JP2002523455A - 蛋白質キナーゼ活性の調節剤としての幾何学的に制限された２−インドリノン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は，蛋白質キナーゼの活性を調節し，したがって，蛋白質キナーゼ関連細胞性疾患，例えば癌の予防および治療に有用であると予測される，新規な幾何学的に制限された２−インドリノンおよびその生理学的に許容される塩に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】序 本発明は，一般に有機化学，生化学，薬理学，および医薬に関する。より詳細
には，本発明は，蛋白質キナーゼ（"ＰＫ"）の活性を調節し，したがって，異常
なＰＫ活性に関連する疾患に対して有益な効果を示すことが予測される，幾何学
的に制限された２−インドリノン誘導体およびその生理学的に許容される塩およ
びプロドラッグに関する。

【０００２】発明の背景 以下は，背景情報としてのみ提供されるものであり，本発明に対する先行技術
であると認めるものではない。

【０００３】 ＰＫは，蛋白質のチロシン，セリンおよびトレオニン残基上のヒドロキシ基の
リン酸化を触媒する酵素である。この外観上は単純な活性の結果は圧倒的である
。細胞成長，分化および増殖，すなわち，細胞生命のほぼすべての観点が種々の
仕方でＰＫ活性に依存する。さらに，異常なＰＫ活性は，比較的生命を脅かさな
い疾患（例えば乾癬）から，非常に悪性の疾患（例えば神経膠細胞腫（脳癌））
までの範囲の疾患の宿主と関連づけられてきた。

【０００４】 ＰＫは，慣用的に２種類に分類することができる：蛋白質チロシンキナーゼ（
ＰＴＫ）およびセリン−トレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）。

【０００５】 ＰＴＫ活性の主な観点は，成長因子レセプターへのその関与である。成長因子
レセプターは，細胞表面蛋白質である。成長因子リガンドが結合すると，成長因
子レセプターは活性型に変換され，これが細胞膜の内表面上の蛋白質と相互作用
する。これは，レセプターおよび他の蛋白質上のチロシン残基のリン酸化を引き
起こし，細胞内部で種々の細胞質シグナリング分子との複合体を形成し，次にこ
れは多くの細胞性応答，例えば，細胞分裂（増殖），細胞分化，細胞成長，細胞
外微細環境への代謝的効果の発現等を行う。さらに詳しい議論については，Ｓｃ
ｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｎｅｕｒｏｎ，９：３０３−
３９１（１９９２）（本明細書において完全に記載されているように，図面を含
め本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい。

【０００６】 ＰＴＫ活性を有する成長因子レセプターは，レセプターチロシンキナーゼ（"
ＲＴＫ"）として知られている。これらは，多様な生物学的活性を有する膜貫通
レセプターの大きなファミリーを含む。現在のところ，ＲＴＫの少なくとも１９
個の異なるサブファミリーが同定されている。これらのサブファミリーの例は，
"ＨＥＲ"ＲＴＫと称されるサブファミリーであり，これにはＥＧＦＲ（上皮成長
因子レセプター），ＨＥＲ２，ＨＥＲ３およびＨＥＲ４が含まれる。これらのＲ
ＴＫは，細胞外グリコシル化リガンド結合ドメイン，膜貫通ドメイン，および蛋
白質上のチロシン残基をリン酸化しうる細胞内細胞質触媒ドメインから構成され
る。

【０００７】 別のＲＴＫサブファミリーは，インスリンレセプター（ＩＲ），インスリン様
成長因子Ｉレセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）およびインスリンレセプター関連レセプ
ター（ＩＲＲ）を含む。ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒはインスリン，ＩＧＦ−Ｉおよ
びＩＧＦ−ＩＩと相互作用して，２つの完全に細胞外グリコシル化されたαサブ
ユニットと２つのβサブユニットのヘテロ４量体を形成し，これは細胞膜を横切
り，チロシンキナーゼドメインを含有する。

【０００８】 第３のＲＴＫサブファミリーは，血小板由来成長因子レセプター（"ＰＤＧＦ
Ｒ"）群として表され，これにはＰＤＧＦＲα，ＰＤＧＦＲβ，ＣＳＦＩＲ，ｃ
−ｋｉｔおよびｃ−ｆｍｓが含まれる。これらのレセプターは，可変数のイムノ
グロビン様ループおよび細胞内ドメインからなるグリコシル化された細胞外ドメ
インから構成され，ここでチロシンキナーゼドメインは関連のないアミノ酸配列
により分断されている。

【０００９】 別の群は，そのＰＤＧＦＲサブファミリーとの類似性のため，しばしばＰＤＧ
ＦＲサブファミリーに包摂される，胎児肝キナーゼ（"ｆｌｋ"）レセプターサブ
ファミリーである。この群は，キナーゼ挿入ドメイン−レセプター胎児肝キナー
ゼ−１（ＫＤＲ／ＦＬＫ−１，ＶＥＧＦ−Ｒ２），ｆｌｋ−１Ｒ，ｆｌｋ−４お
よびｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｆｌｔ−１）からなると考えられている。

【００１０】 チロシンキナーゼ成長因子レセプターファミリーの別の１つのメンバーは，繊
維芽細胞成長因子（"ＦＧＦ"）レセプター群である。この群は，４つのレセプタ
ー，ＦＧＦＲ１−４，および７つのリガンド，ＦＧＦ１−７から構成される。ま
だあまり明確にされていないが，レセプターは，可変数のイムノグロビン様ルー
プおよび細胞内ドメインを含有するグリコシル化された細胞外ドメインから構成
されるようであり，ここでチロシンキナーゼ配列は関係のないアミノ酸配列の領
域により分断されている。

【００１１】 チロシンキナーゼ成長因子レセプターファミリーのさらに別のメンバーは，血
管内皮成長因子（ＶＥＧＦ"）レセプターサブグループである。ＶＥＧＦは，Ｐ
ＤＧＦに類似するダイマーの糖蛋白質であるが，異なる生物学的機能およびイン
ビボでの標的細胞特異性を有する。特に，ＶＥＧＦは，現在のところ，血管新生
および脈管形成において本質的な役割を果たすと考えられている。

【００１２】 既知のＲＴＫサブファミリーのより完全なリストは，Ｐｌｏｗｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，ＤＮ＆Ｐ，７（６）：３３４−３３９（１９９４）（本明細書において
完全に記載されているように，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する
）に記載されている。

【００１３】 ＲＴＫに加え，"非レセプターチロシンキナーゼ"または"細胞性チロシンキナ
ーゼ"と称される，完全に細胞内のＰＴＫのファミリーが存在する。本明細書に
おいては，"ＣＴＫ"と略されるこの後者の呼称を使用する。ＣＴＫは細胞外およ
び膜貫通ドメインを含有しない。現在のところ，１１個のサブファミリー（Ｓｒ
ｃ，Ｆｒｋ，Ｂｔｋ，Ｃｓｋ，Ａｂｌ，Ｚａｐ７０，Ｆｅｓ，Ｆｐｓ，Ｆａｋ，
ＪａｋおよびＡｃｋ）の２４個を越えるＣＴＫが同定されている。Ｓｒｃサブフ
ァミリーは，これまでのところ，ＣＴＫのもっとも大きい群であるようであり，
Ｓｒｃ，Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，Ｂｌｋ，Ｈｃｋ，ＦｇｒおよびＹｒ
ｋを含む。ＣＴＫのより詳細な議論については，Ｂｏｌｅｎ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
，８：２０２３−２０３１（１９９３）（本明細書において完全に記載されてい
るように，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい。

【００１４】 セリン／トレオニンキナーゼもしくはＳＴＫは，ＣＴＫと同様に，主として細
胞内にあるが，ＳＴＫタイプのレセプターキナーゼは少ない。ＳＴＫはもっとも
一般的なサイトゾルキナーゼである。すなわち，細胞質オルガネラおよび細胞骨
格以外の，細胞質のその部分でその機能を行うキナーゼである。サイトゾルは，
細胞の中間代謝および生合成活性のほとんどが生ずる細胞中の領域である。例え
ば，蛋白質がリボソーム上で合成されるのはサイトゾル内である。

【００１５】 ＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫはすべて，病原性状態，特に癌を含む状態の宿主
であることが示唆されてきた。ＰＴＫと関連づけられてきた他の病原性状態には
，限定されるものではないが，乾癬，肝硬変，糖尿病，脈管形成，再狭窄，眼性
疾患，慢性関節リウマチおよび他の炎症性疾患，自己免疫疾患等の免疫疾患，ア
テローム性動脈硬化等の心血管疾患，および種々の腎臓疾患が含まれる。

【００１６】 癌に関しては，腫瘍の発達を推進する過剰な細胞増殖を説明する主要な仮説の
２つは，ＰＫにより制御されることが知られている機能に関連する。すなわち，
悪性細胞成長は細胞分裂および／または分化を調節するメカニズムの故障に起因
することが示唆されている。多数のプロトオンコジンの蛋白質産物は，細胞成長
および分化を制御するシグナル伝達経路に関与することが示されている。これら
のプロトオンコジンの蛋白質産物には，上で議論した，細胞外成長因子，膜貫通
成長因子ＰＴＫレセプター（ＲＴＫ），細胞質ＰＴＫ（ＣＴＫ）およびサイトゾ
ルＳＴＫが含まれる。

【００１７】 ＰＫに関連する細胞活性と広範な種類のヒト疾患との間の見かけ上の連結の観
点から，ＰＫ活性を調節する方法を同定しようとする試みに多大な努力が払われ
ていることは驚くべきことではない。これらのいくつかには，実際の細胞プロセ
スに関与する分子を模倣する大きな分子を用いるバイオミメティック方法が含ま
れる（例えば，変異体リガンド（米国特許４，９６６，８４９）；可溶性レセプ
ターおよび抗体（ＷＯ９４／１０２０２，Ｋｅｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｔｈｏｍａ
ｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：１０７０５−０９（１
９９４），Ｋｉｍ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：８４１−８４４（１９
９３））；ＲＮＡリガンド（Ｊｅｌｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，３３：１０４５０−５６）；Ｔａｋａｎｏ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏ．Ｃｅｌｌ４：３５８Ａ（１９９３）；Ｋｉｎｓｅｌｌａ，ｅｔａｌ．，Ｅ
ｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．１９９：５６６−６２（１９９２）；Ｗｒｉｇｈｔ，ｅ
ｔａｌ．，Ｊ．ＣｅｌｌｕｌａｒＰｈｙｓ．，１５２：４４８−５７）およびチ
ロシンキナーゼ阻害剤（ＷＯ９４／０３４２７；ＷＯ９２／２１６６０；ＷＯ９
１／１５４９５；ＷＯ９４／１４８０８；米国特許５，３３０，９９２；Ｍａｒ
ｉａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
．，３５：２２６８（１９９４））。

【００１８】 上述に加え，ＰＫ阻害剤として作用する小分子を同定する試みがなされている
。例えば，ビス単環，二環およびヘテロ環アリール化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／
２０６４２），ビニレンアザインドール誘導体（ＰＣＴ ＷＯ９４／１４８０８
）および１−シクロプロピル−４−ピリジルキノロン類（米国特許５，３３０，
９９２）が，チロシンキナーゼ阻害剤として記載されている。スチリル化合物（
米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピリジル化合物（米国特許５，３
０２，６０６），キナゾリン誘導体（欧州特許出願０５６６２６６Ａｌ），セレ
ナインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ ＷＯ９４／０３４２７），三環ポリ
ヒドロキシル化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０）およびベンジルホスホン
酸化合物（ＰＣＴ ＷＯ９１／１５４９５）はすべて，癌の治療において有用な
ＰＴＫ阻害剤として記載されている。

【００１９】発明の概要 ＰＫ活性を調節し，したがって異常なＰＫ活性によりもたらされる疾患の治療
および予防において有用であると予測される小さい有機分子を同定する我々自身
の努力により，ＰＫを調節する能力を示す新規な幾何学的に制限された２−イン
ドリノン誘導体のファミリーが発見された。これらが本発明の主題である。

【００２０】 すなわち，本発明は，一般に，レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ），非レ
セプター蛋白質チロシンキナーゼ（ＣＴＫ）およびセリン／トレオニン蛋白質キ
ナーゼ（ＳＴＫ）の活性を調節する，新規な幾何学的に制限された２−インドリ
ノン誘導体およびそのプロドラッグおよび生理学的に許容される塩に関する。さ
らに，本発明は，開示される化合物およびそれらの生理学的に許容される塩およ
びプロドラッグの医薬組成物の製造，およびＰＫによりもたらされる疾患の治療
または予防における使用に関する。疾患の例としては，限定されるものではない
が，癌，糖尿病，肝硬変，心血管疾患，例えばアテローム性動脈硬化症，新脈管
形成，免疫疾患，例えば自己免疫疾患，および腎疾患が挙げられる。

【００２１】 "２−インドリノン"，"インドリン−２−オン"，"２−オキシインドール"およ
び"オキシインドール"との用語は，本明細書において互換的に用いられ，いずれ
も一般式：

【化２】 を有する化学的化合物を表す。

【００２２】 本明細書において用いられる場合，上述の用語は，イオウ誘導体を含むものと
見なされる。すなわち，Ｚ＝イオウである。

【００２３】 "幾何学的に制限された"とは，二重結合に結合している基の互いの空間的関係
が，二重結合の本来の質により決まっている，二重結合のまわりの化学構造を表
す。すなわち，二重結合に結合している原子は，同一平面上，つまり二重結合そ
れ自身の原子と同じ平面内になければならない。このことは，本発明の化合物を
考慮する場合に関する限り，式１および２：

【化３】 により示される一般的構造を参照することにより最もよく示される。

【００２４】 式１は，本発明の化合物の骨格構造を表す。１は例示のためにのみ示され，限
定するものではないことが理解される。１に示されるもの以外の骨格構造も，本
発明の範囲および精神の範囲内である。１から得るべき特徴は，インドリノンの
３位において二重結合に結合している原子の関係である。１において，環系ａお
よび環系ｂは，環炭素を介して二重結合に結合している。二重結合のため，連結
している炭素原子のいずれの側の原子も，同一平面上になければならない。環そ
れ自体は内部的に同一平面上にあるため，全体の分子，すなわち環系ａおよび環
系ｂおよび二重結合は，同一平面上にある。これは式２とは対照的であり，式２
においては，一重結合が環系ａ'を二重結合に連結している。したがって，環系
ａ'は一重結合のまわりに自由に回転することができ，環系ａ'およびｂ'は同一
平面上になくてもよく，互いに垂直であることも可能である。

【００２５】 "医薬組成物"とは，１またはそれ以上の本明細書に記載される化合物またはそ
の生理学的に許容される塩と，他の化学成分，例えば生理学的に許容される担体
および／または賦形剤との混合物を表す。医薬組成物の目的は，化合物の生物へ
の投与を容易にすることである。

【００２６】 本明細書において用いられる場合，"生理学的に許容される担体"とは，生物に
顕著な刺激を引き起こさず，投与される化合物の生物学的活性および特性を排除
しない担体または希釈剤を表す。

【００２７】 "賦形剤"とは，医薬組成物に加えて化合物の投与をさらに容易にする不活性の
物質を表す。賦形剤の例としては，限定されるものではないが，炭酸カルシウム
，リン酸カルシウム，種々の糖および各種の澱粉，セルロース誘導体，ゼラチン
，植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。

【００２８】 "プロドラッグ"とは，インビボで親薬剤に転換される薬剤を表す。プロドラッ
グは，場合により，親薬剤より投与が容易であるかもしれないため，しばしば有
用である。例えば，プロドラッグは経口投与により生物学的に利用可能であるが
，親薬剤はそうではないかもしれない。プロドラッグはまた，親薬剤よりも医薬
組成物中で改良された溶解性を有するかもしれない。プロドラッグの例は，限定
されるものではないが，エステル（"プロドラッグ"）として投与されて，水溶性
であることが移動に不利である細胞膜の通過を容易にし，次に，水溶性であるこ
とが有利である細胞内に入った後，代謝的に加水分解されて活性種のカルボン酸
となるような，本発明の化合物であろう。

【００２９】 プロドラッグのさらに別の例は，短いポリペプチドであろう。例えば，限定さ
れるものではないが，末端アミノ基を介して本発明の化合物のカルボキシ基に結
合している２−１０アミノ酸のポリペプチドは，インビボで加水分解または代謝
されて活性分子を放出する。

【００３０】１．化合物 一般的な構造的特徴 １つの観点においては，本発明は，化学構造Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩ：

【化４】 を有する，幾何学的に制限された２−インドリノン化合物に関する。

【００３１】 本発明の範囲は，本発明の化合物の生理学的に許容される塩およびプロドラッ
グを含む。

【００３２】 Ｒ¹は，水素，アルキル，シクロアルキル，アルケニル，アルキニル，アリー
ル，ヒドロキシ，アルコキシ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−，Ｃ−ア
ミド，Ｃ−チオアミド，アセチル，−Ｓ（＝Ｏ）₂Ｒ"，およびトリハロメチルス
ルホニルからなる群より選択され，ここで，Ｒ"は，水素，アルキル，シクロア
ルキル，アリール，ヘテロアリール（環炭素を介して結合），およびヘテロ脂環
式（環炭素を介して結合）からなる群より選択され; Ａ，Ｂ，ＤおよびＥは，炭素および窒素からなる群より独立して選択され，ここ
で，Ａ，Ｂ，ＤまたはＥが窒素であるとき，それぞれＲ²，Ｒ³，Ｒ⁴またはＲ⁵は
存在せず； Ｆ，Ｇ，ＪおよびＫは，炭素，窒素，酸素およびイオウからなる群より独立して
選択され，ここで，ｎが１でありかつＦ，Ｇ，ＪまたはＫが炭素以外の原子であ
るとき，それぞれＲ⁶，Ｒ⁷，Ｒ⁸またはＲ⁹は存在せず； ｎが０でありかつＦ，ＧまたはＫが酸素またはイオウであるとき，それぞれＲ⁶
，Ｒ⁸またはＲ⁹は存在せず； Ｒ²，Ｒ³，Ｒ⁴，Ｒ⁵，Ｒ⁶，Ｒ⁷，Ｒ⁸およびＲ⁹は，水素，アルキル，トリハロア
ルキル，シクロアルキル，アルケニル，アルキニル，アリール，ヘテロアリール
，ヘテロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカプト，アル
キルチオ，アリールチオ，−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ"，−Ｓ（＝Ｏ）₂Ｒ"，Ｓ−スルホン
アミド，Ｎ−スルホンアミド，Ｎ−トリハロメタンスルホンアミド，−Ｃ（＝Ｏ
）Ｒ"，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−，シアノ，ニトロ，ハロ，シア
ナト，イソシアナト，チオシアナト，イソチオシアナト，Ｏ−カルバミル，Ｎ−
カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，Ｃ−アミド，Ｎ−アミ
ド，アミノおよび−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より独立して選択され； Ｒ²およびＲ³，またはＲ³およびＲ⁴，またはＲ⁴およびＲ⁵，またはＲ⁶およびＲ⁷ ，またはＲ⁷およびＲ⁸，またはＲ⁸およびＲ⁹は，一緒になって，メチレンジオキ
シまたはエチレンジオキシ基を形成してもよく； Ｒ¹³およびＲ¹⁴は，水素，アルキル，シクロアルキル，アリール，ヘテロアリー
ル，ヘテロ脂環式，−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ"，アセチル，−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ"，トリハロメ
タンスルホニルからなる群より独立して選択され，または一緒になって，５員ま
たは６員のヘテロ脂環式環を形成し； Ｒ¹⁰，Ｒ¹¹およびＲ¹²は，アルキル，シクロアルキル，アルケニル，アルキニル
，アリール，ヘテロアリール，ハロ，シアノ，トリハロメチル，ヒドロキシ，ア
ルコキシ，アルキルチオ，アリールオキシ，アリールチオ，Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−
，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺，−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）ＯＲ"，−
（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，シアナト，イソシアナ
ト，チオシアナト，イソチオシアナト，アミノ，−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ"，−Ｓ（＝Ｏ
）₂Ｒ"，ニトロおよび−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より独立して選択され； Ｒ¹⁰およびＲ¹¹またはＲ¹¹およびＲ¹²は，一緒になって，エンド二重結合を形成
してもよく； Ｚは，酸素およびイオウからなる群より選択され； ｒは１，２，３，４，５または６であり；そして ｎは０または１である。

【００３３】 "エンド"との用語は，環構造中に含まれる二重結合を表す。例えば，以下の構
造中の二重結合は"エンド"二重結合である：

【化５】 本明細書において用いられる場合，"アルキル"との用語は，飽和脂肪族炭化水
素を表し，直鎖および分枝鎖の基を含む。好ましくは，アルキル基は，１−２０
個の炭素原子を有する（本明細書において数値範囲，例えば"１−２０"と記載さ
れる場合，これは与えられる範囲の各整数を表す。例えば，"１−２０個の炭素
原子"とは，アルキル基が，１個の炭素原子，２個の炭素原子，３個の炭素原子
，以下同様に，２０個までの炭素原子からなっていてもよいことを意味する。）
。より好ましくは，これは１−１０個の炭素原子を有する中程度のサイズのアル
キルである。最も好ましくは，これは１−４個の炭素原子を有する低級アルキル
である。アルキルは，置換されていてもされていなくてもよい。置換されている
場合，置換基は，好ましくは，シクロアルキル，アリール，ヘテロアリール，ヘ
テロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカプト，アルキル
チオ，アリールチオ，シアノ，ハロ，カルボニル，チオカルボニル，Ｏ−カルバ
ミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，Ｃ−アミド
，Ｎ−アミド，Ｃ−カルボキシ，Ｏ−カルボキシ，シアナト，イソシアナト，チ
オシアナト，イソチオシアナト，ニトロ，シリル，アミノおよび−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴（
Ｒ¹³およびＲ¹⁴は，上で定義したとおりである）から独立して選択される１また
はそれ以上の置換基である。

【００３４】 "シクロアルキル"基は，全炭素単環または縮合環（隣接する炭素原子対を共有
する環）基を表し，ここで，環の１またはそれ以上は完全に共役したパイ電子系
を有しない。シクロアルキル基の例は，限定されるものではないが，シクロプロ
パン，シクロブタン，シクロペンタン，シクロペンテン，シクロヘキサン，アダ
マンタン，シクロヘキサジエン，シクロヘプタン，およびシクロヘプタトリエン
である。シクロアルキル基は，置換されていてもされていなくてもよい。置換さ
れている場合，置換基は，好ましくは，アルキル，アリール，ヘテロアリール，
ヘテロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカプト，アルキ
ルチオ，アリールチオ，シアノ，ハロ，カルボニル，チオカルボニル，カルボキ
シ，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，ニトロ，アミ
ノおよび−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴（Ｒ¹³およびＲ¹⁴は上で定義したとおりである）から独立
して選択される１またはそれ以上の置換基である。

【００３５】 "アルケニル"基は，少なくとも２つの炭素原子および少なくとも１つの炭素−
炭素二重結合からなる，本明細書において定義されるアルキル基である。

【００３６】 "アルキニル"基は，少なくとも２つの炭素原子および少なくとも１つの炭素−
炭素三重結合からなる，本明細書において定義されるアルキル基である。

【００３７】 "アリール"基は，完全に共役したパイ電子系を有する，全炭素単環または縮合
多環（すなわち，隣接する炭素原子対を共有する環）基を表す。アリール基の例
は，限定されるものではないが，フェニル，ナフタレニルおよびアントラセニル
である。アリール基は，置換されていてもされていなくてもよい。置換されてい
る場合，置換基は，好ましくは，ハロ，トリハロメチル，アルキル，ヒドロキシ
，アルコキシ，アリールオキシ，メルカプト，アルキルチオ，アリールチオ，シ
アノ，ニトロ，カルボニル，チオカルボニル，Ｃ−カルボキシ，Ｏ−カルボキシ
，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル
，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，スルフィニル，スルホニル，Ｓ−スルホンアミド，
Ｎ−スルホンアミド，トリハロメタンスルホンアミド，アミノおよび−ＮＲ¹³Ｒ ¹⁴ （Ｒ¹³およびＲ¹⁴は上で定義したとおりである）から選択される１またはそれ
以上の置換基である。

【００３８】 本明細書において用いる場合，"ヘテロアリール"基は，環内に窒素，酸素およ
びイオウからなる群より選択される１またはそれ以上の原子を含み，かつ，完全
に共役したパイ電子系を有する単環式または縮合環（すなわち，隣接する１対の
原子を共有する環）基を表す。ヘテロアリール基の例は，限定されるものではな
いが，ピロール，フラン，チオフェン，イミダゾール，オキサゾール，チアゾー
ル，ピラゾール，ピリジン，ピリミジン，キノリン，イソキノリン，プリンおよ
びカルバゾールである。ヘテロアリール基は，置換されていてもされていなくて
もよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，アルキル，シクロアルキ
ル，ハロ，トリハロメチル，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカ
プト，アルキルチオ，アリールチオ，シアノ，ニトロ，カルボニル，チオカルボ
ニル，スルホンアミド，カルボキシ，スルフィニル，スルホニル，Ｏ−カルバミ
ル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，Ｃ−アミド，
Ｎ−アミド，アミノおよび−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴（Ｒ¹³およびＲ¹⁴は，上で定義したとお
りである）から選択される１またはそれ以上の置換基である。

【００３９】 "ヘテロ脂環式"基は，環中に窒素，酸素およびイオウからなる群より選択され
る１またはそれ以上の原子を有する単環式または縮合環基を表す。環はまた，１
またはそれ以上の二重結合を有していてもよい。しかし，環は完全に共役したパ
イ電子系を有しない。ヘテロ脂環式環は，置換されていてもされていなくてもよ
い。置換されている場合，置換基は，好ましくは，アルキル，シクロアルキル，
ハロ，トリハロメチル，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカプト
，アルキルチオ，アリールチオ，シアノ，ニトロ，カルボニル，チオカルボニル
，カルボキシ，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チ
オ−カルバミル，スルフィニル，スルホニル，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，アミノ
および−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴（Ｒ¹³およびＲ¹⁴は上で定義したとおりである）から選択さ
れる１またはそれ以上の置換基である。

【００４０】 "ヒドロキシ"基は，−ＯＨ基を表す。

【００４１】 "アルコキシ"基は，本明細書において定義される−Ｏ−アルキルおよび−Ｏ−
シクロアルキル基の両方を表す。

【００４２】 "アリールオキシ"基は，本明細書において定義される−Ｏ−アリールおよび−
Ｏ−ヘテロアリール基の両方を表す。

【００４３】 "メルカプト"基は，−ＳＨ基を表す。

【００４４】 "アルキルチオ"基は，本明細書において定義されるＳ−アルキルおよび−Ｓ−
シクロアルキル基の両方を表す。

【００４５】 "アリールチオ"基は，本明細書において定義される−Ｓ−アリールおよび−Ｓ
−ヘテロアリール基の両方を表す。

【００４６】 "カルボニル"基は，−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ"基を表し，ここで，Ｒ"は，本明細書にお
いて定義される，水素，アルキル，シクロアルキル，アリール，ヘテロアリール
（環炭素を介して結合）およびヘテロ脂環式（環炭素を介して結合）からなる群
より選択される。

【００４７】 "アルデヒド"基は，Ｒ"が水素であるカルボニル基を表す。

【００４８】 "シクロケトン"は，環を形成する炭素原子の１つがそれに結合する"＝Ｏ"を有
している，すなわち，環炭素原子の１つが−Ｃ（＝Ｏ）−基であるシクロアルキ
ル基を表す。

【００４９】 "チオカルボニル"基は，−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ"基を表し，ここでＲ"は本明細書にお
いて定義されるとおりである。

【００５０】 "Ｏ−カルボキシ"基は，Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−基を表し，ここでＲ"は本明細書に
おいて定義されるとおりである。

【００５１】 "Ｃ−カルボキシ"基は，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"基を表し，ここでＲ"は本明細書に
おいて定義されるとおりである。

【００５２】 本明細書において用いられる場合，"エステル"とは，本明細書において定義さ
れるＣ−カルボキシ基であり，ここで，Ｒ"は水素以外の挙げられているいずれ
かの基である。

【００５３】 "Ｃ−カルボキシ塩"は，−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺基を表し，ここでＭ⁺は，リチウ
ム，ナトリウム，マグネシウム，カルシウム，カリウム，バリウム，鉄，亜鉛お
よび４級アンモニウムからなる群より選択される。

【００５４】 "アセチル"基は，−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ₃基を表す。

【００５５】 "カルボキシアルキル"基は，−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）ＯＲ"を表し，ここでｒ
は１−６であり，Ｒ"は上で定義したとおりである。

【００５６】 "カルボキシアルキル塩"は，−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺を表し，ここでＭ ⁺ はリチウム，ナトリウム，カリウム，カルシウム，マグネシウム，バリウム，
鉄，亜鉛および４級アンモニウムからなる群より選択される。

【００５７】 "カルボン酸"基は，Ｒ"が水素であるＣ−カルボキシ基を表す。

【００５８】 "ハロ"基は，フッ素，塩素，臭素またはヨウ素を表す。

【００５９】 "トリハロメチル"基は，−ＯＸ₃を表し，ここでＸは本明細書において定義さ
れるハロ基である。

【００６０】 "トリハロメタンスルホニル"基は，Ｘ₃ＣＳ（＝Ｏ）₂−を表し，ここでＸは上
で定義したとおりである。

【００６１】 "シアノ"基は，−Ｃ≡Ｎ基を表す。

【００６２】 "シアナト"基は，−ＣＮＯ基を表す。

【００６３】 "イソシアナト"基は，−ＮＣＯ基を表す。

【００６４】 "チオシアナト"基は，−ＣＮＳ基を表す。

【００６５】 "イソチオシアナト"基は，−ＮＣＳ基を表す。

【００６６】 "スルフィニル"基は，−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ"基を表し，ここでＲ"は本明細書におい
て定義されるとおりである。

【００６７】 "スルホニル"基は，−Ｓ（＝Ｏ）₂Ｒ"基を表し，ここでＲ"は本明細書におい
て定義されるとおりである。

【００６８】 "スルホンアミド"基は，−Ｓ（＝Ｏ）₂ＮＲ¹³Ｒ¹⁴基を表し，ここでＲ¹³およ
びＲ¹⁴は本明細書において定義されるとおりである。

【００６９】 "トリハロメタンスルホンアミド"基は，Ｘ₃ＣＳ（＝Ｏ）₂ＮＲ¹³−基を表し，
ここでＸおよびＲ¹³は本明細書において定義されるとおりである。

【００７０】 "Ｏ−カルバミル"基は，−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ¹³Ｒ¹⁴基を表し，ここでＲ¹³およ
びＲ¹⁴は本明細書において定義されるとおりである。

【００７１】 "Ｎ−カルバミル"基は，Ｒ¹⁴ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ¹³−基を表し，ここでＲ¹³およ
びＲ¹⁴は本明細書において定義されるとおりである。

【００７２】 "Ｏ−チオカルバミル"基は，−ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ¹³Ｒ¹⁴基を表し，ここでＲ¹³ およびＲ¹⁴は本明細書において定義されるとおりである。

【００７３】 "Ｎ−チオカルバミル"基は，Ｒ¹⁴ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ¹³−基を表し，ここでＲ¹³ およびＲ¹⁴は本明細書において定義されるとおりである。

【００７４】 "アミノ"基は，−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴基を表し，ここでＲ¹³およびＲ¹⁴は両方とも水素
である。

【００７５】 "Ｃ−アミド"基は，−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ¹³Ｒ¹⁴基を表し，ここでＲ¹³およびＲ¹⁴ は本明細書において定義されるとおりである。

【００７６】 "Ｎ−アミド"基は，Ｒ¹³Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ¹⁴−基を表し，ここでＲ¹³およびＲ¹⁴ は本明細書において定義されるとおりである。

【００７７】 "ニトロ"基は，−ＮＯ₂基を表す。

【００７８】 "４級アンモニウム"基は，−⁺ＮＲ¹³Ｒ¹⁴Ｒ¹⁵基を表し，ここでＲ¹³，Ｒ¹⁴お
よびＲ¹⁵は，水素および非置換低級アルキルからなる群より独立して選択される
。

【００７９】 "メチレンジオキシ"基は，−ＯＣＨ₂Ｏ−基を表し，ここで酸素原子は，隣接
する環炭素原子に結合している。

【００８０】 "エチレンジオキシ"基は，−ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−基を表し，ここで酸素原子は隣
接する環炭素原子に結合している。

【００８１】 本発明の別の観点は，一般化学構造：

【化６】 を有するオキシインドールを，一般化学構造：

【化７】 の１つを有するシクロケトンと反応させることにより形成される，少なくとも１
０個の化合物のコンビナトリアルライブラリである。式中，Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｆ
，Ｇ，Ｊ，Ｋ，Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³，Ｒ⁴，Ｒ⁵，Ｒ⁶，Ｒ⁷，Ｒ⁸，Ｒ⁹，Ｒ¹⁰，Ｒ¹¹お
よびＲ¹²は，本明細書において先に定義したとおりである。

【００８２】 "反応させる"とは，上述のオキシインドールの１つと上述のシクロケトンの１
つとを，それらが互いに相互作用して，それらの間に共有結合を形成する化学的
環境中に置くことを意味する。本発明の場合，共有結合は，最終的には，オキシ
インドールの３位の炭素原子からシクロケトンのケト炭素原子への二重結合であ
る。

【００８３】 "コンビナトリアルライブラリ"とは，多次元アレイの１つの次元の各化合物を
多次元アレイの他の次元の各化合物と反応させることにより形成されるすべての
化合物をを表す。本明細書において用いられる場合，多次元アレイは２次元であ
り，一方の次元は本発明の全オキシインドールであり，他方の次元は本発明の全
シクロケトンである。各オキシインドールを各シクロケトンと反応させて，２−
インドリノンを形成することができる。このようにして形成されるすべての２−
インドリノン化合物は，本発明の範囲内である。また，本発明のオキシインドー
ルのいくつかと本発明のすべてのシクロケトン，またはすべてのオキシインドー
ルとシクロケトンのいくつかと，またはオキシインドールのいくつかとシクロケ
トンのいくつかとを反応させることにより形成される，より小さいコンビナトリ
アルライブラリも，本発明の範囲内である。

【００８４】 コンビナトリアルライブラリを用いて本発明の化合物を所望の活性についてス
クリーニングすることができることも，本発明の別の観点である。

【００８５】 "所望の活性"とは，選択された蛋白質キナーゼの触媒活性を調節する能力を意
味する。

【００８６】 "スクリーニング"とは，化合物のコンビナトリアルライブラリの全体，または
その任意の一部を，１つまたはそれ以上の標的蛋白質キナーゼと接触させ，次に
その化合物が蛋白質キナーゼの触媒活性に及ぼす影響を観察することを意味する
。

【００８７】 本発明のさらに別の観点は，蛋白質キナーゼ活性，特にＲＴＫ，ＣＴＫまたは
ＳＴＫキナーゼ触媒活性を調節する化合物である。

【００８８】 好ましい構造的特徴 本発明の現在好ましい態様は， ｎが１であり； Ａ，Ｂ，ＤおよびＥが炭素であり； Ｒ¹が水素であり；そして Ｚが酸素である化合物である。

【００８９】 本発明のさらに別の現在好ましい態様は， ｎが１であり； Ａ，Ｂ，ＤおよびＥが炭素であり； Ｒ¹が水素であり； Ｚが酸素であり；そして Ｆ，Ｇ，ＪおよびＫが炭素である化合物である。

【００９０】 本発明のさらに別の現在好ましい態様は， ｎが０であり； Ａ，Ｂ，ＤおよびＥが炭素であり；そして Ｚが酸素である化合物である。

【００９１】 ｎが０であり； Ａ，Ｂ，ＤおよびＥが炭素であり； Ｚが酸素であり； Ｆが窒素であり； Ｒ⁹が水素であり；そして ＧおよびＫが炭素である化合物もまた，本発明の現在好ましい態様である。

【００９２】 また本発明の現在好ましい態様は， ｎが０であり； Ａ，Ｂ，ＤおよびＥが炭素であり； Ｚが酸素であり； Ｋが窒素であり； Ｒ⁶が水素であり；そして ＦおよびＧが炭素である化合物である。

【００９３】 本発明の現在好ましい別の態様は，Ｆ，Ｇ，ＪまたはＫの１つまたは２つが，
独立して窒素である化合物である。

【００９４】 ｎが１であり； Ａ，Ｂ，ＤおよびＥが炭素であり； Ｒ¹が水素であり； Ｚが酸素であり； Ｒ¹³が水素であり；そして Ｒ¹⁴が非置換低級アルキルであるものもまた同様に本発明の現在好ましい態様で
ある。

【００９５】 Ｒ²，Ｒ³，Ｒ⁴，Ｒ⁵，Ｒ⁶，Ｒ⁷，Ｒ⁸およびＲ⁹が， 水素； 非置換低級アルキル； ハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"または−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より選択される基で置
換されている低級アルキル； 非置換低級アルコキシ； ハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，非置換アリールまたは−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より
選択される基で置換されている低級アルコキシ； トリハロメチル； 非置換アルケニル； 非置換アルキニル； 非置換アリール； 非置換低級アルキル，およびハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"または−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴から
なる群より選択される基で置換されている低級アルキルからなる群より独立して
選択される１またはそれ以上の基で置換されているアリール； 非置換ヘテロ脂環式； 非置換低級アルキル，−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ，−Ｃ（＝Ｏ）−（非置換低級アルキル）
，ヒドロキシ，非置換アルコキシ，およびハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"および−Ｎ
Ｒ¹³Ｒ¹⁴からなる群より選択される基で置換されているアルコキシからなる群よ
り独立して選択される１またはそれ以上の基で置換されているヘテロ脂環式； 非置換アリールオキシ； 非置換低級アルキル，トリハロメチル，ハロ，ヒドロキシおよびアミノからなる
群より独立して選択される基で置換されているアリールオキシ； メルカプト； 非置換アルキルチオ； 非置換アリールチオ； ハロ，ヒドロキシおよびアミノからなる群より独立して選択される１またはそれ
以上の基で置換されているアリールチオ； Ｓ−スルホンアミド； −Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"； Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−； ヒドロキシ； シアノ； ニトロ； ハロ； Ｃ−アミド； Ｎ−アミド； アミノ；および −ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より独立して選択されるものもまた本発明の現在好まし
い態様である。

【００９６】 ｎが１であり； Ａ，Ｂ，ＤおよびＥが炭素であり； Ｒ¹が水素であり； Ｚが酸素であり； Ｒ²，Ｒ³，Ｒ⁴，Ｒ⁵，Ｒ⁶，Ｒ⁷，Ｒ⁸およびＲ⁹が， 水素； 非置換低級アルキル； ハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"および−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より選択される基で置
換されている低級アルキル； 非置換低級アルコキシ； ハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，非置換アリールまたは−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より
選択される基で置換されている低級アルコキシ； トリハロメチル； 非置換アルケニル； 非置換アルキニル； 非置換アリール； 非置換低級アルキル，およびハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"および−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴から
なる群より選択される基で置換されている低級アルキルからなる群より独立して
選択される１またはそれ以上の基で置換されているアリール； 非置換ヘテロ脂環式； 非置換低級アルキル，−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ，−Ｃ（＝Ｏ）−（非置換低級アルキル）
，ヒドロキシ，非置換アルコキシ，およびハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"および−Ｎ
Ｒ¹³Ｒ¹⁴からなる群より選択される基で置換されているアルコキシからなる群よ
り独立して選択される１またはそれ以上の基で置換されているヘテロ脂環式； 非置換アリールオキシ； 非置換低級アルキル，トリハロメチル，ハロ，ヒドロキシおよびアミノからなる
群より独立して選択される１またはそれ以上の基で置換されているアリールオキ
シ； メルカプト； 非置換アルキルチオ； 非置換アリールチオ； ハロ，ヒドロキシおよびアミノからなる群より独立して選択される１またはそれ
以上の基で置換されているアリールチオ； Ｓ−スルホンアミド； −Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"； Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−； ヒドロキシ； シアノ； ニトロ； ハロ； Ｃ−アミド； Ｎ−アミド； アミノ；および −ＮＲ¹³Ｒ¹⁴（ここで，Ｒ¹³は水素であり，Ｒ¹⁴は非置換低級アルキルである）
からなる群より独立して選択される化合物も，本発明の別の現在好ましい態様で
ある。

【００９７】 本発明のさらに別の現在好ましい態様は，Ｒ¹⁰，Ｒ¹¹およびＲ¹²が，水素，非
置換低級アルキル，−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）ＯＲ"，−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）Ｏ^- Ｍ⁺ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−，−Ｃ（＝Ｏ））ＯＲ"
，−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺，アミノ，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，ニトロおよび−ＮＲ ¹³ Ｒ¹⁴からなる群より独立して選択される化合物である。

【００９８】 ｎが１であり； Ａ，Ｂ，ＤおよびＥが炭素であり； Ｒ¹が水素であり； Ｚが酸素であり； Ｒ¹³が水素であり； Ｒ¹⁴が非置換低級アルキルであり；そして Ｒ¹⁰，Ｒ¹¹およびＲ¹²が，水素，非置換低級アルキル，−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）
ＯＲ"，−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，Ｒ"Ｃ
（＝Ｏ）Ｏ−，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺，アミノ，Ｃ−アミド
，Ｎ−アミド，ニトロおよび−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より独立して選択される化
合物もまた，本発明の現在好ましい態様である。

【００９９】 Ｒ¹⁰，Ｒ¹¹またはＲ¹²の少なくとも１つが，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，−Ｃ（＝Ｏ
）Ｏ^-Ｍ⁺，−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）ＯＲ"および−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺
からなる群より選択される，直前の段落における構造的特徴を有する化合物は，
本発明の現在好ましい態様である。

【０１００】 直前の段落に記載された構造的特徴を有する化合物において，−（ＣＨ₂）_rＣ
（＝Ｏ）ＯＲ"または−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺基のｒが１または２である
こともまた，本発明の現在好ましい態様である。

【０１０１】 本発明の代表的な化合物は表１に記載される。示される化合物は，例示のため
にのみ表され，いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものと解釈すべ
きではない。

【０１０２】２．表の簡単な説明 １．表１は，本発明の例示的化合物の化学構造を示す。化合物番号は，以下の実
施例の節における化合物番号に対応している。すなわち，表１の化合物１の合成
は，実施例の節の実施例１に記載される。これらの化合物は，例示のためにのみ
示され，いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでは
ない。

【０１０３】 ２．表２は，本発明の例示的化合物の生物学的アッセイの結果を示す。上述と同
様に，表２の化合物番号は，表１の化合物番号と対応している。用いたバイオア
ッセイは以下に詳細に記載される。結果はＩＣ₅₀，すなわち，本発明の化合物が
存在しない対照におけるＰＴＫの活性と比較して，標的とするＰＴＫの活性の５
０％の変化を与える試験化合物のマイクロモル（μＭ）濃度で表される。詳細に
は，示される結果は，本発明の化合物の非存在下で観察される標的ＰＴＫの活性
の５０％の阻害を与えるのに必要な試験化合物の濃度を表す。

【０１０４】 ３．表３は，以下に記載される動物異種移植片モデルにおいてＡ３７５ｓｃ細胞
株を用いたインビボ試験の結果を示す。化合物１３は，表１に示される化学構造
を有する。

【０１０５】

【表１】

【０１０６】

【表２】

【０１０７】３． 生化学 本発明のもう一つの特徴は，ＰＫの触媒活性を調節するための方法であって，
ＰＫを，本発明の化合物または生理学的に許容されるその塩またはプロドラッグ
と接触させることによる方法に関する。

【０１０８】 本発明の別の態様は，ＰＫの活性を調節する化合物を同定する方法である。該
方法は，目的とするＰＫを有する細胞を化合物と接触させ，化合物が細胞に及ぼ
す影響をモニターすることからなる。

【０１０９】 "ＰＫ"とは，ＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫを意味する。すなわち，ＲＴＫ，Ｃ
ＴＫおよびＳＴＫにより触媒されるシグナリングプロセスの調節が，本発明によ
り企図される。

【０１１０】 "方法"という用語は，所与の作業を遂行するための様式，手段，技術，および
手順を指し，化学，薬剤学，生物学，生化学，および医学的技術の従業者には周
知の，あるいは既に該従業者によって既知の様式，手段，技術，および手順から
開発された様式，手段，技術，および手順を含むがこれに限定されない。

【０１１１】 本明細書に用いられる場合，"調節"または"調節すること"という用語は，ＲＴ
Ｋ，ＣＴＫ，およびＳＴＫの触媒活性の変更を指す。特に，調節することは，Ｒ
ＴＫ，ＣＴＫ，およびＳＴＫの触媒活性の活性化を指し，好ましくは， ＲＴＫ
，ＣＴＫ，およびＳＴＫに暴露される化合物または塩の濃度に依存したＲＴＫ，
ＣＴＫ，およびＳＴＫの触媒活性の活性化または阻害を指し，さらに好ましくは
， ＲＴＫ，ＣＴＫ，およびＳＴＫの触媒活性の阻害を指す。

【０１１２】 本明細書に用いられている"触媒活性"という用語は，ＲＴＫおよび／またはＣ
ＴＫの直接または間接的な影響下でのチロシンのリン酸化か，またはＳＴＫの直
接または間接的な影響下でのセリンおよびトレオニンのリン酸化の速度を指す。

【０１１３】 本明細書に用いられている"接触させること"という用語は，本発明の化合物と
標的ＰＫとを，当該化合物がＰＫの触媒活性を直接に，すなわちキナーゼ自体と
相互作用することによるか，または間接に，すなわち当該キナーゼの触媒活性が
依存している別の分子と相互作用することにより，影響することが可能な様式で
一緒に合わせることを指す。かかる"接触させること"は，試験管，ペトリ皿，ま
たは同様のものにおいて行なわれることが可能である。試験管内では，接触させ
ることは，化合物と目的とするＰＫのみが関与してよく，あるいは全細胞が関与
してもよい。また細胞は培養皿内にて維持または成育され，その環境において化
合物と接触してよい。このような状況においては，特定の化合物がＰＫ関連障害
に影響を及ぼす能力，すなわち当該化合物のＩＣ₅₀（以下に定義される）を，よ
り複雑な生体を用いてのインビボでの使用が試みられる以前に，測定することが
可能である。生体の外の細胞については，ＰＫを当該化合物と接触させるための
多様な方法が存在し，かつ当業者には周知であり，直接の細胞微小注射法および
多数の膜貫通担体法を含むがこれに限定されない。

【０１１４】 "監視すること"または"観察すること"は，化合物を特定のプロテインキナーゼ
ＰＫを発現している細胞と接触させることの影響を，観察または検出することを
意味する。観察または検出された効果は，細胞の表現型における変化か，ＰＫの
触媒活性においてか，あるいはＰＫと天然の結合相手との相互作用における変化
であることが可能である。

【０１１５】 "細胞表現型"は，細胞または組織の外面上の様相か，または当該細胞または組
織の生物学的機能を指す。細胞の表現型の例は，これに限定されないが，細胞の
大きさ，細胞成長，細胞分化，細胞増殖，細胞寿命，アポトーシス，および栄養
摂取と使用である。かかる表現型の特徴はこの技術において周知の技術による計
測が可能である。

【０１１６】 "天然の結合相手"は，細胞において特定のＰＫに結合するポリペプチドを指す
。天然の結合相手は，ＰＫを介するシグナル伝達過程において，シグナルの伝播
に役割を果たすことができる。天然の結合相手とＰＫとの相互作用における変化
は，ＰＫ／天然の結合相手の複合体の濃度の増加または減少となって現われ，そ
の結果として，ＰＫがシグナルを伝達する能力に，検出可能な変化が生じる。

【０１１７】 ＲＴＫを介するシグナル伝達は，特異的な成長因子（リガンド）との細胞外の
相互作用に始まり，レセプターの２量体化，内在蛋白質チロシンキナーゼ活性の
一過性の刺激，およびリン酸化がそれに続く。それにより細胞内シグナル伝達分
子のための結合部位が造られ，適切な細胞の応答（たとえば細胞分裂，細胞外の
微小環境に対する代謝効果，その他）を容易にするある範囲の細胞質シグナル分
子との複合体形成に導かれる。Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9 : 303
- 391参照。

【０１１８】 成長因子レセプター上のチロシンリン酸化部位は，シグナリング分子のＳＨ２
（Ｓｒｃホモロジー）ドメインのための高親和性結合部位として機能することが
示されている。Fantlら，1992, Cell 69: 413 - 423，Songyangら，1994, Mol.
Cell. Biol. 14 : 2777 - 2785）， Songyangら，1993, Cell 72 :767 - 778）
，およびKoch ら，1991, Science 252 : 668 - 678。ＲＴＫと結合するいくつか
の細胞内基質蛋白質が同定されている。それらは二つの主要なグループに分けら
れる：（１）触媒ドメインを有する基質，および（２）かかるドメインを欠くが
，アダプターとして役立ち，触媒活性のある分子と結合する。Songyangら，1993
, Cell 72 : 767 - 778。レセプターとその基質のＳＨ２ドメインとの間の相互
作用の特異性は，リン酸化されたチロシン残基を直接取囲んでいるアミノ酸残基
によって決められる。ＳＨ２ドメインと，特定のレセプターのホスホチロシン残
基を取囲んでいるアミノ酸配列との間の結合親和性の差異は，それらの基質リン
酸化のプロフィールに見られる差異と一致している。Songyangら，1993, Cell 7
2 : 767 - 778。これらの観察は，各々のＲＴＫの機能が，その発現パターンな
らびにリガンド利用可能性によるだけでなく，特定のレセプターによって活性化
される下流のシグナル伝達経路によっても決定されることを示唆している。した
がって，リン酸化は特異的な成長因子レセプター，ならびに分化因子レセプター
によって活性化される，シグナリング経路の選択性を決定する重要な段階を提供
する。

【０１１９】 ＳＴＫは，本来細胞質ゾル性であり，しばしばＰＴＫ事象についてのダウン方
向の応答として，細胞内部の生化学に影響を及ぼす。ＳＴＫは，細胞増殖に導く
ＤＮＡ合成とそれに続く細胞分裂とを開始する，シグナリング過程に関係してい
る。

【０１２０】 したがって，ＰＫシグナル伝達は，数ある他の応答の中で特に，細胞増殖，分
化，成長，および代謝をもたらす。異常な細胞増殖は，癌腫，肉腫，グリア芽細
胞腫，および血管腫等の新生物，白血病，乾癬，動脈硬化症，関節炎，および糖
尿病性網膜炎，および制御されない血管新生（angiogenesis）および／または血
管形成（vasclogenesis）に関連する他の疾患を含む，広い範囲の障害および疾
患という結果をもたらしうる。

【０１２１】 本発明の化合物がＰＫを阻害する機構につての正確な理解は，本発明の実施の
ためには必要ではない。しかしながら，このことでいかなる特定の機構または定
理にも縛られるものではないが，当該化合物はＰＫの触媒領域のアミノ酸と相互
作用すると考えられている。ＰＫは典型的には２葉構造を有しており，ＡＴＰは
，ＰＫの中でアミノ酸が保存されている領域内の，２つの葉の間の裂け目に結合
するように見える。ＰＫの阻害剤は，前記のＡＴＰがＰＫに結合するのと同じ普
遍領域において，水素結合，ファン‐デル‐ワールス力，およびイオン相互作用
等の非共有結合によって結合すると信じられている。さらに具体的には，本発明
の化合物の２−インドリノン成分が，正常にはＡＴＰのアデニン環によって占め
られる普遍区域に結合すると考えられている。このように，ある特定の分子の特
定のＰＫに対する特異性は，２−インドリノンコアについての種々の置換基と，
特定のＰＫに特異的なアミノ酸ドメインとの間の，付加的な相互作用の結果とし
て生じてよい。したがって，異なるインドリノン置換基は，特定のＰＫに対する
優先的な結合に貢献してよい。異なるＡＴＰ（または他のヌクレオチド）結合部
位において活性のある化合物を選択する能力は，本発明の化合物を，かかる部位
を用いる蛋白質，すなわち，ＰＫのみならず蛋白質ホスファターゼのターゲッテ
ィングにとって有用なものにする。したがって本明細書において開示される化合
物は，かかる蛋白質についてのインビトロでのアッセイ用としての有用性をもつ
と同時に，かかる蛋白質との相互作用を通じてインビボでの治療効果を示すもの
であってよい。

【０１２２】 もう一つの特徴においては，その触媒活性が本発明の化合物との接触によって
調節されるプロテインキナーゼは，蛋白質チロシンキナーゼであり，さらに詳し
くはレセプター蛋白質チロシンキナーゼである。レセプター蛋白質チロシンキナ
ーゼの中でも，本発明の化合物またはその塩によりその触媒活性が調節されるレ
セプター蛋白質チロシンキナーゼは，これに限定されないが，ＥＧＦ，ＨＥＲ２
，ＨＥＲ３，ＨＥＲ４，ＩＲ，ＩＧＦ−１Ｒ，ＩＲＲ，ＰＤＧＦＲα，ＰＤＧＦ
Ｒβ，ＣＤＦＩＲ，Ｃ−Ｋｉｔ，Ｃ−ｆｍｓ，Ｆｌｋ−１Ｒ，Ｆｌｋ４，ＫＤＲ
／Ｆｌｋ−１，Ｆｌｔ−１，ＦＧＦＲ−１Ｒ，ＦＧＦＲ−２Ｒ，ＦＧＦＲ−３Ｒ
，およびＦＧＦＲ−４Ｒである。

【０１２３】 本発明の化合物，またはその塩あるいはプロドラッグとの接触により，その触
媒活性が調節される蛋白質チロシンキナーゼは，非レセプターまたは細胞性蛋白
質チロシンキナーゼ（ＣＴＫ）であってもよい。したがって，Ｓｒｃ，Ｆｒｋ，
Ｂｔｋ，Ｃｓｋ，Ａｂｌ，ＺＡＰ７０，Ｆｅｓ，Ｆｐｓ，Ｆａｋ，Ｊａｋ，Ａｃ
ｋ，Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，Ｂｌｋ，Ｈｃｋ，Ｆｇｒ， およびＹｒ
ｋ等の，これに限定されないＣＴＫの触媒活性は，本発明の化合物または塩との
接触により調節されることができる。

【０１２４】 本発明の化合物との接触によってその触媒活性が調節されることができるまた
別のＰＫ群は，ＣＤＫ２およびＲａｆ等の（これに限定されない）セリン−トレ
オニンプロテインキナーゼである。

【０１２５】 もう一つの特徴においては，本発明は治療上有効な量の本発明の化合物か，ま
たはその塩またはプロドラッグを生物に投与することにより，ＰＫ関連障害を治
療または予防するための方法に関する。

【０１２６】 もう一つの特徴においては，本発明は治療上有効な量の，本発明の化合物かま
たはその塩またはプロドラッグの医薬組成物を生物に投与することにより，ＰＫ
関連障害を治療または予防するための方法に関する。

【０１２７】 本明細書に用いられる場合，"ＰＫ関連障害"，"ＰＫ攻撃疾患"，および"異常
なＰＫ活性"はすべて不適切な，すなわち不完全な，あるいはより一般的には過
剰な，ＰＫ触媒活性によって特徴づけられる状態を指し，当該特定のＰＫはＲＴ
Ｋ，ＣＴＫ，またはＳＴＫであることが可能である。不適切な触媒活性は；（１
）正常にはＰＫを発現しない細胞におけるＰＫの発現，（２） 望ましくない細
胞増殖，分化および／または成長に導くＰＫ発現の亢進，または（３）細胞増殖
，分化および／または成長の望ましくない減少に導くＰＫ発現の減少，のいずれ
かの結果として生じることが可能である。ＰＫの過剰な活性は，特定のＰＫをコ
ード化している遺伝子の増幅か，または細胞増殖，分化および／または成長と相
互に関係することが可能なあるレベルのＰＫ活性の産生を指す（すなわち，ＰＫ
のレベルが亢進されると，細胞性障害による一つまたはそれより多い症状の激し
さが増す）。不完全な活性は，もちろんその逆であり，ＰＫのレベルが低下する
と，一つまたはそれより多い細胞性障害による症状の激しさが増加する。

【０１２８】 本明細書に用いられる場合，"予防する"，"予防すること"，および"予防"とい
う用語は，生物がＰＫにより媒介される細胞性疾患を最初の場所で獲得すること
を妨げるための方法を指す。

【０１２９】 本明細書に用いられる場合"治療する"，"治療すること"，および"治療"という
用語は，ＰＫを介する細胞性障害および／またはそれに付随する症状を緩和また
は除去するための方法を指す。特に癌に関しては，これらの用語は単に，癌によ
って影響を受けた生物の余命が増すこと，あるいは当該疾患の一つまたはそれよ
り多い症状が減少することを意味する。

【０１３０】 "生物"という用語は，少なくとも一つの細胞を含む生きている実存物を指す。
生きている生物は，たとえばただ一つの真核細胞のように単純であるか，または
ヒトを含めた哺乳類のように複雑であることが可能である。

【０１３１】 本明細書に用いられているような"治療上有効な量"という用語は，治療される
障害の一つまたはそれより多い症状をある程度までやわらげることとなる，投与
される化合物の量を指す。癌の治療に関しては，治療上有効な量は，（１）腫瘍
の大きさを減じる，（２）腫瘍の転移を阻害する（すなわち速度をある程度まで
減じること，好ましくは停止すること），（３）腫瘍の成長をある程度阻害する
（すなわち速度をある程度まで減じる，好ましくは停止する），および／または
（４）癌に関連した一つまたはそれより多い症状をある程度までやわらげる（ま
たは，好ましくは除去する）という効果を有する量を指す。

【０１３２】 したがって本発明は，ＲＴＫ，ＣＴＫ，および／またはＳＴＫの酵素活性に影
響を及ぼし，それによりかかる蛋白質によって伝達されるシグナルを妨害するこ
とにより，ＰＫのシグナル伝達を調節する化合物に向けられたものである。さら
に詳細には，本発明は癌腫，カポジ肉腫を含む肉腫，赤芽細胞腫，グリア芽細胞
腫，髄膜腫，星状細胞腫，黒色腫，および筋芽細胞腫を含むがこれに限定されな
い多くの種類の充実性腫瘍の治癒に向けての治療用アプローチとしての，ＲＴＫ
，ＣＴＫ，および／またはＳＴＫを介するシグナル伝達経路を調節する化合物に
向けられたものである。白血病等の非充実性腫瘍癌の治療または予防もまた本発
明により期待される。適用には，脳の癌，膀胱癌，卵巣癌，胃癌，膵臓癌，結腸
癌，血液の癌，肺癌，および骨の癌が含まれてよいが，これに限定されない。

【０１３３】 本明細書に述べた化合物がその予防，治療，および研究に有用であるかもしれ
ない，制御されないＰＫ活性に関連した障害の型の，限定されないさらなる実例
は，細胞増殖性障害，線維性の障害，および代謝性障害である。

【０１３４】 本発明により予防，治療，またはさらに研究されることができる細胞増殖性障
害は，癌，血管増殖性障害，およびメサンギウム細胞増殖性障害を含む。

【０１３５】 血管増殖性障害は，異常な血管形成（血管の形成）および血管新生（血管の拡
散）を指す。血管形成および血管新生は胚発生，黄体形成，損傷治癒，および臓
器再生等の種々の正常な生理学的過程において重要な役割を果たすが，それらは
また腫瘍を生かしておくために必要な新しい毛細血管を形成する結果となる癌の
発生においても中枢的な役割を演じる。血管増殖障害の他の例は，新しい毛細血
管が関節に侵入して軟骨を破壊する関節炎，および糖尿病性網膜炎のように，網
膜内の新しい毛細血管が硝子体に侵入し，出血させ，さらに失明を引起す眼性疾
患を含む。

【０１３６】 逆に，再狭窄などの，血管の収縮，狭窄，または閉鎖に関連した障害もまた，
本発明の方法により治療または予防することができる。

【０１３７】 線維性障害は細胞外マトリックスの異常な形成を表す。線維性障害の例は，肝
硬変およびメサンギウム細胞増殖障害を含む。肝硬変は，肝性瘢痕の形成を生じ
る結果となる細胞外マトリックス成分の増加によって特徴づけられる。肝性瘢痕
を生じる結果となる亢進された細胞外マトリックスは，肝炎等のウイルス感染に
よっても引起こされることが可能である。脂肪細胞は，肝硬変において重要な役
割を果たすらしい。他の線維性障害はアテローム性動脈硬化症である。

【０１３８】 メサンギウム細胞の増殖性障害は，メサンギウム細胞の異常増殖によってもた
らされる障害を指す。メサンギウム増殖障害は，糸球体腎炎，糖尿病性腎症，お
よび悪性腎硬化症等のヒトの腎疾患，ならびに血栓性細小血管症症候群，移植拒
絶反応，および糸球体症といった障害を含む。ＰＤＧＦＲはメサンギウム細胞の
増殖の維持に関与することが示唆されている。Floegeら，1993, Kidney Interna
tional 43 : 47s - 54s。

【０１３９】 先に記したように，ＰＫは細胞増殖性障害に関係づけられてきた。したがって
，たとえばＲＴＫファミリーのメンバーが癌の発生と関連づけられてきたことも
意外なことではない。ＥＧＦＲ（Tuziら，1991, Br. J. Cancer 63 : 227 - 233
，Torpら，1992, APMIS 100 : 713 - 719），ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Slamonら，198
9, Science 244 : 707 - 712），およびＰＤＧＦ−Ｒ（Kumabeら，1992, Oncoge
ne, 7 : 627 -633）等のこれらのレセプターのいくつかは多くの腫瘍において過
剰発現され，および／またはオートクリンループにより持続的に活性化される。
事実，ほとんどの一般的かつ重い癌においては，これらのレセプターの過剰発現
（Akbasak & Suner-Akbasakら，1992, J. Neurol. Sci., 111 : 119 - 133, Dic
ksonら，1992, Cancer Treatment Res. 61 : 249 - 273, Korcら，1992, J. Cli
n. Invest. 90 1352 - 1360），およびオートクリーンループ（Lee & Donoghue,
1992, J. Cell. Biol., 118 : 1057 - 1070, Korcら，前出，Akbasak & Suner-
Akbasakら，前出）が証明されている。たとえば，ＥＧＦＲは扁平上皮癌，星状
細胞腫，グリア芽細胞腫，頭頚部癌，肺癌，および膀胱癌と関連づけられている
。ＨＥＲ２は乳房，卵巣，胃，肺，膵臓，および膀胱の癌と結びつけられている
。ＰＤＧＦＲはグリア芽細胞腫および黒色腫，ならびに肺，卵巣，および前立腺
の癌と関連づけられている。ＲＴＫ ｃ−ｍｅｔもまた悪性の腫瘍形成と関連づ
けられている。たとえば，ｃ−ｍｅｔは他の癌の中でも，結腸直腸，甲状腺，膵
臓，胃，および肝細胞の癌腫およびリンパ腫と関連づけられている。加えてｃ−
ｍｅｔは白血病に結びつけられている。ｃ−ｍｅｔ遺伝子の過剰発現はまたホジ
キン病およびバーキット病の患者に検出されている。

【０１４０】 Ｆｌｋ／ＫＤＲも同様に，広いスペクトルの腫瘍と関連づけられてきており，
これらには，限定されないが，乳癌，卵巣癌，肺腫瘍，ならびに神経膠芽細胞種
等の神経膠腫が含まれる。

【０１４１】 ＩＧＦ−ＩＲは，栄養上の支持およびI I型糖尿病に関係づけられていること
に加えて，いくつかの型の癌に関係づけられている。たとえば，ＩＧＦ−Ｉはい
くつかの型の腫瘍，たとえばヒト乳癌の癌細胞（Arteagaら，1989, J. Clin. In
vest. 84 : 1418 - 1423），および肺腫瘍小細胞（Macauleyら，1990, Cancer R
es., 50 : 2511 - 2517）に対するオートクリン成長刺激因子として関係づけら
れている。さらに，ＩＧＦ−Ｉは神経系の正常な成長および分化に完全に深くか
かわっていると共に，ヒトの神経膠腫のオートクリン刺激因子でもあるように見
える。Sandberg-Nordqvistら，1993, Cancer Res. 53 : 2475 - 2478。細胞増殖
におけるＩＧＦ−ＩＲとそのリガンドの重要性は，培養されている多くの細胞型
（線維芽細胞，上皮細胞，平滑筋細胞，Ｔリンパ球，骨髄性細胞，軟骨細胞，お
よび骨芽細胞（骨髄の幹細胞）がＩＧＦ−Ｉによって成長するべく刺激されると
いう事実によってさらに支持される。Goldring & Goldring, 1991, Eukaryotic
Gene Expression, 1 : 301 - 326。最近の一連の発表においてBasergaは，ＩＧ
Ｆ−ＩＲが形質転換の機構において中心的な役割を果たしていること，またそれ
自体がヒトの広範囲の悪性腫瘍に対する治療的介入のための好ましい標的となり
得ることを示唆している。Baseerga，1995, Cancer Res., 55 : 249 - 252, Ba
serga, 1994, Cell 79 : 927 - 939, Coppolaら，1994, Mol. Cell. Biol., 14
: 4588 - 4595。

【０１４２】 ＳＴＫは，特に乳癌を含む多くの型の癌に関係づけられている（Caneら，Int.
J. Cancer, 54 : 571 -77（1993））。

【０１４３】 異常なＰＫ活性と疾患との間の結びつきは癌に限らない。たとえば，ＲＴＫは
乾癬，真性糖尿病，子宮内膜症，血管新生，アテローム斑の発生，アルツハイマ
ー病，表皮の過剰増殖，神経変性疾患，年齢に関連した黄斑部変性，および血管
腫といった疾患と関連づけられている。たとえば，ＥＧＦＲは角膜および皮膚の
損傷治癒と関連づけられている。インスリン−ＲおよびＩＧＦ−Ｒの欠陥はI I
型の真性糖尿病において示される。特異的なＲＴＫとそれらの治療上の指標との
間のさらに完全な相関関係は，Plowmanら，1994, DN&P 7 : 334 - 339において
明らかにされている。

【０１４４】 先に記したように，ＲＴＫのみならず，ｓｒｃ，ａｂｌ，ｆｐｓ，ｙｅｓ，ｆ
ｙｎ，ｌｙｎ，ｌｃｋ，ｂｌｋ，ｈｃｋ，ｆｇｒ，およびｙｒｋを含むがこれに
限定されないＣＴＫ（Bolenらによる総説，1992, FASEB J., 6 : 3403 - 3409）
も，増殖および代謝のシグナル伝達経路に深くかかわっており，したがって本発
明が向けられている多くのＰＴＫを介する障害に深くかかわっていることが予想
でき，かつ示されてきた。たとえば突然変異したｓｒｃ（ｖ−ｓｒｃ）は，腫瘍
性蛋白質（ｐｐ６０^v-src）であることがニワトリにおいて示されている。さら
に，その細胞性同等物であるプロト癌遺伝子ｐｐ６０^c-srcは，多くのレセプタ
ーの発癌シグナルを伝達する。腫瘍におけるＥＧＦＲまたはＨＥＲ２／ｎｅｕの
過剰発現は悪性細胞に特徴的であるが正常細胞にはない，ｐｐ６０^c-srcの構造
的活性化に導く。一方，ｃ−ｓｒｃの発現を欠如しているマウスは大理石骨病の
表現形を示し，破骨細胞機能におけるｃ−ｓｒｃの重要な関与と，関連する障害
における可能な関与とを暗示している。

【０１４５】 同様に，Ｚａｐ７０は自己免疫疾患に関与することが示唆されているＴ細胞シ
グナリングに関係づけられてきた。

【０１４６】 ＳＴＫは，炎症，自己免疫疾患，免疫応答，および，再狭窄，線維症， 乾癬
，変形性関節炎，およびリウマチ様関節炎といった過剰増殖障害と結びつけられ
てきた。

【０１４７】 ＰＫはまた着床にも関連づけられてきた。したがって本発明の化合物は，かか
る着床を防ぐ有効な方法を提供し，それにより受胎調節用薬剤として有用であり
うる。

【０１４８】 最後に，ＲＴＫおよびＣＴＫの双方は過免疫障害に深くかかわっていると一般
に考えられている。

【０１４９】 すなわち，治療的有効量の本発明の化合物を生物に投与することにより，蛋白
質キナーゼに関連する癌，例えば，限定されるものではないが，扁平上皮癌，星
状細胞腫，カポジ肉腫，神経膠芽細胞腫，肺癌，膀胱癌，頭頚部癌，黒色種，卵
巣癌，前立腺癌，乳癌，小細胞肺癌，神経膠腫，直腸結腸癌，尿生殖器癌および
胃腸癌を治療または予防しうることは，本発明の１つの観点である。

【０１５０】 本発明のさらに別の観点においては，治療的有効量の本発明の化合物を生物に
投与することにより，癌以外の蛋白質キナーゼ関連疾患，例えば，限定されるも
のではないが，糖尿病，自己免疫疾患，免疫疾患，過増殖性疾患，再狭窄，繊維
症，乾癬，フォン・ヒッペル−リンダウ症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，
新脈管形成，炎症性疾患および心血管疾病を治療または予防することができる。

【０１５１】 表２および３は，上述のＲＴＫのいくつかに対する本発明の代表的な化合物の
活性を示す。示される化合物，示される活性のレベル，および影響される特定の
ＲＴＫのいずれも，いかなる意味においても，本発明を限定するものと解釈すべ
きではない。

【０１５２】

【表３】

【０１５３】

【表４】

【０１５４】４． 医薬組成物および治療用途 本発明の化合物，そのプロドラッグ，または当該化合物とそのプロドラッグの
いずれかの生理学的に許容される塩は，そのままヒトの患者に投与するか，また
は前述の材料が適当な担体または賦形剤と混合された医薬組成物中で投与するこ
とが可能である。薬物の製剤および投与の技術は，"Remington's Pharmcologica
l Sciences"，マック出版社（Mack Publishing Co），ペンシルベニア州，イー
ストン，の最新版に見られるだろう。

【０１５５】投与経路 本明細書において用いられる場合，"投与する"または"投与"は，本発明の化合
物，塩，またはプロドラッグを，あるいは本発明の化合物，塩，またはプロドラ
ッグを含んでいる薬剤学的組成物を，ＰＫ関連障害の予防または治療を目的とし
て生物に送達することに関する。

【０１５６】 適当な投与経路は，これに限定されないが，経口，直腸，経粘膜，または腸管
投与か，あるいは筋肉内，皮下，骨髄内，髄内，直接心室内，静脈内，硝子体内
，腹腔内，鼻腔内，または眼内の注射を含む。

【０１５７】 別法として，全身性の方法ではなく局所に，たとえば当該化合物を充実性腫瘍
内へ直接に，しばしばデポ剤または持効性の製剤において，注射することにより
投与してもよい。

【０１５８】 さらに，当該薬物はターゲティングされたドラッグデリバリーシステムにおい
て，たとえば腫瘍に特異的な抗体によりコートされたリポソームにおいて投与さ
れてもよい。リポソームは当該腫瘍にターゲティングされ，取り込まれることと
なる。

【０１５９】組成物／製剤 本発明の薬剤学的組成物は，この技術に周知の工程，たとえば通常の混合，溶
解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封入，捕捉，または凍結乾燥の工
程により製造されてよい。

【０１６０】 本発明にしたがって使用するための薬剤学的組成物は，活性成分の薬剤学的に
使用可能な製品への加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む，一つまたはそ
れより多い生理学的に許容される担体を用いる通常の方法で製剤されてよい。適
切な製剤は，選ばれた投与経路に依存する。

【０１６１】 注射用には，本発明の化合物は水溶性溶液，好ましくはハンクス溶液，リンガ
ー溶液，または生理的塩類緩衝液等の生理学的に適した緩衝液において製剤され
てよい。

【０１６２】 経粘膜投与用には，浸透されるべき障壁に適した浸透剤が製剤に用いられる。
かかる浸透剤はこの技術において一般に周知である。

【０１６３】 経口投与用には，活性成分を，この技術において周知の薬剤学的に許容される
担体と組合せて製剤することができる。かかる担体は，本発明の化合物を，患者
による経口摂取のための錠剤，丸剤，トローチ，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル
，シロップ，スラリー，懸濁液，その他として製剤されるようにする。経口使用
のための薬剤学的製品は，固形の賦形剤を用い，結果として得られた混合物を任
意に破砕し，所望であればさらに他の適当な補助剤を添加した後に，顆粒混合物
を加工して錠剤または糖衣剤のコアを得る。有用な賦形剤は，特に，ラクトース
，ショ糖，マンニトール，またはソルビトールを含む糖類，たとえばトウモロコ
シデンプン，小麦デンプン，米デンプン，およびジャガイモデンプン等のセルロ
ース製品，およびゼラチン，トラガカントゴム，メチルセルロース，ヒドロキシ
プロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム，および／
またはポリビニルピロリドン（ｐｖｐ）等の他の材料，といった増量剤である。
もし所望であれば，架橋されたポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギニン
酸等の崩壊剤が添加されてもよい。またアルギン酸ナトリウム等の塩も使用され
てよい。

【０１６４】 糖衣剤のコアは，適当なコーティングを供給される。この目的のためには，濃
縮された糖溶液が用いられてよいが，それはアラビアゴム，タルク，ポリビニル
ピロリドン，カルボポルゲル（carbopol gel），ポリエチレングリコール，およ
び／または２酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合
物を任意に含んでよい。識別のため，あるいは活性成分の線量の異なる組合せを
特徴づけるため，染料または色素が錠剤または糖衣剤コーティングに添加されて
よい。

【０１６５】 経口的に用いられることが可能な薬剤学的組成物は，ゼラチンでできたプッシ
ュフィット（push-fit）カプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロールやソル
ビトールといった可塑剤から成るソフトな密封カプセルを含む。プッシュフィッ
トカプセルは，活性成分を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，およ
び／またはタルクやステアリン酸マグネシウムといった潤滑剤，さらに任意に安
定剤と混合して含むことができる。ソフトカプセルにおいては，活性成分は脂肪
油，流動パラフィン，または液体ポリエチレングリコール等の適当な液体中に溶
解または懸濁されてよい。安定剤もこれらの製剤に添加されてよい。

【０１６６】 吸入による投与用には，本発明に従って用いられる化合物は，加圧されたパッ
クまたはネブライザーと，噴射剤，たとえばこれに限定されないが，ジクロロジ
フルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオロエタン，
または二酸化炭素とを用いたエアーゾルスプレイの形状にて便利に送達される。
加圧されたエアーゾルの場合，用量単位は計量された量を送達するべく備えられ
たバルブにより調節されてよい。たとえば吸入器または注入器において使用する
ためのゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは，当該化合物の粉末混合物と
，ラクトースやデンプンといった適当な粉末基剤とを含んで製剤されてよい。

【０１６７】 また当該化合物は，たとえば大量注射または連続的な灌流による非経口投与用
に製剤されてもよい。注射用の製剤は，単位用量にて，たとえばアンプルにて，
あるいは多用量容器中に添加された保存料と共に提供されてよい。当該化合物は
油性または水性の媒体において，懸濁液，溶液，または乳濁液といった形状をと
ってよく，また懸濁，安定および／または分散剤といった製剤物質を含んでもよ
い。

【０１６８】 非経口投与用の薬剤組成物は，これに限定されないが，活性成分の塩等の，水
に可溶性の形状の水溶液を含む。さらに，活性成分の懸濁物は，親油性の媒体中
で調製されてよい。適切な親油性媒体は，脂肪油，ゴマ油等の脂肪油，オレイン
酸エチル等の合成脂肪酸エステル，およびトリグリセリド，またはリポソーム等
の物質を含む。水溶性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム，ソルビトール，またはデキストラン等の当該懸濁液の粘度を増す物質を含ん
でよい。任意で，当該懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にする
べく，当該化合物の可溶性を亢進する適当な安定剤および／または薬剤を含んで
もよい。別法として，活性成分は，使用前に適当な媒体，たとえば無菌の，発熱
物質なしの水を用いて構成するための，粉末の形状であってもよい。

【０１６９】 当該化合物は，たとえばカカオバターまたは他のグリセリドといった通常の坐
剤基剤を用いて，坐剤または停留浣腸等の直腸用組成物に製剤されてもよい。

【０１７０】 先に述べた製剤に加えて，当該化合物はまたデポ製剤として製剤されてよい。
かかる長時間作用性の製剤は，埋込み（たとえば皮下または筋肉内への）による
か，または筋肉内注射により投与されてよい。この投与経路のためには，本発明
の組成物は適当な高分子性または疎水性物質と共に（たとえば薬理学的に許容さ
れる油剤による乳濁液にて），イオン交換樹脂と共に，あるいはこれに限定され
ないがやや溶けにくい塩等のやや溶けにくい誘導体として，製剤されてよい。

【０１７１】 本明細書の薬剤学的組成物はまた，適当な固形またはゲル相の担体または賦形
剤を含んでよい。かかる担体または賦形剤の実例は，これに限定されないが，炭
酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖類，デンプン，セルロース誘導体，
ゼラチン，およびポリエチレングリコール等のポリマーを含む。

【０１７２】 本発明のＰＫ調製化合物の多くは，生理学的に許容される塩類として提供され
てよいが，それにおいては，本発明の化合物は負または正に帯電された種を形成
してもよい。当該化合物が正に帯電した成分を形成している塩の実例は，これに
限定されないが，第４アンモニウム（本明細書の他の場所に定義されている），
塩酸塩，硫酸塩，炭酸塩，乳酸塩，酒石酸塩，マレイン酸塩，コハク酸塩等の，
第４アンモニウム基の窒素原子が，適当な酸と反応した本発明の選ばれた化合物
の窒素である塩類を含む。本発明の化合物が負に帯電した種を形成している塩類
は，これに制限されないが，当該化合物中のカルボン酸基と適当な塩基（たとえ
ば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ），水酸化カリウム（ＫＯＨ），水酸化カルシウ
ム（Ｃａ（ＯＨ）₂），その他）との反応によって形成されるナトリウム，カリ
ウム，カルシウム，およびマグネシウム塩を含む。

【０１７３】用量 本発明における使用に適した薬剤学的組成物は，意図された目的，すなわちＰ
Ｋ活性の調節，またはＰＫ関連障害の治療または予防を遂行するべく充分な量の
活性物質が含まれている組成物を含む。

【０１７４】 さらに具体的には，治療上有効な量とは，疾患の症状を予防，緩和，または改
善するため，あるいは治療されている患者の生存を延長されるために有効な化合
物の量を意味する。

【０１７５】 治療上有効な量の決定は，特に本明細書において提供された詳細な開示に照ら
し合われせば，当業者の能力で充分可能である。

【０１７６】 本発明の方法において用いられる化合物については，治療上有効な量または用
量は，最初は細胞培養検定から算定されることが可能である。したがって，動物
モデルにおける使用のために，用量は細胞培養において測定されるようなＩＣ₅₀ （すなわちＰＫ活性の最大阻害の半分を成し遂げる試験化合物の濃度）を含む循
環濃度範囲を達成するべく公式化されてよい。かかる情報は次いで，ヒトにおけ
る有用な用量のさらに正確な決定のために用いられることが可能である。

【０１７７】 本明細書に述べた化合物の毒性ならびに治療上の有効性は，細胞培養物または
実験動物において，たとえば披検化合物についてＩＣ₅₀およびＬＤ₅₀（双方とも
本明細書の他の場所において議論されている）を測定することにより，標準的な
薬剤学的方法により測定されることが可能である。このような細胞培養物の検定
および動物研究から得られたデータは，ヒトにおいて使用するための用量範囲の
公式化に利用することができる。用量は，用いられる剤形と，利用される投与経
路とに依存して変えられてよい。正確な製剤，投与経路，および用量は，個々の
医師により，患者の状態を考慮して選択されることが可能である。（たとえば，
Finglら，1975, "The Pharmacological Basis of Therapeutics"第１章，１頁を
参照のこと）。

【０１７８】 投薬用量および間隔は，活性をもつ種の，キナーゼ調節効果を維持するために
充分な血漿濃度を提供するべく，個々に調節されてよい。このような血漿濃度は
，最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる。ＭＥＣは各々の化合物ごとに異なるであ
ろうが，インビトロのデータから算定されることは可能であり，たとえばキナー
ゼの５０〜９０％阻害を達成するために必要な濃度は，本明細書に述べた検定法
を用いて確認されてよい。ＭＥＣを成遂げるために必要な用量は個体の特性およ
び投与経路に依存することとなる。ＨＰＬＣ検定法または生物学的検定法は，血
漿濃度を測定するべく使用されることが可能である。

【０１７９】 投薬間隔もまたＭＥＣ値を用いて測定することができる。化合物は，ＭＥＣよ
り高い血漿濃度が１０〜９０％の時間，このましくは３０〜９０％の間，最も好
ましくは５０〜９０％の間にわたって維持される投与計画を用いて投与されるこ
ととなる。

【０１８０】 局所投与または選択的摂取の場合には，薬剤の有効な局所濃度は血漿濃度に関
係なく，この技術において周知の他の方法を，正しい用量および間隔を決定する
べく用いてよい。

【０１８１】 投与される化合物の量は，もちろん治療される患者，苦しみの激しさ，投与法
，処方している医師の判断，その他に依存する。

【０１８２】梱包 当該化合物は，もし所望であれば， ＦＤＡ承認のキット等の，活性成分を含
んでいる一つまたはそれより多い単位剤形を含むパックまたは調剤装置にて提供
されてよい。パックはたとえばＰＴＰ包装等の金属またはプラスチックの箔でよ
い。パックまたは調剤装置には，投与のための使用説明書が添付されてよい。ま
たパックまたは調剤装置は，薬剤の製造，用途，または販売を取締まる政府機関
によって規定された形式の，容器に関連した注意書が添付されてよく，その注意
書は当該組成物の形状について，あるいはヒトまたは獣医学的投与についての当
該機関による承認を反映するものである。かかる注意書は，たとえば米国食品医
薬品局により処方箋調剤薬として承認されたラベルによるものか，または承認さ
れた製品に差込まれたものでもよい。適合した製剤学的担体中で製剤された，本
発明の化合物を含んでいる組成物もまた調製され，適当な容器内に設置され，さ
らに指示された条件による処置のためにラベルされてよい。ラベルに示された適
切な条件は，腫瘍の治療，血管新生の阻害，線維症，糖尿病，およびその他の治
療を含んでよい。

【０１８３】５．合成 本発明の化合物，ならびに前駆体である２−オキシインドールおよびシクロケ
トンは，以下に記載される方法を用いて合成することができる。本明細書の記載
に基づいて，当業者には，本発明の化合物および／または化合物の前駆体を合成
する他の方法が明らかになるであろう。そのような別法は本発明の範囲および精
神の範囲内である。

【０１８４】 一般的合成方法 １−３等量の適当な２−オキシインドールおよび１等量の適当なシクロケトン
を，水または有機溶媒，例えば，限定されるものではないが，Ｃ₁−Ｃ₁₀のアル
コール（メタノール，エタノール，オクタノール等），エチレングリコール，セ
ロソルブ，ジエチルエーテル，ジクロロメタン，クロロホルム，四塩化炭素，ベ
ンゼン，トルエン，キシレン，テトラヒドロフラン，アセトニトリル，ジオキサ
ン，ジメチルスルホキシド，ジメチルホルムアミド，ジメチルアセトアミド，１
−メチル−２−ピロリジン，ピリジン等の中で混合する。好ましくは，溶媒は，
ジメチルスルホキシド，ジメチルホルムアミド，ジメチルアセトアミドおよびＮ
−メチルピロリジンからなる群より選択される有機溶媒である。最も好ましくは
，溶媒は，ジメチルホルムアミドおよびジメチルアセトアミドから選択される。
モル過剰の無機または有機塩基を加える。塩基は，水酸化ナトリウム，水酸化カ
リウム，水酸化アンモニウム，ナトリウムメトキシド，ナトリウムエトキシド，
カリウムｔ−ブトキシド，トリエチルアミン，トリエタノールアミン，ピペリジ
ン，モルホリン，ピロリジンなどであり得るが，これらに限定されない。好まし
くは，塩基は，トリエチルアミン，ピペリジン，モルホリンおよびピロリジンか
らなる群より選択される有機塩基である。最も好ましくは，塩基はピペリジンで
ある。得られた溶液または混合物を，約２０℃から約２００℃で，約０．５時間
から約１００時間，大気圧下でまたは密封管中で撹拌する。温度は，好ましくは
約９０℃から約１７５℃であり，最も好ましくは，約１１０℃から約１５０℃で
ある。反応時間は，好ましくは１時間から約７２時間である。次に，混合物を室
温にする。次に，希水性無機酸（例えば，限定されるものではないが，１Ｎ塩酸
または１Ｎ硫酸）を，塩基を中和するのに十分な量で加える。得られた混合物を
水不溶性有機溶媒，例えば，限定されるものではないが，塩化メチレン，ジエチ
ルエーテル，ヘキサン，酢酸エチル，ベンゼン，または溶媒の混合物（例えば酢
酸エチル／ヘキサン）で抽出する。好ましくは，有機溶媒は酢酸エチルである。
有機溶媒相を分離し，乾燥し，蒸発させて，本発明の化合物を得る。

【０１８５】 特定の合成 以下の例示的合成は，いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものと
解釈すべきではない。

【０１８６】 実施例１：３−（３−メチルインダン−１−イリデン）−１，３−ジヒドロイン
ドール−２−オン ０．５ｇの３−メチル−１−インダノン，１．３７ｇオキシインドールおよび
５ｍｌピペリジンの，３ｍｌのジメチルホルムアミド中の混合物を，密封管中で
１３０℃で一夜加熱して，赤茶色懸濁液を得た。混合物を１Ｎ塩酸溶液に加え，
酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し，硫酸マグネシウムで乾燥し
，濃縮した。クロマトグラフィーにより，１２０ｍｇの３−（３−メチルインダ
ン−１−イリデン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オンを橙色固体として
得た。

【化８】

【０１８７】 実施例２；３−（４−メチルインダン−１−イリデン）−１，３−ジヒドロイン
ドール−２−オン ０．５ｇの４−メチル−１−インダノン，１．３７ｇオキシインドールおよび
３ｍｌピペリジンの，５ｍｌのジメチルホルムアミド中の混合物を，密封管中で
１３０℃で３日間加熱して，赤黒色懸濁液を得た。混合物を１Ｎ塩酸溶液に加え
，酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し，硫酸マグネシウムで乾燥
し，濃縮した。得られた固体を酢酸エチル／ヘキサン（２Ｘ），続いて，塩化メ
チレン／ヘキサンから沈澱させて，４００ｍｇの３−（４−メチル−インダン−
１−イリデン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オンを黄色固体として得た
。

【化９】

【０１８８】 実施例３：３−（５−メトキシインダン−１−イリデン）−１，３−ジヒドロイ
ンドール−２−オン ０．５ｇの５−メトキシ−１−インダノン，１．２３ｇオキシインドールおよ
び２．７ｍｌピペリジンの，４ｍｌのジメチルホルムアミド中の混合物を，密封
管中で１３０℃で３日間加熱して，緑黒色懸濁液を得た。混合物を１Ｎ塩酸溶液
に加え，酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し，硫酸マグネシウム
で乾燥し，濃縮した。クロマトグラフィーにより，２０ｍｇの３−（５−メトキ
シインダン−１−イリデン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オンを茶色固
体として得た。

【化１０】

【０１８９】 実施例４：３−（６−メトキシインダン−１−イリデン）−１，３−ジヒドロイ
ンドール−２−オン ０．５ｇの６−メトキシ−１−インダノン，１．２３ｇオキシインドールおよ
び２．７ｍｌピペリジンの，４ｍｌのジメチルホルムアミド中の混合物を，密封
管中で１３０℃で３日間加熱して，緑黒色懸濁液を得た。混合物を１Ｎ塩酸溶液
に加え，酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し，硫酸マグネシウム
で乾燥し，濃縮した。得られた固体を，塩化メチレン／ヘキサン（３Ｘ）から沈
澱させて，２９０ｍｇの３−（６−メトキシインダン−１−イリデン）−１，３
−ジヒドロインドール−２−オンを黄茶色固体として得た。

【化１１】

【０１９０】 実施例５：３−（５−ジメチルアミノインダン−１−イリデン）−１，３−ジヒ
ドロインドール−２−オン ０．５ｇの５−ジメチルアミノ−１−インダノン，１．１ｇオキシインドール
および２．５ｍｌピペリジンの，４ｍｌのジメチルホルムアミド中の混合物を，
密封管中で１３０℃で１２時間加熱して，赤黒色懸濁液を得た。混合物を１Ｎ塩
酸溶液に加え，酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し，硫酸マグネ
シウムで乾燥し，濃縮した。クロマトグラフィーにより，３５ｍｇの３−（５−
ジメチルアミノ−インダン−１−イリデン）−１，３−ジヒドロインドール−２
−オンを茶色固体として得た。

【化１２】

【０１９１】 実施例６：３−（５−アミノインダン−１−イリデン）−１，３−ジヒドロイン
ドール−２−オン ０．５ｇの５−アミノ−１−インダノン，１．３ｇオキシインドールおよび３
ｍｌピペリジンの，５ｍｌのジメチルホルムアミド中の混合物を，密封管中で１
３０℃で３日間加熱して，赤黒色懸濁液を得た。混合物を１Ｎ塩酸に加え，酢酸
エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し，硫酸マグネシウムで乾燥し，濃
縮した。クロマトグラフィーにより，４５ｍｇの３−（５−アミノインダン−１
−イリデン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オンを茶色固体として得た。

【化１３】

【０１９２】 実施例７：３−（５−クロロインダン−１−イリデン）−１，３−ジヒドロイン
ドール−２−オン ５００ｍｇの５−クロロ−１−インダノン，１．３３ｇオキシインドールおよ
び０．５ｍｌピペリジンの，３ｍｌのジメチルホルムアミド中の混合物を，密封
管中で９５℃で一夜加熱した。水を反応混合物に加えて，油状固体を得た。混合
物を数分間超音波処理し，次にデカントした。この洗浄方法を数回繰り返した。
次に，固体を濾過し，酢酸エチル／ヘキサン（１：３）で洗浄して，１７２ｍｇ
の３−（５−クロロインダン−１−イリデン）−１，３−ジヒドロインドール−
２−オンをからし色固体として得た。

【化１４】

【０１９３】 実施例８：３−（５−ピペリジン−１−イル−インダン−１−イリデン）−１．
３−ジヒドロインドール−２−オン ０．５ｇの５−フルオロ−１−インダノン，１３ｇオキシインドールおよび１
ｍｌピペリジンの，４ｍｌのジメチルホルムアミド中の混合物を，密封管中で，
１２５℃で２．５時間加熱した。反応混合物を水に注加し，水性相をデカントし
た。次に，酢酸エチルを固体が形成するまでゆっくり加えた。固体を濾過し，酢
酸エチル／ヘキサンで洗浄して，カレー色固体を得た。次に，固体をジメチルホ
ルムアミド／アセトンで洗浄することによりさらに精製して，１２２ｍｇの３−
（５−ピペリジン−１−イル−インダン−１−イリデン）−１，３−ジヒドロイ
ンドール−２−オンを橙色固体として得た。

【化１５】

【０１９４】 実施例９：３−（５−ブロモインダン−１−イリデン）−１，３−ジヒドロイン
ドール−２−オン ０．４２２ｇの５−ブロモインダノン，１．３ｇオキシインドールおよび０．
９ｍｌピペリジンの，３ｍｌのジメチルホルムアミド中の反応混合物を，密封管
中で，１１０℃で一夜加熱した。反応混合物を氷水に注加し，酢酸エチルで抽出
した。有機相をブラインで洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮した。黒
色残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフィーを行い，酢酸エチルおよびヘキ
サンで溶出して，７３．０ｍｇの３−（５−ブロモインダン−１−イリデン）−
１，３−ジヒドロインドール−２−オンを黄色固体として得た。

【化１６】

【０１９５】 実施例１０：３−インダン−１−イリデン−１，３−ジヒドロインドール−２−
オン ０．４ｇインダン−２−オン，１．３３ｇオキシインドールおよび０．５ｍｌ
ピペリジンの，３ｍｌのジメチルホルムアミド中の混合物を，密封管中で，１３
０℃で６０時間加熱した。十分な水を加えて，油状固体を沈澱させた。混合物を
デカントし，残りの油状固体を，ヒートガンを用いて，５ｍｌのエタノールとと
もに加熱した。冷却した後，固体を濾別した。固体を３ｍｌのエタノール中でス
ラリー化し，濾過して，１６０ｍｇの３−インダン−１−イリデン−１，３−ジ
ヒドロインドール−２−オンを橙色固体として得た。

【化１７】

【０１９６】 実施例１１：［６−メトキシ−３−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール
−３−イリデン）−インダン−１−イル］酢酸 ０．６６ｇの５−メトキシインダン−３−オン酢酸，２．４ｇオキシインドー
ルおよび１．０ｍｌピペリジンの，３ｍｌのジメチルホルムアミド中の混合物を
，密封管中で１３０℃で１４時間加熱した。３ｍｌの６Ｎ塩酸を冷却した反応混
合物に加え，続いて３ｍｌの水を加えた。次に上清をデカントした。油状残渣を
５ｍｌのエタノール中で溶解するまで加熱し，次に溶液を冷却し，水を加えた。
一夜放置した後，固体が形成し，これを濾過し，エタノールで洗浄した。固体を
４ｍｌの酢酸エチル中で７０℃で４５分間スラリー化し，濾過し，吸引乾燥して
，３００ｍｇの［６−メトキシ−３−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドー
ル−３−イリデン）−インダン−１−イル］−酢酸を得た。

【化１８】

【０１９７】 実施例１２：３−（５，６−ジメトキシインダン−１−イリデン）−１，３−ジ
ヒドロインドール−２−オン ０．６ｇの５，６−ジメトキシ−１−インダノン，１．０４ｇオキシインドー
ルおよび２．３ｍｌピペリジンの，４ｍｌのジメチルホルムアミド中の混合物を
，密封管中で１３０℃で１２時間加熱して，橙色懸濁液を得た。混合物をエタノ
ール中１Ｎ塩酸に加え，形成した固体を濾過し，水およびエタノールですすいだ
。固体をエタノール中でスラリー化し，濾過して，２００ｍｇの３−（５，６−
ジメトキシインダン−１−イリデン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オン
を得た。

【化１９】

【０１９８】 実施例１３：［６−メトキシ−３−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール
−３−イリデン）−インダン−１−イル］酢酸ナトリウム塩 ８ｇの［６−メトキシ−３−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−３
−イリデン）インダン−１−イル］−酢酸の，６０ｍｌの水中の懸濁液を，１０
ｍｌの水中の０．９ｇの水酸化ナトリウムに加えた。混合物を室温で３０分間撹
拌し，濾過した。濾液を凍結し，凍結乾燥して，８ｇの［６−メトキシ−３−（
２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−３−イリデン）−インダン−１−イ
ル］−酢酸ナトリウム塩を得た。

【化２０】

【化２１】

【０１９９】 実施例１４：１'，５'，６'，１'−テトラヒドロ−１Ｈ−［３，４'］ビインド
リリデン−２−オン ６８０ｍｇの１，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−インドール−４−オンお
よび１．３３ｇオキシインドールの，３ｍｌのジメチルホルムアミド中の混合物
を，１４０℃で５０時間加熱した。混合物を水で希釈し，酢酸エチルで抽出した
。有機抽出物を水で，次にブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濾過し
，濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムでヘキサン／酢酸エチルを溶出剤とし
て用いて精製して，１５０ｍｇの１'，５'，６'，７'−テトラヒドロ−１Ｈ−［
３，４'］ビインドリリデン−２−オンを黄色固体として得た。

【化２２】

【０２００】６．生物学的評価 任意の与えられた一群の化合物において，生物学的活性のスペクトルが得られ
るであろうことが理解されるであろう。好ましい態様においては，本発明は，Ｒ
ＴＫ，ＣＴＫ，およびＳＴＫ活性を調節する能力を示す，新規な幾何学的に制限
された２−インドリノンに関する。以下のアッセイを用いて，最適な程度の所望
の活性を示す化合物が選択される。

【０２０１】 アッセイ方法 以下のインビトロアッセイを用いて，本発明の種々の化合物の１つまたはそれ
以上のＰＫに対する活性および効果のレベルを決定することができる。同様にし
て，当該技術分野においてよく知られる技術を用いて，任意のＰＫについて類似
のアッセイを設計することができる。

【０２０２】 本明細書に記載される細胞／触媒アッセイは，ＥＬＩＳＡフォーマットで実施
する。一般的方法は以下のとおりである：天然にまたは組換え的に試験キナーゼ
を発現する細胞に化合物を導入する。選択された時間が経過した後，試験キナー
ゼがレセプターである場合には，レセプターを活性化することが知られているリ
ガンドを加える。細胞を溶解し，あらかじめ酵素的リン酸化反応の基質を認識す
る特異的抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートのウエルに溶解物を移す。
細胞溶解物の非基質成分を洗い流し，ホスホチロシンを特異的に認識する抗体で
基質のリン酸化の量を検出し，試験化合物と接触させていない対照細胞と比較す
る。

【０２０３】 本明細書に記載される細胞／生物学的アッセイは，試験キナーゼの活性化に応
答して生成したＤＮＡの量を測定し，これは一般的な増殖性応答の測定である。
このアッセイの一般的方法は次のとおりである：天然にまたは組換え的に試験キ
ナーゼを発現する細胞に化合物を導入する。選択された時間が経過した後，試験
キナーゼがレセプターである場合にはレセプターを活性化することが知られてい
るリガンドを加える。少なくとも一夜インキュベーションした後，ＤＮＡ標識試
薬，例えばブロモデオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）または３Ｈ−チミジンを加え
る。抗ＢｒｄＵ抗体でまたは放射活性を測定することにより標識されたＤＮＡの
量を検出し，試験化合物と接触させていない対照細胞と比較する。

【０２０４】 １．細胞／触媒アッセイ 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて，ＰＫ活性の存在
を検出し測定することができる。ＥＬＩＳＡは，例えば，Ｖｏｌｌｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，１９８０（"Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎ
ｔ Ａｓｓａｙ，" Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，第２版，Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｍａｎ編，ｐｐ３５９−３７１ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ
．Ｃ．）に記載の既知のプロトコルに従って実施することができる。

【０２０５】 開示されるプロトコルを，特定のＰＫに関する活性を検出するように適合させ
ることができる。例えば，特定のＰＫに関するＥＬＩＳＡ実験を実施するための
好ましいプロトコルは以下に記載される。しかし，ＲＴＫファミリーの他のメン
バー，ならびにＣＴＫおよびＳＴＫに対する化合物の活性を検出するためにこれ
らのプロトコルを適合させることは，当業者の知識の範囲内である。

【０２０６】ＦＬＫ−１アッセイ ＥＬＩＳＡアッセイを実施して，ＦＬＫ−１レセプターのキナーゼ活性，より
詳細にはＦＬＫ−１レセプター上のＴＫ活性の阻害または活性化を測定する。詳
細には，以下のアッセイを実施して，Ｆｌｋ−１を発現するように遺伝子工学処
理された細胞において，ＦＬＫ−１レセプターのキナーゼ活性を測定することが
できる。

【０２０７】材料および方法 ａ． Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ
Ｎｏ．２５８０５−９６）； ｂ． Ｃａｐｐｅｌヤギ抗ウサギＩｇＧ（カタログＮｏ．５５６４１）； ｃ． ＰＢＳ（ＧｉｂｃｏカタログＮｏ．４５０−１３００ＥＢ）； ｄ． ＴＢＳＷ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．２），１５０ｍＭＮａＣｌ
および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）； ｅ． エタノールアミン保存液（１０％エタノールアミン（ｐＨ７．０），４℃
で保存）； ｆ． ＨＮＴＧ緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，および１０％グリセロール）； ｇ． ＥＤＴＡ（０．５Ｍ（ｐＨ７．０）１００Ｘ保存液として）； ｈ． オルトバナジウム酸ナトリウム（０．５Ｍ，１００Ｘ保存液として）； ｉ． ピロリン酸ナトリウム（０．２Ｍ，１００Ｘ保存液として）； ｊ． ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃカタログＮｏ．ＡＳ−７２０９２）； ｋ． ＮＩＨ３Ｔ３ Ｃ７＃３細胞（ＦＬＫ−１発現細胞）； ｌ． ＤＭＥＭ，１Ｘ高グルコースＬ−グルタミン含有（カタログＮｏ．１１９
６５−０５０）； ｍ． ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ（カタログＮｏ．１６０００−０２８）； ｎ． Ｌ−グルタミン，Ｇｉｂｃｏ（カタログＮｏ．２５０３０−０１６）； ｏ． ＶＥＧＦ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．（カタログＮｏ．１００−２０
）Ｍｉｌｌｉ−ＱｄＨ₂Ｏ中１μｇ／１００μｌ保存液として保持し，−２０℃
で保存； ｐ． アフィニティー精製抗ＦＬＫ−１抗血清； ｑ． ホスホチロシン特異的ＵＢ４０モノクローナル抗体（Ｆｅｎｄｌｅｙ，ｅ
ｔ ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：１５５０−１
５５８を参照）； ｒ． ＥＩＡ等級ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ（ＢｉｏＲａｄカタログＮｏ．１
７２−１０１１）； ｓ． ２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸（ＡＢＴ
Ｓ）溶液（１００ｍＭクエン酸（無水），２５０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ４．０
），０．５ｍｇ／ｍｌＡＢＴＳ（ＳｉｇｍａカタログＮｏ．Ａ−１８８８）），
溶液は，使用まで暗所で４℃で保存しなければならない； ｔ． Ｈ₂Ｏ₂（３０％溶液）（ＦｉｓｈｅｒカタログＮｏ．Ｈ３２５）； ｕ． ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂（１５ｍｌＡＢＴＳ溶液，２μｌＨ₂Ｏ₂）使用の５分間
に調製，室温に保持； ｖ． ０．２ＭＨＣｌ保存液，Ｈ₂Ｏ中； ｗ． ジメチルスルホキシド（１００％）（ＳｉｇｍａカタログＮｏ．Ｄ−８４
１８）；および ｙ． トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬカタログＮｏ．２５２００−
０４９）プロトコル １． Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを，ウエルあたり１．０μ
ｇの，０．１ＭＮａ₂ＣＯ₃（ｐＨ９．６）中Ｃａｐｐｅｌ抗ウサギＩｇＧ抗体，
でコーティングする。最終容量をウエルあたり１５０μｌとする。プレートを４
℃で一夜コーティングする。プレートは，４℃で保存したとき，２週間まで保存
することができる。

【０２０８】 ２． 細胞を適当な培養皿中で成長培地（ＤＭＥＭ，２．０ｍＭＬ−グルタミン
，１０％ＦＢＳを補充）中で，コンフルエントとなるまで３７℃，５％ＣＯ₂で
成長させる。

【０２０９】 ３． トリプシン処理により細胞を回収し，Ｃｏｒｎｉｎｇ２５８５０ポリスチ
レン９６ウエル丸底細胞プレートに，２００μｌの成長培地中２５，０００細胞
／ウエルで播種する。

【０２１０】 ４． 細胞を３７℃，５％ＣＯ₂で少なくとも１日成長させる。

【０２１１】 ５． 細胞をＤ−ＰＢＳ １Ｘで洗浄する。

【０２１２】 ６． ２００μｌ／ウエルの飢餓培地（ＤＭＥＭ，２．０ｍＭ ｌ−グルタミン
，０．１％ＦＢＳ）を加える。３７℃，５％ＣＯ₂で一夜インキュベートする。

【０２１３】 ７． 化合物をポリプロピレン９６ウエルプレート中で飢餓培地を用いて１：２
０に希釈する。対照ウエルで使用するために，ジメチルスルホキシドを１：２０
に希釈する。

【０２１４】 ８． ９６ウエル細胞培養プレートから飢餓培地を除去し，１６２μｌの新たに
調製した飢餓培地を各ウエルに加える。

【０２１５】 ９． １：２０に希釈された化合物希釈物１８μｌ（工程７より）を各ウエルに
加え，１：２０ジメチルスルホキシド希釈物を対照ウエルに加え（＋／−ＶＥＧ
Ｆ），細胞刺激の後，１：２００の最終希釈とする。最終ジメチルスルホキシド
は０．５％である。プレートを３７℃，５％ＣＯ₂で２時間インキュベートする
。

【０２１６】 １０． プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合抗体をＥＬＩ
ＳＡプレートから除去する。ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン，ｐＨ７．０
で３回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体およ
び気泡を除去する。

【０２１７】 １１． ウエルあたり１５０μｌのＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン，ｐＨ
７．０でプレートをブロッキングする。プレートをマイクロタイタープレート振
盪器で振盪しながら，３０分間インキュベートする。

【０２１８】 １２． プレートを工程１０で記載したように３回洗浄する。

【０２１９】 １３． ０．５μｇ／ウエルのアフィニティー精製抗ＦＬＵ−１ポリクローナル
ウサギ抗血清を加える。ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミンｐＨ７．０で最終
容量を１５０μｌ／ウエルとする。プレートを振盪しながら３０分間インキュベ
ートする。

【０２２０】 １４． 細胞に１８０μｌの飢餓培地を加え，２０μｌ／ウエルの１０．０ｍＭ
オルトバナジウム酸ナトリウムおよび５００ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦ（最終濃度；ウ
エルあたり１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウムおよび５０ｎｇ／ｍｌＶＥ
ＧＦ）で３７℃，５％ＣＯ₂で８分間細胞を刺激する。陰性対照ウエルには飢餓
培地のみを加える。

【０２２１】 １５． ８分後，培地を細胞から除去し，２００μｌ／ウエルのＰＢＳで１回洗
浄しなければならない。

【０２２２】 １６． １５０μｌ／ウエルのＨＮＴＧ中で室温で５分間振盪しながら細胞を溶
解させる。ＨＮＴＧ配合物はオルトバナジウム酸ナトリウム，ピロリン酸ナトリ
ウムおよびＥＤＴＡを含む。

【０２２３】 １７． ＥＬＩＳＡプレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。

【０２２４】 １８． 細胞溶解物を細胞プレートからＥＬＩＳＡプレートに移し，振盪しなが
ら２時間インキュベートする。細胞溶解物を移すには，ウエルを掻きながらピペ
ットアップおよびダウンを行う。

【０２２５】 １９． プレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。

【０２２６】 ２０． ＥＬＩＳＡプレートを０．０２μｇ／ウエルのＴＢＳＷ＋０５％エタノ
ールアミン中のＵＢ４０とともにインキュベートする。最終容量を１５０μｌ／
ウエルとする。振盪しながら３０分間インキュベートする。

【０２２７】 ２１． プレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。

【０２２８】 ２２． ＥＬＩＳＡプレートを，ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン，ｐＨ７
．０中で１：１０，０００に希釈したＥＩＡ等級ヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲ
ート西洋ワサビペルオキシダーゼとともにインキュベートする。最終容量を１５
０μｌ／ウエルとする。振盪しながら３０分間インキュベートする。

【０２２９】 ２３． 工程１０で記載したようにプレートを洗浄する。

【０２３０】 ２４． １００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液をウエルに加える。振盪しながら１
０分間インキュベートする。

【０２３１】 ２５． １００μｌの０．２ＭＨＣｌを０．１ＭＨＣｌ最終濃度となるように加
えて，発色反応を停止する。室温で１分間振盪する。ゆっくりした空気の流れで
気泡を除去し，ＥＬＩＳＡプレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで４１０ｎｍ
で読む。

【０２３２】ＨＥＲ２−ＥＬＩＳＡ 全細胞におけるＥＧＦレセプター−ＨＥＲ２キメラレセプターアッセイ ＥＧＦＲ−ＮＩＨ３Ｔ３全細胞中のＨＥＲ２キナーゼ活性を以下に記載するよ
うにして測定した。

【０２３３】材料および試薬 ａ． ＥＧＦ：保存液濃度：１６．５ＩＬＭ；ＥＧＦ２０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｃ
ｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ ｂ． ０５−１０１（ＵＢＩ）（ＥＧＦＲ細胞外ドメインを認識するモノクロー
ナル抗体） ｃ． 抗ホスホチロシン抗体（抗Ｐｔｙｒ）（ポリクローナル）（Ｆｅｎｄｌｅ
ｙ，ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照） ｄ． 検出抗体：ヤギ抗ウサギｌｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲー
ト，ＴＡＧＯ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ ｅ． ＴＢＳＴ緩衝液： Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２ ５０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１ ｆ． ＨＮＴＧ ５Ｘ保存液： ＨＥＰＥＳ ０．１Ｍ ＮａＣｌ ０．７５Ｍ グリセロール ５０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １．０％ ｇ． ＡＢＴＳ保存液： クエン酸 １００ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ２５０ｍＭ ＨＣｌ（濃） ０．５ｍＭ ＡＢＴＳ^* ０．５ｍｇ／ｍｌ ＊（２，２'−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）） 溶液は使用するまで暗所で４℃で保存する。

【０２３４】 ｈ． 試薬保存液： ＥＤＴＡ １００ｍＭ ｐＨ７．０ Ｎａ₃ＶＯ₄ ０．５Ｍ Ｎａ₄（Ｐ₂Ｏ₇） ０．２Ｍ方法 ＥＬＩＳＡプレートのプレコート １． ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，９６ウエル，Ｃａｔ．＃２５８０
５−９６）をウエルあたりＰＢＳ中０．５μｇの０５−１０１抗体で１００μｌ
の最終容量／ウエルでコーティングし，４℃で一夜保存する。コーティングした
プレートは４℃で保存した場合，１０日間まで良好である。

【０２３５】 ２． 使用の日，コーティング緩衝液を除去し，１００μｌのブロッキング緩衝
液（ＰＢＳ中５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎインスタント脱脂乾燥ミルク）で置き換え
る。プレートを室温で（約２３℃から２５℃）振盪しながら３０分間インキュベ
ートする。使用の直前に，ブロッキング緩衝液を除去し，プレートをＴＢＳＴ緩
衝液で４回洗浄する。

【０２３６】細胞播種 １． このアッセイには，ＥＧＦＲ細胞外ドメインおよび細胞内ＨＥＲ２キナー
ゼドメインを含有するキメラレセプターを過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を用
いることができる。

【０２３７】 ２． ８０−９０％コンフルエントの培養皿を実験用に選択する。細胞をトリプ
シン処理し，１０％ウシ胎児血清を加えることにより反応を停止させる。細胞を
ＤＭＥＭ培地（１０％ＣＳ ＤＭＥＭ培地）中に懸濁し，１５００ｒｐｍで室温
で５分間１回遠心分離する。

【０２３８】 ３． 細胞を播種培地（ＤＭＥＭ，０．５％ウシ血清）に再懸濁し，トリパンブ
ルーを用いて細胞を計数する。９０％より高い生存性が許容される。細胞をＤＭ
ＥＭ培地（０．５％ウシ血清）中で，ウエルあたり１０，０００細胞の密度で，
ウエルあたり１００μｌで，９６ウエルマイクロタイタープレートに播種する。
播種した細胞を５％ＣＯ₂中で３７℃で約４０時間インキュベートする。

【０２３９】アッセイ方法 １． 播種した細胞を，倒立顕微鏡を用いてコンタミネーションについて検査す
る。薬剤保存液（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭ培地で１：１０に希釈
し，次に５μｌを，最終薬剤希釈１：２００および最終ＤＭＳＯ濃度１％となる
ように，ＴＢＳＴウエルに移す。対照ウエルにはＤＭＳＯのみを加える。５％Ｃ
Ｏ₂中で３７℃で２時間インキュベートする。

【０２４０】 ２． ＥＧＦリガンドの調製：保存液ＥＧＦを，１０μｌ希釈ＥＧＦ（１：１２
希釈）を移したときに１００ｎＭの最終濃度が得られるように，ＤＭＥＭ中で希
釈する。

【０２４１】 ３． ウエルあたり１００μｌに十分なように新たにＨＮＴＧ^*を調製し，氷上
に置く。

【０２４２】 ＨＮＴＧ^*（１０ｍｌ）： ＨＮＴＧ保存液 ２．０ｍｌ ｍｉｌｌｉ−ＱＨ₂Ｏ ７．３ｍｌ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ，ｐＨ７．０ ０．５ｍｌ Ｎａ₃ＶＯ₄，０．５Ｍ ０．１ｍｌ Ｎａ₄（Ｐ₂Ｏ₇），０．２Ｍ ０．１ｍｌ ４． 薬剤とともに１２０分間インキュベーションした後，調製したＳＧＦリガ
ンドを，ウエルあたり１０μｌ，最終濃度１００ｎＭとなるように細胞に加える
。対照ウエルにはＤＭＥＭのみを加える。室温で５分間振盪しながらインキュベ
ートする。

【０２４３】 ５． 薬剤，ＥＧＦ，およびＤＭＥＭを除去する。細胞をＰＢＳで２回洗浄する
。ウエルあたり１００μｌのＨＮＴＧ^*を細胞に移す。氷上に５分間放置する。
この間に，ブロッキング緩衝液を他のＥＬＩＳＡプレートから除去し，上述した
ようにＴＢＳＴで洗浄する。

【０２４４】 ６． マイクロピペッターにぴったりと固定したピペットチップを用いて，細胞
をプレートからはがし，ＨＮＴＧ^*溶解緩衝液を繰り返し吸引および分配するこ
とにより，細胞物質をホモジナイズする。コーティングし，ブロッキングし，洗
浄したＥＬＩＳＡプレートに溶解物を移す。振盪しながら室温で１時間インキュ
ベートする。

【０２４５】 ７． 溶解物を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈した抗Ｐｔｙｒ抗
体をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。抗Ｐｔｙｒ抗血清（
ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）の存在下で，振盪しながら室温で３０分間インキ
ュベートする。

【０２４６】 ８． 抗Ｐｔｙｒ抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈したＴＡ
ＧＯ抗ウサギＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡプレートにウエルあたり１００μｌで移す
。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする（抗ウサギＩｇＧ抗体：ＴＢ
ＳＴ中１：３０００希釈）。

【０２４７】 ９． ＴＡＧＯ検出抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに調製したＡ
ＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。振
盪しながら室温で２０分間インキュベートする（ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液：１０ｍ
ｌＡＢＴＳ保存液中１．０μｌの３０％Ｈ₂Ｏ₂）。

【０２４８】 １０． ５０μｌの５Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を加えることにより反応を停止し（任意），
４１０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定する。

【０２４９】 １１． 最大ホスホチロシンシグナルは，陰性対照の値を陽性対照の値から差し
引くことにより決定する。次に，抽出物含有ウエルについて，陰性対照を差し引
いた後にホスホチロシン含有量のパーセント阻害を計算する。

【０２５０】ＰＤＧＦ−Ｒアッセイ すべての細胞培養培地，グルタミンおよびウシ胎児血清は，特に記載しないか
ぎり，Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌ
ａｎｄ，ＮＹ）から購入した。すべての細胞は，９０−９５％空気および５−１
０％ＣＯ₂の湿潤雰囲気下で３７℃で成長させた。すべての細胞株は，日常的に
１週間に２回サブカルチャーし，Ｍｙｃｏｔｅｃｔ法（Ｇｉｂｃｏ）によりマイ
コプラズマがないことを確認した。

【０２５１】 ＥＬＩＳＡアッセイについては，細胞（Ｕ１２４２，Ｊｏｓｅｐｈ Ｓｃｈｌ
ｅｓｓｉｎｇｅｒ，ＮＹＵから入手）を成長培地（ＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，ＮＥ
ＡＡ，１ｍＭ ＮａＰｙｒおよび２ｍＭＧＬＮ含有）で８０−９０％コンフルエ
ントまで成長させ，９６ウエル組織培養プレートに０．５％血清中で，ウエルあ
たり２５，０００−３０，０００細胞を播種する。０．５％血清含有培地で一夜
インキュベーションした後，細胞を無血清培地に移し，５％ＣＯ₂，３７℃イン
キュベーター中で試験化合物で２時間処理する。次に細胞をリガンドで５−１０
分間刺激し，ＨＮＴＧ（２０ｍＭＨｅｐｅｓ，１５０ｍＭＮａＣｌ，１０％グリ
セロール，５ｍＭＥＤＴＡ，５ｍＭＮａ₃ＶＯ₄，０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０，および２ｍＭＮａＰｙｒ）で溶解する。細胞溶解物（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／
ウエル）をレセプター特異的抗体であらかじめ被覆し，ＴＢＳＴ（５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．２，１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００）中５％ミルクで室温で３０分間ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに
移す。溶解物を振盪しながら室温で１時間インキュベートする。プレートをＴＢ
ＳＴで４回洗浄し，次にポリクローナル抗ホスホチロシン抗体とともに室温で３
０分間インキュベートする。プレートをＴＢＳＴで４回すすぐことにより過剰の
抗ホスホチロシン抗体を除去する。ＥＬＩＳＡプレートにヤギ抗ウサギＩｇＧ抗
体を室温で３０分間加え，次にＴＢＳＴでさらに４回すすぐ。ＡＢＴＳ（１００
ｍＭクエン酸，２５０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄および０．５ｍｇ／ｍＬ２，２'−アジ
ノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸）），およびＨ₂Ｏ₂（１．２
ｍＬ３０％Ｈ₂Ｏ₂を１０ｍｌＡＢＴＳに加える）をＥＬＩＳＡプレートに加えて
発色を開始させる。ＡＢＴＳ添加の約１５から３０分後，４１０ｎｍおよび６３
０ｎｍの参照波長における吸光度を記録する。

【０２５２】ＩＧＦ−Ｉレセプター 以下のプロトコルを用いて，ＩＧＦ−Ｉレセプター上のホスホチロシンレベル
を測定することができ，これはＩＧＦ−Ｉレセプターチロシンキナーゼ活性を示
す。

【０２５３】材料および試薬 ａ． このアッセイにおいて用いる細胞株は，ＩＧＦ−１レセプターを過剰発現
するように遺伝子工学処理された細胞株３Ｔ３／ＩＧＦ−１Ｒである。

【０２５４】 ｂ． ＮＩＨ３Ｔ３／ＩＧＦ−１Ｒを，５％ＣＯ₂，３７℃のインキュベーター
で成長させる。成長培地はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（熱不活性化）＋２ｍＭＬ−
グルタミンである。

【０２５５】 ｃ． アフィニティー精製抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体１７−６９ ｄ． Ｄ−ＰＢＳ： ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２０ｇ／ｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２．１６ｇ／ｌ ＫＣｌ ０．２０ｇ／ｌ ＮａＣｌ ８．００ｇ／ｌ（ｐＨ７．２） ｅ． ブロッキング緩衝液：ＴＢＳＴプラス５％ミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎイ
ンスタント脱脂乾燥ミルク） ｆ． ＴＢＳＴ緩衝液： Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ（ｐＨ７．２／ＨＣｌ １０Ｎ） ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１％ ＴＢＳ（１０Ｘ）の保存溶液を調製し，希釈の間に緩衝液にＴｒｉｔｏｎＸ−１
００を加える。

【０２５６】 ｇ． ＨＮＴＧ緩衝液： ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ（ｐＨ７．２／ＨＣｌ １Ｎ） グリセロール １０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．２％ 保存溶液（５Ｘ）を調製し，４℃で保存する。

【０２５７】 ｈ． ＥＤＴＡ／ＨＣｌ：０．５ＭｐＨ７．０（ＮａＯＨ），１００Ｘ保存液と
して ｉ． Ｎａ₃ＶＯ₄：１００Ｘ保存液として０．５Ｍ，アリコートは−８０℃で保
存する。

【０２５８】 ｊ． Ｎａ₄Ｐ₂Ｏ₇：１００Ｘ保存液として０．２Ｍ ｋ． インスリン様成長因子−１，Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｃａｔ＃Ｇ５１１１） ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗血清 ｍ． ヤギ抗ウサギＩｇＧ，ＰＯＤコンジュゲート（検出抗体），Ｔａｇｏ（Ｃ
ａｔ．Ｎｏ．４５２０，ＬｏｔＮｏ．１８０２）：Ｔａｇｏ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒ
ｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ ｎ． ＡＢＴＳ（２，２'−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン硫酸））
溶液： クエン酸 １００ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ２５０ｍＭ（ｐＨ４．０／１ＮＨＣｌ） ＡＢＴＳ ０．５ｍｇ／ｍｌ ＡＢＴＳ溶液は暗所で４℃で保存しなければならない。溶液は緑色に変色したと
きは廃棄しなければならない。

【０２５９】 ｏ． 過酸化水素：３０％溶液を暗所で４℃で保存する。

【０２６０】方法 以下のすべての工程は，特に記載しないかぎり，室温で実施する。すべてのＥ
ＬＩＳＡプレート洗浄は，プレートを水道水で３回すすぎ，ＴＢＳＴで１回すす
ぐことにより実施する。プレートを軽くたたいてペーパータオルで乾燥させる。

【０２６１】細胞播種 ： １． 組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ２５０２０−１００）で８０−９０％コンフ
ルエントまで成長させた細胞を，トリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％，０．５ｍ
ｌ／Ｄ−１００，ＧＩＢＣＯ）で回収する。

【０２６２】 ２． 細胞を新鮮なＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭＬ−グルタミン中に再懸濁
し，９６ウエル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２５８０６−９６）に２０
，０００細胞／ウエル（１００μｌ／ウエル）で移す。１日インキュベートし，
次に培地を無血清培地（９０／μｌ）で置き換え，５％ＣＯ₂，３７℃で一夜イ
ンキュベートする。

【０２６３】ＥＬＩＳＡプレートコーティングおよびブロッキング ： １． ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ２５８０５−９６）を，１００μｌ
ＰＢＳ中の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で０．５μｇ／ウエルで少なくとも２時間コーテ
ィングする。

【０２６４】 ２． コーティング溶液を除去し，１００μｌのブロッキング緩衝液で置き換え
，３０分間振盪する。ブロッキング緩衝液を除去し，溶解物を加える直前にプレ
ートを洗浄する。

【０２６５】アッセイ方法 ： １． 薬剤は，無血清条件で試験する。

【０２６６】 ２． 薬剤保存液（１００％ＤＭＳＯ中）を９６ウエルポリプロピレンプレート
中でＤＭＥＭで１：１０に希釈し，１０μｌ／ウエルのこの溶液を細胞に移して
，最終薬剤希釈１：１００，最終ＤＭＳＯ濃度１．０％とする。細胞を５％ＣＯ ₂ 中で３７℃で２時間インキュベートする。

【０２６７】 ３． 新鮮な細胞溶解緩衝液（ＨＮＴＧ＊）を調製する。

【０２６８】 ＨＮＴＧ ２ｍｌ ＥＤＴＡ ０．１ｍｌ Ｎａ₃ＶＯ₄ ０．１ｍｌ Ｎａ₄（Ｐ₂Ｏ₇） ０．１ｍｌ Ｈ₂Ｏ ７．３ｍｌ ４． 薬剤を２時間インキュベートした後，１０μｌ／ウエルのＰＢＳ中２００
ｎＭＩＧＦ−１リガンドを細胞に移し（最終濃度２０ｎＭ），５％ＣＯ₂で３７
℃で１０分間インキュベートする。

【０２６９】 ５． 培地を除去し，１００μｌ／ウエルのＨＮＴＧ＊を加え，１０分間振盪す
る。細胞を顕微鏡下で観察して，これらが適切に溶解したか否かを見る。

【０２７０】 ６． １２チャネルピペットを用いて細胞をプレートから掻き取り，吸引と分配
を繰り返すことにより溶解物をホモジナイズする。すべての溶解物を抗体コーテ
ィングＥＬＩＳＡプレートに移し，１時間振盪する。

【０２７１】 ７． 溶解物を除去し，プレートを洗浄し，抗ｐＴｙｒ（ＴＢＳＴ中１：３，０
００）を１００μｌ／ウエルで移し，３０分間振盪する。

【０２７２】 ８． 抗ｐＴｙｒを除去し，プレートを洗浄し，ＴＡＧＯ（ＴＢＳＴ中１：３，
０００）を１００μｌ／ウエルで移し，３０分間振盪する。

【０２７３】 ９． 検出抗体を除去し，プレートを洗浄し，新鮮なＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂（１．２
μｌＨ₂Ｏ₂を１０ｍｌＡＢＴＳに加える）を１００μｌ／ウエルでプレートに移
して，発色を開始させる。

【０２７４】 １０． ＤｙｎａｔｅｃＭＲ５０００で参照波長６３０ｎｍで４１０ｎｍのＯＤ
を測定する。

【０２７５】ＥＧＦＲアッセイ ヒトＥＧＦ−Ｒを発現するよう遺伝子工学処理された細胞中のＥＧＦレセプタ
ーキナーゼ活性を以下に記載するように測定することができる。

【０２７６】材料および試薬 ａ． ＥＧＦリガンド：保存液濃度＝１６．５μＭ；ＥＧＦ２０１，ＴＯＹＯＢ
Ｏ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ ｂ． ０５−１０１（ＵＢＩ）（ＥＧＦＲ細胞外ドメインを認識するモノクロー
ナル抗体） ｃ． 抗ホスホチロシン抗体（抗Ｐｔｙｒ）（ポリクローナル） ｄ． 検出抗体：ヤギ抗ウサギｌｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲー
ト，ＴＡＧＯ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ ｅ． ＴＢＳＴ緩衝液： Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７ ５０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１ ｆ． ＨＮＴＧ ５Ｘ保存液： ＨＥＰＥＳ ０．１Ｍ ＮａＣｌ ０．７５Ｍ グリセロール ５０ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １．０％ ｇ． ＡＢＴＳ保存液： クエン酸 １００ｍＭ ＮａＶＯ₄ ２５０ｍＭ ＨＣｌ（濃） ４．０ｐＨ ＡＢＴＳ^* ０．５ｍｇ／ｍｌ 溶液は使用するまで暗所で４℃で保存する。

【０２７７】 ｈ． 試薬保存液： ＥＤＴＡ １００ｍＭ ｐＨ７．０ Ｎａ₃ＶＯ₄ ０．５Ｍ Ｎａ₄（Ｐ₂０₇） ０．２Ｍ方法 ＥＬＩＳＡプレートのプレコート １． ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，９６ウエル，Ｃａｔ．＃２５８０
５−９６）をウエルあたりＰＢＳ中０．５μｇ，１５０μｌ最終容量／ウエルの
０５−１０１抗体でコーティングし，４℃で一夜保存する。コーティングしたプ
レートは４℃で保存した場合１０日間まで良好に使用しうる。

【０２７８】 ２． 使用の日，コーティング緩衝液を除去し，ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中
５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎインスタント脱脂乾燥ミルク）で置き換える。プレート
を振盪しながら室温（約２３℃−２５℃）で３０分間インキュベートする。使用
の直前に，ブロッキング緩衝液を除去し，プレートをＴＢＳＴ緩衝液で４回洗浄
する。

【０２７９】細胞播種 １． このアッセイにはＮＩＨ３Ｔ３／Ｃ７細胞株（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ５１：１９９−２０９，１９８７）を用いることができる。

【０２８０】 ２． ８０−９０％コンフルエントの皿を実験用に選択する。細胞をトリプシン
処理し，１０％ＣＳ ＤＭＥＭ培地を加えることにより反応を停止させる。細胞
をＤＭＥＭ培地（１０％ＣＳ ＤＭＥＭ培地）中に懸濁し，１０００ｒｐｍで室
温で５分間，１回遠心分離する。

【０２８１】 ３． 細胞を播種培地（ＤＭＥＭ，０．５％ウシ血清）に再懸濁し，トリパンブ
ルーを用いて細胞を計数する。９０％を越える生存率が許容範囲である。細胞を
９６ウエルマイクロタイタープレート上で，ＤＭＥＭ培地（０．５％ウシ血清）
中に，ウエルあたり１０，０００細胞の密度でウエルあたり１００μｌで播種す
る。播種した細胞を５％ＣＯ₂，３７℃で約４０時間インキュベートする。

【０２８２】アッセイ方法 １． 倒立顕微鏡を用いて，播種した細胞のコンタミネーションを調べる。試験
化合物保存液（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭ培地中で１：１０に希釈
し，次に５μｌを試験ウエルに移して，１：２００の最終薬剤希釈および１％の
最終ＤＭＳＯ濃度とする。対照ウエルにはＤＭＳＯのみを加える。５％ＣＯ₂，
３７℃で１時間インキュベートする。

【０２８３】 ２． ＥＧＦリガンドの調製：保存液ＥＧＦを，１０μｌの希釈ＥＧＦ（１：１
２希釈）を移したときに２５ｎＭの最終濃度が得られるように，ＤＭＥＭ中で希
釈する。

【０２８４】 ３． ウエルあたり１００μｌに十分なように新鮮なＨＮＴＧ^*１０ｍｌを調製
する。ＨＮＴＧ＊は以下のものを含む：ＨＮＴＧ保存液（２．０ｍｌ），ｍｉｌ
ｌｉ−ＱＨ₂Ｏ（７．３ｍｌ），ＥＤＴＡ，１００ｍＭ，ｐＨ７．０（０．５ｍ
ｌ），Ｎａ₃ＶＯ₄０．５Ｍ（０．１ｍｌ）およびＮａ₄（Ｐ₂Ｏ₇），０．２Ｍ（
０．１ｍｌ）

【０２８５】 ４． 氷上に置く。

【０２８６】 ５． 薬剤とともに２時間インキュベーションした後，調製したＥＧＦリガンド
を，ウエルあたり１０μｌで，２５ｎＭの最終濃度となるように細胞に加える。
対照ウエルにはＤＭＥＭのみを加える。振盪しながら室温で５分間インキュベー
トする。

【０２８７】 ６． 試験化合物，ＥＧＦおよびＤＭＥＭを除去する。細胞をＰＢＳで２回洗浄
する。ＨＮＴＧ^*をウエルあたり１００μｌで細胞に移す。氷上に５分間置く。
その間に，他のＥＬＩＳＡプレートからブロッキング緩衝液を除去し，上述した
ようにＴＢＳＴで洗浄する。

【０２８８】 ７. マイクロピペッターにぴったりと固定したピペットチップを用いて，細胞
をプレートからはがし，ＨＮＴＧ^*溶解緩衝液を繰り返し吸引および分配するこ
とにより，細胞物質をホモジナイズする。コーティングし，ブロッキングし，洗
浄したＥＬＩＳＡプレートに溶解物を移す。振盪しながら室温で１時間インキュ
ベートする。

【０２８９】 ８． 溶解物を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈した抗Ｐｔｙｒ抗
体をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。抗Ｐｔｙｒ抗血清（
ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）の存在下で，振盪しながら室温で３０分間インキ
ュベートする。

【０２９０】 ９． 抗Ｐｔｙｒ抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈したＴＡ
ＧＯ３０抗ウサギＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡプレートにウエルあたり１００μｌで
移す。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする（抗ウサギＩｇＧ抗体：
ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）。

【０２９１】 １０． 検出抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに調製したＡＢＴＳ
／Ｈ₂Ｏ₂溶液をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。室温で２
０分間インキュベートする（ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液：１０ｍｌＡＢＴＳ保存液中
１．２μｌの３０％Ｈ₂Ｏ₂）。

【０２９２】 １１． ５０μｌの５ＮＨ₂ＳＯ₄を加えることにより反応を停止し（任意），４
１０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定する。

【０２９３】 １２． 最大ホスホチロシンシグナルは，陰性対照の値を陽性対照の値から差し
引くことにより決定する。次に，陰性対照を差し引いた後，抽出物含有ウエルに
ついてのホスホチロシン含有量のパーセント阻害を計算する。

【０２９４】Ｍｅｔ自己リン酸化アッセイ このアッセイは，Ｍｅｔレセプター上のＭｅｔ蛋白質チロシンキナーゼレベル
を分析することにより，Ｍｅｔチロシンキナーゼ活性を決定する試薬 ａ． ＨＮＴＧ（５Ｘ保存溶液）：２３．８３ｇＨＥＰＥＳおよび４３．８３ｇ
ＮａＣｌを約３５０ｍｌｄＨ₂Ｏに溶解する。ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを７
．２に調節し，５００ｍｌグリセロールおよび１０ｍｌＴｒｉｔｏｎＸ−１００
を加え，混合し，ｄＨ₂Ｏを加えて総容量を１Ｌとする。１Ｘ作業溶液１Ｌを作
成するためには，２００ｍｌの５Ｘ保存溶液を８００ｍｌｄＨ₂Ｏに加え，必要
に応じてｐＨを調べて調節し，４℃で保存する。

【０２９５】 ｂ． ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水），Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．＃４５
０−１３００ＥＢ（１Ｘ溶液） ｃ． ブロッキング緩衝液：５００ｍｌｄＨ₂Ｏ中に，１００ｇＢＳＡ，１２．
１ｇＴｒｉｓ−ｐＨ７．５，５８．４４ｇＮａＣｌおよび１０ｍｌＴｗｅｅｎ−
２０を加え，希釈して総容量１Ｌとする。

【０２９６】 ｄ． キナーゼ緩衝液：５００ｍｌｄＨ₂Ｏに，１２．１ｇＴＲＩＳ（ｐＨ７．
２），５８．４ｇＮａＣｌ，４０．７ｇＭｇＣｌ₂および１．９ｇＥＧＴＡを加
え，ｄＨ₂Ｏで総容量１Ｌとする。

【０２９７】 ｅ． ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃
Ｐ−７６２６，４３５．５ｍｇに１００％エタノールを総容量２５ｍｌとなるよ
うに加え，ボルテックスする。

【０２９８】 ｆ． ＡＴＰ（細菌起源），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ−７６９９，粉末を−２
０℃で保存する；作業溶液を作成するためには，３．３１ｍｇを１ｍｌｄＨ₂Ｏ
中に溶解する。

【０２９９】 ｇ． ＲＣ−２０Ｈ ＨＲＰＯコンジュゲート化抗ホスホチロシン，Ｔｒａｎｓ
ｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃａｔ．＃Ｅ１２０Ｈ ｈ． Ｐｉｅｒｃｅ １−Ｓｔｅｐ（商標）Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（
３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン），Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔ．＃３４
０２２ ｉ． Ｈ₂ＳＯ₄，濃硫酸１ｍｌ（１８Ｎ）を３５ｍｌｄＨ₂Ｏに加える。

【０３００】 ｊ． ＴＲＩＳ ＨＣＬ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１５２−５；材料１
２１．１４ｇに６００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏを加え，ＨＣｌでｐＨを７．
５（または７．２）に調節し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで容量を１Ｌとする。

【０３０１】 ｋ． ＮａＣｌ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ２７１−１０，５Ｍ溶液を作成
する。

【０３０２】 ｌ． Ｔｗｅｅｎ−２０，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ３３７−５００ ｍ． Ｎａ₃ＶＯ₄，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ４５４−５０，材料１．８ｇ
に８０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏを加え，ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを１０
．０に調節し，電子レンジで沸騰させ，冷却し，ｐＨを調べ，ｐＨが１０．０で
安定となるまでこの工程を繰り返し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏを加えて総容量１０
０ｍｌとし，１ｍｌアリコートを作成し，−８０℃で保存する。

【０３０３】 ｎ． ＭｇＣｌ₂，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ３３−５００，１Ｍ溶液を作
成する。

【０３０４】 ｏ． ＨＥＰＥＳ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ３１０−５００，２００ｍ
ｌＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに，材料５９．６ｇを加え，ｐＨを７．５に調節し，総
容量２５０ｍｌとし，濾過滅菌する。

【０３０５】 ｐ． アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ−４５０３，材
料３０ｇに滅菌蒸留水を加えて総容量３００ｍｌとし，４℃で保存する。

【０３０６】 ｑ． ＴＢＳＴ緩衝液：１Ｌの目盛り付きシリンダー中の約９００ｍｌのｄＨ₂
Ｏに６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７６６ｇＮａＣｌを加え，溶解したとき，
ＨＣｌでｐＨを７．２に調節し，１．０ｍｌＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え，ｄ
Ｈ₂Ｏで総容量１Ｌとする。

【０３０７】 ｒ． ヤギアフィニティー精製抗体ウサギＩｇＧ（全分子），Ｃａｐｐｅｌ Ｃ
ａｔ．＃５５６４１ ｓ． 抗ｈ−Ｍｅｔ（Ｃ−２８）ウサギポリクローナルＩｇＧ抗体，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｔ．＃ＳＣ−１６１ ｔ． 過渡的にトランスフェクションされたＥＧＦＲ／Ｍｅｔキメラ細胞（ＥＭ
Ｒ）（Ｋｏｍａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８：２３８１−２３９
０（１９９３） ｕ． 炭酸ナトリウム緩衝液，（Ｎａ₂ＣＯ₄，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ４
９５）：材料１０．６ｇに８００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏを加え，溶解した
とき，ＮａＯＨでｐＨを９．６に調節し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総容量１Ｌと
し，濾過し，４℃で保存する。

【０３０８】方法 以下の工程は，特に記載のない限り，全て室温で実施する。ＥＬＩＳＡプレー
ト洗浄は全てＴＢＳＴで４回すすぐことにより行う。

【０３０９】ＥＭＲ溶解 この方法は，レセプター捕捉の開始の前夜または直前に実施することができる
。

【０３１０】 １． 溶解物を３７℃の水浴中で渦巻き動作により最後の結晶が消失するまで急
速に溶解する。

【０３１１】 ２． 細胞ペレットを１ｍＭＰＭＳＦを含有する１Ｘ ＨＮＴＧ中で溶解する。
１５ｃｍ皿の細胞あたり３ｍｌのＨＮＴＧを用いる。計算したＨＮＴＧ容量の１
／２を加え，管を１分間ボルテックスし，残量のＨＮＴＧを加え，さらに１分間
ボルテックスする。

【０３１２】 ３． 管の釣り合いをとり，１０，０００ｘｇ，１０分間，４℃で遠心分離する
。

【０３１３】 ４． 上清をプールし，アリコートを除去して蛋白質測定を行う。

【０３１４】 ５． プールしたサンプルをドライアイス／エタノール浴中で急速凍結する。こ
の工程は，溶解物を一夜保存するか蛋白質測定後に直ちに使用するかにかかわら
ず実施する。

【０３１５】 ６． 標準的ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法を用いて蛋白質測定を実施する（ＢＣ
Ａアッセイ試薬キット，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｔ．＃２３２２
５）。

【０３１６】ＥＬＩＳＡ法 １． Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを，総ウエル容量５０μｌ
，ウエルあたり５μｇの炭酸塩緩衝液中のヤギ抗ウサギ抗体でコーティングする
。４℃で一夜保存する。

【０３１７】 ２． プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合ヤギ抗ウサギ抗
体を除去する。

【０３１８】 ３． １５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら３０
分間インキュベートする。

【０３１９】 ４． ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過
剰の液体および気泡を除去する。

【０３２０】 ５． ウエル総容量１００μｌに対して，ＴＢＳＴ中で希釈したウサギ抗Ｍｅｔ
抗体をウエルあたり１μｇ加える。

【０３２１】 ６． 溶解物をＨＮＴＧで希釈する（９０μｇ溶解物／１００μｌ）。

【０３２２】 ７． 希釈した溶解物１００μｌを各ウエルに加える。６０分間振盪する。

【０３２３】 ８． ＴＢＳＴで４回洗浄する。ペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体お
よび気泡を除去する。

【０３２４】 ９． ウエルあたり５０μｌの１Ｘ溶解物緩衝液を加える。

【０３２５】 １０． 化合物／抽出物をポリプロピレン９６ウエルプレート中で１Ｘキナーゼ
緩衝液中で１：１０に希釈する。

【０３２６】 １１． 希釈した化合物５．５μｌをＥＬＩＳＡプレートウエルに移す。振盪し
ながら室温で２０分間インキュベートする。

【０３２７】 １２． ウエルあたり５．５μｌの６０μＭＡＴＰ溶液を加える。陰性対照には
ＡＴＰを加えない。振盪しながら９０分間インキュベートする。

【０３２８】 １３． ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて
過剰の液体および気泡を除去する。

【０３２９】 １４． ウエルあたり１００μｌのＲＣ２０（ブロッキング緩衝液中１：３００
０希釈）を加える。振盪しながら３０分間インキュベートする。

【０３３０】 １５． ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて
過剰の液体および気泡を除去する。

【０３３１】 １６． ウエルあたり１００μｌのＴｕｒｂｏ−ＴＭＢを加える。振盪しながら
３０−６０分間インキュベートする。

【０３３２】 １７． ウエルあたり１００μｌの１ＭＨ₂ＳＯ₄を加えて反応を停止させる。

【０３３３】 １８． Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイを読
む。試験フィルター＝４５０ｎｍ，参照フィルター＝４１０ｎｍ。

【０３３４】生化学的ｓｒｃアッセイ このアッセイを用いて，ビオチニル化ペプチドのリン酸化を読出しとして測定
することにより，ｓｒｃ蛋白質キナーゼ活性を決定する。

【０３３５】材料および試薬： ａ． ｓｒｃでトランスフォームした酵母（Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｗｏ
ｏｄＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ） ｂ． 細胞溶解物：ｓｒｃを発現する酵母細胞をペレット化し，水で１回洗浄し
，再びペレット化して，使用するまで−８０℃で保存する。

【０３３６】 ｃ． Ｎ−末端ビオチニル化ＥＥＥＹＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹは，当業
者に周知の標準的な方法により調製する。

【０３３７】 ｄ． ＤＭＳＯ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ｅ． ９６ウエルＥＬＩＳＡプレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥａｓｙ Ｗ
ａｓｈ，改変平底プレート，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔ．＃２５８０５−９６ ｆ． ＮＵＮＣ９６ウエルＶ−底ポリプロピレンプレート，化合物の希釈用：Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．＃Ａ−７２０９２ ｇ． Ｖｅｃａｓｔａｉｎ ＥＬＩＴＥ ＡＢＣ試薬：Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌ
ｉｎｇａｍｅ，ＣＡ ｈ． 抗ｓｒｃ（３２７）ｍａｂ：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
Ｐｏｍｂｅを用いて組換えＳｒｃを発現させる（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，
ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：２６２５−２６３４；Ｓｕｐｅｒｔｉ−
Ｆｕｒｇａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４：６００−
６０５）。Ｓ．Ｐｏｍｂｅ ＳＰ２００株（ｈ−ｓ ｌｅｕｌ．３２ ｕｒａ４ ａｄｅ２１０）を記載されたように増殖させ，酢酸リチウム法（Ｓｕｐｅｒｔ
ｉ−Ｆｕｒｇａ，（上掲））によりｐＲＳＰ発現プラスミドでトランスフォーム
する。細胞は１μＭチアミンの存在下で増殖させてｎｍｔｌプロモーターの発現
を抑制するか，またはチアミンの非存在下で増殖させて発現を誘導する。

【０３３８】 ｉ． モノクローナル抗ホスホチロシン，ＵＢＩ０５−３２１（代わりにＵＢ４
０を用いることができる） ｊ． Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡペルオキシダーゼ基質：Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ緩衝液溶液： ａ． ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水）：ＧＩＢＣＯ ＰＢＳ，ＧＩＢ
ＣＯ Ｃａｔ．＃４５０−１３００ＥＢ ｂ． ブロッキング緩衝液：５％無脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ），ＰＢＳ中 ｃ 炭酸塩緩衝液：Ｎａ₂ＣＯ₄，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｃａｔ．＃Ｓ４９５，１００
ｍＭ保存溶液を作成する。

【０３３９】 ｄ． キナーゼ緩衝液：１．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＭｇＣｌ₂；０．２ｍ
ｌ（１Ｍ保存溶液から）ＭｎＣｌ₂；０．２ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＤＴＴ；
５．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＨＥＰＥＳ；０．１ｍｌＴＸ−１００；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総容量１０ｍｌとする。

【０３４０】 ｅ． 溶解緩衝液：５．０ＨＥＰＥＳ（１Ｍ保存溶液から）；２．７４ｍｌＮａ
Ｃｌ（５Ｍ保存溶液から）；１０ｍｌグリセロール；１．０ｍｌＴＸ−１００；
０．４ｍｌＥＤＴＡ（１００ｍＭ保存溶液から）；１．０ｍｌＰＭＳＦ（１００
ｍＭ保存溶液から）；０．１ｍｌＮａ₃ＶＯ₄（０．１Ｍ保存溶液から）；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総容量１００ｍｌとする。

【０３４１】 ｆ． ＡＴＰ：Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ−７６９９，１０ｍＭ保存溶液（５．
５１ｍｇ／ｍｌ）を作成する。

【０３４２】 ｇ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１５２−５，６００ｍ
ｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに１２１．１４ｇの物質を加え，ＨＣｌでｐＨを７．
５に調節し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総容量１Ｌとする。

【０３４３】 ｈ． ＮａＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ２７１−１０，ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ₂Ｏで５Ｍ保存溶液を作成する。

【０３４４】 ｉ． Ｎａ₃ＶＯ₄：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ４５４−５０；８０ｍｌのＭ
ｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに，１．８ｇの物質を加える；ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨ
を１０．０に調節する；電子レンジ中で沸騰させる；冷却する；ｐＨを調べ，加
熱／冷却サイクルの後にｐＨが安定に維持されるまでｐＨ調節を繰り返す；Ｍｉ
ｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総容量１００ｍｌとする；１ｍｌのアリコートを作成し，−
８０℃で保存する。

【０３４５】 ｊ． ＭｇＣｌ₂：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ３３−５００，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで１Ｍ保存溶液を作成する。

【０３４６】 ｋ． ＨＥＰＥＳ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ３１０−５００；２００ｍ
ｌＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに，５９．６ｇの物質を加え，ｐＨを７．５に調節し，
ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総容量２５０ｍｌとし，濾過滅菌する（１Ｍ保存溶液）
。

【０３４７】 ｌ． ＴＢＳＴ緩衝液：ＴＢＳＴ緩衝液：９００ｍｌのｄＨ₂Ｏに，６．０５７
ｇＴＲＩＳおよび８．７６６ｇＮａＣｌを加える；ＨＣｌでｐＨを７．２に調節
し，１．０ｍｌＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加える；ｄＨ₂Ｏで総容量１Ｌとする
。

【０３４８】 ｍ． ＭｎＣｌ₂：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ８７−１００，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで１Ｍ保存溶液とする。

【０３４９】 ｎ． ＤＴＴ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１７２−５ ｏ． ＴＢＳ（ＴＲＩＳ緩衝化食塩水）：９００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに
，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７７７ｇＮａＣｌを加える；ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ₂Ｏで総容量を１Ｌとする。

【０３５０】 ｐ． キナーゼ反応混合物：アッセイプレート（１００ウエル）１枚あたりの量
：１．０ｍｌキナーゼ緩衝液，２００μｇＧＳＴ−ζ，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで
最終容量８．０ｍｌとする。

【０３５１】 ｑ． ビオチン標識ＥＥＥＹＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹ：水中のペプチド
保存溶液（１ｍＭ，２．９８ｍｇ／ｍｌ）を使用の直前に新たに作成する。

【０３５２】 ｒ． Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＥＬＩＴＥ ＡＢＣ試薬：１４ｍｌの作業用試薬
を調製するためには，１滴の試薬Ａを１５ｍｌＴＢＳＴに加え，管を数回逆さに
して混合する。次に１滴の試薬Ｂを加える。管を室温で環状振盪器に入れ，３０
分間混合する。

【０３５３】方法： ｓｒｃでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製 １． ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）
中の０．５μｇ／ウエルの抗ｓｒｃモノクローナル抗体で，４℃で一夜コーティ
ングする。

【０３５４】 ２． ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。

【０３５５】 ３． プレートをＰＢＳ中５％ミルク０．１５ｍｌで，室温で３０分間ブロッキ
ングする。

【０３５６】 ４． プレートをＰＢＳで５回洗浄する。

【０３５７】 ５． 溶解緩衝液中で希釈した，ｓｒｃでトランスフォームした酵母の溶解物を
１０μｇ／ウエルで加える（ウエルあたり総容量０．１ｍｌ）。（溶解物の量は
，バッチにより異なるであろう）。プレートを室温で２０分間振盪する。

【０３５８】ホスホチロシン抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製 １． ４Ｇ１０プレート：１００μｌＰＢＳ中の０．５μｇ／ウエルの４Ｇ１０
で４℃で一夜コーティングし，１５０μｌのＰＢＳ中５％ミルクで室温で３０分
間ブロッキングする。

【０３５９】 キナーゼアッセイ法 １． 未結合蛋白質をプレートから除去し，プレートをＰＢＳで５回洗浄する。

【０３６０】 ２． ウエルあたり０．０８ｍｌのキナーゼ反応混合物（ウエルあたり１０μｌ
の１０Ｘキナーゼ緩衝液および１０μＭ（最終濃度）のビオチン−ＥＥＥＹＥＥ
ＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹ，水中に希釈）を加える。

【０３６１】 ３． １０％ＤＭＳＯを含有する水中に希釈した１０μｌの化合物を加え，室温
で１５分間プレインキュベートする。

【０３６２】 ４． １０μｌ／ウエルの水中０．０５ｍＭＡＴＰ（最終５μＭＡＴＰ）を加え
ることにより，キナーゼ反応を開始させる。

【０３６３】 ５． ＥＬＩＳＡプレートを室温で１５分間振盪する。

【０３６４】 ６． ウエルあたり１０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えることによりキナーゼ反
応を停止させる。

【０３６５】 ７． ９０μｌの上清を，ブロッキングした４Ｇ１０コーティングＥＬＩＳＡプ
レートに移す。

【０３６６】 ８． 振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。

【０３６７】 ９． プレートをＴＢＳＴで５回洗浄する。

【０３６８】 １０． Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＥＬＩＴＥ ＡＢＣ試薬（１００μｌ／ウエル
）とともに室温で３０分間インキュベートする。

【０３６９】 １１． ウエルをＴＢＳＴで５回洗浄する。

【０３７０】 １２． Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢで発色させる。

【０３７１】生化学的ｌｃｋアッセイ このアッセイを用いて，ＧＳＴ−ζのリン酸化を読出しとして測定することに
より，ｌｃｋ蛋白質キナーゼ活性を決定する材料および試薬： ａ． ｌｃｋでトランスフォームした酵母：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ Ｐｏｍｂｅを用いて組換えＬｃｋを発現させる（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕ
ｒｇａ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：２６２５−２６３４；Ｓｕｐｅｒ
ｔｉ−Ｆｕｒｇａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：６
００−６０５）。Ｓ．Ｐｏｍｂｅ ＳＰ２００株（ｈ−ｓ ｌｅｕｌ．３２ ｕ
ｒａ４ ａｄｅ２１０）を記載されたように増殖させ，ｐＲＳＰ発現プラスミド
で酢酸リチウム法によりトランスフォームする（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，
（上掲））。細胞を１μＭチアミンの存在下で増殖させ，発現を誘導する。

【０３７２】 ｂ． 細胞溶解物：ｌｃｋを発現する酵母細胞をペレット化し，水で１回洗浄し
，再ペレット化し，使用するまで−８０℃で凍結保存する。

【０３７３】 ｃ． ＧＳＴ−ζ：細菌中で発現させるためのＧＳＴ−ζ融合蛋白質をコードす
るＤＮＡは，Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ，ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆ
ｒａｎｃｉｓｃｏのＡｒｔｈｕｒ Ｗｅｉｓｓから入手する。トランスフォーム
した細菌を振盪しながら２５℃で一夜増殖させる。ＧＳＴ−ζは，グルタチオン
アフィニティークロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｌａｍｅｄａ，Ｃ
Ａ）により精製する。

【０３７４】 ｄ． ＤＭＳＯ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ｅ． ９６ウエルＥＬＩＳＡプレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥａｓｙ Ｗ
ａｓｈ，改変平底プレート，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔ．＃２５８０５−９６ ｆ． ＮＵＮＣ９６ウエルＶ−底ポリプロピレンプレート，化合物希釈用：Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．＃ＡＳ−７２０９２ ｇ． 精製ウサギ抗ＧＳＴ抗血清：Ａｍｒａｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕ
ｓｔｒａｌｉａ）Ｃａｔ．＃９０００１６０５ ｈ． ヤギ抗ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰ：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃａｔ．＃Ｖ０１０
３０１ ｉ． ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）：Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ Ｃａｔ．＃
５２１５−００５−００３ ｊ． 抗Ｌｃｋ（３Ａ５）モノクローナル抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣａｔ＃ｓｃ−４３３ ｋ． 抗ホスホチロシンモノクローナル抗体ＵＢＩ０５−３２１（代わりにＵＢ
４０を用いてもよい）緩衝液溶液： ａ． ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水）１Ｘ溶液：ＧＩＢＣＯＰＢＳ，
ＧＩＢＣＯ Ｃａｔ．＃４５０−１３００ＥＢ ｂ． ブロッキング緩衝液：１００ｇＢＳＡ，１２．１ｇＴＲＩＳ−ｐＨ７．５
，５８．４４ｇＮａＣｌ，１０ｍｌＴｗｅｅｎ−２０，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで
総容量１Ｌとする。

【０３７５】 ｃ． 炭酸緩衝液：Ｎａ₂ＣＯ₄，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｃａｔ．＃Ｓ４９５；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ₂Ｏで１００ｍＭ溶液とする。

【０３７６】 ｄ． キナーゼ緩衝液：１．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液より）ＭｇＣｌ₂；０．２ｍ
ｌ（１Ｍ保存溶液より）ＭｎＣｌ₂；０．２ｍｌ（１Ｍ保存溶液より）ＤＴＴ；
５．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液より）ＨＥＰＥＳ；０．１ｍｌＴＸ−１００；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総容量１０ｍｌとする。

【０３７７】 ｅ． 溶解緩衝液：５．０ＨＥＰＥＳ（１Ｍ保存溶液より）；２．７４ｍｌＮａ
Ｃｌ（５Ｍ保存溶液より）；１０ｍｌグリセロール；１．０ｍｌＴＸ−１００；
０．４ｍｌＥＤＴＡ（１００ｍＭ保存溶液より）；１．０ｍｌＰＭＳＦ（１００
ｍＭ保存溶液より）；０．１ｍｌＮａ₃ＶＯ₄（０．１Ｍ保存溶液より）；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総容量１００ｍｌとする。

【０３７８】 ｆ． ＡＴＰ：Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ−７６９９，１０ｍＭ保存溶液（５．
５１ｍｇ／ｍｌ）を作成する。

【０３７９】 ｇ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１５２−５，６００ｍ
ｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに，１２１．１４ｇの物質を加え，ＨＣｌでｐＨを７
．５に調節し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総容量１Ｌとする。

【０３８０】 ｈ． ＮａＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ２７１−１０，ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ₂Ｏで５Ｍ保存溶液を作成する。

【０３８１】 ｉ Ｎａ₃ＶＯ₄：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ４５４−５０；８０ｍｌのＭｉ
ｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに，１．８ｇの物質を加える；ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを
１０．０に調節する；電子レンジ中で沸騰させる；冷却する；ｐＨを調べ，加熱
／冷却サイクルの後にｐＨが安定となるまでｐＨ調節を繰り返す；ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ₂Ｏで総容量１００ｍｌとする；１ｍｌのアリコートを作成し，−８０℃で
保存する。

【０３８２】 ｊ． ＭｇＣｌ₂：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ３３−５００，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで１Ｍ保存溶液を作成する。

【０３８３】 ｋ． ＨＥＰＥＳ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ３１０−５００；２００ｍ
ｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに，５９．６ｇの物質を加え，ｐＨを７．５に調節し
，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで総容量２５０ｍｌとし，濾過滅菌する（１Ｍ保存溶液
）。

【０３８４】 ｌ． アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ４５０３；１５
０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに，３０ｇの物質を加え，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで
総容量３００ｍｌとし，０．２２μｍフィルターを通して濾過し，４℃で保存す
る。

【０３８５】 ｍ． ＴＢＳＴ緩衝液：９００ｍｌのｄＨ₂Ｏに，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび
８．７６６ｇＮａＣｌを加える；ＨＣｌでｐＨを７．２に調節する；１．０ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加える；ｄＨ₂Ｏで総容量１Ｌとする。

【０３８６】 ｎ． ＭｎＣｌ₂：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ８７−１００，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで１Ｍ保存溶液を作成する。

【０３８７】 ｏ． ＤＴＴ；Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１７２−５ ｐ． ＴＢＳ（ＴＲＩＳ緩衝化食塩水）：９００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏに
，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７７７ｇＮａＣｌを加える；ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ₂Ｏで総容量１Ｌとする。

【０３８８】 ｑ キナーゼ反応混合物：アッセイプレート（１００ウエル）１枚あたりの量：
１．０ｍｌキナーゼ緩衝液，２００μｇＧＳＴ−ζ，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏで最
終容量８．０ｍｌとする。

【０３８９】方法： ＬｃｋでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製 １． １００μｌの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中のヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ２．０μｇ／ウエルで，４℃で一夜コーティングする。

【０３９０】 ２． ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。

【０３９１】 ３． プレートを０．１５ｍｌのブロッキング緩衝液で室温で３０分間ブロッキ
ングする。

【０３９２】 ４． プレートをＰＢＳで５回洗浄する。

【０３９３】 ５． ０．１ｍｌＰＢＳ中の抗ｌｃｋ（モノクローナル抗体３Ａ５）を０．５μ
ｇ／ウエルで室温で１−２時間加える。

【０３９４】 ６． プレートをＰＢＳで５回洗浄する。

【０３９５】 ７． 溶解緩衝液中に希釈した，ｌｃｋでトランスフォームした酵母の溶解物を
２０μｇ／ウエルで加える（ウエルあたり総容量０．１ｍｌ）。プレートを４℃
で一夜振盪して活性の喪失を防止する。

【０３９６】ホスホチロシン抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製 １． ＵＢ４０プレート：１００μｌＰＢＳ中の１．０μｇ／ウエルＵＢ４０を
４℃で一夜加え，１５０μｌのブロッキング緩衝液で少なくとも１時間ブロッキ
ングする。

【０３９７】キナーゼアッセイ法 １． 未結合蛋白質をプレートから除去し，プレートをＰＢＳで５回洗浄する。

【０３９８】 ２． ウエルあたり０．０８ｍｌのキナーゼ反応混合物（ウエルあたり，水で希
釈した１０μｌの１０Ｘキナーゼ緩衝液および２μｇＧＳＴ−ζを含む）を加え
る。

【０３９９】 ３． １０％ＤＭＳＯを含有する水中で希釈した化合物１０μｌを加え，室温で
１５分間プレインキュベートする。

【０４００】 ４． 水中０．１ｍＭＡＴＰ（最終濃度１０μＭＡＴＰ）を１０μｌ／ウエルで
加えることによりキナーゼ反応を開始させる。

【０４０１】 ５． ＥＬＩＳＡプレートを室温で６０分間振盪する。

【０４０２】 ６． ウエルあたり１０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えることによりキナーゼ反
応を停止させる。

【０４０３】 ７． ９０μｌの上清を，上述のＢ節からのブロッキングした４Ｇ１０コーティ
ングＥＬＩＳＡプレートに移す。

【０４０４】 ８． 振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。

【０４０５】 ９． プレートをＴＢＳＴで５回洗浄する。

【０４０６】 １０． １００μｌＴＢＳＴ中１：５０００に希釈したウサギ抗ＧＳＴ抗体とと
もに室温で３０分間インキュベートする。

【０４０７】 １１． ウエルをＴＢＳＴで５回洗浄する。

【０４０８】 １２． １００μｌのＴＢＳＴ中１：２０，０００に希釈したヤギ抗ウサギ−Ｉ
ｇＧ−ＨＲＰとともに室温で３０分間インキュベートする。

【０４０９】 １３． ウエルをＴＢＳＴで５回洗浄する。

【０４１０】 １４． Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢで発色させる。

【０４１１】ＲＡＦのリン酸化機能を測定するアッセイ 以下のアッセイは，ＲＡＦにより触媒される，その標的蛋白質ＭＥＫならびに
ＭＥＫの標的であるＭＡＰＫのリン酸化の量を測定する。ＲＡＦ遺伝子配列は，
Ｂｏｎｎｅｒら（１９８５，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４００−
１４０７）に記載されており，多くの遺伝子配列データバンクにおいて容易にア
クセス可能である。核酸ベクターの構築および本発明のこの部分において用いら
れる細胞株は，Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８８５５−８８５９）にすべて記載されている。

【０４１２】材料および試薬 １． Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞；ＧＩＢＣ
Ｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ２． ＲＩＰＡ緩衝液：２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣ１ｐＨ７．４，１３７ｍＭＮａ
Ｃｌ，１０％グリセロール，１ｍＭＰＭＳＦ，５ｍｇ／Ｌアプロテニン，０．５
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００； ３． チオレドキシン−ＭＥＫ融合蛋白質（Ｔ−ＭＥＫ）：Ｔ−ＭＥＫ 発現およびアフィニティークロマトグラフィーによる精製は，製造元の方法に従
って実施する。カタログ＃Ｋ３５０−０１およびＲ３５０−４０，Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ

【０４１３】 ４． Ｈｉｓ−ＭＡＰＫ（ＥＲＫ２）；Ｈｉｓ−タグＭＡＰＫは，Ｈｉｓ−ＭＡ
ＰＫをコードするｐＵＣ１８ベクターによりトランスフォームしたＸＬ１ Ｂｌ
ｕｅ細胞中で発現させる。Ｈｉｓ−ＭＡＰＫはＮｉ−アフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製する。Ｃａｔ＃２７−４９４９−０１，Ｐｈａｒｍａｃｉａ
，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，本明細書に記載されたとおり。

【０４１４】 ５． ヤギ抗マウスＩｇＧ：Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅ
ｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ．カタログ，＃５１５−００６−００８，Ｌｏｔ＃２８
５６３ ６． ＲＡＦ−１蛋白質キナーゼ特異的抗体：ＵＲＰ２６５３，ＵＢＩ ７． コーティング緩衝液：ＰＢＳ；リン酸緩衝化食塩水，ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ８． 洗浄緩衝液：ＴＢＳＴ−５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＬｐＨ７．２，１５０ｍ
ＭＮａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ９． ブロッキング緩衝液：ＴＢＳＴ，０．１％エタノールアミンｐＨ７．４ １０． ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ １１． キナーゼ緩衝液（ＫＢ）：２０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．２）
，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１ｍＭＰＭＳＦ，５
ｍｇ／Ｌアプロテニン，７５ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム，０．５ＭＭＤ
ＴＴおよび１０ｍＭＭｇＣｌ₂ １２． ＡＴＰ混合物：ｌ００ｍＭＭｇＣｌ₂，３００ｍＭＡＴＰ，１０ｍＣｉ
γ³³ＰＡＴＰ（ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ）／ｍＬ １３ 停止溶液：１％リン酸；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ １４． Ｗａｌｌａｃリン酸セルロースフィルターマット；Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕ
ｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌａｎｄ １５． フィルター洗浄溶液：１％リン酸，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ
ｈ，ＰＡ １６． Ｔｏｍｔｅｃプレート回収機，Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌ
ａｎｄ １７． Ｗａｌｌａｃベータプレートリーダー＃１２０５，Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕ
ｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌａｎｄ １８． 化合物用に，ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート，Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃ＡＳ−７２０９２方法 以下のすべての工程は，特に指示しないかぎり，室温で実施する。

【０４１５】 １． ＥＬＩＳＡプレートコーティング：ＥＬＩＳＡウエルを１００ｍｌのヤギ
抗マウスアフィニティー精製抗血清（１ｍｇ／ｌ００ｍＬコーティング緩衝液）
で４℃で一夜コーティングする。ＥＬＩＳＡプレートは，４℃で保存したとき，
２週間使用することができる。

【０４１６】 ２． プレートを逆さにして液体を除去する。１００ｍＬのブロッキング溶液を
加え，３０分間インキュベートする。

【０４１７】 ３． ブロッキング溶液を除去し，洗浄緩衝液で４回洗浄する。プレートをペー
パータオル上で軽くたたいて過剰の液体を除去する。

【０４１８】 ４． 各ウエルに１ｍｇのＲＡＦ−１特異的抗体を加え，１時間インキュベート
する。工程３に記載したように洗浄する。

【０４１９】 ５． ＲＡＳ／ＲＡＦで感染させたＳｆ９細胞からの溶解物を解凍し，ＴＢＳＴ
で１０ｍｇ／１００ｍＬに希釈する。１０ｍｇの希釈溶解物をウエルに加え，１
時間インキュベートする。インキュベーションの間，プレートを振盪する。陰性
対照には溶解物を加えない。各ウイルスにつきＭＯＩ５で細胞を組換えバキュロ
ウイルスで感染させた後，ＲＡＳ／ＲＡＦで感染させたＳｆ９昆虫細胞からの溶
解物を調製し，４８時間後に回収する。細胞をＰＢＳで１回洗浄し，ＲＩＰＡ緩
衝液中で溶解する。不溶物質を遠心分離（５分間，１００００ｘｇ）により除去
する。溶解物のアリコートをドライアイス／エタノール中で凍結し，使用まで−
８０℃で保存する。

【０４２０】 ６． 非結合物質を除去し，上に簡単に述べたように洗浄する（工程３）。

【０４２１】 ７． ウエルあたり２ｍｇのＴ−ＭＥＫおよび２ｍｇのＨｉｓ−ＭＡＥＰＫを加
え，キナーゼ緩衝液で容量を４０ｍＬに調節する。細胞抽出物からＴ−ＭＥＫお
よびＭＡＰＫを精製する方法は，本明細書の実施例に記載される。

【０４２２】 ８． 化合物（保存溶液１０ｍｇ／ｍＬＤＭＳＯ）または抽出物をＴＢＳＴプラ
ス１％ＤＭＳＯ中であらかじめ２０倍に希釈する。５ｍＬのあらかじめ希釈した
化合物／抽出物を工程６に記載したウエルに加える。２０分間インキュベートす
る。対照には薬剤を加えない。

【０４２３】 ９． ５ｍＬＡＴＰミックスを加えることによりキナーゼ反応を開始する。イン
キュベーションの間，ＥＬＩＳＡプレート振盪器でプレートを振盪する。

【０４２４】 １０． ６０分後，３０ｍＬの停止溶液を各ウエルに加えることによりキナーゼ
反応を停止する。

【０４２５】 １１． ホスホセルロースマットおよびＥＬＩＳＡプレートをＴｏｍｔｅｃプレ
ート回収機中に置く。フィルターを回収し，フィルター洗浄溶液で製造元の推奨
にしたがってこれを洗浄する。フィルターマットを乾燥する。フィルターマット
を密封し，ケース中に置く。ケースを放射活性検出装置に入れ，フィルターマッ
ト上の放射活性リンを定量する。

【０４２６】 あるいは，アッセイプレートの個々のウエルからの４０ｍＬのアリコートを，
ホスホセルロースフィルターマットの対応する位置に移すことができる。フィル
ターを風乾した後，フィルターをトレイ中に置く。トレイを穏やかにロックし，
洗浄溶液を１５分間ごとに１時間交換する。フィルターマットを風乾する。フィ
ルターマットを密封し，サンプル中の放射活性リンを測定するのに適当なケース
中に入れる。ケースを検出装置に入れ，フィルターマット上の放射活性リンを定
量する。

【０４２７】ＣＤＫ２／サイクリンＡ−阻害アッセイ このアッセイは，外部基質中のＣＤＫ２の蛋白質キナーゼ活性を測定する。

【０４２８】試薬： Ａ． 緩衝液Ａ（８０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．２），４０ｍＭＭｇＣｌ₂）：４
．８４ｇＴｒｉｓ（Ｆ．Ｗ．＝１２１．１ｇ／ｍｏｌ），４．０７ｇＭｇＣｌ₂
（Ｆ．Ｗ．＝２０３．３１ｇ／ｍｏｌ），５００ｍｌＨ₂Ｏ中に溶解。ＨＣｌで
ｐＨを７．２に調節する。

【０４２９】 Ｂ． ヒストンＨ１溶液（０．４５ｍｇ／ｍｌヒストンＨ１および２０ｍＭＨＥ
ＰＥＳ（ｐＨ７．２）：１１．１１１ｍｌの２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．２（４
７７ｍｇＨＥＰＥＳ（Ｆ．Ｗ．＝２３８．３ｇ／ｍｏｌ））中の５ｍｇヒストン
Ｈ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ），１００ｍｌｄｄＨ₂Ｏ中に
溶解する。１ｍｌアリコートとして−８０℃で保存する。

【０４３０】 Ｃ． ＡＴＰ溶液（６０μＭＡＴＰ，３００μｇ／ｍｌＢＳＡ，３ｍＭＤＴＴ）
：１２０μｌの１０ｍＭＡＴＰ，６００μｌの１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡで２０ｍｌ
とし，１ｍｌアリコートとして−８０℃で保存する。

【０４３１】 Ｄ． ＣＤＫ２溶液：ｃｄｋ２／サイクリンＡ，１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．
２，２５ｍＭＮａＣｌ，０．５ｍＭＤＴＴ，１０％グリセロール中。９μｌアリ
コートとして−８０℃で保存する。

【０４３２】プロトコル １． 阻害剤の溶液を，ｄｄＨ₂Ｏ／１５％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）で所望の最終ア
ッセイ濃度の３倍で調製する。

【０４３３】 ２． ２０μｌの阻害剤をポリプロピレンの９６ウエルプレートのウエルに加え
る（または陽性および陰性対照については２０μｌの１５％ＤＭＳＯ）。

【０４３４】 ３． ヒストンＨ１溶液（１ｍｌ／プレート），ＡＴＰ溶液（１ｍｌ／プレート
プラス陰性対照について１アリコート），およびＣＤＫ２溶液（９μｌ／プレー
ト）を解凍する。ＣＤＫ２は使用まで氷上に保存する。ＣＤＫ２溶液を適当にア
リコートに分けて，凍結解凍サイクルの繰り返しを避ける。

【０４３５】 ４． ９μｌＣＤＫ２溶液を２．１ｍｌ緩衝液Ａ（プレートあたり）で希釈し，
混合し，２０μｌを各ウエルに加える。

【０４３６】 ５． １ｍｌヒストンＨ１溶液を１ｍｌＡＴＰ溶液（プレートあたり）と混合し
て，１０ｍｌねじ蓋管に入れる。γ³³Ｐ ＡＴＰを０．１５μＣｉ／２０μｌ（
アッセイ中，０．１５μＣｉ／ウエル）の濃度となるよう加える。ＢＳＡの泡を
避けるよう注意深く混合する。２０μｌを適当なウエルに加える。プレートをプ
レート振盪器上で混合する。陰性対照については，等量の２０ｍＭＨＥＰＥＳ（
ｐＨ７．２）とＡＴＰ溶液とを混合し，γ³³Ｐ ＡＴＰを０．１５μＣｉ／２０
μｌ溶液の濃度となるように加える。２０μｌを適当なウエルに加える。

【０４３７】 ６． 反応を６０分間進行させる。

【０４３８】 ７． ３５μｌの１０％ＴＣＡを各ウエルに加える。プレートをプレート振盪器
上で混合する。

【０４３９】 ８． ４０μｌの各サンプルをＰ３０フィルターマットの升目上にスポットする
。マットを乾燥させる（約１０−２０分間）。

【０４４０】 ９． フィルターマットを２５０ｍｌの１％リン酸（ｄｄＨ₂Ｏ １ｌあたり１
０ｍｌリン酸）で４Ｘ１０分間洗浄する。

【０４４１】 １０． フィルターマットをベータプレートリーダーで計数する。

【０４４２】細胞／生物学的アッセイ ＰＤＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬 ： （１） ＰＤＧＦ：ヒトＰＤＧＦ Ｂ／Ｂ；１２７６−９５６，Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （２） ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中，Ｃａｔ．Ｎｏ
．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
（３） ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可），Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２
２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （４） 抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲート化したマウス
モノクローナル抗体，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （５） ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），即使用可，Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ （６） ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４（Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｒ
ｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ） （７） アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：画分Ｖ粉末；Ａ−８５５１，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ （８）株ヒトＰＤＧＦ−Ｒを発現するよう遺伝子工学処理された３Ｔ３細胞プロトコル （１） 細胞をＤＭＥＭ，１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎ中で，９６ウエルプレート
に８０００細胞／ウエルで播種する。細胞を５％ＣＯ₂中で３７℃で一夜インキ
ュベートする。

【０４４３】 （２） ２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳ ＤＭ
ＥＭ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。

【０４４４】 （３） 第３日に，リガンド（ＰＤＧＦ，３．８ｎＭ，ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳ
Ａ中で調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには，無
血清ＤＭＥＭおよび０．１％ＢＳＡのみを加える；陽性対照細胞には，リガンド
（ＰＤＧＦ）を加えるが試験化合物を加えない。試験化合物は，９６ウエルプレ
ート中で無血清ＤＭＥＭ中でリガンドとともに調製し，連続希釈して７種類の試
験濃度とする。

【０４４５】 （４） リガンド活性化の２０時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ，０．
１％ＢＳＡ中１：１００）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）とと
もに１．５時間インキュベートする。

【０４４６】 （５） 標識試薬とともにインキュベーションした後，デカントし，逆さにした
プレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより，培地を除去する。Ｆｉｘ
Ｄｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室
温で４５分間インキュベートする。

【０４４７】 （６） デカントし，逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくこと
により，ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ブロッキング溶液としてミルク
を加え（ＰＢＳ中５％脱水ミルク，２００μｌ／ウエル），プレートをプレート
振盪器上で室温で３０分間インキュベートする。

【０４４８】 （７） デカントによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄
する。抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中１：１００希釈）を加え
（１００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室温で９０分間インキ
ュベートする。

【０４４９】 （８） デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲー
トをよく除去し，プレートを逆さにしてペーパータオル上で軽くたたくことによ
り乾燥させる。

【０４５０】 （９） ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温
で２０分間，発色が光度計による検出に十分となるまでインキュベートする。

【０４５１】 （１０） サンプルの吸光度は，Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダ
ーで４１０ｎｍで測定する（参照波長として４９０ｎｍで読みとるフィルターを
用いる"二波長"モード）。

【０４５２】ＥＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬 （１） ＥＧＦ：マウスＥＧＦ，２０１；Ｔｏｙｏｂｏ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａ
ｐａｎ （２） ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中，Ｃａｔ．Ｎｏ
．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
（３） ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可），Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２
２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （４） 抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲート化したマウス
モノクローナル抗体，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （５） ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），即使用可，Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ （６） ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４（Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｒ
ｅｄｗｏｏｄＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ） （７） アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：画分Ｖ粉末；Ａ−８５５１，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ （８） ヒトＥＧＦ−Ｒを発現するよう遺伝子工学処理された３Ｔ３細胞株プロトコル （１） 細胞をＤＭＥＭ中１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎで，９６ウエルプレート中
で８０００細胞／ウエルで播種する。細胞を５％ＣＯ₂中で３７℃で一夜インキ
ュベートする。

【０４５３】 （２） ２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳ ＤＭ
ＥＭ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。

【０４５４】 （３） 第３日に，リガンド（ＥＧＦ，２ｎＭ，ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ中で
調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには０．１％Ｂ
ＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを加える。陽性対照細胞には，リガンド（ＥＧＦ
）を加えるが試験化合物を加えない。試験化合物は，９６ウエルプレート中で，
無血清ＤＭＥＭ中でリガンドとともに調製し，連続希釈して７種類の試験濃度と
する。

【０４５５】 （４） リガンド活性化の２０時間後，希釈したＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ中
１：１００，０．１％ＢＳＡ）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）
とともに１．５時間インキュベートする。

【０４５６】 （５） 標識試薬とともにインキュベートした後，デカントして逆さにしたプレ
ートをペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎ
ａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器で室温で４５
分間インキュベートする。

【０４５７】 （６） デカントして逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくこと
によりＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ブロッキング溶液としてミルクを
加え（ＰＢＳ中５％脱水ミルク，２００μｌ／ウエル），プレートをプレート振
盪器で室温で３０分間インキュベートする。

【０４５８】 （７） デカントによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄
する。抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ中１：１００希釈，１％ＢＳＡ）を加え
（１００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器で室温で９０分間インキュ
ベートする。

【０４５９】 （８） デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲー
トをよく除去し，プレートを逆さにしてペーパータオル上で軽くたたくことによ
り乾燥させる。

【０４６０】 （９） ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温
で２０分間，発色が高度計検出に十分となるまでインキュベートする。

【０４６１】 （１０） サンプルの吸光度は，Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダ
ーで，４１０ｎｍ（参照波長として４９０ｎｍを読むフィルターを用いる"二波
長"モード”で）測定する。

【０４６２】ＥＧＦ−誘導性Ｈｅｒ２−推進ＢｒｄＵ取り込み 材料および試薬 ： （１） ＥＧＦ：マウスＥＧＦ，２０１；Ｔｏｙｏｂｏ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａ
ｐａｎ （２）ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中，Ｃａｔ．Ｎｏ．
１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （３） ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可），Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２
２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （４） 抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲート化したマウス
モノクローナル抗体，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （５） ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），即使用可，Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ （６） ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４，自社製。

【０４６３】 （７） アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：画分Ｖ粉末；Ａ−８５５１，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ （８） ＥＧＦ−Ｒの細胞外ドメインおよびＨｅｒ２の細胞内ドメインを有する
キメラレセプターを発現するよう遺伝子工学処理された３Ｔ３細胞株プロトコル ： （１） 細胞をＤＭＥＭ，１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎ中で９６−ウエルプレート
に８０００細胞／ウエルで播種する。細胞を３７℃で５％ＣＯ₂中で一夜インキ
ュベートする。

【０４６４】 （２） ２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳ ＤＭ
ＥＭ，０．１％ＢＳＡを含む）中で２４時間血清飢餓とする。

【０４６５】 （３） 第３日に，リガンド（ＥＧＦ＝２ｎＭ，０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ
中で調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには無血清
ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡのみを加える；陽性対照細胞にはリガンド（ＥＧＦ）
を加えるが試験化合物は加えない。試験化合物は，無血清ＤＭＥＭ中でリガンド
とともに９６ウエルプレート中で調製し，連続希釈して７種類の試験濃度とする
。

【０４６６】 （４） リガンド活性化の２０時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ中１：
１００，０．１％ＢＳＡ）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）とと
もに１．５時間インキュベートする。

【０４６７】 （５） 標識試薬とともにインキュベートした後，デカントして逆さにしたプレ
ートをペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎ
ａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートを室温でプレート振盪器で４５
分間インキュベートする。

【０４６８】 （６） デカントし，逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくこと
により，ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ブロッキング溶液としてミルク
を加え（ＰＢＳ中５％脱水ミルク，２００μｌ／ウエル），プレートをプレート
振盪器上で室温で３０分間インキュベートする。

【０４６９】 （７） デカントによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄
する。抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中１：１００希釈）を加え
（１００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で９０分間室温でインキ
ュベートする。

【０４７０】 （８） デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲー
トをよく除去し，プレートを逆さにしてペーパータオル上で軽くたたくことによ
り乾燥させる。

【０４７１】 （９） ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温
で２０分間，発色が光度計検出に十分となるまでインキュベートする。

【０４７２】 （１０） サンプルの吸光度を，Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダ
ーで，４１０ｎｍで（参照波長として４９０ｎｍで読むフィルターを用いる"二
波長"モードで）測定する。

【０４７３】ＩＧＦ１−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬 ： （１） ＩＧＦ１リガンド：ヒト，組換え；Ｇ５１１，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒ
ｐ，ＵＳＡ （２） ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中，Ｃａｔ．Ｎｏ
．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
（３） ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可），Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２
２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （４） 抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲート化したマウス
モノクローナル抗体，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （５） ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），即使用可，Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ （６） ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４（Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｒ
ｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ） （７） アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：画分Ｖ粉末；Ａ−８５５１，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ （８） ヒトＩＧＦ−１レセプターを発現するよう遺伝子工学処理された３Ｔ３
細胞株プロトコル ： （１） 細胞をＤＭＥＭ，１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎ中で９６−ウエルプレート
に８０００細胞／ウエルで播種する。細胞を５％ＣＯ₂中，３７℃で一夜インキ
ュベートする。

【０４７４】 （２） ２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳ ＤＭ
ＥＭ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする （３） 第３日に，リガンド（ＩＧＦ１＝３．３ｎＭ，０．１％ＢＳＡを含むＤ
ＭＥＭ中で調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには
０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを加える。陽性対照細胞にはリガンド
（ＩＧＦ１）を加えるが試験化合物を加えない。試験化合物は，９６ウエルプレ
ートで無血清ＤＭＥＭ中でリガンドとともに調製し，連続希釈して７種類の試験
濃度とする。

【０４７５】 （４） リガンド活性化の１６時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ，０．
１％ＢＳＡ中１：１００）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）とと
もに１．５時間インキュベートする。

【０４７６】 （５） 標識試薬とともにインキュベーションした後，デカントし，逆さにした
プレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤ
ｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室温
で４５分間インキュベートする。

【０４７７】 （６） デカントし，逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくこと
によりＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ブロッキング溶液としてミルクを
加え（ＰＢＳ中５％脱水ミルク，２００μｌ／ウエル），プレートをプレート振
盪器上で室温で３０分間インキュベートする。

【０４７８】 （７） ブロッキング溶液をデカントにより除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄
する。抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中１：１００希釈）を加え
（１００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室温で９０分間インキ
ュベートする。

【０４７９】 （８） デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲー
トをよく除去し，プレートを逆さにしペーパータオル上で軽くたたくことにより
乾燥する。

【０４８０】 （９） ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器上で室
温で２０分間，発色が光度計検出に十分となるまでインキュベートする。

【０４８１】 （１０） サンプルの吸光度は，Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダ
ーで，４１０ｎｍ（参照波長として４９０ｎｍで読むフィルターを用いる"二波
長"モード）で測定する。

【０４８２】ＦＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ このアッセイは，外来性ＦＧＦレセプターを発現する３Ｔｃ７／ＥＧＦｒ細胞
におけるＦＧＦ誘導性ＤＮＡ合成を測定する。

【０４８３】材料および試薬： １．ＦＧＦ：ヒトＦＧＦ２／ｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｎｏ．１３２５６
−０２９） ２．ＢｒｄＵ標識試薬，（１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４），Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＣａｔＮｏ．１６４７２２９） ３．Ｆｉｘｄｅｎａｔ固定溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃ
ａｔ Ｎｏ．１６４７２２９） ４．抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ（ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノク
ローナル抗体，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍＣａｔ：．Ｎｏ．１６
４７２２９） ５．ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍＣａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９） ６．ＰＢＳ洗浄溶液，ｐＨ７．４（Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ．） ７．アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），画分Ｖ粉末（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−８５５１）方法 １．３Ｔ３遺伝子工学処理細胞株：３Ｔ３ｃ７／ＥＧＦｒ ２．細胞は，ＤＭＥＭ，１０％ＣＳおよび２ｍＭＧｌｎで，９６ウエルプレート
に８，０００細胞／ウエルで播種する。５％ＣＯ₂中で３７℃で２４時間インキ
ュベートする。

【０４８４】 ３．２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に，無血清培地（０％ＤＭＥＭ，０
．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。

【０４８５】 ４．リガンド（ＦＧＦ２（ＤＭＥＭ中１．５ｎＭ，０．１％ＢＳＡ）および試験
化合物を同時に加える。陰性対照ウエルには０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥ
Ｍのみを加え，陽性対照ウエルにはＦＧＦ２リガンドを加えるが試験化合物は加
えない。試験化合物は，９６ウエルプレート中で無血清ＤＭＥＭ中でリガンドと
ともに調製し，連続希釈して７種類の試験濃度とする。

【０４８６】 ５．２０時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬を細胞に加え（１：１００ＢｒｄＵ：Ｄ
ＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ，最終濃度１０μＭ），１．５時間インキュベートする
。

【０４８７】 ６．培地をデカントする。ペーパータオルで痕跡量の物質を除去する。ＦｉｘＤ
ｅｎａｔを加え（５０μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温で４５分間インキ
ュベートする。

【０４８８】 ７．Ｆｉｘｄｅｎａｔ溶液を除去する。ブロッキング溶液（ＰＢＳ中５％脱水ミ
ルク（２００μｌ／ウエル））を加え，プレート振盪器で室温で３０分間インキ
ュベートする。

【０４８９】 ８．ブロッキング溶液をデカントし，ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。抗Ｂｒｄ
Ｕ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ中１：１００希釈，０．１％ＢＳＡ）を加え，プレート
振盪器で室温で９０分間インキュベートする。

【０４９０】 ９．抗体コンジュゲートをデカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐ。ペーパー
タオル上で逆さにして軽くたたくことによりプレートを乾燥する。

【０４９１】 １０．ＴＭＢ溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温で２０
分間，発色が光度検出に十分となるまでインキュベートする。

【０４９２】 １１．Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダーで"二波長"モードを用い
，４９０ｎＭのフィルターを用いて，４１０ｎＭで吸光度を測定する。

【０４９３】生化学的ＥＧＦＲアッセイ このアッセイは，ＥＬＩＳＡを用いてＥＧＦＲのインビトロキナーゼ活性を測
定する材料および試薬 １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥｌｉｓａプレート（ＣｏｒｎｉｎｇカタログＮ
ｏ．２５８０５−９６） ２．ＳＵＭ０１モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌ
ａｂ，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．） ３．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水，ＧｉｂｃｏカタログＮｏ．４５０
−１３００ＥＢ） ４．ＴＢＳＴ緩衝液

【表５】 ５．ブロッキング緩衝液：

【表６】 ６．Ａ４３１細胞溶解物（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｌａｂ，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．
）７．ＴＢＳ緩衝液：

【表７】 ８．ＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ

【表８】 ９．アデノシン−５'−三リン酸（ウマ筋肉からのＡＴＰ，Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ
．Ｎｏ．Ａ−５３９４） ｄＨ₂Ｏ中１．０ｍＭ溶液を調製する。この試薬は使用の直前に作成し，氷上に
保存する。

【０４９４】 １０．ＭｎＣｌ₂ ｄＨ₂Ｏ中１．０Ｍの保存溶液を調製する。

【０４９５】 １１．ＡＴＰ／ＭｎＣｌ₂リン酸化混合物

【表９】 この試薬は，使用直前に調製し，氷上に保存しなければならない。

【０４９６】 １２．ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＳ−７２０９２） １３．エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） ｄＨ₂Ｏ中２００ｍＭの作業溶液を調製する。１０ＮＮａＯＨでｐＨ８．０に調
製する。

【０４９７】 １４．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
Ｌａｂ，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．） １５．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃ
ｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＬＴ０４０４） １６．ＡＢＴＳ（２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−
硫酸），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−１８８８）

【表１０】 最初に，約９００ｍｌのｄＨ₂Ｏ中で２つの成分を混合する。リン酸でｐＨを４
．０に調製する。ＡＢＴＳを加え，カバーし，約０．５時間放置し，濾過する。
溶液は使用前まで暗所で４℃で保存すべきである。

【０４９８】 １７．過酸化水素３０％溶液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ３２５） １８．ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂ １５ｍｌのＡＢＴＳ溶液と２．０μｌのＨ₂Ｏ₂を混合する。使用の５分前に調製
する。

【０４９９】 １９．０．２ＭＨＣｌ方法 １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをウエルあたり１００μｌＰ
ＢＳ中０．５μｇのＳＵＭ０１でコーティングし，４℃で一夜保存する。

【０５００】 ２．プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合ＳＵＭ０１をウエ
ルから除去する。ｄＨ₂Ｏで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽く
たたいて過剰の液体を除去する。

【０５０１】 ３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で
３０分間インキュベートする。

【０５０２】 ４．プレートを脱イオン水で３回，次にＴＢＳＴで１回洗浄する。プレートをペ
ーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体および気泡を除去する。

【０５０３】 ５．溶解物をＰＢＳ中で希釈する（７μｇ溶解物／１００μｌＰＢＳ）。

【０５０４】 ６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で６０分間振盪する。

【０５０５】 ７．上述の工程４に記載したようにプレートを洗浄する。

【０５０６】 ８．１２０μｌのＴＢＳを，捕捉ＥＧＦＲを含有するＥＬＩＳＡプレートに加え
る。

【０５０７】 ９．試験化合物を９６ウエルポリプロピレンプレート中でＴＢＳで１：１０に希
釈する（すなわち，１０μｌ化合物＋９０μｌＴＢＳ）。

【０５０８】 １０．１３．５μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートに加える。対照ウエ
ルには１３．５μｌＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯを加える（ウエルには試験化合物を
加えない）。

【０５０９】 １１．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。

【０５１０】 １２．１５μｌリン酸化混合物を陰性対照ウエルを除くすべてのウエルに直接加
える。陰性対照ウエルにはＡＴＰ／ＭｎＣｌ₂を加えない。（最終ウエル容量は
約１５０μｌ，各ウエル中３μＭＡＴＰ／５ｍＭＭｎＣｌ₂の最終濃度となるは
ずである）。振盪しながら５分間インキュベートする。

【０５１１】 １３．５分後，１６．５μｌの２００ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を各ウエルに
加えることにより反応を停止させ，振盪を続ける。ＥＤＴＡを加えた後，１分間
振盪する。

【０５１２】 １４．脱イオン水で４回，ＴＢＳＴで２回洗浄する。

【０５１３】 １５．ウエルあたり１００μｌの抗ホスホチロシン（ＴＢＳＴ中１：３０００希
釈）を加える。振盪しながら室温で３０−４５分間インキュベートする。

【０５１４】 １６．上述の工程４に記載したように洗浄する。

【０５１５】 １７．１００μｌのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコ
ンジュゲート（ＴＢＳＴ中１：２０００希釈）を各ウエルに加える。振盪しなが
ら室温で３０分間インキュベートする。

【０５１６】 １８．上述の工程４に記載したように洗浄する。

【０５１７】 １９．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液を各ウエルに加える。

【０５１８】 ２０．振盪しながら５−１０分間インキュベートする。気泡を除去する。

【０５１９】 ２１．必要ならば，ウエルあたり１００μｌの０．２ＭＨＣｌを加えて，反応を
停止させる。

【０５２０】 ２２．アッセイをＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡリーダーで読む
；試験フィルター：４１０ｎＭ参照フィルター：６３０Ｎｍ。

【０５２１】生化学的ＰＤＧＦＲアッセイ このアッセイは，ＥＬＩＳＡを用いてＰＤＧＦＲのインビトロキナーゼ活性を
測定する。

【０５２２】材料および試薬 特に記載しないかぎり，以下の試薬の作業溶液の調製は，上述の生化学的ＥＧ
ＦＲアッセイと同じである。

【０５２３】 １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥｌｉｓａプレート（ＣｏｒｎｉｎｇカタログＮ
ｏ．２５８０５−９６） ２．２８Ｄ４Ｃ１０モノクローナル抗ＰＤＧＦＲ抗体（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ Ｌａｂ，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．） ３．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水，ＧｉｂｃｏカタログＮｏ．４５０
−１３００ＥＢ） ４．ＴＢＳＴ緩衝液 ５．ブロッキング緩衝液 ６．ＰＤＧＦＲ−β発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解物（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｌａｂ
，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．） ７．ＴＢＳ緩衝液 ８．ＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ ９．アデノシン−５'−三リン酸（ＡＴＰ，ウマ筋肉由来，Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ
．Ｎｏ．Ａ−５３９４） １０．ＭｎＣｌ₂ １１．キナーゼ緩衝液リン酸化混合物

【表１１】 １２．ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＳ−７２０９２） １３．エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） １４．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌａｂ，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．） １５．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃ
ｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＬＩ０４０４） １６．２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸）（Ａ
ＢＴＳ，Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−１８８８） １７．過酸化水素３０％溶液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ３２５） １８．ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂ １９．０．２ＭＨＣｌ方法 １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをウエルあたり１００μｌＰ
ＢＳ中の０．５μｇの２８Ｄ４Ｃ１０でコーティングする。４℃で一夜保存する
。

【０５２４】 ２．プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合２８Ｄ４Ｃ１０を
ウエルから除去する。ｄＨ₂Ｏで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で
軽くたたいて過剰の液体を除去する。

【０５２５】 ３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で
３０分間インキュベートする。

【０５２６】 ４．プレートを脱イオン水で３回，次にＴＢＳＴで１回洗浄する。プレートをペ
ーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体および気泡を除去する。

【０５２７】 ５．溶解物をＨＮＴＧ中で希釈する（１０μｇ溶解物／１００μｌＨＮＴＧ） ６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で６０分間振盪する。

【０５２８】 ７．プレートを上述の工程４に記載したように洗浄する。

【０５２９】 ８．８０μｌの作業用キナーゼ緩衝液混合物を捕捉ＰＤＧＦＲを含有するＥＬＩ
ＳＡプレートに加える。

【０５３０】 ９．試験化合物を９６ウエルポリプロピレンプレート中でＴＢＳで１：１０に希
釈する（１０μｌ化合物＋９０μｌＴＢＳ）。

【０５３１】 １０．１０μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートに加える。対照ウエル（
試験化合物を加えないウエル）には１０μｌＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯを加える。

【０５３２】 １１．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。

【０５３３】 １２．１０μｌのＡＴＰを陰性対照ウエルを除く全てのウエルに直接加える。（
各ウエル中最終ウエル容量は２０μＭＡＴＰを含む約１００μｌとなるはずであ
る）。振盪しながら３０分間インキュベートする。

【０５３４】 １３．３０分後，１０μｌの２００ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を各ウエルに加
えることにより反応を停止する。

【０５３５】 １４．脱イオン水で４回，ＴＢＳＴで２回洗浄する。

【０５３６】 １５．ウエルあたり１００μｌの抗ホスホチロシン（ＴＢＳＴ中１：３０００希
釈）を加える。振盪しながら室温で３０−４５分間インキュベートする。

【０５３７】 １６．上述の工程４に記載したように洗浄する。

【０５３８】 １７．１００μｌのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコ
ンジュゲート（ＴＢＳＴ中１：２０００希釈）を各ウエルに加える。振盪しなが
ら室温で３０分間インキュベートする。

【０５３９】 １８．上述の工程４に記載したように洗浄する。

【０５４０】 １９．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液を各ウエルに加える。

【０５４１】 ２０．振盪しながら１０−３０分間インキュベートする。気泡を除去する。

【０５４２】 ２１．必要ならば，ウエルあたり１００μｌの０．２ＭＨＣｌを加えて反応を停
止する。

【０５４３】 ２２．Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイを読む
：試験フィルター：４１０ｎＭ，参照フィルター：６３０ｎＭ。

【０５４４】生化学的ＦＧＦＲアッセイ このアッセイは，ＥＬＩＳＡを用いてＭｙｃ−ＧｙｒＢ−ＦＧＦＲ融合蛋白質
のキナーゼ活性をインビトロで測定する。

【０５４５】材料および試薬 １．ＨＮＴＧ

【表１２】 １リットルの５ｘ保存溶液を作成するためには，ＨＥＰＥＳおよびＮａＣｌを
約３５０ｍｌのｄＨ₂Ｏに溶解し，ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを７．２に調節
し（用いるＨＥＰＥＳによる），グリセロール，ＴｒｉｔｏｎＸ１００を加え，
次にｄＨ₂Ｏを加えて最終容量とする。

【０５４６】 ２．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水，Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１
３００ＥＢ） ３．ブロッキング緩衝液 ４．キナーゼ緩衝液

【表１３】 ５．フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．
Ｐ−７６２６） 作業溶液：エタノール中１００ｍＭ ６．ＡＴＰ（細菌起源，Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−７６９９） ６ｍＭの濃度の保存液のためには，１ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏあたり３．３
１ｍｇを用いる。

【０５４７】 ７．ビオチンコンジュゲート化抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（クローン
４Ｇ１０，Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．Ｃａｔ．Ｎ
ｏ．１６−１０３，Ｓｅｒ．Ｎｏ．１４４９５） ８．Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ試薬（アビジンペルオキシダー
ゼコンジュゲート，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．
ＰＫ−６１００） ９．ＡＢＴＳ溶液 １０．過酸化水素３０％溶液（Ｆｉｓｈｅｒカタログ＃Ｈ３２５） １１．ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂ １２．０．２ＭＨＣｌ １３．ＴＲＩＳ ＨＣｌ（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＰ１５２−５） ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏ中の１．０ｍＭ溶液を調製し，ＨＣｌでｐＨを７．２に調
節する １４．ＮａＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ２７１−１０） ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏ中の５Ｍ溶液を調製する １５．ＭｇＣｌ₂（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ３３−５００） ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏ中の１Ｍ溶液を調製する １６．ＨＥＰＥＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＰ３１０−５００） ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏ中の１Ｍ溶液を調製し，ｐＨを７．５に調節し，濾過滅菌
する。

【０５４８】 １７．ＴＢＳＴ緩衝液 １８．炭酸ナトリウム緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ４９５） ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏ中に０．１Ｍ溶液を調製し，ＮａＯＨでｐＨを９．６に調
製し，濾過する。

【０５４９】 １９．ジチオスレイトール（ＤＴＴ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＰ１７２
−２５） 使用直前にＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏ中に０．５ｍＭの作業溶液を調製する。使用す
るまで−２０℃で保存し，残りは廃棄する。

【０５５０】 ２０．ＭｎＣｌ₂ ２１．ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ２２．ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ） ２３．アフィニティー精製ウサギ抗ＧＳＴ ＧｙｒＢ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ Ｌａｂ．ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）方法 以下の全ての工程は，特に記載しない限り，室温で実施する。

【０５５１】 １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを，ウエルの総容量が１００
μｌとなるように，ウエルあたり２μｇの炭酸緩衝液中のヤギ抗ウサギ抗体でコ
ーティングする。４℃で一夜保存する。

【０５５２】 ２．プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合ヤギ抗ウサギ抗体
を除去する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体および気
泡を除去する。

【０５５３】 ３．１５０μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％低脂肪ミルク）を各ウエル
に加える。マイクロタイタープレート振盪器で振盪しながら３０分間インキュベ
ートする。

【０５５４】 ４．ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過
剰の液体および気泡を除去する。

【０５５５】 ５．ウエルあたり０．５μｇのウサギ抗ＧｙｒＢ抗体を加える。抗体をＤＰＢＳ
中で希釈して最終容量をウエルあたり１００μｌとする。マイクロタイタープレ
ート振盪器で振盪しながら室温で１時間インキュベートする。

【０５５６】 ６．工程４に記載したようにＴＢＳＴで４回洗浄する。

【０５５７】 ７．ＨＮＴＧ中の２μｇのＣＯＳ／ＦＧＦＲ細胞溶解物（Ｍｙｃ−ＧｙｒＢ−Ｆ
ＧＦＲ源）を各ウエルに加えて，ウエルあたり１００μｌの最終容量とする。マ
イクロタイタープレート振盪器で振盪しながら１時間インキュベートする。

【０５５８】 ８．工程４に記載したようにＴＢＳＴで４回洗浄する。

【０５５９】 ９．ウエルあたり８０μｌの１ｘキナーゼ緩衝液を加える。

【０５６０】 １０．ポリプロピレン９６ウエルプレート中で試験化合物を１ｘキナーゼ緩衝液
＋１％ＤＭＳＯで１：１０に希釈する。

【０５６１】 １１．希釈した試験化合物溶液および対照ウエルの１０μｌをポリプロピレンプ
レートウエルから対応するＥＬＩＳＡプレートウエルに移し，マイクロタイター
プレート振盪器で振盪しながら２０分間インキュベートする。

【０５６２】 １２．キナーゼ緩衝液中で希釈した７０μＭＡＴＰの１０μｌを陽性対照および
試験ウエル（最終ＡＴＰ濃度は７μＭ／ウエル）に加える。１０μｌの１ｘキナ
ーゼ緩衝液を陰性対照ウエルに加える。マイクロタイタープレート振盪器で振盪
しながら１５分間インキュベートする。

【０５６３】 １３．５μｌの０．５ＭＥＤＴＡをすべてのウエルに加えることによりキナーゼ
反応を停止する。

【０５６４】 １４．工程４に記載したようにＴＢＳＴで４回洗浄する。

【０５６５】 １５．ＴＢＳＴ中で希釈したビオチンコンジュゲート化抗ホスホチロシンモノク
ローナル抗体（ｂ４Ｇ１０）１００μｌを各ウエルに加える。マイクロタイター
プレート振盪器で振盪しながら３０分間インキュベートする。

【０５６６】 １６．Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ試薬を調製する。１滴の試薬Ａを１５ｍｌ
のＴＢＳＴに加える。管を数回逆さにすることにより混合する。１滴の試薬Ｂを
加え，再び混合する。

【０５６７】 １７．工程４に記載したようにＴＢＳＴで４回洗浄する。

【０５６８】 １８．１００μｌのＡＢＣ ＨＲＰ試薬を各ウエルに加える。マイクロタイター
プレート振盪器で振盪しながら３０分間インキュベートする。

【０５６９】 １９．工程４に記載したようにＴＢＳＴで４回洗浄する。

【０５７０】 ２０．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液を各ウエルに加える。

【０５７１】 ２２．振盪しながら５−１５分間インキュベートする。気泡を除去する。

【０５７２】 ２３．必要ならば，１００μｌの０．２ＭＨＣｌ／ウエルを加えることにより 反応を停止させる。

【０５７３】 ２４．アッセイをＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡプレートリーダ
ーで読む；試験フィルター：４１０ｎＭ，参照フィルター：６３０ｎＭ。

【０５７４】生化学的ＦＬＫ−１アッセイ このアッセイは，ＥＬＩＳＡを用いて，ｆｌｋ−１自己リン酸化活性をインビ
トロで評価する。

【０５７５】材料および試薬 １．１５ｃｍ組織培養皿 ２．Ｆｌｋ−１／ＮＩＨ細胞：ヒトｆｌｋ−１クローン３（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ
．，ＭＰＩ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙより入手）を過剰発現す
るＮＩＨ繊維芽細胞株 ３．成長培地：ＤＭＥＭプラス熱不活性化１０％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミン
（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ） ４．飢餓培地：ＤＭＥＭプラス０．５％熱不活性化ＦＢＳ，２ｍＭグルタミン（
Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ） ５．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔ．
Ｎｏ．２５８０５−９６） ６．ｆｌｋ−１に特異的なＬ４またはＥ３８モノクローナル抗体；蛋白質−Ａア
ガロースアフィニティークロマトグラフィーにより精製（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．
） ７．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水）Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．Ｎｏ．４５
０−１３００ＥＢ） ８．ＨＮＴＧ（調製については生化学的ＦＧＦＲを参照） ９．ＰｉｅｒｃｅＢＣＡ蛋白質検定キット １０．ブロッキング緩衝液 １１．ＴＢＳＴ（ｐＨ７．０） １２．キナーゼ緩衝液 １３．キナーゼ停止溶液：２００ｍＭＥＤＴＡ １４．ビオチニル化４Ｇ１０，ホスホチロシンに特異的（ＵＢＩ，Ｃａｔ．Ｎｏ
．Ｎｏ．１６−１０３） １５．ＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．
ＰＫ４０００） １６．ＤＭＳＯ １７．ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＳ−７２０９２） １８．Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ） １９．Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ停止溶液：１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄ ２０．ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−７６９９） ２１．２０％ＤＭＳＯ，ＴＢＳ（ｐＨ７．０）中方法 細胞成長および溶解物調製 １．細胞を成長培地中に播種し，３７℃，５％ＣＯ₂で９０−１００％コンフル
エントとなるまで２−３日間成長させる。２０継代を越えないこと。

【０５７６】 ２．培地を除去し，細胞をＰＢＳで２回洗浄する。ＨＮＴＧ溶解緩衝液で溶解す
る。すべての溶解物を回収し，２０−３０秒間ボルテックス混合する。

【０５７７】 ３．遠心分離（５−１０分間，約１０，０００ｘｇ）により不溶性物質を除去す
る。

【０５７８】 ４．ＢＣＡキットを用いて蛋白質濃度を決定する。

【０５７９】 ５．溶解物を１ｍｇのアリコートに分配し，−８０℃で保存する。

【０５８０】アッセイ方法 １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを，１００μｌのＰＢＳ中の
２μｇ／ウエルの精製Ｌ４（またはＥ３８）でコーティングする。４℃で一夜保
存する。

【０５８１】 ２．プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合蛋白質をウエルか
ら除去する。ｄＨ₂Ｏで１回洗浄し，プレートをペーパータオル上で軽くたたい
て過剰の液体を除去する。

【０５８２】 ３．プレートをウエルあたり１５０μｌのブロッキング緩衝液でブロッキングす
る。４℃で振盪しながら４５−６０分間インキュベートする。

【０５８３】 ４．ブロッキング緩衝液を除去し，ＥＬＩＳＡプレートをｄＨ₂Ｏで３回，ＴＢ
ＳＴで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体を
除去する。

【０５８４】 ５．溶解物をＰＢＳ中で希釈して，最終濃度を５０μｇ／１００μｌとする。１
００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。振盪しながら４℃で一夜インキュベ
ートする。

【０５８５】 ６．プレートを逆さにすることにより未結合蛋白質をウエルから除去する。工程
４と同様に洗浄する。

【０５８６】 ７．８０μｌのキナーゼ緩衝液をウエルに加える（陰性対照ウエルには９０μｌ
）。

【０５８７】 ８．試験化合物をＴＢＳ中２０％ＤＭＳＯを含むポリプロピレンプレートのウエ
ル中で希釈する（通常は１０倍）。

【０５８８】 ９．１０μｌの希釈化合物を固定化ｆｌｋ−１を含むＥＬＩＳＡウエルに加え，
振盪する。対照ウエルには化合物を加えない。

【０５８９】 １０．１ｍＭＡＴＰ保存液から，ｄＨ₂Ｏ中０．３ｍＭＡＴＰ溶液を調製する（
あるいは，キナーゼ緩衝液を用いてもよい）。

【０５９０】 １１．陰性対照を除くすべてのウエルに１０μｌの０．３ｍＭＡＴＰを加える。
振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。

【０５９１】 １２．１時間後，１１μｌの２００ｍＭＥＤＴＡを加えることにより，キナーゼ
反応を停止させる。１−２分間振盪する。

【０５９２】 １３．ＥＬＩＳＡプレートをｄＨ₂Ｏで４回，ＴＢＳＴで２回洗浄する。

【０５９３】 １４．１００μｌの１：５０００ビオチニル化４Ｇ１Ｏ：ＴＢＳＴをすべてのウ
エルに加える。振盪しながら室温で４５分間インキュベートする。

【０５９４】 １５．上述のものをインキュベートしている間，ＡＢＣキットからの５０μｌの
溶液ＡおよびＢを１０ｍｌのＴＢＳＴに加える。これらの溶液は，使用の約３０
分前に混合しなければならない。

【０５９５】 １６．工程４と同様にプレートを洗浄する。

【０５９６】 １７．あらかじめ形成したＡとＢの複合体１００μｌをすべてのウエルに加える
。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。

【０５９７】 １８．工程４と同様にプレートを洗浄する。

【０５９８】 １９．１００μｌのＴｕｒｂｏ−ＴＭＢを加える。室温で１０−１５分間振盪す
る。

【０５９９】 ２０．陽性対照ウエルの色が吸光度約０．３５−０．４に達したとき，１００μ
ｌのＴｕｒｂｏ−ＴＭＢ停止溶液で反応を停止する。

【０６００】 ２１．Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡリーダーでプレートを読む
。試験フィルター：４５０ｎＭ，参照フィルター：４１０ｎＭ。

【０６０１】ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃアッセイ また，以下のプロトコルを用いて，ＰＤＧＦ−Ｒ，ＦＧＦ−Ｒ，ＶＥＧＦ，ａ
ＦＧＦまたはＦｌｋ−１／ＫＤＲ（これらはすべてＨＵＶ−ＥＣ細胞により天然
に発現されている）に対する化合物の活性を測定することができる。

【０６０２】第０日 １． ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞（ヒト臍静脈内皮細胞，（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；カタログＮｏ．１７３０ＣＲＬ）
を洗浄し，トリプシン処理する。ダルベッコリン酸緩衝化食塩水（Ｄ−ＰＢＳ；
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ；カタログＮｏ．１４１９０−０２９から入手）で２回，約
１ｍｌ／１０ｃｍ²組織培養フラスコで洗浄する。非酵素細胞解離溶液（Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ；カタログＮｏ．Ｃ−１５４４）中で
０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理する。０．０５％トリプシン
は，０．２５％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ；カタログＮｏ．２５
２００−０４９）を細胞解離溶液中で希釈することにより作成する。約１ｍｌ／
２５−３０ｃｍ²組織培養フラスコで３７℃で約５分間トリプシン処理する。細
胞をフラスコからはがした後，等量のアッセイ培地を加え，５０ｍｌ滅菌遠心分
離管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログＮｏ．０５−５３９−６
）に移す。

【０６０３】 ２． ５０ｍｌ滅菌遠心分離管中にアッセイ培地を加えることにより，細胞を約
３５ｍｌのアッセイ培地で洗浄し，約２００ｇで１０分間遠心分離し，上清を吸
引し，３５ｍｌのＤ−ＰＢＳに再懸濁する。Ｄ−ＰＢＳでさらに２回洗浄し，細
胞を約１ｍｌ／組織培養フラスコ１５ｃｍ²のアッセイ培地に再懸濁する。アッ
セイ培地は，Ｆ１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ；カタログＮｏ．２１１２７−
０１４）＋０．５％熱不活性化ウシ胎児血清からなる。Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕ
ｎｔｅｒ（商標）（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で細
胞を計数し，アッセイ培地を細胞に加えて０．８−１．０ｘ１０⁵細胞／ｍｌの
濃度とする。

【０６０４】 ３． 細胞を９６ウエル平底プレートに１００μｌ／ウエルまたは０．８−１．
０ｘ１０⁴細胞／ウエルで加える；３７℃，５％ＣＯ₂で約２４時間インキュベー
トする。

【０６０５】第１日 １． 試験化合物の２倍滴定を別々の９６ウエルプレート中に作成する。一般に
，５０μＭから０μＭまで。上述の第０日，工程２と同じアッセイ培地を用いる
。滴定は，９０μｌ／ウエルの試験化合物を２００μＭ（４Ｘ最終ウエル濃度）
で特定のプレートカラムの最上のウエルに加えることにより行う。試験化合物保
存液濃度は通常ＤＭＳＯ中２０ｍＭであるため，２００μＭの薬剤濃度は２％Ｄ
ＭＳＯを含む。

【０６０６】 ＤＭＳＯ濃度を一定に保持しながら薬剤を希釈するために，アッセイ培地中（
Ｆ１２Ｋ＋０．５％ウシ胎児血清）２％ＤＭＳＯとした希釈剤を，試験化合物滴
定の希釈剤として用いる。この希釈物をカラム中の残りのウエルに６０μｌ／ウ
エルで加える。カラムの最上ウエル中の１２０μｌの２００μＭ試験化合物希釈
物から６０μｌを採取し，カラムの第２のウエル中の６０μｌと混合する。この
ウエルから６０μｌを採取し，カラム中の第３のウエル中の６０μｌと混合し，
２倍滴定が完了するまでこれを続ける。最後から２番目のウエルが混合されたと
き，このウエル中の１２０μｌの６０μｌを採取し，これを廃棄する。最後のウ
エルには薬剤非含有対照として６０μｌのＤＭＳＯ／培地希釈物を加える。以下
のアッセイの，滴定する試験化合物の三重のウエルに十分な９つのカラムを作成
する：（１）ＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，から入手，カタログ
Ｎｏ．１００−２００，（２）内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）（酸性繊維芽細胞
成長因子またはａＦＧＦとしても知られる）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａから入手，カタログＮｏ．１４３９６００）；
または（３）ヒトＰＤＧＦ Ｂ／Ｂ（１２７６−９５６，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびアッセイ培地対照。ＥＣＧＦはヘ
パリンナトリウムを有する調製物として得た。

【０６０７】 ２． ５０μｌ／ウエルの試験化合物希釈物を，第０日からのＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ
細胞０．８−１．０ｘ１０⁴細胞／１００μｌ／ウエルを含む９６ウエルアッセ
イプレートに移し，３７^oＣ，５％ＣＯ₂で約２時間インキュベートする。

【０６０８】 ３． 三重に，８０μｇ／ｍｌＶＥＧＦ，２０ｎｇ／ｍｌＥＣＧＦ，または各試
験化合物の条件に対する培地対照を５０μｌ／ウエルで加える。試験化合物につ
いては，成長因子濃度は所望の最終濃度の４倍である。第０日，工程２からのア
ッセイ培地を用いて，成長因子の濃度を調節する。３７℃，５％ＣＯ₂で約２４
時間インキュベートする。各ウエルに５０μｌの試験化合物希釈物，５０μｌの
成長因子または培地，および１００μｌの細胞を加え，総量２００μｌ／ウエル
とする。すなわち，すべてをウエルに加えたとき，４倍濃度の試験化合物および
成長因子は１倍となる。

【０６０９】第２日 １． ³Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ；カタログＮｏ．ＴＲＫ−６８６）を
１μＣｉ／ウエル（ＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清中で調製した
１００μＣｉ／ｍｌ溶液を１０μｌ／ウエル）で加え，３７℃，５％ＣＯ₂で約
２４時間インキュベートする。ＲＰＭＩはＧｉｂｃｏ ＢＲＬから入手する，カ
タログＮｏ．１１８７５−０５１

【０６１０】第３日 １． プレートを−２０℃で一夜凍結する。

【０６１１】第４日 １． プレートを融解し，９６ウエルプレート回収器（Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖ
ｅｓｔｅｒ９６（登録商標））でフィルターマット（Ｗａｌｌａｃ；カタログＮ
ｏ．１２０５−４０１）上に回収する；Ｗａｌｌａｃ Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商
標）液体シンチレーション計数機で計数する。

【０６１２】インビボ動物モデル 異種移植片動物モデル ヒト腫瘍が無胸腺マウス（例えば，Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）中で異種移植
片として成長する能力は，ヒト腫瘍の治療に対する生物学的応答を研究するのに
有用なインビボモデルを提供する。ヒト腫瘍の無胸腺マウスへの最初の成功的な
異種移植（Ｒｙｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｏｖｌｓｅｎ，１９６９，Ａｃｔａ Ｐ
ａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｓｃａｎｄ．７７：７５８−７６０）以来，
多くの異なるヒト腫瘍細胞株（例えば，乳房，肺，尿生殖器，胃腸，頭頸部，神
経膠芽細胞腫，骨，および悪性黒色腫）が移植され，ヌードマウス中での成長に
成功してきた。以下のアッセイを用いて，本発明の種々の化合物の活性，特異性
および効果のレベルを決定することができる。３種類の一般的アッセイ，すなわ
ち細胞／触媒，細胞／生物学的およびインビボアッセイが化合物の評価に有用で
ある。細胞／触媒アッセイの目的は，ＴＫが細胞中の既知の基質上のチロシンを
リン酸化する能力に及ぼす化合物の影響を判定することである。細胞／生物学的
アッセイの目的は，細胞中でＴＫにより刺激される生物学的応答に及ぼす化合物
の影響を判定することである。インビボアッセイの目的は，特定の疾患，例えば
癌の動物モデルにおける化合物の影響を判定することである。

【０６１３】 皮下異種移植片実験に適した細胞株としては，Ｃ６細胞（神経膠腫，ＡＴＣＣ
＃ＣＣＬ１０７），Ａ３７５細胞（黒色腫，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６１９），Ａ４
３１細胞（類表皮癌腫，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５５），Ｃａｌｕ６細胞（肺，Ａ
ＴＣＣ＃ＨＴＢ５６），ＰＣ３細胞（前立腺，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１４３５），お
よびＥＧＦＲ，ＰＤＧＦＲ，ＩＧＦ−１Ｒまたは任意の他の試験キナーゼを過剰
発現するように遺伝子工学処理されたＳＫＯＶ３ＴＰ５細胞およびＮＩＨ３Ｔ３
繊維芽細胞が挙げられる。以下のプロトコルを用いて異種移植片実験を行うこと
ができる。

【０６１４】 雌無胸腺マウス（ＢＡＬＢ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）はＳｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）から入手する。すべての動物は，クリ
ーンルーム条件下で，マイクロアイソレーターケージでアルファドライ敷きわら
で維持する。動物には，滅菌齧歯類食および水を任意に与える。

【０６１５】 細胞株は，適当な培地（例えば，ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，Ｈａｍ'ｓＦ１０，また
はＨａｍ'ｓＦ１２プラス５％−１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭグ
ルタミン（ＧＬＮ））中で成長させる。すべての細胞培養培地，グルタミン，お
よびウシ胎児血清は，特に断らない限り，Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入する。すべての細胞
は，９０−９５％空気および５−１０％ＣＯ₂の湿潤環境下で３７℃で成長させ
る。すべての細胞株は，週に２回，定期的に継代し，Ｍｙｃｏｔｅｃｔ法（Ｇｉ
ｂｃｏ）により判定して，マイコプラズマについては陰性である。

【０６１６】 細胞は，コンフルエント，またはそれに近い状態で，０．０５％トリプシン−
ＥＤＴＡで回収し，４５０ｘｇで１０分間ペレット化する。ペレットを滅菌ＰＢ
Ｓまたは培地（ＦＢＳなし）中に懸濁して特定の濃度とし，細胞をマウス（１群
あたり，８−１０匹のマウス，２−１０ｘ１０⁶細胞／動物）の後側腹部内に移
植する。腫瘍成長は，ベニエカリパスを用いて３−６週間にわたり測定する。腫
瘍体積は，とくに記載のないかぎり，長さｘ幅ｘ高さの積として計算する。Ｐ値
は，スチューデントｔ−テストを用いて計算する。５０−１００μｌの賦形剤（
ＤＭＳＯ，またはＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）中の試験化合物は，通常は移植後の第１日か
ら初めて，異なる濃度でＩＰ注入により輸送することができる。

【０６１７】腫瘍侵襲モデル 以下の腫瘍侵襲モデルが開発されており，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターを選
択的に阻害すると同定された化合物の治療的価値および有効性を評価するために
用いることができる。

【０６１８】方法 ８週齢のヌードマウス（雌）（ＳｉｍｏｎｓｅｎＩｎｃ．）を実験動物として
用いる。腫瘍細胞の移植は，層流フード内で行うことができる。麻酔用に，キシ
ラジン／ケタミンカクテル（１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇキシ
ラジン）を腹膜内に投与する。中線切開を行って，腹腔を露出して（約１．５ｃ
ｍの長さ），容量１００μｌの培地中の１０⁷個の腫瘍細胞を注入する。細胞は
，膵臓の十二指腸葉または結腸の漿膜下に注入する。腹膜および筋肉を６−０絹
連続縫糸により縫合し，皮膚は創傷クリップを用いて縫合する。動物は毎日観察
する。

【０６１９】分析 動物の全体的所見により２−６週間後，マウスを殺し，局所腫瘍の種々の臓器
（肺，肝臓，脳，胃，脾臓，心臓，筋肉）への転移を調べ，分析する（腫瘍サイ
ズ，侵襲の程度，免疫化学，およびインサイチオハイブリダイゼーション測定）
。

【０６２０】細胞毒性の測定 治療用化合物は，細胞毒性効果を発揮するよりも，蛋白質キナーゼ活性の阻害
においてより強力であるべきである。ある化合物の有効性および細胞毒性の尺度
は，治療指数，すなわちＩＣ₅₀／ＬＤ₅₀を決定することにより得ることができる
。５０％阻害を達成するのに必要な用量ＩＣ₅₀は，標準的な技術，例えば本明細
書に記載される技術を用いて測定することができる。５０％毒性を与える用量Ｌ
Ｄ₅₀もまた，標準的な技術を用いて（Ｍｏｓｓｍａｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３），放出されたＬＤＨの量を測定す
ることにより（Ｋｏｒｚｅｎｉｅｗｓｋｉ ａｎｄ Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，１
９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６４：３１３；Ｄｅｃｋｅｒ
ａｎｄ Ｌｏｈｍａｎｎ−Ｍａｔｔｈｅｓ，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ，１１５：６１），または動物モデルにおける致死量を測定するこ
とにより，測定することができる。高い治療指数を有する化合物が好ましい。治
療指数は，２より大きくなくてはならず，好ましくは少なくとも１０，より好ま
しくは少なくとも５０である。

【０６２１】結論 本発明の化合物，方法および医薬組成物は，ＰＫ活性を調節するのに有効であ
り，したがって，ＲＴＫ，ＣＴＫ，およびＳＴＫ関連疾患に対する治療薬として
有効であると予測されることが理解されるであろう。

【０６２２】 当業者は，本発明は，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならび
に本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであ
ろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定の
化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであ
って，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，特許請
求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途
をなすであろう。

【０６２３】 当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示さ
れる本発明に対して置換基および修飾の変更をなすことが可能であることを容易
に理解するであろう。

【０６２４】 本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技
術分野の技術者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は，それぞれの刊行
物が特定的に個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，
本明細書の一部として引用される。

【０６２５】 本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されてい
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，”・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用い
るものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示
されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図する
ものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能
であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発
明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更およ
び変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される
本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。

【０６２６】 さらに，発明の特徴および局面がマーカッシュグループの用語で記載されてい
る場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバ
ーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載さ
れている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である
特許請求の範囲も完全に記載されている。

【０６２７】 他の態様も特許請求の範囲の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 17/06 19/02 19/02 29/00 29/00 １０１ １０１ 35/00 35/00 37/02 37/02 43/00 １１１ 43/00 １１１ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 230 Ｅａｓｔ Ｇｒａｎｄ Ａｖｅｎｕ ｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓ ｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94080，Ｕ ｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅ ｒｉｃａ (72)発明者 サン，リー アメリカ合衆国カリフォルニア州94556， フォスター・シティ，ロックハーバー・レ ーン 64 (72)発明者 トラン，エンゴク・マイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94065， レッドウッド・シティー，シャノン・ウェ イ 550，エスピーティー6306 (72)発明者 ネマタラ，アサード アメリカ合衆国カリフォルニア州94596， ウォルナット・クリーク，ボデガ・プレイ ス 1324 (72)発明者 ニュイエン，アン・ティー アメリカ合衆国カリフォルニア州94539， フレモント，ベカド・プレイス 503 Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 AA03 BC13 MA01 MA04 NA14 ZA39 ZA51 ZA89 ZA96 ZB01 ZB07 ZB08 ZB11 ZB15 ZB26 ZC19 ZC35 4C204 BB01 CB03 DB11 DB13 DB15 DB30 EB03 FB01 GB01

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 化学構造Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩ： 【化１】 ［式中， Ｒ¹は，水素，アルキル，シクロアルキル，アルケニル，アルキニル，アリール
   ，ヒドロキシ，アルコキシ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−，Ｃ−アミ
   ド，Ｃ−チオアミド，アセチル，−Ｓ（＝Ｏ）₂Ｒ"，およびトリハロメチルスル
   ホニルからなる群より選択され，ここで，Ｒ"は，水素，アルキル，シクロアル
   キル，アリール，ヘテロアリール（環炭素を介して結合），およびヘテロ脂環式
   （環炭素を介して結合）からなる群より選択され； Ａ，Ｂ，ＤおよびＥは，炭素および窒素からなる群より独立して選択され，ここ
   で，Ａ，Ｂ，ＤまたはＥが窒素であるとき，それぞれＲ²，Ｒ³，Ｒ⁴またはＲ⁵は
   存在せず； Ｆ，Ｇ，ＪおよびＫは，炭素，窒素，酸素およびイオウからなる群より独立して
   選択され，ここで，ｎが１でありかつＦ，Ｇ，ＪまたはＫが炭素以外の原子であ
   るとき，それぞれＲ⁶，Ｒ⁷，Ｒ⁸またはＲ⁹は存在せず； ｎが０でありかつＦ，ＧまたはＫが酸素またはイオウであるとき，それぞれＲ⁶
   ，Ｒ⁸またはＲ⁹は存在せず； Ｒ²，Ｒ³，Ｒ⁴，Ｒ⁵，Ｒ⁶，Ｒ⁷，Ｒ⁸およびＲ⁹は，水素，アルキル，トリハロア
   ルキル，シクロアルキル，アルケニル，アルキニル，アリール，ヘテロアリール
   ，ヘテロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカプト，アル
   キルチオ，アリールチオ，−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ"，−Ｓ（＝Ｏ）₂Ｒ"，Ｓ−スルホン
   アミド，Ｎ−スルホンアミド，Ｎ−トリハロメタンスルホンアミド，−Ｃ（＝Ｏ
   ）Ｒ"，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−，シアノ，ニトロ，ハロ，シア
   ナト，イソシアナト，チオシアナト，イソチオシアナト，Ｏ−カルバミル，Ｎ−
   カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，Ｃ−アミド，Ｎ−アミ
   ド，アミノおよび−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より独立して選択され； Ｒ²およびＲ³，またはＲ³およびＲ⁴，またはＲ⁴およびＲ⁵，またはＲ⁶およびＲ⁷ ，またはＲ⁷およびＲ⁸，またはＲ⁸およびＲ⁹は，一緒になって，メチレンジオキ
   シまたはエチレンジオキシ基を形成してもよく； Ｒ¹³およびＲ¹⁴は，水素，アルキル，シクロアルキル，アリール，ヘテロアリー
   ル，ヘテロ脂環式，−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ"，アセチル，−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ"，トリハロメ
   タンスルホニルからなる群より独立して選択され，または，一緒になって，５員
   または６員のヘテロ脂環式環であり； Ｒ¹⁰，Ｒ¹¹およびＲ¹²は，アルキル，シクロアルキル，アルケニル，アルキニル
   ，アリール，ヘテロアリール，ハロ，シアノ，トリハロメチル，ヒドロキシ，ア
   ルコキシ，アルキルチオ，アリールオキシ，アリールチオ，Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−
   ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺，−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）ＯＲ"，−
   （ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，シアナト，イソシアナ
   ト，チオシアナト，イソチオシアナト，アミノ，−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ"，−Ｓ（＝Ｏ
   ）₂Ｒ"，ニトロおよび−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より独立して選択され； Ｒ¹⁰およびＲ¹¹，またはＲ¹¹およびＲ¹²は，一緒になってエンド二重結合を形成
   してもよく； Ｚは，酸素およびイオウからなる群より選択され； ｒは，１，２，３，４，５，または６であり； および，ｎは，０または１である］ を有する２−インドリノン，またはその生理学的に許容される塩。
2. 【請求項２】 ｎは１であり； Ａ，Ｂ，ＤおよびＥは炭素であり； Ｒ¹は，水素であり； および，Ｚは，酸素である，請求項１記載の化合物または塩。
3. 【請求項３】 Ｆ，Ｇ，ＪおよびＫは炭素である，請求項２記載の化合物ま
   たは塩。
4. 【請求項４】 ｎは０であり； Ａ，Ｂ，ＤおよびＥは炭素であり；および Ｚは，酸素である，請求項１記載の化合物または塩。
5. 【請求項５】 Ｆは窒素であり； Ｒ⁹は水素であり；および ＧおよびＫは炭素である，請求項４記載の化合物または塩。
6. 【請求項６】 Ｋは，窒素であり； Ｒ⁶は，水素であり；および ＦおよびＧは炭素である， 請求項４記載の化合物または塩。
7. 【請求項７】 Ｆ，Ｇ，ＪまたはＫの１つまたは２つは独立して窒素である
   ，請求項１記載の化合物または塩。
8. 【請求項８】 Ｒ¹³は水素であり；および Ｒ¹⁴は非置換低級アルキルである，請求項２記載の化合物または塩。
9. 【請求項９】 Ｒ²，Ｒ³，Ｒ⁴，Ｒ⁵，Ｒ⁶，Ｒ⁷，Ｒ⁸およびＲ⁹は独立して，
   水素； 非置換低級アルキル； ハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"および−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より選択される基で置
   換されている低級アルキル； 非置換低級アルコキシ； ハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，非置換アリールおよび−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より
   選択される基で置換されている低級アルコキシ； トリハロメチル； 非置換アルケニル； 非置換アルキニル； 非置換アリール； 非置換低級アルキル，およびハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"および−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴から
   なる群より選択される基で置換されている低級アルキルからなる群より独立して
   選択される１またはそれ以上の基で置換されているアリール； 非置換ヘテロ脂環式； 非置換低級アルキル，−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ，−Ｃ（＝Ｏ）−（非置換低級アルキル）
   ，ヒドロキシ，非置換アルコキシ，およびハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"および−Ｎ
   Ｒ¹³Ｒ¹⁴からなる群より選択される基で置換されているアルコキシからなる群よ
   り独立して選択される１またはそれ以上の基で置換されているヘテロ脂環式； 非置換アリールオキシ； 非置換低級アルキル，トリハロメチル，ハロ，ヒドロキシおよびアミノからなる
   群より独立して選択される基で置換されているアリールオキシ； メルカプト； 非置換アルキルチオ； 非置換アリールチオ； ハロ，ヒドロキシおよびアミノからなる群より独立して選択される１またはそれ
   以上の基で置換されているアリールチオ； Ｓ−スルホンアミド； −Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"； Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−； ヒドロキシ； シアノ； ニトロ； ハロ； Ｃ−アミド； Ｎ−アミド； アミノ；および −ＮＲ¹³Ｒ¹⁴， からなる群より選択される，請求項１記載の化合物または塩。
10. 【請求項１０】 Ｒ²，Ｒ³，Ｒ⁴，Ｒ⁵，Ｒ⁶，Ｒ⁷，Ｒ⁸およびＲ⁹は， 水素； 非置換低級アルキル； ハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"および−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より選択される基で置
    換されている低級アルキル； 非置換低級アルコキシ； ハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，非置換アリールおよび−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より
    選択される基で置換されている低級アルコキシ； トリハロメチル； 非置換アルケニル； 非置換アルキニル； 非置換アリール； 非置換低級アルキル，および ハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，および−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より選択される基で
    置換されている低級アルキルからなる群より独立して選択される１またはそれ以
    上の基で置換されているアリール； 非置換ヘテロ脂環式； 非置換低級アルキル，−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ，−Ｃ（＝Ｏ）−（非置換低級アルキル）
    ，ヒドロキシ，非置換アルコキシ，およびハロ，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"および−Ｎ
    Ｒ¹³Ｒ¹⁴からなる群より選択される基で置換されているアルコキシからなる群よ
    り独立して選択される１またはそれ以上の基で置換されているヘテロ脂環式； 非置換アリールオキシ； 非置換低級アルキル，トリハロメチル，ハロ，ヒドロキシおよびアミノからなる
    群より独立して選択される１またはそれ以上の基で置換されているアリールオキ
    シ； メルカプト； 非置換アルキルチオ； 非置換アリールチオ； ハロ，ヒドロキシおよびアミノからなる群より独立して選択される１またはそれ
    以上の基で置換されているアリールチオ； Ｓ−スルホンアミド； −Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"； Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−； ヒドロキシ； シアノ； ニトロ； ハロ； Ｃ−アミド； Ｎ−アミド； アミノ；および −ＮＲ¹³Ｒ¹⁴， からなる群より独立して選択される，請求項８記載の化合物または塩。
11. 【請求項１１】 Ｒ¹⁰，Ｒ¹¹およびＲ¹²は，水素，非置換低級アルキル，−
    （ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）ＯＲ"，−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺，ハロ，ヒドロキ
    シ，アルコキシ，Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺ ，アミノ，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，ニトロおよび−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より
    独立して選択される，請求項１記載の化合物または塩。
12. 【請求項１２】 Ｒ¹⁰，Ｒ¹¹およびＲ¹²は，水素，非置換低級アルキル，−
    （ＣＨ₂）_r．Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺，ハロ，ヒドロ
    キシ，アルコキシ，Ｒ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−，−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ"，−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ^-
    Ｍ⁺，アミノ，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，ニトロおよび−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群
    より独立して選択される，請求項８記載の化合物または塩。
13. 【請求項１３】 Ｒ¹⁰，Ｒ¹¹またはＲ¹²の少なくとも１つは，−Ｃ（＝Ｏ）
    ＯＲ"，−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺，−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）ＯＲ"および−（ＣＨ₂）_r Ｃ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺からなる群より選択される，請求項１２記載の化合物または塩
    。
14. 【請求項１４】 −（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）ＯＲ"または−（ＣＨ₂）_rＣ（＝
    Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺基のｒは１である，請求項１３記載の化合物または塩。
15. 【請求項１５】 −（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）ＯＲ"または−（ＣＨ₂）_rＣ（＝
    Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺基のｒは２である，請求項１３記載の化合物または塩。
16. 【請求項１６】 請求項１記載の化合物または塩および薬学的に許容しうる
    担体または賦形剤を含む医薬組成物。
17. 【請求項１７】 蛋白質キナーゼの触媒活性を調節する方法であって，前記
    蛋白質キナーゼを請求項１記載の化合物または塩と接触させることを含む方法。
18. 【請求項１８】 前記蛋白質キナーゼは，レセプターチロシンキナーゼ，非
    レセプターチロシンキナーゼおよびセリン−トレオニンキナーゼからなる群より
    選択される，請求項１７記載の方法。
19. 【請求項１９】 生物において蛋白質キナーゼ関連疾患を治療または予防す
    る方法であって，治療的有効量の請求項１記載の化合物または塩を前記生物に投
    与することを含む方法。
20. 【請求項２０】 前記蛋白質キナーゼ関連疾患は，レセプターチロシンキナ
    ーゼ関連疾患，非レセプターチロシンキナーゼ関連疾患およびセリン−トレオニ
    ンキナーゼ関連疾患からなる群より選択される，請求項１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記蛋白質キナーゼ関連疾患は，ＥＧＦＲ関連疾患，ＰＤ
    ＧＦＲ関連疾患，ＩＧＦＲ関連疾患およびｆｌｋ／ＫＤＲ関連疾患からなる群よ
    り選択される，請求項１９記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記蛋白質キナーゼ関連疾患は，扁平上皮癌，星状細胞腫
    ，カポジ肉腫，神経膠芽細胞腫，肺癌，膀胱癌，頭頚部癌，黒色種，卵巣癌，前
    立腺癌，乳癌，小細胞肺癌，神経膠腫，直腸結腸癌，尿生殖器癌および胃腸癌か
    らなる群より選択される癌である，請求項１９記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記蛋白質キナーゼ関連疾患は，糖尿病，自己免疫疾患，
    過増殖疾患，再狭窄，繊維症，乾癬，フォン・ヒッペル−リンダウ症，変形性関
    節症，慢性関節リウマチ，新脈管形成，炎症性疾患，免疫疾患および心血管疾患
    からなる群より選択される，請求項１９記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記生物はヒトである，請求項１９記載の方法。
25. 【請求項２５】 Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，ＪおよびＫは炭素であり； Ｚは酸素であり； Ｒ¹は水素であり； Ｒ²，Ｒ³，Ｒ⁴およびＲ⁵は，水素，非置換低級アルキル，トリハロメチル，非置
    換低級アルコキシ，ハロ，ニトロ，シアノ，Ｓ−スルホンアミド，Ｎ−スルホン
    アミド，および−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴からなる群より選択され； ｎは１であり； Ｒ¹⁰またはＲ¹¹の一方は，−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺または−（ＣＨ₂）_rＣ（＝Ｏ）Ｏ ^- Ｍ⁺であり；および Ｒ¹⁰およびＲ¹¹の他方は，水素，非置換低級アルキル，トリハロメチル，非置換
    シクロアルキル，非置換低級アルコキシ，ハロ，ニトロ，シアノ，−Ｃ（＝Ｏ）
    Ｏ^-Ｍ⁺，−（ＣＨ₂）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ^-Ｍ⁺および−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴（ここで，Ｒ¹³およ
    びＲ¹⁴は，水素および非置換低級アルキルからなる群より独立して選択される）
    からなる群より選択される，請求項１記載の化合物。
26. 【請求項２６】 前記Ｓ−スルホンアミド基がＮ，Ｎ−ジメチルスルホンア
    ミドである，請求項２５記載の化合物または塩。