JP5781571B2 - キメラ抗体および処置におけるその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、明細書、特許請求の範囲、図面および配列を含む、その出願の開示が放棄声明(ディスクレイマー)なしに本明細書中に参考として詳細に援用される2002年7月15日出願の同時係属の米国仮特許出願第60/396,263号に対する優先権を主張する。
本発明は、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質の生物学、腫瘍血管およびウイルス感染の分野に関する。本発明は、腫瘍脈管構造標的化およびガン処置のため、ウイルスの進入および伝播を阻害するため、およびウイルス感染を処置するための、驚くべき新規な組成物、方法および組み合わせを提供する。本発明はさらに、ガン、ウイルス感染および関連の疾患の処置における使用のためのアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に結合かつ阻害する、多数の好ましい抗体、免疫複合体およびデュラマイシンベースの組成物を提供する。
化学療法剤に抵抗性の腫瘍細胞は、臨床腫瘍学において重大な問題を示す。腫瘍処置における取り組みのための別の主な問題は、「総細胞殺傷(total cell kill)」、すなわち、全てのいわゆる、制御なしに増殖して、治療によって除去され得るあらゆる腫瘍塊を置き換える能力を有する「クローン原性(clonogenic)」悪性細胞を殺傷することが所望されるということである。この分野でのある程度の進歩にかかわらず、なぜヒトのガンの一般的な形態の多くが有効な化学療法介入に抵抗性であるかについての2つの大きな理由が存在する。
本発明は、安全かつ有効な腫瘍血管標的化、抗新脈管形成および腫瘍破壊のための新規な方法および組成物を提供することによって、当該分野の前述のおよび他の要求に取り組む。この方法および組成物はまた驚くべきことに、ウイルス進入および伝播を阻害することにおいて、そしてウイルス感染および疾患を処置するために有効である。本発明は、腫瘍脈管構造における陰イオン性リン脂質の発現および役割、ならびにウイルス進入および伝播におけるアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質の関与に関する驚くべき発見に一部は基づく。本発明はさらにアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に結合する、特に有利な抗体および免疫複合体、ならびにホスファチジルエタノールアミンに結合するペプチドベースの誘導体の新規なクラスを提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
精製された抗体、または抗原結合フラグメント、またはその免疫複合体を含む組成物であって、該抗体がホスファチジルセリンに結合し、かつホスファチジルセリンに対する結合についてモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と効率的に競合する、組成物。
(項目2)
前記抗体がさらに、ホスファチジン酸に結合し、かつホスファチジン酸に対する結合についてモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と効率的に競合する、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記抗体がさらに、ホスファチジルイノシトールに結合し、かつホスファチジルイノシトールに対する結合についてモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と効率的に競合する、項目1に記載の組成物。
(項目4)
前記抗体がさらに、ホスファチジルグリセロールに結合し、かつホスファチジルグリセロールに対する結合についてモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と効率的に競合する、項目1に記載の組成物。
(項目5)
前記抗体がさらに、カルジオリピンに結合し、かつカルジオリピンに対する結合についてモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と効率的に競合する、項目1に記載の組成物。
(項目6)
前記抗体がさらに、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールおよびカルジオリピンに結合し、かつホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールおよびカルジオリピンの各々に対する結合についてモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と効率的に競合する、項目1に記載の組成物。
(項目7)
前記抗体がさらにホスファチジルエタノールアミンに結合する、項目1に記載の組成物。(項目8)
前記抗体がさらに、ホスファチジルエタノールアミンに結合し、かつホスファチジルエタノールアミンに対する結合についてモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と効率的に競合する、項目7に記載の組成物。
(項目9)
前記抗体が、表4に記載されるモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と実質的に同じリン脂質結合プロフィールを有する、項目1に記載の組成物。
(項目10)
前記抗体が、表3に記載されるホスファチジルセリンについてのモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)の親和性と少なくとも等しいホスファチジルセリンについての親和性を有する、項目1に記載の組成物。
(項目11)
前記抗体が、表4に記載されるモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と実質的に同じリン脂質結合プロフィールを有し、表3に記載されるホスファチジルセリンについてのモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)の親和性と少なくとも等しいホスファチジルセリンについての親和性を有する、項目1に記載の組成物。
(項目12)
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目1に記載の組成物。
(項目13)
前記抗体がIgG抗体である、項目1に記載の組成物。
(項目14)
前記抗体が抗体の抗原結合フラグメントである、項目1に記載の組成物。
(項目15)
前記抗体がscFv、Fv、Fab’、Fab、二価抗体、直鎖状抗体または抗体のF(ab’)2抗原結合フラグメントである、項目14に記載の組成物。
(項目16)
前記抗体がCDR、一価フラグメント、ラクダ化(camelize)または単一ドメインの抗体である、項目14に記載の組成物。
(項目17)
前記抗体がヒト、ヒト化もしくは部分的ヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントである、項目1に記載の組成物。
(項目18)
前記抗体が、ヒト抗体フレームワークまたは定常領域に作動可能に連結された該抗体の抗原結合領域を含む、項目17に記載の組成物。
(項目19)
前記抗体がキメラ抗体である、項目1に記載の組成物。
(項目20)
前記抗体が二重特異性抗体である、項目1に記載の組成物。
(項目21)
前記抗体が組み換え抗体である、項目1に記載の組成物。
(項目22)
前記抗体が操作された抗体である、項目1に記載の組成物。
(項目23)
前記抗体が、活性化された内皮細胞を用いて動物を免疫する工程と、ホスファチジルセリンに結合し、かつホスファチジルセリンに対する結合についてモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と効率的に競合する抗体を該免疫された動物から選択する工程とを包含するプロセスによって調製される、項目1に記載の組成物。
(項目24)
前記抗体が、配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列領域を含む少なくとも第一の可変領域を含む、項目1に記載の組成物。
(項目25)
前記抗体がモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)である、項目1に記載の組成物。
(項目26)
前記抗体が少なくとも第一の生物学的因子に作動可能に連結される、項目1〜25のいずれか1項に記載の組成物。
(項目27)
前記抗体が、実質的に不活性なプロドラッグを切断して実質的に活性な薬物を遊離する少なくとも第一の因子に作動可能に連結される、項目26に記載の組成物。
(項目28)
前記抗体が、実質的に不活性なプロドラッグを切断して実質的に活性な薬物を遊離する、アリールスルファターゼ、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、カテプシン、D−アラニルカルボキシペプチダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ノイラミニダーゼ、β−ラクタマーゼ、ペニシリンアミダーゼ、またはシトシンデアミナーゼに作動可能に連結される、項目27に記載の組成物。
(項目29)
前記抗体が、実質的に不活性なリン酸塩プロドラッグを切断して実質的に活性な薬物を遊離する、アルカリホスファターゼに作動可能に連結される、項目27に記載の組成物。
(項目30)
前記抗体が少なくとも第一の治療因子または診断因子に作動可能に連結される、項目26に記載の組成物。
(項目31)
前記抗体が少なくとも第一の治療因子に作動可能に連結される、項目30に記載の組成物。
(項目32)
前記抗体が少なくとも第一の化学療法剤、放射性治療剤、血管新生阻害因子、アポトーシス誘導性因子、ステロイド、抗代謝物、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、抗チューブリン薬、抗生物質、サイトカイン、アルキル化剤または凝固剤に作動可能に連結される、項目31に記載の組成物。
(項目33)
前記抗体が、TNFα、IL−12またはLECに作動可能に連結される、項目32に記載の組成物。
(項目34)
前記抗体が、内皮細胞の増殖または細胞分裂を殺傷または抑制し得る、細胞傷害性剤、細胞増殖抑制剤または抗細胞性剤に作動可能に連結される、項目32に記載の組成物。
(項目35)
前記抗体が植物由来、真菌由来または細菌由来の毒素に作動可能に連結される、項目34に記載の組成物。
(項目36)
前記抗体が、鎖毒素、リボソーム不活性化タンパク質、αサルシン、ゲロニン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、エピポドフィロトキシン、ジフテリア毒素またはPseudomonas外毒素に作動可能に連結される、項目35に記載の組成物。
(項目37)
前記抗体が、リシンA鎖または脱グリコシル化リシンA鎖に作動可能に連結される、項目36に記載の組成物。
(項目38)
前記抗体が、血管新生阻害因子に作動可能に連結される、項目32に記載の組成物。
(項目39)
前記抗体が、抗チューブリン薬に作動可能に連結される、項目32に記載の組成物。
(項目40)
前記抗体が、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデスシンおよびコンブレタスタチンからなる群より選択される抗チューブリン薬に作動可能に連結される、項目39に記載の組成物。
(項目41)
前記抗体が、凝固物に作動可能に連結される、項目32に記載の組成物。
(項目42)
前記抗体が、診断剤、画像化剤または検出可能因子に作動可能に連結される、項目30に記載の組成物。
(項目43)
前記抗体が、X線検出可能化合物、放射性イオンまたは核磁気スピン共鳴同位体に作動可能に連結される、項目42に記載の組成物。
(項目44)
前記抗体が、
(a)X線検出可能化合物ビスマス(III)、金(III)、ランタン(III)または鉛(II);
(b)検出可能な放射性イオン銅67、ガリウム67、ガリウム68、インジウム111、インジウム113、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、水銀197、水銀203、レニウム186、レニウム188、ルビジウム97、ルビジウム103、テクネチウム99mもしくはイットリウム90;または
(c)検出可能な核磁気スピン共鳴同位体コバルト(II)、銅(II)、クロム(III)、ジスプロシウム(III)、エルビウム(III)、ガドリニウム(III)、ホルミウム(III)、鉄(II)、鉄(III)、マンガン(II)、ネオジム(III)、ニッケル(II)、サマリウム(III)、テルビウム(III)、バナジウム(II)またはイッテルビウム(III);
に作動可能に連結される、項目43に記載の組成物。
(項目45)
前記抗体が、ビオチン、アビジンまたは色素生産性基質との接触の際に着色された生成物を生成する酵素に作動可能に連結される、項目42に記載の組成物。
(項目46)
前記抗体が、少なくとも第一の抗ウイルス因子に作動可能に連結される、項目31に記載の組成物。
(項目47)
前記抗体が、表Gの抗ウイルス因子に作動可能に連結される、項目46に記載の組成物。(項目48)
前記抗体が、シドフォビルまたはAZTに作動可能に連結される、項目46に記載の組成物。
(項目49)
前記生物学的因子をコードするDNAセグメントに作動可能に連結された抗体をコードするDNAセグメントを、同じリーディングフレーム中に含む組み換えベクターを発現することによって調製された融合タンパク質として、生物学的因子に該抗体が作動可能に連結される、項目26に記載の組成物。
(項目50)
前記抗体が、生物学的に遊離可能な結合または選択的に切断可能なリンカーを介して、前記生物学的因子に作動可能に連結される、項目26に記載の組成物。
(項目51)
前記組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む薬学的に受容可能な組成物である、項目1に記載の組成物。
(項目52)
前記薬学的に受容可能な組成物が非経口投与のために処方される、項目51に記載の組成物。
(項目53)
前記薬学的に受容可能な組成物がリポソーム処方物である、項目51に記載の組成物。
(項目54)
前記薬学的に受容可能な組成物がステルス化またはPEG化されたリポソーム処方物である、項目53に記載の組成物。
(項目55)
前記薬学的に受容可能な組成物が前記抗体でコーティングされる、ステルス化またはPEG化されたリポソーム処方物である、項目53に記載の組成物。
(項目56)
前記組成物が第二の生物学的因子をさらに含む、項目1に記載の組成物。
(項目57)
前記組成物が第二の治療因子をさらに含む、項目56に記載の組成物。
(項目58)
前記第二の治療因子が血管新生阻害因子である、項目57に記載の組成物。
(項目59)
前記第二の治療因子が抗ガン剤である、項目57に記載の組成物。
(項目60)
前記抗ガン剤が、DNA複製、有糸分裂または染色体分離を干渉する化合物である、項目59に記載の組成物。
(項目61)
前記抗ガン剤が、化学療法剤、放射性治療剤、血管新生阻害因子、アポトーシス誘導性因子、抗チューブリン薬または腫瘍標的化化学療法剤、放射性治療剤、血管新生阻害因子、アポトーシス誘導性因子または抗チューブリン薬である、項目59に記載の組成物。
(項目62)
前記抗ガン剤が、シトシンアラビノシド、メトトレキセート、アミノプテリン、デメコルチン、ミトラマイシン、クロラムブシル、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ベラパミル、タモキシフェン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、5−フルオロウラシル(5FU)、カンプトセシン、アクチノマイシン−D、マイトマイシンC、シスプラチン、ブレオマイシン、コンブレタスタチンまたはシクロフォスファミドである、項目61に記載の組成物。
(項目63)
前記抗ガン剤がドセタキセルである、項目61に記載の組成物。
(項目64)
前記抗ガン剤が抗チューブリン薬、腫瘍標的化抗チューブリン薬またはチューブリン活性を干渉する化合物である、項目61に記載の組成物。
(項目65)
前記抗ガン剤が、腫瘍細胞もしくは腫瘍間質の接近可能な成分に、または腫瘍脈管構造もしくは腫瘍内脈管構造の表面発現された、表面接近可能な、表面局在した、サイトカイン誘導性もしくは凝固剤誘導性の成分に結合する標的化領域に作動可能に連結された治療因子を含む標的化因子−治療剤構築物である、項目61に記載の組成物。
(項目66)
前記抗ガン剤がリポソーム処方物内に分散される、項目59に記載の組成物。
(項目67)
前記抗ガン剤が、前記抗体でコーティングされているステルス化またはPEG化リポソーム処方物内に分散される、項目59に記載の組成物。
(項目68)
前記第二の治療剤が抗ウイルス因子である、項目57に記載の組成物。
(項目69)
前記抗ウイルス因子が表Gから選択される抗ウイルス因子である、項目68に記載の組成物。
(項目70)
前記抗ウイルス因子がシドフォビルまたはAZTである、項目68に記載の組成物。
(項目71)
細胞不浸透性基に作動可能に連結されたデュラマイシンペプチドを含む、実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体を含む組成物。
(項目72)
前記デュラマイシンペプチドが、生理学的pHで正の電荷を有する基に作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。
(項目73)
前記デュラマイシンペプチドが、生理学的pHで負の電荷を有する基に作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。
(項目74)
前記デュラマイシンペプチドが、ビオチンに、または硫酸塩、スルホン酸塩、ホスホン酸塩、カルボキシル、フェノール、四級アンモニウムイオンもしくはアミン基に作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。
(項目75)
前記デュラマイシンペプチドが、糖、オリゴ糖またはポリ多糖、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたはポリアルコール基に作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。(項目76)
前記デュラマイシンペプチドがタンパク質に作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。
(項目77)
前記デュラマイシンペプチドが、不活性なキャリアタンパク質に作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。
(項目78)
ニュートラビジン、ストレプトアビジン、アルブミンまたは不活性な免疫グロブリンキャリアタンパク質に、デュラマイシンペプチドが作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。
(項目79)
腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍間質に結合する、標的化タンパク質、抗体、またはその抗原結合領域に、前記デュラマイシンペプチドが作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。
(項目80)
前記実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体が、図13A〜図13Oのいずれか1つに記載される実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体である、項目71に記載の組成物。
(項目81)
少なくとも第一の抗ウイルス因子に作動可能に連結されたデュラマイシンペプチドを含む組成物。
(項目82)
前記デュラマイシンペプチドが、表Gから選択された少なくとも第一の抗ウイルス因子に作動可能に連結される、項目81に記載の組成物。
(項目83)
前記デュラマイシンペプチドがシドフォビルまたはAZTに作動可能に連結される、項目81に記載の組成物。
(項目84)
治療における使用のための、項目1〜83のいずれか1項に記載の組成物。
(項目85)
血管形成を阻害することにおける使用のための、項目1〜84のいずれか1項に記載の組成物。
(項目86)
ガンを処置するのにおける使用のための、項目1〜85のいずれか1項に記載の組成物。(項目87)
ウイルス感染を処置するのにおける使用のための、項目1〜86のいずれか1項に記載の組成物。
(項目88)
血管形成を阻害することによって疾患を処置するための医薬の製造における項目1〜87のいずれか1項に記載の組成物の使用。
(項目89)
黄斑変性症、加齢性黄斑変性症、関節炎、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、甲状腺過形成、グレーブス病、血管腫、血管新生緑内障または乾癬を処置するための医薬の製造における項目1〜88のいずれか1項に記載の組成物の使用。
(項目90)
ガンを処置するための医薬の製造における項目1〜89のいずれか1項に記載の組成物の使用。
(項目91)
ウイルス感染を処置するための医薬の製造における項目1〜90のいずれか1項に記載の組成物の使用。
(項目92)
表Jに記載のウイルス病を処置するための医薬の製造における項目1〜91のいずれか1項に記載の組成物の使用。
(項目93)
CMV、RSVまたはアレナウイルスの感染を処置するための医薬の製造における項目1〜92のいずれか1項に記載の組成物の使用。
第一の全体的な実施形態において、本発明は、陰イオン性リン脂質、例えば、ホスファチジルリノシトール(PI)、ホスファチジン酸(PA)およびホスファチジルグリセロール(PG)(およびホスファチジルセリン、PS)が腫瘍脈管構造の接近可能でかつ安定な標的可能マーカーであるという予期せぬ発見に基いた腫瘍血管標的化、腫瘍画像化および処置のための新規な方法を提供する。PA、PI、PGおよび他の陰イオン性リン脂質成分に対する抗体が固形腫瘍の脈管構造に特異的に局在するという予期せぬ発見から、この実施形態が得られた。
本明細書に提供される新規な免疫化技術およびスクリーニング技術に加えて、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に結合して、かつ多数の有利な特性を有する抗体を、モノクローナル抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2または3G4を用いて競合アッセイおよび/または機能的アッセイによって同定することができる。現在では、1B12、3B10、9D2および3G4抗体が好ましい。なぜなら、これらの抗体はリン脂質結合のために血清を要さないからである。モノクローナル抗体9D2および3G4がさらに好ましく、モノクローナル抗体3G4(ATCC 4545)が現在最も好ましい。前述の抗体のいずれか、好ましくは3G4と競合するさらなる抗体を特定するために、好ましいアッセイは、現在のところELISAベースの競合アッセイであり、その多数を本明細書に記載しており、その作用する実施例を開示している。
derivatives)」は、少なくとも第一のPE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンを含むが、これらは、好ましくはPE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンを改変して、実質的に細胞不透過性または実質的に非細孔形成のPE結合構築物を形成することによって、非特異的な毒性を実質的に防止するように改変されている。
探究された特性を有する抗体の生成において十分に機能するように開発された特定の方法が、本明細書の実施例IVにおいて記載されて、添付の未決のクレーム中に具体化されている。これらの方法によって、モノクローナル抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2および3G4、特に、3G4(ATCC4545)によって例示されるような本発明の有利な抗体の生成が可能になった。
(a)候補の抗体産生細胞を調製する工程;および
(b)この候補の抗体産生細胞から、モノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と実質的に交差反応するかまたはそれと競合する抗体を選択する工程、
を包含する。
(a)免疫学的に有効な量の免疫原性アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質を含有する組成物の少なくとも1回の用量および必要に応じて2回以上の用量を動物に投与することによってこの動物を免疫する工程と;
(b)この免疫された動物から適切な抗体産生細胞、例えば、モノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と実質的に交差反応するか、または、競合する抗体を産生する抗体産生細胞を獲得する工程、
を包含する。
(a)適切な抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体産生細胞と不死細胞とを融合して、本発明に従うモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを調製する工程;および
(b)ハイブリドーマから本発明に従う適切な抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体を獲得する工程、
を包含する調製的プロセスにおいて用いられ得る。
(a)免疫学的に有効な量の免疫原性アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質を含む組成物、好ましくは活性化された内皮細胞を含む組成物の少なくとも1回の用量および必要に応じて2回以上の用量を動物に投与することによって動物を免疫する工程;
(b)この免疫された動物からモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの収集物を調製する工程;
(c)本発明による少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質モノクローナル抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と実質的に交差反応するかまたは競合する抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体を産生する、少なくとも第一のハイブリドーマをこの収集物から選択する工程;および
(d)少なくとも第一の抗体産生ハイブリドーマを培養して、少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質モノクローナル抗体を提供する工程と;そして好ましくは
(e)この培養された少なくとも第一のハイブリドーマから少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質モノクローナル抗体を獲得する工程、
を含む方法を包含する。
(a)アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質サンプル、好ましくはPSサンプルと、モノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)および候補抗体の有効量とを接触させる工程;および
(b)この候補抗体が、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSサンプルに対する3G4抗体の結合を実質的に低下させる能力を決定する工程であって;ここでこの候補抗体のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSサンプルに対する3G4抗体の結合を実質的に低下させる能力が、モノクローナル抗体 3G4(ATCC PTA 4545)と実質的に同じエピトープに結合する抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体の指標である、工程、
を包含し得る。
(a)第一のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質サンプル、好ましくはPSと、有効な結合量のモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)とを接触させる工程、およびアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSに対して結合する3G4の量を決定する工程;
(b)第二のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質サンプル、好ましくはPSと、有効な結合量のモノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)とを有効な競合量の候補抗体と組み合わせて接触させる工程、およびこの候補抗体の存在下で、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSに対して結合する3G4の量を決定する工程;および
(c)アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSに対して結合する3G4の量を、好ましくは少なくとも約80%まで低下させる候補抗体を選択する工程によって、モノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と実質的に同じエピトープに結合する抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体を同定する工程、
を包含してもよい。
(a)少なくとも第一の適切な抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体をコードする核酸分子またはセグメントを、適切な抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体産生細胞、好ましくはハイブリドーマから得る工程;および
(b)組み換え宿主細胞において核酸分子またはセグメントを発現して、本発明による組み換え抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質モノクローナル抗体を得る工程
のように、抗体産生細胞を用いる工程を含む方法が挙げられる。
(a)免疫学的に有効な量の免疫原性アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質を含む組成物、好ましくは活性化された内皮細胞を含む組成物の少なくとも1つの用量および必要に応じて2つ以上の用量を動物に投与する工程によって動物を免疫する工程;
(b)この免疫された動物の抗体産生細胞から、好ましくは脾臓から単離されたRNAを発現する組合せの免疫グロブリンファージミドライブラリーを調製する工程;
(c)少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体3G4(ATCC PTA 4545)と実質的に交差反応するかまたは競合する抗体を発現する少なくとも第一のクローンをこのファージミドライブラリーから選択する工程;
(d)抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体をコードする核酸を、少なくとも第一の選択されたクローンから獲得して、組み換え宿主細胞においてこの核酸を発現して、少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体を提供する工程;および、好ましくは
(e)少なくとも第一の選択されたクローンから得られた核酸によって発現される少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体を獲得する工程、を包含する。
本発明はさらに、実質的に細胞不透過性のPE結合構築物を形成するように改変されている少なくとも第一のPE結合ペプチドを含む、実質的に細胞不透過性のホスファチジルエタノールアミン(PE)結合ペプチド構築物および誘導体を提供する。
a time sequential)」とは、本明細書において用いる場合、少なくとも第二の抗ガン剤が、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、3G4に基づく治療剤または実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体の投与とは別の時点で動物または患者に投与されるように「ずらされた(staggered)」ことを意味する。2つの因子は、2つの因子がそのそれぞれの治療効果を発揮することを可能にするように効率的に離れた時点で投与され、すなわち、それらは、「生物学的に有効な時間間隔で」投与される。少なくとも第二の抗ガン剤は、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、3G4に基づく治療剤または実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体の投与前の生物学的に有効な時点で投与されてもよく、あるいはその治療剤投与後の生物学的に有効な時点でこの動物または患者に投与されてもよい。
(a)腫瘍を有する動物または患者に対して、腫瘍結合剤または抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4に基づく抗体に作動可能に連結された診断剤を含む、診断上最小量の少なくとも第一の検出可能に標識された腫瘍結合因子、好ましくは抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4に基づく抗体構築物を投与して、それによって腫瘍の検出可能な画像を形成することによって、腫瘍の画像を形成する工程;および
(b)次に、同じ動物または患者に対して、少なくとも第一の裸の抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4抗体またはこのような抗体を用いる治療剤−抗体構築物の治療上最適の量を投与して、これによって抗腫瘍効果を生じる工程、によって実行され得る。
(a)検出可能に標識された腫瘍結合因子、好ましくは抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4に基づく抗体構築物の診断上有効な量を含む第一の薬学的組成物であって、この腫瘍結合因子または抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4に基づく抗体に作動可能に連結された検出可能な因子を含む組成物;および
(b)治療上有効な量の少なくとも1つの裸の抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4抗体またはこのような抗体を用いる治療剤−抗体構築物を含む第二の薬学的組成物、
を含む、画像および処置処方物または医薬が提供される。
エアロゾルを用いて達成され得る場合、肺への送達が好ましい。しかし、治療剤が腫瘍またはウイルス感染部位へ局在することを可能にする投与の任意の経路が採用される。従って、他の適切な送達の経路としては、経口、直腸、経鼻、局所および膣が挙げられる。参考として本明細書に詳細に援用される米国特許第5,753,230号における他の免疫学的因子について記載されるように、関節炎の処置のための使用および方法、例えば、滑膜内投与が使用され得る。眼に関連する条件については、眼科の処方物および投与を企図する。
本明細書の図面の部分は、本発明特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書において提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。本特許の米国出願は、少なくとも1つのカラー図面を含む。このカラー図面を含む本特許のコピーは、必要な料金の要求および支払いに応じて特許商標庁から提供される。
固体腫瘍およびガン腫は、ヒトにおける全てのガンの90%より多くに相当する。モノクローナル抗体および免疫毒素の使用は、リンパ腫および白血病の治療において検討されている(Vitettaら,1991)が、これらの因子は、ガン腫および他の固体腫瘍に対する臨床試験においては失望すべきことに有効ではなかった(AbramsおよびOldham,1985)。抗体に基づく処置が有効でないことについての主な理由は、高分子は固体腫瘍に容易に輸送されないということである。一旦、腫瘍塊内になっても、これらの分子は、腫瘍細胞、線維性間質、間質性圧力勾配および結合部位障壁の間の緊密な結合の存在に一様に起因して分布することができない(Denekamp,1990;Dvorakら,1991)。
本発明者らは、抗VCAM−1コアグリガンドが、心臓および肺における血管上で構成的に発現されるVCAM−1に対して結合するが、その血管において血栓は生じない能力の背景の機構を理解しようと努めた。心臓および肺における腫瘍環境のプロトロンビン性質および任意の線維素溶解性素因と一般的に結び付いた、この実験的な観察については多くの科学的な可能性がある。
米国特許第6,406,693号は、アミノリン脂質であるホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンが、異なる細胞における原形質膜二重層の内面に正常に隔離されること(Gaffetら、1995;Julienら、1995)、ならびにこのリン脂質隔離が非対称な二重層貫通を生み出すことを説明する。膜非対称性の存在は何度か考察されているが、その存在の理由ならびにその生成および制御のための機構についての理由は、特に血小板以外の細胞については、十分には理解されていない(WilliamsonおよびSchlegel,1994)。
本発明は、腫瘍脈管構造のマーカーの新しいカテゴリーである陰イオン性リン脂質を同定するので、1つ以上の陰イオン性リン脂質に結合する、裸の抗体および免疫複合体を、必要に応じてアミノリン脂質と組み合わせて、腫瘍診断および腫瘍処置において、ここで用いてもよい。
抗体を調製および特徴付けるための手段は、当該分野において周知である。(例えば、Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory、1988を参照のこと;本明細書中で参考として援用される)。ポリクローナル抗血清を調製するために、動物を免疫原性陰イオン性リン脂質および/またはアミノリン脂質(本明細書中で教示されるように、H2O2および他の薬剤で処理された細胞を含む)を含む組成物で免疫し、そして抗血清をこの免疫した動物から収集する。広範な動物種が、抗血清の生成のために使用され得る。代表的に、抗抗血清の生成のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはヤギである。ウサギの比較的大容量の血液が理由で、ウサギは、ポリクローナル抗体の産生のために好ましい選択である。
モノクローナル抗体(MAb)を産生するための種々の方法がまた、現在当該分野において十分に周知である。最も標準的なモノクローナル抗体の産生技術は、一般的に、ポリクローナル抗体を調製するための技術と同じ系に沿って開始する(Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1988;本明細書中で参考として援用される)。ポリクローナル抗体応答は、免疫原性陰イオン性リン脂質および/またはアミノリン脂質組成物を用いて動物を免疫することによって開始され、そして所望の力価レベルが得られる時点で、その免疫した動物を用いてMAbを産生し得る。好ましくは、本明細書中に開示される特定のスクリーニングおよび選択技術が、求められる後の特性を有する抗体を選択するために使用される。
本発明は、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に対して結合する「第二世代」の抗体を提供する。この抗体は、特性が改善されており、そして/または先行技術における抗体と関連する欠点を被らない。一群のこのような抗体が本明細書に開示されており、そのうちモノクローナル抗体9D2および3G4が現在好ましく、3G4(ATCC 4545)抗体が特に好ましい。本発明はまた、特定の免疫技術およびスクリーニングの技術を提供し、これによって、有利な特性を有し、かつ/または欠点が少ない、「〜様(like)」抗体または「競合(competing)」抗体を生成することが可能になる。
本発明の第二世代の抗体は、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に結合するが、このようなリン脂質に対する抗体に通常は関連する病原性の特性は有さない。これは、本発明者らによって開発された新規な免疫技術およびスクリーニングの技術によって部分的には可能になった。
抗体は、可変領域および定常領域から構成される。抗体に関して本明細書において用いる場合、「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列が広範に異なることを意味し、そしてその特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合および特異性において用いられる。しかし、この可変性は、抗体の可変ドメインを通じて均一には分散されない。これは、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方において、「超可変領域」と名付けられた3つのセグメントに(以下に考察されるラクダ化(camelized)抗体以外は)集中される。
4545)抗体)の抗原結合フラグメントはまた、安定性の向上を得ながら、最小化され得る。これは、免疫グロブリンVHドメインおよびVH様ドメインに基づいて単一ドメインの結合タンパク質を調製することによって達成できる(本明細書において参考として援用される、Nuttallら、2000)。
本発明の抗体のさらなる例は、「ラクダ化(camelized)」抗体である。ラクダおよびラマ(Camelidae、ラクダ科)由来の抗体としては、軽鎖を欠き、従って重鎖のみによって形成される、特有の種類の抗体が挙げられる。これらは、「ラクダ化抗体(camelized)」と命名されている。このような抗体の抗原結合部位は、VHH(VHH)と呼ばれる単一のドメインである。
従って、本発明のさらなる局面は、抗体の重鎖および軽鎖(例えば9D2および3G4、そして好ましくは3G4(ATCC 4545)の重鎖および軽鎖)のCDR領域をコードする単離されたDNAセグメントおよび組み換えベクター、ならびに、DNA技術の適用を通じて、このようなCDR領域を発現する組み換え宿主細胞およびファージを作製および使用することに関する。
(E1.ファージミドライブラリー由来の抗体)
組換え技術は、今や、一定範囲の抗体をコードする組換え遺伝子に由来する所望の特異性を有する抗体の調製を可能にしている(Van Dijkら、1989;本明細書中に参考として援用される)。特定の組換え技術は、免疫した動物の脾臓から単離されたRNAから調製されるコンビナトリアル免疫グロブリンファージ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングによる抗体遺伝子の単離を包含する(Morrisonら、1986;WinterおよびMilstein、1991;Barbasら、1992;各々が本明細書中に参考として援用される)。
リン脂質に対する抗体は、ヒト集団において存在する。しかし、これらの抗体は、代表的には、疾患と関連し、本発明におけるそれらの使用は、好ましくは、避けられるべきである。しかし、健常な被験体由来のヒトリンパ球は、本発明における使用のための抗体を作製するための開始物質として適切であるとして使用され得る。
組換え技術は、今や抗体の調製のために利用可能である。上記に開示される組換え免疫グロブリンファージ発現ライブラリーに加えて、別の分子クローニングアプローチは、抗体をヒト抗体ライブラリーを含有するトランスジェニックマウスから調製することである。このような技術は、米国特許第5,545,807号に記載され、これは、本明細書に参考として援用される。
一般に、ヒト抗体は、ヒト治療における使用に少なくとも3つの可能な利点を有する。第1に、そのエフェクター部分はヒトであるので、例えば、補体依存性細胞傷害性(CDC)または抗体依存性細胞傷害性(ADCC)によって標的細胞をより効率的に破壊するために、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用し得る。第2に、ヒト免疫系は、異物として抗体を認識しない。第3に、ヒト循環中の半減期は、天然に存在するヒト抗体と類似であり、より少なくかつより少ない用量を与えることを可能にする。
部位特異的変異誘発は、基礎となるDNAの特異的な変異誘発を通して、個々の抗体の調製において有用な技術である。この技術はさらに、ヒト化しようとしなかろうと、DNA内に1以上のヌクレオチド配列の変化を導入することによって、1以上の前述の考慮を援用して、配列改変体を調製および試験するすばやい能力を提供する。
元々の陰イオン性リン脂質またはアミノリン脂質に対する抗体の供給源とは無関係に、インタクトな抗体、抗体マルチマー、または抗体の種々の機能的な抗原結合領域のいずれか1つは、本発明において使用され得る。例示的な機能領域は、抗体のscFv、Fv、Fab’、FabおよびF(ab’)2フラグメントを含む。このような構築物を調製するための技術は、当業者に周知であり、そして本明細書中にてさらに例示される。
本発明者らは、以前に、腫瘍脈管構造を標的化する際に使用するためのアミノリン脂質に結合するある範囲の免疫複合体を開発した(米国特許第6,312,694号、本明細書中において具体的に援用される)。これらの因子は、腫瘍および腫瘍内脈管構造に結合した治療剤を送達するために、アミノリン脂質結合タンパク質(例えば、アネキシンおよびキニノゲン)、およびアミノリン脂質に対する抗体(例えば、PSおよびPE)を使用する。本発明は、ここで、改善された特性を有する選択された抗PS抗体(例えば、3G4(ATCC 4545)および9D2)を提供し、これらおよび競合する抗体は、ここでまた、免疫結合体の抗体部分として使用され得る。
特定の適用のために、治療剤は、内皮細胞の増殖または細胞分裂を消失または抑制する能力を有する、細胞傷害性薬剤または薬理学的薬剤、特に細胞傷害性薬剤、細胞分裂抑制剤か、そうでなければ抗細胞性薬剤(特に、腫瘍内皮細胞または腫瘍細胞に対する)である。一般に、本発明のこれらの局面は、陰イオン性リン脂質(好ましくは、9D2ベースの抗体または3G4ベースの抗体)に結合されて、そして標的化される内皮に活性な形態で送達され得る任意の薬理学的薬剤の使用を企図する。
サイトカインおよびケモカインは、本発明の抗体に連結するための因子の特定の例である。ある範囲のサイトカインが使用され得、これには、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、IL−8、IL−9、IL−11、IL−13、TGF−β、M−CSF、G−CSF、TNFβ、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、IFN−α、IFN−βが挙げられる。より好ましいサイトカインとしては、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−6、IL−10、GM−CSF、IFNγ、単球化学誘引物質タンパク質−1(MCP−1)、血小板由来増殖因子−BB(PDGF−BB)、およびC−反応性タンパク質(CRP)などが挙げられる。特に好ましい例は、TNFα、TNFα誘導因子およびIL−12である。
陰イオン性リン脂質に対する抗体、またはアミノリン脂質、または本発明の好ましい9D2抗体および3G4抗体(ATCC−4545)に基づく第2世代の抗体は、コアグリガンドを形成するために、凝固を直接的または間接的に刺激し得る成分に連結され得る。米国特許第6,093,399号、同第6,004,555号、同第5,877,289号、および同第6,036,955号が、コアグリガンドを形成するために、抗体と凝固剤の作動可能な会合をさらに記載する目的で、本明細書中において具体的に援用される。
一連の薬物は、チューブリン活性との干渉を介してその効果を行使する。チューブリンの機能は、有糸分裂および細胞の生存能力に不可欠であるので、特定の「抗チューブリン薬」は、強力な化学療法剤である。いくつかの周知であってかつ本発明とともに使用するための現在好ましい抗チューブリン薬は、コルヒチン;タキサン(例えば、タキソール);ビンカアルカロイド類(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンデスチン);およびコンブレタスタチン(combretastatin)である。他の適切な抗チューブリン薬は、サイトカラシン類(B、J、Eを含む)、ドラスタチン(dolastatin)、オーリスタチン(auristatin)PE、パクリタキセル、ウスチロキシン(ustiloxin)D、リゾキシン(rhizoxin)、1069C85、コルセミド(colcemid)、アルベンダゾール、アザトキシン(azatoxin)およびノコダゾールである。
抗脈管形成剤は、本発明の抗体およびペプチドへの結合に有用である。多くの抗癌剤が、それらの作用の機構の一部として、抗脈管形成効果を有する。併用療法で使用するために記載されるこのような任意の1つ以上の薬剤(表Eに含まれる)がまた、本明細書中に記載されるように、本発明の抗体に結合体化され得る。特定の他の薬剤が、作用の一次的な機構として、抗脈管形成効果を有することが発見されるか、設計されるか、または選択された。このような薬剤の例は、以下に記載され、これらのうちの任意がまた、免疫結合体を調製するために使用され得るか、または本発明の併用療法において別々に使用され得る。
本発明はまた、腫瘍内の任意の細胞(腫瘍細胞および腫瘍脈管内皮細胞を含む)においてアポトーシスを誘発する因子を送達するために使用され得る。多くの抗癌剤は、その作用機構の一部として、アポトーシス誘発効果を有する。併用療法において使用するために記載された任意の1つ以上のこのような薬剤(表Fに含まれる)はまた、本明細書中に記載されるように、本発明の抗体に結合体化され得る。特定の他の薬剤が、一次的な機構として、アポトーシス効果を有することが発見されるか、設計されるか、または選択された。このような因子の例は、以下に記載され、これらのうちの任意がまた、免疫結合体を調製するために使用され得るか、または本発明の併用療法において別々に使用され得る。
陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質(特に、PSおよびPE)は、ウイルス感染細胞において曝露され、本発明の抗体(例えば、9D2および3G4(ATCC4545))抗体はまた、任意の1つ以上の抗ウイルス薬剤に連結され得る。本発明のこれらの局面の元にあるさらなる理由、およびその利点は、PE結合ペプチド、抗ウイルス結合体に関して、以下にさらに詳細に記載される。
抗体およびエフェクターの等価物またはさらなる改良物が、今や、一般には上記に提供される物質を出発点として使用して作製され得る。改変および変化が、このような抗体の構造中になされ得、そしてさらに類似または他の様式の所望の特徴を有する分子を入手し得る。例えば、特定のアミノ酸が、相互作用性結合能(例えば、アミノリン脂質、PSおよびPEへの結合)のかなり大きな損失なしに、タンパク質構造において他のアミノ酸の代わりに置換され得る。これらの考察もまた、毒素、抗脈管形成剤、アポトーシス誘発剤および凝血薬などにあてはまる。
アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に対する抗体(改善された特性を有する選択された抗PS抗体、例えば、9D2および3G4(ATCC4545)を含む)は、「免疫毒素」を調製するための抗細胞剤および細胞傷害剤;「コアグリガンド」を調製するための直接的または間接的のいずれかのコアグリガンド;または抗ウイルス性免疫結合体または「イムノビロシド」を調製するための抗ウイルス剤(例えば、ヌクレオシド)に結合体化され得るか、または結合され得るか、または作動可能に関連し得る。PE結合ペプチド(例えば、デュラマイシン)はまた、ある範囲のPE結合ペプチド誘導体および抗ウイルス性ペプチド結合体を調製するために、不活性なキャリア、標的剤または抗ウイルス剤に結合体化され得るか、または結合され得るか、または作動可能に関連し得る。
上記に提供される一般の情報に加えて、抗体またはPE結合ペプチドは、特定の好ましい生化学架橋剤を使用して、治療剤または他の薬剤に結合体化され得る。架橋試薬は、2つの異なる分子の官能基を共に結ぶ分子架橋を形成するために使用される。段階的な様式にて2つの異なるタンパク質を連結するために、所望されないホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤が、使用され得る。例示的なヘテロ二官能性架橋剤は、表Cにおいて参照される。
任意の結合部分は、血液において合理的な安定性を有し、疾患、例えば、腫瘍部位に標的化する前に、付着した薬剤の実質的な放出を予防することが、好ましいけれども、特定の局面において、生物学的に放出可能な結合および/または選択的に切断可能なスペーサーまたはリンカーの使用が、意図される。「生物学的に放出可能な結合」および「選択的に切断可能なスペーサーまたはリンカー」は、循環において合理的な安定性をなお有する。
二重特異性抗体は、一般的に、1つのアームが、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合し、そして二重特異的抗体が、抗原結合部位とは異なる部位において治療剤に結合する限り、使用され得る。
アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に対する抗体(9D2および3G4(ATCC4545)抗体を含む)および改善された特性を有する他の競合抗体、ならびにPE結合ペプチドはまた、分子生物学技術を使用して融合タンパク質を作製するために使用され得る。任意の融合タンパク質が、任意の抗体、PE結合ペプチドおよび第二の薬剤または治療剤(本明細書中に開示される)ならびに当該分野で公知のものを使用して設計および作製され得る。融合タンパク質技術は、他の改変(例えば、CDR配列の最適化、選択的に切断可能なペプチド配列を介する連結など)を有する融合タンパク質を調製するために容易に適合可能である。
本発明が動物およびヒトの処置レジメンにおいて有意な有用性を有するものの、多くの他の特異的および信頼できる使用(多くのインビトロ実施形態における特定の使用を含む)も有する。これらの使用の特定のものは、抗体、ペプチドおよび免疫結合体の特異的結合特性に関連する。本発明の構築物の各々が、アミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質に結合する少なくとも1つの抗体またはペプチド成分を含む点で、これらは、種々の結合実施形態(有用な結合アッセイを含む)において使用され得る。
本発明の治療剤は、一般に、薬学的組成物として処方される。薬学的組成物は、少なくとも本発明の第1の治療剤(薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体中に、溶解または分散した)の生物学的または治療的有効量を含む。組み合わせ治療もまた意図され、そして同じ型の基礎をなす薬学的組成物を、単一医薬および組み合わせ医薬の両方について使用し得る。
本発明の治療剤は、しばしば、非経口投与(例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮を介する注射のための処方、またはぜん動投与および腫瘍もしくは疾患部位(腔内投与)中への直接滴下を含む他の経路のための処方)のために処方される。抗体、免疫結合体またはペプチド結合体を活性成分として含有する水性組成物の調製は、本明細書の開示を参照すれば、当業者に公知である。代表的には、そのような組成物は、水溶液または懸濁液のいずれかにおいて、注射可能な薬剤として調製され得る;注射前の液体への添加において、溶液または懸濁液を調製するための使用に適切な固体形態もまた調製され得る;そしてその調製物はまた、乳化され得る。
処方物は、種々の投薬形態(例えば、上記の注射可能な溶液の型)において容易に投与されるが、他の薬学的に受容可能な形態(例えば、錠剤、ピル、カプセルまたは経口投与のための他の固体、座剤、腟坐薬、経鼻溶液またはスプレー、エアロゾル、吸入剤、リポソーム形態など)もまた意図される。投与形態の型は、処置される疾患または障害に適合される。
特定の実施形態において、リポソームおよび/またはナノカプセルもまた、治療剤とともに使用され得る。リポソームの処方および使用は、以下に要約されるように、当業者に、一般に公知である。本発明は、抗体、リポソームおよび化学療法剤の特定の組合せ(以下に記載される)を提供する。さらに、リポソーム処方物は、本発明の治療剤のいずれかの慣用的な成分として使用され得る。
眼の多くの疾患(特に、脈管形成成分を有するもの)は、本発明によって処置され得る。例えば、眼の脈管新生疾患、年齢関連黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟成の網膜症、角膜移植拒絶、脈管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ならびに角膜脈管新生または網膜/脈絡膜脈管新生と関連する他の疾患(本明細書中で以下に記載される)。
広範な意味で、局所投与のための処方物は、口(頬側)を介してかつ皮膚を通して送達するための処方物を含む。「局所送達システム」はまた、投与される成分を含む経皮的パッチを含む。皮膚を通す送達は、所望の場合、イオン注入または電気的運搬によってさらに達成され得る。
鼻経路および呼吸器経路を介する局所送達は、種々の状態を処置するため(特に、本発明の抗ウイルス処置方法における使用のため)に意図される。これらの送達経路はまた、薬剤を全身性循環に送達するために適切である。従って、鼻性投与のための適切なキャリアにおける活性成分の処方物は、本発明内に含まれ、例えば、鼻性溶液、スプレー、エアロゾルおよび吸入抗原が挙げられる。キャリアが個体である場合、処方物は、例えば、20〜500ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗散剤が挙げられ、例えば、鼻に近接して維持される散剤のコンテナから鼻経路を通る急速な吸入によって投与される。
本発明はまた、処置方法、組合せ処置方法ならびに/または画像化および処置実施形態において使用するための、本発明の少なくとも1つの第1の治療剤(すなわち、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質およびに結合する、抗体、免疫結合体またはペプチド結合体)を含む診断キットおよび治療キットを提供する。このようなキットは、一般的に、少なくとも第1の適切な容器(または容器手段)、少なくとも1つの治療剤、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合する抗体、免疫結合体またはペプチド結合体の薬学的に受容可能な処方物を含む。キットは、例えば、前臨床的、臨床的および/または獣医学的実施形態での使用のための記載された指示書または電子指示書を備え得る。
本発明はさらに、インビトロおよびインビボでの診断法および画像化法を提供する。このような方法は、診断情報、予後情報および/または画像情報(例えば、脈管形成疾患およびウイルス感染、好ましくは、腫瘍処置および画像化方法に関連する)を生成する際の使用に適用可能である。本発明の方法は、インビトロでの診断試験(例えば、サンプルが非侵襲的に得られ、好ましくは、高スループットアッセイにて試験され得るか、そして/または曖昧および確認における臨床診断が望まれる)を含む。インビボ診断および画像化の分野において、本発明の抗体およびペプチドは、1つ以上の検出可能な薬剤に連結され、そして必要に応じて、処置の前に第1工程として、脈管形成部位または腫瘍の画像を形成するために使用される。
従って、本発明は、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を結合、精製、除去、定量またはさもなければ一般には検出するため(例えば、活性化細胞およびアポトーシス細胞および関連する疾患の診断において使用するため)の、免疫検出法に関する。本発明の抗体(例えば、9D2および3G4(ATCC4545))が、インビボ(下記)にて、単離された組織サンプル、生検またはスワブにおいて、そして/またはホモジナイズされた組織サンプルにおいて、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を検出するために使用され得る。このような免疫検出法は、明らかな診断的有用性を有するが、また、非臨床サンプルに(例えば、抗原サンプルの力価測定などにおいて)も適用を有する。
本発明は、種々のインビボ診断および画像化の実施形態を提供する。本発明の特定の局面は、インビボ診断および画像化について、新規な驚くべき有効な組成物に関する。例えば、本発明の新規な抗PS抗体の任意の1つ以上のパネル(好ましくは、9D2または3G4(ATCC4545)抗体または類似の性質を有する競合する抗体)が、インビトロで検出可能な薬剤に連結されて、本発明の免疫診断結合体を形成する。抗体がこの分野において重要な発展を示しているものの、得られる免疫診断は、現在、アミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質の検出と連結されて、任意の以前に記載された診断実施形態または画像化実施形態において使用され得る。
インビボ診断および画像化に関して、本発明は、さらに、癌治療のための代理マーカーとして使用するための組成物および方法を提供する。このような実施形態は、アミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質に結合する抗体、好ましくは、インビボ検出可能な薬剤に連結された、PS、および最も好ましくは、9D2または3G4(ATCC4545)抗体または競合抗体の使用に関する。
本発明の重要な局面は、悪性疾患、腫瘍および脈管新生化腫瘍の処置に関する。これは、脈管新生が多かれ少なかれ重要である腫瘍、およびプロトロンビン血管を有する腫瘍を含む。良性腫瘍の処置が本発明に含まれ、例えば、聴覚神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫およびBPHが挙げられる。血液の腫瘍(例えば、白血病)および骨髄の種々の急性または慢性の新生物形成疾患の処置もまた包含される。
本発明の処置方法は、患者が示す特定の腫瘍、疾患または障害の処置において一般に使用される任意の他の方法と組み合わされてもよい。詳細な治療アプローチがそれ自体で患者の状態に対して有害であることが知られておらず、そして本発明の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質に基づく処置に有意に反作用しない限り、本発明とのその組み合わせが考えられる。
本明細書において用いる場合、本発明の「一次治療因子(primary therapeutic agents)」は、抗アミノリン脂質もしくは抗陰イオン性リン脂質の抗体、免疫複合体またはPE結合ペプチド誘導体および結合体である。本明細書において用いる場合、「二次治療因子(secondary therapeutic agents)」は、第二の、別個の治療因子または抗ガン剤、すなわち、一次治療因子「以外の(other than)」治療剤または抗ガン剤である。任意の二次治療因子は、本発明の併用療法において用いられ得る。また、二次治療因子または「二次抗ガン剤」は、以下の手引きに従って、相加作用、相加作用より大きい作用および潜在的に相乗的な作用を達成するという観点で選択され得る。
内毒素および解毒された内毒素誘導体は、併用処置において、好ましくは低用量で用いられ得る(本明細書において参考として詳細に援用される、PCT公開第WO03/028840号)。動物での使用のために、詳細にはヒトにおける使用のために好ましい、種々の解毒された内毒素が利用可能である。解毒および精練された内毒素、ならびにそれらの組み合わせは、各々が参考として本明細書において詳細に援用される、米国特許第4,866,034号;同第4,435,386号;同第4,505,899号;同第4,436,727号;同第4,436,728号;同第4,505,900号に記載される。
サイトカイン療法は、組み合わせの治療レジメンのための有効なパートナーであることが証明されている。本発明の組み合わせアプローチにおいて、種々のサイトカインが使用され得る。サイトカインの例としては、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、TGF−β、GM−CSF、M−CSF、G−CSF、TNFα、TNFβ、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN−α、IFN−β、IFN−γが挙げられる。サイトカインは、患者の状態およびサイトカインの相対的な毒性のような、臨床的指標と整合する標準的レジメンに従って投与される。ウテログロビンはまた、転移を防止または阻害するために用いられ得る(米国特許第5,696,092号;参考として本明細書に援用される)。
TNFαおよびTNFαの誘導因子はまた、本発明と組み合わせて用いられ得る。TNFαは、脈管透過性を増大し、従って、腫瘍への抗ガン剤の浸透を促進することにおいて有用である。抗体局在化は、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を標的化する場合には決して問題ではない。なぜなら本発明においては、TNFαの併用使用は、腫瘍への他の化学療法剤および免疫複合体の接近を容易にし得、そして遠くの腫瘍細胞への本発明の抗体の結合を増大さえするからである。
背景にある機構(単数または複数)にかかわらず、種々の化学療法剤が、本明細書に開示される併用処置方法において用いられ得る。併用療法について考えられる化学療法剤としては、例えば、タモキシフェン、タキソール、ビンブラスチン、エトポシド(VP−16)、アドリアマイシン、5−フルオロウラシル(5FU)、カンプトテシン、アクチノマイシン−D、マイトマイシンC、コンブレタスタチン(類)、さらに詳細には、ドセタキセル(タキソテール)、シスプラチン(CDDP)、シクロホスファミド、ドキソルビシン、メトトレキセート、パクリタキセル、およびビンクリスチン、ならびにその誘導体およびプロドラッグが挙げられる。
用語「脈管形成」とは、一般的に組織または器官への新規な脈管の生成をいう。通常の生理学的条件下で、ヒトまたは動物は、特定の制限された状況においてのみ脈管形成を受ける。例えば、脈管形成は、通常、組織治癒、胎児および胚の発生、および黄体、子宮内膜および胎盤の形成において観察される。しかし、新たな証拠として、脈管形成が、例えば、副腎組織、前立腺および卵巣における特定の正常な状態において重要であることが示される。本発明の治療剤(抗脈管形成が、作用の様式だけでない)は、従って、所望のまたは「生理学的」脈管形が、本発明を使用する場合、阻害されない点で、顕著な抗脈管形成治療に対する利点を、有する(例えば、抗体A4.6.1(Brem、1998;Bacaら、1997;Prestaら、1997)。
VEGFは、低酸素および発ガン性変異によって誘導される多機能性サイトカインである。VEGFは、胚形成における脈管ネットワークの発生および維持の最初の刺激物である。これは、強力な浸透性誘導剤、内皮細胞化学走化性剤、内皮生存因子、および内皮細胞増殖因子として機能する。その活性は、正常な胚発生に必要とされる。なぜなら、VEGFの一方または両方の対立遺伝子の標的化された破壊が、胚の死を生じるからである。
本発明の治療剤はまた、好ましくは、腫瘍(腫瘍細胞および腫瘍脈管内皮細胞を含む)内で任意の細胞のアポトーシスを誘導する処置方法と組み合わされる。アポトーシスを誘導する例示的な薬剤は、(免疫結合体とともに)上に列挙される。任意の1つ以上のこのようなアポトーシス誘導剤が、本発明の抗体に連結されること無しに、本発明の併用療法において使用され得る。
本発明はまた、標的タンパク質が腫瘍細胞のマーカー、腫瘍脈管構造または腫瘍支質に向けられる、他の免疫毒素またはコアグリガンドとともに使用され得る。PE結合ペプチドを標的化する際に使用するための本明細書中に記載される標的化剤のいずれかが、これらの実施形態において使用され得る。免疫毒素において、結合される薬剤は、抗細胞剤または細胞傷害剤、サイトカイン、放射線治療剤、抗脈管形成剤、アポトーシス誘導剤および抗チューブリン薬物を含む。コアグリガンドにおいて、結合される薬剤は、コアグリガンドである。米国特許第5,855,866号、同第5,965,132号、同第6,261,535号、同第6,051,230号、同第6,451,312号(免疫毒素)、同第6,093,399号、同第6,004,555号、同第5,877,289号、および同第6,036,955号(コアグリガンド)が、このような構築物を例示するために、本明細書中で具体的に参考として援用される。
本発明の抗体(9D2、3G4(ATCC4545)および類似の抗体)は、プロドラッグと組み合わせて使用され得、ここでこの抗体は、プロドラッグ活性化成分(例えば、抗体に接触した際にのみ、プロドラッグをより活性な形態へ変換するプロドラッグ活性化酵素)と作動可能に付随される。この技術は、一般に「ADEPT」と称され、そして例えば、WO95/13095;WO97/26918、WO97/24143および米国特許第4,975,278号および同第5,568,568号(これらは、各々具体的に本明細書中に参考として援用される)において記載される。
リポソーム処方物は、しばしば、治療剤および薬剤において使用される。しかし、最初の研究においてリポソームの生体分布は、このような処方物が、ヒトにおいて幅広く適用可能でないことを意味する。「ステルス(stealth)またはステルス化」リポソームおよび処方の技術は、このように開発され、これは、リポソームがより長く循環することを可能にする。ステルス化リポソームにおける使用のための好ましい薬剤は、ポリエチレングリコール(PEG)であり、そして得られるリポソームはまた、PEG化リポソームと呼ばれる。
本発明はまた、異常な脈管形成が関与する他の疾患(プロトロンビン血管を有する疾患および障害を含む)の処置において使用され得る。治療機構のみではないが、本発明の抗体、免疫結合体およびペプチドベース治療剤はまた、異常な脈管形成(例えば、種々の疾患および障害に寄与する)を有する動物および患者を処置するために使用され得る。
抗体および免疫複合体に加えて、本発明はさらに、詳細には、腫瘍およびウイルス疾患の処置における、PE結合ペプチド誘導体および種々の用途を提供する。現在好ましいPE結合ペプチド構築物および誘導体は、デュラマイシンと命名されたペプチドに基づくものである。PE結合ペプチドおよびデュラマイシン誘導体の3つの一般的カテゴリーが本発明によって提供されるが、そのうちの2つはこの構築物の標的化部分としてPE結合ペプチドまたはデュラマイシンを使用し、他のもう一方は、主にこの構築物のエフェクター部分としてデュラマイシンなどの因子を用いる。
任意のPE結合ペプチドを本発明のこれらの局面において用いてもよい。例えば、低分子および高分子のキニノーゲンはPEに結合することが公知である。ヒトタンパク質を含む、種々のこのような結合タンパク質についてのタンパク質およびDNAの配列は当該分野で公知であり、そのことからPE結合ペプチドの使用が容易になる。例えば、高分子量および低分子量のキニノーゲンについてのヒトの遺伝子およびタンパク質は、各々が本明細書において参考として詳細に援用される、Kitamuraら(1985)およびKellermannら(1986)に記載される。
細胞不浸透性基に、PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンを結合させることは、ペプチドがクラスターを形成する能力を低下させ、実質的にPE結合ペプチドが正常細胞へ浸透することを妨げ、従って毒性を低下させる。しかし、PE結合特性は、維持されており、その結果、このペプチドは、表面上に露出されたPEを有する異常な細胞または感染した細胞に対して局在化し得る。
PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンは、不活性な細胞不浸透性キャリアに対する結合によって細胞不浸透性にされ得る。PE結合活性が実質的に破壊されない限り、広範な不活性な細胞不浸透性キャリアを、PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンに結合体化して、細胞不浸透性PE結合ペプチドを調製し得る。不活性キャリアは好ましくは、それが動物または患者への投与の際に、なんら重大な望ましくない効果を生じないように、生物学的に適合性であるべきである。
不活性キャリアへの結合ではなく、PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンは、標的因子、詳細には腫瘍細胞、腫瘍または腫瘍内脈管構造または腫瘍間質の成分へ結合する因子への結合によって細胞不浸透にされ得る。標的化因子は、標的組織、好ましくは腫瘍環境へこの構築物を指向し、そして結合されたPE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンは、送達の際に治療効果を発揮する。
complex)」とは本明細書において用いる場合、増殖因子レセプターのようなそのレセプターにリガンドまたは増殖因子が特異的に結合する場合に生成される得られる複合体をいう。
正常な条件下で、PEは、細胞表面には露出されない。しかし、種々の疾患状態において、PEは1つ以上の細胞タイプの細胞表面で露出される。例えば、腫瘍脈管構造内の内皮細胞は、PE陽性になり、HuIgGに結合体化されたデュラマイシンを用いる首尾よい腫瘍処置によって本明細書において示されるように、PE指向された治療剤によって標的され得る。PEはまた、ウイルス感染した細胞の細胞表面で露出され、従ってこれは本発明のPE結合ペプチド誘導体を用いる治療介入のさらなる標的である。実際、本出願は、ビオチンおよびHuIgGに連結されたデュラマイシン誘導体によって例示されるとおり、デュラマイシン誘導体が、インビトロおよびインビボの両方で有効な抗ウイルス剤であることを示す。
本発明はさらに、ウイルス感染を処置するのにおける使用のために、必要に応じて抗ウイルス剤に結合体化された、ある範囲の抗体、免疫複合体およびPE結合ペプチド誘導体を提供する。この処置レジメン、および詳細には用量は一般に、本発明のガン処置局面について上記されたとおりであって、この適応性は本発明全体の利点である。作用の特定の機構(単数または複数)の理解は、本発明の抗ウイルス処置を行なうのに必要ではないが、本明細書の実施例によって支持されるとおり、ウイルス処置の基礎にある特定の理由は以下のとおりである。
表H
脊椎動物のウイルス
けるウイルスの任意の1つ以上が本発明を用いて阻害され得、これによってその得られた感染および疾患が処置され得る。
表J
ヒトにおけるウイルス疾患
(抗VCAM−1−tTFコアグリガンドを用いた腫瘍処置)
本実施例は、腫瘍保有動物に対する腫瘍脈管標的化凝固因子(「コアグリガンド(coaguligand)」)の投与後に生じるインビボにおける腫瘍脈管構造の特異的な凝固、および得られた抗腫瘍効果を示す。このコアグリガンドでは、VCAM−1(血管内皮接着分子−1、VCAM−1)に対する抗体を、腫瘍脈管構造に対して改変型のヒト凝固因子である短縮型組織因子(truncated Tissue Factor)(tTF)を送達するための標的因子として用いる。
腫瘍血管上のホスファチジルコリン発現
心臓および肺におけるVCAM−1陽性脈管構造上の抗VCAM−1・tTFの血栓性効果の欠失を説明するために、正常な血管と腫瘍血管との間の異なるアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質、例えば、PSおよびPEの局在化という本発明者らの発展させた概念を確認した。詳細には、彼らは、正常な組織における内皮細胞が、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質、例えばPSおよびPEを、原形質膜のリン脂質二重相の内面に分離して、ここでPSは血栓性反応に関与することができないが;一方、腫瘍の内皮細胞は、原形質膜の外面に対してアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を転位させ、ここでPSはコアグリガンドの凝固作用を支持し得るという仮説をたてた。細胞表面でのPS発現によって、凝固が可能になる。なぜなら、PS発現によって、膜に対する凝固因子の結合が可能になり、凝固開始複合体のアセンブリが協調されるからである。
両方ともマウスのモノクローナルIgM抗体である、抗PS抗体および抗カルジオリピン抗体を、実施例IVに記載のとおり、Roteら(1993、本明細書において参考として援用される)によって生成して、特徴付けした。3SBの主な反応性はPSとの反応であるが、3SBはまた、正常な細胞における内部小葉部分に緊密にやはり分離される原形質膜の比較的少ない成分である、陰イオン性リン脂質、ホスファチジン酸との反応性も有する。
この免疫組織学研究によって、抗PS抗体は、VCAM−1を欠き得る腫瘍の中央領域の血管を含むほとんどの腫瘍血管に10分以内で局在したことが示された。VCAM−1が陽性であった血管はまたPSについても陽性であった。従って、腫瘍におけるVCAM−1発現血管上ではPSの同時発現が存在する。
アネキシンVはコアグリガンド活性をブロックする。
アネキシンVがコアグリガンドによって誘導される第Xa因子形成に影響を与える能力を、色素生産性アッセイによって決定した。IL−1α刺激したbEnd.3細胞を、抗VCAM−・tTFとともにインキュベートし、そしてサポニンで透過化処理した。アネキシンVを、0.1〜10μg/mlの範囲の濃度で添加し、そして細胞を、希釈したProlexTの添加前に30分間インキュベートした。アネキシンVの存在下または非存在下で生成した第Xa因子の量を、決定した。各処置を2連で行い、そして少なくとも2回繰り返した。
アネキシンVのインビボでコアグリガンド誘導性血栓症を阻害する能力を、L540ホジキン腫保有SCIDマウスにおいて試験した。腫瘍を、上記の実施例IIに記載のようにマウスにおいて増殖させた。1群あたり2匹のマウス(直径0.5cmの腫瘍サイズ)を、以下の試薬のいずれか1つで尾静脈を介して静脈内注射した:a)生理食塩水;b)100gのアネキシンV;c)40μgの抗VCAM−1・tTF;d)100μgのアネキシンV、続いて2時間後に40μgの抗VCAM−1・tTF。
アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に対する抗体の生成
本実施例は、腫瘍血管内皮細胞におけるアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質の転位に対するその観察に照らして、本発明者らによって設計された、そしてアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質の転位に対する抗体の生成において十分に機能するように開発された、免疫プロトコールを記載する。アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質、例えばPSおよびPEと反応性の多数の抗体が得られた。本実施例および以下の実施例において、簡便性のために、PSと反応性の抗体を「抗PS抗体(anti−PS antibody)」と命名してもよいが、特定のこれらの抗体の結合はPSには限定されず、本明細書に示されるような特定の他のアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に拡大される。
さらに強力な免疫原として免疫系にアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を提示するために、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を、アミノリン脂質陽性細胞および陰イオン性リン脂質陽性細胞として処方した。他の膜成分によって囲まれる、膜に挿入されたアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質は、抗体を惹起するためのさらに良好な構成およびクリアランス速度を有する。
陰イオン性リン脂質、例えばPSと反応性の抗体の極度に高い力価を有するマウスを得た(表1)。マウスは、なんら毒性の兆候を示さなかった。この免疫プロトコールは、ラット全体よりもマウスで有効であったが、ラットの免疫は、有効であって、9D2抗体が産生された(以下を参照のこと)。
抗PS IgG抗体生成
免疫した動物由来の脾細胞とミエローマパートナーP3X63AG8.653細胞(ATCC,Rockville,MD)とを融合することによってハイブリドーマを得た。
表2
抗PS抗体のアイソタイプおよび血清依存性
抗体をELISAによってさらに研究して、3SBおよびD11と比較した。本研究で用いた抗PS ELISAは以下のとおり行なう。特別な相違が特定されない限り、これが本出願の研究全体を通じて用いたELISAの形式である。
抗PS抗体の相対的親和性
2変換のために用いたMW:IgM−900kDa、IgG−150kDa、アネキシンV−36kDa
3PSに対するアネキシンVの親和性は、0.1nM〜1nMの範囲である。この表における値は、抗PS抗体についてと同じELISA条件を用いてストレプトアビジン−HRPによって検出された市販のビオチン化アネキシンVの結合に相当する。
抗PS抗体のリン脂質特異性
2>>という記号は、同一の抗体濃度で試験した種々のリン脂質に対する結合における少なくとも10倍の相違を示す。
外面化したホスファチジルセリンは腫瘍血管の全体的なマーカーである。
これらの研究で用いた抗PS抗体は、3SBと命名されたマウスモノクローナルIgM抗体だった(実施例IV、Roteら、1993)。3SBは、主にPSに結合するがまた、PSのような分布を有する比較的わずかな陰イオン性リン脂質であるPAとも反応する。用いた抗CL抗体は、D11と命名されたマウスモノクローナルIgM抗体であった(実施例IV、Roteら、1993)。
膜の内面に対してPSを隔離する能力を腫瘍脈管構造が失う時点を推定するため、140〜1600mm3の容積におよぶL540腫瘍において、抗PS局在化を検査した。
表5
中間および大きいサイズの腫瘍において検出されたPS外面化
†汎内皮Ab Meca 32を用いて血管の総数を決定した。PS陽性およびMeca陽性の血管を腫瘍の1断面あたり4領域でカウントした。同じ群内のPS陽性血管の範囲(%)を示す。
同じ抗PS(3SB)抗体および抗CL(D11)抗体を用いて、腫瘍および正常血管内皮上のPS露出を、さらなる3つの動物腫瘍モデル(全部で6つ)を用いるさらなる研究において試験した:L540ヒトホジキンリンパ腫、NCI H358ヒト非小細胞肺ガン(NSCLC)、HT29ヒト結腸直腸ガン、Colo26マウス結腸ガン、B16マウス黒色腫、および3LLマウス肺腫瘍。
表6
腫瘍血管に対する抗PS抗体の特異的局在化
†非抗原特異的尿細管染色は、抗PSおよび抗CLレシピエントの両方で可視であった。
腫瘍におけるアポトーシスマーカーの発現
†3LL腫瘍の壊死領域に時折存在する血管(100を超える内の1)は、アポトーシスの両方のマーカーを示した。
腫瘍血管内皮細胞上でのPS露出をまた、マウスで増殖しているMDA−MB−231ヒト乳房腫瘍において、および皮下で増殖しているマウスMeth A線維肉腫において検査した。これらの研究において用いた抗体は、実施例IVに記載のように生成された、9D2抗体であって、これは陰イオン性リン脂質と反応性である。
さらなる乳ガンモデルにおいては、腫瘍血管内皮上のPS露出を、マウスで増殖しているMDA−MB−435ヒト乳ガン細胞中で検査した。これらの研究で用いた抗体は、3G4抗体のキメラバージョン(ch3G4)である。3G4抗体生成は実施例IVに記載され、そしてキメラ3G4抗体の生成は、実施例XIXに詳細に記載される。MDA−MB−435モデルにおける腫瘍血管内皮に対するch3G4の局在化は、実施例XIXにさらに詳細に記載されており、図22に示される。
10番目のモデルについて、腫瘍血管内皮に対するPSの露出を、多段階の発現の「RIP−Tag」トランスジェニックマウスモデル(RIP1−Tag 2)において検査した。このトランスジェニックマウスモデルでは、あらゆるマウスが、インスリン産生β細胞におけるSV40 T抗原(Tag)ガン遺伝子の発現の結果として12〜14週齢までに膵臓の島腫瘍を発症する。腫瘍は、過剰増殖性島から多段階で発症して、悪性に進行するには血管形成性の切り替えを要する。マトリックスメタロプロテイナーゼ9が血管形成切り替えを制御する(REF)。
陰イオン性リン脂質を腫瘍血管の表面上に露出させる。
1.材料
Na125Iは、Amersham(Arlington Heights,IL)から入手した。ダルベッコ改変イーグル組織培養培地、およびCa2+およびMg2+を含有するダルベッコPBSをGibcoから入手した(Grand Island,NY)。ウシ胎仔血清をHyclone(Logan,Utah)から入手した。L−α−ホスファチジルセリン、L−α−ホスファチジルコリン、カルジオリピン、L−α−ホスファチジルエタノールアミン、L−α−ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、O−フェニレンジアミン、過酸化水素およびトロンビンをSigma(St.Louis,MO)から入手した。24ウェルの平底プレートをFalcon(Becton DickinsonおよびCo.,Lincoln Park,NJ)から入手した。
l Type I)のインターフェロン(全てのタイプのインターフェロンの代わりになるハイブリッドタンパク質)をPBL Biomedical Laboratories(New Brunswick,NJ)から購入した。組み換えのヒト血管内皮増殖因子121(VEGF)、ヒト血小板由来増殖因子−BB、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−8(IL−8)、インターロイキン−10(IL−10)およびヒト線維芽細胞増殖因子−2(FGF−2)をPeproTech(Rocky Hill,NJ)から購入した。
MECA32、汎マウス内皮細胞抗体は、Dr.E.Butcher(Stanford University,CA)から入手して、免疫組織学的研究のための陽性コントロールとして用いた。この抗体の詳細は公表されている(Leppinkら、1989)。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合体化したウサギ抗ラット免疫グロブリン二次抗体、ラット抗マウス免疫グロブリン二次抗体、ならびにヤギ抗マウス二次抗体および抗ラット二次抗体は、Daco(Carpinteria,CA)またはJackson Immunoreserarch Labs(West Grove,PA)のいずれかから購入した。
末期の疾患を有する患者由来のL540Cyホジキンリンパ腫細胞は、V.Diehl教授(Koeln,Germany)から提供された。NCI−H358ヒト非小細胞肺ガンは、Adi Gazdar博士(Southwestern Medical Center,Dallas,TX)から提供された。Meth Aマウス線維肉腫およびMDA−MB−231ヒト乳ガンは、American Type Cell Collection(Rockville,MD)から入手した。マウス脳内皮腫株bEnd.3は、Werner Risau教授(Max Plank Institution,Munich,Germany)から提供されて、10%FBSを有するDMEM中で維持した。成体ウシ大動脈内皮(ABAE)細胞は、Clonetics(San Diego,CA;Walkerville,MD)から購入した。ABAE細胞は、10%血清および2ng/mlのbFGFを含有するDMEM中で維持した。
bEnd.3,ABAE細胞およびL540Cyリンパ腫以外の全ての腫瘍細胞を、10%ウシ胎仔血清、2mM L−グルタミン、2単位/mlペニシリンGおよび2μg/mlストレプトマイシンを補充したDMEM中で維持した。L540Cy細胞は、同じ添加物を含むRPMI 1640中で維持した。細胞を週に1回継代培養した。0.2% EDTAを含有するPBSにおいて0.125%トリプシンを用いてbENd.3細胞のトリプシン処理を行なった。インビトロ研究については、24ウェルプレートにおいて1mlの培養培地に10×103細胞/mlの密度で内皮細胞を播種して、アッセイでの使用の前に48〜96時間インキュベートした。各々の研究の24時間前に培地を再生した。
リン脂質をn−ヘキサンに50μg/mlの濃度まで溶解した。この溶液の100μlを96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加えた。空気中の溶媒のエバポレーション後に、このプレートを、2mM Ca2+を含有するDPBSに溶解した10%ウシ胎仔血清(結合緩衝液)を用いて2時間ブロックした。
内皮細胞が約70%コンフルエンスに達するまで内皮細胞を増殖させた。PS露出を誘導するために、細胞をH2O2(200μM)を用いて37℃で1時間処置した。コントロールのスライドおよび処置したスライドをCa2+およびMg2+含有DPBSを用いて洗浄して、同じ緩衝液に希釈した0.25%グルタルアルデヒドで固定した。50mMのNH4Clとの5分間のインキュベーションによって過剰なアルデヒド基をクエンチした。リン脂質の検出に対する界面活性剤および有機溶媒の効果を試験するために、いくつかのスライドをアセトンを用いるか(5分)、または1%(v/v)TritonTMX−100を含有するPBSを用いてプレインキュベートした。
リン脂質認識の特異性をさらに、種々のリポソームを用いた競合アッセイによって確認した。リポソームを、5mgの単一のリン脂質を含有するクロロホルムの溶液から調製した。この溶液を窒素下で乾燥して、丸底ガラスフラスコ中に薄層を形成させた。次いで、10mlのTris緩衝液(0.1M、pH7.4)を添加して、フラスコを2分間に5回超音波処理した。9D2またはアネキシンV(6.66nM)を200μg/mlのリポソーム溶液とともに室温で1時間プレインキュベートした。この混合物をリン脂質コーティングしたプレートまたは内皮細胞単層に加えた。異なるリポソームの有無において固定されたリン脂質または細胞表面に対して9D2が結合する能力を上記のように決定した。
10倍モル過剰のN−ヒドロキシスクシンイミドビオチン(Sigma,MO)を用いて精製されたタンパク質を室温で1時間インキュベートすることによって、ビオチン化9D2抗体およびアネキシンVを調製した。遊離のビオチンをPBSに対する透析によって除去した。ビオチン化手順は、いずれのタンパク質のPS結合能力も損なうことはなかった。競合研究について、未改変のタンパク質およびビオチン化タンパク質を10倍モル過剰の未改変のタンパク質と事前混合した。次いで、この混合物をPSコーティングプレートに加えた。結合した試薬を、1:1000に希釈されたストレプトアビジン−HRP結合体によって検出した。競合物の非存在下での各々の試薬のPSへの結合を100%値として採用した。
局在化研究のために、2×107個のL540ヒトホジキンリンパ腫細胞または他の腫瘍タイプの1×107個の細胞をSCIDマウス(Charles River,Wilmington,MA)の右脇腹に皮下注射した。腫瘍を0.4〜0.7cm3の容積まで到達させた。1群あたり最小3匹の動物のを用いた。研究を少なくとも3回繰り返した。
雌性のnu/nuマウスまたはSCIDマウスをCharles Riverから購入した。MDA−MB−231ヒト乳腺ガン細胞を、公表されたプロトコール(Price,1996)に従って乳腺脂肪パッドに移植した。要するに、マウスを麻酔して外胸部にわたって皮膚に5mmの切開を作製した。乳腺パッドを露出させて、0.1mlの生理食塩水に再懸濁した1×107個のMDA−MB−231細胞の注射のための正確な部位を確認した。
9D2またはアネキシンVが凍結組織の切片に直接付与される免疫組織化学技術では、原形質膜の内部小葉構造と外部小葉構造との上の陰イオン性リン脂質の間が識別されない。外部に位置するリン脂質を検出するために、本質的に以前に記載されたような方法を行なった(実施例V;Ranら、1998)。腫瘍保有SCIDマウスに、50μgの9D2もしくはビオチン化9D2抗体、または100μgのビオチン化アネキシンVのいずれかを静脈内注射した。60分後にマウスを屠殺して、その血液循環を放血して、以前に記載されたようにヘパリン処理生理食塩水を用いて灌流させた(Burrowsら、1992)。全ての主な器官および腫瘍を回収して、凍結切片の調製のために急速凍結させた。
局在化した9D2抗体またはアネキシンVを有する構造を、DAB染色した切片上の形態学的外観によって、および凍結組織の連続切片上の汎内皮細胞マーカーMECA32を用いた同時染色によって、血管として同定した。腫瘍の連続切片においてMECA 32、9D2またはアネキシンVによって染色した血管をカウントすることによって、DAB染色した切片上の定量を行なった。9D2抗体、コントロールラットIgMまたはアネキシンVを注射した6匹のマウス由来の各々の腫瘍タイプの6つのスライドを試験した。1切片あたり少なくとも10個の無作為の視野(1視野あたり0.317mm2)を、2人の独立した観察者によって、盲検的にスコア付けした。9D2、アネキシンVまたはMECA32によって染色された血管の平均数および標準誤差を算出した。各々の腫瘍タイプ群において決定した9D2またはアネキシンVの陽性血管の平均数を、同じ腫瘍群におけるMECA32陽性血管の平均数と比較した。9D2またはアネキシンV陽性血管の割合を算出した。
1.9D2抗体およびアネキシンVのリン脂質特異性
9D2抗体は、ELISAにおいて、特異的に陰イオン性リン脂質(PS、PA、CL、PI、PG)を認識して、中性のリン脂質(PE、PCおよびSM)とは有意な反応性を有さなかった(図2A;表8)。ELISAにおけるリン脂質に対する9D2の結合の強度の順序は、PA>PS=CL>PG=PIであった。結合は抗原特異的であった。なぜなら無関係の特異性であるいくつかのコントロールラットIgMでは結合は観察されなかったからである。ELISAプレートに吸着された任意の陰イオン性リン脂質に対する9D2の結合は、任意の陰イオン性リン脂質から調製されたリポソームによってブロックされたが、任意の中性のリン脂質から調製されたリポソームによってはブロックされなかった。
9D2抗体およびアネキシンVがPSに対する結合について競合するか否かを試験するために、PSコーティングしたプレート上でビオチン化タンパク質を用いて、交差ブロック研究を行なった。ビオチン化9D2抗体およびアネキシンVの結合を、それぞれ10倍モル過剰の未改変9D2およびアネキシンVによってブロックした(表9)。しかし、未改変のアネキシンVは、ビオチン化9D2がPSプレートに対して結合する能力に影響しなかった。同様に、未改変の9D2抗体の添加は、ビオチン化アネキシンVがPSプレートに対して結合する能力に影響しなかった(表9)。
b競合物の非存在下でのビオチン化試薬の反応性を100%とした。三連の決定の平均値を示す。SDは、平均値の10%未満であった。
3.細胞表面上に外面化された陰イオン性リン脂質に対する結合
細胞表面に対する9D2抗体およびアネキシンVの結合を、マウスbEnd.3内皮細胞またはウシABAE細胞を用いて試験した。9D2もアネキシンVも、静止条件下でいずれの細胞タイプの非透過性単層にも結合しなかった。このことは、原形質膜の陰イオン性リン脂質のほとんどが細胞質ドメインに対して正常に隔離されることを示す。対照的に、内皮細胞の90〜100%においてアポトーシスを生じる条件下で細胞をTNFαおよびアクチノマイシンDとともにプレインキュベートした場合、強力な染色が観察された。
9D2またはアネキシンVが凍結組織の切片に直接加えられる、直接免疫組織化学技術では、原形質膜の内部小葉構造および外部小葉構造の上の陰イオン性リン脂質の間は識別されない。外側に位置するリン脂質を検出するために、9D2およびアネキシンVを腫瘍保有マウスに静脈内注射して、腫瘍血管に対する局在化を直接免疫組織化学によって決定した。
9D2抗体およびアネキシンVは、この研究に含まれた5つ全ての腫瘍において腫瘍血管に局在した(図4;表10)。腫瘍は以下であった:SCIDマウスの乳腺脂肪パッドにおいて正所性に増殖しているヒトMDA−MB−231乳ガン;皮下で増殖しているヒトL540ホジキン腫瘍;皮下で増殖しているヒトNCI−H358 NSCLC;皮下で増殖しているマウスB16黒色腫、および皮下で増殖しているマウスMeth A線維肉腫。
bアネキシンVの局在化は、ビオチン化アネキシンV注射と、それに続くストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合体を用いる凍結切片上での検出によって決定された。
c非抗原特異的尿細管染色は、9D2およびコントロール抗体レシピエントの両方で可視であった。
正所性MDA−MB−231乳房腫瘍を保有するマウスにビオチン化9D2抗体、ビオチン化コントロールIgMまたはビオチン化アネキシンVを静脈内注射した二重染色研究を行なった。1時間後、マウスを屠殺して、その腫瘍を取り出して、凍結切片を切断した。次いで腫瘍切片をCy3結合体化ストレプトアビジンを用いて染色して、ビオチン化タンパク質を検出し、FITC結合体化MECA32を用いて染色して血管内皮細胞を検出した。この検出方法では赤および緑によってビオチン化タンパク質および血管内皮細胞を標識した。ビオチン化タンパク質が内皮に結合した場合、集束型画像(converged image)は黄色になる。
腫瘍環境における陰イオン性リン脂質膜転位
腫瘍血管内皮細胞に固有のインビボ表面マーカーとしてのアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質の発見によって、このような分子の転位および外膜発現に対する腫瘍の微小環境の効果をさらに検討するように本発明者らは促された。本実施例は、腫瘍内の条件を模倣する特定の条件に対して細胞内皮をインビトロで暴露することによって、インタクトな生存可能な細胞において、初期に観察されたアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質表面発現が再現されることを示す。
1.アネキシンVのヨウ素化
組み換えヒトアネキシンVは、ET12a−Panionic リン脂質1プラスミド(University of Washington,SeattleのJ.Tait博士から入手)で形質転換したE.coliから精製した。タンパク質の純度およびPSに対する結合を、それぞれSDS−PAGEおよびPSコーティングされたプラスチックで確認した。ウサギポリクローナル、アフィニティー精製抗アネキシンV抗体を用いてPSに結合したアネキシンVを検出した。アネキシンVは、Bocci(1964)によって記載されたとおりクロラミンTを用いて125Iで放射性標識した。比活性は、Brandfordアッセイ(1976)で測定した場合、タンパク質1μgあたり約1×106cpmであった。
表11に挙げた濃度のサイトカインまたは増殖因子を用いて内皮細胞を処置した。全ての試薬を10%の血清を含む培地中で希釈して、細胞とともに37℃で24時間インキュベートした。
上記の試薬を用いた処置後に、処置した細胞およびコントロール細胞を、7.1ピコモルの125I標識アネキシンV(200μl/ウェル)を含有する結合緩衝液とともにインキュベートした。室温での2時間のインキュベーション後、細胞を徹底的に洗浄して、0.5MのNaOHに溶解した。0.5mlの全体容積をプラスチックチューブに移して、ガンマカウンターでカウントした。5mM EDTAの存在下で非特異的結合を決定して、実験値から差し引いた。その結果を、1×106個の細胞について正規化した、細胞結合したアネキシンVの正味のピコモルとして表現した。
1.H2O2による誘導
マウスbEnd.3内皮細胞を、50,000細胞/ウェルの初期密度で播種した。24時間後に細胞を、漸増濃度(10μM〜500μM)のH2O2とともに37℃で1時間インキュベートするか、または未処置のままにした。インキュベーションの終わりに細胞を0.2%ゼラチン含有PBSで3回洗浄して、0.25%グルタルアルデヒドで固定した。同一のウェルを抗PS IgMで染色するか、またはトリプシン処理してトリパンブルー排除試験によって生存度について評価した。抗PS染色のために、2%ゼラチンを用いた10分間のブロッキング後に、細胞を2μg/mlの抗PS抗体とともにインキュベートし、続いて抗マウスIgM−HRP結合体を用いて検出した。
トロンビンはまた、PS発現を増大するが、H2O2と同じ程度までではないことが観察された。このデータはまた、本発明者らによって開発されたPS発現の腫瘍誘導モデルの欠くことのできない部分である:正常組織におけるトロンビン誘導性PS表面発現はまた、さらなる凝固物である。なぜなら、PS発現は凝固開始複合体のアセンブリを協調させるからである。
インビトロにおけるマウスbEnd.3またはウシABAE細胞を、多くの腫瘍の微小環境に存在する(Lichtenbeldら、1996;Harrisら、1996)種々の濃度の因子および条件、例えば、低酸素/再酸素化、トロンビン、酸性度、炎症性サイトカインおよび過酸化水素を用いて24時間処置した(表11)。
ABAEおよびbEnd.3細胞をIL−1αまたはTNFαの存在下で低酸素/再酸素化に供した場合、強化されたPSおよび陰イオン性リン脂質露出が観察された。サイトカインの非存在下で、低酸素/再酸素化は、ABAE細胞によるPS露出を、アポトーシス濃度のアクチノマイシンDおよびTNFαで処置した細胞について最大レベルの15%〜17.5%まで増大した。毒性未満の濃度のIL−1αまたはTNFαの存在下で、低酸素/再酸素化は、陰イオン性リン脂質露出をそれぞれ最大の26%および33%まで増大した(図5;表11)。低酸素/再酸素化の非存在下でのサイトカインの効果との比較によって、サイトカインおよび低酸素/再酸素化の組み合わせがPS露出に対して相加作用よりも大きい作用であったことが示される。同様の効果がbEnd.3細胞上で観察された。
アミノホスホリピドが腫瘍脈管構造の安定なマーカーであるという驚くべき知見はまた、抗体−治療剤構築物がガン治療に使用され得ることを意味する。標的剤としての抗体の使用に加えて、本発明者らは、アネキシン、および他のアミノホスホリピド結合タンパク質もまた、治療剤を腫瘍脈管構造に特異的に送達するのに使用され得ると結論付けた。以下のデータは、アネキシン−TF構築物のインビボ投与から生じる抗腫瘍効果を示す。
アネキシンV−tTF結合体を調製し、そして固形腫瘍を有するnu/nuマウスに投与した。この腫瘍は、少なくとも約1.2cm3の腫瘍を形成したヒトHT29結腸直腸腺ガン細胞から形成された。アネキシンV−tTFコアグリガンド(10μg)を静脈内投与し、そして24時間循環させた。生理食塩水で処置したマウスを、コントロールマウスとして別々に維持した。1日の処置期間の後、このマウスを屠殺し、そして放血させ、そしてこの腫瘍および主な器官を分析のために採取した。
アネキシンV−tTF結合体が、HT29腫瘍保有マウスにおいて特定の腫瘍血管凝固を誘導することを見出した。アネキシンv−tTF結合体処置した動物における腫瘍血管の約55%が、1回の注射後に血栓形成した。対照的に、コントロール動物の腫瘍脈管構造において血栓、最小限に現れた。
3SB抗PS抗体の抗腫瘍効果
本実施例は、同系および異種の腫瘍モデルを用いる抗PS抗体の抗腫瘍効果を示す。本研究で用いる3SB抗体は、PS(およびPA)に結合するが、本質的にPEとの反応性は欠く。この抗PS抗体は、血栓および腫瘍壊死を伴った腫瘍血管傷害を生じた。
陰イオン性リン脂質に対する抗体(9D2)の抗腫瘍効果
本実施例は、インビボにおける抗腫瘍研究において、PSおよび他の陰イオン性リン脂質に結合する、9D2抗体の効果を実証する。
2リンパ節における転移
さらなる研究では、9D2抗体を、L540腫瘍を有するマウスに1週あたり3回100μgの用量で腹腔内注射した。週に2回ノギスで腫瘍サイズを測定した。コントロール群に比較した抗腫瘍効果を図7に示す。カッコの数は、1群あたりのマウスの総数あたりの退行した腫瘍を有するマウスの数を示す。
抗PS抗体3G4の抗腫瘍効果
本実施例は、同系および異種の腫瘍モデルにおいて抗PS抗体3G4を用いて、さらなる抗腫瘍効果を実証する。本研究で用いる3G4抗体は、PSおよび他の陰イオン性リン脂質に結合するIgG抗体である(実施例IV)。
同系および異種の腫瘍モデルにおいて3G4の効果を検討した。動物腫瘍処置研究のための一般的プロトコールは以下のとおり行なう。特に相違を示さない限り、これは本出願の研究全体にわたって用いたプロトコールである。
キシラジン(20mg/ml);1ml アセプロマジン(10mg/ml);11ml滅菌水である。投与量は、30分間にわたりIP経路を介して体重20〜30グラムあたり0.1mlである。
同系モデルについては、Meth Aマウス線維肉腫腫瘍細胞を用いた。異種モデルの1つにおいて、ヒトMDA−MB−231乳ガン細胞を、乳腺脂肪パッドに播種した。別の異種モデルでは、細胞を注射することおよび腫瘍を処置の前に500mm3を超えるサイズまで増殖させることによって、大きいヒトホジキンリンパ腫L540異種移植片を樹立した。腫瘍保有マウス(1群あたり10匹)に、コントロールに対して、100μgの3G4抗PS抗体(IgG)を腹腔内注射した。処置は週に3回繰り返した。動物を腫瘍測定のために週に2回モニターした。
CMVに対する抗PS抗体の抗ウイルス効果
驚くべきことに、腫瘍脈管構造からウイルス感染へ分野を切り替えて、本発明者らは次に、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に対する抗体がまた抗ウイルス効果を発揮する可能性が高いと判断した。本実施例は実際に、サイトメガロ(CMV)感染の処置において3G4抗体を最初に用いて、これが真実であることを示す。
1.インビトロにおけるCMV感染細胞の処置
6ウェルプレート中のヒト二倍体包皮線維芽細胞(HHF−R2)のコンフルエントな単層を、前に記載されたように、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するヒトCMV AD169を用いて、MOI=0.01で感染させた(Bresnahanら、1996)。要するに、この細胞を、1ウェルあたり1mlの総容積でウイルスとともに、37℃で90分間インキュベートした。感染の間、プレートを30分ごとに穏やかにロッキングさせた。感染後、細胞上清を取り出してDMEM/10% FBS/pen−strep(1ウェルあたり2ml)を各々のウェルに添加した。
組み換えCMVは、SV40プロモーターの制御下でGFPを発現する。従って、感染した細胞は、蛍光顕微鏡下で緑になる。これらの研究では、抗体で処置したCMV感染細胞は、2日目、3日目および9日目に蛍光顕微鏡下で観察された。
標準的プロトコールと用いてプラークアッセイを行なった。要するに、凍結細胞細胞懸濁液を37℃で急速に融解して、1000rpmで1分間、遠心分離によって砕片を除去した。細胞上清の種々の希釈物を、6ウェルプレート中のHHF−R2細胞のサブコンルフエントな単層に加えて、その細胞を37℃で90分間インキュベートさせた(このプレートを30分ごとに穏やかにロッキングさせた)。感染後に、細胞上清を取り出して、2mlのDMEM/10% FBSと交換した。4日目に、各々のウェルの上清を取り出して、細胞に0.01%の低融点のアガロース/DMEM/10% FBSを重層した。このプレートを感染後、37℃で、全部で14日間インキュベートさせた。14日目に、感染した単層を10%緩衝化ホルマリンで固定して、メチレンブルーで染色して、プラークを可視化した。
1.3G4がCMVのウイルス伝播を阻害する
3G4がCMV感染および複製に対して阻害性効果を有するか否かを検討するために、コンフルエントなヒト線維芽細胞を、低いm.o.iでCMVを添加する前に、3G4で前処置した。これらの研究において用いられるCMVは、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する。従って、感染された細胞は、蛍光顕微鏡下で観察された場合に緑になる。
低m.o.iでの抗ウイルス効果に必要な3G4の濃度を決定するために、感染した細胞を、異なる濃度の3G4およびコントロール抗体GV39Gで処置した。図10に示されるように、3G4を100μg/mlおよび50μg/mlで用いて細胞間の伝播の完全な阻害が観察される。細胞を25、12.5および6.25μg/mlの3G4で処置した場合、GFP陽性CMV感染細胞の数が増大される。3G4は、これらのさらに低濃度の一次感染細胞からのウイルス伝播を完全には妨げないが、依然として意味のある抗ウイルス効果を有する。なぜなら、GV39G処置したコントロールウェルに比較して3G4処置したウェルでは、みられるGFP陽性CMV感染細胞はわずかであるからである(図10)。
抗体処置後のウイルスロードを決定するプラークアッセイを行なうことによって3G4の抗ウイルス効果を定量した。このコントロールは、未処置の細胞、GV39G抗体、およびC44抗体を用いるさらなる抗体コントロール、コルヒチンに対するマウスIgG2aアイソタイプ抗体を含んだ。
3という高m.o.i.で感染された線維芽細胞の3G4処置によってまた、ウイルス力価の劇的な低下が生じる。100μg/mlでは、3G4での処置は、コントロールのGV39G処置細胞に比較してウイルス力価の5log10の低下が生じた(図11B)。50μg/mlでは、3G4が、GV39Gに比較して3logまでウイルス複製を阻害した(図11B)。
CMV複製サイクルのどの段階が3G4によってブロックされるかを決定するために、タイミング的な添加研究を行なった。このために、感染後種々の時点で高m.o.i.で感染した線維芽細胞に3G4を加えた。ウイルスロード(細胞および上清の両方において)を標準的なプラークアッセイを用いて定量した。
RSVに対する抗PS抗体の抗ウイルス効果
実施例XIIに示されるCMVに対する劇的な抗ウイルス効果に加えて、本実施例は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)複製の阻害における3つの異なる抗PS抗体の使用を実証する。
1.インビトロにおけるRSV感染細胞の処置
A549細胞を、3つのCoaster 12ウェル組織培養プレートにおいて100%コンフルエンスまで増殖させた。200μLの最小基本イーグル培地を全てのウェルに添加した。抗リン脂質抗体(Ab)を各々のプレートの9つのウェルに添加(100μLに100μg)して、30分後に最初の9ウェルのうちの6つにおける細胞をRSV長型株を含む100μLの容積を1のMOIで用いて感染させた。3つの残りのウェルを感染されていない、抗体処置ウェルのまま残した。抗体を有さない3つの他のウェルを、RSVを上記と同じMOIで用いて感染させた。
プラークアッセイを前に記載の通り行なった(Kischら、1963;Grahamら、1988)。要するに、凍結細胞の細胞上清を37℃で急速融解させた。未希釈の細胞上清から3段の10倍希釈を行なった:10−1、10−2および10−3。各々の希釈の100μLに加えて未希釈のサンプルを、全て3連の80%コンフルエントHep−2細胞株プレートに接種した。プレートを5%CO2,40℃インキュベーターに5日間入れた。5日目に、このプレートを発色させて、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して、各々のウェルにおけるプラークを明らかにした。このプラークを、解剖顕微鏡を用いてカウントして、pfu(プラーク形成単位)/mLにおけるRSVウイルスロードを算出した。
図12に示されるとおり、3SBまたは1B9のいずれかを用いるRSV感染細胞の処置によって、ウイルス複製の対数低下が生じた。感染した細胞を3G4で処置した場合、抗ウイルス効果が、さらに証明された。3G4を用いた処置によって、ウイルス力価において2log10の低下が得られた(図12)。阻害は、CMVで見られるよりも低く、これは3G4の濃度が低かった(25〜50μg/ml)ためである可能性が最も高い。
短鎖抗PS抗体
抗腫瘍因子単独として、腫瘍に対して結合した治療因子を送達するための標的化因子として、および抗ウイルス剤としての使用を含む、本明細書に記載される抗PS抗体の多くの使用を考慮すれば、本実施例は、短鎖(scFv)抗PS抗体を生成するのに適切な技術を記載しており、すなわち、ここではVHドメインおよびVLドメインがペプチドリンカーによって一般に結合される短鎖ポリペプチド鎖に存在する。
細菌ライブラリーの二次ストック(約1×1010クローン)を100μg/mlアンピシリンおよび1%グルコースを含む100ml 2×TYに接種した。これをODが600nmで0.5になるまで、37℃で振盪しながら増殖させた。
20μmolのホスファチジルイノシトールおよび20μmolのビオチン化ホスファチジルセリンを10mlのヘキサンに溶解した。この溶液を、回転エバポレーターを用いてフラスコの表面上に薄層に乾燥させた。2ml PBSを添加して、槽を4℃で30分間超音波処理した。
プレートからの個々のHB2151コロニー(4回の選択後)を、96ウェルプレート中に100μg/mlのアンピシリンおよび1%グルコースを含有する500μl 2×TY中に接種して、37℃で一晩振盪しながら(300rm.)増殖させた。このプレートからの5μlを、1ウェルあたり100μg/mlのアンピシリンを含有する500μl 2×TYを含有する第二の96ウェルプレートに移して、振盪しながら37℃で3時間増殖させた(OD600=0.9)。
4回のパンニング後、以下のクローンはPSプレート上の見込みのあるELISAシグナルを生じて、正確なサイズの挿入物を有する:3E5、3A2、G5、C8、E4および4D5。これらをサブクローニングさせたが、ここではE4は、5つの陽性のサブクローンを有して、4D5は、5つの陽性のサブクローンを有した(表14)。
PE結合ペプチド誘導体の合成
本実施例は、腫瘍およびウイルス疾患を処置するのにおける使用のための例示的なPE結合ペプチド誘導体および結合体の設計および合成に関する。例示的なデュラマイシン誘導体の構造は、図13A〜図13Oのパネルに示されており、これは以下の説明に合致する。
0.387mlの0.1M NaHCO3を含有する水に溶解された0.5mg(0.25μmol)のデュラマイシンを0.113mg(0.25μmol)のNHS−LC−ビオチン(Sigma)に添加した。この反応混合物を室温で1時間、次いで4℃で一晩インキュベートさせた。サンプルをシリカカラムにロードして、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を用いて洗浄して、0.1%TFAおよび70%CH3CNを用いて溶出させた。この溶出物を収集して、遠心分離によって濃縮した。総収量は0.5mgであった(図13A)。
0.286mlの0.1M NaHCO3を含有する水に溶解された0.5mg(0.25μmol)のデュラマイシンを0.034mg(0.25μmol)の2−イミノチオラン塩酸塩(2−IT)に添加した。この混合物を室温で1時間インキュベートさせた。0.13mg(0.26μmol)のヨードアセチル−LC−ビオチン(Pierce)を添加して、その反応物を室温で1時間、そして4℃で一晩インキュベートさせた。サンプルをシリカカラムにロードして、0.1% TFAを用いて洗浄して、0.1%TFAおよび70%CH3CNを用いて溶出させた。この溶出物を収集して、遠心分離によって濃縮した。総収量は0.5mgであった(図13B)。
0.5mlの0.1M NaHCO3を含有する水に1.9mg(0.94μmol)のデュラマイシンを溶解した。ここに、0.4mg(0.88μmol)のNHS−LC−ビオチン(Sigma)を含有する200μlジメチルホルムアミド(DMF)を添加した。この混合物を室温で4時間インキュベートさせた。10mg(0.17μmol)ニュートラビジン(NA)を含有する1mlをこの反応混合物に添加して、これを室温で2時間、次いで4℃で一晩インキュベートさせた。次いでこの反応混合物を、PBS緩衝液を含むG−25カラム(容積50ml)上にロードさせた。この画分を収集して、SDS PAGE(phastゲル)によって解析した。タンパク質含有画分(7〜16)を一緒にプールして、0.22μmフィルターを通した濾過によって滅菌して、280nmでの吸光度を測定することによって濃度を決定した。総収量は5.1mgであった。
0.61mgの(DLB)4NAを含有するPBS緩衝液を、0.005mgN−ヒドロキシスクシンイミジルフルオレセイン(NHS−フルオレセイン)(Sigma)を含有するDMFに添加した。この混合物を室温で1時間インキュベートした。次いで、この反応物をPD10カラム(10ml)に分画した。(DLB)4NA−Fを、タンパク質含有画分(3および4)に溶出させて、これを一緒にプールして、0.22μmフィルターを通した濾過によって滅菌した。総収量は0.5mgであった(図13D)。
ヒトIgG(HIgG)を最初に以下のとおり精製した:1.3ml HIgG(これは、1mM EDTA、pH9を有するホウ酸緩衝液に100mg/ml HIgG、22.5mg/mlグリシンおよび3mg/mlアルブミンを含んだ)を、FPLC(S200、250ml)カラムに加えた。この画分を収集して、phastゲル上でSDS PAGEによって解析した。単量体のIgGを含む画分(21〜32)を一緒にプールして、0.22μmフィルターを通した濾過によって滅菌した。280nmでの吸光度によって決定される総収量は111mgであった。
1mg(0.7ml)の(DIM)nHIgGを、5μlの、NHS−フルオレセインを含有するDMFに添加した。反応混合物を室温で1時間インキュベートして、PD−10カラムで脱塩した。タンパク質含有画分(2〜3)をプールして、0.22μmフィルターを通した濾過によって滅菌した。総収量は0.9mgであった(図13F)。
[(DIM)nHIgG]2のビオチン化誘導体を合成するために、0.66mg(1ml)の[(DIM)nHIgG]2を8μlの、1mg/mlのNHS−LC−ビオチン(Pierce)を含有するDMFに添加した。この混合物を室温で1時間インキュベートした。次いで、この反応混合物をPD−10カラムで脱塩した。タンパク質含有画分(3および4)をプールして、0.22μmフィルターを通した濾過によって滅菌した。最終の収量は0.46mgであった。
2mg(0.99μモル)のデュラマイシンを、0.5ml 0.1M NaHCO3に溶解して、0.136mg(0.99μmol)の2−ITに添加した。この反応混合物を室温で1時間インキュベートした。その後に、0.483mg(0.95μmol)のヨードアセチル−LC−ビオチン(Pierce)を添加してその反応混合物を室温で1時間インキュベートした。10mg(0.17μmol)のニュートラビジンを含む1mlのH2Oを添加して、4℃で一晩インキュベートした。反応混合物をFPLCによって分画した。3つの異なるピークを収集してプールした:[(DIB)4NA]3(画分17〜23);[(DIB)4NA]2(画分24〜33)および(DIB)4NA(画分35〜48)。全てのサンプルを0.22μmのフィルターを通した濾過によって滅菌した。得られた最終収量は以下であった:0.87mgの[(DIB)4NA]3;1.25mgの[(DIB)4NA]2;および1.83mgの(DIB)4NA(図13H)。
0.023mg(0.3μmol)の(DIB)4NAを、0.9μgのNHS−LC−ビオチン(Pierce)に添加した。この反応物を室温で1時間インキュベートして、次いでPD10カラムで脱塩した。総収量は0.04mgであった(図13I)。
0.5ml 0.1M NaHCO3を含有する水に溶解した5mg(2.5μmol)のデュラマイシンを、0.319mg(2.6μmol)の1,3プロパンスルトンに添加した。この混合物を4℃で一晩インキュベートした。このサンプルをシリカカラムにロードして、0.1%TFAで洗浄して、0.1% TFAおよび70% CH3CNを用いて溶出させた。この溶出物を収集して、減圧下での遠心分離によって濃縮した。総収量は5mgであった(図13J)。
0.3ml 0.1M NaHCO3を含有する水に溶解した1mg(0.497μmol)のデュラマイシンを、0.072mg(0.523μmol)の2−ITに添加した。この反応混合物を室温で1時間インキュベートした。0.125mg(0.49μmol)のSBF−塩化物(Pierce)を添加した。この反応混合物を室温で1時間および4℃で一晩インキュベートした。このペプチドをシリカカラムで精製した。この溶出物を収集して、減圧下での遠心分離によって濃縮した。総収量は1mgであった(図13K)。
0.4ml 0.1M NaHCO3を含有する水に溶解した1mg(0.497μmol)のデュラマイシンを、0.109mg(0.592μmol)の2−スルホ安息香酸環状無水物に添加した。この反応物を室温で1時間、4℃で一晩インキュベートした。このペプチドをシリカカラム上で精製した。この溶出物を収集して、減圧下での遠心分離によって濃縮した。総収量は1mgであった(図13L)。
0.5mlの、0.1M NaHCO3を含有する水に溶解した0.25mg(0.124μmol)のデュラマイシンを、0.017mg(0.124μmol)の2−ITに添加した。この反応混合物を室温で1時間インキュベートした。次いで、この混合物を0.049mg(0.124μmol)のEllman試薬に添加した。この混合物を室温で2時間および4℃で一晩インキュベートした。250μlの1mg/mlの4−アミノ−5−ヒドロキシ−2,7−ナフタレンジスルホン酸一ナトリウム塩水和物を100μlの1mg/ml 2−ITに添加した。この反応物を室温で1時間インキュベートした。50μlの反応混合物を前の反応物に添加して、室温で1時間インキュベートした。このペプチドをシリカカラムで精製した。溶出物を収集して、減圧下での遠心分離によって濃縮した(図13M)。
0.5ml 0.1M NaHCO3を含有する水に溶解した5mg(2.5μmol)のデュラマイシンを、0.356mg(2.6μmol)の1,3−ブタンスルトンに添加した。この混合物を4℃で一晩インキュベートした。このサンプルをシリカカラムにロードして、0.1%TFAで洗浄して、0.1% TFAおよび70% CH3CNで溶出した。この溶出物を収集して、減圧下での遠心分離によって濃縮した。総収量は5mgであった(図13N)。
0.5ml 0.1M NaHCO3を含有する水に溶解した0.25mg(0.124μmol)のデュラマイシンを、0.017mg(0.124μmol)の2−ITに添加した。この反応混合物を室温で1時間インキュベートした。次いで、この混合物を0.049mg(0.124μmol)のEllman試薬に添加した。この混合物を室温で2時間および4℃で一晩インキュベートした。このペプチドをシリカカラムで精製した。この溶出物を収集して、減圧下での遠心分離によって濃縮した(図13O)。
デュラマイシン誘導体はPEに特異的に結合する
本実施例は、実施例XVにおいて合成されたデュラマイシン誘導体がPSに特異的であり、従って細胞不浸透性の標的化または抗ウイルス剤に対して連結すること、ならびに腫瘍およびウイルス疾患の処置における使用によって設計されたとおり用いることができることが示される。
PE結合ペプチド誘導体の抗ウイルス効果
実施例XIIおよび実施例XIIIに示されるとおり、抗PS抗体によって媒介される抗ウイルス効果に加えて、本実施例は、他の共通のアミノリン脂質PEに特異的に結合するペプチド誘導体の抗ウイルス効果を実証する。
1.インビトロにおけるCMV感染細胞の処置
6ウェルプレートにおけるヒト二倍体包皮線維芽細胞(HHF−R2)のコンフルエント単層を、実施例XIIに記載されるように、MOI=0.01で、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するヒトCMV AD169を用いて感染させた(Bresnahanら、1996)。この細胞を1ウェルあたりの1.5mlの総容積でウイルスとともに37℃で90分間インキュベートした。感染の間、30分ごとにこのプレートを穏やかにロッキングさせた。感染の後に、細胞上清取り出して、DMEM/10% FBS/pen−strep(1ウェルあたり2ml)を各々のウェルに添加した。
実施例XIIに記載のとおり、組み換えCMVは、SV40プロモーターの制御下でGFPを発現する。従って、感染した細胞は、蛍光顕微鏡下で緑にみえる。これらの研究では、デュラマイシン誘導体で処置したCMV感染した細胞は、4日および6日に蛍光顕微鏡下で観察された。
4日目に、未処理のウェルならびに(DLB)4NAおよび(DIM)nHIgGで処理したウェルに単一の感染したGFP陽性緑色細胞がある(図15、左パネル)。従って、これらのデュラマイシン誘導体でのHHF−R2細胞の処置は、細胞へのウイルスの侵入を阻害しないようである。デュラマイシン誘導体DS−1、DS−2およびDS−3が細胞へのウイルス進入を阻害するといういくつかの前段階的な証拠がある。
3G4抗体の利点
実施例IVに記載のように、本発明者らの固有のプロトコールによって開発された3G4抗体は、文献の抗PS抗体を上回る多くの利点を有するが、これには卓越した抗PS抗体である3SBが挙げられる(Roteら、(1993)。本実施例は、これらの特有の利点を記載する。
3G4はIgG抗体であり、一方3SBはIgMである。IgGクラスの抗体は、高い親和性、インビボにおける低いクリアランス速度、ならびに精製、改変および取り扱いの容易さを含む、IgMを超える多くの利点を有する。IgM抗体である3SBのPS結合の、3G4および別のIgG抗体との比較を図19Aおよび図19Bに示す。
3G4は、PSおよび他の陰イオン性リン脂質を外面化する、活性化された、分裂中の、傷害されたアポトーシスおよび悪性の細胞に結合する。3G4抗体は、インビトロにおいて内皮細胞の増殖を阻害して、静止期細胞と対照的に、分裂している内皮細胞の顕著な選択性阻害を示す。
3G4は、インビボにおいて腫瘍血管内皮細胞の表面に結合する。種々の腫瘍を保有するマウスに静脈内注射した場合、3G4は腫瘍に特異的かつ一貫して局在するが、正常な器官には局在しない。染色は腫瘍血管内皮(図22)、壊死領域および個々の悪性細胞で観察された。腫瘍には、腫瘍内皮および腫瘍細胞の両方の同時の標的を可能にする、3G4についてのマルチ結合部位が存在する。
3G4抗体は、文献で記載される抗リン脂質抗体とは異なる。代表的には、抗リン脂質抗体は、凝固カスケードを妨害する病原性抗体とみなされる。それらは、インビトロにおいて凝固反応を阻害してインビボで血栓を生じる。対照的に3G4、9D2および同様の抗体は、病原性効果のない治療抗体である。
血清の非存在下と同じく血清の存在下で強力にPSコーティングプレートに結合する抗体を同定するためのスクリーニングを用いて、好ましくは所望の抗体が選択されるべきであるという本発明者らの認識から、3G4、9D2および同様の抗体の基部の重要な局面が得られる。この新規な展開によってPSタンパク質および血清タンパク質の複合体を認識する抗体を同定して排除する能力が得られる。なぜならこのような複合体は、抗リン脂質症候群および関連の病態の原因であるかまたはその重要な要因であると考えられるからである。
3G4はマウスにおいて毒性を有さないか毒性が低いという最初の証拠は、3G4が毒性の証拠なしにマウスにおいてハイブリドーマとして増殖するという知見によってもたらされる。また、1mgの精製された3G4が腹腔内に注射された場合、毒性は観察されなかった。
3G4抗体はまた、有意な抗ウイルス効果を発揮する。実施例XIIIに示されるとおり、3G4を用いたRSV感染細胞の処置は、3SBを用いて観察される効果よりも優れていた。従って、これらの結果によって、文献における目立った抗PS抗体である3SBを上回る3G4抗体の別の利点が強調される(Roteら(1993))。
3G4抗体、CDR配列およびキメラ
従って3G4抗体は、血管新生阻害、抗腫瘍血管、および抗ウイルス剤の合わせた特性を保有する。細胞分裂、血管新生、腫瘍増殖およびウイルス性感染に対する3G4の阻害活性は、明白な毒性の欠失とともに考慮すれば、血管新生障害、ガン、糖尿病およびウイルス性感染の処置を含む、この抗体についての広範な治療指標を示す。
抗体の可変領域のもとの配列を、3G4抗体を生成するハイブリドーマからRACEによって得て、そしてその配列を確証した。3G4抗体CDR1−3の重鎖(Vh)の可変領域の核酸およびアミノ酸の配列は、それぞれ配列番号1および配列番号2によって提示される。
マウス相補性決定領域およびヒト定常領域を含むキメラ構築物(ch3G4)を生成して、もとのマウス抗体と本質的に同じように挙動することが示された。
ドセタキセルとの併用療法における3G4抗体
本実施例は、3G4抗体および化学療薬ドセタキセルを用いる腫瘍処置のための併用療法に関する。これらの薬剤は、腫瘍脈管構造内皮細胞および腫瘍細胞区画を攻撃するように設計されて、毒性の低い相乗的な処置をもたらす。この結果によって、この併用療法は、処置効率を実際に有意に増強したことが示された。
インビトロでの腫瘍細胞に対する阻害効果について3G4抗体を試験した。腫瘍細胞に対する直接の阻害効果は観察されなかった。従って、3G4抗体の抗腫瘍効果は、Fcドメイン媒介性の免疫エフェクター機能の増強、例えば、抗体媒介性食作用、ADCC、CDCおよびサイトカイン産生の刺激、またはこれらの機構の組み合わせの増強を含む可能性が高い。
従って、本発明者らは、臨床濃度未満のドセタキセルを用いた内皮細胞および腫瘍細胞の処置が3G4結合を有意に増大することを示した。それらによってまた、3G4抗体が、表面上にPSが露出されている腫瘍細胞のマクロファージ媒介性食作用を促進することが示された。従って、ドセタキセルによって媒介される3G4結合の増大は腫瘍細胞の食作用および3G4抗体のFcドメインによって媒介される他の抗腫瘍効果、例えば、NK細胞の溶解活性を増強して、さらに有効なADCCをもたらす。他の研究によってまた、ドセタキセルを用いた乳ガン患者の処置は血清のIFN−γ、IL−2、IL−6およびGM−CSFサイトカインのレベルの増大、ならびにNKおよびLAK細胞の活性の増強をもたらすことが示されている(Tsavarisら、2002)。
3G4に加えてドセタキセルで処置したマウス由来の腫瘍はまた、コントロールの腫瘍に比較して異常な量のリンパ球を含んだ。この現象は腫瘍細胞を崩壊させることによる免疫細胞の代表的な化学誘引に相当しているが、これはまた、免疫エフェクター細胞上のFcγRに対するFc結合を通じて媒介された3G4による免疫系の活性化を反映し得る。
(抗PS抗体は、インビボにおいてCMV感染を処置する)
実施例XIIに示されるインビトロのCMVに対する抗ウイルス効果に従い、本実施例は、CMVウイルスのマウスバージョン、mCMVを感染させたマウスの生存の増大が実証される。
(インビボにおいてPE結合ペプチド誘導体はCMV感染を処置する)
実施例XVIIに示されるCMVに対するインビトロの抗ウイルス効果に加えて、本実施例によって、デュラマイシンビオチン誘導体であるDLBがmCMVで感染されたマウスの生存を向上させたことが実証される。
(抗PS抗体は、ウイルス感染した細胞に結合する)
本実施例によって、ウイルス感染が細胞表面でPS露出を誘導することおよび抗PS抗体がウイルス感染した細胞に結合することが示される。FACS解析において実証される細胞表面に対するキメラ3G4抗体の結合の増大によって示されるように、ワクシニアウイルスに感染した細胞はPS陽性になる。
(Pichindeウイルスに対する抗PS抗体の抗ウイルス効果)
CMVおよびRSVに対する抗ウイルス効果に加えて、本実施例によってさらに、抗PS抗体がインビトロでPichindeウイルス感染を阻害することが示される。Pichindeウイルスは新世界(New World)アレナウイルスであって、ヒトでは非病原性であり、ラッサ熱の動物モデルにおいて用いられる。
(PE結合ペプチド誘導体を用いる腫瘍処置)
デュラマイシン誘導体の抗ウイルス効果に加えて、インビトロおよびインビボの両方で、本実施例は、腫瘍脈管構造に対するデュラマイシン誘導体の局在化および関連の抗腫瘍効果を実証する。
ヒトIgG(HIgG)を実施例XVに記載されるように最初に精製した。精製したHIgGを、SIABリンカーを用いてデュラマイシンに連結して、得られた(D−SIAB)nHIgG結合体を精製した。
腫瘍サイズが500mm3に達したとき、上記と同じMethAマウス腫瘍モデルを用いて、100μg(D−SIAB)nHIgGを含有する100μlPBSを、尾静脈を介して注射した。同じ量のヒトIgGをコントロールとして注射した。4時間後、マウスを屠殺して正常な生理食塩水を用いて5分間、1%パラホルムアルデヒドを用いて10分間灌流させた。腫瘍および他の主な器官を切り取って液体窒素中で凍結させた。OCTに埋め込んだ後、組織を10μmの切片に凍結切片化してシラン処理したスライドにおいた。冷アセトン中での10分間の固定後に、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgGを用いてスライドを染色して、デュラマイシンHuIgGの体内分布を検出した。Meca32およびペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ラットIgGを用いて組織の血管構造を検出した。
(デュラマイシン結合体の生体分布および特性)
本実施例は、インビトロにおける細胞不浸透性デュラマイシン誘導体の毒性の欠失、インビボで投与されたデュラマイシン誘導体の体内分布、およびデュラマイシン−抗体結合体がマクロファージによるアポトーシス細胞の食作用を増大する能力を実証する。
本発明のデュラマイシン誘導体および結合体は、親のデュラマイシン分子の非特異的な毒性効果を最小にするように設計する。多くの実施例では、これは細胞不浸透性基に対するデュラマイシンの連結によって達成される(実施例XV)。
ヒト乳ガン細胞株MDA−MB−435を増殖させて、対数期に回収して、DPBSに再懸濁した。約107個の細胞を、6〜8週齢の雌性無胸腺ヌードマウスの乳房の脂肪パッドに注射した。100μgデュラマイシン−ビオチンを含む100μl PBSを尾静脈を介して注射した。4時間後、マウスを屠殺して正常な生理食塩水を用いて5分間、1%パラホルムアルデヒドを用いて10分間灌流させた。心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、小腸、胸腺および脾臓を含む主な器官を切り取って液体窒素中で凍結させた。OCTに埋め込んだ後、組織を10μmの切片に凍結切片化してシラン処理したスライドにおいた。冷アセトン中での10分間の固定後に、Cy3標識したストレプトアビジンを用いてスライドを染色してデュラマイシン−ビオチン構築物の体内分布を検出した。Meca32およびFITC標識したヤギ抗ラットIgGを用いて組織の血管構造を検出した。
デュラマイシン−抗体結合体(デュラマイシン−C44、DuC44)がアポトーシス細胞の食作用を増大する能力を次に検討した。
本明細書に開示されかつ特許請求された全ての組成物および方法は、本開示に照らして過度の実験なしに作製しかつ実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、この組成物および方法に対して、そして本明細書に記載されるその方法の工程または工程の順序においては、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、変異が適用され得ることが当業者には理解される。さらに詳細には、化学的におよび生理学的にその両方で関連する特定の因子が本明細書に記載される因子に交換されてもよいが、同じかまたは同様の結果が達成されるということが理解される。全ての同様の置換および改変は、添付の特許請求の範囲として規定されるとおり本発明の精神、範囲および概念のうちであるとみなされることが当業者には明白である。
例示的な処置、または本明細書中に示される補足的な他の詳細を提供する程度に、以下の参考文献が、参考として本明細書中に特に援用される。
Claims (19)
- 精製された抗体であって、該抗体が、ATCC PTA 4545として寄託されたマウスモノクローナル抗体3G4、または、ヒト抗体定常領域に作動可能に結合された該モノクローナル抗体3G4の抗原結合領域を含むキメラ抗体である、精製された抗体。
- 前記抗体が、前記ヒト抗体定常領域に作動可能に結合されたモノクローナル抗体3G4の抗原結合領域を含むキメラ抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体が、二量体抗体、三量体抗体、多量体抗体、二価特異的抗体もしくは組み換え抗体であるか;または、その、scFv、Fv、Fab’、Fab、Fab二量体、二価抗体、直鎖状抗体、F(ab’) 2 、一価フラグメント、ラクダ化もしくは単一ドメインの抗原結合フラグメントである、請求項1または2に記載の抗体。
- 前記抗体が、生物学的因子、診断剤、画像化剤もしくは検出可能因子、または、追加の治療因子もしくは細胞傷害性因子に作動可能に結合される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
- 追加の治療因子をさらに含む、請求項5に記載の薬学的組成物。
- 静脈内、注入、またはエアロゾルの組成物である、請求項5または6に記載の薬学的組成物。
- リポソーム組成物またはナノ粒子組成物である、請求項5〜7のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記リポソーム組成物が、前記抗体またはその抗原結合フラグメントでコーティングされる、ステルス化またはPEG化されたリポソーム組成物である、請求項8に記載の薬学的組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントでコーティングされる、前記ステルス化またはPEG化されたリポソームが、1以上の追加の治療因子を含む、請求項9に記載の薬学的組成物。
- 前記追加の治療因子が、
(a)抗血管形成因子または抗ガン剤;
(b)抗体またはイムノトキシン;
(c)細胞毒、化学療法剤、放射線療法剤、チロシンキナーゼインヒビター、アポトーシス誘導性因子、ステロイド、代謝拮抗薬、葉酸アナログ、抗チューブリン薬、トポイソメラーゼインヒビター、タキサン、コンブレタスタチン、抗生物質、白金配位錯体、サイトカイン、アルキル化剤または凝固因子;
(d)ドセタキセル、パクリタキセル、5−フルオロウラシル、ゲムシタビン、イリノテカン、シスプラチンまたはカルボプラチン
である、請求項6〜10のいずれか一項に記載の薬学的組成物。 - 診断または治療において使用するための、請求項5〜11のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 血管形成を阻害することによる血管形成性疾患の治療において使用するための、請求項5〜12のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記血管形成性疾患、黄斑変性症、関節炎、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、甲状腺過形成、グレーブス病、血管腫、血管新生緑内障または乾癬の治療において使用するための、請求項13に記載の薬学的組成物。
- ガンの治療において使用するための、請求項5〜14のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 化学療法または放射線療法と組み合わせてガンの治療において使用するための、請求項15に記載の薬学的組成物。
- 化学療法剤ドセタキセル、パクリタキセル、5−フルオロウラシル、ゲムシタビン、イリノテカン、シスプラチンまたはカルボプラチンと組み合わせてガンの治療において使用するための、請求項16に記載の薬学的組成物。
- 前記化学療法剤ドセタキセルと組み合わせてガンの治療において使用するための、請求項17に記載の薬学的組成物。
- 肺ガン、肝臓ガン、乳ガン、直腸ガン、メラノーマ、結腸ガン、膵臓ガン、神経膠腫、および前立腺ガンから選択されるガンの治療において使用するための、請求項15〜18のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
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