KR102400464B1 - 암 줄기세포 검출용 바이오 마커 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 줄기세포 검출용 바이오 마커에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암 줄기세포에서 발현되는 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE)을 이용한 암 줄기세포 검출용 바이오 마커 조성물, 암 진단용 조성물, 암 진단 키트 및 암 진단에 대한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암 줄기세포 검출용 바이오 마커인 포스파티딜에탄올아민은 암세포 및 다른 세포에 비해 암 줄기세포에서 발현이 현저히 높고, 발현 시 세포막 외부로 노출된다는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 암 줄기세포 검출용 바이오 마커를 이용할 경우 암 줄기세포를 보다 민감하고 정확하게 검출할 수 있음을 의미하는바, 본 발명의 암의 진단, 예후 예측 및 약물 스크리닝 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

암 줄기세포 검출용 바이오 마커 조성물{Biomarker composition for detecting cancer stem cell}
본 발명은 암 줄기세포 검출용 바이오 마커에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암 줄기세포에서 발현되는 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE)을 이용한 암 줄기세포 검출용 바이오 마커 조성물, 암 진단용 조성물, 암 진단 키트 및 암 진단에 대한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
신체의 장기를 유지하고 재생하기 위해서는 줄기세포의 존재가 필수적이다. 종양 또한 마찬가지로 줄기세포와 유사한 성질을 가지는 이질적 집단인 암 줄기세포가 존재한다. 암 줄기세포를 분리 시험관 내(in vitro) 배양하는 방법으로는 스피어 형성, 알데하이드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase, ALDH) 활성, 세포 표면 표지인자 등 여러 방법이 존재한다. 상기 암 줄기세포는 부유 배양을 통하여 암 줄기세포의 특성인 자가증식법을 이용하여 스피어를 형성하는 세포로, 원 세포주에 비해 강력한 암 형성능과 정상 줄기세포의 특성을 공유한다고 알려져 있다. 또한 종양의 이질적인 특성에서 암 줄기세포는 종양이 악성으로 진행됨에 따라 증가하는 경향을 보이며, 암 줄기세포는 암의 발생은 물론 기존 암 치료법에 대한 내성을 가지며, 재발의 원인으로 보고되어 있다. 따라서 암 줄기세포를 제거하기 위해서는 기존 항암제의 내성을 갖는 세포를 인지하고 표적하는 것이 중요하다.
현재 유방암, 간암, 대장암, 폐암, 위암 등의 분야에서 암 줄기세포를 표적하는 여러 세포 표면 단백질 바이오 마커들이 발굴 및 보고되었으나, 암 줄기세포를 표지한다고 알려진 바이오 마커들의 발현도 종양의 발병 위치, 병기, 전이, 재발에 따라 매우 다른 양상을 보인다. 이러한 암 줄기세포 표적 세포 표면 단백질 바이오 마커의 이질성을 해결하기 위하여, 암 줄기세포를 표적하는 새로운 형태의 바이오 마커 발굴 연구가 필요한 실정이다.
암의 경우 하나의 조직 내에서도 이질성이 매우 강하여, 항암치료 시 항암제 저항성을 가진 암 조직의 발현으로 항암치료가 실패하는 중요한 원인으로 꼽힌다. 암 줄기세포는 이러한 이질성 특징을 나타내는 가장 상위 단계의 세포로 알려져 있으며, 항암제 내성과도 밀접한 연관성을 가지고 있다. 이에 다양한 세포 표면 단백질 표적 치료에도 불구하고, 암 줄기세포를 완벽하게 제거하기는 쉽지 않다. 현재의 암 줄기세포의 단백질 표적 바이오 마커는 대부분 세포의 신호전달이나 세포의 내성 획득 등 다양한 주변 환경에 의하여 발현 빈도가 달라질 수 있다. 따라서 기존 단백질 표적 바이오 마커가 아닌 다른 형태의 암 줄기세포 특이적 세포 표면 표적 바이오 마커를 찾는 것이 중요하다.
한국공개특허 제10-2012-0135332호
Stafford, Jason H., and Philip E. Thorpe. "Increased exposure of phosphatidylethanolamine on the surface of tumor vascular endothelium." Neoplasia (New York, NY) 13.4 (2011): 299. Zhao, Yue, et al. "Cancer stem cells and angiogenesis." International Journal of Developmental Biology 55.4-5 (2011): 477-482.
이에 본 발명자들은 암 줄기세포를 표적하기 위한 바이오 마커를 발굴하기위하여 연구한 결과, 난소암 암 줄기세포에서 포스파티딜에탄올아민의 발현이 난소암 세포주 및 다른 세포주에 비해 현저히 높은 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE)을 포함하는 암 줄기세포 검출용 바이오 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 포스파디틸에탄올아민의 발현을 측정하는 제제를 포함하는 암 줄기세포 검출을 통한 암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 암 진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 생물학적 시료에서 포스파티딜에탄올아민의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 암 줄기세포 검출을 통한 암 진단에 대한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 암 줄기세포 검출용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 포스파티딜에탄올아민의 발현을 측정하는 제제를 포함하는 암 줄기세포 검출을 통한 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 줄기세포 검출을 통한 암 진단 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 생물학적 시료에서 포스파티딜에탄올아민의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 암 줄기세포 검출을 통한 암 진단에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 암 줄기세포 검출용 바이오 마커인 포스파티딜에탄올아민은 암세포 및 다른 세포에 비해 암 줄기세포에서 발현이 현저히 높고, 발현 시 세포막 외부로 노출된다는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 암 줄기세포 검출용 바이오 마커를 이용할 경우 암 줄기세포를 보다 민감하고 정확하게 검출할 수 있음을 의미하는바, 본 발명의 암의 진단, 예후 예측 및 약물 스크리닝 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 난소암 세포주 A2780-AD 세포 및 난소암 암 줄기세포주 A2780-SP 세포의 형태학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 유세포 분석을 통해 난소암 세포주 A2780-AD 세포 및 난소암 암 줄기세포주 A2780-SP 세포의 암 줄기세포 마커 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 LC-MS를 통해 난소암 세포주 A2780-AD 세포 및 난소암 암 줄기세포주 A2780-SP 세포의 지질 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 상기 도 3의 결과에 기초하여, 난소암 세포주인 A2780-AD에 비해 암 줄기세포주인 A2780-SP 세포에서 발현이 증가 또는 감소된 지질을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 난소암 세포주 A2780-AD 세포 및 난소암 암 줄기세포주 A2780-SP 세포의 포스파티딜에탄올아민 발현을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 LC-MS를 통해 암세포화된 암 줄기세포주 A2780-DIF 세포 및 암 줄기세포주 A2780-SP 세포의 지질 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 암 줄기세포주인 A2780-SP 세포에 비해 암세포화된 암 줄기세포주인 A2780-DIF 세포에서 발현이 증가 또는 감소된 지질을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 암세포화된 암 줄기세포주 A2780-DIF 세포 및 암 줄기세포주 A2780-SP 세포의 포스파티딜에탄올아민 발현을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 환자 유래 난소암 암 줄기세포인 EOC-SP 세포 및 암세포화된 환자 유래 난소암 암 줄기세포인 EOC-DIF 세포의 형태학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 EOC-SP 세포 및 EOC-DIF 세포의 암 줄기세포 마커 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 EOC-SP 세포 및 EOC-DIF 세포의 지질 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 상기 도 11의 결과에 기초하여, 환자 유래 난소암 암 줄기세포주인 EOC-SP 세포에 비해 암세포화된 암 줄기세포주인 EOC-DIF 세포에서 발현이 증가 또는 감소된 지질을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 EOC-SP 세포 및 EOC-DIF 세포에서 포스파티딜에탄올아민의 발현을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 유세포 분석을 통해 난소암 세포주 A2780-AD 세포 및 난소암 암 줄기세포주 A2780-SP 세포에서 포스파티딜에탄올아민의 세포막 외부 노출 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 유세포 분석을 통해 난소암 세포주 SKOV3-AD 세포 및 난소암 암 줄기세포주 SKOV3-SP 세포에서 포스파티딜에탄올아민의 세포막 외부 노출 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 유세포 분석을 통해 환자 유래 암 줄기세포주 EOC12-SP 세포 및 EOC21-SP 세포에서 포스파티딜에탄올아민의 세포막 외부 노출 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 유세포 분석을 통해 인간 배아 유래 신장세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포 및 인간 탯줄 정맥내피세포에서 포스파티딜에탄올아민의 발현 및 세포막 외부 노출 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE)을 포함하는 암 줄기세포 검출용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “포스파티딜에탄올아민”은 인지질(phospholipid)의 하나로, 글리세로인지질(glycerophospholipid)에 속한다. 상기 글리세로인지질은 글리세롤 3인산(glycerol 3-phosphate)에 지방산 2개가 결합한 형태인데, 포스파티딜에탄올아민은 인산기에 에탄올아민(ethanolamine)이 결합된 것이다. 이와 같은 포스포에탄올아민은 세포 분열 동안 막의 융합, 수축환의 분해 및 막의 곡률 조절에 관여한다고 알려져 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 포스파티딜에탄올아민은 일반적으로 세포의 인지질 이중층 내막에서 발현되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, “암 줄기세포(Cancer stem cell 또는 Tumor initiating cell)”는 종양을 생성할 수 있는 능력을 가지는 세포를 의미한다. 암 줄기세포는 정상적인 줄기세포와 유사한 특징을 가지며, 줄기세포의 특성인 자기재생능 및 분화능을 통해 종양을 발생시킨다. 또한 종양에서 다른 집단과 구별되어 새로운 종양을 발생시킴으로써 재발 및 전이의 원인이 된다. 그러므로 암 줄기세포를 타겟으로 하여 특이적 치료방법의 발달은 암환자의 생존율을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, “암”은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다.
본 발명의 구체예에서, 위암(gastric cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer), 혈액암(blood cancer), 뼈암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 머리 또는 목암(head or neck cancer), 피부 또는 안구 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁육종(uterine sarcoma), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(anal cancer), 대장암(colon cancer), 난관암(fallopian tube carcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 소장암(small intestine cancer), 내분비암(endocrine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 신장암(adrenal cancer), 연조직종양(soft tissue tumor), 요도암(urethral cancer), 전립선암(prostate cancer), 기관지암(bronchogenic cancer) 및 골수암(bone marrow tumor)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것이 바람직하며, 난소암인 것이 더 바람직하다.
본 발명에 있어서, “바이오 마커”는 생체 내 변화를 객관적으로 측정 및 평가할 수 있는 지표로, 개체의 병리적인 상태, 약물에 대한 반응도 등을 측정·평가할 수 있다. 이에, 바이오 마커는 검출 또는 진단 용도로도 쓰일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 포스파티딜에탄올아민은 암이 아닌 세포 및 암세포보다 암 줄기세포에서 발현이 높은 것이 바람직하다. 상기 암이 아닌 세포의 예로는 인간 배아 유래 신장세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포 및 인간 탯줄정맥내피세포일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 포스파티딜에탄올아민이 암 줄기세포의 표면에서 발현되며, 암이 아닌 세포 및 암세포에 비해 암 줄기세포에서 과발현됨을 확인하였는바, 이는 암 줄기세포의 검출용 또는 암 진단용 바이오마커로 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 포스파티딜에탄올아민의 발현을 측정하는 제제를 포함하는 암 줄기세포 검출을 통한 암 진단용 조성물 및 암 진단 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, “진단”은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 상기 진단은 암의 발병 여부뿐만 아니라 예후, 경과, 병기 등을 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 본 발명의 목적상, 진단은 암의 발병, 예후, 경과, 병기 상태 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, “포스파티딜에탄올아민의 발현을 측정하는 제제”는 상기와 같이 암 줄기세포에서 발현이 증가하는 바이오 마커인 포스파티딜에탄올아민에 특이적으로 결합하여, 이의 발현 수준을 확인함으로써 바이오 마커의 검출에 사용될 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 포스파티딜에탄올아민의 발현을 측정하는 제제는 포스파티딜에탄올아민에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 프로브 및 염료로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 포스파티딜에탄올아민의 발현을 측정하기 위한 제제는 듀라마이신(duramycin) 또는 신나마이신(cinnamycin)을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 암 진단용 키트는 사용하는 방법에 따라 다양한 형태의 키트일 수 있으며, 예를 들어 상기 키트는 유세포분석법, 질량분석법, 광흡수분석법, 크로마토그래피 및 발광분광분석법을 위한 정량 분석 키트일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 정량 분석 키트는 정량 분석 장치를 통해 결과 값을 획득할 수 있다. 상기 정량 분석 장치는 유세포분석기, 핵자기공명분광기, 크로마토그래피, 자외선분광기, 적외선분광기, 형광분광기, 마이크로플레이트리더 및 질량분석기로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 암 진단용 키트에는 상기 포스파티딜에탄올아민의 발현 수준을 측정하는 제제 뿐만 아니라, 면역학적 분석 및 정량 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 예로는 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 키트는 상술한 조성물을 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 암 진단용 조성물 및 암 진단 키트를 이용하여, 생물학적 시료에서 암 줄기세포, 즉, 포스파티딜에탄올아민이 과발현되는 세포를 검출하여 암 줄기세포의 존재 여부를 확인하고, 이로부터 암의 존재 여부 뿐만 아니라 예후, 경과, 병기 등을 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생물학적 시료에서 포스파티딜에탄올아민의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 암 줄기세포 검출을 통한 암 진단에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, “생물학적 시료”는 본 발명의 포스파티딜에탄올아민의 발현이 검출될 수 있는 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다. 상기 생물학적 시료 는 전혈, 혈청, 혈장, 세포, 객담, 조직, 타액(saliva), 생검(biopsy), 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 방법은 생물학적 시료에서 포스파티딜에탄올아민의 발현 정도를 확인함으로써 암 줄기세포의 존재 여부를 판단하며, 이를 통해 암의 진단에 대한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 방법은 유세포분석기, 핵자기공명분광기, 크로마토그래피, 자외선분광기, 적외선분광기, 형광분광기, 마이크로플레이트리더 및 질량분석기로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 정량 분석 장치를 통해 포스파디틸에탄올아민의 발현을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 난소암 세포 및 난소암 암 줄기세포의 지질 발현 비교
1-1. 세포 준비
난소암 세포주 A2780 세포(A2780-AD)와 난소암 암 줄기세포주 A2780-SP 세포를 준비하였다. 난소암 세포주 A2780-AD은 RPMI1640 배지(10% FBS, 100 μg/mL Sterptomycin/Penicillin)를 이용하여 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였고, 일정 기간마다 계대 배양하였다. 상기 암 줄기세포주 A2780-SP 세포는 난소암 세포주인 A2780 세포를 3차원 배양한 후 암 줄기세포를 분리한 것이다. 상기 3차원 배양은 Neurobasal Plus 배지(B-27 supplement (50X), 100 μg/mL Sterptomycin/Penicillin, 100 μg/mL rhFGF, 100 μg/mL rhEGF, Glutamax, 1M HEPES)를 이용하여 Ultra-low attachent dish에서 수행하였다. 상기 3차원 배양조건은 온도 37℃ 및 5% CO2 조건이다.
1-2. 형태학적 분석
준비된 A2780-AD 세포 및 A2780-SP 세포의 형태학적 분석을 수행하였다. 구체적으로, 상기 A2780-AD 세포 및 A2780-SP 세포를 각각의 상기 조건으로 배양하였다. 배양된 세포를 현미경으로 관찰하였다. 형태학적 분석 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 난소암 세포주인 A2780-AD 세포 및 난소암 암줄기세포주인 A2780-SP 세포는 형태학적으로 차이가 있는 것을 확인하였다.
1-3. 암 줄기세포 마커 발현 확인
준비된 A2780-AD 세포 및 A2780-SP 세포에서 암 줄기세포의 마커인 알데하이드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase, ALDH)의 발현을 확인하였다. 구체적으로, ALDEFOUOR™ 키트(STEMCELL Technologies)를 사용하여, 준비된 A2780-AD 세포 중 ALDH를 발현하는 세포를 제조사의 매뉴얼에 따라 표지하였다. 그 후 FACS AttuneNxT(ThermoFisher)를 이용하여 ALDH를 발현하는 세포를 측정하였다. A2780-SP 세포도 동일한 방법으로 ALDH의 발현을 측정하였다. 암 줄기세포 마커를 발현하는 세포를 측정한 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 난소암 암 줄기세포주인 A2780-SP 세포는 ALDH의 발현이 난소암 세포주(A2780-AD)에 비해 현저히 높은 것을 확인하였다.
1-4. 난소암 세포 및 난소암 암 줄기세포의 지질 발현 분석
준비된 A2780-AD 세포 및 A2780-SP 세포의 지질 발현을 분석하였다. 구체적으로, 부착세포인 A2780-AD 세포는 트립신을 처리하여 세포 펠릿을 수집하였다. 또한 부유세포인 A2780-SP 세포는 배양액을 회수한 후 스핀다운(spin down)하여 배지를 제거하여 세포 펠릿을 수집하였다. 수집된 세포 펠릿에 MeOH 610 μl, Internal standards mix 50 μl, 클로로폼(Chloroform) 330 μl 및 Cholesteryl ester standard(1 ng/μl) 20 μl을 첨가하였다. 그 후 3분 마다 30초씩 볼텍싱(vortexing)한 후 스핀다운(spin down) 및 초음파 처리하였으며, 3회 반복하였다. 초음파 처리된 세포를 원심분리(4℃, 1분, 14,000 g)하였고, 상층액을 제거하여 펠릿을 얻었다.
수득된 펠릿에 MeOH 496 μl, CH3Cl 248 μl을 첨가하고, 30% HCl 6 μl을 첨가하였다. 그 후 5분마다 30초씩 볼텍싱한 후 스핀다운하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 그 후 CH3Cl 250 μl 및 0.1N HCl 450 μl을 첨가한 후 1분 동안 볼텍싱한 후 원심분리(4℃, 1분, 6,500 g)하여 층분리를 확인하였다. 아랫층을 파이펫으로 취하였고, 새 튜브에 옮겼다.
새 튜브에 담긴 시료를 비-메틸화(non-methylation) 및 메틸화(methylation) 분석용 시료로 나눈 후 건조시켰다. 비-메틸화 분석용 시료는 용액(A:B=2:1) 50 μl에 희석하여, 메틸화 분석용 시료는 MeOH 50 μl에 희석하여 준비된 샘플을 -80℃에 보관하였다.
준비된 샘플 및 TMSD(Trimethylsilyldiazomethane) 시약을 1:1(v/v) 비율로 혼합한 후 35 내지 40℃에서 15분 동안 반응시켰다. 반응 후 아세트산을 전체 부피의 5% 정도 첨가한 후 용액이 투명해질 때까지 한 방울씩 첨가하였다. 투명해진 용액을 분석을 위한 시료로 사용하였다.
준비된 시료에 포함된 지질을 LC-MS(liquid chromatography mass spectrometry)를 통해 분석하였다. 분석 결과에 기초하여 매트릭스를 작성하였으며, 작성된 매트릭스는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, A2780-AD 세포 및 A2780-SP 세포는 지질 발현 패턴이 상이한 것을 확인하였다.
또한 난소암 세포주인 A2780-AD에 비해 암 줄기세포주인 A2780-SP 세포에서 발현이 증가 또는 감소된 지질을 분석하였다. 구체적으로, SigmaPlot10.0 소프트웨어를 이용하여, 상기 LC-MS 로우 데이터를 도식화하여 발현이 증가 또는 감소된 지질을 분석하였다. 지질 발현 분석 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 난소암 세포주 A2780-AD에 비해 난소암 줄기세포주 A2780-SP 세포에서 발현이 증가된 지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE), 리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine, LPE), 모노글리세라이드(monoglyceride)를 포함한 93종이며, 발현이 감소된 지질은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 다이글리세라이드(diglyceride)를 포함한 61종인 것을 확인하였다.
특히, 난소암 세포주 A2780-AD에 비해 난소암 줄기세포주 A2780-SP 세포에서 발현이 현저히 증가된 포스파티딜에탄올아민의 발현을 비교하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 난소암 줄기세포주 A2780-SP 세포는 포스파티딜에탄올아민의 발현이 난소암 세포주 A2780-AD보다 3배 이상 증가한 것을 확인하였다.
1-5. 암세포화된 암 줄기세포의 지질 발현 분석
암세포화된 암 줄기세포의 지질 발현을 분석하기 위하여, 난소암 암 줄기세포주 A2780-SP 세포를 암세포 배양 조건으로 배양하여 암세포화시켰다. 상기 암세포화된 난소암 암 줄기세포는 A2780-DIF로 명명하였다. 상기 A2780-DIF 세포 및 난소암 암 줄기세포(A2780-SP)의 지질 발현은 상기 실시예 1-4와 동일한 방법으로 확인하였다. 분석 결과에 기초하여 매트릭스를 작성하였으며, 작성된 매트릭스는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, A2780-SP 세포 및 A2780-DIF 세포는 지질 발현 패턴이 상이한 것을 확인하였다. 또한 A2780-DIF 세포의 지질 발현 패턴은 난소암 세포주 A2780-AD와 일부 차이가 있으나, 유사한 경향을 가지는 것을 확인하였다.
또한 암 줄기세포주인 A2780-SP 세포에 비해 A2780-DIF에서 발현이 증가 또는 감소된 지질을 분석하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 난소암 줄기세포주 A2780-SP 세포에 비해 난소암 세포주 A2780-DIF에서 발현이 감소된 지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE)을 포함한 87종이며, 발현이 증가된 지질은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 다이글리세라이드(diglyceride) 등 84종인 것을 확인하였다.
또한 A2780-DIF 세포 및 A2780-SP 세포의 포스파티딜에탄올아민 발현을 비교하였으며, 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, A2780-DIF 세포는 A2780-SP에 비해 포스파티딜에탄올아민의 발현이 감소한 것을 확인하였다.
실시예 2. 환자 유래 난소암 암 줄기세포 및 암세포화된 환자 유래 난소암 암 줄기세포의 지질 발현 비교
환자로부터 난소암 암 줄기세포를 분리하였으며, EOC-SP로 명명하였다. 상기 EOC-SP 세포를 암세포 배양 조건으로 배양하여 암세포화시켰다. 상기 암세포화된 환자 유래 난소암 암 줄기세포는 EOC-DIF로 명명하였다.
준비된 EOC-SP 세포 및 EOC-DIF 세포는 후술되는 실험에 이용되었다.
2-1. 형태학적 분석
준비된 EOC-SP 세포 및 EOC-DIF 세포의 형태학적 분석을 수행하였다. 구체적으로, 상기 세포들을 각각 3차원 배양한 후 현미경으로 관찰하였다. 형태학적 분석 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, EOC-SP 세포 및 EOC-DIF 세포는 형태학적으로 차이가 있는 것을 확인하였다. 특히, EOC-DIF 세포는 암세포화된 것인바, 암세포와 유사한 형태를 보였다.
2-2. 암 줄기세포 마커 발현 확인
EOC-SP 세포 및 EOC-DIF 세포에서 암 줄기세포의 마커인 알데하이드 탈수소효소의 발현을 확인하였다. 구체적으로, ALDEFOUOR™ 키트(STEMCELL Technologies)를 사용하여, EOC-SP 세포 중 ALDH를 발현하는 세포를 제조사의 매뉴얼에 따라 표지하였다. 그 후 FACS AttuneNxT(ThermoFisher)를 이용하여 ALDH를 발현하는 세포를 측정하였다. EOC-DIF 세포도 동일한 방법으로 ALDH의 발현을 측정하였다. 암 줄기세포 마커를 발현하는 세포를 측정한 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 환자 유래 난소암 암 줄기세포주인 EOC-SP 세포는 ALDH의 발현이 EOC-DIF 세포에 비해 현저히 높은 것을 확인하였다.
2-3. EOC-SP 세포 및 EOC-DIF 세포의 지질 발현 분석
EOC-SP 세포 및 EOC-DIF 세포의 지질 발현을 분석하였다. 구체적으로, 부착세포인 EOC-DIF 세포는 트립신을 처리하여 세포 펠릿을 수집하였다. 부유세포인 EOC-SP 세포는 배양액을 회수한 후 스핀다운(spin down)하여 배지를 제거하여 세포 펠릿을 수집하였다. 수집된 세포는 실시예 1-4의 방법과 같은 방법으로 지질 발현을 분석하였다. 분석 결과에 기초하여 매트릭스를 작성하였으며, 작성된 매트릭스는 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, EOC-SP 세포 및 EOC-DIF 세포는 지질 발현 패턴이 상이한 것을 확인하였다.
EOC-SP 세포에 비해 암세포화 된 환자 유래 난소암 암 줄기세포주인 EOC-DIF 세포에서 발현이 증가 또는 감소된 지질을 분석하였으며, 그 결과는 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, EOC-DIF 세포에 비해 EOC-SP 세포에서 발현이 증가된 지질은 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine)을 포함한 87종이며, 발현이 감소 된 지질은 포스파티딜세린(phosphatidylserine)을 포함한 84종인 것을 확인하였다.
EOC-SP 세포 및 EOC-DIF 세포의 포스파티딜에탄올아민의 발현을 비교하였으며, 그 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 환자 유래 난소암 암 줄기세포인 EOC-SP 세포는 포스파티딜에탄올아민의 발현이 EOC-DIF 세포에 비해 2.47배 높은 것을 확인하였다.
실시예 3. 난소암 암 줄기세포에서 포스파티딜에탄올아민의 노출 여부 분석
3-1. 난소암 세포주 A2780-AD 세포 및 난소암 암 줄기세포주 A2780-SP 세포의 비교
유세포 분석을 통해 난소암 세포주(A2780-AD) 및 난소암 암 줄기세포주(A2780-SP)에서 포스파티딜에탄올아민의 노출 여부를 확인하였다. 구체적으로, 포스파티틸에탄올아민에 특이적으로 결합하는 Duramycin-Cy5 Conjugate 형광 염료와 A2780-AD 세포를 함께 배양한 후 유세포 분석을 수행하였다. 유세포 분석 결과에서 형광은 포스파티딜에탄올아민이 세포막 외부로 노출된 것임을 의미한다. A2780-SP 세포도 위와 동일한 방법으로 유세포 분석을 수행하였다. 유세포 분석 결과는 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 난소암 암 줄기세포주 A2780-SP 세포는 포스파티딜에탄올아민의 발현이 A2780-AD 세포에 비해 높았고, 발현된 포스파티딜에탄올아민은 세포막 외부로 노출된다는 것을 확인하였다.
3-2. 난소암 세포주 SKOV3-AD 세포 및 난소암 암 줄기세포주 SKOV3-SP 세포의 비교
유세포 분석을 통해, 다른 난소암 세포주인 SKOV3-AD 세포 및 이의 암 줄기세포주인 SKOV3-SP 세포에서 포스파티딜에탄올아민의 발현을 실시예 3-1과 동일한 방법으로 분석하였다. 상기 난소암 암 줄기세포주 SKOV3-SP 세포는 난소암 세포주 SKOV3-AD 세포를 3차원 배양한 후 분리한 것이다. 유세포 분석 결과는 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 난소암 암 줄기세포주 SKOV3-SP 세포는 포스파티딜에탄올아민의 발현이 난소암 세포주 SKOV3-AD에 비해 현저히 높았고, 발현된 포스파티딜에탄올아민은 세포막 외부로 노출된다는 것을 확인하였다.
3-3. 환자 유래 난소암 암 줄기세포주 EOC12-SP 및 EOC21SP 세포의 비교
환자 유래 난소암 암 줄기세포주 EOC12-SP 세포 및 EOC21-SP 세포를 준비하였다. 상기 EOC12-SP 세포 및 EOC21-SP 세포에서 포스파티딜에탄올아민의 발현을 실시예 3-1과 동일한 방법으로 분석하였다. 유세포 분석 결과는 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 환자 유래 난소암 암 줄기세포주인 EOC12-SP 세포 및 EOC21-SP 세포는 모두 포스파티딜에탄올아민의 발현 수준이 높으며, 발현된 포스파티딜에탄올아민은 세포막 외부로 노출된다는 것을 확인하였다.
3-4. 인간 배아 유래 신장세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포 및 인간 탯줄 정맥내피세포의 비교
상기 실시예 3-1 내지 3-3의 난소암 암 줄기세포와 비교하기 위하여, 인간 배아 유래 신장세포(HEK293FT), 편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil-derived mesenchymal stem cell, TMSC) 및 인간 탯줄 정맥내피세포(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)에서 유세포 분석을 통해 포스파티딜에탄올아민의 발현을 확인하였다. 상기 유세포 분석은 실시예 3-1과 동일한 방법으로 수행하였으며, 그 결과는 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, TMSC, HEK293FT 및 HUVEC는 포스파티딜에탄올아민의 발현이 매우 적으며, 발현된 포스파티딜에탄올아민은 세포막 외부에 노출된다는 것을 확인하였다.
종합적으로 본 발명자들은 난소암 암 줄기세포에서 포스파티딜에탄올아민의 발현이 난소암 세포주 및 다른 세포주에 비해 현저히 높은 것을 확인하였다. 또한 상기 난소암 암 줄기세포는 발현된 포스파티딜에탄올아민이 세포막 외부로 노출된다는 것을 추가 실험을 통해 확인하였다. 이는 포스파티딜에탄올아민이 암 줄기세포 검출용 바이오 마커로 이용될 수 있음을 의미하는바, 본 발명의 포스파티딜에탄올은 암의 진단, 예후 예측 및 약물 스크리닝 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 암 줄기세포의 표면에서 발현되는 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE)의 발현을 측정하는 제제인 듀라마이신(duramycin) 또는 신나마이신(cinnamycin)을 포함하는, 암 줄기세포 검출을 통한 암 진단용 조성물로,
    상기 암은 난소암(ovarian cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer) 및 대장암(colon cancer)으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인, 조성물.
  6. 삭제
  7. 제5항의 조성물을 포함하는 암 줄기세포 검출을 통한 암 진단 키트로,
    상기 암은 난소암(ovarian cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer) 및 대장암(colon cancer)으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인, 키트.
  8. 생물학적 시료에서 듀라마이신(duramycin) 또는 신나마이신(cinnamycin)을 이용하여, 암 줄기세포 표면에서 발현되는 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE)의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 암 줄기세포 검출을 통한 암 진단에 대한 정보 제공 방법으로,
    상기 암은 난소암(ovarian cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer) 및 대장암(colon cancer)으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인, 방법.
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