を示すグラフである。
H鎖V領域の化学合成の過程を示す。
合を阻害する再構成ヒトAUK12−20抗体(L鎖バ
ージョン「a」+H鎖バージョン「a」)の能力につい
てのELISAの結果を示すグラフである。
合を阻害する再構成ヒトAUK12−20抗体(L鎖バ
ージョン「a」+H鎖バージョン「b」)の能力につい
てのELISAの結果を示すグラフである。
合を阻害する再構成ヒトAUK12−20抗体(L鎖バ
ージョン「a」+H鎖バージョン「c」)の能力につい
てのELISAの結果を示すグラフである。
合を阻害する再構成ヒトAUK12−20抗体(L鎖バ
ージョン「a」+H鎖バージョン「d」)の能力につい
てのELISAの結果を示すグラフである。
Claims (39)
- 【請求項1】 ヒトインターロイキン−6受容体(ヒト
IL−6R)に対するマウスモノクローナル抗体の軽鎖(L
鎖)可変領域(V領域)を含んで成る診断用試薬。 - 【請求項2】 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナ
ル抗体の重鎖(H鎖)V領域を含んで成る診断用試薬。 - 【請求項3】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトL鎖V領
域を含んで成る診断用試薬。 - 【請求項4】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトH鎖V領
域を含んで成る診断用試薬。 - 【請求項5】 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナ
ル抗体のL鎖V領域と他の蛋白質との融合蛋白質を含ん
で成る診断用試薬。 - 【請求項6】 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナ
ル抗体のH鎖V領域と他の蛋白質との融合蛋白質を含ん
で成る診断用試薬。 - 【請求項7】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトL鎖V領
域と他の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る診断用試
薬。 - 【請求項8】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトH鎖V領
域と他の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る診断用試
薬。 - 【請求項9】 ヒトIL−6Rに対するマウスL鎖V領域と
ヒトL鎖C領域とから成るキメラL鎖を含んで成る診断
用試薬。 - 【請求項10】 ヒトIL−6Rに対するマウスH鎖V領域
とヒトH鎖C領域とから成るキメラH鎖を含んで成る診
断用試薬。 - 【請求項11】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化L鎖を含
んで成る診断用試薬。 - 【請求項12】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化H鎖を含
んで成る診断用試薬。 - 【請求項13】 ヒトIL−6Rに対するマウスL鎖V領域
とヒトL鎖C領域とから成るキメラL鎖と他の蛋白質と
から成る融合蛋白質を含んで成る診断用試薬。 - 【請求項14】 ヒトIL−6Rに対するマウスH鎖V領域
とヒトH鎖C領域から成るキメラH鎖と他の蛋白質とか
ら成る融合蛋白質を含んで成る診断用試薬。 - 【請求項15】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化L鎖と他
の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る診断用試薬。 - 【請求項16】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化H鎖と他
の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る診断用試薬。 - 【請求項17】 ヒトIL−6Rに対するヒト−マウスキメ
ラ抗体を含んで成る診断用試薬。 - 【請求項18】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化抗体を含
んで成る診断用試薬。 - 【請求項19】 ヒトインターロイキン−6受容体(ヒ
トIL−6R)に対するマウスモノクローナル抗体の軽鎖
(L鎖)可変領域(V領域)を含んで成る医薬。 - 【請求項20】 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクロー
ナル抗体の重鎖(H鎖)V領域を含んで成る医薬。 - 【請求項21】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトL鎖V
領域を含んで成る医薬。 - 【請求項22】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトH鎖V
領域を含んで成る医薬。 - 【請求項23】 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクロー
ナル抗体のL鎖V領域と他の蛋白質との融合蛋白質を含
んで成る医薬。 - 【請求項24】 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクロー
ナル抗体のH鎖V領域と他の蛋白質との融合蛋白質を含
んで成る医薬。 - 【請求項25】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトL鎖V
領域と他の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る医薬。 - 【請求項26】 ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトH鎖V
領域と他の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る医薬。 - 【請求項27】 ヒトIL−6Rに対するマウスL鎖V領域
とヒトL鎖C領域とから成るキメラL鎖を含んで成る医
薬。 - 【請求項28】 ヒトIL−6Rに対するマウスH鎖V領域
とヒトH鎖C領域とから成るキメラH鎖を含んで成る医
薬。 - 【請求項29】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化L鎖を含
んで成る医薬。 - 【請求項30】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化H鎖を含
んで成る医薬。 - 【請求項31】 ヒトIL−6Rに対するマウスL鎖V領域
とヒトL鎖C領域とから成るキメラL鎖と他の蛋白質と
から成る融合蛋白質を含んで成る医薬。 - 【請求項32】 ヒトIL−6Rに対するマウスH鎖V領域
とヒトH鎖C領域から成るキメラH鎖と他の蛋白質とか
ら成る融合蛋白質を含んで成る医薬。 - 【請求項33】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化L鎖と他
の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る医薬。 - 【請求項34】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化H鎖と他
の蛋白質との融合蛋白質を含んで成る医薬。 - 【請求項35】 ヒトIL−6Rに対するヒト−マウスキメ
ラ抗体を含んで成る医薬。 - 【請求項36】 ヒトIL−6Rに対するヒト型化抗体を含
んで成る医薬。 - 【請求項37】 抗腫瘍剤である、請求項19〜36の
いずれか1項に記載の医薬。 - 【請求項38】 抗骨髄腫剤である請求項37に記載の
医薬。 - 【請求項39】 抗多発性骨髄腫剤である請求項38に
記載の医薬。
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