JP2002534441A - 抗ｃｄ３免疫毒素およびその治療的使用 - Google Patents

抗ｃｄ３免疫毒素およびその治療的使用

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Abstract

(57)【要約】 ＣＤ３結合ドメインおよびPseudomonas外毒素変異体を含み、特に、ＣＤ３結合部分として単鎖(ｓｃ)Ｆｖを含む、組換え免疫毒素ポリペプチドについて述べている。本発明の好ましい種は、ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８を含む。また、免疫毒素または医薬的に許容されるそれらの塩；および免疫毒素または医薬的に許容されるそれらの塩を含む医薬組成物を用い、当該免疫毒素、本発明の免疫毒素の調製の中間体である機能的に等価な免疫毒素、ならびにポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中間体の調製方法；移植拒絶の予防およびまたは処置および耐性の誘発、ならびに自己免疫および他の免疫疾患の処置の方法について開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ＣＤ３結合ドメインおよびPseudomonas外毒素Ａ変異体を含む組換
え体免疫毒素に関する。
【０００２】 すべての成熟Ｔ細胞の表面には、ポリペプチド鎖αおよびβ(または他に鎖γ
およびδ)のヘテロダイマーからなるＴ細胞レセプター(ＴＣＲ)分子が存在する
。すべての細胞に約３０，０００存在するＴＣＲα：βヘテロダイマーは、抗原
呈示細胞(ＡＰＣ)上の主要組織適合複合体(ＭＨＣ)で引き寄せられ得、それによ
って、Ｔ細胞のすべての機能性クラスによる抗原認識が行われる。α：βヘテロ
ダイマー自身は、特定ＭＨＣペプチド抗原複合体によるＴＣＲ関与後のシグナル
トランスダクションに含まれ出現することはない。むしろ、その機能は、全末梢
性Ｔ細胞および成熟胸腺細胞の表面上のＴＣＲαβまたはγδヘテロダイマーと
安定して結合するタンパク質の複合体、すなわち、ＣＤ３複合体により提供され
る。ヒトＣＤ３複合体は、通常４種の鎖：γ、δ、εおよびζを有する６つのポ
リペプチドを含む。３種のダイマーは、ＣＤ３複合体(γε、δεおよびζζ)を
構成する[Kishimoto et al., (Eds.), Leukocyte Typing VI, Garland Publishi
ng, Inc., (1998)44]。ＣＤ３タンパク質は、Ｔ細胞レセプター鎖の細胞表面発
現に完全に必須である。ＴＣＲ鎖またはＣＤ３複合体の任意のγ、δもしくはε
鎖の何れかを欠損する変異体は、細胞表面において任意の鎖のＴＣＲを発現しな
い[Janeway and Travers, Immunobiology. The Immune System in Health and D
isease, Ch. 4("Antigen Recognition by T Lymphocytes"), Current Biology L
td., London and Garland Publishing Inc., New York(1996)]。
【０００３】 抗原特異的なＴ細胞活性化およびクローン拡大は、２つのシグナルがＡＰＣに
より休眠Ｔリンパ球の表面に送達されるときに生ずる。免疫応答に対する特異性
を供与する第１のシグナルは、ＭＨＣにかかわって存在する外来性抗原ペプチド
の認識後ＴＣＲを通じて仲介される。ＴＣＲを介する最適なシグナリングは、共
レセプターＣＤ４またはＣＤ８を有するＴＣＲの集合を必要とする。次いで、こ
れは、ＴＣＲおよびＣＤ３細胞質テイルと、ならびにＣＤ４５とシトソルチロシ
ンキナーゼの会合の増加を生ずる。ＣＤ３εおよびζの細胞質ドメインのリン酸
化は、チロシンキナーゼの結合、増殖中に生ずる一連の細胞内イベントの開始、
およびＴ細胞の分化を生ずる。抗原特異的でもなければＭＨＣ制限もしない、“
同時刺激”と呼ばれる第２のシグナルは、ＡＰＣにより発現する１つまたはそれ
以上の個別の細胞表面分子により提供される[Janeway and Travers, 上記 at 4-
28]。Ｔ細胞に対し同時刺激性のシグナルを伴う抗原特異的シグナルの送達は、
Ｔ細胞増殖およびサイトカイン分泌の両方を含み得る、Ｔ細胞の活性化を生ずる
。抗原および共刺激物の組合せにより、天然Ｔ細胞のＩＬ−２およびそのレセプ
ター発現が誘導される。ＩＬ−２は、天然Ｔ細胞、およびその子孫の分化であっ
て、ヘルパー、炎症および細胞毒性Ｔ細胞として分化した機能を必要とする全タ
ンパク質を合成し得る武装エフェクターＴ細胞への分化のクローン拡大を誘導す
る。例えば、Janeway and Travers, 上記 at §§7-8, 7-9参照。
【０００４】 上記適応し得る免疫機構は、臓器移植の成功にとって主な障害となる。核形成
性細胞を含む組織をドナーから移植片レシピエントへ移植すると、Ｔ細胞は、レ
シピエントにおいて、移植臓器に対する即時のＴ細胞仲介応答を殆ど常に引き起
こす、移植片の典型的に高多形性のＭＨＣ分子に対し応答する。サイクロスポリ
ンＡ(cyclosporin A)およびＦＫ−５０６のような、Ｔ細胞の活性化を阻害する
強力な免疫抑制剤の使用は、移植片の生存率を劇的に増加するが、移植片レシピ
エントによる終生の薬剤依存を含む特定の不利な点を伴う。
【０００５】 臓器移植を受けるか、またはＴ細胞仲介免疫疾患を患う患者における免疫抑制
の改善方法の発達は、移植の分野に普遍的な目標である。当分野の作業者の特定
の目的は、患者におけるドナー特異的免疫学的耐性を誘発し得、それにより、別
の方法で免疫抑制剤の継続的な依存から患者を解放す治療剤の発達である。
【０００６】 “免疫学的耐性”なる語は、耐性が生ずる抗原で攻撃する患者対象の免疫系に
より感受性が鈍い状態をいう。移植のセッティングにおいて、特に、レシピエン
トに対する移植片の非自己ＭＨＣ抗原の導入の応答を別の方法で生ずる免疫応答
をマウントする移植片レシピエントの能力の阻害をいう。免疫学的耐性の誘発に
は、体液性、細胞性または体液性および細胞性の両方の機構が含まれる。
【０００７】 全身性ドナー特異的免疫学的耐性は、ドナー細胞による骨髄移植以前に、体全
体の照射またはリンパ球全体の照射を介する患者のコンディショニングの結果と
してのキメラ現象を介し動物モデルおよびヒトモデルにおいて説明されている[N
ikolic and Sykes, Immunol. Res. 16:217-228(1997)]。しかし、放射線の非存
在下、安定化混合多系列同種性キメラ現象(stable mixed multilineage allogen
eic chimerism)および長期間のドナー特異的耐性を生ずる同種性骨髄移植のため
のコンディショニング療法の臨床的必要性が残っている。サラセミアおよび鎌形
赤血球疾患を含む血液学的異常、自己免疫状態、および幾つかの型の酵素欠損状
態は、以前から、同種性骨髄再構成を十分に達成するコンディショニングを付随
する病的状態のため、骨髄移植ストラテジーから除かれていた。放射線を含まな
いコンディショニングアプローチは、有意に、非−悪性疾患の骨髄移植の適用に
まで拡張し得る。
【０００８】 毒性に連結する抗体を含む免疫毒素は、臓器移植拒絶の予防および／または処
置ならびに免疫学的耐性の誘発を提唱する。例えば、レーソスＣＤ３εに対し向
かわせる化学的結合したジフテリア免疫毒素、すなわち、ＦＮ１８−ＤＴ３９０
は、同種移植片耐性の霊長類モデルに使用され、霊長類の島調和性異種移植片モ
デルにおいても使用される[Knechtle et al., Transplantation 63:1(1997); Ne
ville et al., J. Immunother. 19:85(1996); Thomas et al., Transplantation
64:124(1997);Contreras et al., Transplantation 65:1159-1169(1998)]。更
に、化学的に結合したPseudomonas免疫毒素、ＬＭＢ−１ Ｂ３(Ｌｙｓ)−ＰＥ３
８は、進行した固形腫瘍に対する臨床試験に使用される[Pai and Pastan, Curr.
Top. Microbiol. Immunol. 234:83-96(1998)]。しかし、産物異種性は、化学的
に結合した免疫毒素に付随する重要な実施困難性となる。
【０００９】 抗ＣＤ３抗体、ＵＣＨＴ−１の可変性領域を含む一本鎖組換え体免疫毒素およ
びジフテリア毒素は、治療剤として提唱されている(WO96/32137、WO98/39363)。
しかし、ジフテリアに対する一般の個体群の早期のワクチン接種は、多くの患者
の毒性に対する、先在する抗体に関して生ずる。他に、ＰＥ３８に連結する抗Ｔ
ａｃを含む組換え体免疫毒素はまた、臓器移植および自己免疫疾患に対する予防
および処置として提唱されている[Mavroudis et al., Bone Marrow Transplant.
17:793(1996)]。
【００１０】 Ｔ細胞に対し高レベルの方向性毒素効果を有し、それにより、移植拒絶の予防
または処置、免疫学的耐性の誘発、および対宿主性移植片病(ＧＶＨＤ)、自己免
疫疾患、および他のＴ細胞仲介疾患および病状の処置または予防において、改善
される、組換え体免疫毒素を達成することが目的である。
【００１１】 レシピエントが先在する抗体から通常解き放たれる、免疫毒素を提供すること
も目的である。
【００１２】 我々は、ＣＤ３結合ドメインの組換え体融合体およびPseudomonas外毒素Ａ変
異体が、強力なＴ細胞効果を有する免疫毒素を提供することをこの度発見した。
。本発明の免疫毒素は、移植拒絶、対宿主性移植片病(ＧＶＨＤ)、Ｔ細胞仲介自
己免疫疾患、Ｔ細胞白血病、またはＣＤ３エピトープを有するリンパ腫、獲得免
疫欠損シンドローム(ＡＩＤＳ)、および他のＴ細胞仲介疾患および病状の臨床的
処置または予防における改善を提供する。
【００１３】 本発明は、ＣＤ３結合ドメインおよびPseudomonas外毒素Ａ部分を含む組換え
体免疫毒素、および医薬的に許容されるそれらの塩を単離すること；免疫毒素ま
たは医薬的に許容されるそれらの塩を用いる、臓器移植拒絶および対宿主性移植
片病の処置および予防、および免疫学的耐性の誘発、ならびに自己免疫疾患、Ａ
ＩＤＳおよび他のＴ細胞仲介免疫学的疾患、およびＴ細胞白血病またはリンパ腫
の処置または予防のインビトロおよびエキソビボの方法；および新規免疫毒素ま
たはその医薬的に許容されるそれらの塩を含む医薬組成物を目的とする。
【００１４】 本発明はまた、ポリヌクレオチドおよび対象組換え体免疫毒素の調製において
中間体である生理学的に機能等価なポリペプチド；当該ポリヌクレオチドを含む
組換え体発現ベクター、原核性および真核性発現系、および当該発現系を用いる
免疫毒素を合成する方法；および本発明の免疫毒素の精製方法に関する。
【００１５】 特に、本発明は、Pseudomonas aeruginosa外毒素Ａ、すなわちＰＥ３８のトラ
ンケート断片に融合したマウス抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体ＵＣＨＴ−１の
一本鎖(“ｓｃ”)Ｆｖ断片である、新規組換え体免疫毒素、ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ-
１)−ＰＥ３８に関係する。例えば、インビトロでのＴ細胞死滅に高い効果の当
該ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８を発見した；そして我々は、更に、免疫毒
素が、ヒトＣＤ３εのトランスジェニックマウスのインビトロの用量依存方法に
おいて高レベルのマウスＣＤ３／ヒトＣＤ３ダブルポジティブＴ細胞を除去し得
ることを発見した。
【００１６】 １．ＣＤ３結合ドメイン “ＣＤ３結合ドメイン”なる語句は、Ｔ細胞またはリンパ球における哺乳類、
およびより好ましくは霊長類、およびより好ましくは、ヒトのＣＤ３抗原に結合
または他に会合し得るアミノ酸配列をいう。
【００１７】 本発明の免疫毒素のＣＤ３結合毒素は、好ましくは、ＣＤ３に対するポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体であり、より好ましくはモノクローナル抗ＣＤ
３抗体である。より好ましくは、抗ＣＤ３抗体は、ヒトＣＤ３のε鎖のエピトー
プに、または他にヒトＣＤ３のεおよびγ鎖により形成されるエピトープに結合
し得るモノクローナル抗体である。
【００１８】 本明細書中で使用する“抗体”なる語句は、未処理免疫グロブリンおよび種々
の型の修飾または改変抗体を含み、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合により結合する
Ｆｖ断片、またはＦａｂもしくは(Ｆａｂ)'２断片のような抗体の断片、一本鎖
抗体、および親抗体の抗原結合機能および特異性を保持する他の断片を含む。抗
体は、動物(特に、マウスまたはラット)またはヒト起源のものであるか、または
キメラ性または人体に適応させたものであり得る。ＣＤ３抗原およびより特にヒ
トＣＤ３抗原に特異的に結合し得る抗体を生ずる方法が、KohlerおよびMilstein
の働きから得られる既知の方法を使用して調製されたハイブリドーマにより産生
され得る[Nature 256:495-97(1975)]。当分野に既知であるように、抗体“重”
または“軽”鎖は、Ｎ末端可変領域(Ｖ)およびＣ末端定常領域(Ｃ)を有する。可
変性領域は、抗体の結合抗原に結合する分子の部分であり、その一方、定常領域
は、抗体のエフェクター機能を決定する。全長の免疫グロブリンまたは抗体重鎖
には、約１１６アミノ酸の可変領域および約３５０アミノ酸の定常領域が含まれ
る。全長の免疫グロブリンまたは抗体軽鎖には、約１１０アミノ酸のＮ末端可変
領域、ＣＯＯＨ末端に約１１０アミノ酸の定常領域が含まれる。重鎖可変領域は
、ＶＨといい、軽鎖可変領域は、ＶＬという。典型的に、ＶＬは、ＶＬおよびＪ Ｉ (すなわち、連結領域)遺伝子セグメントによりコードされる軽鎖の部分を含み
[Sakans et al., Nature 280:288-294(1979)]、および“ＶＨ”には、ＶＨ、Ｄ
Ｈ(すなわち、多様性領域)およびＪＨ遺伝子セグメントによりコードされる重鎖
の部分が含まれる[Early et al., Cell 19:981-92(1980)]。ＶＨおよびＶＬ断片
は、あわせて“Ｆｖ”という。未処理抗体のＦｖ領域は、ＶＨおよびＶＬドメイ
ンのヘテロダイマー(すなわち、分離した鎖を含む)である。
【００１９】 本明細書で使用の“Ｆ(ａｂ')２”なる語句は、ちょうつがい領域および重お
よび軽鎖の可変性および第１の定常領域を含む抗体の二価断片をいい、それは、
天然抗体分子のペプシン消化によるか、または組換え手段により産生され得る。
“Ｆａｂ”なる語句は、重および軽鎖の可変性および第１の定常領域を含む抗体
の一価断片をいい、それは、Ｆ(ａｂ')２断片のジスルフィド架橋を還元するか
、または組換え手段により生じ得る。
【００２０】 当分野に既知のように、免疫グロブリン軽または重鎖可変領域には、４つの比
較的保存された“フレームワーク領域”(ＦＲ)が隣接する３つの超過変領域、相
補性決定領域(ＣＤＲ)とも呼ばれる領域が含まれる。構成要素である軽および重
鎖の組み合わせたフレームワーク領域は、ＣＤＲの位置付けおよび配列に関与す
る。ＣＤＲは抗原のエピトープへの結合に最初に応答し得、典型的にＣＤＲ１、
ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、それらは可変領域鎖のＮ末端から始めて順番
に番号付けしている。フレームワーク領域は、同様に番号付けされている。多数
のフレームワーク領域およびＣＤＲは述べられている[Kabat and Wu, Sequences
of Proteins of Immunological Interest, U.S. Government Printing Office,
NIH Publication No. 91-3242(1991)]。ＣＤＲおよびＦＲポリペプチドセグメ
ントは、先在する抗体またはそれらをコードするＤＮＡのＦｖ領域の配列分析に
経験的に基づくように設計する。KabatおよびWuおよび他で開示されている目的
の抗体配列のアライメントから、フレームワーク領域およびＣＤＲは、目的の抗
体または他のＣＤ３結合領域について決定され得る。
【００２１】 “キメラ性”は、１を超える天然抗体から誘導される配列を含む遺伝的に工作
された抗体を意味する。キメラ抗体の例は、非ヒト可変ドメインがヒト定常ドメ
インに連結するようなとき、フレームワークおよびＣＤＲが異なる源から由来す
るものがある。その一部として、“人体に適応した”抗体は、非ヒトＣＤＲがヒ
トである少なくとも一部のフレームワーク領域中に組み込まれる抗体を含むと一
般的に理解されている。
【００２２】 本明細書中で使用する場合、“一本鎖抗体”なる語句(または“一本鎖免疫毒
素”なる語句)は、ＣＤ３結合ドメインが一本鎖ポリペプチド鎖上に存在する分
子をいう。一本鎖抗体は、結合抗体の重および軽鎖のそれぞれの結合ドメインを
決定および単離することにより、および結合機能を保存し得る連結部分を供する
ことにより典型的に調製される。これは、本質的に、一本ポリペプチド鎖上で、
可変領域ドメインが抗原への結合に必要となる部分のみを有する、根本的に縮約
した抗体を形成する。一本鎖抗体の調製方法は、米国４，９４６，７７８に記載
されている。それは引用によりこの文書に加える。
【００２３】 本発明の一本鎖免疫毒素には、その一本鎖抗体断片を含む。毒素部分は、好ま
しくは、所望によりリンカーペプチドを介してＣＤ３結合ドメインに融合される
が、ＣＤ３結合ドメインを含む鎖に対する１つまたはそれ以上のジスルフィド結
合を介して連結する分離ポリペプチド鎖としても存在し得る。
【００２４】 本発明の免疫毒素は、“一価”となり得、それは、鎖上に１つのＣＤ３結合ド
メイン(例えば、抗体の組合せＶＨおよびＶＬ可変領域)を含むことを意味する。
【００２５】 本発明の免疫毒素はまた、“二価”であり、それは、２つのＣＤ３結合ドメイ
ンを含むことを意味する。２つの抗原結合ドメインは、一本鎖上または他にジス
ルフィド結合により連結するか他に引力(例えば水素結合)のために近接する２つ
またはそれ以上の鎖上において位置し得る。２つのＣＤ３結合ドメインが一本鎖
上にあるとき、それは、一列に並んで存在するか(すなわち、鎖において連続し
て並び、ペプチド結合またはリンカーにより結合している)または介在するＰＥ
変異または他の機能性ドメインにより鎖中において分離されている。
【００２６】 一本鎖抗体(または一本鎖免疫毒素)は、他の一本(または二本)鎖分子による鎖
内部ジスルフィド結合の形成により、またはパートナーのためのドメインの固有
の親和性の手段により、発現系に依存する発現において多重結合し得る。鎖はホ
モダイマーまたはヘテロダイマーを形成し得る。
【００２７】 本発明の免疫毒素のＣＤ３結合部分は、好ましくは“組換え体”抗体である。
同様に、本発明の免疫毒素は、“組換え体”免疫毒素である。“組換え体”なる
語句の使用により、抗体(または免疫毒素)は遺伝子工学により作成されるヌクレ
オチド(例えば、ＤＮＡ)セグメントから細胞中で合成されると理解され得る。“
単離した”なる語句は、ポリペプチドが天然環境から取り除かれることを示す。
組換え体宿主細胞内で産生され、および／または組換え体宿主細胞内に含まれる
ポリペプチドは、本発明の目的のために単離されると見なされる。“単離された
ポリペプチド”として意図されるものは、組換え体宿主細胞から、部分的にまた
は実質的に精製されたポリペプチドである。
【００２８】 好ましくは、本発明の免疫毒素のＣＤ３結合部分は、一本鎖(“ｓｃ”)抗体で
ある。免疫毒素は好ましくは一価である。
【００２９】 最も好ましくは、本発明のＣＤ３結合部分は、抗体の一本鎖Ｆｖ領域(または
そのＣＤ３結合断片)を含み、この場合、ＶＨ領域(またはそのＣＤ３結合部分)
は、所望によりリンカーペプチドを介しＶＬ領域(またはそのＣＤ３部分)に融合
される。
【００３０】 ＶＬ領域は、好ましくは、そのカルボキシル末端を介して、ＶＨ領域のアミノ
末端に連結する；他に、ＶＨ領域は、そのカルボキシル末端を介して、ＶＬ領域
のアミノ末端に連結し得る。
【００３１】 ＶＬおよびＶＨ領域の任意のペプチドリンカーは、好ましくは、ＣＤ３結合ド
メインのフォールディングおよび活性化に独立しており；ＣＤ３結合ドメインを
妨げ得るか患者において免疫学的反応の原因となり得る整った二次構造を発達す
る傾向はなく、ＣＤ３結合ドメインと相互作用する疎水性または荷電特性を最小
とする。
【００３２】 ペプチドコネクターは、好ましくは１−５００アミノ酸であり、より好ましく
は１−２５０；より好ましくはわずかに１−１００(例えば１−２５または１０
−２０)アミノ酸である。
【００３３】 上記それぞれの選択の場合、リンカーは好ましくは直線状である。
【００３４】 一般的にＧｌｙ、ＡｌａおよびＳｅｒを含むリンカーは、そのペプチドの特徴
を満たすと予想され得る。例えば、ＶＬドメインのカルボキシル末端をＶＨドメ
インのアミノ末端に結合する、ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８のリンカーは
、[ＧＧＧＳ]４(配列番号５)である。
【００３５】 全体またはその断片が本発明のＣＤ３結合ドメインとして用いるのに適当であ
る特定抗−ＣＤ３抗体の例は、 (１)ＵＣＨＴ−１[Beverley and Callard, Eur. J. Immunol. 11:329(1981);Bur
ns et al., J. Immunol. 129:1451(1982)]、配列番号２中に含まれるｓｃＦｖ配
列。ＵＣＨＴ−１は、ＩｇＧ１、κイソ型を有するモノクローナルマウス抗ヒト
抗ＣＤ３抗体である。当該抗体は、胸腺、骨髄、末梢リンパ球組織、および血液
中のＴ細胞と反応する。未処理抗体は、Biomeda(カタログ番号K009, V1035)また
はCoulter Corp.より商業的に利用可能である。種々の領域は、ここでは配列番
号２の３から１１２残基(軽鎖)および１２８から２４９(重鎖)を含む。ＵＣＨＴ
−１は、Ｆｖ断片として非活性であり、ヒト乳および卵巣の腫瘍細胞を標的とす
るＴ細胞中で抗ＨＥＲ２二重特異性免疫結合体との融合パートナーとして使用さ
れる[Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217 (1992)]。 (２)ＳＰ３４(C. Terhorst, Beth Israel Deaconess Hospitalにより最初に単離
された)は、霊長類およびヒトＣＤ３の両方と反応する。ＳＰ３４は、ＳＰ３４
がＣＤ３のε鎖に単独で存在するエピトープを認識するＵＣＨＴ−１およびＢＣ
−３(下記)とは異なるが、ＵＣＨＴ−１およびＢＣ−３は、εおよびγ鎖の両方
により寄与するエピトープを認識する。未処理抗体は、PharMingenから商業的に
利用可能である。 (３)ＢＣ−３(Fred Hutchinson Cancer Research Institute)(GvHDのフェーズI/
II試験で使用した)[Anasetti et al., Transplantation 54:844(1992)] である。
【００３６】 ＣＤ３抗原に特異的な結合親和性を有し、ヒト源の少なくとも幾つかの配列を
有する他のモノクローナル抗体は、上記抗体の相同体の範疇に入るとみなされる
。これらの抗体には、(１)例えばＵＣＨＴ−１(またはＳＰ３４またはＢＣ３)と
と同一のＣＤＲを有し、ヒト源の少なくとも５つのアミノ酸の少なくとも１つの
配列セグメントを有するモノクローナル抗体；および(２)モルに基づきＵＣＨＴ
−１と同程度に有効な、少なくとも約８０％およびより少なくとも約９０％のヒ
トＣＤ３抗原と結合するための例えばＵＣＨＴ−１と競合し、ヒト源の少なくと
も５アミノ酸の少なくとも１つの配列セグメントを有するモノクローナル抗体が
含まれる。“特異的結合親和性”は、結合分子の表面上の疎水性結合、塩連結お
よび水素結合のような非共有結合性相互作用により決定された結合親和性を意味
する。特記しなければ、“特異的結合親和性”は、生体分子反応では少なくとも
約１０６リッター／ｍｏｌｅの結合定数を含む。
【００３７】 例えば、ＵＣＨＴ−１のようなものに実質的に相同なＣＤＲを有する本発明の
抗体はまた、本発明の範囲内であり、インビトロ突然変異により生じ得る。実質
的に親和性およびその相同体の特異性を保持する定常または可変領域へ導入し得
る変異は、当分野に既知のような同類アミノ酸置換を生ずる変異である。ＵＣＨ
Ｔ−１に関し、抗体の変異体形は、好ましくは、ＵＣＨ−１の可変領域と少なく
とも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する可変領
域を有する。より好ましくは抗体の変異形のＣＤＲのそれぞれは、ＵＣＨＴ−１
の相当するＣＤＲに少なくとも８０％、より好ましくは９０％または少なくとも
９５％の同一性を有する。
【００３８】 実施上の問題として、任意の特定ポリペプチド配列が少なくとも８０％、９０
％または少なくとも９５％の何れかであるとき、他のポリペプチド“に同一な”
なる語句は、Bestfitプログラムのような既知のコンピュータープログラムを通
常用いて決定され得る(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for
Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Dri
ve, Madison, Wis. 53711)。特定配列が、本発明による引用配列に、例えば９５
％の同一性を有するかどうかを決定するBestfitまたは他の配列アライメントプ
ログラムを使用するとき、パラメーターはもちろん、同一性の割合は引用アミノ
酸配列の全長にわたって計算され、引用配列における全アミノ酸残基数の５％ま
での相同性においてギャップが認められるようにセットする。
【００３９】 好ましい実施態様での本発明のＣＤ３部分は、γおよびε鎖の両方により形成
されるヒトＣＤ３エピトープを認識し、好ましくはＵＣＨＴ−１であり、より好
ましくは、ＵＣＨＴ−１のＦｖ領域(またはそのＣＤ３結合断片)である。より好
ましくは、ＣＤ３結合部分は、ＵＣＨＴ−１の一本鎖断片であり、最も好ましく
は、ＵＣＨＴ−１の一本鎖Ｆｖ領域(またはそのＣＤ３結合断片)である。
【００４０】 一本鎖として再構成され、Pseudomonas aeruginosa外毒素Ａの細胞結合ドメイ
ン検出断片へ融合するとき、ＵＣＨＴ−１のＦｖ領域は、標準的インビトロアッ
セイにおいて、およびヒトＣＤ３εに異種的なトランスジェニックマウスのイン
ビボにおいて、Ｔ細胞死滅の高レベルの効力が見られた。
【００４１】 ２．Pseudomonas毒素部分 Pseudomonas外毒素−Ａ(以下“ＰＥ”)は、Pseudomonas aeruginosaにより分
泌される６１３アミノ酸(分子量６６Ｋｄ)の最高に活性のあるモノマータンパク
質であり、それは、ＡＤＰリボシル化(ribosylation)を触媒(すなわち、ＥＦ−
２への酸化ＮＡＤのＡＤＰリボシル部分の移送を触媒する)することによる伸長
ファクター２(ＥＦ−２)、本質的な真核性翻訳ファクターの不活性化を介して真
核細胞中のタンパク質合成を阻害する[Kreitman and Pastan Blood 83:426(1994
)]。成熟ポリペプチドは、配列番号３に開示するアミノ酸配列を有し、配列番号
４に開示する２５残基のシグナルは配列により、通常、先行される。
【００４２】 天然ＰＥにおける３つの構造的に明白なドメインは、細胞毒性を促進すること
に関し作用する(US4,892,827、US5,696,237およびUS5,863,745(それらはすべて
引用によりこの文書に加える))。アミノ末端のドメインＩａ(および配列番号３
の１から約２５２に通常該当する)は、細胞ターゲッティングおよび結合を仲介
する。ドメインII(配列番号３の２５３−３６４残基)は、細胞膜を通過してサイ
トソルへの移動に応答し、ドメインIII(配列番号３の４０５から６１３残基)は
、伸長ファクター２のＡＤＰリボシル化を仲介し、それによって、タンパク質を
不活性化し、細胞死の原因となる。ドメインIIIは、内部原形質網状物へエンド
サイトーシス化およびプロセス化毒素を向かわせるカルボキシル末端配列(ＲＥ
ＤＬＫ)(配列番号６)を含む。ドメインＩｂ(配列番号３の残基３６５−４０４)
は、ドメインIIIに関し作用することが明らかであると同時に、このドメインの
残基３６５−３８０の欠損は、活性の喪失を生じない。
【００４３】 本発明の免疫毒素の“ＰＥ変異体”または他に“ＰＥ部分”は、移動および触
媒(すなわち、ＡＤＰリボシル化)機能を有するが、細胞結合能を実質的に減少ま
たは欠損させる、天然ＰＥの変異形である。すべて、または実質的にすべての細
胞結合ドメインＩａの崩壊または欠損は、実質的に細胞結合能を減少し、そのた
め、天然ＰＥ分子の非特異的毒性を実質的に減少させることが見られる。例えば
、ドメインＩａの欠損は、ドメインIIおよびドメインIII、それぞれの移動およ
びＡＤＰリボシル化機能を保持するにも拘わらず細胞毒性のない、４０ｋＤａタ
ンパク質、ＰＥ４０を産する[Kondo et al., J. Biol. Chem, 263:9470-9475(19
88)]。
【００４４】 ＰＥ３８は、成熟ＰＥタンパク質のドメインＩａを本質的に欠損(例えば配列
番号３のアミノ酸１−２５０を欠損する)し、また、配列番号３のアミノ酸残基
３６５から３８０を欠損し、そのため、配列番号３の３８１から６１３に連結す
る残基２５１から３６４(配列番号２の残基２５５−６０１参照)を含むアミノ酸
を有する、ＰＥの３８ｋＤａ断片である。例えば、ＵＳ５，６０８，０３９，ｃ
ｏｌ．１０、II．１−２０(ＰＥは、天然ＰＥのアミノ酸２５３−３６４および
３８１−６１３に含まれるトランケート毒素をいうことを示す)。有利に、ＰＥ
３８は、天然タンパク質の３７２および３７９位のシステイン残基を欠き、他に
、復元過程の他のシステインによるジスルフィド結合の形成の可能性があり、不
活性なキメラ毒素の形成を導き得る。
【００４５】 本発明のポリペプチドのＰＥ毒素部分はまた、配列番号２の残基２５５−６０
１により定義される配列に対し少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少な
くとも９５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性のある
ポリペプチドを含み得る。この場合、“に対し同一性”なる語句は、上記の意義
を有する。
【００４６】 ＰＥ３８ＫＤＥＬは、毒素のカルボキシル末端がオリジナル配列ＲＥＤＬＫ(
配列番号６)からＫＤＥＬ(配列番号８)へ変化していることを除き、上記ＰＥ３
８のアミノ酸配列を有する。
【００４７】 他の欠損または変化は、ＰＥにおいて、または標的細胞に対する融合タンパク
質の細胞毒性を増加するか、または相当するＣＤ３抗原を欠く細胞に対する非特
異的な細胞毒性を減少するため、ＰＥに抗体を結合するＩｇＧ定常領域のような
リンカーの付加において、生じ得る。ＰＥドメインIIのアミノ末端の欠損部分は
、天然ＰＥ分子またはドメインIIの有意な欠損が生じないものの使用と比較する
と、細胞毒性活性を増加する。他の修飾には、標的細胞のサイトソルへの分子の
移転を助ける組換え体ＰＥ分子に対し適当なカルボキシル末端配列が含まれる。
有効性の見られるアミノ酸配列は、ＲＥＤＬＫ(配列番号６)(天然ＰＥにおいて)
、ＲＥＤＬ(配列番号７)またはＫＤＥＬ(配列番号８)(上記考察のＰＥ３８ＫＤ
ＥＬにおいて)を含み、それら、または内部原形質網状物へのタンパク質の維持
もしくは再循環するように機能する他の配列を繰返す。ＵＳ５，４８９，５２５
参照。それは引用によりこの文書に加える。他の変異体は、単一のアミノ酸置換
を含み得る(例えば、５９０および６０６位でＬｙｓとＧｌｎを置換する)。
【００４８】 ＥＰのドメインIII中へ挿入された認識部分を有する更なるＰＥ変異体は、Ｕ
Ｓ５，４５８，８７８に記載されており、それらは引用によりこの文書に加える
。
【００４９】 ３．免疫毒素の構成 本発明は、１つまたはそれ以上のPseudomonas変異体に対するＣＤ３の結合ド
メインの融合を含み、また２つまたはそれ以上のＣＤ３結合ドメインおよび少な
くＴも１つのＰＥ変異体を含む免疫毒素融合を含む。
【００５０】 本明細書で用いるとき、“融合した”または“融合”なる語句は、以下のポリ
ペプチドをいう： (ｉ)“第１ポリペプチドドメイン”は、“第２ポリペプチドドメイン”のアミノ
末端への化学的(すなわち、ペプチド)結合を介し、所望によりペプチドコネクタ
ーを介しカルボキシル末端で結合するか、または逆に (ii)(ｉ)の“第２ポリペプチドドメイン”は、(ｉ)の“第１ポリペプチドドメイ
ン”のアミノ末端への化学的(すなわち、ペプチド)結合を介し、所望により、ペ
プチドコネクターを介しカルボキシル末端で結合する。
【００５１】 同様に、本発明のポリヌクレオチド中間体と関連して使用するとき、“融合し
た”なる語句は、第１機能性ドメインをコードするヌクレオチド配列の３'−[ま
たは逆に５'−]末端が、各々、第２機能性ドメインをコードするヌクレオチド配
列の５'−[または逆に３'−]末端に、化学的結合を直接介するか(すなわち、共
有結合)または第１機能性ドメインをコードするヌクレオチド配列および第２機
能性ドメインをコードするヌクレオチド配列にその末端を介して化学的に(すな
わち共有結合的に)結合するコネクターヌクレオチド配列を間接的に介して結合
することを意味する。
【００５２】 融合を形成する更なるペプチド配列は、全長またはトランケートされた(例え
ば、溶液、細胞外断片の)ヒトタンパク質から選択され得る。そのペプチド配列
の例には、ヒト免疫グロブリンドメイン、他のヒト血清タンパク質からのドメイ
ン、または多量体化し得る他のドメインが含まれる[Kostelny et al., J. Immun
ol. 148:1547-1553 (1992); WO93/11162;Pack and Plueckthum, Biochmistry 31
:1579-1584(1992);Hu et al., Can. Res. 56:3055-3061 (1996);WO94/09817;Pac
k et al., J. Mol. Biol. 246:28-34(1995)]。当該更なる機能性ドメインはまた
、ペプチドコネクターとしての役割をし得、例えば、ＣＤ３抗原結合ドメインを
ＰＥ部分に結合すること、または他に、当該更なるドメインは、融合分子におい
て他の場所に、例えば、そのアミノまたはカルボキシル末端に位置し得る。
【００５３】 本発明の好ましい態様では、抗ＣＤ３抗体の一本鎖Ｆｖは、移動および触媒機
能を有するＰＥのトランケート断片へ融合されるが、実質的には細胞結合能を欠
いている。
【００５４】 好ましくは、ＣＤ３抗原を認識する抗体結合領域は、ＰＥ分子の欠損ドメイン
への置換において挿入され得る。そのため、本発明の種々の実施態様では、ＣＤ
３結合部分が、カルボキシル末端を介し(所望により、コネクターペプチドまた
は他の機能ドメインを介する)ＰＥ毒素部分のアミノ末端へ結合することが好ま
しい。
【００５５】 他に、ＰＥ毒素部分は、カルボキシル末端を介し(また、所望により、コネク
ターペプチドまたは他の機能性ドメインを介する)、ＣＤ３結合部分のアミノ末
端に結合し得る。
【００５６】 一本鎖において複数のＣＤ３結合ドメインが存在する場合、ペプチド結合また
はリンカーにより一列に並んで連結するか、または他に介在するＰＥ部分または
他の機能性部分により別けられて連結し得る。
【００５７】 ＣＤ３結合領域に連結する任意のペプチドコネクターおよびＰＥ部分は、好ま
しくは、ＣＤ３結合ドメインのフォールディングおよび活性化が独立し得、ＣＤ
３結合ドメインで妨害し得るか患者の免疫学的反応の原因となり得る整った二次
構造を発達する傾向から解き放たれており、ＣＤ３結合ドメインと相互作用する
疎水性または荷電特性を最小とする。コネクターは、好ましくは１−５００アミ
ノ酸、より好ましくは１−２５０、およびより好ましくはわずかに１−１００(
例えば、１−２５、１−１０、１−７または１−４)アミノ酸である。
【００５８】 上記それぞれの選択の場合、リンカーは好ましくは直線状である。
【００５９】 一般的に、ＣＤ結合ドメインおよび小さな、非荷電性アミノ酸を含むＥＰ部分
に連結するコネクターペプチドは、そのコネクターの特徴を満たすと予想される
。例えば、ｓｃ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８中のコネクターペプチドは、Ｌｙｓ−
Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ(ＫＡＳＧＧ)(配列番号９)である。種々の長さ
の他のペプチドおよび配列の組成物もまた有用となり得る。
【００６０】 最も好ましい、本発明の免疫毒素は、カルボキシル末端、所望により、コネク
ターペプチドを介し、ＰＥ３８のアミノ末端に融合されるＵＣＨＴ−１のＦｖ領
域(またはそのＣＤ３結合断片)を含む一本鎖ポリペプチドである。 ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８は、予想分子量６４，５６３ダルトン(６
４．５ｋＤ)を有する６００アミノ酸のタンパク質である。
【００６１】 E. coliから転写を開始するコーディング配列に通常供されるＭｅｔの切断が
不完全であるため、上記分子のE. coli由来の実際の翻訳産物は、更なるＮ−末
端メチオニン(Ｍｅｔ)残基を含み得ることが注目される。更に、実施例１により
調製されるｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)ＰＥ３８ポリペプチドは、クローニングを促
進するためＮ末端に加えられる配列の結果としてＮ末端または２位(すなわち、
Ｍｅｔの次)に加えられたアラニン(Ａｌａ)を含み得る。ＵＣＨＴ−１の軽鎖の
種々領域の成熟アミノ末端は、配列番号２の３位(すなわち、アスパラギン酸(Ａ
ｓｐ))で始まる。従って、実施例１により調製されるような分子のE. coli発現
は、１つまたはそれ以上の、下記機能的に等価な産物を、使用する発現株、およ
び使用する正確な発酵および精製に依存して、生じ得る：当該ポリペプチドは、
配列番号２の配列１−６０１を有し、配列番号１のヌクレオチド１−１８０３に
よりコードされ；当該ポリペプチドは、配列番号２の配列２−６０１を有し、配
列番号１のヌクレオチド４−１８０３によりコードされ；そして当該ポリペプチ
ドは、配列番号２の配列３−６０１を有し、配列番号１のヌクレオチド７−１８
０３によりコードされる。
【００６２】 タンパク質のその任意の形(または相当する核酸)が、特記しない限り、本明細
書で使用するとき、“ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８”なる語句に含まれる
。
【００６３】 本発明はまた、配列番号２を有するポリペプチドに対し少なくとも８０％の同
一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なく
とも９５％の同一性のあるポリペプチドを含む。この場合、“に対し同一性”な
る語句は、上記の意味の通り。
【００６４】 特定の免疫毒素分子は、ポリペプチド鎖に位置するドメイン間の引力によるか
、またはシステイン残基間のジスルフィド結合の形成により，“ダイマー化”し
得る。例えば、ダイマーは、２つのポリペプチド鎖から、または鎖の２対から形
成され得る。ダイマーは、ホモダイマーまたはヘテロダイマーであり得る(ヘテ
ロダイマーの例は、ＰＥ毒素が二本鎖のうち一本にのみ存在する構成である)。
本発明による特定の二価一本鎖免疫毒素構成、またはダイマー化構成を図１で解
説する。図１Ａ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦに示されるダイマー化免疫毒素構成には、
２つ(またはそれ以上)の鎖が含まれる。図１Ｂに示される構成は、二価一本鎖免
疫毒素である。図１Ｅに示す分子は、全長の組換え的に調製した、毒素に連結し
た抗体である。図１Ｆの構成は、組換え的に調製された、毒素に連結したＦ(ａ
ｂ')２断片(すなわち、２対の鎖のダイマーを含む)である。図１に示す構成中の
ＰＥ毒素は、好ましくはＰＥ３８であり、抗体可変性ドメインは、ＵＣＨＴ−１
から得られ得る。
【００６５】 特に、本発明のダイマー免疫毒素の最初の例証実施態様は、図１Ａに示すよう
なダイアボディー(diabody)である。“ダイアボディー”は、それぞれの鎖が、
ＶＬおよびＶＨドメインおよびＰＥ変異体毒素を含み、当該鎖は、ジスルフィド
結合よりもむしろ可変性ドメイン間の引力(例えば、水素結合、図１Ａには示し
ていない)により結合し得る、２つの一本鎖(好ましくは同一)を含む免疫毒素構
成を意味する。図１Ａは、示すようにＶＬ−Ｌ−ＶＨ−ＰＥ変異体毒素の配置を
有する一対の一本鎖を示す。
【００６６】 一本鎖免疫毒素と対照してみると、鎖内Ｆｖ形成を予防する目的のため、ダイ
アボディーの各ポリペプチド鎖中のＶＬとＶＨドメイン間のリンカーＬは、好ま
しくは実質的に融通性がなく、リンカー：(Ｇｌｙ)４Ｓｅｒ(配列番号１０)によ
り例示されるように一般的に１０アミノ酸を超えず、より好ましくは１−５アミ
ノ酸を超えず、完全に欠き得る。(対照として、一本鎖免疫毒素中のＶＬとＶＨ
との間のリンカーは、好ましくは少なくとも１４アミノ酸がある。)そのため、
ダイアボディーの機能性Ｆｖ領域は、２つの鎖の相互作用により同時に実際に形
成される。ダイアボディーは、哺乳類細胞およびE. coliから発現する。ダイア
ボディー構成は、Hollingerら[Proc. Nat. Acad. Sci90:6444(1993)]およびＷｕ
ら[Immunotech 2:21(1996)]により一般的に述べられている。
【００６７】 本発明の他の例示実施態様では、図１Ｂに示すように一列に並んだ一本鎖構成
には、連続して、すなわち、ペプチド結合によりまたは所望により融通性のある
ペプチドリンカーを介して連続的に連結した２つの抗ＣＤ３Ｆｖ領域を含む。図
１Ｂは、ＶＬ−Ｌ−ＶＨ−Ｘ−ＶＬ−Ｌ−ＶＨ−Ｙ−毒素の配置を有する構成を
示し、この場合、ＸおよびＹは、独立してペプチド結合またはリンカーから選択
される。特に、Ｌは、リンカー、すなわち、(ＧＧＧＳ)４配列番号５であり、Ｘ
およびＹのそれぞれは、ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８(すなわち、ＫＡＳ
ＧＧ，配列番号９)の“コネクター”の配列のようなものを有し得る。ｓｃＦｖ(
ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８構成に類似して、２つのＦｖ領域のそれぞれのＶＬお
よびＶＨドメインは、融通性があり(図１Ｂ、および図１ＣおよびＤにおいてＶ
ＬおよびＶＨドメインに連結するルーピングラインにより示された)、好ましく
は約１０−３０、より好ましくは約１４から２５のアミノ酸を有するペプチドリ
ンカーＬにより分離される。好ましくは、図１Ｂに示した構成における２つのＦ
ｖ領域は、両方の抗ＣＤ３結合ドメインである。そのため、ある実施態様では、
Ｆｖ領域は、ＣＤ３の同じエピトープに結合し得、同一性があり(または各領域
またはそのコードするヌクレオチド配列は、修飾され発現または組換えを促進す
る)；または他に各Ｆｖは、ヒトＣＤ３抗原上で異なるエピトープに結合するよ
うに選択され得る。本発明のＰＥ毒性部分は、Ｆｖドメインの１つのカルボキシ
ルまたはアミノ末端に結合し得る(所望により、介在リンカーまたは機能性配列
を介する)。(他に、複数ＰＥ毒素セグメントは、分子中に存在する。)図１Ｂに
おいて、ＰＥ配列は、Ｆｖドメインの１つのカルボキシル末端に連結する。
【００６８】 抗原結合領域が異なる抗原に結合しその分子を“二重特異性”とする一列に並
んだ一本鎖抗体分子は、一般的に、Gruberら[J. Immunol. 152:5368(1994)]、Ku
rcuczおよびSegal[J. Immunol. 154:4576(1995)]、Mallenderら[J. Biol. Chem.
269:199 (1994)]およびMackら[Proc. Nat. Acad. Sci. 92:7021(1995)]に記載
されている。
【００６９】 また本発明の他の構成は、引力(例えば、水素結合)により、またはジスルフィ
ド結合により、鎖間のダイマー化を促進する役割をする“ダイマー化ドメイン”
をそれぞれ含む２つのポリペプチド鎖から調製される。(述べられた結合力は、
図１Ｃおよび図１Ｄの点により示される)図１Ｃにおいて一対の星により示され
るそれぞれのダイマー化ドメインは、鎖内、例えばＦｖ領域とＰＥ毒素部分の間
に内在し得る(示すように)；または他の態様では、ダイマー化ドメインは、Ｆｖ
ドメインのＮ末端に位置し得る(示さず)；および他の態様では、ダイマー化ドメ
インは、ＰＥ毒素のＣ末端に位置し得る(示さず)。図１Ｃに示す構成では、各鎖
は、ＶＬ−Ｌ−ＶＨ−ダイマー化ドメイン−ＰＥ変異体毒素の配列を有する。ダ
イマー化ドメインは、一般的にPackおよびPlueckthun[Biochem. 31:1579(1992)]
および上記のKostelnyらにより記載されている。適当なダイマー化ドメインは、
ヘテロダイマー転写ファクターまたは両親媒性らせんから得られ、哺乳類細胞お
よびE. coliにおいて発現し得る。
【００７０】 本発明による他のダイマー化構成は、ジスルフィド結合およびＣＨ３セグメン
ト間の引力の形成を介するダイマー化するＩｇのちょうつがいおよび第３の定常
領域(“ＣＨ３”)領域を含む一本鎖免疫毒素から調製される。
【００７１】 図１Ｄに示すように、本発明の“ミニボディー(minibody)”−毒素は、それぞ
れの鎖に、例えばヒトＩｇＧ１のちょうつがい(“Ｈ”)およびＣＨ３を介しＰＥ
毒素部分に結合するＦｖ領域が含まれる二本の一本鎖を含む。図１Ｄにおいてす
こし陰をつけた各長円形は、ちょうつがいおよびＣＨ３ドメインを示す。そのた
め、各鎖は、ＶＬ−Ｌ−ＶＨ−Ｈ＋ＣＨ３−ＰＥ変異体毒素の配置を有する。ポ
リペプチド鎖は、各ちょうつがいおよびＣＨ３ドメイン間の、ジスルフィド結合
(図１Ｄ、および図１ＥおよびＦにおいて、太線で示す)、および引力(点で示す)
により結合する。(図１Ｄにおいて、“Δミニボディー−毒素”として示す種々
の構成は、天然抗体の重および軽鎖を通常対とするちょうつがい領域におけるシ
ステインを、例えばセリンおよびアラニンで置換することにより、および重鎖に
結合するちょうつがいにおける２つの残存システインを未処理のままとすること
により、システインの誤対合を予防するように変異する。)
【００７２】 他の変異体は、他の免疫グロブリンイソ型または他の哺乳類種、例えばマウス
ＩｇＧ由来のちょうつがいを利用する。“ミニボディー”は、一般的に、Huら[C
an. Res. 56:3055(1996)]により記載されている。
【００７３】 本発明の他の例示の構成は、本発明のように重鎖(図１Ｅ、パネル左)または軽
鎖(図１Ｅ、パネル右)の何れかのＣ末端を介してＰＥ変異体毒素に融合する組換
え体抗体を含む。天然抗体において、鎖は、示すようにジスルフィド結合(太線
で鎖をつなぐ)により連結する。当該全長抗体毒素は、通常一対でダイマーとな
る。その構成において、マウスＩｇＧ２ｂまたはヒトＩｇＧ４のような非ｈｕＦ
ｃγレセプター結合Ｉｇは、天然Ｆｃで置換され得る。所望により、ＰＥ毒素部
分は、重および軽鎖の両方で示され得る(示さず)。
【００７４】 本発明による更なる構成には、組換え的に調製したＦ(ａｂ')２断片を含み(示
したちょうつがい領域を含む)、それは、重鎖(図１Ｆ、パネル左)または軽鎖(図
１Ｆ、パネル右)のカルボキシル末端を介し(所望により、リンカーを介する、示
さず)ＰＥ変異体毒素に結合している。当該Ｆ(ａｂ')２毒素分子は、一般的に一
対でダイマーとなる。図１Ｆですこし影をつけた長円形は、示したような、重鎖
(“ＣＨ”)の定常ドメインまたは軽鎖(“Ｃκ”)の定常ドメインの何れかを示す
。ポリペプチド鎖のちょうつがい領域は、ジスルフィド結合コネクター標識“ち
ょうつがい”により定常領域から離れて示される。そのため、各鎖は、ＶＬ−Ｃ κ およびＶＨ−ＣＨ１−ちょうつがい−ＰＥ毒素(図１Ｆ、左)または他にＶＬ−
Ｃκ−ＰＥ毒素およびＶＨ−ＣＨ１−ちょうつがい(図１Ｆ、右)の配置を有する
。
【００７５】 上記構成は、当業者に既知の組換え工学技術により既知出発物質から調製され
得る。
【００７６】 本発明はまた、開示ポリペプチド上のアミノ酸における同類置換、または免疫
毒素のＣＤ３結合能または触媒活性に他の点では影響を与えない残基の小数の欠
失または付加を行うことにより、開示種のポリペプチドとは異なるポリペプチド
相同体(および当該ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子)を含むことを目的とす
る。
【００７７】 “同類置換”は、ポリペプチド化学の当業者が実質的に非荷電のポリペプチド
の少なくとも二次構造および好ましくは三次構造を予測し得るように、同様の性
質を有する他のものによる１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換を意味する。同
類置換は、一般的に、側鎖が関係するアミノ酸のファミリー内で生ずるものであ
る。典型的なアミノ酸置換には、アラニンまたはバリンとグリシン、アスパラギ
ンとグルタミン、セリンとスレオニンおよびアルギニンとリシンが含まれる。
【００７８】 また、本発明の範囲は、本明細書中で開示の免疫毒素の種の相同体である。 “相同体”または“相同性”なる語句は、２つのペプチドまたは２つの核酸分
子における類似の配列をいう。相同性は、比較目的でアライメントし得る各配列
での位置を比較することにより決定され得る。比較配列の位置を同一塩基または
アミノ酸が占めるとき、当該分子は、その位置で相同性がある。配列間の相同性
の程度は、配列により占められるマッチするか相同性のある位置の数の関数であ
る。
【００７９】 好ましくは、本発明の免疫毒素ポリペプチド種の相同体は、本発明の当該免疫
毒素ポリペプチドに、少なくとも８０％の同一性、および好ましくは少なくとも
９０％の相同性、およびより好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する。
【００８０】 本発明のポリペプチドのアミノ酸全部(グリシンを除く)は、好ましくは天然に
生ずるＬ−アミノ酸である。
【００８１】 本発明の範囲内には、本発明の組換え体免疫毒素ポリペプチドおよびその相同
体をコードする単離ポリヌクレオチド(例えば、ｃＤＮＡ)、特に、配列番号２の
残基１−６０１、２−６０１または３−６０１を有するｓｃ(ＵＣＨＴ−１)−Ｐ
Ｅ３８または少なくとも１００(および好ましくは少なくとも２００)アミノ酸を
有するｓｃ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８の断片をコードするポリヌクレオチドがあ
る。
【００８２】 本発明は、配列番号１に示す核酸ばかりでなく、配列番号２のポリペプチドま
たはその断片をコードし、遺伝的コードの同義性のため配列番号１に示す核酸配
列とは異なる配列を有する単離核酸；および前述の核酸の相補鎖もまた含まれる
。
【００８３】 本発明の他の態様は、配列番号２のポリペプチドのような本発明のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド(好ま
しくは少なくとも３００塩基(ヌクレオチド)、より好ましくは６００塩基、より
好ましくは少なくとも９００塩基を有する)を提供する。当該ハイブリダイゼー
ション反応は、低または高緊縮条件下行い得る。
【００８４】 ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当な緊縮条件(例えば、約４５℃
の６．０×塩化ナトリウム／硝酸ナトリウム(ＳＳＣ)の後、５０℃で２．０×Ｓ
ＳＣで洗浄)は、当業者に既知であるか、またはCurrent Protocols in Molecula
r Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6中に見られる。例え
ば、洗浄ステップでの塩濃度は、約５０℃の２．０×ＳＳＣの低緊縮条件から約
５０℃の０．２×ＳＳＣの高緊縮条件までから選択され得る。加えて、洗浄ステ
ップの温度は、室温(ＲＴ)、約２２℃の低緊縮条件から約６５℃の高緊縮条件ま
でに増加し得る。“緊縮ハイブリダイゼーション条件”は、５０％ホルムアミド
、５×ＳＳＣ、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸三ナトリウム、５０ｍ
Ｍ リン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×Denhard溶液、１０％硫酸デキストラン
および２０μｇ／ｍｌ変性シェアーサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩
インキュベーションし、その後、約６５℃の０．１×ＳＳＣ中のフィルターで洗
浄することを目的とする。
【００８５】 “単離”ポリペプチドは、天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたは
ＲＮＡを目的とする。例えば、ベクター中に含まれる組換え体ＤＮＡは、本発明
の目的のために単離することが考えられる。単離ＤＮＡ分子の更なる例には、異
種性宿主細胞に保持される組換え体ＤＮＡ分子または溶液中の精製(部分的また
は実質的に)ＤＮＡ分子が含まれる。単離ＲＮＡには、本発明のＤＮＡ分子のイ
ンビボまたはインビトロＲＮＡ転写産物が含まれる。本発明の単離核酸分子には
、更に、合成的に作成されたその分子が含まれる。
【００８６】 本発明にはまた、本発明のコネクターペプチドおよび／またはリンカーをコー
ドする単離オリゴヌクレオチドを含む。そのオリゴヌクレオチドは、ＣＤ３結合
ドメインおよびＰＥ部分をコードするポリヌクレオチドで“フレーム中に融合さ
れ”、好ましくは、分子中に特有の制限酵素部位が含まれる。
【００８７】 “フレーム中に融合される”とは、(１)リンカーオリゴヌクレオチドが原因で
、ＣＤ３結合ドメインまたはＰＥ部分のリーディングフレームのシフトが生じる
ことはなく；および(２)ＣＤ３結合ドメインとＰＥ部分とのリーディングフレー
ム間の翻訳終結はないことを意味する。
【００８８】 本発明は、更に新規ポリペプチドの合成において中間体である新規融合ポリペ
プチドの生理学的に機能等価なタンパク質を含む。“生理学的に機能等価な”と
は、特定宿主細胞由来の本発明の成熟組換え体融合ポリペプチドの効果的な発現
および分泌が必要または望ましいため、そのアミノ酸配列を加えた本発明の融合
ポリペプチドを含む巨大分子をいう。その加えた配列は、典型的には、成熟タン
パク質のアミノ末端に加え、通常、分泌経路にタンパク質を向ける役割をするリ
ーダー(すなわち、シグナル)配列を形成し、通常、細胞からタンパク質を分泌す
る時点または分泌する前のタンパク質から切断される。シグナル配列は、関連タ
ンパク質の天然Ｎ末端領域から得られるか、または分泌タンパク質をコードする
宿主遺伝子から得ることができるか、または目的のポリペプチドの分泌を増加す
ることが知られる任意の配列から得られ得、その配列には合成配列ならびに“プ
レ”および“プロ”領域の間の全組合せが含まれる。シグナル配列と成熟タンパ
ク質をコードする配列との間の連結は、宿主の切断部位に相当する。
【００８９】 ＣＤ３結合領域が発現を導く、すなわち、融合分子において他のコーディング
配列から上流に位置する本発明のポリペプチドでは、哺乳類系(例えば、ＣＨＯ
、ＣＯＳ)または酵母(例えば、P. pastoris)からの発現を有効に得るシグナル配
列を利用するのに都合が良い。しかし、更なるシグナル配列は、天然の免疫グロ
ブリン鎖の配列と必ずしも一致せず、特定宿主細胞から成熟ポリペプチドを発現
／分泌するのに適当である、任意の適当な源から得られる。
【００９０】 タンパク質のアミノまたはカルボキシル末端での精製を促進する他の配列の添
加は、本発明の一部であることを意図する。その配列の例は、ニッケルアフェニ
ティー樹脂の精製用のポリヒスチジンタグおよびｃ−ｍｙｃ、または赤血球凝集
素(ＨＡ)に対する抗体により認識されるペプチド配列を含む。そのペプチド“タ
グ”は、当業者に既知である。
【００９１】 ＰＥ毒素部分が発現を導く本発明の免疫毒素ポリペプチドでは、適当なリーダ
ー配列は、E. coli、哺乳類(例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ)細胞または酵母由来の成
熟異種性ポリペプチドを分泌する天然ＰＥ外毒素Ａリーダー配列(配列番号４)を
含み得る。しかし、ＰＥまたは宿主細胞に対し天然である必要のない他のリーダ
ー配列は、特定宿主において成熟融合タンパク質の効果的な発現を提供し得る。
【００９２】 ４．本発明の組換え体免疫毒素の調製方法−一般 ａ．ＣＤ３結合部分を生ずる抗体の調製：抗体の１つまたはそれ以上の領域を
クローニングする一般的ストラテジーは、ハイブリドーマからＲＮＡを抽出する
ことにより、およびプライマーとしてランダムヘキサマーを使用してＲＮＡを逆
転写することにより、開始される。
【００９３】 特に、抗体のＦｖ断片をクローニングするため、ＶＨおよびＶＬドメインのそ
れぞれは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により増幅される。重鎖配列は、重鎖
のアミノ末端タンパク質配列により設計した５'端プライマーおよび共通免疫グ
ロブリン定常領域配列による３'プライマーを用い増幅し得る(Kabat and Wu、上
述)。軽鎖Ｆｖ領域は、抗体軽鎖のアミノ末端タンパク質配列により設計した５'
末端プライマーを用い、およびプライマーＣ−κと組合せて、増幅する。他の適
当なプライマーが本明細書で提供される配列表から得られ得ると当業者ならば認
識し得るが、ＵＣＨＴ−１のＦｖ領域の単離に適当なプライマーを実施例１に記
載する。
【００９４】 粗ＰＣＲ産物を、適当なクローニングベクターにサブクローニングする。ＤＮ
Ａ制限酵素による正確な大きさの挿入物を含むクローンを同定する。重鎖または
軽鎖コーディング領域のヌクレオチド配列を、クローニング部位に隣接するシー
ケンシングプライマーを用い二本鎖プラスミドＤＮＡから決定し得る。商業上利
用できるキット(例えば、Sequenase kit, U.S. Biochemical Corp. Cleveland,
Ohio, USA)を用い、ＤＮＡのシークエンシングを促進し得る。
【００９５】 本明細書で開示の配列情報を得ると、当業者は、既知の方法を使用してこれら
の配列をコードする核酸を容易に調製し得ることもまた認識されるであろう。そ
のため、Ｆｖ領域をコードするＤＮＡは、例えば、リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)お
よび自己持続配列複製(self-sustained sequence replication)のような増幅技
術、適当な配列のクローニングおよび制限処理またはホスホトリエステル法、ホ
スホジエステル法、ジエチルホスホラミダイト法および固相支持体法によるよう
な直接の化学的合成を含む、任意の適当な方法により調製され得る。化学合成は
、一本鎖オリゴヌクレオチドを生ずる。これは、相補性配列とのハイブリダイゼ
ーションによるか、または鋳型として一本鎖を使用しＤＮＡポリメラーゼにより
重合化することにより、二本鎖ＤＮＡ中に変換し得る。完全な一本鎖Ｆｖ領域を
化学的に合成し得る一方、後に同時にライゲーションする多数の短い配列(約１
００から１５０塩基)を好ましくは合成する。他に部分配列がクローニングされ
、適当な部分配列が適当な制限酵素を使用し切断され得る。次いで、断片をライ
ゲーションし、望ましいＤＮＡ配列を作成し得る。
【００９６】 一旦、Ｆｖ可変性軽鎖および重鎖ＤＮＡを得ると、当該配列は、直接か、また
はペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を介するか何れかにより、または、
当業者に既知の技術を使用するＰＣＲにより、同時にライゲーションされ得る。
好ましい実施態様では、重鎖および軽鎖領域は、軽鎖Ｆｖドメインのカルボキシ
ル末端で始まり重鎖Ｆｖドメインのアミノ末端で終了する融通性ポリペプチドリ
ンカーにより連結される。全配列は、一本鎖ＣＤ３結合部分の形成においてＦｖ
ドメインをコードする。
【００９７】 ｂ．ＣＤ３結合領域およびＰＥ部分の融合：Ｆｖ領域は、直接毒素部分に融合
され得るか、またはコネクターペプチドを介して連結し得る。コネクターペプチ
ドを単に用い、抗体と毒素部分との間にスペースを提供するか、または最適な立
体配座のそれぞれの達成を可能とするこれら領域間での移動性を促進し得る。コ
ネクターペプチドを含むＤＮＡ配列はまた、クローニングを促進する配列(プラ
イマー部位または制限酵素部位のような)を供するか、または抗体および毒素部
分をコードする配列間のリーディングフレームを保護し得る。
【００９８】 一般に、本発明の免疫毒素融合タンパク質のクローニングには、ＣＤ３結合部
分をコードするＤＮＡおよびＰＥ毒性部分をコードするＤＮＡを別々に調製する
こと、および特定の望ましい融合タンパク質をコードする構成を形成するプラス
ミドまたは他のベクター中に当該ＤＮＡ配列を組換えることが含まれる。ベクタ
ーは、適当なプロモーター配列などを含む発現プラスミドであるか、またはその
後に免疫毒素コーディングＤＮＡ断片は、発現プラスミド中に移され得る。他の
アプローチには、ＣＤ３結合部分をコードするＤＮＡを、ＰＥ毒素部分を既にコ
ードしている構成中に挿入させることを含む。
【００９９】 ｃ．組換え体免疫毒素の発現：本発明のタンパク質は、E. coli、他の細菌性
宿主、酵母、ならびにＣＯＳ、ＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞系および骨髄腫細胞系
のような種々の高等真核細胞を含む、種々の宿主細胞において発現し得る。組換
え体タンパク質遺伝子は、各宿主の適当な発現調節配列に実施可能となるように
結合し得る。E. coliの場合、これには、Ｔ７、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｌａｃまたは
ラムダプロモーターのようなプロモーター、リボゾーム結合部位、および好まし
くは転写終結シグナルが含まれる。真核性物の場合、調節配列には、プロモータ
ーおよび好ましくは免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスな
どから得られるエンハンサー、およびポリアデニル化配列が含まれ、スプライス
ドナーおよびアクセプター配列を含み得る。
【０１００】 ジフテリア毒素およびPdeudomonas外毒素は両方とも、伸長ファクター−２(Ｅ
Ｆ−２)のＡＤＰリボシル化、本質的に真核性翻訳ファクターによる真核性細胞
におけるタンパク質合成を妨げる。そのため、真核性発現の場合、ＥＦ−２が変
異し、そのためP.外毒素によるＡＤＰリボシル化に耐性となる細胞を使用するこ
とが好ましい。その変異体宿主および変異体ＥＦ−２タンパク質は、哺乳類[Moe
hring et al., Somatic Cell Genetics 5:469-480(1979):Kohno et al., J. Bio
l. Chem. 262:12298-12305(1987)]および酵母細胞[Phan et al., J. Biol. Chem
. 268:8665-8668 (1993);Kimata, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 19
1:1145-1151(1993)]の両方について述べられている。
【０１０１】 本発明のプラスミドは、E. coliの場合には塩化カルシウム形質転換および哺
乳類細胞の場合にはリン酸カルシウム処置またはエレクトロポレーションのよう
な既知の方法により選択宿主細胞中に移される。プラスミドにより形質転換され
る細胞は、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏおよびｈｙｇ遺伝子のようなプラスミドに含
まれる遺伝子により供与される構成物質への耐性により選択され得る。
【０１０２】 生物学的活性を減少させることなく、一本鎖Ｆｖ領域および一本鎖Ｆｖ領域を
含む融合タンパク質対して修飾が為され得ることは明らかである。幾つかの修飾
が為され、一本鎖Ｆｖ領域のクローニング、発現または融合タンパク質へ組み込
みを促進する。その修飾は、当業者に既知であり、例えば、開始部位を提供する
アミノ末端に添加されたメチオニン、または保存的に位置付けられた制限酵素部
位または終止コドンの何れかを作成した末端に置く付加アミノ酸が含まれる。例
えば、実施例１で使用するプライマーは、E. coliの発現のための開始メチオニ
ンをコードする配列およびクローニングを促進するＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、Ｓａ
ｌＩ、ＮｃｏＩおよびＢｓｔＸＩ制限酵素部位を導入する。一度発現すると、組
換え体タンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、アフェニティーカラム、カラムク
ロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当分野に既知の標準的方法により精
製され得る。少なくとも約９０から９５％の実質的に純粋な組成物が好ましく、
９８から９９％、または９９％を超える一様性を有する組成物が医薬の使用に最
も好ましい。一旦、部分的にまたは望ましい一様性にまで精製すると、ポリペプ
チドは、医薬目的の内毒素から実質的に解き放たれ、治療に使用され得る。
【０１０３】 当業者は、化学合成、生物学的発現、または精製後、一本鎖Ｆｖ領域または一
本鎖Ｆｖ領域を含む融合タンパク質は、天然のタンパク質とは実質的に異なる立
体配座を有し得ることを認識し得る。この場合、タンパク質を変性し、減少し、
次いで、好ましい立体配座にタンパク質をリフォールディングする必要があり得
る。
【０１０４】 E. coliのような細菌から、一本鎖抗体を発現し、および／または当該タンパ
ク質を変性し、一本鎖抗体を含む適当なフォールド形へのリフォールディングを
誘導する方法は、述べられており、既知であり、本発明のポリペプチドに適用し
得る[Buchner et al., Analytical Biochemistry 205:263-270(1992)]。
【０１０５】 特に、E. coliまたは他の細菌由来の機能性タンパク質は、しばしば、封入体
から生じ、強力な変性およびその後のリフォールディングを使用するタンパク質
の可溶化を必要とする。可溶化ステップにおいて、還元剤は、当分野に既知であ
るようにジスルフィド結合を切断(dissolve)するために存在しなければならない
。還元剤を伴う典型的な緩衝液は、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、６Ｍグアニジ
ン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ ＤＴＥ(ジチオエリトリトール)である。タンパ
ク質ジスルフィド結合の酸化還元は、上記Buchnerらにより述べられているよう
に、還元および酸化形の低分子量チオール試薬の存在下有効に触媒され得る。復
元は、典型的に、リフォールディング緩衝液中への変性および還元タンパク質の
希釈(例えば、１００倍)により行われる。８ｍＭ ＧＳＳＧの存在下の復元は、
再現し得る、高安定の産物を提供することが判明した。この目的の典型的な緩衝
液は、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ Ｌ−アルギニン、８ｍＭ 酸
化型グルタチオン(ＧＳＳＧ)、および２ｍＭ ＥＤＴＡである。
【０１０６】 ５．組換え体抗ＣＤ３免疫毒素の治療的使用 本明細書中で述べる免疫毒素ポリペプチドを、免疫系のＴ細胞仲介疾患または
病状を処置または予防するため、利用すると少なくとも部分的なＴ細胞の減少を
生ずる。免疫毒素は、患者のＴ細胞の数を全身的に減少させるため、インビボで
行う方法を利用する。免疫毒素はまた、処置細胞数からＴ細胞を減少させるため
、エキソビボで利用し得る。
【０１０７】 インビボ適用 患者においてＴ細胞を全身的に死滅させる目的で患者にインビボで投与するこ
とにより、ヒト(同種)または非ヒト(異種)源の何れかの由来の骨髄または幹細胞
移植または固形器官移植(solid organ transplantation)に関連する製剤、コン
ディショニングレジメまたは誘発耐性処置の構成要素として、Ｔ細胞仲介疾患ま
たは病状の予防または処置を提供することは本発明の範囲内である。
【０１０８】 ＢおよびＴリンパ球は両方とも、骨髄において通常のリンパ球の祖先、多能性
幹細胞から骨髄を起源とするが、Ｂリンパ球のみは骨髄中で成熟する。Ｔ細胞は
、胸腺へ移動して成熟し、次いで、血流へと入り、それは、末梢リンパ組織への
移動する。リンパ組織には、リンパ球がつくられる中枢リンパ器官、および適当
な免疫応答が開始する二次または末梢リンパ器官が含まれる。中枢リンパ器官は
、骨髄および胸腺である。末梢リンパ器官には、リンパ線、脾臓、消化管関連リ
ンパ組織、気管支関連リンパ組織および粘膜関連リンパ組織が含まれる(上記Jan
eway and Travers, §1-2)。
【０１０９】 本発明は、患者のＴ細胞仲介疾患の処置または予防の方法を含み、Ｔ細胞の減
少に有効量の本発明の免疫毒素を必要とする患者に投与することを含む。骨髄に
おけるＴ細胞レベルの減少によって、患者の末梢血液および／またはリンパ組織
は抗原に対する患者のＴ細胞仲介応答を改善し、耐性誘発の手助けをする。例え
ば、免疫毒素は、患者においてＴ細胞の減少を行い、それにより、患者における
移植同種性(または異種性)細胞、組織または器官のＴ細胞仲介の急性または慢性
移植拒絶を予防または減少するため、または細胞、組織または器官に対する免疫
学的耐性を発達させるため、同種移植(または異種移植)のレシピエントであるか
またはレシピエントとなる患者に有用にも投与し得る。
【０１１０】 好ましくは、器官移植拒絶を予防または処置するためにインビボで投与すると
き、免疫毒素は、期間中、数回にわたって患者に投与することが望ましい。通常
、少なくとも第１の投与は外科手術よりも先に行うこと(好ましくはできるだけ
早い時期に)、およびその後の投与をその時点または外科的手術後直ぐに開始さ
れることが好ましい。
【０１１１】 免疫毒素は、単独で、またはサイクロスポリンＡ、サイクロスポリンＧ、ラパ
マイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチルラパマイシン(ＲＡＤ)、ＦＫ−５
０６、ミコフェノール酸、ミコフェノレートモフェチル(ＭＭＦ)、サイクロホス
ホアミド、アザチオプレン、レフラノミド(leflunomide)、ミゾリビン、デオキ
シスペルグアリン化合物またはその誘導体または類似体、２−アミノ−２−[２
−(４−オクチルフェニル)エチル]プロパン−１,３−ジオール、好ましくは塩酸
塩のようなもの(ＦＴＹ７２０)、コルチコステロイド(例えば、メトトレキサー
ト、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン)、または他の免
疫修飾化合物(例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ)；抗−ＬＦＡ−１または抗ＩＣＡＭ抗
体、またはＴ細胞の共刺激を予防する他の抗体、例えば白血球レセプターまたは
そのリガンドに対する抗体(例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７
、ＣＤ２５、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ１５２(Ｃ
ＴＬＡ−４)、ＣＤ１５４(ＣＤ４０リガンド))を含む急性または慢性移植拒絶の
処置に有効な他の医薬と組合せて、何れかにおいてインビボで投与され得る。
【０１１２】 特に、長期移植引受および明白な免疫学的耐性は、本発明の抗ＣＤ３免疫毒素
と、デオキシスペルグアリン化合物または他のスペルグアリン類似体のようなス
ペルグアリン誘導体との組合せ投与により行い得、好ましい実施態様では、本発
明は、耐性誘発療法における抗ＣＤ３免疫毒素とデオキシスペルグアリン化合物
との組合せ投与を含む。例えば、要約がAmerican Society of Transplant Surge
ons, May 15, 1997に示されている、Eckhoffら、およびContrerasら、Transplan
tation 65:1159 (1998)参照(両方とも引用によりこの文書に加える)。“デオキ
シスペルグアリン化合物”なる語句には、ＵＳ４，５１８，５３２(引用により
この文書に加える)に開示の１５−デオキシ−スペルグアリン(“ＤＳＧ”と呼ば
れ、またグスペリムス(gusperimus)としても知られる)、すなわち、Ｎ−[４−(
３−アミノプロピル)アミノブチル]−２−(７−Ｎ−グアニジノヘプタンアミド)
−２−ヒドロキシエタンアミド、その医薬的に許容される塩；および特に、ＵＳ
４，５２５，２９９(引用によりこの文書に加える)に開示の(−)−１５−デオキ
シスペルグアリンおよびその医薬的に許容される塩が含まれる。所望により、活
性(Ｓ)−(−)または(Ｒ)−(＋)−１５−デオキシスペルグアリン異性体およびそ
の塩がＵＳ５，８６９，７３４およびＥＰ７６５，８６６(両方とも引用により
この文書に加える)に開示されており；およびＤＳＧのトリヒドロクロリド形が
ＵＳ５，１６２，５８１に開示されている(引用によりこの文書に加える)。
【０１１３】 耐性誘発療法において抗ＣＤ３免疫毒素による使用のための他のスペルグアリ
ン誘導体には、ＵＳ４，６５８，０５８、ＵＳ４，９５６，５０４、ＵＳ４，９
８３，３２８、ＵＳ４，５２９，５４９およびＥＰ２１３，５２６、ＥＰ２１２
，６０６(引用によりこの文書にすべて加える)に開示の化合物が含まれる。
【０１１４】 更に好ましい実施態様における本発明には、本発明による抗ＣＤ３免疫毒素と
、ＵＳ５，４７６，８７０およびＥＰ６００，７６２(両方とも引用によりこの
文書に加える)に開示の化合物のような他のスペルグアリン類似体、例えば、無
機および有機酸と共に、
【化１】 すなわち、２−[[[４−[[３−(アミノ)プロピル]アミノ]ブチル]アミノ]カルボ
ニルオキシ]−Ｎ−[６−[(アミノイミノメチル)−アミノ]ヘキシル]アセトアミ
ド(“トリスペリムス(tresperimus)”)およびその医薬的に許容される付加塩；
ＵＳ５，６３７，６１３およびＥＰ６６９，３１６(引用によりこの文書に加え
る)に開示の化合物、例えば、
【化２】 すなわち、２−[[[４−[[３(Ｒ)−(アミノ)ブチル]アミノ]ブチル]アミノカルボ
ニルオキシ]−Ｎ−[６−[(アミノイミノメチル)アミノ]ヘキシル]アセトアミド
トリス(トリフルオロ酢酸)および他の医薬的に許容されるその塩との組合せ投与
が含まれる。上記化合物の医薬的に許容される塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸
およびリン酸、および(有機酸に関し)フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸
、蓚酸およびクエン酸；ＵＳ５，７３３，９２８およびＥＰ７４３，３００(引
用によりこの文書に加える)に開示の化合物；ＵＳ５，８８３，１３２およびＥ
Ｐ７５５，３８０(引用によりこの文書に加える)に開示の化合物；およびＵＳ５
，５０５，７１５(例えば、col. 4, I. 44-col. 5, I. 45)(引用によりこの文書
に加える)に開示の化合物を含む無機酸または有機酸を伴う塩を含む。
【０１１５】 “組合せ投与”は、本発明の抗ＣＤ３免疫毒素およびスペルグアリン誘導体ま
たは類似体の両方による、有機移植レシピエントの処置を意味する。
【０１１６】 免疫毒素およびスペルグアリン誘導体または類似体の投与は、同時に行われる
必要はないが、むしろ時間的に別け得る。しかし、典型的に、免疫毒素およびス
ペルグアリン関連化合物の一連の投与は、少なくともある程度重複する。
【０１１７】 抗ＣＤ３免疫毒素の全用量は、好ましくは、２−３の注射により得られ、最初
の投与は、移植よりも最大実施可能時間前に行い、その後の注射は例えば約２４
時間の間を開ける。
【０１１８】 免疫毒素は、好ましくは、移植前および移植時および／または移植後に投与さ
れる。同種移植では、抗ＣＤ３免疫毒素の投与は、好ましくは、移植外科手術よ
りも約２−６時間前に行い、その一方、異種移植または生体同種移植の場合、第
１の抗ＣＤ３免疫毒素注射は、移植よりも約１週間前に行い得る。例えば、Knec
htle et al.[Transplantation 63:1(1997)]参照。耐性誘発療法では、免疫毒素
処置は、好ましくは、移植後、約１４日までに、および好ましくは約７日までに
、または５日までに、更には３日までに終了される。
【０１１９】 スペルグアリン誘導体または類似体は、移植前、移植時および／または移植後
に投与され得る。移植前または後の何れかの処置の長さが変化し得る。
【０１２０】 耐性誘発療法では、スペルグアリン誘導体または類似化合物による処置は、好
ましくは、移植後約１２０日未満で、およびより好ましくは移植後約６０日後、
およびより好ましくは約３０日、およびまたより好ましくは移植後１４未満、ま
たは約１０日で回収される。
【０１２１】 そのため、“組合せ投与”なる語句は、処置療法の範囲内に含まれ、この場合
、例えば、１つまたはそれ以上の用量の免疫毒素が移植前に投与され、その後、
移植時あたりで開始する１つまたはそれ以上の用量が投与される；スペルグアリ
ン誘導体または類似体が移植の前および／または移植時、および典型的には移植
後連続的に同時に投与される。
【０１２２】 メチルプレドニゾロンのようなコルチコステロイドを組合せ投与療法に組み込
め得る。例えば、ステロイド投与は、移植前に開始し得、その後１つまたはそれ
以上の投与を続け得る。
【０１２３】 本発明の抗ＣＤ３免疫毒素を、好ましくは、２−３ｌｏｇｓに患者のＴ細胞数
を減少させるのに十分な用量で提供する。本明細書により２−３ｌｏｇｓに患者
のＴ細胞数を減少させる総計有効用量は、対象の約５０μｇ／ｋｇ体重から約１
０ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは、約０．１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋ
ｇの間であり得る。
【０１２４】 スペルグリン誘導体または類似体による誘導処置のための用量療法は、０−３
０日で１から１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの間であり、所望により、例えば、１５日
で約２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである。
【０１２５】 更なるステロイドを、抗ＣＤ３免疫毒素注射時に、例えば、移植外科手術の日
に７ｍｇ／ｋｇ、＋２４時間で３．５ｍｇ／ｋｇ、および＋４８時間で０．３５
ｍｇ／ｋｇのようなメチルプレドニゾロンの減少療法として、投与し得る。他に
、ステロイド用量は、例えば免疫毒素注射時に４０ｍｇ／ｋｇメチルプレドニゾ
ロンによる一定の処置を維持し得る。ステロイドの正確な量および選択は、標準
的な臨床実施と一致して変化し得る。
【０１２６】 本発明の組合せ治療の好ましい実施態様では、組合せ治療の免疫毒素は、ｓｃ
Ｆｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８であり、特に、配列番号１を有する免疫毒素であ
る。当該ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８は、好ましくは、１５−デオキシス
ペルグアリン、特に(−)−１５−デオキシスペルグアリンと共投与される。他の
態様では、当該ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８は上記化合物(ａ)と共投与さ
れる。更なる実施態様では、当該ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８は上記化合
物(ｂ)と共投与される。
【０１２７】 上記組合せ治療および異種移植にかかわる本発明の他の方法の実施において、
特に、移植レシピエントがヒトの場合、ドナー細胞、組織または器官は、好まし
くは、ブタであり、最も好ましくは、トランスジェニック、例えば、ヒトＤＡＦ
発現、ブタから、補充される。
【０１２８】 本発明の方法の他の態様では、免疫毒素は、インビボで、宿主(すなわち、骨
髄移植レシピエント)Ｔ細胞の致死を介する対移植片性宿主病の予防または処置
のために骨髄レシピエントに投与され得る。骨髄移植は、白血病、無形成貧血ま
たは特定の遺伝子疾患のような特定の疾患の処置が必要であり、患者自身の骨髄
がひどく傷つくか、または全身の放射または化学治療が患者の造血系を破壊する
。骨髄移植による造血系の再構成の欠損によって、患者は、ひどく免疫抑制され
、感染が疑われることになる。
【０１２９】 ドナー同種性骨髄の安定な植付けは、大部分は、ドナーとレシピエントの間の
ＭＨＣマッチングに依存する。通常、１つまたは２つの抗原の範囲のみのミスマ
ッチングは、レシピエントＴ細胞による異なる骨髄移植片の拒絶のため、骨髄移
植に許容される。(また、以下で考察する対宿主性移植片病は、非常に不釣合い
があるとき非常にひどくなる。)加えて、わずかなミスマッチングが、通常、レ
シピエントＴ細胞を減少させるために致死用量または致死以下の用量の全身放射
または全リンパ球放射によるレシピエントのコンディショニングを必要とする。
患者を全体的にまたは殆ど免疫無能にする骨髄移植患者への放射線照射の必要性
は、潜在的に有用性のある、固形器官または細胞性移植、鎌状赤血球虚血、サラ
セミアおよび形成不能虚血を含む種々疾患に対する骨髄移植の臨床適用に対して
著しい制限を課する。
【０１３０】 本発明は、放射の非存在下でレシピエントＴ細胞を死滅する直接の方法を提供
することにより、この問題に取り組む。
【０１３１】 そのため、本発明は、他の態様において、患者に対するＴ細胞の減少に有効量
の免疫毒素の投与を含む、ドナー骨髄および／または幹細胞富化末梢血液細胞の
患者における植付け前に骨髄移植患者をコンディショニングする方法を提供する
。免疫毒素は、患者におけるＴ細胞群を減少させ、それにより、ドナー骨髄移植
片の宿主(すなわち、患者)の拒絶を予防する。造血幹細胞を富化するドナー組成
物を得る方法が、ＵＳ５，８１４，４４０、ＵＳ５，６８１，５５９、ＵＳ５，
６７７，１３６およびＵＳ５，０６１６２０(引用により本明細書に加える)に開
示されている。
【０１３２】 特に、すべてではないとしても、主としてＴリンパ球によって仲介される対宿
主性移植片病(ＧＶＨＤ)は、時として致命的な、多くは衰弱的な同種性骨髄移植
合併症である。ＧＶＨＤは、骨髄レシピエントにより移植片において獲得され、
宿主に対する免疫応答を発揮するドナーＴ細胞が原因となる。ＧＶＨＤは、典型
的に、ドナーとレシピエントのヒト白血球抗原(ＨＬＡ)の不完全な免疫学的マッ
チングから生ずる。 従って、本発明はまた、骨髄移植患者におけるＧＶＨＤの予防または処置の方
法を意図し、初期の移植後期間の、またはＧＶＨＤの症状が明らかとなったとき
の患者に対する本発明の免疫毒素の投与であって、ドナーおよび宿主Ｔ細胞を含
む宿主(すなわち、患者)のＴ細胞のレベルの減少に有意な量の投与を含む。ドナ
ーおよび宿主Ｔ細胞の初期の減少は、同種性キメラを創り出し；すなわち、免疫
毒素による宿主Ｔ細胞除去後に成熟する空間を提供するＴ細胞は、ドナーおよび
宿主の抗原の両方を耐性とし、対宿主性移植片拒絶に関与させない。“初期の移
植後期間”は、骨髄移植後の約２週間までの一日またはそれ以上の日の期間を意
味する。
【０１３３】 更なる実施態様では、本発明の抗ＣＤ３免疫毒素は、Ｔ細胞白血病およびリン
パ腫のような、他のＴ細胞仲介疾患を処置するために必要な患者に投与し得る。
上記のように、Ｔ細胞白血病およびリンパ腫の臨床処置は、典型的に、患者のリ
ンパ球を無差別に死滅するために全身に放射し、その後の骨髄置換に依存する。
白血病／リンパ腫患者に投与する本発明の免疫毒素は、全身性の放射をＴ細胞除
去の選択的方法に取って代え得る。
【０１３４】 本発明の更なる態様では、本発明の免疫毒素はまた、全身性エリテマトーデス
(ＳＬＥ)、Ｉ型糖尿病、リュウマトイド関節炎(ＲＡ)、重症性筋無力症および多
発性硬化症のようなＴ細胞仲介自己免疫疾患をインビボで、患者のＴ細胞を取り
除くことにより、処理するために投与され得る。免疫毒素はまた、後天性免疫不
全症候群(ＡＩＤＳ)のような免疫系の感染性疾患で苦しむ患者に、感染性Ｔ細胞
の患者を減少させるに十分な量を投与し、それにより、患者のＨＩＶ−１増幅を
阻害し得る。加えて、抗ＣＤ３免疫毒素は、慢性免疫抑制が例えば糖尿病または
代謝疾患それぞれの患者に島または肝細胞移植を促進することにより、許容され
ない場合の病状または疾患を処置するために患者に投与され得る。肝細胞移植が
妥当な疾患および感染症には、血友病、α１−抗トリプシン不全、およびビリル
ビン過剰血症が含まれる。
【０１３５】 上記本発明の方法では、患者は、好ましくはヒトであり、ドナーは、同種(す
なわち、ヒト)であるか異種(たとえば、ブタ)であり得る。当該移植は、非修飾
か修飾された器官、組織または細胞移植であり得、例えば、心臓、肺、複合心配
、気管、肝臓、腎臓、前立腺、島細胞、腸、例えば、小腸、皮膚、筋肉または四
肢、骨髄、食道、角膜または神経組織移植である。
【０１３６】 インビボの適用の場合、免疫毒素は、ＣＤ３担持細胞の標的とされた群の少な
くとも一部を死滅させるに有効な量を患者に投与する。
【０１３７】 一般的に、免疫毒素の有効量は、すなわち、リンパ系および／または末梢血液
において、１またはそれ以上のｌｏｇで、さらに好ましくは少なくとも約２ｌｏ
ｇで、また更に好ましくは少なくとも２−３ｌｏｇで、Ｔ細胞の標的群を減少さ
せる。最も有効な形式の投与および用量療法は、疾患のひどさおよび進行、患者
の健康および処置への応答ならびに医師の処置判断に依存する。そのため、その
分子の用量は、個人の対象に対し決定すべきである。
【０１３８】 骨髄移植に伴うＧＶＨＤの処置または予防において、免疫毒素は、骨髄移植直
後の患者血液およびリンパ球において見られる全Ｔ細胞群(すなわち、ドナーに
レシピエントを加えたＴ細胞)を、少なくとも約５０％およびより好ましくは少
なくとも約８０％、およびまた更に好ましくは少なくとも約９５％(例えば、９
９％)、すなわち、少なくとも２ｌｏｇ(例えば、２−３ｌｏｇ)、減少させるに
十分量の骨髄移植レシピエントに投与される。
【０１３９】 対移植片性宿主病および／またはＧＶＨＤを処置または予防する骨髄レシピエ
ントの適当な用量療法は、骨髄移植の直前および／または直後から６日間１日お
きに免疫毒素を投与し、合計で約１０−５００μｇ／ｋｇ、およびより好ましく
は２００−３００μｇ／ｋｇの用量をもたらす投与を含む。
【０１４０】 白血球／リンパ腫の処置の場合、免疫毒素は、投与時のＴ細胞群を、少なくと
も約５０％、およびより好ましくは約８０％、およびより好ましくは少なくとも
約９５％(例えば、９９％)、すなわち、少なくとも２ｌｏｇ(例えば、少なくと
も２−３ｌｏｇ)減少させるために有意な量を投与する。
【０１４１】 患者の骨髄におけるＣＤ３担持細胞および特にＴ細胞、血液またはリンパ組織
のレベルは、ＦＡＣＳ分析により検定され得る。
【０１４２】 末梢血液およびリンパ器官からＴ細胞を減少させる免疫毒素処置の効果は、血
液サンプル中のＴ細胞数と、免疫毒素処置前および後の対象から採取した浸軟化
リンパ組織からのＴ細胞数とを比較することにより、決定され得る。Ｔ細胞の減
少は、Nevilleら[J. Immunother. 19:85-92(1996)]により述べられているフロー
サイトメトリーにより追跡し得る。
【０１４３】 ジフテリア毒素の細胞結合ドメイン欠損形に結合する抗レーソスＣＤ３モノク
ローナル抗体を含む化学的結合免疫毒素による２ｌｏｇのＴ細胞数の減少は、レ
ーソスサルにおける腎同種移植片に対する移植耐性を伴うことが見られる[Thoma
s et al., Transplantation 64:124-135(1997); Knechtle et al., Transplanta
tion 63:1-6 (1997)]。
【０１４４】 一般的に、本明細書により、患者においてＴ細胞数を２−３ｌｏｇ減少させる
全有効量の用量は、最良なものは、約５０μｇ／対象の体重ｋｇと約１０ｍｇ／
ｋｇの間(例えば、約５０μｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇとの間)、およびより好まし
くは約０．１ｍｇ／ｋｇと１ｍｇ／ｋｇとの間であると述べることができる。
【０１４５】 患者は、毎日の単一または複数投与に基づき処置され得る。免疫毒素組成物は
また、月に基づき(または適当なときには週間間隔で)、また、単一または複数投
与に基づき投与され得る。
【０１４６】 一連の疾患状態では、投与の用量および時期が変り得ることが認識される。組
成物の初期投与は、上記範囲でより高用量となり得、疾患の処置後よりも頻繁に
投与され得る。
【０１４７】 例えば、実施例１のポリペプチドｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８は、腎移
植患者に投与され得、それは、移植直前から開始して、移植後１週間、毎日また
は１日おきに、平均患者(７０ｋｇ)ではポリペプチドを週あたり約０．３−１０
ｍｇの用量で投与し続ける。移植後の第一週の後、処置療法は、平均患者では週
あたり０．１から１ｍｇの範囲のポリペプチドの用量で、数週間おきに減少させ
る。しかし、免疫毒素処置は、移植後５週間に、および典型的には移植後３週間
または１週間に短縮される。
【０１４８】 エキソビボ適用 体から取り除かれる単離細胞群からのＴ細胞のエキソビボ減少の目的に免疫毒
素を利用することもまた、本発明の範囲内である。
【０１４９】 本発明は、移植または患者への導入前に本発明の免疫毒素と接触する細胞、組
織または器官を含む免疫系のＴ細胞仲介疾患または症状の予防または処置の方法
を含む。
【０１５０】 ある態様では、免疫毒素は、器官移植拒絶の予防の方法に使用され得、この場
合、当該方法には、取っておいたドナーＴ細胞の器官を一掃するため、レシピエ
ントへの移植前にＴ細胞の減少に有効量の免疫毒素を含む組成物でドナー器官(
例えば、心臓、肺、腎臓、肝臓)を潅流することが含まれる。
【０１５１】 本発明の他の態様では、免疫毒素は、Ｔ細胞白血球／リンパ腫または他のＴ細
胞仲介疾患または病状を、癌化または他に影響されたＴ細胞の患者細胞群(例え
ば、骨髄)を免疫毒素で一掃することにより、およびＴ細胞減少細胞群を患者に
再注入することにより、処置する自家組織治療におけるエキソビボの利用ができ
る。
【０１５２】 特に処置の方法には、 (ａ)患者からＣＤ３担持細胞(例えば、骨髄)を含む細胞群を補充すること (ｂ)Ｔ細胞の減少に有効量の免疫毒素で細胞群を処置すること、そして (ｃ)患者へ(例えば、血液中に)処置細胞群を再注入すること、 が含まれる。
【０１５３】 自家組織治療の更なる適用には、ＨＩＶにより感染した対象を処置する方法が
含まれ、 (ａ)ＨＩＶで感染したＴ細胞を含む患者から細胞群を単離すること、 (ｂ)Ｔ細胞の減少に有効量の免疫毒素で単離細胞群を処理すること、そして (ｃ)患者へ処置細胞群を再導入すること、 のステップを含む。
【０１５４】 本発明の更なる他の実施態様により、免疫毒素は、骨髄移植を行った患者にお
いて、対宿主性移植片病に対する予防および耐性の誘発としてドナー細胞群から
Ｔ細胞を減少させる目的でエキソビボで利用され得る。その方法には、 (ａ)適当なドナー(すなわち、適当なＭＨＣ、ＨＬＡマッチングを有する同種性
ドナー)の単離骨髄および／または幹細胞富化末梢血液細胞を含む細胞組成物を
提供すること、 (ｂ)生存可能なＣＤ３担持細胞(すなわち、Ｔ細胞)を少なくとも部分的に減少さ
せる接種物を形成する有効量の免疫毒素で細胞組成物を処置すること、そして (ｃ)処置した接種物を患者に導入すること、 のステップが含まれる。
【０１５５】 ドナー接種物からのＴ細胞減少の利点により、植付け後に成熟するドナーＴ細
胞は、宿主を免疫学的に耐性とし、対宿主性移植片病拒絶を開始しないことであ
る。
【０１５６】 有利なことに、上記エキソビボ治療の目的では、免疫毒素は、インビボで成し
遂げるか、または耐性とし得るレベルがはるかに過剰の治療濃度で提供され得る
。例えば、免疫毒素は、培養中にＣＤ３担持細胞を死滅させるため、約０．５か
ら５０，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で培養中にＣＤ３発現性細胞をインキュベーシ
ョンし得る。
【０１５７】 そのため、実施例１で調製した０．００５から５０μｇ／ｍｌの免疫毒素を有
する１時間２５℃の培養培地中のヒトサイトカイン修飾末梢血液白血球(ＣＭＰ
ＢＬ、５×１０６ｍｌ)のインキュベーションの結果、ＣＤ３＋細胞数が約２．
５ｌｏｇ減少し、３Ｈチミジン吸収により測定するとバックグラウンドレベルに
ＰＨＡ誘導増殖が減少する。
【０１５８】 更なる態様では、上記エキソビボ治療方法は、免疫毒素のインビボ投与と組合
され、骨髄移植患者の拒絶を処置または予防し、免疫学的耐性を生ずる改善方法
を提供し得る。例えば、骨髄移植を行った患者の対移植片性宿主病および／また
は対宿主性移植片病の予防および／または処置のための本発明の免疫毒素のイン
ビボおよびエキソビボの両方の投与を含む方法には、 (ａ)患者の生存可能なＣＤ３担持細胞(すなわち、Ｔ細胞)のレベルを減少させる
こと(すなわち、患者の末梢血液またはリンパ系から)、 (ｂ)Ｔ細胞の減少に有効量の免疫毒素で適当なドナーを処置する造血細胞(すな
わち、骨髄および／または幹細胞富化末梢血液細胞)を含む接種物を提供するこ
と、そして (ｃ)患者へ接種物を導入し、その後、所望により、ドナーおよび患者のＴ細胞を
更に減少させるため免疫毒素を患者に投与すること、 のステップが含まれる。
【０１５９】 ステップ(ａ)、すなわち、患者Ｔ細胞の減少は、患者への免疫毒素のインビボ
の投与により、および／または従来述べられているような、単離患者骨髄または
末梢血液の免疫毒素によるエキソビボ処理を含む自家組織治療により、行い得る
。
【０１６０】 上記のような本発明のインビボおよびエキソビボ方法は、急性リンパ芽球白血
病(ＡＬＬ)、急性非リンパ芽球白血病(ＡＮＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)の
ような白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、重症複合型免疫不全証拠群(ＳＣＩＤ)、オ
ステオポローシス、無形成性貧血、ゴーシェ病、サラセミア、菌状息肉腫(ＭＦ)
、セザニー症候群(Sezany syndrome)(ＳＳ)、または他の先天的または遺伝的に
決定される造血異常を含む骨髄移植により治癒し得または治療し得る疾患の処置
に適当である。
【０１６１】 特に、また、同種性または異種性細胞治療または組織もしくは器官移植に関連
してドナー特異的および抗原特異的耐性を誘導する薬剤として免疫毒素を利用す
ることは、本発明の範囲内である。そのため、免疫毒素は、患者において、ドナ
ー細胞、組織または器官、例えば、心臓、肺、複合心配、気管、肝臓、腎臓、前
立腺、島細胞、腸、例えば、小腸、皮膚、筋肉または四肢、骨髄、食道、角膜ま
たは神経組織に免疫学的耐性を誘発するコンディショニング療法の一部として投
与され得る。
【０１６２】 全身性ドナー特異的移植耐性は、レシピエントの全体的リンパ球放射、その後
のドナー細胞による骨髄移植の結果としてキメラを介するＭＨＣミスマッチの動
物モデルおよびヒトにおいて一時的に達成される。再構成動物は、Ｔ細胞、Ｂ細
胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、赤血球および血小板を含むすべて
のリンパ造血系統のドナーおよびレシピエント細胞の両方を含む、末梢血液の安
定性混合複数系統キメラを示す。更に、混合同種性キメラは、ドナー型皮膚移植
片に対するドナー特異的耐性を示すが、それらは容易に第三者移植片を容易に拒
絶する。ドナー特異的耐性はまた、キメラから得られるリンパ球が増殖および同
種性ドナー細胞に対する細胞毒性活性を減少するが、第三者細胞に対する通常の
免疫反応性を保持することが見られるインビトロアッセイにより確認される。
【０１６３】 そのため、本発明は更に、ドナー細胞、組織または器官で移植された患者のコ
ンディショニングの方法を意図する。本発明は、 (ａ')患者(すなわち、患者の末梢血液またはリンパ系において)の生存可能なＣ
Ｄ３担持細胞(すなわち、Ｔ細胞)のレベルを減少させること、 (ｂ')Ｔ細胞の減少に有効量の免疫毒素で処置したドナーの単離造血細胞(すなわ
ち、骨髄および／または幹細胞富化末梢血液細胞)を含む接種物を提供すること
、 (ｃ')患者に接種物を導入し、その後、 (ｄ')ドナー細胞、組織または器官を患者に移植すること、または (ａ)患者におけるＣＤ３担持細胞群を減少させること、 (ｂ)Ｔ細胞の減少に有効量の免疫毒素で処置したドナーの単離骨髄および／また
は幹細胞富化末梢血液細胞を含む接種物を提供すること、 (ｃ)患者に接種物を導入すること、 のステップを含む。
【０１６４】 上記方法は、好ましくは、全身性放射または全体的リンパ球放射の非存在下、
および最も好ましくは任意の放射の非存在下、行う。
【０１６５】 ６．免疫毒素を含む組成物 本発明の組換え体免疫毒素は、医薬的に許容される担体において非修飾ポリペ
プチドまたは医薬的に許容されるその塩として投与され得る。 本明細書で使用するとき“医薬的に許容される塩”は、ポリペプチド鎖のアミ
ノ基の酸付加塩を形成する医薬的に許容される非毒性酸から、またはポリペプチ
ド鎖のカルボキシル基の塩基性塩を形成する医薬的に許容される非毒性塩基から
、調製される塩をいう。その塩は、内部塩としておよび／または本発明のポリペ
プチドのアミノまたはカルボキシル末端の塩として形成され得る。適当な、医薬
的に許容される酸付加塩は、医薬的に許容される、非毒性有機酸、ポリマー性酸
または無機酸のものである。適当な有機酸の例には、酢酸、アスコルビン酸、安
息香酸、ベンゼンスルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコ
ン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リ
ンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、蓚酸、パモイック酸(p
amoic)、パントテン酸、リン酸、サリチル酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−ト
ルエンスルホン酸など、ならびにタンニン酸またはカルボキシメチルセルロース
のようなポリマー性酸が含まれる。適当な無機酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸
、リン酸、硝酸などのような無機酸が含まれる。カルボキシル基の形成塩の適当
な無機塩基の例には、ナトリウム、カリウム、リチウム塩のようなアルカリ金属
塩；例えば、カルシウム、バリウムおよびマグネシウム塩のようなアルカリ土類
金属；およびアンモニウム、銅、第一鉄、亜鉛、マンガン(II)、アルミニウム、
マンガン(III)塩などが含まれる。好ましいのは、アンモニウム、カルシウム、
マグネシウム、カリウムおよびナトリウム塩である。カルボキシル基の形成塩に
適当な医薬的に許容される有機塩基の例には、例えば、トリメチルアミン、トリ
エチルアミン、トリ(ｎ−プロピル)アミン、ジシクロヘキシルアミン、β−(ジ
メチルアミノ)−エタノール、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、トリエ
タノールアミン、β−(ジエチルアミノ)エタノール、アルギニン、リシン、ヒス
チジン、Ｎ−エチルピペリジン、ヒドラバミン(hydrabamine)、コリン、ベタイ
ン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルコサミン(methylglucamine)
、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、カフェイン、プロカインな
どのような有機アミンが含まれる。
【０１６６】 ポリペプチドの酸付加塩は、ポリペプチドを、１つまたはそれ以上の等価な所
望の無機または有機酸、例えば、塩酸に接触させることによる通常の方法により
調製され得る。ペプチドのカルボキシル基の塩は、通常、ペプチドを、１つまた
はそれ以上の等価な所望の塩基、例えば、金属性水酸化塩基、例えば水酸化ナト
リウム；例えば、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムのような金属性炭酸ナ
トリウムまたは重炭酸塩基；または例えば、トリエチルアミン、トリエタノール
アミンなどのようなアミン塩基などに接触させることにより、調製され得る。
【０１６７】 インビボかエキソビボ適用の何れかの場合、本発明の医薬組成物には、好まし
くは、滅菌した、発熱物質のない、非経口的に許容される液体である担体が含ま
れる。水、生理食塩水、水性デキストランおよびグリコールは、好ましい液体担
体、特に(等張性であるとき)注射溶液またはエキソビボ使用の場合に好ましい。
【０１６８】 免疫毒素またはその塩を含む組成物を全身的に、すなわち非経口的に(例えば
、筋肉注射的に、静脈注射的に、皮下注射的に、または皮内注射的に)投与され
るか、または腹膜内注射により投与され得る。
【０１６９】 静脈内投与または器官の体腔もしくは管腔への投与のような非経口的投与に特
に有用な組成物には、通常、医薬的に許容される担体、好ましくは緩衝性生理食
塩水などの水性担体に可溶される融合タンパク質の溶液を含む。これら組成物は
、滅菌され、通常、望ましくない問題を有さない。これら組成物は、通常既知の
滅菌技術により滅菌され得る。当該組成物はまた、ｐＨ調節および緩衝性剤、毒
性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
カルシウム、乳酸ナトリウムなどを必要とするため、医薬的に許容される補助物
質を含み得る。これら製剤中の免疫毒素タンパク質の濃度は、広く変化し得、選
択された特定の投与形式および患者のニーズにより、液体体積、粘性、体重など
に主として基づいて選択される。非経口的に投与される組成物を調製する実際の
方法は、当業者に既知であるかまたは明白であり、刊行物Remington's Pharmace
utical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980)に
詳細に述べられている。
【０１７０】 免疫毒素またはその塩を含む医薬組成物はまた、経口、局所、または局所投与
、例えば、エアロゾルまたは経皮的に使用され得る。
【０１７１】 経口投与に適当な単位投与形には、粉末、錠剤、丸薬、カプセルおよびトロー
チ剤が含まれる。経口投与するとき、ポリペプチドは、例えば、タンパク質を酸
性および酵素学的加水分解に耐性とする組成物とタンパク質を複合することによ
り、またはリポソームのような適当な耐性担体にタンパク質をパッキングするこ
とにより、消化から保護されなければならない。消化からタンパク質を保護する
種々の手段は、当分野に既知である。
【０１７２】 局所投与形の例には、スプレー、点眼液、鼻腔溶液および軟膏が含まれる。例
えば、スプレーは、適当な溶媒中にペプチドを溶解することにより、および吸入
治療に通常用いるエアロゾルとしての役割をするスプレーとすることにより、製
造され得る。点眼または鼻腔溶液は、活性成分ペプチドを蒸留水中に溶解し、緩
衝剤、等張剤、シックナー、保存剤、安定化剤、界面活性剤、殺菌剤などのよう
な必要な任意の補助剤を加え、ｐＨ４から９に混合物を調節することにより、製
造され得る。軟膏はまた、例えば、２％水性カルボキシビニルポリマーのような
ポリマー溶液および、２％水酸化ナトリウムのような塩基から組成物を調製し、
ゲルを得るため混合し、ゲルと特定量の精製融合ポリペプチドを混合することに
より、調製し得る。
【０１７３】 当該組成物は、当分野に既知の方法により調製された凍結乾燥物であり得る。
【０１７４】 本発明のインビボの方法の実施において、治療的に有効量の組換え体免疫毒素
ポリペプチド、医薬的に許容されるその塩、または上記と同一のものを含む医薬
組成物を必要な患者に投与する。
【０１７５】 以下の例示は、本発明を解説するため、同じものを作成し使用する当業者の手
助けをするために示したものであり、本発明を限定することを目的としたもので
はない。
【０１７６】 実施例 ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８の調製 (ａ)ハイブリドーマ細胞由来のＵＣＨＴ−１抗体可変領域のクローニング マウス抗ヒトＣＤ３のＦｖ領域をコードする遺伝子は、開示のＵＣＨＴ−１ｓ
ｃＦｖ(Shalaby et al.上記)の配列およびクローニング抗体可変領域[Orlandi e
t al., PNAS 86:3833-3387(1989)]に述べられている共通プライマーに基づくオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いＵＣＨＴ−１ハイブリドーマＲＮＡ(Beverle
y and Callard, 1981)からＲＴ−ＰＣＲにより増幅される。配列番号１１から配
列番号２２を参照。 オリゴＩＭ３４ＡおよびＩＭ３４Ｂを用い、ＶＬ領域を増幅し、ＩＭ−６１お
よびＩＭ−３４Ｃを用い、ＶＨ断片を増幅する。次いで、２つの増幅断片をE. c
oliプラスミドベクター(ＴＡベクター、Invitrogen)および決定されたそのＤＮ
Ａ配列にサブクローニングする。クローニングＤＮＡ配列を決定後、ｐＵＣ１８
および適当な制限酵素部位のサブクローン化ＰＣＲ断片を切断しＴ４ＤＮＡリガ
ーゼによりライゲーションすることにより２分子を単一のｐＵＣ１８基礎のプラ
スミドに組合せる。ＶＬを含みその後にポリリンカー次いでその後にＶＨを含む
このプラスミドをＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断する。２つのアニール化オリゴ
、ＩＭ−２４ＡおよびＩＭ２４Ｂを含み、消化し、これら２つの部位に相補的な
末端を含む、リンカーをＸｂａＩおよびＳａｌＩ部位の間に挿入する。生じたク
ローン‘ＣｌｏｎｅＢ’は、配列番号２に述べるものとは異なるリンカーにより
、一本鎖免疫毒素をコードする。このリンカーと、ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−Ｐ
Ｅ３８に使用されるリンカー(ＧＧＧＳ)４(配列番号５)との置換を以下に述べる
。しかし、最初に必要なことは、上記Shalabyらにより報告されたクローンＦｖ
断片の配列に関係して観察される可変領域配列における２つの変化である： (１)重鎖配列(ＶＨ)中のヌクレオチド２０８位のＡからＣへの変化。これは、ア
ミノ酸(Ｌｅｕ)がこの位置でコードされていると報告されており、当該論文では
ヌクレオチド配列とは関係していないが現在得られたクローンの配列とは関係す
るため、上記Shalabyらによるエラーを反映しているようである。そして、 (２)アミノ酸残基９８のＰｈｅからＳｅｒへの変化。これは、ＰＣＲ誘導エラー
であり、ＶＬのこの点変異は、望ましいヌクレオチド変化が相補性オリゴＶＬ２
およびＶＬ３を用い組み込まれる標準的な４法ＰＣＲ反応を用い校正される。隣
接オリゴ、５'側のＶＬ１および３'側のＶＨ４は、下記のように変化を安定化す
る。
【０１７７】 ａ１．ＶＬ中の点変異の校正 鋳型としてｐＵＣ１８／ＵＣＨＴ−１‘ＣｌｏｎｅＢ'を用いるＰＣＲ反応は
、オリゴ対ＶＬ１およびＶＬ２またはＶＬ３およびＶＨ４で開始される。２つの
個別のＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動で分離され、その相補性末端は、アニーリン
グされ、ＶＬ１およびＶＨ４を用いこれら２つの断片に連結する第２のＰＣＲ反
応を、鋳型として先のアニーリングした産物を使用して行われる。
【０１７８】 ａ２．‘ＣｌｏｎｅＢ’由来のリンカーの置換 ＶＬおよびＶＨを分離するリンカーは、鋳型として校正される点変異を有する
プラスミドを用い、２つの連続的なＰＣＲ反応により、配列(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)４ (配列番号５)を含むリンカーに変化される。両方の連続反応のための５'プライ
マーはベクター配列(Ｍ１３Ｒ；New England Biolabs)のベクター配列に相補的
である。第１のＰＣＲ反応の３'プライマーはＶＬ６であり、第２の反応用の３'
プライマーはＶＬ８である。ＶＬ６およびＶＬ８は、コーディング鎖に相補的で
あり；ＶＬ８中のＢｓｔＸＩ部位は、ＵＣＨＴ−１のＶＨ断片のＮ末端方向に生
ずる。この第２のＰＣＲ反応から生ずるＰＣＲ産物は、ＶＬのＣＯＯＨ末端、新
規リンカーおよびＶＨのＮ末端をコードする(ちょうどＢＳＴＸＩ部位を超える)
。この第２のＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物は、更に第３のＰＣＲ反応へと拡大し
、ＶＬのＮ末端領域を加える。この反応は、３'プライマーとして第２のＰＣＲ
産物を、５'プライマーとしてベクター内のＭ１３Ｒ(New England Biolabs)プラ
イマーを使用する。この第３のＰＣＲ反応の鋳型は、ｐＵＣ１８／ＵＣＨＴ−１
‘ＣｌｏｎｅＢ'プラスミドである。第１と第２のリンカーを置換し、ＶＨの残
りにＰＣＲ産物を結合させるために、この第３の反応からＰＣＲ産物を、ＶＬの
連結部分で生ずるＢａｍＨＩで切断し、ベクターはＶＨ内に生ずるＢｓｔＸＩで
切断する。ｐＵＣ１８／ＵＣＨＴ−１‘ＣｌｏｎｅＢ'プラスミドはまた、Ｂａ
ｍＨＩおよびＢｓｔＸＩで切断され、相当する領域は、新規産物で置換される。
【０１７９】 実施例１で使用したプライマーおよびオリゴは、配列番号１１、配列番号１２
、配列番号１３、配列番号１４(クローニングに使用されるコーディングオリゴ)
、配列番号１５(リンカーに使用されるコーディングオリゴ)、配列番号１６(リ
ンカーに使用する相当する非コーディングオリゴ)、配列番号１７(ｎｔ１０２−
１２４のＶＬの５'末端)、配列番号１８(ｎｔ＃２９３に正しいＴを有する３'プ
ライマー)、配列番号１９(ｎｔ２９３に正しいＴを有する５'プライマー)、配列
番号２０(非コーディングプライマー)、配列番号２１および配列番号２２である
。
【０１８０】 (ｂ)ＰＥ３８のクローニング ＰＥ３８のクローニングは、Benharら[Bioconjugate Chem. 5:No.4(1994)]に
より、およびＵＳ５，９８１，７２６およびＵＳ５，９９０，２９６(引用によ
りこの文書に加える)に記載されている。
【０１８１】 (ｃ)免疫毒素融合の調製 新規ｓｃＦｖをｐＥＴ１５ｂE. coli発現ベクター(Novagen)中にクローニング
する。最初に、ＰＣＲを用い部位をｓｃＦｖに加え、ｐＥＴ１５ｂクローニング
ベクターおよびP.exotoxin含有プラスミド、ｐＲＢ３９１(I.Pastanにより送ら
れた)由来のＨｉｎｄIIIに適するこの断片を作成する。(他に、ＰＥ３８断片を
コードするＤＮＡ配列は、標準的なＰＣＲ法および適当なオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用い、ＡＴＣＣ６７２０８としてＡＴＣＣに寄託されているｐＪＨ８
プラスミドから再構成した。この方法では、ｐＪＨ８プラスミドは、ＨｉｎｄII
I部位をＰＣＲにより加える変異を必要とし、コネクター配列は、ｐＲＢ３９１
プラスミド中に存在し、Benharら1994、上記、に述べられている。加えて、ＰＥ
４０断片内のドメインＩｂの１６アミノ酸(天然ＰＥの３６５−３８０)の除去は
、ＰＣＲにより行われ、ｐＲＢ３９１のＰＥ３８断片と機能同一のプラスミドを
生ずる。生じたプラスミドが同じ翻訳フレーム内にある確認は、ＤＮＡ配列分析
により得られ得る。)
【０１８２】 ＮｃｏＩ制限酵素部位をコードするＮ末端残基ＭｅｔおよびＡｌａを加え、プ
ラスミドの発現を促進する。
【０１８３】 産物のアミノ酸配列(Ｎ末端のＭｅｔ−Ａｌａを含む)は配列番号２に与えられ
ており、相当するヌクレオチド配列は配列番号１に与えられている。
【０１８４】 配列番号２では、ＶＬは、残基３−１１１を含み、ペプチドリンカーは、残基
１１２−１２７を占め、ＶＨは、残基１２８−２４９を含み、コネクターは、残
基２５０−２５４に位置し、そしてトランケートＰＥは、残基２５５−６０１を
含む。アミノ末端残基ＭｅｔおよびＡｌａは、E. coliプラスミドｐＥＴ１５ｂ
から発現を促進するために加えられたＮｃｏＩ制限酵素部位(ヌクレオチド１か
らヌクレオチド６のＤＮＡ配列)によりコードされる。ＥｃｏＲＩ部位(ヌクレオ
チド１０９１からヌクレオチド１９０６のＤＮＡ配列)とＢｇｌII／ＢａｍＨＩ
部位(ヌクレオチド１９３９からヌクレオチド１９４４のＤＮＡ配列)との間の３
'非コーディングＤＮＡは、中間体クローニングベクター(ｐＬｉｔｍｕｓ３８、
New England Biolabs)のポリリンカー由来の配列全体を有する。ヌクレオチド７
５１からヌクレオチド７５６のＤＮＡ配列のＨｉｎｄIII制限酵素部位が存在す
る。
【０１８５】 E. coli株ＢＬＲ(ＤＥ３)におけるｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８の発現
が見られ、配列番号２の残基２−６０１を有するアラニン−ｌｅｄポリペプチド
を含む高い同一性産物(純度９５％以上)を生ずる。
【０１８６】 (ｄ)ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８の発酵、リフォールディングおよび精製 組換え体ｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８の産生の方法を、５０Ｌのスケー
ルで確立する。ＰＥＴ１５ｂをE. coli BLR(DE3)(Novagen, Inc.)に形質転換す
る。自己制御、ｐＨ−スタット−グリセロールフィーディングストラテジーを用
いるフェドバッチシステムを使用する。フィーディングは、開始量の炭素源が減
少し、グリセロールが自動的に制限的方法で加えられ、ｐＨが調節されるた後正
確に開始される。この方法は、過剰グリセロールのおよびまた完全炭素源減少の
有害な効果を避ける。 最適な培地は、６ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．６ｇ／ｌ ＫＣｌ、０．２ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２４．０ｇ／ｌＮ−Ｚ−アミンＡ、７２ｇ／ｌ酵母抽
出物、１００ｍｇ／ｌクエン酸Ｆｅ(III)アンモニウム、１２ｍｇ／ｌＭｎＳＯ
４・Ｈ２Ｏおよび１０ｇ／ｌグリセロールを含む。最適な発現レベルには、ラク
トースパルス誘導がＯＤ５５０ ５０で必要である。このアプローチを用い、１
ｋｇ封入体を含む湿細胞ペレット４．３ｋｇを、下記条件下、発酵実験から２４
時間後回収する：体積：５０ｌ；ミキシング：２００−２５０ｒｐｍ；エアレー
ション／圧：１ｖｖｍ／１ｂａｒ；ｐＯ２調節：手動調節；ｐＨ調節：６．７＜
ｘ＜７．１；アルカリ：２Ｎ ＮａＯＨ；温度：３７℃；接種：ＯＤ５５０＝１
．８のＬＢの増殖培養あたり１．０ｌ；誘導：ＯＤ５５０＝５２で５０ｇ／ｌ
Ｄ−ラクトース；収集：誘導後１１時間。
【０１８７】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度計で評価すると、全細胞性タンパク質の２５％の
発現レベルが、ＯＤ５５０ ５０で過剰Ｄ−ラクトースで誘導後に到達する。こ
のアプローチを用い、発酵ブロスあたり８６ｇ湿細胞ペレット(ｗｃｐ)および２
０ｇ封入体(ＩＢｓ)の産生性が測定される。１．４ｇ／ｌの産物力価は、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよびｓｃＦｖ(ＵＣＨＴ−１)−ＰＥ３８の濃度計定量により決定さ
れる。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/436 Ａ６１Ｋ 31/436 ４Ｃ０８５ 31/52 31/52 ４Ｃ０８６ 31/573 31/573 ４Ｃ２０６ 31/664 31/664 ４Ｈ０４５ 31/7056 31/7056 38/00 39/104 39/104 Ａ６１Ｐ 37/06 Ａ６１Ｐ 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/21 Ｃ０７Ｋ 14/21 16/28 16/28 19/00 19/00 Ｃ０７Ｄ 261/18 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 307/88 // Ｃ０７Ｄ 261/18 473/38 307/88 498/18 ３０１ 473/38 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 498/18 ３０１ Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０９／４１４，１３４ (32)優先日 平成11年10月７日(1999．10．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 リチャード・マイケル・ライト アメリカ合衆国08801ニュージャージー州 アナンデイル、ツイン・オークス・レイン 27番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA38 BA46 BA80 CA07 CA10 CA20 DA06 EA04 GA11 GA19 GA25 HA01 4C037 RA02 4C056 AA01 AB01 AC01 AD01 AE03 FA03 FB18 4C072 AA03 BB03 CC01 CC12 UU01 4C084 AA02 AA07 BA22 BA23 BA25 CA04 DA33 MA02 NA14 ZB08 ZB21 4C085 AA14 BA19 CC07 CC23 CC24 EE03 4C086 AA01 AA02 BA06 BC67 BC76 CB07 DA35 EA11 EA19 MA01 MA02 NA14 ZB08 ZB21 4C206 AA01 AA02 FA08 HA31 MA01 MA02 MA21 MA24 MA28 NA14 ZB08 ZB21 4H045 AA10 AA30 BA10 BA40 CA11 CA40 DA76 DA83 EA22 EA50 FA74

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＣＤ３結合ドメインおよびPseudomonas外毒素Ａ部分、およ
    び医薬的に許容されるその塩を含む単離組換え体免疫毒素。
  2. 【請求項２】 ＣＤ３結合ドメインが、マウス抗ヒトＣＤ３モノクローナル
    抗体、ＵＣＨＴ−１の一本鎖(“ｓｃ”)Ｆｖ断片であり、Pseudomonas外毒素Ａ
    部分が、Pseudomonas aeruginosa外毒素Ａおよび医薬的に許容されるその塩のト
    ランケート化断片である、請求項１記載の免疫毒素。
  3. 【請求項３】 配列番号２の残基１−６０１または２−６０１または３−６
    ０１を有する組換え体免疫毒素ポリペプチド、および医薬的に許容されるその塩
    、および相同体。
  4. 【請求項４】 請求項１の免疫毒素の調製における中間体である、ポリヌク
    レオチドまたは生理学的に機能等価なポリペプチド。
  5. 【請求項５】 Ｔ細胞の減少に有効量の請求項１の免疫毒素または医薬的に
    許容されるその塩を、必要とする患者に投与することを含む、免疫系のＴ細胞仲
    介疾患または症状の予防または処置方法。
  6. 【請求項６】 移植または患者への導入前に請求項１の免疫毒素または医薬
    的に許容されるその塩と、細胞、組織または器官とを接触させることを含む、免
    疫系のＴ細胞仲介疾患または症状の予防または処置の方法。
  7. 【請求項７】 ドナーの細胞、または組織もしくは器官を移植した患者のコ
    ンディショニング方法であって、 (ａ)患者のＣＤ３担持細胞群を減少させること、 (ｂ)Ｔ細胞の減少に有効量の請求項１の免疫毒素または医薬的に許容されるその
    塩で処理されたドナーの単離骨髄および／または幹細胞富化末梢血液細胞を含む
    接種物を提供すること、 (ｃ)患者に接種物を導入すること、 を含む方法。
  8. 【請求項８】 骨髄移植した患者における移植拒絶、対移植片性宿主病およ
    び／または対宿主性移植片病の予防および／または処置の方法であって、 (ａ)患者の生存可能なＣＤ３担持細胞のレベルを減少させること、 (ｂ)Ｔ細胞の減少に有効量の請求項１の免疫毒素または医薬的に許容されるその
    塩で処置された適当なドナーの造血細胞を含む接種物を提供すること、そして (ｃ)患者へ接種物を導入し、その後、所望により、ドナーおよび患者のＴ細胞を
    更に減少させるため請求項１の免疫毒素または医薬的に許容されるその塩を患者
    に投与すること、 を含む方法。
  9. 【請求項９】 治療的に有効量の請求項１の免疫毒素または医薬的に許容さ
    れるその塩と、サイクロスポリンＡ、ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキ
    シ)エチルラパマイシン(ＲＡＤ)、ＦＫ−５０６、ミコフェノール酸、ミコフェ
    ノレートモフェチル(ＭＭＦ)、サイクロホスホアミド、アザチオプレン、レフラ
    ノミド(leflunomide)、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン化合物またはその
    誘導体または類似体、２−アミノ−２−[２−(４−オクチルフェニル)エチル]プ
    ロパン−１,３−ジオール(ＦＴＹ７２０)、コルチコステロイド、または他の免
    疫修飾化合物；抗−ＬＦＡ−１または抗ＩＣＡＭ抗体、およびＴ細胞の共刺激を
    予防する他の抗体から選択される急性または慢性の移植拒絶に有効な医薬製剤と
    の共投与を含む、請求項５または８の方法。
  10. 【請求項１０】 請求項５から９の何れかの方法に使用の薬剤製造に使用の
    請求項１の免疫毒素または医薬的に許容されるその塩。
  11. 【請求項１１】 医薬的に許容される希釈剤または担体を伴う請求項１の免
    疫毒素を含む医薬組成物または医薬的に許容されるその塩。
  12. 【請求項１２】 １つまたはそれ以上の医薬的に許容される担体または希釈
    剤を伴う請求項１の免疫毒素または医薬的に許容されるその塩を含む、請求項５
    から９の何れかの方法に使用の医薬組成物。
  13. 【請求項１３】 急性または慢性移植拒絶の処置に有効な医薬製剤と組合せ
    に使用する請求項１０または１１の組成物。
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