PT2269656E - Anticorpos selecionados e peptídeos de duramicina que se ligam a fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios e seus usos no tratamento de infecções virais e câncer - Google Patents

Anticorpos selecionados e peptídeos de duramicina que se ligam a fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios e seus usos no tratamento de infecções virais e câncer Download PDF

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Sophia Ran
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Description

DESCRIÇÃO
ANTICORPOS SELECIONADOS QUE SE LIGAM A AMINOFOSFOLIPÍDIOS E SEUS USOS NO TRATAMENTO TAIS COMO O CÂNCER
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da invenção A presente invenção refere-se aos campos do aminofosfolipídio e biologia aniônica do fosfolipídio e vasos sanguíneos tumorais. Ela provê inesperadas novas composições, e seus usos e combinações para alvo vascular tumoral e tratamento do câncer. A invenção, além disso, provê um número de preferidos anticorpos e composições imunoconjugadas que se ligam e inibem aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos para uso no tratamento de cancêr doenças relacionadas. 2. Descrição da técnica relacionada
Resistência de célula tumoral a agentes quimioterápicos representa um problema significante na oncologia clínica. Outro problema principal para chamar a atenção no tratamento de tumor é o desejo para uma "morte total de células", por exemplo, matar todas as células chamadas de células malignas "clonogênicas" que têm a habilidade de crescer descontroladamente e repor qualquer massa tumoral que deva ser removida pela terapia. Apesar de certos avanços no campo, essas são duas das razões principais de porque muitas formas prevalentes de câncer humano ainda resistem a intervenção quimioterápica efetiva.
Devido ao objetivo de desenvolver tratamentos que aproximem-se da morte celular completa, certos tipos de tumor têm sido mais sensíveis à terapia do que outros. Por exemplo, tumores de tecido flexível, ex., linfomas, e tumores do sangue e órgãos formadores de sangue, ex. leucemias, tem geralmente sido mais suscetíveis à terapia quimioterápica do que tumores sólidos, tais como carcinomas.
Uma razão para a suscetibilidade de tumores estabelecidos em tecidos flexíveis e no sangue à quimioterapia é a maior acessibilidade do linfoma e células leucêmicas à intervenção quimioterapêutica. Simplesmente posto, é muito mais difícil para a maioria dos agentes quimioterápicos alcançarem todas as células de uma massa tumoral sólida do que tumores em tecidos flexíveis e no sangue, e então muito mais difícil de alcançar a morte celular total. Aumentar a dose de agentes quimioterápicos geralmente resulta em efeitos colaterais tóxicos, os quais geralmente limitam a efetividade de agentes antitumorais convencionais.
Outra estratégia de tratamento de tumor é o uso de uma "imunotoxina", na qual um anticorpo de célula antitumoral é usado para liberar toxina às células tumorais. Entretanto, em comum com as tentativas quimioterapêuticas, terapia com imunotoxinas também sofre de desvantagens significantes quando aplicada a tumores sólidos. Por exemplo, células antígeno-negativas ou antígeno deficiente podem sobreviver e repovoar o tumor ou levar a futuras metástases. Mais uma razão para a resistência de tumores sólidos à terapias baseadas em anticorpos é que a massa tumoral é geralmente impermeável a agentes macromoleculares tais como anticorpos e imunotoxinas. Tanto as distâncias de difusão físicas e a pressão intersticial no tumor são limitações significantes a esse tipo de terapia. 2
Uma estratégia de tratamento melhorada é alvejar a vasculatura de tumores sólidos. Alvejar os vasos sanguíneos dos tumores ao invés das células tumorais apresenta certas vantagens, pois não é provável levar ao desenvolvimento de células tumorais resistentes, e que as células alvo são prontamente acessíveis. Além disso, destruição dos vasos sanguíneos leva a uma amplificação do efeito antitumoral, como muitas células tumorais contam com um único vaso para seu oxigénio e nutrientes. Exemplos de agentes vasculares alvejantes (VTAs) são descritos nas patentes americanas números 5.855.866, 5.965.132, 6.261.535, 6.051.230 e 6.451.312, as quais descrevem a distribuição de agentes anticelulares direcionados e toxinas para marcadores da vasculatura tumoral.
Outra útil versão de abordar o alvejamento vascular é direcionar um fator de coagulação a um marcador expresso ou absorvido pela vasculatura tumoral ou estroma (Huang et ai., 1997; Patentes americanos números 6.093, 6.004.555, 5.877.289 e 6.036.955). A distribuição de coagulantes, ao invés de toxinas, à vasculatura tumoral tem as vantagens adicionais de imunogenicidade reduzida e mesmo menor risco de efeitos colaterais tóxicos. Como revelado na Patente Americana número 5.877.289, um fator de coagulação preferido para uso em tal tumor-específico "coaguligantes" é uma versão incompleta da proteína humana indutora de coagulação, Fator Tecidual (TF), o maior iniciador da coagulação sanguínea.
Recentemente, os aminofosfolipídios fosfatidilserina (PS) e fosfatidiletanolamina (PE) foram identificados como marcadores específicos da vasculatura tumoral (Ran et al., 1998). Isso leva ao desenvolvimento de novos imunoconjugados 3 anti-PS e anti-PE para distribuição de agentes anticelulares, toxinas e fatores de coagulação aos vasos sanguíneos tumorais (Patente Americana número 6.312.694). Além disso, descobriu-se que anticorpos não-conjugados à PS ou PE apresentaram um efeito anticâncer sem se ligar a um agente terapêutico, o qual ficou conhecido como o aminofosfolipídio "anticorpo nu", tentando-se aproximar do alvejamento e tratamento vascular tumoral 9Patente Americana número 6.406.693).
Embora métodos que tomem como alvo os imunoconjugados e aminofosfolipídios precedentes representem avanços significativos no tratamento de tumores, certas células tumorais periféricas podem sobreviver à destruição tumoral difundida causada por tais terapias. Estratégias antiangiogênicas, as quais inibem o desenvolvimento de nova vasculatura a partir de vasos sanguíneos pré-existentes e/ou células tronco endoteliais circulantes, são então contemplados para uso de forma combinada com o VTA, métodos que tomam como alvo coaguligantes e aminofosfolipídios das Patentes Americanas números 5.855.866, 6.093.399, 6.312.694 e 6.406.693.
Angiogênese desempenha um papel importante em processos fisiológicos, tais como embriogênese, cicatrização de feridas e menstruação, mas é também envolvido em certos eventos patológicos, tais como em crescimento tumoral, artrite, psoríase e retinopatia diabética (Ferrara, 1995) . Como aplicado ao tratamento tumoral, estratégias antiangiogênicas são baseadas na inibição da proliferação de vasos em desenvolvimento, geralmente na periferia de um tumor sólido. Essas terapias são, em sua maioria, aplicadas para reduzir o risco de micrometástase ou para inibir 4 crescimento futuro de um tumor sólido após intervenções mais convencionais (tais como cirurgia e quimioterapia).
Patentes Americanas números 6.342.219, 6.524.583, 6.342.221 e 6.416.758 descrevem anticorpos e imunoconjugados que se ligam ao fator A de crescimento endotelial vascular (VEGF, anteriormente conhecido como fator de permeabilidade vascular, VPF), um estimulante primário da angiogênese. Esses anticorpos têm a importante vantagem de inibir a ligação de VEGF a apenas um dos dois receptores primários de VEGF. Pelo bloqueio da ligação de VEGF ao VEGFR2, mas não ao VEGFR1, esses anticorpos têm um perfil de segurança melhorado, mantendo os efeitos benéficos mediados via VEGFR1, por exemplo, em funções de condroclastos, osteoclastos e macrófagos.
Rudikoff el al., Proc. Natl. Acad. Sei, EUA, 79:. 1979-1983, 1982, diz respeito a uma substituição de aminoácidos na proteína de mieloma PCHO de ligação, SI07, o que altera a especificidade de ligação ao antigénio.
MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745, 1996, diz respeito a análise de contacto e ligação local topografia e classificação em certas interações antígeno- anticorpo. de PascaJis el ai, J. Immunol, 169:.. 3076-3084 regiões determinantes de complementaridade, 2002 relatos de que apenas um terço dos resíduos de CDR estão envolvidos na interaeção com o antigénio e preocupações enxertia abreviadas (CDRs) para engenheiro menos Os anticorpos monoclonais humanizados imunogénicas. 5
Wu et al., J. Mol. Biol, 294:. 151-162, 1999, diz respeito a humanização de um anticorpo monoclonal murino contra a CD40 pela optimização simultânea de resíduos de CDR e estrutura utilizando bibliotecas de CDR com mutações aleatórias na terceira CDR das cadeias pesadas e leves. US 6406693 revela certos métodos baseados em anticorpos anti-aminofosfolipi^io e composições para uso no tratamento de tumores.
Embora os métodos precedentes têm avançado a técnica de tratamento tumoral, o desenvolvimento de terapias adicionais ou alternativas que têm como alvo vasculatura é ainda procurado. A identificação de novos marcadores de vasculatura tumoral é necessário para expandir o número de opções terapêuticas. O desenvolvimento de novos anticorpos nus com propriedades anticancerígenas poderia ser particularmente um importante avanço, de forma que permite que a mesma parte tomada como alvo seja usada tanto como um único agente terapêutico e como um agente que tem como alvo a vasculatura para a distribuição de outras drogas. Agentes terapêuticos que têm ambas as propriedades antiangiogênica e antivascular, por exemplo, tumor destrutivo, propriedades na mesma molécula poderiam ser de grande valor. E mesmo mais importantes avanços poderiam ser a identificação de uma classe de agentes terapêuticos com propriedades anticancerígenas e efeitos terapêuticos em outros sistemas. O desenvolvimento de agentes capazes de tratar tanto câncer como infecções virais, dois dos maiores desafios médicos significantes desta era, poderia ser uma notável e importante avanço.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO 6
De acordo com a presente invenção é proporcionada uma composição de acordo com o indicado nas reivindicações. A presente invenção direciona as necessidades precedentes e outras da técnica anterior provendo novos métodos e composições para tomar como alvo tumores vasculares de forma segura e eficaz, antiangiogênese e destruição tumoral, tais métodos e composições são também surpreendentemente eficazes na inibição da entrada virai e disseminação e para tratar infecções virais e doenças. A invenção é baseada, em parte, em descobertas surpreendentes relativas a expressão e ao papel de fosfolipidios aniônicos na vasculatura tumoral e o envolvimento de aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos na entrada virai e disseminação. A presente invenção, além disso, fornece anticorpos particularmente vantajosos e imunoconjugados que ligam-se a aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos, e uma nova classe de derivados baseados em peptídeos que ligam-se a fosfatidiletanolamina.
Saliente-se que o assunto da presente invenção que não se encontra englobado no âmbito das reivindicações não faz parte da presente invenção.
Visão geral: Numa primeira modalidade global, a invenção fornece novos métodos para tomar como alvo tumor vascular, visualização de tumor e tratamento baseado na descoberta inesperada de que fosfolipidios aniônicos, tais como fosfatidilinositol (PI), ácido fosfatidico (PA) e fosfatidilglicerol (PG), (bem como fosfatidilserina, PS), são marcadores acessíveis e que podem ser tomados como alvo de forma estável da vasculatura tumoral. Esta modalidade originou-se da descoberta inesperada de que anticorpos contra PA, PI, PG e outros componentes fosfolipídicos 7 aniônicos especificamente se localizam na vasculatura de tumores sólidos.
Aspectos adicionais desta modalidade foram desenvolvidos a partir da descoberta inesperada de que anticorpos nus contra fosfolipidios aniônicos, tais como PA, PI e PG (assim como PS), inibem especificamente a angiogênese de vasos sanguíneos tumorais e induzem a destruição da vasculatura tumoral e a necrose tumoral in vivo na ausência de conjugação a moléculas efetoras, tais como toxinas e coagulantes. A invenção então fornece métodos seguros e eficazes de alvejamento vascular, antiangiogênese e tratamento tumoral usando uma terapêutica de componente baseado em um único anticorpo que se liga a fosfolipidios aniônicos.
Um aspecto essencial fundamental da invenção é que a translocação de fosfolipidios aniônicos à superfície de células endoteliais vasculares de tumor ocorrem, pelo menos numa parte significante, independentemente de dano celular e mecanismos apoptóticos ou outros de morte celular. Expressão de fosfolipidios aniônicos na vasculatura tumoral é então não uma consequência de, ou um gatilho para morte celular e destruição, mas ocorre em células endoteliais vasculares morfologicamente intactas. Isto significa que expressão de fosfolipidios aniônicos na vasculatura tumoral não é transitória, ao invés é estável o suficiente para prover um alvo para intervenção terapêutica.
Dado a descoberta de que fosfolipidios aniônicos são estavelmente induzidos na vasculatura tumoral, a invenção adicionalmente fornece uma gama de novos métodos e composições para visualizar a vasculatura tumoral e 8 destruição usando imunoconjugados de anticorpos contra fosfolipidios aniônicos. Esses imunoconjugados compreendem anticorpos contra fosfolipidios aniônicos que estão operacionalmente ligados a agentes terapêuticos, tais como toxinas e coagulantes, e são úteis na distribuição especifica de diagnósticos e terapias à superfície das membranas celulares endoteliais da vasculatura tumoral. Os agentes terapêuticos são distribuídos em contato íntimo com a membrana celular endotelial vascular tumoral, permitindo tanto a entrada rápida na célula-alvo ou a associação rápida com células efetoras, componentes da cascata de coagulação e semelhantes.
Numa segunda modalidade especial, a invenção fornece um número de anticorpos preferidos que se ligam a aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos (e imunoconjugados relacionados e composições), tais anticorpos tendo estruturas e propriedades que fornecem vantagens sobre aqueles conhecidos na técnica. Essa chamada "segunda geração" de anticorpos melhorados será preferencialmente usada no tratamento antiangiogênico, anticâncer e antiviral e em outros métodos de tratamento revelados aqui.
As novas classes de anticorpos que se ligam a aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos fornecidas pela presente invenção superam várias desvantagens na técnica anterior pelo fornecimento de anticorpos terapêuticos sem as propriedades patogênicas geralmente associadas com anticorpos a aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos na técnica. A invenção foi desenvolvida, em parte, usando novas técnicas de imunização e triagem desenvolvidas a partir unicamente de observações dos inventores no comportamento de fosfolipidios nas células endoteliais de tumor vascular, e 9 distanciando os anticorpos gerados a partir de anticorpos antifosfolipidicos associados com doença. Tais anticorpos não apenas têm propriedades únicas e segurança aumentada, mas são igualmente ou mais eficazes do que anticorpos existentes em estudos comparativos. As composições e métodos desses aspectos da invenção também se estendem ao uso de imunoconjugados e combinações, usando a categoria específica de anticorpos fornecidos.
Anteriormente à presente invenção, anticorpos que se ligam a aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos e têm as propriedades de novos anticorpos reveladas aqui não eram conhecidos. Entretanto, na luz da invenção revelada aqui, a técnica é agora fornecida com a metodologia para gerar novos anticorpos candidatos e com as técnicas para testar tais anticorpos para identificar adicionais anticorpos úteis da reunião de candidatos. Na luz desta invenção, então, uma gama de anticorpos com propriedades vantajosas e perfis de ligação de aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos pode ser feita sem o sofrimento de desvantagens notáveis e efeitos colaterais associados com anticorpos da técnica anterior. Tais anticorpos podem então ser usados em uma variedade de modalidades, incluindo na inibição de angiogênese e no tratamento de câncer e infecções virais.
Adicionalmente às novas técnicas de imunização e de triagem fornecidas aqui, anticorpos que se ligam a aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos e têm um número de propriedades vantajosas podem agora ser identificados por competição e/ou ensaios funcionais usando os anticorpos monoclonais 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 ou 3G4. Os anticorpos monoclonais 9D2 e 3G4 são mais preferidos, com o anticorpo 3G4 (ATCC 4545) presentemente sendo o mais 10 preferido. Para identificar anticorpos adicionais que competem com qualquer um dos anticorpos precedentes, preferencialmente 3G4, os ensaios preferidos são presentemente ensaios de competição baseados no ELISA, um número dos quais são descritos aqui, e exemplos funcionais dos quais são revelados.
Numa terceira modalidade especial, a presente invenção fornece uma nova classe de derivados peptídicos de impermeabilizadores de células que se ligam ao aminofosfolipídio, fosfatidiletanolamina (PE) . Esses "derivados peptídicos que se ligam à PE" compreendem pelo menos um primeiro peptídeo que se liga à PE, preferencialmente duramicina, o qual tem sido modificado para prevenir substancialmente toxicidade não-específica, preferencialmente pela modificação de peptídeos que se ligam à PE, preferencialmente duramicina, para formar um substancialmente impermeabilizante celular ou substancialmente uma construção que se liga à PE não formadora de poros. A geração de "substancialmente impermeabilizante celular" construção que se liga à PE ou duramicina é preferencialmente alcançada pelo ataque do peptídeo que se liga à PE ou duramicina a pelo menos um primeiro grupo impermeabilizante celular. A síntese de um número de derivados exemplares de duramicina é descrita aqui. 0 "grupo ou grupos de células impermeabilizantes" pode ser pequenas moléculas, carreadores inertes, ou podem eles mesmos ser agentes alvo que concedem uma função de alvo adicional à construção resultante, tal como ter como alvo a vasculatura tumoral. Então, o peptídeo ligante à PE pode ser o único agente alvo ligado a um carreador inerte, ou pode ser um de 11 dois agentes onde cada um concede uma função alvejadora à construção. Adicionalmente, peptideos que se ligam à PE, preferencialmente duramicina, são operacionalmente ligados a efetores, tal como o peptídeo que se liga à PE ou duramicina provê a função alvejadora e o agente ligado tem um efeito terapêutico substancial uma vez liberado à célula-alvo. Exemplos preferidos são peptideos que se ligam à PE ou duramicina ligados a agentes antivirais, tais como nucleosideos.
Como PE é essencialmente ausente da superfície de células normais sob condições normais, os substancialmente impermeabilizantes celulares peptideos que se ligam à PE da presente invenção funcionam para seletivamente se ligar à PE na superfície de células aberrantes ou células associadas com doença, tais como células endoteliais de tumor vascular, proliferando e/ou células infectadas por vírus. Na ligação de tais células-alvo aberrantes, as construções que se ligam à PE ou derivados inibem ou interrompem as funções da PE nessas células, resultando então num benefício terapêutico total, por exemplo, no tratamento de tumores ou doenças virais. 0 uso bem sucedido de peptideos que se ligam à PE substancialmente impermeabilizantes celulares na inibição de entrada virai e propagação é revelado aqui. Em modalidades onde os peptideos que se ligam à PE são ligados a agentes antivirais, tais como cidofovir, tratamento antiviral mais seguro e acentuado é fornecido.
Numa quarta modalidade especial, a invenção fornece adicionalmente uma importante nova classe de composições e métodos para inibir a replicação virai, infecção e disseminação para uso no tratamento de infecções virais e doenças. Esses métodos são baseados no surpreendente 12 critério de que anticorpos e peptídeos que se ligam a aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos, tais como PS, PE, PI, PA e PG, particularmente PS e PE, poderiam ser agentes antivirais seguros e eficazes. Não apenas provou-se que esse critério é correto, como também a presente invenção fornece dados mostrando o uso útil não esperado de anticorpos e peptídeos que se ligam a aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos no combate à disseminação virai, o que significa que esses agentes são amplamente aplicáveis no tratamento de uma gama de infecções virais e doenças associadas.
Essas descobertas adicionalmente encerram novas categorias de imunoconjugados, composições, kits e métodos de uso nos quais um anticorpo de um aminof osf olipidios ou fosfolipidios aniônicos, particularmente PS e PE, é operacionalmente ligado a um agente antiviral. Os derivados peptídicos que se ligam à PE que são substancialmente impermeabilizantes celulares, tais como os derivados peptídicos de duramicina, podem também estar ligados a agentes antivirais. Cada um desses agentes então fornece novas drogas antivirais unicamente direcionadas a células infectadas por vírus. 0 desenvolvimento de novos agentes terapêuticos eficazes e seguros no tratamento de angiogênese aberrante, câncer e infecções virais e doenças é então um avanço na técnica.
Embora unicamente eficaz, os vários métodos e composições da presente invenção podem também ser usados em combinação com outras terapias e agentes para favorecer o fornecimento de métodos de tratamento combinado, e 13 composições, medicamentos e kits relacionados da invenção. Numa quinta modalidade especial, então, a invenção fornece adicionalmente composições, métodos e kits particularmente combinados, por exemplo para o tratamento de câncer, o qual tem sido selecionado e descoberto para funcionar junto de forma surpreendentemente bem, como explicado em maiores detalhes aqui.
Anticorpos de segunda geração: Certos métodos descobertos que funcionam bem na geração de anticorpos com as propriedades procuradas são descritos aqui no Exemplo IV e incorporado nas reivindicações pendentes. Esses métodos permitiram a geração de anticorpos vantajosos da invenção como exemplificado pelos anticorpos monoclonais 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 e 3G4, particularmente 3G4 (ATCC 4545). A presente invenção então fornece anticorpos purificados, fragmentos que se ligam a antigenos e imunoconjugados relacionados, os quais se ligam a pelo menos um aminofosfolipidio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS, e que efetivamente compete com o anticorpo monoclonal 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 ou 3G4, preferencialmente com 9D2 ou 3G4 (ATCC 4545), e mais preferencialmente com 3G4, para ligação ao aminofosfolipidio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS.
Como usado em todo o requerimento, os termos "um" e "uma" são usados no sentido de que eles significam "pelo menos um", "pelo menos um primeiro", "um ou mais" ou "uma pluralidade" dos componentes de referência ou passos, exceto em exemplos onde um limite superior é depois especificamente estabelecido. Então, um "anticorpo", como usado aqui, significa "pelo menos um primeiro anticorpo". Os limites 14 operáveis e parâmetros de combinação, assim como as quantidades de qualquer agente individual, serão conhecidos àqueles indivíduos normalmente versados na técnica à luz da presente descoberta.
Em certos aspectos, os anticorpos irão efetivamente competir com o anticorpo monoclonal 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 ou 3G4, preferencialmente com 9D2 ou 3G4, e mais preferencialmente com 3G4 (ATCC 4545), para ligação a um aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS, ou terá o perfil de ligação do aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico do anticorpo monoclonal 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 ou 3G4, preferencialmente de 9D2 ou 3G4, e mais preferencialmente de 3G4, como estabelecido adiante na Tabela 4; não será derivado de um paciente com uma doença, e não serão significantemente inibidas as reações de coagulação in vitro, causar significante trombose in vivo ou ter atividades anticoagulantes em lupos.
Preferencialmente, tais anticorpos também demonstrarão um aumento nas propriedades estruturais ou numa faixa ou grau de propriedades vantajosas funcionais em estudos controlados em comparação a um anticorpo da literatura, tal como sendo IgG, tendo uma maior afinidade ou demonstrando ligação aumentada a células endoteliais ativadas, inibição aumentada da proliferação celular endotelial ou angiogênese, aumento da localização de vasos sanguíneos tumorais, efeitos anticâncer e/ou antivirais.
Aspectos particulares da invenção são então baseados no original do inventor, geração surpreendente de anticorpos tendo a propriedade antecedente e outras propriedades 15 vantajosas reveladas e inerentes. Agora que um quadro de anticorpos preferidos, e um número de anticorpos particularmente preferidos foi fornecido, a presente invenção além disso encerra uma classe de anticorpos de definida especificidade de epítopos, onde tais anticorpos, ou respectivos fragmentos antigenos-ligantes, efetivamente competem como o anticorpo monoclonal 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 ou 3G4, preferencialmente com 9D2 ou 3G4, e mais preferivelmente com 3G4 (ATCC 4545), para ligação do antigeno, de tal forma que eles se ligam a essencialmente o mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 ou 3G4, preferencialmente com 9D2 ou 3G4, e mais preferencialmente com 3G4 (ATCC 4545). A invenção como reivindicada é habilitada de acordo com a presente especificação e prontamente disponível referências tecnológicas, conhecimento e materiais de partida. Entretanto, no interesse do presente peticionário, Conselho de Regentes, The University of Texas System, amostras do hibridoma da linha celular produzindo o anticorpo monoclonal 3G4 foram submetidas para depósito com a American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University
Blvd., Manassas, VA 20110-2209, U.S.A. As amostras foram submetidas por Avid Bioservices, Inc., 14272 Franklin Avenue, Tustin, CA 92780, U.S.A., uma subsidiária do licenciado, Peregrine Pharmaceuticals, Inc., durante a semana começando em 8 de julho de 2002, onde receberam em 10 de julho e 12 de julho de 2002, mostrando-se viáveis, e dando-se o número de adesão da ATCC PTA 4545 em 30 de julho de 2002.
Este depósito foi feito sob as cláusulas do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de 16
Microrganismos para os Propósitos de Procedimento de Patente e as respectivas regras (Tratado de Budapeste). 0 hibridoma irá ser disponibilizado pela ATCC sob os termos do Tratado de Budapeste na emissão de uma patente americana com reivindicações pertinentes. Disponibilidade do hibridoma depositado não é para ser interpretada como uma licença para praticar a invenção em contravenção dos direitos assegurados sob a autoridade de qualquer governo de acordo com suas leis de patente. À luz do quadro de anticorpos, os anticorpos preferidos e as técnicas reveladas aqui e conhecidas na técnica, aqueles indivíduos habitualmente versados na técnica são agora providos com uma nova classe de anticorpos que se ligam a aminofosfolipídios ou fosfolipídios aniônicos e tem propriedades vantajosas. Esses anticorpos são "como" ou "baseados nos" anticorpos monoclonais 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 ou 3G4. Preferencialmente, os anticorpos da invenção são "anticorpos baseados em 9D2 ou como 9D2", e mais preferencialmente, os anticorpos da invenção são "anticorpos baseados em 3G4 ou como 3G4". A seguinte descrição de anticorpos "como" é fornecida em termos do anticorpo 3G4 (ATCC 4545) por simplicidade, mas é especificamente incorporada aqui por referência como aplicável a cada um dos anticorpos 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5 e 9D2.
Um anticorpo como 3G4 é um anticorpo, ou respectivo fragmento ligante de antígeno, que se liga a substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC 4545) ou que se ligam a pelo menos um primeiro aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS, em essencialmente o mesmo epítopo que 17 o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC 4545). Preferencialmente, o anticorpo, ou respectivo fragmento ligante a antigeno, se ligará ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC 4545).
Os termos "que se liga a quase, substancialmente ou essencialmente o mesmo, ou o mesmo, epitopo que" o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC 4545) significa que um anticorpo "reticula" com o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC 4545). "Anticorpos que reticulam" são aqueles que reconhecem, se ligam a ou tem imunoespecificidade para substancialmente ou essencialmente o mesmo, ou o mesmo, epitopo, sitio epitópico ou epítopo de aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico comum que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC 4545) de tal forma que são capazes de efetivamente competir com o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC 4545) pela ligação a pelo menos um aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, mais do que um aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico ou a todos os aminofosfolipídios ou fosfolipídios aniônicos aos quais o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC 4545) se liga. "Anticorpos 3G4 que reagem de forma cruzada" são sucintamente chamados de "anticorpos como 3G4", e "anticorpos baseados em 3G4", e tais termos são usados intercambiavelmente aqui e aplicados a composições, usos e métodos. A identificação de um ou mais anticorpos que se liga(m) a cerca de, substancialmente, essencialmente ou no mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC 4545) é uma questão técnica direta agora que 3G4, com suas propriedades vantajosas, tem sido fornecido. Como a identificação de anticorpos que reticulam é determinada em comparação com um anticorpo de referência, será entendido que realmente a determinação do epítopo ao qual o anticorpo de referência 18 (3G4) e o anticorpo teste se ligam não é e forma alguma requerido para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo ou substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4. Entretanto, informação considerável no epitopo ligado a 3G4 é incluida aqui e o mapeamento do epitopo pode ser feito adicionalmente. A identificação de anticorpos que reagem de forma cruzada pode ser prontamente determinada usando qualquer um da variedade de testes de triagem imunológica no qual a competição de anticorpo pode ser avaliada. Todos os tais testes são rotina na técnica e são adicionalmente descritos aqui em detalhe. Cada uma das Patentes Americanas números 6.342.219 e 6.342.221 são especificamente incorporadas aqui por referência para propósitos incluindo mesmo o posterior acréscimo do presente ensinamento referindo-se a como fazer anticorpos que se ligam a mesma ou substancialmente ou essencialmente o mesmo epitopo como um dado anticorpo, tal como 3G4, ou que efetivamente compita com um dado anticorpo pela ligação a um antigeno.
Por exemplo, onde os anticorpos teste a serem examinados são obtidos de diferentes fontes animais, ou são mesmo de diferentes isotipos, um simples teste de competição pode ser empregado no qual o controle (3G4) e anticorpos teste são misturados (ou pré-adsorvidos) e aplicados a uma composição antigênica de aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico, preferencialmente PS. Por "composição antigênica de aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico" entende-se qualquer composição que contenha um antigeno que se liga a 3G4 como descrito aqui, tal como descrito na Tabela 4. Então, protocolos baseados em ELISAs e Western blottings são adequados para uso em tais estudos simples de competição. 19
Em certas modalidades, alguém poderia ou pré-misturar os anticorpos controle (3G4) com quantidades variadas de anticorpos teste (ex., 1:10 ou 1:100) por um período de tempo antes de aplicar a uma composição antigênica. Em outras modalidades, o controle e as quantidades variadas de anticorpos teste podem simplesmente ser misturadas durante a exposição à composição antigênica. Em qualquer evento, pelo uso de espécies ou isotipos secundários de anticorpos alguém poderia estar apto a detectar apenas os anticorpos de controle ligados, a ligação do qual será reduzida pela presença de um anticorpo teste que reconhece substancialmente o mesmo epítopo.
Na condução de um estudo de competição de anticorpo entre um anticorpo controle e qualquer anticorpo teste (não considerando as espécies ou isotipo), alguém poderia primeiro marcar o controle (3G4) com um marcador detectável, tal como, por exemplo, biotina ou um marcador enzimático ou mesmo radioativo para permitir subsequente identificação. Nesses casos, alguém poderia pré-misturar ou incubar os anticorpos controle marcados com os anticorpos teste a serem examinados em várias proporções (por exemplo, 1:10, 1:100 ou 1:1000) e (opcionalmente após um adequado período de tempo) então testar a reatividade dos anticorpos controle marcados e comparar este com um valor de controle no qual nenhum anticorpo teste potencialmente competitivo tenha sido incluído na incubação. O ensaio pode novamente ser qualquer um de uma gama de testes imunológicos baseados na hibridização de anticorpo, e os anticorpos de controle poderiam ser detectados por meios de detecção de seus marcadores, por exemplo, usando estreptavidina no caso de anticorpos biotinilados ou pelo 20 uso de substrato cromogênico relativo a um marcador enzimático (tal como substrato 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) com enzima peroxidase) ou por simplesmente detectar um marcador radioativo. Um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que os anticorpos de controle estará apto a efetivamente competir pela ligação e então ia significantemente reduzir a ligação do anticorpo de controle, como evidenciado por uma redução na ligação marcada. A reatividade dos anticorpos de controle (marcados) na ausência de um anticorpo competitivamente irrelevante poderia ser o controle de grande importância. 0 controle de baixa importância poderia ser obtido incubando-se os anticorpos marcados (3G4) com anticorpos não-marcados de exatamente o mesmo tipo (3G4), onde a competição poderia ocorrer e reduzir a ligação dos anticorpos marcados. Num ensaio teste, uma redução significante na reatividade dos anticorpos marcados na presença de um anticorpo teste é indicativa de um anticorpo teste que reconhece o mesmo epitopo, por exemplo, um que "reaja de forma cruzada" com o anticorpo marcado (3G4).
Uma redução significante é uma "reprodutível", por exemplo, observada consistentemente, redução na ligação. Uma "redução significante" em termos da presente aplicação é definida como uma redução reprodutível (na ligação de 3G4 a um ou mais aminofosfolipídios ou fosfolipídios aniônicos, preferencialmente Ps, em um ELISA) de pelo menos cerca de 70%, cerca de 75% ou cerca de 80% em uma proporção entre cerca de 1:10 e cerca de 1:1000. Anticorpos com mais precisas atividades de bloqueio cruzado exibirão uma redução reproduzível (na ligação de 3G4 a um ou mais 21 aminofosfolipídios ou fosfolipídios aniônicos, preferencialmente PS, em um ELISA ou outro ensaio adequado) de pelo menos cerca de 82%, cerca de 85%, cerca de 88%, cerca de 90%, cerca de 92% ou cerca de 95% ou algo em qualquer proporção entre cerca de 1:10 e cerca de 1:1000.
Bloqueio cruzado completo ou quase completo, tal como exibindo uma redução reprodutível na ligação de 3G4 a um ou mais aminofosfolipídios ou fosfolipídios aniônicos de cerca de 97% ou de cerca de 96% ou algo próximo, embora de jeito nenhum requerido a praticar a invenção, é certamente não excluído.
Como a totalidade de anticorpos de segunda geração, a competição pode ser medida em referência a um anticorpo que pelo menos se liga à fosfatidilserina, onde o anticorpo de segunda geração efetivamente compete pela ligação à fosfatidilserina; em referência a um anticorpo que pelo menos se liga ao ácido fosfatídico, onde o anticorpo de segunda geração efetivamente compete pela ligação ao ácido fosfatídico; em referência a um anticorpo que pelo menos se liga ao fosfatidilinositol, onde o anticorpo de segunda geração efetivamente compete pela ligação ao fosfatidilinositol; em referência a um anticorpo que pelo menos se liga ao f osf at idilglicerol, onde o anticorpo de segunda geração efetivamente compete pela ligação ao fosfatidilglicerol; em referência a um anticorpo que pelo menos se liga à cardiolipina, onde o anticorpo de segunda geração efetivamente compete pela ligação à cardiolipina; e opcionalmente em referência a um anticorpo que pelo menos se liga à fosfatidiletanolamina, onde o anticorpo de segunda geração efetivamente compete pela ligação à fosfatidiletanolamina. 22
Em certas modalidades, os anticorpos de segunda geração podem ser medidos em referência a um anticorpo gue se liga a pelo menos um primeiro e segundo aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico, e ainda o anticorpo de segunda geração efetivamente compete pela ligação ao primeiro e segundo aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico; em referência a um anticorpo que se liga a pelo menos um primeiro, segundo e terceiro aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico, e ainda o anticorpo de segunda geração efetivamente compete pela ligação ao primeiro, segundo e terceiro aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico; em referência a um anticorpo que se liga a pelo menos um primeiro, segundo, terceiro e quarto aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico, e ainda o anticorpo de segunda geração efetivamente compete pela ligação ao primeiro, segundo, terceiro e quarto aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico; ou em referência a um anticorpo que se liga a pelo menos um primeiro, segundo, terceiro, quarto e quinto aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico, e ainda o anticorpo de segunda geração efetivamente compete pela ligação ao primeiro, segundo, terceiro, quarto e quinto aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico.
Em outras modalidades, um anticorpo de segunda geração pode ser caracterizado como um anticorpo que exibe significante ligação a pelo menos um aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico, sem detecção de ligação a um fosfolipidio neutro contendo colina e que efetivamente compete com um anticorpo monoclonal da invenção, preferencialmente 3G4 (ATCC 4545) . 23
Em modalidades particulares, o anticorpo exibe significante ligação aos fosfolipidios aniônicos PS, PA, PI, PG e CL; tem o perfil de ligação de PS=PA=PI=PG>CL>>PE, onde > indica pelo menos 2 vezes de diferença na ligação e >> indica pelo menos 10 vezes de diferença na ligação a tais fosfolipidios; não exibe ligação detectável à fosfatidilcolina ou esfingomielina; e efetivamente compete com o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC 4545) pela ligação a cada um dos fosfolipidios PS, PA, PI, PG e CL.
Preferencialmente, os anticorpos de segunda geração terão as características precedentes e também exibirão ligação significante a pelo menos um fosfolipídio aniônico presente na superfície celular de células ativadas, em divisão, injuriadas, apoptóticas ou infectadas com vírus. Mais preferencialmente, o anticorpo também inibe significantemente a proliferação de células endoteliais em divisão sem alterar significantemente células guiescentes, e mais preferencialmente, não tem atividades anticoagulantes de lupos.
Funcionalmente, os anticorpos de segunda geração irão preferencialmente suprimir angiogênese, ter um efeito antitumoral e um efeito antiviral, preferencialmente in vivo, e mais preferencialmente, irão fazer isso sem causar complicações trombóticas significantes em animais ou pacientes. Então, os anticorpos preferidos possuem as propriedades combinadas de um agente antiangiogênico, antitumor vascular, antitumor e antiviral. A invenção é exemplificada pelo anticorpo monoclonal 3G4, produzido pelo hibridoma ATCC 4545, ou um fragmento que se liga a antígeno de tal anticorpo monoclonal. Um hibridoma 24 que produz um anticorpo monoclonal que se liga a substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC 4545) é outro aspecto da invenção.
Nas seguintes descrições das composições, imunoconjugados, ou uma respectiva região que se liga a antigeno, a não ser que seja diferentemente estabelecido ou esclarecido a partir da terminologia cientifica, refere-se a uma gama de anticorpos antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidios aniônicos assim como a anticorpos específicos que reagem de forma cruzada com 3G4.
Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina", como usados aqui, referem-se amplamente a um agente ligante imunológico, incluindo anticorpos monoclonais e policlonais. Dependendo do tipo de domínio constante nas cadeias pesadas, anticorpos são designados a uma das cinco maiores classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Vários desses são adicionalmente divididos em subclasses ou isotipos, tais como IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, e assim por diante. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondam às diferentes classes de imunoglobulinas são nomeados CC, β, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas das subunidades configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
Geralmente, onde os anticorpos ao invés de regiões ligantes a antígenos são usadas na invenção, IgG e/ou IgM são preferidas porque elas são os anticorpos mais comuns na situação fisiológica e porque ela são as mais facilmente feitas no ambiente laboratorial. As "cadeias leves" de anticorpos de mamíferos são apontadas como um dos dois tipos mais claramente distintos: kappa (K) e lâmbda (λ), baseando-se na sequência de aminoácidos de seus domínios constantes. 25 Não há essencialmente preferência pelo uso de cadeias leves K ou λ nos anticorpos da presente invenção. 0 uso de anticorpos monoclonais (MAbs) ou seus respectivos derivados é muito preferido. Reconhece-se que MAbs têm certas vantagens, por exemplo, reprodutibilidade e produção em larga escala, que faz deles adequados para tratamento clinico. A invenção então fornece anticorpos monoclonais que tem como origem murina, humano, macaco, rato, hamster, coelho e mesmo sapo ou galinha. Anticorpos de murina, humano ou humanizado irão gerar os preferidos.
Como será entendido pelos indivíduos versados na técnica, os reagentes ligantes imunológicos, encerrados pelo termo "anticorpo" estendem-se a todos os anticorpos de todas as espécies, e respectivos fragmentos de ligação de antígenos, incluindo anticorpos diméricos, triméricos e poliméricos; anticorpos biespecíficos; anticorpos quiméricos; anticorpos humanos e humanizados; anticorpos recombinantes, construídos e "camelisados", e fragmentos relacionados. 0 termo "anticorpo" é usado então para se referir a qualquer molécula como anticorpo que tenha uma região antígeno ligante, e esse termo inclui fragmentos de anticorpos tais como Fab', Fab, F(ab')2, domínios de anticorpos individuais (DABs), Fv, scFv (Fv de cadeia única), anticorpos lineares, diacorpos, anticorpos "camelisados" e assim por diante. As técnicas para preparar e usar várias construções e fragmentos baseados em anticorpos são bem conhecidas na técnica (ver Kabal et al., 1991). Diacorpos, em particular, são adicionalmente descritos e, EP 404, 097 e WO 93/11161, cada um 26 especificamente incorporado aqui por referência; enquanto anticorpos lineares são posteriormente descritos em Zapata et ai., (1995) , .
Em certas modalidades, as composições da invenção incluem pelo menos um primeiro antiaminofosfolipidio ou fosfolipídio antianiônico que incluem pelo menos uma primeira região variável que inclui uma região de sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 75%, mais preferencialmente , pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente , pelo menos cerca de 85%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% , e mais preferencialmente, pelo menos cerca de 95% ou algo em torno disso da sequência de aminoácido igual à sequência de aminoácido do SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4; em que o referido anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico pelo menos substancialmente mantém as propriedades biológicas dos anticorpos antiaminofosfolipidicos ou antifosfolipidios aniônicos da presente invenção, como exemplificado pelo anticorpo 3G4.
Igualdade ou homologia com respeito à essas e outras sequências de anticorpos antiaminofosfolipidios ou antifosfolipidios aniônicos da presente invenção é definida aqui como a percentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos às sequências de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou à sequência de outro anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico da invenção, após alinhar as sequências e introduzir intervalos, se necessário, para alcançar o percentual máximo de igualdade sequencial. A manutenção de substancialmente a mesma, ou mesmo mais eficácia das propriedades biológicas do anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico 27 sequencial usado para comparação importante. Tais comparações exemplo, usando um ou mais dos detalhe aqui. é particularmente são facilmente feitas, por vários ensaios descritos em
Em certas modalidades preferidas, anticorpos antiaminofosfolipidios ou antifosfolipidio aniônicos da invenção compreendem pelo menos uma primeira região variável que inclui uma região sequencial de aminoácido tendo a mesma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4, como exemplificado pelas regiões variáveis que incluem uma região de sequência de aminoácidos codificados pela sequência de ácidos nucléicos e SEQ ID N0:1 ou SEQ ID N0:3. Tais sequências são as sequências de Vh e VK da 3G4 ScFv incluindo CDR1-3 (regiões determinantes de complementaridade) das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas.
Em outras modalidades preferidas, anticorpos de segunda geração são produzidos que tem propriedades aumentadas ou superiores em comparação a um anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico original, tal como 3G4 (ATCC 4545).
Em certas modalidades, os anticorpos empregados serão anticorpos "humanizados", parcialmente humanos ou humanos. Anticorpos "humanizados" são geralmente anticorpos monoclonais quiméricos de camundongos, ratos ou outras espécies não-humanas, possuindo domínios de regiões constantes e/ou variáveis humanas ("anticorpos quiméricos parcialmente humanos"). Vários anticorpos monoclonais humanizados para uso na presente invenção serão anticorpos quiméricos onde pelo menos uma primeira de ligação a 28 antígenos, ou região determinante de complementaridade (CDR), de um camundongo, rato ou outro anticorpo monoclonal não-humano é operacionalmente ligado a, ou "enxertado" a uma região constante de anticorpo humano ou "armação".
Anticorpos monoclonais humanizados para uso aqui podem também ser anticorpos monoclonais de espécies não-humanas onde um ou mais aminoácidos selecionados tenham sido trocados por aminoácidos mais comumente observados em anticorpos humanos. Isto pode ser prontamente alcançado pelo uso de tecnologia recombinante rotineira, particularmente mutagênese sitio especifica.
Anticorpos completamente humanos, ao invés de "humanizados", podem também ser preparados e usados na presente invenção. Tais anticorpos humanos podem ser obtidos de indivíduos saudáveis simplesmente obtendo uma população de linfócitos sanguíneos periféricos misturados de um indivíduo humano, incluindo células apresentadoras de antígenos e produtoras de anticorpos, e estimulando a população celular in vitro pela mistura com uma quantidade imunologicamente eficaz de uma amostra de aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico. As células produtoras de anticorpos antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico, uma vez obtidos, são usados na produção de hibridoma e/ou anticorpos recombinantes. Técnicas adicionais para produção de anticorpos monoclonais humanos incluem a imunização de animais transgênicos, preferencialmente um camundongo transgênico, que abrange uma biblioteca de anticorpos humanos com uma quantidade imunologicamente eficaz de uma amostra de aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico. Isso também gera 29 células produtoras de anticorpos antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico para adicional manipulação no hibridoma e/ou produção de anticorpo recombinante, com a vantagem de que células do baço, ao invés de células sanguíneas periféricas, podem ser prontamente obtidas de animais transgênicos ou camundongos.
Anticorpos de acordo coma invenção podem ser facilmente preparados pela seleção de um anticorpo que substancialmente reticula ou compete com o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545), Processos e métodos adequados preparativos abrangem: (a) preparo de células candidatas à produção de anticorpos; e (b) seleção das células candidatas à produção de anticorpos de um anticorpo que substancialmente reticule ou compita com o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545) .
Um processo de preparo de células produtoras de anticorpos adequadas e de obtenção de anticorpos por elas produzidos pode ser feito in situ em um dado paciente. Ou seja, simplesmente fornecendo uma quantidade imunologicamente eficaz de uma amostra de aminofosfolipidio ou fosfolipídio aniônico imunogênico a um paciente resultará na geração apropriada de anticorpos. Então, o anticorpo é ainda "obtido" da célula produtora de anticorpo, mas isso não tem que ser isolado do hospedeiro e subsequentemente administrado ao paciente, estando apto a localizar espontaneamente à vasculatura tumoral e exercer seus efeitos biológicos antitumorais. Entretanto, tais modalidades não são normalmente preferidas. 30 Células produtoras de anticorpos adequadas podem também ser obtidas, e anticorpos subsequentemente isolados e/ou purificados, pelo estímulo de linfócitos sanguíneos periféricos com aminofosfolipídios ou fosfolipídios aniônicos in vitro.
Outros métodos abrangem a administração a um animal de uma composição imunizadora compreendendo pelo menos um primeiro componente de aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico imunogênico e selecionando a partir de um animal imunizado um anticorpo que substancialmente reticule ou compita com o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545). Esses métodos geralmente abrangem: (a) imunização de um animal pela administração ao animal de pelo menos uma dose, e opcionalmente mais do que uma dose, de uma composição compreendendo uma quantidade imunogenicamente eficaz de um aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico imunogênico; e (b) obtenção de célula produtora de anticorpos adequada para o animal imunizado, tal como uma célula produtora de anticorpo que produz um anticorpo que substancialmente reticula ou compete com o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545) .
Uma preferida "composição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico imunogênico", como usado aqui, é uma composição compreendendo células endoteliais ativadas. "Células endoteliais ativadas" são preferencialmente preparadas pela colocação de células endoteliais sob pelo menos uma primeira condição, ou em contato com pelo menos um 31 primeiro fator, o qual ativa as células endoteliais, e/ou mimetiza um ambiente tumoral, por um tempo eficaz para eficaz para substancialmente manter a viabilidade celular e estimular a expressão de pelo menos um fosfolipídio aniônico na superfície das células endoteliais. "Condições" eficazes como exemplos para preparar células endoteliais ativadas são ambientes hipóxicos e/ou ácidos. Exemplos de "fatores" eficazes para preparar células endoteliais ativadas são concentrações eficazes de H2O2, trombina, citocina(s) inflamatórias, tais como IL-lOC, IL-ΐβ, interferon ou TNFa, e geralmente, combinações de condições e/ou fatores que mimetizam um ambiente tumoral.
Sem considerar a natureza dos processos de imunização, ou o tipo de animal imunizado, células produtoras de anticorpos adequadas são obtidas do animal imunizado e, preferencialmente, posteriormente manipuladas pelas mãos do homem. "Um animal imunizado", como usado aqui, é um animal não-humano, a não ser que seja expressamente estabelecido de outra forma. Embora qualquer célula produtora de anticorpo possa ser usada, mais preferencialmente, células do baço são obtidas como a fonte de células produtoras de anticorpos. As células produtoras de anticorpos podem ser usadas em um processo preparativo que compreende: (a) fundindo uma célula produtoras de anticorpos antiaminofosfolipídios ou antifosfolipídio aniônicos com uma célula imortal para preparar um hibridoma que produza um anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção; e 32 (b) obtenção de um anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico de acordo com a invenção a partir do hibridoma. Células produtoras de anticorpos antiaminofosfolipidios ou antifosfolipidio aniônicos "adequados", hibridomas e anticorpos são aqueles que produzem, ou existem como, anticorpos antiaminofosfolipidios ou antifosfolipidio aniônicos preferencialmente anticorpos que substancialmente reticulam ou competem com o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545). Métodos preparatórios de anticorpos monoclonais baseados em hibridoma então incluem aqueles que compreendem: (a) imunizar um animal pela administração ao animal de pelo menos uma dose, e opcionalmente mais de uma dose, d uma composição compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um aminofosfolipidio ou fosfolipídio aniônico imunogênico, preferencialmente uma composição compreendendo células endoteliais ativadas; (b) preparar uma coleção de hibridomas produtoras de anticorpos monoclonais do animal imunizado; (c) selecionar a partir da coleção pelo menos um primeiro hibridoma que produz pelo menos um primeiro anticorpo monoclonal antiaminofosfolipidico ou antifosfolipidico aniônico de acordo com a invenção, opcionalmente um anticorpo antiaminofosfolipidio ou um anticorpo 33 antifosfolipídio aniônico que substancialmente reticula ou compete com o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC 4545); (d) cultivo de pelo menos um primeiro hibridoma produtor de anticorpos para o fornecimento de pelo menos um primeiro anticorpo monoclonal antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico; e preferencialmente (e) obtenção de pelo menos um primeiro anticorpo monoclonal antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico do cultivado de pelo menos um primeiro hibridoma.
Na identificação de um anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico que substancialmente reaja de forma cruzada com o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545), o passo selecionador pode compreender: (a) Colocar em contato uma amostra de aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente uma amostra de PS, com quantidades eficazes do anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545) e um anticorpo candidato; e (b) Determinar a capacidade do anticorpo candidato de reduzir substancialmente a ligação do anticorpo 3G4 com a amostra de aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS; onde a capacidade do anticorpo candidato de reduzir substancialmente reduzir a ligação do anticorpo 3G4 ao aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS, é indicativo do anticorpo 34 antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico que se liga a substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545). 0 passo selecionado pode ainda compreender: (a) Colocar em contato uma primeira amostra de aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS, com uma quantidade efetivamente ligada do anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545) e determinar a quantidade de 3G4 que se liga ao aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS. (b) Colocar em contato uma segunda amostra de aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS, com uma quantidade efetivamente ligada de anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545) em combinação com uma quantidade competidora eficaz de um anticorpo candidato e determinar a quantidade de 3G4 que se liga ao aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS, na presença do anticorpo candidato; e (c) Identificação de um anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico que se liga a substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545) pela seleção de um anticorpo candidato que reduza a quantidade de 3G4 que se liga ao aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS, preferencialmente por pelo menos cerca de 80%. 35
Como animais não-humanos são usados para imunização, os anticorpos monoclonais obtidos a partir de um tal hibridoma irá ter geralmente uma composição não-humana. Tais anticorpos podem ser opcionalmente sujeitos a um processo de humanização, como conhecido daqueles indivíduos versados na técnica e revelados aqui mais adiante. Alternativamente, animais transgênicos, tais como camundongos, podem ser usados que compreendam uma livraria genética de anticorpo humano. Imunização de tais animais irá então diretamente resultar na geração de anticorpos humanos adequados.
Após a produção de uma célula produtora de anticorpos adequados, mais preferencialmente um hibridoma, quer produza anticorpos humanos ou não-humanos, os ácidos nucléicos codificadores de anticorpos monoclonais podem ser clonados para preparar um anticorpo monoclonal "recombinante". Qualquer técnica de clonagem recombinante pode ser utilizada, incluindo o uso de PCR™ para iniciar a síntese das sequências do anticorpo codificador de ácidos nucléicos. Então, ainda que métodos preparatórios adicionais de anticorpos monoclonais apropriados incluam aqueles que compreendem o uso de células produtoras de anticorpos como se segue: (a) Obtenção de pelo menos uma primeira molécula ou segmento apropriado de ácido nucléico codificador de anticorpos antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico de uma célula produtora adequada de anticorpos antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico, preferencialmente um hibridoma; e (b) Expressão da molécula de ácido nucléico ou segmento em uma célula hospedeira recombinante para obter um 36 anticorpo monoclonal antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico recombinante de acordo com a presente invenção.
Entretanto, outras técnicas recombinantes eficazes estão disponíveis que estão idealmente adaptadas ao preparo de anticorpos monoclonais recombinantes. Tais técnicas de recombinação incluem os métodos de preparação de anticorpos monoclonais baseados na biblioteca de fagemidas compreendendo: (a) Imunização de um animal pela administração ao animal de pelo menos uma dose, e opcionalmente mais de uma dose, de uma composição compreendendo uma quantidade imunogenicamente eficaz de um aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico imunogênico, preferencialmente uma composição compreendendo células endoteliais ativadas. (b) Preparo de uma biblioteca de fagemidas e imunoglobulina combinatorial exprimindo RNA isolado das células produtoras de anticorpos, preferencialmente do baço, de animais imunizados; (c) Seleção da biblioteca do fagemida de pelo menos um primeiro clone que exprime pelo menos um primeiro anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico, opcionalmente um que substancialmente reticule ou compita com o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545); (d) Obtenção de anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico codificadores de ácidos nucléicos de pelo menos um primeiro clone 37 selecionado e expressão dos ácidos nucléicos em uma célula hospedeira recombinante para fornecer pelo menos um primeiro anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipídio aniônico; e preferencialmente (e) Obtenção de pelo menos um primeiro anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico expresso pelos ácidos nucléicos obtidos a partir de um primeiro clone selecionado.
Novamente, em tais técnicas baseadas na biblioteca de fagemidas, animais transgênicos carregando bibliotecas genéticas de anticorpos humanos podem ser empregados, produzindo então anticorpos monoclonais humanos recombinantes.
Sem considerar a maneira da preparação de um primeiro segmento de ácido nucléico de anticorpos antiaminofosfolipidios ou antifosfolipidio aniônicos, adicionais segmentos de ácido nucléico adequados podem ser prontamente preparados por técnicas de biologia molecular padrão. Com o propósito de confirmar que qualquer variável, mutante ou segmento de ácido nucléico de anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico de segunda geração é adequado para o uso na presente invenção, o segmento de ácido nucléico será testado para confirmar a expressão de um anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipídio aniônico de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, a variável, mutante ou segmento de ácido nucléico de segunda geração será também testado para confirmar a hibridização sob condições padrão, mais preferencialmente, condições padrão precisas de hibridização. Condiçoes exemplares de hibridização adequadas 38 incluem a hibridização em cerca de 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS) , cerca de 0,5 M de NaPCb, cerca de 1 mM de EDTA a cerca de 50 °C; e lavagem com cerca de 1% de SDS a cerca de 42 °C.
Como uma espécie de anticorpos monoclonais recombinantes, quer tenha origem humana ou não-humana, pode ser prontamente preparado, qualquer dos métodos de tratamento da invenção pode ser executado pelo fornecimento ao animal ou paciente de pelo menos um primeiro segmento de ácido nucléico que expressa uma quantidade biologicamente eficaz de pelo menos um primeiro anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico no paciente. O "segmento de ácido nucléico que exprime um aminofosfolipidio ou fosfolipídio aniônico, anticorpo como 3G4 ou baseado em 3G4", irá geralmente estar na forma de pelo menos uma expressão construída, e pode estar na forma de uma expressão construída incluída dentro de um vírus ou dentro de uma célula hospedeira recombinante. Vetores de terapia gênica preferidos da presente invenção irão geralmente ser vetores virais, tais como incluídos dentro de um retrovírus recombinante, vírus herpes simples (HSV), adenovírus, vírus adenoassociado (AAV), citomegalovírus (CMV), e assim por diante.
Derivados impermeáveis de duramicina da célula: A invenção além disso fornece células substancialmente impermeáveis à construções peptídicas ligantes de fosfatidiletanolamina (PE) e derivados, os quais compreendem pelo menos um primeiro peptídio ligante à PE que tem sido modificado para formar uma construção que se liga à PE substancialmente impermeante celular. Preferencialmente, a invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo, em 39 um carreador farmaceuticamente aceitável, uma quantidade biologicamente ou terapeuticamente eficaz de pelo menos uma primeira construção que se liga a PE, substancialmente impermeante celular, o qual compreende pelo menos um primeiro peptídio ligante à PE que tem sido modificado para formar uma construção que se liga a PE, substancialmente impermeabilizante celular. Então, as construções que se ligam a PE, substancialmente impermeabilizante celular são construções para uso farmacêutico, farmacológico e terapêutico, por exemplo, usos médicos, preferencialmente para uso no tratamento de infecções virais. Em certas modalidades, a invenção fornece uma construção que se ligam a PE, substancialmente impermeabilizante celular, a não ser cinamicina ligada à biotina.
De modo mais preferencial, os derivados peptídicos que se ligam a PE, substancialmente impermeabilizante celular da invenção são substancialmente derivados peptídicos impermeáveis à duramicina e composições farmacêuticas relacionadas. 0 peptídio de duramicina é tipicamente modificado para formar um derivado de duramicina substancialmente impermeável à célula por ligação operante a pelo menos um primeiro grupo impermeabilizante celular. Ligação operante de um grupo impermeabilizante celular pode ser via o resíduo de lisina na posição 2 do aminoácido na sequência SEQ ID NO:9. 0 grupo impermeabilizante celular pode ter uma carga positiva ou negativa no pH fisiológico ou pode ser polar. Grupos exemplares incluem sulfato, sulfonato, fosfato, carboxil, fenólico, íon quaternário de amónio e grupos amino. Uma composição farmacêutica compreendendo duramicina ligada à biotina é um exemplo particular dentro da invenção. 40
Duramicinas substancialmente impermeabilizantes celulares podem também ser eficientemente ligadas a um açúcar, oligo ou polissacarideo, aminoácido, peptídio, polipeptidio, proteína ou grupo poliálcool. Certas duramicinas impermeabilizantes celulares são aquelas eficientemente ligadas a um carreador de proteína inerte, tal como neutravidina, estreptavidina, albumina ou uma imunoglobulina inerte carreadora de proteína, dentre as quais duramicina ligada à IgG humana (HIgG) é particularmente preferida. Outros exemplos de duramicinas impermeabilizantes celulares são aquelas ligadas à agentes alvo, preferencialmente aqueles que se ligam à uma célula tumoral, vasculatura tumoral ou estroma tumoral ou a uma célula infectada com vírus. Exemplos de agentes alvejantes que se ligam a um componente da célula tumoral, vasculatura tumoral ou estroma tumoral são mostrados nas Patentes Americanas números 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289 e 6.036.955.
Tratamento de tumor: A invenção, além disso, fornece composições compreendendo pelo menos um primeiro anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico purificado, ou fragmento ligante a antígeno ou imunoconjugado relacionado, opcionalmente um que se ligue a essencialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545), ou a um derivado que se liga a PE, substancialmente impermeabilizante celular, preferencialmente um derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante celular. Tais composições são preferencialmente composições farmaceuticamente aceitáveis, incluindo aquelas formuladas para administração parenteral, tais como para administração intravenosa, ou para administração como um lipossoma ou um aerossol. 41 A presente invenção fornece uma gama de métodos e usos dos anticorpos antiaminofosfolipidios ou antifosfolipidios aniônicos, incluindo os anticorpos que reagem de forma cruzada 3G4, como 3G4 ou baseados em 3G4, e os derivados de duramicina impermeabilizantes celulares. Concernindo todos os métodos, os termos "um" e "uma" são usados para significar "pelo menos um", "pelo menos um primeiro", "um ou mais" ou "uma pluralidade" de passos nos métodos relatados, à exceção onde seja especificamente declarado. Isto é particularmente relevante aos passos de administração nos métodos de tratamento. Então, não somente podem doses diferentes ser empregadas com a presente invenção, mas diferentes números de doses, por exemplo, injeções ou inalações, podem ser usadas, e incluindo injeções ou inalações múltiplas. Terapêutica combinada pode ser usada, administrada antes, após ou durante a administração do anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico ou imunoconjugado ou ao derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante à célula. Vários métodos úteis in vitro e usos são fornecidos que têm implicações biológicas importantes. Os primeiros fornecidos são métodos de, e usos em, ligação de aminofosfolipidios ou fosfolipidios aniônicos, preferencialmente PS e PE, os quais geralmente compreendem colocar em contato de forma eficaz uma composição compreendendo um aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico, preferencialmente PS ou PE, com pelo menos um primeiro anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico, ou fragmento ligante à antigeno relacionado, opcionalmente um anticorpo que se liga a substancialmente o mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545), ou com um derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante celular. 0 "contato" é 42 sob condições eficazes para permitir a formação de complexos ligados, e quaisquer complexos formados dessa forma são detectados. Os métodos de detecção e usos podem ser usados relativamente com amostras biológicas, por exemplo, no diagnóstico para apoptose, células tumorais ou infectadas por vírus, e kits de diagnóstico baseados nisso são também fornecidos. Métodos de inibição de proliferação e usos são fornecidos, os quais preferencialmente usam os anticorpos, fragmentos ligantes a antígenos e imunoconjugados da invenção. Métodos para inibir a proliferação celular endotelial e/ou migração geralmente compreendem colocar em contato uma população de células ou tecidos que incluem uma população de células endoteliais com uma composição compreendendo uma quantidade biologicamente eficaz de pelo menos um primeiro anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico, opcionalmente um que se ligue a substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545), ou um fragmento ligante a antígeno relacionado, sob condições eficazes para inibir a proliferação endotelial e/ou migração.
Os métodos precedentes e usos podem ser feitos in vitro e in vivo, no último caso, onde os tecidos ou células são localizados pelo animal e o anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico é administrado ao animal. Em ambos os casos, os métodos e usos tornam-se métodos e usos para inibir a angiogênese, compreendendo o contato de um tecido compreendendo, ou uma população de, vasos sanguíneos potencialmente angiogênicos com uma composição antiangiogênica compreendendo uma quantidade biologicamente eficaz de pelo menos um primeiro anticorpo 43 antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico, opcionalmente um que se ligue a substancialmente o mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545), ou um fragmento antigeno ligante relacionado, sob condições eficazes para inibir a angiogênese.
Onde populações de vasos sanguíneos potencialmente angiogênicos são mantidas ex vivo, a presente invenção tem uso em programas de descoberta de drogas. Testes de triagem in vitro, com controles positivos e negativos confiáveis, são úteis como um primeiro passo no desenvolvimento de drogas para inibir ou promover a angiogênese, assim como na delineação de informação adicional no processo angiogênico. Onde a população de vasos sanguíneos potencialmente angiogênicos é localizada num animal ou paciente, a composição antiangiogênica é administrada ao animal como uma forma e terapia.
Terapias antiangiogênicas ou antivasculares são fornecidas em termos de animais e pacientes que tem, ou estão com risco de desenvolver qualquer doença ou desordem caracterizada por vascularização não desejada, inapropriada, aberrante, excessiva e/ou patológica. É bem conhecido daqueles indivíduos normalmente versados na técnica que como angiogênese aberrante ocorre em uma grande variedade de doenças e desordens, uma dada terapia antiangiogênica, uma vez demonstrada ser eficaz em qualquer sistema de modelo aceitável, pode ser usada para tratar a variedade inteira de doenças e desordens ligadas à angiogênese.
Os métodos e usos da presente invenção são particularmente planejados para uso em animais e pacientes que têm, ou que estão com risco de desenvolver, qualquer forma de tumor 44 vascularizado; degeneração da mácula, incluindo degeneração da mácula relacionada ao envelhecimento; artrite, incluindo artrite reumatóide; aterosclerose e placas ateroscleróticas; diabete retinopática e outras retinopatias; hiperplasia tiróide, incluindo doença de Grave; hemangioma; glaucoma neovascular; e psoríase.
Os métodos e usos da invenção são adicionalmente planejados para o tratamento de animais e pacientes que têm, ou estão com risco de desenvolver, malformações arteriovenosas (AVM), meningioma e restenose vascular, incluindo restenose seguida de angioplastia. Outros alvos pretendidos dos métodos e usos terapêuticos são animais e pacientes que têm, ou que estão com risco de desenvolver, angiofibroma, dermatite, endometriose, membros hemofílicos, cicatrizes hipertróficas, doenças inflamatórias e desordens, granuloma piogênico, esclerodermia, sinovite, tracoma e adesões vasculares.
Como revelado na Patente Americana número 5.712.291, cada um dos grupos de tratamento precedentes são de e]nenhuma maneira exaustivos dos tipos de condições que são para serem tratadas pela presente invenção. Patente Americana número 5.712.291 identifica um número de outras condições que podem ser eficazmente tratadas por uma terapia antiangiogênica; o propósito de mostrar que o tratamento de todas as doenças angiogênicas representam um conceito unificado, uma vez que uma categoria definida de compostos inibidores da angiogênese tem sido revelado e reivindicado (no presente caso, anticorpos antiaminofosfolipídios ou antifosfolipídio aniônicos, opcionalmente aqueles que se ligam a substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545) ) ; e o propósito de mostrar que o 45 tratamento de todas as doenças angiogênicas é habilitado por dados de apenas um único modelo de sistema.
Adicionalmente ao tratamento de doenças angiogênicas e vasculares, aspectos importantes e unificados da presente invenção são composições e métodos para o tratamento de animais e pacientes que têm, ou que estão com risco de desenvolver, câncer. Todos os métodos e usos do tratamento de câncer incluem a administração ou uso de pelo menos um anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipidio aniônico primeiramente purificado, ou fragmento ligante a antigeno ou imunoconjugado relacionado, opcionalmente um que se liga a essencialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545), ou um derivado peptídico ligante à PE substancialmente impermeabilizante celular, preferencialmente um derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante celular. Tais construções são administradas a animais e pacientes com câncer em quantidades terapeuticamente eficazes.
Os métodos de tratamento de câncer da invenção, mesmo aqueles usando anticorpos, não contam com somente a aplicação de efeitos antivasculares e/ou antiangiogênicos. Os métodos e usos do tratamento de câncer são adequados para o tratamento de todas as formas de câncer, incluindo animais e pacientes que têm, ou estão com risco de desenvolver, um tumor sólido vascularizado, um tumor metastático ou metástase a partir de um tumor primário.
Tanto anticorpos não-conjugados como "anticorpos nus" e fragmentos relacionados, e imunoconjugados nos quais o anticorpo, ou fragmento antigeno-ligante relacionado, é operativamente ligado ao agente terapêutico, pode ser usado 46 nos aspectos anticâncer da invenção. A não ser que seja especificamente estabelecido ou esclarecido em termos científicos, os termos "anticorpo e fragmento relacionado", como usados aqui, consequentemente significam um anticorpo ou fragmento "não-conjugado ou nu", o qual não é ligado a outro agente, particularmente um agente terapêutico ou diagnóstico. Essas definições não excluem modificações do anticorpo, tais como, sob a forma de exemplo, modificações para aumentar a meia-vida biológica, afinidade, avidez ou outras propriedades do anticorpo, ou combinações do anticorpo com outros efetores.
Nos métodos baseados em imunoconjugados para tratar câncer, o anticorpo, ou fragmento ligante a antígeno relacionado, é eficientemente ligado a qualquer um ou mais de um de uma variedade de agentes biológicos terapêuticos e/ou chamados agentes anticâncer secundários (o anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico propriamente dito, sendo o primeiro agente antiangiogênico), o qual pode ter um efeito anticâncer direto ou indireto.
Conformemente, a invenção além disso fornece métodos para, e usos na distribuição de agentes terapêuticos ou diagnósticos selecionados aos tumores. Tais modalidades compreendem a administração a um animal ou paciente com tumor de uma quantidade biologicamente eficaz de uma composição compreendendo pelo menos um primeiro imunoconjugado no qual o agente diagnóstico ou terapêutico é eficientemente ligado ao anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico ou fragmento ligante de antígeno relacionado, opcionalmente um que se liga a substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545) . 47
As composições, assim como os métodos e usos da invenção, então incluem composições compreendendo um anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico, opcionalmente um que se liga a substancialmente o mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545), ligado eficientemente a pelo menos um primeiro agente biológico, terapêutico ou diagnóstico. Os anticorpos são preferencialmente ligados a agentes radioterapêuticos, agentes antiangiogênicos, agentes indutores de apoptose, drogas antitubulina, anticelulares, agentes citotóxicos ou citocinas (ou a drogas antivirais, como discutido abaixo).
Certos agentes preferidos para ligação são agentes diagnósticos in vivo, por exemplo, os que permitem ao conjugado ser usado como um marcador substituto para quimioterapia.
Agentes preferidos para uso em anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico ou em conjugados terapêuticos baseados em 3G4 são aqueles que complementam ou aumentam os efeitos do anticorpo e/ou aqueles selecionados para um tipo particular de tumor ou paciente. "Agentes terapêuticos que complementam ou aumentam os efeitos do anticorpo" incluem agentes radioterápicos, agentes que aumentam a permeabilidade vascular, certas citocinas, agentes antiangiogênicos, agentes induores de apoptose e drogas antitubulina, qualquer um ou mais os quais podem ser usados em conjunto.
Agentes normalmente preferidos são o agente citotóxico, gelonina; citocinas, tais como TNFCC, IL-12 e LEC (quimiocina expressa pelo fígado); agentes anticâncer com efeitos antiangiogênicos, como na Tabela E; agentes anticâncer que 48 induzem apoptose, como na Tabela F; e drogas antitubulina da família da combretastatina. Um agente particularmente preferido é o docetaxel.
As composições de tratamento contra câncer e métodos da presente invenção podem também ser usados de forma combinada com outras terapias e diagnósticos. Os usos "combinados" em termos de anticorpos antiaminofosfolipídios ou antifosfolipídio aniônicos ou baseados em 3G4 juntamente com agentes terapêuticos, também incluem composições, medicamentos, coquetéis, kits e métodos combinados, onde o agente terapêutico está na forma de uma pró-droga. Métodos de tratamento de câncer combinados são aqueles nos quais pelo menos um primeiro anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico purificado, ou fragmento ligante de antígeno ou imunoconjugado relacionado, opcionalmente um que se liga a essencialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545), ou um derivado peptídico que se liga a PE, substancialmente impermeabilizante celular, preferencialmente um derivado de duramicina substancialmente um impermeabilizante celular, é administrado a um animal ou paciente com câncer em combinação com uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos um segundo agente terapêutico ou anticâncer. A invenção além disso fornece composições, composições medicamentosas, kits terapêuticos e coquetéis medicinais compreendendo, opcionalmente em pelo menos uma primeira composição ou Container, uma quantidade biologicamente eficaz de pelo menos um primeiro anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico, opcionalmente um que se liga a substancialmente o mesmo 49 epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545), ou um fragmento ligante a antígeno ou imunoconjugado relacionado, ou um derivado peptídico que se liga à PE substancialmente impermeabilizante celular, preferencialmente um derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante celular; e uma quantidade biologicamente eficaz de pelo menos um segundo agente biológico, componente ou sistema, preferencialmente pelo menos um segundo agente terapêutico ou anticâncer. 0 "pelo menos um segundo agente biológico, componente ou sistema" irá geralmente ser um agente terapêutico ou diagnóstico, componente ou sistema, mas ele não é. Por exemplo, o pelo menos um segundo agente biológico, componente ou sistema pode compreender componentes para modificação de anticorpo e/ou ligação de outros agentes ao anticorpo. Certos agentes biológicos, componentes ou sistemas secundários preferidos são pró-drogas ou componentes para fazer e usar pró-drogas, incluindo componentes para fazer a pró-droga propriamente dita e componentes para adaptar os anticorpos da invenção à função em tais pró-drogas ou modalidades ADEPT.
Onde a doença a ser tratada é câncer, o "pelo menos um segundo agente anticâncer" é escolhido em referência ao anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico, construção de 3G4, ou um derivado peptídico ligante à PE substancialmente impermeabilizante celular, preferencialmente um derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante celular, sendo o primeiro agente anticâncer. Os anticorpos da invenção podem então ser combinados com agentes quimioterapêuticos, citocinas, agentes antiangiogênicos, agentes indutores de apoptose ou 50 imunotoxinas anticâncer ou coaguligantes. "Agentes quimioterapêuticos" também incluem genes, vetores, construções sem sentido e ribozimas.
Agentes anticâncer normalmente preferidos são agentes anticâncer com efeitos antiangiogênicos, como na Tabela E; agentes anticâncer que induzem apoptose, como na Tabela F; e drogas antitubulina da familia da combretastatina. Um agente particularmente preferencial é docetaxel.
Em termos de composições, kits e/ou medicamentos da invenção, as quantidades eficazes combinadas de agentes terapêuticos pode ser compreendida em um único contêiner ou forma contêiner, ou compreendida em contêineres distintos ou em formas de contêineres. Os coquetéis irão geralmente ser misturados juntos para uso combinado. Agentes formulados para administração intravenosa irão geralmente ser preferidos. Componentes de visualização podem também ser incluídos. Os kits podem também compreender instruções para usar pelo menos um primeiro anticorpo e o(s) outro(s) componente(s) biológico(s) incluído(s).
Falando de forma generalizada, pelo menos o segundo agente anticâncer pode ser administrado ao animal ou paciente de forma substancialmente simultânea com o anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico, terapêutico baseado em 3G4 ou derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante celular; assim como a partir de uma única composição farmacêutica ou a partir de duas composições farmacêuticas administradas quase que juntamente.
Alternativamente, o pelo menos segundo agente anticâncer pode ser administrado ao animal ou paciente em um tempo 51 sequencial à administração do anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipídio aniônico, terapêutico baseado em 3G4 ou derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante celular. "Num tempo sequencial", como usado aqui, significa em estágios, de tal forma que pelo menos um segundo agente anticâncer é administrado ao animal ou paciente em um tempo distinto à administração do anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico, terapêutico baseado em 3G4 ou derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante celular. Os dois agentes são administrados em tempos efetivamente separados para permitir que os dois agentes exerçam seus respectivos efeitos terapêuticos, por exemplo, eles são administrados em "intervalos de tempo biologicamente eficazes". 0 pelo menos um segundo agente anticâncer pode ser administrado ao animal ou paciente em um tempo biologicamente eficaz anterior ao anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico, terapêutico baseado em 3G4 ou derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante celular, ou em um tempo biologicamente eficaz subsequente àquela terapêutica.
Visualização de tumor pode também ser conduzida, preferencialmente usando um anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico ou construção de anticorpo baseado em 3G4 marcada de forma detectada. Visualização de acordo com a invenção pode detectar células pré-apoptóticas e apoptóticas, de forma que ela possa ser usada após a terapia como um marcador substituto. Alternativamente, como a imagem formada será "profética" dos sítios de ligação da terapêutica a ser usada, visualização pode ser conduzida anterior ao tratamento. Tratamento de câncer pode ser então feito por: 52 (a) formação de uma imagem de um tumor pela administração a um animal ou paciente com tumor uma quantidade diagnosticamente mínima de pelo menos um primeiro agente ligante marcado de forma detectável, preferencialmente um anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico ou construção de anticorpo baseada em 3G4, compreendendo um agente diagnóstico eficientemente ligado ao agente ligante do tumor ou anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico ou anticorpo baseado em 3G4, então formando uma imagem detectável do tumor; e (b) administração subsequente ao mesmo animal ou paciente de uma quantidade terapeuticamente otimizada de pelo menos um primeiro anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico nu ou anticorpo 3G4 ou construção terapêutica agente-anticorpo usando um anticorpo tal, então causando um efeito antitumoral.
Formulações de imagem e tratamento ou medicamentos são então fornecidos, os quais geralmente compreendem: (a) Uma primeira composição farmacêutica compreendendo uma quantidade diagnosticamente efetiva de um agente ligante de tumor marcado de forma detectável, preferencialmente um anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico ou construção de anticorpo baseada em 3G4, que compreende um agente detectável eficientemente ligado ao agente de ligação de tumor ou anticorpo antiaminofosfolipídio 53 ou antifosfolipídio aniônico ou anticorpo baseado em 3G4; e (b) Uma segunda composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico nu ou anticorpo 3G4 ou construção terapêutica agente-anticorpo tal como um anticorpo.
Tratamento de infecções virais: Desenvolvimentos particularmente importantes e surpreendentes da invenção concernindo composições, combinações, kits, métodos, usos e medicamentos para tratar ou prevenir infecções virais. Os métodos de tratamento antivirais da invenção concernem a administração ou uso de qualquer um ou mais dos precedentes e agentes terapêuticos adicionais da invenção.
Num primeiro exemplo, as composições antivirais e métodos de tratamento da invenção concernem a administração ou uso de pelo menos um primeiro anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico purificado, ou fragmento ligante de antígeno relacionado, opcionalmente um que se liga a essencialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545), ou um derivado peptídico que se liga à PE substancialmente impermeabilizante celular, preferencialmente um derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante celular, como revelado acima em termos das composições e em termos de tratamento de câncer. Dos derivados peptídicos que se ligam à PE substancialmente impermeabilizantes celulares, aqueles preferidos para o uso irão ser derivados de duramicina substancialmente impermeabilizantes celulares, tais como 54 duramicina ligada à biotina ou duramicina ligada à HIgG. Dada a surpreendente conexão entre os anticorpos e peptídeos da invenção e infecções virais, a presente invenção também fornece uma variedade de novos agentes terapêuticos para uso no tratamento de infecções virais. Em particular, a invenção fornece um anticorpo para um aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico, particularmente PS e PE, eficientemente ligado a pelo menos um primeiro agente antiviral. Além disso a invenção fornece um derivado peptidico ligante à PE substancialmente impermeabilizante celular, preferencialmente um derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante celular, eficientemente ligado a pelo menos um primeiro agente antiviral. Agentes antivirais adequados para ligação aos anticorpos e peptídeos da invenção incluem aqueles apresentados na Tabela G.
Por essa razão, além de tudo, as composições antivirais e métodos de tratamento da invenção dizem respeito à administração a um animal ou paciente com uma infecção virai de uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um primeiro anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico purificado, ou fragmento antígeno ligante ou imunoconjugado antiviral relacionado, opcionalmente um que se liga a essencialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545), ou um derivado peptidico que se liga à PE substancialmente impermeabilizante celular, preferencialmente um derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante celular, ou imunoconjugado antiviral relacionado.
Os métodos de tratamento antivirais e usos da invenção são adequados para tratar todos os vírus em animais e 55 pacientes, e mesmo em plantas. Os agentes terapêuticos da invenção podem inibir a entrada virai, mas preferencialmente inibem a replicação virai, saida e disseminação a partir de células hospedeiras infectadas. A invenção é adequada para o tratamento de todos os virus que infectam vertebrados, como listados aqui na Tabela H, particularmente humanos, e particularmente virus que são patogênicos em humanos.
As infecções virais e doenças associadas que podem ser tratadas pela invenção incluem aqueles virus e doenças apresentadas na Tabela J, como exemplificado pelo Tratamento de CMV, RSV e infecções de arenavirus, e também hepatite, influenza, pneumonia, febre de Lassa e AIDS.
As composições e métodos de tratamento antiviral da presente invenção podem também ser usados em conjunto com outras terapias e diagnósticos. Esses usos "combinados" são combinados com agentes antivirais separados em composições, medicamentos, coquetéis, kits e métodos de tratamento combinados.
Os métodos de tratamento precedentes de câncer e antivirais e usos irão geralmente envolver a administração de uma composição farmaceuticamente eficaz ao animal ou paciente sistemicamente, tal como por injeção transdérmica, intramuscular, intravenosa e assim por diante. Para o tratamento de infecções virais, particularmente infecções respiratórias virais, a administração ao pulmão é preferida, como pode ser alcançada usando-se um aerossol. Entretanto, qualquer rota de administração que permita ao agente terapêutico localizar o tumor ou sitio da infecção virai será aceitável. 56
Então, outras rotas adequadas de distribuição incluem oral, retal, nasal, tópica e vaginal. Para usos e métodos para o tratamento de artrite, por exemplo, administração intrasinovial, pode ser empregado, como descrito para outros agentes imunológicos na Patente Americana número 5.753.230. Para condições associadas como olho, formulações oftálmicas e administração são contempladas. "Administração", como usado aqui, significa provisão ou distribuição de anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipidio aniônico ou terapêuticos baseados em 3G4, ou derivado peptidico que se liga à PE substancialmente impermeabilizante celular, preferencialmente derivados de duramicina em quantidade(s) e por período(s) de tempo eficaz para exercer um efeito terapêutico. A administração passiva de terapêuticos proteináceos é geralmente preferida, em parte, por sua simplicidade e reprodutibilidade.
Entretanto, o termo "administração" é aqui usado para se referir a qualquer e todos os meios pelos quais os terapêuticos são administrados. "Administração" então inclui o fornecimento de células que produzem os anticorpos antiaminofosfolipídios ou antifosfolipídio aniônicos, baseados em 3G4 ou terapêuticos derivados de duramicina de forma eficaz. Em tais modalidades, pode ser desejável a formulação ou acondicionamento de células em uma membrana permeável seletivamente, estrutura ou dispositivo implantável, geralmente uma que possa ser removido após cessar a terapia. Administração exógena irá ainda ser geralmente preferida, como ela representa um método não 57 invasivo que permite que a dose seja intimamente monitorada e controlada.
Os métodos terapêuticos e usos da invenção também se estendem para a provisão de ácidos nucléicos que codificam anticorpos antiaminofosfolipidios ou antifosfolipídio aniônicos, terapêuticos derivados de duramicina ou baseados em 3G4 de uma forma efetiva para resultar na sua expressão in vivo. Qualquer técnica de terapia genética pode ser empregada, tal como distribuição de DNA nu, genes recombinantes e vetores, distribuição baseada em células, incluindo manipulação ex vivo de células de pacientes, e coisas do tipo. Lipossomas e lipossomas "escondidos" serão preferidos para o uso em algumas modalidades.
As composições farmacêuticas e métodos de tratamento da invenção empregam "quantidades terapeuticamente eficazes" de um anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico, opcionalmente um que se liga a substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3G4 (ATCC PTA 4545), ou um fragmento antígeno ligante ou imunoconjugado de um tal anticorpo, ou um derivado peptídico que se liga à PE substancialmente impermeabilizante celular, preferencialmente um derivado de duramicina substancialmente impermeabilizante celular. Os "efeitos terapêuticos" e consequentes "quantidades terapeuticamente eficazes" são medidas por diferentes parâmetros no tratamento de câncer versus tratamento antiviral.
No tratamento de câncer, as quantidades dos agentes são eficientes para matar especificamente pelo menos uma porção das células tumorais, células endoteliais vasculares intratumorais ou tumorais; a especificamente induzir 58 apoptose em pelo menos uma porção de células tumorais, células endoteliais vasculares intratumorais ou tumorais; a promove especificamente a coagulação em pelo menos uma porção do tumor ou vasos sanguíneos intratumorais; a especificamente fechar ou destruir pelo menos uma porção dos vasos transportadores de sangue do tumor; a induzir necrose específica em pelo menos uma porção do tumor; e/ou induzir a regressão tumoral ou diminuição na administração a um animal ou paciente.
No tratamento de infecções virais e doenças relacionadas, as guantidades dos agentes são eficazes para inibir um ou mais reguerimentos para infecções virais em curso, tais como entrada virai, e preferencialmente, replicação virai, saída e disseminação das células hospedeiras infectadas. As guantidades podem também matar ou remover pelo menos uma porção das células infectadas por virus de uma forma que neutralize a replicação virai, disseminação e curso da infecção. Além de tudo, as quantidades dos agentes são eficientes para reduzir, reduzir significantemente ou erradicar a infecção virai na administração ao animal ou paciente.
Os termos "preferencialmente" e "especificamente", como usados aqui, significam que o anticorpo antiaminofosfolipídio ou antifosfolipidio aniônico, terapêuticos baseados em 3G4, ou derivados peptídicos que se liga à PE substancialmente impermeabilizante celular, preferencialmente derivados de duramicina, alcancem efeitos anticâncer ou antivirais que são substancialmente confinados ao sítio da doença, e não causem substancialmente coagulação, destruição e/ou necrose tecidual em tecidos normais e saudáveis do animal ou indivíduo. A estrutura e 59 função das células saudáveis e tecidos é então mantida substancialmente intacta pela prática da invenção.
DESCRIÇÃO SUMÁRIA DOS DESENHOS
Os seguintes desenhos de parte da presente especificação e são incluídos para, além disso, demonstrar certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor entendida por referência a um ou mais desses desenhos juntamente com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas aqui. 0 arquivo americano dessa patente contém pelo menos um desenho feito a cores. Cópias dessa patente com desenho(s) colorido(s) serão fornecidas pelo Patent nad Trademark Office em requerimento e pagamento da taxa necessária.
Figura 1: Localização do anticorpo anti-PS (3SB) em células endoteliais vasculares em linfoma de Hodgkin humano L540, carcinoma pulmonar 3LL de murina e tumores de melanoma de murina B16 em camundongos. Camundongos suportando tumores SCID foram injetados intravenosamente com 20 μρ de IgM de camundongos anti-PS (3SB) ou anti-CL (Dll). A circulação sanguínea foi difundida com salina depois de 1 hora. Camundongos foram sacrificados depois de 1 hora e tumor e órgãos foram coletados e rompidos congelados. IgM de camundongo foi detectada em seções congeladas usando conjugados de IgM peroxidase anti-camundongos de cabra. Anticorpo anti-PS especificamente localizado em vasos sanguíneos (indicados por setas) em todos os tumores. Nenhuma localização foi observada em camundongos injetados com controle, IgM anti-CL. 60
Figura 2a e Figura 2B: Ligação do anticorpo 9D2 e anexina V a fosfolipideos adsorvidos no plástico. Fosfolipideos foram absorvidos ao plástico de pratos microtiter. Após bloquear com 10% de soro, anticorpo o 9D2 (Figura 2a) ou anexina V (Figura 2B) foram adicionados em concentrações na faixa de 6,66 nM a 0,005 nM na presença de soro a 10%. Os pratos foram lavados e os anticorpos ligados a 9D2 e anexina V foram detectados usando IgM-HRP anti-ratos de cabra e IgG anti-anexina V de coelho seguido por HRP anti-coelho, respectivamente.
Figura 3: Inibição da ligação do anticorpo 9D2 e anexina V a fosfolipideos aniônicos em células endoteliais tratadas com H2O2 com lipossomas fosfolipidicos competidores. Anticorpo 9D2 e anexina V (6,66 nM) foram pré-incubados com vários lipossomas fosfolipidicos (200 μρ/πΛ) em tampão DPBS contendo 10% de soro. O anticorpo 9D2 ligado e anexina V foram detectados usando IgM-HRP anti-rato de cabra e IgG anti-anexina V de coelho seguido por HRP anti-coelho respectivamente. Ligação na presença ou ausência de lipossomas competidores foi determinada. Desvios padrão de medidas em triplicata foram menores do que 10% dos valores da média.
Figura 4: Localização do anticorpo 9D2 biotinilado e anexina V nas células endoteliais vasculares e células tumorais em tumores de mama humana ortotópicas MDA-MB-231 em camundongos.
Camundongos nu/nu possuindo tumores MDA-MB-231 em suas camadas adiposas mamárias receberam por injeção intravenosa 50 μg de anticorpo 9D2 biotinilado ou 100 μg de anexina V biotinilada. Uma hora mais tarde, suas circulações 61 sanguíneas foi perfundida com salina. Tumor e órgãos foram removidos e rompidos congelados. 9D2 e anexina V localizados foram detectados nas seções congeladas usando conjugado de estreptavidina-HRP. Seções tumorais derivadas de camundongos injetadas com salina ou IgM de ratos controle serviram como controles negativos.
Figura 5: Efeitos combinados de hipóxia e citocinas inflamatórias na exposição a PS. Células bEnd.3 foram tratadas por 24 horas com IL-lOC e TNFa sob condições normóxicas (barras brancas) e hipóxicas (barras cinzas). As monocamadas de células permaneceram intactas e viáveis sob essas condições. Externalização de PS foi determinada pela medida da ligação de 125I-anexina V. 0 nível de exposição a PS foi expresso como a percentagem destes em células tratadas com combinação de actinomicina D e TNFa.
Figura 6A e Figura 6B: Efeitos antitumorais no anticorpo anti-PS (3SB) em animais com tumores singênicos e xenogênicos. 1 x 107 células de carcinoma Colo 26 coloretal de murina (Figura 6A) ou linfoma L540 humano de Hodgkin (Figura 6B) foram injetados subcutaneamente no flanco direito de camundongos BALB/c (Figura 6A) ou camundongos machos CB17 SCID (Figura 6B) , respectivamente. Deixaram-se os tumores crescerem a um tamanho de cerca de 0,6 - 0,9 cm3 e então injetou-se nos camundongos (4 animais por grupo) intraperitonealmente com 20 μρ de anticorpo anti-PS nu (quadrados brancos) ou salina (círculos brancos). Tratamento foi repetido 3 vezes com intervalos de 48 horas. Os animais foram monitorados diariamente para medidas dos tumores e peso corporal. Camundongos foram sacrificados quando os tumores alcançaram 2 cm3, ou mais cedo caso os tumores 62 apresentassem sinais de necrose ou ulceraçao. Controle de IgM de camundongo apresentou resultados similares à salina.
Figura 7: Efeitos antitumorais do anticorpo 9D2 em camundongos com linfoma humano de Hodgkin's L540. Injetou-se 100 μg de anticorpo 9D2 (círculos brancos) em grupos de camundongos apresentando tumor intraperitonealmente 3 vezes por semana, de forma oposta o controle (quadrados brancos). O tamanho do tumor foi medido compassos de calibre duas vezes por semana. O volume tumoral é plotado contra o número de dias após a injeção de células tumorais. Os números entre parênteses indicam o número de camundongos com tumores regredidos/número de camundongos por grupo.
Figuras 8A, 8B, 8C, Figura 8D, Figura 8E, Figura 8F e Figura 8G. Efeitos antitumorais de anticorpos anti-PS, 3G4, em animais com tumores singênicos e xenogênicos. Células tumorais Meth A de murina (Figura 8A), câncer de mama humano MDA-MB-231 (Figura 8B e Figura 8E) , linfoma humano de Hodgkin's L540 (Figura 8C e 8D) e câncer MDA-MB-231 (Figura 8F e Figura 8G) foram injetadas em camundongos. Deixou-se ocorrer o crescimento dos tumores apresentados antes do tratamento. Permitiu-se que as células de linfoma humano de Hodgkin's formassem grandes tumores. Cada grupo de camundongos foi injetado intraperitonealmente 3 vezes por semana com 100 μρ de anticorpo 3G4 de forma oposta ao controle (3G4 é exposto nas Figura 8A, Figura 8B, Figura 8C; e apresentado por círculos abertos na Figura 8D, Figura 8E e Figura 8F) . Os animais foram monitorados duas vezes por semana para medidas tumorais. O volume tumoral é plotado contra o número de dias após a inoculação tumoral (Figura 8A) ou contra os dias de tratamento (Figura 8B e Figura 8C) por 20-30 dias (Figura 8A, Figura 8B e Figura 8C) ; números 63 nos parênteses indicam o número de camundongos com tumores regredidos/número total de camundongos por grupo) ou 60 dias (Figura 8D, Figura 8E e Figura 8F) . O anticorpo 3G4 e anticorpo quimérico 3G4 (ch3G4) foram usados para tratar células cancerígenas MDA-MB-231, de forma oposta ao controle (Figura 8G).
Figura 9A e Figura 9B. Inibição da replicação de CMV in vitro pelo anticorpo 3G4. Células HHF-R2 infectadas com CMV foram tratadas com 3G4 (dois painéis de cima). O controle nasce onde permaneceu não-tratado (dois painéis de baixo) ou onde houve tratamento com o isotipo do anticorpo GV39G IgG3 tomado como controle (dois painéis do meio). Células foram observadas em diferentes pontos de tempo: dia 3 (coluna da esquerda) e dia 9 (coluna da direita). Células infectadas aparecem em verde sob o microscópio fluorescente. Tratamento com anticorpo a 100 μρ/πϋΐ (Figura 9A) e 50 μg/mL (Figura 9B) .
Figura 10. Inibição dependente da concentração de replicação de CMV in vitro. Células HHF-R2 infectadas com CMV foram tratadas com diferentes concentrações de 3G4 (painéis de cima). O controle nasce onde permaneceram não-tratados (painel de baixo) ou onde foram tratados com o isotipo tomado como controle, anticorpo IgG3 GV39G (painéis do meio). Células foram observadas no dia 9. Células infectadas aparecem verdes sob o microscópio fluorescente.
Figura 11A, Figura 11B e Figura 11C. Quantificação de carga virai CMV em células tratadas com anticorpo e inibição de replicação em um estágio mais avançado do ciclo de replicação virai. Monocamadas de fibroblastos humanos foram infectados com CMV a uma baixa m.o.i. de 0,01 UFC/célula e 64 tratadas com as concentrações indicadas de anticorpo 3G4; o anticorpo controle, GV39G; ou o anticorpo controle anticolchicina, C44 (Figura 11A; Não-tratado, controle não-tratado). Monocamadas de fibroblastos humanos foram infectadas com CMV a uma alta m.o.i of 3 UFC/cell e tratadas com 50 μρ/ηϋΐ, ou 100 μρ/ηϋΐι do anticorpo 3G4 ou o anticorpo controle, GV39G (Figura 11B) . Monocamadas de fibroblastos humanos foram infectadas com CMV a uma alta m.o.i., o anticorpo 3G4 ou o anticorpo controle, GV39,G fora ]m adicionados nos pontos de tempo indicados após infecção (Figura 11C) . Em cada uma das Figuras 11A, Figura 11B e Figura 11C, a carga virai nas células e sobrenadantes foi quantificada usando um teste de placa padrão.
Figura 12. Inibição da replicação RSV in vitro por anticorpos 3G4, 1B9 e 3SB. Células A-549 RSV-infectadas foram tratadas com 3G4, 1B9 ou 3SB ou deixadas sem tratamento como controle. Tratamento com 1B9 (verde) e 3SB (vermelho) resultou em um registro de decréscimo na replicação virai (contra controle em azul). O efeito antiviral mais pronunciado de 3G4 é mostrado em rosa. Figura 13A, Figura 13B, Figura 13C, Figura 13D, Figura 13E, Figura 13F, Figura 13G, Figura 13H, Figura 131, Figura 13J, Figura 13K, Figura 13L, Figura 13M, Figura 13N, Figura 130, Figura 13P, Figura 13Q e Figura 13R. Estruturas de derivados de duramicina. As estruturas quimicas de derivados de duramicina exemplares do Exemplo XV são representadas. Em cada um dos compostos da Figura 13A até a Figura 130, o peptídeo ligante à PE, duramicina, tem sido ligado a um grupo impermeabilizante celular para prevenir a construção de exercer efeitos tóxicos significantes não-especificos. A estrutura esquemática de peptideo cíclico de duramicina de partida é apresentada na Figura 13P. A sequência linear é 65 representada por SEQ ID NO: 9, e as estruturas dos aminoácidos modificados na sequência são representadas na Figura 13Q. Figura 13R representa uma construção antiviral de duramicina exemplar, na qual duramicina é ligada ao cidofovir.
Figura 14A, Figura 14B, Figura 14C e Figura 14D. Especificidades de ligação de derivados da duramicina. Os derivados de duramicina foram preparados como descrito no Exemplo XV e suas especificidades determinadas usando ELISAs e ELISAs de competição, como descrito no Exemplo XVI. Figura 14A, perfil de ligação de fosfolipídeos de derivados de duramicina contra um painel de fosfolipídeos, apresentando especificidade para PE; Figura 14B, soro não tem efeito significante na ligação à PE. Figura 14C e Figura 14D resulta de ELISAs de competição confirmando a especificidade de derivados de duramicina para PE.
Figura 15. Inibição da replicação de CMV in vitro por derivados de duramicina. Células HHF-R2 infectadas com CMV foram tratadas com derivados de duramicina (DLB)4NA e (DIM)nHIgG. 0 poço controle foi deixado sem tratamento. Células foram observadas em diferentes pontos de tempo: dia 4 (painéis da esquerda) e dia 6 (painéis da direita). Células infectadas aparecem verdes sob o microscópio de fluorescência. (DLB) 4NA e (DIM)nHIgG inibem a difusão virai a partir de células individualmente infectadas.
Figura 16. Inibição seletiva de células endoteliais em divisão por anticorpos anti-PS. Os anticorpos anti-PS 3SB, 9D2 e 3G4 foram testados para efeitos inibitórios em células endoteliais in vitro como no exemplo XVIII. Cada um dos anticorpos 3SB, 9D2 E 3G4 exibiram inibição seletiva da 66 divisão de células endoteliais (subconfluente) em oposição às células quiescentes (confluente). Ambos os anticorpos 9D2 e 3G4 têm um maior efeito inibitório do que 3SB.
Figura 16A e Figura 17B. Efeitos alvejantes antiangiogênicos e vasculares do anticorpo 3G4 em camundongos com tumor. Camundongos nus com tumores ortotópicos MDA-MB-231 foram tratados três vezes por semana com 100 μρ/όοεε de anticorpo 3G4 (tratado, painéis da direita) ou com a mesma dose de um isotipo equivalente, anticorpo controle (controle, painéis esquerdos). Na conclusão do tratamento, animais foram perfundidos e tumores foram rompidos congelados, cortados e manchados com um anticorpo da murina CD31 (rato, anticamundongo), um marcador pan-endotelial da vasculatura de murina (Figura 17A), ou embebida em parafina e manchado com H&E (Figura 17B). Comparando as seções tumorais do controle e de animais tratados nota-se que a administração de 3G4 resulta em efeitos antiangiogênicos (Figura 17A) e alvejamento vascular (Figura 17B).
Figura 18A e Figura 18B. DNA e sequências de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo 3G4. Sequências de aminoácidos e DNA para as cadeias pesadas (Figura 18a, SEQ ID NO:l e SEQ ID NO: 2) e leves (Figura 18B; SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4) são apresentadas, e os sítios de restrição nas sequências de DNA são apresentados. A sequência líder é distinguida da proteína madura, que começa conforme apresentado pela primeira seta na Figura 18A e Figura 18B. Formas exemplares de enxertar cada sequência variável com uma região constante humana são demonstradas, onde a primeira parte das respectivas sequências das regiões constantes humanas (SEQ 67 ID NO :7 e SEQ ID NO: 8) é apresentada pela segunda seta na Figura 18A e na Figura 18B.
Figura 19A e Figura 19B. Comparação da ligação de PS no anticorpo IgG anti-PS, 3G4, com o anticorpo IgM anti-PS, 3SB. A ligação de PS no anticorpo IgM, 3SB (♦) e dois anticorpos IgG, 3G4 (^) e 3B10 () foi determinada por ELISA usando concentrações de anticorpos até 3,375 nM (Figura 19A) . A ligação de PS dos anticorpos 3SB (♦), 3G4 (x) e 3B10 () em concentrações de até 0,06 nM é mostrada separadamente (Figura 19B).
Figura 20. Inibição da ligação do anticorpo 3G4 à PS imobilizada usando lipossomas fosfolipideos competidores. O anticorpo 3G4 (0,1 μρ/ηϋ.) foi pré-incubado por 30 minutos com vários lipossomas feitos a partir de fosfolipideos puros (PS-L, PE-L, PI-L, PC-L, CL-L, PA-L e PG-L) ou somente tampão (controle). As misturas foram adicionadas a pratos de ELISA cobertos de PS, lavados e anticorpos ligados foram detectados usando anticorpos secundários e OPD. Ligação na presença dos lipossomas listados é apresentada e comparada à ligação do anticorpo 3G4 na ausência de qualquer lipossoma.
Figura 21. Ligação de 3G4 quimérico a fosfolipideos. O anticorpo quimérico 3G4 (ch3G4) foi preparado conforme descrito no Exemplo XIX, Fosfolipideos (PS, PI, PE, PC, SM, CL, PG e PA) foram adsorvidos a placas plásticas ou de microtitulação. Após bloqueio, anticorpo 3G4 quimérico foi adicionado nas concentrações apresentadas. As placas foram lavadas e o anticorpo quimérico 3G4 ligado foi detectado via ligação de anticorpo secundário e desenvolvimento. 68
Figura 22. Localização de 3G4 quimérico no tumor endotélio vascular in vivo. ch3G4 biotinilado (painéis de cima) e IgG controle (painéis de baixo) foram administrados a camundongos com tumores MD-MBA-435s. Seções tumorais foram manchadas com o anticorpo MECA 32 seguido por anticorpo secundário IgG anti-rato marcado com FITC foi conduzido para detectar endotélio vascular (painéis do meio). As imagens vermelhas e verdes foram fundidas (painéis da direita), depois do que proteínas biotiniladas ligadas ao endotélio da vasculatura do tumor apareceram em amarelo. A mancha coincidente do anticorpo 3G4 localizado e do marcador MECA 32 do endotélio vascular é apresentada pela cor amarela nas imagens sobrepostas (alto à direita).
Figura 23. Aumento da fagocitose dos macrófago de células PS-positivas por 3G4. Células tumorais HL-60 foram marcadas com a tintura verde fluorescente CFDA, e exposição à PS foi induzida por 200 μΜ H2O2. Células tratadas foram coletadas e opsonizadas durante 1 hora usando 5 μρ/ιηΕ de 3G4 ou um anticorpo controle (BBG3) de isotipo igual. Células alvo foram então adicionadas a macrófagos, os quais foram isolados de ossos de camundongos e cultivados em cavidades laminares durante 5 dias em meio contendo 5 ng/mL de GM-CSF. Após 2 horas, as lâminas foram fixadas e fagocitose foi visualmente contada sob microscópio de fluorescência. Resultados são apresentados como a percentagem de macrófagos fagocitários (macrófagos que tenham fagocitado pelo menos uma célula tumoral).
Figura 24A e Figura 24B. Indução da exposição à PS em células endoteliais por docetaxel. Células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) e células endoteliais de microvasos humanos (HMVEC) foram tratadas com 10 nM de 69 docetaxel por 24 horas. Células foram coletadas, lavadas com PBS e incubadas com 3G4 a 10 μρ/πΛ por 30 minutos, em gelo. As células foram então lavadas duas vezes, IgG anticamundongo de cabra marcada com FITC foi adicionada e as células incubadas por um período de mais 30 minutos em gelo. As células foram então lavadas e analisadas por FACS usando um citômetro FACSCalibu (Becton-Dickinson, San Jose, CA) com software de aquisição CellQuest. Tanto HMVEC (Figura 24B) quanto HUVEC tratada (Figura 24A) apresentam aumento significante na ligação de 3G4 quando comparado à células não-tratadas.
Figura 25A, Figura 25B e Figura 25C. Indução da exposição de PS à linhas de células tumorais por docetaxel. Carcinoma 3LL de pulmão de camundongo Lewis, carcinoma de cólon de camundongos Colo 26 e células de câncer de mama humano MDA-MB-435 foram tratadas com 10 nM de docetaxel por 24 horas. Células foram coletadas, lavadas com PBS e incubadas com 3G4 a 10 μρ/ηϋΐ por 30 minutos, em banho de gelo. As células foram então lavadas duas vezes, IgG anti-camundongos de cabra marcada com FITC foi adicionado e as células incubadas por mais 30 minutos em banho de gelo. As células foram então lavadas e analisadas por FACS usando um citômetro FACSCalibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA) com software de aquisição CellQuest. As células de MDA-MB-435 (Figura 25C), Colo 26 (Figura 25B) e 3LL tratadas (Figura 25A) apresentaram aumento significante na ligação de 3G4 quando comparadas com células não-tratadas.
Figura 26A. Indução da exposição à PS em células MDA-MB-231 de câncer de mama humano por docetaxel. Células MDA-MB-231 de câncer de mama humano foram tratadas com 10 nM de docetaxel por 24 horas. Células foram coletadas, lavadas com 70 PBS e incubadas com 3G4 quimérico (ch3G4) ou controle, IgG humana por 30 minutos, em gelo. As células foram então lavadas duas vezes, anti-IgG marcada com FITC foi adicionada e as células analisadas por FACS, como acima. Existe um aumento significante na ligação a ch3G4 quando comparada com o controle, IgG humana.
Figura 27. Tratamento com anticorpos anti-PBS aumentam a sobrevivência de camundongos infectados com mCMV. Camundongos Balb/C foram infectados com mCMV e tratados com 3G4 ou ch3G4 conforme descrito no Exemplo XXI. Os camundongos foram monitorados para sobrevivência passados 90 dias após a infecção.
Figura 28. Tratamento com derivado de duramicina-biotina, DLB aumenta a sobrevivência de camundongos infectados por mCMV. Camundongos Balb/C foram infectados com mCMV e tratados com DLB conforme descrito no Exemplo XXII. Os camundongos foram monitorados para sobrevivência passados 90 dias após a infecção.
Figura 29A e Figura 29B. Ligação de 3G4 quimérico à células infectadas com vírus Vaccinia. Células U937 foram infectadas com vírus Vaccinia e manchado com o anticorpo quimérico 3G4 (ch3G4) ou controle IgG humana (HigG) no dia 2 após a infecção. Figura 29A, células U-937 não-infectadas. Figura 29B, células U-937 infectadas com vírus Vaccinia. Os picos na Figura 29A e Figura 29B são: pico da esquerda (vermelho), controle sozinho de anticorpo secundário; pico do meio (azul), controle de HigG; pico da direita (verde), ch3G4.
Figura 30A, Figura 30B, Figura 30C e Figura 30D.
Inibição da replicação do vírus Pichinde em um m.o.i. de 71 0,01 UFC/cell. As células infectadas foram tratadas com 100 μg/mL de 3G4 (Figura 30A) ou anticorpo controle equivalente ao isotipo, GV39G (Figura 30B). No dia 2 após a infecção, as células foram coletadas com tripsina e permitiu-se que aderissem à lâminas. As células foram fixadas com acetona, e manchadas com soro policlonal de coelho anti-PIC seguido por anticorpo secundário conjugado biotina anti-coelho de cabra. O anticorpo secundário sozinho não produziu manchas (Figura 30C) . A percentagem de células infectadas no 3G4 contra células controle tratadas também é apresentada (Figura 30D).
Figura 31. Duramicina-Humana IgG (HIgG) conjugado inibe crescimento de tumor MethA in vivo. Camundongos BALB/c com células de tumor MethA foram tratadas com o conjugado duramicina-HigG (D-SIAB)NHigG, no qual duramicina é conjugada a HigG usando o ligante SIAB, ou com controle HigG conforme descrito no Exemplo XXV.
Figura 32. Conjugado de duramicina não é citotóxico. O composto duramicina naturalmente ocorrente e a construção de duramicina biotinilada, DLB foram testadas para efeitos citotóxicos em células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) usando um teste MTT.
Figura 33. Conjugado duramicina-anticorpo aumenta a fagocitose de macrófagos de células apoptóticas. Um conjugado de duramicina-anticorpo foi construído pela ligação de duramicina a CC4, um anticorpo IgG2a de camundongo, para criar duramicina-C44 (DuC44). Células apoptóticas HL-60 foram incubadas com macrófagos derivados de medula óssea de camundongos na presença de DuC44, um anticorpo de camundongo controle, BBG3 e anticorpo 3G4. Fagocitose foi avaliada como a percentagem de fagócitos 72 positivos para levantamento. Dados são valores de média ± erro padrão.
DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS
Tumores sólidos e carcinomas contabilizam por mais de 90% de todos os cânceres em homens. Embora o uso de anticorpos monoclonais e imunotoxinas tem sido investigado na terapia de linfomas e leucemias (Vitetta et al., 1991), esses agentes têm sido ineficientes de forma desapontadora em triagens clinicas contra carcinomas e outros tumores sólidos (Abrams e Oldham, 1985) . A razão principal para a ineficiência de tratamentos baseados em anticorpos é que macromoléculas não são prontamente transportadas para dentro de tumores sólidos. Mesmo uma vez em uma massa tumoral, essas moléculas falham na distribuição constante devido à presença de junções compactas entre células tumorais, estroma fibroso, gradientes de pressão intersticial e barreiras de sítios de ligação (Denekamp, 1990; Dvorak et al., 1991).
No desenvolvimento de novas estratégias para tratar tumores sólidos, os métodos que envolvem alvejamento da vasculatura do tumor, ao invés de células tumorais, oferecem vantagens distintas. Uma efetiva destruição ou bloqueio dos vasos tumorais prendem o fluxo de sangue pelo tumor, resultando em uma avalanche de morte de células tumorais. Construções anticorpo-coagulante e anticorpo-toxina, exemplos de VTA os quais destroem seletivamente e/ou ocludem vasos sanguíneos tumorais, têm já sido usados para aumentar o efeito na marcação específica e destruição da vasculatura tumoral, resultando na necrose tumoral (Burrows et al., 73 1992; Burrows e Thorpe, 1993; WO 93/17715; WO 96/01653; Huang et al., 1997. VTA exerce sua ação primária nos vasos sanguíneos pré-existentes de tumores sólidos, e diferem de agentes antiangiogênicos que previnem a formação de novos vasos sanguíneos. Existem numerosas vantagens das VTAs sobre outras terapias de câncer. Primeiro, um único vaso fornece a nutrição para e facilita a remoção de produtos inúteis do metabolismo de centenas ou milhares de células tumorais, e apenas tem que ser danificada em um ponto para bloquear o fluxo de sangue para cima e para baixo. VTAs são então particularmente eficientes em tumores estabelecidos. Segundo, matança de células endoteliais, embora um mecanismo útil, não é requerido. Uma mudança de forma ou de local de iniciação da coagulação sanguínea pode ser suficiente. Terceiro, a célula endotelial é adjacente ao fluxo de sangue, assegurando distribuição adequada da droga. Quarto, o alvo é uma célula diplóide normal que não é propenso de adquirir mutações genéticas que resultem em resistência a droga. Quinto, um marcador de indica como substituto de atividade biológica, por exemplo, fluxo sanguíneo, é mensurável.
Sexto, efeitos temporários na função vascular pode ser suficiente para efeitos antitumorais significantes. Estudos indicam que mais de 99% de células tumorais in vivo podem ser mortas durante um período de 2 horas de isquemia. Finalmente, ao contrário dos inibidores de angiogênese, VTAs apenas exigem administração intermitente para sinergizar com tratamentos convencionais, ao invés de administração crónica durante meses ou anos. 74 VTAs citotóxicos sao descritos nas seguintes patentes: Patentes Americanas números 5.660.827, 5.776.427, 5.863.538, 5.965.132, 6.004.554, 6.051.230, 6.261.535 e 6.451.312. Onde anticorpos, fatores de crescimento ou outros ligantes que se ligam são usados para especificamente distribuir um coagulante à vasculatura tumoral, tais agentes são nomeados "coaguligantes". VTAs coaguligantes são descritos nas seguintes patentes: Patentes Americanas números 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289 e 6.036.955.
Um coagulante normalmente preferido para uso em coaguligantes é o Fator Tecidual cortado (tTF) (Huang et al., 1997; WO 96/01653; Patente Americana 5.877.289). TF é o maior iniciador da coagulação sanguinea (Ruf et al., 1991; Edgington et al., 1991). Em sitios de injúria, Fator VlI/VIIa no sangue entra em contato com, e liga-se a, TF em células nos tecidos perivasculares. O complexo TF:VIIa, na presença da superfície de fosfolipídio, ativa os fatores IX e X. Isso, por sua vez, leva à formação de trombina e fibrina e, por último, um coágulo sanguíneo (Ruf e Edgington, 1994) . O recombinante, forma cortada de fator tecidual (tTF) , faltando os domínios citosólicos e transmembranais, é uma proteína solúvel que tem cerca de cinco vezes de magnitude abaixo da habilidade indutora de coagulação do que TF natas (Stone et al., 1995; Huang et al., 1997). Isto é porque TF precisa estar associada com fosfolipídeos para o complexo com Vila para ativar IXa ou Xa eficientemente. Entretanto, quando tTF é distribuído ao endotélio vascular tumoral por meios de um agente ou anticorpo alvejante, este é trazido de volta para a proximidade de uma superfície lipídica e ganha novamente atividade trombogênica (Huang et al., 1997; 75
Patente Americana números 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289 e 6.036.955) . Um coaguligante é então criado que seletivamente trombose a vasculatura tumoral. TF truncado tem várias vantagens que recomendam seu uso em coaguligantes vasculares alvejados. tTF humana é prontamente disponível, e a proteína humana terá imunogenicidade baixa ou desprezível em seres humanos; tTF humana é completamente funcional em animais experimentais, incluindo camundongos; e tTF alvejado é altamente potente porque ela dispara a ativação de uma cascata de proteínas de coagulação, dando um grande efeito amplificado (Patentes Americanas números 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289 e 6.036.955) .
Uma gama de moléculas alvo adequadas que são disponíveis no endotélio tumoral, mas amplamente ausente de endotélios normais, têm sido descritos. Por exemplo, alvos expressos podem ser utilizados, tais como endoglina, E-selectina, P-selectina, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, um TIE, um ligante reativo com LAM-1, um receptor VEGF/VPF, um receptor FGF, integrina (Χνβ3, pleiotropina ou endosialina (Patentes Americanas 5.855.866, 5.877.289; Burrows et al., 1992;
Burrows e Thorpe, 1993; Huang et al., 1997; Liu et al., 1997; Ohizumi et al., 1997).
Alvos adsorvidos são outro grupo adequado, tal como VEGF, FGF, TGFp, HGF, PF4, PDGF, TIMP, um ligante que se liga a TIE ou uma isoforma de fibronectina associada a tumor (Patentes Americanas números 5.877.289, 5.965.132, 6.051.230 e 6.004.555). Isoformas de fibronectina são ligantes que se ligam à família de receptores de integrina. Isoforma de fibronectina associadas a tumor são componentes que podem 76 ser alvejados tanto da vasculatura tumoral quanto do estroma tumoral. 0 anticorpo monoclonal BC-1 (Carnemolla et al., 1989) especificamente se liga às isoforma de fibronectina associadas a tumor.
Outros alvos induzíveis pelo ambiente natural do tumor ou intervenção subsequente do homem são também entidades que podem servir como alvo, como descrito nas Patentes Americanas números 5.776.427, 5.863.538 e 6.036.955. Quando usado em conjunto com anterior supressão em tecidos normais e indução vascular tumoral, antígenos MHC Classe 2 podem também ser empregados como alvos (Patentes Americanas números 5.776.427, 5.863.538, 6.004.554 e 6.036.955). Um alvo geralmente preferido para aplicações clinicas é a molécula-1 de adesão endotelial vascular (VCAM-1) (Patentes Americanas números 5.855.866, 5.877.289, 6.051.230, 6.004.555 e 6.093.399). VCAM-1 é uma molécula de adesão celular que é induzida por citocinas inflamatórias IL-la, IL-4 (Thornhill et al., 1990) e TNFa (Munro, 1993) e cujo papel in vivo é recrutar leucócitos para sítios de inflamação aguda (Bevilacqua, 1993). VCAM-1 está presente em células da vasculatura endotelial em um número de tumores malignos humanos incluindo neuroblastoma (Patey et al., 1996), carcinoma renal (Droz et al., 1994), carcinomas pulmonares não-pequenos (Staal-van den Brekel et al., 1996), doença de Hodgkin (Patey et al., 1996), e angiosarcoma (Kuzu et al., 1993), assim como em tumores benignos, tais como angioma (Patey et al., 1996) e hemangioma (Kuzu et al., 1993). Expressão constitutiva de VCAM-1 em seres humanos é confinada a poucos vasos na tiróide, timo e rins (Kuzu et al., 1993; Bruijn e Dinklo, 77 1993), e em camundongo para vasos no coraçao e pulmão (Fries et al., 1993).
Seguramente dos dados apresentados aqui mesmo adicionais suplementos aqueles fornecidos nas Patentes Americanas números 5.855.866, 5.877.289, 6.051.230, 6.004.555 e 6.093.399, e apresentada a indução seletiva de trombose e enfarte do tumor resultante da administração de um coaguligante anti-VCAM-l*Ttf. Os resultados apresentados foram gerados usando-se camundongos com linfoma L450 humano de Hodgkin. Quando crescido como um xenoenxerto em SCID de camundongo, esse tumor apresenta intima similaridade à doença humana em respeito à expressão de citocinas inflamatórias (Diehl et al., 1985) e a presença de VCAM-1 e outras moléculas de ativação endotelial nesta vasculatura.
Usando um coaguligante anti-VCAM-l*Ttf covalentemente ligado, no qual tTF foi diretamente ligado ao anticorpo anti-VCAM-1, é apresentado aqui que o coaguligante localiza seletivamente os vasos tumorais, induz trombose desses vasos, causa necrose par desenvolver pelo tumor e retarda crescimento tumoral em camundongos com tumores sólidos L450 de Hodgkin. Tumores geralmente precisavam ter pelo menos cerca de 0,3 cm em diâmetro para responde ao coaguligante, porque VCAM-1 estava ausente de pequenos tumores. Presumivelmente, em pequenos tumores, os níveis de citocinas secretadas por células tumorais ou células hospedeiras que infiltram o tumor são muito baixos para indução por VCAM-1. Isto está de acordo com os estudos das Patentes Americanas números 5.855.866, 5.877.289, 6.051.230, 6.004.555 e 6.093.399 onde as invenções apresentaram-se como sendo mais úteis em tumores sólidos maiores. 78
Embora a mancha com VCAM-1 foi inicialmente observada mais na periferia do tumor, o coaguligante evidentemente se ligou a e ocludiu os vasos transportadores de sangue - -como ele foi capaz de reduzir o fluxo sanguíneo em todas as regiões tumorais. Além disso, um dos inventores considerou que a geração de trombina causada pela administração inicial do coaguligante provavelmente levou a indução adicional de VCAM-1 em vasos centrais (Sluiter et al., 1993), resultando em um sinal amplificado e evidente destruição da região intratumoral. Esse tipo de expressão induzida por coagulante de marcadores adicionais que servem como alvo, e então amplificação do sinal, é também revelada na Patente Americana número 6.036.955.
Como mostrado aqui, embora a localização de vasos exprimindo VCAM-1 no coração e pulmão de camundongos foi observada na administração de um coaguligante anti-VCAM-1, essa construção não induziu trombose em tais sítios não-tumorais. Além disso, o coaguligante anti-VCAM-1 não foi mais tóxico aos camundongos do que foi o coaguligante controle de especificidade irrelevante, novamente indicando que a expressão constitutiva de VCAM-1 no coração e vasos pulmonares não levaram à toxicidade. Esse dado é importante para o progresso clínico imediato da terapia coaguligante, dado que VCAM-1 é um marcador de ocorrência natural do endotélio da vasculatura tumoral em humanos. Entretanto, esse fenômeno também forneceu aos inventores um discernimento único, levando a uma abordagem totalmente diferente da destruição da vasculatura tumoral. A. Tratamento tumoral com anticorpos nus para aminofosfolipídeos 79
Os inventores empeharam-se para entender o mecanismo por trás da habilidade do coaguligante anti-VCAM-1 de se ligar ao VCAM-1 constitutivamente expresso em vasos sanguíneos no coração e pulmões, e ainda não causar trombose naqueles vasos. Existem numerosas possibilidades científicas para essa observação empírica, geralmente conectada com a natureza protrombótica do ambiente tumoral e qualquer predisposição fibrinolítica no coração e pulmões.
Geralmente, existe um equilíbrio biológico entre o sistema de coagulação (deposição de fibrina) e o sistema fibrinolítico (degradação de fibrina por enzimas). Entretanto, em doenças malignas, particularmente carcinomas, esse equilíbrio é quebrado, resultando na ativação anormal da coagulação (hipercoagulabilidade ou o "estado protrombótico". Apesar de extensa pesquisa, uma explicação clara molecular para a natureza protrombótica do ambiente tumoral não poderia ser discernida até recentemente.
Após análise detalhada de muitas opções possíveis, os inventores entenderam que a falha do coaguligante VCAM-1 de causar trombose em vasos de tecidos normais era devido à ausência do aminofosfolipídio, fosfatidilserina (PS) da superfície luminal de tais vasos. Para completar a teoria, então, não apenas poderia fosfatidilserina ter que demonstrar estar ausente desses vasos normais, mas sua presença no lado luminal dos vasos associados a tumor poderia ter que ser demonstrada.
Os inventores então usaram marcação imunoistoquímica para avaliar a distribuição de um anticorpo monoclonal antifosfatidilserina (anti-PS) injetado intravenosamente em camundongos com tumor. Esses estudiosos revelaram que os 80 vasos expressando VCAM-1 no coraçao e pulmões não tinham PS, enquanto os vasos que exprimiam VCAM-1 no rumor exprimiam PS. A necessidade para expressão de PS de superfície na ação coaguligante é adicionalmente indicada pela descoberta do inventor que anexina V, a qual se liga a PS, bloqueia ação coaguligante anti-VCAM-l*tTF, tanto in vivo como in vitro A falta de efeito trombótico do coaguligante anti-VCAM-1 em vasos do coração e pulmão normais foi então explicada, pelo menos em parte: a ausência do aminofosfolipídeo, fosfatidilserina, significa que os vasos normais não tem uma superfície procoagulante na qual os complexos de coagulação podem construir. Na ausência de PS de superfície, anti-VCAM-l*tTF se liga a vasos de coração e pulmão expressando VCAM-1, mas não pode induzir trombose. Em contraste, vasos exprimindo VCAM-1 no tumor apresentam expressão coincidente de PS de superfície. 0 coaguligante que se liga aos vasos tumorais e ativa fatores de coagulação localmente para formar um trombo oclusivo.
Além de delinear os efeitos trombóticos tumor-específicos dos coaguligantes anti-VCAM-1, a expressão específica do aminofosfolipídeo, fosfatidilserina, na superfície luminal dos vasos sanguíneos tumorais também permitiram aos inventores explicarem o fenótipo protrombótico observado, mas não entendido, em estudos recentes. A expressão de PS tem um papel significante no estado protrombótico da vasculatura tumoral.
Seguindo a descoberta deles de que o aminofosfolipídeo representativo, fosfatidilserina, foi especificamente expresso na superfície luminal dos vasos sanguíneos tumorais, mas não em vasos sanguíneos normais, os inventores 81 entenderam que outros aminofosfolipídeos tinham potenciais como alvos para intervenção terapêutica. Os inventores então desenvolveram métodos de tratamento e alvejamento da vasculatura tumoral baseando-se em tomar como alvo os aminofosfolipidios fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina (PE) .
Um aspecto particularmente surpreendente do estudos dos inventores foi que a administração de um anticorpo antiaminofosfolipídio não-conjugado foi eficiente no tratamento de tumor. Isto deu suporte para novas passagens importantes do tratamento tumoral usando anticorpos não-con jugados ou "nus" que se ligam a aminofosfolipidios. Esses métodos de tratamento e alvejamento da vasculatura tumoral são descritos na Patente Americana número 6.406.693. Embora efeitos antitumorais em modelos de animais aceitos pela arte são demonstrados na Patente Americana número 6.406.693, e estendidos aqui, a habilidade de aminofosfolipidios de agir como marcadores alvejáveis eficientes e seguros da vasculatura tumoral não poderia ter sido prevista a partir de estudos anteriores à Patente Americana número 6.406.693.
Uma vez que a descoberta de aminof osf olipidios como marcadores específicos da vasculatura tumoral tem sido provada, os inventores começaram a desenvolver uma variedade de imunotoxinas que possam ser alvejadas por aminofosfolipidios e coaguligantes para uso no tratamento tumoral. Como explicado na Patente Americana número 6.406.693, isso levou a descoberta inesperada de anticorpos antiaminofosfolipidios para uso no tratamento tumoral. Na investigação do potencial de alvejar no aminofosfolipídio no contexto de distribuição de uma toxina ou coagulante à vasculatura tumoral, os inventores por acaso descobriram que 82 anticorpos anti-PS nus tinham um efeito destrutivo na vasculatura tumoral in vivo na ausência de qualquer parte efetora adicional. A habilidade de anticorpos antiaminofosfolipidios de tanto localizar especificamente a vasculatura tumoral e exercer um efeito destrutivo concomitante , levando à necrose tumoral, foi inesperado. A presente invenção fornece inesperados e melhorados anticorpos anti-PS de "sequnda geração" para uso, entre outras modalidades, como anticorpos nus em tratamento tumoral. Um painel de anticorpos anti-PS de segunda geração é revelado aqui, do qual os anticorpos monoclonais 9D2 e 3G4 (ATCC 4545) são normalmente preferidos, juntamente com técnicas de triagem e imunização particulares para a geração de anticorpos adicionais com tais propriedades vantajosas. Também é apresentado aqui que dano vascular aos vasos tumorais por anticorpos anti-PS e mediada, pelo menos em parte, através de efetores do hospedeiro. Esses e outros critérios dos presentes inventores permitiram a otimização do tratamento com anticorpos nus, tanto com uso sozinho quanto em combinação com outros agentes anticâncer, como ensinado aqui. B. Tratamento tumoral usando anticorpos para fosfolipidios aniônicos
Patente Americana número 6.406.693 explica que os aminofosfolipidios fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina são normalmente segregados à superfície interna da membrana plasmática de dupla camada em diferentes células (Gaffet et al., 1995; Julien et al., 1995) e que esta segregação lipídica cria uma transbicamada assimétrica. Embora a existência de assimetria membranar tenha sido discutida por 83 algum tempo, a razão para sua existência e os mecanismos para sua geração e controle são escassamente entendidos (Williamson e Schlegel, 1994), particularmente em células exceto plaquetas.
Os inventores logo demonstraram que PS é translocado para a superfície de células endoteliais da vasculatura tumoral e que isso ocorre, pelo menos em parte significante, independentemente de mecanismos apoptóticos ou outros mecanismos de morte celular (Patente Americana número 6.406.693). Então, a expressão superficial de PS no ambiente tumoral não é uma consequência da morte celular, nem ela inicia a imediata destruição celular. Apesar da exposição de PS ser detectada consistentemente em células endoteliais vasculares intactas em vários tumores sólidos, o endotélio vascular tumoral não é abertamente apoptótico, mas é morfologicamente anunciado (embora diferente àquele em tecidos normais) e metabolicamente ativo. Isto é importante para métodos terapêuticos baseados no alvejamento de PS, significando que translocação de PS para a superfície externa nas células endoteliais da vasculatura tumoral é suficientemente estável para PS para servir como uma entidade que pode ser tomada como alvo para terapia bem sucedida (usando tanto anticorpos nus como conjugados terapêuticos).
Apesar das importantes descobertas da Patente Americana número 6.406.693 (e 6.312.694, ver abaixo), as sugestões para tomar como alvo células endoteliais vasculares tumorais baseando-se em fosfolipídios foram restritas ao alvejamento de aminofosfolipídios, tais como PS e PE. Através do desenvolvimento de ferramentas biológicas com especificidade seletiva para diferentes fosfolipídios e aminofosfolipídios, 84 os presentes inventores identificaram agora uma nova categoria de fosfolipidios que são surpreendentemente sobreregulados em células endoteliais vasculares tumorais. Esses são os fosfolipidios aniônicos, os quais são apresentados aqui para também serem marcadores específicos e estáveis da vasculatura tumoral, permitindo intervenção terapêutica usando tanto anticorpos nus e imunoconjugados que se ligam a fosfolipidios aniônicos.
Fosfolipidios aniônicos são amplamente ausentes da superfície de células de mamíferos em repouso sob condições normais. Fosfatidilserina, a qual é o fosfolipídio aniônico mais abundante da membrana plasmática, é firmemente segregado ao folíolo interno da membrana plasmática na maior parte dos tipos celulares sob condições normais (Williamson e Schlegel, 1994; Zwaal e Schroit, 1997). Fosfatidilinositol (PI), outro fosfolipídio aniônico importante, é também predominantemente situado no folíolo interno da membrana plasmática (Calderon e DeVries, 1997). Os fosfolipidios aniônicos de menor importância, ácido fosfatídico (PA) e fosfatidilglicerol (PG), tem apenas sido examinado em poucos tipos celulares, mas eles também aparentam estar principalmente situados no folíolo interno da membrana plasmática (Hinkovska-Galcheva et ai., 1989). Cardiolipina (CL), outro fosfolipídio aniônico, está presente na membrana mitocondrial e está ausente da membrana plasmática (Daum, 1985).
Os fosfolipidios neutros são também distribuídos assimetricamente na membrana plasmática. Os aminofosfolipidios neutros, fosfatidiletanolamina (PE) está predominantemente no folíolo interno. Os fosfolipidios neutros contendo colina, fosfatidilcolina (PC) e 85 esfingomielina (SM), estão predominantemente no folíolo externo.
Assimetria da PS, juntamente com aquela da PE, é mantida por um transportador dependente de ATP, aminofosfolipidio translocase (Mg2+ ATPase), a qual catalisa o transporte de aminofosfolipidios do foliolo externo para o foliolo interno da membrana plasmática (Seigneuret e Devaux, 1984). Perda ou colapso da assimetria de PS e PE resulta do movimento para fora desses fosfolipidios na membrana plasmática e é causado ou pela inibição da translocase (Bitbol et al., 1987; Comfurius et al., 1990), ativação de transportadores da PS e/ou ativação de enzimas escramblase, enzimas dependentes de Ca2+ que transportam todos os lipídios bidirecionalmente (Zhao et al., 1998) .
Perda da assimetria da PS é observada sob diferentes condições patológicas e fisiológicas, incluindo injúria celular, morte celular programada e apoptose (Blankenberg et al., 1998; Bombeli et al., 1997), envelhecimento celular (Herrmann e Devaux, 1990), ativação de plaquetas (Rote et al., 1993; Zwaal et al., 1989), injúria (Boyle et al., 1996) e transformação maligna (Sugimura et al., 1994). Exposição à PS também tem um papel na fusão intercelular de mioblastos (Sessions e Horwitz, 1981) e tropoblastos (Adler et al., 1995), migração celular (Vogt et al., 1996) e degranulação celular (Demo et al., 1999). Células endoteliais externalizam PS em resposta ao aumento de fluxo de Ca2+ induzido por trombina (Qu et al., 1996), ionóforo de cálcio ou ésteres de porbol (Julien et al., 1997), hiperlipidemia (Lupu et al., 1993) e concentrações não-líticas de proteínas complemento C5b-9 (Christiansen et al., 1997). Exposição espontânea de PS tem também sido observada em células 86 malignas na ausência de ativadores exógenos ou injúria celular (Utsugi et ai., 1991). Várias consequências maiores seguem a exposição de PS membranar. Macrófagos fagociticos reconhecem, atacam e eliminam células apoptóticas e senescentes PS-positivas (McEvoy et al., 1986; Tait e Smith, 1999). PS também medeia ligação dos linfócitos Ta células endoteliais ativadas por trombina (Qu et al., 1996). 0 sistema complemento é ativado por PS e contribui para a lise de células PS-positivas (Test e Mitsuyoshi, 1997). Finalmente, exposição de PS contribui para uma mudança procoagulante no endotélio (Williamson e Schlegel, 1994; Bombeli et al., 199 7) provendo uma superfície lipídica negativamente carregada para montagem e ativação de complexos de coagulação (Bevers et al., 1985; Dachary-Prigent et al., 1996). 0 caráter protrômbico do endotélio tumoral tem sido reconhecido há muito tempo (Donati e Falanga, 2001).
Apesar do foco em PS na literatura científica, e o trabalho inicial dos inventores confinados a aminofosfolipidios tais como PS e PE (Patentes Americanas números 6.406.693 e 6.312.694), os presentes inventores levantaram a hipótese que uma categoria de fosfolipidios mais ampla poderia ser exposta na vasculatura tumoral. Devido ao aumento das condições de estresse do microambiente tumoral, os inventores entenderam que uma variedade de fosfolipidios aniônicos poderia ser sobreregulados na vasculatura tumoral, fornecendo novas oportunidades em potencial para intervenção terapêutica.
Os inventores entenderam que a injúria e ativação do endotélio tumoral são causadas por: 1) citocinas derivadas 87 do tumor, tais como interleucina-1 e fator de necrose tumoral, o qual ativa o endotélio e induz a expressão de moléculas de adesão celular (Shaughnessy et al., 1989; Orr et al.r 2000); 2) espécies oxigénio reativas (ROS) geradas por leucócitos que aderem ao endotélio (Orr et al., 2000); e 3) ROS gerados pelas próprias células tumorais como um subproduto do metabolismo (Shaughnessy et al., 1989); Soares et al., 1994) ou como resultado da exposição à hipóxia seguido por reoxigenação (Zulueta et al., 1995). Essas observações sugeriram que fluxos de Ca2+ devem ser gerados por esses estresses no endotélio tumoral que, por sua vez, causam exposição do PS e PE, através de ativação da escramblase ou inibição da aminofosfolipidio translocase.
Entretanto, os inventores estenderam esses critérios para a hipótese de que fosfolipidios aniônicos, não apenas os fosfolipidios PS e PE, poderiam ser sobreregulados na vasculatura tumoral. Para detectar fosfolipidios aniônicos da superfície da célula, os inventores geraram um novo anticorpo monoclonal, 9D2, o qual reage com fosfolipidios aniônicos, mas não reagem com fosfolipidios neutros. 9D2, então, diferencia de agentes ligantes a aminofosfolipidios gerais, de forma que se liga ao aminofosfolipidio aniônico, PS, mas não ao aminofosfolipidio neutro, PE. O anticorpo 9D2 é também mais especifico para fosfolipidios aniônicos do que é o ligante natural, anexina V, o qual se liga fortemente à PE, além de fosfolipidios aniônicos (Blankenberg et al., 1998) .
Conforme detalhado na presente aplicação, os inventores descobriram que 9D2 e anexina V localizam especificamente o endotélio tumoral após injeção intravenosa em camundongos com vários tipos de tumores sólidos. Essa descoberta valida 88 a hipótese do inventor de que fosfolipidios aniônicos rotineiramente ficam expostos na superfície do endotélio vascular tumoral e pode ser usado como moléculas alvo para terapia tumoral (e visualização) . A presente invenção então fornece uma variedade de novos métodos e composições baseadas em anticorpos para uso no alvejamento de fosfolipidios aniônicos e tratamento de tumores, ambos em termos de anticorpos nus e na distribuição de drogas citotóxicas, citocinas, coagulantes e coisas do tipo. Além de alvejar PS, como ensinado pelas Patentes Americanas números 6.406.693 e 6.312.694, os fosfolipidios aniônicos atualmente preferidos para alvejar pela presente invenção são PI, um fosfolipídio aniônico principal, PA e PG, com o alvejamento de CL também sendo contemplado em certas modalidades.
Uma das maiores descobertas que aparecem da presente invenção é que os fosfolipidios aniônicos são expostos na superfície do endotélio tumoral (Exemplo VI). Este fenômeno foi demonstrado usando dois reagentes independentes que se ligam seletivamente a fosfolipidios aniônicos: um anticorpo monoclonal, 9D2, desenvolvido pelos inventores particularmente para validar esse ponto, e anexina V. O anticorpo 9D2 e anticorpos competidores são os componentes mais preferidos da presente invenção.
Anticorpo 9D2 e anexina V se ligam com grande afinidade e especificidade a fosfolipidios aniônicos adsorvidos em plástico, como lipossomas, ou apresentados na superfície da membrana de células ativadas ou apoptóticas in vitro. 9D2 se liga fortemente à PS, PA e CL, mas mais fracamente a PI e PG. Anexina V se liga a PE além de PS, CL, PA, PI e PG, conforme descoberto anteriormente (Andree et al., 1990; 89
Schlaepfer et al., 1987; Boustead et al., 1993; Blackwood e Ernst, 1990). Ligação de 9D2 a fosfolipídios aniônicos não requereu íons Ca2+, enquanto que a ligação de anexina V requereu Ca2+.
Estudos de bloqueio cruzado em pratos cobertos de PS mostraram que 9D2 e anexina V não bloqueiam a ligação à PS um do outro. Isso indica que os dois reagentes reconhecem diferentes epítopos na molécula de PS, ou mais provavelmente, formas empacotadas de forma diferente de PS. Pensa-se que anexina V liga-se à superfície planar de PS, enquanto pensa-se que anticorpos anti-PS se ligam a PS empacotados hexagonalmente (Rauch e Janoff, 1990). Ambas as formas estão provavelmente presentes em pratos cobertos de PS. Esses estudos práticos de bloqueio cruzado (Exemplo VI) também servem para mostrar que anticorpos os quais efetivamente competem pela ligação a fosfolipídios aniônicos, por exemplo, que se ligam a efetivamente o mesmo epítopo, podem ser prontamente identificados uma vez que um anticorpo de referência (por exemplo, 9D2 é fornecida. A presente aplicação também mostra que o anticorpo 9D2 e anexina V especificamente localizam vasos tumorais, e células tumorais em regiões necróticas e ao seu redor, de todos os tumores examinados in vivo (Exemplo VI). Entre 15 e 40% dos vasos sanguíneos nos tumores tinham endotélio positivo para fosfolipídios aniônicos. Em contraste, nenhum dos vasos sanguíneos em tecidos normais tinham exteriorizado fosfolipídios aniônicos de forma detectável. A especificidade de marcação da vasculatura tumoral por 9D2 foi demonstrada por: 1) a falta de vasos tumorais marcados por IgM controle de rato; 2) o bloqueio da ligação de 9D2 ou 90 anexina V a células endoteliais tratadas com H2O2 in vitro por lipossomas preparados a partir de fosfolipídios aniônicos, mas não fosfolipídios neutros; 3) a descoberta de que estração de fosfolipídios de seções tumorais com detergentes ou solventes orgânicos aboliram a marcação; e 4) a falta de localização de tanto 9D2 ou anexina V para o endotélio quiescente em órgãos normais. 0 principal fosfolipídio aniôico que é localizado pela 9D2 ou anexina V na vasculatura tumoral é provavelmente o PS, como esse é o fosfolipídio aniônico mais abundante e sua exposição na superfície celular é regulada por influências ambientais ou injúria. Entretanto, outros fosfolipídios aniônicos (e.g., PI, PA, PG) são também provavelmente expostos, apesar de serem menos abundantes.
Embora não detectados por 9D2, o maior fosfolipídio neutro, PE, provavelmente contribui, juntamente com PS, para a localização de anexina observada nos vasos tumorais. Sabe-se também que o PE é exposto no endotélio tumoral, e a posição de PE na membrana plasmática é regulada de uma forma semelhante da PS (Patente Americana número 6.406.693). PE é segregado ao folíolo interno da membrana plasmática em parte pela aminofosfolipídio translocase, embora em um grau menos do que o PS (Devaux, 1992), e é transportado à superfície externa pela escramblase (Zhou et al., 1997). PE, como PS, também é exposto durante apoptose e ativação celular (Emoto et al., 1997; Umeda e Emoto, 1999).
Para examinar o mecanismo de exposição de fosfolipídios aniônicos nas células endoteliais tumorais, uma série de estudos foi feita na qual células endoteliais in vitro foram tratados com vários fatores e condições que se sabe que 91 estão presentes no microambiente tumoral (Exemplo VII). Hipóxia seguida por reoxigenação, acidez e exposição de ps aumentada por trombina em células endoteliais viáveis a entre 10 a 22% do nivel observado quando todas as células são apoptóticas. Citocinas inflamatórias (TNFa E IL-1) também causaram um enfraquecimento porém indução definitiva da exposição à PS.
Essas descobertas são consistentes com a possibilidade que, em tumores, a exposição de fosfolipidios aniônicos no endotélio vascular é induzida por hipóxia/reoxigenação em combinação com citocinas inflamatórias, trombina e acidez. Embora o mecanismo preciso não precisa ser entendido para executar a presente invenção, ROS pode ser gerado por células tumorais como um biproduto do metabolismo ou em resposta a hipóxia (Zulueta et al., 1995). Citocinas liberadas por células tumorais podem induzir moléculas de adesão de leucócitos no endotélio que medeiam a aderência de macrófagos ativados, células polimorfonucleares e plaquetas ao endotélio tumoral e posterior secreção de ROS. O ROS pode então induzir a translocação de PS pela oxidação de moléculas de transporte contendo tiol ou peroxidação de lipídios (Herrmann e Devaux, 1990), possivelmente pela causa do influxo de Ca2+ ou liberação de Ca2+ para estoques intracelulares (Wang e Joseph, 2000) .
Exposição de PS e outros fosfolipíios aniônicos em parte explica o status procoagulante do endotélio tumoral que tem sido há muito tempo reconhecido (Donati e Falanga, 2001). Os fosfolipidios aniônicos fornecem a superfície na qual os fatores de coagulação concentram e agregam (Bevers et al., 1985; Dachary-Prigent et al., 1996). Isto também fornece um sítio de ligação para macrófagos circulantes (McEvoy et al., 92 1996) e células 1986), linfócitos T (Qu et al., polimorfonucleares que ajudam na infiltração de leucócitos nos tumores.
Anticorpos e outros ligantes que se ligam a fosfolipidios aniônicos podem então ser usados para marcação de alvos, visualização e/ou tratamento de vasos sanguíneos tumorais. Fosfolipidios aniônicos são atrativos como vasos alvo de tumor por várias razões: eles são abundantes (PS está presente em 3 x 106 moléculas por célula) ; eles estão na superfície luminal do endotélio tumoral, a qual é diretamente acessível para ligação por agentes que alvejam vasos no sangue; eles estão presentes em uma maior percentagem de células endoteliais tumorais em diversos tumores sólidos; e eles estão essencialmente ausentes do endotélio em todos os tecidos normais.
Agentes que alvejam vasos empregando drogas ou coagulantes têm se mostrado altamente eficientes, e algumas vezes curativos, em camundongos com grandes tumores sólidos (Huang et al., 1997; Nilsson et al., 2001; Patentes Americanas números 5.660.827, 5.776.427, 5.855.866, 5.863.538, 5.965.132, 6.004.554, 6.051.230, 6.261.535, 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289 e 6.036.955). A presente invenção então fornece anticorpos nus e agentes que tomam como alvo vasos direcionados contra fosfolipidios aniônicos para uso no alvejamento de vasculatura tumoral na diagnose e tratamento de câncer no ser humano.
Embora um entendimento molecular preciso de como anticorpos nus direcionados contra fosfolipidios aniônicos e aminofosfolipidios funcionam no tratamento tumoral não é necessário para executar o tratamento, os inventores têm 93 contemplado vários mecanismos que podem contabilizar pela morte celular de endotélio observada. Os mecanismos favorecidos (particularmente para o anticorpo 3G4 descrito aqui) são funções efetoras imunes mediadas pelo dominio Fc, tais como citotoxidade celular dependente de anticorpo (ADCC), citotoxidade dependente de complemento (CDC) e fagocitose mediada por anticorpo. Citotoxidade mediada por células, lise mediada por complemento e/ou apoptose, sinalização celular induzida por anticorpo e/ou perturbações do citoesqueleto podem também ser envolvidos.
Ligação de anticorpos intactos contra fosfolipidios aniônicos e aminofosfolipidios, particularmente 3G4, à superfície celular endotelial vascular significa que as porções Fc dos anticorpos projetam-se para entro do lúmen do vaso. Como fragmentos Fc de anticorpo ativam a via do complemento, a destruição celular observada pode ser o resultado da lise direcionada pelo complemento. Ligação do anticorpo então ativa a cascata de coagulação dependente de complemento, causando a agregação de complexos multicomponentes e, enfim, a geração de um complexo lítico que permeabiliza a célula alvo. "ADCC ativado por complemento" pode também ser operante na destruição, na qual o complemento se liga à célula-alvo coberta por anticorpos, e no qual células, tais como neutrófilos, tendo receptores para o complemento, lisam a célula-alvo.
Como os anticorpos nus ou não-conjugados, incluindo os fragmentos que se ligam a antígeno relacionados, se ligam a fosfolipidios aniônicos e aminofosfolipidios na superfície das células endoteliais vasculares tumorais, eles irão formar uma capa de anticorpos na superfície luminal. Isso pode funcionar para atrair células efetoras imunes, tais 94 como células T citotóxicas e/ou células natural killer (NK), as quais irão exercer um efeito citotóxico mediado por célula nas células endoteliais vasculares.
Ligação do anticorpo a fosfolipidios aniônicos podem também induzir apoptose em células endoteliais vasculares tumorais. Embora não existam informações de ligação de anticorpo à PS realmente induzindo apoptose (ao invés de PS sendo um marcador resultante da apoptose) , os inventores consideram este como sendo outro mecanismo possível para os efeitos antitumorais observados. E também possível que a ligação do anticorpo em fosfolipidios aniônicos e aminofosfolipidios na superfície de células endoteliais vasculares tumorais podem causar distúrbios na organização citoesquelética da célula. Como o citoesqueleto desempenha um papel na organização de membranas de superfície, e como ligação do anticorpo pode perturbar (ou perturbar mais) a membrana, ligação de anticorpos a fosfolipidios aniônicos e aminofosfolipidios pode transmitir mudanças às proteínas do citoesqueleto que interagem com a bicamada. Já se sabe que a organização espacial das proteínas do citoesqueleto controla a estabilidade da membrana e a forma celular, e é possível que perturbação de algum equilíbrio citoesquelético pode ter consequências de longo alcance na integridade celular.
Outro mecanismo de operação da invenção pode ser que o anticorpo que se liga a fosfolipidios aniônicos e aminofosfolipidios na superfície celular endotelial pode iniciar a transdução de sinal por vias até agora indefinidas. Ligação de anticorpo pode também causar distúrbio em vias de transdução de sinais conhecidas, por 95 exemplo, pela alteração da conformação e/ou interações dos receptores de membrana, proteínas de transdução de sinais, canais de membrana, e assim por diante. Sinais para destruição de células (apoptose) pode ser iniciada ou mimetizada, e/ou sinais de preservação/homeostáticos podem ser inibidos.
Embora possua interesse científico, determinar a estrutura exata da destruição vascular alcançada por anticorpos nus a fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios não é necessária para executar o tratamento. Dado que a administração dessas categorias de anticorpos mostra resultados de forma vantajosa em efeitos antitumorais específicos in vivo, o tratamento pode ser empregado sem considerar o mecanismo celular que está por trás desse fenômeno. 0 uso de anticorpos nus que se ligam a fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios, então representa um importante avanço na terapia tumoral, fornecendo vantagens na preparação e custo. C. Anticorpos contra fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios
Como a presente invenção identifica uma nova categoria de marcadores da vasculatura tumoral, os fosfolipídios, anticorpos nus e imunoconjugados que se ligam a um ou mais fosfolipídios aniônicos, opcionalmente em conjunto com aminofosfolipídios, pode agora ser usado na diagnose tumoral e tratamento.
Cl. Anticorpos Policlonais
Os meios para a preparação e caracterização de anticorpos são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, 96
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Para se preparar antisoros policlonais, imuniza-se um animal com uma composição compreendendo um fosfolipidio aniônico e/ou aminofosfolipidio imunogênico, incluindo células tratadas com H2O2 e outros agentes, como ensinado aqui, e coleta-se os antisoros desse animal imunizado. Uma ampla faixa de espécies de animais pode ser usada para a produção de antisoros. Tipicamente, o animal empregado para a produção de anti-antisoros é um coelho, camundongo, rato, hamster, porquinho da índia ou cabra. Devido ao volume relativamente grande de sangue dos coelhos, um coelho é uma escolha preferida para a produção de anticorpos policlonais. A quantidade de composição imunogênica usada na produção de anticorpos policlonais varia com a natureza do imunogênio assim como com o animal empregado para a imunização. Uma variedade de rotas pode ser usada para a administração do imunogênio; subcutânea, intramuscular, intradérmica, intravenosa, intraperitoneal e intraesplênica. A produção de anticorpos policlonais pode ser monitorada por amostragem do sangue do animal imunizado em pontos diversos depois da imunização. Uma segunda injeção de reforço pode também ser dada. 0 processo de reforço e de titulação é repetido até ser obtido um titulo adequado. Quando o nivel de titulação desejado é obtido, o animal imunizado pode ser sangrado e o soro ser isolado e armazenado. 0 animal pode também ser usado para gerar anticorpos monoclonais.
Conforme é bem conhecido na técnica, o caráter imunogênico de uma composição especifica pode ser acentuado pelo emprego de estimuladores não específicos da resposta imune, conhecidos como adjuvantes. Adjuvantes exemplares incluem o 97 adjuvante de Freund completo, um estimulador não específico da resposta imune contendo Mycobacterium tuberculosis morto; adjuvante de Freund incompleto; e adjuvante de hidróxido de alumínio.
Pode também ser desejável se reforçar o sistema imune do hospedeiro, conforme se pode conseguir por associação de fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios com, ou acoplado a um veículo. Veículos exemplares são hemocianina de cracas (KLH) e albumina sérica bovina (BSA). Outras albuminas tais como ovalbumina, albumina sérica de camundongo ou albumina sérica de coelho podem também ser usadas com veículos. Conforme é bem conhecido na técnica, o caráter imunogênico de uma determinada composição pode sofrer variações. No entanto, a geração de anticorpos contra fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios não é particularmente difícil. Por exemplo, anticorpos antifosfatidilserina altamente específicos foram criados em coelhos imunizados por injeções intramusculares de fosfatidilserina contendo géis de poliacrilamida e com vesículas fosfatidilserina-citocromo c (Maneta-Peyret et al., 1988; 1989). 0 uso de implantes de poliacrilamida aumentaram a produção de anticorpos (Maneta-Peyret et al., 1988; 1989). Os anticorpos antifosfatidilserina criados desta forma são capazes de detectar fosfatidilserina in situ em plaguetas humanas (Maneta-Peyret et al., 1988). Os grupos de Inoue, Rote e Rauch têm desenvolvido também anticorpos anti-PS e anti-PE (ver abaixo).
Embora a geração de anticorpos contra fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios pode ser alcançada de diversas formas, certos métodos preferidos são descritos agui no Exemplo IV. 98 C2 . Anticorpos monoclonais.
Diversos métodos para a geraçao de anticorpos monoclonais (MAbs) são também agora bem conhecidos na técnica. As técnicas de geração de anticorpos monoclonais mais padronizadas geralmente começam seguindo os mesmos princípios seguidos na preparação de anticorpos policlonais (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; incorporado ao presente documento a título de referência). Uma resposta de anticorpo policlonal é iniciada por imunização de um animal com uma composição de fosfolipídio aniônico e/ou aminofosfolipídio imunogênico e, quando se obtém um nível de titulação desejado, pode se usar o animal imunizado para gerar MAbs. Preferencialmente, a triagem particular e técnicas de seleção reveladas aqui são usadas para selecionar anticorpos com as características procuradas.
Os MAbs podem ser facilmente preparados pelo emprego de técnicas bem conhecidas, tais como as exemplificadas na patente U.S. No. 4.196.265. Tipicamente esta técnica abrange a imunização de um animal adequado com a composição imunogênica selecionada. A composição de imunização é administrada de um modo efetivo para estimular as células produtoras de anticorpos. Os roedores tais como camundongos e ratos são os preferidos, no entanto é também possível o emprego de células de coelho, carneiro e rã. 0 emprego de ratos pode proporcionar determinadas vantagens (Goding, 1986, pp. 60-61), mas os camundongos são preferidos, sendo os mais preferidos os camundongos BALB/c uma vez que estes são os mais rotineiramente usados e geralmente resultam em uma porcentagem mais alta de fusões estáveis. 99
Depois da imunização, as células somáticas com o potencial para a produção de anticorpos desejados, especificamente linfócitos B (células B) são selecionados para emprego no protocolo de geração de MAbs. As células podem ser obtidas de baços de biópsia, amídalas ou nódulos linfáticos, ou de uma amostra de sangue periférico. As células do baço e as células do sangue periférico são preferidas, as primeiras por serem uma fonte rica de células produtoras de anticorpos que se encontram no estágio de plasmoblastos em divisão, e as últimas por ser o sangue periférico o de mais fácil acesso. Freqiientemente, um painel de animais terá sido imunizado e o baço do animal com a titulação mais alta de anticorpos será removido e os linfócitos do baço obtidos por homogeneização do baço com uma seringa. Tipicamente um baço proveniente de um camundongo imunizado contém aproximadamente de 5 x 107 a 2 x 108 linfócitos.
Os linfócitos B produtores de anticorpos provenientes do animal imunizado são então fundidos com células de uma célula imortal de mieloma, geralmente da mesma espécie do animal que foi imunizado. As linhagens celulares de mieloma adequadas para emprego nos procedimentos de fusão produtores de hibridomas são de preferência não produtoras de anticorpos, têm uma alta eficiência de fusão e apresentam deficiências de enzimas que as tornam incapazes de crescer em determinados meios seletivos que sustentam somente o crescimento das células fundidas desejadas (hibridomas).
Qualquer uma de uma série de células de mieloma pode ser usada, conforme é do conhecimento dos peritos na técnica (Goding, pp. 65-66; Campbell, pp. 75-83, 1984). Nos casos em que o animal imunizado é um camundongo, por exemplo, pode se usar P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NSl/lAg 4 1, Sp210-Agl4, FO, 100 NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1,7 e S194/5XX0 Bul; para ratos, pode se usar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F, 4B210 ou uma das linhagens celulares de camundongo relacionadas acima; e U-266, GM1500-GRG2, LICR-L0N-HMy2 e UC729-6, são todos úteis em conexão com as fusões de células humanas.
Os processos para a geração de híbridos de células do nódulo linfático ou baço produtoras de anticorpos e de células de mieloma geralmente consistem na mistura de células somáticas com células de mieloma numa proporção de 4:1, embora a proporção possa variar de aproximadamente de 20:1 a aproximadamente 1:1, respectivamente, na presença de um agente ou agentes (químicos ou elétricos) que promovem a fusão das membranas celulares. Os processos de fusão empregando o vírus Sendai já foram descritos por Kohler e Milstein (1975; 1976) e os que empregam polietilenoglicol
(PEG) tal como PEG a 37% (v/v) por Gefter et al. (1977). O emprego de processos de fusão induzidos eletricamente é também adequado (Goding pp. 71-74, 1986).
Os procedimentos de fusão geralmente produzem híbridos viáveis a baixas frequências, de aproximadamente 1 x 10~6 a 1 x IO-8. No entanto, isto não representa um problema uma vez que híbridos fundidos e viáveis são diferenciados das células não fundidas geradoras (especialmente as células de mieloma não fundida que normalmente continuariam a se dividir indefinidamente) por cultivo em um meio seletivo. O meio seletivo é geralmente um que contém um agente que bloqueia a síntese de novo de nucleotídeos no meio de cultura de tecidos. Os agentes exemplares e preferidos são aminopterina, metotrexato e azaserina. A aminopterina e metotrexato bloqueiam a síntese de novo tanto das purinas como das pirimidinas, ao passo que azaserina bloqueia 101 somente a síntese da purina. Nos casos em que se emprega aminopterina ou metotrexato, o meio é suplementado com hipoxantina e timidina como uma fonte de nucleotídeos (meio HAT) . Nos casos em que se emprega azaserina, o meio é suplementado com hipoxantina. 0 meio de seleção preferido é HAT. Somente as células capazes de operar trajetos de salvamento de nucleotídeos são capazes de sobreviver no meio HAT. As células de mieloma têm deficiência de enzimas chave do trajeto de salvamento, tais como hipoxantina fosforibosil transferase (HPRT) e não podem sobreviver. As células B podem operar este trajeto, mas elas têm um período de vida limitado em cultura e geralmente morrem dentro de aproximadamente duas semanas. Portanto, as únicas células que podem sobreviver no meio seletivo são aqueles híbridos formados de células de mieloma e células B.
Este cultivo produz uma população de hibridomas dos quais são selecionados hibridomas específicos. Tipicamente a seleção de hibridomas é conduzida por cultivo das células por diluição de um único clone em placas de microtitulação, seguindo-se o teste dos sobrenadantes clonais individuais (depois de aproximadamente duas a três semanas) para se constatar a reatividade anti-VEGF desejada. Este ensaio deve ser sensível, simples e rápido, tal como ensaios radioimunes, imunoensaios enzimáticos, ensaios de citotoxicidade, ensaios de placa, ensaios de ligação imunológica por pontos e análogos.
Os hibridomas selecionados seriam então diluídos em série e clonados em linhagens celulares produtoras de anticorpos individuais, clones estes que poderão então ser propagados indefinidamente para fornecer MAbs. As linhagens celulares 102 podem ser exploradas para a produção de MAb de dois modos básicos. Uma amostra do hibridoma pode ser injetada (frequentemente na cavidade peritoneal) em um animal histocompat ivel do tipo que foi usado para fornecer as células somáticas e de mieloma para a fusão original. 0 animal injetado desenvolve tumores que secretam o anticorpo monoclonal especifico produzido pelo hibrido de células fundidas. Os fluidos corporais do animal, tais como soro ou fluido de ascite, podem então ser coletados para produzir MAbs em alta concentração. As linhagens de células individuais poderiam também ser cultivadas in vitro, onde os MAbs são secretados naturalmente para dentro do meio de cultura do qual elas podem ser facilmente obtidos em altas concentrações.
Os MAbs produzidos por qualquer dos meios geralmente serão ainda mais purificados, usando-se filtração, por exemplo, centrifugação e diversos processos cromatográficos, tais como HPLC ou cromatografia de afinidade, sendo todas tais técnicas de purificação bem conhecidas dos peritos na técnica. Estas técnicas de purificação abrangem fracionamento para separar o anticorpo desejado dos demais componentes de uma mistura. Os processos analíticos especialmente adequados à preparação de anticorpos incluem, por exemplo cromatografia de proteína A-Sefarose e/ou de proteína G- Sefarose. D. Anticorpos de segunda geração para fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios A presente invenção fornece anticorpos "de segunda geração" que se ligam a aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos, tais anticorpos tendo propriedades melhoradas e/ou não 103 sofrem da desvantagem associada com os anticorpos na técnica anterior.
Na lista de tais anticorpos é revelada aqui, dos quais os anticorpos 9D2 e 3G4 são geralmente preferidos, com o anticorpo 3G4 (ATCC 4545) sendo particularmente preferido. A invenção também fornece técnicas particulares de triagem e imunização, as quais permitem que sejam produzidos anticorpos "como" ou "competidores" com propriedades vantajosas e/ou menos desvantagens.
Dl. Propriedades dos anticorpos
Os anticorpos de segunda geração da invenção se ligam a aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos e ainda não têm propriedades patogênicas geralmente associadas com anticorpos de tais fosfolipidios. Isto tornou-se possível, em parte, pelas novas técnicas de triagem e imunização desenvolvidas pelos inventores. Síndrome(s) antifosfolipídicas (APS) são associadas com auto-anticorpos nomeados anticorpos "anticardiolipina" e anticorpos "anticoagulante de lupos". Essas síndromes são associadas com a predisposição para tromboembolia venosa e arterial, trombocitopenia e uma variedade de síndromes neurológicas. Os anticorpos antifosfolipidios nesses pacientes são então "anticorpos patogênicos".
Embora escritos durante anos como "anticorpos antifosfolipidios" e "anticorpos anti-PS", tais anticorpos patogênicos de fato reconhecem cofatores de proteínas que se ligam a cardiolipina PS ou ambos, não aos f osf olipidios propriamente dito (Galli et al., 1990, 1993; McNeil et al., 1990; Rote, 1996). Anticorpos anticardiolipina reconhecem 104 uma região particular (entre os resíduos 281 e 288) na β2-glicoproteína I, enquanto anticorpos anticoagulantes de lupos reconhecem protrombina. Similarmente, anticorpos anti-PE que ocorrem em estados de doença se ligam a PE juntamente com proteínas, tais como quininogênio de alto e baixo peso molecular (HK), precaluquerina e fator XI (Sugi e Mclntyre, 1995, 1996a; 1996b). Baseando-se nesse tipo de reconhecimento protéico, os anticorpos antifosfolipídios deslocam os cofatores protéicos dos fosfolipídios, criando então os sintomas da doença.
Os anticorpos da presente invenção têm sido particularmente selecionados com base na não-ligação a aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos juntamente com cofatores protéicos, preferivelmente são anticorpos antifosfolipídios "verdadeiros". Como tais, o anticorpos da invenção não se ligam ou deslocam os cofatores protéicos dos fosfolipídios e são então seguros para administração. Realmente, camundongos tratados com os anticorpos da invenção em altas doses por períodos prolongados de tempo não apresentaram mudanças na capacidade de coagulação, ainda que a resposta de camundongos com APS quando injetados com anticorpos anticardiolipina ou anticoagulantes de lupos.
Sem considerar os mecanismos subjacentes, anticorpos antifosfolipídios ocorrendo na população humana são correlacionados com doenças autoimunes, por exemplo, lupos sistémico eritematoso (Branch et al., 1987; Staub et al., 1989; Drouvalakis e Buchanan, 1998; Smirnov et al., 1995; Rauch et al., 1986; Rauch e Janoff, 1990) e perda de fecundidade periódica (Rote et al., 1995; Rote, 1996 ; Vogt et al., 1996; 1997; Katsuragawa et al., 1997) . Nenhuns dos tais sintomas têm sido associados com os anticorpos da 105 presente invenção que são administrados a camundongos ou macacos.
Também, o epítopo reconhecido pelos anticorpos da invenção, tais como o 9D2 e 3G4 (ATCC 4545), não é o mesmo daquele reconhecido pela anexina V. Isso é apresentado aqui, como os agentes não bloqueiam a ligação a fosfolipidios de forma reticulada uns aos outros. 0 epítopo reconhecido pelos anticorpos 9D2 e 3G4 é provavelmente uma forma hexagonalmente empacotada de PS, a qual é a forma imunogênica. Anexina V da mesma forma se liga a PS planar em adição à forma hexagonal. A forma hexagonal de concentrados de PS dentro de protuberâncias na membrana plasmática associada com a ativação celular e dentro de "vesículas" nas células apoptóticas. A distribuição restrita dos anticorpos da invenção, tais como os anticorpos 9D2 e 3G4 (ATCC 4545), então contribui adicionalmente para a falta de toxicidade detectável e falta de efeito na coagulação dos anticorpos.
Para gerar anticorpos para aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos com propriedades vantajosas e/ou efeitos colaterais reduzidos ou essencialmente ausentes, a presente invenção fornece métodos de triagem e imunização preferidos. Outras técnicas de imunização e anticorpos têm sido reportadas na literatura (Umeda et al., 1989; Igarashi et al., 1991; Rote et al., 1993), incluindo aqueles com especificidade reportada para o tipo de cadeias de ácidos graxos envolvidos (Levy et al., 1990; Qamar et al., 1990).
Umeda et al. (1989) reportou a produção de anticorpos monoclonais reconhecendo epítopos estereoespecíficos de fosfatidilserina. Entretanto, o sistema Umeda sofre da desvantagem de usar imunização direta da fosfatidilserina no 106 baço de camundongos usando uma amostra de aminofosfolipídio coberta por Salmonella (Umeda et al., 1989). Muitos dos anticorpos reportados por Umeda et al. (1989) também exigem atividade anticoagulante, a qual é uma desvantagem não associada com os anticorpos da presente invenção. 0 perfil de ligação do anticorpo 3G4 é diferente daquele do anticorpo PSC8 de Umeda et al. (1989).
Os anticorpos da invenção também têm a vantagem de reconhecer todos ou a maior parte dos fosfolipidios aniônicos, os quais podem fornecer mais alvos para a ligação. Então, os anticorpos de segunda geração da invenção podem ser definidos como tendo substancialmente a mesma, ou a mesma especificidade fosfolipidica que os anticorpos 9D2 e 3G4 (ATCC 4545), como revelado aqui na Tabela 4.
Igarashi et al. (1991) também reportou a indução de anticorpos anti-PS, mas novamente usou imunização intraesplênica e somente um leve aumento do titulo foi observado quando o antigeno foi novamente injetado intravenosamente. A maioria dos MAbs de Igarashi et al. (1991) reagiram de forma reticulada com o DNA e muitos exibiram atividade anticoagulante do lupos, nenhuma dessas desvantagens existem nos anticorpos desenvolvidos pelos presentes inventores. 0 perfil de ligação do anticorpo preferido 3G4 da invenção é também diferente daqueles anticorpos na Tabela 1 de Igarashi et al. (1991).
Outros têm reportado as atividades anticoagulantes de lupos de anticorpos monoclonais de murina que reticulam com mais de um fosfolipidio aniônico (Alving et al., 1987); Rauch & Janoff, 1990), mas os presentes inventores não têm passado por dificuldades na obtenção de anticorpos livres de 107 atividade anticoagulante de lupos. Isso representa uma vantagem distinta dos métodos, anticorpos e anticorpos competidores de acordo com a presente invenção.
Adicionalmente a evitar o uso de anticorpos de pacientes, tal como descrito em Rauch et al. (1986), Ravirajan et al. (1995) e Menom et al. (1997), a presente aplicação também demonstra as propriedades vantajosas de anticorpos fornecidos por essa invenção em comparações lado a lado com anticorpos existentes da literatura, tal como o anticorpo 3SB descrito por Rote et al. (1993). Embora o anticorpo 3SB tem propriedades adequadas para uso em vários dos métodos revelados aqui, os anticorpos desenvolvidos pelos presentes inventores entretanto realizaram fora o anticorpo 3SB em estudos comparativos, por exemplo, como mostrado aqui pelo aumento de efeitos antivirais em anticorpos 3G4 em oposição ao anticorpo 3SB (Exemplo XIII).
Os anticorpos da presente invenção também podem ser caracterizados por sua afinidade. Anterior à invenção, os anticorpos na literatura tem relativamente pouca afinidade (onde reportado). Em certas modalidades, os anticorpos de segunda geração da invenção são então definidos como aqueles que têm uma afinidade por PS pelo menos igual à afinidade de anticorpos 9D2 ou 3G4 (ATCC 4545) para PS, em particular, a afinidade quando medida em um ELISA conforme descrito aqui, como revelado na Tabela 3.
Mais preferencialmente, os anticorpos de segunda geração da invenção são definidos como aqueles tendo a afinidade para PS pelo menos à afinidade dos anticorpos 9D2 e 3G4 (ATCC 4545) para PS, como revelado na Tabela 3, e como tento substancialmente a mesma, ou a mesma especificidade para 108 fosfolipídios que os anticorpos 9D2 e 3G4 (ATCC 4545), como revelado na Tabela 4, e como não sendo soro dependente. Mais preferivelmente, os anticorpos de segunda geração são aqueles tendo uma afinidade por PS pelo menos igual à afinidade do anticorpo 3G4 (ATCC 4545) para PS, como revelado na Tabela 3, e como tendo a mesma especificidade para fosfolipídio que o anticorpo 3G4 (ATCC 4545), como revelado na Tabela 4.
D2. Tecnologias CDR
Anticorpos são compostos de regiões variáveis e constantes. 0 termo "variável", como usado aqui em referência a anticorpos, significa que certas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência entre anticorpos, e são usados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular a seu antígeno particular. Entretanto, a viabilidade não é sequer distribuída pelos domínios variáveis dos anticorpos. Ele é concentrado em três segmentos nomeados "regiões hipervariáveis", tanto nos domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada (exceto anticorpos camelizados discutidos abaixo).
As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são chamadas de região estrutural (FR) . Os domínios variáveis de cadeias genuínas leves e pesadas cada um compreende quatro FRs (FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente), adotando amplamente uma configuração de folha β, conectada por três regiões hipervariáveis, as quais formam voltas conectando, e em alguns casos, formando parte da estrutura de folha β. 109
As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em intima proximidade pelos FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sitio de ligação de antigeno de anticorpos (Kabat et al., 1991). Os domínios constantes não são envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antigeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpo. 0 termo "região hipervariável", como usado aqui, refere-se a resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígenos, A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-56 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al., 1991) e/ou aqueles resíduos de uma "volta hipervariável" (por exemplo, resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada). Resíduos "estrutura" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável exceto as regiões hipervariáveis de resíduos como definidas aqui. O DNA e as sequências deduzidas de aminoácidos das cadeias Vh e VK do anticorpo 3G4 (ATCC 4545) são fornecidos aqui como SEQ ID NO:l, 2, 3 e 4, respectivamente. Essas sequências incluem CDR1-3 das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo. À luz da sequência e outras informações fornecidas aqui, e do conhecimento da técnica, uma gama de anticorpos melhorados e como 3G4 e regiões que se ligam a antígenos podem agora ser preparadas e são então incluídas na presente invenção. 110
Em certas modalidades, a invenção fornece pelo menos um CDR do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como ATCC 4545. Em outras modalidades, a invenção fornece um CDR, anticorpo, ou região que se liga a antigeno relacionada, a qual se liga a pelo menos um primeiro aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico, preferencialmente PS, e o qual compreende pelo menos um CDR do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como ATCC 4545.
Aspectos adicionais da invenção dizem respeito a pelo menos um CDR que tem uma sequência de aminoácios CDR de incorporada na região variável de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou uma forma variante ou que tenha sofrido mutação relacionada. Outros aspectos da invenção dizem respeito a um CDR, anticorpo, ou região que se liga a antigeno relacionada, a qual se liga a pelo menos um primeiro aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico, preferencialmente PS, e o qual compreende pelo menos um CDR com uma sequência de aminoácidos CDR incorporada na região variável de sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO: 4, ou uma forma variante ou que tenha sofrido mutação relacionada, onde tal forma variante ou que tenha sofrido mutação mantém a ligação ao aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico, preferencialmente PS.
Em uma modalidade particular, a invenção fornece um anticorpo, ou região que se liga a antigeno relacionada, na qual as regiões estruturais do anticorpo 3G4 (ATCC 4545) têm sido alteradas de IgG de camundongo para humana, tal como IgGi humana ou outra subclasse de IgG para reduzir a imunogenicidade em humanos. Em outras modalidades, as sequências do anticorpo 3G4 (ATCC 4545) são examinadas para a presença de epítopos de célula T, como é conhecido na 111 técnica. A sequência fundamental pode então ser alterada para remover epítopos de células T, por exemplo, para "desimunizar" o anticorpo. A disponibilidade do DNA e das sequências de aminoácidos das cadeias Vh e VK do anticorpo 3G4 (SEQ ID NO: 1, 2, 3 e 4) significa que uma variedade de anticorpos pode agora ser preparada usando tecnologias CDR. Em particular, mutações randômicas são feitas nos CDRs e os produtos tirados para identificar anticorpos com maiores afinidades e/ou maiores especificidades.
Tal mutagênese e seleção é rotineiramente praticada nas técnicas de anticorpo. É particularmente adequado para uso na presente invenção, dadas as vantagens de técnicas de triagem reveladas aqui.
Essas técnicas são usadas para gerar anticorpos variantes com propriedades biológicas melhoradas relativas ao anticorpo original a partir do qual eles são preparados, tal como os anticorpos 9D2 e 3G4 (ATCC 4545). Tais variantes, ou compostos de segunda geração, são tipicamente variantes substituintes envolvendo um ou mais resíduos de regiões hipervariáveis substituídas de um anticorpo original. Uma forma conveniente de gerar tais variantes substituintes é a maturação de afinidade usando exposição a fagos.
Na afinidade de maturação usando exposição a fagos, vários sítios de regiões hipervariáveis (por exemplo, sítios 6-7) são mudados para gerar todos as substituições amino possíveis em cada sítio. Os variantes de anticorpo então gerados são dispostos de uma forma monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusões para o produto do 112 gene III de M13 empacotado em cada partícula. Os variantes apresentados a fagos são então tirados para sua atividade biológica (por exemplo afinidade de ligação) como revelado aqui. Para identificar sítios de regiões hipervariáveis candidatos para modificação, triagem de alaninas mutagênicas podem ser feitos para resíduos de regiões hipervariáveis identificadas contribuindo significantemente para ligação ao antigeno. Técnicas de mistura e implantação de CDR podem também ser usadas com os anticorpos da presente invenção, preferencialmente os anticorpos 9D2 e 3G4 (ATCC 4545).
Mistura de CDR insere sequências de CDR em uma região estrutural especifica (Jirholt et al., 1998). Técnicas de implantação de CDR permitem a combinação ramdômica de sequências de CDR dentro de uma única estrutura mestre (Soderlind et al., 1999, 2000). Usando tais técnicas, as sequências CDR do anticorpo 3G4 (ATCC 4545), por exemplo, são mudadas para criar uma pluralidade de sequências diferentes, as quais são incorporadas em uma sequência esqueleto e os anticorpos variantes resultantes são tirados para características desejadas, por exemplo, maior afinidade.
Na luz da informação da presente descoberta, o fragmento que se liga a antigeno dos anticorpos, preferencialmente 9D2 e 3G4 (ATCC 4545), pode também ser minimizado, dando aumento de estabilidade. Isso pode ser alcançado preparando-se proteínas que se ligam a um único domínio baseado em domínios de imunoglobulina VH e como VH (Nuttall et al., 2000). 113
Alternativamente, ou adicionalmente, a estrutura cristalina do complexo antigeno-anticorpo pode ser delineada e analisada para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico, por exemplo, PS. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para a substituição. Uns dos tais variantes são gerados, o quadro de variantes é sujeito à triagem, como descrito aqui, e anticorpos com propriedades análogas, porém diferentes ou mesmo propriedades superiores em um ou mais testes relevantes são selecionadas para desenvolvimento adicional. D3. Anticorpos camelizados
Outros exemplos de anticorpos da invenção são anticorpos "camelizados". Anticorpos de camelos e lhamas (Camelidae, camelídeos) incluem um único tipo de anticorpo, o qual é destituído de cadeias leves e então formado somente por cadeias pesadas. Esses têm sido nomeados "anticorpos camelizados". 0 sítio de ligação ao antígeno de tais anticorpos é um único domínio, referido como Vhh(VHH).
Como o DNA e as sequências de aminoácidos das cadeias Vh e Vk do anticorpo 3G4 (ATCC 4545) são fornecidas aqui (SEQ ID Nos 1, 2, 3 e 4), versões camelizadas do anticorpo 3G4 podem também ser preparadas. Mutações e adaptações estruturais podem ser feitas para remodelar o Vh de um par VH-VL em um único domínio VHh com retenção de uma variabilidade suficiente (Muyldermans et al., 2001,). Tais construções VHh SÃO unidades pequenas, robustas e de reconhecimento eficiente (Riechmann e Muyldermans, 1999) com potente capacidade de ligação a antígeno, a qual pode fornecer vantagem adicional de interagir com novos epítopos que são 114 inacessíveis a pares Vh-Vl convencionais. Então, anticorpos camelizados são semelhantes a fragmentos Fv, mas podem ter benefícios adicionais.
Patente Americana número 5.800.988, Patente Americana número 6.005.079, petição PCT número WO 94/04678, petição PCT número WO 94/25591, Riechmann & Muyldermans (1999) e Muyldermans et al. (2001) descrevem e capacitam adicionalmente a produção de anticorpos camelisados.
Em acordo, o CDR do anticorpo 3G4 pode ser enxertado na estrutura do domínio variável da imunoglobulina de cadeia pesada do anticorpo Camelidae.
D4. Sequências CDR
Aspectos adicionais da invenção então dizem respeito a segmentos de DNA isolados e regiões CDR codificadoras de vetores recombinantes de cadeias leves e pesadas de anticorpos, tais como 9D2 e 3G4, e preferencialmente 3G4 (ATCC 4545), cadeias leves e pesadas, e a criação e uso de células hospedeiras recombinantes e fagos pela aplicação de tecnologia de DNA, a qual expressa tais regiões CDR. A invenção então fornece um polinucleotídeo isolado que contém uma sequência de nucleotídeo que codifica pelo menos um CDR do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado com ATCC 4545. A invenção adicionalmente fornece um polinucleotídio isolado que contém a sequência de nucleotídeo que codifica CDR, anticorpo ou região que se liga a antígeno relacionada, a qual se liga a pelo menos um primeiro aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico,
preferencialmente PS, e o qual compreende pelo menos um CDR 115 do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como ATCC 4545.
Aspectos adicionais da invenção envolvem um polinucleotídio isolado que contém uma sequência de nucleotidio que codifica pelo menos um CDR que tem uma sequência de aminoácidos CDR incorporada na região variável da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou uma forma variante ou que tenha sofrido mutagênese relacionada. Outros aspectos da invenção dizem respeito a um polinucleotídio isolado que contém uma sequência de nucleotidio que codifica um CDR, anticorpo ou região que se liga a antígeno relacionada, a qual se liga a pelo menos um primeiro aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS, e que compreende pelo menos um CDR que tem uma sequência de aminoácidos CDR incorporada na região variável da com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou uma variante ou forma que tenha sofrido mutação relacionada, onde tal variante ou forma que tenha sofrido mutação mantém a ligação ao aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS.
Em outros aspectos da invenção, o polinucleotídio isolado contém a sequência nucleotídica da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:3, ou um variante ou uma forma que tenha sofrido mutação relacionada. Em particular, o polinucleotídio isolado contém a sequência nucleotídica da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID N0:3, ou um variante ou uma forma que tenha sofrido mutação relacionada, cuja sequência de nucleotidio codifica um CDR, anticorpo ou região que se liga a antígeno relacionada que se liga a pelo menos um primeiro aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS, onde qualquer tal forma variante ou que tenha sofrido mutação mantém a 116 ligação ao aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS. A presente invenção então diz respeito a polinucleotidios e segmentos de DNA, isolados de qualquer mamífero, preferencialmente humanos ou murinas, que são livres de DNA genômico total e são capazes de expressão regiões de CDR de cadeias pesadas e leves de fosfolipídios antianiônicos e aminofosfolipídios, tais como 9D2 e 3G4, e preferencialmente 3G4 (ATCC 4545), cadeias leves e pesadas. Como usado aqui, os termos "segmento de polinucleotídeo" e "segmento de DNA" refere-se a polinucleotídios e moléculas de NDA que têm sido isoladas livres de DNA genômico total de uma espécie particular. Incluído no termo "segmento de polinucleotídio" e "segmento de DNA", estão os segmentos de DNA e fragmentos menores de tais segmentos, e também vetores recombinantes, incluindo, por exemplo, plasmídios, cosmídios, fagos, vírus e coisas do tipo.
Similarmente, um segmento de DNA compreendendo um segmento codificador ou porção de gene isolada codificadora de regiões CDR purificadas de cadeias leves e pesadas de anticorpo antifosfolipídio aniônico ou antiaminof osf olipídio, tais como 9D2 e 3G4, e preferencialmente 3G4, cadeias leves e pesadas, refere-se a um segmento de DNA incluindo tais sequências codificadores e, em certos aspectos, sequências regulatórias, isoladas substancialmente longe de outros genes de ocorrência natural ou sequências codificadores de proteínas. Em relação a isso, o termo "gene" é usado para, de forma simples, referir-se a uma proteína, polipeptídio ou unidade codificadora de peptídio funcional. Como será entendido pelos indivíduos versados na técnica, esse termo funcional inclui as 117 sequências codificadoras de anticorpos originais e segmentos que sofreram engenharia que expressam, ou podem ser adaptados a expressar, proteínas, polipeptídios ou peptídios que se ligam a antígeno adequados. "Isolados substancialmente longe de outra sequências codificadoras" significa que o segmento codificador ou porção do gene isolado de interesse forma a parte significante da região codificadora do segmento de DNA, e que o segmento de DNA não contém grandes porções de DNA codoficante de ocorrência natural, tal como grandes fragmentos cromossômicos ou outros genes funcionais ou regiões codificadoras de DNAc. É claro, isto refere-se ao segmento de DNA como orginalmente isolado, e não exclui genes ou regiões codificadoras adicionadas posteriormente ao segmento pela mão do homem.
Em modalidades particulares, a invenção diz respeito a segmentos codificadores isolados ou porções de genes isoladas e vetores recombinantes incorporando sequências de DNA que codificam regiões variáveis de cadeias pesadas e leves de anticorpos anti-fosfolipidios aniônicos ou antiaminof osf olipidios, tais como 9D2 e 3G4, e preferencialmente 3G4, cadeias leves e pesadas, que compreendem pelo menos uma primeira região de sequência que inclui uma região de sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 75%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 85%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou algo próximo disso da identidade da sequência de aminoácido da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, onde as referidas regiões veriáveis 118 mantém pelo menos substancialmente as propriedades biológicas das regiões variáveis de sequências de aminoácidos SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:2.
Como revelado aqui, as sequências podem compreender certos aminoácidos de função biologicamente equivalente ou "substituições conservativas". Outras sequências podem compreender aminoácidos não-equivalentes funcionalmente ou "substituições não-conservativas" que sofreram engenharia deliberadamente para melhorar as propriedades do CDR ou do anticorpo contendo o CDR, como é conhecido daqueles indivíduos normalmente versados na técnica e adicionalmente descritos aqui.
Também será entendido que sequências de aminoácidos e ácidos nucléicos podem incluir resíduos adicionais, tais como aminoácidos N- ou C- adicionais ou sequências 5' ou 3', e ainda correspondam a uma sequência da invenção, até que a sequência encontre os critérios estabelecidos acima, incluindo preferencialmente a manutenção ou melhora de atividade protéica biológica, onde a expressão de proteína é afetada. A adição de sequências terminais inclui várias sequências não-codificantes ladeando igualmente as porções 5' e 3' da região codificadora, e também as regiões de controle.
Os segmentos de ácido nucléico da presente invenção podem então ser combinados com outras sequências de DNA, tais como protômeros, sinais de poliadenilação, sítios enzimáticos de restrição adicionais, sítios de clonagem múltipla, outros segmentos codificadores, e coisas do tipo, de tal forma que seu comprimento total pode variar consideravelmente. É então contemplado que um fragmento de ácido nucléico de quase 119 qualquer comprimento possa ser empregado, com o comprimento total preferencialmente sendo limitado pela facilidade de preparação e uso no protocolo pretendido de DNA recombinante.
Vetores recombinantes então formam aspectos adicionais da presente invenção. Vetores particularmente úteis são contemplados a serem aqueles fatores nos quais a porção codificante do segmento de DNA é posicionada sob o controle de um protômero. Geralmente, embora não exclusivamente, um protômero recombinante ou heterólogo será empregado, por exemplo, um protômero não normalmente associado com sequências codificadoras no seu ambiente natural. Tais protômeros podem incluir protômeros de bactéria, virais, eucarióticos e de mamíferos, desde que o protômero direcione eficientemente a expressão do segmento de DNA no tipo celular, organismo, ou mesmo animal, escolhido para expressão. 0 uso de combinações de protômeros e tipos celulares é conhecido daqueles indivíduos versados na técnica de biologia molecular. Os protômeros empregados podem ser constitutivos, ou induzidos, e podem ser usados sob as condições apropriadas para direcionar altos níveis de expressão do segmento de DNA introduzido, como tal é vantajoso na produção em larga escala de proteínas ou peptídios recombinantes. A expressão das sequências de ácidos nucléicos da invenção pode ser convenientemente alcançada por uma ou mais técnicas padrão conhecidas por aqueles indivíduos versados na técnica e adicionalmente descritas aqui. Por exemplo, a última descrição da expressão recombinante de fusão de proteínas 120 aplica-se igualmente bem a anticorpos e fragmentos de anticorpos que não são operacionalmente associados com outra sequência de DNA ao nível do ácido nucléico. EI. Anticorpos proveniente de Bibliotecas de Fagemideos A tecnologia recombinante agora permite a preparação de anticorpos que têm a especificidade desejada a partir de genes recombinantes que codificam uma série de anticorpos (Van Dijk et al., 1989). Determinadas técnicas recombinantes abrangem o isolamento dos genes de anticorpo por seleção imunológica das bibliotecas combinatoriais de expressão de fagos de imunoglobulina preparadas a partir de RNA isolado do baço de um animal imunizado (Morrison et al., 1986; Winter e Milstein, 1991; Barbas et al., 1992).
Para tais processos, as bibliotecas combinatoriais de fagemideos de imunoglobulina são preparadas a partir de RNA isolado do baço de um animal imunizado e os fagemideos que expressam os anticorpos adequados são selecionados por peneiragem empregando-se células que expressam o antígeno e as células de controle. As vantagens desta abordagem sobre as técnicas de hibridomas convencionais são que podem ser produzidos e selecionados aproximadamente 104 vezes mais anticorpos em um único ciclo e novas especificidades são geradas por combinação de cadeia H e L, o que aumenta ainda mais a porcentagem de anticorpos adequados gerados.
Um processo para a geração de um grande repertório de diversas moléculas de anticorpo em bactérias utiliza o bacteriófago lâmbda como o vetor (Huse et al., 1989). A produção de anticorpos empregando-se o vetor lâmbda abrange a clonagem de populações de sequências de DNA de cadeia pesada e leve em vetores de partida separados. Os vetores 121 são subsequentemente combinados aleatoriamente para formar um único vetor que dirige a co-expressão de cadeias pesadas e leves para formar os fragmentos do anticorpo. As sequências de DNA de cadeia leve e pesada são obtidas por amplificação, de preferência por PCR™ ou por uma técnica de amplificação correlata, de mRNA isolado das células do baço (ou de seus hibridomas) de um animal que tenha sido imunizado com um antigeno selecionado. As sequências de cadeia pesada e leve são tipicamente amplificadas usando-se iniciadores que incorporam sítios de restrição nas extremidades do segmento de DNA amplificado para facilitar a clonagem de segmentos de cadeia pesada e leve para dentro dos vetores de partida.
Um outro processo para a geração e seleção de grandes bibliotecas de sítios de combinação de anticorpos total ou parcialmente sintéticos, ou parátopos, utiliza vetores de exposição derivados do fago filamentoso tal como M13, fl ou fd. Estes vetores de exposição de fagos filamentosos, a que se refere como "fagemídeos", produzem grandes bibliotecas de anticorpos monoclonais que têm imunoespecificidades diversas e inéditas. A tecnologia emprega um domínio de ancoragem de membrana de proteína de revestimento de fago filamentoso como um meio para ligar produtos gênicos e genes durante o estágio de agrupamento de replicação de fagos filamentosos e foi usado para a clonagem e expressão de anticorpos a partir de bibliotecas combinatoriais (Kang et al., 1991; Barbas et al., 1991) .
Esta técnica geral para a exposição de fagos filamentos é descrita na patente U.S. No. 5.658.727. Num sentido mais geral, o processo proporciona um sistema para a clonagem e seleção simultâneas de especificidades de ligação de 122 ligantes pré-selecionadas a partir de repertórios de genes de anticorpos empregando-se um sistema de um único vetor. A seleção de membros isolados da biblioteca que tenham uma capacidade de ligação a ligante pré-selecionada permite se associar a capacidade de ligação de uma molécula de anticorpo expressa a um meio conveniente para isolar o gene que codifica o membro da biblioteca. A ligação de expressão com seleção é efetuada pela combinação de direcionamento de um polipeptídio de fusão ao periplasma de uma célula bacteriana para permitir a montagem de um anticorpo funcional, e o direcionamento de um polipeptídio de fusão para o revestimento de uma partícula de fago filamentoso durante a montagem do fago para permitir a seleção conveniente do membro da biblioteca que interessa. 0 direcionamento periplasmático é produzido pela presença de um domínio de sinal de secreção em um polipeptídio de fusão. 0 direcionamento a uma partícula de fago é produzido pela presença de um domínio de ancoragem de membrana de proteína de revestimento de fago filamentoso (isto é, um domínio de ancoragem de membrana derivado de cpIII ou de cpVIII) em um polipeptídio de fusão. A diversidade de uma biblioteca combinatorial de anticorpos baseada em fagos filamentosos pode ser aumentada por remanejamento dos genes de cadeia pesada e leve, por alteração de uma ou mais regiões determinadoras de complementaridade dos genes clonados de cadeia pesada da biblioteca, ou por introdução de mutações aleatórias na biblioteca por reações de cadeia de polimerase propensas a erro. Processos adicionais para a seleção de bibliotecas de fagemídeos são descritos nas patentes U.S. Nos. 5.580.717, 5.427.908, 5.403.484, e 5.223.409. 123
Um outro processo foi desenvolvido para a seleção de grandes bibliotecas combinatoriais de anticorpos, utilizando-se a expressão das populações de diversas sequências de cadeia pesada e leve na superfície de um bacteriófago filamentoso, tais como M13, fl ou fd (patente U.S. No. 5.698.426) . Duas populações de diversas sequências de cadeia pesada (Hc) e leve (Lc) são sintetizadas por reação de cadeia de polimerase (PCR™) . Estas populações são clonadas em vetores separados à base de M13 contendo elementos necessários para a expressão. 0 vetor de cadeia pesada contém uma sequência de proteína de revestimento VIII (gVIII) de gene de modo que a tradução das sequências de cadeia pesada produz proteínas de fusão gVIII-Hc. As populações dos dois vetores são combinadas aleatoriamente de modo que somente as porções de vetor que contêm as sequências Hc e Lc são ligadas em um vetor único circular. 0 vetor combinado dirige a co-expressão das sequências Hc e Lc para a montagem dos dois polipept ídios e a expressão superficial sobre M13 (patente U.S. No. 5.698.426). A etapa de combinação junta aleatoriamente as diferentes sequências de codificação de Hc e Lc no interior de duas populações diversas em um único vetor. As sequências de vetor doadas por cada vetor independente são necessárias para a produção de fago viável. Além disso, como as sequências pseudo gVIII são contidas em somente um dos dois vetores de partida, a co-expressão de fragmentos de anticorpos funcionais como proteínas de fusão gVIII-Hc associadas com Lc não pode ser efetuada na superfície do fago até as sequências de vetor estarem ligadas no vetor único. A expressão na superfície da biblioteca de anticorpos é conduzida em uma cepa supressora de âmbar. Um códon de 124 interrupção de âmbar entre a sequência Hc e a sequência gVIII desliga os dois componentes em uma cepa não supressora. 0 isolamento do fato produzido da cepa não supressora e a infecção de uma cepa supressora ligará as sequências de Hc à sequência de gVIII durante a expressão. A cultura da cepa supressora depois da infecção permite a co-expressão na superfície de M13 de todas as espécies de anticorpos no interior da bibliotecas como proteínas de fusão gVIII (proteínas de fusão gVIII-Fab). Alternativamente, o DNA pode ser isolado da cepa não supressora e ser então introduzido em uma cepa supressora para produzir o mesmo efeito. A biblioteca de expressão na superfície é selecionada para a presença de fragmentos Fab específicos que se ligam a moléculas pré-selecionadas por procedimentos de isolamento por afinidade padrão. Tais processos incluem, por exemplo, peneiragem (Parmley e Smith, 1988), cromatografia de afinidade e procedimentos de manchamento de fase sólida. A peneiragem é preferida, pois podem ser selecionados facilmente altos títulos de fagos, de modo rápido e em volumes pequenos. Além disso, este procedimento pode selecionar espécies de fragmentos Fab menores dentro da população, que caso contrários permaneceriam não-detectados, e amplificados a populações substancialmente homogéneas. Os fragmentos Fab selecionados podem ser caracterizados por sequenciamento de ácidos nucléicos que codificam os polipeptídios depois da amplificação da população de fagos.
Um outro processo para as produção de diversas bibliotecas de anticorpos e seleção para especificidades de ligação desejáveis é descrito na patente U.S. No. 5.667.988 e na patente U.S. No. 5.759.817. 0 processo abrange a preparação 125 de bibliotecas de moléculas de imunoglobulina heterodiméricas na forma de bibliotecas de fagemideos usando-se oligonucleotídeos degenerados e reações de extensão de iniciador para incorporar as degenerações nas regiões CDR de domínios variáveis de cadeia pesada e leve de imunoglobulina, e expor os polipeptídios na superfície do fagemídeo. Em seguida a proteína de exposição é selecionada pela capacidade de se ligar a um antígeno pré-selecionado. 0 processo para a produção de uma molécula de imunoglobulina heterodimérica geralmente abrange (1) a introdução de um gene que codifica a região V de cadeia pesada ou leve que interessa no vetor de exposição de fagemídeo; (2) a introdução de um sítio de ligação randomizado no vetor de proteína de exposição de fagemídeo por alongamento de iniciador com um oligonucleotídeo contendo regiões de homologia a um CDR do gene de região V de anticorpo e contendo regiões de degeneração para produzir sequências de codificação aleatorizadas para formar uma população grande de vetores de exposição, sendo cada um capaz de expressar sítios de ligação putativos diferentes expostos na proteína de exposição de superfície de fagemídeo; (3) a expressão da proteína de exposição e sítio de ligação na superfície de uma partícula de fago filamentoso; e (4) o isolamento (seleção) da partícula de fago expressa na superfície usando técnicas por afinidade tais como peneiragem de partículas de fago contra um antígeno pré-selecionado, isolando deste modo uma ou mais espécies de fagemideos contendo uma proteína de exposição contendo um sítio de ligação que se liga a um antígeno pré-selecionado.
Uma outra variação deste processo para a produção de diversas bibliotecas de anticorpos e seleção para 126 especificidades de ligação desejáveis é descrito na patente U.S. No. 5.702.892. Neste processo, somente sequências de cadeia pesada são empregadas, sendo as sequências de cadeia pesada aleatorizadas em todas as posições de nucleotídeos que codificam ou a região hipervariável CDRi ou a CDRIII, sendo a variabilidade genética dos CDRs gerada independentemente de qualquer processo biológico.
No processo, são construídas duas bibliotecas para remanejar geneticamente motivos de oligonucleotídeos dentro do quadro da estrutura do gene de cadeia pesada. Por mutação aleatória tanto de CDRI como de CDRIII, as regiões hipervariáveis do gene de cadeia pesada foram reconstruídas para resultar em uma coleção de sequências extremamente diversas. As proteínas de cadeia pesada codificadas pela coleção de sequências de genes mutados possuíam o potencial de ter todas as características de ligação de uma imunoglobulina exigindo ao mesmo tempo somente uma das duas cadeias de imunoglobulina.
Especificamente, o processo é colocado em prática na ausência da proteína de cadeia leve de imunoglobulina. Uma biblioteca de fagos apresentando proteínas de cadeia pesada modificadas é incubada com um ligante imobilizado para selecionar os clones que codificam as proteínas recombinantes que se ligam especificamente ao ligante imobilizado. Os fagos ligados são então dissociados do ligante imobilizado e amplificados por cultivo em células hospedeiras bacterianas. As placas virais individuais, expressando cada uma delas uma proteína recombinante diferente, são expandidas, e os clones individuais podem então ter testada a atividade de ligação. 127 Ε2. Anticorpos provenientes de Linfócitos Humanos
Anticorpos contra fosfolipídios ocorrem na população humana. Entretanto, esses anticorpos são tipicamente associados com doenças e seu uso na presente invenção deveria ser preferencialmente evitado. Entretanto, linfócitos humanos de indivíduos saudáveis podem ser usados de forma apropriada como materiais de partida para gerar um anticorpo para uso na invenção. A imunização in vitro, ou estimulação de antígenos, pode também ser usada para gerar um anticorpo humano para uso na presente invenção. Tais técnicas podem ser usadas para estimular os linfócitos de sangue periférico de indivíduos normais e sadios, simplesmente por estimulação das células produtoras de anticorpos com fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios in vitro .
Tal "imunização in vitro" abrange a ativação específica a antígeno dos linfócitos B não imunizados, geralmente dentro de uma população mista de linfócitos (culturas mistas de linfócitos, MLC) . As imunizações in vitro podem ser também sustentadas por fatores de diferenciação e de crescimento de células B e linfoquinas. Os anticorpos produzidos por estes processos são frequentemente anticorpos de IgM (Borrebaeck & Moller, 1986) .
Foi descrito um outro processo (patente U.S. No. 5.681.729) onde linfócitos humanos que produzem principalmente anticorpos IgG (ou IgA) podem ser obtidos. 0 processo abrange, em um sentido geral, o transplante de linfócitos humanos em um animal imunodeficiente, de modo que os linfócitos humanos "peguem" no corpo do animal; a imunização do animal com um antígeno desejado, de modo a gerar 128 linfócitos humanos que produzam um anticorpo específico ao antígeno; e a recuperação dos linfócitos humanos que produzem o anticorpo do animal. Os linfócitos humanos deste modo produzidos podem ser usados para produzir um anticorpo monoclonal por imortalização de linfócitos humanos que produzem o anticorpo, clonagem dos linfócitos imortalizados de origem humana obtidos que produzem o anticorpo, e recuperação de um anticorpo monoclonal específico ao antígeno desejado a partir dos linfócitos clonados imortalizados de origem humana.
Os animais imunodeficientes que podem ser empregados nesta técnica são aqueles que não apresentam rejeição quando os linfócitos humanos são transplantados nos animais. Tais animais podem ser artificialmente preparados por tratamentos físicos, químicos ou biológicos. Qualquer animal imunodeficiente pode ser empregado. Os linfócitos humanos podem ser obtidos do sangue periférico humano, do seu baço, nódulos linfáticos, amídalas ou análogos. A "pega" dos linfócitos humanos transplantados nos animais pode ser produzida por administração simples de linfócitos humanos aos animais. A via de administração não é restrita e pode ser, por exemplo, subcutânea, intravenosa ou intraperitoneal. A dose dos linfócitos humanos não é restrita e pode ser geralmente ser de 106 a 108 linfócitos por animal. 0 animal imunodeficiente é então imunizado com o antígeno desejado.
Depois da imunização, os linfócitos humanos são recuperados do sangue, baço, nódulos linfáticos ou outros tecidos linfáticos por qualquer processo convencional. As células mononucleares, por exemplo, podem ser separadas por processo 129 de centrifugação Ficoll-Hypaque (gravidade especifica; 1,077), e os monócitos removidos pelo processo de adsorção ao prato plástico. As células contaminantes que se originam do animal imunodeficiente podem ser removidas empregando-se um antisoro especifico às células do animal. O antisoro pode ser obtido, por exemplo, por imunização de um segundo animal distinto com as células do baço do animal imunodeficiente e por recuperação do soro do animal imunizado distinto. O tratamento com o antisoro pode ser conduzido em qualquer estágio. Os linfócitos humanos podem também ser recuperados por um processo imunológico empregando uma imunoglobulina humana expressa na superfície celular como um marcador.
Por estes processos, os linfócitos humanos que produzem principalmente anticorpos de IgG e IgA específicos a um ou mais fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios selecionados podem ser obtidos. Os anticorpos monoclonais são então obtidos dos linfócitos humanos por imortalização, seleção, cultura celular e produção de anticorpos. E3. Camundongos Transgênicos Contendo Bibliotecas de Anticorpos Humanos A tecnologia recombinante está agora disponível para a preparação de anticorpos. Além das bibliotecas combinatoriais de expressão de fagos de imunoglobulina descritas acima, outra abordagem de clonagem molecular consiste em se preparar anticorpos de camundongos transgênicos contendo bibliotecas de anticorpos humanos. Tais técnicas são descritas na patente U.S. No. 5.545.807.
No sentido mais geral, estes processos abrangem a produção de um animal transgênico que tem inserido na sua linha germinal material genético que codifica pelo menos uma parte 130 de uma imunoglobulina de origem humana ou que pode se rearranjar para codificar um repertório de imunoglobulinas. 0 material genético inserido pode ser produzido de uma fonte humana ou pode ser produzido sinteticamente. 0 material pode codificar pelo menos uma parte de uma imunoglobulina conhecida ou pode ser modificado para codificar pelo menos uma parte de uma imunoglobulina alterada. 0 material genético inserido é expresso no animal transgênico, resultando na produção de uma imunoglobulina derivada pelo menos em parte do material genético de imunoglobulina humana inserido. Foi descoberto que o material genético é rearranjado no animal transgênico, de modo que um repertório de imunoglobulinas com parte ou partes derivadas do material genético inserido pode ser produzido mesmo se o material genético inserido for incorporado na linha de germinação na posição errada ou com uma geometria errada. 0 material genético inserido pode ser na forma de DNA clonado em vetores procarióticos tais como plasmídeos e/ou cosmideos. Os fragmentos de DNA maiores são inseridos utilizando-se vetores de cromossomos artificiais de levedura (Burke et al., 1987) ou por introdução de fragmentos de cromossomos (Richer e Lo, 1989). 0 material genético inserido pode ser introduzido no hospedeiro de modo convencional, por injeção, por exemplo, ou por outros procedimentos em ovos fertilizados ou em células embrionárias originais.
Em aspectos preferidos, um animal hospedeiro que inicialmente não é portador de material genético que codifica regiões constantes de imunoglobulina é utilizado, 131 de modo que o animal transgênico resultante usará somente o material genético humano inserido quando produzir imunoglobulinas. Isto pode ser obtido quer empregando-se um hospedeiro mutante que ocorre na natureza e que não é portador do material genético relevante ou por preparação artificial de mutante, por exemplo, em linhagens celulares para finalmente criar um hospedeiro do qual o material genético relevante tenha sido removido.
Nos casos em que o animal hospedeiro for portador de material genético que codifica regiões constantes de imunoglobulina, o animal transgênico será portador do material genético que ocorre na natureza e o material genético inserido e produzirá as imunoglobulinas derivadas do material genético que ocorre na natureza, do material genético inserido e das misturas dos dois tipos de material genético. Neste caso a imunoglobulina desejada pode ser obtida por seleção de hibridomas derivados do animal transgênico, tal como, por exploração do fenômeno de exclusão alélica da expressão genética do anticorpo ou perda diferencial de cromossomos.
Quando um animal transgênico adequado tiver sido preparado, o animal é simplesmente imunizado com o imunogênio desejado. Dependendo da natureza do material inserido, o animal pode produzir uma imunoglobulina quimérica, tal como uma de origem mista camundongo/humana, em que o material genético de origem estranha codifica somente parte da imunoglobulina; ou então o animal pode produzir uma imunoglobulina totalmente estranha, tal como uma de origem totalmente humana, em que o material genético de origem estranha codifica uma imunoglobulina integral. 132
Podem ser produzidos antisoros policlonais a partir do animal transgênico depois da imunização. As células produtoras de imunoglobulina podem ser removidas do animal para produzir a imunoglobulina que interessa. É preferível que os anticorpos monoclonais sejam produzidos do animal transgênico, tal como por fusão das células do baço do animal com células de mieloma e selecionando-se os hibridomas resultantes para selecionar os que produzem o anticorpo desejado. Técnicas adequadas para tais processos são descritas no presente documento.
Em uma abordagem alternativa, o material genético pode ser incorporado ao animal de um modo tal que o anticorpo desejado seja produzido nos fluidos corporais tais como soro ou secreções externas do animal tais como leite, colostro ou saliva. Por exemplo, por inserção in vitro de material genético que codifica pelo menos uma parte de uma imunoglobulina humana em um gene de um mamífero que codifica para uma proteína do leite e introdução subsequente do gene em um óvulo fertilizado do mamífero, tal como por injeção, o óvulo pode se desenvolver em um mamífero fêmea adulto produzindo leite que contém imunoglobulina derivada pelo menos em parte do material genético de imunoglobulina humana inserido. 0 anticorpo desejado pode então ser coletado do leite. Técnicas adequadas para a condução de tais processos são conhecidas dos peritos na técnica.
Os animais transgênicos acima são geralmente empregados para produzir anticorpos humanos de um único isotipo, mais especificamente um isotipo que é essencial para a maturação das células B, tais como IgM e possivelmente IgD. Um outro processo preferido para a produção de anticorpos humanos é descrito nas patentes U.S. Nos. 5.545.806; 5.569.825; 133 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; e 5.770.429, em que são descritos animais transgênicos que são capazes de comutar de um isotipo necessário para o desenvolvimento de células B para outros isotipos.
No desenvolvimento de um linfócito B, a célula inicialmente produz IgM com uma especificidade de ligação determinada pelas regiões Vh e Vl rearranjadas de modo produtivo. Subsequentemente, cada célula B e as suas células filhas sintetizam anticorpos com as mesmas regiões V de cadeia L e H, mas elas podem comutar o isotipo da cadeia H. 0 emprego de regiões constantes mu ou delta é em grande parte determinado por emendas alternadas, permitindo que IgM e IgD sejam co-expressas em uma única célula. Os outros isotipos de cadeia pesada (gama, alfa e épsilon) são somente expressos nativamente depois que um evento de rearranjo de genes delete os éxons mu de C e delta de C. Este processo de rearranjo de genes, denominado comutação de isotipos, tipicamente ocorre por recombinação entre os segmentos denominados de comutação localizados imediatamente acima de cada gene de cadeia pesada (exceto delta). Os segmentos de comutação individuais tem entre 2 e 10 kb de comprimento e consistem principalmente em sequências curtas repetidas.
Por estes motivos é preferível que os transgenes incorporem sequências reguladoras transcricionais dentro de aproximadamente 1-2 kb acima de cada região de comutação que deve ser utilizada para a comutação de isotipos. Estas sequências reguladoras transcricionais incluem, de preferência, um promotor e um elemento acentuador, e incluem com mais preferência a região de flanqueamento de 5' (isto é acima) que é naturalmente associada (isto é, que ocorre na configuração da linha de germinação) com uma região de 134 comutação. Embora uma sequência de flanqueamento de 5' proveniente de uma região de comutação possa ser ligada operativamente a uma região de comutação diferente para a construção de transgene, em algumas modalidades é preferível que cada região de comutação incorporada na construção de transgene tenha a região de flanqueamento de 5' que ocorre imediatamente acima na configuração de linha de germinação que ocorre na natureza. As informações sobre sequências que se referem a sequências da região de comutação de imunoglobulina são conhecidas (Mills et al., 1990; Sideras et al., 1989).
No processo descrito nas patentes U.S. Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; e 5.770.429, os transgenes de imunoglobulina humana contidos na função do animal transgênico funcionam corretamente através da via do desenvolvimento de células B, levando à comutação de isotipos. Consequentemente, neste processo, estes transgenes são construídos de modo a produzir a comutação de isotipos e um ou mais dos seguintes: (a) expressão de alto nível e específica ao tipo de célula, (2) rearranjo de genes funcionais, (3) ativação da exclusão alélica e resposta a ela, (4) expressão de um repertório primário suficiente, (5) transdução de sinal, (6) hipermutação somática, e (7) dominação do locus de anticorpo de transgene durante a resposta imune.
Uma exigência importante para a função de transgene é a geração de um repertório primário de anticorpos que é suficientemente diverso para desencadear uma resposta imune secundária para uma ampla faixa de antígenos. O gene de cadeia pesada rearranjado consiste em um éxon de peptídeo de sinal, um éxon de região variável e um arranjo em carruagem 135 de regiões de domínio múltiplo de região constante, cada um dos quais é codificada por diversos éxons. Cada um dos genes de região constante codifica a porção constante de uma classe diferente de imunoglobulinas. Durante o desenvolvimento das células B, as regiões constantes proximais à região V são deletadas levando à expressão das novas classes de cadeia pesada. Para cada classe de cadeia pesada, padrões alternativos de emendas de RNA dão origem tanto a imunoglobulinas de transmembrana como segregadas. 0 locus da cadeia pesada humana consiste em aproximadamente 200 segmentos de gene V cobrindo 2Mb, cobrindo aproximadamente 30 segmentos de gene d cobrindo aproximadamente 40 kb, seis segmentos J englobados dentro de uma área de 3 kb e nove segmentos de genes de região constante dispersados sobre aproximadamente 300 kb. O locus integral cobre aproximadamente 2,5 Mb da porção distai do braço longo do cromossomo 14. Os fragmentos de transgene de cadeia pesada contendo membros de todos as seis famílias conhecidas de VH, os segmentos de genes D e J assim como as regiões constantes mu, delta, gama 3, gama 1 e alfa 1 são conhecidos (Berman et al., 1988). Os fragmentos genômicos contendo todos os segmentos de genes necessários e as sequências reguladoras necessária provenientes de um locus de cadeia leve humana é construído de modo análogo. A expressão de transgenes leves e pesados de imunoglobulina rearranjados com sucesso geralmente tem um efeito dominante pela supressão do rearranjo dos genes de imunoglobulina endógeno no animal transgênico não humano. No entanto, em determinadas modalidades, é desejável se efetuar a inativação completa dos loci de Ig endógena de modo que as cadeias de imunoglobulina híbrida compreendendo uma região 136 variável humana e uma região constante não humana (tal como murina), não possam ser formadas, por exemplo, por transcomutação, por exemplo, entre as sequências de Ig endógena e transgênica. Utilizando-se a tecnologia de célula original embrionária e recombinação homóloga, pode ser facilmente eliminado o repertório de imunoglobulina endógena. Além disso, a supressão dos genes de Ig endógena pode ser produzida utilizando-se uma variedade de técnicas, tais como a tecnologia de anti-senso.
Em outros aspectos da presente invenção, pode ser desejável se produzir uma imunoglobulina transcomutada. Podem ser usados anticorpos compreendendo tais imunoglobulinas quiméricas transcomutadas para uma variedade de aplicações em que é desejável se ter uma região constante não humana (murina, por exemplo) , para a retenção das funções efetoras no hospedeiro, por exemplo. A presença de uma região murina constante pode proporcionar vantagens sobre uma região constante humana para prover funções de efetuador murino, por exemplo (ADCC, por exemplo, fixação do complemento murino) de modo que um anticorpo quimérico possa ser testado em um modelo de doença murina. Depois do animal ser testado, a sequência que codifica a região variável humana pode ser isolada, por amplificação por PCR™, por exemplo, ou por clonagem de DNAc da fonte (clone de hibridoma) e emendada a uma sequência que codifica uma região constante humana desejada para codificar um anticorpo de sequência humana mais adequado para emprego terapêutico em seres humanos. E4. Anticorpos Humanizados 137
Os anticorpos humanos têm geralmente pelo menos três vantagens potenciais para serem empregadas na terapia humana. Em primeiro lugar, como a porção efetora é humana, ela pode interagir melhor com as outras partes do sistema imunológico humano, para destruir células alvo mais eficientemente, por citotoxicidade dependente de complemento (CDC), por exemplo, ou por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Em segundo lugar, o sistema imunológico humano não deveria reconhecer o anticorpo como estranho. Em terceiro lugar, a meia vida na circulação humana será análoga à dos anticorpos humanos que ocorrem na natureza, permitindo que sejam dadas doses menores e menos frequentes. São propostos no presente diversos processos para a preparação de anticorpos humanos. Além dos anticorpos humanos, os anticorpos "humanizados" podem ter muitas vantagens. Anticorpos "humanizados" são geralmente anticorpos monoclonais quiméricos ou mutantes de camundongos, ratos, hamsters, coelhos ou de outras espécies, portadores de domínios de região constante e/ou variável humana ou alterações específicas. As técnicas para a geração de anticorpo denominado "humanizado" são conhecidas dos peritos na técnica.
Os anticorpos humanizados também tem as vantagens acima. Em primeiro lugar, a porção efetora ainda é humana. Em segundo lugar, o sistema imunológico humano não deveria reconhecer o quadro ou região constante como estranha e, portanto a resposta de anticorpo contra tais anticorpos injetados deveria ser menor do que contra um anticorpo murino totalmente estranho. Em terceiro lugar, os anticorpos humanizados injetados, ao contrário do que ocorre com 138 anticorpos de camundongos injetados, terão, se supõe, uma meia vida mais semelhante à dos anticorpos humanos que ocorrem na natureza, permitindo também doses menores e menos frequentes.
Uma série de processos foi descrita para a produção de anticorpos humanizados. Pode ser utilizado o rearranjo controlado dos domínios de anticorpos ligados através de ligações disulfeto de proteínas para formar novos anticorpos de moléculas de proteínas artificiais ou "quiméricos". (Konieczny et al., 1981). A tecnologia de DNA recombinante pode também ser usada para construir fusões genéticas entre sequências de DNA que codificam domínios de cadeia pesada e leve variáveis de anticorpos de camundongos e domínios constantes de cadeia leve e pesada de anticorpos humanos (Morrison et al., 1984).
As sequências de DNA que codificam porções de ligação a antígeno ou regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) de anticorpos monoclonais murinos podem ser enxertadas por meios moleculares nas sequências de DNA que codificam os quadros de cadeias leve e pesada de anticorpos humanos (Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988). Os produtos recombinantes expressos são denominados "remodelados" ou anticorpos humanizados, e compreendem a estrutura de uma cadeia leve ou pesada de anticorpos humanos e as porções de reconhecimento de antígeno, CDRs, de um anticorpo monoclonal murino.
Um outro processo para a produção de anticorpos humanizados é descrito na patente U.S. No. 5.639.641. 0 processo proporciona, através de redisposição na superfície, anticorpos de roedores humanizados que têm uma eficácia 139 de uma terapêutica melhorada devido à apresentação superfície humana na região variável. No processo: (1) os alinhamentos de posição de uma combinação de regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpos são gerados para produzir um conjunto de posições com a superfície exposta da estrutura de regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que as posições de alinhamento para todas as regiões variáveis têm pelo menos um grau de identidade de 98%; (2) um conjunto de resíduos de aminoácidos com a superfície exposta da estrutura de regiões variáveis de cadeia pesada e leve é definido para um anticorpo de roedor (ou fragmento seu); (3) é identificado um conjunto de resíduos de aminoácidos com a superfície exposta da estrutura das regiões variáveis de cadeia pesada e leve que é praticamente idêntico ao conjunto de resíduos de aminoácidos com a superfície exposta de roedores; (4) o conjunto de resíduos de aminoácidos com a superfície exposta da estrutura de regiões variáveis de cadeia pesada e leve definidos na etapa (2) é substituído pelo conjunto de resíduos de aminoácidos com a superfície exposta da estrutura de regiões variáveis de cadeia pesada e leve identificados na etapa (3) exceto aqueles resíduos de aminoácidos que se encontram dentro de 5A de qualquer átomo de qualquer resíduo das regiões determinadoras de complementaridade do anticorpo de roedor; e (5) é produzido o anticorpo de roedor humanizado que tem uma especificidade de ligação.
Um processo análogo para a produção de anticorpos humanizados é descrito nas patentes U.S. Nos. 5.693.762; 5.692.761; 5.585.089; e 5.530.101. Estes processos abrangem a produção de imunoglobulinas humanizadas tendo uma ou mais regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) e 140 aminoácidos adicionais possíveis provenientes de uma imunoglobulina doadora e uma região de estrutura proveniente de uma imunoglobulina aceitadora humana. Cada cadeia de imunoglobulina humanizada geralmente compreende além das CDRs, aminoácidos provenientes da estrutura de imunoglobulina doadora que são capazes de interagir com as CDRs para efetuar a afinidade de ligação, tais como um ou mais aminoácidos que se encontram na imediata adjacência a uma CDR na imunoglobulina doadora ou aqueles dentro de aproximadamente 3A conforme previsto por modelagem molecular. Cada uma das cadeias pesada e leve pode ser projetada empregando-se qualquer uma, qualquer combinação ou todos os critérios de posições diversos descritos nas patentes U.S. Nos. 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; e 5.530.101. Quando combinadas em um anticorpo intacto, as imunoglobulinas humanizadas são substancialmente não imunogênicas em humanos e conservam substancialmente a mesma afinidade como a imunoglobulina doadora ao antígeno original.
Um processo adicional para a produção de anticorpos humanizados é descrito nas patentes U.S. Nos. 5.565.332 e 5.733.743. Este processo combina a idéia de humanização de anticorpos com as bibliotecas de fagemídeos também descrita em detalhes no presente. Em um sentido geral, o processo utiliza sequências provenientes do sítio de ligação a antígeno de um anticorpo ou população de anticorpos dirigidos contra um antígeno que interessa. Portanto, para um único anticorpo de roedor, sequências compreendendo parte do sítio de ligação a antígeno do anticorpo podem ser combinadas com repertórios diversos de sequências de anticorpos humanos que possam, em combinação, criar um sítio de ligação a antígeno completo. 141
Os sítios de ligação a antígeno criados por este processo diferem dos criados por enxerto de CDRs pelo fato de que somente a porção da sequência do anticorpo de roedor original tem a possibilidade de fazer contato com o antígeno de um modo análogo. As sequências humanas selecionadas têm a probabilidade de serem de sequências diferentes e de fazer contatos alternativos com o antígeno proveniente daqueles do sítio de ligação original. No entanto, os limites impostos pela ligação da porção da sequência original a antígeno e os formatos do antígeno e os seus sítios de ligação a antígenos têm a probabilidade de levar os novos contatos das sequências humanas para a mesma região ou epítopo do antígeno. Este processo foi, portanto denominado "seleção marcada por epítopo" (EIS).
Começando-se com um anticorpo de animal, um processo resulta na seleção de anticorpos que são parcialmente anticorpos humanos. Tais anticorpos podem ter uma analogia suficiente em sequência a anticorpos humanos a serem usados diretamente na terapia ou depois de alteração de alguns resíduos chave. As diferenças em sequência entre o componente de roedor do anticorpo selecionado com sequências humanas poderiam ser minimizadas se forem substituídos aqueles resíduos que diferem por resíduos de sequências humanas, por mutagênese dirigida a sítio, por exemplo, de resíduos individuais ou por enxerto de CDR de laços inteiros. No entanto, os anticorpos com sequências integralmente humanas podem também ser criados. EIS, portanto, oferece um processo para se preparar anticorpos parcialmente humanos ou integralmente humanos que se ligam ao mesmo epítopo como os anticorpos animais ou parcialmente humanos respectivamente. Em EIS, os repertórios de fragmentos de anticorpos podem ser expostos na superfície da fase filamentosa e os fragmentos 142 codificando genes com atividades de ligação a antigeno selecionados por ligação do fago ao antigeno. Métodos adicionais para humanizar os anticorpos contemplados para serem usados na presente invenção estão descritos nas Patentes US n° 5.750.078; 5.502.167; 5.705.154; 5.770.403; 5.698.417; 5.693.493; 5.558.864; 4.935.496 e 4.816.567. E5. Mutagênese por PCR™ A mutagênese especifica a sitio é uma técnica útil na preparação de anticorpos individuais através da mutagênese especifica do DNA subjacente. A técnica proporciona ainda uma capacidade imediata de se preparar e testar variantes de sequências, incorporando uma ou mais das considerações acima, quer humanizando quer não, por introdução de uma ou mais alterações de sequências de nucleotídeos no DNA.
Embora muitos processos sejam adequados para uso em mutagênese, o emprego da reação em cadeia de polimerase (PCR™) é geralmente preferido agora. Esta tecnologia oferece um processo rápido e eficiente de se introduzir as mutações desejadas em uma sequência de DNA dada. O texto abaixo descreve especificamente o emprego de PCR™ para introduzir pontos de mutação em uma sequência, conforme possa ser usado para alterar o aminoácido codificado pela sequência dada. As adaptações deste processo são também adequadas para a introdução de sítios de enzimas de restrição em uma molécula de DNA.
Neste processo, são projetados oligonucleotídeos sintéticos para incorporar um ponto de mutação em uma extremidade de um segmento amplificado. Depois da PCR™, os fragmentos 143 amplificados tem as pontas cegadas por tratamento com fragmentos de Klenow, e os fragmentos com as pontas cegas são então ligados e subclonados em um vetor para facilitar a análise de segiiência. A fim de se preparar o DNA gabarito que se deseja mutagenizar, o DNA é subclonado em um vetor de alto número de cópias tal como pUC19, usando-se sitios de restrição flanqueando a área a ser mutada. 0 DNA gabarito é então preparado usando-se uma minipreparação de plasmídeo. Os primers de oligonucleotideos adequados que são baseados na sequência progenitora, mas que contém o ponto de mutação desejado e que são flanqueados na extremidade 5' por um sitio de enzima de restrição, são sintetizados usando-se um sintetizador automatizado. É geralmente necessário que o primer seja homólogo ao DNA gabarito para aproximadamente 15 bases aproximadamente. Iniciadores podem ser purificados por eletroforese de desnaturação em gel de poliacrilamida, embora isto não seja absolutamente necessário em PCR™. A extremidade de 5' dos oligonucleotideos deveria então ser fosforilada. 0 DNA gabarito deve ser amplificado por PCR™, utilizando-se os primers de oligonucleotideos que contêm os pontos de mutação desejados. A concentração de MgCl2 no tampão de amplificação será geralmente de aproximadamente 15 mM. Geralmente devem ser conduzidos aproximadamente 20-25 ciclos de PCR™ do seguinte modo: desnaturação, 35 segundos a 95°C; hibridização, 2 minutos a 50°C; e amplificação, 2 minutos a 72°C. A PRC™ geralmente incluirá um último ciclo de alongamento de aproximadamente 10 minutos a 72°C. Depois da etapa de alongamento final, aproximadamente 5 unidades de fragmentos de Klenow devem ser acrescentados à mistura de 144 reação e incubados durante outros 15 minutos, a aproximadamente 30°C. A atividade de exonuclease dos fragmentos de Klenow é necessária para alinhas as extremidade e adequada para a clonagem de extremidades cegas. A mistura de reação resultante deve geralmente ser analisada por eletroforese em gel de acrilamida ou agarose não- desnaturada para se verificar que a amplificação produziu o produto previsto. Processar-se-ia então a mistura de reação por remoção da maior parte dos óleos minerais, extraindo-se com clorofórmio para remover o óleo restante, extraindo-se com fenol tamponado e concentrando-se por precipitação com etanol a 100%. Em seguida deve se digerir aproximadamente metade dos fragmentos amplificados com a enzima de restrição que corta nas sequências flanqueadoras usadas nos oligonucleotídeos. Os fragmentos digeridos são purificados sobre gel de agarose de baixa gelificação/fusão.
Para se subclonar os fragmentos e para se verificar o ponto de mutação, deve-se subclonar os dois fragmentos amplificados em um vetor adequadamente digerido por ligação de ponta cega. Isto seria usado para transformar E. coli, da qual o DNA de plasmídeo poderia ser subsequentemente preparado empregando-se uma minipreparação. A porção amplificada do DNA de plasmídeo seria então analisada por sequenciamento de DNA para confirmar que o ponto de mutação correto foi gerada. Isto é importante, uma vez que a Taq DNA polimerase pode introduzir mutações adicionais nos fragmentos de DNA. A introdução de um ponto de mutação pode também ser efetuada empregando-se etapas de PCR™ em sequência. Neste 145 procedimento, os dois fragmentos abrangendo a mutação são fundidos um com outro e estendidos por sintese mutuamente tratada com primer. Este fragmento é então amplificado por uma segunda etapa de PCR™, evitando deste modo a ligação de extremidade cega necessária no protocolo acima. Neste processo, a preparação do DNA gabarito, a geração dos primers de oligonucleotideos, e a primeira amplificação de PCR™ são conduzidas conforme descrito acima. Neste processo, no entanto, os oligonucleotideos escolhidos devem ser homólogos ao DNA gabarito durante um trecho tendo entre aproximadamente 15 e aproximadamente 20 bases e deve portanto se sobrepor entre si por aproximadamente 10 bases ou mais.
Na segunda amplificação por PCR™, usar-se-ia cada fragmento amplificado e cada sequência de primer que flanqueia e se conduziria PCR™ por entre aproximadamente 20 e aproximadamente 25 ciclos, empregando-se as condições descritas acima. Novamente subclonar-se-iam os fragmentos e se verificaria que os pontos de mutação estavam corretos empregando as etapas expostas acima.
Ao se empregar qualquer um dos processos acima, é geralmente preferido se introduzir a mutação por amplificação de um fragmento o menor possível. Naturalmente os parâmetros tais como a temperatura de fusão do oligonucleotídeo que será geralmente influenciada pelo teor de GC e pelo comprimento do oligo, devem também ser cuidadosamente consideradas. A execução destes processos, e a sua otimização, se for necessário, serão do conhecimento dos peritos na técnica, e se encontram descritas com mais detalhes em diversas publicações, tais como Current Protocols in Molecular Blology, 1995. 146
Quando se conduz a mutagênese específica a sítio, a Tabela A pode ser empregada como referência.
Tabela A
Aminoácidos Códons
Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteína Cys C UGC UGU Ácido aspártico Asp D GAC GAU Ácido glutâmico Glu E GAA GAG Fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina Ile I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU 147
Prolina Pro P CCA ccc CCG CCU Glutamina Gin Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Valina Vai V GUA GUC GUG GUU Triptofano Trp W UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU Ε6. Fragmentos e Derivados de Anticorpos
Independente da fonte do anticorpo original contra um fosfolipidio aniônico ou aminofosfolipidio, guer anticorpo intacto, multimeros de anticorpo, ou qualquer um de uma variedade de regiões funcionais de ligação a antigeno do anticorpo podem ser usadas na presente invenção. Regiões funcionais exemplares incluem fragmentos scFv, Fv, Fab', Fab e F(ab')2 fragmentos e anticorpos. As técnicas para a preparação de tais construções são bem conhecidas dos peritos na técnica e são exemplificadas em detalhes no presente. A escolha da construção de anticorpo pode ser influenciada por diversos fatores. Uma meia-vida prolongada, por exemplo, pode resultar da readsorção ativa de anticorpos intactos no interior do rim, uma propriedade do fragmento Fc de imunoglobulina. Espera-se, portanto, que os anticorpos à 148 base de IgG, apresentem uma eliminação no sangue mais lenta do que os seus correspondentes Fab'. No entanto as composições à base do fragmento Fab' geralmente apresentarão uma capacidade de penetração melhor no tecido.
Fragmentos de anticorpos podem ser obtidos por proteólise da imunoglobulina integral pela tiol protease não especifica, papaina. A digestão da papaína rende dois fragmentos idênticos que se ligam a antigeno, denominados "fragmentos Fab", cada um com um sitio único de ligação a antigeno e um "fragmento Fc" residual. A papaina deve primeiro ser ativada por redução do grupamento sulfidrila no sitio ativo com cisteina, 2-mercaptoetanol ou ditiotreitol. Metais pesados na enzima de estoque devem ser removidos por quelação com EDTA (2 mM) para se assegurar a atividade enzimática máxima. A enzima e o substrato são normalmente misturados entre si numa razão de 1:100 em peso. Depois de incubação, a reação pode ser extinta por alquilação irreversível do grupamento tiol com iodoacetamida ou simplesmente por diálise. O caráter completo da digestão deve ser monitorado por SDS-PAGE e as diversas frações devem ser separadas por proteína A-Sefarose ou por cromatografia de troca de íons. O procedimento normal para a preparação de fragmentos F(ab')2 a partir de IgG de origem humana e de coelho é a proteólise limitada pela enzima pepsina. As condições, lOOx anticorpos de excesso peso/peso em tampão acetato com um pH de 4,5, 37 °C, sugerem que o anticorpo é clivado no lado do terminal C da ligação disulfeto ente cadeias pesadas. As taxas de digestão de IgG de camundongo podem variar com a subclasse e pode ser difícil obter granes rendimentos de 149 fragmentos F(ab')2 ativos sem alguma IgG não-digerida ou completamente degradada. IgG2b especialmente é altamente suscetível a uma degradação completa. As outras subclasses exigem condições de incubação diferentes para produzir resultados ótimos, todas estas condições conhecidas na técnica. 0 tratamento com pepsina de anticorpos intactos produz um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de combinação com antígeno e continua capaz de ligar de forma reticulada o antígeno. A digestão de IgG do rato por pepsina exige condições que incluem a diálise em tampão acetato a 0,1 M, pH de 4,5 e em seguida incubação durante quatro horas com pepsina a 1% peso/peso; a digestão de IgGi e IgG2a é melhorada se primeiro ela for submetida a diálise contra tampão formiato a 0,1 M, pH 2,8, a 4 °C durante 16 horas seguindo-se de tampão acetato. IgG2b produz resultados mais consistentes com a incubação em protease V8 estafilocócica (a 3% peso/peso) em tampão de fosfato de sódio a 0,1 M com pH 7,8 durante quatro horas a 37 °C.
Um fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxila do domínio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteína(s) da região de articulação do anticorpo. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos. 150
Um fragmento "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio completo de reconhecimento e ligação a antígeno. Esta região consiste em um dímero de uma cadeia pesada e em um domínio variável de cadeia leve em uma associação íntima con-covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação a antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem uma especificidade de ligação a antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo somente três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer um antígeno e de se ligar a ele, embora com uma afinidade inferior à do sítio de ligação integral.
Fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou "scFv" (agora também conhecidos como "cadeias únicas") compreendem os domínios Vh e Vl do anticorpo, estando estes domínios presentes em uma única cadeia de polipeptídios. Geralmente o polipeptídio Fv compreende ainda um linker de polipeptídio entre os domínios Vh e Vl o que permite que sFv forme a estrutura desejada para a ligação a antígeno.
As patentes abaixo complementam ainda mais as instruções da presente invenção no tocante à preparação e emprego de regiões de anticorpos funcionais de ligação a antígeno, incluindo fragmentos de anticorpos scFv, Fv, Fab', Fab e F(ab')2: patentes U.S. Nos. 5.855.866; 5.877.289; 5.965.132; 6.093.399; 6.261.535 e 6.004.555. WO 98/45331 inclui uma adicional descrição e ensino da preparação de regiões variáveis, hipervariáveis e determinantes de complementaridade (CDR) de anticorpos. Além disso, a 151 produção bem sucedida de construções scFv pelo escopo da presente invenção é detalhada no Exemplo XIV. "Diacorpos" são pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação a antígeno, compreendendo os fragmentos um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídios (Vh-Vl) . Empregando-se um ligante que é demasiado curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares da outra cadeia e criar dois sítios de ligação a antígeno. Os diacorpos são descritos em EP 404.097 e WO 93/11161, ambas especificamente incorporadas ao presente documento a título de referência. "Anticorpos lineares", que podem ser biespecíficos ou monoespecíficos compreendem um par de segmentos em tandem Fd (Vh-Ch1-Vh-Ch1 ) que formam um par de regiões de ligação a antígeno, conforme descrito em Zapata et al. (1995.
Empregando-se um Fab' ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo com os benefícios associados sobre a penetração no tecido, pode se derivar vantagens adicionais da modificação do fragmento para aumentar sua meia-vida. Uma variedade de técnicas pode ser empregada, tais como manipulação ou modificação da molécula de anticorpo em si e também conjugação aos veículos inertes. Qualquer conjugação com a única finalidade de aumentar a meia-vida e não para fornecer um agente ao alvo, deve ser abordada cuidadosamente, pois Fab' e outros fragmentos são escolhidos para penetrar tecidos. Mesmo assim, a conjugação a polímeros não proteínas, tais como PEG e semelhantes, é contemplada. 152
Modificações diferentes da conjugação são, portanto, baseadas na modificação da estrutura do fragmento de anticorpo para torná-lo mais estável, e/ou para reduzir a taxa de catabolismo no corpo. Um mecanismo para tais modificações consiste no emprego de D-aminoácidos no lugar de L-aminoácidos. Os peritos na técnica compreenderão que a introdução de tais modificações precisa ser acompanhada de testes rigorosos da molécula resultante para se assegurar de que ela ainda conserva as propriedades biológicas desejadas. Outras modificações de estabilização incluem o emprego da adição de porções estabilizadoras ou ao terminal N ou ao terminal C ou a ambos, o que é geralmente usado para prolongar a meia-vida das moléculas biológicas. A título de exemplo somente, pode-se desejar modificar os terminais por acilação ou aminação.
Modificações moderadas do tipo de conjugação para emprego com a presente invenção incluem a incorporação de um epítopo de resgate de ligação a receptor ao fragmento de anticorpo. As técnicas para se conseguir isso incluem a mutação da região adequada do fragmento de anticorpo ou a incorporação do epitopo em forma de uma etiqueta de peptideo que é fixada ao fragmento de anticorpo. WO 96/32478 exemplifica tal tecnologia. Os epítopos de resgate de ligação a receptor são tipicamente regiões de três ou mais aminoácidos a uma distância de um ou dois laços do domínio Fc que são transferidos para a posição análoga no fragmento de anticorpo. Os epítopo que se ligam a receptores de resgate da WO 98/45331 são para serem usados na presente invenção. F. Imunoconjugados que se ligam a fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios 153
Os presentes inventores desenvolveram no início uma variedade de imunoconjugados que se ligam a aminofosfolipídios para uso na marcação da vasculatura tumoral (Patente Americana número 6.312.694). Esses agentes usam proteínas que se ligam a aminofosfolipídios, tais como anexinas e quininogênios, e anticorpos contra aminofosfolipídios, tais como PS e PE, para distribuir agentes terapêuticos para tumor e vasculatura intratumoral ligados. A presente invenção agora fornece anticorpos selecionados anti-PS com propriedades melhoradas, tais como 3G4 (ATCC 4545) e 9D2, e esses e anticorpos competidores podem agora também ser usados como as porções de anticorpos de imunoconjugados.
Adicionalmente ao uso de agentes de marcação da vasculatura que se ligam a aminofosfolipídios (Patente Americana número 6.312.694), a presente descoberta de que fosfolipídios aniônicos, assim como aminofosfolipídios, são estáveis e entidades que podem ser tomadas como alvo pela vasculatura tumoral fornece para o uso de uma variedade de novos agentes que marcam vasos tumorais. Os novos compostos, não sugeridos no trabalho anterior direcionados a aminofosfolipídios, usa anticorpos direcionados contra fosfolipídios aniônicos para distribuir toxinas, citocinas, coagulantes e outros agentes terapêuticos para fosfolipídios aniônicos sobreregulados no tumor e na vasculatura intratumoral. Como detalhado acima em se tratando de anticorpos nus, o desenvolvimento desses aspectos da invenção requereram a geração de ferramentas biológicas, particularmente anticorpos, com apurada especificidade para diferentes fosfolipídios, fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios. 154
Como a presente invenção apresenta que fosfolipídios aniônicos e aminof osf olipídios, tais como PS, PE, PI, PA e PG, e mais particularmente PS e PE, são alvos seguros e eficazes para terapia antiviral, anticorpos e peptídios que se ligam a esses componentes, particularmente PS e PE, podem agora ser vantajosamente ligados a uma variedade de agentes antivirais conhecidos. Esses conjugados antivirais incluem tanto conjugados baseados em peptídios quanto conjugados baseados em anticorpos, o último dos quais pode ser nomeado imunoconjugados antivirais ou "imunovirocidas".
Nesses aspectos da invenção, qualquer anticorpo contra um fosfolipídio aniônico pode ser usado para preparar um imunoconjugado, imunotoxina ou coaguligante, com anticorpos tais como os anticorpos de segunda geração, particularmente os anticorpos como 9D2 e 3G4, com seus perfis vantajosos de ligação a fosfolipídios aniônicos, sendo preferidos. Agentes para uso em tais imunoconjugados preferencialmente incluem agentes anticelulares ou citotóxicos, coagulantes (fatores de coagulação), citocinas, agentes radioterápicos, agentes antiangiogênicos, agentes indutores de apoptose, drogas antitubulina e agentes antivirais (e os peptídios que se ligam ao PE, tais como derivados de duramicina, como revelado em detalhes aqui). Nos imunoconjugados antivirais, não existe requerimento para usar um anticorpo de segunda geração como revelado aqui, embora esse possa ser certamente empregado. Qualquer anticorpo para fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios pode ser então ligado a um agente antiviral para formar um imunoconjugado antiviral ou imunovirocida, de acordo com a presente invenção. F1. Agentes citotóxicos e Anticelulares 155
Para determinadas aplicações, os agentes terapêuticos serão agentes citotóxicos ou farmacológicos, especialmente agentes citotóxicos, citostáticos ou anticelulares de outra natureza que têm a capacidade de destruir ou interromper o crescimento ou divisão celular de células, particularmente de células endoteliais tumorais ou células tumorais. Em geral, estes aspectos da presente invenção prevêem o emprego de qualquer agente farmacológico que pode ser conjugado a um anticorpo contra um fosfolipidio aniônico, preferencialmente um anticorpo baseado em 9D2 ou 3G4, e distribuído na forma ativa ao endotélio marcado.
Agentes anticelulares exemplares incluem agentes quimioterapêuticos, assim como citotoxinas. Os agentes quimioterapêuticos que podem ser usados incluem: hormônios, tais como esteróides; antimetabólitos, tais como citosina arabinosídeo, fluorouracil, metotrexato ou aminopterina; antraciclinas; mitomicina C; alcaloides de vinca; demecolcina; etoposídeo; mitramicina; agentes de alquilação antitumorais, tais como clorambucil ou melfalan. Outras modalidades podem incluir agentes tais como citoquinas. Basicamente, qualquer agente anticelular pode ser usado, desde que ele possa ser conjugado com sucesso ou associado a um anticorpo de um modo que permitirá que o seu direcionamento, internalização, liberação e/ou apresentação aos componentes sanguíneos no sítio das células endoteliais alvo, tais como células endoteliais.
Podem ocorrer circunstâncias, como quando o antígeno alvo não é internalizado por uma rota consistente com uma intoxicação eficiente pelo composto tóxico, onde se desejará atingir agentes quimioterapêuticos, tais como medicamentos antitumorais, citocinas, antimetabólitos, agentes de 156 alquilação, hormônios, e análogos. Uma variedade de agentes quimioterapêuticos e outros farmacológicos foram agora conjugados com sucesso a anticorpos e mostraram que funcionam farmacologicamente, incluindo doxorubicina, daunomicina, metotrexato, vinblastina, neocarzinostatina, macromicina, trenimon e a-amanitina.
Em outras circunstâncias, qualquer efeito colateral em potencial da terapia à base de citotoxina pode ser eliminado com o emprego de inibidores de síntese de DNA, tais como daunorubicina, doxorubicina, adriamicina e análogos. Estes agentes são, portanto, exemplos preferidos de agentes anticelulares para emprego em certos aspectos na presente invenção. Em termos de agentes citostáticos, tais compostos geralmente destroem o ciclo celular natural de uma célula alvo, de preferência de modo tal que a célula é retirada do ciclo celular.
Uma ampla variedade de agentes citotóxicos é conhecida que pode ser conjugada a anticorpo contra um fosfolipídio aniônico, preferencialmente um anticorpo baseado em 9D2 ou 3G4. Exemplos incluem diversas toxinas derivadas de plantas, fungos, ou bactérias úteis, que, a título de exemplo, incluem diversas toxinas de cadeia A, especialmente cadeia A de ricina; proteínas inativadoras de ribossomas, tais como saporina ou gelonina; α-sarcina; aspergilina; restrictocina; ribonucleases, tais como ribonuclease placental; toxina diftérica; e exotoxina de pseudomonas, para citar somente algumas.
Das toxinas, o uso de gelonina e de cadeias de ricina A são as preferidas. 0 uso de gelonina como o efetor ou porção toxínica de imunoconjugados que se ligam a marcadores 157 expressos, acessíveis à ligação, adsorvidos ou localizados em vasos sanguíneos intratumorais de um tumor vascularizado é descrito na Patente Americana número 6.051.230 e na Patente Americana número 6.451.312, a qual particulmente diz respeito a gelonina ligada à VEGF como um agente marcador.
Como a cadeias de ricina A, outra parte toxínica preferida é a cadeia de toxina A que tenha sido tratada para modificar ou remover resíduos de carboidratos, conhecida como cadeia deglicosilada A (dgA). Cadeia deglicosilada de ricina A é preferida por causa de sua extrema potência, longa meia-vida, e porque ela é economicamente plausível de manufaturá-la no âmbito clínico e escalar.
Pode ser desejável do ponto de vista farmacológico se empregar a menor molécula possível, que mesmo assim proporcione uma resposta biológica adequada. Pode ser, portanto, desejável se empregar peptídeos de cadeia A menores que proporcionarão uma resposta anticelular adequada. Para tal fim, foi descoberto que a cadeia A de ricina pode ser "truncada" pela remoção dos 30 aminoácidos N-terminais por Nagarase (Sigma), conservado ainda uma atividade adequada de toxina. É proposto que, nos casos em que for desejado, pode se empregar esta cadeia A truncada em conjugados de acordo com a presente invenção.
Alternativamente, pode se pensar que a aplicação de tecnologia de DNA recombinante à porção de cadeia A de toxina proporcionará benefícios adicionais de acordo com a invenção. Tendo sido obtida a clonagem e expressão de cadeia A de ricina biologicamente ativa, é agora possível se identificar e preparar variantes menores de peptídeos e outras variantes deles que mesmo assim apresentam uma 158 atividade tóxica adequada. Alem disso o fato de que a cadeia A de ricina foi aqora clonada permite a aplicação de mutaqênese diriqida a sitio, através da qual pode se facilmente preparar e selecionar os peptídeos derivados de cadeia A e se obter porções adicionais úteis para emprego em conexão com a presente invenção. F2. Citocinas
Citocinas e quimiocinas são exemplos particulares de agentes para ligação aos anticorpos da presente invenção. Uma gama de citocinas pode ser usada, incluindo IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL —8, IL-9, IL-11, IL-13, TGF-β, M-CSF, G-CSF, ΤΝΡβ, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, IFN-CC, IFN-β. Citocinas mais preferidas incluem IL-la, IL-ΐβ, IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFNy, proteína-1 de monócito quimioatraente (MCP-1), fator de crescimento derivado de plaqueta-BB (PDGF-BB) e proteína C-reativa (CRP) e análogos. Exemplos particularmente preferidos são TNFCC, indutores de TNFCC e IL-12 .
TNFCC aumenta a permeabilidade vascular. Esse agente é contemplado para ligação a um anticorpo da invenção, particularmente onde o imunoconjugado resultante é usado em terapia combinada para o tratamento de câncer. 0 anticorpo distribuirá o TNFCC ligado para o ambiente tumoral, e a permeabilidade vascular aumentada causada no tumor irá facilitar a penetração de um segundo agente anticâncer no tumor, amplificando então o efeito antitumoral total. Construções scFv são particularmente contempladas para uso em tais modalidades. Isto ocorre parcialmente porque TNFCC 159 funciona como um trímero e as construções scFv estarao aptas para trimerizar imediatamente. IL-12, por exemplo, pode ser ligado a um anticorpo e usado para redirecionar defesas do hospedeiro para atacar os vasos tumorais. Usando IL-12, uma forma scFv da região que se liga a antigeno pode ser preferida. A quimiocina LEC (quimiocina expressa pelo fígado, também conhecida como NCC-4, HCC-4, ou LCM) é outro componente preferido (Giovarelli et al., 2000). LEC é quimiotático para células dendríticas, monócitos, células T, células NK e neutrófilos e pode então aumentar respostas antitumorais mediadas pelo hospedeiro. F3. Fatores de Coagulação
Um anticorpo contra um fosfolipídio aniônico, ou um anticorpo de segunda geração baseado nos anticorpos referidos 9D2 e 3G4 (ATCC 4545) da invenção, podem ser ligados a um componente que seja capaz de estimular direta ou indiretamente a coagulação, para formar um coaguligante. Patentes Americanas números 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289 e 6.036.955 descrevem ainda a associação operativa de coagulantes com anticorpos para formar coaguligantes. Os anticorpos da invenção podem ser ligados diretamente ao coagulante ou ao fator de coagulação, ou podem ser ligados a uma segunda região de ligação que se liga e em seguida libera o coagulante ou fator de coagulação. Conforme empregado no presente, os termos "coagulante" e "fator de coagulação" são usados para se referir a um componente que seja capaz de direta ou indiretamente estimular a coagulação em condições adequadas, de preferência quando fornecido a um ambiente in vivo específico, tal como a vasculatura tumoral. 160
Os fatores de coagulação preferidos são as composições de Fator de Tecido, tal como o TF truncado (tTF) , moléculas de TF diméricas, multiméricas e mutantes. TF truncado" (tTF) se refere a construções de TF que tornam-se deficientes em ligação a membrana por remoção de uma quantidade suficiente de sequências de aminoácidos para efetuar tal alteração na propriedade. Uma "quantidade suficiente" dentro deste contexto significa uma quantidade da sequência transmembrana de aminoácidos originalmente suficiente para fazer a molécula de TF entrar na membrana ou para mediar a ligação da membrana funcional da proteína TF. A remoção de uma "quantidade suficiente de sequência que abrange a transmembrana" cria, portanto, uma proteína ou polipeptídio de Fator de Tecido truncado deficiente na capacidade de ligação à membrana de fosfolipídio, de modo que a proteína é substancialmente uma proteína solúvel que não se liga de modo significativo às membranas de fosfolipídios. 0 TF truncado deixa, portanto, substancialmente de converter o Fator VII em Fator Vila em um ensaio de TF padrão, mas conserva a atividade denominada catalítica inclusive a ativação do Fator X na presença do Fator Vila. A patente U.S. No. 5.504.067, 6.156.321, 6.132.729 e 6.132.730 descrevem com mais detalhes tais proteínas truncadas do Fator de Tecido. É preferível que os Fatores de Tecido para emprego nestes aspectos da presente invenção não possuam geralmente as regiões de transmembrana e citosólicas (aminoácidos 220-263) da proteína. No entanto não há necessidade de se limitar as moléculas de TF truncado ao comprimento exato dos 219 aminoácidos.
As composições de Fator de Tecido podem também ser úteis como dímeros. Qualquer uma das construções de Fator de 161
Tecido truncado, mudado ou outros podem ser preparadas em uma forma dimérica para emprego na presente invenção. Conforme é do conhecimento dos peritos na técnica, tais dimeros de TF podem ser preparados empregando-se técnicas padrão da biologia molecular e de expressão recombinante, em que duas regiões da codificação são preparadas em quadro e expressas a partir de um vetor de expressão. Do mesmo modo, diversas tecnologias de conjugação química podem ser empregadas em conexão com a preparação de dimeros de TF. Os monômeros individuais de TF podem ser derivados antes da conjugação. Todas estas técnicas serão facilmente conhecidas dos peritos na técnica.
Se for desejado, os dimeros e multímeros de Fator de Tecido podem ser ligados através de uma ligação biologicamente liberável, tal como um linker seletivamente clivável ou sequência de aminoácidos seletivamente clivável. Os ligantes de peptídeos, por exemplo, que incluem um sítio de clivagem para uma enzima de preferência localizada ou ativa dentro de um ambiente de tumor são consideradas. Formas exemplares de tais ligantes de peptídeos são aqueles que são clivados por uroquinase, plasmina, trombina, Fator IXa, Fator Xa, ou uma metaloproteinase, tal como colagenase, gelatinase ou estromelisina.
Em determinadas modalidades, os dimeros do Fator de Tecido podem ainda compreender uma porção de inserção de membrana hidrófoba impedida, para encorajar mais tarde a associação funcional do Fator de Tecido com a membrana de fosfolipídio, mas somente em determinadas condições definidas. Conforme descrito dentro do contexto dos Fatores de Tecido, as sequências de associação de membrana hidrófoba são geralmente extensões de aminoácidos que promovem a 162 associação com o ambiente de fosfolipidios devido à sua natureza hidrófoba. Os ácidos graxos podem também ser usados para proporcionar a porção de inserção de membrana potencial.
Tais sequências de inserção de membrana podem se localizar tanto no terminal N como no terminal C da molécula de TF ou geralmente apensas em um outro ponto qualquer da molécula desde que a sua fixação a ela não impeça as propriedades funcionais da construção do TF. A intenção da porção de inserção impedida é que ela permaneça não funcional até que a construção de TF se localize dentro do ambiente tumoral e permita que o apêndice hidrófobo se torne acessível e ainda promova uma associação física maior com a membrana. Novamente, prevê-se que as ligação liberáveis biologicamente e as sequências seletivamente cliváveis se tornem especialmente úteis neste sentido, sendo a ligação ou sequência somente clivada ou de outro modo modificada depois da localização dentro do ambiente tumoral e da exposição a enzimas específicas ou a outras moléculas biologicamente ativas.
Em outras modalidades, as construções de tTF podem ser multiméricas ou poliméricas. Dentro deste contexto, uma "construção polimérica" contém 3 ou mais construções de Fator de Tecido. Uma "construção multimérica ou polimérica de TF" é uma construção que compreende uma primeira molécula ou derivado de TF operativamente fixada a pelo menos uma segunda e a uma terceira molécula ou derivado de TF. Os multímeros podem compreender entre aproximadamente 3 e aproximadamente 20 tais moléculas de TF. As unidades individuais de TF dentro dos multímeros ou polímeros podem também ser ligadas por ligantes de peptídeos seletivamente 163 cliváveis ou outras ligações biologicamente liberáveis conforme desejado. Novamente, tal como no caso de dimeros de TF de que se tratou acima, as construções podem ser produzidas facilmente ou empregando expressão e manipulação recombinante ou empregando-se processos químicos de síntese padrão.
Outras construções de TF úteis dentro do contexto da presente invenção são aqueles mutantes que são deficientes na capacidade de ativar o Fator VII. Tais "mutantes de ativação de Fator VII" são geralmente definidos no presente como mutantes de TF que se ligam a Fator VlI/VIIa funcional, ativam proteoliticamente o Fator X, mas são substancialmente isentos da capacidade de ativar proteoliticamente o Fator VII. Consequentemente, tais construções são mutantes de TF aos quais falta a atividade de ativação do Fator VII. A capacidade de tais mutantes de ativação de Fator VII funcionarem na promoção de coagulação específica a tumor é baseada no seu fornecimento específico à massa vascular tumoral e na presença do Fator Vila a níveis baixos no plasma. Depois da administração de tal conjugado de agente de direcionamento-mutante de ativação de Fator VII, o mutante se localizará dentro da massa vascular de um tumor vascularizado. Antes da localização, o mutante de TF será geralmente incapaz de promover a coagulação em qualquer outro sítio do corpo, com base na sua incapacidade de converter o Fator VII em Fator Vila. NO entanto, depois da localização e acumulação no interior da região do tumor, o mutante então encontrará uma quantidade suficiente de Fator Vila proveniente do plasma para iniciar o trajeto de coagulação extrínseca, levando à trombose específica a 164 tumor. 0 Fator Vila exógeno poderia também ser administrado ao paciente.
Qualquer uma ou mais de uma variedade de mutantes de ativação de Fator VII podem ser preparados e usados em conexão com a presente invenção. Existe uma quantidade considerável de dados científicos no tocante a sítios de reconhecimento na molécula de TF para o Fator VlI/VIIa. Será portanto, compreendido, que a região de ativação do Fator VII geralmente se encontra entre aproximadamente o aminoácido 157 e aproximadamente o aminoácido 167 da molécula de TF. No entanto, prevê-se que os resíduos fora desta região possam também provar ser relevantes à atividade de ativação do Fator VII e pode-se considerar, portanto, a introdução de mutações em qualquer um ou mais dos resíduos geralmente localizados entre aproximadamente o aminoácido 106 e aproximadamente o aminoácido 209 da sequência de TF (WO 94/07515; WO 94/28017).
Como detalhado nas Patentes Americanas números 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289 e 6.036.955, uma variedade de outros fatores de coagulação pode ser empregada em conexão com a presente invenção, conforme exemplificado pelos agentes apresentados abaixo. Podem ser usados na presente invenção Trombina, Fator V/Va e derivados, Fator VlII/VIIIa e derivados, Fator IX/IXa e derivados, Fator X/Xa e derivados, Fator Xl/XIa e derivados, Fator XII/XIIa e derivados, Fator XlII/XIIla e derivados, ativador de Fator X e ativador de Fator V. O ativador de Fator X do veneno de víbora de Russel é previsto para emprego na presente invenção. Os anticorpos monoclonais específicos para o ativador de Fator X presentes 165 no veneno de víbora de Russel foram também produzidos, podendo ser usados para fornecer especificamente o agente como parte de um ligante de ligação biespecífico. 0 tromboxano A2 é formado a partir de endoperóxidos pelas ações em sequência das enzimas ciclooxigenase e tromboxano sintase nos microssomas das plaquetas. 0 tromboxano A2 é gerado facilmente pelas plaquetas e é um vasoconstritor potente, devido à sua capacidade de produzir agregação de plaquetas. Tanto o tromboxano A2 como análogos ativos seus são previstos para emprego na presente invenção. A tromboxano sintase e outras enzimas que sintetizam as prostaglandinas ativadores de plaquetas, podem também ser usadas como "coagulantes" dentro do contexto do presente. Os anticorpos monoclonais para a tromboxano sintase e a purificação por imunoafinidade dela são conhecidos; tal como o DNAc para a tromboxano sintase humana. cc2-antiplasmina, ou inibidor de (X2-plasmina, é um inibidor de proteinase presente naturalmente no plasma humano que funciona para inibir eficientemente a lise dos coágulos de fibrina induzidos pelo ativador de plasminogênio. A 0C2-antiplasmina é um inibidor especialmente potente, e é prevista para ser empregada na presente invenção.
Como a sequência de DNAc para 0c2-antiplasmina está disponível, as proteínas de fusão e/ou de expressão recombinante são as preferidas. Os anticorpos monoclonais contra (X2-antiplasmina são também disponíveis que podem ser usados nas modalidades de ligante de ligação biespecíficos da invenção. Estes dois anticorpos poderiam ser usados para fornecer a2-antiplasmina exógena ao sítio alvo ou para 166 coletar a2-antiplasmina endógena e concentrá-la dentro da região alvo. F4. Medicamentos Antitubulina
Uma série de medicamentos exercem seus efeitos por interferência na atividade de tubulina. Como as funções de tubulina são essenciais para mitose e para a viabilidade das células, determinados "medicamentos antitubulina" são agentes quimioterapêuticos poderosos. Alguns dos mais conhecidos e atualmente preferidos medicamentos antitubulina para emprego com a presente invenção são colchicina; taxanos, tal como taxol; alcaloides da vinca, tais como vinblastina, vincristina e vindescina; e combretastatinas. Outros medicamentos antitubulina adequados são citocalasinas (incluindo B, J, E), dolastatina, auristatina PE, paclitaxel, ustiloxina D, rizoxina, 1069C85, colcemida, albendazol, azatoxina e nocodazol.
Conforme descrito nas patentes U.S. Nos. 5.892.069, 5.504.074 e 5.661.143, as combretastatinas são derivados de estradiol que geralmente inibem mitose celular.
Combretastatinas exemplares que podem ser usadas em conjunto com a invenção incluem aquelas baseadas em combretastatina A, B e/ou D e aquelas descritas nas patentes U.S. Nos. 5.892.069, 5.504.074 e 5.661.143. As combretastatinas A-l, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, B-l, B-2, B-3 e B-4 são exemplares dos tipos acima.
As patentes U.S. Nos. 5.569.786 e 5.409.953 descrevem o isolamento, caracterização estrutural e sintese de cada uma das combretastatinas A-l, A-2, A-3, B-l, B-2, B-3 e B-4 e 167 preparados e métodos do emprego de tais combretastatinas para tratar tumores neoplásticos. Qualquer uma ou mais de tais combretastatinas pode ser usada em conjunto com a presente invenção. A combretastatina A-4, conforme descrita nas patentes U.S. Nos. 5.892.069, 5.504.074, 5.661.143 e 4.996.237 pode também ser usada com a presente invenção. A patente U.S. No. 5.561.122 descreve prodrogas adequados de combretastatina A-4, que são contemplados para uso combinado com a presente invenção. A patente U.S. No. 4.940.726 descreve especialmente lactonas macrociclicas denominadas combretastatina D-l e "Combretastatina D-2', podendo qualquer uma das duas ser usada em combinação com as composições e métodos da presente invenção. A patente U.S. No. 5.430.062, se refere a derivados de estilbeno e análogos de combretastatina com atividade anticancerigena que podem ser usados em combinação com a presente invenção. F5. Agentes antiangiogênicos
Agentes antiangiogênicos são úteis para a ligação dos anticorpos e peptídios da invenção. Muitos agentes anticâncer têm um efeito antiangiogênico como parte de seu mecanismo de ação. Qualquer um ou mais de tais agentes descritos para uso em terapias combinadas, incluindo aquelas na Tabela E, podem também ser conjugadas a um anticorpo da invenção, como descrito aqui. Certos outros agentes têm sido descobertos, designados ou selecionados para ter um efeito antiangiogênico como um mecanismo primário de ação. Exemplos de tais agentes são descritos abaixo, qualquer um dos quais 168 pode também ser usado para preparar um imunoconjugado ou usado separadamente em terapias combinadas com a invenção.
Numerosos inibidores de tirosina quinase úteis para o tratamento de angiogênese, conforme manifesto em diversos estados mórbidos, são agora conhecidos. Estes incluem, por exemplo, as 4-aminopirrolo[2,3-d]pirimidinas da patente U.S. No. 5.639.757 que podem também ser usadas em combinação com a presente invenção. Outros exemplos de moléculas orgânicas capazes de modular a transdução de sinal de tirosina quinase através do receptor VEGFR2 são os compostos de quinazolina e composições da patente U.S. No. 5.792.771, descreve com mais detalhes as combinações para emprego com a presente invenção no tratamento de doenças angiogênicas.
Foi mostrado que os compostos de outras classes quimicas inibiam angiogênese e podem ser usados em combinação com a presente invenção Os esteróides como os esteróides angiostáticos 4,9 (11)-esteróides e C-21-oxigenados, conforme descrito na patente U.S. No. 5.972.922, podem ser empregados na terapia combinada. As patentes U.S. Nos. 5.712.291 e 5.593.990, descrevem talidomida e compostos correlatos, precursores, análogos, metabólitos e produtos de hidrólise que podem também ser usados em combinação com a presente invenção para inibir a angiogênese. Os compostos na patente U.S. No. 5.712.291 e 5.593.990 podem ser administrados oralmente. Outros agentes antiangiogênicos exemplares que são úteis em conexão com a terapia combinada são relacionados na Tabela B. Cada um dos agentes relacionados nela são exemplares e não são absolutamente limitantes.
TABELA B
Inibidores e Reguladores Negativos de Angiogênese 169 SUBSTÂNCIAS REFERÊNCIAS Angiostatina 0'Reilly et al., 1994 Endostatina 0'Reilly et al. , 1997 Fragmento de 16kDa de prolactina Ferrara et al., 1991; Clapp et al. 1993; Lee et al. 1998 Peptídeos de laminina Kleinman et al. 1993; Yamamura et al. 1993; Iwamoto et al. 1996; Tryggvason, 1993 Peptídeos de fibronectina Grant et al., 1998; Sheu et al., 1997 Inibidores de metaloproteinases de Tecido (TIMP 1,2,3,4) Sang, 1998 Inibidores de ativador de plasminogênio (PAI-1, -2) Soft et al., 1995 170
Fator α de necrose de tumor (alta dose, in vitro) Frater-Schroder et al., 1987 TGF-βΐ Ray Chadhury e D'Amore, 1991; Tada et al., 1994 Interferonas (IFN-a,-β, Y) Moorer et al., 1998; Lingen et al. 1998 ELR-CXD quimioquinas: IL-12; SDF-1; MIG; Moore et al., 1998; Hiscox e Jiang, Fator de plaquetas 4(PF-4); IP-10 1997; Coughlin et al., 1998; Tanaka et al., 1997 Tromboespondina (TSP) Good et al., 1990; Frazier, 1991; Bornstein, 1992; Tolsan et al., 1993; Sheibani e Frazier, 1995 SPARC Hasselaar e Sage, 1992, Lance et al. , 1992; Jendraschak e Sage, 1996 2-Metoxiestradiol Fotsis et al., 1994 Proteína relacionada com Jackson et al., 1994 171 proliferina Suramina Gagliardi et al., 1992; Takano et al., 1994; Waltenberger et al., 1996; Gagliardi et al. , 1998; Manetti et al., 1998 Talidomida D'Amato et al., 1994 Kenyon et al., 1997; Wells, 1998 Cortisona Thorpe et al., 1993 Folkman et al., 1983 Sakamoto et al., 1986 Linomida Vukanovic et al., 1993; Ziche et al. , 1998; Nagler et al., 1998 Fumagilina TNP-470) (AGM-1470; Sipos et al., 1994; Yoshida et al., 1998 Tamoxifen Gagliardi e Collins, 1993; Lindner e Borden, 1997; Haran et al., 1994 Extrato de passarinho erva de Yoon et al., 1995 coreana (Viscum album 172 coloratum) Retinóides Oikawa et al., 1989; Lingen et al., 1996; Majewski et al., 1996 CM101 Hellerqvist et al., 1993; Quinn et al., 19 95; Wamil et al., 1997; DeVore et al., 1997 Dexametasona Hori et al., 1996, Wolff et al., 1997 Fator inibidor de leucemia (LIF) Pepper et al., 1995
Determinados componentes preferidos para serem empregados na inibição de angiogênese são angiostatina, endostatina, vasculostatina, canstatina e maspina. A proteína nomeada "angiostatina" é apresentada nas Patentes Americanas 5.776.704, 5.639.725 e 5.733.876. Angiostatina é uma proteína com peso molecular de cerca de 38 kD a cerca de 45 kD, como determinado pela redução de eletroforese em gel de poliacrilamida, a qual contém aproximadamente regiões de Kringle e 1 a 4 moléculas de plasminogênio. Angiostatina geralmente tem uma sequência de aminoácido substancialmente semelhante àquela do fragmento de plasmionogênio de murina começando no aminoácido número 98 de uma molécula de plasminogênio de murina intacta. 173 A sequência de aminoácidos de angiostatina varia pouco entre espécies. Por exemplo, na angiostatina humana, a sequência de aminoácido é substancialmente semelhante à sequência do fragmento de plasminogênio de murina descrito acima, embora uma sequência de angiostatina humana ativa pode começar tanto no aminoácido número 9 7 ou 99 de uma sequência de aminoácido de plasminogênio humano intacto. Ademais, plasminogênio humano pode ser usado, como ele tem antiangiogênica semelhante, como mostrado em tumor de camundongo.
Determinadas terapias antiangiogênicas já mostraram provocar regressões tumorais, e angiostatina é um dos tais agentes. Endostatina, um fragmento COOH-terminal de 20 kDa de colágeno XVIII, o polissacarídeo bacteriano CM101, e anticorpo LM609 também têm atividade angiostática. Entretanto, à luz de suas outras propriedades, eles são referidos como terapias antivasculares ou toxinas de vasos tumorais, como eles não podem inibir a angiogênese, mas também iniciam a destruição de vasos tumorais através de mecanismos na maioria indefinidos.
Angiostatina e endostatina tem sido o foco de estudo intenso como eles são os primeiros inibidores da angiogênese que demonstraram a capacidade de não somente inibir o crescimento tumoral, mas também causar regressões tumorais em camundongos. Existem múltiplas proteases que têm se apresentado produtoras de angiostatina a partir de plasminogênio incluindo elastase, metaloelastase de macrófago (MME), matrilisina (MMP-7) e gelatinase B de 92 kDa/colagenase tipo IV (MMP-9). 174 MME pode produzir angiostatina a partir de plasminogênio em tumores e fator colônia-estimulante de granulócito-macrófago (GMCSF) regula a expressão de MME por macrófagos induzindo a produção de angiostatina. 0 papel do MME na geração de angiostatina é sustentado pela descoberta de que a MME é de fato expressa em amostras clinicas de carcinomas hepatocelulares de pacientes. Outra protease considerada de ser capaz de produzir angiostatina é estromelisina-1 (MMP-3). MMP-3 tem mostrado produtora de fragmentos semelhantes a angiostatina a partir de plasminogênio in vitro. 0 mecanismo de ação para angiostatina é atualmente obscuro, faz-se a hipótese de que ele se liga a um receptor da superfície celular não-identifiçado nas células endoteliais, induzindo as células endoteliais a sofrerem morte celular programada ou impedimento mitótico.
Endostatina aparenta ser um agente antiangiogênese e antitumoral ainda mais poderoso, embora sua biologia é menos clara. Endostatina é eficiente em causar regressões em um número de modelos tumorais em camundongos. Tumores não desenvolvem resistência à endostatina e, após múltiplos ciclos de tratamento, tumores entram em um estado de dormência durante o qual eles não aumentam em volume. Neste estado de dormência, a percentagem de células tumorais sofrendo apoptose foi aumentado, resultando numa população que essencialmente fica no mesmo tamanho. Acredita-se que a endostatina se ligue a um receptor de superfície de célula endotelial não identificado que medeia seu efeito.
Patente Americana número 5.854.205, para Folkman e 0'Reilly, refere-se a endostatina e seu uso como um inibidor da proliferação de células endoteliais e angiogênese. A proteína endostatina corresponde ao fragmento C-terminal do 175 colágeno tipo XVIII, e a proteína pode ser isolada de uma variedade de fontes. Patente Americana número 5.854.205 também ensina que endostatina pode ter uma sequência de aminoácido de um fragmento de colágeno tipo XVIII, um colágeno tipo XV, ou esterase pré-gástrica BOVMPE 1. Combinações de endostatina com outras proteínas antiangiogênicas, particularmente angiostatina, são também descritas pela Patente Americana número 5.854.205, de tal forma que as composições combinadas são capazes de regredir eficientemente a massa de tumor dependente de angiogênese. CM101 é um polissacarídeo bacteriano que tem sido bem caracterizado quanto a sua capacidade de induzir inflamação neovascular em tumores. CM101 se liga a e liga de forma reticulada receptores expressos em endotélio diferencial que estimula a ativação do sistema complemento. Ele também inicia uma resposta inflamatória direcionada por citocina que marca seletivamente o tumor, É um agente unicamente antipatogênico que subregula a expressão de VEGF e de seus receptores. CM101 é normalmente usado em testes clínicos como uma droga anticâncer, e pode ser usada juntamente com essa invenção. A trombospondina (TSP-1) e o fator de plaquetas 4 (PF4) podem também ser usados na presente invenção. Estes são ambos inibidores de angiogênese que são associados com heparina e encontrados em grânulos oc de plaquetas. TSP-1 é uma glicoproteína de domínio múltiplo grande de 450kDa que é constituinte da matriz extracelular. TSP-1 se liga a muitas das moléculas proteoglicanas encontradas na matriz extracelular incluindo HSPGs, fibronectina, laminina e diferentes tipos de colágeno. TSP-1 inibe a migração e proliferação das células endoteliais in vitro e a 176 angiogênese in vivo. TSP-1 pode também suprimir o fenótipo maligno e a tumorigênese das células endoteliais transformadas. 0 gene p53 supressor de tumor mostrou regular diretamente a expressão de TSP-1 de modo tal que a perda da atividade de p53 causa uma redução dramática na produção de TSP-1 e um aumento concomitante na angiogênese iniciada pelo tumor. PF4 é uma proteína de 70aa que é um membro da família CXC ELR de quimiocinas que é capaz de inibir de modo potente a proliferação de células endoteliais in vitro e a angiogênese in vivo. PF4 administrado intratumoralmente ou fornecida por um vetor adenoviral é capaz de provocar uma inibição do crescimento tumoral.
Interferons e inibidores de metaloproteinase são duas outras classes de inibidores angiogênicos que ocorrem na natureza e que podem ser distribuídos de acordo com a presente invenção. A atividade antiendotelial dos interferons é conhecida desde os princípios da década de 1980, no entanto o mecanismo da inibição continua obscuro. É conhecido o fato de que elas podem inibir a migração das células endoteliais e que elas têm realmente alguma atividade antiangiogênica in vivo que é possivelmente mediada por uma capacidade de inibir a produção de promotores angiogênicos pelas células tumorais. Os tumores vasculares em particular são sensíveis a interferon, por exemplo, hemangiomas proliferantes podem ser tratados com sucesso com IFNOC.
Os inibidores de tecidos de metaloproteinases (TIMPs) constituem uma família de inibidores das metaloproteases de matriz (MMPs) que ocorrem na natureza e que podem também inibir a angiogênese e podem ser usados em protocolos de 177 tratamento da presente invenção. As MMPs desempenham um papel chave no processo angiogênico, uma vez que elas degradam a matriz através da qual as células endoteliais e os fibroblastos migram quando se estendem ou remodelam a rede vascular. Na verdade um membro dos MMPs, MMP-2, mostrou que se associa com o endotélio ativado através da integrina (Χνβ3, presume-se que para tal fim. Se esta interação for destruída por um fragmento de MMP-2, então a angiogênese é regulada para baixo e o crescimento tumoral é inibido. Há uma série de agentes farmacológicos que inibem a angiogênese, podendo um ou mais deles ser usado como parte da presente invenção. Estes incluem AGM-1470/TNP-470, talidomida e carboxiamidotriazol (CAI). Constatou-se que a fumagilina era um inibidor potente de angiogênese em 1990, e deste então foram desenvolvidos os análogos sintéticos de fumagilina, AGM-1470 e TNP-470. Estes dois medicamentos inibem a proliferação das células endoteliais in vitro e a angiogênese in vivo. TNP-470 foi estudado extensamente em testes clínicos humanos, os dados sugerindo que a administração a longo prazo é otima. A talidomida foi originalmente usada como um sedativo, mas foi descoberto que era um potente teratogênico e seu uso foi interrompido. Em 1994 foi descoberto que a talidoma é um inibidor de angiogênese. A talidomida é atualmente objeto de testes clínicos como um agente anticancerígeno assim como tratamento de doenças vasculares oftálmicas.
CAI é um inibidor de angiogênese sintético de baixo peso molecular que age como um bloqueador de canais de cálcio e que impede a reorganização da actina, a migração e proliferação das células endoteliais no colágeno IV. CAI 178 inibe a neovascularização a concentrações fisiológicas possíveis e é bem tolerado oralmente por pacientes com câncer. Os testes clínicos com CAI deram estabilização de doenças em 49% dos pacientes com câncer que tinham uma doença progressiva antes do tratamento. A cortisona na presença de heparina ou de fragmentos de heparina mostrou que inibia o crescimento de tumores em camundongos por bloqueio da proliferação das células endoteliais. 0 mecanismo implicado no efeito inibidor aditivo do esteróide com a heparina é obscuro, embora se considere que a heparina possa aumentar a absorção do esteróide pelas células endoteliais. A mistura mostrou que aumentava a dissolução da membrana basal sob as capilares recém-formadas e isto é também uma explicação possível para o efeito angiostático aditivo. Os conjugados de heparina-cortisol também têm efeitos potentes angiostático e antitumoral in vivo.
Outros inibidores específicos de angiogênese podem ser administrados aos tumores usando os métodos de marcação de tumores da presente invenção. Esses incluem, mas não se limitam a, Fator Anti-invasivo, ácidos retinóicos e paclitaxel (patente U.S. No. 5.716.981); AGM-1470 (Ingber et al., 1990); extrato de cartilagem de tubarão (patente U.S. No. 5.618.925); poliamida aniônica ou oligômeros de poliuréia (patente U.S. No. 5.593.664); derivados de oxindol (patente U.S. No. 5.576.330); derivados de estradiol (patente U.S. No. 5.504.074); e derivados de tiazolopirimidina (patente U.S. No. 5.599.813) são também previstos para uso como composições antiangiogênicas para os usos combinados da presente invenção. 179
As composições que compreendem um antagonista de uma ανβ3 integrina podem também ser usadas para inibir a angiogênese como parte da presente invenção. Conforme descrito na patente U.S. No. 5.766.591, os polipeptídios contendo RGD e seus sais, inclusive polipeptídios cíclicos, são exemplos adequados de antagonistas de integrinas ανβ3. 0 anticorpo LM609 contra a (Χνβ3 integrina também induz as regressões de tumores. Os antagonistas de ανβ3 integrina tais como LM609 induzem apoptose de células endoteliais angiogênicas não afetando os vasos sanguíneos em repouso. LM609 ou outros antagonistas de ανβ3 podem também funcionar por inibição da interação de ανβ3 e de MMP-2, uma enzima proteolítica que se pensa que representa um papel importante na migração das células endoteliais e dos fibroblastos. A patente U.S. No. 5.753.230 é especificam ente incorporada ao presente documento a título de referência para descrever anticorpos contra (Χνβ3 (vitronectina (Χνβ3) para combinação com a presente invenção para a inibição de angiogênese.
Como angiopoietinas são ligantes para Tie2, Outros processos de intervenção terapêutica com base na alteração de sinalização através do receptor Tie2 podem também ser usados em combinação com a presente invenção, tal como empregando-se um receptor Tie2 solúvel capaz de bloquear a ativação de Tie2 (Lin et al., 1998a). O fornecimento de uma tal construção empregando-se terapia genética adenoviral recombinante mostrou ser eficaz no tratamento de câncer e na redução de metástases (Lin et al., 1998).
As angiopoietinas, como os membros da família de VEGF, são fatores de crescimento bastante específicos para o endotélio vascular (Davis e Yancopoulos, 1999; Holash et al., 1999). 180
As angiopoietinas que foram descritas pela primeira vez eram agonistas ou ativadores de receptor de ocorrência natural, angiopoietina-1 (Ang-1), e um antagonista receptor de ocorrência natural, angiopoietina-2 (Ang-2), ambos agem através do receptor de tirosina quinase da célula endotelial, Tie2.
Duas novas angiopoietinas, angiopoietina-3 (camundongo) e angiopoietina-4 (humana) foram também identificadas (Valenzuela et al., 1999). A angiopoietina-3 parece agir como um antagonista (como a Ang-2) ao passo que a angiopoietina-4 parece funcionar como um agonista (como Ang-1) (Valenzuela et al., 1999). Uma proteína denominada angiopoietina-3 foi também clonada do coração humano e foi relatado que não tinha efeito mitogênico sobre células endoteliais (Kim et al., 1999).
Embora VEGF seja necessária para os estágios precoces do desenvolvimento vascular, a angiopoietina 1 é geralmente necessária para os estágios tardios de vascularização. VEGF, portanto, age para promover a diferenciação, proliferação e formação vascular primitiva de células endoteliais. A angiopoietina-1 age através do receptor Tie2 para promover a manutenção e estabilização dos vasos maduros. A angiopoietina-1, portanto é um fator de maturação ou estabilização que se pensa que converte vasos imaturos em vasos imaturos por promoção de interações entre células endoteliais e as células de sustentação circundantes (Holash et al, 1999). A presente invenção também pode ser usada para fornecer agentes que induzem apoptose em qualquer célula no interior do tumor inclusive células de tumores e células endoteliais 181 vasculares tumorais. Muitos agentes anticancerígenos têm, como parte do seu mecanismo de ação, um efeito indutor de apoptose. Qualquer um ou mais de tais agentes descritos para uso em terapias combinadas, incluindo aqueles da Tabela F, podem também ser conjugados a um anticorpo da invenção, como descrito aqui. Certos outros agentes têm sido descobertos, desenhados ou selecionados para ter um efeito indutor de apoptose como mecanismo primário. Exemplos de tais agentes são descritos abaixo, qualquer um dos quais pode também ser usado para preparar um imunoconjugado ou usado separadamente em terapia combinada com a invenção.
Muitas formas de câncer têm relatos de mutações nos genes supressores de tumor, tais como o p53. A inativação de p53 resulta numa incapacidade de promover a apoptose. Com esta incapacidade, as células cancerígenas progridem na tumorigênese, ao invés de se tornarem destinadas a morte celular. Por este motivo, a provisão de supressores de tumores é também prevista para uso na presente invenção para estimular a morte celular. Os supressores de tumores exemplares incluem, sem limitação, p53, o gene Retinoblastoma (Rb), o tumor de Wilm (WT1), bax alfa, enzima conversora de interleucina-lb e família, gene MEN-1, neurofibromatose, tipo 1 (NF1), pl6 inibidor de cdk, gene do câncer coloretal (DCC), geme de polipose adenomatosa familiar (FAP), gene supressor de tumores múltiplos (MTS-1), BRCA1 e BRCA2.
Os preferidos para uso são os genes p53 (patentes U.S. Nos. 5.747.469; 5.677.178 e 5.756.455), Retinoblastoma, BRCA1 (patentes U.S. Nos. 5.750.400; 5.654.155; 5.710.001; 5.756.294; 5.709.999; 5.693.473; 5.753.441; 5.662.829; e 182 5.747.282), MEN-1 (número de acesso do GenBank U93236) e adenovírus EIA (patente U.S. No. 5.776.743).
Outros oncogenes que inibem apoptose ou morte celular programada incluem, mas não se limitam a, bcr-abl, bcl-2 (distinta de bcl-1, ciclina Dl; números de acesso GenBank M14745, X06487; Patentes Americanas números 5.650.491, 5.539.094) e membros familiares incluindo Bcl-xl, Mcl-1, Bak, Al, A20. Superexpressão de bcl-2 foi primeiramente descoberta em linfornas de células T. bcl-2 funciona como um oncogene pela ligação e inativação de Bax, uma proteína da via apoptótica; Inibição da função da bcl-2 previne a inativação da Bax, e permite que a via apoptótica continue. Então, inibição dessa classe de oncogenes, por exemplo, usando sequências de nucleotídeos sem sentido, é contemplada para uso na presente invenção em aspectos onde o aumento da apoptose é desejado (Patente Americana número 5.650.491, 5.539.094 e 5.583.034) .
Outras composições que podem ser fornecidas por anticorpos baseados na presente invenção incluem genes que codificam o ligante indutor de apoptose relacionado com o fator de necrose de tumor denominado TRAIL e o polipeptídio de TRAIL (patente U.S. No. 5.763.223); a protease associada com apoptose de 24kD da patente U.S. No. 5.605.826; fator 1 associado com Fas, FAF1 (patente U.S. No. 5.750.653). Também previstos para emprego nestes aspectos da presente invenção é a provisão de enzima conversora de interleucina-ΐβ e membros da família, que são relatados como também a estimular apoptose.
Os compostos tais como os derivados de carboestiril (Patente U.S. no. 5.672.603; e 5.464.833); peptídeos apogênicos 183 ramificados (patente U.S. No. 5.591.717); inibidores de fosfotirosina e análogos de fosfotirosina não hidrolisáveis (patente U.S. No. 5.565.491; e 5.693.627); agonistas de receptores retinóides RXR (patente U.S. No. 5.399.586) e até antioxidantes (patente U.S. No. 5.571.523) podem também ser usados. Os inibidores de tirosina quinase, tais como genisteína, podem também ser ligados a anticorpos da presente invenção (conforme sustentado pela patente U.S. No. 5.587.459). F7. Agentes antivirais
Como fosfolipidios aniônicos e aminofosfolipídios, particularmente PS e PE, ficam expostos em células infectadas por vírus, os anticorpos da invenção, tais como os anticorpos 9D2 e 3G4 (ATCC 4545), podem também ser ligados a qualquer um ou mais agentes antivirais. Razões adicionais subjacentes a esses aspectos da invenção, e as vantagens relacionadas, são descritos em maiores detalhes abaixo em consideração ao peptídio que se liga a PE, conjugados antivirais.
Exemplares agentes antivirais que são os para a ligação de anticorpos ou peptídios são também descritos em maiores detalhes juntamente com o peptídio que se liga a PE, conjugados antivirais da invenção. Qualquer um ou mais agentes antivirais, incluindo aqueles da Tabela G, podem ser conjugados a um anticorpo da invenção, como descrito aqui. Tais agentes antivirais podem também ser usados separadamente em combinação com terapias antivirais da invenção. G. Equivalentes biologicamente funcionais 184
Equivalentes, ou até mesmo aperfeiçoamentos de anticorpos e efetores podem agora ser preparados, empregando-se geralmente os materiais fornecidos acima como um ponto de partida. Podem ser introduzidas modificações e alterações na estrutura de tal anticorpo e mesmo assim se obter uma molécula que tenha caracteristicas iguais ou de outro modo qualquer desejáveis. Determinados aminoácidos, por exemplo, podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura protéica sem uma perda considerável da capacidade de ligação interativa. Estas considerações também se aplicam a toxinas, agentes antiangiogênicos, agentes indutores de apoptose, coagulantes e análogos.
Como é a capacidade e a natureza interativa de uma proteína que define a atividade funcional biológica daquela proteína, determinadas substituições na sequência de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de proteína (ou naturalmente, na sequência de DNA subjacente) e mesmo assim ser obtida uma proteína com propriedades iguais (agonísticas). É, portanto, previsto que diversas alterações podem ser feitas na sequência dos anticorpos ou agentes terapêuticos (ou sequências de DNA subjacentes) sem uma perda perceptível da sua utilidade ou atividade biológica. Os equivalentes funcionais biológicos preparados a partir da mutação de uma sequência de DNA subjacente podem ser preparados utilizando-se as informações de códons fornecidas no presente na Tabela A e os detalhes técnicos de suporte na mutagênese específica a sítio. É também um fato bem conhecidos dos peritos na técnica, que está implícito na definição de proteína ou peptídeo "equivalente biologicamente funcional" a idéia de que existe um limite ao número de alterações que podem ser feitas 185 dentro de uma porção definida da molécula e ainda assim resultar em uma molécula com um nivel aceitável de atividade biológica equivalente. As proteínas e peptídeos equivalentes biologicamente funcionais são assim definidos no presente como aquelas proteínas e peptídeos em que determinados, não a maior parte ou todos os aminoácidos podem ser substituídos. Naturalmente, uma multiplicidade de proteínas/peptídeos distintos com diferentes substituições podem ser facilmente preparados e usados de acordo com a presente invenção.
As substituições de aminoácidos são geralmente baseadas na relativa analogia dos substituintes de cadeia lateral de aminoácidos, seu caráter hidrófobo, seu caráter hidrófilo, sua carga, tamanho e semelhantes, por exemplo. Uma análise do tamanho, formato e tipo dos substituintes de cadeia lateral de aminoácidos revela que arginina, lisina e histidina são todos resíduos com carga positiva; que alanina, glicina e serina são todos de um mesmo tamanho; e que fenilalanina, triptofano e tirosina têm todos um formato geralmente semelhante. Portanto, com base nestas considerações, arginina, lisina e histidina; alanina, glicina e serina; e fenilalanina, triptofano e tirosina; são definidos no presente como equivalentes biologicamente funcionais.
Ao se fazer alterações mais quantitativas, o índice hidropático dos aminoácidos pode ser considerado. Cada aminoácido teve atribuído um índice hidropático com base no seu caráter hidrófobo e características de carga; estes índices são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina 186 (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5). A importância do índice hidropático dos aminoácidos ao conferir uma função biológica interativa a uma proteína é geralmente compreendida na técnica (Kyte e Doolittle, 1982, incorporada ao presente documento a título de referência). É fato conhecido que determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice ou valor hidropático análogo e continuar conservando uma atividade biológica análoga. Ao se fazer alterações baseadas no índice hidropático, é preferida a substituição dos aminoácidos cujos índices hidropáticos se encontram dentro de limites de ± 2, sendo especialmente preferidos os que se encontram dentro de limites de ± 1, e ainda mais preferidos aqueles que se encontram dentro de limites de ± 0,5.
Fica, portanto, subentendido que um aminoácido pode ser substituído por outro que tem o mesmo valor de hidrofilicidade e mesmo assim se obter uma proteína biologicamente equivalente. Conforme descrito em detalhes na patente U.S. No. 4.554.101 os valores de hidrofilicidade foram atribuídos aos resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+3,0); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (—1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4). 187
Ao se fazer alterações com base nos valores de hidrofilicidade, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade se encontram dentro de limites de ± 2 são preferidos, sendo os que se encontram dentro de limites de ± 1 especialmente preferidos, sendo ainda mais especialmente preferidos os que se encontram dentro de limites de ± 0,5. H. Conjugação
Anticorpos para aminofosfolipídios e fosfolipidios aniônicos, incluindo anticorpos selecionados anti-PS com propriedades melhoradas, tais como 9D2 e 3G4 (ATCC 4545), podem ser conjugados ou ligados a, ou operativamente associado com, agentes anticelulares e citotóxicos para preparar "imunotoxinas"; a coagulantes, seja direta ou indiretamente, para preparar "coaguligantes"; ou a agentes antivirais, tais como nucleosideos, para preparar imunoconjugados antivirais ou "imunovirocidas". Peptídios que se ligam à PE, tal como duramicina podem também estar conjugados ou ligados a, ou operativamente ligados a, carreadores inertes, agentes marcadores ou agentes antivirais, para preparar uma variedade de Peptídios que se ligam à PE e conjugados peptídicos antivirais.
Embora ligações covalentes sejam preferidas, outros meios de ligações eficientes podem, também ser usados. Por exemplo, construções ligadas podem ser geradas usando pontes avidina:biotina. Além do conhecimento disponível para aqueles indivíduos normalmente versados na técnica, co-pertencente à Patente Americana número 6.093.399 descreve e possibilita o uso de avidina:biotina na ligação operativa de anticorpos e agentes marcadores a agentes biológicos e terapêuticos. 188
Os dois agentes também podem ser juntados por uma segunda região de ligação, preferencialmente uma região que se liga a antígeno ou anticorpo relacionada. Isto é exemplificado por coaguligantes onde o agente marcador é ligado ao coagulante via uma segunda região de ligação (Patentes Americanas números 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289 e 6.036.955), a qual foi feita e usada com sucesso no tratamento do câncer. Onde o primeiro agente marcador é uma região que se liga a antígeno ou anticorpo, o uso de uma segunda região ligante que é também um anticorpo, ou região que se liga a antígeno, resulta em uma construção de anticorpo biespecífica. O preparo e uso de anticorpos biespecíficos em geral é bem conhecido na técnica, e é posteriormente revelado aqui.
Tecnologia de imunoconjugados é agora geralmente conhecida na técnica. Entretanto, certas vantagens podem ser alcançadas através da aplicação de certas tecnologias preferidas, tanto na preparação e purificação para subsequente administração clínica. Por exemplo, enquanto construções baseadas em igG irão tipicamente exibir melhor capacidade de ligação e menor depuração sanguíneo do que seus sósias Fab', construções baseadas em fragmentos Fab' irão geralmente exibir melhor capacidade de penetração no tecido. Adicionalmente, enquanto numerosos tipos de ligações disulfeto contendo ligantes são conhecidas que podem ser empregadas com sucesso na conjugação de anticorpo e peptídio, certos ligantes irão geralmente ser preferidos ao invés de outros ligantes, baseados em características e capacidades farmacológicas diferentes. Por exemplo, ligantes que contém uma ponte disulfeto que é estericamente "escondida" tendem a ser preferidos, devido a sua maior 189 estabilidade in vivo, então evitando a liberaçao do coagulante antes da ligação no sitio de ação.
Cada tipo de reticulador, assim como a forma de como a reticulação é feita, tenderá a variar a farmacodinâmica do conjugado resultante. Alguém pode desejar ter um conjugado que permanecerá intacto sob condições encontradas em qualquer lugar no corpo exceto no sitio de ação pretendido, no ponto tal que é desejado que o conjugado tenha boas caracteristicas de "liberação".
Então, o esquema particular de reticulação, incluindo em particular o reagente de reticulação particular usado e as estruturas que estão ligadas de forma reticulada, serão de algum significado.
Dependendo dos agentes específicos a serem conjugados, pode ser necessário ou desejável fornecer um espaçador peptídico operativamente ligando o anticorpo ou peptídio que se liga a PE e o segundo ou agente terapêutico. Certos espaçadores peptídicos são capazes de dobrar em uma estrutura em volta ligada por disulfeto. Clivagem proteolítica pelo volta poderia então fornecer um polipeptídio heterodimérico onde o anticorpo e o agente terapêutico são ligados somente por uma única ligação disulfeto. Um exemplo de tal toxina é a toxina de cadeia A de ricina.
Quando certos outros compostos de toxina são utilizados, um espaçador peptídico não-clivável pode ser fornecido para ligar operativamente o anticorpo e o composto de toxina da proteína de fusão. Toxinas que podem ser usadas juntamente com espaçadores peptídicos não-cliváveis são aqueles que podem, eles mesmos, ser convertidos por clivagem 190 proteolítica, em uma forma citotóxica ligada por disulfeto. Um exemplo de tal composto de toxina é o composto exotoxina de Pseudomonas. Uma variedade de agentes quimioterapêuticos e outros agentes farmacológicos foram conjugados com sucesso a anticorpos e mostraram funcionar farmacologicamente. Agentes antineoplásicos como exemplo que têm sido investigados incluem doxorubicina, daunomicina, metotrexato, vinblastina, e vários outros. Além disso, a ligação de outros agentes tais como neocarzinostatina, macromicina, trenimon e α-amanitina têm sido descritos. Esses métodos de ligação podem ser adaptados para uso com isto.
Qualquer ligação covalente ao anticorpo ou peptidio que se liga à PE deveria idealmente ser feito em um sitio distinto do(s) sitio(s) funcional(is). As composições são então "ligadas" de qualquer forma operativa que permita a cada região executar sua função pretendida sem prejuízo significativo, em particular, de forma que a construção resultante ainda se ligue ao antígeno pretendido ou à PE de forma que o agente ligado mantenha substancialmente atividade biológica e/ou recupere atividade biológica quando liberado da construção.
Hl. Reticuladores Bioquímicos
Além das informações gerais dadas acima, anticorpos ou peptídios que se ligam a PE podem ser conjugados a agentes terapêuticos ou outros empregando-se determinados reticuladores bioquímicos preferidos. Os reagentes de reticulação são usados para formar pontes moleculares que ligam entre si grupos funcionais de duas moléculas diferentes. Para se ligar duas proteínas diferentes de um modo em etapas, podem ser usados reticuladores 191 heterobifuncionais que eliminam uma formação indesejável de homopolímeros. Reticuladores heterobifuncionais exemplares estão relacionados na Tabela C.
Tabela C
Reticuladores HeteroBifuncionais
Reticula-dor Reativo em relação a Vantagens e Aplicações Comprimento do Braço Espaçador depois da Reticulação SMTP Aminas primárias Sulfidrilas Maior estabilidade 11,2 A Reticula- dor Reativo em relação a Vantagens e Aplicações Comprimento do Braço Espaçador depois da Reticulação SPDP Aminas primárias Sulfidrilas Tiolação Reticulação clivável 6,8 A Reticula- dor Reativo em relação a Vantagens e Aplicações Comprimento do Braço Espaçador depois da 192
Reticulaçao LC-SPDP Aminas primárias Sulfidrilas Braço espaçador prolongado 15,6 A SulfO-LC-SPDP Aminas primárias Sulfidrilas Braço espaçador prolongado Hidrossolúvel 15,6 A SMCC Aminas primárias Sulfidrilas Grupamento reativo a maleimida estável Conjugação enz ima-anticorpo Conjugação de haptenoproteína portadora 11,6 A Sulfo-SMCC Aminas primárias Sulfidrilas Grupo reativo a maleimida estável Hidrossolúvel Conjugação de enz ima-anticorpo 11,6 A 193
MBS Aminas primárias Sulfidrilas Conjugação enz ima-anticorpo Conjugação de haptenoproteína portadora 9, 9 A Sulfo-MBS Aminas primárias Sulfidrilas Hidrossolúvel 9, 9 A SIAB Aminas primárias Sulfidrilas Conjugação enzima-antc 10,6 A Sulfo-SIAB Aminas primárias Sulfidrilas Hidrossolúvel 10,6 A Reticulad Reativo em Vantagens e Comprimento do or relação a Aplicações Braço Espaçador depois da Reticulação SMPB Aminas primárias Sulfidrilas Braço espaçador prolongado Conjugação 14,5 A 194
enzima-anticorpo Sulfo-SMPB Aminas primárias Sulfidrilas Braço espaçador prolongado Hidrossolúvel 14,5 A EDC/Sulfo -NHS Aminas primárias Grupamentos carboxila Conjugação Haptenoportador 0 ABH Carboidrato s Não seletivos Reage com grupamentos de açúcares 11,9 A
Os reticuladores heterobifuncionais contêm dois grupamentos reativos: um geralmente reagindo com o grupamento amina primária (tal como N-hidroxisuccinimida) e o outro geralmente reagindo com o grupamento tiol (tal como disulfeto de piridila, maleimidas, halogênios, etc.) Através do grupamento que reage com amina primária, o reticulador pode reagir com o(s) resíduo(s) de lisina de uma proteína (o anticorpo selecionado, fragmento ou peptídio que se liga a PE, por exemplo) e através do grupo reativo tiol, o reticulador, já ligado à primeira proteína, reage com o resíduo de cisteína (grupamento sulfidrila livre) da outra proteína. 195
As composições, portanto, geralmente têm, ou são derivadas para ter, um grupamento funcional disponível para os fins de reticulação. Esta exigência não é considerada como limitante, uma vez que uma ampla variedade de grupamentos pode ser usada deste modo. Os grupamentos amina primária ou secundária, os grupamentos hidrazida ou hidrazina, álcool carboxil, fosfato, carbamato ou grupamentos de alquilação podem ser usados para a ligação ou a reticulação. 0 braço de espaçador entre os dois grupamentos reativos de um reticulador podem ter diversos comprimentos e composições químicas. Um braço espaçador mais longo permite uma flexibilidade maior dos componentes do conjugado, ao passo que alguns componentes específicos na ponte (tais como o grupamento benzeno), podem proporcionar uma estabilidade extra ao grupamento reativo ou uma maior resistência da ligação química à ação de diversos aspectos (a ligação disulfeto resistente a agentes redutores). 0 emprego de espaçadores de peptídeo, tais como L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala, é também considerado. É preferível se empregar um reticulador que tem uma estabilidade razoável no sangue. Numerosos tipos de reticuladores contendo ligações de disulfeto são conhecidos e podem ser empregados com sucesso em conjugação. Os ligantes que contêm uma ligação disulfeto que é estericamente impedida podem resultar em uma maior estabilidade in vivo, impedindo a liberação do agente antes da sua ligação no sítio de ação. Estes ligantes são, portanto, um grupo preferido de agentes de ligação. 196
Um dos reagentes de reticulação mais preferidos é SMPT, que é um reticulador bifuncional contendo uma ligação disulfeto que é "estericamente impedida" por um anel benzênico adjacente e grupamentos metila. Acredita-se que o impedimento estérico da ligação disulfeto serve a função de proteger a ligação de ataque por ânions de tiolato tais como glutationa, que podem estar presentes nos tecidos e no sangue e, portanto, ajudam a impedir o desacoplamento do conjugado antes do fornecimento do agente ligado ao sitio do tumor. É prevista a possibilidade de se empregar o agente SMPT em conexão com os conjugados da presente invenção. 0 reagente de reticulação SMPT, tal como muitos outros reagentes de reticulação conhecidos, confere a capacidade de se reticular grupamentos funcionais tais como SH de cisteina ou aminas primárias (tal como o grupamento amino épsilon de lisina). Um outro tipo possível de reticulador inclui as fenilazidas fotoreativas heterobifuncionais contendo uma ligação disulfeto clivável tal como sulfosuccinimidil-2-(p-azidosalicilamido)etil-1,3'-ditiopropionato. 0 grupamento N-hidroxisuccinimidil reage com grupamentos amina primária e a fenilazida (por fotólise) reage não seletivamente com qualquer resíduo de aminoácido.
Além dos reticuladores impedidos podem também ser empregados reticuladores não impedidos de acordo com o presente. Outros reticuladores úteis, não considerados como contendo ou gerando um disulfeto protegido incluem SATA, SPDP e 2-iminotiolano. 0 emprego de tais reticuladores é bem compreendido na técnica.
Uma vez conjugado, o conjugado é separado dos anticorpos não conjugados ou peptídios e outros agentes e de outros 197 contaminantes. Um grande número de técnicas de purificação está disponível para emprego para conferir aos conjugados um grau suficiente de pureza para torná-los clinicamente úteis. Os processos de purificação à base de separação por tamanho tais como filtração de gel, permeação a gel ou cromatografia líquida de alto desempenho serão geralmente muito úteis. Outras técnicas cromatográficas, tais como separação Blue-Sepharose, podem também ser usadas. H2. Ligantes Biologicamente Liberáveis
Embora seja preferido que qualquer porção de ligação tenha uma estabilidade razoável no sangue, para impedir a liberação substancial do agente terapêutico ligado antes de ser sido atingido o sítio da doença, por exemplo, o sítio do tumor, em determinados aspectos, é contemplado o emprego de ligações biologicamente liberáveis e/ou de espaçadores ou ligantes seletivamente cliváveis. "Ligações biologicamente liberáveis" e "espaçadores ou ligantes seletivamente cliváveis" ainda teriam uma estabilidade razoável na circulação.
Os anticorpos ou peptídios que se ligam a PE de acordo com a invenção podem, portanto, serem ligados a um ou mais agentes terapêuticos ou secundários através de uma ligação biologicamente liberável. Qualquer forma de agente marcador ou anticorpo pode ser usada, incluindo anticorpos intactos, embora sejam preferidos em determinadas modalidades fragmentos ScFv. "Ligações biologicamente liberáveis" ou "ligações seletivamente hidrolizáveis" incluem todas as ligações que são liberáveis, cliváveis ou hidrolizáveis somente ou preferencialmente sob determinadas condições. Isto inclui 198 ligações disulfeto e trissulfeto e ligação lábil em ácido, conforme descrito nas patentes U.S. Nos. 5.474.765 e 5.762.918. 0 emprego de um espaçador sensível a ácido para ligação de um agente terapêutico ou medicamento a um anticorpo ou peptídio que se liga a PE da invenção é especialmente contemplado. Em tais modalidades, os agentes terapêuticos são eliminados no interior de compartimentos ácidos no interior de uma célula. Contempla-se que a liberação sensível a ácido possa ocorrer extracelularmente, mas mesmo assim depois do alvo específico ter sido atingido, de preferência ao sítio tumoral ou à célula infectada por vírus. Determinados exemplos atualmente preferidos incluem anticorpos ligados a colchicina ou doxorubicina através de um espaçador sensível a ácido. A ligação por meio de porções carboidrato dos anticorpos é também contemplada. Em tais modalidades, os agentes terapêuticos são liberados no interior de compartimentos ácidos no interior de uma célula. 0 anticorpo ou peptídio que se liga a PE pode também ser derivatizado para introduzir grupamentos funcionais que permitem a ligação do(s) agente(s) terapêutico(s) através de uma ligação biologicamente liberável. 0 anticorpo ou peptídio que se liga a PE pode então ser derivatizado para introduzir cadeias laterais que terminam em grupamentos hidrazida, hidrazina, amina primária e amina secundária. Os agentes terapêuticos podem ser conjugados por ligação de base de Schiff, uma ligação hidrazona ou acil hidrazona ou um ligante hidrazida (patentes U.S. Nos. 5.474.765 e 5.762.918). 199
Também conforme descrito nas patentes U.S. Nos. 5.474.765 e 5.762.918, o anticorpo ou peptídio que se liga a PE pode ser ligado operativamente ao agente terapêutico através de uma ou mais ligações biologicamente liberáveis que são ligações sensíveis a enzima, incluindo ligações peptídicas, ésteres, amidas, fosfodiésteres e glicosídeos.
Certos aspectos preferidos da invenção dizem respeito ao emprego de ligantes de peptídeos que incluem pelo menos um primeiro sítio de clivagem para uma peptidase e/ou proteinase que se encontra de preferência localizada no interior do sítio da doença, especialmente no interior do sítio da doença, particularmente no ambiente tumoral. 0 fornecimento mediado por anticorpo ou peptídio do agente terapêutico ligado deste modo resulta na clivagem especificamente no interior do sítio da doença ou no ambiente tumoral, resultando na liberação específica do agente terapêutico ativo. Determinados ligantes de peptídeo incluirão um sítio de clivagem que é reconhecido por uma ou mais enzimas implicadas na remodelagem.
Os ligantes de peptídeo que incluem um sítio de clivagem para uroquinase, pró-uroquinase, plasmina, plasminogênio, TGFP, estafiloquinase, Trombina, Fator IXa, Fator Xa ou uma metaloproteinase, tal como uma colagenase intersticial, uma gelatinase ou uma estromelisina são especialmente preferidos. As patentes U.S. Nos. 6.004.555, 5.877.289 e 6.093.399 descrevem e possibilitam adicionalmente como preparar e usar imunoconjugados que compreendem ligações liberáveis biologicamente e ligantes seletivamente cliváveis e peptídeos. A patente U.S. No. 5.877.289 descreve e possibilita como preparar e empregar imunoconjugados que compreendem um peptídeo seletivamente clivável que é clivado 200 por uroquinase, plasmina, Trombina, Fator IXa, Fator Xa ou uma metaloproteinase, tal como uma colagenase intersticial, uma gelatinase ou uma estromelisina, dentro de um ambiente tumoral.
Os ligantes de peptideos seletivamente cliváveis atualmente preferidos são aqueles que incluem um sitio de clivagem para plasmina ou uma metaloproteinase (também conhecida como "metaloproteases de matriz" ou "MMPs"), tal como uma colagenase intersticial, uma gelatinase ou uma estromelisina. Outros ligantes de peptideos que podem ser usados com vantagem em conexão com a presente invenção incluem, por exemplo, sequências cliváveis de plasmina, tais como aquelas cliváveis pela pró-uroquinase, TGFP, plasminogênio e estafiloquinase; sequências cliváveis de Fator Xá; sequências cliváveis de MMP, tais como aquelas cliváveis pela gelatinase A; sequências cliváveis de colagenase, tais como aquelas cliváveis pela pele de colágeno de pele de bezerro (cadeia OCl(I)), colágeno de pele de bezerro (cadeia (X2 (I) ) , colágeno de cartilagem de bovino (cadeia OCl(II)), colágeno de fígado humano (cadeia OCl(III)), 0C2M humana, PZP humana, OCiM de rato, OC2M de rato, 0Cil3(2J) de rato, 0Cil3(27J) de rato, e sítios de clivagem autolíticos de colagenase de fibroblasto humano. Além do conhecimento disponível daqueles indivíduos normalmente versados na técnica, o texto e sequências da Tabela B2 nas Patentes Americanas em co-propriedade números 6.342.219, 6.524.583, 6.342.221 e 5.416.758 descrevem e possibilitam o uso de tais sequências cliváveis. H3. Anticorpos Biespecíficos 201
Anticorpos biespecíficos podem ser empregados, em geral, tão logo um braço se liga a um aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico e o anticorpo biespecífico é ligado, no sitio distinto do sitio de ligação a antigeno, a um agente terapêutico.
Em geral, a preparação de anticorpos biespecíficos é também bem conhecida na técnica. Um processo abrange a preparação separada de anticorpos que têm especificidade para o aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico, por um lado, e como um agente terapêutico por outro lado. Fragmentos pépticos F(ab'y)2 são preparados a parir de dois anticorpos escolhidos, seguidos por redução de cada um para proporcionar fragmentos separados Fab'ySH. Os grupamentos SH de um dos dois parceiros a serem acoplados são então alquilados com um reagente de reticulação tal como o-fenilenodimaleimida para prover grupamentos maleimida livres em um parceiro. Este parceiro pode então ser conjugado ao outro por meio de uma ligação tioéter, para resultar no heteroconjugado desejado F(ab'y)2. Outras técnicas são conhecidas em que é conduzida a reticulação com SPDP ou proteína A ou é preparada uma construção triespecífica.
Um outro processo para se produzir anticorpos biespecíficos é pela fusão de dois hibridomas para formar um quadroma. Conforme empregado no presente, o termo "quadroma" é empregado para descrever a fusão produtiva de dois hibridomas de células B. Empregando-se novas técnicas padrão, dois hibridomas produtores de anticorpos são fundidos para resultar em células filhas, e aquelas células que tiverem mantido a expressão dos dois conjuntos de genes de imunoglobulina de clonotipo são então selecionadas. 202
Um processo preferido de geração de um quadroma abrange a seleção de uma enzima mutante deficiente de pelo menos um dos hibridomas genitores. A primeira linhagem de células de hibridoma mutante é então fundida com células de um segundo hibridoma que tiver sido letalmente exposto, a iodoacetamida, por exemplo, impedindo a continuação da sua sobrevivência. A fusão celular permite que se salve o primeiro hibridoma por aquisição do gene para a sua deficiência enzimática do hibridoma tratado letalmente, e a salvação do segundo hibridoma através da fusão ao primeiro hibridoma. É preferível, mas não necessário, é a fusão de imunoglobulinas do mesmo isotipo, mas de uma subclasse diferente. Um anticorpo de subclasses mistas permite o emprego se um ensaio alternativo para o isolamento de um quadroma preferido.
Mais detalhadamente, um processo de desenvolvimento e seleção de quadromas abrange a obtenção de uma linhagem de hibridomas que secreta o MAb primeiramente escolhido e a conversão dele em deficiente para a enzima metabólica essencial, hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HGPRT). Para se obter mutantes deficientes do hibridoma, cultivam-se células na presença de concentrações crescentes de 8-azaguanina (1 x 10~7 M a 1 x 1CP5 M) . Os mutantes são subclonados por diluição limitante e testados para sua sensibilidade a hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT). 0 meio de cultura pode consistir, por exemplo, em DMEM suplementado com FCS a 10%, L-Glutamina a 2mM e penicilina-estreptomicina a 1 mM.
Uma linhagem celular de hibridoma complementar que produz o segundo MAb desejado é empregada para gerar os quadromas por técnicas padrão de fusão celular. Resumindo, 4,5 x 107 203 primeiras células sensíveis a HAT são misturadas com 2,8 x 107 segundas células resistentes a HAT que foram previamente tratadas com uma dose letal do inibidor bioquímico irreversível iodoacetamida (5 mM em solução salina tamponada com fosfato) durante 30 minutos em gelo antes da fusão. A fusão celular é induzida utilizando-se polietilenoglicol (PEG) e as células são dispostas em placas de microcultura de 96 cavidades. Os quadromas são selecionados usando-se meio contendo HAT. As culturas contendo anticorpos biespecíficos são identificadas, usando-se, por exemplo, um ELISA isotipo específico e fase sólida e fingimento por imunofluorescência específica a isotipo.
Em uma modalidade de identificação para identificar o anticorpo biespecífico, as cavidades das placas de microtitulação (Falcon, Becton Dickinson Labware) são revestidas com um reagente que interage especificamente com um dos anticorpos de hibridoma genitor e que não tem uma reatividade cruzada com ambos anticorpos. As placas são lavadas, bloqueadas e os sobrenadantes (SNs) a serem testados são acrescentados a cada cavidade. As placas são incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas, os sobrenadantes são descartados, as placas lavadas e acrescentado conjugado de fosfatase alcalina antianticorpo durante 2 horas à temperatura ambiente. As placas são lavadas e acrescentado a cada cavidade um substrato de fosfatase, por exemplo, P-nitrofenilfosfato (Sigma, St. Louis). As placas são incubadas, acrescentando-se NaOH 3N a cada cavidade para interromper a reação, e valores de OD410 determinados empregado-se um leitor ELISA.
Em uma outra modalidade de identificação as placas de microtitulação previamente tratadas com poli-L-lisina são 204 usadas para ligar uma das células alvo a cada cavidade, sendo então as células fixadas, empregando-se, por exemplo, glutaraldeido a 1%, e os anticorpos biespecificos são testados para verificar a sua capacidade de se ligar à célula intacta. Além disso, podem ser usados FACS, fingimento por imunofluorescência, anticorpos específicos a idiotipo, ensaios de competição de ligação a antígenos, e outros processos comuns na técnica de caracterização de anticorpos em conjunto com a presente invenção para identificar os quadromas preferidos.
Depois do isolamento do quadroma, os anticorpos biespecificos são purificados dos demais produtos celulares. Isto pode ser produzido por uma variedade de procedimentos de isolamento de proteínas, conhecidos dos peritos na técnica de purificação de imunoglobulinas. Os meios para a preparação e caracterização de anticorpos são bem conhecidos na técnica (Vide, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, 19 8 8) .
Fizeram-se os sobrenadantes provenientes dos quadromas selecionados, por exemplo, passar sobre colunas de sefarose de proteína A e proteína G para se ligar a IgG (dependendo do isotipo). Os anticorpos ligados são então eluídos com um tampão de citrato com pH 5,0, por exemplo. As frações eluídas contendo os BsAbs, são dialisadas contra um tampão isotônico. Alternativamente, faz-se o eluato também passar sobre uma coluna de sefarose anti-imunoglobulina. O BsAb é em seguida eluído com cloreto de magnésio a 3,5 M. Os BsAbs purificados deste modo são então testados para detecção da sua atividade de ligação por um ELISA específico a isotipo, por exemplo, e por ensaio de fingimento por 205 imunofluorescência das células alvo, conforme descrito acima.
Os BsAbs purificados e os anticorpos genitores podem também ser caracterizados e isolados por eletroforese SDS-PAGE, seguindo-se um fingimento com prata ou Coomassie. Isto é possível quando um dos anticorpos genitores tem um peso molecular maior do que o outro, migrando a banda dos BsAbs no meio entre a dos dois anticorpos genitores. A redução das amostras verifica a presença de cadeias pesadas com dois pesos moleculares aparentes diferentes. H4. Proteínas de Fusão e Expressão Recombinante
Anticorpos a aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos, incluindo os anticorpos 9D2 e 3G4 (ATCC 4545) e outros anticorpos competidores com propriedades melhoradas, e peptídios que se ligam a PE, podem também ser usados para criar proteínas de fusão empregando-se técnicas da biologia molecular. Qualquer proteína de fusão pode ser projetada e preparada empregando-se qualquer um dos anticorpos, peptídios que se ligam a PE e segundo ou agentes terapêuticos descritos no presente e os que são conhecidos na técnica. A tecnologia de proteínas de fusão é facilmente adaptada para se preparar proteínas de fusão com outras modificações, tais como otimizações em sequências de CDR, ligação via uma sequência de peptídio seletivamente clivável, e análogos. 0 emprego de técnicas de DNA recombinante para se atingir tais fins é agora prática padrão dos peritos na técnica.
Estes processos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação in vivo/recombinação genética. A síntese de DNA e de RN A pode, 206 além disso, ser conduzida utilizando-se sintetizadores automatizados (vide, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., 1989). A preparação de uma tal proteína em fusão geralmente acarreta a preparação de uma primeira e de uma segunda regiões de codificação de DNA e a ligação funcional ou junção de tais regiões, em quadro para preparar uma única região de codificação que codifica a proteína de fusão desejada. No presente contexto, a sequência de anticorpo será ligada em quadro com uma sequência de DNA que codifica um agente terapêutico. Não se pensa em geral que seja especialmente relevante qual a porção do imunoconjugado é preparada como região de terminal N e como de terminal C.
Quando a região de codificação desejada tiver sido produzida, cria-se um vetor de expressão. Os vetores de expressão contêm um ou mais acima das regiões de DNA inseridas que agem para promover a transcrição do DNA e deste modo para promover a expressão da proteína recombinante codificada. Este é o significado de "expressão recombinante".
Para se obter uma versão denominada "recombinante" do imunoconjugado, o vetor é expresso em uma célula recombinante. A construção do(s) segmento(s) de DNA para a expressão em um sistema procariótico ou eucariótico pode ser conduzida por técnicas geralmente conhecidas dos peritos na técnica de expressão recombinante. Acredita-se que praticamente qualquer sistema de expressão possa ser empregado na expressão.
Os imunoconjugados da invenção podem ser expressos com sucesso em sistemas de expressão eucariótica, tal como em 207 células CHO, no entanto, é previsto que os sistemas de expressão bacterianos, tais como E. coli pQE-60 serão especialmente úteis para uma preparação em grande escala e subsequente purificação das construções. Os cDNAs podem também ser expressos nos sistemas bacterianos, com as proteínas codificadas expressas como fusões com β-galactosidase, ubiquitina, glutationa S-transferase de Schistosoma japonicum, e análogos. Acredita-se que a expressão bacteriana terá vantagens sobre a expressão eucariótica em termos de facilidade de emprego e quantidade de materiais obtidos deste modo.
Em termos de expressão microbiana, as patentes U.S. Nos. 5.583.013; 5.221.619; 4.785.420; 4.704.362; e 4.366.246 suplementam ainda mais a presente descoberta em conexão com a expressão de genes nas células hospedeiras recombinantes.
Os imunoconjugados produzidos de modo recombinante podem ser purificados e preparados para a administração humana. Alternativamente os ácidos nucléicos que codificam os imunoconjugados podem ser fornecidos por terapia genética. Embora possam ser empregados os DNAs recombinantes nus ou plasmídeos, é preferido o emprego de lipossomas ou vetores. A capacidade de determinados vírus de penetrar nas células por endocitose mediada por receptores e de se integrar ao genoma celular do hospedeiro e expressar genes virais de modo estável e eficiente tornaram os vírus candidatos atraentes para a transferência de genes estranhos para as células de mamíferos. Os vetores da terapia gênica preferidos para emprego na presente invenção serão geralmente vetores virais. 208
Os retrovírus são promissores como vetores de fornecimento genético devido a sua capacidade de integrar os seus genes aos do genoma do hospedeiro, transferindo uma grande quantidade de material genético estranho, infectando um amplo espectro de espécies e de tipos de células além de serem acondicionados em linhagens celulares especiais. Outros vírus, tais como o adenovírus, vírus de herpes simples (HSV), citomegalovírus (CMV) e vírus associado a adeno (AAV) tais como os descritos na patente U.S. No. 5.139.941 podem também ser construídos para servir como vetores para a transferência de genes.
Embora alguns vírus que podem aceitar material genético estranho sejam limitados quanto ao número de nucleotídeos que eles podem acomodar e à faixa de células que eles infectam, estes vírus demonstraram que efetuam com sucesso a expressão dos genes. No entanto, os adenovírus não integram o seu material genético ao genoma do hospedeiro e portanto não necessitam de replicação do hospedeiro para a expressão de genes, tornando-os idealmente adequados para uma expressão genética rápida, eficiente e heteróloga. As técnicas para a preparação de vírus infectantes com defeito de replicação são bem conhecidas na técnica.
Em determinados modalidades adicionais, o vetor de terapia gênica será HSV. Um fator que torna HSV um vetor atraente é o tamanho e a organização do genoma. Como HSV é grande, a incorporação de uma multiplicidade de genes ou de cassetes de expressão é menos problemática do que no caso de sistemas virais menores. Além disso, a disponibilidade de diferentes sequências de controle virai com desempenho variável (tal como temporal, de resistência) torna possível se controlar a expressão até um ponto muito maior do que em outros 209 sistemas. É também uma vantagem o fato de que o vírus tem uma quantidade relativamente pequena de mensagens emendadas, facilitando ainda mais as manipulações genéticas. Hsv é também relativamente fácil de ser manipulado e pode ser cultivado a altas titulações.
Naturalmente, quando se empregam sistemas de fornecimento virai, é desejável se purificar o virion suficientemente a fim de torná-lo essencialmente livre de contaminantes indesejáveis, tais como de partículas virais defeituosas interferentes e de outros pirogênios, de modo que ele não cause nenhuma reação inconveniente na célula, no animal ou no indivíduo que receber a construção de vetor. Um meio preferido de purificação do vetor abrange o emprego de gradientes de densidade flutuante, tal como a centrifugação com gradiente de cloreto de césio. I. Testes Funcionais e de Ligação
Embora a presente invenção tenha utilidade significativa nos regimes de tratamento de animais e humanos ela também tem muitos outros usos específicos e de confiança, inclusive usos práticos em muitas modalidades in vitro. Determinados destes usos estão relacionados às propriedades de ligação específica dos anticorpos, peptídios ou imunoconjugados. Em cada uma das construções da invenção está incluso pelo menos um anticorpo ou componente peptídico que se liga a um aminofosfolipídio e/ou um fosfolipídio aniônico, eles podem ser usados e, uma variedade de modalidades ligantes, incluindo ensaios úteis de ligação. A presença de um agente ligado, nos casos em que é relevante, embora proporcione propriedades vantajosas, não nega a utilidade das regiões do primeiro anticorpo ou 210 peptídio em qualquer ensaio de ligação. Ensaios de ligação adequadamente úteis, portanto incluem os habitualmente empregados na técnica, tais como os imunoblots, Western blots, dot blots, RIAs, ELISAs, imunoistoquímica, triagem de células ativadas fluorescentes (FACS), imunoprecipitação, cromatografia por afinidade, e semelhantes, conforme será descrito abaixo no presente.
Determinados ensaios padrão de ligação são aqueles em que um antigeno é imobilizado sobre uma matriz de suporte sólida, tal como nitrocelulose, náilon ou uma combinação sua, tal como em immunoblots, Western blots, ELISAs e ensaios relacionados. Outros ensaios importantes são aqueles usando células, onde os componentes da presente invenção podem ser usados para testar células com aminofosfolipidios e/ou fosfolipidios aniônicos na superfície celular. Tais ensaios podem ser aplicados em testes pré-clínicos, por exemplo, considerando o design de medicamentos, testando o mecanismo de ação e/ou selecionando agentes terapêuticos para uso combinado.
Além disso, ensaios in vitro são úteis na diagnose de doenças relacionadas com ativação celular aberrante e/ou apoptose, onde a testagem para a presença de aminofosfolipidios e/ou fosfolipidios aniônicos na superfície celular poderia ser particularmente útil. As construções da invenção podem então ser usadas juntamente com blocos de tecido embebidos em parafina em imunoistoquímica, fixados com formalina e recém-congelados; na seleção de células ativadas fluorescentes, citometria de fluxo ou microfluorometria de fluxo. 211
Essas construções da invenção têm adicionais usos práticos em imunoprecipitação, modalidades purificadoras de antigenos, tais como cromatografia por afinidade, incluindo, em casos de anticorpos biespecificos, o passo único de purificação rápida de um ou mais antigenos ao mesmo tempo; e em muitos outros ensaios de ligação que serão conhecidos dos indivíduos versados na técnica dada a informação apresentada aqui .
Ainda outros usos práticos das presentes construções são como controles em ensaios funcionais, incluindo muitos ensaios e sistemas in vitro e ex vivo. Como a ligação e propriedades funcionais dos anticorpos, peptídios e conjugados da invenção são particularmente específicos, como revelado aqui, tais "usos" controle são realmente extremamente valiosos. Os ensaios que beneficiam e uma tal aplicação prática da presente invenção incluem, por exemplo, ensaios envolvendo a detecção de aminofosfolipídios e/ou fosfolipídios aniônicos na superfície celular.
Esses sistemas de ensaio podem também ser desenvolvidos em ensaios de seleção de medicamentos in vitro e ex vivo, onde a presente provisão de materiais biológicos com propriedades bem definidas é particularmente importante. Por exemplo, no uso das construções da presente invenção como controles positivos na seleção de pequenas moléculas que tem propriedades de ligação semelhantes, equivalentes ou melhoradas, por exemplo, em triagem e desenvolvimento de medicamentos. J. Composiçoes Farmacêuticas
Os agentes terapêuticos da presente invenção irao geralmente ser formulados como composiçoes 212 farmacêuticas.
As composições farmacêuticas compreenderão uma quantidade biologicamente ou terapeuticamente eficiente de pelo menos um primeiro agente terapêutico da invenção, dissolvido ou disperso em um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico ou meio aquoso. Produtos terapêuticos combinados são também previstos, podendo ser empregado o mesmo tipo de composição farmacêutica básica tanto para os medicamentos simples como os combinados.
As expressões "aceitável do ponto de vista farmacêutico ou farmacológico" se referem a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra indesejável quando administradas a um animal, ou a um ser humano, conforme apropriado. Empregos veterinários são também incluídos na invenção e preparados "aceitáveis do ponto de vista farmacêutico" incluem preparados para uso clínico e/ou veterinário.
Conforme empregado no presente, "veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico" inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimento, agente antibacteriano e antifúngico, agente isotônico e de retardamento de absorção e semelhantes. 0 emprego de tais meios e agentes para as substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, é previsto o seu emprego nas composições terapêuticas. Para a administração a seres humanos, os preparados devem satisfazer padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza, conforme exigido pelo FDA Office of Biologics standards. Ingredientes suplementares ativos podem também ser incorporados às composições. 213
Preparados de "dosagem unitária são aqueles que contêm uma dose ou sub-dose do ingrediente administrado adaptada a um fornecimento específico definido no tempo. Preparados de "dosagem unitária" exemplares, por exemplo, são aqueles que contêm uma dose ou unidade diária ou sub-dose diária ou uma dose ou unidade semanal ou sub-dose semanal e semelhantes. J1. Preparados Injetáveis
Os agentes terapêuticos da invenção serão frequentemente formulados para administração parenteral, particularmente para tratamento tumoral, por exemplo, preparados para injeção intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, por exemplo, ou outras vias, incluindo a administração peristáltica e instilação direta em um tumor ou sítio de doença (administração intracavidade). A preparação de uma composição aquosa que contém um anticorpo, imunoconjugado ou peptídio conjugado como um ingrediente ativo será conhecida dos peritos na técnica à luz da descrição da presente invenção. Tipicamente tais composições podem ser preparadas na forma de injetáveis, quer como soluções quer como suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para serem empregadas para a preparação de soluções ou suspensões por adição de um líquido antes da injeção podem também ser preparadas; e os preparados podem também ser emulsifiçados.
As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis; preparados que incluem óleo de gergelim, óleo de amendoim ou propilenoglicol aquoso; e pós estéreis para uma preparação extemporânea das soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e o fluido na 214 medida em que existe a possibilidade de se aplicar com seringa. Deve ser estável nas condições de fabricação e armazenagem e deve ser preservada de ação contaminante por microrganismo, tais como bactérias e fungos.
Os agentes terapêuticos podem ser formulados em uma composição aquosa estéril na forma neutra ou de sal. As soluções dos agentes terapêuticos como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis do ponto de vista farmacêutico podem ser preparadas em água adequadamente misturadas com um surfactante, tal como hidroxipropilcelulose. Os sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupamentos amino livres da proteína) e os que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo ácidos clorídrico ou fosfórico, ou tais ácidos orgânicos como acético, trifluoroacético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados com grupamentos carboxil livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férrico e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes.
Os veículos adequados incluem solventes e meios de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido, por exemplo, e semelhantes), suas misturas adequadas, e óleos vegetais. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, açúcares ou cloreto de sódio, por exemplo, A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, com o emprego de um revestimento, tal como lecitina, pela conservação da granulometria necessária no caso de dispersão e/ou com o emprego de surfactantes. 215
Em condições habituais de armazenagem e uso, todos tais preparados devem conter um conservante para prevenir o crescimento de microrganismos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser produzida por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, por exemplo e semelhantes. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser produzida pelo emprego nas composições de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina, por exemplo.
Antes ou depois da preparação, os agentes terapêuticos devem ser extensamente submetidos à diálise para remover moléculas indesejáveis de baixo peso molecular, e/ou a liofilização para preparado mais imediato em um veículo desejável, quando apropriado. As soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação dos agentes ativos na quantidade necessária a um solvente adequado com diversos outros ingredientes enumerados acima, conforme for desejado, seguindo-se uma filtração esterilizante. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação de diversos ingredientes esterilizados ativos a um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dos enumerados acima.
No caso de pós estéreis para a preparação de soluções estéreis injetáveis, os processos preferidos de preparação são técnicas de secagem a vácuo e secagem por congelamento que produzem um pó do ingrediente ativo além de qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução sua previamente filtrada de forma estéril. 216
As composições farmacêuticas adequadas de acordo com a presente invenção geralmente incluirão uma quantidade do agente terapêutico misturada com um diluente ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico, tal como uma solução aquosa estéril para resultar em uma faixa de concentrações finais, dependendo do uso final. As técnicas de preparação são geralmente bem conhecidas na técnica conforme exemplificado por Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed. Mack Publishing Company, 1980. Para administração humana, preparações devem padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança de forma geral e pureza conforme requerido pelo FDA Office of Biological Standards. Na formulação, os agentes terapêuticos serão administrados de uma forma compatível com a dosagem da formulação e numa quantidade tal que seja terapeuticamente eficiente. J2. Preparado de Liberação Sustentada
Formulações são de fácil administração em uma variedade de formas de dosagem, tais como os tipos de soluções injetáveis descritas acima, mas outras formas aceitáveis do ponto de vista farmacêutico são também previstas, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas ou outras sólidas, por exemplo, para a administração oral, supositórios, pessários, soluções nasais ou pulverizadores, aerossóis, inalantes, formulações tópicas, formas lipossômicas e semelhantes. O tipo de forma para a administração será correspondente à doença ou distúrbio a ser tratado.
Podem também ser usadas cápsulas farmacêuticas de "liberação lenta" ou composições ou preparados de "liberação sustentada" e são geralmente aplicáveis. Preparados de 217 liberação lenta são geralmente projetadas para produzir um nível de medicamento constante durante um período prolongado de tempo e podem ser usados para agentes terapêuticos de acordo com a presente invenção. As formulações de liberação lenta são tipicamente implantadas na vizinhança do sítio da doença, por exemplo, no sítio do tumor ou da infecção virai.
Exemplos adequados de preparados de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo agentes terapêuticos, estando as matrizes na forma de artigos com formato, tal como em película ou microcápsula. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres; hidrogéis, poli(2-hidroxietilmetacrilato), por exemplo, ou poli(vinil álcool); polilactídeos, tal como em patente U.S. No. 3.773.919, por exemplo; copolímeros do ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato; etilenovinilacetato não degradável; copolímeros degradáveis de ácido lático-ácido glicólico, tais como de Lupron Depot ™ (microesferas injetáveis compostas do copolímero de ácito lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida); e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Embora polímeros tais como etilenoacetato de vinila e ácido lático-ácido glicólico permitem a liberação de moléculas durante um período de 100 dias, determinados hidrogéis liberam proteínas durante períodos mais curtos de tempo. Quando anticorpos encapsulados permanecem durante muito tempo no corpo, eles podem se desnaturar ou agregar como resultado de exposição à umidade a 37 °C, reduzindo deste modo a atividade biológica e/ou alterando a imunogenicidade. Estratégias racionais são disponíveis para a estabilização, dependendo do mecanismo implicado. Se o mecanismo de agregação envolve, por exemplo, formação de ligação S-S 218 intermolecular por meio de uma troca de tiodissulfeto, a estabilização é atingida por modificação dos resíduo de sulfidrila, liofilização de soluções ácidas, controle do teor de umidade, emprego de aditivos adequados, desenvolvendo-se composições de matriz polimérica específica e semelhantes. J3. Lipossomas e Nanocápsulas
Em determinadas modalidades, podem também ser empregados lipossomas e/ou nanopartícuias com os agentes terapêuticos. A formação e emprego de lipossomas é do conhecimento geral dos peritos na técnica, conforme resumido abaixo. A presente invenção fornece combinações particulares de anticorpos, lipossomas e agentes quimioterapêuticos, os quais são descritos abaixo. Além disso, uma formulação lipossomal pode ser usada como um componente de rotina de qualquer um dos agentes terapêuticos da invenção como um todo.
Os lipossomas são formados a partir de fosfolipídios que se encontram dispersos em um meio aquoso e que formam espontaneamente vesículas multilamelares de duas camadas concêntricas (também denominadas vesículas multilamelares MLVs). As MLVs geralmente têm diâmetros que vão de 25 nm a 4 μιη. As MLVs, uma vez submetidas a ultra-som, produzem pequenas vesículas unilamelares (SUVs) com diâmetros na faixa de 200 a 500 ângstrons, contendo uma solução aquosa no núcleo.
Os fosfolipídios podem formar uma variedade de estruturas diferentes de lipossomas quando dispersas em água, dependendo da relação molar de lipídio para água. Com relações baixas, o lipossoma é a estrutura preferida. As 219 características físicas dos lipossomas dependem do pH, da resistência iônica e da presença de cátions divalentes. Os lipossomas podem mostrar uma baixa permeabilidade a substâncias iônicas e polares, mas a temperaturas elevadas sofrem uma transição de fase que altera de modo nítido a sua permeabilidade. A transição de fase inclui uma alteração de uma estrutura bem compactada, ordenada, conhecida com o estado de gel para uma estrutura não compactada menos ordenada, conhecida como estado fluido. Isto ocorre a uma temperatura característica de transição de fase e resulta em um aumento na permeabilidade a íons, açúcares e medicamentos.
Os lipossomas interagem com células por quatro mecanismos diferentes: endocitose por células fagocíticas do sistema reticuloendotelial, tais como macrófagos e neutrófilos; adsorção à superfície celular, quer por forças não específicas hidrófobas fracas ou eletrostáticas, ou por interações específicas com componentes da superfície celular; fusão com a membrana celular plasmática por inserção da bicamada lipídica de conteúdo lipossomal no citoplasma; e por transferência dos lipídios do lipossoma para as membranas celular ou subcelular, ou vice-versa, sem qualquer associação do conteúdo do lipossoma. Fazendo-se variar a composição do lipossoma pode-se alterar qual o mecanismo que se encontra operando, embora mais de um possa estar operando ao mesmo tempo.
As nanocápsulas podem geralmente aprisionar compostos de um modo estável e reproduzível. Para se evitar efeitos colaterais devidos à sobrecarga polimérica intracelular, tais partículas ultrafinas (dimensões de aproximadamente 0,1 μιη) devem ser projetadas empregando-se polímeros capazes de 220 se degradarem in vivo. As nanopartícuias de polialquilcianoacrilato biodegradáveis que satisfazem estas exigência são previstas para emprego na presente invenção, e tais partículas podem ser facilmente preparadas. J4. Preparados Oftálmicos
Muitas doenças oftálmicas, principalmente aquelas com um componente angiogênico, podem ser tratadas pela presente invenção. Por exemplo doença neovascular ocular, degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética, retinopatia de prematuridade, rejeito de enxerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasias retrolentais e outras doenças associadas com a neovascularização córnea ou neovascularização retinal/coroidal, como descrito mais abaixo.
Os agentes terapêuticos da presente invenção podem deste modo ser empregados com vantagem na preparação de composições farmacêuticas adequadas para uso como soluções oftálmicas incluindo aquelas para a administração intravitreal e/ou intracameral. Para o tratamento de qualquer um dos distúrbios acima ou outras desordens, os agentes terapêuticos administrados ao olho ou olhos do paciente que necessitasse do tratamento na forma de um preparado oftálmico preparado de acordo com prática farmacêutica convencional, veja, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a. Edição, páginas 1488 a 1501 (Mack Publishing Co., Easton, PA). O preparado oftálmico conterá um agente terapêutico numa concentração de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1% em peso, de preferência de aproximadamente 0, 05 a aproximadamente 0,5% em uma solução, suspensão ou unguento 221 aceitável do ponto de vista farmacêutico. Alguma variação na concentração necessariamente ocorrerá, dependendo do composto especifico empregado, das condições do paciente a ser tratado e semelhantes, e a pessoa responsável pelo tratamento determinará a concentração mais adequada para o paciente individual. A preparação oftálmica se encontrará, de preferência, na forma de uma solução aquosa estéril contendo, se for desejado, ingredientes adicionais, tais como, conservantes, tampões, agentes de tonicidade, antioxidantes e estabilizantes, agentes não iônicos umectantes ou clarificantes, agentes intensificadores de viscosidade, por exemplo, e semelhantes.
Conservantes adequados para emprego em tal solução incluem cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, clorobutanol, timerosal e análogos. Tampões adequados incluem ácido bórico, bicarbonato de sódio e de potássio, boratos de sódio e de potássio, carbonato de sódio e de potássio, acetato de sódio, bifosfato de sódio e análogos, em quantidades suficientes para manter o pH entre aproximadamente pH 6 e pH 8, e de preferência, entre aproximadamente pH 7 e pH 7,5. Agentes de tonicidade adequados são dextran 40, dextran 70, dextrose, glicerina, cloreto de potássio, propilenoglicol, cloreto de sódio e semelhantes, de modo tal que o cloreto de sódio equivalente da solução oftálmica se encontra na faixa de 0,9 mais ou menos 0,2%.
Os antioxidantes e estabilizantes adequados incluem bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, tiosulfito de sódio, tiouréia e semelhantes. Agentes umectantes e clarificantes adequados incluem polissorbato 80, polissorbato 20, poloxâmero 282 e tiloxapol. Agentes intensificadores de viscosidade adequados incluem dextran 222 40, dextran 70, gelatina, glicerina, hidroxietilcelulose, hidroximetilpropilcelulose, lanolina, metilcelulose, petrolato, polietilenoglicol, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose e semelhantes. O preparado oftálmico será administrado topicamente ao olho do paciente que tem necessidade do tratamento por métodos convencionais, na forma de gotas, por exemplo, ou por banho do olho em solução oftálmica. J5. Preparados Tópicos
No sentido mais amplo, os preparados para a administração tópica incluem aqueles para fornecimento por via bucal ou pela pele. "Sistemas de fornecimento tópico" também incluem emplastros transdérmicos contendo o ingrediente a ser administrado. O fornecimento através da pele pode ainda ser atingido por iontoforese ou por eletrotransporte, se for desejado.
Preparados adequados para a administração tópica na boca incluem pastilhas compreendendo os ingredientes em uma base flavorizada, geralmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte tais como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia; e enxágues bucais compreendendo o ingrediente a ser administrado em um veiculo liquido adequado.
Os preparados adequados para a administração tópica à pele incluem unguentos, cremes, géis e pastas compreendendo o ingrediente a ser administrado em um veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico. O preparado de agentes terapêuticos para uso tópico, tal como em cremes, unguentos e géis incluem a preparação de bases de unguentos oleaginosas ou hidrossolúveis, conforme é do conhecimento 223 dos peritos na técnica à luz da presente descoberta. Por exemplo, estas composições podem incluir óleos vegetais, gorduras animais e mais preferivelmente, hidrocarbonetos semi-sólidos obtidos de petróleo. Componentes específicos usados podem incluir unguento branco, unguento amarelo, cera de cedeu ésteres, ácido oléico, óleo de oliva, parafina, petrolato, petrolato branco, espermacete, glicerina de amido, cera branca, cera amarela, lanolina, lanolina acedera e monoestearato de glicerina. Diversas bases para unguento hidrossolúveis podem também ser usadas, incluindo-se éteres glicólico e derivados, polietilenoglicóis, estearato de polioxil 40 e polisorbatos.
Os preparados para a administração retal podem ser apresentados em forma de um supositório com uma base adequada compreendendo, por exemplo, manteiga de cacau ou um salicilato. Preparado adequados para a administração vaginal podem ser apresentados em forma de pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou preparados pulverizáveis contendo além do ingrediente ativo tais veículos que são conhecidos na técnica como sendo adequados. J6. Preparados Nasais
Fornecimento local através das vias nasal e respiratória é contemplado para o tratamento de diversas condições, particularmente para uso nos métodos de tratamento antivirais da presente invenção. Estas vias de fornecimento são também adequadas para o fornecimento de agentes à circulação sistémica. Os preparados dos ingredientes ativos em veículos adequados para a administração nasal são, portanto, também incluídos na invenção, soluções nasais, pulverizações, aerossóis e inalantes, por exemplo. Nos casos 224 em que o veículo é um sólido os preparados incluem um pó grosseiro tendo uma granulometria na faixa de 20 a 500 mícrons, por exemplo, sendo administrados por inalação rápida, por exemplo, através da passagem nasal de um recipiente com o pó mantido próximo ao nariz.
Preparados adequados, em que o veículo é um líquido são úteis na administração nasal. As soluções nasais são geralmente soluções aquosas destinadas a serem administradas às passagens nasais em gotas ou pulverizações e são preparadas de modo tal que elas sejam análogas em muitos sentidos às secreções nasais, para ser mantida a ação ciliar normal. Portanto, as soluções nasais aquosas geralmente são isotônicas e ligeiramente tamponadas para ser mantido um pH de 5,5 a 6,5. Além disso, podem ser incluídos no preparado conservantes antimicrobianos, análogos aos empregados nos preparados oftálmicos, e estabilizadores adequados de medicamentos, se necessário. Diversos preparados nasais comerciais são conhecidos e incluem, por exemplo, antibióticos e anti-histaminas e são usados para as profilaxia da asma.
Inalações e inalantes são preparados farmacêuticos destinados a fornecer um medicamento ou composto à árvore respiratória de um paciente. Um vapor ou neblina é administrado e atinge a área afetada. Esta via pode também ser empregada para fornecer agentes à circulação sistémica. As inalações podem ser administradas por vias respiratórias nasal ou oral. A administração de soluções de inalação somente é eficaz se as gotículas forem suficientemente pequenas e de tamanho uniforme de modo que a neblina atinja os bronquíolos. 225
Um outro grupo de produtos, também conhecidos como inalações e às vezes denominadas insuflações, compreendem medicamentos finamente pulverizados ou líquidos que são levados para dentro das passagens respiratórias por emprego de sistemas de fornecimento especiais, tais como os aerossóis farmacêuticos que têm uma solução ou suspensão do medicamento em um propelente de gás liquefeito. Quando liberada através de uma válvula adequada e adaptador oral, uma dose medida da inalação é impelida para dentro do trato respiratório do paciente. A granulometria é de importância capital na administração deste tipo de preparação. Foi relatado que a granulometria ótima para penetração na cavidade pulmonar seria da ordem de 0,5 a 7 μιη. Neblinas tênues são produzidas por aerossóis comprimidos e por este motivo é considerado vantajoso. K Kits Terapêuticos e de diagnóstico
Esta invenção também propõe kits terapêuticos e de diagnóstico compreendendo pelo menos um primeiro agente terapêutico da presente invenção, por exemplo, um anticorpo, imunoconjugado ou peptídio conjugado que se liga a aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, para uso em métodos de tratamento, métodos de tratamento combinado e/ou em modalidades de visualização e tratamento. Tais kits geralmente conterão, em meios de recipientes adequados, um preparado aceitável do ponto de vista farmacêutico de pelo menos um agente terapêutico, anticorpo, imunoconjugado ou peptídio conjugado que se liga a aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico. Os kits podem também conter instruções escritas ou eletrónicas para uso em, por exemplo, modalidades pré-clínicas, clínicas e/ou veterinárias. 226
Os kits podem também conter outras composições, formulações farmaceuticamente aceitáveis e segundos agentes biológicos e terapêuticos, incluindo aqueles para terapia combinada e/ou para diagnóstico e visualização. Por exemplo, tais kits podem conter qualquer um ou mais de uma gama de agentes quimioterapêuticos, radioterapêuticos ou antiangiogênicos, anticorpos anticélulas tumorais, antivasculatura tumoral ou antiestromas tumorais, imunotoxinas ou coaguligantes, agentes antivirais e/ou componentes diagnósticos ou agentes. Instruções escritas ou eletrónicas para uso em terapias combinadas e/ou para diagnose e visualização podem também ser incluídos.
Os kits podem ter um único Container que contém o primeiro anticorpo, imunoconjugado ou peptídio conjugado que se liga a um aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, com ou sem quaisquer componentes adicionais, ou eles podem ter contêineres distintos para cada agente desejado. A cada terapia combinada é fornecida, uma única solução pode ser pré-misturada, seja numa combinação equivalente molar, seja com um componente em excesso em relação ao outro. Alternativamente, o agente terapêutico primário da invenção e o segundo agente biológico ou terapêutico, tal como um segundo agente anticâncer ou antiviral, kit pode ser mantido separadamente em contêineres distintos do kit antes da administração ao paciente.
Quando os componentes do kit são fornecidos em uma ou mais soluções líquidas, a solução líquida é preferencialmente uma solução aquosa, com uma solução aquosa estéril sendo particularmente preferida. Entretanto, os componentes do kit podem ser fornecidos como pó(s) seco(s). Quando os reagentes ou componentes são fornecidos como um pó 227 seco, o pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado. 0 solvente pode também ser fornecido em outro Container com o kit.
Os containeres dos kits terapêuticos e de diagnóstico geralmente incluem pelo menos um frasquinho, tubo de teste, frasco, garrafa, seringa ou outro Container ou formas de containeres, dentro dos quais o agente terapêutico e qualquer outro desejado são colocados e, preferencialmente, aliquotados de forma adequada. Como pelo menos dois componentes separados são preferidos, os kits irão preferencialmente incluir pelo menos dois tais containeres. Os kits podem também compreender um terceiro ou quarto Container para contr um tampão estéril farmaceuticamente aceitável ou outro diluente.
Os kits podem também conter formas pelas quais administrar os agentes terapêuticos para um animal ou paciente, por exemplo, uma ou mais agulhas ou seringas, ou mesmo um conta-gotas, pipeta, ou outros aparatos semelhantes, a partir dos quais as formulações possam ser injetadas no animal ou aplicadas a uma área doente do corpo. Os kits da presente invenção irão também tipicamente incluir formas para acomodar os frasquinhos, ou algo semelhante, e outro componente, em confinamento hermético para venda comercial, tal como, por exemplo, injeção ou containeres de plástico moldados dentro dos quais os frasquinhos desejados e outros aparatos são colocados e retidos. L. Imunodetecção e visualização A presente invenção fornece ainda métodos de diagnóstico e visualização in vivo e in vitro. Tais métodos são aplicáveis para uso na geração de informação de 228 diagnóstico, prognóstico e/ou visualização, por exemplo, relacionado com doenças angiogênicas e infecções virais, e preferencialmente relacionadas a métodos de tratamento tumoral e de visualização. Os métodos da invenção incluem testes diagnósticos in vitro, por exemplo, onde as amostras podem ser obtidas de forma não-invasiva e preferencialmente testadas em ensaios altamente testados do inicio ao fim e/ou onde o diagnóstico clinico equivocado e a confirmação é desejada. No campo da diagnose e visualização in vivo, os anticorpos e peptídios da invenção são ligados a um ou mais agentes detectáveis e usados para formar uma imagem de um sitio angiogênico ou tumor, opcionalmente como o primeiro passo anterior ao tratamento. A invenção então diz respeito a métodos de imunodetecção para ligação, purificação, quantificação ou de outra forma geralmente detectando aminofosfolipidios e fosfolipídios aniônicos, por exemplo, para uso na diagnose de células ativadas e apoptóticas e doenças associadas. Os anticorpos da presente invenção, tais como 9D2 e 3G4 (ATCC 4545), podem ser empregados para detectar aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos in vivo (ver abaixo), em amostras de tecidos isolados, biópsias ou esfregaços e/ou em amostras homogeneizadas de tecidos. Tais métodos de imunodetecção têm utilidade diagnóstica evidente, mas também tem aplicações a amostras não-clínicas, tais como na titulação de amostras de antígenos, e semelhantes.
Os passos de vários métodos de imunodetecção úteis tem sido descritos na literatura científica, tais como, por exemplo, Nakamura et al., 1987, especificamente incorporada aqui por referência. Em geral, os métodos de imunoligações incluem a obtenção de uma amostra suspeita de conter 229 aniônicos, aminofosfolipídios e/ou fosfolipídios preferencialmente células suspeitas de ter aminofosfolipídios e/ou fosfolipídios aniônicos na superfície celular, e contatando a amostra com um anticorpo da invenção, tal como 9D2 e 3G4 (ATCC 4545) , sob condições eficazes para permitir a formação de complexos imunes. Quaisquer complexos imunes formados durante o processo de ligação são então detectados e preferencialmente quantificados. A amostra analisada pode ser uma amostra celular, tais como células expostas a certas condições teste no laboratório. A amostra pode ser também uma amostra biológica de um animal ou paciente, por exemplo, um suspeito de ter uma doença associada com ativação ou apoptose de um ou mais tipos celulares. Uma amostra tal pode ser uma amostra de seção tecidual ou espécie, uma biópsia, um swab ou esfregaço, um extrato de tecido homogeneizado ou separado ou formas purificadas suas formas
Fazendo o contato da amostra biológica escolhida com o anticorpo sob condições efetivas e por um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes (complexos imunes primários) é geralmente uma questão de simplesmente adicionar o anticorpo à amostra e incubar a mistura por um período de tempo longo o suficiente para os anticorpos formarem complexos imunes com, i.e., para ligar a qualquer aminofosfolipídio e/ou fosfolipídio aniônico presente. Após esse tempo, a composição amostra-anticorpo, tal côo uma seção de tecido ou placa de ELISA, irá geralmente ser lavado para remover qualquer espécie de anticorpo ligado de forma não-específica, permitindo que 230 somente os anticorpos ligados especificamente com os complexos imunes primários sejam detectados. A detecção da formação de imunocomplexos é bem conhecida na técnica e pode ser alcançada através da aplicação de numerosos caminhos. Esses métodos são geralmente baseados na detecção de um indicador ou marcador, tal como qualquer etiqueta ou indicador radioativo, fluorescente, biológico ou enzimático conhecido na técnica. Patentes Americanas envolvendo o uso de tais marcadores incluem 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350, 3.996.345, 4.277.437, 4.275.149 e 4.366.241. O uso de enzimas que geram um produto colorido em contato com um substrato cromogênico são geralmente preferidos. Ligantes secundários que se ligam, tais como um anticorpo secundário ou um arranjo que se liga de um ligante biotina/avidina, podem também ser usados, como é conhecido na técnica.
Os anticorpos da invenção, tais como 9D2 e 3G4 (ATCC 4545), empregados na detecção podem eles mesmos ser ligados a uma marca detectável, onde alguém poderia simplesmente detectar essa marca, permitindo então a determinação da quantidade de complexos imunes primários na composição.
Preferencialmente, os complexos imunes primários são detectados através de um ligante secundário que se liga e que tem afinidade de ligação para os anticorpos da invenção. Em tais casos, o ligante secundário que se liga pode ser ligado a um marcador detectável. O ligante secundário que se liga é geralmente ele mesmo um anticorpo, e pode então ser denominado um anticorpo "secundário". Os complexos imunes primários são contatados com o ligante secundário marcado que se liga, ou anticorpo, sob condições efetivas e por um 231 período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes secundários. Os complexos imunes secundários são então geralmente lavados para remover qualquer ligação não-específica de anticorpos ou ligantes, e o marcador remanescente nos complexos imunes secundários é então detectado.
Outros métodos incluem a detecção de complexos imunes primários por um caminho de dois passos. Um segundo ligante que se liga, tal como um anticorpo, que tem afinidade de ligação para o primeiro anticorpo é usado para formar complexos imunes secundários, como descrito acima. Após a lavagem, os complexos imunes secundários são contatados com um terceiro ligante que se liga ou anticorpo que tem afinidade de ligação para o segundo anticorpo, novamente sob condições efetivas e por um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes (complexos imunes terciários). 0 terceiro ligante ou anticorpo é ligado a um indicador detectável, permitindo a detecção dos complexos imunes terciários então formados. Esse sistema pode prover para a amplificação de sinal, se desejado.
Diagnose ou monitoração clínica pode ser aplicada a pacientes com uma variedade de doenças, particularmente aquelas associadas com exposição aumentada de aminofosfolipídio e/ou fosfolipídio aniônico na superfície celular. A detecção de um aminofosfolipídio e/ou fosfolipídio aniônico, ou um aumento nos níveis de um aminofosfolipídio ou fosfolipídio aniônico, em comparação com os níveis em uma amostra biológica correspondente de um indivíduo normal, é indicativa de um paciente com uma doença deste tipo. 232
Entretanto, como é conhecido dos indivíduos versados na técnica, um tal diagnóstico clínico não poderia ser feito tomando-se como base este método somente. Aqueles indivíduos versados na técnica são muito familiarizados com a diferenciação entre expressão significativa de um biomarcador, o qual representa uma identificação positiva, e expressão em baixo nível ou em segundo plano de um biomarcador. Realmente, níveis de expressão em segundo plano são geralmente usados para formar um "atalho" acima com mancha aumentada será contabilizada como significante ou positiva. L2. Visualização in vivo.
Nessas modalidades, anticorpos e peptídios, preferencialmente os anticorpos da invenção, tais como os anticorpos 9D2, 3G4 (ATCC 4545) e semelhantes, são operativamente fixados, ligados ou conjugados a uma marca detectável. "Marcas detectáveis" são compostos ou elementos que podem ser detectados devido a suas propriedades funcionais específicas, ou características químicas, o uso dos quais permite ao componente ao qual eles estão fixados ser detectado, e ainda quantificado, se desejado. Em conjugados peptídicos e anticorpos para protocolos de diagnóstico in vivo ou "métodos de visualização", as marcas podem ser detectadas usando-se métodos não-invasivos.
Muitos agentes de visualização apropriados são conhecidos na técnica, assim como são métodos para sua fixação a anticorpos e ligantes que se ligam (ver, por exemplo, Patentes Americanas números 5.021.236 e 4.472.509). Certos métodos de fixação envolvem o uso de complexo quelato metálico empregando, por exemplo, um agente quelante 233 orgânico tal como DTPA fixado ao anticorpo (Patente Americana número 4.472.509). Anticorpos monoclonais podem também reagir com uma enzima na presença de um agente acoplador tal como glutaraldeido ou periodato. Conjugados com marcadores de fluoresceina são preparados na presença desses agentes acopladores ou por reação com isotiocianato.
Um exemplo de marcas detectáveis são os ions paramagnéticos. Nesse caso, ions adequados incluem cromo (III), manganês (II), ferro (III), cobalto (II), níquel (II) , cobre (II), neodímio (III), samário (III), itérbio (III) , gadolínio (III), vanádio (II), térbio (III), disprósio (III), hólmio (III) e érbio (III), com o gadolínio sendo particularmente preferido. íons úteis em outros contextos, tais como visualização por raio-X, incluem mas não são limitados a lantânio (III), ouro (III), chumbo (II), e especialmente bismuto (III). Marcas fluorescentes incluem rodamina, fluoresceina e renografina. Rodamina e fluoresceina são geralmente ligados via um intermediário de isotiocianato.
No caso de isótopos radioativos para aplicações de diagnóstico, exemplos adequados incluem 14carbono, 51cromo, 36cloro, 57cobalto, 58cobalto, cobre67, 152Eu, gálio67, 3hidrogênio, iodo123, iodo125, iodo131, índio111, 59ferro, 32fósforo, rênio186, rênio188 , 75selênio, 35enxofre, tecnécio99m e yttrium90 . 125I é tem sido geralmente preferido para uso em certas modalidades, e tecnécio99m e índio111 são também geralmente preferidos devido à sua baixa energia e adequabilidade para detecção de longa faixa.
Anticorpos marcados radioativamente e peptídios para uso na presente invenção podem ser produzidos de acordo com 234 métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, grupos funcionais intermediários que são geralmente usados para ligar ions metálicos radioisotópicos a anticorpos são ácido dietilenotriaminopentacético (DPTA) e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
Anticorpos monoclonais podem também ser iodizados por contato com iodeto de sódio ou potássio e um agente químico oxidante tal como hipoclorito de sódio, ou um agente enzimático oxidante, tal como lactoperoxidase. Anticorpos antitumorais de acordo com a invenção podem ser marcados com tecnécio-99 por um processo de troca de ligante, por exemplo, pela redução de pertecnato com solução estanosa, quelando o tecnécio reduzido em uma coluna Sephadex e aplicando o anticorpo a essa coluna. Técnicas de marcação diretas são também adequadas, por exemplo, por incubação de pertecnato, um agente redutor tal como SNCI2, uma solução tampão tal como solução de ftalato de sódio-potássio, e o anticorpo.
Os isótopos de ressonância magnética nuclear tais como o gadolinium são detectados usando um dispositivodo de imagiologia magnética nuclear e substancias readioactivas tais como techniciurn99m ou índio111 que são detectados usando uma câmara ou detector de cintilação. A Patente U.S. n° 5.627.036 proporciona uma orientação adicional relativamente à introdução segura e eficaz de contrutos tituláveis no sangue de um indivíduo e meios para determinar a distribuição do agente titulado no exterior do corpo, por exemplo, usando uma câmara de cintilação gama ou por medição das ressonâncias magnéticas. L3. Marcador substituto para a terapia de câncer 235
Em consideração ao diagnóstico in vivo e visualização, a presente invenção fornece além disso composições e métodos para uso como um marcador substituto para terapia de câncer. Tais modalidades envolvem o uso de um anticorpo que se liga a um aminofosfolipidio e/ou fosfolipidio aniônico, preferencialmente PS, e mais preferencialmente ao uso de anticorpos 9D2 e 3G4 (ATCC 4545) ou anticorpos competidores, ligados a um agente detectável in vivo.
Muitas terapias anticâncer em uso corrente induzem apoptose e necrose. aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos, particularmente PS, são marcadores de células pré-apoptóticas e apoptóticas. Então, visualização com um anticorpo adequado, preferencialmente 9D2, 3G4 (ATCC 4545) ou anticorpos competidores, pode ser usado para identificar células pré-apoptóticas e apoptóticas e então fornecer informação considerando o progresso da terapia. Isto é o que o significado de "marcador substituto para a terapia de câncer", como usado aqui. 0 uso dos anticorpos da invenção, preferencialmente aqueles compreendendo os anticorpos 9D2 e 3G4 (ATCC 4545) ou anticorpos competidores com propriedades semelhantes, fornecem vantagens particulares como marcadores substitutos para terapia de câncer. Por exemplo, a capacidade de identificar células pré-apoptóticas é uma vantagem particular. A especificidade dos anticorpos também fornecerá dados de visualização com maior sentido para o clínico. Também, o perfil de segurança desses anticorpos é impressivo e fornece vantagens sobre a anexina, por exemplo, e anexina sofre de desvantagens associadas com a coagulação. 236
Em acordo, qualquer um métodos e diagnóstico e de visualização in vivo descritos acima podem ser adaptados para uso prognóstico como marcador substituto para terapia de câncer simplesmente pelo uso em um paciente passando por terapia de câncer. M. Tratamento tumoral.
Aspectos importantes da presente invenção envolvem o tratamento de malignidades, tumores e tumores vascularizados. Isso inclui tumores nos quais a angiogênese é mais ou menos importante e tumores apresentando vasos sanguíneos protrombóticos. 0 tratamento de tumores benignos é induzido na invenção, tal como neuroma acústico, neurofibroma, tracoma, granulomas piogênicos e BPH. 0 tratamento de tumores de origem sanguínea, tais como leucemias, e várias doenças agudas ou crónicas da medula óssea é também incluído. A presente invenção é amplamente aplicável ao tratamento de qualquer tumor maligno, quer apresentando um componente vascular ou não. Tumores para tratamento incluem tumores sólidos, particularmente carcinomas, os quais requerem um componente vascular para o fornecimento de oxigénio e nutrientes. Tumores sólidos exemplares que podem ser tratados usando a invenção incluem, mas não são limitados a, carcinomas do pulmão, mama, ovário, estômago, pâncreas, laringe, esófago, testículos, fígado, parótida, trato biliar, colo, reto, colo de útero, útero, endométrio, rim, bexiga, próstata, tiróide, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, carcinomas de pequenas células, melanomas, gliomas, glioblastomas, neuroblastomas e análogos. 237 A presente invenção é contemplada para o uso no tratamento de qualquer paciente que esteja com um tumor sólido. Em geral, a invenção pode ser usada para tratar tumores de todos os tamanhos, incluindo aqueles de cerca de 0,3 - 0,5 cm e acima, tumores de mais do que 0,5 cm em tamanho e pacientes que possuam tumores de entre cerca de 1,0 e de cerca de 2,0 cm em tamanho, embora tumores deste tamanho e incluindo os tumores maiores encontrados em humanos podem também ser tratados.
Embora a presente invenção não é geralmente planejada como um tratamento preventivo ou profilático, o uso da invenção não é certamente confinado ao tratamento de pacientes com tumores de tamanhos somente moderados ou grandes. Existem muitas razões subjacentes a esses aspectos da invenção. Por exemplo, um paciente apresentando estar com tumor primário de tamanho moderado ou acima pode também ter vários outros tumores metastáticos que são considerados como sendo de tamanho pequeno ou mesmo nos estágios primários de espalhamento de tumor metastático. Dado que os anticorpos antiaminofosfolipidios ou anti-fosfolipidios aniônicos dos derivados Peptídios que se ligam à PE, ou combinações, da invenção são geralmente administrados na circulação sistémica de um paciente, eles irão ter naturalmente efeitos nos tumores metastáticos secundários e menores, embora isso não seja a intenção primária do tratamento. Além disso, mesmo em situações onde a massa tumoral como um todo é um único pequeno tumor, certos efeitos benéficos antitumorais resultarão do uso dos presentes tratamentos. A orientação fornecida aqui considerando os pacientes adequados para uso juntamente com a presente invenção é planejado como ensino de que certos perfis de pacientes 238 podem auxiliar com a seleção de pacientes para tratamento com a presente invenção. A pré-seleção de certos pacientes, ou categorias de pacientes, não nega de forma alguma a utilidade básica da presente invenção em conjunto com o tratamento de todos os pacientes com câncer. Uma outra consideração é o fato de que a investida no tumor fornecida pela terapia anticorporal da invenção pode predispor o tumor a tratamentos terapêuticos adicionais, tal como o tratamento subsequente resulta em efeito sinergistico em toda a parte ou mesmo leva à total remissão ou cura. Não se acredita que qualquer tipo particular de tumor deveria ser excluído de tratamento usando a presente invenção. Entretanto, o tipo de células tumorais podem ser relevantes para o uso da invenção em conjunto com agentes terapêuticos terciários, particularmente imunotoxinas de células antitumorais e quimioterapêuticos. Como a presente invenção inclui intimamente seus modos de ação de marcação e destruição da vasculatura tumoral, e como a vasculatura é substancialmente ou totalmente a mesma em todos os tumores sólidos, será entendido que a presente metodologia é amplamente ou completamente aplicável ao tratamento de todos os tumores sólidos, não considerando o fenótipo ou genótipo particular das próprias células tumorais. Os dados apresentados aqui são atrativos e apresentam resultados impressivos em uma grande variedade de diferentes modelos tumorais.
Doses terapeuticamente eficientes são prontamente determináveis usando informações de um modelo animal, como apresentado nos estudos detalhados aqui, e de dados clínicos usando uma variedade de agentes terapêuticos. Animais experimentais com tumores sólidos são frequentemente usados 239 para otimizar doses terapêuticas apropriadas antes de mudar para um ambiente clinico. Tais modelos são conhecidos como sendo muito confiáveis na previsão de estratégias anticâncer eficientes. Por exemplo, camundongos com tumores sólidos, tais como os usados nos Exemplos, são amplamente usados em testes pré-clinicos. Os inventores tem usado tais modelos de camundongos aceitos na arte para determinar faixas trabalháveis de agentes terapêuticos que fornecem efeitos antitumorais benéficos com mínima toxicidade.
Em termos de terapia tumoral, tendo em mente que os benefícios de segurança criados associados com a invenção como um todo, alguém pode se referir à literatura científica e de patente no sucesso de usar outras terapias antivasculares. Como forma de exemplo, a Patente Americana números 5.855.866, 5.877.289, 5.965.132, 6.051.230, 6.004.555, 5.776.427, 6.004.554, 6.036.955 e 6.093.399 descrevem além disso o uso de tais agentes como podem ser aplicados a aqueles da presente invenção. Patentes Americanas números 6.312.694 e 6.406.693 proporcionam uma guia para a dosagem e tratamento usando anticorpos não-conjugados para PS e PE e imunoconjugados relacionados.
Como é conhecido na técnica, existem objetivos realísticos que podem ser usados como linha de base juntamente com testagens pré-clínicas antes de proceder ao tratamento clínico. Entretanto, devido à segurança já demonstrada em modelos aceitáveis, testagens pré-clínicas da presente invenção serão mais um caso de otimização, ao invés de confirmação de eficiência. Então, testagem pré-clínica pode ser empregada para selecionar os agentes, doses ou combinações mais vantajosas. 240
Uma dose de anticorpo, método combinado ou medicamento que resulta em qualquer efeito antitumoral consistentemente detectável, incluindo regressão de tumores da vasculatura detectáveis, trombose e/ou destruição e necrose tumoral, irá ainda definir uma invenção útil. Efeitos regressivos, trombóticos, destrutivos e necróticos devem preferencialmente ser observados entre cerca de 10% e cerca de 40-50% dos vasos sanguíneos tumorais e tecidos tumorais, acima de cerca de entre 50% e cerca de 99% de tais efeitos sendo observados. A presente invenção pode também ser eficiente contra vasos a justante do tumor, i.e., marcar pelo menos um subgrupo dos vasos de drenagem, particularmente com citocinas liberadas do tumor estarão agindo nesses vasos, mudando seu perfil antigênico.
Também será entendido que mesmo em tais circunstâncias onde os efeitos antitumorais da terapia são em direção ao terminal inferior desta faixa, pode ser que essa terapia ainda seja igual ou mesmo mais eficiente do que quaisquer outras terapias conhecidas no contexto do tumor particular. É infelizmente evidente para um clínico que certos tumores não podem ser efetivamente tratados a médio ou longo prazo, mas isso não nega a utilidade da prsente terapia, particularmente onde ela é pelo menos tão eficiente quanto outras estratégias geralmente propostas.
Na arte de criar doses apropriadas de anticorpos antiaminofosfolipídios ou anti-fosfolipídios aniônicos, derivados de peptídios que se ligam a PE ou terapêuticas combinadas para o tratamento de tumores vascularizados, alguém poderia prontamente extrapolar dos estudos a partir de animais descritos aqui para chegar em doses apropriadas para administração clínica. Para alcançar essa conversão, 241 alguém poderia tomar em consideração para a massa de agentes administrados por unidade de massa do animal experimental e, preferencialmente, tomar em consideração para as diferenças na área superficial do corpo entre o animal experimental e o paciente humano. Todos tais cálculos são bem conhecidos e rotineiros para aqueles indivíduos normalmente versados na técnica.
Por exemplo, ao tomar as doses bem sucedidas de terapêuticos usadas no estudo de camundongo, e aplicar cálculos padrão baseados em massa e área superficial, doses eficazes de agentes para pacientes humanos poderiam estar entre cerca de 1 mg e cerca de 500 mg de anticorpo por paciente, e preferencialmente, entre cerca de 10 mg e cerca de 100 mg de anticorpo por paciente.
Em acordo, usando essa informação, os inventores contemplaram que doses baixas úteis para administração humana serão de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou de cerca de 30 mg ou algo próximo por paciente; e doses altas úteis para administração humana serão de cerca de 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 ou de cerca de 500 mg ou algo próximo por paciente. Doses intermediárias úteis para administração humana são contempladas como sendo de cerca de 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 ou de cerca de 225 mg ou algo próximo por paciente. Em geral, faixa de doses de entre cerca de 5-100 mg, cerca de 10-80 mg, cerca de 20-70 mg, cerca de 25-60 mg, ou cerca de 30-50 mg por paciente serão preferidas. Entretanto, qualquer faixa particular usando qualquer uma das doses exemplares relatadas precedentemente ou qualquer valor intermediário entre as faixas particulares estabelecidas é contemplada. 242 Não obstante as faixas estabelecidas, será entendido que, dados os parâmetros e orientação detalhada apresentadas aqui, outras variações nas faixas ativas ou ótimas serão incluídas na presente invenção. Será então entendido que doses mais baixas podem ser mais apropriadas em combinação com certos agentes, e que altas doses podem ainda ser toleradas, particularmente dada a segurança aumentada da presente invenção. 0 uso de anticorpos humanos ou humanizados e efetores humanos confere à presente invenção ainda mais segurança para uso clínico, reduzindo além disso as chances de toxicidade significante ou efeitos colaterais em tecidos saudáveis. A intenção de regimes terapêuticos da presente invenção é geralmente para produzir efeitos antitumorais significantes enquanto ainda mantém-se a dose abaixo dos níveis associados com toxicidade não-aceitável. Além da variação da dose propriamente dita, o regime de administração pode também ser adaptado para otimizar a estratégia do tratamento. Uma estratégia de tratamento atualmente preferida é a administração entre cerca de 1-500 mg, e preferencialmente, entre cerca de 10-100 mg do anticorpo, ou coquetel terapêuico contendo de tal maneira, cerca de 3 vezes dentro de um período de cerca de 7 dias. Por exemplo, doses serão dadas em cerca do dia 1, dia 3 ou 4 e dia 6 ou 7.
Na administração de doses particulares deles próprios, alguém poderia preferencialmente fornecer uma composição farmaceuticamente aceitável (de acordo com os padrões do FDA de esterilidade, pirogenicidade, pureza e segurança geral) ao paciente sistematicamente. Injeção intravenosa é geralmente preferida, e o método mais preferido é o emprego 243 de uma infusão contínua por um período de tempo de cerca de 1 ou 2 horas ou algo próximo. Embora isso não seja necessário para determinar tais parâmetros antes do tratamento usando a presente invenção, deveria ser notado que os estudos detalhados aqui resultam em pelo menos alguma trombose sendo observada especificamente nos vasos sanguíneos de um tumor sólido dentro de cerca de 12-24 horas da injeção, e que as próprias células tumorais começam a morrer dentro de cerca de 24 a 72 horas. Necrose tumoral difundida é geralmente observada nas próximas cerca de 48-96 horas, até e incluindo necrose maior do que 60% sendo observada.
Naturalmente, antes do uso difundido, testes clínicos serão conduzidos. Os vários elementos de condução de um teste clínico, incluindo o tratamento e monitoração do paciente, serão conhecidos dos indivíduos versados na técnica à luz da presente descoberta. A seguinte informação está sendo apresentada como um guia geral para uso no estabelecimento de tais testes.
Pacientes escolhidos para os primeiros estudos do tratamento terão falhado na resposta a pelo menos um processo da terapia convencional, e terá a doença mensurável objetivamente conforme determinado por exames físicos, técnicas de laboratório e/ou procedimentos terapêuticos. Qualquer quimioterapia deveria ter sido interrompida pelo menos 2 semanas antes de entrar no estudo. Onde anticorpos monoclonais de murina ou porções de anticorpo são empregadas, os pacientes não devem ter histórico de alergia à imunogloblina de camundongo. 244
Certas vantagens serão encontradas no uso de um cateter localizado na no centro da veia com uma abertura tripla de lúmen. A terapêutica deve ser filtrada, por exemplo, usando um filtro de 0,22 μ, e diluido apropriadamente, como com salina, a um volume final de 100 mL. Antes do uso, a amostra teste também deve ser filtrada de forma semelhante, e sua concentração obtida antes e após a filtração pela determinação do A280. A recuperação esperada deve estar na faixa de 87% a 99%, e ajustes para perda de proteína podem ser então calculados.
As construções podem ser administradas por um período de aproximadamente 4-24 horas, com cada paciente recebendo 2-4 infusões em intervalos de 2-7 dias. Administração pode também ser feita por um grau fixo de infusão por um período de 7 dias. A infusão dada em qualquer nível de dose deve ser dependente em qualquer toxicidade observada. Então, se Grau II de toxicidade for alcançado após uma única infusão qualquer, ou em um período de tempo particular para uma infusão de grau contínuo, outras doses devem ser evitadas ou a infusão de grau contínuo interrompida a não ser que a toxicidade melhore. Doses crescentes devem ser administradas a grupos de pacientes até aproximadamente 60% dos pacientes apresentarem toxicidade de Graus III ou IV inaceitável em qualquer categoria. Doses que são de 2/3 desse valor são definidas como a dose segura.
Exames físicos, medidas de tumor e testes de laboratório deve, é claro, ser feitos antes do tratamento e em intervalos de até 1 mês ou posterior. Testes de laboratório devem incluir completas contagens de sangue, creatinina sérica, creatinina quinase, eletrólitos, uréia, nitrogénio, SGOT, bilirrubina, albumina e proteína sérica 245 total. Amostras de soro tomadas em até 60 dias após o tratamento devem ser avaliadas por radioimunotestes para a presença da construção administrada, e anticorpos contra quaisquer porções relacionadas. Análises imunológicas do soro, usando qualquer teste padrão tal como, por exemplo, ELISA ou RIA, irá permitir a avaliação da farmacocinética e depuração da terapêutica.
Para avaliar as respostas antitumorais, os pacientes devem ser examinados de 48 horas a 1 semana e novamente em 30 dias após a última infusão. Quando doença evidente estava presente, dois diâmetros perpendiculares de todas as massas devem ser medidos diariamente durante o tratamento, dentro de 1 semana após a conclusão da terapia, e em 30 dias. Para medir doença não-evidente, varreduras CT seriais poderiam ser feitas em intervalos de 1 cm pelo peito, abdómen e pelve em 48 horas a 1 semana e novamente em 30 dias. Amostras de tecido devem também ser avaliadas histologicamente, e/ou por citometria de fluxo, usando biópsia dos dítios de doença ou mesmo amostras de sangue ou fluido se apropriado.
Respostas clinicas podem ser definidas por medição aceitável. Por exemplo, uma resposta completa pode ser definida pelo desaparecimento de todo tumor mensurável 1 mês após o tratamento. Considerando que uma resposta parcial pode ser definida por redução de 50% ou mais da soma de produtos da diâmetros perpendiculares de todos os nódulos tumorais estimados 1 mês após o tratamento, sem sitios de tumor apresentando alargamento. Semelhantemente, uma resposta mista pode ser definida por uma redução do produto de diâmetros perpendiculares de todas as lesões mensuráveis por 50% ou mais 1 mês após o tratamento, como progressão em um ou mais sitios. 246 À luz dos resultados de ensaios clínicos, tais como aqueles descritos acima, um tratamento de regime ainda mais preciso pode ser formulado. Mesmo assim, alguma variação na dosagem pode mais tarde ser necessária dependendo da condição do indivíduo a ser tratado. A resposta física para administração irá, à luz da presente descoberta, estar apta a determinar a dose apropriada para o indivíduo. Tal otimização e ajuste é rotineiramente feito na técnica, e de forma alguma reflete um resultado impróprio de experimentos. N. Terapias combinadas de tumor.
Os métodos de tratamento da presente invenção podem ser combinados com quaisquer outros métodos geralmente empregados no tratamento de um tumor, doença ou desordem em particular que o paciente exiba. Tão logo que uma aproximação terapêutica particular não seja conhecida a como sendo prejudicial à condição do paciente em si mesma, e não aja contra significantemente o tratamento antiaminofosfolipídio ou antifosfolipídio aniônico da invenção, essa combinação coma presente invenção é contemplada.
Terapia de combinação para doenças não-malignas é também contemplada. Um exemplo particular da tal é a hiperplasia prostática benigna (BPH), a qual pode ser tratada em combinação com outros tratamentos atualmente praticados na técnica. Por exemplo, marcação de imunotoxinas para marcadores localizados no BPH, tais como PSA.
Juntamente com o tratamento de tumor sólido, a presente invenção pode ser usada em combinação com tentativas clássicas, como cirurgia, quimioterapia, radioterapia,
citocina terapia, antiangiogênese e assim por diante. A 247 invenção então fornece terapias combinadas nas quais os anticorpos, imunoconjugados ou peptídio conjugados são usados simultaneamente com, antes ou após tratamento cirúrgico ou de radiação; ou são administrados a pacientes com, antes ou depois de agentes quimioterapêuticos ou radioterapêuticos convencionais, citocinas, agentes antiangiogênicos, agentes indutores de apoptose, imunotoxinas marcadas ou coaguligantes ou coisas do tipo. Muitos exemplos de agentes terapêuticos adequados têm sido descritos acima juntamente com os aspectos imunoconjugados da presente invenção. Qualquer um dos agentes inicialmente descritos para uso como uma parte do conjugado terapêutico podem também ser usados separadamente, em terapias de combinação da presente invenção.
Em termos de cirurgia, qualquer intervenção cirúrgica pode ser praticada juntamente com a presente invenção. Em conexão com radioterapia, qualquer mecanismo de indução de dano de DNA localmente por células tumorais é contemplado, tais como irradiação γ, raios-X, irradiação UV, microondas e mesmo emissões eletrónicas e semelhantes. A distribuição direta de radioisótopos a células tumorais é também contemplada, e isso pode ser usado juntamente com um anticorpo marcador ou outras formas de marcação. 0 uso geral de combinações de substâncias no tratamento de câncer é bem conhecido. Por exemplo, Patente Americana número 5.710.134 revela componentes que induzem necrose em tumores juntamente com substâncias não-tóxicas ou "pró-drogas". As enzimas liberadas por processos necróticos clivam a "pró-droga" não tóxica na droga "tóxica", a qual leva à morte celular tumoral. Também, Patente Americana número 5.747.469 revela o uso combinado de vetores virais 248 que codificam p53 e agentes danificadores do DNA. Qualquer tentativas semelhantes podem ser usadas com a presente invenção.
Quando um ou mais agentes são usados juntamente com os a terapêutica baseada em anticorpos, imunoconjugados e peptidios da presente invenção, não há requerimento para os resultados combinados serem aditivos dos efeitos observados quando cada tratamento é conduzido separadamente. Embora pelo menos efeitos aditivos são geralmente desejáveis, um efeito antitumoral aumentado em cima de uma das terapias individuais poderia ser benéfico. Também, não há requerimento particular para o tratamento combinado para exibir efeitos sinergisticos, embora é certamente possível e vantajoso. NI. Seleção de segundos agentes Anticâncer
Os "agente terapêuticos primários" da presente invenção, como usados aqui, são anticorpos antiaminofosfolipídios ou anti-fosfolipídios aniônicos, imunoconjugados ou derivados Peptidios que se ligam à PE e conjugados. Os "agentes terapêuticos secundários", como usados aqui, são segundos, agentes terapêuticos distintos ou agentes anticâncer, i.e., agentes terapêuticos ou agentes anticâncer "além dos" agentes terapêuticos primários. Qualquer agente terapêutico secundário pode ser usado em terapias de combinação da presente invenção. Também, agentes terapêuticos secundários ou "segundos agentes anticâncer" podem ser selecionados com uma visão para alcançar aditivos, maiores do que efeitos aditivos e potencialmente sinergisticos, de acordo com a seguinte orientação. 249
Para praticar terapia antitumor combinada, alguém poderia simplesmente administrar a um animal ou paciente uma terapia baseada em anticorpo antiaminofosfolipidio ou antifosfolipidio aniônico ou peptidio que se liga a PE da presente invenção juntamente com outra, i.e., um segundo, agente anticâncer distinto de uma forma eficiente para resultar nas suas ações combinadas antitumorais no animal ou paciente. Os agentes poderiam então ser fornecidos em quantidades eficientes e por períodos de tempo eficazes para resultar em sua presença combinada pelo tumor ou vasculatura tumoral e suas ações combinadas no ambiente tumoral. Para alcançar esse objetivo, as terapêuticas primárias da presente invenção e a segunda, agentes anticâncer distintos podem ser administrados ao animal substancialmente de forma simultânea, seja numa única composição, ou como suas composições distintas usando diferentes rotas de administração.
Alternativamente, a terapêutica baseada no anticorpo antiaminofosfolipidio ou antiaminofosfolipidio aniônico, imunocon jugado ou peptidio que se liga a PE da presente invenção pode preceder, ou seguir, o segundo, agente anticâncer distinto por, por exemplo, intervalos variando de minutos a semanas. Em certas modalidades onde as terapêuticas primárias da presente invenção e a segunda, agentes anticâncer distintos são aplicados separadamente ao animal, alguém poderia assegurar que um período de tempo significativo não expire entre o tempo de cada administração, d tal forma que cada agente ainda esteja apto a exercer um efeito combinado no tumor de forma vantajosa. Em tais exemplos, é contemplado que alguém poderia colocar em contato o tumor com ambos os agentes dentro de cerca de 5 minutos a cerca de uma semana de cada um e, 250 preferencialmente, dentro de cerca de 12-72 horas de cada um, com um tempo de atraso de apenas cerca de 12-48 horas sendo mais preferido.
Os agentes terapêuticos secundários para terapias de combinação em tempo separado podem ser selecionados baseando-se em certos critérios, incluindo aqueles discutidos abaixo. Entretanto, a preferência para selecionar um segundo ou mais, agentes anticâncer distintos para administração prévia ou subsequente não impede seu uso em administração substancialmente de forma simultânea, se desejado.
Segundo, agentes anticâncer distintos selecionados para administração "anterior" à administração de agentes terapêuticos primários da presente invenção, e projetados para alcançar efeitos aumentados e potencialmente sinergisticos, incluem agentes que induzem a expressão dos aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos pela vasculatura tumoral. Por exemplo, agentes que estimulam a produção localizada de cálcio, transportadores ativos de membrana que movem PS e outros fosfolipidios para a superfície externa da membrana plasmática, machucam o endotélio tumoral, causam alterações pré-apoptóticas e/ou induzem apoptose no endotélio tumoral irão geralmente resultar na expressão aumentada de aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos. Exemplos de tais agentes são o docetaxel e o paclitaxel. Os aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos podem então ser marcados usando-se um anticorpo da invenção, amplificando então o efeito terapêutico total, e também dando ataque aumentado via efetores hospedeiros (complemento, ADCC, fagocitose mediada por anticorpo, CDC). 251
Drogas que têm seletividade para células endoteliais angiogênicas, remodeladas ou ativadas, tais como estão presentes nos vasos sanguíneos tumorais, mas não em vasos sanguíneos normais latentes , podem também ser usado para causar seletivamente exposição do PS e outros fosfolipídios na superfície de células endoteliais do tumor. Exemplos de tais agentes são combretastatinas e docetaxel. Isso novamente poderia levar ao aumento da ligação de anticorpos e aumento da iniciação dos mecanismos efetores hospedeiros.
Segundo, agentes anticâncer distintos selecionados para administração "subsequente aos" agentes terapêuticos primários da presente invenção, e projetados para alcançar efeitos aumentados e potencialmente sinergísticos, incluem agentes que se beneficiam dos efeitos do agente terapêutico primário. A terapêutica baseada em anticorpo antiaminofosfolipídio ou antiaminofosfolipídio aniônico, imunoconjugado ou peptídio da presente invenção irá causar a destruição do tumor. Em concordância, segundos efetivos agentes anticâncer distintos para administração subsequente incluem agentes antiangiogênicos, os quais inibem metástase; agentes marcando células tumorais necróticas, tal como anticorpos específicos para antígenos intracelulares que ficam acessíveis de células malignas in vivo (Patentes Americanas números 5.019.368, 4.861.581 e 5.882.626); e agentes quimioterapêuticos e anti-imunoconjugados de células tumorais, as quais atacam quaisquer células tumorais que possam sobreviver na periferia.
Em algumas situações, pode ser desejável estender o período de tempo para tratamento significantemente, onde vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7), várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, ,7 ou 8) ou mesmo vários meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 252 ou 8) passam entre as respectivas administrações. Isso poderia ser vantajoso em circunstâncias onde um tratamento era planejado para destruir substancialmente o tumor, assim como o agente terapêuico primário da presente invenção, e outro tratamento foi planejado para prevenir a micrometástase ou novo crescimento tumoral, tal como a administração de um agente antiangiogênico. Antiangiogênicos devem ser administrados em um tempo exato após a cirurgia, entretanto, para permitir wound cura. Agentes antiangiogênicos podem então ser administrados durante o tempo de vida do paciente.
Também é previsto que mais de uma administração, quer do agente terapêutico primário ou secundário, agente anticâncer distinto será utilizado. 0 agente terapêutico primário e o segundo, agente anticâncer distinto pode ser administrado intercambiavelmente, em dias ou semanas alternadas; ou uma sequência de um tratamento de agente pode ser dado, seguido por uma sequência do outro tratamento. Em qualquer evento, para conseguir a regressão tumoral usando uma terapia combinada, tudo que é necessário é distribuir ambos os agentes em uma quantidade combinada eficaz para exercer um efeito antitumoral, sem considerar os tempos para administração.
Se administrado substancialmente em sequência ou simultaneamente, os anticorpos e terapêuticos antiaminofosfolipidio ou antiaminofosfolipidio aniônico da presente invenção podem ser administrados em combinação com um ou mais agentes ou medicamentos quimioterapêuticos. Medicamentos quimioterapêuticos podem matar células tumorais em proliferação, aumentando as áreas necróticas criadas pelo tratamento como um todo. Os medicamentos podem 253 então aumentar a açao trombótica dos agentes terapêuticos primários da invenção. A maioria dos medicamentos quimioterapêuticos para câncer são seletivos para dividir, células oxigenadas. Eles têm vantagens em terapia combinada como o medicamento quimioterapêutico age em diferentes alvos a partir dos agentes terapêuticos primários da invenção, levando a um efeito antivascular ou antitumoral mais completo. Por exemplo, medicamentos quimioterapêuticos são ativos seletivamente contra a divisão de forma rápida de células tumorais oxigenadas na periferia tumoral, enquanto os agentes da invenção agem primariamente em vasos ou células tumorais no centro do tumor "estressado", onde espécies oxigénio reativas ativadas são abundantes. Medicamentos antiangiogênicos que são seletivos para vasos angiogênicos bem oxigenados na periferia tumoral poderiam também ser eficientes na combinação, como os agentes da invenção agem em vasos relativamente hipóxicos e quiescentes no núcleo tumoral.
Pela indução da formação de trombo nos vasos sanguíneos, os agentes terapêuticos primários podem também aumentar a ação de medicamentos quimioterapêuticos pela retenção ou aprisionamento dos medicamentos pelo tumor. Os quimioterapêuticos são medicamentos retidos pelo tumor, enquanto o resto do medicamento é depurado pelo corpo. Células tumorais são então expostas a uma concentração mais alta do medicamento por um período de tempo mais longo. Este aprisionamento do medicamento pelo tumor torna possível a redução da dose do medicamento, tornando o tratamento mais seguro assim como mais eficiente. 254
Outros medicamentos para uso combinado na presente invenção são aqueles que agem em células que são "sensibilizadas" para o medicamento pela ação do agente terapêutico primário, tal como doses reduzidas da segunda droga são necessárias para alcançar esse efeito antitumoral. Por exemplo, isso poderia ocorrer onde um componente principal da segunda ação da droga é exercida em vasos tumorais e os anticorpos ou agentes da invenção sensibilizam as células para a droga. 0 mesmo é verdade onde o agente terapêutico primário da invenção sensibiliza células tumorais para uma segunda droga, seja diretamente ou através de estimulo da liberação de citocina. Outros segundos agentes anticâncer para terapia combinada são aqueles que aumentam a atividade das células efetoras do hospedeiro, por exemplo, pela inibição seletiva da atividade dos componentes imunossupressores do sistema imune. Tais agentes capacitam os agentes terapêuticos primários da invenção, os quais estimulam o ataque por células efetoras como parte de seu mecanismo, para funcionar de forma mais agressiva. Um exemplo de tal agente é o docetaxel.
Embora um entendimento do(s) mecanismo(s) preciso(s) de ação dos agentes terapêuticos primários não é necessário para praticar o tratamento da invenção, dados e deduções racionais envolvendo tais mecanismos podem ser usados para selecionar segundos agentes anticâncer particulares para uso combinado na presente invenção. A eficácia da terapia combinada escolhida, por sua vez, suporta os dados iniciais e mecanismos propostos de ação, e também leva a categorias preferidas de agentes anticâncer segundos para praticar terapia combinada. 255
Drogas que induzem apoptose são preferidas para uso em terapias combinadas. Docetaxel, por exemplo, induz apoptose e então exposição de PS pela ligação aos microtúbulos e rompimento da mitose celular (Hotchkiss et al., 2002). Tratamento de células endoteliais, as quais alinham-se aos vasos sanguíneos tumorais, e células Tumorais com docetaxel em concentrações subclínicas é apresentado aqui para induzir expressão de PS na superfície celular, como demonstrado pela ligação forte do anticorpo 3G4 in vitro.
Os presentes inventores têm também determinado que os efeitos antitumorais dos anticorpos da invenção incluem acréscimo do domínio mediado por Fc das funções efetoras imunes, como apresentado pelo aumento da fagocitose mediada por anticorpo. Então, os anticorpos devem também exercer outras funções mediadas pelo domínio Fc, tais como ADCC, CDC, estímulo da produção de citocinas e tais mecanismos em combinação. Isto é também relevante para o docetaxel, como outros estudos tem mostrado que o tratamento de pacientes com câncer de mama com docetaxel leva a aumento no soro dos níveis de citicinas IFN-γ, IL-2, IL-6 e GM-CSF, aumentando as respostas imunes antitumorais nesses pacientes pelo aumento da atividade da natural killer (NK) e natural killer linfocina ativadas (LAK) (Tsavaris et al., 2002).
Então, os inventores entenderam que docetaxel irá tanto induzir a expressão de PS quanto a ligação do anticorpo administrado, e também aumentar as atividades dos efetores imunes, os quais medeiam efeitos antitumorais. Baseados nas considerações precedentes, os inventores têm mostrado que a combinação dos anticorpos da presente invenção, como exemplificado pelo anticorpo 3G4, com docetaxel foi significantemente superior tanto ao ocetaxel ou ao 3G4 256 sozinho em xenoenxertos de camundongos com ortotópico MDA-MB-435 câncer de mama humano (Exemplo XX).
Em concordância, docetaxel e outros agentes terapêuticos que induzem apoptose são agentes preferidos para uso em tratamentos combinados da presente invenção. Combinações de anticorpos com aminofosfolipidios e/ou fosfolipidios aniônicos com drogas quimioterapêuticas que induzem apoptose, tais como docetaxel, deveriam atacar sinergisticamente células endoteliais da vasculatura tumoral e compartimentos da célula tumoral, levando não somente ao aumento significativo da eficácia do tratamento como também a uma menor toxicidade. Essas combinações são contempladas para uso no tratamento de câncer de mama, particularmente a combinação de quimioterapia metronômica usando docetaxel com um anticorpo da presente invenção. N2. Endotoxina
Endotoxinas e derivados detoxifiçados de endotoxina podem ser usados na tratamento combinado, preferencialmente a baixas doses (Publicação PCT número WO 03/028840). Várias endotoxinas detoxifiçadas são disponíveis, as quais são preferidas para uso em animais e particularmente para uso em humanos. Endotoxinas detoxifiçadas e purificadas, e combinações relacionadas, são descritas nas Patentes Americanas números 4.866.034, 4.435.386, 4.505.899, 4.436.727, 4.436.728, 4.505.900. O derivado não-tóxico de lipídio A monofosforil (MPL) é um exemplo de uma endotoxina detoxificada que pode ser usada na presente invenção. MPL é conhecido por ser seguro para humanos; ensaios clínicos usando MPL como um adjuvante têm 257 mostrado que 100 μg/m2 são seguros para uso humano, mesmo com base em pacientes ambulatoriais. N3. Citocinas
Terapia com citocina provou ser um parceiro eficaz para regimes terapêuticos combinados.Várias citocinas podem ser empregadas nos caminhos combinados da presente invenção. Exemplos de citocinas incluem IL-la, IL-ΐβ, IL-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL -8, IL -9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-β, GM-CSF, G-CSF, TNFOC, ΤΝΓβ, LAF, TCGF, BCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-CC, IFN-β, IFN-γ.
Citocinas são administradas de acordo com regimes padrão, consistentes com indicações clinicas tais como a condição do paciente e relativa toxicidade da citocina. Uteroglobinas podem também ser usadas para prevenir ou inibir metástases (Patente Americana número 5.696.092).
N4. TNFCC e indutores de TNFCC TNFCC e indutores de TNFOC podem também ser usados em combinação com a presente invenção. TNFCC aumenta a permeabilidade vascular, e é então útil na facilitação da penetração de agentes anticâncer no tumor. Embora a localização de anticorpo é sem dúvida alguma um problema na marcação de aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos, como na presente invenção, o uso combinado de TNFCC pode facilitar o acesso de outros quimioterapêuticos e imunoconjugados ao tumor, e mesmo aumentar a ligação dos anticorpos da invenção a células tumorais muito distantes.
Baixos níveis de endotoxina, antagonistas Racl, tais como um adenovírus atenuado ou construído, DMXAA (e FAA) , 258 CM101 e talidomida podem também ser usados. Antagonistas Racl podem ser usados no tratamento combinado da presente invenção, como cerca de 5000 partículas de DNA por célula causam supraregulação de TNF independente do CD14 (Sanlioglu et al., 2001). CM101, talidomida e DMXAA podem também ser usados em combinação juntamente, em doses padrão ou reduzidas. N5. Quimioterapêuticos
Sem considerar o(s) mecanismo(s) subjacente(s), uma variedade de agentes quimioterapêuticos podem ser usados nos métodos de tratamento combinados revelados aqui. Agentes quimioterapêuticos contemplados para uso combinado incluem, por exemplo, tamoxifeno, taxol, vinblastina, etoposídeo (VP-16), adriamicina, 5-fluoroacil (5FU), camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, combretastatina(s), mais particularmente docetaxel (tacotero), cisplatina (CDDP), ciclofosfamida, doxorubicina, metotrexato, paclitaxel e vancristina, e derivados e prodrogas relacionadas.
Como será entendido por aqueles indivíduos normalmente versados na técnica, doses apropriadas de agentes quimioterapêuticos incluem aquelas já empregadas em terapias clínicas onde os quimioterapêuticos são administrados sozinhos ou em combinação com outros quimioterapêuticos. Entretanto, baixas doses são agora possíveis graças às vantagens fornecidas pela presente invenção. Somente a título de exemplo, agentes tais como cisplatina, e outros alquilantes de DNA podem ser usados. Cisplatina tem sido amplamente usados para tratar câncer, com doses eficazes em aplicações clínicas de 20 mg/m2 por cinco dias a cada três semanas para um total de três ciclos. Cisplatina não é 259 absorvida oralmente e deve então ser distribuída via injeção intravenosamente, subcutaneamente, intratumoralmente ou intraperitonealmente.
Outros agentes úteis incluem compostos que interferem com a replicação do DNA, mitose, segregação cromossomal e/ou atividade da tubulina. Tais compostos quimioterapêuticos incluem adriamicina, também conhecida como doxorubicina, etoposídeo, verapamil, podofilotoxina(s), combretastatina(s), e assim por diante. Amplamente utilizados em ambientes clínicos para o tratamento de neoplasmas, esses compostos são administrados através de injeções de bolo intravenosamente em doses variando de 25-75 mg/m2 em intervalos de 21 dias para adriamicina, a 35-50 mg/m2 para etoposídeo intravenosamente ou dobrar a dose intravenosa oralmente.
Agentes que rompem a síntese e fidelidade de precursores polinucleotídios podem também ser usados. Particularmente úteis são agentes que sofreram testes extensivos e são prontamente disponíveis. Como tais, agentes como 5-fluoroacil (5-FU) são preferencialmente usados pelo tecido neoplásico, fazendo esse agente particularmente útil para marcação para células neoplásicas. Embora relativamente tóxico, 5-FU, é aplicável em uma grande variedade de veículos, incluindo tópicos, entretanto é comumente usada administração intravenosa com doses variando de 3 a 15 mg/Kg/dia.
Agentes quimioterapêuticos exemplares que são úteis juntamente com terapia combinada são listados na Tabela D. Cada um dos agentes listados nessa tabela são exemplares e de forma alguma limitantes. O artífice versado é encaminhado 260 15a Edição para "Remington’s Pharmaceutical Sciences" capitulo 33, nas páginas especificas de 624-652. Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamente dependendo da condição do indivíduo a ser tratado. 0 clínico responsável pela administração estará apto a determinar a dose apropriada para o assunto individual.
TABELA C
Agentes Quimioterapêuticos Úteis Na Doença Neoplástica CLASSE TIPO DE AGENTE NOMES NÃO PROTEGIDOS (OUTROS NOMES) DOENÇA Agentes de Alquila Mostardas de Mechloretham Doença de Hodgkin, Nitrogénio ina (HN2) linfornas Hodgkin não de 261 -çao
Ciclofosfami da Ifosfamida
Leucemias linfocíticas aguda e crónica, doença de Hodgkin, linfomas não de Hodgkin, mieloma múltiplo, neuroblastoma, tumor de mama, ovário, pulmão, de Wilms, do colo do útero, do testículo, sarcomas do tecido mole
Melfalan (L- sarcolisina)
Clorambucil
Mieloma múltiplo mama, ovário
Leucemia linfocítica crónica, acroglobulinemia primária, doença de Hodgkin, linfomas não de Hodgkin
Etilenoiminas e
Hexametilmel amina
Ovário 262
Metilmelaminas Tiotês Bexiga,mama, ovário Alquil Sulfonatos Busulfan Leucemia granulocitica crónica Carmustina (BCNU) Doença de Hodgkin, linfomas não de Hodgkin, tumores primários do cérebro, mieloma múltiplo, Nitroso uréias melanoma maligno Lomustine (CCNU) Doença de Hodgkin, linfomas não de Hodgkin, tumores primários do cérebro, de pequenas células do pulmão 263
Semustina Tumores primários (metil-CCNU) do cérebro, estômago, cólon NOMES NÃO PROTEGIDOS CLASSE TIPO DE AGENTE (OUTROS DOENÇA NOMES) Estreptozoci Insulinoma na pancreático Agentes Nitroso uréias (estreptozot maligno, carcinóide de ocina) maligno Aquilaç ão Dacarbazina melanoma maligno, Triazinas (DTIC; dimetiltriaz doença de Hodgkin, sarcomas do tecido enoimidazol mole carboxamida) 264
Metotrexato Leucemia (ametopterin linfocítica a) aguda, coriocarcinoma, Análogos do micose fungóide, Ácido Fólico mama, cabeça e pescoço, pulmão sarcoma Antime- osteogênico Fluoracil Mama, cólon, tabólic (5-fluoro estômago, os uracila; 5- FUO pâncreas, ovário,cabeça e Floxuridina pescoço, bexiga (fluorodesox Análogos de iuridina; urinária, lesões FUdR) pré-malignas da Pirimidina pele (tópico) Citarabina Leucemias (citosina linfocítica aguda e arabinosídeo ) granulocítica aguda 265
Mercaptopuri Leucemias ne linfocítica (6- aguda, mercaptopuri granuiocítica na;6-MP) aguda e granuiocítica crónica Análogos de Purina e Inibidores Correlatos Tioguanina (6- tioquanina; TG) Leucemias granuiocítica aguda, linfocítica aguda e granuiocítica crónica Pentostatina Leucemia de células (2- pilosa, micose desoxicoform icina) fungóide, leucemia linfocítica crónica 266
Produto s Alcaloides de Vinalstina (VLB) Doença de Hodgkin, linfomas não de Hodgkin, mama, Naturai Vinca testículo s NOMES NÃO PROTEGIDOS CLASSE TIPO DE AGENTE (OUTROS DOENÇA NOMES) Vincristina Leucemia linfocítica aguda, neuroblastoma, Produto tumor de wilms, s Naturai Alcaloides de Vinca rabdomiosarcoma, doença de Hodgkin, linfomas não de s Hodgkin, pulmão de pequenas células. 267
Epipodofilotox Etoposídeo Testículos, pulmões inas Tertiposideo de pequenas células e outros pulmões, mama, doença de Kodgkin, linfomas não de Hodgkin, sarcoma de Kaposí. Dactinomicin Coriocarcinoma, a tumor de Wilms, rabdomiosarcoma, (actinomicin testículos, sarcoma a D) de Kaposí Antibióticos Daunorubicin a Leucemias granulocítica aguda (daunomicina r e linfocítica aguda rubidomicina ) 268
Doxorubicina Sarcomas do tecido mole, osteogênico e outros; doença de Hodgkin, linfomas não de Hodgkin, leucemias agudas, mama, geniturinário, tiróide, pulmão, estômago, neuroblastoma. Bleomicina Testículos, cabeça e pescoço, pele, esófago, pulmão e trato geniturinário; doença de Hodgkin, linfomas não de Hodgkin. CLASSE TIPO DE AGENTE NOMES NÃO PROTEGIDOS DOENÇA (OUTROS NOMES) 269
Plicamicina Testículos, (mitramicina hipercalcernia ) maligna Produto s Antibióticos Mitomicina (mitomicina C) estômago, colo do útero, cólon, mama, pâncreas, bexiga, cabeça e pescoço Enzimas L- Asparaginase Leucemia linfocítica aguda Naturai s Leucemia de células pilosas, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinóide, células Modificadores de Resposta Biológica Interferon alfa renais, ovário, bexiga, linfomas não de Hodgkin, micose fungóide, mieloma múltiplo, leucemia granulocítica crónica 270
Agentes Miscelâ neas Complexos de Coordenação de Platina Cisplatina (cis-DDP) Carboplatina Testículos, ovário, bexiga, cabeça e pescoço, pulmão, tiróide, colo do útero, endométrio, neurolastoma, sarcoma osteogênico Antracenodiona Mitoxantrona Leucemia granulocítica aguda, mama Uréia substituída Hidroxiuréia Leucemia granulocítica crónica, policitemia vera, trombocitose essencial, melanoma maligno Derivado de Metil-hidrazina Procarbazina (N- metilidrazin a, MIH) Doença de Hodgkin Supressor Adrenocortical Mitotano (o,p '-DDD) Córtex adrenal Aminogluteti mida Mama 271
Hormôni os e Antagon istas Adrenocorticos teróides Prednisona (diversos outros preparados equivalente disponíveis) Leucemias linfocíticas agudas e crónicas, linfomas não de Hodgkin, doença de Hodgkin, mama CLASSE TIPO DE AGENTE NOMES NÃO PROTEGIDOS (OUTROS NOMES) DOENÇA Hormô-nios e Antagonistas Progestinas Caproato de hidroxiproge sterona Acetato de medroxiproge sterona Acetato de megestrol Endométrio, mama 272
Estrogênios Dietilstilbe strol Etinilestrad iol (outros preparados disponíveis) Mama,próstata Antiestrogênio Tamoxifen Mama Andrógenos Propionato de testosterona Fluoximester ona (outros preparados disponíveis) Mama Antiandrógeno Flutamida Próstata Análogo de hormônio liberador de gonadotropina Leuprolide Próstata Ν6. Antiangiogênicos O termo "angiogênese" se refere à geração de novos vasos sanguíneos, geralmente em um tecido ou órgão. Sob condições fisiológicas normais, humanos ou animais sofrem angiogênese somente em situações específicas restritas. Por exemplo, angiogênese é normalmente observada na cura de feridas, desenvolvimento fetal e embrionário e formação dos 273 corpus luteum, endométrio e placenta. Novas evidências, entretanto, mostram que angiogênese é importante em certas situações normais, tais como no tecido adrenal, próstata e ovário. Os agentes terapêuticos da presente invenção, nos quais antiangiogênese não é o único modo de ação, então tem vantagens sobre terapias proeminentes antiangiogênicas, tais como anticorpo A4.6.1 (Brem, 1998; Baça et al.r 1997; Presta et al., 1997), no que a angiogênese desejável ou "fisiológica" não será inibida no uso da presente invenção.
Angiogênese não-controlada (persistente e/ou desregulada) é relacionada a vários estados de doenças, e ocorre durante o desenvolvimento tumoral e metástase. Cogita-se que ambas as angiogêneses, controladas e descontroladas, procedem de forma semelhante. Células endoteliais e pericitos, envoltos por uma membrana basal, formam vasos sanguíneos capilares. Angiogênese começa com a erosão da membrana basal por enzimas liberadas pelas células endoteliais e leucócitos. As células endoteliais, as quais se alinham ao lúmen dos vasos sanguíneos, então projetam-se pela membrana basal. Estimulantes angiogênicos induzem as células endoteliais a migrar pela membrana basal erodida. As células migrantes formam um "broto" para fora do vaso sanguíneo de origem, onde as células endoteliais sofrem mitose e proliferam. Os brotos endoteliais se fusionam uns com os outros para formar laços capilares, criando o novo vaso sanguíneo.
Apesar de novas evidências de que angiogênese é requerida em alguns tecidos normais, terapias antiangiogênicas ainda são importantes no tratamento de tumores e outras doenças. Terapias antiangiogênicas são então planejadas para uso em tratamentos combinados da 274 presente invenção. A combinação de uma dose baixa, relativamente frequente de um agente terapêutico da presente invenção em combinação com um agente que inibe angiogênese é particularmente considerado. Agentes antiangiogênicos exemplares que são úteis juntos com terapia combinada são listados acima (juntamente com imunoconjugados). Qualquer um ou mais de tais agentes, incluindo aqueles na Tabela B, podem ser usados em terapias combinadas com a invenção. Angiostatina, endostatina, vasculostatina, canstatina e maspina são geralmente preferidos. Muitos agentes anticâncer conhecidos também têm um efeito antiangiogênico como parte de seu mecanismo de ação. Esses agentes, como exemplificado por aqueles na Tabela E, são particularmente contemplados para uso nos aspectos da terapia combinada da presente invenção (eles podem também estar conjugados ao anticorpo da invenção, como descrito acima).
Tabela E
Agentes anticâncer com atividade antiangiogênica
Classe ou tipo de agente Exemplos Alquiladores Ciclofosfamida, edelfosina, estramustina, melfalan Antimetabólitos Fluorouracil, metotrexato, mercaptopurina, UFT, tegafur, uracil, citabarina 275
Antibióticos antitumorais daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, mitomicina, mitoxantrona Inibidores da topoisomerase Camptotecina, irinotecan, etoposídeo, topotecan Taxanos Docetaxel, paclitxael Alcaloides Vinca Vinblastina, vincristina Miscelânea Cisplatina, octreotídeo
Além disso, o anticorpo LM609 contra a integrina ανβ3 também induz regressões tumorais e pode ser usada em terapias combinadas. Antagonistas da integrina ανβ3, tais como LM609, induzem apoptose de células endoteliais angiogênicas deixando os vasos sanguíneos quiescentes intactos. LM609 ou outros antagonistas ανβ3 podem também trabalhar pela inibição da interação de ανβ3 e MMP-2, uma enzima proteolítica cogitada a desempenhar um papel importante na migração de células endoteliais e fibroblastos.
Apoptose do endotélio angiogênico por LM609 pode ter um efeito cascata no resto da rede vascular. Inibindo a rede vascular tumoral a partir da resposta completa ao sinal tumoral para expandir pode, de fato, iniciar o colapso parcial ou completo da rede resultando na morte da célula tumoral e perda de volume tumoral. É possível que endostatina e angiostatina funcionem de forma semelhante. 0 fato de que LM609 não afeta vasos quiescentes mas é capaz de 276 causar regressões tumorais sugere fortemente que nem todos os vasos sanguíneos precisam ser marcados para tratamento para obter um efeito antitumoral.
Anticorpos para angiogenina podem também ser empregados, como descrito na Patente Americana número 5.520.914. Como FGF está relacionado com a angiogênese, inibidores de FGF podem também ser usados. Certos exemplos são os compostos com N-acetilglucosamina alternando na sequência com ácido urônico 2-O-sulfatado como suas unidades mais repetidas, incluindo glicosaminoglicanos, tais como sulfato de arcaran. Tais compostos são descritos na Patente Americana número 6.028.061, especificamente incorporados aqui por referência, e podem ser usados juntamente com isto.
N7. Inibidores de VEGF VEGF é uma citocina multifuncional que é induzida por hipóxia e mutações oncogênicas. VEGF é um estimulante primário do desenvolvimento e manutenção da rede vascular na embriogênese. Ela funciona como um potente agente indutor da permeabilidade, um agente quimiotático de célula endotelial, um fato de sobrevivência endotelial, um fator de proliferação de célula endotelial. Sua atividade é requerida para o desenvolvimento embrionário normal, como o rompimento de um ou ambos alelos marcados de VEGF resulta na letalidade embrionária. O uso de um ou mais métodos de inibição de VEGF é um aspecto preferido das terapias de combinação da presente invenção. O reconhecimento de VEGF como um estímulo primário da angiogênese em condições patológicas tem levado a vários métodos para bloquear a atividade da VEGF. Qualquer um dos inibidores a VEGF desenvolvidos pode agora ser empregado de 277 forma vantajosa com isto. Em acordo, qualquer um ou mais dos seguintes anticorpos anti-VEGF neutralizadores, construções de receptores solúveis, estratégias sem sentido, aptâmeros de RNA e inibidores da tirosina quinase projetados para interferir com a sinalização de VEGF pode então ser usada.
Agentes adequados incluem anticorpos neutralizadores (Kim et al., 1992; Presta et ai., 1997; Sioussat et al., 1993; Kondo et al., 1993; Asano et al., 1995), construções de receptores solúveis (Kendall e Thomas, 1993 ; Aiello et al., 1995; Lin et al ., 19 9 8; Millauer et al., 1996), inibidores da tirosina quinase (Siemeister et al., 1998), estratégias sem sentido, aptâmeros de RNA e ribozimas contra VEGF ou receptores VEGF (Saleh et al., 1996; Cheng et al., 1996). Variantes do VEGF com propriedades antagonistas também podem ser empregados, como descrito em WO 98/16551.
Bloqueio de anticorpos contra VEGF será preferido em certas modalidades, particularmente por simplicidade. Anticorpos monoclonais contra VEGF têm sido vistos para inibir crescimento xenoenxerto de tumor humano e formação de ascite em camundongos (Kim et al., 1993; Mesiano et al., 1998; Luo et al., 1998a; 1998b; Borgstrom et al., 1996; 1998;). 0 anticorpo A4.6.1 é um anticorpo de alta afinidade anti-VEGF capaz de bloquear a ligação de VEGF tanto a VEGFR1 quanto a VEGFR2 (Kim et al., 1992; Wiesmann et al., 199 7; Muller et al., 1998; Keyt et al., 1996). A4.6.1 foi recentemente humanizado por técnicas de exposição de fago monovalente e está atualmente na Fase 1 de ensaios clínicos como um agente anticâncer (Brem, 1998; Baça et al., 1997; Presta et al., 1997). 278
Varredura de mutagênese de alanina e cristalografia de raio-X de VEGF ligado pelo fragmento Fab de A4.6.1 apresentado que o epitopo na VEGF que A4.6.1 se liga é centrado ao redor dos aminoácidos 89-94. Esse dado estrutural demonstra que A4.6.1 inibe competitivamente VEGF de ligação ao VEGFR2, mas inibe VEGF de se ligar a VEGFR1 muito provavelmente por impedimento estéreo (Muller et al., 1998; Keyt et al., 1996). A4.6.1 pode ser usada em combinação com a presente invenção. Entretanto, um novo anticorpo chamado de 2C3 (4545) é geralmente preferido, o qual bloqueia seletivamente a interação de VEGF com somente um dos dois receptores para VEGF. 2C3 inibe o crescimento de células endoteliais mediado por VEGF, tem potente atividade antitumoral e bloqueia seletivamente a interação de VEGF com VEGFR2 (KDR/Flk-1), mas não com VEGFR1 (FLT-1). Em contraste ao A4.6.1, 2C3 permite a inibição especifica de angiogênese induzida por VEGFR2, sem inibição concomitante de quimiotaxia de macrófagos (mediada por VEGFR1), e é então considerado como sendo um terapêutico mais seguro. Patentes Americanas números 6.342.219, 6.342.221, 6.416.758 e 6.416.758 descrevem o anticorpo 2C3 e seus usos na terapia antiangiogênica e na inibição de VEGF. N8. Agentes indutores de apoptose
Os agentes terapêuticos da presente invenção são também preferencialmente combinados com outros métodos de tratamento que induzem apoptose em quaisquer células do tumor, incluindo células tumorais e células endoteliais da vasculatura tumoral. Agentes exemplares que induzem apoptose são listados acima (juntamente com imunoconjugados). 279
Qualquer um ou mais de tais agentes indutores de apoptose podem ser usados em terapias combinadas da presente invenção, sem estarem ligados a um anticorpo da invenção.
Muitos agentes anticâncer conhecidos também têm um efeito indutor de apoptose como parte de seu mecanismo de ação. Esses agentes, como exemplificado por aqueles na Tabela F, são particularmente considerados para uso nos aspectos da terapia combinada da presente invenção (eles podem também estar conjugados ao anticorpo da invenção, como descrito acima).
Tabela F
Agentes anticâncer que induzem apoptose
Classe ou tipo do agente Exemplos Antimetabólitos Citarabina, fludarabina, 5-fluoro-29-deoxiuridina, gemcitabina, hidroxiuréia, metotrexato Agentes reticuladores de DNA Clorambucil, cisplatina, ciclofosfamida, mostarda de nitrogénio Agentes intercalantes Adriamicina (doxorubicina) , mitixantrona Venenos da topoisomerase Etoposideo, teniposideo 280 II Agentes direcionados a microtúbulo Colcemida, colchicina, docetaxel, vincristina Inibidores da quinase Flavopiridol, estaurosporina, STI571 (CPG 57148B), UCN-01 (7-hidroxiestaurosporina) Inibidores da farnesil transferase L-739749, L-744832 Hormônios Glicocorticóides, fenretidina Agentes fragmentadores de DNA Bleomicina Antagonistas hormonais Tamoxifeno, finasterida, antagonistas da LHRH Biológicos TNF-CC, TRAIL, anti-CD20 Inibidores da síntese protéica L-asparaginase, cicloeximida, puromicina, toxina diftérica Venenos da topoisomerase II Camptotecina, toptecan Ν9. Imunotoxinas e coaguligantes A presente invenção pode também ser usada juntamente com outras imunotoxinas ou coaguligantes nos quais a porção 281 marcadora é direcionada a um marcador das células tumorais, vasculatura tumoral ou estroma tumoral. Qualquer um dos agentes tumorais descritos aqui na marcação de um peptídio que se liga a PE para uma célula tumoral, vasculatura tumoral ou estroma tumoral pode ser usado nessas modalidades. Nas imunotoxinas, os agentes ligados incluem agentes anticelulares ou citotóxicos, citocinas, agentes radioterapêuticos, agentes antiangiogênicos, agentes indutores de apoptose e drogas antitubulina. Nos coaguligantes, os agentes ligados são coaguligantes. Patentes Americanas números 5.855.866, 5.965.132, 6.261.535, 6.051.230, 6.451.312 (imunotoxinas), 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289 e 6.036.955 (coaguligantes) exemplificam tais construções. N10. ADEPT e terapia antidroga
Os anticorpos da presente invenção, incluindo o 9D2, 3G4 (ATCC 4545) e anticorpos semelhantes, podem também ser usados juntamente com prodrogas, onde o anticorpo é operativamente associado com um componente ativador de prodroga, tal como uma enzima ativadora de prodroga, a qual converte uma prodroga para a forma mais ativa apenas no contato com o anticorpo. Essa tecnologia é geralmente nomeada "ADEPT", e é descrita em, por exemplo, WO 95/13095; WO 97/26918, WO 97/24143, e Patentes Americanas números 4.975.278 e 5.658.568. O termo "prodroga", como usado aqui, refere-se a uma forma precursora ou derivada de uma substância biologicamente ou farmaceuticamente ativa que exerce citotoxicidade reduzida ou, de outra forma, efeitos anticelulares em células alvo, incluindo células endoteliais 282 da vasculatura tumoral, em comparação com a droga de origem na qual ele se baseia. Preferencialmente, a prodroga ou forma precursora exerce citotoxicidade ou efeitos anticelulares significantemente reduzidos, ou mais preferencialmente, negligiveis em comparação com a forma de origem ou "natural". "Prodrogas" são capazes de serem ativadas ou convertidas para resultar na forma de origem, mais ativa da droga. A capacidade técnica de fazer e usar prodrogas existe na habilidade dos artesãos comuns. Willman et al. (1986) e Stella et al. (1985) suplementam a descrição e ensino de como fazer e usar várias prodrogas. Coinstruções exemplares de prodrogas que podem ser usadas no contexto da presente invenção incluem, mas não se limitam a prodrogas contendo fosfato (Patente Americana número 4.975.278), prodrogas contendo tiofosfato, prodrogas contendo sulfato, prodrogas baseadas em peptídios (Patentes Americanas número 5.660.829; 5.587.161; 5.405.990; WO 97/07118), prodrogas modificadas com D-aminoácidos, prodrogas glicosiladas (Patente Americana número 5.561.119; 5.646.298; 4.904.768; 5.041.424), prodrogas contendo β-lactanos, prodrogas contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituídas (Patente Americana número 4.975.278), prodrogas contendo fenilacetamida opcionalmente substituídas, e mesmo 5-fluorocitosina (Patente Americana número 4.975.278) e prodrogas 5-fluorouridina e semelhante. O tipo de agente terapêutico ou droga citotóxica que pode ser usada ma forma de prodroga é virtualmente sem limites. Os agentes mais citotóxicos serão preferidos para uma tal forma de distribuição, sobre, por exemplo, a distribuição de coagulantes, os quais são menos preferidos 283 para uso como prodrogas. Tudo o que é requerido na formação da prodroga é projetar a construção de tal forma que a prodroga é substancialmente inativa e a droga "liberada" ou ativada tem atividade substancial, ou pelo menos suficiente para o propósito previsto. Várias melhorias nas prodrogas originais são também conhecidas e consideradas para uso com isso, como revelado na WO 95/03830; EP 751,144 (antraciclinas) ; WO 97/07097 (ciclopropilindois); e WO 96/20169. Por exemplo, prodrogas com Km reduzido dão descritas na Patente Americana número 5.621.002, a qual pode ser usada no contexto da presente invenção. Terapia com prodroga que é conduzida intracelularmente também é conhecida, como exemplificado por WO 96/03151 e pode ser praticada juntamente.
Para uso em ADEPT, o agente que ativa ou converte a prodroga na droga mais ativa é operativamente ligado a um anticorpo da invenção. O anticorpo então localiza a capacidade de conversão da prodroga pelo sitio angiogênico ou tumoral, de forma que a droga ativa somente é produzida em tais regiões e não na circulação ou em tecidos saudáveis.
Enzimas que podem ser ligadas aos anticorpos da invenção para funcionar na ativação da prodroga incluem, mas não se limitam a, fosfatase alcalina para uso em conjunto com prodrogas contendo fosfato (Patente Americana número 4.975.278); arilsulfatase para uso em conjunto com prodrogas contendo sulfato (Patente Americana número 5.270.196); peptidases e proteases, tais como protease serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidade (Patentes Americanas números 5.660.829; 5.587.161; 5.405.990) e catepsinas (incluindo catepsina B e L), para uso em conjunto 284 com prodrogas baseadas em peptídios; D-alanilcarboxipeptidades para uns em conjunto com prodrogas D-aminoácido modificadas; enzimas que clivam carboidratos tais como β-galactosidase e neuraminidase para uso em conjunto com prodrogas glicosiladas (Patentes Americanas números 5.561.119; 5.646.298); β-lactanoase para uso em conjunto com prodrogas contendo β-lactano; penicilina amidases, tais como penicilina V amidase (Patente Americana número 4.975.278) ou penicilina G amidase, para uso em conjunto com drogas derivadas nos seus nitrogénios amino com grupos fenoxiacetamida ou fenilacetamida; e citosina desaminase (Patentes Americanas números 5.338.678; 5.545.548) para uso em conjunto com prodrogas baseadas em 5-fluorocitosina (Patente Americana número 4.975.278).
Anticorpos com atividade enzimática, conhecidos como anticorpos catalíticos ou "abzimas", podem também ser empregados para converter prodrogas em drogas ativas. Abzimas baseadas nos anticorpos da invenção, preferencialmente os 9D2 e 3G4 e anticorpos semelhantes, então formam outro aspecto da presente invenção. A capacidade técnica para fazer abzimas também existe com aqueles indivíduos normalmente versados na técnica, como exemplificado por Massey et al. (1987), especificamente incorporado aqui por referência para propósitos de suplementar o ensino de abzimas. Anticorpos catalíticos capazes de catalisar a quebra de uma prodroga na posição varbamato, tal como um carbamato aril de mostarda de nitrogénio, são posteriormente considerados, como descrito na EP 745.673. 0. Lipossomas cobertos por anticorpos e terapêuticos 285
Formulações lipossomais são geralmente usadas em terapêuticos e farmacêuticos. Entretanto, a distribuição de lipossomas em estudos iniciais significaram que tais formulações não foram amplamente aplicáveis ao uso em humanos. A tecnologia de lipossomas "escondidos ou encobertos" e formulações foi então desenvolvida, o que permite aos lipossomas circularem durante mais tempo. Um agente preferido para uso em lipossomas secretos é polietilenoglicol (PEG), e os lipossomas resultantes são também denominados lipossomas PEGilados.
Lipossomas escondidos têm sido propostos para uso na distribuição de agentes citotóxicos a tumores em pacientes com câncer. Uma variedade de drogas foram incorporadas em lipossomas escondidos, incluindo cisplatina (Rosenthal et ai., 2002), TNFCC (Kim et al., 2002), doxorubicina (Symon et al., 1999) e adriamicina (Singh et al., 1999). Entretanto, relatórios recentes têm indicada baixa eficácia não prevista da doxorubicina e vinorelbina lipossomal escondida no tratamento de câncer de mama metastático (Rimassa et al., 2003) . A presente invenção fornece formulações lipossomais escondidas melhoradas, superando várias desvantagens na técnica, na qual os lipossomas escondidos são funcionalmente associados ou "cobertos" com um anticorpo que se liga a um aminofosfolipidio ou fosfolipídio aniônico, preferencialmente PS ou PE. O 9D2, 3G4 (ATCC 4545) e semelhantes, anticorpos competidores da invenção são preferidos para tais usos, embora qualquer anticorpo ou região de ligação a antigeno relacionada, a qual se liga a um aminofosfolipidio ou fosfolipídio aniônico pode ser 286 usada. Um anticorpo divalente ou porção de anticorpo não é requerida nesses aspectos da invenção.
Qualquer lipossoma escondido pode formar as bases das novas formulações lipossomais, e preferencialmente um lipossoma PEGilado será empregado.Os lipossomas escondidos são "cobertos", i.e., operativamente ou funcionalmente associado com o anticorpo que se liga a um aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico. A associação operativa ou funcional é feita de forma que o anticorpo retém a capacidade de se ligar especificamente ao aminofosfolipidio ou fosfolipidio aniônico alvo, preferencialmente PS ou PE, distribuindo então o lipossoma escondido e quaisquer conteúdos relacionados às células positivas para PS e/ou PE, tais como células tumorais e células do endotélio vascular tumoral.
Os lipossomas escondidos cobertos de anticorpo da invenção podem ser usados sozinhos. Preferencialmente, no entanto, tais lipossomas conterão também um ou mais segundos agentes terapêuticos, tais como agentes anticâncer ou quimioterapêuticos (o primeiro agente terapêutico sendo o próprio anticorpo). Os segundos agentes terapêuticos são geralmente descritos como estando no "centro" do lipossoma. Qualquer um ou mais dos segundos agentes anticâncer ou quimioterapêuticos conhecidos na técnica e/ou descritas aqui para conjugação de anticorpos, ou para terapias combinadas, podem ser usados nos lipossomas escondidos cobertos por anticorpo da invenção. Por exemplo, qualquer agente quimioterapêutico ou radioterapêutico, citocina, agente antiangiogênico ou agente indutor de apoptose. Geralmente preferidos dentre os agentes quimioterapêuticos são drogas antitubulina, docetaxel epaclitaxel. 287
Além disso, os lipossomas escondidos cobertos com anticorpos da invenção podem também ser carregados com uma ou mais drogas antivirais para uso no tratamento de infecções virais e doenças. Como com os agentes anticâncer, qualquer um ou mais das segundas drogas antivirais conhecidas na técnica e/ou descritas aqui para conjugação com anticorpos, ou para terapias combinadas, pode ser usada nos lipossomas escondidos cobertos por anticorpo da invenção. Cidofovir e AZT são geralmente exemplos preferidos. P. Antivascular, antiangiogênico e outras terapias
Se baseados em mecanismos antiangiogênicos, vasculatura protrombótica ou outros antivasculares, a presente invenção pode então ser usada para tratar doenças prevalentes e/ou clinicamente importantes fora do campo de câncer, incluindo artrite, artrite reumatóide, psoríase, aterosclerose, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada com a velhice, doença de Grave, restenose vascular, incluindo restenose seguindo angioplastia, malformações arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma e glaucoma neovascular. Outros alvos para intervenção incluem angiofibroma, placas ateroscleróticas, neovascularização de implante de córnea, articulações hemofílicas, cicatrizes hipertróficas, síndrome de osler-weber, fibroplasia retrolental granuloma piogênico, escleroderma, adesões vasculares, sinovite, dermatite, várias outras doenças inflamatórias e desordens, e mesmo endometriose. Outras doenças e desordens que são tratáveis pela invenção, e a base unificadora de tais desordens, são estabelecidas abaixo.
Uma doença prominente na qual vasculatura aberrante e angiogênese é envolvida é a artrite reumatóide, onde os vasos sanguíneos na linha sinovial das articulações sofre angiogênese. Além de formar novas redes vasculares, as células endoteliais liberam fatores e espécies oxigénio reativas que levam a crescimento de pannus e destruição de cartilagem. Os fatores envolvidos na angiogênese podem contribuir ativamente para, e ajudar a manter, o estado inflamatório crónico da artrite reumatóide. Fatores associados com angiogênese também têm um papel na osteoartrite, contribuindo para a destruição da articulação. Vários fatores, incluindo VEGF, tem mostrado estarem envolvidos na patogênese da artrite reumatóide e osteoartrite.
Outro exemplo importante de uma doença envolvendo vasculatura aberrante e angiogênese é a doença neovascular ocular. Essa doença é caracterizada pela invasão de novos vasos sanguíneos para dentro das estruturas do olho, tais como a retina ou córnea. É a causa mais comum de cegueira e está envolvida em aproximadamente vinte doenças do olho. Na degeneração macular relacionada com a velhice, os problemas visuais associados são causados por um encravamento dos capilares coroidais através de defeitos na membrana de Bruch com proliferação de tecido fibrovascular abaixo do pigmento retinal do epitélio. Dano angiogênico é também associado com retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade, rejeição de implante de córnea, glaucoma neovascular e fibroplasia retrolental.
Outras doenças associadas com neovascularização córnea que podem ser tratadas de acordo coma presente invenção incluem, mas não são limitadas a, queratoconjuntivite 289 epidêmica, deficiência de vitamina A, esgotamento de lentes de contato, queratite atópica, queratite limbica superior, pterégio, ceratite seca, doença de sjõgren, acne rosácea, filectenulose, sífilis, infecções por Mycrobacteria, degeneração lipídica, queimaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneração marginal de Terrien, queratólise mariginal, artrite reumatóide, lupos sistémico, poliarterite, trauma, sarcoidose de Wegeners, esclerite, doença de Johnson, queratotomia radial perifigóide e rejeição de implante de córnea.
Doenças associadas com neovascularização retinal/coroidal que podem ser tratadas de acordo com a presente invenção incluem, mas não são limitadas a, retinopatia diabética, degeneração macular, anemia falciforme, sarcóide, sífilis, pseudoxantoma elástico, doença de Pagets, oclusão venal, oclusão arterial, doença obstrutiva da carótida, uveíte/vitrite crónica, infecções micobacterianas, doença de Lyme, eritematose de lupos sistémica, retinopatia da prematuridade, doença de Eales, doença de Bechets, infecções causando retinite ou coroidite, histoplasmose ocular pretensa, doença de Bests, miopia, caroços óticos, doença de Stargarts, pars plantitis, desacoplamento retinal crónico, síndromes da hiperviscosidade, toxoplasmose, trauma e complicações pós-laser.
Outras doenças que podem ser tratadas de acordo com a presente invenção incluem, mas não são limitadas a, doenças associadas com rubeose (neovascularização do ângulo) e doenças causadas pela proliferação anormal de tecido fibrovascular ou fibroso incluindo todas as formas de 290 vitreoretinopatia proliferativa, associada ou não com diabete.
Inflamação crónica também envolve vasculatura aberrante e angiogênese patológica. Tais doenças estabelecidas como colite ulcerativa e doença de Crohn apresentam alterações histológicas com o encravamento de novos vasos sanguíneos dentro dos tecidos inflamados. Bartonelose, uma infecção bacteriana encontrada na América do Sul, pode resultar em um estado crónico que é caracterizado pela proliferação de células endoteliais vasculares.
Outro papel patológico associado com vasculatura aberrante e angiogênese é encontrado em aterosclerose. As placas formadas pelo lúmen dos vasos sanguíneos têm sido mostradas como tendo atividade estimulatória angiogênica. Existe evidência particular do significado patofisiológico de marcadores angiogênicos, tais como VEGF, na progressão de aterosclerose coronária humana, assim como em processos de recanalização em doenças coronárias obstrutivas. A presente inenção fornece um tratamento eficaz para tais condições.
Uma das doenças angiogênicas mais frequentes da infância é o hemanginoma. Na maioria dos casos, os tumores são benignos e regridem sem intervenção. Em casos mais severos, tumores progridem para formas mais cavernosas e infiltrativas e criam complicações clínicas.
Formas sistémicas de hemanginomas, as hemangiomatoses, tem um alto grau de mortalidade. Hemanginomas resistentes à terapia não podem ser tratados com a terapêutica correntemente em uso, mas são endereçados pela invenção. 291
Angiogênese também é responsável pelo dano encontrado em doenças hereditárias tais como doença de Osler-Weber-Rendu, ou telangiecstasia hemorrágica hereditária. Esta é uma doença hereditária caracterizada por angiomas pequenos múltiplos, tumores de vasos sanguíneos ou linfáticos. Os angiomas são encontrados na pele e em membranas mucosas, geralmente acompanhados por epistaxe (sangria nasal) ou sangramento gastrintestinal e algumas vezes com fístula arteriovenosa hepática ou pulmonar.
Angiogênese também é envolvida em processos fisiológicos normais tais como reprodução e cicatrização de ferimentos. Angiogênese é um importante passo na ovulação e também na implantação da blástula após fertilização. Prevenção de angiogênese de acordo com a presente invenção poderia ser usada para induzir amenorréia, para bloquear ovulação ou para prevenir a implantação pela blástula. Na cicatrização de feridas, reparo excessivo ou fobroplasia pode ser um efeito colateral prejudicial de procedimentos cirúrgicos e pode ser causado ou exarcebado pela angiogênese. Adesões são uma complicação frequente da cirurgia e leva a problemas tais como obstrução pequena do intestino. Isso também pode ser tratado pela invenção.
Aminofosfolipídios e/ou fosfolipídios aniônicos, particularmente PS, são também envolvidos em anemia de célula falciforme, em particular, como parte de um mecanismo de liberação. Anticorpos para PS podem então ser usados para tratar ou melhorar anemia de célula falciforme. 0 uso do 3G4 (ATCC 4545) ou anticorpos do tipo é preferido, particularmente um dímero Fab relacionado. 292 A maioria das bactérias expressa o fosfolipídio aniônico, PA. Anticorpos que se ligam a PA, opcionalmente com ligação a outros fosfolipidios aniônicos, podem então ser usados como agentes ant'-bactérias. Embora os anticorpos da invenção podem ser preparados em E. coli, e não são então bactericidas em todas as circunstâncias, acredita-se que um papel antibactéria in vivo é resultante da habilidade de fixar o complemento. Um anticorpo intacto ao invés de um fragmento de anticorpo deveria então ser usado como um agente antibactéria. 0 3G4 (ATCC 4545) e anticorpos do tipo são preferidos para uso em tais modalidades, embora qualquer anticorpo que fixa complemento e se liga à PA pode ser empregado, tal como outros anticorpos que se ligam à PA da Tabela 4.
Sindrome do antifosfolipidio e lupos, desordens autoimunes nas quais anticorpos são produzidos contra os próprios fosfolipidios do corpo, são associadas com desordens de coagulação, incluindo abortos e trombocitopenia (baixa contagem de plaquetas). Em acordo, os anticorpos anti-fosfolipidios nesses pacientes são anticorpos patogênicos, os quais causam trombose. Os anticorpos da presente invenção, entretanto, se ligam a aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos sem exibir tais efeitos colaterais. Em acordo, os anticorpos da invenção são contemplados para uso no tratamento de sindrome do antifosfolipidio, doenças associadas e complicações relacionadas.
Acredita-se que os anticorpos patogênicos anti-fosfolipidios que circulam em pacientes com sindrome do aminofosfolipidio se ligam à PS, PE e outros fosfolipidios em combinação com proteínas, tais como P2-glicoproteína I, 293 protrombina, quininogênios, precaliquerina e fator XI (Rote, 1996; Sugi e Mclntyre, 1995; 1996a; 1996b). P2-glicoproteína I e protromina ligada ao PS são descritos como sendo os antigenos primários para anticorpos anticardiolipina e anticorpos lupos, respectivamente. Q. Derivados de peptídios que se ligam à PE e conjugados
Além de anticorpos e imunoconjugados, a presente invenção também fornece derivados peptídicos que se ligam à PE e vários usos, particularmente no tratamento de tumores e doenças virais. Construções e derivados peptídicos que se ligam à PE correntemente preferidas são aqueles baseados no peptídio designado duramicina. Três categorias gerais de peptídicos que se ligam à PE e derivados de duramicina são fornecidos pela invenção, dois dos quais usam o peptídicos que se ligam à PE ou duramicina como a porção alvo da construção, e a outra usa a duramicina ou agente semelhante principalmente como a porção efetora da construção. 0 uso de peptídios que se ligam à PE, preferencialmente duramicina, como agentes alvo é baseada na habilidade deles de conceder uma capacidade de ligação seletiva a uma construção resultante. Em acordo, uma construção ou conjugado contendo peptídio que se liga à PE, preferencialmente duramicina, irá especificamente se ligar a células que expressam PE, tais como células endoteliais vasculares tumorais, células tumorais malignas, células em proliferação e/ou células infectadas por vírus.
Como os peptídios que se ligam à PE tais como duramicina têm atividade biológica adicionalmente à função de alvo de PE, não é necessário conjugar um peptídio que se 294 liga à PE tal como duramicina a um agente terapêutico para alcançar um conjugado terapêutico. Entretanto, como peptidios que se ligam à PE tais como duramicina têm toxicidade associada em suas formas naturais, o peptídio deveria ser modificado para reduzir a toxicidade. As toxicidades são relacionadas com a habilidade dos peptidios de formar aglomerados, formar poros nas membranas celulares, e a geralmente permear ou penetrar nas células. Em acordo, essas funções deveriam ser atenuadas, até significantemente ou substancialmente prevenir o peptídio que se liga à PE de formar aglomerados, permear nas células e ser não-especificamente tóxico. Preferencialmente, enquanto a capacidade de se ligar à PE é substancialmente mantida, a capacidade de peptidios que se ligam à PE de formar aglomerados e penetrar nas células é substancialmente inibida, então significantemente reduzindo ou abolindo a citotoxidade. A primeira categoria de derivados peptídicos que se ligam à PE com toxicidade reduzida pela presente invenção é aquela na qual o peptídio que se liga à PE, preferencialmente duramicina, torna a célula relativamente ou substancialmente impermeável. Isto é preferencialmente alcançado pela ligação a um grupo impermeabilizante da célula, o qual pode ser um grupo pequeno com carga positiva ou negativa ou um grupo polar, ou pode ser na forma de um carreador inerte. Os termos "grupo impermeabilizante celular" e "peptídio que se liga à PE impermeabilizante celular", como usado aqui, são relativos ao invés de absolutos, e referem-se a peptidios que se ligam à PE modificados, preferencialmente duramicina, nos quais a capacidade de formar agregados e permear células tem sido significantemente, e preferencialmente substancialmente, 295 reduzida. Os peptídios que se ligam à PE impermeabilizantes celulares podem funcionar prendendo PE, e moléculas de membrana associadas, no exterior de células e/ou trazendo defesas do hospedeiro para suportar as células cobertas por peptídios.
Por essa categoria de derivados peptídicos que se ligam à PE, certas construções irão enfatizar o recrutamento de defesas do hospedeiro, aumentando então sua atividade terapêutica. Por exemplo, onde um peptídio que se liga à PE, preferencialmente duramicina, é ligado a uma imunoglobulina, a imunoglobulina pode então funcionar tanto como um carreador inerte e como um efetor imune. Isso se aplica a imunoglobulinas da chamada "especificidade irrelevante" e derivados de imunoglobulina sem capacidade de se ligar a antígenos, tais como regiões Fc. Em virtude da imunoglobulina ligada ou do derivado de imunoglobulina, tais construções estarão aptas a redirecionar as defesas do hospedeiro contra células gue exprimem PE, por exemplo, atraindo e/ou ativando células efetoras imunes.
Na segunda categoria geral de derivados peptídicos gue se ligam à PE da invenção, os peptídios ainda são modificados para reduzir a penetração celular e toxicidade resultante, mas ao invés de usar um pegueno grupo impermeabilizante ou carreador inerte, um agente é usado que muda a distribuição sanguínea e tecidual da construção resultante. Exemplos preferidos são aqueles nos quais um peptídio que se ligam à PE, preferencialmente duramicina, é ligado a um agente alvo gue se liga a um componente de uma célula tumoral, tumor ou vasculatura intratumoral ou estroma tumoral. Embora o peptídio que se ligam à PE por ele mesmo ainda tem a propriedade de alvejar, nesses aspectos da 296 invenção, o agente que alveja primariamente direciona a construção ao tecido alvo, para o ambiente tumoral, e o peptidio que se liga à PE ligado tal como duramicina exerce um efeito terapêutico na distribuição. A terceira categoria geral de derivados peptidios que se ligam à PE retornam para o uso do peptidio que se liga à PE, preferencialmente duramicina, como agente que alveja para localizar o derivado para células que expressam PE. Como células infectadas por vírus expressam PE na superfície celular, em oposto ao normal, células não-infectadas, ligar um peptidio que se liga à PE tal como duramicina a um agente antiviral irá fornecer um agente antiviral eficiente, alvejado. Embora a porção peptídica que se liga a PE, preferencialmente duramicina, pode ter efeitos terapêuticos adicionais, o agente antiviral ligado é projetado para ser o agente terapêutico primário em tais construções.
Qualquer uma das técnicas de conjugação descritas acima podem ser usadas para preparar derivados de duramicina de acordo com a invenção, incluindo reticuladores, espaçadores de peptidios, construções biotina:avidina e expressão recombinante. Um sítio vantajoso de ligação na molécula de duramicina, por exemplo, é o do resíduo de lisina no aminoácido de posição 2 na sequência de duramicina (SEQ ID N0:9; Figura 13P; Hayashi et al., 1990). Entretanto, ligação nesse sítio não é um requerimento para a invenção.
Em acordo, peptidios que se ligam à PE, preferencialmente duramicina, podem ser derivados para ter um grupo funcional disponível para fins de reticulação. Uma grande variedade de grupos pode ser usada dessa forma, por exemplo, grupos amino primários e secundários, grupos 297 hidrazida ou hidrazina, álcoois carboxil, fosfato, carbamato e grupos alquilantes. Os agentes para ligação, incluindo agentes antivirais, podem então ser conjugados através de uma ligação de base de Schiff, uma hidrazona ou acil hidrazona ligada a um ligante hidrazida (Patentes Americanas números 5.474.765 e 5.762.918). Q1. Peptidios que se ligam a PE e antimicrobianos
Qualquer peptidio que se liga a PE pode ser usado nesses aspectos da invenção. Por exemplo, sabe-se que quininogênios de baixo e alto peso molecular se ligam a PE. As sequências de proteína e DNA para uma variedade de tais proteínas ligantes, incluindo as proteínas humanas, são conhecidas na técnica, facilitando o uso destes peptidios que se ligam à PE.
Por exemplo, os genes e proteínas humanas para quininogênios de baixo e alto peso molecular são descritos em Kitamura et al., (1985) e Kellermann et al., (1986).
Patente Americana número 6.312.694 descreve certos conjugados que se ligam a PE usando proteínas que se ligam a PE, tais como quininogênios, e fragmentos que se ligam a PE relacionados. Na Patente Americana número 6.312.694, as proteínas que se ligam a PE ou fragmentos que se ligama PE relacionados são eficientemente ligados a agentes anticelulares, toxinas e fatores de coagulação. No uso presente, peptidios que se ligam a PE são ligados a carreadores inertes, agentes que alvejam tumores ou agentes antivirais. Embora os presentes agentes para ligação e seus métodos de uso representem avanços surpreendentes, a Patente Americana n° 6.312.694 descreve e capacita peptidios que se 298 ligam a PE, tais como fragmentos de peptídios de quininogênios que se ligam a PE.
Peptídios que se ligam a PE normalmente preferidos para uso na invenção são aqueles baseados na molécula que se liga a PE, duramicina. Duramicina (2622U90, Molil901) é um petídio antimicrobiano da família dos lantibióticos (Patente Americana número 4.452.782; Shotwell et al., 1958; Nakamura e Racker, 1984) e outros membros da família dos lantibióticos podem ser usados na presente invenção. Onde os peptídios que se ligam a PE são usados como o agente a ser usado como alvo da construção, por exemplo, quando ligados a um carreador inerte ou a um agente antiviral, um peptídio que se liga a PE lantibióticos deveria substancialmente reter a atividade de se ligar a PE. Quando usado como agente terapêutico em uma construção, particularmente quando ligado a um agente que alveja tumor, existe mais tolerância para alguma perda da atividade de se ligar a PE.
Testar um peptídio candidato para confirmar ou identificar aqueles que substancialmente se ligam a PE é um problema direto na luz da presente descoberta e pode ser alcançado, por exemplo, usando qualquer um ou mais dos ELISAs descritos aqui. Lantibióticos para uso como peptídios que se ligam à PE aqui irão preferencialmente exibir substancialmente a mesma atividade de se liga a PE que a duramicina, e ainda mais preferivelmente, irá também exibir substancialmente a mesma especificidade para PE sobre outros fosfolipídios como duramicina. Tais propriedades podem também ser prontamente determinadas na luz da presente descoberta, particularmente os exemplos em andamento. 299
Baseado no critério acima, os seguintes lantibióticos podem ser usados como parte das construções e conjugados da presente invenção: duramicina, cinamicina, actagardina, ancovenina, epidermina, galidermina, lantiopeptina, mersacidina, nisina, Pep5 e subtilina. Duramicina é o peptidio que se liga a PE mais preferido para uso em todos os aspectos da invenção. Duramicina é um antimicrobiano, o qual também tem sido sugerido para o uso no tratamento de asma, bronquite crónica e infecção por Mycobacterium tuberculosis (Patentes Americanas números 5.849.706; 5.716.931; 5.683.675; 5.651.957; e 5.512.269) e fibrose cística (McNulty et al., 2003). Entretanto, duramicina não foi anteriormente descrita ou sugerida para conjugação a um grupo impermeabilizante celular, particularmente não para uso no tratamento de infecções virais.
Cinamicina (Ro09-0198) é uma molécula relacionada que se liga a PE (Wakamatsu et al., 1986; Choung et al., 1988a; 1988b) . Cinamicina marcada tem sido usada como uma sonda para estudar o movimento transbicamada do PE (Aoki et al., 1994; Emoto et al., 1996) e exposição de PE durante apoptose de células T in vitro (Emoto et al., 1997; Umeda e Emoto, 1999). Entretanto, usos terapêuticos de derivados de cinamicina de acordo com a presente invenção não foram previamente descritos ou sugeridos. Composições farmacêuticas contendo derivados peptídicos que se ligam a PE da invenção baseados na cinamicina, e vários usos clínicos relacionados, então representam um avança na técnica, particularmente onde pretende-se usar tais composições no tratamento de infecções virais.
Os seguintes peptídios antimicrobianos podem também ser usados nos conjugados da invenção, particularmente como 300 agentes terapêuticos ligados a agentes que tem como alvo tumores: cistibióticos, tais como pediocina AcH/PAl, leucocina A/Ual 187, mesentericina Y 105, sacacina A, sacacina P, lactacina F, cereina 7/8 e carnobacteriocinas, tais como carnobacteriocina A, BM1 e B2; e tiolbióticos, particularmente lactococinas, tais como lactococinas B, A, Ma, Na, Ga e G. Q2. Grupos impermeabilizantes celulares.
Ligar um peptídio que se liga a PE, preferencialmente duramicina, a um grupo impermeabilizante celular irá reduzir a capacidade dos peptídios de formar aglomerados, prevenindo substancialmente o peptídio que se liga a PE de permear para dentro de células normais e então reduzindo a toxicidade. A propriedade de se liga a peptídio é mantida, entretanto, de forma que os peptídios podem localizar de células aberrantes a infectadas, as quais têm PE exposto na superfície.
Exemplos de grupos impermeabilizantes celulares incluem grupos que têm carga positiva ou negativa no pH fisiológico, tais como sulfato, sulfonato, fosfato, carboxil, fenólico, íons quaternários de amónio e grupos amina. Exemplos adicionais são grupos polares, tais como açúcares simples e polissacarídeos, aminoácidos e poliálcoois. Duramicina, em particular, pode ser ligada a biotina para formar peptídios que se ligam a PE biotinilados, os quais podem ser dispersos em uma composição farmacêutica ou medicamento, particularmente um planejado para tratar uma infecção virai. O grupo impermeabilizante celular pode também ser um polipeptídio, proteína ou imunoglobulina, qualquer um podendo funcionar como um carreador inerte ou como um agente alvejante. 301 Q3. Carreadores inertes
Peptídios que se ligam à PE, preferencialmente duramicina, podem receber propriedade de impermeabilizante celular pela ligação com um carreador impermeabilizante celular inerte. Uma grande variedade de carreadores impermeabilizantes celulares inertes podem ser conjugados a um peptidio que se liga a PE, preferencialmente duramicina, para preparar um peptidio que se liga a PE impermeabilizante celular, de forma que a atividade de se ligar a PE não seja substancialmente destruída. Os carreadores inertes devem preferencialmente ser biologicamente compatíveis, de tal forma que eles não resultem em quaisquer efeitos desfavoráveis significantes na administração a um animal ou paciente.
Carreadores de proteínas podem ser usados, e proteínas exemplares são albuminas e globulinas. Neutravidina e estreptavidina geralmente serão preferidas. Carreadores não-protéicos podem também ser usados, tais como polímeros naturais ou sintéticos, incluindo polissacarídeos e PEG.
Em certas modalidades, o carreador será uma imunoglobulina ou porção relacionada. Imunoglobulinas humanas (HIgG) serão preferidas para administração humana. Imunoglobulinas podem também conceder funções de alvo, conforme discutido abaixo. Como um carreador inerte, uma imunoglobulina é uma de "especificidade irrelevante", no que ela não concede uma função alvejante para o conjugado. Entretanto, certas vantagens podem ainda ser alcançadas pela seleção de tipos particulares de imunoglobulinas. Por exemplo, a porção Fc de uma imunoglobulina pode ser usada 302 imunes do hospedeiro e então para recrutar células adicionalmente estimular defesas do hospedeiro. Q4. Agentes targeting
Ao invés de se ligar a um carreador inerte, Peptídios que se ligam à PE, preferencialmente duramicina, podem ser atribuídos impermeabilizantes celulares pela ligação a um agente alvejante, em particular, um que se liga a um componente de uma célula tumoral, tumor ou vasculatura tumoral ou estroma tumoral. 0 agente alvejante direciona a construção ao tecido alvo, preferencialmente o ambiente tumoral, e o peptídio que se liga à PE, preferencialmente duramicina, exerce um efeito terapêutico na distribuição.
Agentes marcadores adequados são componentes, tais como anticorpos e outros agentes, que se ligam a uma célula tumoral. Agentes que "se ligam a célula tumoral" são definidos aqui como agentes que tomam como alvo que se ligam a qualquer componente acessível ou componentes de uma célula tumoral, ou que se liga a um componente que é ele próprio ligado a, ou de outra forma associado com, uma célula tumoral, como é posteriormente descrito aqui. A maioria de tais agentes marcadores de células tumorais e ligantes aglutinantes são considerados para serem agentes, particularmente anticorpos, que se ligam à superfície celular tumoral do antígeno ou marcador. Muitos tais antígenos são conhecidos, assim como uma variedade de anticorpos para uso na ligação de antígenos e marcação tumoral. A invenção então inclui agentes marcadores que se ligam a um antígeno da superfície de uma célula tumoral identificada e/ou que se liga a uma célula tumoral intacta.
Os antígenos identificados da superfície celular tumoral e 303 células tumorais intactas da Tabela I e da Tabela II das Patentes Americanas números 5.877.289, 6.004.555, 6.036.955 e 6.093.399 exemplificam antigenos da superfície de células tumorais adequados.
Exemplos de regiões de ligação de células tumorais são aquelas que compreendem uma região de ligação de antígeno que se liga ao antígeno tumoral pl85HER2 da superfície celular, proteína de núcleo de mucina de leite, TAG-72, Lewis ou antígeno carcinoembriônico (CEA). Outro grupo de regiões de ligação de células tumorais são aquelas que compreendem uma região de ligação de antígeno de um anticorpo que se liga a um antígeno associado ao tumor que se liga ao anticorpo 9.2.27, 0V-TL3, M0vl8, B3 (ATCC HB 10573), KS1/4 (obtido a partir de uma célula compreendendo o vetor Pgkc2310 (NRRL B-18356) ou o vetor pG2A52 (NRRL B-18357), 260F9 (ATCC HB 8488) ou D612 (ATCC HB 9796). D612 é descrito na Patente Americana número 5.183.756, e tem Número de Adesão ATCC HB 9796; B3 é descrito na Patente Americana número 5.242.813, e tem Número de Adesão ATCC HB 10573; e anticorpos recombinantes e quiméricos KS1/4 são descritos na Patente Americana número 4.975.369.
Componentes marcáveis de células tumorais incluem adicionalmente componentes liberados de células tumorais necróticas ou, de outra forma, danificadas, incluindo antigenos citosólicos e/ou nucleares de células tumorais. Esses são preferencialmente antígeno(s) intracelulares insolúveis presentes em células que podem ser induzidas à permeabilidade, ou em fantasmas celulares de células todas substancialmente neoplásicas e normais, que não são presentes ou acessíveis no exterior de células vivas normais de um mamífero. 304
Patentes Americanas números 5.019.368, 4.861.581 e 5.882.626, emitidos para Alan Epstein e colegasdescrevem e revelam ainda mais como fazer e usar anticorpos específicos para antígenos intracelulares que tornam-se acessíveis a partir de células malignas in vivo. Os anticorpos descritos são suficientemente específicos para componentes celulares internos de células malignas de mamíferos, mas não para componentes celulares externos. Alvos exemplares incluem histonas, mas todos os componentes intracelulares liberados a partir de células tumorais necróticas são incluídos. Na administração para um animal ou paciente com um tumor vascularizado, tais anticorpos localizam para as células malignas em virtude do fato que tumores vascularizados naturalmente contém células tumorais necróticas, devido aos processos de remodelagem tumoral que ocorrem in vivo e causam pelo menos uma proporção de células malignas a se tornarem necróticas. Além disso, o uso de tais anticorpos juntamente com outras terapias que aumentam a necrose tumoral servem para aumentar a eficiência de marcação e subsequente terapia. Esses tipos de anticorpos podem então ser usados como agentes marcadores e revelados aqui.
Uma gama de agentes marcadores adequados são disponíveis que se ligam a marcadores presentes no endotélio do tumor e estroma, mas amplamente ausentes de células normais, endotélio e estroma. Para a marcação da vasculatura tumoral, o anticorpo marcador ou ligante irá geralmente se ligar a um marcador expresso por, adsorvido a, induzido em ou, de outra forma, localizado nos vasos sanguíneos intratumorais de um tumor vascularizado. "Componentes da vasculatura tumoral" então incluem tanto moléculas da superfície celular endotelial da vasculatura tumoral e quaisquer componentes, tais como fatores de crescimento, que 305 podem ser ligados a esses receptores da superfície celular ou moléculas. As seguintes patentes suplementam ainda mais os presentes ensinamentos considerando a preparação e uso de agentes marcadores direcionados contra marcadores expressos, adsorvidos, induzidos ou localizados na vasculatura tumoral: Patentes Americanas números 5.855.866; 5.776.427; 5.863.538; 5.660.827; 5.855.866; 5.877.289; 6.004.554; 5.965.132; 6.036.955; 6.093.399; 6.004.555.
Exemplos de alvos expressos na superfície de tumores e vasos sanguíneos intratumorais incluem receptores da superfície celular vascular e moléculas de adesão a células (Thorpe e Ran, 2000, ver Tabela 1). Exemplos adequados incluem endoglina, marcada por, por exemplo, TEC-4, TEC-11, E-9 e anticorpos de Cnif; E-selectina, marcada por, por exemplo, anticorpos H4/18; VCAM-1, marcado por, por exemplo, anticorpos El/6 e 1.4c3; endosialina, marcada por, por exemplo, anticorpos FB5; integrina ανβ3, marcada por, por exemplo, LML609 e agentes marcadores de peptídios; o receptor VEGFR1 de VEGF, marcado por um número de anticorpos, e particularmente por VEGF; o complexo receptor VEGF, também marcado por um número de anticorpos, tais como 3E7 e GV39; e PSMA, marcado por anticorpos tais como J591. Exemplos tais como endoglina, receptores TGFP, E-selectina, P-selectina, VCAM-1, ICAM-1, um ligante reativo com LAM-1, um receptor VEGF/VPF, um receptor FGF, integrina (Χνβ3ΐη pleiotropina, endosialina são descritos e habilitados pelas Patentes Americanas números 5.855.866; 5.877.289; 6.004.555; 6.093.399.
Outros exemplos adicionais incluem proteoglicanas, tais como NG2, e matriz de metaloproteinases (MMPs), tais como MMP2 e MMP9, cada um marcado por agentes marcadores 306 particulares de peptídios (Thorpe e Ran, 2000). Esses são exemplos de enzimas remodeladoras que são expressas como entidades marcáveis no tumor, o qual é um sitio de remodelaqem vascular. Outros marcadores adequados são trombomodulina, Thy-1 e cistatina. Estudos identificando sequências elevadas no endotélio tumoral tem também identificado trombomodulina, MMP 11 (estromelisina) , MMP2 (qelatinase) e vários coláqenos como marcadores vasculares de tumor marcáveis, o que está também de acordo com as Patentes Americanas números 6.004.555 e 6.093.399.
Outro marcador adequado é PSMA (antiqeno de membrana específico a prostato). PSMA, inicialmente definido pelo anticorpo monoclonal 7E11, foi oriqinalmente identificado como um marcador de câncer de próstata e é conhecido por ser uma glicoproteína integral de membrana tipo 2. O anticorpo 7E11 se liga a um epítopo intracelular de PSMA que, em células viáveis, não está disponível para ligação. No contexto da presente invenção, PSMA é então marcado usando anticorpos para o domínio extracelular. Tais anticorpos reagem com o endotélio da vasculatura tumoral em uma variedade de carcinomas, incluindo pulmão, cólon e mama, mas não com endotélio vascular normal.
Muitos anticorpos que se ligam ao domínio externo de PSMA são prontamente disponíveis e podem ser usados na presente invenção. Anticorpos monoclonais 3E11, 3C2, 4E10- 1.14, 3C9 e 1G3 apresentam especificidades para diferentes regiões do domínio extracelular da proteína PSMA e são adequados para o uso aqui. Três anticorpos adicionais ao domínio extracelular de PSMA são J591, J415 E PEQ226.5, os quais confirmam a expressão de PSMA na vasculatura associada a tumor e podem ser usados na invenção. Como os ácidos 307 nucléicos que codificam PSMA e variantes relacionados são também prontamente disponíveis, Patentes Americanas números 5.935.818 e 5.538.866, anticorpos adicionais podem ser gerados, caso seja desejado.
Patente Americana número 6.150.508 descreve vários outros anticorpos monoclonais que se ligam ao domínio extracelular de PSMA, o qual pode ser usado na presente invenção. Qualquer um ou mais dos trinta e cinco anticorpos monoclonais exemplares reativos com PSMA expressos na superfície celular podem ser usados. Esses incluem, 3F5.4G6 (ATCC HB12060); 3D7-1.I. (ATCC HB12309); 4E10-1.14 (ATCC HB12310); 3E11 (ATCC HB12488); 4D8 (ATCC HB12487); 3E6 (ATCC HB12 486) ; 3C9 (ATCC HB12484); 2C7 (ATCC HB12490); 1G3 (ATCC HB12489); 3C4 (ATCC HB12494); 3C6 (ATCC HB12491); 4D4 (ATCC HB12493); 1G9 (ATCC HB12495); 5C8B9 (ATCC HB12492); 3G6 (ATCC HB12485); e 4C8B9 (ATCC HB12492).
Outros anticorpos,ou porções ligantes relacionadas, que reconhecem um domínio extracelular de PSMA são descritos nas Patentes Americanas números 6.107.090 e 6.136.311. Quatro linhas de células de hibridoma em particular são descritas, sendo E99, J415, J533 e J591 (ATCC HB-12101, HB-12109, HB-12127 e HB-12126), qualquer um ou mais dos quais podem então ser usados como um agente marcador de acordo com a invenção reivindicada.
Agentes marcadores que se ligam a marcadores "adsorvidos" são outro grupo adequado, tal como aqueles que se ligam a ligantes ou fatores de crescimento que se ligam ao tumor ou aos receptores da superfície celular da vasculatura tumoral. Tais anticorpos incluem aqueles que se ligam a VEGF, FGF, TGF$, HGF, PF4, PDGF, TIMP ou uma 308 isoforma de fibronectina associada ao tumor (Patentes Americanas números 5.877.289; 5.965.132; 6.093.399 e 6.004.555) .
Outros anticorpos de marcação adequados, ou fragmentos relacionados, são aqueles que se ligama epítopos que estão presentes em complexos ligante-receptor ou complexos fator de crescimento-receptor, mas ausentes tanto do ligante individual ou do fator de crescimento e do receptor. Tais anticorpos irão reconhecer e se ligar a um complexo ligante-receptor ou fator de crescimento-receptor, como apresentado na superfície celular, mas não se ligará ao ligante livre ou fator de crescimento do receptor não-complexado. Um "complexo ligado ao receptor", como usado aqui, então se refere ao complexo resultante produzido quando um ligante ou fator de crescimento especif icamente se liga ao seu receptor, tal como um receptor de fator de crescimento.
Esses aspectos são exemplificados pelo complexo receptor VEGF/VEGF. Tais complexos ligante-receptor estarão presentes em um número significantemente maior em células endoteliais associadas a tumor do que em células endoteliais não associadas a tumor, e podem então ser marcados por anticorpos anti-complexo. Anticorpos anti-complexo incluem os anticorpos monoclonais 2E5, 3E5 e 4E5 e fragmentos relacionados.
Antígenos induzíveis naturalmente e artificialmente por citocinas e coagulantes podem também ser marcados. Antígenos exemplares induzidos por ciocinas são E-selectina, VCAM-1, ICAM-1, endoglina, um ligante reativo com LAM-1, e mesmo antígenos MHC de classe II, os quais são induzidos por, por exemplo, IL-1, IL-4, TNF-a, TNF-β ou TNF-γ, como podem ser 309 liberados por monócitos, macrófagos, células mastro, células T helper, células T positivas para CD8, células NK ou mesmo células tumorais.
Além disso, antigenos induziveis incluem aqueles induziveis por um coagulante, tal como por trombina, Fator IX/IXa, Fator X/Xá, plasmina ou uma metaloproteinase (matriz de metaloproteinase, MMP). Geralmente, antigenos indutiveis por trombina serão usados. Esse grupo de antigenos incluem P-selectina, E-selectina, PDGF e ICAM-1, com a indução e marcação da P-selectina e/ou E-selectina sendo geralmente preferida.
Em outras modalidades, agentes marcadores da vasculatura e estroma (ver abaixo) da invenção serão agentes marcadores que são eles mesmos ligantes biológicos, ou porções relacionadas, ao invés de anticorpos. "Ligantes biológicos" nesse sentido serão aquelas moléculas que se ligam a ou se associam com moléculas de superfície celular, tais como receptores, que são acessíveis no estroma ou em células vasculares; como exemplificado com citocinas, hormônios, fatores de crescimento, e semelhantes. Qualquer tal fator de crescimento ou ligante pode ser usado desde que ele se ligue ao estroma ou vasculatura associada com a doença, por exemplo, a um receptor biológico específico presente na superfície de uma célula endotelial da vasculatura tumoral.
Fatores de crescimento adequados para uso nesses aspectos da invenção incluem, por exemplo, VEGF/VPF (fator de crescimento endotelial vascular/fator de permeabilidade vascular), FGF (família de proteínas de fator de crescimento de fibroblastos), TGFP (fator de crescimento transformador 310 Β), uma isoforma de fibronectina associada ao tumor, fator de espalhamento/fator de crescimento de hepatócito (HGF), fator plaquetário 4 (PF4), PDGF (plaqueta derivada do fator de crescimento), TIMP ou mesmo IL-8, IL-6 ou Fator XlIIa. VEGF/VPF e FGF serão geralmente preferidos.
Outros agentes de marcação adequados são aqueles que se ligama ao estroma associado ao tumor. Durante a progressão tumoral, a matriz extracelular do tecido ao redor é remodelada através de dois processos principais: a degradação proteolítica dos componentes da matriz extracelular do tecido normal; e a síntese de novo de componentes da matriz extracelular por células tumorais e células estromáticas ativadas por citocinas induzidas por tumor. Esses dois processos geram uma "matriz extracelular tumoral" ou "estroma tumoral", o qual é permissivo para progressão tumoral e é quantitativamente e qualitativamente distinto das matrizes extracelulares ou estroma de tecidos normais. 0 "estroma tumoral" então tem componentes marcáveis que não estão presentes em tecidos genuínos. Certos agentes marcadores estromáticos de tumor preferidos para uso na invenção são aqueles que se ligam a marcadores da membrana basal, colágeno tipo IV, laminina, heparan sulfato, proteoglicana, fibronectinas, plaquetas ativadas, LIBS, RIBS e tenascina. As seguinte patentes suplementam ainda mais os presentes ensinamentos considerando a preparação e uso de agentes marcadores estromáticos do tumor: Patente Americana número 5.877.289, 6.093.399, 6.004.555 e 6.036.955.
Componentes de tumor associados com estroma incluem componentes estruturais e funcionais do estroma, matriz 311 extracelular e tecidos conectivos. Agentes marcadores de estroma tumoral então incluem aqueles que se ligam a componentes tais como marcadores da membrana basal, colágenos tipo IV, laminina, fibrina, heparan sulfato, proteoglicanas, glicoproteinas, polissacaridios aniônicos tais como heparina e compostos semelhantes à hepaina e fibronectinas.
Anticorpos exemplares úteis são aqueles que se ligam à tenascina, uma glicoproteína extracelular de grande peso molecular expressa no estroma de vários tumores benignos e malignos. Anticorpos antitenascina podem então ser usados como agentes marcadores (Patentes Americanas números 6.093.399 e 6.004.555).
Outros agentes marcadores adequados incluem anticorpos e ligantes que se ligam a uma célula de músculo liso, um pericito, um fibroblasto, um macrófago, e um linfócito infiltrante ou leucócito. "Plaquetas ativadas" são outros componentes do estroma tumoral, como plaquetas se ligam ao estroma quando ativadas, e tais plaquetas podem então ser marcadas pela invenção.
Outros agentes marcadores estromais adequados, regiões que se ligam a antigenos e anticorpos relacionadas ligadas a componentes do estroma tumoral "indutivel", tal como aqueles induziveis por citocinas, e especialmente aqueles induzidos por coagulantes, tais como trombina. Um grupo de anticorpos antiestroma preferidos são aqueles que se ligam a RIBS, o sitio de ligação induzido por receptor, no fibrinogênio. "RIBS" é então um antigeno mercável, a expressão do qual no estroma é ditada por plaquetas ativadas. Anticorpos que se 312 ligam ao LIBS, o sítio de ligação induzido por ligante, em plaquetas ativadas são também úteis.
Elementos marcáveis particularmente preferidos em estroma associado ao tumor são geralmente as isoforma de fibronectina associadas ao tumor (FN) . Fibronectinas são constituintes de glicoproteínas multifuncionais, de alto peso molecular de tanto matrizes extracelulares quanto de fluidos corporais. Eles são envolvidos em muitos processos biológicos diferentes, tais como o estabelecimento e manutenção da morfologia normal da célula, migração celular, hemostasia e trombose, cicatrização de feridas e transformação oncogênica.
Isoforma de fibronectina são ligantes que se ligam à família de receptores da integrina. "Isoforma de fibronectina associadas ao tumor" podem ser consideradas como sendo parte da vasculatura tumoral e/ou do estroma tumoral. Isoforma de fibronectina têm heterogeneidade estrutural extensiva, a qual é realizada nos níveis transcricional, pós-transcricional e pós-translacional.
Diversidade estrutural em fibronectinas é primeiro efetuada pela união alternativa de três regiões (ED-A, Ed-B e IIICS) da transcrito de fibronectina primário para gerar pelo menos 20 diferentes isoforma. Assim como sendo regulada de uma forma específica tecidual e de desenvolvimento, sabe-se que a forma de união de RNAm-pré-fibronectina é desregulada em células transformadas e em malignidades. De fato, as sequências de isoforma de fibronectina contendo o ED-A, ED-B e IIICS são expressas em uma maior extensão em células tumorais malignas do que em células normais. 313
De forma particular, a isoforma de fibronectina contendo a sequência ED-B (isoforma B+), é altamente expressa em tecidos fetais e tumorais assim como durante a cicatrização de uma ferida, mas restrita na expressão em tecidos adultos normais. Moléculas de fibronectina B+ não são detectáveis em vasos maduros, mas sobrereguladas em vasos sanguíneos angiogênicos em situações normais (por exemplo, desenvolvimento do endométrio), angiogênese patológica (por exemplo, em retinopatia diabética) e no desenvolvimento tumoral. A isoforma de fibronectina chamada de B+ (B-FN) é então particularmente adequada para o uso com a presente invenção. A sequência ED-B é uma repetição da homologia completa do tipo-III codificada por um único éxon e compreendendo 91 aminoácidos. A presença da isoforma B+ por si só constitui um neoantígeno induzido por tumor, mas além disso, expressão de ED expõe um antígeno normalmente escondido na repetição 7 do tipo 3 (precedendo ED-B) ; desde que esse epítopo não é exposto em moléculas de fibronectina que não têm ED-B, segue-se que a expressão de ED-B induz a expressão de neoantígenos tanto direta quanto indiretamente. Esse sítio antigênico escondido forma o alvo do anticorpo monoclonal, BC-1 (European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, UK, número 88042101). O anticorpo BC1 pode ser usado como um componente marcador vascular da presente invenção.
Anticorpos melhorados com especificidade para a isoforma ED-B são descritos em WO 97/45544. Tais anticorpos tem sido obtidos como uma única cadeia de Fvs (scFvs) a partir de bibliotecas de regiões variáveis de anticorpos humanos expostos na superfície de bacteriófagos filamentosos (ver 314 também WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236 e WO/93/19172) .
Usando uma biblioteca de fagos anticorpos, scFvs especificas podem ser isoladas tanto por seleção direta em fragmentos de fibronectina recombinantes contendo o dominio ED-B e no próprio ED-B recombinante quando esses antigenos são cobertos em uma superfície sólida ("panning"). Essas mesmas fontes de antígeno tem também sido usadas com sucesso para produzir scFvs de "segunda geração" com propriedades melhoradas relativas aos clones de origem em um processo de "maturação de afinidade". Os scFvs isolados reagem fortemente e especificamente com a isoforma B+ na fibronectina humana, preferencialmente sem tratamento prévio com N-glicanase.
Os anticorpos da WO 97/45544 são então particularmente considerados para uso aqui. Em aplicações antitumorais, esses domínios de ligação de antígeno de anticorpos humanos são vantajosos como eles têm menos efeitos colaterais na administração humana. Os anticorpos referenciados se ligam ao domínio ED-B diretamente. Preferencialmente, os anticorpos se ligam tanto a fibronectina ED-B humana quanto à fibronectina ED-B não-humana, tal como uma de camundongo, permitindo a testagem e análise em animais modelos. Os fragmentos de anticorpo estendem-se para Fv (scFv), Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb de cadeia única e diacorpos.
Mesmo anticorpos ainda melhorados específicos para o domínio ED de fibronectina tem sido produzidos com constantes de dissociação subnanomolares, como descrito em WO 99/58570, e são ainda mais preferidos para uso aqui. Esses agentes marcadores são exemplificados pelo anticorpo L19, descrito 315 em WO 99/58570, ensina como fazer e usar esse e anticorpos relacionados. Esses anticorpos têm afinidade especifica para um epitopo caracteristico do dominio ED-B de fibronectina e tem afinidade melhorada para o epitopo ED-B.
Tais anticorpos recombinantes melhorados estão disponíveis no formato scFv, de uma biblioteca de exposição de fago de anticorpo. Em adição ao H10 e L19, o último do qual tem uma constante de dissociação para o domínio ED-B de fibronectina na faixa de concentração subnanomolar, as técnicas de WO 99/58570 podem ser preparadas para preparar anticorpos semelhantes. O isolamento de fragmentos de anticorpo humano scFv específicos para o domínio ED-B de fibronectina a partir de bibliotecas de exposição de fagos de anticorpos e do isolamento de um fragmento e anticorpo humano scFv ligando-se ao ED-B com afinidade subnanomolar são particularmente descritos nos Exemplos 1 e 2 do WO 99/58570.
Anticorpos preferidos então incluem aqueles com afinidade específica para um epitopo caracteristico do domínio ED-B da fibronectina, onde o anticorpo tem afinidade aumentada para o epitopo ED-B, onde a afinidade está na faixa subnanomolar, e onde o anticorpo reconhece fibronectina ED-B(+). Outros formatos preferidos são aqueles onde o anticorpo é um anticorpo scFv ou recombinante e onde a afinidade é aumentada pela introdução de um número limitado de mutações em seus resíduos CDR. Resíduos exemplares para serem mudados incluem 31-33, 50, 52 e 54 do domínio VH e resíduos 32 e 50 de seus domínios VL. Tais anticorpos são capazes de se ligar ao domínio ED-B de fibronectina com um Kd de 2 7 a 54 pM; como exemplificado pelo anticorpo L19 ou variantes funcionalmente equivalentes a partir do L19. 316 Q5. Conjugados antivirais
Sob condições normais, PE não é exposto na superfície celular. Entretanto, em vários estados de doença, PE foca exposto na superfície celular de um ou mais tipos celulares. Por exemplo, células endoteliais na vasculatura tumoral ficam positivas a PE e podem ser marcadas por terapêutica direcionada à PE, como apresentado aqui pelo tratamento tumoral bem sucedido usando duramicina conjugada ao HuIgG. PE também fica exposto na superfície celular de células infectadas por vírus, os quais são então marcadores adicionais para intervenção terapêutica usando os derivados do peptídio que se liga à PE da presente invenção. Realmente, a presente aplicação mostra que derivados de duramicina, como exemplificado por aqueles ligados à biotina e HuIgG, são agentes antivirais eficientes, tanto in vitro quanto in vivo. Várias drogas antivirais, incluindo AZT, aciclovir, ganciclovir, cidofovir (derivados da citosina) e novas drogas antivirais são limitadas pela toxicidade/eficácia. Baseadas em suas observações considerando alterações na PE durante infecção virai, e ainda à luz da eficácia dos derivados de Peptídios que se ligam à PE, originais, os presentes inventores tem problemas endereçados no campo antiviral pela projeção de novas terapêuticas antivirais com toxicidade reduzida e eficácia aumentada. Nas novas terapêuticas antivirais da invenção, drogas antivirais são ligadas a Peptídios que se ligam à PE, os quais funcionam para distribuir as drogas antivirais para células infectadas por vírus. 317
Além disso, os inventores tem as seguintes observações em consideração ao desenvolvimento do peptídio que se liga a PE, derivados antivirais da presente invenção. Dados são apresentados aqui para mostrar que derivados peptídicos que se ligam à PE, por exemplo, duramicina-L-biotina, são tomados por macrófagos in vivo, especialmente no pulmão, mesmo após administração sistémica. Na infecção, muitos vírus primeiro passam por células do sistema celular reticuloendotelial (RES), e o macrófago é a principal célula para a tomada virai. Então, pela ligação de drogas antivirais aos peptídios que se ligam à PE, tal como duramicina, o efeito antiviral da droga é direcionado ao tipo celular primário (macrófago) responsável por limpar vírus invasores.
Como os derivados peptídicos que se ligam à PE localizam em macrófagos no pulmão após administração sistémica irá naturalmente ser eficiente. Administração ao pulmão por métodos mais diretos, incluindo via aerossol, é também previsto. A presente invenção então soluciona deficiências importantes no campo do tratamento virai pelo fornecimento de remédios antivirais amplamente aplicáveis e práticos.
As novas terapêuticas antivirais da presente invenção então compreendem um peptídio que se liga à PE, preferencialmente usando uma ligação biologicamente liberável ou hidroliticamente lábil para ligar os dois agentes. Qualquer um de uma gama de agentes antivirais, incluindo qualquer agente desenvolvido como antiviral no futuro, pode ser ligado a um peptídio que se liga a PE para formar uma vantajosa terapêutica antiviral de acordo com essa invenção. Somando-se aos agentes chamados de antivirais clássicos, outros inibidores de DNA/RNA podem também estar ligados ao 318 peptídio que se liga a PE para formar um terapêutico antiviral. Agentes antivirais exemplares são listados na Tabela G, qualquer um ou mais dos quais pode estar ligado a um peptídio que se liga a PE para preparar um conjugado antiviral da invenção, ou pode ser usado separadamente nas terapias de combinação antivirais da invenção.
Tabela G Vírus causadores de doenças comuns e drogas antivirais Vírus causadores Categorias de doenças drogas de
Drogas antivirais exemplares
Herpes vírus
Cidofovir, aciclovir, penciclovir (famciclovir), gangciclovir, desoxiguanosina, foscarnet, idoxuridina, trifluorotimidina, vidarabina, sorivudina
Retrovírus
Inibidores transcriptase reversa nucleotídeos (RT) da Zidovudina, didanosina, de zalcitabina, lamivudina, estavudina, 319 abacavir, multinucleotideo de resistência A, multinucleotideo de resistência B Inibidores de RT não nucleotídeo Nevirapina, delavirdina, efavirenz, adefovir dipivoxil Inibidores da protease Indinavir, ritonavir, saquinavir, nelf inavir, amprenavir Antineoplásico especifico da fase do ciclo celular Hidroxiuréia (Hydrea™, Bristol Myers-Squibb) Hepatite B Desoxicitosina trifosfato, lamivudina trifosfato, emtricitabina trifosfato, adefovir difosfato, penciclovir trifosfato, lobucavir 320 trifosfato Hepatite C Interferon alfa, ribavirina Influenza A e B Amantadina, rimantadina, zanamivir, oseltamivir
Na faixa dos agentes e drogas antivirais, AZT e cidofovir são geralmente preferidos para ligação ao peptídio que se liga a PE, conjugado antiviral irá se ligar a macrófagos nos pulmões, para células infectadas por vírus e pode também se ligar a partículas virais. Dependendo do ligante ou da tecnologia de conjugação usada, a droga antiviral pode ser liberada na superfície da célula alvo e então ser tomada para dentro da célula. Preferencialmente, o conjugado por si só é tomado para dentro da célula, tal como por um macrófago ou célula infectada por vírus. A tomada pode ocorrer naturalmente ou pode ser mediada por vírus. Uma vez no interior da célula, assim como um conjugado de anticorpo, hidrólise do ligante libera o agente antiviral ativo.
Um exemplo de uma opção de ligante adequada para um agente antiviral duramicina-cidofovir é demonstrada na Figura 13R. Nesse exemplo, o conjugado duramicina-cidofovir é designado para se ligar a macrófagos nos pulmões e ser tomado na célula. Hidrólise do linker leva à decomposição do fosforamidato e liberação do cidofovir ativo ou um derivado permeável da célula (R na Figura 13R) que é quebrado a cidofovir. 321
Outros acoplamentos contendo ligações biologicamente lábeis podem ser usadas, tais como, por exemplo, disulfeto, ácido lábil, enzimaticamente clivável ou hidrolisável. Em acordo, qualquer ligação seletivamente hidrolisável ou biologicamente liberável descrita para uso em anticorpos ligantes para agentes terapêuticos pode ser usado juntamente com o peptidio que se liga a PE, derivados antivirais da presente invenção. A escolha do ligante não é limitada pelo peptidio que se liga a PE particular, tal como duramicina, pois o peptidio pode ser derivados para introduzir grupos funcionais permitindo a ligação do agente antiviral selecionado, como descrito acima. R. Métodos de tratamento antivirais
Além disso, presente invenção fornece uma variedade de anticorpos, imunoconjugados e derivados de peptídios que se ligam a PE, opcionalmente conjugados a agentes antivirais, para uso no tratamento de infecções virais. Os regimes de tratamento, e particularmente das doses, são geralmente como descrito acima para aspectos do tratamento de câncer da presente invenção, o que é adaptavelmente uma vantagem da invenção como um todo. Embora um entendimento do(s) mecanismo(s) particular(es) de ação não é necessário para praticar o tratamento antiviral da invenção, certos das razões subjacentes ao tratamento virai, como sustentado pelos exemplos funcionantes aqui, são como se segue.
Acredita-se que os mecanismos mais importantes estejam conectados com a replicação virai e com a ativação da célula hospedeiro. Durante a infecção virai, o virus ativa a célula durante seu processo de replicação dentro da célula. Esse processo de ativação celular é necessário para a replicação 322 virai, como mostrado pelo vírus da herpes, hepatite-C e HIV-1. Progressão do vírus ativa a expressão do gene, tanto virai quando hospedeiro. Por exemplo, a replicação do vírus Pichinde e vírus Machupo é inibida pela actinomicina D tarde no ciclo de replicação, indicando que a transcrição genética da célula hospedeiro é necessária para completar a replicação virai. A ativação da célula hospedeiro pelo vírus faz a célula externalizar fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios, tais como PS e PE. Em particular, os inventores entendem que a ativação virai causa fluxos de Ca2+ para dentro da célula, os quais ativam a escrambalase, externalizando fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios, particularmente PS e PE. Anticorpos, derivados peptídicos e conjugados que se ligam a fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios, preferencialmente PS e PE, então se ligam e interferem com o processo de ativação, evitando que o vírus esteja apto a se replicar de forma própria.
Os presentes exemplos mostram que a invenção age tarde no processo de infecção virai, bloqueando a maturação virai ou saída. Os estudos dos inventores mostram que o efeito inibitório dos agentes da invenção são amplamente aplicáveis, e isso tem sido demonstrado a funcionar em vírus que usam diferentes mecanismos de saída. Por exemplo, os exemplos presentes demonstram o bloqueio do vírus da herpes (CMV), o qual escapa das vesículas exocitóticas derivadas do Golgi, e bloqueio do arenavírus (vírus Pichinde) e paramixovírus (RSV), o qual brota para fora diretamente da membrana plasmática. 323 Células infectadas por vírus externalizam fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios, particularmente PS e PE, os quais são normalmente intracelulares, i.e., confinados à superfície interna da membrana plasmática. Durante a escapada do vírus, fosfolipídios redistribuem no sítio de saída, acomodando a dobra da membrana durante o desenvolvimento virai ou exocitose da membrana plasmática, e fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios são externalizados durante esse processo. Os anticorpos, derivados de peptídios e conjugados da invenção podem então se ligar aos fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios externalizados, particularmente PS e PE, e bloqueiam o escape do vírus da célula infectada. Ligação das construções da invenção a células infectadas por vírus é também apresentada nos exemplos presentes.
Os anticorpos, derivados peptídicos e conjugados da invenção podem além disso se ligar aos fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios externalizados, particularmente PS e PE, e interferir com uma ou mais vias de sinalização necessárias para a expressão do gene virai e/ou replicação.
Além disso, os próprios virions envelopados provavelmente tem fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios, tais como PS e PE, na sua superfície externa. Uma vez que vírus não têm uma translocase para manter ou refazer a assimetria fosfolipídica, exposição contínua de fosfolipídios tais como PS e PE é esperada. Os anticorpos, derivados peptídicos e conjugados da invenção podem então causar opsonização, ligação do complemento, fagocitose por células do hospedeiro e macrófagos e depuração de partículas virais livres. 324
Em ainda outro aspecto da invenção, vírus provavelmente precisam de fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios para infecção e/ou formação de sincitia. Os anticorpos, derivados peptídicos e conjugados da invenção podem além disso bloquear esses aspectos do ciclo de vida virai pela ligação a fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios.
De acordo com os critérios anteriores, e à luz dos exemplos presentes, o espectro do tratamento virai para a presente invenção se estende a qualquer vírus, quer seja envelopado ou não, DNA ou RNA. Como os anticorpos que se ligam a fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios, derivados peptídicos e conjugados da invenção pelo menos em parte bloqueiam a replicação virai dentro da célula, e/ou previnem a saída de vírus das células, a invenção não é limitada ao tratamento somente de vírus envelopados, nem a qualquer vírus particular, o que é uma vantagem importante. Por exemplo, trabalho publicado subsequente à invenção reporta que anexina V e vesículas de PS podem inibir infecção por HIV-1 de macrófagos, mas não podem inibir infecção por HIV-1 de células ou inibir outros vírus, tais como viris G da estomatite vesicular e vírus da leucemia de murina anfotrópica (Callahan et al., 2003).
Naturalmente, os anticorpos, derivados peptídicos e conjugados da invenção agem em vírus envelopados, particularmente aqueles vírus que têm fosfolipídios aniônicos e aminofosfolipídios, de PS e PE, na superfície externa do envelope, onde os anticorpos, derivados peptídicos e conjugados causam depuração virai e/ou inibição da entrada virai das células alvo. 325
Um importante aspecto da presente invenção é então que é universalmente aplicável, sendo adequado para o tratamento de vírus recombinantes, projetados e sintéticos, por exemplo, criados como parte do bioterrorismo. Realmente, a invenção não é limitada ao tratamento de animais e humanos. Como as categorias de hospedeiros encontrados no vírus taxa incluem algas, arqueas, bactérias, fungos, invertebrados, micoplasmas, plantas, protozoas, espiroplasmas e vertebrados, a invenção pode ser usada para inibir infecção virai e replicação em qualquer tal colocação, incluindo em vírus de importância para a agricultura. 0 tratamento da infecção virai e doenças associadas em vertebrados é atualmente preferido, e qualquer um ou mais dos vírus na Tabela H, os quais infectam animais vertebrados, podem ser inibidos, e a infecção resultante tratada, usando a presente invenção.
TABELA H Vírus de vertebrados
Família Gênero Espécie tipo Adenoviridae Mastadenovirus Adenovirus humano 2 Aviadenovírus Adenovirus de Vírus como febre de galinha 1 suíno africano Vírus de febre de suíno africano 326
Arenaviridae Arenavirus Arterivirus Virus da coriomeningite linfocitica Virus da arterite equina Astroviridae Astrovirus Astrovirus humano 1 Birnaviridae Aquabirnavirus Virus de necrose pancreática Avibirnavirus infeccioso Virus da doença da bolsa infecciosa Bunyaviridae Bunyavirus Virus bunyamwera Hantavirus Virus Hantaan Nairovirus Phleobovirus Virus da doença de ovelha Nabrobi Virus siciliano da febre de Sandfly Caliciviridae Calicivirus Exantema vesicular de virus suino Circoviridae Circovirus Virus da anemia de galinha 327
Coronaviridae Coronavirus Torovirus Deltavirus Vírus da bronquite infecciosa de aves Berne vírus Delta vírus da hepatite Filoviridae Filovirus Vírus de Marburg Flaviviridae Flavivirus Pestivirus Vírus semelhantes ao da hepatite C Vírus da febre amarela Vírus da diarréia bovina Vírus da hepatite C Hepadnaviridae Orthophepadnavirus Avihepadnavirus Vírus da hepatite B Vírus da hepatite B de pato Herpesviridae Subfamília Alphaherpesvirin ae Simplexvirus Herpesvirus humano 1 Herpesvirus humano 328
Subfamília
Betaherpesvirina e
Subfamília
Gammaherpesvirin ae
Iridoviridae
Varicellovirus
Citomegalovirus
Muromegalovirus
Roseolovirus
Lymphocryptovirus
Rhadinovirus
Ranavirus
Lymphocystivirus Vírus como vírus Goldfish de 3
Herpesvirus humano 5 Citomegalovirus de camundongo 1
Herpesvirus humano 6
Herpesvirus humano 4 Herpesvirus atelino 2 Vírus Vírus Vírus 1 de sapo 3 de linguado de Goldfish 329
Orthomyxoviridae
Influenzavirus A, B
Influenzavirus C Vírus como Thogoto Vírus de influenza A Vírus de influenza C Vírus Thogoto
Papovaviridae
Polyomavirus
Papillomavirus
Poliomavirus de murina Papilomavirus de lebre dos EUA (Shope)
Paramyxoviridae
Subfamília
Paramyxovirinae
Subfampilia
Pneumovirinae
Parayxovírus
Morbillivirus
Rubulavirus
Pneumovirus Vírus de parainfluenza humano 1 Vírus de sarampo Vírus de caxumba Vírus sincitial respiratório humano 330
Parvoviridae Subfamília Parovirinae Parvovirus Vírus minúsculo de camundongo Erythovirus Vírus B19 Dependovírus Vírus 2 adeno-associado Picornaviridae Enterovirus Poliovírus 1 Rhinovirus Rinovírus humano IA Hepatovirus Vírus da hepatite A Cardiovirus Vírus da encefalomiocardite Vírus 0 da doença de pés e boca Aphthovirus Poxviridae Subfamília 331
Chordopoxvirinae Orthopoxvirus Vírus vaccinia Papapoxyvirus Vírus de Orf Avipoxvirus Vírus de galinha Capripoxvirus Vírus de carneiro Leporipoxvirus Vírus de myxoma Suipoxvirus Vírus de suíno Molluscipoxvirus Vírus de molusco contagioso Yatapoxvirus Vírus de tumor de macaco Yaba Reoviridae Orthoreovirus Reovírus 3 Orbivirus Vírus da língua azul 1 Rotavirus Rotavirus simiano SA 11 Coltivirus Vírus da febre de carrapato do Colorado Vírus de peixe dourado 332
333
Ephemerovirus passageira Togaviridae Alphavirus Vírus de Sindbis Rubivirus Vírus da rubéola 0 uso da invenção no tratamento de infecções virais e doenças associadas em mamíferos é preferido, particularmente em termos de animais de valor ou estimados tais como cavalos de corrida e animais de estimação, e animais e pássaros usados para produzir comida diretamente (por exemplo, carne) ou indiretamente (por exemplo, leite e ovos) para consumo humano. Além do tratamento humano, modalidades exemplares da invenção incluem o tratamento de cavalos, cachorros, gatos e assim por diante; o tratamento de vacas, porcos, javalis, ovelhas, cabras, búfalos, bisões, lhamas, cervos, alces, e outros animais grandes, assim como seus novos, incluindo bezerros e cordeiros. 0 tratamenro de humanos é particularmente preferido, seja para vírus de ocorrência natural ou para aqueles criados pelo bioterrorismo. Em termos de vírus de ocorrência natural e das doenças resultantes, a invenção novamente é ilimitada em suas aplicações. Em acordo, qualquer um ou mais dos vírus na Tabela J pode ser inibido usando a presente invenção, e as infecções resultantes e doenças então tratadas.
TABELA J
Doenças virais em humanos 334
Doença Vírus Tipo de vírus AIDS Vírus da imunodeficiência humana (HIV) Retrovirus Bronquiolite e pneumonia virai Vírus sincitial respiratório Paramyxovirus Bronquiolite Vírus parainfluenza Paramyxovirus Câncer cervical Papiloma vírus humano Papovavirus Catapora Vírus varicela-zoster Herpesvirus Dengue Vírus da dengue Flavivirus Febre hemorrágica do ebola Vírus ebola Filovirus Herpes genital Vírus-2 de herpes simplex Herpesvirus Febre hemorrágica do hantavirus Hantavirus Bunyavirus Hepatite Hepatite A Picornavirus Hepatite B Hepadavirus Hepatite C Flavivirus 335
Hepatite D Deltavirus Hepatite E Calcivirus Influenza Virus influenza A, B e C Orthomyxovirus Febre hemorrágica argentiniana junina Virus junino Arenavirus Febre hemorrágica de Lassa Virus Lassa Arenavirus Febre hemorrágica de Machupo Virus Machupo Arenavirus Sarampo Vírus rubéola Paramyxovirus Mononucleose Vírus Epstein-Barr Herpesvirus Doença CMV (pneumonia virai, sindrome como mononucleose) Citomegalovírus Herpesvirus Sindrome respiratória aguda severa (SARS) Coronavirus humano Coronavirus Herpes-zóster Vírus varicela-zoster Herpesvirus 336
Varíola Vírus varíola Poxvirus Febre amarela Vírus da febre amarela Flavivirus Doença do oeste do Nilo Vírus do Oeste do Nilo Encefalite equina ocidental Vírus ocidental EE Togavirus Pneumonia, hepatite, doença respiratória aguda Adenovirus Adenovirus Gastoenterite Rotavirus Rotavirus Encefalite Vírus da floresta de Semliki Alphavirus Varíola bovina Vírus vaccinia Poxvirus Encefalite EE venezuelano Alphavirus Meningite, encefalite, meningoencefalite Coriomeningite linfocítica Arenavirus Febre hemorrágica venezuelana Guanarito vírus Arenavirus Febre do vale da greta (febre hemorrágica, Vírus da febre do vale da greta Bunyavirus 337 encefalite) Febre hemorrágica de Marburg Vírus Marburg Filovirus Encefalite originada em carrapato Vírus da encefalite originada em carrapato (TBEV) Flavivirus Encefalite Vírus hendra Paramyxovirus Encefalite Vírus niphan Paramyxovirus Febre hemorrágica da Criméia-Congo Vírus da febre hemorrágica da Criméia-Congo Bunyavirus Febre hemorrágica brasileira Vírus sabia Arenavírus A invenção é particularmente considerada para uso no tratamento de doenças relacionadas com CMV tais como pneumonia virai, sindrome como mononucleose, e malformações congenitais associadas (surdez e retardo mental); doenças respiratórias, tais como aquelas causadas pelo RSV, incluindo bronquiolite e pneumonia virai, influenza, o frio comum e SARS; AIDS, hepatite; cânceres associados com infecções virais; mononucleose; e varíola.
Em outras modalidades, os inventores particularmente consideram a inibição dos arenavírus, os quais são patogênicos no homem. Os arenavírus incluem o vírus do Velho 338
Mundo responsável pela febre de Lassa (Lassa vírus) e coriomeningite linfocítica (LCMV). Febre de Lassa é endémica na África Ocidental, afetando até 300.000 pessoas anualmente e causando até 3000 mortes. Infecção com febre de Lassa leva a febre e mal-estar dentro de cerca de 10 dias. Dor abdominal, náusea, vómito e diarréia são comuns. Faringite e tosse podem ocorrer. Sintomas neurológicos são geralmente brandos. Síndromes de vazamento vascular tais como efusões pleurais e edema, estão presentes nos casos mais severos. Hemorragia é vista em cerca de um quarto dos pacientes. A doença pode causar alterações no sistema cardiovascular que culminam em choque e morte.
Arenavírus também incluem e os vírus do Novo Mundo antigenicamente distintos responsáveis pela febre hemorrágica argentina (vírus Junin), febre hemorrágica boliviana (vírus Machupo) e febre hemorrágica venezuelana (vírus Guaranito). Todos esses vírus estão na categoria A do CDC como armas potenciais de bioterrorismo.
Embora não interligado com aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos, outros anticorpos que se ligam a vírus diretamente tem sido desenvolvidos em drogas aprovadas. Isto se aplica para o CytoGam, o qual é usado para suprimir infecções CMV em pacientes imunosuprimidos, e Synagis, o qual é usado para proteger recém-nascidos de doenças sincitiais respiratórias. Então, não há problemas no uso de anticorpos monoclonais para acessar e neutralizar vírus em tecidos.
As doses que são adequadas para as modalidades antitumorais são também adequadas para os tratamentos antivirais. Semelhantemente, administração múltipla pode ser usada para 339 infecções crónicas, e altas doses podem ser usadas para infecções agudas. Qualquer rota adequada de administração pode ser empregada, novamente como revelado para aspectos do tratamento de câncer, incluindo IV, IM, SC, como um aerossol para pulmões ou vias aéreas e coisas do tipo.
As terapêuticas fornecidas pela invenção são agentes valiosos tendo um amplo espectro de atividade antiviral. Além de ser eficaz contra um grande número de vírus potencialmente letais, os agentes podem também ser administrados após exposição ao vírus, mesmo em colocações onde a natureza exata do vírus não é conhecida. Então, as terapias antivirais da presente invenção não requerem um prolongado período de tempo entre a identificação do patógeno e distribuição da terapia, em contraste marcado com o tempo e gasto requerido pelo desenvolvimento, produção ou distribuição de vacinas específicas.
Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deve-se ter em apreço por aqueles indivíduos versados na técnica que as técnicas reveladas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção, e então podem ser consideradas como constituindo métodos preferidos para sua prática. EXEMPLO 1 (exemplo de referência)
Tratamento tumoral com coaquligante anti-VCAM-l-tTF 0 presente exemplo mostra a coagulação específica da vasculatura tumoral in vivo que resulta do seguimento da 340 administração de um coagulante tumoral direcionado à vasculatura ("coaguligante") para animais com tumor e os efeitos antitumorais resultantes. Nesse coaguligante, um anticorpo direcionado ao VCAM-1 (molécula-1 de adesao endotelial vascular, VCAM-1) é usado como um agente alvejando para distribuir Fator Tecidual cortado (tTF), uma forma modificada de um coagulante humano, à vasculatura tumoral. 0 hibridoma MK2.7, secretando um anticorpo IgGi de rato contra VCAM-1 de murina, foi obtido da Coleção Americana de Culturas de Espécies (ATCC, Rockville, MD; ATCC CRL 1909). O hibridoma R187, secretando um anticorpo de IgG de rato contra proteína virai de murina p30 gag, foi também obtido a partir do ATCC, e foi usado como isotipo de controle equiparado para o anticorpo anti-VCAM-1.
Os vasos sanguíneos dos vasos maiores e o tumor de camundongos com L540 humana subcutânea de tumor de Hodgkin foram examinados imunoistoquimicamente para expressão de VCAM-1 usando um anticorpo anti-VCAM-1. Além de tudo, expressão de VCAM foi observada em 20-30% dos vasos sanguíneos tumorais totais manchados pelo anticorpo anti-endogolina, MJ 7/18, usado como um controle positivo. Expressão vascular constitutiva de VCAM-1 foi encontrada no coração e pulmões tanto em animais com tumor quanto em animais normais. Manchamento estromático forte foi observado em testículos onde a expressão de VCAM-1 foi estritamente extravascular.
Camundongos apresentando tumores L450 subcutâneos foram injetados intravenosamente com anticorpo anti-VCAM-1 e, duas horas depois, os camundongos foram dessangrados. O tumor e 341 órgãos normais foram removidos e seções congeladas foram preparadas e examinadas imunoistoquimicamente para determinar a localização do anticorpo. Anticorpo anti-VCAM-1 foi detectado no endotélio do tumor, coração e pulmão. Manchamento foi especifico como nenhum manchamento do endotélio foi observado no tumor e órgãos de camundongos injetados com uma espécie de anticorpo equiparado ao isotipo de especificidade irrelevante, R187. Nenhuma localização de anticorpo anti-VCAM-1 foi encontrada nos testículos ou em qualquer outro órgão normal, exceto coração e pulmão.
Um conjugado anti-VCAM-l«tTF ou "coaguligante" foi preparado usando fator tecidual cortado (tTF). Administração intravenosa do coaguligante anti-VCAM-l»tTF induz a trombose seletiva dos vasos sanguíneos tumorais, em oposto aos vasos em tecidos normais, em camundongos com tumor. 0 coaguligante anti-VCAM-l*tTF foi administrado aos camundongos com tumores L450 subcutâneos de 0,4 a 0,6 cm em diâmetro. Antes da injeção do coaguligante, tumores eram saudáveis, tendo uma morfologia uniforme não tendo regiões de necrose. Os tumores eram bem vascularizados e tinham ausência completa de vasos trombosados espontaneamente ou hemorragias. Em quatro horas após a injeção do coaguligante, 40-70% dos vasos sanguíneos estavam trombosados, apesar do manchamento inicial de somente 20-30% dos vasos sanguíneos tumorais. Os vasos trombosados continham agregados de plaquetas oclusivas, eritrócitos empacotados e fibrina. Em várias regiões, os vasos sanguíneos tinham se rompido, derramando eritrócitos no interstício tumoral.
Em 24 horas após a injeção do coaguligante, os vasos sanguíneos ainda estavam ocludidos e hemorragia extensa 342 tinha se espalhado pelo tumor. Células tumorais tinham se separado umas das outras, tinham ácido nucléico picnótico e estavam sofrendo citólise. Em 72 horas, necrose avançada estava evidente pelo tumor. É provável que a deposição de trombina induzida por coaguligante inicial resulte em aumento da indução do antigeno alvo VCAM-1 em vasos centrais, então amplificando o alvejamento e a destruição do tumor. A ação trombótica de anti-VCAM-l*tTF nos vasos tumorais foi antigeno especifica. Nenhum dos reagentes de controle administrados em quantidades equivalentes (tTF sozinho, anticorpo anti-VCAM-1 sozinho, tTF mais anticorpo anti-VCAM-1 ou o coaguligante controle de especificidade irrelevante) causaram trombose.
Além da trombose dos vasos sanguíneos tumorais, esse estudo também mostra que administração intravenosa do coaguligante anti-VCAM-l*tTF não induz trombose dos vasos sanguíneos em órgãos normais. Apesar da expressão de VCAM-1 em vasos no coração e pulmão de camundongos normais ou com tumor L450, trombose não ocorreu após administração de coaguligante anti-VCAM-l*tTF. Nenhum sinal de trombose, dano tecidual ou alteração de morfologia foi visto em 25 camundongos injetados com 5 a 45 μg de coaguligante 4 ou 24 horas mais cedo. Existia uma aparência histológica normal do coração e pulmão do mesmo camundongo que tinha maior trombose tumoral. Todos os outros órgãos maiores (cérebro, fígado, rim, baço, pâncreas, intestino, testículos) também tinham morfologia inalterada.
Seções congeladas de órgãos e tumores de camundongos tratados com coaguligantes deram padrões de manchamento 343 coincidentes quando desenvolvidos seja com o anticorpo anti-TF, 10H10, ou um anticorpo anti-rato IgG e confirmado que o coaguligante tinha se localizado em vasos no coração, pulmão e tumor. A intensidade do manchamento era igual àquela vista quando coaguligante foi aplicado diretamente às seções em altas concentrações seguido pelo desenvolvimento com anti-TF ou IgG anti-rato, indicando que a saturação da ligação tinha sido atingida in vivo.
Esses estudos mostraram que a ligação do coaguligante ao VCAM-1 na vasculatura normal no coração e pulmão não é suficiente para induzir trombose, e que a vasculatura tumoral fornece fatores adicionais para suportar a coagulação.
Atividade antitumoral do coaguligante anti-VCAM-l*tTF foi determinada em camundongos SCID com tumores de L540 de 0,3-0,4 cm3. A droga foi administrada intravenosamente três vezes em intervalos de quatro dias. A média do volume tumoral de camundongos tratados com anti-VCAM-l*tTF foi significantemente reduzido em 21 dias de tratamento (P < 0,001) em comparação com todos os outros grupos. Nove de um total de quinze camundongos tratados com o coaguligante especifico apresentaram mais de 50% de redução no volume tumoral. Esse efeito foi especifico uma vez que tTF não-conjugado, coaguligante de IgG controle e mistura de anticorpo anti-VCAM-1 e tTF não afetaram o crescimento tumoral.
EXEMPLO II
Expressão de fosfatidilserina em vasos sanguíneos tumorais 344
Para explicar a falta de efeito trombótico do anti-VCAM-l«tTF na vasculatura positiva para VCAM-1 no coração e pulmões, alguns inventores desenvolveram um conceito de aminofosfolipídio e fosfolipídio aniônico diferencial, por exemplo, PS e PE, localização entre vasos sanguíneos Tumorais e normais. Especificamente, eles levantaram a hipótese de que células endoteliais em tecidos normais segregam aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos, por exemplo, PS e PE, à superfície interna da bicamada fosfolipídica da membrana plasmática, onde o PS é incapaz de participar em reações trombóticas; Considerando que células endoteliais em tumores translocam aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos para a superfície externa da membrana plasmática, onde PS pode suportar a ação coagulante do coaguligante. Expressão de PS na superfície celular permite a coagulação porque ela capacita a ligação dos fatores de coagulação para a membrana e coordena a montagem dos complexos de iniciação de coagulação. 0 modelo do inventor de translocação de aminofosfolipídio e fosfolipídio aniônico para a superfície das células endoteliais dos vasos sanguíneos tumorais, como desenvolvido aqui, é surpreendente que a expressão de PS não ocorre depois, e não engatilha inevitavelmente a morte celular. Expressão de aminofosfolipídio e fosfolipídio aniônico na superfície da célula endotelial tumoral é então suficientemente estável para permitir que aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos, por exemplo, PS e PE, sirvam como entidades alvejáveis para intervenção terapêutica.
Para confirmar a hipótese de que o endotélio de vaso sanguíneo tumoral expressa PS na superfície luminal da membrana plasmática, os inventores usaram o seguinte estudo 345 imunoistoquímico para determinar a distribuição de anticorpo anti-PS após injeção intravenosa em camundongos com tumor L450. A. Métodos
Anticorpos anti-PS e anticardiolipina, ambos anticorpos IgM monoclonais de camundongo, foram produzidos e caracterizados por Rote et ai. (1993, incorporado aqui por referência) como descrito no Exemplo IV. A maior reatividade do 3SB é com PS, mas ele também tem reatividade com o fosfolipidio aniônico, ácido fosfatidico, um componente relativamente menor da membrana plasmática também firmemente segregado ao foliolo interno em células normais.
Camundongos com tumor L540 foram injetados intravenosamente com 20 μρ de anticorpos IgM de camundongo ou anti-PS ou anticardiolipina. Após 10 minutos, camundongos foram anestesiados e suas circulações sanguíneas foram perfundidas com salina heparinizada. Tumores e tecidos normais foram removidos e rompidos com congelamento. Seções em série dos órgãos e tumores foram manchadas ou com IgM anticamundongo marcada com HRP para detecção de anticorpo anti-PS ou com anticorpo anti-VCAM-1 seguido por Ig anti-rato marcada com HRP.
Para preservar os fosfolipídios da membrana nas partes congeladas, o seguinte protocolo foi desenvolvido. Animais foram perfundidos com DPBS contendo 2,5 mM de Ca2+. Tecidos foram levantados em lâminas cobertas por 3-aminopropiltrietoxisilano e foram manchadas dentro de 24 horas. Nenhum solvente orgânico, formaldeído ou detergentes foram usados para fixação ou lavagem das lâminas. Lâminas 346 foram reidratadas por DPBS contendo 2,5 mM de Ca2+ e 0,2% de gelatina. A mesma solução também foi usada para lavar seções para remover o excesso de reagentes. Seções foram incubadas com IgM ant icamundongo marcadas com HRP por 3,5 horas a temperatura ambiente para detectar IgM anti-PS. B. Resultados
Este estudo imunoistoquímico mostrou que anticorpo anti-PS localizado dentro de 10 minutos para a maioria dos vasos de sangue tumorais, incluindo vasos na região central do tumor que podem não ter VCAM-1. Vasos que foram positivos para VCAM-1 foram também positivos para PS. Então, existe expressão coincidente de PS nos vasos que expressam VCAM-1 em tumores.
Nos estudos de localização in vivo, nenhum dos vasos em órgãos normais, incluindo vasculatura positiva para VCAM-1 do coração e pulmão, foram manchados, indicando que PS é ausente da superfície externa das células endoteliais. Em contraste, quando seções de tecidos normais e tumores foram diretamente marcados com anticorpo anti-PS in vitro, nenhuma diferença foi visível entre normais e tumorais, endotélio ou outros tipos de célula, mostrando que PS está presente nessas células mas apenas é expresso na superfície de células endoteliais em tumores. A especificidade da detecção de PS foi confirmada por dois estudos independentes. Primeiro, um anticorpo monoclonal de IgM de camundongo direcionado contra um lipídio carregado negativamente diferente, cardiolipina, não retornou ao tumor ou quaisquer órgãos in vivo. Segundo, pré-tratamento de seções congeladas com acetona aboliram manchamento com 347 anticorpo anti-PS, presumivelmente porque ele extraiu os lipídios juntamente com o anticorpo anti-PS ligado.
EXEMPLO III
Anexina V bloqueia a atividade coaguligante 0 presente exemplo fornece mais evidências do papel da expressão de PS superficial na atividade coaguligante a partir de estudos usando o ligante PS de alta afinidade, anexina V, que se liga para bloquear a função da PS in vitro e in vivo. A. Anexina V bloqueia ativação do coaguligante do fator X in vitro A capacidade da anexina V de afetar a formação do fator Xá induzida pelo coaguligante foi determinada por um ensaio cromogênico. Células bEnd.3 estimuladas com IL-ΐα foram incubadas com anti-VCAM-l«tTF e permeabilizadas por saponina. Anexina V foi adicionada em concentrações variando de 0,1 a 10 μρ/ηϋ, e células foram incubadas por 30 minutos antes da adição de Proplex T diluído. A quantidade de Fator Xá gerada na presença ou ausência de anexina V foi determinada. Cada tratamento foi feito em duplicata e repetido pelo menos duas vezes. A necessidade para a expressão de PS na ação coaguligante é além disso indicada pela descoberta dos inventores de que anexina V, a qual se liga a PS com alta afinidade, bloqueia a capacidade de células bEnd.3 ligadas a anti-VCAM-l*tTF de gerar fator Xá in vitro. 348
Anexina V adicionada a células permeabilizadas pré-incubadas com anti-VCAM-l*tTF inibiram a formação do fator Xá de uma forma dose dependente. Na ausência de Anexina V, coagiuligante ligado à célula produziu 95 ng de fator Xá por 10.000 células por 60 minutos. A adição de quantidades crescentes de Anexina V (na faixa dos μρ por mL) inibiram a produção de fator Xá. Em 10 μρ/mL, Aexina V inibiu a produção de Fator Xá em 58%. Nenhuma inibição adicional foi observada pelo aumento da concentração de Anexina V durante o ensaio, indicando que Anexina V saturou todos os sítios de ligação disponíveis em 10 μρ/mL. B. Anexina V bloqueia atividade coaguligante in vivo. A capacidade da anexina V de inibir trombose induzida por coaguligante in vivo foi examinada em camundongos SCID com L540 de Hodgkin. Tumores foram crescidos em camundongos e dois camundongos por grupo (tamanho do tumor de 0,5 cm em diâmetro) foram injetados intravenosamente via veia do rabo com um dos seguintes reagentes: a) salina; b) ; 100 μρ de anexina V; c) 40 μρ de anti-VCAM-l«tTF; d) 100 μρ de anexina V seguida em duas horas mais tarde por 40 μρ de anti-VCAM-l«tTF.
Quatro horas após a última injeção os camundongos foram anestesiados e perfundidos com salina heparinizada. Tumores foram removidos, fixados com 4% de formalina, embebidos em parafina e manchados com hematoxilina-eosina. O número de vasos sanguíneos trombosados e não-trombosados foi contado e a percentagem de trombose foi calculada. 349
Anexina V também bloqueia a atividade do coaguligante anti-VCAM—l*tTF in vivo. Grupos de camundongos com tumor foram tratados com um dos reagentes de teste ou controle. Deu-se aos camundongos (a) salina; (b) 100 μg de anexina V; (c) 40 μg de coaguligante anti-VCAM-l*tTF; ou (d) 100 μg de anexina V e, 2 horas mais tarde, 40 μg de coaguligante anti-VCAM-l*tTF. Resultados idênticos foram obtidos em ambos os camundongos por grupo.
Nenhuma trombose espontânea, hemorragias ou necroses foram observadas nos tumores derivados de camundongos injetados com salina. Tratamento somente com Anexina V não alterou a morfologia tumoral.
De acordo com outro dado apresentado aqui, 40 μρ de coaguligante anti-VCAM-l«tTF causou trombose em 70% dos vasos sanguíneos tumorais totais. A maior parte dos vasos sanguíneos foi oclusa com eritrócitos empacotados ou coágulos, e células tumorais foram separadas umas das outras. Tanto os efeitos antitumorais quanto os induzidos por coaguligantes, i.e., trombose intravascular e alterações na morfologia da célula tumoral, foram completamente abolidos pelo pré-tratamento dos camundongos com Anexina V.
Essas descobertas confirmam que os efeitos antitumorais dos coaguligantes são mediados pelo bloqueio da vasculatura tumoral. Esses dados também demonstram que o PS é essencial para trombose induzida por coaguligantes in vivo.
EXEMPLO IV
Geraçao de_anticorpos para aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos 350
Esse exemplo descreve um protocolo de imunização feito pelos inventores à luz de suas observações na translocação de aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos nas células endoteliais vasculares tumorais, e descobriram que funcionam bem na geração de anticorpos contra aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos. Um número de anticorpos reativos com aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos, tais como PS e PE, foram obtidos. No exemplo presente e nos seguintes, por simplicidade, anticorpos reativos com PS podem ser nomeados "anticorpos anti-PS", embora a ligação de alguns desses anticorpos não se restringe ao PS mas se estende também a certos outros aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos, como apresentado aqui. A. Protocolo de imunização
Para apresentar aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos ao sistema imune como imunógenos mais fortes, os aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos foram formulados como células positivas para aminofosfolipídios ou fosfolipídios aniônicos. Os aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos inseridos na membrana, rodeados por outros componentes da membrana, têm uma melhor conformação e grau de depuração para aumentar anticorpos. A intenção é imunizar animais imunocompetentes com células autólogas expressando aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos, como exemplificado nesse exemplo por PS, onde os animais poderiam não produzir anticorpos contra todos os antígenos seguros de superfície, mas poderiam reconhecer fosfolipídios expostos na membrana, por exemplo, PS, como um elemento estranho. 0 procedimento é aplicável para o uso de quaisquer animais de laboratório padrões, tais como 351 camundongos BALB/c imunocompetentes e ratos de Lewis, com quaisquer células positivas para aminofosfolipidios ou fosfolipidios aniônicos. Camundongos BALB/c e células de endotelioma de camundongo, bEnd.3 foram cultivadas em 10% DMEM com 9 mL/500 mL de tampão HERPES, em encubadora com 10% de CO2. As células bEnd.3 foram expandidas em frascos T175 TC até o número de células desejadas ser obtido. Tipicamente, cada frasco em 70-80% de confluência tem cerca de 3 x 106 células, e cada camundongo deveria receber de 1 x 106 a 20 x 106 células até 1 x 107 células. Células bEnd.3 são tratadas com de 50 μΜ a 200 μΜ de peróxido de hidrogénio durante 1 a 2 horas a 37 °C para expor fosfolipidios aniônicos, tais como PS, antes da imunização. 0 estoque de H2O2 é [9,8M] ; 30% (v/v). Este é diluído 1:1000, então 0,4 mL é adicionado no frasco de T175 TC com 40 mL de meio até uma concentração final de 100 μΜ de H2O2. As células foram mantidas por 1 hora a 37 °C. Para coletar, as células foram lavadas 3 vezes com PBS aquecido + 10 mM de EDTA, para remover todo o BSA ou proteína sérica no meio. As células foram removidas com tratamento suave de tripsina, lavadas e centrifugadas por 5 minutos a 1000 rpm. O sobrenadante foi aspirado e as células resuspendidas em DMEM sem aditivos até o volume apropriado (cada camundongo recebe cerca de 1 χ 107 células em 200 μι) e mantidas em gelo. Células tratadas dessa forma foram injetadas (200 μΕ de suspensão celular) em cada camundongo IP usando seringa de 1 mL e 23 agulhas aferidas. Camundongos foram imunizados de três a sete vezes em intervalos de 3 a 4 semanas. Soro imune foi coletado pela sangria dos camundongos dez dias após cada 352 impulso, começando do segundo impulso. 0 titulo do soro para anti-PS foi testado por ELISA.
Essas imunizações com células positivas para PS sutólogas não resultaram na produção irrestrita de autoanticorpos, mas se limitaram à produção de anticorpos reativos com PS ou reativos com PS em combinação com outros aminofosfolipídios e fosfolipidios aniônicos.
Em outro estudo, ratos de Lewis fêmeas foram imunizados com células endoteliais bEnd.3 que tenham sido tratadas com 200 μΜ de peróxido de hidrogénio por 2 horas. O Tratamento causou translocação de fosfolipidios aniônicos para a superfície externa em 70-90% das células conforme detectado por Anexina V marcada com iodo. Células tratadas foram lavadas, separadas e contadas. Dois milhões de células foram suspendidas em PBS estéril e injetadas 5 vezes i.p., com intervalos de 3 semanas entre as injeções. O título dos anticorpos policlonais para fosfolipídios aniônicos foi determinado dois dias após cada imunização. B. Antisoro de alto título
Camundongos com títulos extremamente altos de anticorpos reativos com fosfolipídios aniônicos, tais como PS foram obtidos (Tabela 1). Os camundongos não apresentaram quaisquer sinais de toxicidade. Embora esse protocolo de imunização eram mais eficientes em camundongos do que em ratos de uma forma geral, imunização de ratos foi eficiente e produziu o anticorpo 9D2 (ver abaixo). TABELA 1 353
Geraçao de anticorpos IgG anti-PS
Faixa do titulo Número de camundongos por grupo (% do total) 1:100 - 1:1.000 2/30 (6,66%) 1:1000 - 1:10.000 5/30 (16,6%) 1:10.000 - 1:100.000 18/30 (60%) 1:100.000 - 1:1.000.000 5/30 (16,6%)
Em imunizações adicionais, vários camundongos foram imunizados três vezes com células bEnd.3 tratadas com peróxido de hidrogénio e o soro foi testado 54 dias após a primeira imunização. Anticorpos IgG reativos com PS no soro foram detectados com uma IgG anticamundongo, Fc especifico de anticorpo secundário, e anticorpos igM no soro foram detectados com uma IgG mu anticamundongo de anticorpo secundário especifico. Um número de antisoros efetivos com anticorpos IgG e IgM reativos com PS foram obtidos usando esse protocolo de imunização, do qual o antisoro com anticorpos IgG foram geralmente mais eficazes.
Esses métodos podem agora ser usados para gerar outros anticorpos anti-PS particulares, por exemplo, incluindo aqueles tirados para competir de forma eficiente com o anticorpo 3G4 descrito abaixo. Tipicamente, quando o titulo de IgG do antisoro desejado para PS alcança > 200.000, mas o 354 título de PC é < 50.000, fusão pode ser feita para gerar o anticorpo monoclonal.
Também, esses métodos não se limitam ao tratamento celular inicial com H2O2, como outros métodos para induzir expressão de aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos podem ser usados. Por exemplo, tratamento com TNF e actinomicina D é outro método útil. Em um caso, células bEnd.3 subconfluentes (-85% de confluência) foram tratadas com 10 ng/mL de TNF de camundongo e 1 μρ/ιηΐ, de actinomicina D por 16 horas a 37 °C na incubadora. As células foram então tomadas pelo procedimento de imunização conforme esboçado acima. C. Anticorpos IgG e IgM monoclonais
Hibridomas foram obtidos pela fusão de esplenócitos de animais imunizados com mieloma associado a células P3X63AG8.653 (ATCC, Rockville, MD).
Um importante aspecto da técnica do inventor para preparar anticorpos monoclonais úteis no tratamento tumoral é a estratégia de seleção, a qual envolve a triagem para selecionar anticorpos que se ligam a aminofosfolipidios ou fosfolipidios aniônicos, mas não a fosfolipidios neutros. A estratégia para isolar anticorpos monoclonais reativos com PS, por exemplo, envolveram a triagem de hibridomas sobrenadantes em placas cobertas por PS usando uma IgG anticamundongo, Fc gama de anticorpo secundário específico. Triagem foi primeiramente conduzida contra quatro 355
PE fosfolipídios (PS, fosfatidilserina; fosfatidiletanolamina; CL, cardiolipina; e PC, fosfatidilcolina), assim como células bEnd3. Clones reativos com o fosfolipidio neutro, PC foram descartados, como eram clones não-reativos com células bEnd3. Clones anti PS de alta ligação foram selecionados. Os poços que tinham reatividade somente para PS, ou forte preferência para PSforam subclonados primeiro, e poços que exibiram reatividade para PS juntamente com ligação a outros fosfolipídios aniônicos foram subclonados em segundo lugar. Nos estudos seguintes, anticorpos monoclonais IgM de camundongo nomeados 3SB, Dll e BA3, produzidos e descritos por Rote et ai. (1993), foram também incluídos. 0 anticorpo 3SB é descrito na literatura como um anticorpo anti-PS e o anticorpo Dll é descrito na literatura como um anticorpo anticardiolipina (anti-CL). Detalhes da geração e caracterização desses anticorpos foram reportados por Rote et al. (1993) . 0 isotipo de cada hibridoma selecionado gerado pelos inventores foi determinado. Como anticorpos da classe IgG tem numerosas vantagens sobre os da IgM, incluindo tipicamente alta afinidade, menor depuração in vivo e simplicidade de purificação, modificação e manuseio, sua geração foi particularmente desejada. Para focar em poços com isotipo IgG homogéneo, poços contendo IgM ou uma mistura de diferentes tipos de Igs foram descartados ou reclonados. Subclonagem de clones altamente positivos foi repetida três ou quatro vezes. 0 isotipo de anticorpos IgG e IgM representativos, conforme determinado por ELISA, é apresentado na Tabela 2. Os inventores inicialmente nomearam o anticorpo 3G4 "F3-G4", 356 antes de mudar a designação de 3G4. isso nao reflete qualquer alteração no material biológico TABELA 2
Isotipo e soro dependência de anticorpos anti-PS
Nome Origem Espécie/Isotipo 3 SB Rote et al., 1993 IgM kappa de camundongo Dl 1 N. Rote IgM kappa de camundongo BA3 Rote et al., 1993 IgM kappa de camundongo 9D2 Esse estudo IgM kappa de rato 1B12 Esse estudo IgGi kappa de camundongo 3G4 Esse estudo IgG3 kappa de camundongo 1B9 Esse estudo IgGi kappa de camundongo 357 3B10 Esse estudo IgG3 kappa de camundongo 2G7 Esse estudo IgGi kappa de camundongo 7C5 Esse estudo IgGi kappa de camundongo D. Protocolo de ELISA e caracterização de anticorpo monoclonal
Os anticorpos foram estudados com ELISA e comparados com 3SB e Dll. 0 ELISA anti-PS usado nos presentes estudos é conduzido como se segue. A não ser que diferenças particulares sejam especificadas, este é o formato do ELISA usado pelos estudos da presente aplicação. 0 ELISA é exemplificado usando o antigeno PS (P-6641 25 mg 10 mg/mL (solvente é clorofórmio: MeOH 95:5) em garrafa de 2,5 mL) . Outros fosfolipídios podem ser usados empregando o mesmo protocolo. A solução estoque de PS (ou outros fosfolipídios) deve ser aliquotada e estocada em um
Container hermético a -30 °C. As 96 placas de poços preferidas são Dynatech U bottom Immulon 1 (de Dynatech Labs, Cat# 011-010-3550). O tampão bloqueador padrão usado aqui é soro bovino a 10% dissolvido em PBS. Outras soluções bloqueadoras são adequadas, mas quaisquer detergentes devem ser excluídos de soluções de bloqueio e lavagem. O anticorpo primário é a amostra teste ou mistura. O anticorpo secundário preferido é 358
IgG-HRP de cabra, anticamundongo. As soluçoes de desenvolvimento são: 10 mL de Na2PC>4 0,2 M, 10 mL de ácido cítrico 0,1 M, um comprimido de 10 mg de OPD, e 10 μΡ de peróxido de hidrogénio. A solução para interrupção é H2SO4 0,18 M. 0 protocolo requer a cobertura dos 96 poços da placa com PS como se segue: diluir o a solução estoque de PS em n-hexano até 10 μg/mL e misturar bem. Adicionar 50 μΡ em cada poço e deixá-los evaporar durante 1 hora. Adicionar 200 μΡ de soro 10% (ou outro tampão bloqueador) a cada poço, cobrir e manter à temperatura ambiente durante 2 horas ou em pernoite a 4 °C. Pavar a placa três vezes com PBS. Adicionar o primário anticorpo (diluir com tampão bloqueador) e incubar por 2 horas a 37 °C. Pavar três vezes com PBS. Adicionar 100 μΡ/poço de anticorpo secundário (tipicamente IgG-HRP anticamundongo de cabra ou outro anticorpo secundário apropriado) e incubar por 1 hora a 37 °C. Pavar a placa três vezes com PBS. Desenvolver o EPISA pela adição de 100 μΡ de solução de desenvolvimento a cada um dos poços, desenvolver durante 10 minutos, adicionar então 100 μΡ de solução de interrupção para cada poço e ler o O.D. a 490 nm.
Os seguintes resultados são apresentados para 0D2, 1B12, 3G4 e 1B9. A afinidade desses anticorpos para PS foi determinada e comparada com 3SB. Quantidades das afinidades relativas dos novos anticorpos são muito melhores comparados com 3SB (Tabela 3). TABEPA 3
Afinidade relativa dos anticorpos anti-PS 359
Nome ECso (μσ/ΜΙ)1 Ligação versus 3SB (vezes aumentadas) ECso (nM)1 Afinidade versus 3SB (vezes aumentadas) 3 SB 0,468 1 0,518 1 Dl 1 > 40,0 0,011 > 44, 4 0,011 9D2 0,104 4,50 0,115 4,50 1B12 0,312 1,50 2,07 0,25 3G4 0,040 11, 7 0,266 1,94 1B9 0,019 24, 6 0, 126 4, 11 Anexina V2 0, 100 4, 68 2, 77 0, 18 1Baseado em diluições dos sobrenadantes das Culturas dos Tecidos; concentração de IgG e IgM foram determinadas por ELISA sanduíche usando ou IgG anti-rato ou anticamundongo como anticorpos capturadores. Todos os clones secretam em média de 10 a 15 μρ/ιτΛ de Ig. 360 1 MW usado para conversão: IgM - 900 KDa, IgG - 150 KDa, 2
Anexina V - 36 KDa 3Afinidade da anexina V para o PS está na faixa de 0,1 nM a 1 nM. O valor nessa tabela representa a ligação de anexina V biotinilada comercial detectada por estreptavidina-HRP usando as mesmas condições do ELISA utilizadas para anticorpos anti-PS. A especificidade dos anticorpos foi determinada por ELISA usando placas cobertas com os seguintes fosfolipídios: PS, fosfatidilserina; PI, fosfatidilinositol; PA, ácido fosfatídico; PG, fosfatidilglicerol; PC, fosfatidilcolina; CL, cardiolipina; e SM, esfingomielina. Os perfis de especificidade de 9D2, 1B12, 3G4 e 1B9, quando comparados com 3SB e Dll, são apresentados na Tabela 4. TABELA 4
Especificidade do fosfolipídio de anticorpos anti-PS
Nome Força relativa de reatividade no ELISA1'2 3SB PS = PA >> CL, PI, PE, PG Dll CL = PA >> PS, PI, PE, PG 9D2 PA > PS = CL > PG = PI >> PE 1B12 PS = PA > CL > PE = PI, PG 3G4 PS = PA = PI = PG = CL >> PE 361
3B10 PS = PA = PI >> PE 1B9 PS somente 2G7 PS somente 7C5 PS somente Anexina V PS = PE = PI = PA > CL > PG diferença na concentrações diferença na concentrações 'O símbolo > indica pelo menos 2 vezes de ligação a vários fosfolipídios testados em idênticas de anticorpos. 20 símbolo >> indica pelo menos 10 vezes de ligação a vários fosfolipídios testados em idênticas de anticorpos.
Os anticorpos 1B9, 2G7 e 7c5 comportam-se essencialmente da mesma maneira. Esses anticorpos reconhecem somente PS e requerem soro ou proteínas séricas para se ligar ao PS. A maior reatividade do 3SB é com PS, mas ele também tem reatividade com ácido fosfatídico, o qual é um componente relativamente secundário na membrana plasmática (Hinkovska-Galcheva et al., 1989). 3SB é essencialmente destituído de reatividade com a fosfatidiletanolamina e fosfatidilinositol, assim como com fosfatidilcolina e esfingomielina (Tabela 4). PS é o fosfolipídio aniônico mais abundante da membrana plasmática e é firmemente isolado do folíolo interno da 362 membrana plasmática em células normais sob consições normais. PS é um aminofosfolipídio. PE também é um aminofosfolipídio, mas PE é neutro, não aniônico. Além de ser um aminofosfolipídio neutro, PE se comporta de maneira similar com o PS e é normalmente segregado justamente ao folíolo interno da membrana plasmática. PI é outro fosfolipídio aniônico principal da membrana plasmática, o qual é segregado justamente ao folíolo interno em células normais sob condições normais. PA e PG são fosfolipídios aniônicos secundários da membrana plasmática, os quais são normalmente segregados ao folíolo interno. CL é um fosfolipídio aniônico presente nas membranas mitocondriais, e tipicamente ausente da membrana plasmática. PC e SM são fosfolipídios neutros contendo colina da membrana plasmática. Tamto o PC quanto SM são predominantemente localizados no folíolo externo sob condições normais.
Em se mantendo com o modelo do inventor para expressão diferencial de aminofosfolipídio e fosfolipídio aniônico entre vasos sanguíneos tumorais e normais, nenhum dos anticorpos desenvolvidos usando o protocolo selecionado reagiram com os fosfolipídios neutros, PC e SM. 0 anticorpo 1B9 foi específico para PS, enquanto 9D2, 1B12 e 3G4 ligados a aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos com as preferências apresentadas na Tabela 4. 0 anticorpo 9D2 é também descrito no Exemplo VI.
EXEMPLO V
Fosfatidilserina externalizada em marcadores globais dos vasos sanguíneos tumorais 363 0 presente exemplo mostra que a exposição do PS ocorre em células endoteliais nas quais de dez tumores sólidos diferentes crescendo em camundongos e não é limitado ao modelo tumoral L540 descrito no Exemplo II. PS externalizado in vivo foi detectado pela injeção de um anticorpo monoclonal direcionado contra PS intravenosamente em camundongos com vários tipos de tumores de murina e humanos. Anticorpos anti-PS são mostrados como se ligando especificamente ao endotélio vascular em todos os dez tipos de modelos tumorais diferentes. Endotélio vascular em órgãos normais derivados do mesmo camundongo foram limpos. Um anticorpo monoclonal de controle igualado com o isotipo não localizou as células quer tumorais quer normais. Células apoptóticas foram também identificadas imunoistoquimicamente, onde muito poucas células endoteliais em tumores expressaram marcadores para apoptose. 0 presente exemplo então mostra que células endoteliais vasculares mas não em vasos normais externalizam PS. A maioria das células endoteliais tumorais tendo exposto PS eram não-apoptóticas. PS é então um marcador abundante e acessível da vasculatura tumoral que pode ser usado para visualização de vasos tumorais e terapia. A. Tumores L540, H358 e HT29 0 anticorpo anti-PS usado nesses estudos foi o anticorpo monoclonal IgM de camundongo nomeado 3SB (Exemplo IV, Rote et al., 1993). 3SB se liga principalmente ao PS, mas também reagem com PA, um fosfolipídio aniônico relativamente secundário com a distribuição tal como PS. 0 anticorpo anti-CL usado foi o anticorpo monoclonal IgM de camundongo nomeado Dll (Exemplo IV, Rote et al., 1993). 364
Exposição de PS no endotélio vascular normal e tumoral foi primeiramente examinado em três modelos de tumor animais: linfornas de Hodgkin humanos L450, carcinoma de pulmão de células humanas não-pequenas NCI H358 (NSCLC) e carcinomas coloretais HT29 humanos. Para os tumores crescerem in vivo, 2 x 106 células foram injetadas no flanco direito de camundongos SCID e deixou-se os tumores alcançarem 0,8-1,2 cm em diâmetro.
Camundongos com tumores grandes (volume acima de 800 mm3) foram injetados intravenosamente via veia do rabo com 20 μg de ou anticorpos anti-PS ou anti-CL. Uma hora após a injeção, camundongos foram anestesiados e sua circulação sanguínea foi perfundida com salina heparinizada. Tumores e órgãos normais foram removidos e rompido congelado para preparação de crioseções. IgM de camundongo foi detectada usando IgM anticamundongo de cabra (μ específica) conjugado HRP seguido por desenvolvimento com carbazol. Pelo menos 10 campos randômicos por seção foram analisados com ampliação de 40x e a percentagem média de vasos positivos foi calculada.
Os anticorpos anti-PS especificamente alocados na vasculatura de todos os três tumores (HT 29, L540 E NCI- H358) in vivo, como indicado por detecção da IgM de camundongo. Neste primeiro estudo, as percentagens médias de vasos manchados nos tumores foi de 80% para HT 29, 30% para L540 e 50% para NCI-H358. Vasos em todas as regiões dos tumores foram manchados e houve manchamento tanto dos pequenos capilares quanto dos vasos maiores.
Nenhum manchamento de vasos foi observado com anticorpos anti-PS em quaisquer tecidos normais. No rim, túbulos foram 365 manchados tanto em recipientes anti-PS quanto em recipientes anti-CL, e isso referindo-se à secreção de IgM através deste órgão. Anticorpos anti-CL não foram detectados em quaisquer tumores ou tecidos normais, exceto rim. Essas descobertas indicam que somente o endotélio tumoral expõe PS no sitio externo da membrana plasmática. B. Tumores L540 pequenos e grandes
Para estimar o tempo no qual a vasculatura tumoral perde a capacidade de segregar PS ao lado interno da membrana, localização de anti-PS foi examinada em tumores L450 variando em volume de 140 a 1.600 mm3.
Camundongos foram divididos em 3 grupos de acordo com seu tamanho tumoral: 140-300, 350-800 e 800-1.600 mm3. Ab anti- PS não foi detectado em três camundongos com tumores L540 pequenos (até 300 mm3). Ab anti-PS localizado em três animais de 5 no grupo de tumores L540 de tamanho intermediário e em todos os camundongos (4 em 4) com grandes tumores L540 (Tabela 5). Percentagem de vasos sanguíneos positivos para PS do total (identificados por marcador Meca 32 endotelial pan) foi de 10-20% no grupo intermediário L540 e de 20-40% no grupo de tumores grandes L540 (Tabela 5). TABELA 5
Externalização de PS detectada em tumores de tamanhos médios e grandes
Tamanho tumoral Número de tumores casos positivos 366 (mm3) positivos/total* para PS/total** 350-800 3/5 10-20 850-1.600 4/4 20-40 *Camundongos com tumores L540 Cy foram divididos em três grupos de acordo com o tamanho tumoral. 20 μg de anticorpos anti-PS foram injetados intravenosamente e deixou-se circular durante 1 hora. Anticorpos de camundongos foram detectados em seções congeladas usando conjugado IgM-peroxidase anticamundongo. **Número total de vasos sanguíneos foi determinado usando Meca 32 Ab pan-endotelial. Vasos PS positivos e Meca positivos foram contados em 4 campos por seção transversal do tumor. Faixa percentual de vasos positivos para PS no mesmo grupo é apresentada.
C. Tumores L540, H358, HT29, Colo26, B16 e 3LL
Usando os mesmos anticorpos anti-PS (3SB) e anti-CL (Dll), exposição PS no endotélio vascular normal e tumoral foi examinada em outros estudos usando três modelos de tumor animais adicionais (seis no total): linfomas de Hodgkin humanos L540, carcinoma de célula pulmonar humana não pequeno NCI H358 (NSCLC), carcinomas coloretais humanos HT29, carcinomas de colo de camundongo Colo 26, melanomas de camundongo B16 e tumores de pulmão de camundongo 3LL.
Nesses estudos, tumores cresceram subcutaneamente em camundongos SCID e deixou-se alcançar um volume de 0,4-0,7 367 cm3. Três ou mais camundongos foram usados por grupo. Anticorpos IgM de camundongo anti-PS ou anti-PL (30 μg/camundongo) foram injetados intravenosamente em 200 μΡ de salina. Trinta minutos mais tarde, os camundongos foram sacrificados, dessangrados e sua circulação sanguínea perfundida com salina heparinizada. Órgãos maiores e tumores foram coletados e rompido congelado para preparação com crioseções. IgM de camundongo foi detectada usando IgM anticamundongo de cabra (μ específica)-HRP conjugado seguido pelo desenvolvimento com carbazol.
Seções seriais do tumor foram manchadas com um anticorpo monoclonal, MECA 32, direcionado contra um marcador pan-endotelial de vasos de camundongos. Vasos positivos para PS foram identificados morfologicamente e por seu manchamento coincidente com IgM anticamundongo e MECA 32. Pelo menos 10 campos randômicos por seção (0,317 mm2/campo) foram examinados de forma cega por dois diferentes observadores. A percentagem de vasos positivos para MECA 32 que mancharam positivamente para PS foram calculados. Três tumores de cada tipo foram examinados em cada um dos dois estudos separados. Os valores médios e erros padrão (SE) foram calculados. Variação intertumor no número de vasos positivos para PS e total em cada grupo foi de aproximadamente 10%.
Todos os seis tumores neste estudo continham vasos positivos para PS (Tabela 6) . Detecção de PS por 3SB foi específica uma vez que nenhum manchamento do endotélio tumoral foi observado com o anticorpo anti-CL (Tabela 6, FIG.l). Nenhuma localização vascular de anticorpos anti-PS ou anti-CL foi observada em órgãos normais exceto os rins (manchamento tubular tanto em recipientes anti-PS e anti-CL refletem a secreção de IgM através deste órgão). 368 TABELA 6
Localizaçao específica de anticorpos anti-PS para vasos tumorais
Tecido Anti-PS* Anti-CL Tumor L540 19,3 ± 3,3 0 Tumor H358 15,6 ±4,1 0 Tumor HT 29 4,2 ± 1,6 0 Tumor B16 40,6 ± 5.4 0 Tumor 3LL 5,3 ± 3,7 0 Tumor Colo 26 12,4 ± 2,4 0 Adrenal 0 0 Cérebro 0 0 Coração 0 0 Rim o** o** Intestino 0 0 Fígado 0 0 369
Pulmão 0 0 Pâncreas 0 0 Baço 0 0 Testículos 0 0 *0s resultados são apresentados como a percentagem média (± SE) de vasos positivos para PS de vasos manchados com MECA 32 por campo de 0,317 mm2. Seis tumores de cada tipo foram analisados. O número médio de vasos positivos para MECA 32 por campo de 0,317 mm2 foi 25, 21, 17, 18, 27 e 22 ± 10% dos vasos para tumores L540, H358, HT29, B16, 3LL e Colo 26, respectivamente. **Manchamento tubular especifico de não-antigeno foi visível tanto em recipientes anti-PS quanto em recipientes anti-CL.
Nesses estudos, a percentagem de vasos positivos para PS variaram de 10% nos tumores de Colo 26 a 40% em tumores B16. IgM anti-PS estava presente na superfície luminal de capilares e vênulas em todas as regiões dos tumores. Vasos PS positivos geralmente não apresentam anormalidades morfológicas que eram aparentes por microscópio ótico. Vasos ocasionais localizados em áreas necróticas apresentaram sinais de deterioração. Anticorpo anti-PS (mas não o anticorpo anti-CL) também localizado em células tumorais necróticas e apoptóticas.
Esses estudos controlados demonstraram que PS é consistentemente exposto na superfície luminal do endotélio 370 vascular em vários tumores, mas não em tecidos normais, e que a expressão da vasculatura tumoral não é modelo especifica. D. A maioria dos vasos tumorais PS positivos são não apoptóticos
Uma técnica de dupla marcação foi usada para identificar células endoteliais apoptóticas em seções tumorais. Células endoteliais foram identificadas com o marcador celular pan-endotelial, MECA 32. Células apoptóticas foram identificadas imunoistoquimicamente usando dois marcadores independentes: uma forma ativa da caspase-3, a qual identifica mudanças citosólicas em células que estão para morrer (Krajewska et ai., 1997), e DNA fragmentado, o qual identifica células com alterações nucleares (Gavrieli et al., 1992).
Caspase-3 ativa foi detectada por um anticorpo especifico anticaspase-3 de coelho (R&D, Mineápolis, MN) seguido por incubação com IgG anti-coelho conjugada a fosfatase alcalina (AP, Pierce, Rockford, IL) . Outras seções tumorais foram analisadas por ensaio de Túnel (kit ApopTag™, Oncor, MD) usando conjugado fosfatase alcalina-anti-digoxigenina como um reagente detector. Seções foram duplamente manchadas para marcadores de apoptose (rosa) e o marcador de célula endotelial, MECA 32 (marrom). Ambas as cores foram claramente visíveis nas mesmas células, se marcadores de células endoteliais e células apoptóticas coincidissem. Células endoteliais em cinco em cada seis tipos de tumor (HT29, H358, B16, Colo 26, L540) não apresentam nenhum dos marcadores de apoptose (Tabela 7). 0 sexto tipo de tumor, 3LL, apresentou poucas células endoteliais apoptóticas que 371 estavam localizadas em áreas necróticas. Em contraste, células malignas apoptóticas variaram de 1-2% em tumores L540 a 12,6-19,6% em tumores 3LL. TABELA 7
Expressão de marcadores apoptóticos em tumores
Tipo tumoral Caspase-3 ativa Ensaio de Túnel Células tumorais (% do total)1 Vasos tumorais Células tumorais (% do total)1 Vasos tumorais 3LL 19,8 ±4,3 < 1,02 12,6 ± 3,6 0 HT29 13, 7 ± 2,3 0 7,8 ± 2,5 0 H358 5,8 ± 2,0 0 4,3 ± 1,6 0 Colo 26 5,3 ± 1,5 0 4,1 ± 1,5 0 B16 4,2 ± 1,8 0 3,5 ± 1,6 0 L540 2,3 ± 1,0 0 1,6 ± 0,5 0 1 A percentagem de células tumorais ou vasos sanguíneos tumorais que foram positivos para ou caspase-3 ou Túnel foi determinada em dez altos campos de força por seção. Os 2 campos foram selecionados randomicamente ao longo de duas 372 direções perpendiculares dos cantos para o centro do tumor. A média (± SE) da percentagem de células positivas ou vasos em tumores de 6 camundongos é apresentada. **Vasos ocasionais (1 em > 100) na área necrótica do tumor 3LL apresentou ambos os marcadores de apoptose.
E. MDA-MB-231 e Tumores Meth A
Exposição de PS no endotélio vascular tumoral foi também examinado em tumores de mama humana MDA-MB-231 crescendo em camundongos e em fibrosarcoma Meth A de camundongo crescendo subcutaneamente. O anticorpo usado nesses estudos foi o anticorpo 9D2, gerado como descrito no Exemplo IV, o qual é reativo com fosfolipidios aniônicos.
Como descrito em detalhes no Exemplo VI, 9D2 localizado em vasos tumorais em tumores L540, NCI-H358 e B16, assim como em modelos de tumor de mama MDA-MB-231 crescendo ortotopicamente na parte polpuda das patas camundongos SCID e fibrosarcoma Meth A de camundongo crescendo subcutaneamente. 9D2 localizado em vasos tumorais em todos os cinco tumores. Endotélio vascular nos tumores mostraram manchamento de membrana distinto. Anticorpo 9D2 também localizado na membrana e citosol de células tumorais necróticas e apoptóticas. Nenhuma localização vascular do anticorpo 9D2 foi observada em 9 dos 10 órgãos normais que foram examinados, com manchamento não-especifico dos túbulos no rim sendo observados.
Estudos de duplo manchamento foram também feitos nos quais camundongos com tumores de mama MDA-MB-231 ortotópicos foram injetados intravenosamente com anticorpo 9D2 biotinilado e
seções congeladas depois manchadas com MECA32 conjugado-FITC 373 (Exemplo VI). Cerca de 40% dos vasos positivos para MECA 32 se ligaram a 9D2. F. Tumores MD-MBA-435
Em uma outra modalidade de câncer de mama, exposição de PS no endotélio vascular tumoral foi examinado por células de câncer de mama humanas MDA-MB-435 crescendo em camundongos. O anticorpo usado nesses estudos é uma versão quimérica do anticorpo 3G4 (ch3G4). A geração do anticorpo 3G4 é descrita no Exemplo IV, e a produção do 3G4 quimérico é detalhada no Exemplo XIX. A localização do ch3G4 no endotélio vascular tumoral no modelo MDA-MB-435 é descrito em mais detalhes no Exemplo XIX e apresentado na Figura 22.
Resumidamente, tumores foram estabelecidos usando células MDA-MB-435 e versões biotiniladas do anticorpo quimérico 3G4 e uma IgG controle de irrelevante especificidade foi administrada. Seções tumorais foram manchadas com estreptavidina conjugada com Cy3 para detectar as proteínas biotiniladas. Duplo manchamento com o anticorpo MECA 32 seguido por anticorpo secundário IgG anti-rato marcado com FITC foi conduzido para detectar o endotélio vascular. Esse método de detecção marcou as proteínas biotiniladas e o endotélio vascular usando verde e vermelho, de forma que proteínas biotiniladas ligadas ao endotélio apareceram em amarelo em uma imagem convergida (Figura 22). Este estudo mostrou a localização específica do anticorpo quimérico 3G4 para o endotélio vascular tumoral. G. Tumores RIP-cauda
Para o décimo modelo, exposição de PS no endotélio vascular tumoral foi examinado em um modelo de camundongo transgênico 374 "RIP-cauda" (RIPl-Cauda 2) de carcinogênese de vários estágios. Neste modelo de camundongo transgênico, cada camundongo desenvolve por si só tumores do pâncreas em 12-14 semanas de idade como resultado da expressão do antigeno SV40 T (Tag) oncogene em células beta produtoras de insulina. Tumor se desenvolve em múltiplos estágios a partir de ilhotas hiperproliferativas, e requerem um desvio angiogênico para progredir em direção a malignidade. Matriz de metaloproteinase-9 controla o desvio angiogênico (REF).
Estudos de localização de 9D2 foram conduzidos no modelo RIPl-Cauda2 em colaboração com Dr. Donald McDonald, Professor de Patologia da UCSF. 9D2 foi injetado intravenosamente dentro de camundongos RlPl-Cauda2 começando em 10 semanas de idade, quando todos os camundongos têm tumores sólidos pequenos altamente vascularizados. Duplo manchamento de seções tumorais finas (80 μιη) foi feito para identificar 9D2 e CD31 localizado em pâncreas tumorais e normais. Aproximadamente 50% dos vasos em tumores pancreáticos (CD31 positivo) tinham 9D2 localizado, enquanto vasos em ilhas normais não foram manchados. Camundongos injetados com IgM controle de rato tinham manchamento fraco e não-frequente dos vasos tumorais. Algum vazamento de 9D2 e IgM controle de rato dentro de tecidos extravasculares abaixo do endotélio também foram evidentes. O presente exemplo então confirma que células endoteliais vasculares em tumores externalizam PS e fosfolipidios aniônicos para sua superfície luminal, onde eles podem ser ligados por anticorpos anti-PS in vivo. PS está ausente da superfície externa de células endoteliais vasculares em tecidos normais, indicando que anticorpos que reconhecem PS, anexina V e outros ligantes podem ser usados para distribuir 375 drogas citotóxicas, coagulantes e radionuclídeos para visualizar ou destruir seletivamente os vasos em tumores sólidos.
Endotélio tumoral para PS apareceu, para a maior parte, ser viável, nos tumores usados neste estudo. Ele não apresenta marcadores para apoptose, ele é morfologicamente intacto e metabolicamente ativo, como indicado por sua expressão de VCAM-1, E-selectina e outras proteínas rapidamente retornadas. Embora geralmente considerado como um indicador de apoptose, exposição de PS tem sido observada em vários tipos de células viáveis, incluindo células malignas (Rao et al., 1992), (Utsugi et al., 1991) plaquetas ativadas (Rote et al., 1993), e trofoblastos embriónicos em vários estágios de migração, invasão da matriz e fusão (Adler et al., 1995).
Ausência de correlação entre a exposição a PE e entrega à morte celular tem sido também mostrada em células B de linfoma pré-apoptóticas que restauram assimetria PS e crescem normalmente após remoção do estímulo pró-apoptótico (Hammill et al., 1999) . Em células normais viáveis, exposição de PS é provavelmente disparada por eventos de superfície, tais como interações ligante-receptor, que induzem o fluzo de Ca2+ para dentro das células (Dillon et al., 2000). Fluxos de Ca2+ ativam escramblase (Zhao et al., 1998) e simultaneamente inibem a aminofosfolipídio translocase (Comfurius et al., 1990). PS em vasos tumorais é atrativo como alvo para visualização de câncer ou terapia por várias razões: ele é abundante (aproximadamente 3 x 106 moléculas por célula) ; ele está na superfície luminal do endotélio tumoral, o qual é diretamente acessível para ligação por agentes alvejantes 376 vasculares no sangue; ele está presente em alta percentagem das células endoteliais tumorais em diversos tumores sólidos, e ele está ausente do endotélio em todos os tecidos normais examinados até a data. Anticorpos não-conjugados, agentes alvejantes e agentes de visualização direcionados contra PS na vasculatura tumoral podem então ser usados para a detecção e tratamento do câncer no ser humano.
EXEMPLO VI
Fosfolipídios aniônicos são expostos na superfície de vasos sanguíneos tumorais
Fosfolipídios aniônicos são amplamente ausentes do folíolo externo da membrana plasmática de células de mamífero sob condições normais. Exposição da fosfatidilserina, por exemplo, na superfície celular ocorre durante apoptose, necrose, injúria celular, ativação celular e transformação maligna. 0 presente exemplo mostra que fosfolipídios aniônicos são sobreregulados na vasculatura tumoral in vivo, como demonstrado pela localização tanto do anticorpo específico quanto do ligante natural que se liga aos fosfolipídios aniônicos.
Um anticorpo monoclonal, 9D2, o qual especificamente reconhece fosfolipídios aniônicos, foi injetado dentro de camundongos com uma variedade de tumores ortotópicos e ectópicos. Outros camundongos receberam Anexina V, um ligante natural que se liga aos fosfolipídios aniônicos. Tanto 9D2 quanto Anexina V especificamente localizados o endotélio vascular em todos os tumores e também em células tumorais dentro e em volta de regiões de necrose. Entre 15 a 40% das células endoteliais em vasos tumorais foram 377 manchados. Nenhuma localização foi detectada no endotélio normal. Vários fatores e condições associadas ao tumor conhecidas como sendo presentes no microambiente tumoral foram examinadas por sua capacidade de causar exposição de fosfolipídios aniônicos em células endoteliais cultivadas, como julgado pela ligação de 9D2 e Anexina V. Hipóxia/reoxigenação, acidez, trombina e citocinas inflamatórias todas induziram a exposição de fosfolipidios aniônicos. Peróxido de hidrogénio foi também um forte indutor. Tratamento combinado com citocinas inflamatórias e hipóxia/reoxigenação tiveram mais do que efeitos aditivos. A exposição demonstrada dos fosfolipidios aniônicos no endotélio tumoral in vivo é então suscetível a ser causado por injúria e ativação por citocinas e espécies oxigénio reativas. Sem considerar o mecanismo, fosfolipídios aniônicos são marcadores dos vasos tumorais que agora podem ser usados para alvejamento de vasos tumorais, visualização e terapia. A. Materiais e Métodos 1. Materiais
Na125I foi obtido a partir de Amersham (Arlington Heights, IL) meio de cultura tecidual de Águia modificado de Dulbecco e PBS Dulbecco contendo Ca2+ e Mg2+ foram obtidosde Gibco (Grand Island, NY) . Soro de bezerro fetal foi obtido de Hyclone (Logan, Utah) . L-a-fosfatidilserina, L-CC- fosfatidilcolina, cardiolipina, L-a-fosfatidiletanolamina, L-a-fosfatidilinositol, esfingomielina, ácido fosfatídico, fosfatidilglicerol, 0-fenilenodiamina, peróxido de 378 hidrogénio e trombina foram de Sigma (St. Louis, MO). Placas de superfície inferior plana com 24 poços foram obtidos de Falcon (Becton Dickinson e Co., Lincon Park, NJ).
Fator de crescimento de hepatócito recombinante (HGF ou fator de dispersão) e actinomicina foi de Calbiochem (San Diego, CA) . Alfa e beta interleucina-1 de murina recombinante e fator de necrose tumoral alfa (TNFa) foram comprados de R&D Systems (Minneapolis, MN) . Interferon do tipo I universal (proteína híbrida que substitui para todos os tipos de interferons) foi comprado por PBL Biomedical Laboratories (New Brunswick, NJ). Fator de crescimento endotelial vascular humano recombinante 121 (VEGF), fator BB de crescimento derivado de plaqueta humana, interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), interleucina 10 (IL-10) e fator-2 de crescimento de fibroblasto humano (FGF-2) foram comprados de PeproTech (Rocky Hill, NJ). 2. Anticorpos MECA 32, um pan-anticorpo de célula endotelial de camundongo, foi obtido do Dr. E. Butcher (Universidade Stanford, CA) e serviu como o controle positivo para estudos imunoistoquímicos. Detalhes deste anticorpo tem sido publicados (Leppink et ai., 1989). Imunoglobulina anti-rato de coelho, imunoglobulina anti-rato de camundongo e anticorpos conjugados a peroxidase horseadish (HRP) foram comprados ou do Daco (Carpinteria, CA) ou de Jackson Immunoresearch Labs (West Grove, PA). O anticorpo 9D2 usado nesses estudos foi gerado conforme descrito no Exemplo IV. 9D2 é um anticorpo monoclonal de rato reativo com fosfolipídios aniônicos. Posterior 379 caracterizaçao da especificidade do fosfolipídio de 9D2 é dado na seção de resultados deste exemplo. 3. Células Células de linfoma de Hodgkin L540Cy, derivados de um paciente com doença em estágio terminal, foram fornecidas pelo professor V. Diehl (Kõln, Alemanha). De estreptomicina. Células L540Cy foram mantidas em RPMI 1640 contendo os mesmos aditivos. Células foram subcultivadas uma vez por semana. Tripsinização de células bEnd.3 foi feita usando 0,125% de tripsina em PBS contendo 0,2% de EDTA. Para estudos in vitro, células endoteliais foram cultivadas em uma densidade de 10 x 103 células /mL em 1 mL de meio de cultura em placas de 24 poços e incubadas 48-96 horas antes de serem usadas nos ensaios. Meio foi restaurado 24 horas após cada estudo. 5. Reatividade com fosfolipidios imobilizados em plástico
Fosfolipidios foram dissolvidos em n-hexano a uma concentração de 50 μρ/ιτΛ. 100 μ]1, desta solução foi adicionada a poços de placas de microtitulação de 96 poços. Após evaporação do solvente ao ar, as placas foram bloqueadas por 2 horas com 10% de soro bovino fetal diluido em DPBS contendo 2 mM de Ca2+ (tampão ligante).
Anticorpo 9D2 ou anexina V foi diluída com o tampão ligante na presença de 10% de soro a uma concentração inicial de 6,7 nM. Diluições seriais de 2 vezes foram preparadas nas placas (100 μΐι/poço) As placas foram então incubadas por 2 horas a temperatura ambiente. As placas foram lavadas e a 9D2 e anexina V foram detectadas por IgM anti-rato de cabra 380 conjugada ao HRP e anexina V anti-humana de coelho seguido por IgG anti-coelho de cabra conjugada com HRP (todos diluídos de 1:1000), respectivamente. Reagentes secundários foram detectados pelo uso de substrato cromogênico OPD seguido por placas de leitura a 490 nm usando um leitor de microtitulações (Molecular Devices, Paio Alto, CA). A especificidade do anticorpo 9D2 foi validada pelo uso de controle de IgM de rato de especificidade irrelevante (Pharmigen, São Diego, CA) . A especificidade da ligação da anexina V aos fosfolipídios, os quais são dependentes de Ca2+, foi determinada pela diluição do reagente com DPBS contendo 5 mM de EDTA. Controles negativos adicionais consistindo de lavagem das placas com o tampão ligante contendo 0,2% de um detergente Teen 20. Esse tratamento extrai lipídios, removendo então o fosfolipídio que foi adsorvido ao plástico. Nem o anticorpo 9D2 nem a anexina V se ligaram a placas lavadas com detergente. 6. Detecção de fosfolipídios aniônicos na superfície de células endoteliais cultivadas Células endoteliais cresceram até alcançarem aproximadamente 70% de confluência. Para induzir exposição a PS, células foram tratadas com H2O2 (200 μΜ) por 1 hora a 37 C. Lâminas controle e tratadas foram lavadas com DPBS contendo Ca2+ e Mg2+ e fixadas com 0,25% de glutaraldeído diluído no mesmo tampão. Excesso de grupos aldeído foram debelados por incubação com 50 mM de NH4CI por 5 minutos. Para examinar o efeito de detergentes e solventes orgânicos na detecção de fosfolipídios, algumas lâminas foram pré-incubadas com acetona (5 minutos) ou com PBS contendo 1% (v/v) de Triton™ X-100. 381 Células foram lavadas com DPBS (contendo Ca2+, Mg2+ e 0,2% p/v de gelatina) e incubadas com 1 μg/mL de anexina V biotinilada (Pharmigen, São diego, CA) ou com 1 μg/mL de anticorpo 9D2. Após 2 goras de incubação, células foram lavadas com 0,2% de tampão gelatina e foram incubadas com estreptavidina-HRP (diluição 1:500). IgM de rato de especificidade irrelevante e estreptavidina sozinha foram usadas como controles negativos nesses estudos. Todos os passos foram feitos a temperatura ambiente. Atividade de HRP foi medida pela adição de O-fenilenodiamina (0,5 mg/mL) e peróxido de hidrogénio (0,03% p/v) em tampão citrato-fosfato, pG 5,5. Após 15 minutos, 100 μΡ do sobrenadante foram transferidos para placas de 96 poços, 100 μΡ de H2SO4 0,18 M foram adicionados e a absorvância foi medida a 490 nm. Alternativamente, células PS-positivas foram detectadas por adição de substrato de carbazol, resultando em um precipitado vermelho-amarronzado insolúvel. Cada estudo foi feito em duplicata e repetido pelo menos duas vezes. 7. Inibição de ligação de 9D2 e anexina V a fosfolipídios por lipossomas A especificidade de reconhecimento fosfolipídico foi mais adiante confirmada por ensaios de competição com vários lipossomas. Pipossomas foram preparados a partir de soluções de 5 mg de um único fosfolipídio em clorofórmio. As soluções foram secas sob nitrogénio para formar uma fina camada em um frasco de vidro de fundo redondo. Dez mP de tampão Tris (0,1 M, pH 7,4) foram então adicionados e o frasco foi submetido a ultra-som cinco vezes por 2 minutos. 9D2 ou anexina V (6,66 nM) foram pré-incubados com 200 μρ/ιηΡ de solução lipossomal por 1 hora a temperatura ambiente. A mistura foi adicionada para placas cobertas de fosfolipídios de 382 monocamadas de células endoteliais. A capacidade de 9D2 de se ligar a um fosfolipídio imobilizado ou superfície celular na presença ou ausência de diferentes lipossomas foi determinada como descrito acima. 8. Competição de 9D2 e anexina V para ligação a PS imobilizados
Anticorpo 9D2 biotinilado e anexina V foram preparados pela incubação de proteínas purificadas com um excesso de 10 vezes molar de N-hidroxisuccinimida biotina (Sigma, MO) por 1 hora a temperatura ambiente. Biotina livre foi removida por diálise contra PBS. O procedimento de biotinilação não prejudica a capacidade de ligação de PS de qualquer proteína. Para estudos de competição, proteínas não- modificadas e biotiniladas foram pré-misturadas com um excesso molar de 10 vezes de proteínas não-modifiçadas. As misturas foram então adicionadas às placas cobertas por PS. Reagentes ligados foram detectados por conjugado estreptavidina-HRP diluído 1:1000. A ligação de PS a cada reagente na ausência de um competidor foi tomada como o valor de 100%. 9. Crescimento de tumores implantados subcutaneamente
Para estudos de localização, 2 x 107 células de linfoma de Hodgkin humano L540 ou 1 x 107 células de outros tipos tumorais foram injetados subcutaneamente no flanco direito de camundongos SCID (Charles River, Wilmington, MA) . Deixou-se os tumores alcançarem um volume de 0,4-0,7 cm3. O mínimo de três animais por grupo foi usado. Estudos foram replicados pelo menos três vezes. 10. Modelo ortotópico de carcinoma de mama humano MDA-MB-231 383
Nu/nu ou camundongos SCID foram comprados de Charles River. Células de carcinoma de mama humano MDA-MB-231 foram implantadas dentro da parte de baixo de patas de mamíferos de acordo como protocolo publicado (Price, 1996). Resumidamente, camundongos foram anestesiados e uma incisão de 5 mm foi feita na pele sobre o tórax lateral. A parte de baixo da pata dos mamíferos foi exposta para assegurar o correto sítio para injeção de 1 x 107 células MDA-MB-231 resuspendidas em 0,1 mL de salina. 11. detecção de fosfolipídios aniônicos em camundongos com tumor in vivo. Técnicas imunoistoquímicas, nas quais 9D2 ou anexina V são aplicadas diretamente a seções de tecidos congelados, não discriminam entre fosfolipídios aniônicos no folíolo interno e o folíolo externo da membrana plasmática. Para determinar fosfolipídios posicionados externamente, métodos foram feitos essencialmente como anteriormente descrito (Exemplo V; Ran et al.r 1998) . Camundongos SCID com tumor foram injetados intravenosamente com ou 50 μg de 9D2 ou anticorpo 9D2 biotinilado ou 100 μρ de anexina V biotinilada. Sessenta minutos mais tarde camundongos foram sacrificados e suas circulações sanguíneas foram dessangradas e perfundidas com salina heparinizada conforme anteriormente descrito (Burrows et al., 1992) . Todos os órgãos maiores e tumor foram coletados e rompido congelado para preparo de crioseções.
Seções foram bloqueadas com PBS contendol0% de soro. Para prevenir a perda de fosfolipídios durante o processo de laminação, detergentes e solventes orgânicos foram omitidos a partir de tampões de bloqueio e de lavagem. IgM de rato foi detectada usando IgM anti-rato de cabra (μ específica)- 384 HRP conjugada seguida pelo desenvolvimento com carbazol ou DAB (Fries et al., 1993). Reagentes biotinilados foram detectados por estreptavidina conjugada a HRP.
Seções tumorais derivadas de camundongos injetados com salina de IgM de rato de especificidade irrelevante serviram como controles negativos. Controles adicionais consistiam da incubação das lâminas em solução Triton 1% ou em acetona por 10 minutos. Esses tratamentos extraem fosfolipidios. Nenhum sinal foi detectado sob essas condições. O número de vasos positivos por alto campo de força foi determinado em ampliação de lOOx. Pelo menos 10 campos por seção foram examinados e a percentagem média de vasos positivos foi calculada. Manchamento das seções por esse método para a presença de 9D2 ou anexina V detecta células com fosfolipidios aniônicos externalizados gue eram acessíveis para ligação pelos reagentes in vivo.
12. Identificação e quantificação de vasos tumorais positivos para PS
Estruturas com anticorpo 9D2 localizado ou anexina V foram identificados como vasos sanguíneos pela aparência morfológica em seções manchadas com DAB e por co-incidente manchamento com o marcador celular pan-endotelial, MECA 32 em seções seriais de tecidos congelados. Quantificação nas seções manchadas com DAB foi feita pela contagem de vasos manchados com MECA 32, 9D2 ou anexina V em seções seriais de um tumor. Seis lâminas de cada tipo de tumor derivadas de 6 camundongos injetados com anticorpo 9D2, IgM controle de rato ou anexina V foram examinados. Pelo menos 10 campos randômicos por seção (0,317 mm2/campo) foram contados de forma cega por dois observadores independentes. Os números 385 médios e erros padrão dos vasos manchados com 9D2, anexina V ou MECA 32 foram calculados. 0 número médio de vasos positivos para 9D2 e anexina V determinados em cada tipo de grupo tumoral foi comparado com o número médio de vasos positivos para MECA 32 no mesmo grupo tumoral. A percentagem de vasos positivos para 9D2 ou anexina V foi calculada.
Em outros estudos, camundongos com tumores MDA-MB-231 (0,3- 0. 7 cm3 em volume) foram injetados intravenosamente com 50 μg de 9D2 biotinilado, IgM controle ou anexina V (seis camundongos por grupo). Reagentes biotinilados foram primeiramente incubados com conjugado estreptavidina-Cy3, lavado com PBS, então incubado com anticorpo MECA 32 seguido por anticorpo secundário IgG anti-rato marcado com FITC. Imagens avulsas, tomadas com filtros apropriados para Cy3 (vermelho) e FITC (verde) fluorescente, respectivamente, foram capturados por câmera digital e transferidos para um computador. Imagens de 10 campos randômicos (0,317 mm2/campo) demonstraram coloração amarela (um produto da fluorescência misturada verde e vermelha) foram sobrepostos com a ajuda do software Metaview. O mesmo método foi usado para analisar tumores de camundongos injetados com IgM de rato controle ou salina. A percentagem de vasos com 9D2 ou anexina V localizados foi calculada como se segue: número médio de vasos amarelos por campo dividido pelo número médio de vasos verdes (total) multiplicado por 100. B. Resultados
1. Especificidade de fosfolipidios de anticorpo 9D2 e anexina V 386 0 anticorpo 9D2 reconhece especificamente fosfolipídios aniônicos (PS, PA, CL, PI, PG) e não tem reatividade significante com fosfolipídios neutros (PE, PC e SM) em ELISA (Figura 2A; Tabela 8), A ordem de força de ligação do 9D2 a fosfolipídios em ELISA foi PA>PS=CL>PG=PI. A ligação foi antígeno-específica uma vez que nenhuma ligação foi observada com vários IgM de rato controles de especificidade irrelevante. Ligação de 9D2 a qualquer um dos fosfolipídios aniônicos para placas de ELISA foram bloqueadas por lipossomas preparados de qualquer um dos fosfolipídios aniônicos, mas não por lipossomas preparados de qualquer um dos fosfolipídios neutros. TABELA 8
Especificidade fosfolipídica de 9D2 e Anexina V
Fosfolipídio Abundância e localização na membrana plasmática sob condições normais* ECso DE LIGAÇÃO (PM) Nome Tipo 9D2 Anexina V PS PL Amino aniônico Maior PL (15%), localizado no lado interno 12 100 PA PL aniônico Menor PL (menos que 1%) 2 100 387 PG PL aniônico Menor PL (menos que 1%) 100 250 PI PL aniônico Maior PL (7%), principalmente localizado no lado interno 100 50 CL PL aniônico Ausente da membrana plasmática 15 130 PE PL amino neutro Maior PL (22%), principalmente localizado no lado interno >8000 100 SM PL colina neutro Maior PL (9%) , localizado no lado externo >8000 >8000 PC PL colina neutro Maior PL (46%), localizado no lado externo >8000 >8000 *Percentagem de fosfolipídios totais, tomados de Fridrikkson, et at., 1999. Percentagens podem variar para diferentes tipos celulares.
Anexina V também se ligou a fosfolipídios aniônicos, mas sua ligação foi menos especifica do que a do 9D2 no que ele também se ligou fortemente ao fosfolipídio neutro, PE. A ordem de força da ligação de anexina V a f osf olipídios no ELISA foi PI>PS=PE=PA=CL>PG (Tabela 8). Essas descobertas para anexina V são consistentes com os dados iniciais (Andree et al., 1990). A ligação do 9D2 não foi afetada pela presença de EDTA 5mM, mostrando que isso não requereu Ca2+ para ligação a fosfolipídios aniônicos. Ao contrário, a ligação da anexina V com aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos foi abolida na presença de EDTA 5mM, como esperado da sua dependência conhecida pelo Ca2+ para ligação a fosfolipídios aniônicos ou PE (Schlaepfer et al., 1987;
Blackwood e Ernst, 1990).
Nem 9D2 nem anexina V ligados a placas de ELISA que tenham sido cobertas com fosfolipídios mas então lavadas com Teen 0,2% em salina, confirmando que suas ligações foram para os f osf olipídios absorvidos. 9D2 e anexina V não se ligaram detectavelmente à heparina, heparan sulfato ou a DNA de fita única ou dupla. 2. Anticorpo 9D2 e anexina V não se bloqueiam de forma cruzada na ligação da PS um com o outro
Para examinar se o anticorpo 9D2 e anexina V competem pela ligação ao PS, estudos de bloqueio cruzado foram feitos usando proteínas biotiniladas em placas cobertas com PS. Ligação de anticorpo biotinilado 9D2 e anexina V foram bloqueados por um excesso molar de 10 vezes de 9D2 não-modificado e anexina V, respectivamente (Tabela 9).
Entretanto, anexina V não-modifiçada não afetou a capacidade 389 de 9D2 biotinilado de se ligar à placa PS. Dessa forma, adição de anticorpo 9D2 não-modifiçado não alterou a capacidade de anexina V biotinilada de se ligar à placa de PS (Tabela 9). TABELA 9 9D2 e Anexina V nao se bloqueiam de forma cruzada na ligação
ao PS
Proteína que se liga a PE Competidor3 Ligação controle)b (% Anexina biotinilada V Anexina V 8% 9D2 biotinilado Anexina V 93% Anexina biotinilada V 9D2 95% 9D2 biotinilado 9D2 5% anexina V ou anticorpo 9D2 foram pré-misturados em excesso molar de 10 vezes nos reagentes biotinilados. Ligação de reagentes biotinilados para PS em placas de microtitulação foram detectados por estreptavidina-HRP. bReatividade de reagentes biotinilados na ausência de um competidor foi tomada como 100%. Os valores médios de determinações em triplicata são apresentados. SD foi menor do que 10% do valor médio. 390
Esses resultados indicam que o anticorpo 9D2 e anexina V não se bloqueiam de forma cruzada para placas de PS, seja porque eles reconhecem diferentes epítopos na molécula de PS ou diferentes conformações de PS adsorvido no plástico. 3. Ligação a fosfolipidios aniônicos externalizados nas superfícies celulares A ligação do anticorpo 9D2 e anexina V a superfícies celulares foi examinada usando células de endotelioma bEnd.3 ou células ABAE bovinas. Nem 9D2 e nem anexina se ligaram a monocamadas não-permeabilizadas de cada tipo celular sob condições quiescentes. Isso indica que a maioria dos fosfolipidios aniônicos da membrana plasmática são normalmente sequestrados para o domínio citosólico. Em contraste, manchamento forte foi observado quando células foram pré-incubadas com TNFCC e actinomicina D sob condições que causaram apoptose em 90-100% das células endoteliais.
Para confirmar que 9D2 e anexina V foram ligados a fosfolipidios nas superfícies celulares, células bEnd.3 tratadas com H2O2 foram incubadas com anticorpo 9D2 ou anexina V na presença ou ausência de vários lipossomas competidores. Fosfolipidios aniônicos ficaram expostos em células bEnd.3 viáveis,não-apoptóticas quando elas são tratadas com uma concentração subtóxica (100-200 μΜ) de H2O2 (Ran et al., 2002). A ligação do anticorpo 9D2 a células bend.3 tratadas com H2O2 foi inibida por lipossomas contendo fosfolipidios aniônicos mas não por lipossomas contendo fosfolipidios neutros (Figura 3). A magnitude da inibição da ligação de 9D2 a células variou na ordem PA>PS>CL>PG>PI, em forte 391 concordância com os resultados obtidos usando fosfolipídios imobilizados em plástico (Figura 2A e Figura 2B) . Semelhantemente, a ligação da anexina V a células tratadas com H2O2 foi bloqueada por lipossomas contendo PS, PA, PE, CL e, em menor extensão, PI e PG. Lipossomas contendo SM ou PC não bloquearam a ligação de anexina V às células, tudo em concordância com os resultados obtidos usando fosfolipídios imobilizados em plástico.
Esses resultados confirmam que 9D2 se liga a fosfolipídios aniônicos nas células endoteliais tratadas com H2O2, enquanto anexina V se liga a PE além de em fosfolipídios aniônicos. 4. Detecção de fosfolipídios aniônicos externalizados em células in vivo Técnicas imunoistoquímicas diretas, nas quais 9D2 e anexina V são aplicados diretamente em seções de tecidos congelados, não discriminam entre fosfolipídios aniônicos no folíolo interno e no folíolo externo da membrana plasmática. Para detectar fosfolipídios posicionados externamente, 9D2 e anexina V foram injetados intravenosamente dentro de camundongos com tumor e a localização de vasos tumorais foi determinada por imunoistoquímica indireta.
Camundongos com vários tipos de tumores sólidos foram injetados intravenosamente com anticorpo 9D2 ou anexina V biotinilada, e uma hora mais tarde, foram dessangrados e os tumores e tecidos normais foram removidos e seções congeladas foram preparadas. Seções congeladas de tecidos foram cortados e manchados com IgM anti-rato marcada com HRP ou com estreptavidina marcada com HRP para determinar a que células o 9D2 e anexina V tem se ligado após a injeção. 392
Vasos sanguíneos foram identificados morfologicamente, e de suas manchas positivas pelo anticorpo de célula pan-endotelial, MECA 32, em seções seriais. 5. Biodistribuição do anticorpo 9D2 e anexina V em camundongos com tumor
Anticorpo 9D2 e anexina V localizados em vasos tumorais em todos os cinco tumores incluídos neste estudo (Figura 4; Tabela 10). Os tumores eram: tumor de mama humana MDA-MB-231 crescendo ortotopicamente na gordura das patas de mamíferos de camundongos SCID; tumor de Hodgkin L540 humano crescendo subcutaneamente; NCI-H358 NSCLC humano crescendo subcutaneamente; melanoma B16 de camundongo crescendo subcutaneamente e fibrosarcoma Meth A de camundongo crescendo subcutaneamente. TABELA 10
Localização específica de 9D2 e anexina V em vasos tumorais 393
Tecido Anticorpo 9D2a Controle IgM de rato Anexina Vb Tumores MDA-MB-231 40,6 ± 5,4 45,3 ±5,6 L540cy 19,3 ± 3,3 16,7 ± 3,9 NCI-H358 15m6 ±4,1 ND BI 6 23,4 ± 4,5 21,3 ± 6,6 Meth A 25,7 ± 6,8 ND Normal Adrenal Cérebro Coração Rim _C Intestino Fígado Pulmão Pâncreas 394
Baço Testículos aLocalizaçao do anticorpo 9D2 e IgM controle de rato em camundongos com tumor foram determinados por injeção do anticorpo (50 μρ) , perfundindo a circulação sanguínea do camundongo com salina e detectando o anticorpo em seções dos tecidos usando um conjugado IgM anti-rato-peroxidase. Os resultados são apresentados como a percentagem média (± SE) de vasos positivos para PS de vasos manchados com MECA 32 por campo de 0,317 mm2. Seis amostras de cada tipo foram analisadas. O número médio de vasos positivos para MECA 32 por campo de 0,317 mm2 foi 23, 25, 21, 18 3 19 ± 10 vasos para MDA-MB-231, L540cy, H358, B16 e tumores Meth A, respectivamente. bLocalização de anexina V foi determinada pela injeção de anexina V biotinilada seguida por detecção em seções congeladas usando conjugado estreptavidina-peroxidase. cManchamento tubular específico não-antígeno foi visível no 9D2 e nos recipientes de anticorpo controle. 9D2 e anexina V deram essencialmente os mesmos padrões de manchamento. Localização do anticorpo 9D2 para vasos tumorais foi específico, uma vez que nenhum manchamento de endotélio tumoral foi observado com IgM de rato de especificidade irrelevante. Presumivelmente, vazamento de IgM de rato controle para fora dos vasos tumorais ocorreram em alguma extensão, mas o manchamento de IgM extravascular 395 foi muito difuso ou fraco para discernir por imunoistoquimica indireta.
Nenhuma localização vascular do anticorpo 9D2 ou de anexina V foi observada em nove de dez órgãos normais que foram examinados (Tabela 10). No rim, manchamento de túbulos foi observado que deu a impressão de não ser antigeno especifico. Túbulos foram manchados tanto em recipientes com 9D2 quanto com IgM de rato controle, presumivelmente por causa da secreção de IgM ou seus metabólitos através desse órgão. Os ovários, um sitio de angiogênese fisiológica, não foram examinados. A percentagem de vasos positivos de 9D2 e anexina V variaram de 40% em tumores MDA-MB-231 até 15% em tumores H358. Vasos positivos para fosfolipidios aniônicos estavam presentes na superfície luminal de capilares e vasos em todas as regiões dos tumores, mas eram particularmente prevalentes dentro e ao redor de regiões de necrose. A maioria dos vasos sanguíneos positivos para fosfolipidios aniônicos não apresentaram anormalidades morfológicas que eram aparentes ao microscópio ótico. Vasos ocasionais, particularmente aqueles localizados em áreas necróticas, apresentaram sinais morfológicos de deterioração. Anticorpo 9D2 e anexina V também localizaram-se em células tumorais necróticas e apoptóticas, enquanto a localização de IgM controle não foi detectável (Figura 4).
Essas descobertas demonstraram que fosfolipidios aniônicos estão presentes na superfície luminal de células endoteliais vasculares em vários tumores, mas não em tecidos normais. 6. Estudos de duplo manchamento 396
Estudos de duplo manchamento foram também feitos nos quais camundongos com tumores de mama MDA-MB-231 ortotópicos foram injetados intravenosamente com anticorpo 9D2 biotinialado, IgM controle biotinilada ou anexina V biotinilada. Uma hora depois, os camundongos foram dessangrados, e seus tumores foram removidos e seções congeladas foram cortadas. As seções tumorais foram então manchadas com Cy3 conjugada com estreptavidina para detectar as proteínas biotiniladas e com MECA 32 conjugado com FITC para detectar o endotélio vascular. Esse método de detecção marcou as proteínas biotiniladas e o endotélio vascular com vermelho e verde. Onde as proteínas biotiniladas estão ligadas ao endotélio, a imagem convergida aparece em amarelo.
Nesses estudos, a 9D2 biotinilada e anexina V apareceram na maior parte ligadas ao endotélio vascular, porque seus padrões de manchas convergiram com aquele da MECA 32. Cerca de 40% dos vasos positivos para MECA 32 ligados a 9D2 e anexina V, em concordância estrita com os resultados obtidos por imunoistoquímica indireta. Entretanto, o vazamento de proteínas biotiniladas no interstício tumoral foi detectado por duplo manchamento, enquanto não era aparente por imunoistoquímica indireta.
Proteínas biotiniladas estavam visíveis fora do endotélio vascular em volta de uma minoria de vasos, cerca de 5%. Em tumores de camundongos que tem sido injetados com IgM de rato biotinilada de especificidade irrelevante, a IgM biotinilada também vazou no do interstício tumoral aproximadamente num percentual semelhante aos vasos, cerca de 5%, mas na maior parte deram a impressão de não estarem ligados ao endotélio vascular. Presumivelmente, a detecção 397 de 9D2 extravasado e anexina V pela técnica de dupla marcação, mas não pela técnica de imunoistoquimica direta, reflete a grande sensibilidade da técnica precedente e a maior precisão com a qual dois padrões de manchas podem ser comparados. Tumores de controle não-injetados foram completamente desmanchados por estreptavidina-Cy3, indicando que fluorescência vermelha corresponde à proteina localizada.
EXEMPLO VII
Translocação membranar de fosfolipídios aniônicos em um ambiente tumoral A descoberta dos aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos como marcadores de superfície in vivo únicos para células endoteliais vasculares tumorais instigaram os inventores a investigar adicionalmente o efeito do microambiente tumoral na translocação e expressão na membrana externa de tais moléculas. 0 presente exemplo mostra que a exposição de células endoteliais in vitro a certas condições que mimetizam aquelas em um tumor duplicam a expressão superficial inicial observada de aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos em células intactas e viáveis. A. Materiais e Métodos
1. Iodação de Anexina V
Anexina V recombinante humana foi purificada de E.coli transformada com plasmídeo fosfolipídiol ET12a-Paniônico (obtido de Dr. J. Tait, University of Washington, Seattle) . A pureza da proteína e da ligação de PS foram confirmadas em 398 SDS-PAGE e em plástico coberto com PS, respectivamente. Anticorpos policlonais de coelho antianexina de afinidade purificada foram usados para detectar anexina V ligada à PS. Anexina V foi radiomarcada com 125I usando cloramina T conforme descrito por Bocci (1964). A atividade especifica foi aproximadamente 1 x 106 cpm^g de proteína, conforme medido por um ensaio de Bradford (1976). 2. Tratamento de célula endotelial Células endoteliais foram tratadas com citocinas ou fatores de crescimento nas concentrações listadas na Tabela 11. Todos os reagentes foram diluídos em meio contendo 10% de soro e incubados com as células a 37 °C por 24 horas.
Para estudar o efeito da hipóxia, células foram semeadas em placas com 24 poços e foram incubadas em uma atmosfera normóxica umidificada (21% O2, 5% CO2) , por 48 horas antes de serem transferidas para uma atmosfera hipóxica umidificada (1% O2, 5% CO2, 94% N2) em uma câmara selecionada (Billups Rothenberg Inc., Del Mar, Ca). Células foram incubadas em uma câmara hipóxica por 24 horas a 37 °C e foram então retornadas para um ambiente normóxico por 4 horas a 37 °C. As células foram comparadas com uma cultura paralela de uma passagem igual, alimentada no mesmo dia e mantida inteiramente sob condições normóxicas. Em alguns estudos, IL-la (10 ng/mL) e TNFCC (20 ng/mL) foram adicionados ao meio antes de transferir para a câmara hipóxica.
Para examinar o efeito de um microambiente ácido, células foram expostas ao meio de crescimento sem bicarbonato, o qual foi ajustado para diferentes pHs 399 (variando entre 7,3 e 6,2) com a quantidade necessária de HC1. Células foram incubadas a 37 °C na ausência de CO2. Foi confirmado que o meio de cultura manteve o pH designado durante o período de 24 horas da cultura. Essas condições experimentais não foram tóxicas para as células bovinas ou de camundongo e não tiveram efeito na morfologia celular ou viabilidade da monocamada vinculada.
3. Detecção de PS em células endoteliais cultivadas pela anexina V marcada com 125I
Após tratamento com os reagentes descritos acima, células tratadas e de controle foram incubadas com 7,1 pmols de anexina V marcada com 125I (200 μΕ/poço) no tampão ligante. Após 2 horas de incubação a temperatura ambiente, células foram lavadas exaustivamente e dissolvidas em 0,5 M de NaOH. 0 volume total de 0,5 mL foi transferido para tubos plást icos e contados num contador gama. Ligaçao nao-específica foi determinada na presença de 5 mM de EDTA e foi subtraído de valores experimentais. Os resultados foram expressos como pmols líquidos de anexina V ligada à célula, normalizado por 1 x 106 células.
Ligação máxima de anexina V foi determinada em células simultaneamente tratadas com actinomicina D e TNFCC (50 ng/mL de cada componente). Como tem sido reportado anteriormente, esses agentes causam apoptose e exposição de PS em 90-100% das células endoteliais (Lucas et al., 1998). Ligação basal de anexina V-125I a células não-tratadas foi determinada na presença de meio com 10% de soro. A quantidade de anexina V-1251 que se ligou a culturas não-tratadas foi subtraída daquela nas culturas tratadas. Exposição do PS foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: anexina V ligada à célula 400 (pmols) sob condições experimentais dividido pela ligação máxima de anexina V (pmols), multiplicado por 100. Cada estudo foi feito em duplicata e foi feito pelo menos três vezes. Valores médios foram calculados. O SE dos valores médios de três experimentos em separado foi menor do que 5%. B. Resultados 1. Indução por H2O2 Células endoteliais bEnd.3 de camundongo foram semeadas em uma densidade inicial de 50.000 células/poço. Vinte e quatro células posteriores foram incubadas com concentrações crescentes de H2O2 (de 10 μΜ a 500 μΜ) durante 1 hora a 37 °C ou deixadas sem tratamento. No fim da incubação, células foram lavadas três vezes com PBS contendo 0,2% de gelatina e fixadas com 0,25% de glutaraldeído. Poços idênticos foram ou manchados com IgM anti-PS ou tripsinizados e avaliados para viabilidade pelo teste de exclusão de Trypan Blue. Para o manchamento anti-PS, após o bloqueio com 2% de gelatina por 10 minutos, células foram incubadas com 2 μg/mL de anticorpo anti-PS, seguido pela detecção com conjugado HRP-IgM anticamundongo.
Exposição de células endoteliais ao H2O2 em altas concentrações causam a translocação de PS em ~ 90% das células. Entretanto, isso é acompanhado pela separação das células do substrato e pelo decréscimo da viabilidade celular para cerca de 50-60%. A associação da expressão de PS de superfície com o decréscimo da viabilidade celular é compreensível, embora ainda é interessante notar que -90% da translocação de PS é observada com somente 50-60% de decréscimo na viabilidade celular. 401
Usando concentrações mais baixas de H2O2 resultou na expressão significativa de PS sem qualquer redução apreciável na viabilidade celular. Por exemplo, PS foi detectado na superfície celular de cerca de 50% das células em todos os poços tratados com H2O2 usando H2O2 em concentrações tão baixas quanto 20 μΜ. É importante notar que, sob essas baixas concentrações de H2O2, as células permaneceram firmemente ligadas ao plástico e umas às outras, não apresentando alterações morfológicas e sem ter sinais de citotoxicidade. Análise detalhada revela essencialmente 100% de contato célula-célula, retenção da forma celular apropriada e citoesqueleto intacto. A expressão superficial de 50% de PS induzida por baixos níveis de H2O2 foi então observada em populações celulares nas quais a viabilidade celular era idêntica ao controle, células não-tratadas (i.e., 95%). A expressão de PS associada com altas concentrações de H2O2 foi acompanhada por dano celular, e as células PS positivas expostas a altas concentrações de H2O2 foram separadas, boiando e tinham citoesqueletos rompidos. A manutenção da viabilidade celular na presença de baixas concentrações de H2O2 é consistente com dados de outros laboratórios. Por exemplo, Schorer et ai. (1985) mostrou que células endoteliais de veias umbilicais humanas (HUVEC) tratadas com 15 μΜ de H2O2 conseguiram de 90 a 95% de viabilidade (reportado como 5% a 10% de injúria), enquanto aquelas expostas a 1.500 μΜ de H2O2 foram apenas 0%-50% viáveis (50% a 100% injuriadas). O uso de H2O2 para mimetizar o ambiente tumoral in vitro também é apropriado tendo em vista que o ambiente 402 tumoral é rico em células inflamatórias, tais como macrófagos PMNs e granulócitos, os quais produzem H2O2 e outras espécies oxigénio reativas. Embora nunca antes conectado com estáveis marcadores vasculares tumorais, células inflamatórias são conhecidas por mediar ferimentos a células endoteliais por mecanismos envolvendo espécies oxigénio reativas que requerem a presença de H2O2 (Weiss et al., 1981; Yamada et al., 1981; Schorer et al., 1985). De fato, estudos tem mostrado que o estimulo de PMNs in vitro produz concentrações de H2O2 suficientes para causar ferimento celular endotelial subletal sem causar morte celular (medido por ensaios de liberação de cromo) ou destacamento celular; e que essas concentrações de H2O2 são alcançáveis localmente in vivo (Schorer et al., 1985).
Os dados presentes de translocação in vitro correlacionam com os primeiros resultados mostrando que anticorpos anti-PS localizam especificamente para células endoteliais vasculares tumorais in vivo, e não se ligam a células em tecidos normais. A descoberta de que concentrações de H2O2 semelhantes a concentrações in vivo induzem a translocação de PS para a superfície da célula endotelial sem romper a integridade celular tem importantes implicações além de validar os dados originais in vivo e a abordagem terapêutica do inventor. Células endoteliais de humanos, bovinos e murinas são todas conhecidas como sendo PS negativas sob condições normais. Qualquer expressão de PS previamente documentada tem sempre sido associada com dano celular e/ou morte celular. Este não é o caso nos presentes estudos, onde a viabilidade normal é mantida. Isso mostra que a translocação de PS no endotélio vascular tumoral é mediada por mecanismos 403 bioquímicos desconectados ao dano celular. Acredita-se que seja a primeira demonstração de expressão de PS na superfície em células endoteliais intactas morfologicamente e a primeira indicação de que a expressão de PS pode ser desconectada da(s) via(s) de apoptose. Retornando para a operabilidade da presente invenção, essas observações novamente confirmam que PS é um marcador sustentável, ao invés de transitório, de vasos sanguíneos tumorais e um candidato adequado para intervenção terapêutica. 2. Indução por trombina
Observou-se também que a trombina aumenta a expressão de PS, embora não na mesma extensão que ο H2O2. Esse dado é também uma parte integrante do modelo de indução tumoral da expressão de PS desenvolvida pelos presentes inventores: expressão superficial de PS induzida por trombina em tecidos normais poderia também promover a coagulação tendo em vista que a expressão de PS coordena a montagem dos complexos de iniciação da coagulação. 0 ambiente tumoral é conhecido como sendo protrombótico, de tal forma que a vasculatura tumoral é predisposta para coagulação (Patente Americana número 5.877.289). Como trombina é um produto da cascata da coagulação, ele está presente na vasculatura tumoral. De fato, a presença de trombina induz a expressão de VCAM, contribuindo para a habilidade do inventor de explorar VCAM como um marcador alvejante da vasculatura tumoral (Patente Americana números 5.855.866; 5.877.289). 0 presente dado mostrando que trombina também induz a expressão de PS é então tanto relevante para o alvejamento de aminofosfolipídios com anticorpos nus quanto para conjugados 404 terapêuticos, e ainda explica os efeitos benéficos do coaguligante anti-VCAM contendo Fator Tecidual (Exemplo I). 3. Outros agentes do estresse oxidativo Células bEnd.3 de camundongo ou ABAE bovina in vitro foram tratadas por 24 horas com várias concentrações de fatores e condições que são presentes no microambiente de muitos tumores (Lichtenbeld et al., 1996; Harris et al., 1996), tal como hipóxia/reoxigenação, trombina, acidez, citocinas inflamatórias e peróxido de hidrogénio (Tabela 11) .
Externalização de PS e de fosfolipidios aniônicos foi quantificado pela medição de ligação anexina V-125I. A quantidade de ligação de anexina V foi comparada com aquela de células nas quais apoptose de 90-100% das células tinham sido induzidas por tratamento combinado com actinomicina D e TNFa. Actinomicina D e TNFa induziram a ligação de 6,2 pmols de anexina V por 106 células (3,8 x 106 moléculas de anexina V por célula) em ambos os tipos celulares, em boa concordância com dados da literatura (Rao et al., 1992). Esse valor foi tomado como o nivel máximo de fosfolipidios aniônicos externalizados. TABELA 11
Indução de PS pela recriação do ambiente tumoral
Tratamento Concent ração Anexina v-125I (% de ligação máxima) 405 Células ABAE Células bEnd.3 Meio com 10% de soro N/A 0 0 Actinomicina D + TNFOC 50 ng/mL cada 100 100 VEGF 20 ng/mL 0 0 FGF-2 20 ng/mL 0 0 Fator de dispersão 40 ng/mL 0 0 TGF βι 20 ng/mL 0 0 PDGF-BB 20 ng/mL 0 0 IL-10 20 ng/mL 0 0 IL-8 20 ng/mL 0 0 11-6 20 ng/mL 0 0 ii-ia 10 ng/mL 6,4 7,5 IL-ΐβ 10 ng/mL 5, 8 5,5 Interferon 40 ng/mL 8,6 2,8 TNFa 20 ng/mL 7, 4 13, 7 406
Trombina 50 nM co co 17, 4 Hipóxia 1% 02 15, 0 a 17, 5 22,5 Hipóxia + IL-la Igual ao anterior 26, 0 31,0 Hipóxia + TNFa Igual ao anterior 33, 0 36,0 pH 6,6 N/A 20,2 18,9 Peróxido de hidrogénio 200 μΜ 95, 5 98,4
Na Tabela 11, as concentrações de citocinas, fatores de crescimento e trombina usadas foram selecionadas de valores da literatura para ter efeito estimulante máximo em células endoteliais cultivadas. Essas concentrações não causam toxicidade no período de teste (24 horas) como julgado pela aparência morfológica, uma falta de separação, e uma falta de tomada pelo tripan azul. A concentração de H2O2 empregada foi a concentração máxima que não causou citotoxicidade sob as condições escolhidas. A ligação basal de Anexina V-125I foi determinada na presença de meio de crescimento sozinho. Exposição de PS máxima foi determinada após indução de apoptose pelo tratamento combinado com actinomicina D e TNFa. Média de duplicata de três estudos separados é apresentada. Erro padrão foi menor do que 5%. 407 Células não-tratadas foram amplamente isentas de PS externalizado, como julgado pela ligação de anticorpo anti-PS (9D2) ou anexina V (Tabela 11). A ligação basal na presença de meio de crescimento sozinho foi de 0,44 e 0,68 pmols de anexina V-125I para células ABAE e células bEnd.3, respectivamente. Isso corresponde a aproximadamente 7,1% e 10,9% da ligação máxima para células ABAE e bEnd.3, respectivamente, as quais correlacionaram-se bem com a descoberta de que aproximadamente 10% das células se ligam à anexina V biotinilada sob as mesmas condições. VEGF, HGF, FDF, TGFpi, PDGF, IL-6, IL-8 E IL-10 não aumentam a ligação de 125I-anexina V acima do nível basal para células não-tratadas. Mediadores inflamatórios (IL-la, IL-ΐβ, TNFa e interferon) causaram um pequeno, porém reproduzível aumento na translocação de fosfolipídio aniônico e de PS, que variou de 5 a 8% do nível máximo para células ABAE e de 3 a 14% para células bEnd3.
Hipóxia/reoxigenação, trombina ou condições externas ácidas (pH 6,8-6,6) induziram uma externalização de PS e fosfolipídio aniônico moderadamente alta que variou de 8 a 20% do nível máximo para células ABAE e de 17 a 22% do nível máximo para células bend.3. O aumento mais alto na translocação de fosfolipídios aniônicos e PS foi observado após o tratamento com de 100 μΜ a 200 μΜ de peróxido de hidrogénio. Esse tratamento causou a quase completa externalização (95%) de PS em ambos os tipos celulares conforme avaliado pela ligação de 125I-anexina V (Tabela 11). Mais do que 7 0% de células ABAE e bEnd.3 se ligaram a anexina V biotinilada, conforme avaliado imunoistoquimicamente. 408 Células endoteliais nas quais a translocação de fosfolipídio aniônico e PS foi gerada pelo tratamento com hipóxia/reoxigenação, trombina, acidez, TNFOcm IL-1 ou H2O2 permaneceram ligadas à matriz durante o período de tempo do ensaio (24 horas), manterá o contato célula-célula e reteram a sua capacidade de excluir tintura azul de tripan. Orientação normal de PS e fosfolipídio aniônico foi recuperada 24 a 48 horas após na maioria das células após a remoção do fator de indução, ou as condições culturais foram retornadas ao normal. Esses resultados indicam que estresse oxidativo brando, criado pela direta aplicação de H2O2 ou indiretamente por hipóxia/reoxigenação, acidez, trombina ou citocinas inflamatórias, dispara uma translocação passageira de PS e fosfolipídios aniônicos em células endoteliais viáveis. 4. Efeitos combinados de citocinas inflamatórias e hipóxia/reoxigenação
Aumento da exposição de PS e fosfolipídio aniônico foi observado quando células ABAE bEnd.3 foram sujeitas a hipóxia/reoxigenação na presença de IL-ΐα ou TNFOC. Na ausência das citocinas, hipóxia/reoxigenação aumentaram a exposição de PS pelas células ABAE a 15%-17,5% do nível máximo de células tratadas com concentrações apoptóticas de actinomicina D e TNFCC. Na presença de concentrações subtóxicas de IL-ΐα ou TNFa, hipóxia/reoxigenação aumentou a exposição de fosfolipídio aniônico para 26% e 33% respectivamente do máximo (Figura 5; Tabela 11) . Comparação com o efeito de citocinas na ausência de hipóxia/reoxigenação indica que a combinação de citocinas e hipóxia/reoxigenação tem mais do que efeitos aditivos na 409 exposição de PS. Efeitos similares foram observados em células bEnd.3.
Então, no ambiente tumoral, a exposição de PS e fosfolipídios aniônicos induzida por hipóxia/reoxigenação pode ser amplificada por citocinas inflamatórias e possivelmente por outros estímulos semelhantes, tais como acidez e trombina.
Esses estudos in vitro irradiaram luz no mecanismo de exposição de PS em células endoteliais tumorais in vivo. Eles mostram que vários fatores induziram exposição de PS em células endoteliais sem causar toxicidade, a qual mimetiza a situação em tumores in vivo. Hipóxia seguido por reoxigenação, acidez e trombina pela maior parte aumentaram a exposição de PS em células endoteliais viáveis. Citocinas inflamatórias (TNFa e IL-ia) também causaram uma fraca porém definitiva indução na exposição de PS.
Essas condições são provavelmente o maior estímulo indutor em tumores in vivo porque: i) endotélio positivo para PS é prevalente em regiões de dentro e ao redor de necrose onde hipóxia, acidez, vasos sanguíneos trombosados e leucócitos infiltrantes do hospedeiro são comumente observados; ii) a descoberta de que hipóxia/reoxigenação amplifica a fraca atividade de exposição de PS do TNFa e IL-1 em células endoteliais in vitro correlaciona com a situação in vivo em tumores onde hipóxia e tumor secretor de citocina e células hospedeiras coexistem; iii) hipóxia/reoxigenação e trombina têm sido reportados como geradores de espécies oxigénio reativas (ROS) em células endoteliais através da ativação de enzima membranar equivalente a NADPH oxidase (Zulueta et ai., 1995). ROS 410 produzidas por células malignas devem contribuir para o dano a células endoteliais (Shaughnessy et al., 1989). Peróxido de hidrogénio foi o indutor mais poderoso de exposição de PS em células endoteliais cultivadas encontradas no presente estudo, fornecendo suporte indireto para o envolvimento de ROS. PS externalizados fornecem uma superfície fosfolipídica negativa na qual os fatores de coagulação se concentram e se agregam. Isso pode contribuir para o status de procoagulante no endotélio tumoral que foi tardiamente reconhecido. PS também fornece um sítio de ligação para macrófagos circulantes (McEvoy et al., 1986), linfócitos T (Qu et al., 1996) e células polimorfonucleares que ajudam na infiltração de leucócitos nos tumores. Aderência de macrófagos ativados, células polimorfonucleares e plaquetas ao PS no endotélio tumoral podem levar a secreção adicional de espécies reativas de oxigénio e amplificação adicional da exposição de PS. EXEMPLO VIII (exemplo de referência)
Efeitos antitumorais de conjugados de anexina V A surpreendente descoberta de que aminofosfolipídios e fosfolipídios aniônicos são marcadores estáveis da vasculatura tumoral significa que construções de anticorpo-agentes terapêuticos podem ser usadas no tratamento do câncer. Além de usar anticorpos como agentes alvejantes, anexinas e outras proteínas de ligação específicas podem também ser usadas para distribuir especificamente agentes terapêuticos à vasculatura tumoral. Os dados a seguir mostram os efeitos antitumorais que resultam da administração in vivo de construções anexina-TF. 411 A. Métodos
Um conjugado anexina V-tTF foi preparado e administrado para camundongos nu/nu com tumores sólidos. Os tumores foram formados a partir de células de carcinoma coloretal HT29 humano que formaram tumores de pelo menos cerca de 1,2 cm3. 0 coaguligante anexina V-tTF (10 μg) foi administrado intravenosamente e deixou-se circular durante 24 horas. Camundongos tratados com salina foram mantidos separadamente como animais controle. Após o período de tratamento de um dia, os camundongos foram sacrificados e dessangrados e os tumores e órgãos maiores foram coletados para análise. B. Resultados 0 conjugado anexina V-tTF foi descoberto como indutor da coagulação de vasos sanguíneos tumorais específicos em camundongos com tumor HT29. Aproximadamente 55% dos vasos sanguíneos tumorais em animais tratados com conjugado anexina V-tTF foram trombosados após uma única injeção. Em contraste, existiam mínimas evidências de trombose na vasculatura tumoral dos animais controle. EXEMPLO IX (exemplo de referência)
Efeitos antitumorais de anticorpos 3SB e anti-PS
O presente exemplo mostrou os efeitos antitumorais de anticorpos anti-PS usando modelos tumorais xenogênicos e singênicos. O anticorpo 3SB usado nesse estudo se liga a PS 412 (e PA) , mas é essencialmente destituído de reatividade com PE. Esse anticorpo anti-PS causou danos vasculares tumorais, acompanhado de trombose, e necrose tumoral.
Os efeitos de anticorpos anti-PS foram primeiramente examinados em modelos tumorais singênicos e xenogênicos usando o anticorpo 3SB. Para um modelo singênico, 1 x 107 células de carcinoma coloretal de murina Colo 26 (obtido de Dr. Ian Hart, ICRF, Londres) foram injetados subcutaneamente dentro do flanco direito de camundongos com BALB/c. No modelo xenogênico, uma xenografia de linfoma L540 de Hodgkin humano foi estabelecido pela injeção de 1 x 107 células subcutaneamente dentro do flanco direito de camundongos machos CB17 SCID. Deixou-se os tumores crescerem até um tamanho de cerca de 0,6-0,9 cm3 antes do tratamento.
Camundongos com tumor (4 animais por grupo) foram injetados intraperitonealmente com 20 μρ de anticorpo anti-PS 3SB (IgM), IgM de camundongo controle ou salina. Tratamento foi repetido 3 vezes com um intervalo de 48 horas. Animais foram monitorados diariamente para medições tumorais e peso corporal. Volume tumoral foi calculado conforme descrito no Exemplo I. Camundongos foram sacrificados quando os tumores alcançaram 2 cm3, ou mais cedo se os tumores apresentaram sinais de necrose ou ulceração. O crescimento tanto de tumores xenogênicos quanto de tumores singênicos foi efetivamente inibido pelo tratamento com anticorpos anti-PS 3SB (Figura 6A e Figura 6B). Anticorpos anti-PS causaram dano vascular tumoral, acompanhado de trombose, e de necrose tumoral. A presença de 413 coágulos e desintegração de massa tumoral ao redor de vasos sanguíneos bloqueados foi evidente.
Quantitativamente, o tratamento com anticorpo anti-PS 3SB inibiu o crescimento tumoral em até 60% do volume tumoral de controle em camundongos com grandes tumores Colo 26 (Figura 6A) e L540 (Figura 6B) . Nenhum retardamento de crescimento tumoral foi encontrado em camundongos tratados com salina ou IgM controle. Nenhuma toxicidade foi observada em camundongos tratados com anticorpos anti-PS, com órgãos normais preservando a morfologia inalterada, indistinguivelmente de camundongos tratados com salina ou não-tratados. A regressão tumoral começou 24 horas após o primeiro tratamento e os tumores continuaram a reduzir de tamanho durante os próximos 6 dias. Isto foi observado tanto em modelos tumorais + imunocomprometidos e singênicos, indicando que o efeito foi mediado por mecanismo(s) independente(s) do status imune. Além disso, o declínio do peso tumoral foi associado com o aumento de vigilância e aparência geralmente saudável dos animais, comparado com camundongos controle com tumores maiores do que 1500 mm3. Recrescimento tumoral ocorreu 7-8 dias após o primeiro tratamento.
Os resultados obtidos com o tratamento anti-PS de tumores L540 são mais à frente compelidos pelas razões seguintes. Notavelmente, a necrose tumoral observada no tratamento de tumor L540 ocorreu independente do fato da percentagem de vasos que se mancharam positivamente para PS nos tumores L540 ter sido menor do que em tumores HT 29 e NCI-H358. Isso implica que mesmo necroses mais rápidas 414 poderiam provavelmente resultar da mesma forma por ocasião do tratamento de outros tipos de tumor. Além disso, tumores L540 são geralmente escolhidos como modelo experimental porque eles fornecem seções histológicas limpas e eles são, de fato, conhecidos como sendo resistentes à necrose.
EXEMPLO X
Efeitos antitumorais do anticorpo (9D2) contra fosfolipídios aniônicos
Esse exemplo mostra os feitos do anticorpo 9D2, os quais se ligam a PS e outros fosfolipídios aniônicos, em estudos antitumorais in vivo.
Uma alta dose do anticorpo de rato (> 150 μρ) que se liga a fosfolipídios aniônicos, 9D2, foi injetado em camundongos desguarnecidos com tumores H358. Estudos de imunolocalização mostram que ele se localiza intensamente no endotélio tumoral (4+), embora ligação não-específica de 9D2 em nível baixo em vasos normais foi observada devido à alta dose (como poderia ser observado para um anticorpo IgM controle de especificidade irrelevante) .
Quando 9D2 foi injetado intraperitonealmente em um camundongo SCID com um tumor L540 para produção de ascite, o tumor ficou necrótico e entrou em colapso. Na injeção de um anticorpo controle (MK 2.7, IgG de rato) em um camundongo SCID com um tumor L540, nenhum efeito similar foi observado. O efeito do anticorpo anti-PS 9D2 no crescimento de tumores L540 in vivo foram então determinados de maneira mais precisa. O tratamento começou quando os tumores alcançaram 200-250 μυ (dia 0) . Do dia 0 ao dia 7, 415 camundongos foram injetados intraperitonealmente com -150 μg de IgM (200 μΕ de sobrenadante) ou 200 μΐϋ de DMEM 10%. Do dia 7 até o dia 22, camundongos foram injetados intraperitonealmente com -300 μρ de IgM (400 μύ de sobrenadante) ou 400 μύ de DMEM 10%. Dia 22 foi o último dia de tratamento e os camundongos foram sacrificados.
Conforme apresentado na Tabela 12, dos dias 10 ao 22, crescimento tumoral é geralmente inibido por cerca de 40% a 50%. No final do estudo, apenas 4 camundongos no grupo tratado tiveram tumores maiores do que 2.000 μ]1. em volume, em contraste com 9/9 no grupo controle. TABELA 12
Efeitos de anticorpos anti-PS em tumores L540 in vivo
Dia após o inicio do tratamen to Média de volume tumoral (μΕ) 0, *0 inibição Número de camundongos com volume tumoral > 2000 μΕ Controle Tratado Controle Tratado 0 341 320 6,2 0 0 1 464 325 10,8 0 0 3 412 415 0 0 0 7 687 455 33,8 0 0 416 10 904 544 39,9 1/9 0 13 945 545 42,4 1/9 0 15 1373 685 50,1 4/9 1/10 17 1426 842 41, 0 4/9 4/10 20 1992 987 50,5 6/9 4/10 22 2560 1365 53,3 9/9 4/10
Em outro estudo in vivo, os efeitos dos anticorpos anti-PS de rato no crescimento de tumores L540 em camundongos CB17 SCID foram acompanhados por 45 dias após a injeção de células tumorais. Esses camundongos com tumor foram tratados com 300 μg de anticorpo anti-PS diariamente, intraperitonealmente, ou com 300 \IL de DMEM 10% diariamente, intraperitonealmente, como controle. Vários parâmetros do tratamento tumoral foram notavelmente melhores no grupo tratado em comparação com aqueles do controle (Tabela 13). TABELA 13
Efeitos em anticorpos anti-PS em tumores L540 in vivo
Outros parâmetros Controle Tratado % de tumores regredidos1 (60 dias 0 40% 417 após o tratamento) % de tumores regredidos1 (90 dias após o tratamento) 0 20% Volume médio de tumores secundários (μύ)2 537 ± 30 366 ± 56 1 Tumores pequenos demais para serem medidos em camundongos tratados nos tempos indicados (60 vs. 90 dias) após o tratamento 2 Metástases em nódulos linfáticos
Em um estudo adicional, o anticorpo 9D2 foi injetado intraperitonealmente em uma dose de 100 μρ três vezes por semana em camundongos com tumores L540. O tamanho tumoral foi medido com compassos duas vezes por semana. Os efeitos antitumorais em comparação com o grupo controle são apresentados na Figura 7. O número em parênteses indica o número de camundongos com tumores regredidos pelo número total de camundongos por grupo.
EXEMPLO XI
Efeitos antitumorais de anticorpo anti-PS 3G4 O presente exemplo demonstra efeitos antitumorais adicionais usando o anticorpo anti-PS 3G4 em modelos tumorais singênicos e xenogênicos, 0 anticorpo 3G4 usado nesse estudo é um anticorpo IgG que se liga a PS e outros fosfolipidios aniônicos (Exemplo IV). A. Protocolos para estudos de tumores em animais 418
Os efeitos do 3G4 foram examinados em modelos tumorais singênicos e xeongênicos. 0 protocolo geral para estudos de tratamento de tumor animal é conduzido como se segue. A não ser que diferenças particulares sejam especificadas, esse é o protocolo usado nos estudos da presente aplicação.
Os animais são obtidos de Charles Rivers Laboratories. Os camundongos são de 4-5 semanas, fêmeas, camundongos C.B-17 SCID ou Caça de Raposa SCID. Camundongos são colocados em gaiolas autoclavadas, com água e comida estéreis, com manipulação estéril. Todos os procedimentos feitos em capela de fluxo laminar. Os camundongos foram aclimatados por 1 semana e então marcados na orelha e uma amostra de sangue (aproximadamente 75-100 μΒ) tomados da veia do rabo para checar o escoamento por ELISA. Quaisquer camundongos que falhassem no escoamento por ELISA não deveriam ser usados para procedimentos de teste. Camundongos foram injetados ortotopicamente com células tumorais na parte gordurosa da pata (MFP) ou subcutaneamente dentro do flanco direito 2-3 dias após a serem marcados na orelha e terem sido removidas as amostras de sangue.
No modelo ortotópico, 1 x 107 células em 0,1 mL de DMEM são tipicamente injetados em camundongos MFP ou anestesiados. Camundongos são anestesiados com 0,075 mL de coquetel para camundongo injetado intraperitonealmente. O coquetel do camundongo é composto por 5 mL de Ketamina (100 mg/mL) ; 2,5 mL de Xilazina (20 mg/mL) ; 1 mL de Acepromazina (10 mg/mL); 11 mL de água estéril. A dosagem é de 0,1 mL por 20-30 gramas de peso corporal via rota intraperitoneal por uma duração de 30 dias. 419
Uma vez que o camundongo está anestesiado, medido através da ausência de resposta à compressão da unha/pés, o camundongo é deitado no seu lado esquerdo e esfregado com etanol 70% exatamente atrás da cabeça e em volta da área de trás do antebraço direito. Uma incisão de 2-3 mm é feita exatamente atrás do antebraço direito (tórax lateral), a qual revela a gordura esbranquiçada da pata quando a aba da pele é levantada). 0,1 mL de células são injetadas dentro da gordura da pata usando uma seringa de 1 mL e uma agulha de medida 27, produzindo uma bolha na gordura da pata. A incisão é fechada usando um grampo para incisões. O camundongo retornou para sua gaiola e foi observado até que ele tenha despertado da anestesia e se mexa. O status da saúde pós-operativa é determinado, e se quaisquer sinais de angústia são observados, é dado acetaminofeno ao animal (0,24 mg/mL) + codeina (0,024 mg/mL) na água para beber. O grampo para incisões é removido após uma semana. Esse método é usado para que as células fiquem posicionadas corretamente dentro do sitio selecionado e não na região subcutânea. Tumores terão aproximadamente 200 μυ de volume (CxLxA) em 14-15 dias e o grau alcançado é de essencialmente 100%.
No modelo subcutâneo, camundongos são caracteristicamente injetados com 1 x 107 células em 0m2 mL. Camundongos não são anestesiados, mas são controlados usando-se uma pinça na de pele de camundongo expondo o flanco direito. Uma seringa de 1 mL com agulha de medida 23 é usada para injetar 1 x 107 células em 200 μL, exatamente sob a pele do camundongo e uma bolha será vista. Não é incomum observar uma pequena quantidade de vazamento de fluido do sitio da injeção. Uma movimento de rotação pode ser usado quando remover a agulha da injeção subcutânea para reduzir esse vazamento. O volume tumoral é medido por CxLxA. 420
No protocolo da perfusão, camundongos são injetados IV com 1000 U de heparina em 0,2 mL de salina. Camundongos são então sedados pela injeção intraperitoneal ao camundongo com 0,1 mL de coquetel para camundongo. Quando o animal estiver suficientemente sedado, o que é medido pela ausência de reflexo quando os pés/unha são comprimidos, a cavidade torácica é aberta para expor o coração e os pulmões. Uma agulha de tamanho 30 ligada a uma bomba de perfusão e tubo é inserida no ventrículo esquerdo. O ventrículo direito é cortado de forma que o sangue possa gotejar para fora. Salina é bombeada através da bomba durante 12 minutos a uma velocidade de 1 mL por minuto. No final da perfusão, a agulha e o tubo são removidos. Tecidos são removidos para estudos adicionais, sejam eles imunoistoquímicos ou patológicos. B. Resultados do tratamento tumoral.
Para o modelo singênico, células de tumor de fibrosarcoma de camundongos Meth A foram usadas. Em um modelo xenogênico, células de tumor de mama MDA-MB-231 humanas foram cultivadas na polpa gordurosa mamária. Em outro exemplo xenogênico, uma xenografia de linfoma L540 de Hodgkin humana foi estabelecida pela injeção de células e deixando o tumor crescer até um tamanho de mais de 500 mm3 antes do tratamento. Camundongos com tumor (10 animais por grupo) foram injetados intraperitonealmente com 100 μρ de anticorpo anti-PS 3G4 (IgG) em oposição ao controle. O tratamento foi repetido três vezes por semana. Os animais foram monitorados duas vezes por semana para medidas tumorais. 421 0 crescimento tanto de tumores singênicos quanto de tumores xenogênicos foi efetivamente inibido pelo tratamento com anticorpos anti-PS 3G4. Tratamento pelos primeiros 20 a 30 dias é apresentado nas Figuras 8A, 8B e 8C. Os anticorpos causaram danos à vasculatura tumoral, trombose localizada e necrose tumoral. O tratamento das células tumorais Meth A singênicas foi particularmente bem sucedido, e o tratamento das células tumorais de mama MDA-MB-231 humanas crescendo na polpa gordurosa mamária também produziu regressões tumorais (Figuras 8A e 8B). Mesmo em camundongos com grandes tumores L540, os quais se sabe que são resistentes à necrose, o tratamento com anticorpo 3G4 inibiu o crescimento tumoral em comparação com o controle. Nenhum retardamento do crescimento tumoral foi encontrado em camundongos controle. Nenhuma toxicidade foi observada em camundongos tratados com anticorpos anti-PS.
Tumores também foram estabelecidos usando-se células MD-MBA-435 e tratadas conforme descrito acima. O crescimento desses tumores foi também eficientemente inibido pólo tratamento com o anticorpo 3G4. O tratamento de tumores grandes L540, células tumorais MDA-MB-231 e MD-MBA-435 por 60 dias é apresentado nas figuras 8D, 8E e 8F. Os anticorpos causaram danos vasculares ao tumor, trombose, necrose e crescimento tumoral retardado, sem evidências de toxicidade. Células luciferases MD-MBA-435 foram obtidas do Dr. Angels Sierra Jimenez, Barcelona, Espanha e cresceram em DMEM 10%. Camundongos foram injetados com células tumorais como descrito acima, e em duas semanas após injeção, os tumores foram medidos e o volume registrado. Tratamento de 422 camundongos com tumores de volumes médios similares (200 mm3) foi feito usando o anticorpo 3G4 e o anticorpo quimérico 3G4, produzido conforme descrito no Exemplo XIX, versus controle. Tratamento foi iniciado por injeção intraperitoneal (800 μρ) no dia 15 e continuou com injeções de 200 μρ a cada dois ou três dias até a injeção final de 400 μρ no dia 35. Volumes tumorais e pesos corporais dos camundongos foram medidos nos dias das injeções. Camundongos foram sacrificados e perfundidos com salina por 12 minutos. Os órgãos e o tumor foram removidos, rompido congelado em nitrogénio liquido e o tumor cortado para análise imunoistoquimica.
Este estudo mostrou que tanto o anticorpo 3G4 quanto o anticorpo 3G4 quimérico retardam de forma eficaz o crescimento tumoral em oposto ao controle (Figura 8G).
EXEMPLO XII
Efeitos antivirais de anticorpos anti-PS contra CMV
Campos de comutação surpreendentes da vasculatura tumoral para infecções virais, os inventores depois entenderam que os anticorpos para aminofosfolipidios e fosfolipidios aniônicos poderiam também exercer semelhantemente um efeito antiviral. O presente exemplo realmente mostra que isso é verdade, primeiramente usando o anticorpo 3G4 no tratamento da infecção por citomegalovirus (CMV). A. Métodos 1. Tratamento de células infectadas com CMV in vitro 423
Monocamadas confluentes de fibroblastos do prepúcio diplóide humano (HHF-R2) em placas com seis poços foram infectadas com CMV AD 169 humano expressando proteína verde fluorescente (GFP) em um MOI - 0,01 conforme anteriormente descrito (Bresnahan et al., 1996). Resumidamente, as células foram incubadas com vírus num volume total de 1 mL por poço a 37 °C por 90 minutos. Durante a infecção, as placas foram gentilmente agitadas a cada 30 minutos. Posteriormente à infecção, o sobrenadante celular foi removido e DMEM/FBS 10%/Pen-strep (2 mL por poço) foi adicionado a cada poço.
Diluições de 3G4 do anticorpo controle equiparado com o isotipo GV39G (100 μρ/πΛ e 50 μρ/ιτΛ) foram adicionados aos poços. As células infectadas foram incubadas a 37 °C por um total de 19 dias. O meio e o anticorpo em cada poço foi trocado a cada 3 dias. No dia 19, as células e sobrenadantes de cada poço foram coletadas e congeladas a -80 °C até que os teste com as placas fossem executados. 2. Microscopia fluorescente O recombinante CMV expressa GFP sob o controle do protômero SV40. Então , células infectadas aparecem em verde sob o microscópio de fluorescência. Nesses estudos, o anticorpo tratado com células infectadas com CMV foram observadas sob microscópio de fluorescência nos dias 2, 3 e 9. 3. Ensaios de placa 424
Os ensaios de placa foram feitos usando protocolos padrão. Resumidamente, as suspensões celulares de células congeladas foram descongeladas rapidamente a 37 °C e centrifugadas para remover fragmentos a 1000 rpm por minuto. Diferentes diluições dos sobrenadantes celulares foram adicionados para monocamadas subconfluentes de células HFF-R2 em placas de 6 poços e as células incubadas a 37 °C por 90 minutos (as placas foram gentilmente agitadas a cada 30 minutos). Após a infecção, os sobrenadantes celulares foram removidos e substituídos com 2 mL de DMEM/FBS 10%. No dia 4, o sobrenadante em cada poço foi removido e as células cobertas com agarose/DMEM/FBS 10% 0,01% de baixo ponto de fusão. As placas foram incubadas a 37 °C por um total de 14 dias após a infecção. No dia 14, as monocamadas infectadas foram fixadas com formalina tamponada 10% e manchada com azul de metileno para visualizar as placas. B. Resultados
1. 3G4 inibe a disseminação virai de CMV
Para investigar se 3G4 tem um efeito inibitório na infecção e replicação de CMV, fibroblastos humanos confluentes foram pré-tratados com 3G4 antes que CMV fosse adicionado a uma baixa m.o.i. O CMV usado nesses estudos expressam proteínas fluorescentes verdes (GFP). Então, células infectadas aparecem verdes quando observadas sob um microscópio de fluorescência.
No dia 30 do tratamento, com tanto 50 μρ/ιηΕ quanto com 100 μg/mL do anticorpo, existiam células infectadas tanto em poços não-tratados quanto em poços tratados com 3G4 ou anticorpo controle equiparado como isotipo, GV39G. Então, 425 tratar os fibroblastos com 3G4 nao aparenta inibir significantemente a entrada de virus nas células.
No dia 9, entretanto, existe uma diferença dramática no número de células infectadas nas 3G4 tratadas versus controle, poços tratados com GV39G (Figura 9A e Figura 9B; comparar o painel do topo da direita com os painéis do meio e da direita abaixo). Enquanto o virus se espalhou para aproximadamente 80% da monocamada nos poços de controle, o virus é restrito a célula unicamente infectada original nos poços tratados com 3G4. Então, 3G4 limita a proliferação de CMV da célula originalmente infectada para as células vizinhas. Essa inibição da proliferação virai é observada quando as células são tratadas com 100 μg/mL (Figura 9A) e 50 μg/mL (Figura 9B). 2. Inibição virai é dependente da concentração de anticorpo
Para determinar qual concentração de 3G4 é necessária para o efeito antiviral a uma baixa m.o.i., células infectadas foram tratadas com diferentes concentrações de 3G4 e o anticorpo controle, GV39G. Como apresentado ma Figura 10, a completa inibição de propagação de célula a célula é observada com 3G4 a 100 μg/mL e 50 μg/mL. Quando as células foram tratadas com 25, 12,5 e 6,25 μg/mL de 3G4, apareceram números crescentes de células infectadas com CMV GFP positivas. Embora 3G4 não previna totalmente a disseminação virai das células infectadas primariamente a essas baixas concentrações, ela ainda tem um efeito antiviral significativo, uma vez que menos células infectadas com CMV GFP positivas são vistas nas tratadas com 3G4 quando comparadas com células tratadas com GV39G, poços de controle (Figura 10). 426 3. Quantificação da carga virai a uma baixa M.O.I. 0 efeito antiviral de 3G4 foi quantificado pela execução de ensaios de placa para determinar a carga virai após o tratamento com anticorpo. Os controles incluíram células não-tratadas, o anticorpo GV39G e um anticorpo controle adicional usando o anticorpo C44, um anticorpo de isotipo de IgG2a de camundongo para a colchicina.
Tratamento de células infectadas (m.o.i. = UFC/célula) com 100 μρ/ιτΛ de 3G4 resultou em um decréscimo dramático de 6 logio no título virai quando comparado com o controle, células tratadas com GV39-G (Figura 11-A). Essa inibição traduz em uma inibição aproximada de 99,9999% da replicação virai. Numa concentração de 50 μg/mL, tratamento com 3G4 resulta em um decréscimo de 3,5 logio no título virai quando comparado com tratamento de GV39G. Usando 3G4 a 25 μρ/ιηΐ, e 12,5 μρ/ηίΐΐ,, os resultados ainda são dramáticos, e mesmo a 6,25 μρ/ηιΐΐ, um efeito inibitório ainda é observado (Figura 11A) . 4. Quantificação da carga virai em alta M.O.I.
Tratamento de fibroblastos infectados com 3G4 a uma alta m.o.i. de 3 também resulta em uma dramática redução do título virai. A 100 μg/mL, tratamento com 3G4 resultou em um decréscimo de 5 logio no título virai quando comparado com o controle, células tratadas com GV39G (Figura 11B). A 50 μg/mL, replicação virai 3G4 inibida por 3 logs quando comparado com GV39G (Figura 11B). 5. Inibição da replicação em um estágio avançado 427
Para determinar qual estágio do ciclo replicativo de CMV é bloqueado por 3G4, uma estudo de adição cronometrado foi feito. Para isso, 3G4 foi adicionado a fibroblastos infectados a uma alta m.o.i. em diferentes pontos de tempo após a infecção. A carga virai (tanto nas células quanto no sobrenadante) foi quantificada usando um ensaio de placa padrão.
Adição de 3G4 até 24 horas após a infecção resultou num decréscimo de 5-6 logio no titulo virai (Figura 11C). Entretanto, quando a adição de 3G4 foi atrasada para 48 horas, o efeito inibitório de 3G4 foi reduzido para 2 logio e quando a adição foi atrasada para 72 a 96 horas, o efeito inibitório foi adicionalmente reduzido. Isso mostra que 3G4 interfere com o último estágio da replicação de CMV que ocorre entre 24-48 horas após a infecção. Então, 3G4 não interfere significantemente com a infecção ou com inicio imediato ou expressão genética antecipada. Ela preferencialmente age tarde no ciclo de replicação virai, por exemplo, na expressão gênica tardia, síntese de DNA virai, empacotamento virai ou disseminação.
EXEMPLO XIII
Efeitos antivirais ou anticorpos anti-PS contra RSV
Adicionalmente aos efeitos antivirais dramáticos contra CMV apresentados no Exemplo XII, o presente exemplo demonstra o uso de três diferentes anticorpos anti-PS na inibição da replicação do Vírus Sincitial Respiratório (RSV). A. Métodos 428 1. Tratamento de células infectadas por RSV in vitro Células A-549 cresceram a 100% de confluência em três placas de cultura tecidual de 12 poços Costar. 200 μυ de meio Eagle essencial mínimo foi adicionado a todos os poços. Anticorpo antifosfolipídio (Ab) foi adicionado (100 μρ em 100 μ]0) a 9 poços de cada placa e 30 minutos mais tarde células em 6 dos 9 poços iniciais foram infectadas com um MOI de 1 com linhagem longa de RSV em um volume de 100 μΐϋ. Os três poços restantes foram deixados como não-infectados, poços tratados com anticorpo. Os três outros poços sem anticorpo foram infectados com RSV no mesmo MOI descrito acima.
Cada placa foi usada para testar os três diferentes anticorpos: 3G4, 3SB e 1B9 (Exemplo IV). Células foram incubadas em 5% CO2 a 40 °C por 2 horas e então 600 μΐϋ de meio foi adicionado para completar o volume de 1 mL em cada poço. Uma placa de célula A-549 foi mantida nas mesmas condições, como controle. Sobrenadantes foram coletados em 4, 24 e 72 horas após a infecção. A cada ponto de tempo, quatro poços de cada placa foram amostrados: um poço somente com células tratadas com Ab, dois poços tinham células infectadas com RSV/tratadas com Ab e um poço tinha somente células infectadas com RSV. As amostras foram congeladas a -80 até o ensaio da placa. 2. Ensaios das placas
Os ensaios das placas foram feitos como anteriormente descrito (Kisch et al., 1963; Graham et al., 1988).
Resumidamente, as suspensões de células congeladas foram descongeladas rapidamente a 37 °C. Três diluições de dez 429 vezes foram feitas dos sobrenadantes das células não-diluidos: ΙΟ-1, IO-2 e IO-3. 100 μΐϋ de cada diluição mais a amostra não-diluida foram inoculados em placas com linhagem celular Hep-2 confluente em 80%, todas em triplicatas.
Placas foram colocados em 5% de CO2, incubador a 40 °C por 5 dias. No quinto dia, as placas foram desenvolvidas e
manchadas com hematoxilina e eosina para revelar as placas em cada poço. As placas foram contadas usando um microscópio dissector para calcular a carga virai de RSV em UFC
(unidades formadoras de placas)/mL B. Resultados
Como visto na Figura 12, tratamento de células infectadas com RSV quer com 3SB ou com 1B9 resultaram em um decréscimo de log na replicação virai. O efeito antiviral foi ainda mais pronunciado quando as células infectadas foram tratadas com 3G4. Tratamento com 3G4 resultou em um decréscimo de 2 logio no titulo virai (Figura 12). A inibição foi mais baixa do que a vista com CMV, mais provavelmente porque a concentração de 3G4 estava baixa (25-5 0 μρ/ιτΛ)
EXEMPLO XIV
Cadeia única de anticorpos anti-PS
Dados os muitos usos dos anticorpos anti-PS descritos aqui, incluídos como agentes antitumorais somente, como agentes alvejantes para distribuir agentes terapêuticos acoplados para os tumores, e como agentes antivirais, o presente exemplo descreve técnicas adequadas para gerar anticorpos anti-PS (scFv) de cadeia única, por exemplo, nos 430 quais os domínios VH e Vl são apresentados em uma única cadeia polipeptídica, geralmente junta por um ligante peptídico. A. Preparação da biblioteca de anticorpos contra fagos 0 estoque secundário da biblioteca de bactérias (cerca de 1 x 1010 clones) foi inoculado em 100 mL de 2xTY contendo 100 μg/mL de ampicilina e 1% de glicose. Ele cresceu com agitação a 37 °C até que OD a 600 nm foi 0,5.
Fago ajudador M13K07 foi adicionado a 1013 UFC e incubado sem agitação em banho-maria a 37 °C por 30 minutos. As células infectadas foram centrifugadas a 3.500 g por 10 minutos. O pellet foi resuspendido em 200 mL de 2xTY contendo 100 μρ/ηΛ de ampicilina e 75 μρ/πΛ de canamicina e incubado com agitação a 30 0 em pernoite. A cultura foi centrifugada a 10.800 g por 10 minutos. 1/5 do volume de PEG/NaCl foi adicionado ao sobrenadante, misturado bem e de ixado por 1 hora O O , Ele foi então centrifugado a 10 .800 g por 30 minutos. 0 pellet foi resuspenso em 40 mL de PBS e 8 mL de PEG/NaCl foram adicionados. Ele foi misturado e deixado por 20 minutos a 4 °C. Ele foi então centrifugado a 10.800 g por 10 minutos e o sobrenadante aspirado. O pellet foi resuspenso em 2 mL de soro humano 10% e centrifugado a 11.600 g por 10 minutos em uma microcentrífuga para remover a maior parte dos fragmentos bacterianos remanescentes.
Para pré-pan, a biblioteca de anticorpo de fago em soro humano a 10% foi adicionada ao prato coberto por PC e incubado por 60 minutos a temperatura ambiente. 431 B. Seleção de lipossomas biotinilados. 20 μιηοΐ de f osf atidilinositol e 20 μιηοΐ de
fosfatidilserina biotinilada foram dissolvidas em 10 mL de hexano. Essa solução foi seca a uma camada fina na superfície do frasco usando um rotaevaporador. 2 mL de PBS foi adicionado e o banho submetido ao ultra-som a 4°C por 30 minutos. 100 μί do fago scFv e 100 μL de lipossomas biotinilados foram então misturados na presença de soro humano a 10% e gentilmente rodado por 1 hora a temperatura ambiente. O bloqueio foi feito com 100 μι, de dinamicroesf eras de estreptavidina M-280 pela adição de 600 μL de caseína 2,5%/BSA 0,5% por 30 minutos a temperatura ambiente. As microesferas foram separadas do tampão de bloqueio com um MPC-E (Concentrador de Partículas Magnéticas da Dynal) por 4-5 minutos.
As microesferas foram resuspensas em 100 μΕ de PBS. 100 μΕ de dinamicroesferas de estreptavidina bloqueada foram adicionados ao fago ligado ao antígeno biotinilado e gentilmente rodado por 15 minutos à temperatura ambiente. A separação foi alcançada com MPC-E por 5 minutos e o sobrenadante vertido para fora. Ele foi lavado cinco vezes com 1 mL de PBS. Para cada lavagem, as microesferas foram resuspendidas e abaixadas com o MPC-E.
Finalmente, o fago eluiu-se o fago das microesferas pela resuspensão em 300 μΕ de trietalamina 100 mM por 30 minutos. 150 μΕ de tris pH 7,4 1M foi adicionado para neutralização. As microesferas foram separadas novamente com o MPC-E. 432 150 μΐϋ de fago sobrenadante foi usado para infectar 10 mL de bactéria TG1 em fase log. 10 mL de cultura foi agitado na presença de 20 μg/mL de ampicilina a 37 °C por uma hora. Ampicilina foi adicionada até a concentração final de 50 μρ/πΛ e agitada por outra hora. 1013 UFC de fago ajudador M13 foi adicionado a essa cultura, transferido para 100 mL de meio 2TY contendo 100 μρ/ιτΛ de ampicilina e agitado a 37 °C por 1 hora. Kanamicina foi adicionada até a concentração final de 100 μρ/ιτΛ e agitada a 30 °C em pernoite. 0 procedimento de preparação de fago foi repetido e o procedimento de seleção repetido por outras três ou quatro vezes. C. ELISA de anticorpo de cadeia única monoclonal:
Colónias individuais de HB2151 das placas (após 4 rodadas de seleção) foram inoculadas em 500 μL de 2Xty contendo 100 μρ/ηϋΐ, de ampicilina e 1% de glicose em placas de 96 poços e crescidos com agitação (300 rpm) em pernoite a 37 °C. 5 μΕ dessa placa foram transferidas para uma segunda placa de 96 poços contendo 500 μL de 2xTY contendo 100 μρ/ιτΛ de ampicilina por poço e crescidas em agitação a 37 °C por 3 horas (OD600=0,9).
Em cada poço foi adicionado 50 μΕ de 2xTY contendo 100 μg/mL de ampicilina, 10 mM de IPTG (concentração final é de 1 mM), o qual cresceu com agitação em pernoite a 30 °C. Ele foi centrifugado a 1.800 g por 10 minutos e 100 μΕ do sobrenadante usado no ELISA seguinte. 433
Placas de 96 poços (DYNEX IMMUL0N®1B) foram cobertas com PS dissolvido em etanol numa concentração de 10 μρ/ιηΕ (P6641 10 mg/mL solvente foi clorofórmio:metanol 95:5). 10 μg/mL de PC foram cobertos da mesma forma. Essas placas foram evaporadas a 4 °C em ambiente frio. 250 μΕ de caseína 2,5% foram adicionados a cada poço, e as placas foram cobertas e bloqueadas a 37 °C por 1 hora.
Poços foram rinsados 3 vezes com PBS, 100 μΕ/poço de soro humano a 10% e 100 μΕ/poço de sobrenadante contendo scFv solúvel foi adicionado e incubado por 60 minutos a 37 °C. A solução foi descartada e lavada por 6 vezes com PBS. 100 μΕ de 9E10 em caseína 5%/BSA-PBS 0,5% (diluição 1:5000) foram adicionados em cada poço, incubados a 37 °C por 1 hora e lavados 6 vezes com PBS. 100 μΕ de anticorpo anti-camundongo-cabra-HRP (diluição 1:10000) foi adicionado a cada poço, incubado a 37 °C por 1 hora e lavado 5 vezes com PBS. 100 μΕ de OPD 0,05% foram adicionados para cada poço e desenvolvidos por 5 minutos. 100 μΕ de H2SO4 0,18 M foi adicionado para interromper a reação e ler a O.D. 490.
Clones antígeno-positivos foram corridos em placas de 2xTYAG e cresceram no pernoite a 30 °C. Colónias sozinhas positivas foram colocadas em 3 mL de meio 2xTYAG e crescidas por 12 horas a 37 °C. Plasmídeos foram extraídos e inserções de gene scFv checadas por digestão enzimática e PCR. Aqueles com inserções de tamanho correto foram sequenciados.
As colónias com inserções de tamanho correto cresceram em 100 mL de meio 2xTYAG e foram agitadas a 37 °C OD 600=0,5. Estes foram transferidos para 900 mL de 2xTYA e cresceram até que OD 600=0,9. 1 M de IPTG foi adicionado até 434 uma concentração final de 1 mM e agitado a 30 °C por um pernoite. O sobrenadante foi averiguado usando o mesmo método de ELISA anterior. A proteína scFv foi purificada a partir da fração periplásmica usando cromatografia de afinidade de Ni++-agarose. D. Resultados
Após 4 rodadas de garimpada, os seguintes clones deram sinal de ELISA promissor em placas PS e tiveram o correto tamanho da inserção: 3E5, 3A2, G5, C8, E4 e 4D5. Estes têm sido subclonados, em que E4 deu 5 subclones positivos e 4D5 deu 5 subclones positivos (Tabela 14). 435
463ELISA na placa OS 1-1 o o 1-1 CM 1-1 03 Li0 LiO LiO r- o CM LiO 5-1 \—1 \—1 \—1 \—1 5-1 \—1 \—1 O o o o o o o o CM CM 00 LiO 00 CM CM O O 00 r- o \—1 \—1 \—1 5-1 \—1 CM CM \—1 \—1 o o o o o o o o \—1 l> oo oo r- 00 r- CM r- \—1 5-1 o CM 5-1 o CM o < < < < < < < < o o o O o o O o o o ϊ—1 oo LiO 00 KD 03 00 03 00 00 00 \—1 5-1 CM 5-1 5-1 5-1 5-1 5-1 o O o O o o O o l> 00 LiO 03 l> 00 00 00 00 r- 00 00 00 O o o o o o o o O o o o o o o o 00 LiO oo CM CM oo CM 00 r- 00 00 00 00 CM 00 o o o o o o \—1 o o o o o o o o o l> l> ϊ—1 l> CM 03 03 03 o 03 03 00 o o o o 5-1 o o o 5-1 o o o o o o o o o 00 LiO l> o 03 03 o CM o o o 03 03 00 \—1 5-1 \—1 \—1 \—1 o \—1 o o O o o o o o o LiO o CM oo ϊ—1 CM 00 LiO \—1 LiO \—1 CM oo oo 5-1 CM 5-1 \—1 5-1 \—1 5-1 5-1 5-1 \—1 K K K K o o o o o o o o 00 l> l> ϊ—1 ϊ—1 \—1 CM 5-1 CM \—1 5-1 CM oo 5-1 \—1 5-1 \—1 5-1 5-1 \—1 5-1 o o o o o o o o l> LiO 00 ϊ—1 LiO l> o O \—1 o CM \—1 r- o 5—1 5—1 5—1 5—1 \—1 5—1 *—1 5—1 o o o o o o o o (73 oo CM l> 00 00 ϊ—1 CM 03 5-1 CM o oo 5-1 5-1 o o 5-1 \—1 5-1 5-1 5-1 5-1 5-1 o O o o o o o o 436 437 3Ε5 3Α2 G5 C8 E4 4D5
Uma vez que os clones positivos foram identificados, eles foram sequenciados. 0 ácido nucléico ScFv e a sequência de proteína do clone 3A2 é demonstrado na SEQ ID NO:5 e na SEQ ID NO:6, respectivamente. Os clones positivos cresceram em grande escala e o scFv purificado usando cromatografia de afinidade de Níquel agarose. 0 scFv purificado foi obtido usando eletroforese em gel Phast.
EXEMPLO XV
Síntese de derivados peptídicos que se ligam a PE 0 presente exemplo envolve o desenvolvimento e a síntese de derivados e conjugados peptídicos que se ligam a PE exemplares para uso no tratamento de tumores e doenças virais. As estruturas para derivados de duramicina exemplares são estabelecidas nos painéis das Figuras da 13A até a Figura 130, os quais atendem a descrição a seguir.
A. DLB 0,5 mg (0,25 μιηοΐ) de duramicina dissolvida em 0,387 mL de NaHC03 0,1 M em água foi adicionado a 0,113 mg (0,025 μιηοΐ) de NHS-LC-Biotina (Sigma) . A mistura reacional foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora e então a 4o no pernoite. A amostra foi posta numa coluna de sílica, lavada com 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA), eluída com 0,1% de TFA e 70% de CH3CN. O eluato foi coletado e concentrado por centrifugação. O total de rendimento foi de 0,5 mg (Figura 13A).
B. DIB 438 0,5 mg (0,25 μιηοΐ) de duramicina dissolvida em 0,286 mL de NaHCOs 0,1 M em água foi adicionada a 0,034 mg (0,25 μιηοΐ) de cloridrato de 2-iminotiolano (2-IT). A mistura foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora. 0,13 mg (0,26 μιηοΐ) de iodoacetil-LC-Biotina (Pierce) foi adicionado e a reação incubada a temperatura ambiente por 1 hora e a 4 °C durante o pernoite. A amostra foi posta em uma coluna de sílica, lavada com TFA 0,1%, eluída com TFA 0,1% e 70% de CH3CN. O eluato foi coletado e concentrado por centrifugação. O rendimento total foi de 0,5 mg (Figura 13B) .
C. (DLB)4NA 1,9 mg (0,94 μιηοΐ) de duramicina foi dissolvido em 0,5 mL de NaHCCg 0,1 M em água. A este, 0,4 mg (0,88 μιηοΐ) de NHS-LC-Biotina (Sigma) em 200 μΕ de dimetilformamida (DMF) foi adicionado. A mistura foi incubada a temperatura ambiente durante 4 horas. 10 mg (0,17 μιηοΐ) de neutravidina (NA) em 1 mL foram adicionados à mistura reacional, a qual foi incubada a temperatura ambiente por 2 horas e então a 4°C no pernoite. A mistura reacional foi então colocada em uma coluna G-25 (volume de 50 mL) em tampão PBS. As frações foram coletadas e analisadas por SDS PAGE (gel phast) . Frações contendo proteínas (7-16) foram reunidas, esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,22 μιη e a concentração determinada pela medição da absorção a 280 nm. 0 rendimento total foi de 5,1 mg. A amostra foi então fracionada por FPLC. Três picos foram coletados que corresponderam ao seguinte: pico 1: [(DLB)4NA]3 (frações 17-23); pico 2: [(DLB)4]2 (frações 24- 33) e pico 3: (DLB)4NA (frações 35-48). Todas as amostras 439
foram esterilizadas por filtração usando um filtro de 0,22 μιη. Os rendimentos finais obtidos foram: 0,34 mg de [ (DLB) 4NA] 3; 0,59 mg de [(DLB>4]2 e 1,41 mg de (DLB)4NA (Figura 13C).
D. (DLB)4NA-F 0,61 mg de (DLB)4NA em tampão PBS foi adicionado a 0,005 mg de N-hidroxisucinimidil fluoresceina (NHS-fluoresceína) (Sigma) em DMF. A mistura foi incubada a temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura reacional foi então fracionada em uma coluna PD10 (10 mL). (DLB)4NA-F foi eluido nas frações contendo proteínas (3 e 4), as quais foram reunidas e esterilizadas por filtração usando um filtro de 0,22 μιη. O rendimento total foi de 0,5 mg (Figura 13D) .
E. (DIM)nHIgG IGg humana (HIgG) foi primeiramente purificada como se segue: 1,3 mL de HIgG (que incluiu 100 mg/~mL de HIgG, 22,5 mg/mL de glicina e 3 mg/mL de albumina em tampão barato com 1 mM de EDTA, pH 9) foi aplicado a uma coluna de FPLC (S200, 250 mL). As frações foram coletadas e analisadas por SDS PAGE em gel de phast. Frações contendo IgG monomérica IgG (21-32) foram reunidas e esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,22 μιη. O rendimento total determinado por absorção a 280 nm foi de 111 mg. HIgG purificada (55 mg em 13 mL de tampão barato, pH 9) foi adicionado a 1,003 mg em 0,5 mL de SMCC (Pierce) em DMF. A mistura foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora. Ao mesmo tempo, outra mistura reacional contendo 6 mg de duramicina (3 μιηοίε; dissolvidos em 0,5 mL de NaHCCG 0,1 440 M) e 0,413 mg 2-IT (3 μιηοΐ; em 0,1 Μ CaCCé foi incubado a temperatura ambiente por 1 hora. Após o fim das reações, as duas misturas reacionais foram combinadas e incubadas a temperatura ambiente por 2 horas e a 4 °C no pernoite. Os produtos da reação foram analisados por SDS PAGE em gel phast. Os produtos da reação foram colocados em uma coluna de FPLC em tampão barato, pH 9. Frações de FPLC correspondentes ao trimero (5-14), dimero (15-24) e monômero (25-37) foram agrupadas e esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,22 μιη. O rendimento total do monômero foi de 54,6 mg. Cinco em sete grupos de duramicina foram ligados a cada molécula de HIgG (Figura 13E) .
F. (DIM)nHIgG-F 1 mg (0,7 mL) de (DIM)nHIgG foi adicionado a 5 μί de NHS-fluoresceina em DMF. A mistura reacional fé incubada a temperatura ambiente por 1 hora e dessalinizada em uma coluna PD-10. Frações contendo proteína (2-3) foram agrupadas e esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,22 μιη. O rendimento total fio de 0,9 mg (Figura 13F) .
G. (DIM)nHIgG-B e [ (DIM) nHIgG] 2-B
Para sintetizar derivados biotinilados de [ (DIM) nHIgG] 2, 0,66 mg (1 mL) de [ (DIM) nHIgG] 2 foi adicionado a 8 μΐ^ de 1 mg/mL de NHS-LC-Biotina (Pierce) em DMF. A mistura foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora. A mistura reacional dói então dessalinizada em uma coluna de PD-10. Frações contendo proteínas (3 e 4) foram agrupadas e esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,22 μιη. O rendimento final foi de 0,46 mg. 441 A biotinilação do monômero (DIM)nHIgG foi feita da mesma forma. Resumidamente, 1,06 mg (0,75 mL) de (DIM)nHIgG foram adicionados a 12 μΒ de 1 mg/mL de NHS-LC-Biotina em DMF. Após incubação a temperatura ambiente por 1 hora, o produto reacional foi dessalinizada em uma coluna de PD-10. Frações contendo proteínas (3 e 4) foram agrupadas e esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,22 μιη. O rendimento final foi de 0,62 mg (Figura 13G) .
H. (DIB)4NA 2 mg (0,99 μιηοΐ) de duramicina foram dissolvidos em 0,5 mL de NaHCCb 0,1 M e adicionado a 0,136 mg (0,99 μιηοΐ) de 2-IT. A mistura reacional foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora. Após isso, 0,483 mg (0,95 μιηοΐ) de iodoacetil-LC-Biotina (Pierce) foi adicionado e a mistura reacional incubada a temperatura ambiente por 1 hora. 10 mg (0,17 μιηοΐ) de neutravidina em 1 mL de H2O foi adicionado e incubado a 4 °C no pernoite. A mistura reacional foi fracionada por FPLC. Três diferentes picos foram coletados e agrupados: [(DIB)4NA]3 (frações 17-23); [(DIB)4NA]2 (frações 24-33); e (DIB)4NA (frações 35-48). Todas as amostras foram esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,22 μιη. Os rendimentos totais obtidos foram de 0,87 mg de [(DIB)4NA]3; 1,25 mg de [(DIB)4NA]2; e 1,83 mg de (DIB)4NA (Figura 13H).
I. (DIB)4NA-B 0,023 mg (0,3 μιηοΐ) de (DIB)4NA foi adicionada a 0,9 μg de NHS-LC-Biotina (Pierce). A reação foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora e então dessalinizada em 442 uma coluna de PD-10. 0 rendimento total foi de 0,04 mg (Figura 131). J. DS-1 5 mg (2,5 μιηοΐ) de duramicina dissolvida em 0,5 mL de NaHCCb 0,1 M em água foi adicionado a 0,319 mg (2,6 μιτιοίε) de propano sultono) .A mistura foi incubada a 4 °C em pernoite. A amostra foi colocada em uma coluna de sílica, lavada com TFA 0,1%, eluida com 0,1% de TFA e 70% de CH3CN. 0 eluato foi coletado e concentrado por centrifugação sob pressão reduzida. O rendimento total foi de 5 mg (Figura 13J) . K. DS-2 1 mg (0, 49 7 μιηοΐ) de duramicina dissolvida em 0,3 mL de NaHCCg 0,1 M em água foi adicionado a 0,072 mg (0,523 μιηοΐ) de 2-IT. A mistura reacional foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora. 0,125 mg (0,49 μιηοΐ) de cloreto de SBF (Pierce) foi adicionado. A mistura reacional foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora e a 4 °C no pernoite. 0 peptidio foi purificado em uma coluna de sílica. 0 eluato foi coletado e concentrado por centrifugação sob pressão reduzida. 0 rendimento total foi de 1 mg (Figura 13K). L. DS-3 1 mg (0, 497 μιηοΐ) de duramicina dissolvida em 0,4 mL de NaHC03 0, 1 M em água foi adicionado a 0,109 mg (0,592 μιηοΐ) de anidrido cíclico de ácido 2-sulf obenzóico. A reação foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora e a 4 °C em pernoite. O peptidio foi purificado em uma coluna de sílica. O eluato foi coletado e concentrado por 443 centrifugação sob pressão reduzida. 0 rendimento total foi de 1 mg (Figura 13L). 0,25 mg (0,124 μιηοΐ) de duramicina dissolvida em 0,5 mL de NaHCCb 0,1 M em água foi adicionado a 0,017 mg (0,124 μπιοί) de 2-IT. A mistura reacional foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora. A mistura foi então adicionada a 0, 049 mg (0,124 μπιοί) de reagente de Ellman. A mistura foi incubada a temperatura ambiente por 2 horas e pernoitou a 4 °C. 250 μ]1, de 1 mg/mL de hidrato de sal
monossódico do ácido 4-amino-5-hidróxi-2,7-naftaleno disulfônico foi adicionado a 100 μ]1, de 1 mg/mL 2-IT. A reação foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora. 50 desta mistura reacional foram adicionados à reação anterior e incubados a temperatura ambiente por 1 hora. O peptidio foi purificado em coluna de sílica. O eluato foi coletado e concentrado por centrifugação sob pressão reduzida (Figura 13M). N. DS-5 5 mg (2,5 μπιοί) de duramicina dissolvido em 0,5 mL de NaHCCg 0,1 M em água foi adicionado a 0,356 mg (2,6 μπιοί) de 1,3-butano sultona. A mistura foi incubada a 4 °C em pernoite. A amostra foi colocada em uma coluna de sílica, lavada com TFA 0,1%, eluída com TFA 0,1% e 70% de CH3CN. O eluato foi coletado e concentrado por centrifugação sob pressão reduzida. 0 rendimento total foi de 5 mg (Figura 13N) . O. DC-1 444 0,25 mg (0,124 μπιοί) de duramicina dissolvida em 0,5 mL de NaHCCb 0,1 M em água foi adicionada a 0,017 mg (0,124 μπιοί) de 2-IT. A mistura reacional foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora. A mistura foi então adicionada a 0,049 mg (0,124 μπιοί) de reagente de Ellman. A mistura foi incubada a temperatura ambiente por 2 horas e pernoitou a 4 °C. 0 peptídio foi purificado em uma coluna de sílica. 0 eluato foi coletado e concentrado or centrifugação sob pressão reduzida (Figura 130). EXEMPLO XVI (exemplo de referência)
Derivados de duramicina que se ligam especificamente a PE 0 presente exemplo mostra que derivados de duramicina sintetizados no Exemplo XV são específicos para PE e podem então ser usados como planejado, pela ligação a um impermeante celular, agentes alvejantes ou antivirais e uso no tratamento de tumores e doenças virais.
Para testar a especificidade de derivados de duramicina, particularmente a ligação ao PE em preferência a outros fosfolipídios, uma série de ELISAs de competição foram feitas. A capacidade dos derivados de duramicina de competir ou com DIB ou com DLB pela ligação ao PE foi testada no seguinte método.
PE e PC foram dissolvidos separadamente em etanol. A concentração final foi de 5 μρ/ηΜΙ,. 100 μΡ foram adicionados
a cada poço de placas de ELISA com 96 poços (DYNEX IMMULON® 1B) . Essas placas foram evaporadas a 4°C em um ambiente frio. 250 μΡ de caseína 2,5% foram adicionados a cada poço, cobertos e bloqueados a 37 °C por 1 hora. 0 tampão bloqueador foi descartado e 100 μΡ de caseína 2,5% 445 adicionados a cada poço. 0 composto de duramicina foi adicionado como uma diluição serial pela placa, tal como (DIM)nHIgG, (DIB)4NA, (DLB)4NA, DS, duramicina e DIB. A concentração inicial de (DIM)nHIgG foi de 1,4 mg/mL, a concentração inicial de (DIB) 4NA foi de 800 |lg/mL, e a concentração inicial de (DLB)4NA foi de 800 μg/mL. Estes foram incubados a 37 °C por 1 hora e lavados 5 vezes com PBS. 100 μΕ de HRP-estreptavidina (diluição 1:5000) foi adicionada a cada poço, incubado a 37 °C por 1 hora e lavado 5 vezes com PBS. 100 μL de OPD 0,05% foi adicionado a cada poço e progredido por 5 minutos. 100 μΕ de H2SO4 0,18 M foram adicionados para interromper a reação e ler a O.D. 490.
Os dados resultantes foram tabulados e então plotados graficamente. Como exemplificado pelos dados nas Figuras 14C e 14D, concentrações crescentes de derivados de duramicina decrescem a absorvância a 490 nm, mostrando que os derivados de duramicina competem com DIB e DLB pela ligação a fosfatidiletanolamina.
Os perfis de ligação dos fosfolipidios de construções de duramicina foram confirmados usando ELISAs adicionais. O respectivo testa lipídios PS, PE, PI, CL, PC, PG, SM e colesterol foram dissolvidos separadamente em etanol e usados para cobrir placas de ELISA. Compostos de duramicina foram adicionados como diluições seriais pelas placas. Após os passos de incubação e de lavagem, um reagente de detecção secundário foi adicionado para cada poço e a reatividade determinada usando o ensaio colorimétrico conforme descrito acima. 446
Perfis de ligação de fosfolipidios representativos para derivados de duramicina biotina, DIB e DLB são descritos na Figura 14A. É mostrado que DIB e DLB são específicos para PE, com ligação a cada um dos PS, PI, CL, PC, PG e SM sendo desprezível ou não-detectável. (DIM)nHIgG-B e [(DIM)nHIgG]2-B tinham essencialmente o mesmo perfil de ligação que o DLB. Embora mínima ligação ao PS foi observada em altas concentrações de DIB (Figura 14A) , isso não tem sentido no contexto do estudo, como a ligação ao PS foi não-detectável em concentrações de DIB que eram saturastes e metade do máximo para a ligação de PE. Então, as construções de duramicina se ligam especificamente a fosfatidiletanolamina.
Foi também mostrado que o soro não tem efeito significante na ligação à PE pelos derivados de duramicina. Isto é exemplificado pela ligação do derivado de duramicina biotina, DLB às placas de ELISA cobertas com PE na presença e ausência de soro (BSA) , onde os perfis de ligação não mostram diferenças significativas (Figura 14B).
EXEMPLO XVII
Efeitos antivirais dos derivados peptídicos que se ligam a PE
Além dos efeitos antivirais mediados por anticorpos anti-PS, como apresentado no Exemplo XII e no Exemplo XIII, o presente exemplo demonstra os efeitos antivirais dos derivados peptídicos que se ligam especificamente ao outro aminofosfolipídio comum, PE. A. Métodos 1. Tratamento de células infectadas com CMV in vitro 447
Monocamadas confluentes de fibroblastos do prepúcio diplóides humanos (HHF-R2) em placas de seis poços foram infectados com CMV AD169 humana expressando proteína fluorescente verde (GFP) em uma MOI = 0,01, conforme descrito no Exemplo XII (Bresnahan et al., 1996). As células foram incubadas com vírus num volume total de 1,5 mL por poço a 37 °C por 90 minutos. Durante a infecção, as placas foram agitadas gentilmente a cada 30 minutos. Após a infecção, o sobrenadante celular foi removido e DMEM/FBS 10%/Pen-strep (2 mL por poço) foi adicionado a cada poço.
Diferentes diluições de derivados de duramicina (DLB)4NA, (DIM)nHIgG, DS-1, DS-2, DS-3 e DC-1 foram adicionados aos poços antes da adição do vírus, e após a infecção. As células infectadas foram incubadas a 37 °C por um total de 14 dias. O meio e derivado de duramicina em cada poço foram recolocados a cada 3 dias. 2. Microscopia fluorescente
Como no Exemplo XII, o CMV recombinante expressa GFP sob o controle do promotor SV40. Então, células infectadas aparecem verdes sob microscópio de fluorescência. Nesses estudos, as células infectadas com CMV tratadas com derivados de duramicina foram observadas sob o microscópio fluorescente nos dias 4 e 6. B. Resultados
No dia 4, existiam células únicas infectadas verdes positivas para GFP em poços não-tratados e poços tratados com (DLB) 4NA e (DIM)nHIgG (Figura 15, painéis da esquerda). Então, tratamento de células HHF-R2 com esses derivados de duramicina não parecem inibir a entrada de vírus nas 448 células. Existe alguma evidência preliminar de que os derivados da duramicina DS-1, DS-2 e DS-3 inibem a entrada virai nas células.
No dia 6 após o tratamento com (DLB)4NA e (DIM)nHIgG, existia uma diferença marcante no número de células infectadas GFP-positivas em poços não-tratados versus poços tratados com derivados de duramicina (Figura 15, painéis do meio) . Pelo dia 6, o vírus tinha se espalhado da única célula infectada vista no dia 4 em células ao redor nos poços não-tratados. (Figura 15, topo, comparar o painel da esquerda como painel do meio) . Entretanto, no dia 6 nos poços tratados com (DLB) 4NA e (DIM)nHIgG, o vírus é limitado à célula unicamente infectada original (Figura 15, meio e embaixo, comparar os painéis da esquerda com os painéis do meio).
Em concordância, (DLB) 4NA e (DIM)nHIgG limitaram o espalhamento de CMV da célula infectada originalmente às células ao redor. Essa inibição de espalhamento virai é observada quando células foram tratadas com diferentes concentrações de (DLB)4NA (100 μρ/ιπύ r 50 μρ/ιηύ) e (DIM)nHIgG (200 μρ/ιτΛ e 100 μg/mL) .
EXEMPLO XVIII
Vantagens do anticorpo 3G4 O anticorpo 3G4 desenvolvido pelo protocolo único do inventor, conforme descrito no Exemplo IV, tem muitas vantagens sobre os anticorpos anti-PS na literatura, incluindo o prominente anticorpo anti-PS, 3SB (Rote et al.r 1993). O presente exemplo descreve algumas dessas vantagens. 449 A. Classe e especificidade 3G4 é um anticorpo IgG, enquanto 3SB é um anticorpo IgM. Anticorpos da classe IgG tem numerosas vantagens sobre os da IgM, incluindo maior afinidade, grau de depuração menor in vivo e simplicidade de purificação, modificação e manuseio. Uma comparação do anticorpo IgM que se liga a PS, 3SB, com 3G4 e outro anticorpo IgG é mostrada mas Figuras 19A e 19B. 3G4 reage fortemente com os fosfolipidios aniônicos PS, PA, PI, PG e CL com aproximadamente a mesma intensidade, e se liga ao aminofosfolipidio, PE menos fortemente. Ele não tem reatividade com PC e SM e tem o seguinte perfil de especificidade de ligação: PS=PA=PI=PG>CL>>PE (Exemplo IV, Tabela 4) . 3G4 não se liga de forma detectável à heparina, heparan sulfato ou a DNA de fita dupla ou de fita única, nem a proteínas celulares extraídas de células bEnd.3 em Western blots. A ligação do 3G4 não é afetada pela presença de 5 mM de EDTA, mostrando que Ca2+ não é requerido para ligação de 3G4 a fosfolipidios aniônicos. 3G4 não se liga a placas de ELISA que tenham sido cobertas com fosfolipidios, entretanto, lavadas com 0,2% de Tween 20 em salina, confirmando que a ligação era com o fosfolipídio absorvido. O anticorpo 3G4 reage tanto com fosfolipidios humanos quanto de camundongos, o que é importante para o desenvolvimento pré-clínico e clínico. 3G4 é mais específico para fosfolipidios aniônicos do que o ligante natural, anexina V. Ao contrário do 3G4, anexina V também se liga fortemente a fosfolipidios neutros em concentrações fisiológicas de Ca2+. A especificidade de 3G4 para fosfolipidios aniônicos foi confirmada por ensaios nos 450 quais os lipossomas formados de diferentes fosfolipidios foram usados para competir pela ligação com 3G4 com PS imobilizados. Lipossomas foram preparados a partir de soluções de 5 mg de um único fosfolipídio em clorofórmio. As soluções foram secas sob nitrogénio para formar uma fina camada em um frasco de vidro de fundo redondo. Dez mL de tampão Tris (0,1 M, pH 7,4) foram então adicionados e o frasco foi submetido ao ultra-som cinco vexes por 2 minutos. O anticorpo 3G4 (0,1 μρ/ιηύ) foi adicionado ou ao tampão a lipossomas fosfolipidicos diferentes e pré-incubados por 30 minutos a temperatura ambiente. A mistura foi adicionada a placas cobertas por PS (após bloqueio padrão), incubadas por 1 hora, lavadas e o segundo anticorpo adicionado. Após 1 hora, as placas foram lavadas e desenvolvidas por 5 minutos usando OPD.
Como mostrado no Exemplo IV, 3G4 se liga a PS, PA, PI, PG e CL quando imobilizado e se liga a PE imobilizado em um grau menor, mas não se liga a PC imobilizado. A capacidade d 3G4 de se ligar a PS imobilizado na presença ou ausência de diferentes lipossomas é apresentada na Figura 20. Resultados desses estudos de competição lipossomal mostram que a ligação do 3G4 ao PS adsorvido às placas de ELISA foram bloqueadas por lipossomas preparados a partir de PS, PA, PI, PG e CL, mas que lipossomas preparados a partir de PE e PC não resultam em uma redução detectável na ligação de 3G4 (figura 20). Também, lipossomas SM não eram inibitórios. B. Inibição da proliferação celular 3G4 se liga a células ativadas, em divisão, danificadas, apoptóticas e malignas que externalizam PS e outros fosfolipidios aniônicos. O anticorpo 3G4 inibe a 451 proliferação de células endoteliais in vitro, como mostra uma inibição seletiva marcada de células endoteliais em divisão em oposição a células quiescentes. 0 efeito dos anticorpos anti-PS 3G4, 9D2, 3B10, 1B9, 2G7, 7C5 e 3SB no crescimento de células bEnd.3 in vitro foi determinado. Células bEnd.3 (10.000/poço) foram semeadas em placas de 48 poços e deixou-se aderirem. 20% de DMEM somente (controle) ou 20% de DMEM contendo os anticorpos (de 20 μρ a 40 μρ de IgG total por poço) foi adicionado 4 horas após semeadura. Cada clone foi testado em duas placas separadas em triplicatas. Células foram soltas 48 e 96 horas depois, a contagem celular foi determinada em cada poço e o número médio de células por tratamento foi calculado.
Os anticorpos 3G4 e 9D2 foram particularmente eficientes, seguidos por 3SB e 3D10, com 1B9, 2G7 e 7C5 tendo efeitos inibitórios menores. Cada um dos anticorpos mostraram uma inibição seletiva de células endoteliais em divisão (subconfluentes) em oposição a células quiescentes (confluentes). Em estudos comparativos, 3G4 mostrou o maior efeito inibitório, seguido por 9D2, cada um dos quais eram mais inibitórios do que 3SB (Figura 16). C. Efeitos antitumorais 3G4 se liga à superfície de células endoteliais vasculares in vivo. Quando injetadas intravenosamente nos camundongos com vários tumores, 3G4 se localiza especificamente e consistentemente no tumor, mas não em órgãos normais. Manchamento foi observado no endotélio vascular tumoral (Figura 22), áreas necróticas e células malignas individuais. Existem múltiplos sítios de ligação 452 para 3G4 em tumores, os quais permitem alvejamento simultâneo tanto de tumor endotelial quanto de células endoteliais. 3G4 suprime a angiogênese e crescimento tumoral in vivo e não apresenta toxicidade a órgão detectável em camundongos com tumor. Em estudos iniciais, 3G4 mostrou efeitos antitumorais impressivos em modelos tumorais singênicos e xenogênicos, onde o anticorpo causa danos à vasculatura tumoral, decréscimo na vascularização e na necrose tumoral (Exemplo XI). Regressões de tumores estabelecidos têm sido observadas em 30% a 50% dos animais tratados.
Efeitos representativos antiangiogêicos e de alvejamento vascular do anticorpo 3G4 são apresentados na Figura 17A e Figura 17B, respectivamente. Análise de seções tumorais de camundongos nus com tumores ortotópicos MDA-MB-231 tratados com 3G4 revelaram efeitos antiangiogênicos em todos os tumores tratados. Figura 17A mostra imagens representativas de tumores de camundongos tratados com 3G4 em oposição a anticorpos controle. O tumor controle não apresenta sinais de necrose e é altamente vascularizado, como demonstrado pelo marcador celular pan-endotelial, CD31, detectado em vasos sanguíneos tumorais (Figura 17A, painel esquerdo). Em contraste, tumores de camundongos tratados com 3G4tem 80% a 90% de necrose e é quase completamente desprovido de estruturas positivas para CD-31, indicando que o tratamento produziu um efeito antiangiogênico substancial (Figura 17A, painel da direita).
Outro componente de atividade anticancerígena de 3G4 é a indução de danos à vasculatura tumoral. Isso [e ilustrado 453 na Figura 17B, a qual fornece imagens representativas de tumores marcados com H&E derivados do mesmo estudo controlado. Os vasos sanguíneos nos tumores de controle são bem perfundidos, morfologicamente intactos e rodeados por células de tumor divisoras viáveis (Figura 17B, painel da esquerda). Em contraste, os vasos sanguíneos em animais tratados com 3G4 são frequentemente observados como tendo uma camada endotelial desintegrante e são bloqueados pelas células endoteliais destacadas e, provavelmente, por células do hospedeiro que são atraídas para vasos nus (Figura 17B, painel da direita). 0 vaso representativo no tumor tratado com 3G4 mostra claramente a perda de função, conforme indicado pela camada pré-necrótica de células tumorais ao redor (Figura 17B, painel da direita).
Em resumo, o exame histológico seguindo ao tratamento de tumores MDA-MB-231 ortotópicos usando 3G4 mostra: 1) desintegração do endotélio vascular em cerca de 50% de vasos no tumor; 2) ligação de leucócitos ao endotélio tumoral e infiltração de células mononucleares dentro do interstício tumoral; 3) oclusão de vasos tumorais por agregados plaquetários e células vermelhas; 4) uma redução de 70% na densidade microvascular em tumores tratados com 3G4 versus camundongos sem tratamento; e 5) necrose central dos tumores, com sobrevivência de uma borda periférica de células tumorais, típico de uma VTA. Então, uma ação antitumoral primária do anticorpo 3G4 é exercida através de efeitos na vasculatura tumoral. Outros mecanismos, particularmente dependentes da citotoxidade celular direcionada contra as próprias células tumorais, provavelmente contribuem para o efeito antitumoral, Isso é importante, e pode permitir a morte de mais células tumorais, incluindo aquelas na borda periférica. 454
Em estudos de acompanhamento de perto, o efeito do 3G4 no crescimento tumoral tem sido examinado em outros modelos de murina, incluindo singênicos (fibrosarcoma Meth A de camundongo), xenoenxertos subcutâneos (linfoma de Hodgkin humano L540) e tumores ortotópicos (câncer de mama humano MDA-MB-231 e câncer de mama humano MDA-MB-435) . Tratamento de camundongos com anticorpo 3G4 resultaram em 90%, 65% e 50% e 70% de retardo no crescimento desses tumores, respectivamente. Tanto tumores pequenos (0,1 cm de diâmetro) quanto bem estabilizados (0,3 cm de diâmetro, 200 mm3) foram inibidos da mesma forma. Tratamento anti-PS induziu remissões completas a longo prazo em 50% de camundongos com Meth A e 30% de camundongos com tumores MDA-MB-231. 3G4 tem o maior efeito inibitório em camundongos imunocompetentes. Os modelos ortotópicos de tumores de mama humanos (MDA-MB-231 e MDA-MB-435), nos quais tumores de mama humanos crescem na gordura de patas de mamíferos ou camundongos, são importantes como esses são modelos práticos e realísticos de câncer de mama humano crescendo pela mama de humanos. D. Perfil de segurança O anticorpo 3G4 é diferente para anticorpos antifosfolipídios descritos na literatura. Tipicamente, anticorpos antifosfolipídios são considerados como anticorpos patogênicos que interferem com a cascata de coagulação. Eles inibem reações de coagulação in vitro e causam trombose in vivo. Em contraste, 3G4, 9D2 e anticorpos semelhantes são anticorpos terapêuticos sem efeitos patogênicos. 1. Coagulação 455
Em estudos de coagulação in vitro, uma fraca inibição de coagulação induzida por Fator Tecidual (TF) foi observada usando altas doses de anticorpo 3G4. Em outros estudos usando doses mais baixas, plasma recalcifiçado de camundongos tratados com 3G4 coagularam no mesmo nível que plasma recalcifiçado de camundongos tratados com BBG3 na presença de fator tecidual. Também, a adição de 100 \iq/mL de 3G4 para células mais o fator tecidual in vitro não afetam o grau de geração do fator de coagulação Xá em proplex (via de coagulação extrínseca).
Sem considerar a fraca inibição de coagulação induzida por TF usando altos níveis de anticorpos in vitro, o anticorpo 3G4 tem sido testado in vivo e não causa complicações trombóticas em camundongos normais ou com tumores (por exemplo, ver Exemplo XI). 0 anticorpo 3G4 tem sido também testado em macacos in vivo e nenhum efeito colateral significante tem sido observado. 2. Outros indicadores de baixa toxicidade ou de sua ausência A primeira evidência de que 3G4 não tem nenhuma toxicidade ou toxicidade baixa em camundongos veio do fato de que a descoberta de que crescimentos de 3G4 como um hibridoma em camundongos sem evidência de toxicidade. Também, quando 1 mg de 3G4 purificado foi injetado intraperitonealmente, nenhuma toxicidade foi obserfada.
Estudos sistemáticos in vivo têm agora sido conduzidos nos quais grupos de três camundongos BALB com oito semanas de idade foram injetados intraperitonealmente com 100 μρ de 3G4 purificada ou com um IgG3 controle equiparada ao isotipo (BBG3) três vezes por semana durante 2 ou 3 456 semanas. Nenhum sinal físico de toxicidade tem sido observado, e nenhum sinal histopatológico de toxicidade do órgão ou anormalidades morfológicas tem sido detectadas em seções de órgãos maiores removidas de camundongos tratados com 3G4. Os seguintes parâmetros foram especificamente examinados.
Em termos de massa corporal, camundongos tratados com 3G4 ganharam peso no mesmo grau que camundongos tratados com BBG3. Nenhuma perda de peso foi observada nos primeiros estudos. Não houveram sinais físicos de toxicidade, por exemplo, perda de pêlos, perda de apetite, etc. Não houveram mudanças na contagem de células sanguíneas, incluindo células vermelhas, plaquetas, células brancas, contagem de linfócitos absolutos ou contagem de neutrófilos absolutos. Para analisar a celularidade da medula óssea, seções de parafina de medula óssea derivadas de camundongos tratados com 3G4 ou BBG3 (seis injeções, 100 μg) foram examinados para celularidade total e composição celular. Medulas nos animais tratados foram essencialmente completamente celulares (como poderia ser esperado de um mamífero novo). Progenitores de eritróide, granulocítico e linfocítico e megacariócitos estavam presentes em números normais.
Em resumo, nenhum exemplo de toxicidade tem sido observado em mais do que 200 camundongos tratados com altas doses de 3G4 (0,1 mg) três vezes por semana durante 2-3 semanas. Mesmo quando as doses tão altas quanto 2 mg são dadas, nenhum sinal de toxicidade foi observado. Camundongos retém sinais físicos normais, celularidade da medula óssea, contagem de células brancas sanguíneas, funções histológicas e de coagulação. 457 0 anticorpo 3G4 tem também sido administrado a macacos em estudos de segurança e nenhum efeito colateral tem sido observado.
Estudos cinéticos de depuração sanguínea tem também sido conduzidos em camundongos. 3G4 foi radioiodado usando o reagente Bolton Hunter e foi injetado intravenosamente em camundongos (25 g) . Amostras de sangue foram removidas via a veia do rabo em vários pontos de tempo posteriores. 0 grau de depuração sanguínea de 3G4 foi típico de uma IgG de camundongo no camundongo. A meia-vida da fase a de depuração dói de 3 horas enquanto aquela na fase β foi de cinco dias. Volume de distribuição foi normal (100 mL/Kg). Esses estudos indicam que 3G4 não interage com tecidos hospedeiros normais, levando a sua depuração acelerada. E. Efeitos antivirais 0 anticorpo 3G4 também exerce efeitos significantes antivirais. Como mostrado e visto no Exemplo XIII, o tratamento de células infectadas com RSV com 3G4 foi superior ao efeito observado usando 3G4. Esses resultados
Realçam outra vantagem do anticorpo 3G4 sobre o proeminente anticorpo anti-PS na literatura, 3SB (Rote et al. (1993). O anticorpo 3G4 também é apresentado como sendo eficaz na inibição de CMV, tanto in vitro (Exemplo XII) e em aumentando a sobrevivência de camundongos infectados com CMVm in vivo (Exemplo XXI). Além disso, o anticorpo 3G4 é adicionalmente apresentado como inibindo o a infecção do vírus Pichinde, o agente infeccioso da febre de Lassa (Exemplo XXIV). A exposição de PS na superfície celular aqui mostra seguir a infecção virai, e a capacidade do 458 anticorpo 3G4 de se ligar a células infectadas com vírus Vaccinia (Exemplo XXIII), mostra que o anticorpo 3G4 tem potencial enorme com um amplo espectro de agente antiviral.
EXEMPLO XIX
Anticorpo 3G4, Sequências CDR e Quimera 0 anticorpo 3G4 então possui as propriedades combinadas de um agente antiangiogênico, antitumoral vascular e antiviral. As atividades inibitórias de 3G4 na divisão celular, angiogênese, crescimento tumoral e infectividade virai, tomadas juntas com falta de aparente toxicidade, mostrou indicações terapêuticas amplas para esse anticorpo, incluindo no tratamento de desordens antiangiogênicas, câncer, diabete e infecções virais.
Anticorpos reconhecendo substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo 3G4 podem ser gerados para uso em uma ou mais das terapias antiangiogênicas, antitumorais vasculares e antivirais, por exemplo, por imunização e confirmada por estudos de competição de anticorpos. Anticorpos que se ligam a essencialmente o mesmo epítopo que o anticorpo 3G4 podem também ser gerados de um conhecimento das sequências do anticorpo 3G4 fornecidas aqui. 0 presente exemplo fornece as sequências de regiões dependentes de complementaridade (CDRs) do anticorpo 3G4 e o uso da informação da sequência. A. Sequências do anticorpo 3G4
As sequências originais das regiões variáveis do anticorpo foram obtidas por RACE do hibridoma que produz o anticorpo 3G4 e as sequências verificadas. As sequências de ácido nucléico e de aminoácidos da região variável da 459 cadeia pesada (Vh) do anticorpo 3G4 englobando CDR1-3 são representadas pela SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO: 2 incluem parte da sequência lider do camundongo e sequências da cadeia constante, como mostrado na Figura 18A. A sequência lider é representada por aminoácidos de 1 ao 19 da SEQ ID NO: 2, e a proteína madura começa conforme mostrado pela seta na figura 18A. Informação da sequência da região determinante de complementaridade suficiente é incluída pela sequência da proteína madura até a porção da sequência terminando em VSS, após a qual os aminoácidos não são essenciais para ligação do antígeno. Como tal, o sítio BstEII na sequência do ácido nucléico pode ser usado como um sítio conveniente para preparar uma região variável de camundongo funcional, por exemplo, para uso em enxertar em uma região constante humana (Figura 18A).
Na prática, a sequência 3G4-2BVH tem sido enxertada em uma região constante γΐ humana no sítio BstEII usando um vetor Lonza pEE. 0 produto resultante contém a sequência líder do camundongo e seu VH é juntado com a sequência humana CHI da forma apresentada na Figura 18A, onde ASTLGPSVFPLAPSSKSTSG (SEQ ID NO:7) representa a primeira parte da sequência CHI humana.
As sequências de ácido nucléico e aminoácido da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo 3G4 englobando CDR1-3 são representados pela SEQ ID N0:3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente. SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 novamente incluem parte da sequência líder do camundongo e sequências da cadeia constante, como apresentado na Figura 18B. A sequência líder é do aminoácido 1 até o 22 da SEQ ID NO:4, 460 e a proteína madura começa conforme mostrado pela seta na Figura 18B. Informação da sequência da região determinante de complementaridade suficiente é incluída pela sequência da proteína madura até a porção da sequência terminando em TVF, após a qual os aminoácidos não são essenciais para a ligação antigênica. Como tal, o sítio Bbsl na sequência do ácido nucléico pode ser usado como um sítio conveniente para preparar uma região variável de camundongo funcional, por exemplo, para uso no enxerto em uma região constante humana (Figura 18B).
Na prática, a sequência 3G4-2BVL tem sido enxertada em uma região constante K humana no sítio Bbsl usando um vetor Lonza pEE. 0 produto resultante contém a sequência líder do camundongo e seu VL é junto com a sequência humana CL1 da forma apresentada na Figura 18B, onde IFPPSDEQLKSGGTAS (SEQ ID NO:8) representa a primeira parte da sequência da região constante humana K. B. Geração e caracterização do anticorpo quimérico 3G4 A construção quimérica contendo as regiões determinantes de complementaridade de murina e as regiões constantes humanas tem sido produzidas (ch3G4) e mostradas como tendo comportamento essencialmente igual ao anticorpo de murina original. 0 anticorpo de murina 3G4 foi convertido em um anticorpo quimérico humano-camundongo (Avanir (Xenerex) Biosciences, San Diego, CA) . A Vh de murina foi clonada e enxertada na região constante γΐ humana no sítio BstEII de vetor Lonza 2BVH. A Vk de murina foi clonada e enxertada na região constante K humana no sítio Bbsl de vetor Lonza 461 2BVL. As sequências foram verificadas. A construção inteira foi expressa em células CHO e purificadas. 0 ch3G4 resultante pelo menos fez tal como a 3G4 de murina às placas de ELISA cobertas com fosfolipidios. 0 perfil de ligação in vitro de 3G4 quimérico ao painel de fosfolipidios é apresentado na Figura 21, onde a ligação ao PS, PA, CL, PI e PG é mostrada como sendo similar. A ligação foi antigeno especifica uma vez que nenhuma ligação foi observada com anticorpos de controle de especificidade irrelevante. Em certos estudos, uma ligação aparentemente maior da 3G4 quimérica versus o anticorpo 3G4 foi observada; isso pode ser por causa da ligação superior do anticorpo secundário.
In vivo, ch3G4 se localiza no endotélio vascular tumoral e exerce efeitos antitumorais. Os efeitos antitumorais do ch3G4 em células cancerígenas de mama humana MDA-MB-435 crescendo em camundongos são descritos no Exemplo XI e apresentado na Figura 8G. Tratamento de camundongos com tumores MDA-MB-435 usando o anticorpo quimérico efetivamente retardou o crescimento tumoral em oposição ao controle.
Localização de ch3G4 foi examinada em células cancerígenas de mama humanas MDA-MB-435 crescendo em camundongos. Camundongos foram injetados intravenosamente com ch3G4 biotinilado ou IgG controle de especificidade irrelevante. Uma hora mais tarde, os camundongos foram dessangrados, e seus tumores foram removidos e seções congeladas foram cortadas. Reagentes biotinilados foram primeiro incubados com conjugado estreptavidina-Cy3, lavados com PBS, então incubados com anticorpo MECA 32 seguido por anticorpo secundário marcado com FITC. Imagens 462 únicas, tomadas com filtros apropriadas para Cy3 (vermelho) e FITC (verde) fluorescente respectivamente, foram capturados por câmera digital e transferidos para computador. Imagens convergentes demonstraram coloração amarela (um produto da fluorescência verde e amarela misturada), sobrepostas com a ajuda do software Metaview.
Neste método de duplo manchamento, as proteínas biotiniladas e o endotélio vascular são manchados com vermelho e verde. Quando as proteínas biotiniladas são ligadas ao endotélio, a imagem convergente aparece em amarelo. Como mostrado na Figura 22, ch3G4 biotinilado se liga ao endotélio vascular tumoral, porque os padrões de manchamento convergem com aquele da MECA 32.
EXEMPLO XX
Anticorpo 3G4 em terapia combinada com Docetaxel 0 presente exemplo envolve terapias combinadas para Tratamento tumoral usando o anticorpo 3G4 e a droga quimioterapêutica, docetaxel. Esses agentes são projetados para atacar o endotélio celular da vasculatura tumoral e compartimentos celulares tumorais, levando ao tratamento sinergístico com baia toxicidade. Os resultados mostraram que essa terapia de combinação de fato aumentou significantemente a eficácia do tratamento. A. Efeitos antitumorais mediados pelo domínio Fc 0 anticorpo 3G4 foi testado para efeitos inibitórios em células tumorais in vitro. Nenhum efeito inibitório direto nas células tumorais foi observado. Entretanto, é provável que os efeitos antitumorais do anticorpo 3G4 incluem acréscimo mediado pelo domínio Fc de funções 463 efetoras imunes, tais como fagocitose mediada por anticorpo, ADCC, CDC e estimulo de produção de citocina, ou esses mecanismos combinados.
Os efeitos da 3G4 na fagocitose de células PS positivas por macrófagos tem sido avaliados. Células tumorais fluorescentes foram tratadas com H2O2 para induzir a exposição de PS. Células tratadas e não-tratadas foram então coletadas e postas em contato com anticorpo 3G4 ou anticorpo controle (BBG) Macrófagos da medula óssea de camundongos foram então adicionados, e a capacidade dos macrófagos de fagocitar as células tumorais fluorescentes foi analisada usando um microscópio de fluorescência.
Foi determinado que 3G4 poderia aumentar a fagocitose de células positivas para PS por macrófagos em mais de três vezes (Figura 23). Essa descoberta dá suporte ao entendimento do inventor de que o domínio Fc do anticorpo 3G4 contribui para os efeitos antitumorais do anticorpo. Ou seja, o domínio Fc ativa funções efetoras imunes do hospedeiro, as quais então exercem efeitos antitumorais. 0 anticorpo 3G4 deve então aumentar a atividade lítica de células NK, levando a ADCC mais efetiva. B. Docetaxel induz exposição de PS em células endoteliais
A indução da exposição de PS em células endoteliais por concentrações subclínicas de docetaxel foi examinada in vitro pela análise de FACS. Células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) e células endoteliais de microvasos humanos (HMVEC) foram tratadas com 10 nM de docetaxel por 24 horas e examinadas por FACS. Ambas (HUVEC e HMVEC) apresentaram aumento significativo na ligação de 3G4 quando comparadas com células não-tratadas (Figura 24A 464 e Figura 24B, respectivamente). Incubação de docetaxel por 48 e 72 horas foram também realizadas. C. Docetaxel induz exposição de PS em células tumorais A indução in vitro da exposição de PS por concentrações subclinicas de docetaxel foi também examinada pela análise de FACS usando um painel de linhas de células tumorais. Carcinoma de pulmão de lewis de camundongo 3LL, carcinoma de cólon de camundongo Colo26 e células de câncer de mama humano MDA-MB-435 foram tratadas com 10 nM de docetaxel por 24 horas e examinados por FACS. Todas as linhas de células tumorais testadas apresentaram aumento significativo na ligação a 3G4 quando comparadas com células não-tratadas (Figuras 25A, 25B e 25C, respectivamente). Incubações de docetaxel por 48 e 72 horas foram também conduzidas. Linhas de células tumorais de melanoma B16 de camundongo e fibrosarcoma Meth A de camundongo foram posteriormente analisadas e também mostram aumento significativo na ligação a 3G4 quando comparados com células não-tratadas.
Células de câncer de mama humano MDA-MB-231 foram tratadas com 10 nM de docetaxel por 24 horas e incubadas ou com o anticorpo quimérico 3G4 (ch3G4) ou com controle, IgG humana e analisado por FACS. Esses resultados mostram que o aumento significativo na ligação do anticorpo é antigeno especifico e que o anticorpo quimérico comporta-se como o anticorpo 3G4 de origem (Figura 26). D. Tratamento de tumor sinergistico com 3G4 e docetaxel
Os inventores então mostraram que o tratamento de células endoteliais e de células tumorais com docetaxel em 465 concentrações subclínicas aumentaram significativamente a ligação de 3G4. Eles também mostraram que o anticorpo 3G4 facilita a fagocitose mediada por macrófago de células tumorais nas quais PS é exposto na superfície. A] 0 aumento na ligação de 3G4 mediado por docetaxel deveria então aumentar a fagocitose de células tumorais e outros efeitos antitumorais mediados pelo domínio Fc do anticorpo 3G4, tal como aumento da atividade lítica de células NK, levando a ADCC mais eficaz. Estudos de outros tem também mostrado que tratamento de câncer de mama em pacientes com docetaxel leva a um aumento nos níveis de citocinas IFN-γ, IL-2, IL-6 e GM-CSF no soro e aumento de atividade celular da NK e da LAK (Tsavaris et al., 2002). O efeito antitumoral da terapia combinada de 3G4 com docetaxel foi então examinado em um modelo ortotópico em camundongos SCID com carcinoma de mama humano MDA-MB-435. Camundongos com tumor de mama humano ortotópico MDA-MB-435 foram tratados intraperitonealmente somente com 3G4 (100 μρ/όοΞθ), somente com docetaxel(10 mg/Kg) , ou com 3G4 em combinação com docetaxel (100 μg/dose e 10 mg/Kg, respectivamente), durante três semanas, com a administração em três vezes por semana. O tratamento começou 6 dias após a implantação da célula tumoral.
Esses estudos mostraram que a terapia combinada de 3G4 mais docetaxel resultou na inibição do crescimento de 90%. Inibição do crescimento de 3G4 mais docetaxel foi significantemente superior ao 3G4 sozinho (p < 0,005) e docetaxel sozinho (p < 0,01). E. Alvejamento de células tumorais apoptóticas com 3G4 à porção FcyR em células dendríticas
Tumores de camundongos tratados com 3G4 mais docetaxel também contiveram quantidades não comuns de linfócitos, quando comparados com tumores de controle. Embora esse fenômeno possa representar quimioatração típica de células imune pela desintegração de células tumorais, ele poderia também refletir a ativação do sistema imune por 3G4 mediado através da ligação de Fc ao FcyR em células imunes efetoras.
Para caracterizar os efeitos da administração de 3G4 e de docetaxel no infiltrado de célula imune intratumoral, os tipos de células presentes nesses infiltrados podem ser identificados por imunomanchamento de seções congeladas e/ou seções de parafina de tecidos tumorais usando anticorpos direcionados contra marcadores específicos de macrófagos, neutrófilos, granulócitos, células NK e linfócitos ativados (Pharmigen, San Diego, CA). A extensão, fenótipo e status de ativação desse infiltrado pode ser graduado. Produção de citocina pela infiltração de células imunes, incluindo IL-2 e INF, podem também ser analisados via técnicas imunoistoquímicas. Níveis de citocina sérica podem ser avaliados por ELISA e manchamento intracelular pode ser usado para identificar os compartimentos celulares específicos responsáveis pela produção de citocinas. Os efeitos das células imunes infiltrantes na proliferação de célula tumoral e apoptose pode ser então sistematicamente avaliado. À luz dos dados precedentes, os inventores além disso consideraram métodos aumentando a potência da imunoterapia de câncer de mama pelo alvejamento de células apoptóticas tumorais mediadas por 3G4 ap receptor gama Fc (Fc(y)R) em células dendríticas. Apresentação de antígeno eficiente, a qual inclui eficientes respostas imunes celulares e 467 humorais, é importante para o desenvolvimento de vacinas tumorais e imunoterapias. Células dendriticas (DC) são as células mais potentes apresentadoras de antigenos (APC) que aprontam os linfócitos T citotóxicos contra antigenos associados a tumor. Melhoria da apresentação de antígeno tumoral por células dendriticas (DCs) deve levar ao desenvolvimento de vacinas tumorais mais potentes.
Apresentação de antigeno pela internalização mediada pelo receptor Fc(γ) R de DCs pode ser aumentada em até 1000 vezes comparada com fase fluida de pinocitose de antigenos. Células tumorais apoptóticas (ATC) são uma excelente fonte de antigenos para células dendriticas carregadas porque múltiplos antigenos específicos tumorais (tanto conhecidos como desconhecidos) podem ser eficientemente apresentados a células T natas, fazendo a ocorrência de variantes de fuga imune menos propensos devido ao fechamento de certos epitopos. Em animais de estudo, DCs vibrados com ATCs tem sido mostrados como produtores de potente atividade antitumoral in vitro e in vivo. Entretanto, informações recentes demonstraram que os ATCs sozinhos eram de alguma forma insuficientes para ativar a imunidade antitumoral, possivelmente por causa de sua insuficiente compreensão e falta de capacidade de induzir a maturação de DC.
Estudos recentes demonstraram também que complexo imune-ATC foram mais eficientes internalizados pelo DC, mais eficientes na indução da ativação de DC e maturação, e mais importante, complexos imune-ATC podem aumentar significativamente tanto a apresentação de antígeno de restrição MHC I e II, induzindo dessa forma os T helpers antitumorais e a imunidade CTL. 468
Os inventores previram que usando os anticorpos anti-PS da prsente invenção para aumentar imunidade tanto hormonal quanto antitumoral celular, e auxiliar a eficácia ATC baseando-se de vacinas tumorais de DC. Como PS é um marcador universal e o especifico mais abundante de células tumorais apoptóticas, o painel de anticorpos da invenção, particularmente 3G4, pode se ligar no PS em ATCs. Os inventores já demonstraram que 3G4 pode aumentar a tomada de DC de células tumorais apoptóticas por 300% através de internalização mediada por Fc(y)R de complexos 3G4-ATC. Pelo aumento da tomada de ATC por DC mediado por Fc(γ) R, é então compreendido que 3G4 e anticorpos semelhantes podem aumentar em grande parte tanto a apresentação de antígeno t] restrita ao MHC I quanto ao MHC II, induzir ambas as potentes imunidades antitumoral celular quanto hormonal, e auxiliar a eficácia de vacinas tumorais DC baseadas em ATC. Isso pode ser demonstrado pelo estabelecimento da eficácia de DC carregado com imunocomplexos 3G4-ATC na indução de T hl, CTL e resposta de anticorpo in vivo, e pela determinação da potência de imunidade antitumoral induzida pela imunização de DC carregado com complexos imunes 3G4-ATC in vivo.
EXEMPLO XXI
Anticorpos anti-PS tratam infecções CMV in vivo
Seguindo os efeitos antivirais contra CMV in vitro apresentados no Exemplo XII, o presente exemplo demonstra a sobrevivência aumentada de camundongos infectados com a versão murinica do virus CMV, mCMV.
Camundongos BALB/c (6 semanas de idade, cinco camundongos por grupo) foram infectados 469 intraperitonealmente com 5 x 105 UFC de mCMV RVG102. Os camundongos foram tratados intraperitonealmente no dia 1 com o anticorpo 3G4 (1 mg/camundongo), ou ao anticorpo quimérico humano-camundongo, ch3G4 descrito acima (1 mg/camundongo). Camundongos não-tratados serviram como o controle. Os camundongos foram tratados a cada quatro dias depois com 0,5 mg/camundongo de anticorpo ou anticorpo quimérico até o dia 26. Os camundongos foram monitorados para sobrevivência 90 dias passados após a infecção.
Tratamento com ambas as formas original e quimérica do anticorpo 3G4 resultou no aumento da sobrevivência dos camundongos infectados com mCMV. Camundongos tratados com 3G4 ou ch3G4 tiveram 100% e 80% de sobrevivência, respectivamente, quando comparado com camundongos não-tratados, onde apenas 25% dos camundongos sobreviveram à infecção (Figura 27)
EXEMPLO XXII
Derivado peptídico que se liga a PE trata infecção CMV in vivo
Além dos efeitos antivirais in vitro contra CMV apresentados no Exemplo XVII, este exemplo demonstra que o derivado de duramicina-biotina, DLB aumentou a sobrevivência de camundongos infectados com mCMV.
Camundongos BALB/C (6 semanas de idade, cinco camundongos por grupo) foram infectados intraperitonealmente com 5 x 105 UFCs de mCMV RVG102. Os camundongos foram tratados intraperitonealmente no dia 1 e a cada quatro dias com 2 0 μρ/θ3ΐτηαηάοηρο do derivado de duramicina, DLB. Camundongos não-tratados serviram como 470 controle. Os camundongos foram monitorados para sobrevivência 90 dias passados após a infecção.
Tratamento com o derivado de duramicina-biotina, DLB, aumentou a sobrevivência de camundongos infectados com mCMV. Camundongos tratados com DLB tiveram 100% de sobrevivência, guando comparados com camundongos não-tratados, enguanto somente 25% dos camundongos sobreviveram à infecção (Figura 28).
EXEMPLO XXIII
Anticorpos anti-PS se ligam a células infectadas com virus O presente exemplo mostra que a infecção virai induz a exposição a PS na superfície celular e que anticorpos anti-PS se ligam a células infectadas por vírus. Células infectadas com vírus Vaccinia ficam PS positivas, como mostrado pelo aumento da ligação do anticorpo quimérico 3G4 à superfície celular demonstrado em análises de FACS. Células U937 foram infectadas com vírus Vaccinia tripsinizado a um alto m.o.i. de 2. Resumidamente, vírus Vaccinia foi tratado com um volume igual de 0,25 mg/mL de tripsina por 30 minutos a 37 °C. O vírus foi adicionado a células U937 em um volume total de 0,5 mL. Após 1,5 hora, meio fresco foi adicionado às células e as células foram incubadas em um frasco T25 a 37 °C por 2 dias. Células não-infectadas serviram como os controles. Células U937 infectadas e não-infectadas foram manchadas com um anticorpo primário, quer como anticorpo quimérico 3G4 (ch3G4) ou com IgG humana (HIgG) como controle. As células foram lavadas, bloqueadas com soro de camundongo normal e então manchadas com o anticorpo 471 primário por 45 minutos no gelo. Após três lavagens, as células foram manchadas com uma diluição 1:400 de anticorpo secundário conjugado FITC anti-humano de cabra e foram analisados em um FACScan.
Resultados das análises de FACS mostraram como que é significante o deslocamento com ch3G4 em células U-937 infectadas com vírus Vaccinia (Figura 29B, pico da direita (verde). Esse estudo então mostra que a infecção de células com o vírus Vaccinia leva à exposição de PS na superfície celular e que a versão quimérica do anticorpo anti-PS, 3G4 é capaz de se ligar a essas células infectadas com vírus.
EXEMPLO XXIV
Efeitos antivirais de anticorpos anti-PS contra o vírus Pichinde
Adicionalmente aos efeitos antivirais contra CMV e RSV, o presente exemplo ainda mostra que os anticorpos anti-AS inibem a infecção do vírus Pichinde in vitro. Vírus Pichinde é o arenavírus do Novo Mundo, o qual não é patogênico em seres humanos, e é usado em modelos animais para a febre de Lassa.
Monocamadas confluentes de células Vero foram tratadas com o anticorpo 3G4 ou com um anticorpo controle equiparado ao isotipo, GV39G, após infecção com o vírus Pichinde a uma baixa m.o.i. de 0,01 UFC/célula. Resumidamente, as células foram incubadas com vírus em um volume total de 1 mL por poço a 37 °C por 90 minutos. Durante a infecção, as placas foram gentilmente agitadas a cada 30 minutos. Após a infecção, o sobrenadante celular foi removido e DMEM/FBS 10%/pen-strep foi adicionado a cada poço (2 mL por poço) . 472
No dia 2, as células foram coletadas com tripsina e permitiu-se que aderissem a lâminas de câmara Biocoat. Elas foram fixadas e manchadas com soro anti-PIC de coelho policlonal seguido de um secundário anti-coelho de cara biotina conjugado (anticorpo secundário sozinho não pruduziu mancham como mostrado na Figura 30C). 0 número de células infectadas por campo de 100 células foi contado.
Em células tratadas com 3G4, o virus é restrito a células sozinhas que têm mancha de cor vermelho escuro, contando cerca de 1 em cerca de 100 células (Figura 30A) . Essas são provavelmente as células que foram originalmente infectadas pelo virus, como foi visto com CMV (Exemplo XII). Entretanto, em células tratadas com o controle, anticorpo GV39G, o virus se espalhou e infectou todas as células (Figura 30B).
Essa forma de inibição de replicação virai é parecida com aquela observada quando 3G4 foi usado para tratar fibroblastos humanos infectados com CMV. Então, o anticorpo anti-PS, 3G4 previne eficientemente a disseminação do virus Pichine de célula para célula, conforme quantificado na Figura 30D. EXEMPLO XXV (exemplo de referência)
Tratamento de tumor usando derivados peptídicos que se ligam a PE
Adicionalmente aos efeitos antivirais de derivados de duramicina, tanto in vitro quanto in vivo, o presente exemplo demonstra a localização de derivados de duramicina na vasculatura tumoral e efeitos antitumorais associados.
A. Tratamento tumoral com conjugado duramicina-HuIgG 473
IgG humana (HIgG) foi primeiramente purificada conforme descrito no Exemplo XV. HIgG purificado foi ligado a duramicina usando o ligante SIAB, e o conjugado (D-SIABnHIgG purificado.
Linha celular de fibrosarcoma Meth A cresceu, a qual foi coletada na fase log e resuspendida em DPBS. Aproximadamente 106 células tumorais de Meth A foram injetadas subcutaneamente no dorso medial de camundongos machos BALB/c com 6-8 semanas de idade. 5 dias após a implantação, os camundongos foram separados randomicamente em dois grupos (n = 15). Do dia 10, um grupo recebeu 150 μρ de conjugado duramicina-HuIgG por injeção intraperitoneal por 2 semanas consecutivas. O outro grupo recebeu a mesma quantidade de HuIgG como controle. Volumes tumorais foram medidos duas vezes por semana e foram calculados usando a fórmula l/2ab2, (onde "a" é o eixo longo e "b" é o eixo curto do tumor). Camundongos foram sacrificados quando os tumores alcançaram o tamanho de aproximadamente 1400 mm3. O conjugado duramicina-HIgG inibiu o crescimento tumoral de MethA em camundongos BALB/c na dose de 150 μg/dia, quando comparado com o controle IgG humano (Figura 31) . B. Conjugado duramicina-HuIgG localiza para a vasculatura tumoral
Usando o mesmo modelo de tumor de camundongo Meth A acima, quando o tamanho do tumor alcançou 500 mm3, 100 μg (D-SIAB) nHIgG em 100 μΒ de PBS foram injetados pela veia do rabo. A mesma quantidade de IgG humana foi injetada como controle. Após 4 horas, camundongos foram eutanasiados e perfundidos com salina normal por 5 minutos e 1% de 474 paraformadeído por 10 minutos. O tumor e outros órgãos maiores foram dissecados e congelados em nitrogénio liquido. Após serem embebidos em OTC, o tecido foi criocortado em seções de 10 μιη e colocados em lâminas silanizadas. Após a fixação em acetona fria por 10 minutos, lâminas foram manchadas com IgG anti-humana de cabra marcada com peroxidase para detectar a biodistribuição de duramicina-HuIgG. Meca32 e IgG anti-rato de cabra marcada com peroxidase foram usadas para detectar a vasculatura sanguínea do tecido.
Esse estudo mostrou o conjugado de duramicina-HIgG localizado na vasculatura tumoral nos animais tratados. EXEMPLO XXVI (exemplo de referência)
Biodistribuição e propriedades dos conjugados de duramicina O presente exemplo demonstra a falta de toxicidade de derivados de duramicina impermeantes celulares in vitro, a biodistribuição de derivados de duramicina administrados in vivo e a capacidade de conjugados de anticorpo-duramicina de aumentar a fagocitose de células apoptóticas por macrófagos. A. Conjugados de duramicina-biotina são não-citotóxicos
Os derivados e conjugados de duramicina da invenção são projetados para minimizar os efeitos tóxicos não-específicos da molécula de duramicina original. Em muitos exemplos, isto é alcançado ligando-se a duramicina a um grupo impermeável celular (Exemplo XV). A construção DLB de duramicina biotinilada foi preparada conforme descrito no Exemplo XV. O composto de 475 duramicina não-modifiçado e DLB foram testados para efeitos citotóxicos em HUVEC usando um ensaio MMT. Enquanto a duramicina não-modifiçada apresentou toxicidade dose-dependente, DLB não foi tóxico, equiparando-se ao controle não-tratado (Figura 32). B. Localização do conjugado de duramicina-biotina a macrófagos no pulmão A linha celular de câncer de mama humano MDA-MB-435 cresceu, foi coletada na fase log e resuspendida em DPBS. Aproximadamente 107 células foram injetadas na parte polpuda de gordura mamária em camundongos nus anémicos fêmeas de 6-8 semanas de idade. 100 μρ de duramicina- biotina em 100 μg PBS foram injetados através da veia do rabo. Após 4 horas, camundongos foram eutanasiados e perfundidos com salina normal por 5 minutos e 1% de paraformadeido por 10 minutos. Órgãos maiores, incluindo coração, pulmão, rim, fígado, cérebro, intestino, testículos e baço foram dissecados e congelados em nitrogénio líquido. Após embebidos em OCT, o tecido foi criocortado em seções de 10 μιη e colocados em lâminas silanisadas. Após fixação em acetona fria por 10 minutos, as lâminas foram manchadas com estreptavidina marcada com Cy3 para detectar a biodistribuição da construção de duramicina-biotina. Meca32 e IgG anti-rato de cabra marcada com FITC foram usados para detectar a vasculatura sanguínea no tecido. A injeção intravenosa do conjugado de duramicina-biotina em camundongos nus com tumores MDA-MB-435 resultou na deposição da droga nas células tumorais, túbulos renais e nos macrófagos no pulmão. Houve deposição mínima no fígado e nenhuma distribuição detectável no cérebro, 476 intestino e testículos. A localização de macrófagos no pulmão pode ser explorada nas modalidades antivirais da invenção. C. Conjugado duramicina-anticorpo aumenta a fagocitose de células apoptóticas A capacidade de um conjugado duramicina-anticorpo (duramicina-C44, DuC44) de aumentar a fagocitose de células apoptóticas foi depois investigada.
Macrófagos foram isolados e cultivados a partir da medula óssea de camundongo. 0 meio usado para o isolamento, cultivo e estímulo de macrófagos BM foi DMEM contendo 2 mM de glutamina, 0,37% (p/v) NaHCCd, 10% (v/v) de FCS inativado pelo calor, e 0,5 ng/mL de GM-CSF de camundongo. Células da medula óssea foram coradas assepticamente dos fémures dissecados com jato de meio completo direcionado por uma agulha de numeração 25. As células foram então ajustadas a uma densidade de aproximadamente 3 x 105 células/mL de meio completo, e foram distribuídas em alíquotas de 0,5 mL em lâminas de câmara com 8 poços. Células foram incubadas por 1 hora a 37 °C em CO2 5%, em uma câmara umidificada para permitir que os macrófagos se sofram adesão e espalhamento. Células não-aderentes foram removidas pela adição de 5 mL de PBS aquecido a cada poço, resuspendendo células não-aderentes dando tapas moderados na placa, e sacudindo as lâminas para descartar as células não-aderentes. Essa lavagem foi feita num total de três vezes, As células foram mantidas a 37 °C sob uma atmosfera de CO2 7,5% (v/v) por 5 dias. O meio completo foi trocado dia sim dia não até que as células fossem usadas. 477 0 seguinte método foi usado para marcar células alvo HL-60 com um riscador fluorescente de células. 10 mM de uma solução estoque de CFDA SE foi preparada imediatamente antes do uso pela dissolução do conteúdo de um frasquinho seco em 90 μύ de DMSO e diluindo com PBS para 10 μΜ. Centrifugação foi usada para obter um precipitado de células HL-60 e o sobrenadante aspirado. As células foram resuspensas em CFDA/PBS e incubadas a 37 °C por 15 minutos. As amostras foram centrifugadas e o sobrenadante aspirado. As células foram resuspensas em meio e incubadas por mais 30 minutos. A viabilidade celular e fluorescência foram confirmadas como sendo superiores a 95%.
Nesse ensaio de fagocitose, células HL-60 marcadas foram expostas à radiação UV em 254 nm por 5 minutos e incubadas a 37 °C por uma hora para induzir apoptose. 104 células HL-60 apoptóticas foram incubadas com macrófagos por 1 hora. Conjugado de duramicina-C44 foi incluído na concentração de 10 μg/mL. A mesma concentração de anticorpo de camundongo BBG3 foi usada como controle negativo, e o anticorpo 3G4 foi também incluído por comparação. Hoechst 33342 foi adicionado ao meio nos últimos 45 minutos na concentração de 10 μρ/ιηύ. Lâminas foram lavadas com PBS 3 vezes, e fixadas em paraformadeído 4% por 15 minutos. As lâminas foram manchadas com anticorpo CD11 anticamundongo de rato (CD11 é um marcador de macrófago), diluído com 0,2% de gelatina por 1 hora, lavado e marcado com anticorpo secundário anti-rato de cabra marcado com cermelho Texasw.
As células foram analisadas sob o microscópio de fluorescência. Macrófagos são identificados como células vermelhas, devido ao marcador CD11. Macrófagos que 478 fagocitaram células apoptóticas são identificados como células verdes, devido ao marcador fluorescente nas células alvo. Células vermelhas e verdes foram contadas e a fagocitose foi quantificada como a percentagem de fagócitos positivos para captura.
Esse estudo mostra que o conjugado anticorpo-duramicina, DuC44, aumentou a fagocitose de células HL-60 apoptóticas por macrófagos (Figura 33). Então, a porção de duramicina é ligada à superfície das células apoptóticas, permitindo à porção do anticorpo projetado do conjugado que seja reconhecido pelos macrófagos. 0 conjugado de duramicina-anticorpo então funcionou similarmente ao anticorpo 3G4. Como esperado, um fragmento (Fab)2 do anticorpo 3G4, sem a região Fc, não induziu fagocitose acima dos níveis de controle.
Como o primeiro estudo apresentou conjugados de duramicina-biotina para localização de macrófagos no pulmão seguida de administração in vivo, o estímulo de fagocitose mediada por macrófagos de células apoptóticas apresentado no presente estudo tem importantes implicações para os usos terapêuticos da presente invenção, tal como no tratamento de infecções virais pulmonares.
Todas as composições e métodos revelados e descritos na presente podem ser feitas e executadas sem experimentação indevida à luz da presente revelação. 479
LISTAGEM DE SEQLTÊNCIA
<110> SISTEMA DA UNIVERSIDADE DO TEXAS
Thorpe, Philip E.
Soares, M. Melina Huang, Xianming He, Jin Ran, Sophia
<120> ANTICORPOS SELECIONADOS E PEPTÍDEOS DE
DURAMICINA QUE SE LIGAM A FOSFOLIPÍDIOS ANIÔNICOS & AMINOFOSFOLIPÍDIOS E SEU USO NO TRATAMENTO DE INFECÇÕES VIRAIS E CÂNCER <130> 4001.003010 <14 0> PCT/US03/21925 <141> 2003-07-15 <150> 60/396,263 <151> 2002-07-15 <160> 9 <170> PATENTE NA VERSÃO 3.1 <210> 1 <211> 519 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atgggatgga cctggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgag 60 gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gagaagcctg gcgcttcagt gaagctatcc 120 tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tacaacatga actgggtgaa acagagccat 180 ggaaagagcc ttgaatggat tggacatatt gatccttact atggtgatac ttcctacaac 240 cagaagttca ggggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcaaga gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgtaaa ggggggttac 360 tacgggcact ggtacttcga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctcagct 420 acaacaacag ccccatctgt ctatcccttg gtcccgggcg gatcccccgg gctgcaggaa 480 ttcgatatca agcttatcga taccgtcgac ctcgagggg 519 <210> 2 <211> 152
<212> ?RT <213> Mus musculus <400> 2 480
Met Gly Trp Thr Trp He Phe Xle Leu Ile Leu Ser Vai Thr Thr Gly 1 5 10 15
Vai His Ser Giu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys 20 25 30
Pro Gly Ala Ser Vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45
Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Vai Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60
Glu Trp Ile Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80
Gin Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gin Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai 100 105 110
Tyr Tyr Cys Vai Lys Gly Gly Tyr Tyr Gly His Trp Tyr Phe Asp Vai 115 120 125
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Thr Thr Thr Ala 130 135 140
Pro Ser Vai Tyr Pro Leu Vai Pro 145 150 <210> 3 <211> 435
<212> DNA <213> Mus <4 00> 3 atggacatga musculus gggctcctgc acagattttg ggcttcttgt tgctcttgtt tccaggtacc 60 agatgtgaca tccagat gac ccagtctcca tcctccttat ctgcctctct gggagaaaga 120 gtcagtctca cttgtcgggc aagtcaggac attggtagta gcttaaactg gcttcagcag 180 ggaccagatg gaactattaa acgcctgatc tacgccacat ccagtttaga ttctggtgtc 240 cccaaaaggt tcagtggcag taggtctggg tcagattatt ctctcaccat cagcagcctt 300 gagtctgaag attttgtaga ctattactgt ctacaatatg ttagttctcc tcccacgttc 360 481 420 420 435 ggtgctggga ccaagctgga gctgaaacgg gctgatgctg caccaactgt cttcatcttc gggcggatcc cccgg <210> 4 <211> 144 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gin Ile Leu Gly Phe Leu Leu Leu Leu 15 10 15
Phe Pro Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Vai Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Gin Asp Ile Gly Ser Ser Leu Asn Trp Leu Gin Gin Gly Pro Asp Gly 50 55 60
Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Vai 65 70 75 80
Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr 85 90 95
Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Vai Asp Tyr Tyr Cys Leu Gin 100 105 110
Tyr Vai Ser Ser Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 115 120 125
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Vai Phe Ile Phe Gly Arg Ile Pro 130 135 140 <210> 5 <211> 783
<212 > DNA
<213> SEQÚÊNCIA ARTIFICIAL <220>
<223> OLIGONUCLEOTÍDIO SINTÉTICO 482 <400> 5 gcccagccgg ccatggccga ggtgcagctg gtggagtctg ggggaggcgt ggtccagcct 60 gggaggtccc tgagactctc ctgtgcagcc tctggattca ccttcagtag ctatggcatg 120 cactgggtcc gccaggctcc aggcaagggg ctggagtggg tggcagttat atcatatgat 180 ggaagtaata aatactatgc agactccgtg aagggccgat tcaccatctc cagagacaat 240 tccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac agcctgagag ctgaggacac ggccgtgtat 300 tactgtgcaa gattgcatgc tcagacttgg ggccaaggta ccctggtcac cgtctcgagt 360 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtagtg cacttcagtc tgtgctgacg 420 cagccgcctt cagtgtctgc ggccccagga cagaaggtca ccatctcctg ctctggaagc 480 agctccgaca tggggaatta tgcggtatcc tggtaccagc agctcccagg aacagccccc 540 aaactcctca tctatgaaaa taataagcga ccctcaggga ttcctgaccg attctctggc 600 tccaagtctg gcacctcagc caccctgggc atcactggcc tctggcctga ggacgaggcc 660 gattattact gcttagcatg ggataccagc ccgcggaatg tattcggcgg agggaccaag 720 ctgaccgtcc taggtgcggc cgcacatcat catcaccatc acggggccgc agaacaaaaa 780 ctc 783 <210> 6
<211> 261 <212> PRT
<213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <220>
<223> POLIPEPTÍDEO <400> 6
Ala Gin Pro Ala Met Ala Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15
Vai Vai Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly 35 40 45
Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Ser.Asn Lys 50 55 60
Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 483 65 70 75 80
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 85 90 95
Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu His Ala Gin Thr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Ala Leu Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser 130 135 140
Vai Ser Ala Ala Pro Gly Gin Lys Vai Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser 145 150 155 160
Ser Ser Asp Met Gly Asn Tyr Ala Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro 165 170 175
Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser 180 185 190
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr 195 200 205
Leu Gly Ile Thr Gly Leu Trp Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 210 215 220
Leu Ala Trp Asp Thr Ser Pro Arg Asn Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240
Leu Thr Vai Leu Gly Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala 245 250 255
Ala Glu Gin Lys Leu 260 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 484
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15
Ser Thr Ser Gly 20 <210> 8 <211> 15
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 15 10 15 <210> 9 <211> 19
<212> PRT <213> Streptomyces cinnamoneus <220>
< 2 21> PERFIL VARIADO <222> (11)..(18) <223> Xaa = Abu <4 00> 9
Ala Lys Gin Ala Ala Ala Phe Gly Pro Phe Xaa Phe Vai Ala Asp Gly 1 5 10-15
Asn Xaa Lys 485

Claims (21)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição compreendendo um anticorpo purificado, ou fragmento de ligação ao antigénio ou seu imunoconjugado, em que o referido anticorpo: (a) compreende uma região variável da cadeia pesada que inclui os residuos de aminoácidos da complementaridade regiões determinantes (CDR) a partir dos ácidos aminados posições 31-35 (CDR-H1), 50-56 (CDR-H2) e 95-102 (DCR H3) da SEQ ID NO: 2; e uma região variável da cadeia leve que inclui os residuos de aminoácidos das posições CDR de amino ácidos 24-34 (CDR Ll), 50-56 (CDR L2) e 89-97 (DCR L3) da SEQ ID NO: 4; (b) liga-se a fosfatidilserina num ELISA realizado na presença de 10% de soro e compreende uma região variável da cadeia pesada que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; ou uma região variável da cadeia leve que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; ou (c) liga-se a fosfatidilserina num ELISA realizado na presença de 10% de soro e compreende uma região variável da cadeia pesada que inclui uma variante ou uma forma mutagenizada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que a referida variante ou forma mutagenizada tem, pelo menos, cerca de 96% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e uma região variável da cadeia leve que inclui uma variante ou uma forma mutagenizada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, em que a referida variante ou forma mutagenizada tem pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 4; e em que o referido tem o protocolo de ELISA: 96 poços é revestido com fosfatidilserina (PS), como segue: - Diluir a solução de estoque de PS em n-hexano a 10 mg/ml e misturar bem - Adicionar 50 μΐ a cada cavidade e permitir que esta se evaporar durante uma hora, adicionar 200 μΐ de tampão de bloqueio a cada poço, em que o referido tampão de bloqueio é 10% de soro bovino dissolvida em PBS, a tampa e manter à temperatura ambiente durante 2 horas ou durante a noite a 4 °C, lava-se a placa três vezes com PBS adicionar a amostra de teste de anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio referido e incubadas durante 2 horas a 37 °C, lavar três vezes com PBS adiciona-se 100 μΐ /poço de anticorpo secundário (de cabra, anti-IgG de ratinho-HRP ou outro anticorpo secundário apropriado) e incubar durante 1 hora a 37 °C lava-se a placa três vezes com PBS desenvolver o ensaio ELISA pela adição de 100 μΐ de solução de desenvolvimento de cada um dos poços, desenvolver durante 10 minutos, em seguida adicionar 100 μΐ de solução de paragem a cada poço e leia a densidade óptica a 490 nm da solução de revelação sendo 10 ml de Na2PC>4 0,2 M, 10 ml de ácido cítrico 0,1 M e um comprimido de 10 mg de ofenilenediamina e 10 μΐ de peróxido de hidrogénio, sendo a solução de paragem 0,18 M H2SO4.
  2. 2. A composição da reivindicação 1, em que o referido anticorpo se liga a fosfatidilserina na referida elisa e compreende uma região de cadeia variável que inclui uma sequência de aminoacidos de seq id no: 2 ou uma cadeia leve da região variável que inclui um sequência de aminoacidos de seq id no: 4.
  3. 3. A composição da reivindicação 1, em que o referido anticorpo se liga a fosfatidilserina na referida elisa e compreende uma região variável de cadeia pesada que inclui uma variante ou uma forma mutagenizada da sequência de aminoacidos de seq id no: 2, em que um referida variante ou forma mutagenizada tem pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência de aminoacidos pará o aminoácido sequência de seq id no: 2; e uma região variável da cadeia leve que inclui uma variante ou uma forma mutagenizada da amino sequência de ácido de seq id no: 4, em que a referida variante uo forma mutagenizada tem pelo menos cerca de 96% de aminoácido identidade de sequência com uma sequência de aminoacidos de seq id no: 4.
  4. 4. A composição da reivindicação 2 ou 3, em que o referido anticorpo compete eficazmente com o anticorpo monoclonal 3g4 (depositado como atcc pta 4545) para se ligar a uma fosfatidilserina na referida elisa.
  5. 5. A composição da reivindicação 3, em que o referido anticorpo se liga a fosfatidilserina na referida elisa e compreendendo uma região variável de cadeia pesada que inclui uma variante ou uma forma mutagenizada da sequência de aminoacidos de seq id no: 2, em que um referida variante ou forma mutagenizada tem pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência de aminoacidos em relação ao aminoácido da sequência de seq id no: 2; e uma região variável da cadeia leve que inclui uma variante ou uma forma mutagenizada de amino sequência de ácido de seq id no: 4, em que a referida variante uo forma mutagenizada tem pelo menos cerca de 9 7% de aminoácido identidade de sequência com uma sequência de aminoacidos de seq id no: 4.
  6. 6. A composição da reivindicação 5, em que o referido anticorpo se liga a fosfatidilserina na referida ELISA e compreende uma região variável da cadeia pesada que inclui uma variante ou uma forma mutagenizada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que a referida variante ou forma mutagenizada tem pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e uma região variável da cadeia leve que inclui uma variante ou uma forma mutagenizada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, em que a referida variante ou forma mutagenizada tem pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 4.
  7. 7. A composição da reivindicação 6, em que o referido anticorpo se liga a fosfatidilserina na referida ELISA e compreende uma região variável da cadeia pesada que inclui uma variante ou uma forma mutagenizada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que a referida variante ou forma mutagenizada tem pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e uma região variável da cadeia leve que inclui uma variante ou uma forma mutagenizada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, em que a referida variante ou forma mutagenizada tem, pelo menos, cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 4.
  8. 8. A composição da reivindicação 1, em que o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que inclui os resíduos de aminoácidos das posições CDR de amino ácidos 31-35 (CDR-H1), 50-56 (CDR-H2) e 95-102 (CDR H3) da SEQ ID NO: 2; e uma região variável da cadeia leve que inclui os resíduos de aminoácidos das CDRs de aminoácidos nas posições 24-34 (CDR Ll), 50-56 (CDR L2) e 89-97 (RDC L3) da SEQ ID NO: 4.
  9. 9. A composição da reivindicação 8, em que o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável da cadeia leve que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
  10. 10. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido anticorpo é um ser humano, humanizado, dimérica, trimérica, multimérica, quimérico, biespecifico, anticorpo recombinante ou engenharia parte-humano; ou um scFv, Fv, Fab ', Fab, Fab dimero, diacorpo, anticorpo linear, F (ab') 2, CDR, fragmento univalente, camelizados ou fragmento único domínio de ligação do antigénio da mesma.
  11. 11. Uma composição compreendendo um anticorpo quimérico, em que pelo menos uma primeira região de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal de ratinho anticorpo 3G4, depositado como ATCC PTA 4545, está operacionalmente ligada a uma região constante de anticorpo humano.
  12. 12. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido anticorpo está operacionalmente ligado a um biológica agente, um agente de diagnóstico ou um agente terapêutico adicional.
  13. 13. A composição de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a referida composição é uma composição farmaceuticamente aceitável, em que a composição farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, de preferência, compreende ainda um agente terapêutico adicional.
  14. 14. A composição de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a referida composição é uma composição de aerossol.
  15. 15. A composição de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a referida composição é um lipossoma farmaceuticamente aceitável ou composição de nanoparticulas; e em que, opcionalmente e preferencialmente em que a referida composição farmaceuticamente aceitável é um lipossoma composição do lipossoma é uma composição de lipossomas stealth ou PEGuilado que é revestido com o referido anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio; e em que, opcionalmente, e ainda mais preferencialmente o referido stealthed ou PEGuilado lipossoma contém um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
  16. 16. A composição de qualquer uma das reivindicações 12 a 15, em que o referido agente terapêutico adicional é: (a) um agente anti-angiogénico ou um agente anti-cancro; (b) uma citotoxina, um agente quimioterapêutico, um agente radioterapêutico, inibidor da tirosina quinase, agente indutor de apoptose, esteróides, anti-metabolito, análogo do ácido fólico, drogas anti-tubulina, inibidores da topoisomerase, taxano, combretastatina, antibióticos, complexo de coordenação de platina, citocina, alquilação agente ou coagulante; (c) docetaxel, paclitaxel, 5-fluorouracil, gemcitabina, irinotecano, cisplatina ou carboplatina.
  17. 17. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização em diagnóstico ou terapia.
  18. 18. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização no tratamento de uma doença angiogénico por inibição da angiogénese, de preferência, para uso no tratamento de degeneração macular, artrite, aterosclerose, retinopatia diabética, hiperplasia da tiróide, doença de Grave, hemangioma, glaucoma neovascular e psoríase.
  19. 19. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização no tratamento do cancro.
  20. 20. A composição da reivindicação 19, para utilização no tratamento de cancro em combinação com quimioterapia ou radioterapia.
  21. 21. A composição da reivindicação 20, para utilização no tratamento de cancro em combinação com o agente quimioterapêutico docetaxel, paclitaxel, 5-fluorouracil, gemcitabina, irinotecano, cisplatina ou carboplatina.
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