ES2197926T3 - Metodo para purificar factores de crecimiento de queratinocitos. - Google Patents
Metodo para purificar factores de crecimiento de queratinocitos.Info
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Classifications
-
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- C07K—PEPTIDES
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA PURIFICACION DE FACTORES DE CRECIMIENTO DE QUERATINOCITO.
Description
Método para purificar factores de crecimiento de
queratinocitos.
La presente invención se refiere al campo y la
purificación de proteínas. Específicamente, la presente invención
se refiere al campo de la purificación de factores de crecimiento
de queratinocitos.
Los factores de crecimiento polipeptídicos son
mediadores importantes de la comunicación intercelular (Rubin et
al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos
86:802-806). Estas moléculas generalmente se
liberan por un tipo celular y actúan influyendo sobre la
proliferación de otros tipos celulares.
Una familia de factores de crecimiento es la de
los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Actualmente se
conocen ocho miembros de la familia FGF que comparten una relación
entre las estructuras primarias: factor de crecimiento de
fibroblastos básico, bFGF (Abraham et al., (1986); EMBO
J., 5:2523-2528); factor de crecimiento
de fibroblastos ácido, aFGF (Jaye et al., (1986), Science,
233:541-545); producto génico
int-2, int-2 (Dickson & Peters
(1987), Nature, 326:833); hst/kFGF
(Delli-Bovi et al. (1987), Cell,
50:729-737, y Yoshida et al., (1987),
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos,
84:7305-7309); FGF-5 (Zhan
et al., (1988), Mol. Cell. Biol.,
8:3487-3945); FGF-6 (Marics
et al., (1989), Oncogene,
4:355-340); factor de crecimiento de
queratinocitos (Finch et al. (1989), Science,
24:752-755; Rubin et al. (1989),
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos,
86:802-806; Ron et al., (1993), The
Journal of Biological Chemistry, 268
(4):2984-2988; y Yan et al., (1991),
In Vitro Cell. Dev. Biol.,
27A:437-438); e hisactofilina (Habazzettl
et al., (1992), Nature,
359:855-858).
Entre la familia FGF de proteínas, el factor de
crecimiento de queratinocitos (KGF) es el único efector de la
proliferación de células epiteliales que no son fibroblastos
(particularmente queratinocitos) derivado de tejidos
mesenquimáticos. La expresión ``KGF nativo'' se refiere a un
polipéptido humano (hKGF) natural o recombinante (rKGF) (con o sin
una secuencia señal) como se representa por la secuencia de
aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 2 o una variante alélica
del mismo. [A menos que se indique otra cosa, la numeración de
aminoácidos para las moléculas descritas en este documento
corresponderá a la presentada para la forma madura de la molécula
nativa (es decir, menos la secuencia señal), como se representa por
los aminoácidos 32 a 194 de la SEC ID Nº:2].
El KGF nativo puede aislarse a partir de fuentes
naturales. Por ejemplo, el hKGF puede aislarse a partir de un medio
acondicionado por una línea de fibroblastos de pulmón embrionario
(Rubin et al., (1989), supra). Para obtener una
preparación de hKGF purificada, se usaron 3 etapas cromatográficas,
particularmente, cromatografía de afinidad en
heparina-Sepharose™ (Pharmacia, Piscataway, NJ),
exclusión molecular en HPLC, y HPLC de fase inversa. Se recuperaron
aproximadamente 6 mg de hKGF a partir de 10 litros de medio
acondicionado. Estas etapas cromatográficas sólo recuperaron un 0,8%
del hKGF total basándose en un ensayo de actividad mitogénica. Un
ejemplo adicional enseña el uso de otra etapa cromatográfica usando
cromatografía de afinidad de heparina-Sepharose™ y
cromatografía de intercambio iónico Mono-S™
(Pharmacia, Piscataway, NJ) para el aislamiento de rKGF producido en
bacterias (Ron et al., (1993), Journal of Biological
Chemistry, 268: 2984-2988).
Suzuki, M. et al., (FEBS Vol. 328 Nº 1, 2
(1993), 17-20) enseña la purificación parcial de un
factor mitogénico de unión a heparina, SDGF-3, para
hepatocitos de rata a partir de bazo bovino por una combinación de
cromatografía de afinidad en heparina, cromatografía de intercambio
catiónico y cromatografía de exclusión molecular. Los autores
proponen la identidad de dicho factor aislado y el factor de
crecimiento de queratinocitos (KGF) debido a que tienen varias
propiedades y actividades similares. Sin embargo, no hay ninguna
evidencia clara e inequívoca de la identidad de
SDGF-3 y KGF debido a las diferencias considerables
en tamaño y al hecho de que la adición de anticuerpo monoclonal
anti-KGF no anula completamente la actividad como
factor de crecimiento de SDGF-3.
Las propiedades de los factores de crecimiento de
queratinocitos sugieren la posibilidad de su aplicación como un
fármaco para promover la estimulación específica del crecimiento de
células epiteliales. Por lo tanto, sería deseable crear un método o
métodos para obtener niveles relativamente altos de factores de
crecimiento de queratinocitos homogéneos para proporcionar
cantidades suficientes de material para una evaluación biológica
exhaustiva in vitro e in vivo y para una aplicación
terapéutica potencial.
El objeto de esta invención es proporcionar un
nuevo método para la purificación de factores de crecimiento de
queratinocitos.
La presente invención se refiere a un método para
purificar un factor de crecimiento de queratinocitos (KGF),
comprendiendo el método las siguientes etapas:
- a)
- obtener una solución que comprende el KGF;
- b)
- cargar la solución de la etapa (a) en una resina de intercambio catiónico;
- c)
- eluir el KGF en una solución de eluato procedente de la resina de intercambio catiónico;
- d)
- pasar la solución de eluato de la etapa (c) a través de (i) una matriz de exclusión de peso molecular o (ii) una matriz de cromatografía de interacción hidrófoba; y
- e)
- recuperar el KGF,
con la condición de que dicho método no comprenda
una etapa de cromatografía de afinidad en heparina.
Generalmente, la etapa de cromatografía de
intercambio catiónico del método de la presente invención puede
realizarse con cualquier tampón adecuado (por ejemplo, solución
salina tamponada con fosfato, acetato sódico o
Tris-HCl) a un pH comprendido preferiblemente entre
aproximadamente 6,8 y 7,5. Las columnas adecuadas para uso en esta
etapa incluyen columnas de carboximetil celulosa, carboximetil
agarosa, agarosa sulfatada y celulosa (por ejemplo, columnas de
resina de S-Sepharose Fast Flow™, resina
Mono-S™ y resina de CM-celulosa™,
disponibles en el mercado en Pharmacia Piscataway, NJ). El caudal
será variable dependiendo del tamaño de la columna.
La etapa de exclusión molecular del método puede
realizarse en cualquier tampón adecuado (por ejemplo, solución
salina tamponada con fosfato) a un pH preferiblemente comprendido
entre aproximadamente 7,0 y 7,5. Las columnas adecuadas para uso en
esta etapa incluyen columnas de exclusión molecular basadas en
agarosa, basadas en acrilamida, basadas en sílice o basadas en
polímero (por ejemplo, columnas de resina Sephadex
G-75™ y resina Superdex-75™,
disponibles en el mercado en Pharmacia).
En una realización particularmente preferida del
método, que implica una cromatografía de interacción hidrófoba, los
grupos sulfhidrilo libres pueden oxidarse antes de la etapa de
interacción hidrófoba, discutida más adelante. Puede emplearse
cualquier forma de oxidación. Por ejemplo, la proteína puede
exponerse al oxígeno atmosférico durante un período de tiempo
adecuado. Como alternativa, pueden emplearse diversos procedimientos
de oxidación. Uno de tales procedimientos es particularmente
adecuado para factores de crecimiento de queratinocitos en los que
se han delecionado o reemplazado uno o más restos de cisteína, en
comparación con la molécula de KGF nativa. En este procedimiento,
puede añadirse un agente oxidante (por ejemplo, diclorhidrato de
cistamina u otro agente oxidante apropiado, por ejemplo, cistina,
glutatión oxidado o cobre divalente) a una concentración final,
ajustando el pH a un valor comprendido preferiblemente entre
aproximadamente 7 y 9,5, siendo más preferido un pH de 9,0 \pm0,3
cuando se usa diclorhidrato de cistamina), y manteniendo la
temperatura a un valor comprendido preferiblemente entre
aproximadamente 10 y 30ºC, durante un período apropiado. El segundo
procedimiento puede usarse para la oxidación del KGF nativo y otros
factores de crecimiento de queratinocitos con modelos comparables
de restos de cisteína. En este procedimiento, la oxidación puede
realizarse añadiendo una cantidad apropiada de un modificador de la
intensidad iónica (por ejemplo, (NH_{4})_{2}SO_{4}),
ajustando el pH a un valor comprendido preferiblemente entre
aproximadamente 7,5 y 9,5, y manteniendo la temperatura
preferiblemente entre aproximadamente 23 \pm 5ºC durante un
período apropiado.
La etapa de interacción hidrófoba puede
realizarse usando cualquier tampón adecuado (por ejemplo, fosfato
sódico) a un pH comprendido preferiblemente entre aproximadamente
6,0 y 8,0, más preferiblemente de aproximadamente 7,0, y eluyendo
con un gradiente lineal decreciente de
(NH_{4})_{2}SO_{4} que varía de 2 a 0 M. Las columnas
adecuadas para uso en esta etapa incluyen resinas sustituidas con
alquilo o fenilo (por ejemplo, una columna de resina
Butyl-650M Toyopearl™, disponible en el mercado en
Tosohaas, Inc., Montgomeryville, PA y columnas de resina de fenil
Sepharose™ y de resina de fenil Superose™, disponibles en el mercado
en Pharmacia).
El proceso de la presente invención puede usarse
para purificar KGF. De esta forma, debe entenderse que las
expresiones ``factor de crecimiento de queratinocitos'' y ``KGF'',
como se emplean en esta descripción, pretenden incluir y significar
indistintamente, a menos que se indique otra cosa, KGF nativo y
proteínas análogas de KGF (o ``muteínas'') caracterizadas por una
secuencia peptídica sustancialmente igual que la secuencia peptídica
del KGF nativo y porque retienen algunas o todas las actividades
biológicas del KGF nativo, particularmente la proliferación de
células epiteliales no fibroblásticas (por ejemplo, presentando una
estimulación al menos aproximadamente 500 veces mayor de
queratinocitos BALB/MK que de fibroblastos NIH/3T3, y una
estimulación al menos 50 veces mayor de queratinocitos BALB/MK que
de células epiteliales BS/589 o de células epiteliales CC1208, como
se determina por la incorporación de H-timidina).
Por ``caracterizado por una secuencia peptídica sustancialmente
igual que la secuencia peptídica del KGF nativo'' se entiende una
secuencia peptídica que se codifica por secuencia de ADN capaz de
hibridar con los nucleótidos 201 a 684 de la SEC ID Nº:1,
preferiblemente en condiciones de hibridación rigurosas.
La determinación de una posición de aminoácidos
correspondiente entre dos secuencias de aminoácidos puede
determinarse alineando las dos secuencias para maximizar las
correspondencias de los restos incluyendo los cambios de los
extremos amino y/o carboxilo, introduciendo huecos cuando sea
necesario y/o delecionando restos presentes como insertos en el
candidato. Las búsquedas en bases de datos, los análisis de las
secuencias y las manipulaciones pueden realizarse usando uno de los
programas de algoritmo de exploración de homología/identidad de
secuencias bien conocidos y usados rutinariamente (por ejemplo,
Pearson y Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. Estados
Unidos., 85:2444-2448; Altschul et
al. (1990), J. Mol. Biol., 215:403 -410; Lipman y
Pearson (1985), Science, 222:1435 o Devereux et
al., (1984), Nuc. Acids. Res.
12:387-395).
Las condiciones rigurosas, en el contexto de la
hibridación, serán condiciones rigurosas combinadas de sal,
temperatura, disolventes orgánicos y otros parámetros controlados
típicamente en reacciones de hibridación. Son condiciones de
hibridación rigurosas ejemplares la hibridación en 4 X SSC a 62-
67ºC, seguido de lavado en 0,1 X SSC a 62-67ºC
durante aproximadamente 1 hora. Como alternativa, son condiciones de
hibridación rigurosas ejemplares la hibridación en formamida al
45-55%, 4 X SSC a 40-45ºC [Véase T.
Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory
Manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 387 a
389].
De esta manera, las proteínas incluyen
variaciones alélicas o deleción (deleciones), sustitución
(sustituciones) o inserción (inserciones) de aminoácidos,
incluyendo fragmentos, moléculas quiméricas o híbridas de KGF
nativo. Un ejemplo de KGF incluye proteínas que tienen restos
correspondientes a Cys^{32} y Cys^{46} de la SEC ID Nº: 2
reemplazados o delecionados, teniendo la molécula resultante mejor
estabilidad en comparación con la molécula parental (como se enseña
en el documento U.S.S.N. 08/487.825 de propiedad común, presentado
el 7 de julio de 1995). Otro ejemplo de KGF incluye polipéptidos de
cambio de carga donde uno o más de los restos aminoacídicos
41-154 del KGF nativo (preferiblemente los restos
Arg^{41}, Gln^{43}, Lys^{55}, Lys^{95}, Lys^{128},
Asn^{137}, Gln^{138}, Lys^{139}, Arg^{144}, Lys^{147},
Gln^{152}, Lys^{153} o Thr^{154}) se han delecionado o
sustituido con un resto neutro o cargado negativamente seleccionado
para obtener una proteína con una carga positiva reducida (como se
ensaña en el documento U.S.S.N. 08/323.337, de propiedad común,
presentado el 13 de octubre de 1994). Otro ejemplo de KGF incluye
proteínas generadas sustituyendo al menos un aminoácido dentro de
una región de formación de bucles de
Asn^{115}-His^{116}-Tyr^{117}-
Asn^{118}-Thr^{119} del KGF nativo por al menos
un aminoácido que tiene un mayor potencial de formación de bucles
(como se enseña en el documento U.S.N.N. 08/323.473 de propiedad
común, presentado el 13 de octubre de 1994). Otro ejemplo adicional
incluye proteínas que tienen una o más sustituciones, deleciones o
adiciones de aminoácidos dentro de una región de
123-133 (aminoácidos 154-164 de la
SEC ID Nº:2) del KGF nativo; estas proteínas pueden actividad
agonista o antagonista.
Las muteínas preferidas para poner en práctica la
presente invención se seleccionan entre:
- a)
- un polipéptido que tiene restos correspondientes a la cisteína en la posición de aminoácidos 32 de la SEC ID Nº:2 y la cisteína en la posición de aminoácidos 46 de la SEC ID Nº:2 reemplazada o delecionada;
- b)
- un polipéptido de cambio de carga donde uno o más de los restos aminoacídicos 72-185 de la SEC ID Nº: 2 se han delecionado o sustituido con un resto neutro o un resto cargado negativamente seleccionado para producir una proteína con una carga positiva reducida;
- c)
- un polipéptido generado por sustitución de al menos un aminoácido dentro de la región formadora de bucles de Asn^{146}-His^{147}-Tyr^{148}- Asn^{149}-Thr^{150} de la SEC ID Nº:2 por al menos un aminoácido que tiene un mayor potencial de formación de bucles; o
- d)
- un polipéptido que tiene una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos dentro de los restos aminoacídicos 154-164 de la SEC ID Nº:2.
Las muteínas preferidas adicionales se
seleccionan entre, donde ``-'' significa una deleción en esa
posición: C(32,46)S, \DeltaN15, \DeltaN16,
\DeltaN17, \DeltaN16, \DeltaN17, \DeltaN18, \DeltaN19,
\DeltaN20, \DeltaN21, \DeltaN22, \DeltaN23, \DeltaN24,
\DeltaN3/C(46)S, \DeltaN3/C(46)-,
\DeltaN8/C(46)S, \DeltaN8/C(46)-,
C(32,46)S/R(175)E,
C(32,46)S/R(175)Q,
\DeltaN23/R(175)Q, C(32,46,71)S,
C(32,46,133)S, C(32,46,133,137)S,
\DeltaN23/N(168)E,
\DeltaN23/K(170)E,
\DeltaN23/K(170)Q,
\DeltaN23/R(175)A,
\DeltaN23/R(175)A,
\DeltaN23/R(175)E,
\DeltaN23/R(175)L,
\DeltaN23/K(178)E,
\DeltaN23/K(178)Q, \DeltaN23(184)E,
\DeltaN23(184)Q,
\DeltaN23/Q(183)E/K(184)E,
R(175)Q o H(147)G, designándose cada
muteína por referencia a la SEC ID Nº:2.
Son incluso más preferidos los KGF que incluyen
un resto de metionina inicial.
\DeltaN23/K(147)E,
\DeltaN23/K(147)Q,
\DeltaN23/K(153)E,
\DeltaN23/K(153)Q, \DeltaN23/Q
(152)E/K(153)E; R(144)Q y
H(116)G.
Como también apreciarán los especialistas en la
técnica, pueden utilizarse diversos sistemas de
hospedador-vector para expresar la secuencia
codificante de la proteína KGF. Éstos incluyen, pero sin limitación,
sistemas de células eucariotas tales como sistemas de células de
mamíferos infectados con virus (por ejemplo, vaccinia virus,
adenovirus, etc.); sistemas de células de insecto infectados con
virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como
vectores de levadura que contienen levadura; o sistemas de células
procariotas tales como bacterias transformadas con ADN de
bacteriófago, ADN plasmídico o ADN cosmídico. Los elementos de
expresión de estos vectores varían en sus intensidades y
especificidades. Dependiendo del sistema de
hospedador-vector utilizado, puede usarse uno
cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción
adecuados.
Una vez que se ha aislado, purificado y ensayado
el producto proteico de la expresión de KGF con respecto a la
actividad KGF (usando procedimientos conocidos por los especialistas
en la técnica), puede formularse en una diversidad de composiciones
farmacéuticas. Típicamente, tales composiciones incluyen un vehículo
o excipiente adecuado, normalmente definido químicamente, para el
agente terapéutico y, dependiendo de la forma de administración
deseada, también otros ingredientes. La composición puede incluir
vehículos acuosos o constar de formulaciones en fase sólida en las
que el KGF se incorpora en vehículos no acuosos tales como colágeno,
ácido hialurónico y diversos polímeros. La composición puede
formularse convenientemente para administrarse en una diversidad de
formas, incluyendo por inyección, por vía oral, tópica, intranasal
y por liberación pulmonar.
La figura 1 muestra las secuencias de nucleótidos
(SEC ID Nº:1) y de aminoácidos (SEC ID Nº:2) del KGF nativo (los
nucleótidos que codifican la forma madura del KGF nativo se
representan por las bases 201 a 684 de la SEC ID Nº:1 y la forma
madura del KGF se representa por los restos aminoacídicos 32 a 194
de la SEC ID Nº:2).
Las figuras 2A, 2B y 2C muestran los mapas
plasmídicos de pCFM1156, pCFM1656 y pCFM3102, respectivamente.
La figura 3 muestra las secuencias de nucleótidos
(SEC ID Nº:3) y de aminoácidos (SEC ID Nº:4) de la construcción
RSH-KGF.
La figura 4 muestra las secuencias de nucleótidos
(SEC ID Nº:5) y de aminoácidos (SEC ID Nº:6) de la construcción
contenida del plásmido KGF.
La figura 5 muestra los OLIGOS sintetizados
químicamente (OLIGO#6 a OLIGO#11; SEC ID Nº:12-17,
respectivamente) usados para sustituir la secuencia de ADN entre un
sitio KpnI y un sitio EcoRI para un sitio KpnI
(de las posiciones de aminoácidos 46 a 85 de la SEC ID Nº:6) en el
KGF del plásmido contenido en la construcción para producir la
construcción en el plásmido KGF(dsd).
La figura 6 muestra los OLIGOS sintetizados
químicamente (OLIGO#12 a OLIGO#24; SEC ID Nº: 18-30,
respectivamente) usados para construir KGF (de codones
optimizados).
La figura 7 muestra las secuencias de nucleótidos
(SEC ID Nº:31) y de aminoácidos (SEC ID Nº:32) de
C(1,15)S, un análogo de KGF que tiene sustituciones de
cisteína por serina en las posiciones de aminoácidos 1 y 15 del KGF
nativo.
La figura 8 muestra las secuencias de nucleótidos
(SEC ID Nº: 33) y de aminoácidos (SEC ID Nº: 34) de
R(144)Q, un análogo de KGF que tiene una sustitución
de arginina por ácido glutámico en la posición de aminoácidos 144
del KGF nativo.
La figura 9 muestra las secuencias de nucleótidos
(SEC ID Nº:35) y de aminoácidos (SEC ID Nº:36) de
C(1,15)S/R(144)Q, un análogo de KGF que
tiene sustituciones de cisteína por serina las posiciones de
aminoácidos 1 y 15 y una sustitución de arginina por glutamina en
la posición de aminoácidos 144 del KGF nativo.
La figura 10 muestra las secuencias de
nucleótidos (SEC ID Nº:37) y de aminoácidos (SEC ID Nº:38) de
\DeltaN15, un análogo de KGF que tiene una deleción de los
primeros 15 aminoácidos del extremo N del KGF nativo.
La figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos
(SEC ID Nº:39) y de aminoácidos (SEC ID Nº:40) de \DeltaN23, un
análogo de KGF que tiene una deleción de los primeros 23 aminoácidos
del extremo N del KGF nativo.
La figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos
(SEC ID Nº:41) y de aminoácidos (SEC ID Nº:42) de
\DeltaN23/R(144)Q, un análogo de KGF que tiene una
deleción de los primeros 23 aminoácidos en el extremo N y una
sustitución de arginina por glutamina en la posición de aminoácidos
144 del KGF nativo.
Se proporcionan métodos convencionales para
muchos de los procedimientos descritos en los siguientes ejemplos, o
procedimientos alternativos adecuados, en manuales ampliamente
reconocidos de biología molecular tales como, por ejemplo,
Molecular Cloning, Segunda Edición, Sambrook et al.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) y Current Protocols in
Molecular Biology, Ausabel et al., Greene Publishing
Associates/Wiley-Interscience, Nueva York
(1990).
La clonación del gen KGF humano de longitud
completa (que codifica un polipéptido con la secuencia del KGF
nativo), se realizó tanto por reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) de ARN procedente de una célula animal como por PCR de
oligonucleótidos sintetizados químicamente (``OLIGO'') (con codones
optimizados para E. coli). A continuación se describen los
dos procedimientos:
Se realizó una amplificación por PCR usando ARN
aislado de células que se sabe que producen el polipéptido.
Inicialmente, se rompieron células de una línea de fibroblastos
humanos AG1523A (obtenida a partir de Human Genetic Mutant Cell
Culture Repository Institute For Medical Research, Camden, New
Jersey) con tiocianato de guanidinio, seguido de extracción (de
acuerdo con el método de Chomyzinski et al., (1987), Anal.
Biochem., 172:156). Usando un protocolo de transcriptasa
inversa convencional para el ARN total, se generó ADNc de KGF. La
amplificación por PCR (PCR#1) del gen KGF se realizó usando el ADNc
de KGF como plantilla y los cebadores OLIGO#1 y OLIGO#2 que
codifican secuencias de ADN inmediatamente 5' y 3' del gen KGF
[Thermocycler modelo 9600 (Perkin-Elmer, Cetus,
Norwalk, CT); 28 ciclos; constando cada ciclo de un minuto a 94ºC
para la desnaturalización, dos minutos a 60ºC para el templado, y
tres minutos a 72ºC para el alargamiento]. Después se usó una
pequeña alícuota del producto de PCR#1 como plantilla para una
segunda amplificación por PCR de KGF (PCR#2) idéntica a las
condiciones del ciclo descritas anteriormente con la excepción de
que la temperatura de templado fue de 50ºC. Para la clonación de
expresión del gen KGF, se usaron cebadores de PCR inclusivos para
crear sitios de restricción convenientes en los dos extremos del gen
KGF. Se usaron OLIGO#3 y OLIGO#4 para modificar el producto de ADN
de KGF procedente de la PCR#2 para incluir sitios de restricción
MluI y BamHI en los extremos 5' y 3' del gen,
respectivamente [PCR#3; 30 ciclos, constando cada ciclo de un
minuto 94ºC para la desnaturalización, 2 minutos a 60ºC para el
templado y 3 minutos a 72ºC para el alargamiento]. Este ADN
posteriormente se cortó con MluI y BamHI, se extrajo
con fenol y se precipitó con etanol. Después se resuspendió y se
unió (usando ligasa de T4) al plásmido pCFM1156 (figura 2A) que
contenía una secuencia señal ``RSH'' para obtener la construcción
RSH-KGF (figura 3). Los productos de unión se
utilizaron para transformar (de acuerdo con el método de Hanahan
(1983), J. Mol. Biol., 166:557) la cepa FM5 de E.
coli (ATCC: 53911) y se cultivaron en placas con LB+kanamicina a
28ºC. Se seleccionaron varios transformantes y se cultivaron en
pequeños cultivos líquidos que contenían 20 \mug/ml de kanamicina.
El plásmido RSH-KGF se aisló de las células de cada
cultivo y se secuenció el ADN. Debido a un sitio NdeI
interno en el gen KGF, no fue posible clonar directamente la
secuencia del gen nativo en el vector de expresión deseado con los
sitios de restricción NdeI y BamHI. Esto se consiguió
como una unión de tres vías. El plásmido RSH-KGF se
cortó con los sitios de restricción únicos de BsmI y
SstI, y se aisló un fragmento de ADN de \sim3 kpb (que
contenía el extremo 3' del gen KGF) después de una electroforesis a
través de un gel de agarosa al 1%. Se realizó una PCR (PCR#4) como
se ha descrito para la PCR#3 con la excepción de la sustitución del
OLIGO#3 por el OLIGO#5. El producto de ADN de PCR después se cortó
con NdeI y BsmI y se aisló un fragmento de ADN de 311
pb después de la electroforesis a través de un gel de agarosa al
4%. El tercer fragmento usado en la unión fue un fragmento de ADN de
1,8 kpb de pCFM1156 cortado con NdeI y SstI aislado
después de electroforesis a través de un gel de agarosa al 1%.
Después de la unión (ligasa de T4), la transformación, la selección
con kanamicina y la secuenciación del ADN como se ha descrito
anteriormente, se seleccionó un clon que contenía la construcción de
la figura 4, y el plásmido se denomino KGF. Debido a un sitio de
unión a ribosomas interno que producía productos truncados, la
secuencia de ADN de KGF entre los sitios únicos KpnI y
EcoRI se reemplazó por OLIGOS sintetizados químicamente
(OLIGO#6 a OLIGO#11) para minimizar el uso del sitio de iniciación
interno (figura 5).
Los OLIGOS se fosforilaron con polinucleótido
quinasa de T4 y después se desnaturalizaron térmicamente. Después se
dejó que los OLIGOS monocatenarios (ss) formaran un fragmento de ADN
ds dejando que la temperatura se redujera lentamente hasta la
temperatura ambiente. Después se usó ligasa de T4 para unir
covalentemente los dos extremos adherentes de los OLIGO internos y
el fragmento de OLIGO ds entero al plásmido KGF cortado con
KpnI y EcoRI. El nuevo plásmido se denominó KGF
(dsd).
Se construyó un gen KGF con codones optimizados
para E. coli por amplificación por PCR de los OLIGOS#12 a 24
sintetizados químicamente.
Los OLIGOS#12 a 24 se diseñaron de forma que la
secuencia de ADN entera que codificaba el KGF nativo se representara
por OLIGOS de la cadena ``Watson'' o ``Crick'' y tras la
amplificación por PCR produjeran la secuencia de ADN bicatenaria
deseada (figura 6) [PCR#5, Thermocycler modelo 9600 (Perkin- Elmer
Cetus); 21 ciclos, constando cada ciclo de 31 segundos a 94ºC para
la desnaturalización, 31 segundos a 50ºC para la hibridación y 31
segundos a 73ºC para el alargamiento; después de los 21 ciclos, la
PCR se terminó con una etapa de alargamiento final de 7 minutos].
Después de la amplificación por PCR, el fragmento de ADN se cortó
con XbaI y BamHI y el fragmento de 521 pb se unió al
plásmido de expresión pCFM1156 cortado con las mismas enzimas. La
PCR#5 utilizó los cebadores exteriores (100 pmoles/100 \mul rxn)
de los OLIGO#12 y OLIGO#13 y 1 \mul/100 \mul de rxn de una
plantilla de KGF obtenida por unión (por ligasa de T4) de los
OLIGOS#14 a #19 (los OLIGOS#15 a OLIGOS#18 se fosforilaron con
polinucleótido quinasa de T4) usando los OLIGOS#20 a OLIGOS#24 como
oligos de ayuda de banda (Jayaraman et al. (1992),
Biotechniques 12:392) para la unión. La construcción
final se denominó KGF (codones optimizados).
Todos los análogos de KGF descritos en este
documento se componen en parte de secuencias de ADN encontradas en
KGF (dsd) o KGF (con codones optimizados), o una combinación de los
dos. Las secuencias se modifican adicionalmente por la inserción en
sitios de restricción convenientes de secuencias de ADN que
codifican los aminoácidos del análogo de KGF particular, obtenidos
utilizando una o más de las técnicas descritas anteriormente para la
síntesis de fragmentos de ADN. Cualquiera de los análogos puede
generarse totalmente por cualquiera de las técnicas descritas
anteriormente. Sin embargo, como parte del diseño general de OLIGOS,
se usaron codones optimizados para E. coli cuando fue
apropiado, aunque la presencia de codones optimizados para E.
coli, en parte o en su totalidad, de cualquiera de los genes,
cuando se examinaron, no aumentó significativamente el rendimiento
de la proteína que podía obtenerse a partir de células bacterianas
cultivadas. Las figuras 7 a 12 presentan construcciones de
secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de análogos de KGF
particulares ilustrativas convenientes: C(1,15)S
(figura 7); R(144)Q (figura 8),
C(1,15)S/R(114)Q (figura 9); \DeltaN15
(figura 10); \DeltaN23 (figura 11) y
\DeltaN23/R(144)Q (figura 12). Todas las
construcciones de análogos de KGF descritas en este documento se
confirmaron por secuenciación del ADN.
En la clonación de genes análogos de KGF se
utilizaron tres plásmidos de expresión diferentes. Éstos fueron
pCFM1156 (ATCC 69702), pCFM1656 (ATCC 69576) y pCFM3102 (figuras
2A, 2B y 2C, respectivamente). El plásmido p3102 puede obtenerse a
partir del plásmido pCFM1656 realizando una serie de cambios de
bases dirigidos con mutagénesis de oligos solapantes por PCR.
Empezando en el sitio BgIII (plásmido pCFM1656 pb nº 180)
inmediatamente 5' con respecto al promotor de replicación del
plásmido, ^{P}copB, y avanzando hacia los genes de replicación
del plásmido, los cambios de pares de base son los siguientes:
Como se ha visto anteriormente, pCFM1156,
pCFM1656 y pCFM3102 son muy similares entre sí y contienen muchos de
los mismos sitios de restricción. Los plásmidos se eligieron por
conveniencia y los componentes de ADN del vector pueden
intercambiarse fácilmente para nuevas construcciones. El hospedador
usado para todas las clonaciones fue la cepa FM5 de E. coli
(ATCC: 53911) y las transformaciones se realizaron (de acuerdo con
el método de Hanahan (1983), supra) o por electroelución con
un aparato de transfección Gene Pulser™ (BioRad Laboratories, Inc.,
Hercules, CA), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Inicialmente, se inició un pequeño inóculo
cultivado recientemente del clon de E. coli recombinante
deseado que llevaba la construcción deseada en uno de los tres
vectores pCFM transfiriendo 0,1 ml de una solución madre de glicerol
congelada de la cepa apropiada a un matraz de dos litros que
contenía 500 ml de caldo de Luria. El cultivo se agitó a 30ºC
durante 16 horas. Posteriormente, el cultivo se transfirió a un
fermentador de 15 l que contenía 8 l de medio de lote estéril (Tsai,
et al., (1987), J. Industrial Microbiol.,
2:181-187).
La alimentación de fermentación del lote comienza
con el suministro de medio de alimentación nº 1 (Tsai, et al.
(1987), supra). Cuando la DO600 alcanzó un valor de 35, la
expresión del análogo de KGF deseado se indujo por un aumento rápido
de la temperatura de cultivo a 37ºC para permitir la amplificación
del plásmido. Después de 2 horas a 37ºC, la temperatura de cultivo
se elevó rápidamente a 42ºC para desnaturalizar el represor CI y la
adición de la Alimentación 1 se interrumpió a favor de la
Alimentación 2, cuya velocidad de adición empezó a 300 ml/h. La
alimentación 2 comprendía 175 g/l de
tripticasa-peptona, 87,5 g/l de extracto de levadura
y 260 g/l de glucosa. Después de una hora a 42ºC, la temperatura de
cultivo se redujo a 36ºC, y esta temperatura después se mantuvo
durante otras 6 horas.
Después se interrumpió la fermentación y las
células se recogieron por centrifugación en bolsas de plástico
colocadas dentro de frascos de centrífuga de 1 litro. Las células
se sedimentaron por centrifugación a 400 rpm durante 60 minutos,
después de lo cual los sobrenadantes se retiraron y la pasta celular
se congeló a -90ºC.
Después de la expresión de los diversos análogos
de KGF en E. coli, se purificaron KGF nativo,
C(1,15)S, R(144)Q,
C(1,15)S/R(144)Q, \DeltaN15,
\DeltaN23 y proteína \DeltaN23/R(144)Q usando el
siguiente procedimiento. Se suspendió pasta celular de una
fermentación de alta densidad de células a 4ºC en NaCl 0,2 M,
NaPO_{4} 20 mM, pH 7,5 como una solución al 10-20%
(peso por volumen) usando un mezclador de alto cizallamiento
adecuado. Las células suspendidas después se lisaron pasando la
solución a través de un homogeneizador (APV Gaulin, Inc., Everett,
MA) tres veces. El homogeneizado que salía se enfrió a 4- 8ºC usando
un intercambiador térmico adecuado. Después, los desechos se
retiraron por centrifugación del lisado en una centrifuga
J-6B™ (Beckman Instruments, Inc., Brea, CA) equipada
con un rotor JS 4.2 a 4.200 rpm durante 30-60 min.
a 4ºC. Los sobrenadantes después se decantaron cuidadosamente y se
introdujeron en una columna preparada previamente de 450 ml (5 cm x
23 cm) de resina de S-Sepharose Fast Flow™
(Pharmacia) equilibrada con NaCl 0,2 M, NaPO_{4} 20 mM, pH 7,5 a
4ºC. A continuación, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna
(2250 ml) de NaCl 0,4 M; NaPO_{4} 20 mM, pH 7,5 a 4ºC. La
proteína deseada se eluyó lavando la columna con 5 l de NaCl 0,5 M,
NaPO_{4} 20 mM, pH 7,5. De nuevo, se recogieron fracciones de 50
ml y se controló continuamente la A_{280} del efluente. Después,
las fracciones que según la A_{280} contenían el material eluido
se analizaron por SDS-PAGE a través de geles al 14%
para confirmar la presencia del polipéptido deseado.
Las fracciones que contenían proteínas de interés
después se reunieron, seguido de la adición de un volumen igual de
agua destilada. La muestra diluida después se introdujo en una
columna de 450 ml, previamente preparada (5 cm x 23 cm) de
S-Sepharose Fast Flow equilibrada con NaCl 0,4 M,
NaPO_{4} 20 mM, pH 6,8 a 4ºC. La columna se lavó con 2250 ml de
NaCl 0,4 M, NaPO_{4} 20 mM; pH 6,8 y la proteína se eluyó usando
un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna que variaba de NaCl
0,4 M, NaPO_{4} 20 mM, pH 6,8 a NaCl 0,6 M, NaPO_{4} 20 mM, pH
6,8. De nuevo, se recogieron fracciones de 50 ml bajo un control
constante de la A_{280} del efluente. Después se reunieron las
fracciones que contenían la proteína (determinada por
SDS-PAGE al 14%), seguido de la concentración a
través de una membrana YM-10 (límite de peso
molecular 10.000) en una celda de agitación de 350 cc (Amicon, Inc.
Mayberry, MA) hasta un volumen de 30-40 ml.
Después, el concentrado se introdujo en una
columna generada previamente de 1300 ml (4,4 cm x 85 cm) de resina
Superdex-75™ (Pharmacia) equilibrada en tampón de
columna que comprende 1X PBS (solución salina tamponada con fosfato
de Dulbecco, ``D-PBS'' sin calcio y magnesio) o NaCl
0,15 M, NaPO_{4} 20 mM, pH 7,0. Después de dejar que la muestra
entrara en la columna, la proteína se eluyó de la matriz de
exclusión molecular usando un tampón de columna. Posteriormente, se
recuperaron fracciones de 10 ml y se reunieron las que contenían el
análogo (determinado por SDS-PAGE al 14%).
Típicamente, la concentración de proteína fue de aproximadamente
5-10 mg/ml en el conjunto resultante. Todos los
procedimientos anteriores se realizaron a 4-8ºC a
menos que se especifique otra cosa.
Se usó un procedimiento de purificación
alternativo para purificar KGF nativo, C(1,15)S y
\DeltaN23. El procedimiento implica las siguientes etapas y, a
menos que se especifique otra cosa, todos los procedimientos,
soluciones y materiales se realizaron a 23 \pm 5ºC.
Después de completarse la fase de producción de
una fermentación bacteriana, el cultivo celular se enfrió a
4-8ºC y las células se recogieron por centrifugación
o por un proceso similar. Basándose en el rendimiento esperado de
proteína por peso unitario de pasta celular y la cantidad de
proteína purificada requerida, se suspendió una cantidad apropiada
de pasta celular, en peso, en una solución tampón suave, NaPO_{4}
20 mM, NaCl 0,2 M, pH 7,5, que pesaba aproximadamente 5 veces más
que la pasta celular a suspender. Las células se dispersaron hasta
que se obtuvo una solución homogénea usando un mezclador de alto
cizallamiento. La temperatura de la dispersión de pasta celular se
mantuvo a 4-8ºC durante la homogeneización.
Las células después se lisaron por presión, por
ejemplo, pasando la dispersión de pasta celular dos veces a través
de un homogeneizador de células dimensionado de manera apropiada. El
homogeneizado se mantuvo enfriado a 5 \pm 3ºC. Para clarificar el
lisado celular, se empleó un alojamiento con filtro en el fondo
preparado previamente (Cuno, Inc., Meriden, CT) equipado con un
filtro que tenía una cantidad apropiada de superficie específica de
filtro, equilibrado con un volumen adecuado de NaCl 0,2 M,
NaPO_{4} 20 mM, pH 7,5. El equilibrio y la clarificación se
realizaron a 5 \pm 3ºC. Antes de la clarificación, se usó una
cantidad apropiada de un adyuvante de filtro adecuado para
pre-recubrir el filtro y para mezclarse
minuciosamente con el lisado celular, después de lo cual el lisado
de clarificó pasando la solución a través del aparato de filtración.
El filtro se lavó con NaCl 0,2 M, NaPO_{4} 20 mM, pH 7,5. El
filtrado y todos los lavados posteriores se recogieron en un
recipiente enfriado de capacidad adecuada, manteniendo todos ellos a
menos de 10ºC.
Después de la clarificación, el lisado se pasó a
través de una columna preparada previamente de
SP-Sepharose Fast Flow que contenía al menos 1 ml de
resina por 2 g de pasta celular. La columna de
SP-Sepharose Fast Flow se equilibró con NaCl 0,2 M,
NaPO_{4} 20 mM, pH 7,5, frío (5 \pm 3ºC). La temperatura de la
columna se mantuvo a menos de 10ºC. El lisado clarificado (5 \pm
3ºC) después se introdujo en la columna de intercambio iónico,
controlando continuamente la absorbancia a 280 nm (A_{280}) del
eluato. Después de introducir la muestra, la columna se lavó con
NaCl 0,2 M, NaPO_{4} 20 mM, pH 7,5 frío, seguido de lavado con
NaCl 0,3 M, NaPO_{4} 20 mM, pH 7,5 a 23 \pm 5ºC.
Para eluir la proteína deseada, se usó un
gradiente lineal que variaba de NaCl 0,2-1 M,
NaPO_{4} 20 mM, pH 7,5. Se recogió el producto bruto en varias
fracciones basándose en la A_{280} del eluato. Después de la
elución, estas fracciones se reunieron y se anotó el volumen.
Para oxidar los grupos sulfhidrilo libres, se
realizó una etapa de oxidación. Para la proteínas con los modelos
de cisteína alterados, en comparación con el KGF nativo, se añadió
un agente oxidante (por ejemplo, diclorhidrato de cistamina u otro
agente oxidante apropiado, por ejemplo, cistina, glutatión oxidado o
cobre divalente) a una concentración final de 1-20
mM y el pH se ajustó a 7-9,5 con un pH de 9,0
\pm0,3 cuando se usó diclorhidrato de cistamina. La oxidación se
realizó a 10-30ºC durante un período adecuado. Para
la proteína KGF nativa, la oxidación se realizó añadiendo una
cantidad apropiada de (NH_{4})_{2}SO_{4} tal como
(NH_{4})_{2}SO_{4} 1-2 M, ajustando el
pH a 7,5-9,5 y manteniendo la temperatura a 23
\pm5ºC durante un período apropiado.
Después de la oxidación, el pH de la solución se
ajustó a un valor comprendido entre 6,5 y 9,5. Cuando fue necesario,
se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido a la solución a
una concentración final de 2 M. Para retirar los particulados, la
solución se pasó a través de filtros de clarificación
apropiados.
El producto filtrado y oxidado después se sometió
a cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). La matriz de HIC era
resina Butyl-650M Toyopearl™ (Tosohaas, Inc.,
Montgomeryville, PA). La solución que contenía proteína se introdujo
en la columna, que previamente se había equilibrado con
(NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M, NaCl 0,15 M, NaPO_{4} 20 mM,
pH 7,0. Después de introducir la muestra, la columna se lavó con
(NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M, NaCl 0,15 M, NaPO_{4} 20 mM,
pH 7,0. La proteína deseada después se eluyó usando un gradiente
lineal decreciente de (NH_{4})_{2}SO_{4} que variaba de
2-0 M desarrollado en NaCl 0,15 M, NaPO_{4} 20
mM, pH 7,0. Cuando comenzó a eluir la proteína deseada, como se
indica por un aumento en la A_{280} del eluato, se recogieron las
fracciones. Después se analizaron alícuotas de cada fracción por
SDS-PAGE. Las fracciones que contenían la proteína
deseada después se reunieron, se mezclaron minuciosamente y se
determinó el volumen del conjunto, así como la concentración de
proteína contenida.
El eluato que contenía proteína HIC reunido
después se concentró y se cambió el tampón de elución. Típicamente,
las proteínas se concentraron a 5,0- 10,0 mg/ml. La ultrafiltración
se realizó usando un sistema de ultrafiltración equipado con un
sistema cassette Pellicon™ (Millipore, Inc., Bedford, MA) con una
membrana que tenía los poros dimensionados de manera apropiada.
Después de la concentración, la muestra se
diafiltró frente a un tampón apropiado. El material retenido de la
etapa de concentración se diafiltró frente a NaCl 0,15 M,
NaPO_{4} 20 mM, pH 7,0 hasta que la conductividad del material
retenido estaba dentro de un 5% de la conductividad de la solución
de NaCl 0,15 M, NaPO_{4} 20 mM, pH 7,0.
Además, para retirar los precipitados y la
endotoxina bacteriana que pudiera estar presente, la muestra que
contenía proteína diafiltrada concentrada se pasó a través de un
filtro Posidyne™ de 0,1 \mum (Pall, Inc., Cortland, NY).Después
de determinar la concentración de proteínas de la solución y
basándose en la concentración deseada el producto a granel final, la
solución se diluyó con NaCl 0,15 M, fosfato sódico 20 mM, pH 7,0,
hasta la concentración final deseada. Después se realizó una
filtración aséptica final a través de un filtro de 0,22 \mum,
según se transfería el producto a granel final a un recipiente sin
pirógenos para el almacenamiento (a aproximadamente 5ºC) para una
formulación adicional.
Este ejemplo describe la expresión, aislamiento y
caracterización de dos formas de KGF recombinantes biológicamente
activas (rKGF) producidas en un sistema de expresión de
mamíferos.
El gen de KGF humano se aisló por amplificación
por PCR de un ADNc obtenido a partir de fibroblastos humanos
dérmicos normales (Clonetec, Inc. Palo Alto, CA). Después de la
obtención del ADNc por la transcriptasa inversa, se usó la PCR para
amplificar el gen de KGF. Se usaron el OLIGO#25 y el OLIGO#26 para
amplificar el gen del ADNc y se usaron el OLIGO#27 y el OLIGO#28
para poner sitios de restricción HindIII y BglII en
los extremos del fragmento por una segunda amplificación de PCR,
como se indica en la figura 1.
Después de la clonación y de la confirmación de
la secuencia de ADN, se usó el ADN del gen de KGF.
La amplificación se realizó usando dos
cebadores:
El cebador con sentido, OLIGO#29, incluía un
sitio XbaI y una secuencia de traducción Kozak consenso
(5'-CCACC-3') cadena arriba del
codón de iniciación, ATG. El cebador antisentido, OLIGO#30, incluía
un sitio de clonación Sall y un codón stop adicional. Después
de 18 ciclos de amplificación por PCR (30 seg. de desnaturalización
a 94ºC, 40 seg. de hibridación a 55ºC y 40 seg. de alargamiento a
72ºC), el producto se digirió con XbaI y Sall y se
unió con un ADN digerido de forma similar de pDSR\alpha2 (de
acuerdo con los métodos de Bourdrel, et al., (1993),
Protein Exp. & Purif., 4:130-140 y
Lu et al., (1992), Arch. Biochem. Biophys.,
298:150-158). Esto produjo un plásmido
KGF/pDSR\alpha2 que ponía el gen KGF humano entre el promotor
temprano de SV40 y las secuencias de poliadenilación de
\alpha-FSH. Se recogieron dos clones y el
análisis de la secuencia de ADN confirmó la construcción del vector
deseado.
Después se linealizaron dos microgramos de ADN de
KGF/pDSR\alpha2 con PvuI. Después se transfectaron células
de ovario de hámster chino (CHO), sembradas el día antes a 0,8 x
10^{6} células/60 mm de placa de cultivo, con el ADN tratado
usando un método de precipitación con fosfato cálcico convencional
(Bourdrel et al., supra). Dos semanas después, se
recogieron las colonias individuales y se transfirieron a placas de
24 pocillos. El medio acondicionado se consideró sin suero cuando
las células alcanzaron lla confluencia y se analizaron alícuotas
del mismo por transferencia de Western usando un antisuero
policlonal de conejo reactivo contra KGF humano expresado en E.
coli.
Se realizaron transferencias de Western
procesando muestras a través de geles de SDS - poliacrilamida al
12,5% (p/v), seguido de electrotransferencia durante 1 h a 400 mA en
membranas de nitrocelulosa usando un aparato de transferencia
semiseco (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA). Como
tampón de transferencia se usó Tris 20 mM, glicina 150 mM y metanol
al 20%. Las láminas de nitrocelulosa se bloquearon por incubación
con suero de cabra normal al 10% en PBS. Como anticuerpo primario
se usó antisuero de conejo inducido contra KGF procedente de E.
coli. Para el uso, se diluyó 1/10.000 en suero de cabra normal
al 1% en PBS y se incubó con las láminas de nitrocelulosa bloqueadas
durante 12 horas a temperatura ambiente, después de lo cual se
retiró el exceso de anticuerpo por tres lavados de 30 minutos en
PBS. Las membranas de nitrocelulosa después se incubaron en 100 ml
de suero de cabra normal al 1% en PBS que contenía IgG de cabra
anti-conejo biotinilada con Vectastain™ (anticuerpo
secundario, vector Labs, Burlingame, CA), durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Después de tres lavados de 10 minutos en PBS,
se realizó una incubación a temperatura ambiente de 30 minutos en
100 ml de solución de suero de cabra normal al 1% que contenía
estreptavidina y peroxidasa biotinilada, preparada de acuerdo con
las instrucciones del fabricante (Vector Labs). Después de tres
lavados en PBS, el material con reacción cruzada con KGF se
visualizó por incubación en una mezcla de 60 \mul de
H_{2}O_{2} al 30% (p/v) en 100 ml de PBS y 50 mg de
4-cloronaftol en 20 ml de metanol. La reacción se
detuvo aclarando en agua después de 10 minutos.
El análisis de las transferencias reveló que el
anticuerpo específico para KGF se asociaba con tres bandas proteicas
distintas, estando dos de ellas muy relacionadas con pesos
moleculares de aproximadamente 25-29 kDa y una con
un peso molecular estimado de aproximadamente 17 kDa, en comparación
con el peso molecular esperado de aproximadamente 18,8 de la
proteína madura de 163 aminoácidos. Además, se seleccionaron varios
clones de alta expresión que secretaban más de 2,0 mg de rKGF por
litro, a juzgar por el análisis de Western, y se expandieron en
frascos cilíndricos (de acuerdo con el método de Lu et al.,
supra) para generar grandes volúmenes de medio acondicionado
sin suero para la purificación de KGF por cromatografía de
intercambio catiónico y exclusión molecular, como se indica más
adelante.
Se purificó KGF a partir de tres litros de medio
condicionado sin suero aplicando el medio directamente a una columna
de intercambio catiónico (5 x 24 cm) rellena con 450 ml de columna
de sulfoetilo de SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)
pre-equilibrada con fosfato sódico 20 mM, pH 7,5.
Después de lavar con 5 volúmenes de columna de fosfato sódico 20 mM,
NaCl 0,2 M, pH 7,5, el rKGF se eluyó usando un gradiente lineal de
20 volúmenes de columna de NaCl de 0,2 a 1,0 M en fosfato sódico 20
mM, pH 7,5. Se recogieron fracciones de 50 ml con un control
continuo de la A_{280}. La proteína KGF se detectó analizando
alícuotas de cada fracción por SDS-PAGE. La
SDS-PAGE se realizó en un sistema de electroforesis
(Novex, San Diego, CA) usando geles de premoldeo de
Tris-glicina al 14% (de acuerdo con el método de
Laemmli (1970), Nature, 227:680-685).
Las muestras se mezclaron con tampón de muestra SDS no reductor sin
calentamiento antes de la carga. Las proteínas se detectaron por
tinción con azul de Coomassie o con plata. Se vieron dos picos de
elución posterior que contenían bandas proteicas que correspondían a
las bandas de 25-29 kDa y 17 kDa detectadas por
transferencia de Western. Las fracciones que contenían cada uno de
estos picos se concentraron por separado a un volumen menor de 1,0
ml y se sometieron a exclusión molecular.
Las exclusiones moleculares emplearon columnas de
resina Superdex-75™ (HR 10/30, Pharmacia)
pre-equilibradas con PBS, pH 7,2 y calibradas con
los siguientes patrones de peso molecular conocido (BioRad, San
Francisco CA): tiroglobulina (670 kDa), gamma globulina (158 kDa),
ovoalbúmina (44 kDa), mioglobina (17 kDa) y vitamina
B-12 (1,4 kDa). Estas etapas de purificación dieron
como resultado una purificación de aproximadamente 2000 veces de
rKGF, incluyendo específicamente un material de 17 kDa y 30 kDa,
como se estima por tinción con plata.
En el caso del material de mayor peso molecular,
el rKGF eluyó como un pico simétrico principal, que se denominó
KGF-a. Tras el análisis de SDS-PAGE
de una cantidad menor de este material, 3 \mug/franja frente a 6
\mug/franja, se resolvieron dos bandas con una diferencia de peso
molecular de 1-2 kDa. En el caso del material de
menor peso molecular denominado KGF-b, la exclusión
molecular produjo una preparación proteica que tenía la movilidad
esperada. Tanto para KGF-a como para
KGF-b, el rendimiento total después de la
purificación fue de aproximadamente un 30-40%.
También se analizaron las secuencias de
aminoácidos de KGF-a y KGF-b. Estos
análisis se realizaron en un secuenciador automático (Modelo 477A o
470A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) equipado con un
analizador de PTH- aminoácidos on line Modelo 120A y un sistema de
recogida de datos Modelo 900A (de acuerdo con el método de Lu et
al., (1991), J. Biol. Chem.,
266:8102-8107). El análisis de la secuencia
de Edman de KGF-a reveló una secuencia
N-terminal principal de
X_{1}-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-X_{2}-
X_{3}-S- (SEC ID Nº:51). También estaba presente
una secuencia minoritaria que empezaba en el tercer aminoácido
N-terminal, ácido aspártico, en un 1,6% de la
proteína secuenciable total. X_{1}, X_{2} y X_{3} fueron los
no asignados debido a la ausencia de señales de feniltiohidantoinil
(PTH) aminoácido durante el análisis de la secuencia.
De manera interesante, el análisis de la
secuencia N-terminal de KGF-b reveló
una secuencia de aminoácidos N-terminal de
S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V-
(SEC ID Nº:52), que indicaba que es una forma truncada
N-terminalmente de KGF que ha escindido
proteolíticamente en el enlace peptídico Arg^{23}- Ser^{24}.
Para caracterizar adicionalmente el
KGF-a purificado y KGF-b, la
proteína se sometió a glicosidasas, (neuraminidasa,
O-glicanasa y/o N-glicanasa) usando
técnicas conocidas (Sasaki et al., (1987), J. Biol.
Chem. 262:12059- 12076; Takeuchi et al., (1988),
J. Biol. Chem., 263:3657-3663; Zsebo
et al., (1990), Cell,
63:195-201). Estos datos indican que el
KGF-a contiene carbohidratos unidos a N y a O,
aunque la forma de menor peso molecular de KGF-a
probablemente contiene sólo azúcar unido a N. El tratamiento con
glicosidasa no produjo una reducción de peso molecular para
KGF-b, indicando que la molécula no está
glicosilada.
Cada análogo de KGF se diluyó y se ensayó con
respecto a la actividad biológica midiendo la absorción
[^{3}H]-timidina de células Balb/MK (de acuerdo
con el método de Rubin et al., (1989), supra). Las muestras
primero se diluyeron en medio de bioensayo que constaba de MEM de
Eagle de encargo al 50%, F12 de encargo al 50% y 5 \mug/ml de
transferrina, selenita sódica a 5 ng/ml, HSA al 0,0005% y Tween 20
al 0,005%. Después se añadieron muestras de KGF a placas de 96
pocillos Falcon Primeria sembradas con células Balb/MK. Se midió la
incorporación [^{3}H]-timidina durante la síntesis
de ADN y se convirtió en la entrada de la concentración de KGF
nativo por comparación con una curva patrón de KGF nativo. Cada uno
de los análogos ensayados presentó actividad mitogénica.
La interacción con el receptor de KGF se examinó
usando preparaciones de membrana de receptor de KGF aisladas
preparadas a partir de queratinocitos epidérmicos de ratón Balb/MK
(por el procedimiento descrito por Massague (1983), J. Biol.
Chem., 258:13614-13620). Específicamente,
se diluyeron diversas formas de KGF con Tris-HCl 50
mM, pH 7,5, que contenía albúmina de suero bovino al 0,2% para
variar en concentración de 0,8 ng a 100 ng por 50 \mul. Se
incubaron individualmente con la preparación de membrana (75 ng/ml)
y KGF derivado de E. coli marcado con ^{125}I (1,5 ng). Los
experimentos de unión al receptor y de competición se realizaron a
4ºC durante 16 h, después de lo cual se tomaron muestras, se
centrifugaron y se lavaron dos veces con el tampón diluyente
anterior para retirar el KGF no unido y unido de forma no
específica, marcado. Después las muestras se sometieron a un
recuento para determinar la radiactividad restante. Se construyeron
curvas de competición para la unión al receptor entre muestras de
KGF y KGF marcado representando el porcentaje de no competición
frente a las concentraciones de cada muestra de KGF. Los
experimentos de no competición del ensayo de radiorreceptor
indicaron que KGF, KGF-a y KGF-b
procedentes de E. coli tienen una actividad de unión a
receptores similar.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Amgen Inc.
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método para purificar factores de crecimiento de queratinocitos
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 52
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Amgen Inc.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1840 DeHavilland Drive
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Thousand Oaks
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: U.S.A
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- ZIP: 91320-1789
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatenIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/487.830
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN: aún desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 862 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 194 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 596 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 186 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 499 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 164 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAATGACCTA GGAGTAACAA TCAAC
\hfill25
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAAAACAAACA TAAATGCACA AGTCCA
\hfill26
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA
\hfill26
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A
\hfill31
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA
\hfill27
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTGCGTATCG ACAAACGCGG CAAAGTCAAG GGCACCC
\hfill37
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAC TGTT
\hfill44
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAGGTGTT GAATCTG
\hfill37
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCTTGGGTGC CCTTGACTTT GCCGCGTTTG TCGATACGCA GGTAC
\hfill45
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACAGCAACAG TACGGATTTC CATAATATTG TAGTTGTTTT TCATC
\hfill45
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAATTCAGATT CAACACCTTT GATTGCAACG ATACCA
\hfill36
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAGTTTTGATC TAGAAGGAGG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCAAAACTGG ATCCTATTAA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 91 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAGTTTTGATC TAGAAGGAGG AATAACATAT GTGCAACGAC ATGACTCCGG AACAGATGGC
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTACCAACGTT AACTGCTCCA GCCCGGAACG T
\hfill91
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 90 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCACACCCGTA GCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC GTGTTCGTCG TCTGTTCTGC
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA
\hfill90
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 22:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 90 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGTGGTAAAG TTAAAGGTAC CCAGGAAATG AAAAACAACT ACAACATCAT GGAAATCCGT
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACTGTTGCTG TTGGTATCGT TGCAATCAAA
\hfill90
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 90 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGGTGTTGAAT CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGAATGCAACG AAGACTGCAA CTTCAAAGAA
\hfill90
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 90 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTGATCCTGG AAAACCACTA CAACACCTAC GCATCTGCTA AATGGACCCA CAACGGTGGT
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT
\hfill90
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 88 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATCCCGGTTC GTGGTAAAAA AACCAAAAAA GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCAATCACTT AATAGGATCC AGTTTTGA
\hfill88
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTACGGGTGTG ACGTTCCGGG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTTTACCACG TTTGTCGATA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATTCAACACC TTTGATTGCA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCAGGATCAG TTCTTTGAAG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGAACCGGGAT ACCTTTCTGG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 495 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 164 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 495 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 164 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 495 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 164 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 450 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 38:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 149 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 39:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 426 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 40:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 40:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 41:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 426 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 41:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 42:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 43:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 43:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG
\hfill24
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 44:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS: NO
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complementario (1..24)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 44:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC
\hfill24
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 45:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 45:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAATCTACAA TTCACAGA
\hfill18
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 46:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 46:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTTAAGTTATT GCCATAGG
\hfill18
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 47:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 47:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAACAAAGCTT CTACAATTCA CAGATAGGA
\hfill29
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 48:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 48:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAACAAGATCT TAAGTTATTG CCATAGG
\hfill27
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 49:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 49:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGGTCTAGAC CACCATGCAC AAATGGATAC TGACATGG
\hfill38
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 50:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 50:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCCGTCGACC TATTAAGTTA TTGCCATAGG AAG
\hfill33
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 51:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 51:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 52:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 52:
Claims (18)
1. Un método para purificar un factor de
crecimiento de queratinocitos (KGF), comprendiendo el método las
siguientes etapas:
- a)
- obtener una solución que comprende el KGF;
- b)
- introducir la solución de la etapa a) en una resina de intercambio catiónico;
- c)
- eluir el KGF en una solución de eluato de la resina de intercambio catiónico;
- d)
- pasar la solución de eluato de la etapa c) a través de (i) una matriz de exclusión de peso molecular, o (ii) una matriz de cromatografía de interacción hidrófoba; y
- e)
- recuperar el KGF,
con la condición de que dicho método no comprenda
una etapa de cromatografía de afinidad de heparina.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la resina de intercambio catiónico se selecciona entre una
columna de carboximetil celulosa, carboximetil agarosa, agarosa
sulfatada o celulosa.
3. El método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, donde la solución de eluato de la etapa c)
se pasa a través de una matriz de exclusión de peso molecular.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
donde la matriz de exclusión de peso molecular se selecciona entre
columnas basadas en agarosa, basadas en acrilamida, basadas en
sílice o basadas en polímero.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, donde la solución de eluato de la etapa c)
se pasa a través de una matriz de cromatografía de interacción
hidrófoba.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5,
donde se oxidan los grupos sulfhidrilo libres del KGF en la solución
de eluato antes de pasar la solución de eluato a través de la
matriz de cromatografía de interacción hidrófoba.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6,
donde el KGF se oxida por contacto con un agente oxidante.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7,
donde el agente oxidante se selecciona entre diclorhidrato de
cistamina, cistina, glutatión oxidado o cobre divalente.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 y 5 a 8, donde la matriz de cromatografía de
interacción hidrófoba se selecciona entre una columna que tiene una
resina sustituida con alquilo o fenilo.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho KGF comprende los restos
aminoacídicos 32-194 de la SEC ID Nº:2,
opcionalmente con una secuencia señal, o una muteína del mismo.
11. El método de la reivindicación 10, donde
dicha muteína de factor de crecimiento de queratinocitos se
selecciona entre
- a)
- un polipéptido que tiene restos correspondientes a la cisteína en la posición de aminoácidos 32 de la SEC ID Nº:2 y la cisteína en la posición de aminoácidos 46 de la SEC ID Nº:2 reemplazada o delecionada;
- b)
- un polipéptido de cambio de carga donde uno o más restos aminoacídicos 72-185 de la SEC ID Nº:2 se han delecionado o sustituido con un resto neutro o un resto cargado negativamente seleccionado para obtener una proteína con una carga positiva reducida;
- c)
- un polipéptido generado por medio de la sustitución de al menos un aminoácido dentro de la región de formación de bucles de Asn^{146}- His^{147} -Tyr^{148} -Asn^{149} -Thr^{150} de la SEC ID Nº:2 por al menos un aminoácido que tiene un mayor potencial de formación bucles; o
- d)
- un polipéptido que tiene una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos dentro de los restos aminoacídicos 154-164 de la SEC ID Nº:2
12. El método de la reivindicación 11, donde
dicha muteína se selecciona entre C(32,46)S,
\DeltaN15, \DeltaN16, \DeltaN17, \DeltaN18, \DeltaN19,
\DeltaN20, \DeltaN21, \DeltaN22, \DeltaN23, \DeltaN24,
\DeltaN3/C(46)S, \DeltaN3/C(46)-,
\DeltaN8/C(46)S, \DeltaN8/C(46)-,
C(32,46)S/R(175)E,
C(32,46)S/R(175)Q,
\DeltaN23/R(175)Q, C(32,46,71)S,
C(32,46,133)S, C(32,46,133,137)S,
\DeltaN23/N(168)E,
\DeltaN23/K(170)E,
\DeltaN23/K(170)Q,
\DeltaN23/R(175)A,
\DeltaN23/R(175)E,
\DeltaN23/R(175)L,
\DeltaN23/K(178)E,
\DeltaN23/K(178)Q, \DeltaN23(184)E,
\DeltaN23/K(184)Q,
\DeltaN23/Q(183)E/K(184)E,
R(175)Q o H(147), estando cada muteína
designada por la referencia a la SEC ID Nº 2.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 10 a 12, donde dicho KGF incluye un resto de
metionina inicial.
14. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 13, donde el KGF se produce en una célula
procariota.
15. El método de acuerdo con la reivindicación
14, donde la célula procariota es E. coli.
16. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 13, donde el KGF se produce en una célula
de mamífero.
17. El método de acuerdo con la reivindicación
16, donde la célula eucariota es una célula de ovario de hámster
chino
18. El método de acuerdo con la reivindicación
15, donde el método comprende:
- a)
- obtener una solución que comprende \DeltaN23, donde la metionina inicial es opcional;
- b)
- cargar la solución de la etapa a) en una resina de intercambio catiónico seleccionada entre columnas de carboximetil celulosa, carboximetil agarosa, agarosa sulfatada o celulosa;
- c)
- eluir el KGF en una solución de eluato de la resina de intercambio catiónico;
- d)
- poner en contacto la solución de eluato con un agente oxidante, donde el agente oxidante se selecciona entre diclorhidrato de cistamina, cistina, glutatión oxidado o cobre divalente;
- e)
- pasar la solución de eluato de la etapa d) a través de una matriz de cromatografía de interacción hidrófoba seleccionada entre una resina sustituida con alquilo o fenilo;
y
- f)
- recuperar \DeltaN23 de la matriz de cromatografía de interacción hidrófoba.
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