JPH07313188A - 免疫抑制剤 - Google Patents
免疫抑制剤Info
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- JPH07313188A JPH07313188A JP6082836A JP8283694A JPH07313188A JP H07313188 A JPH07313188 A JP H07313188A JP 6082836 A JP6082836 A JP 6082836A JP 8283694 A JP8283694 A JP 8283694A JP H07313188 A JPH07313188 A JP H07313188A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に特異的に結合
して、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−２応答を遮断
する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有
する免疫抑制剤、該ポリペプチドをコードする遺伝子、
該遺伝子を有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有す
る形質転換体、該形質転換体を培養して目的とするポリ
ペプチドを製造する方法を提供する。 【構成】 ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に特異的に結合
して、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−２応答を遮断
する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有
する免疫抑制剤、該ポリペプチドをコードする遺伝子、
該遺伝子を有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有す
る形質転換体、該形質転換体を培養して目的とするポリ
ペプチドを製造する方法。
して、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−２応答を遮断
する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有
する免疫抑制剤、該ポリペプチドをコードする遺伝子、
該遺伝子を有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有す
る形質転換体、該形質転換体を培養して目的とするポリ
ペプチドを製造する方法を提供する。 【構成】 ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に特異的に結合
して、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−２応答を遮断
する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有
する免疫抑制剤、該ポリペプチドをコードする遺伝子、
該遺伝子を有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有す
る形質転換体、該形質転換体を培養して目的とするポリ
ペプチドを製造する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトインターロイキン２
レセプターγ鎖に特異的に結合して、ヒトインターロイ
キン２レセプターγ鎖とインターロイキン２レセプター
β鎖との結合を選択的に阻害し、インターロイキン２応
答を遮断する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチ
ドを含有する免疫抑制剤、該ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、該遺伝子を有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮ
Ａを有する形質転換体、該形質転換体を培養して目的と
するポリペプチドを製造する方法に関する。本ポリペプ
チドは、単独、あるいはインターロイキン２のインター
ロイキン２レセプターへの結合を阻害する物質と併用す
ることにより、インターロイキン２の関与が示唆されて
いる臓器移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性疾患や
自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬として有効な薬
剤として利用し得る有用な物質である。以下、「インタ
ーロイキン２」を単に「ＩＬ−２」と称することがあ
る。
レセプターγ鎖に特異的に結合して、ヒトインターロイ
キン２レセプターγ鎖とインターロイキン２レセプター
β鎖との結合を選択的に阻害し、インターロイキン２応
答を遮断する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチ
ドを含有する免疫抑制剤、該ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、該遺伝子を有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮ
Ａを有する形質転換体、該形質転換体を培養して目的と
するポリペプチドを製造する方法に関する。本ポリペプ
チドは、単独、あるいはインターロイキン２のインター
ロイキン２レセプターへの結合を阻害する物質と併用す
ることにより、インターロイキン２の関与が示唆されて
いる臓器移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性疾患や
自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬として有効な薬
剤として利用し得る有用な物質である。以下、「インタ
ーロイキン２」を単に「ＩＬ−２」と称することがあ
る。
【０００２】
【従来の技術】臓器移植の外科的技術が著しく向上した
現在、臓器移植手術の成否は術後の移植片拒絶反応をい
かにして抑制できるかにポイントが絞られてきている。
拒絶反応は、生体が移植片を異物として認識し、それを
排除するために一連の免疫反応が惹起されることにより
生じる。そこで、従来より拒絶防止薬として、ステロイ
ド剤、アザチオプリン、メトトレキセート、６−メルカ
プトプリンなどのいわゆる免疫抑制剤と呼ばれている薬
剤の投与が行われてきた。しかし、安全域が狭いこと、
あるいは効果が弱いことなどの理由で生着率の著しい向
上はみられなかった。ところが、近年開発されたサイク
ロスポリンＡの登場により、生着率には格段の向上がみ
られるようになった。しかしながら、サイクロスポリン
Ａには重篤な腎毒性があることが明らかとなり、その使
用の制限を与儀なくされてきている。したがって、より
安全で、かつ効果的な免疫抑制剤の開発が望まれてきて
いる。
現在、臓器移植手術の成否は術後の移植片拒絶反応をい
かにして抑制できるかにポイントが絞られてきている。
拒絶反応は、生体が移植片を異物として認識し、それを
排除するために一連の免疫反応が惹起されることにより
生じる。そこで、従来より拒絶防止薬として、ステロイ
ド剤、アザチオプリン、メトトレキセート、６−メルカ
プトプリンなどのいわゆる免疫抑制剤と呼ばれている薬
剤の投与が行われてきた。しかし、安全域が狭いこと、
あるいは効果が弱いことなどの理由で生着率の著しい向
上はみられなかった。ところが、近年開発されたサイク
ロスポリンＡの登場により、生着率には格段の向上がみ
られるようになった。しかしながら、サイクロスポリン
Ａには重篤な腎毒性があることが明らかとなり、その使
用の制限を与儀なくされてきている。したがって、より
安全で、かつ効果的な免疫抑制剤の開発が望まれてきて
いる。
【０００３】さて、ＩＬ−２は、ヘルパーＴ細胞から産
生されるタンパク質であり、生体内においてキラーＴ細
胞の増殖や分化誘導、Ｂ細胞の分化誘導など、広汎な働
きを有している生体防御上非常に重要な因子である。臓
器移植や骨髄移植においては、移植片の生着の鍵を握る
と考えられている宿主対移植片反応（ＨＶＧ反応）、あ
るいは移植片対宿主反応（ＧＶＨ反応）に、ＩＬ−２な
どにより活性化されたキラーＴ細胞が深く関与している
ことが示されている。他方、自己免疫疾患は生体内での
免疫系のバランスがくずれ、生体自身を攻撃することに
より発症すると考えられており、その中でも特にＩＬ−
２をはじめとする免疫系に関与する因子の過剰産生、あ
るいはそれに対する過剰反応などがその大きな一因とな
っている可能性が高い。
生されるタンパク質であり、生体内においてキラーＴ細
胞の増殖や分化誘導、Ｂ細胞の分化誘導など、広汎な働
きを有している生体防御上非常に重要な因子である。臓
器移植や骨髄移植においては、移植片の生着の鍵を握る
と考えられている宿主対移植片反応（ＨＶＧ反応）、あ
るいは移植片対宿主反応（ＧＶＨ反応）に、ＩＬ−２な
どにより活性化されたキラーＴ細胞が深く関与している
ことが示されている。他方、自己免疫疾患は生体内での
免疫系のバランスがくずれ、生体自身を攻撃することに
より発症すると考えられており、その中でも特にＩＬ−
２をはじめとする免疫系に関与する因子の過剰産生、あ
るいはそれに対する過剰反応などがその大きな一因とな
っている可能性が高い。
【０００４】これらのことから、ＩＬ−２応答を選択的
かつ効果的に抑制することができれば、臓器移植時の拒
絶反応の予防や、自己免疫疾患の治療が可能となるもの
と考えられるようになった。事実、ＩＬ−２と細胞毒を
融合させて、ＩＬ−２を結合する受容体（ＩＬ−２レセ
プター）を有しているＩＬ−２応答細胞を選択的に傷害
することができるポリペプチドを調製し、これを自己免
疫疾患の動物モデルの一つであるアジュバント関節炎ラ
ットに投与すると関節炎の発症が遅れ症状も軽くなり、
またマウス同種心臓移植時に投与すると移植心の拒絶が
抑制されるという報告もある（ Proc. Natl.Acad.Sci.U
SA、８６巻、１００８頁、1989年）。しかし、ＩＬ−２
と細胞毒を融合させて得られるポリペプチドはその血中
半減期が短く、効果をあげるためには大量に投与する必
要があり、それに伴う副作用が懸念される。そこで、よ
り安全でかつ有効なＩＬ−２応答を抑制できる薬剤の開
発が望まれている。
かつ効果的に抑制することができれば、臓器移植時の拒
絶反応の予防や、自己免疫疾患の治療が可能となるもの
と考えられるようになった。事実、ＩＬ−２と細胞毒を
融合させて、ＩＬ−２を結合する受容体（ＩＬ−２レセ
プター）を有しているＩＬ−２応答細胞を選択的に傷害
することができるポリペプチドを調製し、これを自己免
疫疾患の動物モデルの一つであるアジュバント関節炎ラ
ットに投与すると関節炎の発症が遅れ症状も軽くなり、
またマウス同種心臓移植時に投与すると移植心の拒絶が
抑制されるという報告もある（ Proc. Natl.Acad.Sci.U
SA、８６巻、１００８頁、1989年）。しかし、ＩＬ−２
と細胞毒を融合させて得られるポリペプチドはその血中
半減期が短く、効果をあげるためには大量に投与する必
要があり、それに伴う副作用が懸念される。そこで、よ
り安全でかつ有効なＩＬ−２応答を抑制できる薬剤の開
発が望まれている。
【０００５】従来より、ＩＬ−２応答細胞上のＩＬ−２
レセプターは、分子量が約５５ｋｄのα鎖と約７５ｋｄ
のβ鎖の２つの糖蛋白質分子からなることが知られてお
り、それぞれの分子とＩＬ−２との結合の解離定数は、
α鎖の場合１０-8Ｍ、β鎖の場合１０-9Ｍであるが、α
鎖とβ鎖の両方の分子が接してＩＬ−２との三者の会合
体が形成された場合には、解離定数が１０-12Ｍという
高親和性の結合となることものと考えられていた。しか
し、マウスの非リンパ球系の細胞にヒトβ鎖ｃＤＮＡを
単独に導入してもＩＬ−２の結合は起こらず、また、ヒ
トα鎖とヒトβ鎖のｃＤＮＡを同時に導入しても、中程
度のＩＬ−２の結合は起こるが、高親和性の結合は起こ
らないことが明らかとなり（Science、２４４巻、５５
１頁、１９８９年）、ＩＬ−２の結合を規定するα鎖、
β鎖以外の第三の分子の存在が示唆されるようになっ
た。そして、本発明者らによって、第三のＩＬ−２レセ
プターの構成分子である６４ｋｄの糖蛋白質分子（以
下、ＩＬ−２レセプターγ鎖と称する）をコードする遺
伝子がクローニングされることにより（特願平４−１０
４９４７・Science、２５７巻、３７９頁、１９９２
年）、ＩＬ−２／ＩＬ−２レセプターシステムが完全に
解明された。
レセプターは、分子量が約５５ｋｄのα鎖と約７５ｋｄ
のβ鎖の２つの糖蛋白質分子からなることが知られてお
り、それぞれの分子とＩＬ−２との結合の解離定数は、
α鎖の場合１０-8Ｍ、β鎖の場合１０-9Ｍであるが、α
鎖とβ鎖の両方の分子が接してＩＬ−２との三者の会合
体が形成された場合には、解離定数が１０-12Ｍという
高親和性の結合となることものと考えられていた。しか
し、マウスの非リンパ球系の細胞にヒトβ鎖ｃＤＮＡを
単独に導入してもＩＬ−２の結合は起こらず、また、ヒ
トα鎖とヒトβ鎖のｃＤＮＡを同時に導入しても、中程
度のＩＬ−２の結合は起こるが、高親和性の結合は起こ
らないことが明らかとなり（Science、２４４巻、５５
１頁、１９８９年）、ＩＬ−２の結合を規定するα鎖、
β鎖以外の第三の分子の存在が示唆されるようになっ
た。そして、本発明者らによって、第三のＩＬ−２レセ
プターの構成分子である６４ｋｄの糖蛋白質分子（以
下、ＩＬ−２レセプターγ鎖と称する）をコードする遺
伝子がクローニングされることにより（特願平４−１０
４９４７・Science、２５７巻、３７９頁、１９９２
年）、ＩＬ−２／ＩＬ−２レセプターシステムが完全に
解明された。
【０００６】すなわち、マウスの非リンパ球系の細胞に
ヒトβ鎖とヒトγ鎖のｃＤＮＡを同時に導入しＩＬ−２
の結合を解析すると、当初β鎖単独で生じると考えられ
ていた中親和性の結合が観察されるようになり、また、
ヒトα鎖、ヒトβ鎖、及びヒトγ鎖のｃＤＮＡを同時に
導入すると、当初α鎖とβ鎖により生じると考えられて
いた高親和性のＩＬ−２の結合が起こることが明らかと
なった。更に、ＩＬ−２のシグナル伝達のトリガーと考
えられているＩＬ−２とＩＬ−２レセプター複合体の細
胞内への取り込み反応は、β鎖単独、あるいはα鎖とβ
鎖の両者の発現細胞においては生じないが、それらの細
胞にγ鎖を発現させることにより生じることが示され
た。従って、本発明者らが世界で初めて見いだすことに
成功したＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、単にＩＬ−２
の結合を規定している分子ではなく、ＩＬ−２のシグナ
ル伝達機構に必須の分子であることが明らかとなった。
ヒトβ鎖とヒトγ鎖のｃＤＮＡを同時に導入しＩＬ−２
の結合を解析すると、当初β鎖単独で生じると考えられ
ていた中親和性の結合が観察されるようになり、また、
ヒトα鎖、ヒトβ鎖、及びヒトγ鎖のｃＤＮＡを同時に
導入すると、当初α鎖とβ鎖により生じると考えられて
いた高親和性のＩＬ−２の結合が起こることが明らかと
なった。更に、ＩＬ−２のシグナル伝達のトリガーと考
えられているＩＬ−２とＩＬ−２レセプター複合体の細
胞内への取り込み反応は、β鎖単独、あるいはα鎖とβ
鎖の両者の発現細胞においては生じないが、それらの細
胞にγ鎖を発現させることにより生じることが示され
た。従って、本発明者らが世界で初めて見いだすことに
成功したＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、単にＩＬ−２
の結合を規定している分子ではなく、ＩＬ−２のシグナ
ル伝達機構に必須の分子であることが明らかとなった。
【０００７】ＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、ＩＬ−２
存在下でＩＬ−２レセプターβ鎖の細胞外領域に結合す
ることが知られている（Science、２５７巻、３７９
頁、１９９２年）。従って、β鎖とγ鎖との結合を妨げ
ると、β鎖単独の場合にはＩＬ−２結合そのものが生じ
ず、α鎖とβ鎖の両者に対しては中程度の結合が生じる
ものの、ＩＬ−２シグナル伝達が遮断されるものと考え
られる。すなわち、ＩＬ−２応答細胞上のＩＬ−２レセ
プターβ鎖とＩＬ−２レセプターγ鎖との結合を阻害す
ることができれば、ＩＬ−２のシグナル伝達が完全に遮
断されてＩＬ−２に対して不応答性となり、ＩＬ−２が
関与していると考えられる臓器移植時の拒絶反応や、自
己免疫疾患等の治療が可能となる。しかし、現在までＩ
Ｌ−２レセプターβ鎖とＩＬ−２レセプターγ鎖との結
合阻害する活性を有する物質は全く知られていない。
存在下でＩＬ−２レセプターβ鎖の細胞外領域に結合す
ることが知られている（Science、２５７巻、３７９
頁、１９９２年）。従って、β鎖とγ鎖との結合を妨げ
ると、β鎖単独の場合にはＩＬ−２結合そのものが生じ
ず、α鎖とβ鎖の両者に対しては中程度の結合が生じる
ものの、ＩＬ−２シグナル伝達が遮断されるものと考え
られる。すなわち、ＩＬ−２応答細胞上のＩＬ−２レセ
プターβ鎖とＩＬ−２レセプターγ鎖との結合を阻害す
ることができれば、ＩＬ−２のシグナル伝達が完全に遮
断されてＩＬ−２に対して不応答性となり、ＩＬ−２が
関与していると考えられる臓器移植時の拒絶反応や、自
己免疫疾患等の治療が可能となる。しかし、現在までＩ
Ｌ−２レセプターβ鎖とＩＬ−２レセプターγ鎖との結
合阻害する活性を有する物質は全く知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
はヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に特異的に結合して、ヒ
トＩＬ−２レセプターγ鎖とＩＬ−２レセプターβ鎖と
の結合を選択的に阻害し、ＩＬ−２応答を遮断する活性
を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有する免疫
抑制剤、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡ
を有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有する形質転
換体、該形質転換体を培養して目的とするポリペプチド
を製造する方法を提供することである。本ポリペプチド
は、単独、あるいはＩＬ−２とＩＬ−２レセプターとの
結合を阻害する物質と併用することにより、ＩＬ−２の
関与が示唆されている臓器移植時の拒絶反応の予防、ア
レルギー性疾患または自己免疫疾患などの炎症性疾患の
治療薬として有効な薬剤として利用し得る。
はヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に特異的に結合して、ヒ
トＩＬ−２レセプターγ鎖とＩＬ−２レセプターβ鎖と
の結合を選択的に阻害し、ＩＬ−２応答を遮断する活性
を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有する免疫
抑制剤、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡ
を有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有する形質転
換体、該形質転換体を培養して目的とするポリペプチド
を製造する方法を提供することである。本ポリペプチド
は、単独、あるいはＩＬ−２とＩＬ−２レセプターとの
結合を阻害する物質と併用することにより、ＩＬ−２の
関与が示唆されている臓器移植時の拒絶反応の予防、ア
レルギー性疾患または自己免疫疾患などの炎症性疾患の
治療薬として有効な薬剤として利用し得る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、後述の方法によ
り、目的とするヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に特異的に
結合して、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とヒトＩＬ−２
レセプターβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−２応
答を遮断する活性を有するポリペプチドを見いだし、本
発明を完成した。すなわち、本発明はヒトＩＬ−２レセ
プターγ鎖に特異的に結合して、ヒトＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖とヒトＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を選択的
に阻害し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するポリペ
プチド、該ポリペプチドを含有する免疫抑制剤、該ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換え
ＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有する形質転換体、該形質転
換体を培養して目的とするポリペプチドを製造する方法
を提供するものである。詳細には本発明は以下の通りで
ある。 （発明１）ヒトインターロイキン２レセプターγ鎖に特
異的に結合し、ヒトインターロイキン２の応答を遮断す
る活性を有するポリペプチド。 （発明２）ポリペプチドが、マウスモノクローナル抗体
である発明１記載のポリペプチド。 （発明３）モノクローナル抗体を産生する細胞が、ＧＰ
−２又はＧＰ−４である発明２記載のモノクローナル抗
体。 （発明４）モノクローナル抗体を産生する細胞が、ＴＵ
Ｇｈ４、ＴＵＧｈ５又はＡＧ１４である発明２記載のモ
ノクローナル抗体。 （発明５）ポリペプチドが、モノクローナル抗体の可変
領域のみを含んでなる発明１記載のポリペプチド。 （発明６）ポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸
配列を有するポリペプチドである発明５記載のポリペプ
チド。 （発明７）ポリペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸
配列を有するポリペプチドである発明５記載のポリペプ
チド。 （発明８）ポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸
配列のＮ末端Ｍｅｔが除かれたポリペプチドである発明
５記載のポリペプチド。 （発明９）ポリペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸
配列のＮ末端Ｍｅｔが除かれたポリペプチドである発明
５記載のポリペプチド。 （発明１０）ポリペプチドが、（１）配列番号１記載の
アミノ酸配列の一部を削除、（２）配列番号１記載のア
ミノ酸配列の一部を他のアミノ酸配列に置換、（３）配
列番号１記載のアミノ酸配列にアミノ酸残基もしくはペ
プチドを付加、または（４）配列番号１記載のアミノ酸
配列の一部をアセチル化、アミド化、もしくはポリエチ
レングリコール付加したものである発明５記載のポリペ
プチド。 （発明１１）ポリペプチドが、（１）配列番号２記載の
アミノ酸配列の一部を削除、（２）配列番号２記載のア
ミノ酸配列の一部を他のアミノ酸配列に置換、（３）配
列番号２記載のアミノ酸配列にアミノ酸残基もしくはペ
プチドを付加、または（４）配列番号２記載のアミノ酸
配列の一部をアセチル化、アミド化、もしくはポリエチ
レングリコール付加したものである発明５記載のポリペ
プチド。 （発明１２）ポリペプチドが、マウスモノクローナル抗
体の定常領域をヒト抗体の定常領域へと変換した発明１
記載のポリペプチド。 （発明１３）ポリペプチドが、マウスモノクローナル抗
体の定常領域、及び可変領域の枠組み配列を、各々ヒト
抗体の定常領域と枠組み配列へと変換した発明１記載の
ポリペプチド。 （発明１４）発明１ないし１３記載のポリペプチドを含
有してなる免疫抑制剤。 （発明１５）発明１ないし１３記載のポリペプチドと、
抗ヒトインターロイキン２レセプターα鎖抗体、及び／
又は抗ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖抗体とを
含有してなる発明１４記載の免疫抑制剤。 （発明１６）発明１ないし１３記載のポリペプチドと、
抗ヒトインターロイキン２レセプターα鎖抗体の可変領
域を含むポリペプチド、該ポリペプチドの一部を削除し
たポリペプチド、該ポリペプチドの一部を他のアミノ酸
に置換したポリペプチド、もしくは該ポリペプチドの一
部に他のアミノ酸残基、ポリペプチドあるいは他の物質
を付加したポリペプチド、及び／又は抗ヒトインターロ
イキン２レセプターβ鎖抗体の可変領域を含むポリペプ
チド、該ポリペプチドの一部を削除したポリペプチド、
該ポリペプチドの一部を他のアミノ酸に置換したポリペ
プチド、もしくは該ポリペプチドの一部に他のアミノ酸
残基、ポリペプチドあるいは他の物質を付加したポリペ
プチドとを含有してなる発明１４記載の免疫抑制剤。 （発明１７）発明１ないし１３記載のポリペプチドと、
ヒト定常領域を有する抗ヒトインターロイキン２レセプ
ターα鎖抗体、及び／又はヒト定常領域を有する抗ヒト
インターロイキン２レセプターβ鎖抗体とを含有してな
る発明１４記載の免疫抑制剤。 （発明１８）発明１ないし１３記載のポリペプチドと、
ヒト定常領域及びヒト可変領域の枠組み配列を有する抗
ヒトインターロイキン２レセプターα鎖抗体、及び／又
はヒト定常領域及びヒト可変領域の枠組み配列を有する
抗ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖抗体とを含有
してなる発明１４記載の免疫抑制剤。 （発明１９）発明１ないし１３記載のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ。 （発明２０）ＤＮＡが配列番号１記載の塩基配列を有す
る発明１９記載のＤＮＡ。 （発明２１）ＤＮＡが配列番号２記載の塩基配列を有す
る発明１９記載のＤＮＡ。 （発明２２）発明１９ないし２１記載のＤＮＡを有する
組換えＤＮＡ。 （発明２３）発明２２記載の組換えＤＮＡを有する形質
転換体。 （発明２４）形質転換体が大腸菌、または真核細胞であ
る発明２３記載の形質転換体。 （発明２５）発明２３または２４記載の形質転換体を培
養することにより、発明１ないし１３記載のポリペプチ
ドを生産させ、該ポリペプチドを取得することを特徴と
する該ポリペプチドの製造方法。
解決するために鋭意研究を重ねた結果、後述の方法によ
り、目的とするヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に特異的に
結合して、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とヒトＩＬ−２
レセプターβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−２応
答を遮断する活性を有するポリペプチドを見いだし、本
発明を完成した。すなわち、本発明はヒトＩＬ−２レセ
プターγ鎖に特異的に結合して、ヒトＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖とヒトＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を選択的
に阻害し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するポリペ
プチド、該ポリペプチドを含有する免疫抑制剤、該ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換え
ＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有する形質転換体、該形質転
換体を培養して目的とするポリペプチドを製造する方法
を提供するものである。詳細には本発明は以下の通りで
ある。 （発明１）ヒトインターロイキン２レセプターγ鎖に特
異的に結合し、ヒトインターロイキン２の応答を遮断す
る活性を有するポリペプチド。 （発明２）ポリペプチドが、マウスモノクローナル抗体
である発明１記載のポリペプチド。 （発明３）モノクローナル抗体を産生する細胞が、ＧＰ
−２又はＧＰ−４である発明２記載のモノクローナル抗
体。 （発明４）モノクローナル抗体を産生する細胞が、ＴＵ
Ｇｈ４、ＴＵＧｈ５又はＡＧ１４である発明２記載のモ
ノクローナル抗体。 （発明５）ポリペプチドが、モノクローナル抗体の可変
領域のみを含んでなる発明１記載のポリペプチド。 （発明６）ポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸
配列を有するポリペプチドである発明５記載のポリペプ
チド。 （発明７）ポリペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸
配列を有するポリペプチドである発明５記載のポリペプ
チド。 （発明８）ポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸
配列のＮ末端Ｍｅｔが除かれたポリペプチドである発明
５記載のポリペプチド。 （発明９）ポリペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸
配列のＮ末端Ｍｅｔが除かれたポリペプチドである発明
５記載のポリペプチド。 （発明１０）ポリペプチドが、（１）配列番号１記載の
アミノ酸配列の一部を削除、（２）配列番号１記載のア
ミノ酸配列の一部を他のアミノ酸配列に置換、（３）配
列番号１記載のアミノ酸配列にアミノ酸残基もしくはペ
プチドを付加、または（４）配列番号１記載のアミノ酸
配列の一部をアセチル化、アミド化、もしくはポリエチ
レングリコール付加したものである発明５記載のポリペ
プチド。 （発明１１）ポリペプチドが、（１）配列番号２記載の
アミノ酸配列の一部を削除、（２）配列番号２記載のア
ミノ酸配列の一部を他のアミノ酸配列に置換、（３）配
列番号２記載のアミノ酸配列にアミノ酸残基もしくはペ
プチドを付加、または（４）配列番号２記載のアミノ酸
配列の一部をアセチル化、アミド化、もしくはポリエチ
レングリコール付加したものである発明５記載のポリペ
プチド。 （発明１２）ポリペプチドが、マウスモノクローナル抗
体の定常領域をヒト抗体の定常領域へと変換した発明１
記載のポリペプチド。 （発明１３）ポリペプチドが、マウスモノクローナル抗
体の定常領域、及び可変領域の枠組み配列を、各々ヒト
抗体の定常領域と枠組み配列へと変換した発明１記載の
ポリペプチド。 （発明１４）発明１ないし１３記載のポリペプチドを含
有してなる免疫抑制剤。 （発明１５）発明１ないし１３記載のポリペプチドと、
抗ヒトインターロイキン２レセプターα鎖抗体、及び／
又は抗ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖抗体とを
含有してなる発明１４記載の免疫抑制剤。 （発明１６）発明１ないし１３記載のポリペプチドと、
抗ヒトインターロイキン２レセプターα鎖抗体の可変領
域を含むポリペプチド、該ポリペプチドの一部を削除し
たポリペプチド、該ポリペプチドの一部を他のアミノ酸
に置換したポリペプチド、もしくは該ポリペプチドの一
部に他のアミノ酸残基、ポリペプチドあるいは他の物質
を付加したポリペプチド、及び／又は抗ヒトインターロ
イキン２レセプターβ鎖抗体の可変領域を含むポリペプ
チド、該ポリペプチドの一部を削除したポリペプチド、
該ポリペプチドの一部を他のアミノ酸に置換したポリペ
プチド、もしくは該ポリペプチドの一部に他のアミノ酸
残基、ポリペプチドあるいは他の物質を付加したポリペ
プチドとを含有してなる発明１４記載の免疫抑制剤。 （発明１７）発明１ないし１３記載のポリペプチドと、
ヒト定常領域を有する抗ヒトインターロイキン２レセプ
ターα鎖抗体、及び／又はヒト定常領域を有する抗ヒト
インターロイキン２レセプターβ鎖抗体とを含有してな
る発明１４記載の免疫抑制剤。 （発明１８）発明１ないし１３記載のポリペプチドと、
ヒト定常領域及びヒト可変領域の枠組み配列を有する抗
ヒトインターロイキン２レセプターα鎖抗体、及び／又
はヒト定常領域及びヒト可変領域の枠組み配列を有する
抗ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖抗体とを含有
してなる発明１４記載の免疫抑制剤。 （発明１９）発明１ないし１３記載のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ。 （発明２０）ＤＮＡが配列番号１記載の塩基配列を有す
る発明１９記載のＤＮＡ。 （発明２１）ＤＮＡが配列番号２記載の塩基配列を有す
る発明１９記載のＤＮＡ。 （発明２２）発明１９ないし２１記載のＤＮＡを有する
組換えＤＮＡ。 （発明２３）発明２２記載の組換えＤＮＡを有する形質
転換体。 （発明２４）形質転換体が大腸菌、または真核細胞であ
る発明２３記載の形質転換体。 （発明２５）発明２３または２４記載の形質転換体を培
養することにより、発明１ないし１３記載のポリペプチ
ドを生産させ、該ポリペプチドを取得することを特徴と
する該ポリペプチドの製造方法。
【００１０】本発明に従えば、ヒトＩＬ−２レセプター
γ鎖に結合し、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とヒトＩＬ
−２レセプターβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−
２応答を遮断する活性を有するポリペプチドが提供され
る。
γ鎖に結合し、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とヒトＩＬ
−２レセプターβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−
２応答を遮断する活性を有するポリペプチドが提供され
る。
【００１１】本研究者らはまずヒトＩＬ−２レセプター
γ鎖に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマを多数作成し、その中からヒトＩ
Ｌ−２応答を阻害する活性を有するマウスモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択した。
以下にマウス抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの調製法を
記す。
γ鎖に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマを多数作成し、その中からヒトＩ
Ｌ−２応答を阻害する活性を有するマウスモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択した。
以下にマウス抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの調製法を
記す。
【００１２】ハイブリドーマは骨髄腫細胞と抗体産生細
胞を融合することにより製造される。抗体産生細胞とし
ては、リコンビナントヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子
で免疫されたマウスやラットなどの動物からの脾臓また
はリンパ節細胞を用いればよい。なお、免疫する物質と
しては、リコンビナントヒトＩＬ−２レセプター分子の
場合、単独、あるいは他の蛋白質との融合分子、分子の
一部のポリペプチド等を用いても差し支えない。その場
合、リコンビナントヒトＩＬ−２レセプター分子のう
ち、細胞外領域のみからなる分子を用いると特に効率的
である。また、リコンビナントヒトＩＬ−２レセプター
γ鎖分子の代わりに、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子
を発現しているヒト細胞、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖
分子をコードする遺伝子が導入され、該γ鎖分子を生合
成するに至ったマウス細胞等を用いても構わない。ま
た、それらの細胞より精製したγ鎖分子そのものを免疫
原として用いてもさしつかえない。
胞を融合することにより製造される。抗体産生細胞とし
ては、リコンビナントヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子
で免疫されたマウスやラットなどの動物からの脾臓また
はリンパ節細胞を用いればよい。なお、免疫する物質と
しては、リコンビナントヒトＩＬ−２レセプター分子の
場合、単独、あるいは他の蛋白質との融合分子、分子の
一部のポリペプチド等を用いても差し支えない。その場
合、リコンビナントヒトＩＬ−２レセプター分子のう
ち、細胞外領域のみからなる分子を用いると特に効率的
である。また、リコンビナントヒトＩＬ−２レセプター
γ鎖分子の代わりに、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子
を発現しているヒト細胞、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖
分子をコードする遺伝子が導入され、該γ鎖分子を生合
成するに至ったマウス細胞等を用いても構わない。ま
た、それらの細胞より精製したγ鎖分子そのものを免疫
原として用いてもさしつかえない。
【００１３】抗体産生細胞と骨髄腫細胞の由来する動物
の種は、両細胞が融合可能な限り異なってもよいが、通
常同一種の細胞を用いた方が良い結果が得られる。本発
明実施のための一つの好ましいハイブリドーマは、ヒト
リコンビナントＩＬ−２レセプターγ鎖分子の細胞外領
域のみからなるポリペプチドで免疫したマウスの脾臓細
胞または同リンパ節細胞と、マウス骨髄腫細胞との間の
ハイブリドーマである。例えば、生理食塩水に懸濁した
ヒトリコンビナントＩＬ−２レセプターγ鎖分子の細胞
外領域のみからなるポリペプチドで免疫したBalb/cマウ
スの脾臓細胞とBalb/cマウスの骨髄腫細胞SP2/0-Ag14の
間のハイブリドーマであり、後述の実施例で示されるよ
うに優れた結果が得られる。ヒトリコンビナントＩＬ−
２レセプターγ鎖分子の細胞外領域のみからなるポリペ
プチドは、同分子をコードする遺伝子を含む発現プラス
ミドベクターを有する形質転換体を培養することにより
得られる。形質転換体としては大腸菌等の原核細胞、Ｃ
ＨＯ細胞等の真核細胞などいずれを用いても構わない。
の種は、両細胞が融合可能な限り異なってもよいが、通
常同一種の細胞を用いた方が良い結果が得られる。本発
明実施のための一つの好ましいハイブリドーマは、ヒト
リコンビナントＩＬ−２レセプターγ鎖分子の細胞外領
域のみからなるポリペプチドで免疫したマウスの脾臓細
胞または同リンパ節細胞と、マウス骨髄腫細胞との間の
ハイブリドーマである。例えば、生理食塩水に懸濁した
ヒトリコンビナントＩＬ−２レセプターγ鎖分子の細胞
外領域のみからなるポリペプチドで免疫したBalb/cマウ
スの脾臓細胞とBalb/cマウスの骨髄腫細胞SP2/0-Ag14の
間のハイブリドーマであり、後述の実施例で示されるよ
うに優れた結果が得られる。ヒトリコンビナントＩＬ−
２レセプターγ鎖分子の細胞外領域のみからなるポリペ
プチドは、同分子をコードする遺伝子を含む発現プラス
ミドベクターを有する形質転換体を培養することにより
得られる。形質転換体としては大腸菌等の原核細胞、Ｃ
ＨＯ細胞等の真核細胞などいずれを用いても構わない。
【００１４】骨髄腫細胞としては、SP2/0-Ag14のほか
に、X63-Ag8-6.5.3, P3-X63-Ag8-U1,P3-X63-Ag8, P3-NS
I/1-Ag4-1, MPC11-4.5.6.TG.1.7, （以上マウス細
胞）、210.RCY.Ag1.2.3 （ラット細胞）、SK0-007,GH15
006TG-A12 （以上ヒト細胞）等の８アザグアニン耐性の
細胞株を用いてもよい。ハイブリドーマの作成と、更に
その中からＩＬ−２レセプターのγ鎖分子に結合し、Ｉ
Ｌ−２応答を遮断する活性を有するモノクローナル抗体
を産生しているハイブリドーマクローンの選択は、例え
ば次の様にして行える。ポリエチレングリコール、ある
いはセンダイウイルスなどを用いて抗体産生細胞と骨髄
腫細胞とを融合させる。融合したハイブリドーマのみ
が、ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む
培地（ＨＡＴ培地）中で生育することができる。得られ
たハイブリドーマがすべて抗体を産生しているわけでは
ないし、抗体を産生しているハイブリドーマがすべて目
的とする抗体を産生しているわけではないので、それら
のハイブリドーマクローンの中からＩＬ−２レセプター
のγ鎖分子に結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有
しているモノクローナル抗体を産生しているハイブリド
ーマクローンを選択しなければならない。
に、X63-Ag8-6.5.3, P3-X63-Ag8-U1,P3-X63-Ag8, P3-NS
I/1-Ag4-1, MPC11-4.5.6.TG.1.7, （以上マウス細
胞）、210.RCY.Ag1.2.3 （ラット細胞）、SK0-007,GH15
006TG-A12 （以上ヒト細胞）等の８アザグアニン耐性の
細胞株を用いてもよい。ハイブリドーマの作成と、更に
その中からＩＬ−２レセプターのγ鎖分子に結合し、Ｉ
Ｌ−２応答を遮断する活性を有するモノクローナル抗体
を産生しているハイブリドーマクローンの選択は、例え
ば次の様にして行える。ポリエチレングリコール、ある
いはセンダイウイルスなどを用いて抗体産生細胞と骨髄
腫細胞とを融合させる。融合したハイブリドーマのみ
が、ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む
培地（ＨＡＴ培地）中で生育することができる。得られ
たハイブリドーマがすべて抗体を産生しているわけでは
ないし、抗体を産生しているハイブリドーマがすべて目
的とする抗体を産生しているわけではないので、それら
のハイブリドーマクローンの中からＩＬ−２レセプター
のγ鎖分子に結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有
しているモノクローナル抗体を産生しているハイブリド
ーマクローンを選択しなければならない。
【００１５】その選択は例えば以下の様な方法を用いて
行うことができる。すなわち、ハイブリドーマ培養上清
中に産生されている抗体の、ヒトＩＬ−２レセプターγ
鎖分子をコードする遺伝子が導入され、該ペプチドを発
現しているマウスＬ９２９細胞（以下Ｌγ細胞と称す
る）への結合と、ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子をコ
ードする遺伝子が導入され、該ペプチドを発現している
マウスＬ９２９細胞（以下、Ｌβ細胞と称する）への結
合を測定し、前者に対して結合量が高く、後者に対して
結合量の低いものを選択する。そのような抗体を産生し
ているハイブリドーマがＩＬ−２レセプターのγ鎖分子
に特異的に結合する抗体を産生しているハイブリドーマ
となる。
行うことができる。すなわち、ハイブリドーマ培養上清
中に産生されている抗体の、ヒトＩＬ−２レセプターγ
鎖分子をコードする遺伝子が導入され、該ペプチドを発
現しているマウスＬ９２９細胞（以下Ｌγ細胞と称す
る）への結合と、ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子をコ
ードする遺伝子が導入され、該ペプチドを発現している
マウスＬ９２９細胞（以下、Ｌβ細胞と称する）への結
合を測定し、前者に対して結合量が高く、後者に対して
結合量の低いものを選択する。そのような抗体を産生し
ているハイブリドーマがＩＬ−２レセプターのγ鎖分子
に特異的に結合する抗体を産生しているハイブリドーマ
となる。
【００１６】細胞への抗体の結合量の測定は、放射標識
された抗マウスイムノグロブリン抗体を用いたラジオイ
ムノアッセイ、蛍光色素標識された抗マウスイムノグロ
ブリン抗体を用いた蛍光イムノアッセイなどいかなる方
法を用いてもかまわない。また、スクリーニングに用い
る細胞は、ヒトγ鎖を発現している細胞とヒトγ鎖を発
現していない細胞との組み合わせである限りいかなる細
胞を用いてもかまわない。
された抗マウスイムノグロブリン抗体を用いたラジオイ
ムノアッセイ、蛍光色素標識された抗マウスイムノグロ
ブリン抗体を用いた蛍光イムノアッセイなどいかなる方
法を用いてもかまわない。また、スクリーニングに用い
る細胞は、ヒトγ鎖を発現している細胞とヒトγ鎖を発
現していない細胞との組み合わせである限りいかなる細
胞を用いてもかまわない。
【００１７】ＩＬ−２レセプターのγ鎖分子に特異的に
結合する抗体が、すべてＩＬ−２応答を遮断する活性を
有する抗体とは限らないので、更に例えば以下のような
方法により、ＩＬ−２レセプターのγ鎖分子に対する抗
体を産生しているハイブリドーマの中から、ＩＬ−２応
答を遮断する活性を有する抗体を産生しているハイブリ
ドーマを選択する。ハイブリドーマ培養上清を、ヒトＩ
Ｌ−２依存的に増殖活性を示すヒト成人Ｔ細胞白血病ウ
イルス感染Ｔ細胞株ＩＬＴ−Ｍａｔ細胞に加え、ＩＬＴ
−Ｍａｔ細胞の増殖阻害活性を測定する（Journal of E
xperimental Medicine、１６９巻、１３２３頁）。増殖
阻害活性を有していれば、そのハイブリドーマが目的と
するモノクローナル抗体産生細胞ということになる。な
お、ＩＬ−２レセプターのγ鎖分子に対する抗体を産生
しているハイブリドーマの中から、ＩＬ−２応答を遮断
する活性を有する抗体を産生しているハイブリドーマを
選択する方法としては、ＩＬＴ−Ｍａｔ細胞を用いる方
法以外にも、ヒト細胞を用いて行うヒトＩＬ−２の生物
活性測定法である限り、いかなる方法を用いても構わな
い。こうして得られたハイブリドーマクローンとして、
例えばＧＰ−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３５７６、ＢＰ−４
６４１）、ＧＰ−４（ＦＥＲＭ Ｐ−１３５７５、ＢＰ
−４６４０）、ＴＵＧｈ４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０１
１、ＢＰ−４６４２）、ＴＵＧｈ５（ＦＥＲＭ Ｐ−１
４０１２、ＢＰ−４６４３）および、ＡＧ１４（ＦＥＲ
ＭＢＰ−４６４８）と呼ばれる細胞がある。
結合する抗体が、すべてＩＬ−２応答を遮断する活性を
有する抗体とは限らないので、更に例えば以下のような
方法により、ＩＬ−２レセプターのγ鎖分子に対する抗
体を産生しているハイブリドーマの中から、ＩＬ−２応
答を遮断する活性を有する抗体を産生しているハイブリ
ドーマを選択する。ハイブリドーマ培養上清を、ヒトＩ
Ｌ−２依存的に増殖活性を示すヒト成人Ｔ細胞白血病ウ
イルス感染Ｔ細胞株ＩＬＴ−Ｍａｔ細胞に加え、ＩＬＴ
−Ｍａｔ細胞の増殖阻害活性を測定する（Journal of E
xperimental Medicine、１６９巻、１３２３頁）。増殖
阻害活性を有していれば、そのハイブリドーマが目的と
するモノクローナル抗体産生細胞ということになる。な
お、ＩＬ−２レセプターのγ鎖分子に対する抗体を産生
しているハイブリドーマの中から、ＩＬ−２応答を遮断
する活性を有する抗体を産生しているハイブリドーマを
選択する方法としては、ＩＬＴ−Ｍａｔ細胞を用いる方
法以外にも、ヒト細胞を用いて行うヒトＩＬ−２の生物
活性測定法である限り、いかなる方法を用いても構わな
い。こうして得られたハイブリドーマクローンとして、
例えばＧＰ−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３５７６、ＢＰ−４
６４１）、ＧＰ−４（ＦＥＲＭ Ｐ−１３５７５、ＢＰ
−４６４０）、ＴＵＧｈ４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０１
１、ＢＰ−４６４２）、ＴＵＧｈ５（ＦＥＲＭ Ｐ−１
４０１２、ＢＰ−４６４３）および、ＡＧ１４（ＦＥＲ
ＭＢＰ−４６４８）と呼ばれる細胞がある。
【００１８】モノクローナル抗体の大量調製を行うに
は、ＧＰ−２細胞（ＦＥＲＭ Ｐ−１３５７６、ＢＰ−
４６４１）、ＧＰ−４細胞（ＦＥＲＭ Ｐ−１３５７
５、ＢＰ−４６４０）、ＴＵＧｈ４細胞（ＦＥＲＭ Ｐ
−１４０１１、ＢＰ−４６４２）、ＴＵＧｈ５細胞（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４０１２、ＢＰ−４６４３）あるいは、
ＡＧ１４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６４８）を、組織適合性
動物、あるいは胸腺欠損ヌードマウスなどの腹腔内に接
種して増殖させ、該動物の腹水中に産生された抗体を回
収して、塩析、イオン交換クロマトグラフィーなどの操
作により精製すればよい。
は、ＧＰ−２細胞（ＦＥＲＭ Ｐ−１３５７６、ＢＰ−
４６４１）、ＧＰ−４細胞（ＦＥＲＭ Ｐ−１３５７
５、ＢＰ−４６４０）、ＴＵＧｈ４細胞（ＦＥＲＭ Ｐ
−１４０１１、ＢＰ−４６４２）、ＴＵＧｈ５細胞（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４０１２、ＢＰ−４６４３）あるいは、
ＡＧ１４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６４８）を、組織適合性
動物、あるいは胸腺欠損ヌードマウスなどの腹腔内に接
種して増殖させ、該動物の腹水中に産生された抗体を回
収して、塩析、イオン交換クロマトグラフィーなどの操
作により精製すればよい。
【００１９】次に、ＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、
ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するモノクローナル抗
体のＶ領域からなるポリペプチドは以下のようにして作
成することができる。まず、ＩＬ−２レセプターγ鎖に
結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマクローンよりtotalＲＮ
Ａを抽出し、モノクローナル抗体のＶ領域をコードする
遺伝子（ｃＤＮＡ）を取得する。本発明者らはより迅速
に目的とするｃＤＮＡを取得する方法を鋭意工夫し、以
下の様な方法により抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡ
を取得した。
ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するモノクローナル抗
体のＶ領域からなるポリペプチドは以下のようにして作
成することができる。まず、ＩＬ−２レセプターγ鎖に
結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマクローンよりtotalＲＮ
Ａを抽出し、モノクローナル抗体のＶ領域をコードする
遺伝子（ｃＤＮＡ）を取得する。本発明者らはより迅速
に目的とするｃＤＮＡを取得する方法を鋭意工夫し、以
下の様な方法により抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡ
を取得した。
【００２０】すなわち、既に遺伝子の塩基配列が報告さ
れているマウスＩｇＧのＨ鎖、及びＬ鎖の塩基配列を基
に、それぞれのＶ領域の遺伝子の５’端、及び３’端に
共通性の高い２０〜３０個の塩基配列を有するＤＮＡ分
子（プライマーＤＮＡ）４種類を考案する。以降、５’
側、３’側とはＨ鎖Ｖ領域遺伝子、及びＬ鎖Ｖ領域遺伝
子のセンスストランドを基準としている。５’側プライ
マーとは、センスストランド上の配列を有するＤＮＡ分
子であり、３’側のプライマーとはセンスストランドの
３’端に相補的な配列を有するＤＮＡ分子である。次に
考案したＬ鎖Ｖ領域５’側プライマーの５’端に、翻訳
開始コドンであるＡＴＧ配列を付加し、Ｈ鎖の３’側プ
ライマーの３’端に翻訳終止コドンを付加する。もちろ
ん、Ｈ鎖Ｖ領域５’側プライマーの５’端にＡＴＧ配列
を付加し、Ｌ鎖Ｖ領域３’側プライマーの３’端に終止
コドンを付加しても良い。終止コドンとしてはTAA,TAG,
TGAのいずれを用いても良い。尚、本発明の実施例にお
いては、終止コドンとしてTGAを用いた。なおＨ鎖及び
Ｌ鎖のそれぞれのプライマーＤＮＡの５’端（ここでの
５’端とは３’側プライマーにおいては該プライマー分
子を基準としたときの５’端である）に、発現ベクター
に挿入するための適当な制限酵素サイトを導入してお
く。デザインしたプライマーＤＮＡはＤＮＡ合成機など
を用いて化学合成する。
れているマウスＩｇＧのＨ鎖、及びＬ鎖の塩基配列を基
に、それぞれのＶ領域の遺伝子の５’端、及び３’端に
共通性の高い２０〜３０個の塩基配列を有するＤＮＡ分
子（プライマーＤＮＡ）４種類を考案する。以降、５’
側、３’側とはＨ鎖Ｖ領域遺伝子、及びＬ鎖Ｖ領域遺伝
子のセンスストランドを基準としている。５’側プライ
マーとは、センスストランド上の配列を有するＤＮＡ分
子であり、３’側のプライマーとはセンスストランドの
３’端に相補的な配列を有するＤＮＡ分子である。次に
考案したＬ鎖Ｖ領域５’側プライマーの５’端に、翻訳
開始コドンであるＡＴＧ配列を付加し、Ｈ鎖の３’側プ
ライマーの３’端に翻訳終止コドンを付加する。もちろ
ん、Ｈ鎖Ｖ領域５’側プライマーの５’端にＡＴＧ配列
を付加し、Ｌ鎖Ｖ領域３’側プライマーの３’端に終止
コドンを付加しても良い。終止コドンとしてはTAA,TAG,
TGAのいずれを用いても良い。尚、本発明の実施例にお
いては、終止コドンとしてTGAを用いた。なおＨ鎖及び
Ｌ鎖のそれぞれのプライマーＤＮＡの５’端（ここでの
５’端とは３’側プライマーにおいては該プライマー分
子を基準としたときの５’端である）に、発現ベクター
に挿入するための適当な制限酵素サイトを導入してお
く。デザインしたプライマーＤＮＡはＤＮＡ合成機など
を用いて化学合成する。
【００２１】次に、得られたハイブリドーマより公知の
方法に従ってtotalＲＮＡを抽出し、逆転写酵素と３’
側プライマーＤＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを作製し、
５’側プライマーＤＮＡ及び３’側プライマーＤＮＡを
用い、Taqポリメラーゼによる Polymerase Chain React
ion法（ＰＣＲ法、Science, 230巻, 1350頁, 1985年）
にて抗体のＨ鎖のＶ領域及びＬ鎖のＶ領域をコードする
ＤＮＡ断片のみをそれぞれ選択的に増幅し取得する。
方法に従ってtotalＲＮＡを抽出し、逆転写酵素と３’
側プライマーＤＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを作製し、
５’側プライマーＤＮＡ及び３’側プライマーＤＮＡを
用い、Taqポリメラーゼによる Polymerase Chain React
ion法（ＰＣＲ法、Science, 230巻, 1350頁, 1985年）
にて抗体のＨ鎖のＶ領域及びＬ鎖のＶ領域をコードする
ＤＮＡ断片のみをそれぞれ選択的に増幅し取得する。
【００２２】Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子と、Ｌ鎖Ｖ
領域をコードする遺伝子とを大腸菌等で発現させ、機能
的な抗体Ｖ領域からなるポリペプチドを調製するには、
それぞれの遺伝子を２つのベクターに別個に組み込んで
発現させるか、又はそれぞれの遺伝子を１つのベクター
に同時に組み込んで発現させ、その後Ｈ鎖Ｖ領域からな
るポリペプチドとＬ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをア
ッセンブリさせてもよいが、その効率は極めて悪いこと
が知られている（Science, 240巻, 1038頁, 1988年）。
本来抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖がＳＳ架橋による共有結合で結
合して得られる分子が２つが組み合わさって構成されて
いる。すなわちダイマーの構造をしており、また各分子
のＨ鎖同士がＳＳ結合を形成している。Ｈ鎖とＬ鎖のＳ
Ｓ架橋の位置はともに定常領域（以下、Ｃ領域と称す
る）上であり、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域同士は非共有結
合で結合している。したがって、Ｈ鎖Ｖ領域からなるポ
リペプチドとＬ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをアッセ
ンブリさせて抗体Ｖ領域のみからなるポリペプチドを調
製する場合、両分子の会合は非共有結合のみに頼らなけ
ればならないため、機能的な分子の形成効率が悪いもの
と考えられる。しかし最近になって、Ｈ鎖Ｖ領域からな
るポリペプチドとＬ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをリ
ンカーを用いて連結させ、１本鎖の機能的な分子として
調製する技術が開発された（Science, 242巻, 423頁,19
88年）。本発明者らは当該技術を応用して、機能的でか
つ１本鎖の抗ＩＬ−２レセプターγ鎖抗体のＶ領域のみ
からなるポリペプチドを発現させることに成功した。
領域をコードする遺伝子とを大腸菌等で発現させ、機能
的な抗体Ｖ領域からなるポリペプチドを調製するには、
それぞれの遺伝子を２つのベクターに別個に組み込んで
発現させるか、又はそれぞれの遺伝子を１つのベクター
に同時に組み込んで発現させ、その後Ｈ鎖Ｖ領域からな
るポリペプチドとＬ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをア
ッセンブリさせてもよいが、その効率は極めて悪いこと
が知られている（Science, 240巻, 1038頁, 1988年）。
本来抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖がＳＳ架橋による共有結合で結
合して得られる分子が２つが組み合わさって構成されて
いる。すなわちダイマーの構造をしており、また各分子
のＨ鎖同士がＳＳ結合を形成している。Ｈ鎖とＬ鎖のＳ
Ｓ架橋の位置はともに定常領域（以下、Ｃ領域と称す
る）上であり、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域同士は非共有結
合で結合している。したがって、Ｈ鎖Ｖ領域からなるポ
リペプチドとＬ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをアッセ
ンブリさせて抗体Ｖ領域のみからなるポリペプチドを調
製する場合、両分子の会合は非共有結合のみに頼らなけ
ればならないため、機能的な分子の形成効率が悪いもの
と考えられる。しかし最近になって、Ｈ鎖Ｖ領域からな
るポリペプチドとＬ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをリ
ンカーを用いて連結させ、１本鎖の機能的な分子として
調製する技術が開発された（Science, 242巻, 423頁,19
88年）。本発明者らは当該技術を応用して、機能的でか
つ１本鎖の抗ＩＬ−２レセプターγ鎖抗体のＶ領域のみ
からなるポリペプチドを発現させることに成功した。
【００２３】まず、プロモーター領域を含むＤＮＡ、リ
ボゾーム結合領域を含むＤＮＡ、ＡＴＧ配列を付加した
５’側プライマーに導入した制限酵素サイトを含むＤＮ
Ａ、同鎖３’側プライマーに導入した制限酵素サイトを
含むＤＮＡ、抗体Ｌ鎖Ｖ領域と抗体Ｈ鎖Ｖ領域とをつな
ぐための適当な長さのリンカーペプチドをコードするＤ
ＮＡ、ＡＴＧ配列を付加していない５’側プライマーに
導入した制限酵素サイトを含むＤＮＡ、同鎖３’側プラ
イマーに導入した制限酵素サイトを含むＤＮＡ、最後に
ターミネーター領域を含むＤＮＡの順に上流より並べら
れているＤＮＡを含有する発現ベクターを構築する。Ｐ
ＣＲにより増幅したＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡと、
Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのそれぞれを挿入する場
合、リンカーペプチドをコードするＤＮＡ及びＶ領域を
コードするＤＮＡの翻訳がずれないように注意する。
ボゾーム結合領域を含むＤＮＡ、ＡＴＧ配列を付加した
５’側プライマーに導入した制限酵素サイトを含むＤＮ
Ａ、同鎖３’側プライマーに導入した制限酵素サイトを
含むＤＮＡ、抗体Ｌ鎖Ｖ領域と抗体Ｈ鎖Ｖ領域とをつな
ぐための適当な長さのリンカーペプチドをコードするＤ
ＮＡ、ＡＴＧ配列を付加していない５’側プライマーに
導入した制限酵素サイトを含むＤＮＡ、同鎖３’側プラ
イマーに導入した制限酵素サイトを含むＤＮＡ、最後に
ターミネーター領域を含むＤＮＡの順に上流より並べら
れているＤＮＡを含有する発現ベクターを構築する。Ｐ
ＣＲにより増幅したＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡと、
Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのそれぞれを挿入する場
合、リンカーペプチドをコードするＤＮＡ及びＶ領域を
コードするＤＮＡの翻訳がずれないように注意する。
【００２４】さて、本発明においてプロモーターの由来
は問うところではなく、例えば大腸菌のtrpプロモータ
ー、tacプロモーター、trcプロモーター、lacプロモー
ターや、λファージのλＰLプロモーター、λＰRプロモ
ーター、さらには真核細胞のＳＶ４０プロモーター、Mo
loneyＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーターなどを
用いることができる。リボゾーム結合領域は、例えば大
腸菌のtrpＬやtrpＥ、lacＺのリボゾーム結合領域や、
λファージのＣII蛋白のリボゾーム結合領域を用いるこ
とができる。あるいは化学合成したＤＮＡ配列を用いる
ことができる。また、目的とするポリペプチドを大腸菌
体内に顆粒状として大量に蓄積させるために、リボゾー
ム結合領域を２つ以上としてもよい。
は問うところではなく、例えば大腸菌のtrpプロモータ
ー、tacプロモーター、trcプロモーター、lacプロモー
ターや、λファージのλＰLプロモーター、λＰRプロモ
ーター、さらには真核細胞のＳＶ４０プロモーター、Mo
loneyＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーターなどを
用いることができる。リボゾーム結合領域は、例えば大
腸菌のtrpＬやtrpＥ、lacＺのリボゾーム結合領域や、
λファージのＣII蛋白のリボゾーム結合領域を用いるこ
とができる。あるいは化学合成したＤＮＡ配列を用いる
ことができる。また、目的とするポリペプチドを大腸菌
体内に顆粒状として大量に蓄積させるために、リボゾー
ム結合領域を２つ以上としてもよい。
【００２５】Ｈ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドとＬ鎖Ｖ
領域からなるポリペプチドとを繋ぐためのリンカーペプ
チドの配列は、得られる抗体Ｖ領域からなるポリペプチ
ドが機能的である限りいかなる配列でもよいが、生体内
投与時の副作用を最小限とするためになるべく短く、独
自の構造を有しないような配列とした方が望ましい。タ
ーミネーターとしては、例えば大腸菌のtrpＡターミネ
ーター、rrnBターミネーター、recAターミネーターなど
を用いることができる。また、発現プラスミドのコピー
数は一般的に多い方が好ましく、複製起点としてpBR系
の複製起点よりpUC系の複製起点を用いた方が望まし
い。
領域からなるポリペプチドとを繋ぐためのリンカーペプ
チドの配列は、得られる抗体Ｖ領域からなるポリペプチ
ドが機能的である限りいかなる配列でもよいが、生体内
投与時の副作用を最小限とするためになるべく短く、独
自の構造を有しないような配列とした方が望ましい。タ
ーミネーターとしては、例えば大腸菌のtrpＡターミネ
ーター、rrnBターミネーター、recAターミネーターなど
を用いることができる。また、発現プラスミドのコピー
数は一般的に多い方が好ましく、複製起点としてpBR系
の複製起点よりpUC系の複製起点を用いた方が望まし
い。
【００２６】構築した発現ベクターにＰＣＲにて増幅し
たＨ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ
及びＬ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをコードするＤＮ
Ａをそれぞれ挿入して組換えＤＮＡを得る。挿入後、こ
の組換えＤＮＡを通常の方法で宿主に導入し、そして組
換えＤＮＡ上の遺伝子を発現させれば良い。宿主として
は、原核生物及び真核生物の何れであってもよい。原核
生物の例としては、大腸菌、枯草菌などを挙げることが
できる。真核細胞は例えば酵母、ＣＨＯ細胞などを用い
れば良い。好ましくは原核細胞、更に好ましくは大腸菌
を宿主として用いるのが良い。組換えＤＮＡをこれらの
生物に組み込む方法も公知の方法を利用すればよく、例
えば大腸菌では、対数増殖期の細胞を５０ｍＭの塩化カ
ルシウムで氷中約３０分処理することにより、大腸菌の
細胞壁の構造を変化させ、続いてプラスミドＤＮＡを注
入し約１０分後３０℃〜４２℃で２分間の熱処理を施し
た後、培地を加え３０℃〜３７℃で約６０分培養するこ
とにより、組換えＤＮＡを細胞に組み込むことができ
る。
たＨ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ
及びＬ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをコードするＤＮ
Ａをそれぞれ挿入して組換えＤＮＡを得る。挿入後、こ
の組換えＤＮＡを通常の方法で宿主に導入し、そして組
換えＤＮＡ上の遺伝子を発現させれば良い。宿主として
は、原核生物及び真核生物の何れであってもよい。原核
生物の例としては、大腸菌、枯草菌などを挙げることが
できる。真核細胞は例えば酵母、ＣＨＯ細胞などを用い
れば良い。好ましくは原核細胞、更に好ましくは大腸菌
を宿主として用いるのが良い。組換えＤＮＡをこれらの
生物に組み込む方法も公知の方法を利用すればよく、例
えば大腸菌では、対数増殖期の細胞を５０ｍＭの塩化カ
ルシウムで氷中約３０分処理することにより、大腸菌の
細胞壁の構造を変化させ、続いてプラスミドＤＮＡを注
入し約１０分後３０℃〜４２℃で２分間の熱処理を施し
た後、培地を加え３０℃〜３７℃で約６０分培養するこ
とにより、組換えＤＮＡを細胞に組み込むことができ
る。
【００２７】目的とするＩＬ−２レセプターγ鎖に対す
るモノクローナル抗体のＶ領域のみからなるポリペプチ
ドは、組換えＤＮＡで形質転換された細胞を培養するこ
とによって当該細胞の体内あるいは培地中に蓄積させる
ことができる。培地は各細胞を培養しうるそれぞれの公
知の培地を利用すればよく、培養条件も公知の条件でよ
い。培養後は、目的とするモノクローナル抗体のＶ領域
のみからなるポリペプチドを公知の方法で取得すればよ
い。
るモノクローナル抗体のＶ領域のみからなるポリペプチ
ドは、組換えＤＮＡで形質転換された細胞を培養するこ
とによって当該細胞の体内あるいは培地中に蓄積させる
ことができる。培地は各細胞を培養しうるそれぞれの公
知の培地を利用すればよく、培養条件も公知の条件でよ
い。培養後は、目的とするモノクローナル抗体のＶ領域
のみからなるポリペプチドを公知の方法で取得すればよ
い。
【００２８】ＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ−
２応答を遮断する活性を有するマウスモノクローナル抗
体のＣ領域をヒト抗体のＣ領域へと変換したポリペプチ
ド、またはマウスモノクローナル抗体の定常領域、及び
Ｖ領域の枠組み配列（以下、ＦＲと称する）を各々ヒト
抗体のＣ領域、ＦＲへと変換したポリペプチドは以下の
ようにして作成することができる。まず、抗体のＨ鎖、
あるいはＬ鎖のそれぞれのシグナルペプチドをコードす
る遺伝子の５’端塩基配列に相当する２０〜３０個の長
さのＤＮＡを合成する。その際、合成されるＤＮＡの
５’端に発現ベクターのプロモーター領域の下流への挿
入のための制限酵素サイトを導入しておく。続いて抗体
のＨ鎖、あるいはＬ鎖のそれぞれのＶ領域をコードする
遺伝子の３’端塩基配列の相補的配列に相当する２０〜
３０個の長さのＤＮＡを合成する。同様に該ＤＮＡの
３’端に、ヒト抗体のＣ領域ｃＤＮＡを結合させるため
の制限酵素サイトを配しておく。ＩＬ−２応答を遮断す
る活性を有するマウスモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマより、常法に従ってｔｏｔａｌＲＮＡを調製し、
リバーストランスクリプターゼ等を用いて一本鎖ｃＤＮ
Ａを調製後、合成したＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ
反応を行い、抗体のＨ鎖、あるいはＬ鎖のそれぞれのシ
グナルペプチド及びＶ領域をコードするＤＮＡ断片を取
得する。
２応答を遮断する活性を有するマウスモノクローナル抗
体のＣ領域をヒト抗体のＣ領域へと変換したポリペプチ
ド、またはマウスモノクローナル抗体の定常領域、及び
Ｖ領域の枠組み配列（以下、ＦＲと称する）を各々ヒト
抗体のＣ領域、ＦＲへと変換したポリペプチドは以下の
ようにして作成することができる。まず、抗体のＨ鎖、
あるいはＬ鎖のそれぞれのシグナルペプチドをコードす
る遺伝子の５’端塩基配列に相当する２０〜３０個の長
さのＤＮＡを合成する。その際、合成されるＤＮＡの
５’端に発現ベクターのプロモーター領域の下流への挿
入のための制限酵素サイトを導入しておく。続いて抗体
のＨ鎖、あるいはＬ鎖のそれぞれのＶ領域をコードする
遺伝子の３’端塩基配列の相補的配列に相当する２０〜
３０個の長さのＤＮＡを合成する。同様に該ＤＮＡの
３’端に、ヒト抗体のＣ領域ｃＤＮＡを結合させるため
の制限酵素サイトを配しておく。ＩＬ−２応答を遮断す
る活性を有するマウスモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマより、常法に従ってｔｏｔａｌＲＮＡを調製し、
リバーストランスクリプターゼ等を用いて一本鎖ｃＤＮ
Ａを調製後、合成したＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ
反応を行い、抗体のＨ鎖、あるいはＬ鎖のそれぞれのシ
グナルペプチド及びＶ領域をコードするＤＮＡ断片を取
得する。
【００２９】同様にヒト抗体のＣ領域遺伝子は、抗体を
合成しているヒトＢ細胞株やヒト形質細胞株よりｔｏｔ
ａｌＲＮＡを調製して、リバーストランスクリプターゼ
等を用いてｃＤＮＡを調製後、あらかじめ合成した抗体
のＨ鎖、あるいはＬ鎖のそれぞれのＣ領域の５’端、及
び３’端の部分の塩基配列に相当するＤＮＡをプライマ
ーとしてＰＣＲすることにより得られる。その際、５’
側プライマーの５’端の外側には、抗体のＨ鎖、あるい
はＬ鎖のそれぞれのシグナルペプチド及びＶ領域をコー
ドするＤＮＡ断片を取得する際用いた３’側プライマー
に導入した制限酵素サイトと同じサイトを、また、３’
側プライマーの５’端の外側には、発現ベクターのプロ
モーター領域の下流への挿入のための制限酵素サイトを
配しておき、Ｖ領域３’端とＣ領域５’端の繋ぎ目は、
フレームがずれないようにデザインする。なお、調製す
る抗体のクラスあるいはサブクラスは、それぞれのクラ
スあるいはサブクラスの抗体を産生する細胞よりｔｏｔ
ａｌＲＮＡを調製してＣ領域をコードするＤＮＡを調製
することにより、使用目的に応じて自由に決定できる。
合成しているヒトＢ細胞株やヒト形質細胞株よりｔｏｔ
ａｌＲＮＡを調製して、リバーストランスクリプターゼ
等を用いてｃＤＮＡを調製後、あらかじめ合成した抗体
のＨ鎖、あるいはＬ鎖のそれぞれのＣ領域の５’端、及
び３’端の部分の塩基配列に相当するＤＮＡをプライマ
ーとしてＰＣＲすることにより得られる。その際、５’
側プライマーの５’端の外側には、抗体のＨ鎖、あるい
はＬ鎖のそれぞれのシグナルペプチド及びＶ領域をコー
ドするＤＮＡ断片を取得する際用いた３’側プライマー
に導入した制限酵素サイトと同じサイトを、また、３’
側プライマーの５’端の外側には、発現ベクターのプロ
モーター領域の下流への挿入のための制限酵素サイトを
配しておき、Ｖ領域３’端とＣ領域５’端の繋ぎ目は、
フレームがずれないようにデザインする。なお、調製す
る抗体のクラスあるいはサブクラスは、それぞれのクラ
スあるいはサブクラスの抗体を産生する細胞よりｔｏｔ
ａｌＲＮＡを調製してＣ領域をコードするＤＮＡを調製
することにより、使用目的に応じて自由に決定できる。
【００３０】得られたマウス抗体のシグナルペプチドと
Ｖ領域とをコードするＤＮＡ断片と、ヒト抗体のＣ領域
をコードするＤＮＡ断片とを、それぞれに導入したサイ
トに当たる制限酵素によりそれぞれを切断した後、それ
ぞれを混合する。ついで、これらのＤＮＡを制限酵素に
より切断された動物細胞で発現可能な発現ベクターに挿
入する。発現ベクターを切断するために用いられる制限
酵素は、マウス抗体のシグナルペプチドとＶ領域とをコ
ードするＤＮＡ断片と、ヒト抗体のＣ領域をコードする
ＤＮＡ断片とにＰＣＲプライマーに由来して導入される
制限酵素サイトに一致する切断面を生じるものである。
なお、マウス抗体のシグナルペプチドとＶ領域とをコー
ドするＤＮＡ断片がＨ鎖のそれをコードする場合には、
ヒト抗体Ｈ鎖のＣ領域をコードするＤＮＡ断片と混合し
て発現ベクターに挿入しなければならず、同様に、マウ
ス抗体のシグナルペプチドとＶ領域とをコードするＤＮ
Ａ断片がＬ鎖のそれをコードする場合には、ヒト抗体Ｌ
鎖のＣ領域をコードするＤＮＡ断片と混合して発現ベク
ターに挿入しなければならない。最終的に、マウス抗体
のシグナルペプチドとＶ領域とをコードするＤＮＡ断片
と、ヒト抗体のＣ領域をコードするＤＮＡ断片とが、発
現ベクターに正しい方向に挿入されているものをそれぞ
れ選択する。
Ｖ領域とをコードするＤＮＡ断片と、ヒト抗体のＣ領域
をコードするＤＮＡ断片とを、それぞれに導入したサイ
トに当たる制限酵素によりそれぞれを切断した後、それ
ぞれを混合する。ついで、これらのＤＮＡを制限酵素に
より切断された動物細胞で発現可能な発現ベクターに挿
入する。発現ベクターを切断するために用いられる制限
酵素は、マウス抗体のシグナルペプチドとＶ領域とをコ
ードするＤＮＡ断片と、ヒト抗体のＣ領域をコードする
ＤＮＡ断片とにＰＣＲプライマーに由来して導入される
制限酵素サイトに一致する切断面を生じるものである。
なお、マウス抗体のシグナルペプチドとＶ領域とをコー
ドするＤＮＡ断片がＨ鎖のそれをコードする場合には、
ヒト抗体Ｈ鎖のＣ領域をコードするＤＮＡ断片と混合し
て発現ベクターに挿入しなければならず、同様に、マウ
ス抗体のシグナルペプチドとＶ領域とをコードするＤＮ
Ａ断片がＬ鎖のそれをコードする場合には、ヒト抗体Ｌ
鎖のＣ領域をコードするＤＮＡ断片と混合して発現ベク
ターに挿入しなければならない。最終的に、マウス抗体
のシグナルペプチドとＶ領域とをコードするＤＮＡ断片
と、ヒト抗体のＣ領域をコードするＤＮＡ断片とが、発
現ベクターに正しい方向に挿入されているものをそれぞ
れ選択する。
【００３１】調製したＨ鎖またはＬ鎖のマウス抗体のシ
グナルペプチド、Ｖ領域、及びヒト抗体のＣ領域をコー
ドする遺伝子を含むそれぞれの発現ベクターを通常の方
法により動物細胞に同時に導入する。発現させる宿主
は、動物細胞以外でもよいが、その場合は、それぞれの
宿主で発現可能なベクターを用いる。導入後、細胞をク
ローニングして、その培養上清中に産生されている抗体
のＩＬ−２レセプターγ鎖に対する結合活性を測定する
ことにより、目的とするＩＬ−２レセプターγ鎖に結合
し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するマウスモノク
ローナル抗体のＣ領域をヒト抗体のＣ領域へと変換した
ポリペプチドを得ることができる。
グナルペプチド、Ｖ領域、及びヒト抗体のＣ領域をコー
ドする遺伝子を含むそれぞれの発現ベクターを通常の方
法により動物細胞に同時に導入する。発現させる宿主
は、動物細胞以外でもよいが、その場合は、それぞれの
宿主で発現可能なベクターを用いる。導入後、細胞をク
ローニングして、その培養上清中に産生されている抗体
のＩＬ−２レセプターγ鎖に対する結合活性を測定する
ことにより、目的とするＩＬ−２レセプターγ鎖に結合
し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するマウスモノク
ローナル抗体のＣ領域をヒト抗体のＣ領域へと変換した
ポリペプチドを得ることができる。
【００３２】マウスモノクローナル抗体のＣ領域、及び
Ｖ領域のＦＲを各々ヒト抗体のＣ領域、ＦＲへと変換し
たポリペプチドは、以下のようにして調製できる（Medi
calImmunology、２２巻、６号、６２８頁）。まず、調
製したマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードする
ＤＮＡから導きだしたアミノ酸配列と、既に知られてい
るヒトの抗体のＶ領域アミノ酸配列とのホモロジー検索
を行い、最もホモロジーの高い配列をＨ鎖、及びＬ鎖に
ついてそれぞれ選択する。次に、シグナルペプチドとＶ
領域のＦＲ部分は選択したヒト抗体のアミノ酸配列とな
るように、またそれ以外のＶ領域はマウスモノクローナ
ル抗体のアミノ酸配列となるようにデザインして、その
ペプチドをコードするＤＮＡ断片をＨ鎖、及びＬ鎖につ
いてそれぞれデザインし合成する。その際、３０〜４０
個位の塩基の長さとなるようにＤＮＡ断片を分割し、そ
れぞれの繋ぎ目は５〜７程度重なるようにして、更に一
つおきに本来の配列の相補的配列となるように合成す
る。また、シグナルペプチドの５’端とＶ領域の３’端
の外側には、それぞれ発現ベクター、ヒトＣ領域と結合
させるための制限酵素サイトを配しておく。それらの合
成ＤＮＡ断片を混合してＰＣＲ後、回収した抗体のＨ鎖
及びＬ鎖それぞれのシグナルペプチドとＶ領域をコード
するＤＮＡ断片を、導入した制限酵素サイトに当たる制
限酵素により切断する。上述のマウスモノクローナル抗
体のＨ鎖、及びＬ鎖のＣ領域をヒト抗体のＣ領域へと変
換したポリペプチドをそれぞれ発現するベクターより、
同様の制限酵素を用いてＨ鎖、及びＬ鎖のシグナルペプ
チドとＶ領域をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ切断分
離し、調製したシグナルペプチドとＶ領域をコードする
ＤＮＡ断片へとすげ替える。このようにして構築した組
換えＤＮＡを上記と同様の方法により動物細胞へ導入
し、同様の方法で発現している細胞を選択することによ
り、目的とするＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ
−２応答を遮断する活性を有するマウスモノクローナル
抗体のＣ領域、及びＶ領域のＦＲを各々ヒト抗体のＣ領
域、ＦＲへと変換したポリペプチド得ることができる。
Ｖ領域のＦＲを各々ヒト抗体のＣ領域、ＦＲへと変換し
たポリペプチドは、以下のようにして調製できる（Medi
calImmunology、２２巻、６号、６２８頁）。まず、調
製したマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードする
ＤＮＡから導きだしたアミノ酸配列と、既に知られてい
るヒトの抗体のＶ領域アミノ酸配列とのホモロジー検索
を行い、最もホモロジーの高い配列をＨ鎖、及びＬ鎖に
ついてそれぞれ選択する。次に、シグナルペプチドとＶ
領域のＦＲ部分は選択したヒト抗体のアミノ酸配列とな
るように、またそれ以外のＶ領域はマウスモノクローナ
ル抗体のアミノ酸配列となるようにデザインして、その
ペプチドをコードするＤＮＡ断片をＨ鎖、及びＬ鎖につ
いてそれぞれデザインし合成する。その際、３０〜４０
個位の塩基の長さとなるようにＤＮＡ断片を分割し、そ
れぞれの繋ぎ目は５〜７程度重なるようにして、更に一
つおきに本来の配列の相補的配列となるように合成す
る。また、シグナルペプチドの５’端とＶ領域の３’端
の外側には、それぞれ発現ベクター、ヒトＣ領域と結合
させるための制限酵素サイトを配しておく。それらの合
成ＤＮＡ断片を混合してＰＣＲ後、回収した抗体のＨ鎖
及びＬ鎖それぞれのシグナルペプチドとＶ領域をコード
するＤＮＡ断片を、導入した制限酵素サイトに当たる制
限酵素により切断する。上述のマウスモノクローナル抗
体のＨ鎖、及びＬ鎖のＣ領域をヒト抗体のＣ領域へと変
換したポリペプチドをそれぞれ発現するベクターより、
同様の制限酵素を用いてＨ鎖、及びＬ鎖のシグナルペプ
チドとＶ領域をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ切断分
離し、調製したシグナルペプチドとＶ領域をコードする
ＤＮＡ断片へとすげ替える。このようにして構築した組
換えＤＮＡを上記と同様の方法により動物細胞へ導入
し、同様の方法で発現している細胞を選択することによ
り、目的とするＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ
−２応答を遮断する活性を有するマウスモノクローナル
抗体のＣ領域、及びＶ領域のＦＲを各々ヒト抗体のＣ領
域、ＦＲへと変換したポリペプチド得ることができる。
【００３３】本発明のポリペプチドは、ＩＬ−２レセプ
ターγ鎖に特異的に結合して、ＩＬ−２の応答を遮断す
る活性を有しており、臓器移植時の拒絶反応の予防、自
己免疫疾患などの治療に対して有効なものである。ま
た、本発明のモノクローナル抗体は、ここで得られたハ
イブリドーマクローンの産生するモノクローナル抗体に
限定されるものではなく、ＩＬ−２レセプターγ鎖に結
合し、かつＩＬ−２応答を遮断する活性を有する限り本
発明のモノクローナル抗体に含まれる。また、本モノク
ローナル抗体のＣ領域を公知の方法により、ヒトＣ領域
へと変換したキメラ抗体、更にＶ領域のＦＲをヒト化し
た抗体も、ＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、かつＩＬ
−２応答を遮断する活性を有する限り本発明のモノクロ
ーナル抗体に含まれる。また、同じく本発明のポリペプ
チドの構造は、例えば配列表の配列番号１または２記載
の配列であるが、これらに限定されるものではなく、Ｉ
Ｌ−２レセプターγ鎖に結合し、かつＩＬ−２応答を遮
断する活性を有する限り本発明のポリペプチドに含まれ
る。例えば、（１）配列番号１または２記載のポリペプ
チド構造中の１若しくは複数個のアミノ酸残基を他のア
ミノ酸残基に置換した構造を有するポリペプチド、
（２）配列番号１または２記載のポリペプチド構造中の
Ｎ末端及び／またはＣ末端より１若しくは複数個のアミ
ノ酸残基が欠損し、かつ連続しているアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（３）配列番号１又は２記載のポリ
ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に１若しくは複数
個のアミノ酸残基が付加された構造を有するポリペプチ
ド及び（４）配列番号１又は２記載のポリペプチド構造
中の１若しくは複数個のアミノ酸残基がアセチル化、ア
ミド化又はポリエチレン付加された構造を有するポリペ
プチド、等もＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ−
２応答を遮断する活性を有する限り本発明のポリペプチ
ドに含まれる。特に、配列表の配列番号１及び２記載の
ポリペプチドのＮ末端のMetは微生物を用いて発現する
過程又は精製過程において切断され、その結果Ｎ末端が
Aspとなる場合がある。このポリペプチドも上記活性、
即ちヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ−２応
答を遮断する活性を有する。また、Ｍｅｔが結合した形
で生産させた後、アミノペプチダーゼ等の酵素でＮ末端
Ｍｅｔをはずしたものも上記活性を有する。更に、必要
により本発明のモノクローナル抗体、及びポリペプチド
に毒素を付加したものを用いても良い。
ターγ鎖に特異的に結合して、ＩＬ−２の応答を遮断す
る活性を有しており、臓器移植時の拒絶反応の予防、自
己免疫疾患などの治療に対して有効なものである。ま
た、本発明のモノクローナル抗体は、ここで得られたハ
イブリドーマクローンの産生するモノクローナル抗体に
限定されるものではなく、ＩＬ−２レセプターγ鎖に結
合し、かつＩＬ−２応答を遮断する活性を有する限り本
発明のモノクローナル抗体に含まれる。また、本モノク
ローナル抗体のＣ領域を公知の方法により、ヒトＣ領域
へと変換したキメラ抗体、更にＶ領域のＦＲをヒト化し
た抗体も、ＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、かつＩＬ
−２応答を遮断する活性を有する限り本発明のモノクロ
ーナル抗体に含まれる。また、同じく本発明のポリペプ
チドの構造は、例えば配列表の配列番号１または２記載
の配列であるが、これらに限定されるものではなく、Ｉ
Ｌ−２レセプターγ鎖に結合し、かつＩＬ−２応答を遮
断する活性を有する限り本発明のポリペプチドに含まれ
る。例えば、（１）配列番号１または２記載のポリペプ
チド構造中の１若しくは複数個のアミノ酸残基を他のア
ミノ酸残基に置換した構造を有するポリペプチド、
（２）配列番号１または２記載のポリペプチド構造中の
Ｎ末端及び／またはＣ末端より１若しくは複数個のアミ
ノ酸残基が欠損し、かつ連続しているアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（３）配列番号１又は２記載のポリ
ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に１若しくは複数
個のアミノ酸残基が付加された構造を有するポリペプチ
ド及び（４）配列番号１又は２記載のポリペプチド構造
中の１若しくは複数個のアミノ酸残基がアセチル化、ア
ミド化又はポリエチレン付加された構造を有するポリペ
プチド、等もＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ−
２応答を遮断する活性を有する限り本発明のポリペプチ
ドに含まれる。特に、配列表の配列番号１及び２記載の
ポリペプチドのＮ末端のMetは微生物を用いて発現する
過程又は精製過程において切断され、その結果Ｎ末端が
Aspとなる場合がある。このポリペプチドも上記活性、
即ちヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ−２応
答を遮断する活性を有する。また、Ｍｅｔが結合した形
で生産させた後、アミノペプチダーゼ等の酵素でＮ末端
Ｍｅｔをはずしたものも上記活性を有する。更に、必要
により本発明のモノクローナル抗体、及びポリペプチド
に毒素を付加したものを用いても良い。
【００３４】本発明の免疫抑制剤は上記モノクローナル
抗体、あるいはポリペプチドを0.1重量％〜100重量％、
好ましくは0.5重量％〜70重量％の割合で含有すればよ
い。したがって、本発明のモノクローナル抗体、あるい
はポリペプチドをそのまま投与してもよいし、また通常
製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。
製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ
本発明のモノクローナル抗体、あるいはポリペプチドと
反応しない物質が用いられる。注射剤の場合には、本発
明のモノクローナル抗体、あるいはポリペプチドを水に
溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水又は
ぶどう糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤、保存
剤、安定化剤又は賦形剤を含有させてもよい。また、こ
れらの製剤は治療上価値のある他の成分を含有していて
もよい。
抗体、あるいはポリペプチドを0.1重量％〜100重量％、
好ましくは0.5重量％〜70重量％の割合で含有すればよ
い。したがって、本発明のモノクローナル抗体、あるい
はポリペプチドをそのまま投与してもよいし、また通常
製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。
製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ
本発明のモノクローナル抗体、あるいはポリペプチドと
反応しない物質が用いられる。注射剤の場合には、本発
明のモノクローナル抗体、あるいはポリペプチドを水に
溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水又は
ぶどう糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤、保存
剤、安定化剤又は賦形剤を含有させてもよい。また、こ
れらの製剤は治療上価値のある他の成分を含有していて
もよい。
【００３５】本発明に係る免疫抑制剤の投与方法として
は、経口、注射、直腸内などいずれの方法を用いてもか
まわないが、注射による投与が好ましい。投与量は、投
与方法、患者の症状、年齢などにより異なるが、通常１
回0.001〜1000mg、好ましくは0.01〜10mgを１日当り１
〜３回投与すればよい。
は、経口、注射、直腸内などいずれの方法を用いてもか
まわないが、注射による投与が好ましい。投与量は、投
与方法、患者の症状、年齢などにより異なるが、通常１
回0.001〜1000mg、好ましくは0.01〜10mgを１日当り１
〜３回投与すればよい。
【００３６】以下本発明を実施例に基づいて更に詳細に
説明する。尚、本発明は実施例に限定されるものではな
い。
説明する。尚、本発明は実施例に限定されるものではな
い。
【００３７】
（実施例１、細胞外領域のみからなるリコンビナントヒ
トＩＬ−２レセプターγ鎖ポリペプチドの調製）細胞外
領域の３’端にｓｔｏｐコドンを持つＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖ｃＤＮＡを調製するため、内部にＮｄｅＩサイト
を有するオリゴマー5'-GGACATATGCTGAACACGACAATTCTG-
3'（配列番号：３）と内部にＨｉｎｄIIIサイトを有す
るオリゴマー5'-GAAAAGCTTCTATTATGAAGTATTGCTCC-3'
（配列番号：４）をＤＮＡ合成機３８０Ａにより合成し
た。両オリゴマーをプライマーとし、ＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖分子のｃＤＮＡを含むプラスミド（本プラスミド
で形質転換された大腸菌は、通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２００と
して寄託されている）を鋳型としてサーマルサイクラー
を用い、TaqポリメラーゼによるＰＣＲ（変性９４℃、
アニール５５℃、合成７２℃、２０サイクル）を行っ
た。約０．７ｋｂの増幅されたバンドを回収して、Ｎｄ
ｅＩとＨｉｎｄIII（宝酒造社製）にて切断後、プラス
ミドｐＦｖ（ＴＵ２７）−ＤＥ（本プラスミドで形質転
換された大腸菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３９７３として寄託
されている）をＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで切断し回収し
た大きな断片とライゲーションし、ｐＩＬ−２ＲＧＳを
構築した（図１）。ｐＩＬ−２ＲＧＳで形質転換された
大腸菌ＨＢ１０１をＭ９−カザミノ酸培地にて培養し、
大腸菌の菌体内に顆粒として発現させた。大腸菌を超音
波破砕し、３，０００ｘｇで遠心分離する事により顆粒
を分離した。更に、顆粒を６Ｍグアニジン塩酸にて溶解
した後、最終濃度が３，５Ｍグアニジン塩酸、３０μＭ
還元型グルタチオン、３μＭ酸化型グルタチオン存在
下、蛋白濃度が５０μｇ／ｍｌの条件で、室温で一晩攪
拌することにより巻戻しを行い、１５０ｍＭＮａＣｌを
含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）（以下、ＰＢ
Ｓと略す）に対して透析する事により、可溶性の細胞外
領域のみからなるリコンビナントヒトＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖ポリペプチドを調製した。
トＩＬ−２レセプターγ鎖ポリペプチドの調製）細胞外
領域の３’端にｓｔｏｐコドンを持つＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖ｃＤＮＡを調製するため、内部にＮｄｅＩサイト
を有するオリゴマー5'-GGACATATGCTGAACACGACAATTCTG-
3'（配列番号：３）と内部にＨｉｎｄIIIサイトを有す
るオリゴマー5'-GAAAAGCTTCTATTATGAAGTATTGCTCC-3'
（配列番号：４）をＤＮＡ合成機３８０Ａにより合成し
た。両オリゴマーをプライマーとし、ＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖分子のｃＤＮＡを含むプラスミド（本プラスミド
で形質転換された大腸菌は、通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２００と
して寄託されている）を鋳型としてサーマルサイクラー
を用い、TaqポリメラーゼによるＰＣＲ（変性９４℃、
アニール５５℃、合成７２℃、２０サイクル）を行っ
た。約０．７ｋｂの増幅されたバンドを回収して、Ｎｄ
ｅＩとＨｉｎｄIII（宝酒造社製）にて切断後、プラス
ミドｐＦｖ（ＴＵ２７）−ＤＥ（本プラスミドで形質転
換された大腸菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３９７３として寄託
されている）をＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで切断し回収し
た大きな断片とライゲーションし、ｐＩＬ−２ＲＧＳを
構築した（図１）。ｐＩＬ−２ＲＧＳで形質転換された
大腸菌ＨＢ１０１をＭ９−カザミノ酸培地にて培養し、
大腸菌の菌体内に顆粒として発現させた。大腸菌を超音
波破砕し、３，０００ｘｇで遠心分離する事により顆粒
を分離した。更に、顆粒を６Ｍグアニジン塩酸にて溶解
した後、最終濃度が３，５Ｍグアニジン塩酸、３０μＭ
還元型グルタチオン、３μＭ酸化型グルタチオン存在
下、蛋白濃度が５０μｇ／ｍｌの条件で、室温で一晩攪
拌することにより巻戻しを行い、１５０ｍＭＮａＣｌを
含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）（以下、ＰＢ
Ｓと略す）に対して透析する事により、可溶性の細胞外
領域のみからなるリコンビナントヒトＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖ポリペプチドを調製した。
【００３８】（実施例２、ハイブリドーマの調製）６〜
８週令の雌のBALB/cマウスに、細胞外領域のみからなる
リコンビナントヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ポリペプチ
ドを１匹あたり１００μｇずつフロインドの完全アジュ
バント（バクト社製）とともに皮下投与することにより
免疫した。３週間おきに同様の操作により２回追加免疫
し、マウスの眼窩静脈より採血して、後に述べる方法に
従って、細胞外領域のみからなるリコンビナントヒトＩ
Ｌ−２レセプターγ鎖ポリペプチドへの結合量を調べる
ことにより抗体価を測定した。抗体価の高かったマウス
を更に同様の操作にて最終免疫し、その３日後、脾臓を
摘出して脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞（SP2/0-Ag14）と
を、５０％ポリエチレングリコール＃４０００（ナカラ
イテスク社製）存在下にて、細胞数にして１０：１の割
合で混合し細胞融合させた。融合細胞を、１０％牛胎児
血清（ギブコ社製）を含むRPMI1640培地（ギブコ社製）
にて５Ｘ１０6個／ｍｌとなるように懸濁し、１穴あた
り５Ｘ１０5個のマウス胸腺細胞を含有する９６穴平底
プレート（コーニング社製）に１００μｌずつ分注し
た。１日、２日、３日、６日後に培地の半量をヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地（ＨＡＴ
培地）と交換し、以後３日ごとに同様の操作を繰り返し
た。融合より約２週間後、融合した細胞（ハイブリドー
マ）の増殖してきた各穴の培養上清に含まれる抗体の、
Ｌγ細胞とＬβ細胞への結合量を測定し、Ｌγ細胞にの
み結合するハイブリドーマを、限界希釈法にてクローン
化した。
８週令の雌のBALB/cマウスに、細胞外領域のみからなる
リコンビナントヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ポリペプチ
ドを１匹あたり１００μｇずつフロインドの完全アジュ
バント（バクト社製）とともに皮下投与することにより
免疫した。３週間おきに同様の操作により２回追加免疫
し、マウスの眼窩静脈より採血して、後に述べる方法に
従って、細胞外領域のみからなるリコンビナントヒトＩ
Ｌ−２レセプターγ鎖ポリペプチドへの結合量を調べる
ことにより抗体価を測定した。抗体価の高かったマウス
を更に同様の操作にて最終免疫し、その３日後、脾臓を
摘出して脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞（SP2/0-Ag14）と
を、５０％ポリエチレングリコール＃４０００（ナカラ
イテスク社製）存在下にて、細胞数にして１０：１の割
合で混合し細胞融合させた。融合細胞を、１０％牛胎児
血清（ギブコ社製）を含むRPMI1640培地（ギブコ社製）
にて５Ｘ１０6個／ｍｌとなるように懸濁し、１穴あた
り５Ｘ１０5個のマウス胸腺細胞を含有する９６穴平底
プレート（コーニング社製）に１００μｌずつ分注し
た。１日、２日、３日、６日後に培地の半量をヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地（ＨＡＴ
培地）と交換し、以後３日ごとに同様の操作を繰り返し
た。融合より約２週間後、融合した細胞（ハイブリドー
マ）の増殖してきた各穴の培養上清に含まれる抗体の、
Ｌγ細胞とＬβ細胞への結合量を測定し、Ｌγ細胞にの
み結合するハイブリドーマを、限界希釈法にてクローン
化した。
【００３９】更に同様の方法により、それぞれのハイブ
リドーマクローンの培養上清中の細胞への結合量を測定
して、抗ＩＬ−２レセプターγ鎖抗体産生ハイブリドー
マを得た。更に、得られた抗ＩＬ−２レセプターγ鎖抗
体産生ハイブリドーマの培養上清について、以下の方法
にてＩＬ−２の生理活性の抑制能を調べた。１０％牛胎
児血清（ＦＣＳ）を含むRPMI1640培地にて２Ｘ１０5個
／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT-Mat細胞液を１
穴当たり１００μｌずつ９６穴平底マイクロプレートに
分注して、サンプルの培養上清を５０μｌ加え、更に１
０％ＦＣＳを含むRPMI1640培地にて２００ｕ／ｍｌに調
製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μｌずつ
加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培養し
た。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポ
ン社製）を加えて培養し、細胞内に取り込まれた放射活
性量をシンチレーシンカウンター（パッカード社製）に
て測定することにより、培養上清によるＩＬ−２の生理
活性の阻害能を調べた。このような方法にてＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子に対する抗体を産生するハイブリドー
マを調製した。こうして得られたハイブリドーマとして
ＧＰ−２（ＦＥＲＭＰ−１３５７６、ＢＰ−４６４
１）、ＧＰ−４（ＦＥＲＭ Ｐ−１３５７５、ＢＰ−４
６４０）、ＴＵＧｈ４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０１１、Ｂ
Ｐ−４６４２）、ＴＵＧｈ５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０１
２、ＢＰ−４６４３）および、ＡＧ１４（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４６４８）がある。ハイブリドーマＧＰ−２が産生
する抗体をＧＰ−２抗体と呼び、ハイブリドーマＧＰ−
４が産生する抗体をＧＰ−４抗体と呼ぶ。ハイブリドー
マＴＵＧｈ４が産生する抗体をＴＵＧｈ４抗体と呼び、
ハイブリドーマＴＵＧｈ５が産生する抗体をＴＵＧｈ５
抗体と呼ぶ。ハイブリドーマＡＧ１４が産生する抗体を
ＡＧ１４抗体と呼ぶ。
リドーマクローンの培養上清中の細胞への結合量を測定
して、抗ＩＬ−２レセプターγ鎖抗体産生ハイブリドー
マを得た。更に、得られた抗ＩＬ−２レセプターγ鎖抗
体産生ハイブリドーマの培養上清について、以下の方法
にてＩＬ−２の生理活性の抑制能を調べた。１０％牛胎
児血清（ＦＣＳ）を含むRPMI1640培地にて２Ｘ１０5個
／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT-Mat細胞液を１
穴当たり１００μｌずつ９６穴平底マイクロプレートに
分注して、サンプルの培養上清を５０μｌ加え、更に１
０％ＦＣＳを含むRPMI1640培地にて２００ｕ／ｍｌに調
製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μｌずつ
加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培養し
た。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポ
ン社製）を加えて培養し、細胞内に取り込まれた放射活
性量をシンチレーシンカウンター（パッカード社製）に
て測定することにより、培養上清によるＩＬ−２の生理
活性の阻害能を調べた。このような方法にてＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子に対する抗体を産生するハイブリドー
マを調製した。こうして得られたハイブリドーマとして
ＧＰ−２（ＦＥＲＭＰ−１３５７６、ＢＰ−４６４
１）、ＧＰ−４（ＦＥＲＭ Ｐ−１３５７５、ＢＰ−４
６４０）、ＴＵＧｈ４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０１１、Ｂ
Ｐ−４６４２）、ＴＵＧｈ５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０１
２、ＢＰ−４６４３）および、ＡＧ１４（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４６４８）がある。ハイブリドーマＧＰ−２が産生
する抗体をＧＰ−２抗体と呼び、ハイブリドーマＧＰ−
４が産生する抗体をＧＰ−４抗体と呼ぶ。ハイブリドー
マＴＵＧｈ４が産生する抗体をＴＵＧｈ４抗体と呼び、
ハイブリドーマＴＵＧｈ５が産生する抗体をＴＵＧｈ５
抗体と呼ぶ。ハイブリドーマＡＧ１４が産生する抗体を
ＡＧ１４抗体と呼ぶ。
【００４０】（実施例３、抗体のＶ領域のみをコードす
るｃＤＮＡの調製）５Ｘ１０6個のハイブリドーマＧＰ
−２、あるいはＧＰ−４をPBSにて洗浄後、guanidine t
hiocyanate, N-lauryl sarcosine 及び EDTAを含むＲＮ
Ａ抽出用緩衝液（ファルマシア社製）に懸濁した。ハイ
ブリドーマ懸濁液をCesium Cloride溶液（ρ=1.51g/ml,
ファルマシア社製）が入ったチューブに重層し、１２
５，０００ｘｇにて１６時間遠心した。ハイブリドーマ
懸濁液とCesium Cloride溶液は等容量とした。上清を吸
い取ったのち、残部に１ｍＭ EDTAを含む１０ｍＭトリ
ス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて懸濁を行い、懸
濁液を新しいチューブに入れ、６５℃で５分間インキュ
ベートした。これに、１／１０容量の２Ｍ Potassium A
cetate（ｐＨ５．０）（ファルマシア社製）と３倍容量
のエタノール（ナカライテスク社製）を加えて、−２０
℃で一晩放置した。５，０００ｘｇにて２０分間の遠心
分離を行った後上清を捨て、得られた沈澱を８０％エタ
ノールにて洗浄し、沈澱を乾燥させた。沈澱を１ｍＭ E
DTAを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）
にて溶解してtotalＲＮＡ画分溶液とした。
るｃＤＮＡの調製）５Ｘ１０6個のハイブリドーマＧＰ
−２、あるいはＧＰ−４をPBSにて洗浄後、guanidine t
hiocyanate, N-lauryl sarcosine 及び EDTAを含むＲＮ
Ａ抽出用緩衝液（ファルマシア社製）に懸濁した。ハイ
ブリドーマ懸濁液をCesium Cloride溶液（ρ=1.51g/ml,
ファルマシア社製）が入ったチューブに重層し、１２
５，０００ｘｇにて１６時間遠心した。ハイブリドーマ
懸濁液とCesium Cloride溶液は等容量とした。上清を吸
い取ったのち、残部に１ｍＭ EDTAを含む１０ｍＭトリ
ス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて懸濁を行い、懸
濁液を新しいチューブに入れ、６５℃で５分間インキュ
ベートした。これに、１／１０容量の２Ｍ Potassium A
cetate（ｐＨ５．０）（ファルマシア社製）と３倍容量
のエタノール（ナカライテスク社製）を加えて、−２０
℃で一晩放置した。５，０００ｘｇにて２０分間の遠心
分離を行った後上清を捨て、得られた沈澱を８０％エタ
ノールにて洗浄し、沈澱を乾燥させた。沈澱を１ｍＭ E
DTAを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）
にて溶解してtotalＲＮＡ画分溶液とした。
【００４１】次に、totalＲＮＡ画分溶液に、抗体のＨ
鎖のＶ領域の３’側プライマー溶液（最終濃度で１μ
Ｍ）、Ｌ鎖のＶ領域の３’側プライマー溶液（最終濃度
で１μＭ）、deoxyNTP混合液、ｃＤＮＡ合成用緩衝液
（アマシャム社製）、RNAase Inhibitor（宝酒造社
製）、及びReverse Transcriptase（宝酒造社製）を加
えて４２℃にて１時間反応させｃＤＮＡを合成した。得
られたｃＤＮＡに、抗体Ｈ鎖Ｖ領域のみをコードするｃ
ＤＮＡを増幅するために用いる５’側プライマー及び
３’側プライマー（それぞれ最終濃度１μＭ）、及び抗
体Ｌ鎖Ｖ領域のみをコードするｃＤＮＡを増幅するため
に用いる５’側プライマー及び３’側プライマー（それ
ぞれ最終濃度１μＭ）、deoxy ＮＴＰ混合液、ＰＣＲ用
緩衝液（シータス社製）及びTaq Polymerase（宝酒造社
製）を加えＰＣＲ（シータス社、サーマルサイクラー）
を行った。反応は変性３０秒（９４℃）、アニール３０
秒（５５℃）、プライマーイクステンション１分（７２
℃）にて３０サイクル行い、各サイクル毎にプライマー
イクステンションの時間を１５秒ずつ延長させた。反応
後、１ｍＭ EDTAを含む４０ｍＭトリス酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、該
当するｃＤＮＡフラグメントを切り出し、ジーンクリー
ンキット（バイオ１０１社製）を用いて抽出・精製し
た。なお、ｃＤＮＡの合成、及びＰＣＲに用いたプライ
マーの配列を図２に示した（配列番号：５−８）。
鎖のＶ領域の３’側プライマー溶液（最終濃度で１μ
Ｍ）、Ｌ鎖のＶ領域の３’側プライマー溶液（最終濃度
で１μＭ）、deoxyNTP混合液、ｃＤＮＡ合成用緩衝液
（アマシャム社製）、RNAase Inhibitor（宝酒造社
製）、及びReverse Transcriptase（宝酒造社製）を加
えて４２℃にて１時間反応させｃＤＮＡを合成した。得
られたｃＤＮＡに、抗体Ｈ鎖Ｖ領域のみをコードするｃ
ＤＮＡを増幅するために用いる５’側プライマー及び
３’側プライマー（それぞれ最終濃度１μＭ）、及び抗
体Ｌ鎖Ｖ領域のみをコードするｃＤＮＡを増幅するため
に用いる５’側プライマー及び３’側プライマー（それ
ぞれ最終濃度１μＭ）、deoxy ＮＴＰ混合液、ＰＣＲ用
緩衝液（シータス社製）及びTaq Polymerase（宝酒造社
製）を加えＰＣＲ（シータス社、サーマルサイクラー）
を行った。反応は変性３０秒（９４℃）、アニール３０
秒（５５℃）、プライマーイクステンション１分（７２
℃）にて３０サイクル行い、各サイクル毎にプライマー
イクステンションの時間を１５秒ずつ延長させた。反応
後、１ｍＭ EDTAを含む４０ｍＭトリス酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、該
当するｃＤＮＡフラグメントを切り出し、ジーンクリー
ンキット（バイオ１０１社製）を用いて抽出・精製し
た。なお、ｃＤＮＡの合成、及びＰＣＲに用いたプライ
マーの配列を図２に示した（配列番号：５−８）。
【００４２】（実施例４、発現ベクターの構築）図４に
示すように、まずpT13SNco（本プラスミドを含有する
Ｅ． ｃｏｌｉＡＪ−１２４４７は、ＦＥＲＭ Ｐ−１
０７５７、ＢＰ−４６３５ として通産省工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託されている。）［J. Bioch
em.,１０４巻, ３０頁, １９８８年に記載］を制限酵素
ＣｌａＩ及びＢａｍＨＩ（いずれも宝酒造社製）にて切
断して得られる大きいＤＮＡ断片と、図３に示された配
列を有するＤＮＡ断片（リンカー、配列番号９、１
０））とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて
連結した。図３に示された配列を有するＤＮＡ断片はＤ
ＮＡ合成機で作成した。
示すように、まずpT13SNco（本プラスミドを含有する
Ｅ． ｃｏｌｉＡＪ−１２４４７は、ＦＥＲＭ Ｐ−１
０７５７、ＢＰ−４６３５ として通産省工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託されている。）［J. Bioch
em.,１０４巻, ３０頁, １９８８年に記載］を制限酵素
ＣｌａＩ及びＢａｍＨＩ（いずれも宝酒造社製）にて切
断して得られる大きいＤＮＡ断片と、図３に示された配
列を有するＤＮＡ断片（リンカー、配列番号９、１
０））とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて
連結した。図３に示された配列を有するＤＮＡ断片はＤ
ＮＡ合成機で作成した。
【００４３】次に、プラスミドpT13SNcoに由来するＣｌ
ａＩ−ＢａｍＨＩ大断片と合成ＤＮＡ断片を連結して得
られるプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｖｕII（い
ずれも宝酒造社製）にて切断し、小さいＤＮＡ断片（便
宜的にＡ断片と命名する）を得る。一方、ｐＵＣ１８
（Methods in Enzymology, １０１巻, ２０頁, １９８
３年）を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼ（宝酒造社製）を用いて切断面を平滑化し、
更にＴ４リガーゼを用いて自己連結させて、ＨｉｎｄII
Iサイトを消失させる。ＨｉｎｄIIIサイトが消失したｐ
ＵＣ１８を制限酵素ＮｄｅＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ（宝酒造社製）を用いて切断面を平滑化し、更
にＴ４リガーゼを用いて自己連結させて、ＮｄｅＩサイ
トを消失させる。ＨｉｎｄIIIサイトとＮｄｅＩサイト
が消失したｐＵＣ１８を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｃII（宝
酒造社製）にて切断して得られる大きいＤＮＡ断片と、
Ａ断片とをＴ４リガーゼにて連結することにより、複製
起点をpUC系のものとするプラスミド pFv-DEを得た。
ａＩ−ＢａｍＨＩ大断片と合成ＤＮＡ断片を連結して得
られるプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｖｕII（い
ずれも宝酒造社製）にて切断し、小さいＤＮＡ断片（便
宜的にＡ断片と命名する）を得る。一方、ｐＵＣ１８
（Methods in Enzymology, １０１巻, ２０頁, １９８
３年）を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼ（宝酒造社製）を用いて切断面を平滑化し、
更にＴ４リガーゼを用いて自己連結させて、ＨｉｎｄII
Iサイトを消失させる。ＨｉｎｄIIIサイトが消失したｐ
ＵＣ１８を制限酵素ＮｄｅＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ（宝酒造社製）を用いて切断面を平滑化し、更
にＴ４リガーゼを用いて自己連結させて、ＮｄｅＩサイ
トを消失させる。ＨｉｎｄIIIサイトとＮｄｅＩサイト
が消失したｐＵＣ１８を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｃII（宝
酒造社製）にて切断して得られる大きいＤＮＡ断片と、
Ａ断片とをＴ４リガーゼにて連結することにより、複製
起点をpUC系のものとするプラスミド pFv-DEを得た。
【００４４】（実施例５、pFv-DEへの抗体Ｖ領域ｃＤＮ
Ａの組み込み、及びＶ領域のみからなる抗体生産菌の調
製）図５に示すように、まずpFv-DEを制限酵素ＮｄｅＩ
及びＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断して大きいＤＮＡ断
片を得た。この大きいＤＮＡ断片と、実施例３で得られ
たＧＰ−２のＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＳａｌ
Ｉで切断した断片とをＴ４リガーゼを用いて連結した。
また、同様にして、大きいＤＮＡ断片と、実施例３で得
られたＧＰ−４のＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＳ
ａｌＩで切断した断片とをＴ４リガーゼを用いて連結し
た。こうして得られた２種のプラスミドを、それぞれ制
限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIII（宝酒造社製）で切断
して大きいＤＮＡ断片をそれぞれ調製した。大きいＤＮ
Ａ断片のうちＧＰ−２のＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを含むもの
と、実施例３で得られたＧＰ−２のＨ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡ
をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIで切断した断片とをＴ４リ
ガーゼを用いて連結した。また、同様にして、大きいＤ
ＮＡ断片のうちＧＰ−４のＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを含むも
のと、実施例３で得られたＧＰ−４のＨ鎖Ｖ領域ｃＤＮ
ＡをＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIで切断した断片とをＴ４
リガーゼを用いて連結した。こうして、Ｖ領域のみから
なる抗体を発現する２種のプラスミド、すなわちpFv(GP
-2)-DE 及び pFv(GP-4)-DE をそれぞれ取得した。続い
てそれぞれのプラスミドで大腸菌HB101株を形質転換
し、Ｖ領域のみからなる抗体を生産する株として、E. c
oli pFv(GP-2)-DE/HB101（ＡＪ−１２８４４， ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３６０７、ＢＰ−４６３６）、及び E. coli
pFv(GP-4)-DE/HB101（ＡＪ−１２８４５， ＦＥＲＭ
Ｐ−１３６０８、ＢＰ−４６３７）を得た。
Ａの組み込み、及びＶ領域のみからなる抗体生産菌の調
製）図５に示すように、まずpFv-DEを制限酵素ＮｄｅＩ
及びＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断して大きいＤＮＡ断
片を得た。この大きいＤＮＡ断片と、実施例３で得られ
たＧＰ−２のＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＳａｌ
Ｉで切断した断片とをＴ４リガーゼを用いて連結した。
また、同様にして、大きいＤＮＡ断片と、実施例３で得
られたＧＰ−４のＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＳ
ａｌＩで切断した断片とをＴ４リガーゼを用いて連結し
た。こうして得られた２種のプラスミドを、それぞれ制
限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIII（宝酒造社製）で切断
して大きいＤＮＡ断片をそれぞれ調製した。大きいＤＮ
Ａ断片のうちＧＰ−２のＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを含むもの
と、実施例３で得られたＧＰ−２のＨ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡ
をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIで切断した断片とをＴ４リ
ガーゼを用いて連結した。また、同様にして、大きいＤ
ＮＡ断片のうちＧＰ−４のＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを含むも
のと、実施例３で得られたＧＰ−４のＨ鎖Ｖ領域ｃＤＮ
ＡをＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIで切断した断片とをＴ４
リガーゼを用いて連結した。こうして、Ｖ領域のみから
なる抗体を発現する２種のプラスミド、すなわちpFv(GP
-2)-DE 及び pFv(GP-4)-DE をそれぞれ取得した。続い
てそれぞれのプラスミドで大腸菌HB101株を形質転換
し、Ｖ領域のみからなる抗体を生産する株として、E. c
oli pFv(GP-2)-DE/HB101（ＡＪ−１２８４４， ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３６０７、ＢＰ−４６３６）、及び E. coli
pFv(GP-4)-DE/HB101（ＡＪ−１２８４５， ＦＥＲＭ
Ｐ−１３６０８、ＢＰ−４６３７）を得た。
【００４５】（実施例６、Ｖ領域のみからなる抗体生産
菌より、生産物の取得）得られた形質転換株 E. coli
pFv(GP-2)-DE/HB101（ＡＪ−１２８４４、ＦＥＲＭ Ｐ
−１３６０７、ＢＰ−４６３６）及び E. coli pFv(GP-
4)-DE/HB101（ＡＪ−１２８４５， ＦＥＲＭ Ｐ−１
３６０８、ＢＰ−４６３７）それぞれを、５０μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含む２ｘＴＹ［１．６％トリプト
ン、１％酵母エキス、（以上バクト社製）、０．５％Na
OH、ｐＨ７．０］５ｍｌ中で３７℃の条件下で一晩生育
させた。ついで、その培養懸濁液５ｍｌを１００ｍｌの
Ｍ９−カザミノ酸培地（０．６％Na2HPO4・12H2O、０．
３％KH2PO4、０．０５％NaCl、０．１％NH4Cl、０．０
５％MgSO4・7H20、０．００１４７％CaCl2、０．２％グ
ルコース、０．２％カザミノ酸、０．０２％L-ロイシ
ン、０．０２％L-プロリン、０．０００２％チアミン塩
酸塩、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ６．９）へ
接種し、３７℃にて３時間培養した。その後、終濃度が
２５μｇ／ｍｌとなるように3-インドールアクリル酸
（IAA）を添加し、更に３７℃にて２０時間誘導培養し
た。菌体懸濁液の一部を位相差顕微鏡により約１５００
倍に拡大して観察すると、大腸菌体内に顆粒が形成され
ていることが認められた。
菌より、生産物の取得）得られた形質転換株 E. coli
pFv(GP-2)-DE/HB101（ＡＪ−１２８４４、ＦＥＲＭ Ｐ
−１３６０７、ＢＰ−４６３６）及び E. coli pFv(GP-
4)-DE/HB101（ＡＪ−１２８４５， ＦＥＲＭ Ｐ−１
３６０８、ＢＰ−４６３７）それぞれを、５０μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含む２ｘＴＹ［１．６％トリプト
ン、１％酵母エキス、（以上バクト社製）、０．５％Na
OH、ｐＨ７．０］５ｍｌ中で３７℃の条件下で一晩生育
させた。ついで、その培養懸濁液５ｍｌを１００ｍｌの
Ｍ９−カザミノ酸培地（０．６％Na2HPO4・12H2O、０．
３％KH2PO4、０．０５％NaCl、０．１％NH4Cl、０．０
５％MgSO4・7H20、０．００１４７％CaCl2、０．２％グ
ルコース、０．２％カザミノ酸、０．０２％L-ロイシ
ン、０．０２％L-プロリン、０．０００２％チアミン塩
酸塩、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ６．９）へ
接種し、３７℃にて３時間培養した。その後、終濃度が
２５μｇ／ｍｌとなるように3-インドールアクリル酸
（IAA）を添加し、更に３７℃にて２０時間誘導培養し
た。菌体懸濁液の一部を位相差顕微鏡により約１５００
倍に拡大して観察すると、大腸菌体内に顆粒が形成され
ていることが認められた。
【００４６】続いて上記の如く培養した菌体懸濁液を遠
心分離機にかけ菌体を集め、２倍濃縮となるように、３
０ｍＭ NaClを含む２０ｍＭTris-HCl緩衝液（ｐＨ７．
５）を添加して懸濁を行った。懸濁液に、１ｍｇ／ｍｌ
濃度のリゾチームを含む０．５Ｍ EDTA（ｐＨ８．０）
水溶液３７．５ｍｌを添加し、攪はんした後、氷中にて
１時間放置した。ついで超音波破砕で菌体を破壊し、６
０００ｒｐｍ，５分間の遠心分離を行うことにより顆粒
を回収した。この顆粒を６Ｍ塩酸グアニジン溶液中に可
溶化し、さらに溶液の濃度の調製を行って目的ポリペプ
チド濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにし、かつ塩酸
グアニジン濃度が３．５Ｍとなるようにした。その後、
これに酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンを添加
し、それぞれの終濃度が３μＭおよび３０μＭとなるよ
うにした。続いて、ｐＨを８．０に調整した後、室温で
１０〜１６時間放置した。最後に、ＰＢＳを用いて透析
を行い、目的とするＶ領域のみからなる抗体を得た。得
られた２種の抗体をそれぞれポリペプチドFv(GP-2)及び
ポリペプチドFv(GP-4)と命名した。両ポリペプチドの分
子量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により決
定した。その分子量は後述の実施例７に従って推定され
たアミノ酸配列から計算される値とそれぞれほぼ一致し
た。また、プロテインシークエンサーにてＮ末端側のア
ミノ酸配列を検定した。両ポリペプチドとも、後述の実
施例７で予想されたアミノ酸配列と同一の配列を有する
ことが確認された。
心分離機にかけ菌体を集め、２倍濃縮となるように、３
０ｍＭ NaClを含む２０ｍＭTris-HCl緩衝液（ｐＨ７．
５）を添加して懸濁を行った。懸濁液に、１ｍｇ／ｍｌ
濃度のリゾチームを含む０．５Ｍ EDTA（ｐＨ８．０）
水溶液３７．５ｍｌを添加し、攪はんした後、氷中にて
１時間放置した。ついで超音波破砕で菌体を破壊し、６
０００ｒｐｍ，５分間の遠心分離を行うことにより顆粒
を回収した。この顆粒を６Ｍ塩酸グアニジン溶液中に可
溶化し、さらに溶液の濃度の調製を行って目的ポリペプ
チド濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにし、かつ塩酸
グアニジン濃度が３．５Ｍとなるようにした。その後、
これに酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンを添加
し、それぞれの終濃度が３μＭおよび３０μＭとなるよ
うにした。続いて、ｐＨを８．０に調整した後、室温で
１０〜１６時間放置した。最後に、ＰＢＳを用いて透析
を行い、目的とするＶ領域のみからなる抗体を得た。得
られた２種の抗体をそれぞれポリペプチドFv(GP-2)及び
ポリペプチドFv(GP-4)と命名した。両ポリペプチドの分
子量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により決
定した。その分子量は後述の実施例７に従って推定され
たアミノ酸配列から計算される値とそれぞれほぼ一致し
た。また、プロテインシークエンサーにてＮ末端側のア
ミノ酸配列を検定した。両ポリペプチドとも、後述の実
施例７で予想されたアミノ酸配列と同一の配列を有する
ことが確認された。
【００４７】（実施例７、塩基配列の決定、及びアミノ
酸配列の推定）構築したＶ領域のみからなるポリペプチ
ドを発現するプラスミドpFv(GP-2)-DE、及びpFv(GP-4)-
DEをアルカリＳＤＳ法にて精製し、市販されているシー
クエンス用プライマーＭ４、あるいはＲＶ（宝酒造社
製）を用い、7-DEAZAシークエンスキット（宝酒造社
製）にて塩基配列を決定した。得られた塩基配列よりア
ミノ酸配列配列を推定した。なお、配列表の配列番号１
にポリペプチドFv(GP-2)をコードするＤＮＡの塩基配列
を示した。また、同塩基配列より推定されるアミノ酸配
列を併記した。配列表の配列番号２にポリペプチドFv(G
P-4)をコードするＤＮＡの塩基配列を示した。また、同
塩基配列より推定されるアミノ酸配列を併記した。配列
表の配列番号１に示されるように、ポリペプチドFv(GP-
2)はＮ末端にMetを、Ｃ末端にSerを有する２４４個のア
ミノ酸からなるポリペプチドである。また、ポリペプチ
ドFv(GP-4)はＮ末端にMetを、Ｃ末端にSerを有する２４
３個のアミノ酸からなるポリペプチドである。ＧＰ−２
が産生する抗体のＬ鎖Ｖ領域は配列表の配列番号１に示
されるアミノ酸配列のうち、２番目から１０９番目に至
る配列に当たり、Ｈ鎖Ｖ領域は１２４番目から２４４番
目に至る配列に当たる。ＧＰ−４が産生する抗体のＬ鎖
Ｖ領域は配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の
うち、２番目から１０８番目に至る配列に当たり、Ｈ鎖
Ｖ領域は１２３番目から２４３番目に至る配列に当た
る。
酸配列の推定）構築したＶ領域のみからなるポリペプチ
ドを発現するプラスミドpFv(GP-2)-DE、及びpFv(GP-4)-
DEをアルカリＳＤＳ法にて精製し、市販されているシー
クエンス用プライマーＭ４、あるいはＲＶ（宝酒造社
製）を用い、7-DEAZAシークエンスキット（宝酒造社
製）にて塩基配列を決定した。得られた塩基配列よりア
ミノ酸配列配列を推定した。なお、配列表の配列番号１
にポリペプチドFv(GP-2)をコードするＤＮＡの塩基配列
を示した。また、同塩基配列より推定されるアミノ酸配
列を併記した。配列表の配列番号２にポリペプチドFv(G
P-4)をコードするＤＮＡの塩基配列を示した。また、同
塩基配列より推定されるアミノ酸配列を併記した。配列
表の配列番号１に示されるように、ポリペプチドFv(GP-
2)はＮ末端にMetを、Ｃ末端にSerを有する２４４個のア
ミノ酸からなるポリペプチドである。また、ポリペプチ
ドFv(GP-4)はＮ末端にMetを、Ｃ末端にSerを有する２４
３個のアミノ酸からなるポリペプチドである。ＧＰ−２
が産生する抗体のＬ鎖Ｖ領域は配列表の配列番号１に示
されるアミノ酸配列のうち、２番目から１０９番目に至
る配列に当たり、Ｈ鎖Ｖ領域は１２４番目から２４４番
目に至る配列に当たる。ＧＰ−４が産生する抗体のＬ鎖
Ｖ領域は配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の
うち、２番目から１０８番目に至る配列に当たり、Ｈ鎖
Ｖ領域は１２３番目から２４３番目に至る配列に当た
る。
【００４８】（実施例８、抗体ＧＰ−２、抗体ＧＰ−
４、ポリペプチドFv(GP-2)、及びポリペプチドFv(GP-4)
の活性の検定）１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培
地にて２ｘ１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したI
LT-Mat細胞液を９６穴平底マイクロプレート上の各穴に
分注した。ILT-Mat細胞液の分注量は１穴当たり１００
μｌずつとした。そこに各サンプル溶液を添加した。添
加するサンプル溶液の容量は５０μｌであり、それぞれ
に含まれる抗体あるいはポリペプチドの量は、それぞれ
４０μｇ／ｍｌであった。３７℃、３０分間インキュベ
ートし、更に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地
を用いて種々の濃度に調製したヒトリコンビナントＩＬ
−２溶液を５０μｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７
℃にて４８時間培養した。最後の４時間は１μＣｉの3
Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加えて培養した。細胞
内に取り込まれた放射活性量をシンチレーションカウン
ター（パッカード社製）にて測定することにより、抗体
ＧＰ−２、抗体ＧＰ−４、ポリペプチドFv(GP-2)、及び
ポリペプチドFv(GP-4)の応答遮断能を調べた。その結果
図６に示す通り、抗体ＧＰ−２、抗体ＧＰ−４、ポリペ
プチドFv(GP-2)、及びポリペプチドFv(GP-4)は、それぞ
れILT-Mat細胞のＩＬ−２応答を遮断する活性を有して
いることが明らかとなった。
４、ポリペプチドFv(GP-2)、及びポリペプチドFv(GP-4)
の活性の検定）１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培
地にて２ｘ１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したI
LT-Mat細胞液を９６穴平底マイクロプレート上の各穴に
分注した。ILT-Mat細胞液の分注量は１穴当たり１００
μｌずつとした。そこに各サンプル溶液を添加した。添
加するサンプル溶液の容量は５０μｌであり、それぞれ
に含まれる抗体あるいはポリペプチドの量は、それぞれ
４０μｇ／ｍｌであった。３７℃、３０分間インキュベ
ートし、更に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地
を用いて種々の濃度に調製したヒトリコンビナントＩＬ
−２溶液を５０μｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７
℃にて４８時間培養した。最後の４時間は１μＣｉの3
Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加えて培養した。細胞
内に取り込まれた放射活性量をシンチレーションカウン
ター（パッカード社製）にて測定することにより、抗体
ＧＰ−２、抗体ＧＰ−４、ポリペプチドFv(GP-2)、及び
ポリペプチドFv(GP-4)の応答遮断能を調べた。その結果
図６に示す通り、抗体ＧＰ−２、抗体ＧＰ−４、ポリペ
プチドFv(GP-2)、及びポリペプチドFv(GP-4)は、それぞ
れILT-Mat細胞のＩＬ−２応答を遮断する活性を有して
いることが明らかとなった。
【００４９】（実施例９、抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗
体、抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体共存下における、モ
ノクローナル抗体ＧＰ−２のＩＬ−２応答遮断活性の検
定）１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて４ｘ
１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT-Mat細胞
液を９６穴平底マイクロプレート上の各穴に分注した。
ILT-Mat細胞液の分注量は１穴当たり１００μｌずつと
した。そこに各サンプル溶液を添加した。添加するサン
プル溶液の容量は５０μｌであり、それぞれに含まれる
抗体ＧＰ−２、抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体および抗
ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体の量は、それぞれ４０μｇ
／ｍｌであった。３７℃、３０分間インキュベートし、
更に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて
種々の濃度に調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液
を５０μｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４
８時間培養した。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミ
ジン（デュポン社製）を加えて培養した。細胞内に取り
込まれた放射活性量をシンチレーションカウンター（パ
ッカード社製）にて測定することにより、抗ＩＬ−２レ
セプターα鎖抗体及び／又は抗ＩＬ−２レセプターβ鎖
抗体と共存させた場合の抗体ＧＰ−２の応答遮断能を調
べた。その結果図７に示す通り、モノクローナル抗体Ｇ
Ｐ−２は、抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体及び／又は抗
ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体を共存することにより、IL
T-Mat細胞のＩＬ−２応答をより効果的に遮断すること
が明らかとなった。
体、抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体共存下における、モ
ノクローナル抗体ＧＰ−２のＩＬ−２応答遮断活性の検
定）１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて４ｘ
１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT-Mat細胞
液を９６穴平底マイクロプレート上の各穴に分注した。
ILT-Mat細胞液の分注量は１穴当たり１００μｌずつと
した。そこに各サンプル溶液を添加した。添加するサン
プル溶液の容量は５０μｌであり、それぞれに含まれる
抗体ＧＰ−２、抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体および抗
ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体の量は、それぞれ４０μｇ
／ｍｌであった。３７℃、３０分間インキュベートし、
更に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて
種々の濃度に調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液
を５０μｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４
８時間培養した。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミ
ジン（デュポン社製）を加えて培養した。細胞内に取り
込まれた放射活性量をシンチレーションカウンター（パ
ッカード社製）にて測定することにより、抗ＩＬ−２レ
セプターα鎖抗体及び／又は抗ＩＬ−２レセプターβ鎖
抗体と共存させた場合の抗体ＧＰ−２の応答遮断能を調
べた。その結果図７に示す通り、モノクローナル抗体Ｇ
Ｐ−２は、抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体及び／又は抗
ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体を共存することにより、IL
T-Mat細胞のＩＬ−２応答をより効果的に遮断すること
が明らかとなった。
【００５０】（実施例１０、抗体ＴＵＧｈ４、抗体ＴＵ
Ｇｈ５および抗体ＡＧ１４の活性の検定）１０％ＦＣＳ
を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２ｘ１０5個／ｍｌの
濃度となるように懸濁したILT-Mat細胞液を９６穴平底
マイクロプレート上の各穴に分注した。ILT-Mat細胞液
の分注量は１穴当たり１００μｌずつとした。そこに各
サンプル溶液を添加した。添加するサンプル溶液の容量
は５０μｌであり、それぞれに含まれる抗体あるいはポ
リペプチドの量は、それぞれ４０μｇ／ｍｌであった。
３７℃、３０分間インキュベートし、更に１０％ＦＣＳ
を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて種々の濃度に調製
したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μｌずつ加
えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培養した。
最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポン社
製）を加えて培養した。細胞内に取り込まれた放射活性
量をシンチレーションカウンター（パッカード社製）に
て測定することにより、抗体ＴＵＧｈ４、抗体ＴＵＧｈ
５および抗体ＡＧ１４それぞれの応答遮断能を調べた。
その結果、抗体ＴＵＧｈ４、抗体ＴＵＧｈ５および抗体
ＡＧ１４は、それぞれILT-Mat細胞のＩＬ−２応答を遮
断する活性を有していることが明らかとなった。
Ｇｈ５および抗体ＡＧ１４の活性の検定）１０％ＦＣＳ
を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２ｘ１０5個／ｍｌの
濃度となるように懸濁したILT-Mat細胞液を９６穴平底
マイクロプレート上の各穴に分注した。ILT-Mat細胞液
の分注量は１穴当たり１００μｌずつとした。そこに各
サンプル溶液を添加した。添加するサンプル溶液の容量
は５０μｌであり、それぞれに含まれる抗体あるいはポ
リペプチドの量は、それぞれ４０μｇ／ｍｌであった。
３７℃、３０分間インキュベートし、更に１０％ＦＣＳ
を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて種々の濃度に調製
したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μｌずつ加
えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培養した。
最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポン社
製）を加えて培養した。細胞内に取り込まれた放射活性
量をシンチレーションカウンター（パッカード社製）に
て測定することにより、抗体ＴＵＧｈ４、抗体ＴＵＧｈ
５および抗体ＡＧ１４それぞれの応答遮断能を調べた。
その結果、抗体ＴＵＧｈ４、抗体ＴＵＧｈ５および抗体
ＡＧ１４は、それぞれILT-Mat細胞のＩＬ−２応答を遮
断する活性を有していることが明らかとなった。
【００５１】（参考例、抗体ＴＵＧｍ２の活性の検定）
モノクローナル抗体ＴＵＧｍ２（実施例２の方法に準拠
してラットに免疫することにより作成した抗マウスＩＬ
−２レセプターγ鎖抗体）及び／又は抗マウスＩＬ−２
レセプターβ鎖抗体（ＴＭ−β１；ファーミンジェン社
製）を用いて、これらがＣＴＬＬ細胞のＩＬ−２応答性
を遮断するかどうかを調べた。１０％ＦＣＳを含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地にて１ｘ１０4個／ｍｌの濃度となる
ように懸濁したＣＴＬＬ−２細胞液を９６穴平底マイク
ロプレート上の各穴に分注した。ＣＴＬＬ−２細胞液の
分注量は１穴当たり５０μｌずつとした。そこに各サン
プル溶液を添加した。添加するサンプル溶液の容量は５
０μｌであり、それぞれに含まれる抗体の量は、それぞ
れ４０μｇ／ｍｌであった。３７℃、３０分間インキュ
ベートし、更に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培
地を用いて種々の濃度に調製したヒトリコンビナントＩ
Ｌ−２溶液を５０μｌずつ加えた。最終的にそれぞれの
穴の中の溶液の容量が２００μｌとなるように１０％Ｆ
ＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。次に、５
％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培養した。最後の４
時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加
えて培養した。細胞内に取り込まれた放射活性量をシン
チレーションカウンター（パッカード社製）にて測定す
ることにより、モノクローナル抗体ＴＵＧｍ２及び／又
は抗マウスＩＬ−２レセプターβ鎖抗体それぞれの応答
遮断能を調べた。その結果図８に示すとおり、モノクロ
ーナル抗体ＴＵＧｍ２は、抗マウスＩＬ−２レセプター
β鎖抗体と共存させることにより、ＣＴＬＬ−２細胞の
ＩＬ−２応答を遮断することが明らかとなった。
モノクローナル抗体ＴＵＧｍ２（実施例２の方法に準拠
してラットに免疫することにより作成した抗マウスＩＬ
−２レセプターγ鎖抗体）及び／又は抗マウスＩＬ−２
レセプターβ鎖抗体（ＴＭ−β１；ファーミンジェン社
製）を用いて、これらがＣＴＬＬ細胞のＩＬ−２応答性
を遮断するかどうかを調べた。１０％ＦＣＳを含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地にて１ｘ１０4個／ｍｌの濃度となる
ように懸濁したＣＴＬＬ−２細胞液を９６穴平底マイク
ロプレート上の各穴に分注した。ＣＴＬＬ−２細胞液の
分注量は１穴当たり５０μｌずつとした。そこに各サン
プル溶液を添加した。添加するサンプル溶液の容量は５
０μｌであり、それぞれに含まれる抗体の量は、それぞ
れ４０μｇ／ｍｌであった。３７℃、３０分間インキュ
ベートし、更に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培
地を用いて種々の濃度に調製したヒトリコンビナントＩ
Ｌ−２溶液を５０μｌずつ加えた。最終的にそれぞれの
穴の中の溶液の容量が２００μｌとなるように１０％Ｆ
ＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。次に、５
％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培養した。最後の４
時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加
えて培養した。細胞内に取り込まれた放射活性量をシン
チレーションカウンター（パッカード社製）にて測定す
ることにより、モノクローナル抗体ＴＵＧｍ２及び／又
は抗マウスＩＬ−２レセプターβ鎖抗体それぞれの応答
遮断能を調べた。その結果図８に示すとおり、モノクロ
ーナル抗体ＴＵＧｍ２は、抗マウスＩＬ−２レセプター
β鎖抗体と共存させることにより、ＣＴＬＬ−２細胞の
ＩＬ−２応答を遮断することが明らかとなった。
【００５２】
【発明の効果】本発明のヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に
特異的に結合して、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とＩＬ
−２レセプターβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−
２応答を遮断する活性を有するポリペプチドは、単独、
あるいはＩＬ−２のＩＬ−２レセプターへの結合を阻害
する物質と併用することにより、ＩＬ−２の関与が示唆
されている臓器移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性
疾患や自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬として有
効な薬剤として利用し得る有用な物質である。
特異的に結合して、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とＩＬ
−２レセプターβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−
２応答を遮断する活性を有するポリペプチドは、単独、
あるいはＩＬ−２のＩＬ−２レセプターへの結合を阻害
する物質と併用することにより、ＩＬ−２の関与が示唆
されている臓器移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性
疾患や自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬として有
効な薬剤として利用し得る有用な物質である。
【００５３】
配列番号：１ 配列の長さ：732 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．７３２ 配列 ATG GAC ATC CTG CTG ACC CAG TCT CCA TCA ATC ATG TCT GCA TCT CTA 48 Met Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 GGG GAA CGG GTC ACC ATG ACC TGC ACT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TCC 96 Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser 20 25 30 AGT TAC TTG CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CTC 144 Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu 35 40 45 TGG ATT TAT AGC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCA GCT CGC TTC 192 Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGC ATG 240 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met 65 70 75 80 GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAC CAG TAT CAT CGT TCC 288 Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser 85 90 95 CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTC AAA GTC GAC AAA 336 Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Val Asp Lys 100 105 110 TCC TCA GGA TCT GGC TCC GAA TCC AAA AGC ACG CAG GTC AAA CTC GAG 384 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln Val Lys Leu Glu 115 120 125 GAG TCT GGA TCT GAG CTG GTG AGG CCT GGA GCT TCA GTG AAG CTG TCC 432 Glu Ser Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser 130 135 140 TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACA TTC ACC AGC TAC TGG ATG CAC TGG GTG 480 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val 145 150 155 160 AAG CAG AGG CAT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA AAT ATT TAT CCT 528 Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro 165 170 175 GGT AGT GGT AGT ACT AAC TAC GAT GAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACA 576 Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr 180 185 190 CTG ACT GTA GAC ACA TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATG CAC CTC AGC AGC 624 Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser 195 200 205 CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT ACA AGA AGC AGC CGG 672 Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Ser Arg 210 215 220 AAC TGG GTC TAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC 720 Asn Trp Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 225 230 235 240 ACC GTC TCC TCA 732 Thr Val Ser Ser
【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：729 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：１．．７２９ 配列 ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＣＡ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ
ＧＣＣ ＴＣＣ ＣＴＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＴＣＴ ＧＴＧ ４８ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ １ ５
１０ １５ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＣＡ ＴＧＴ ＣＧＡ
ＧＣＡ ＡＧＴ ＧＧＧ ＡＡＴ ＡＴＴ ＣＡＣ ＡＡＴ ９６ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ａｓｎ ２０ ２５
３０ ＴＡＴ ＴＴＡ ＧＣＡ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＡＧ
ＧＧＡ ＡＡＡ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ １４４ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ３５ ４０
４５ ＧＴＣ ＴＡＴ ＡＡＴ ＧＣＡ ＡＡＡ ＡＣＣ ＴＴＡ ＧＣＡ ＧＡＴ
ＧＧＴ ＧＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＧＴ １９２ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｓｅｒ ５０ ５５
６０ ＧＧＣ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＣＡ ＣＡＡ ＴＡＴ ＴＣＴ
ＣＴＣ ＡＡＧ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ２４０ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ ６５ ７０
７５ ８０ ＣＣＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＧＧ ＡＧＴ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ
ＣＡＡ ＣＡＴ ＴＴＴ ＴＧＧ ＡＧＴ ＡＣＴ ＣＣＧ ２８８ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ
Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ ８５
９０ ９５ ＴＧＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ
ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＧ ＡＡＡ ＴＣＣ ３３６ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ １００ １０５
１１０ ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＣＣ ＧＡＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＧＣ
ＡＣＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ３８４ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ １１５ １２０
１２５ ＴＣＴ ＧＧＡ ＣＣＴ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＧ
ＧＣＴ ＴＣＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＡＴＡ ＴＣＣ ＴＧＣ ４３２ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ １３０ １３５
１４０ ＡＡＧ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＴＡＣ ＴＣＡ ＴＴＣ ＡＣＴ ＧＧＣ
ＴＡＣ ＴＡＣ ＡＴＧ ＣＡＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ４８０ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｙｓ １４５ １５０
１５５ １６０ ＣＡＡ ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＴＡ ＡＡＧ ＡＧＣ ＣＴＴ ＧＡＧ ＴＧＧ
ＡＴＴ ＧＧＡ ＣＧＴ ＡＴＴ ＡＡＴ ＣＣＴ ＴＡＣ ５２８ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｙｒ １６５
１７０ １７５ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＣＴ ＡＣＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＡＡＣ ＣＡＧ ＡＡＴ
ＴＴＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＴＧ ５７６ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １８０ １８５
１９０ ＡＣＴ ＧＴＡ ＧＡＴ ＡＡＧ ＴＣＣ ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＣＡ ＧＣＣ
ＴＡＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ６２４ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １９５ ２００
２０５ ＡＣＡ ＴＣＴ ＧＡＧ ＧＡＣ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＡＴ ＴＡＣ
ＴＧＴ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＡＴ ＴＡＣ ＴＡＣ ６７２ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ ２１０ ２１５
２２０ ＧＧＴ ＡＧＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＧＣＴ ＴＡＣ ＴＧＧ
ＧＧＣ ＣＡＡ ＧＧＧ ＡＣＴ ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＣＴ ７２０ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｔｒｐ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ ＧＴＣ ＴＣＴ ＧＣＡ
７２９ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ
ＧＣＣ ＴＣＣ ＣＴＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＴＣＴ ＧＴＧ ４８ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ １ ５
１０ １５ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＣＡ ＴＧＴ ＣＧＡ
ＧＣＡ ＡＧＴ ＧＧＧ ＡＡＴ ＡＴＴ ＣＡＣ ＡＡＴ ９６ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ａｓｎ ２０ ２５
３０ ＴＡＴ ＴＴＡ ＧＣＡ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＡＧ
ＧＧＡ ＡＡＡ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ １４４ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ３５ ４０
４５ ＧＴＣ ＴＡＴ ＡＡＴ ＧＣＡ ＡＡＡ ＡＣＣ ＴＴＡ ＧＣＡ ＧＡＴ
ＧＧＴ ＧＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＧＴ １９２ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｓｅｒ ５０ ５５
６０ ＧＧＣ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＣＡ ＣＡＡ ＴＡＴ ＴＣＴ
ＣＴＣ ＡＡＧ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ２４０ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ ６５ ７０
７５ ８０ ＣＣＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＧＧ ＡＧＴ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ
ＣＡＡ ＣＡＴ ＴＴＴ ＴＧＧ ＡＧＴ ＡＣＴ ＣＣＧ ２８８ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ
Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ ８５
９０ ９５ ＴＧＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ
ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＧ ＡＡＡ ＴＣＣ ３３６ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ １００ １０５
１１０ ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＣＣ ＧＡＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＧＣ
ＡＣＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ３８４ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ １１５ １２０
１２５ ＴＣＴ ＧＧＡ ＣＣＴ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＧ
ＧＣＴ ＴＣＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＡＴＡ ＴＣＣ ＴＧＣ ４３２ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ １３０ １３５
１４０ ＡＡＧ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＴＡＣ ＴＣＡ ＴＴＣ ＡＣＴ ＧＧＣ
ＴＡＣ ＴＡＣ ＡＴＧ ＣＡＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ４８０ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｙｓ １４５ １５０
１５５ １６０ ＣＡＡ ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＴＡ ＡＡＧ ＡＧＣ ＣＴＴ ＧＡＧ ＴＧＧ
ＡＴＴ ＧＧＡ ＣＧＴ ＡＴＴ ＡＡＴ ＣＣＴ ＴＡＣ ５２８ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｙｒ １６５
１７０ １７５ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＣＴ ＡＣＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＡＡＣ ＣＡＧ ＡＡＴ
ＴＴＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＴＧ ５７６ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １８０ １８５
１９０ ＡＣＴ ＧＴＡ ＧＡＴ ＡＡＧ ＴＣＣ ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＣＡ ＧＣＣ
ＴＡＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ６２４ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １９５ ２００
２０５ ＡＣＡ ＴＣＴ ＧＡＧ ＧＡＣ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＡＴ ＴＡＣ
ＴＧＴ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＡＴ ＴＡＣ ＴＡＣ ６７２ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ ２１０ ２１５
２２０ ＧＧＴ ＡＧＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＧＣＴ ＴＡＣ ＴＧＧ
ＧＧＣ ＣＡＡ ＧＧＧ ＡＣＴ ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＣＴ ７２０ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｔｒｐ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ ＧＴＣ ＴＣＴ ＧＣＡ
７２９ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ
【００５５】配列番号：３ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 ＧＧＡＣＡＴＡＴＧＣ ＴＧＡＡＣＡＣＧＡＣ ＡＡＴＴＣＴＧ
２７
２７
【００５６】配列番号：４ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GAAAAGCTTC TATTATGAAG TATTGCTCC 29
【００５７】配列番号：５ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CAGGTSMARC TCGAGSAGTC WGG 23
【００５８】配列番号：６ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 AAGCTTCATG AGGAGACGGT GACCGTGGTC CC 32
【００５９】配列番号：７ 配列の長さ：45 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 ACAGTCATAA TGTCCCATAT GGAYATYCWG MTGACMCAGT CTCCA 45
【００６０】配列番号：８ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GCATCGTCGA CTTTGAGCTC CAGCTTGGTC CC 32
【００６１】配列番号：９ 配列の長さ：87 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CGATTAGTAA GGAGGTTTCA TATGTCGACA AATCCTCAGG ATCTGGCTCC GAATCCAAAA 60 GCACGCAGGT CAAACTCGAG AAGCTTG 87
【００６２】配列番号：１０ 配列の長さ：８９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 ＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴ ＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴ ＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧ ＣＴＴ
ＴＴＧＧＡＴＴ ＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡ ＴＣＣＴＧＡＧＧＡＴ ６０ ＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴ ＡＴＧＡＡＡＣＣＴＣ ＣＴＴＡＣＴＡＡＴ
８９
ＴＴＧＧＡＴＴ ＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡ ＴＣＣＴＧＡＧＧＡＴ ６０ ＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴ ＡＴＧＡＡＡＣＣＴＣ ＣＴＴＡＣＴＡＡＴ
８９
【図１】プラスミドpIL-2RGSの構築工程を示す図面であ
る。
る。
【図２】プライマーの配列を示す。
【図３】Ｌ鎖Ｖ領域とＨ鎖Ｖ領域をつなぐためのリンカ
ーのＤＮＡ配列を示す。
ーのＤＮＡ配列を示す。
【図４】プラスミドpFv-DEの構築工程を示す図面であ
る。
る。
【図５】プラスミドpFv(GP-2)、及びプラスミドpFv(GP-
4)の構築工程を示す図面である。
4)の構築工程を示す図面である。
【図６】モノクローナル抗体ＧＰ−２、ＧＰ−４、Ｆｖ
（ＧＰ−２）、及びＦｖ（ＧＰ−４）が、それぞれILT-
Mat細胞のＩＬ−２依存的増殖を抑制する活性を有する
事を示す図面である。 ▲；コントロール抗体添加 ■；ＧＰ−２抗体添加 □；Ｆｖ（ＧＰ−２）添加 ●；ＧＰ−４添加 ○；Ｆｖ（ＧＰ−４）添加
（ＧＰ−２）、及びＦｖ（ＧＰ−４）が、それぞれILT-
Mat細胞のＩＬ−２依存的増殖を抑制する活性を有する
事を示す図面である。 ▲；コントロール抗体添加 ■；ＧＰ−２抗体添加 □；Ｆｖ（ＧＰ−２）添加 ●；ＧＰ−４添加 ○；Ｆｖ（ＧＰ−４）添加
【図７】モノクローナル抗体ＧＰ−２、及びＧＰ−４
が、抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体（Ｈ３１）、あるい
は抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体（ＴＵ２５）共存下
に、それぞれILT-Mat細胞のＩＬ−２依存的増殖を抑制
する活性を有することを示す図面である。 ▲；コントロール抗体添加 ■；ＧＰ−２抗体添加 □；抗ＩＬ−２Ｒβ鎖抗体添加 △；抗ＩＬ−２Ｒβ鎖抗体＋ＧＰ−２抗体添加 ○；抗ＩＬ−２Ｒα鎖抗体添加 ●；抗ＩＬ−２Ｒα鎖抗体＋ＧＰ−２抗体添加 ◆；抗ＩＬ−２Ｒα鎖抗体＋β鎖抗体＋ＧＰ−２抗体添
加
が、抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体（Ｈ３１）、あるい
は抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体（ＴＵ２５）共存下
に、それぞれILT-Mat細胞のＩＬ−２依存的増殖を抑制
する活性を有することを示す図面である。 ▲；コントロール抗体添加 ■；ＧＰ−２抗体添加 □；抗ＩＬ−２Ｒβ鎖抗体添加 △；抗ＩＬ−２Ｒβ鎖抗体＋ＧＰ−２抗体添加 ○；抗ＩＬ−２Ｒα鎖抗体添加 ●；抗ＩＬ−２Ｒα鎖抗体＋ＧＰ−２抗体添加 ◆；抗ＩＬ−２Ｒα鎖抗体＋β鎖抗体＋ＧＰ−２抗体添
加
【図８】モノクローナル抗体ＴＵＧｍ２が単独、あるい
は抗マウスＩＬ−２レセプターβ鎖抗体と共存させた場
合に、それぞれがＣＴＬＬ−２細胞のＩＬ−２依存的増
殖を抑制する活性を有することを示す図面である。 ●；抗体なし（培地のみ） ○；抗体ＴＵＧｍ２添加 □；抗ＩＬ−２Ｒβ鎖抗体添加 ■；ＴＵＧｍ２＋抗ＩＬ−２Ｒβ鎖抗体添加
は抗マウスＩＬ−２レセプターβ鎖抗体と共存させた場
合に、それぞれがＣＴＬＬ−２細胞のＩＬ−２依存的増
殖を抑制する活性を有することを示す図面である。 ●；抗体なし（培地のみ） ○；抗体ＴＵＧｍ２添加 □；抗ＩＬ−２Ｒβ鎖抗体添加 ■；ＴＵＧｍ２＋抗ＩＬ−２Ｒβ鎖抗体添加
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/13 ＺＮＡ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 中澤 はるみ 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 金山 由佳 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 菅村 和夫 宮城県仙台市青葉区旭が丘１−27−８ (72)発明者 竹下 敏一 宮城県仙台市青葉区上杉４−４−32−302
Claims (25)
- 【請求項１】 ヒトインターロイキン２レセプターγ鎖
に特異的に結合し、ヒトインターロイキン２の応答を遮
断する活性を有するポリペプチド。 - 【請求項２】 ポリペプチドが、マウスモノクローナル
抗体である請求項１記載のポリペプチド。 - 【請求項３】 モノクローナル抗体を産生する細胞が、
ＧＰ−２又はＧＰ−４である請求項２記載のモノクロー
ナル抗体。 - 【請求項４】 モノクローナル抗体を産生する細胞が、
ＴＵＧｈ４、ＴＵＧｈ５又はＡＧ１４である請求項２記
載のモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 ポリペプチドが、モノクローナル抗体の
可変領域のみを含んでなる請求項１記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項６】 ポリペプチドが、配列番号１記載のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドである請求項５記載のポ
リペプチド。 - 【請求項７】 ポリペプチドが、配列番号２記載のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドである請求項５記載のポ
リペプチド。 - 【請求項８】 ポリペプチドが、配列番号１記載のアミ
ノ酸配列のＮ末端Ｍｅｔが除かれたポリペプチドである
請求項５記載のポリペプチド。 - 【請求項９】 ポリペプチドが、配列番号２記載のアミ
ノ酸配列のＮ末端Ｍｅｔが除かれたポリペプチドである
請求項５記載のポリペプチド。 - 【請求項１０】 ポリペプチドが、（１）配列番号１記
載のアミノ酸配列の一部を削除、（２）配列番号１記載
のアミノ酸配列の一部を他のアミノ酸配列に置換、
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列にアミノ酸残基も
しくはペプチドを付加、または（４）配列番号１記載の
アミノ酸配列の一部をアセチル化、アミド化、もしくは
ポリエチレングリコール付加したものである請求項５記
載のポリペプチド。 - 【請求項１１】 ポリペプチドが、（１）配列番号２記
載のアミノ酸配列の一部を削除、（２）配列番号２記載
のアミノ酸配列の一部を他のアミノ酸配列に置換、
（３）配列番号２記載のアミノ酸配列にアミノ酸残基も
しくはペプチドを付加、または（４）配列番号２記載の
アミノ酸配列の一部をアセチル化、アミド化、もしくは
ポリエチレングリコール付加したものである請求項５記
載のポリペプチド。 - 【請求項１２】 ポリペプチドが、マウスモノクローナ
ル抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域へと変換した請
求項１記載のポリペプチド。 - 【請求項１３】 ポリペプチドが、マウスモノクローナ
ル抗体の定常領域、及び可変領域の枠組み配列を、各々
ヒト抗体の定常領域と枠組み配列へと変換した請求項１
記載のポリペプチド。 - 【請求項１４】 請求項１ないし１３記載のポリペプチ
ドを含有してなる免疫抑制剤。 - 【請求項１５】 請求項１ないし１３記載のポリペプチ
ドと、抗ヒトインターロイキン２レセプターα鎖抗体、
及び／又は抗ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖抗
体とを含有してなる請求項１４記載の免疫抑制剤。 - 【請求項１６】 請求項１ないし１３記載のポリペプチ
ドと、抗ヒトインターロイキン２レセプターα鎖抗体の
可変領域を含むポリペプチド、該ポリペプチドの一部を
削除したポリペプチド、該ポリペプチドの一部を他のア
ミノ酸に置換したポリペプチド、もしくは該ポリペプチ
ドの一部に他のアミノ酸残基、ポリペプチドあるいは他
の物質を付加したポリペプチド、及び／又は抗ヒトイン
ターロイキン２レセプターβ鎖抗体の可変領域を含むポ
リペプチド、該ポリペプチドの一部を削除したポリペプ
チド、該ポリペプチドの一部を他のアミノ酸に置換した
ポリペプチド、もしくは該ポリペプチドの一部に他のア
ミノ酸残基、ポリペプチドあるいは他の物質を付加した
ポリペプチドとを含有してなる請求項１４記載の免疫抑
制剤。 - 【請求項１７】 請求項１ないし１３記載のポリペプチ
ドと、ヒト定常領域を有する抗ヒトインターロイキン２
レセプターα鎖抗体、及び／又はヒト定常領域を有する
抗ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖抗体とを含有
してなる請求項１４記載の免疫抑制剤。 - 【請求項１８】 請求項１ないし１３記載のポリペプチ
ドと、ヒト定常領域及びヒト可変領域の枠組み配列を有
する抗ヒトインターロイキン２レセプターα鎖抗体、及
び／又はヒト定常領域及びヒト可変領域の枠組み配列を
有する抗ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖抗体と
を含有してなる請求項１４記載の免疫抑制剤。 - 【請求項１９】 請求項１ないし１３記載のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ。 - 【請求項２０】 ＤＮＡが配列番号１記載の塩基配列を
有する請求項１９記載のＤＮＡ。 - 【請求項２１】 ＤＮＡが配列番号２記載の塩基配列を
有する請求項１９記載のＤＮＡ。 - 【請求項２２】 請求項１９ないし２１記載のＤＮＡを
有する組換えＤＮＡ。 - 【請求項２３】 請求項２２記載の組換えＤＮＡを有す
る形質転換体。 - 【請求項２４】 形質転換体が大腸菌、または真核細胞
である請求項２３記載の形質転換体。 - 【請求項２５】 請求項２３または２４記載の形質転換
体を培養することにより、請求項１ないし１３記載のポ
リペプチドを生産させ、該ポリペプチドを取得すること
を特徴とする該ポリペプチドの製造方法。
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (5)
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|---|---|---|---|
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| JP3606594 | 1994-03-07 | ||
| JP5-94491 | 1994-03-07 | ||
| JP6-36065 | 1994-03-07 | ||
| JP08283694A JP3844519B2 (ja) | 1993-04-21 | 1994-04-21 | 免疫抑制剤 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP08283694A Expired - Fee Related JP3844519B2 (ja) | 1993-04-21 | 1994-04-21 | 免疫抑制剤 |
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-
1994
- 1994-04-21 JP JP08283694A patent/JP3844519B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP3844519B2 (ja) | 2006-11-15 |
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