KR101669709B1 - 포스파티딜에탄올아민에 결합하는 펩타이드, 및 바이러스 감염 및 암을 치료하는데 있어서 이의 용도 - Google Patents

포스파티딜에탄올아민에 결합하는 펩타이드, 및 바이러스 감염 및 암을 치료하는데 있어서 이의 용도 Download PDF

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Abstract

종양 혈관구조 및 바이러스 도입 및 확산에 있어서 음이온성 인지질 및 아미노인지질의 역할, 및 암 및 바이러스 감염 치료시 이러한 발견을 이용한 조성물 및 방법에 관한 놀라운 발견이 기재되어 있다. 또한 암, 바이러스 감염 및 관련 질병의 안전하고 효과적인 치료에 사용하기 위한 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 결합하여 이를 억제하는 유리한 항체, 면역접합체 및 듀라마이신계 조성물 및 배합물이 기재되어 있다.

Description

포스파티딜에탄올아민에 결합하는 펩타이드, 및 바이러스 감염 및 암을 치료하는데 있어서 이의 용도{Peptides binding to phosphatidylethanolamine and their use in treating viral infections and cancer}
발명의 배경
본원은 명세서, 청구의 범위, 도면 및 서열을 포함하는 이의 특허원의 기재내용이 포기없이 본원에 참조로 상세히 인용된, 2002년 7월 15일자로 출원된 동시-계류중인 미국 가특허원 제60/396,263호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 아미노인지질 및 음이온성 인지질 생물학, 종양 혈관 및 바이러스 감염 분야에 관한 것이다. 본 발명은 종양 혈관구조 표적화 및 암 치료용, 바이러스 도입 및 확산 억제용, 및 바이러스 감염 치료용의 놀라운 신규 조성물, 방법 및 배합물을 제공한다. 본 발명은 또한 암, 바이러스 감염 및 관련 질병의 치료시 사용하기 위한 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하여 이들을 억제시키는 다수의 바람직한 항체, 면역접합체 및 듀라마이신계 조성물을 제공한다.
관련 기술의 설명
화학치료요법제에 대한 종양 세포 내성은 임상 종양학에서 현저한 문제를 나타낸다. 종양 치료에 촛점이 맞추어진 다른 주요 문제는 "전체 세포 사멸", 즉, 조절가능하지 않게 성장하고 치료요법에 의해 제거될 수 있는 어떠한 종양 덩이도 대체하는 능력을 갖는 소위 "클론원성(clonogenic)" 악성 세포 모두를 사멸시키는 것에 대한 요구이다. 당해 분야에서의 특정의 발전에도 불구하고, 많은 우세한 형태의 사람 암이 여전히 효과적인 화학치료요법적 중재에 내성인 주요 이유가 2가지 있다.
전체 세포 사멸을 달성하는 치료를 개발하기 위한 목표에 기인하여, 특정 유형의 종양이 다른 종양보다도 치료요법에 있어 더욱 개량되어져 왔다. 예를 들어, 연 조직 종양, 예를 들어, 림프종, 및 혈액과 혈액 형성 기관의 종양, 예를 들어, 백혈병은 일반적으로 암종과 같은 고형 종양보다 화학치료요법에 대해 더욱 반응성이다.
화학치료요법에 대한 연 조직 및 혈액계 종양의 민감성에 있어 하나의 이유는 화학치료요법적 중재에 대한 림프종 및 백혈병 세포의 더욱 큰 접근성이다. 단순하게 말해서, 대부분의 화학치료요법제는 연 조직 종양 및 혈액계 종양의 경우보다 고형 종양 덩이의 세포 모두에 도달하기가 더욱 어렵고, 따라서, 전체 세포 사멸을 달성하기가 더욱 어렵다. 화학치료요법제의 투여량의 증가는, 일반적으로 통상의 항종양제의 효능을 제한하는, 독성 부작용을 가장 흔하게 초래한다.
다른 종양 치료 전략은 항-종양 세포 항체를 사용하여 독소를 종양 세포로 전달하는 "면역독소"의 사용이다. 그러나, 화학치료요법적 시도와 공통적으로, 면역독소 치료요법은 또한 고형 종양에 적용하는 경우 현저한 단점을 지닌다. 예를 들어, 항원-음성 세포 또는 항원-결핍 세포는 생존하여 종양을 재소생시켜 추가의 전이를 유도한다. 항체계 치료요법에 대한 고형 종양 내성에 있어 추가의 이유는, 종양 덩이가 일반적으로 항체 및 면역독소와 같은 거대분자제에 침투할 수 없다는 것이다. 종양내에서 물리학적 확산 거리 및 세포간 압력(interstitial pressure) 둘 다는 이러한 유형의 치료요법을 현저히 제한시킨다.
개선된 치료 전략은 고형 종양의 혈관구조를 표적화하는 것이다. 종양 세포 자체보다는 오히려, 종양의 혈관을 표적화하는 것이, 내성 종양 세포의 발달을 초래하지 않는 경향이 있고, 표적화된 세포가 용이하게 접근가능하다는 점에서 특히 유리하다. 또한, 혈관의 파괴는, 많은 종양 세포가 이들의 산소 및 영양분을 혈관 하나에 의존하기 때문에, 항-종양 효과의 증폭을 가져온다. 예시적인 혈관 표적화제(VTA)는 항-세포제와 종양 혈관구조의 마커에 대한 독소의 표적화된 전달을 기술하고 있는 미국 특허 제5,855,866호, 제5,965,132호, 제6,261,535호, 제6,051,230호 및 제6,451,312호에 기술되어 있다.
혈관 표적화 시도의 다른 효과적인 버젼은 종양 혈관구조 또는 기질내에서 발현되거나 흡수된 마커에 대한 응고 인자를 표적화하는 것이다[참조: Huang et al., 1997; 미국 특허 제6,093,399호, 제6,004,555호, 제5,877,289호 및 제6,036,955호]. 독소보다는 오히려 혈액응고제의 종양 혈관구조로의 전달은 또한 감소된 면역원성과 심지어 독성 부작용의 보다 낮은 위험의 장점을 지닌다. 미국 특허 제5,877,289호에 기술된 것으로써, 이러한 종양 특이적인 "응고리간드(coaguligand)"에서 사용하기 위한 바람직한 응고 인자는 사람 응고-유발 단백질인, 조직 인자(TF), 혈액 응고의 주요 억제제의 절단된 버젼(a truncated version)이다.
최근에, 아미노인지질 포스파티딜세린(PS)과 포스파티딜에탄올아민(PE)이 종양 혈관구조의 특이적 마커로서 확인되었다[참조: Ran et al., 1998]. 이러한 사실은 종양 혈관에 항-세포제, 독소 및 응고 인자를 전달하기 위한 신규의 항-PS 및 항-PE 면역접합체의 개발을 이끌었다(참조: 미국 특허 제6,312,694호). 또한, PS 및 PE에 대한 접합되지 않은 항체가 치료제에 부착하지 않고 항암 효과를 발휘하는 것이 발견되었으며, 이는 종양 혈관 표적화 및 치료에 대한 아미노인지질 "노출된 항체(naked antibody)"로 알려지게 되었다(참조: 미국 특허 제6,406,693호).
비록 앞서의 면역접합체 및 아미노인지질 혈관 표적화 방법이 종양 치료에 있어 현저한 진보를 나타낸다고는 하나, 특정의 말초 종양 세포는 이러한 치료요법에 의해 유발된 광범위한 종양 파괴에서 생존할 수 있다. 따라서, 미리존재하는 혈관 및/또는 순환하는 내피 줄기 세포로부터의 새로운 혈관구조의 발달을 억제하는, 항-혈관형성 전략은 미국 특허 제5,855,866호, 제6,093,399호, 제6,312,694호 및 제6,406,693호의 응고리간드 및 아미노인지질 표적화 방법인 VTA와 함께 사용하기 위해 고려되고 있다.
혈관형성은 배아발생, 상처 치료 및 월경과 같은 생리학적 과정에 있어 중요한 역활을 하지만, 또한 종양 성장, 관절염, 건선 및 당뇨병성 망막증과 같은 특정의 생리학적 현상에 관여한다(참조: Ferrara, 1995). 종양 치료에 적용되는 것으로서, 항-혈관형성 전략은 일반적으로 고형 종양의 주변부에서 싹(budding) 혈관의 증식을 억제하는 것에 기초한다. 이러한 치료요법은 미세전이의 위험을 감소시키고 더욱 통상적인 개입(예: 수술 또는 화학요법)후 고형 종양의 추가의 성장을 억제하는데 주로 적용된다.
미국 특허 제6,342,219호, 제6,524,583호, 제6,342,221호 및 제6,416,758호는 혈관형성의 주요 자극제인, 혈관 내피 성장 인자-A(VEGF, 이전에 혈관 침투 인자, VPF로 알려짐)에 결합하는 항체 및 면역접합체를 기술하고 있다. 이들 항체는 2개의 주요 VEGF 수용체중 단지 하나에 결합하는 VEGF를 억제하는 중요한 장점을 갖는다. VEGFR1이 아닌, VEGFR2에 대한 VEGF의 결합을 차단함으로써, 이들 항체는 예를 들면, 대식세포, 파골세포 및 연골세포 작용에 있어 VEGFR1을 통해 중재된 유리한 효과를 유지하면서, 개선된 안정성 측면을 지닌다.
비록 앞서의 방법들이 종양 치료 분야를 발전시켜왔다고 해도, 추가의 또는 다른 혈관 표적화 치료요법의 개발이 여전히 고려되고 있다. 종양 혈관형성의 새로운 마커의 확인은 치료학적 선택권의 수를 확장시키는데 요구된다. 항암 특성을 갖는 새로운 노출된 항체의 개발은, 이러한 개발이 단일-제제 치료요법 및 다른 약물의 전달용 혈관 표적화제로서 둘다 사용될 동일한 표적화 잔기를 허용하기 때문에 특히 중요한 발전일 수 있다. 동일한 분자내에서 항-혈관형성 및 항-혈관 특성 둘 다, 예를 들면, 종양 파괴 특성을 갖는 치료제는 매우 가치가 있을 수 있다. 더욱 더 중요한 발전은 다른 시스템에서 항암 특성 및 치료효과를 지닌 치료제 부류를 확인하는 것이 될 것이다. 당해 시대의 가장 중요한 의학적 도전인 암과 바이러스 감염 둘다를 치료할 수 있는 제제의 개발은 현저하고 중요한 획기적 발전이 될 것이다.
발명의 요약
본 발명은 안전하고 효과적인 종양 혈관 표적화, 항-혈관형성 및 종양 파괴용의 신규 방법 및 조성물을 제공함으로써 선행기술의 상기한 요구 및 다른 요구에 부응하는 것이며, 이러한 방법 및 조성물은 또한 바이러스 도입 및 확산을 억제하고 바이러스 감염 및 질병을 치료하는데 매우 효과적이다. 본 발명은 부분적으로, 종양 혈관구조에서 음이온성 인지질의 발현 및 역활과 바이러스 도입 및 확산에 있어 아미노인지질 및 음이온성 인지질의 관련성에 대한 놀랄만한 발견에 기초한다. 본 발명은 또한 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하는 특히 유리한 항체 및 면역접합체와, 포스파티딜에탄올아민에 결합하는 새로운 부류의 펩타이드계 유도체를 제공한다.
개요: 첫번째 종합적인 양태에서, 본 발명은 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파티드산(PA) 및 포스파티딜글리세롤(PG)(및 포스파티딜세린, PS)과 같은 음이온성 인지질이 종양 혈관구조의 접근가능하고 안정되게 표적화가능한 마커라는 예상치않은 발견에 기초한 종양 혈관 표적화, 종양 영상화 및 치료용 신규 방법을 제공하는 것이다. 당해 양태는 PA, PI, PG 및 기타 음이온성 인지질 성분들에 대한 항체가 고형 종양의 혈관구조에 특이적으로 국지화한다는 예상치 않은 발견에 기인한다.
당해 양태내 추가의 측면은 PA, PI 및 PG(또한 PS)와 같은 음이온성 인지질에 대한 노출된 항체가 종양 혈관 혈관형성을 특이적으로 억제하고, 독소 또는 응고제와 같이 효과기 분자(effector molecule)에 대한 접합의 부재하에 생체내에서 종양 혈관구조 파괴 및 종양 괴사를 유발한다는 예상치못한 발견으로부터 개발되었다. 따라서, 본 발명은 음이온성 인지질에 결합하는 단일 성분 항체계 치료요법을 사용한 혈관 표적화, 항-혈관형성 및 종양 치료의 안전하고 효과적인 방법을 제공한다.
본 발명의 근본적인 놀라운 특징은, 종양 혈관 내피 세포의 표면에 대한 음이온성 인지질의 전위가 세포 손상 및 세포자살 메카니즘(apoptotic mechanism) 또는 다른 세포-사멸 메카니즘과는 독립적으로, 적어도 현저한 부분에서 발생한다는 것이다. 따라서, 종양 혈관구조내 음이온성 인지질 발현은 세포 사멸 및 파괴의 결과 또는 이에 대한 개시(trigger)의 결과가 아니라, 형태학적으로 완전한 혈관 내피 세포에서 발생한다. 이러한 사실은, 종양 혈관구조내 음이온성 인지질 발현이 일시적인 것이 아니라, 오히려 치료학적 개입을 위한 표적물을 제공하기에 충분하도록 안정하다는 것을 의미한다.
음이온성 인지질이 종양 혈관구조내에서 안정하게 유발된다는 발견의 제공으로, 본 발명은 또한 음이온성 인지질에 대한 항체의 면역접합체를 사용하여 종양 혈관구조 영상화 및 파괴를 위한 광범위한 신규 방법 및 조성물을 제공한다. 이들 면역접합체들은 독소 및 응고제와 같은 치료제에 작동적으로 부착된 음이온성 인지질에 대한 항체를 포함하며, 종양 혈관 내피 세포막의 표면에 대한 진단 및 치료요법의 특이적인 전달에 있어 유용하다. 당해 치료제는 종양 혈관 내피 세포막과 친밀하게 접촉하여 전달되어, 표적 세포내로의 신속한 도입 또는 효과기 세포, 응고 케스케이드의 성분 등과의 신속한 연합을 허용한다.
두번째 종합적인 양태에서, 본 발명은 아미노인지질 및 음이온성 인지질(및 관련 면역접합체 및 조성물)에 결합하는 다수의 바람직한 항체를 제공하며, 당해 항체는 당해 분야에 공지된 것들을 능가하는 장점을 제공하는 구조 및 특성을 지닌다. 이들 소위 "제2 세대(second generation)" 또는 개선된 항체는 바람직하게는 항-혈관형성, 항-암 및 항-바이러스 및 본원에 기술된 다른 치료 방법에서 사용될 것이다.
본 발명에 의해 제공된 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하는 새로운 부류의 항체는 당해 분야의 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 대한 항체와 일반적으로 연관되어 있는 병리학적 특성없이 치료학적 항체를 제공함으로써 선행기술의 각종 단점들을 극복한다. 본 발명은 부분적으로, 새로운 면역화를 사용하고, 종양 혈관 내피 세포내 인지질의 거동에 대한 발명자 고유의 관찰로부터 개발된 기술을 스크리닝하며 질병과 연관한 항-인지질 항체로부터 생성된 항체를 떼어놓음으로써 개발되었다. 이러한 항체들은 고유의 특성 및 개선된 안전성을 지닐뿐 아니라, 비교 연구에서 존재하는 항체와 동일하거나 이보다 더욱 효과적이다. 본 발명의 이러한 측면의 조성물 및 방법은 제공된 항체의 특이적 범주를 사용한 면역접합체와 배합물의 사용에 또한 연장된다.
본 발명에 앞서, 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하고 본원에 기술된 신규 항체의 특성을 갖는 항체는 알려져 있지 않았다. 그러나, 본원에 기술된 발명의 측면에서, 당해 기술은 본 발명에 이르러 새로운 후보 항체를 생성하는 방법론과 이러한 항체를 시험함으로서 후보물질의 풀(pool)로부터 유용한 항체를 추가로 동정하는 기술을 제공한다. 따라서, 본 발명의 측면에서, 선행기술의 항체와 연관된 주목할만한 단점과 부작용이 없는, 유리한 특성과 아미노인지질 및 음이온성 인지질 결합 프로파일을 지닌 광범위한 항체를 제조할 수 있다. 즉, 이러한 항체는 혈관형성의 억제 및 암과 바이러스 감염의 치료를 포함한 다양한 양태에서 사용될 수 있다.
본원에 제공된 신규 면역화 및 스크리닝 기술외에, 아미노인지질과 음이온성 인지질에 결합하고 다수의 유리한 특성을 갖는 항체가, 본 발명에 이르러, 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4를 사용한 경쟁 및/또는 작용 검정에 의해 확인될 수 있다. 현재, 1B12, 3B10, 9D2 및 3G4 항체가, 인지질 결합을 위한 혈청을 필요로 하지 않기 때문에 바람직하다. 모노클로날 항체 9D2 및 3G4가 더욱 바람직하며, 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)가 현재 가장 바람직하다. 외부 항체중 어느것, 바람직하게는 3G4와 경쟁하는 추가의 항체를 확인하기 위한, 현재 바람직한 검정은 ELISA를 기초로한 경쟁 검정이며, 이들 다수는 본원에 기술되어 있고, 이의 작업 실시예가 기술되어 있다.
세번째의 종합적인 양태에서, 본 발명은 아미노인지질, 포스파티딜에탄올아민(PE)에 결합하는 세포-비침투성 펩타이드계 유도체의 새로운 부류를 제공한다. 이러한 "PE-결합 펩타이드 유도체"는 적어도 제1의 PE-결합 펩타이드, 바람직하게는 듀라마이신을 포함하며, 이러한 펩타이드는 PE-결합 펩타이드, 바람직하게는 듀라마이신을 변형시킴에 의해 실질적으로 세포 비침투성이거나 실질적으로 공극을 형성하지 않는 PE-결합 작제물을 형성함으로써 실질적으로 비특이적인 독성을 방지하도록 변형된다.
"실질적으로 세포 비침투성"인 PE-결합 작제물 또는 듀라마이신의 생성은 바람직하게는 적어도 제1 세포 비침투성 그룹에 PE-결합 펩타이드 또는 듀라마이신이 부착함에 의해 달성된다. 다수의 예시적인 듀라마이신 유도체의 합성은 본원에 기술되어 있다. "세포 비침투성 그룹 또는 그룹들"은 소 분자의 불활성 담체일 수 있거나, 자체가 종양 혈관구조에 대해 표적화하는 것과 같이 수득되는 작제물에 추가의 표적화 작용을 부여하는 표적화제일 수 있다. 따라서, PE-결합 펩타이드는 불활성 담체에 연결된 단독의 표적화제일 수 있거나, 각각 작제물에 대해 표적화 작용을 부여하는 2개의 제제중 하나일 수 있다. 따라서, PE-결합 펩타이드, 바람직하게 듀라마이신은 효과기에 작동적으로 부착함으로써, PE-결합 펩타이드 또는 듀라마이신은 표적화 작용을 제공하고 부착된 제제는 표적 세포로 전달되면 실질적인 치료 효과를 지닌다. 바람직한 예는 PE-결합 펩타이드이거나 뉴클레오사이드와 같은 항-바이러스제에 연결된 듀라마이신이다.
PE는 필수적으로 정상 조건하에서 정상 세포의 표면으로부터 부재하기 때문에, 본 발명의 실질적으로 세포 비침투성인 PE-결합 특성은 이상 세포 또는 종양 혈관 내피 세포, 증식 세포 및/또는 바이러스로 감염된 세포와 같은 질병과 관련된 세포의 표면에서 PE에 선택적으로 결합하는 작용이 있다. 이러한 이상 표적 세포에 결합하면, PE-결합 작제물 또는 유도체는 이러한 세포에서 PE 작용을 억제하거나 차단함으로써 종양 및/또는 바이러스 질병의 치료시 총체적인 치료학적 잇점을 가져온다. 바이러스 도입 및 확산을 억제하는데 있어서 실질적으로 세포 비침투성인 PE-결합 펩타이드의 성공적인 사용은 본원에 기술되어 있다. PE-결합 펩타이드가 시도포비르와 같은 항-바이러스제에 부착되는 양태에서, 증진되고 안전한 항-바이러스 치료가 제공된다.
네번째의 종합적인 양태에서, 본 발명은 또한 바이러스 감염 및 질병을 치료하는데 사용하기 위한 바이러스 복제, 감염 및 확산을 억제하는 새로운 부류의 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 방법은 PS, PE, PI, PA 및 PG, 특히 PS 및 PE와 같은 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하는 항체 및 펩타이드가 안전하고 효과적인 항-바이러스제일 수 있다는 놀라운 식견에 기초한다. 이러한 식견이 정확한 것으로 입증되지는 않았지만, 본 발명은 바이러스 확산을 저지하는데 있어서 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하는 항체 및 펩타이드의 예상치못한 효과적인 사용을 나타내는 데이타를 제공하며, 이는, 이들 제제가 광범위한 바이러스 감염 및 관련 질병의 치료에 광범위하게 적용가능함을 의미한다.
이러한 발견들은 또한 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 특히 PS 및 PE에 대한 항체를 항-바이러스제에 작동적으로 부착시키는 새로운 범주의 면역접합체, 조성물, 키트 및 사용 방법을 포함한다. 듀라마이신, 펩타이드 유도체와 같은 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체는 또한 항-바이러스제에 연결될 수 있다. 즉, 이들 제제 각각은 바이러스 감염된 세포에 대해 유일하게 표적화하는 새로운 항-바이러스 약물을 제공한다.
따라서, 이상 혈관형성, 암 및 바이러스 감염 및 질병의 치료에 효과적인 신규의 안정한 치료제의 개발은 당해 분야의 획기적인 발견이다.
비록 유일하게 효과적이라 해도, 본 발명의 각종 방법 및 조성물은 또한 다른 치료요법 및 제제와 함께 유리하게 사용되어 배합 치료 방법, 및 본 발명의 관련 조성물, 약제 및 키트를 제공할 수 있다. 따라서, 다섯번째 종합적인 양태에서, 본 발명은 또한 본원에 더욱 상세히 설명된 바와 같이, 놀랍게도 함께 잘 작용하도록 선택되고 발견된, 예를 들면, 암 치료용의 특정의 배합 조성물, 방법 및 키트를 제공한다.
제2 세대 항체: 고려된 특성을 갖는 항체 세대에 있어 잘 작용하는 것으로 발견된 특정의 방법은 본원의 실시예 IV에 기술되어 있고 첨부된 청구의 범위에 구체화되어 있다. 이들 방법들은 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 및 3G4, 특히 3G4(ATCC 4545)에 의해 예시되는 바와 같은 본 발명의 유리한 항체의 생성을 허용한다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 결합하고, 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 대한 결합에 있어, 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4, 바람직하게는 9D2 또는 3G4(ATCC 4545) 및 가장 바람직하게는 3G4와 효과적으로 경쟁하는 정제된 항체, 항원-결합 단편 및 이의 면역접합체를 제공한다.
전체 명세서를 통해 사용된 것으로써, 용어 "a" 및 "an"은, 상한선이 이후에 특정되는 경우를 제외하고는, 언급된 성분 또는 단계의 "적어도 하나", "적어도 첫번째", "하나 이상" 또는 "다수"를 의미하는 의미로 사용된다. 따라서, 본원에 사용된 것으로서, "항체"는 "적어도 첫번째 항체"를 의미한다. 배합물의 작동가능한 한계 및 매개변수, 및 특정한 단일 제제의 양은 본 기술내용의 측면에서 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있을 것이다.
특정의 양태에서, 항체는 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 대한 결합에 있어, 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4, 및 가장 바람직하게는 3G4 (ATCC 4545)와 효과적으로 경쟁하거나 표 4에 설정된 것으로서, 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4, 바람직하게는 9D2 또는 3G4, 가장 바람직하게는 3G4의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 결합 프로파일을 지니고; 혈청 의존적, 예를 들면, 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하기 위해 혈청을 필요로 하지 않거나; 질병이 있는 환자로부터 기원하지 않고 실험관내에서 응고 반응을 현저히 억제하지 않거나, 생체내에서 현저한 혈전을 유발하지 않거나 루프스 응고 활성을 지닐 것이다.
바람직하게는, 이러한 항체는 또한 문헌에서의 IgG와 같은 항체와 비교시 조절된 연구에서 유리한 범위 또는 정도의 작용 특성 또는 구조적 특성에 있어서의 증진을 입증하며, 보다 높은 친화성을 지니거나 활성화된 내피세포, 내피 세포 증식 또는 혈관 형성의 증가된 억제, 증진된 종양 혈관 국재화, 항암 및/또는 항-바이러스 효과를 입증한다.
따라서, 본 발명의 특정 측면은 위에서 기술하고, 다른 부분에서 기재하며 고유의 유리한 특성을 갖는 항체의, 본 발명자 기원의 놀랄만한 세대를 기초로 한다. 본원에서 바람직한 항체의 패널 및 다수의 특히 바람직한 항체가 제공되었으며, 본 발명은 또한 정의된 에피토프-특이성의 항체 부류를 포함하며, 여기서, 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항원 결합에 있어 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4, 바람직하게는 9D2 또는 3G4, 및 가장 바람직하게는 3G4(ATCC 4545)와 효과적으로 경쟁함으로써, 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4, 바람직하게는 9D2 또는 3G4, 및 가장 바람직하게는 3G4(ATCC 4545)와 필수적으로 동일한 에피토프에 결합한다.
청구된 것으로서 본 발명은 본 명세서 및 용이하게 입수가능한 기술 참조 문헌, 노-하우 및 출발 물질에 따라 가능하다. 그럼에도 불구하고, 본 출원인인 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템을 대신하여, 3G4 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주의 샘플을 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 기탁물로 제출하였다. 당해 샘플은 미국 캘리포니아주 92780 투스틴 프랭클린 애비뉴 14272 소재의 아비드 바이오서비시즈, 인크(Avid Bioservices, Inc.)가 2002년 7월 8일로 시작하는 주 동안에 제출하였고, 2002년 7월 10일 및 7월 12일자로 수령되었으며, 수령시 생존한 것으로 밝혀져서, 2002년 7월 30일자로 ATCC 수탁 번호 PTA 제4545호를 부여받았다.
당해 기탁물은 특허 과정의 목적 및 이의 법규(부다페스트 조약)에 있어 미생물 기탁의 국제적 승인을 위한 부다페스트의 조약하에 이루어졌다. 당해 하이브리도마는 미국 특허의 허여시 관련된 청구와 함께 부다페스트 조약하에 ATCC로부터 입수가능하게 될 것이다. 기탁된 하이브리도마의 유용성은 특허법에 따라 특정 정부의 권한하에 승인된 권리의 위배시 본 발명을 실시하는 허가증으로서 구성되지는 않는다.
본원에 기술되고 당해 분야에 공지된 항체, 바람직한 항체 및 기술의 패널 측면에서, 당해 분야의 숙련가들에게 본 발명에 이르러 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하며 유리한 특성을 지닌 새로운 부류의 항체가 제공된다. 이들 항체는 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4와 "유사"하거나 이에 "기초"한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 "9D2계 또는 9D2-유사 항체"이며, 가장 바람직하게는, 본 발명의 항체는 "3G4계 또는 3G4-유사 항체"이다. "유사" 항체의 다음 기술은 단순성을 위한 3G4 항체(ATCC 4545)의 측면에서 제공되나, 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5 및 9D2 항체 각각에 적용되는 것으로서 본원에 참조로 구체적으로 인용된다.
3G4-유사 항체는 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 필수적으로 동일한 에피토프에서 적어도 첫번째의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 바람직하게는, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 동일한 에피토프에 결합할 것이다.
용어 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 "거의, 실질적으로 또는 필수적으로 동일하거나, 이와 동일한 에피토프에 결합하는"은, 항체가 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 "교차-반응"함을 의미한다. "교차-반응 항체"는 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 실질적으로 또는 필수적으로 동일하거나, 동일한, 에피토프, 에피토프 부위 또는 일반적인 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 에피토프에 대해 인지하거나, 결합하거나 면역특이성을 가짐으로써 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)가 결합하는 적어도 하나의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 하나 이상의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 또는 모든 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하기 위해 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 효과적으로 경쟁할 수 있는 것이다. "3G4-교차-반응성 항체"는 "3G4-유사 항체" 및 "3G4-계 항체"로 간결하게 칭해지며, 이러한 용어들은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 조성물, 용도 및 방법에 적용된다.
모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 거의, 실질적으로, 필수적으로 또는 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체의 확인은, 본 발명에 이르러, 이의 유리한 특성과 함께, 3G4가 제공하는 직접적인 기술 문제이다. 교차-반응성 항체의 확인이 참조 항체와 비교하여 측정되므로, 참조 항체(3G4) 및 시험 항체가 결합하는 에피토프를 실질적으로 측정하는 것은 모노클로날 항체 3G4와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 확인하기 위해 어떠한 방식으로든 요구되지 않는다. 그러나, 3G4에 의해 결합된 에피토프에 있어서의 고려할 만한 정보는 본원에 포함되며 에피토프 맵핑(mapping)도 추가로 수행할 수 있다.
교차-반응성 항체의 확인은 항체 경쟁이 평가될 수 있는 다양한 면역학적 스크리닝 검정중 어느 하나를 사용하여 용이하게 측정할 수 있다. 이러한 검정들 모두는 당해 분야에서 통상적이며 또한 본원에 상세히 기술되어 있다. 미국 특허 제6,342,219호 및 제6,342,221호 각각은 3G4와 같은 제공된 항체와 동일하거나 실질적으로 또는 필수적으로 동일한 에피토프에 결합하거나 항원에 결합하기 위해 제공된 항체와 효과적으로 경쟁하는 항체를 제조하는 방법에 관한 본 발명의 교시를 심지어 추가로 보충함을 포함하는 목적을 위해 본원에 참조로 상세히 인용된다.
예를 들어, 시험할 시험 항체를 상이한 동물 공급원으로부터 입수하거나, 심지어 상이한 동형인 경우, 대조군(3G4)와 시험 항체를 혼합(또는 예비-흡착)시키고 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 항원 조성물, 바람직하게는 PS에 적용시키는 단순한 경쟁 검정을 사용할 수 있다. "아미노인지질 또는 음이온성 인지질 항원 조성물"은 표 4에 기술된 바와 같은, 본원에 기술된 3G4-결합 항원을 함유하는 어떠한 조성물을 의미한다. 즉, ELISA 및 웨스턴 블롯팅에 기초한 프로토콜이 이러한 단순한 경쟁 연구에 사용하기에 적합하다.
특정 양태에서는, 대조군 항체(3G4)를 변화량의 시험 항체(예를 들면, 1:10 또는 1:100)과 항원 조성물에 적용하기 전 일정 기간동안 예비혼합시킬 수 있다. 다른 양태에서, 대조군 및 변화량의 시험 항체는 항원 조성물에 노출시키는 동안 단순 혼합할 수 있다. 어떠한 상황에서도, 종 또는 동형 2차 항체를 사용함으로써, 결합된 대조군 항체만을 검출할 것이고, 이의 결합은 실질적으로 동일한 에피토프를 인지하는 시험 항체의 존재에 의해 감소될 것이다.
대조군 항체와 어떠한 시험 항체(종 또는 동형에 관계없이)간의 항체 경쟁 연구 수행시, 우선 대조군(3G4)을 예를 들면, 후속적인 확인이 가능한 바이오틴 또는 효소(또는 심지어 방사활성) 표지와 같은 검출가능한 표지로 표지시킬 수 있다. 이러한 경우, 표지된 대조군 항체는 시험할 시험 항체와 다양한 비율(예를 들면, 1:10, 1:100 또는 1:1000) 및 (임의로 적합한 기간후)로 예비 혼합하거나 항온처리한 후, 표지된 대조군 항체의 반응성을 검정하고, 당해 검정 값을 강력하게 경쟁하는 시험 항체가 항온처리에 포함되지 않은 대조군 값과 비교할 수 있다.
당해 검정은 다시 항체 하이브리드화에 기초한 면역학적 검정의 범위중 어느 하나 일 수 있으며, 대조군 항체는 이들의 표지, 예를 들면, 바이오티닐화된 항체의 경우 스트렙트아비딘을 사용하거나 효소적 표지[3,3'5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질과 퍼옥시다제 효소와 같은]와 관련하여 색소원성 기질을 사용하거나 또는 방사활성 표지를 단순 검출함에 의해 검출할 수 있다. 대조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 결합에 대해 효과적으로 경쟁할 것이므로 결합된 표지에 있어서의 감소로 입증되는 바와 같이 대조군 항체 결합을 현저히 감소시킬 것이다.
전혀 관련되지 않은 항체의 부재하에서 (표지된) 대조군 항체의 반응성은 대조군 최고값일 수 있다. 경쟁이 표지된 항체의 결합을 발생시키거나 이를 감소시키는 경우, 대조군 최저값은 표지된 (3G4) 항체를 정확하게 동일한 유형(3G4)의 표지되지 않은 항체와 항온처리함으로써 수득할 수 있다. 시험 검정에서, 시험 항체의 존재하에서 표지된 항체 반응성의 현저한 감소는 동일한 에피토프, 즉, 표지된(3G4) 항체와 "교차-반응"하는 에피토프를 인지하는 시험 항체의 지표이다.
현저한 감소는 "재현가능한", 즉, 결합에 있어서의 감소가 일정하게 관측된다. 본원에서 "현저한 감소"는 약 1:10 내지 약 1:1000의 어떠한 비에서도 적어도 약 70%, 약 75% 또는 약 80%의 재현가능한 감소(ELISA에 있어서 하나 이상의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 대한 3G4 결합에 있어)로 정의한다. 더욱 엄격한 교차-차단 활성을 갖는 항체는 약 1:10 내지 약 1:1000의 어떠한 비에서도 적어도 약 82%, 약 85%, 약 88%, 약 90%, 약 92% 까지의 재현가능한 환원(ELISA 또는 다른 적합한 검정에서 하나 이상의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 대한 3G4 결합)을 나타낼 것이다. 본 발명을 실시하는데 필요한 수단없이도, 약 97% 또는 약 96% 정도까지의 하나 이상의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대한 3G4 결합에 있어서의 재현가능한 감소를 나타내는 것과 같은 완전하거나 거의 완전한 교차-차단이 특정하게 배제되지는 않는다.
제2 세대 항체 전체와 관련하여, 경쟁은, 제2 세대 항체가 포스파티딜세린에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하는, 적어도 포스파티딜세린에 결합하는 항체를 참조하여; 제2 세대 항체가 포스파티드산에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하는, 포스파티드산에 적어도 결합하는 항체를 참조하여; 제2 세대 항체가 포스파티딜이노시톨에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하는, 포스파티딜이노시톨에 적어도 결합하는 항체를 참조하여; 제2 세대 항체가 포스파티딜글리세롤에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하는, 포스파티딜글리세롤에 적어도 결합하는 항체를 참조하여; 제2 세대 항체가 카디올리핀에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하는, 카디올리핀에 적어도 결합하는 항체를 참조하여; 및 임의로 제2 세대 항체가 포스파티딜에탄올아민에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하는, 포스파티딜에탄올아민에 적어도 결합하는 항체를 참조하여 측정할 수 있다.
특정 양태에서, 제2 세대 항체는, 제2 세대 항체가 제1 및 제2 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하고, 적어도 제1 및 제2 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 항체를 참조하여; 제2 세대 항체가 제1, 제2 및 제3의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하고 적어도 제1, 제2 및 제3 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 항체를 참조로; 제2 세대 항체가 제1, 제2, 제3 및 제4 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하고 적어도 제1, 제2, 제3 및 제4 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 항체를 참조로; 또는 제2 세대 항체가 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하고 적어도 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 항체를 참조로 측정할 수 있다.
추가의 양태에서, 제2 세대 항체는 하나 이상의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대해 현저한 결합을 나타내며, 콜린을 함유하는 중성의 인지질에 대한 검출가능한 항체가 없고 본 발명의 모노클로날 항체, 바람직하게는 3G4(ATCC 4545)와 효과적으로 경쟁하는 항체로 특성화될 수 있다.
특정 양태에서, 항체는 음이온성 인지질 PS, PA, PI, PG 및 CL에 대한 현저한 결합을 나타내며; PS=PA=PI=PG>CL>>PE(여기서, >는 결합에 있어 2배 이상의 차이를 나타내며 >>는 이러한 인지질에 대한 결합에 있어 10배 이상의 차이를 나타낸다)의 인지질 결합 프로파일을 가지며; 포스파티딜콜린 또는 스핑고마이엘린에 대해 검출가능한 결합을 나타내지 않고; 음이온성 인지질 PS, PA, PI, PG 및 CL 각각에 대한 결합을 위해 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 효과적으로 경쟁한다.
바람직하게는, 제2 세대 항체는 앞서의 특성을 지닐 것이며 또한 활성화되거나, 분열하거나, 손상되거나, 세포사멸되거나 바이러스 감염된 세포의 세포 표면에 존재하는 하나 이상의 음이온성 인지질에 대해 현저한 결합을 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 항체는 또한 정지기 세포를 현저히 변경하지 않으면서 분열하는 내피 세포의 증식을 현저히 억제하고 더욱 바람직하게는 현저한 루프스 항응고 활성을 지니지 않는다.
기능적으로, 제2 세대 항체는 바람직하게는 혈관형성을 억제할 것이고, 바람직하게는 생체내에서 항종양 효과 및 항바이러스 효과를 지니며, 더욱 바람직하게는 동물 또는 환자에게 현저한 혈전 합병증을 유발하지 않을 것이다. 따라서, 바람직한 항체는 항혈관형성제, 항종양 혈관제, 항종양제 및 항바이러스제의 배합된 특성을 지닌다.
본 발명은 모노클로날 항체 3G4에 의해 예시되거나, 하이브리도마 ATCC 4545 또는 이러한 모노클로날 항체의 항원-결합 단편에 의해 생성된다. 모노클로날 항체3G4(ATCC 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마가 본 발명의 다른 측면이다.
본 발명에 따른 조성물, 면역접합체, 약제, 배합물, 콕테일(cocktail), 키트, 제1 및 제2의 의약적 용도 및 모든 방법의 하기 기술에 있어서, 용어 "항체" 및 "면역접합체", 또는 이의 항원-결합 영역은, 달리 제시하거나 과학 용어로부터 명백하지 않는한, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체의 범위 및 특정 3G4 교차 반응성 항체를 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체" 및 "면역글로불린'은 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함하는 모든 면역학적 결합제를 광범위하게 언급한다. 중쇄내 불변 영역의 유형에 따라, 항체는 5개의 주요 부류중 하나로 분리한다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. 수개의 이들 항체는 또한 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등과 같은 아부류 또는 동형으로 추가로 분리된다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 칭한다. 상이한 부류의 면역글로불린의 소단위 구조 및 3차원 구조는 잘 공지되어 있다.
일반적으로, 항원 결합 영역외의 항체가 본 발명에 사용되는 경우, IgG 및/또는 IgM이 바람직한데, 이는, 이들이 생리학적 상황에서 가장 일반적인 항체이고 이들이 실험실 세팅에서 가장 용이하게 제조되기 때문이다. 포유동물 항체의 "경쇄"는 이들의 불변 영역의 아미노산 서열을 기초로 하여, 2개의 명확하게 구별되는 유형인, 카파(κ) 및 람다(λ)중 하나로 지정된다. 필수적으로 본 발명의 항체중에 κ 또는 λ 경쇄를 사용하는 것은 바람직하지 않다.
모노클로날 항체(MAb) 또는 이의 유도체의 사용이 더욱 바람직하다. MAb는 특정의 장점, 예를 들면, 재생성 및 대량 생산의 장점을 갖는 것으로 인지되어 있어, 이들을 임상 치료에 적합하도록 한다. 따라서, 본 발명은 쥐, 사람, 원숭이, 랫트, 햄스터, 래빗 및 심지어 개구리 또는 닭 기원의 모노클로날 항체를 제공한다. 쥐, 사람 또는 사람화된 모노클로날 항체가 일반적으로 바람직할 것이다.
당해 분야의 숙련가에게 이해될 것으로써, 용어 "항체"에 의해 포함되는 면역학적 결합 시약은 이량체, 삼량체 및 다량체 항체; 비특이적인 항체; 키메라 항체; 사람 및 사람화된 항체; 재조합, 가공된 및 카멜화된(camelized) 항체, 및 이의 단편을 포함하는, 모든 종, 및 이의 항원 결합 단편으로부터의 모든 항체에 연장된다.
따라서, 용어 "항체"는 항원 결합 영역을 갖는 모든 항체-유사 분자를 말하며, 당해 용어는 Fab', Fab, F(ab')2, 단일 영역 항체(DAB), Fv, scFv(일본쇄 Fv), 선형 항체, 다이아바디(diabody), 카멜화된 항체 등과 같은 항체 단편을 포함한다. 각종 항체계 작제물 및 단편을 제조하고 사용하기 위한 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있다[참조: Kabat et al., 1991, 본원에 참조로 상세히 인용됨). 특히, 다이아바디는 또한, 각각 본원에 참조로 상세히 인용된 제EP 404,097호 및 제WO 93/11161호에 추가로 기술되어 있는 반면; 선형 항체는 또한 본원에 참조로 상세히 인용된 문헌[참조: Zapata et al. (1995)]에 또한 기술되어 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열에 대해 서열 동질성이 약 75% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상 및 가장 바람직하게는 95% 이상인 아미노산 서열 영역을 포함하는 적어도 제1의 변이 영역을 포함하는 적어도 제1 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 포함하며; 여기서, 상기 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체는, 3G4 항체에 의해 예시되는 바와 같이, 본 발명의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체의 생물학적 특성을 적어도 실질적으로 유지한다.
본 발명의 이러한 및 다른 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 서열과 관련한 상동성 또는 동질성은 본원에, 서열을 정렬시키고 갭을 도입한 후, 필요에 따라 최대 서열 상동성%를 달성한 후, 서열 2 또는 서열 4의 서열에 대해, 또는 본 발명의 다른 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체의 서열에 대해 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의한다. 서열 비교에 사용된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체의 실질적으로 동일하거나, 심지어 더욱 효과적인 생물학적 특성의 유지가 특히 중요하다. 이러한 비교는 예를 들면, 본원에 상세히 기술된 하나 이상의 각종 검정을 사용하여 용이하게 수행한다.
특정의 바람직한 양태에서, 본 발명의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체는 서열 1 또는 서열 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열 영역을 포함하는 가변 영역에 의해 예시되는 바와 같이, 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열 영역을 포함하는 적어도 제1의 가변 영역을 포함한다. 이러한 서열은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 CDR1-3(상보성 결정 영역)을 포함하는 3G4 ScFv의 Vh 및 Vκ의 서열이다.
다른 바람직한 양태에서는, 원래의 항-아미노인지질와 같은 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4(ATCC 4545)과 비교시 증가되거나 우수한 특성을 갖는 제2 세대 항체가 제공된다.
특정 양태에서, 사용된 항체는 "사람화된", 부분-사람 또는 사람 항체일 것이다. "사람화된" 항체는 일반적으로 마우스, 랫트, 또는 사람 불변 및/또는 가변 영역 도메인("부분 사람 키메라 항체")를 지닌 기타 비사람 종으로부터의 키메라 모노클로날 항체이다. 본 발명에 사용하기 위한 각종의 사람화된 모노클로날 항체는, 마우스, 랫트 또는 기타 비사람 모노클로날 항체의 적어도 제1 항원 결합 영역, 또는 상보성 결정 영역(CDR)이 사람 항체 불변 영역 또는 "구조(framework)"에 작동적으로 부착되거나 "이식(grafted)"된다.
본원에서 사용하기 위한 "사람화된" 모노클로날 항체는 또한, 하나 이상의 선택된 아미노산이 사람 항체내에서 더욱 일반적으로 관측된 아미노산으로 교환되어 있는 비-사람종으로부터의 모노클로날 항체일 수 있다. 이것은 통상의 재조합 기술, 특히 부위-특이적인 돌연변이유발의 사용을 통해 용이하게 달성할 수 있다.
"사람화된"이 아닌 전체의 사람 항체를 또한 제조하여 본 발명에 사용할 수 있다. 이러한 사람 항체는 항원이 존재하고 항체-생산 세포를 포함하는 사람 대상체로부터 혼합된 말초 혈액 림프구의 집단을 단순히 수득하고, 이를 면역학적 유효량의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 샘플과 혼합시킴에 의해 시험관내에서 당해 세포 집단을 자극시킴으로서 건강한 대상체로부터 수득할 수 있다. 사람 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 생성하는 세포는, 일단 수득되면, 하이브리도마 및/또는 재조합 항체 생산에 사용된다.
사람 모노클로날 항체 생산을 위한 추가의 기술은 사람 항체 라이브러리와 면역학적 유효량의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 샘플을 포함하는 형질전환 동물, 바람직하게는, 형질전환 마우스를 포함한다. 이는 또한 하이브리도마 및/또는 재조합 항체 생산시 추가로 조작하기 위한 사람 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체-생산 세포를 생성하며, 말초 혈액 세포보다는 비장 세포가 형질전환 동물 또는 마우스로부터 용이하게 수득될 수 있어 유리하다.
본 발명에 따른 항체는, 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)과 실질적으로 교차-반응하거나 경쟁하는 항체를 선택함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 적합한 제조 과정 및 방법은
(a) 후보 항체-생산 세포를 제조하는 단계; 및
(b) 후보 항체-생산 세포로부터 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 교차-반응하거나 경쟁하는 항체를 선택하는 단계를 포함한다.
적합한 항체-생산 세포를 제조하고 이로부터 항체를 수득하는 한가지 방법은 대상 환자 자체내에서 수행할 수 있다. 즉, 환자에게 면역학적 유효량의 면역원성 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 샘플을 단순 제공함으로써 적절한 항체가 생성될 것이다. 따라서, 항체는 여전히 항체-생산 세포로부터 "수득"되지만, 숙주로부터 분리되어 연속해서 환자에게 제공되어야 할 필요는 없으며, 종양 혈관구조에 일시적으로 국재화하여 이의 생물학적 항-종양 효과를 발휘할 수 있어야 한다. 그러나 이러한 양태는 현재 바람직하지 않다.
적합한 항체-생산 세포가 또한 수득될 수 있으며, 항체는, 말초 혈액 림프구를 실험관내에서 아미노인지질 또는 음이온성 인지질로 자극시킴에 의해 연속적으로 분리되고/되거나 정제될 수 있다.
다른 방법은 적어도 제1의 면역원성 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 성분을 포함하는 면역 조성물을 동물에게 투여하고, 면역화시키고 면역화된 동물로부터 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 교차-반응하거나 경쟁하는 항체를 선택함을 포함한다. 이러한 방법들은 일반적으로:
(a) 면역학적 유효량의 면역원성 아미노인지질 또는 음이온성 인지질을 포함하는 조성물의 적어도 1회의 투여량, 및 임의로 1회 이상의 투여량을 동물에게 투여함으로써 당해 동물을 면역화시키는 단계; 및
(b) 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 교차-반응하거나 경쟁하는 항체를 생산하는 항체-생산 세포와 같은, 면역화된 동물로부터 적합한 항체-생산 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 바람직한 "면역학적 유효량의 면역원성 아미노인지질 또는 음이온성 인지질을 포함하는 조성물"은 활성화된 내피 세포를 포함하는 조성물이다. "활성화된 내피 세포"는 바람직하게는, 세포 생존성을 실질적으로 유지시키고 내피 세포의 표면에서 하나 이상의 음이온성 인지질의 발현을 자극하는데 유효한 시간동안, 적어도 제1 조건하에 내피 세포를 두거나, 내피 세포를 활성화시키고/시키거나 종양 환경을 모사하는 적어도 제1 인자와 접촉시킴에 의해 제조한다.
활성화된 내피 세포를 제조하는데 효과적인 "조건"의 예는 저산소 및/또는 산성 환경이다. 활성화된 내피 세포를 제조하는데 효과적인 "인자"의 예는 유효 농도의 H2O2, 트롬빈, IL-1α, IL-1β, 인터페론 또는 TNFα와 같은 염증성 사이토킨 및, 일반적으로 종양 환경을 모사하는 조건 및/또는 인자들의 조합이다.
면역화 과정의 특성, 또는 면역화된 동물의 유형에 상관없이, 적합한 항체-생산 세포가 면역화된 동물로부터 수득되어, 바람직하게는 수동으로 추가로 조작된다. 본원에 사용된 것으로서, "면역화된 동물"은 달리 제시하지 않는한, 비-사람 동물이다. 어떠한 항체-생산 세포도 사용될 수 있지만, 가장 바람직하게는, 비장 세포가 항체-생산 세포 공급원으로서 수득된다. 항체-생산 세포는:
(a) 적합한 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체-생산 세포와 불멸 세포를 융합시켜 본 발명에 따라서 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하는 단계; 및
(b) 하이브리도마로부터 본 발명에 따라 적합한 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에서 사용될 수 있다.
"적합한" 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체-생산 세포, 하이브리도마 및 항체는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 교차-반응하거나 경쟁하는 항체를 생산하거나, 이러한 항체로 존재하는 것들이다.
따라서, 하이브리도마계 모노클로날 항체 제조 방법은
(a) 면역학적 유효량의 면역원성 아미노인지질 또는 음이온성 인지질을 포함하는 조성물, 바람직하게는 활성화된 내피 세포를 포함하는 조성물을 동물에게 적어도 1회 투여량, 및 임의로 1회 이상의 투여량으로 투여함으로써 면역화시키는 단계;
(b) 면역화된 동물로부터 모노클로날 항체-생산 하이브리도마의 수집물을 제조하는 단계;
(c) 수집물로부터 본 발명에 따른 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 모노클로날 항체, 임의로 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 교차-반응하거나 경쟁하는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 생산하는 적어도 제1의 하이브리도마를 생산하는 적어도 제1의 하이브리도마를 선택하는 단계; 및
(d) 적어도 제1의 항체-생산 하이브리도마를 배양하여 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 모노클로날 항체를 제공하는 단계; 및 바람직하게는
(e) 배양된 적어도 제1의 하이브리도마로부터 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 모노클로날 항체를 수득하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 교차-반응하는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 확인하는데 있어서, 선택 단계는
(a) 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 샘플, 바람직하게는 PS 샘플을 유효량의 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545) 및 후보 항체와 접촉시키는 단계; 및
(b) 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 대한 3G4 항체의 결합을 실질적으로 감소시키는 후보 항체의 능력을 측정하는 단계[여기서, 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS 샘플에 대한 3G4 항체의 결합을 실질적으로 감소시키는 후보 항체의 능력은 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체의 지표이다]를 포함할 수 있다.
선택 단계는 추가로
(a) 제1 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 샘플, 바람직하게는 PS를 유효 결합량의 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 접촉시키고 아미노인지질 또는 양이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 결합하는 3G4의 양을 측정하는 단계;
(b) 제2 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 샘플, 바람직하게는 PS를, 유효 경쟁량의 후보 항체와 조합하여 유효 결합량의 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 접촉시키고 후보 항체의 존재하에 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 3G4의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 결합하는 3G4의 양을 바람직하게는 적어도 약 80%까지 감소시키는 후보 항체를 선택함으로써 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 모든 선택 기준은 바람직하게는 혈청의 부재하에 수행하여 단백질과 함께 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 환자의 병리학적 항체를 모사하는 항체가 생성되는 단점을 피하는 것이다.
비-사람 동물이 면역화에 사용되므로, 이러한 하이브리도마로부터 수득된 모노클로날 항체는 흔히 비-사람 제조원을 지닐 것이다. 이러한 항체는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있고 또한 본원에 기술된 것으로서, 임의로 사람화 방법, 이식 또는 돌연변이에 적용시킬 수 있다. 달리는, 사람 항체 유전자 라이브러리를 포함하는, 마우스와 같은 형질전환 동물을 사용할 수 있다. 따라서, 이러한 동물의 면역화는 적합한 사람 항체를 직접 생성시킬 것이다.
사람 또는 비-사람 항체를 생산하는 것에 상관없이, 적합한 항체-생산 세포, 가장 바람직하게는 하이브리도마를 생산한 후, 모노클로날 항체-암호화 핵산을 클로닝하여 "재조합" 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. PCRTM의 사용을 포함하는, 특정한 재조합 클로닝 기술을 사용하여 항체-암호화 핵산 서열의 합성을 개시할 수 있다. 따라서, 추가의 적절한 모노클로날 항체 제조 방법은 다음과 같은 항체-생산 세포를 사용함을 포함하는 방법을 포함한다:
(a) 적합한 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체-생산 세포, 바람직하게는 하이브리도마로부터 제1의 적합한 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체-암호화 핵산 분자 또는 분절을 수득하는 단계; 및
(b) 재조합 숙주 세포내에 핵산 분자 또는 분절을 발현시켜 본 발명에 따르는 재조합 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 모노클로날 항체를 수득하는 단계.
그러나, 재조합 모노클로날 항체의 제조에 이상적으로 적합한 기타 강력한 재조합 기술을 이용할 수 있다. 이러한 재조합 기술은 다음을 포함하는 파지미드 라이브러리(phagemid library)계 모노클로날 항체 제조방법을 포함한다:
(a) 면역학적 유효량의 면역원성 아미노인지질 또는 음이온성 인지질을 포함하는 조성물, 바람직하게는 활성화 내피 세포를 포함하는 조성물의 하나 이상의 투여량 및 임의로 1 초과의 투여량을 동물에게 투여하는 단계;
(b) 면역화된 동물의 항체-생산 세포, 바람직하게는 비장으로부터 분리된, RNA를 발현하는 조합성 면역글로불린 파지미드 라이브러리를 제조하는 단계;
(c) 하나 이상의 제1 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC 4545)와 실질적으로 교차-반응하거나 경쟁하는 것을 발현하는 적어도 제1의 클론을 파지미드 라이브러리로부터 선택하는 단계;
(d) 적어도 제1의 선택된 클론으로부터 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체-암호화 핵산을 수득하고 재조합 숙주 세포내의 핵산을 발현시켜 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 제공하는 단계; 및 바람직하게는
(e) 적어도 제1의 선택된 클론으로부터 수득된 핵산에 의해 발현된 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 수득하는 단계.
다시, 이러한 파지미드(phagemid) 라이브러리계 기술에서, 사람 항체 유전자 라이브러리를 지닌 형질전환 동물을 사용할 수 있으며, 이에 따라 재조합 사람 모노클로날 항체가 수득된다.
제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 핵산 분절의 제조 방식에 상관없이, 추가의 적합한 항체 핵산 분절을 표준 분자 생물학 기술에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 어떠한 변이체, 돌연변이체 또는 제2 세대 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 핵산 분절도 본 발명에 사용하기에 적합하다는 사실을 확인하기 위해, 핵산 분절을 시험하여 본 발명에 따라서 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체의 발현을 확인할 것이다. 바람직하게는, 변이체, 돌연변이체 또는 제2의 생산 핵산 분절을 또한 시험하여, 표준, 더욱 바람직하게는 표준의 엄격한 하이브리드화 조건하에서의 하이브리드화를 확인할 것이다. 예시적인 적합한 하이브리드화 조건은 약 50℃에서의 약 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 약 0.5M NaPO4, 약 1mM EDTA중 하이브리드화 및 약 42℃에서 약 1% SDS를 사용한 세척을 포함한다.
각종 재조합 모노클로날 항체로서, 사람 또는 비-사람 기원이 용이하게 제조될 수 있는지에 상관없이, 동물 또는 환자에게서 생물학적 유효량의 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 발현하는 적어도 제1의 핵산 분절을 동물 또는 환자에게 제공함에 의해 본 발명의 어떠한 치료 방법도 발휘될 수 있다. "항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질, 3G4-유사 또는 3G4계 항체를 발현하는 핵산 분절"은 일반적으로 적어도 발현 작제물의 형태일 수 있고 바이러스 또는 재조합 숙주 세포내 포함된 발현 작제물의 형태일 수 있다. 본 발명의 바람직한 유전자 치료요법 벡터는 일반적으로 재조합 레트로바이러스, 헤르페스 단성 바이러스(HSV), 아데노바이러스, 아데노-연합 바이러스(AAV), 사이토메갈로바이러스(CMV)내 포함된 것과 같은 바이러스 벡터일 것이다.
세포 비침투성 듀라마이신 유도체: 본 발명은 또한 변형되어 실질적으로 세포 비침투성 PE-결합 작제물을 형성하는 적어도 제1의 PE-결합 펩타이드를 포함하는 실질적인 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드 작제물 및 유도체를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 변형되어 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 작제물을 형성하는 적어도 제1 PE-결합 펩타이드를 포함하는, 적어도 제1의 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 작제물의 생물학적 또는 치료학적 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체속에 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 따라서, 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 작제물은 약제학적, 약리학적 및 치료학적, 예를 들면 의학적으로 사용하기 위한, 바람직하게는 바이러스 감염 치료에 사용하기 위한 작제물이다. 특정 양태에서, 본 발명은 바이오틴에 연결된 신나마이신외에 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 작제물을 제공한다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 펩타이드 유도체 및 이의 약제학적 조성물이다. 듀라마이신 펩타이드는 통상적으로 변형되어 적어도 제1의 세포 비침투성 그룹에 작동적으로 부착함에 의해 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체를 형성한다. 세포 비침투성 그룹의 작동적 부착은 서열 9의 2번 아미노산 위치에서의 라이신 잔기를 통해 이루어질 수 있다.
세포 비침투성 그룹은 생리학적 pH에서 양성 또는 음성 전하를 가지거나 극성일 수 있다. 예시적인 그룹은 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 카복실, 페놀성, 4급 암모늄 이온 및 아민 그룹을 포함한다. 바이오틴에 연결된 듀라마이신을 포함하는 약제학적 조성물이 본 발명의 특정 예이다.
실질적인 세포 비침투성 듀라마이신은 또한 당, 올리고- 또는 다당류, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 또는 다가알콜 그룹에 작동적으로 부착될 수 있다. 특정의 세포 비침투성 듀라마이신은 뉴트라비딘, 스트렙타비딘, 알부민과 같은 불활성 담체 단백질, 또는 불활성 면역글로불린 담체 단백질에 작동적으로 부착된 것들이며, 이중 듀라마이신이 사람 IgG(HIgG)에 부착된 것이 특히 바람직하다. 세포 비침투성 듀라마이신의 다른 예는 표적화제, 바람직하게는 종양 세포, 종양 혈관구조 또는 종양 기질 또는 바이러스 감염된 세포에 결합하는 것들이다. 종양 세포, 종양 혈관구조 또는 종양 기질의 성분에 결합하는 표적화제의 예는 본원에 참조로 상세히 인용된 미국 특허 제6,093,399호, 제6,004,555호, 제5,877,289호 및 제6,036,955호에 교시되어 있다.
종양 치료: 본 발명은 또한 적어도 제1의 정제된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역접합체와 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 동일한 에피토프에 필수적으로 결합하는 것, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 바람직하게는 정맥내 투여와 같은 비경구 투여용, 또는 리포좀 또는 에어로졸과 같은 투여용으로 제형화된 것들을 포함하는, 약제학적으로 허용되는 조성물이다.
본 발명은 3G4-교차-반응성의 3G4 유사 또는 3G4계 항체를 포함하는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 및 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체의 다수 방법 및 용도를 제공한다. 모든 방법들과 관련하여, 용어 "하나(a 또는 an)"은 특별히 기술한 경우를 제외하고는 인용된 방법의 "하나 이상", "적어도 제1의", "하나 이상" 또는 "다수"의 단계를 의미하는데 사용된다. 이는 특히 치료 방법에 있어서의 투여 단계와 관련되어 있다. 즉, 본 발명에서 사용된 상이한 투여량 뿐만 아니라, 상이한 다수의 투여량, 예를 들면, 주입 또는 흡입이 다수의 주입 또는 흡입에 까지 및 이를 포함하여 사용될 수 있다. 배합 치료요법이 사용될 수 있고, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 면역접합체 또는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체의 투여 전, 투여 후 또는 투여 동안 투여될 수 있다.
중요한 생물학적 영향을 갖는 각종의 유용한 시험관내 방법 및 용도가 제공된다. 첫번째로 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS 또는 PE를 포함하는 조성물을 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 또는 이의 항원 결합 단편과, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체와, 또는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체와 효과적으로 접촉시킴을 일반적으로 포함하는, 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS 또는 PE를 결합시키는 방법 및 이러한 결합에 있어서의 용도를 제공한다. "접촉"은 결합된 복합체가 형성되도록 하고, 형성된 어떠한 복합체도 검출되도록 하는데 효과적인 조건하에 수행된다. 검출 방법 및 용도는 생물학적 샘플과 관련하여, 예를 들면, 세포사멸, 종양 및 바이러스 감염된 세포 진단시 사용될 수 있으며, 이를 기초로한 진단 키트도 또한 제공된다.
본 발명의 항체, 항원 결합 단편 및 면역접합체를 바람직하게 사용하는 증식 억제 방법 및 용도도 제공된다. 내피 세포 증식 및/또는 이주를 억제하는 방법은 일반적으로 내피 세포의 집단을 포함하는 세포 또는 조직의 집단을, 생물학적 유효량의 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체와, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 내피 세포 증식 및/또는 이주를 억제하는데 효과적인 조건하에 접촉시킴을 포함한다.
상기 방법 및 용도는 시험관내 및 생체내에서 수행할 수 있으며, 생체내에서 수행하는 경우, 조직 또는 세포는 동물내에 위치하며 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체는 동물에게 투여된다. 둘다의 경우에서, 당해 방법 및 용도는 잠재적인 혈관형성 혈관 또는 이의 집단을 포함하는 조직 또는 이의 집단을, 생물학적 유효량의 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체와, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것, 또는 이의 항원-결합 단편과 혈관형성을 억제하는데 효과적인 조건하에서 접촉시킴을 포함하여, 혈관형성을 억제하는 방법 및 용도가 된다.
잠정적인 혈관형성 혈관의 집단이 생체외에서 유지되는 경우, 본 발명은 약물 전달 프로그램에서 이용된다. 시험관내 스크리닝 검정에서, 확실한 양성 및 음성 대조군을 사용하는 것은, 혈관형성을 억제하거나 촉진시키는 약물의 개발, 및 혈관형성 과정에서 추가의 정보의 기술에서 제1 단계로 유용한다. 잠재적인 혈관형성 혈관의 집단이 동물 또는 환자내에 위치하는 경우, 항-혈관형성 조성물을 치료요법의 형태로서 동물에게 투여한다.
항-혈관형성 및 항-혈관 치료요법은 바람직하지 않고, 부적절하며, 비정상적이고, 과도하고/하거나 생리학적 혈관신생으로 특징화되는 어떠한 질병 또는 장애가 있거나 이러한 질병 또는 장애로 진행될 위험에 있는 동물 및 환자의 측면에서 제공된다. 비정상적인 혈관형성은 광범위한 질병 및 장애에서 발생하므로, 제공된 항-혈관형성 치료요법이, 일단 어떠한 허용되는 모델 시스템에서 효과적인 것으로 밝혀지면, 이를 혈관형성과 관련된 질병 및 장애 전체 범위를 치료하는데 사용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 방법 및 용도는 특히, 어떠한 형태의 혈관화 종양; 노화 관련 황반 변성을 포함하는 황반 변성; 류마티스 관절염을 포함하는 관절염; 죽상경화증 및 죽상경화판; 당뇨병성 망막병증 및 기타 망막병증; 그레이브스 병(Grave's disease)을 포함하는 갑상샘 과다형성; 혈관종; 신생혈관 녹내장 및 건선에 걸렸거나 이러한 질병으로 진행될 위험이 있는 동물 및 환자에게 사용하도록 의도된다.
본 발명의 방법 및 용도는 또한 동정맥 기형(AVM), 수막종, 및 혈관성형술에 이은 재협착을 포함하는 혈관 재협착을 지니거나 이러한 상태로 진행될 위험이 있는 동물 및 환자를 치료하도록 의도된다. 치료 방법 및 용도의 다른 의도된 표적은 혈관섬유종, 피부염, 자궁내막증, 혈우병 관절, 비대 흉터, 염증 질병 및 장애, 화농육아종, 피부경화증, 윤활막염, 트라코마 및 혈관 유착이 있거나 이러한 상태로 진행될 위험이 있는 동물 및 환자의 치료 방법 및 용도의 표적물로 의도된다.
본원에 참조로 상세하게 인용된 미국 특허 제5,712,291호에 기술된 바와 같이, 상기 치료 그룹 각각은 본 발명에 의해 치료될 상태 유형의 완전한 수단은 없다. 미국 특허 제5,712,291호는 항-혈관형성 치료요법에 의해 효과적으로 치료될 수 있는 다수의 다른 상태를 확인하기 위한 목적; 일단 혈관형성 억제 화합물의 정의된 범주가 기술되고 청구되면[본 경우에는, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것], 모든 혈관형성 질병이 단일화된 개념을 나타냄을 보여주기 위한 목적; 및 모든 혈관형성 질병의 치료가 단지 하나의 모델 시스템으로부터의 데이타에 의해 가능함을 보여주는 목적을 포함하는, 특정의 특수 목적을 위해 참조로 본원에서 인용된다.
혈관형성 및 혈관 질병의 치료외에, 본 발명의 중요하고 통합된 측면은 암이 있거나 암으로 진행될 위험이 있는 동물 및 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법이다. 모든 암 치료 방법 및 용도는 적어도 제1의 정제된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역접합체, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 필수적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체의 투여 또는 사용을 포함한다. 이러한 작제물은 치료학적 유효량으로 암에 걸린 동물 또는 환자에게 투여된다.
본 발명의 암 치료 방법, 심지어 항체를 사용하는 방법은 단독으로 항-혈관 및/또는 항-혈관형성 효과를 발휘하지 않는다. 본 발명의 암 치료 방법 및 용도는 혈관화 고형 종양, 일차 암으로부터의 전이 종양 또는 전이를 지니거나 이렇게 질행될 위험이 있는 동물 및 환자를 포함하는 모든 형태의 암을 치료하는데 적합하다.
접합되지 않거나, "노출된 항체(naked antibody)" 및 이의 단편과, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 치료제에 작동적으로 부착된 면역접합체 둘다가 본 발명의 항-암 측면에서 사용될 수 있다. 따라서, 달리 특정하게 기술하거나 과학적 용어로 명백하지 않는 한, 본원에 사용된 것으로서 용어 "항체 및 이의 단편"은 다른 제제, 특히 치료제 또는 진단제에 부착되지 않는 "접합되지 않거나 노출된" 항체 또는 단편을 의미한다. 이러한 정의는 예로써 항체, 또는 항체와 다른 유효인자의 배합물의 생물학적 반감기, 친화도, 친화성 또는 기타 특성을 향상시키기 위한 변형과 같은, 항체의 변형을 배제하지는 않는다.
암 치료용의 면역접합체를 기초로 하는 방법에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항-암 효과를 직접적으로 또는 간접적으로 지닐 수 있는 어떠한 하나 이상의 범위의 생물학적 치료제 및/또는 소위 제2의 항암제(제1의 항-혈관형성제인 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 자체)에 작동적으로 부착된다.
따라서, 본 발명은 또한 종양에 선택된 치료제 또는 진단제를 전달하기 위한 방법 및 용도를 제공한다. 이러한 양태는 진단제 또는 치료제가 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합된 것에 작동적으로 부착된 적어도 제1의 면역접합체를 포함하는 조성물의 생물학적 유효량을 종양을 지닌 동물 또는 환자에게 투여함을 포함한다.
따라서, 본 발명의 조성물, 및 방법 및 용도는 적어도 제1의 생물학적, 치료 또는 진단제에 작동적으로 부착된, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한 것을 포함하는 조성물을 포함한다. 항체는 바람직하게는 방사치료요법제, 항-혈관형성제, 세포사멸-유도제, 항-튜불린 약물, 항-세포성, 세포독성제 또는 사이토킨(또는, 하기 논의한 바와 같은 항-바이러스 약물)에 연결된다.
부착용의 특정의 바람직한 제제는 예를 들면, 접합체가 화학치료요법용 대리 마커로 사용되도록 하는 생체내 진단제이다.
항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 치료 접합제에서 사용하기 위한 바람직한 제제는 항체의 효과를 보완하거나 증진시키는 것들 및/또는 특정 종양 유형 또는 환자에 대해 선택된 것들이다. "항체의 효과를 보완하거나 증진시키는 치료제"는 방사치료요법제, 혈관 침투 증진제, 특정의 사이토킨, 항-혈관형성제, 세포사멸 유도제, 및 항-튜불린 약물을 포함하며, 이들중 하나 이상이 함께 사용될 수 있다.
현재 바람직한 제제는 세포독성제, 겔로닌; TNFα, IL-12 및 LEC(간-발현된 케모킨)과 같은 사이토킨; 표 E에서와 같이, 항-혈관형성 효과를 지닌 항암제; 표 F에서와 같이 세포사멸을 유도하는 항암제 및 콤브레타스타틴 게열로부터의 항-튜불린 약물이다. 특히 바람직한 제제는 도세탁셀이다.
본 발명의 암 치료 조성물 및 방법은 또한 다른 치료 및 진단제와 함께 사용될 수 있다. 치료제와의 배합에 있어 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 또는 3G4계 항체의 측면에서 "배합된" 용도는 배합 조성물, 약제, 콕테일, 키트, 방법을 포함하며, 여기서, 치료제는 전구약물의 형태이다.
배합된 암 치료 방법은, 적어도 제1의 정제된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역접합체, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 필수적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것들, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체가 적어도 제2의 치료제 또는 항암제의 치료학적 유효량과 함께 암을 지닌 동물 또는 환자에게 투여되는 방법이다.
본 발명은 또한 생물학적 유효량의 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것들, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역접합체, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체; 및 생물학적 유효량의 적어도 제2의 생물학적 제제, 성분 또는 시스템, 바람직하게는 적어도 제2의 치료제 또는 항암제를, 임의로 적어도 제1의 조성물 또는 용기내에 포함하는 조성물, 약제학적 조성물, 치료 키트 및 의학적 콕테일을 제공한다.
"적어도 제2의 생물학적 제제, 성분 또는 시스템"은 종종 치료제 또는 진단제, 성분 또는 시스템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 적어도 제2의 생물학적 제제, 성분 또는 시스템은 항체를 변형시키고/시키거나 다른 제제를 항체에 부착시키기 위한 성분들을 포함할 수 있다. 특정의 바람직한 제2의 생물학적 제제, 성분 또는 시스템은 전구약물 자체를 제조하기 위한 성분 및 본 발명의 항체를 이러한 전구약물 또는 ADEPT 양태에서 작용하도록 개조한 성분들을 포함하는 전구약물의 제조 및 사용을 위한 전구약물 또는 성분들이다.
치료할 질병이 암인 경우, "적어도 제2의 치료제 또는 항암제"는 치료학적 키트 또는 콕테일에 포함될 것이다. 용어 "적어도 제2의 항암제"는 제1의 항암제인, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4 작제물, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체를 참조하여 선택한다. 즉, 본 발명의 항체는 화학치료요법제, 방사치료요법제, 사이토킨, 항-혈관형성제, 세포사멸 유도제 또는 항암 면역독소 또는 응고리간드(coaguligand)와 결합될 수 있다. "화학치료요법제"는 또한 유전자, 벡터, 안티센스 작제물 및 리보자임을 포함한다.
현재 바람직한 제2의 항암제는 표 E에서와 같은 항-혈관형성 효과를 갖는 항암제; 표 F에서와 같이 세포사멸을 유도하는 항암제; 및 콤브레타스타틴 게열로부터의 항-튜불린 약물이다. 특히 바람직한 제제는 도세탁셀이다.
본 발명의 조성물, 키트 및/또는 의약의 측면에서, 배합된 유효량의 치료제는 단일 용기 또는 용기 수단내에 포함되거나 별개의 용기들 또는 용기 수단들내에 포함될 수 있다. 콕테일은 일반적으로 배합용으로 함께 혼합될 것이다. 정맥내 투여용으로 제형화된 제제가 종종 바람직하다. 영상화 성분들이 또한 포함될 수 있다. 키트는 또한 포함된 적어도 제1의 항체 및 하나 이상의 다른 생물학적 제제를 사용하기 위한 지침서를 포함할 수 있다.
일반적으로 말해서, 적어도 제2의 항암제는 단일의 약제학적 조성물 또는 2개의 약제학적 조성물이 함께 근접하게 투여되는 것과 같이, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4계 치료제 또는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체와 실질적으로 동시에 동물 또는 환자에게 투여될 수 있다.
달리는, 적어도 제2의 항암제를 동물 또는 환자에게 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4계 치료제 또는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체의 투여에 연속된 싯점에 투여할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "연속된 싯점"은, 적어도 제2의 항암제가 동물 또는 환자에게 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4계 치료제 또는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체의 투여와는 별개의 시간에 투여되도록 "시간차를 두는것(staggered)"을 의미한다. 2개의 제제는 이들이 각각의 치료 효과를 발휘하도록 효과적으로 떨어진 시간에 투여하는데, 예를 들어, 이들은 "생물학적으로 효과적인 시간 간격"에서 투여된다. 적어도 제2의 항암제는, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4계 치료제 또는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체 투여전 생물학적으로 효과적인 시간에, 또는 이러한 치료제 투여 후 생물학적으로 효과적인 시간에 동물 또는 환자에게 투여될 수 있다.
종양 영상화는 또한 바람직하게는 검출가능하게 표지된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 항체 작제물을 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 영상화는 예비-세포사멸성 및 세포사멸성 세포를 검출할 수 있으므로, 대리 마커로서 치료요법후 사용될 수 있다. 달리는, 형성된 영상이 사용되는 치료제의 결합 부위의 지표일 것이므로, 영상화를 치료전에 수행할 수 있다. 따라서, 암 치료는
(a) 종양을 지닌 동물 또는 환자에게 종양 결합제 또는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 항체에 작동적으로 부착된 진단제를 포함하는, 적어도 제1의 검출가능하게 표지된 종양 결합제, 바람직하게는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 항체 작제물의 진단학적 최소량을 종양을 지닌 동물 또는 환자에게 투여함으로써 종양의 검출가능한 영상을 형성시킴에 의해 종양의 영상을 형성시키는 단계; 및
(b) 연속적으로 동일한 동물 또는 환자에게 치료학적 최적량의 적어도 제1의 노출된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4 항체 또는 이러한 항체를 사용한 치료제-항체 작제물을 투여함으로서 항종양 효과를 유발시키는 단계에 의해 수행될 수 있다.
따라서,
(a) 종양 결합제 또는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 항체에 작동적으로 부착된 검출가능한 제제를 포함하는, 검출가능하게 표지된 종양 결합제, 바람직하게는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 항체 작제물의 진단 유효량을 포함하는 제1의 약제학적 조성물; 및
(b) 하나 이상의 노출된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4 항체 또는 이러한 항체를 사용하는 치료제-항체 작제물을 포함하는 제2의 약제학적 조성물을 일반적으로 포함하는 영상화 및 치료 제형 또는 의약이 제공된다.
바이러스 감염 치료: 본 발명의 특히 중요하고 놀라운 발전은 바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 조성물, 배합물, 키트, 방법, 용도 및 의약에 관한 것이다. 본 발명의 항-바이러스 치료 방법은 본 발명의 선행 및 추가의 치료제중 하나 이상의 투여 또는 용도에 관한 것이다.
제1의 예에서, 본 발명의 항-바이러스 조성물 및 치료 방법은, 조성물 및 암 치료 측면에서 위에서 기술한 바와 같은, 적어도 제1의 정제된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 필수적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체의 투여 또는 용도에 관한 것이다. 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체중에서, 사용하기에 바람직한 것은 HIgG에 연결된 듀라미아신 또는 바이오틴에 연결된 듀라마이신과 같은 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체일 것이다.
본 발명의 항체와 펩타이드 및 바이러스 감염 사이의 놀라운 관계를 제공하면서, 본 발명은 또한 바이러스 감염을 치료하는데 사용하기 위한 신규 범위의 치료제를 제공한다. 특히, 본 발명은 적어도 제1의 항-바이러스제에 작동적으로 연결된 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 특히 PS 및 PE에 대한 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 적어도 제1의 항-바이러스제에 작동적으로 연결된 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 듀라마이신 펩타이드 유도체를 제공한다. 본 발명의 항체 및 펩타이드에 부착시키기 위한 적합한 항-바이러스제는 표 G에 설정된 것들을 포함한다.
따라서, 본 발명의 총체적인 항-바이러스 조성물 및 치료 방법은 바이러스 감염된 동물 또는 환자에게 치료학적 유효량의 적어도 제1의 정제된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항-바이러스 면역접합체, 임의로 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 필수적으로 동일한 에피토프에 결합한 것, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체, 또는 이의 항-바이러스 면역접합체를 포함하는 조성물을 투여하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 항-바이러스 치료 방법 및 용도는 동물 및 환자, 및 심지어 식물에서 모든 바이러스를 치료하는데 적합하다. 본 발명의 치료제는 바이러스 도입을 억제할 수 있으나, 바람직하게는 감염된 숙주 세포로부터의 바이러스 복제, 배출(egress) 및 확산을 억제한다. 본 발명은 표 H에 나열된 척추동물, 특히 사람에 감염되는 모든 바이러스, 및 특히 사람에게서 병원성인 바이러스를 치료하는데 적합하다. 본 발명에 의해 치료될 수 있는 바이러스 감염 및 관련 질병은 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡계 신시티얼 바이러스(RSV) 및 아레나바이러스 감염, 및 또한 간염 바이러스, 인플루엔자, 폐렴, 라싸 열(Lassa fever) 및 AIDS의 치료에 의해 예시되는 바와 같이, 표 J에 설정된 바이러스 감염 및 질병을 포함한다.
본 발명의 항-바이러스 치료 조성물 및 방법은 또한 다른 치료제 및 진단제와 배합하여 사용할 수 있다. 이러한 "배합된" 용도는 배합된 조성물, 약제, 콕테일, 키트 및 치료 방법에서 별개의 항-바이러스제와 배합된다.
전술한 암 및 항-바이러스 치료 방법 및 용도는 흔히 약제학적으로 효과적인 조성물을 동물 또는 환자에계 경피, 근육내, 정맥내 주사 등과 같이 전신계적으로 투여함을 포함할 것이다. 바이러스 감염, 특히 호흡기 바이러스 감염을 치료하기 위해서는, 에어로졸을 사용하여 달성될 수 있는 것으로서 폐로의 전달이 바람직하다. 그러나, 치료제가 종양 또는 바이러스 감염 부위에 국재화되도록 하는 어떠한 투여 경로도 허용될 것이다. 따라서, 다른 적합한 전달 경로는 경구, 직장내, 비내, 국소 및 질내 투여를 포함한다. 관절염의 치료를 위한 용도 및 방법을 위해서는, 예를 들면, 본원에서 참조로 상세히 인용된 미국 특허 제5,753,230호에서 기타 면역학적 제제에 대해 기술된 바와 같은, 윤활막내 투여가 사용될 수 있다. 눈과 관련된 상태를 위해서는, 안과 제형 및 투여가 고려된다.
본원에 사용된 것으로서, "투여"는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 치료제, 또는 실질적인 세포 비침투성 인지질 항체 또는 3G4계 치료제, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 듀라마이신 유도체를 치료 효과가 발휘되기에 효과적인 양 및 시간 동안 제공하거나 전달하는 것을 의미한다. 단백질성 치료요법제의 수동적 투여가 부분적으로는 이의 단순성 및 반복성을 위해 일반적으로 바람직하다.
그러나, 용어 "투여"는 치료제가 전달되는 어떠한 및 모든 수단을 언급하는데 사용된다. 따라서, "투여"는 효과적인 방식으로 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4계 또는 듀라마이신 유도체 치료요법제을 생산하는 세포를 제공하는 것을 포함한다. 이러한 양태에서는, 세포를 선택적으로 침투성인 막, 구조물 또는 이식가능한 장치, 일반적으로 제거함으로서 치료를 중단할 수 있는 장치내에 제형화하거나 패키징시키는 것이 바람직할 수 있다. 외인성 투여가 여전히 일반적으로 바람직한데, 이는 당해 투여량이 밀접하게 모니터되거나 조절되도록 하는 비-침습적인 방법을 나타내기 때문일 것이다.
본 발명의 치료 방법 및 용도는 또한 생체내에서 이를 발현시키기에 효과적인 방식으로 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4계 또는 듀라마이신 유도체 치료요법제를 암호화하는 핵산을 제공하는 것에 연장된다. 노출된 DNA 전달, 재조합 유전자 및 벡터, 환자의 세포의 생체외 조작을 포함한 세포계 전달 등과 같은 어떠한 유전자 치료요법 기술도 사용될 수 있다. 리포좀 및 은밀화된 리포좀(stealthed liposome)이 일부 양태에서 사용하기에 바람직할 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물 및 치료 방법은 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 임의로 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545), 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 면역접합체, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체의 "치료학적 유효량"을 사용한다. "치료학적 효과" 및 연속된 "치료학적 유효량"은 암 치료 대 항-바이러스 치료에 있어서 상이한 매개변수로 측정한다.
암 치료에서, 제제의 양은 종양 세포, 종양 또는 종양내 혈관 내피 세포의 적어도 일부분을 특이적으로 사멸시키고; 종양 세포, 종양 또는 종양내 혈관 내피 세포의 적어도 일부분에서 세포사멸을 특이적으로 유도하고; 종양 또는 종양내 혈관의 적어도 일부분에서 응고를 특이적으로 촉진시키고; 종양의 혈액 수송 관의 적어도 일부를 특이적으로 폐쇄시키거나 파괴하고; 종양의 적어도 일부에서 괴사를 특이적으로 유도시키고/시키거나 동물 또는 환자에게 투여시 종양 회귀 또는 완화를 유도하는데 효과적이다.
바이러스 감염 및 관련 질병을 치료하는데 있어서, 제제의 양은 바이러스 도입, 및 바람직하게는 바이러스 복제, 배출 및 감염된 숙주 세포로부터의 확산과 같은 진행중인 바이러스 감염에 있어 하나 이상의 요건을 억제하는데 효과적이다. 또한, 제제의 양은 바이러스 복제, 확산 및 진행중인 감염에 상응하는 방식으로 바이러스 감염된 세포의 적어도 일부를 죽이거나 제거할 수 있다. 총괄하여, 제제의 양은 동물 또는 환자에게 투여시 바이러스 감염을 감소시키거나, 현저히 감소시키거나 전멸시키는데 효과적이다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "우선적으로는" 및 "특이적으로"는, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4계 치료제, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 듀라마이신 유도체가 질병 부위에 실질적으로 한정된 항암 또는 항-바이러스 효과를 달성하고 실질적으로 동물 또는 대상체의 정상인 건강한 조직에서의 응고, 파괴 및/또는 조직 괴사를 유발하지 않음을 의미한다. 따라서, 건강한 세포 및 조직의 구조 및 작용은 본 발명의 실시에 의해 실질적으로 손상되지 않고 유지된다.
하기 도면들은 본 명세서의 일부를 구성하며 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 나타낸 특정 양태의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참조하여 더욱 잘 이해될 수 있다. 본 특허의 미국 파일은 칼라로 제작된 하나 이상의 도면을 포함한다. 칼라 도면을 갖는 당해 특허의 사본은 미국 특허 상표청에 요청하고 필요한 비용을 지불하면 제공될 것이다.
도 1은 마우스에서 L540 사람 호지킨 림프종, 3LL 쥐 폐 암종 및 B16 쥐 흑색종 종양의 혈관 내피 세포에 대한 항-PS 항체(3SB)의 국재화를 도시한 것이다. 종양을 지닌 SCID 마우스에게 20㎍의 항-PS(3SB) 또는 항-CL(D11) 마우스 IgM을 정맥내 주사하였다. 혈액 순환을 1시간 후 염수로 관류시켰다. 마우스를 1시간 후 참수시키고 종양 및 기관을 수거하여 신속히 동결시켰다. 마우스 IgM을 항-마우스 IgM-퍼옥시다제 접합체를 사용하여 동결된 단면상에서 검출하였다. 항-PS 항체는 모든 종양에서의 혈관에 대해 특이적으로 국재화하였다(화살표로 표시). 대조군인, 항-CO IgM을 주사한 마우스에서는 국재화가 관측되지 않았다.
도 2a 및 도 2b는 플라스틱에 흡착된 인지질에 대한 9D2 항체 및 아넥신 V의 결합을 도시한다. 인지질은 미세역가 플레이트의 플라스틱에 흡착되었다. 10% 혈청으로 차단시킨 후, 9D2 항체(도 2a) 또는 아넥신 V(도 2b)를 10% 혈청의 존재하에서 6.66nM 내지 0.005nM 범위의 농도로 가하였다. 플레이트를 세척하고 결합된 9D2 항체 및 아넥신 V를 염소 항-랫트 IgM-HRP 및 래빗 항-아넥신 V IgG에 이어 항-래빗-HRP를 각각 사용하여 검출하였다.
도 3은 경쟁하는 인지질 리포좀과 함께 H2O2-처리된 내피 세포상에서 음이온성 인지질에 대한 9D2 항체 및 아넥신 V의 결합을 억제하는 것을 도시한 것이다. 9D2 항체 및 아넥신 V(6.66nM)를 10% 혈청을 함유하는 각종의 인지질 리포좀(200㎍/ml) DPBS 완충액과 함께 예비 항온처리한다. 결합된 9D2 항체 및 아넥신 V를 염소 항-랫트 IgM-HRP 및 래빗 항-아넥신 V IgG에 이은 항-래빗-HRP 각각을 사용하여 검출하였다. 경쟁하는 리포좀의 존재 또는 부재하에서의 결합을 측정하였다. 3회 측정의 표준편차는 평균치의 10% 미만이었다.
도 4은 마우스에서 같은 자리 MDA-MB-231 사람 유방 종양에서 혈관 내피 세포 및 종양 세포에 대한 바이오티닐화된 9D2 항체 및 아넥신 V의 국재화를 도시한 것이다. 이들의 유방 지방 덩이내 MDA-MB-231 종양을 지닌 Nu/nu 마우스에 50㎍의 바이오티닐화된 9D2 항체 또는 100㎍의 바이오티닐화된 아넥신 V를 정맥내 주사하였다. 1시간 후, 이들의 혈액 순환을 염수로 관류시켰다. 종양 및 기관을 제거하여 신속히 동결시켰다. 국재화된 9D2 및 아넥신 V를 스트렙트아비딘-HRP 접합체를 사용하여 동결된 단면에서 검출하였다. 염수 또는 대조군 랫트 IgM을 주사한 마우스로부터 유도된 종양 단면은 음성 대조군으로 제공되었다.
도 5는 PS 노출시 저산소증 및 염증 사이토킨의 배합 효과를 도시한 것이다. bEnd.3 세포를 24시간 동안 IL-1α 및 TNFα로 정상(백색 바아) 및 저산소증(회색 바아) 조건하에서 IL-1α 및 TNFα로 처리하였다. 세포 단층은 이러한 조건하에서 완전하게 생존된 상태로 잔류한다. PS 외부화를 125I-아넥신 V의 결합을 측정함으로써 측정하였다. PS 노출 수준은 악티노마이신 D 및 TNFα의 배합물로 치료된 세포에서의 노출 수준의 퍼센트로 나타내었다.
도 6a 및 도 6b는 동계 및 이계(xenogeneic) 종양을 지닌 동물에서 항-PS 항체(3SB)의 항-종양 효과를 도시한 것이다. 쥐 결장직장 암종 콜로 26(도 6a) 또는 사람 호지킨 림프종 L540(도 6b)의 1x107 세포를 BALB/c 마우스(도 6a) 또는 수컷 CB17 SCID 마우스(도 6b)의 우측 옆구리내로 피하 주사하였다. 종양이 약 0.6 내지 0.9cm3의 크기로 자라도록 한 후 마우스(그룹당 4마리)에 20㎍의 노출된 항-PS 항체(□) 또는 염수(○)를 복강내 주사하였다. 치료를 3회 48시간의 간격으로 반복하였다. 동물을 종양 측정 및 체중에 대해 매일 모니터하였다. 종양이 2cm3에 이르거나 종양이 괴사 또는 궤양화의 신호를 나타내기 전에 마우스를 참수시켰다. 대조군 마우스 IgM은 염수에 재해 유사한 결과를 제공하였다.
도 7은 L540 사람 호지킨 림프종을 지닌 마우스에서 9D2 항체의 항-종양 효과를 도시한 것이다. 종양을 지닌 마우스 그룹에 100㎍의 9D2 항체(●)를, 대조군(□)과 대치되는 것으로써, 매주 3회 복강내 주사하였다. 종양 크기클 1주에 2회씩 캘리퍼스로 측정하였다. 종양 용적을 종양 세포를 주사한 후 경과일수에 대해 플롯팅한다. 괄호안의 수는 회귀된 종양/그룹당 마우스의 총수를 갖는 마우스의 수를 나타낸다.
도 8a, 8b, 8c, 8d, 8e, 8f 및 8g는 동계 및 이계 종양을 지닌 동물에서 항-PS 항체인 3G4의 항-종양 효과를 도시한 것이다. 쥐 Meth A 종양(도 8a), 사람 MDA-MB-231 유방암(도 8b 및 도 8e), 사람 호지킨 림프종 L540(도 8c 및 8d) 및 MDA-MB-231 암(도 8f 및 8g)을 마우스에 주사하였다. 종양이 치료 전에 나타난 크기로 성장하도록 하였다. 사람 호지킨 림프종 세포가 큰 종양을 형성하도록 하였다. 마우스의 각각의 그룹에, 대조군에 대치되는 것으로서 100㎍의 3G4 항체를 주당 3회 복강내 주사하였다(3G4는 도 8A, 8B 및 8C에 기술되었고, 도 8d, 8e 및 8f상에 ○로 나타내었다). 동물을 종양 측정을 위해 1주에 2회 모니터하였다. 종양 크기를 종양 접종후(도 8a) 경과 일수에 대해 또는 치료 일수에 대해(도 8b 및 8c) 20 내지 30일 동안(도 8a, 8b 및 8c; 괄호안의 수는 회귀된 종양/그룹당 마우스의 총 수를 지닌 마우스의 수를 나타낸다) 또는 60일 동안(도 8d, 8e 및 8f) 플롯팅하였다. 대조군에 대치되는 것으로서(도 8g), 3G4 항체 및 키메라 3G4 항체(ch3G4)로 MDA-MB-231 암 세포를 치료하였다.
도 9a 및 도 9b는 3G4 항체에 의한 시험관내 CMV 복제의 억제를 도시한 것이다. CMV-감염된 HHF-R2 세포를 3G4(상단 2개의 패널)로 처리하였다. 대조군 웰을 처리하지 않은 채로 두거나(하단 2개의 패널) 동형 매치된 대조군 IgG3 항체 GV39G(중간의 2개의 패널)로 처리하였다. 세포를 상이한 싯점에서 관측하였다: 3일째(좌측 컬럼) 및 9일 째(우측 컬럼). 감염된 세포는 형광 현미경하에서 녹색으로 보인다. 100㎍/ml(도 9a) 및 50㎍/ml(도 9b)에서 항체 처리.
도 10은 시험관내 CMV 복제의 농도 의존적 억제를 도시한 것이다. CMV-감염된 HHF-R2 세포를 상이한 농도의 3G4(상부 패널)로 처리하였다. 대조군 웰을 처리하지 않은 채 두거나(하단 패널) 동형 매치된 대조군 IgG3 항체 GV39G(중간 패널)로 처리하였다. 세포를 9일째에 관측하였다. 감염된 세포는 형광 현미경하에서 녹색으로 보인다.
도 11a, 11b 및 11c는 항체로 처리된 세포에서 CMV 바이로스 부하의 정량화 및 바이러스 복제 주기의 말기 단계에서의 복제 억제를 도시한 것이다. 사람 섬유아세포의 단층을 CMV로 0.01 pfu/세포의 저 m.o.i.로 감염시키고 제시한 농도의 3G4 항체; 대조군 항체, GV39G; 또는 대조군 항-콜치킨 항체, C44(도 11a; 비처리, 비처리 대조군)로 처리하였다. 사람 섬유아세포의 단층을 CMV로 3pfu/세포의 고 m.o.i.로 감염시키고 50㎍/ml 또는 100㎍/ml의 3G4 항체 또는 대조군 항체인, GV39G(도 11b)로 처리하였다. 사람 섬유아세포의 단층을 CMV로 고 m.o.i.로 감염시키고, 3G4 항체 또는 대조군 항체, GV39G로 감염시킨 후 제시된 싯점에 가하였다(도 11C). 각각의 도 11A, 11B 및 11C에서 세포 및 상층액내 바이러스 부하는 표준 플라크 검정을 사용하여 정량화하였다.
도 12는 3G4, 1B9 및 3SB 항체에 의한 시험관내 RSV 복제의 억제를 도시한 것이다. RSV로 감염된 A-549 세포를 3G4, 1B9 또는 3SB로 처리하거나 대조군으로서 처리하지 않은채로 두었다. 1B9(녹색) 및 3SB(적색)를 사용한 처리는 바이러스 복제에 있어서 대수 감소(청색 대조군에 대해)를 초래하였다. 심지어 더욱 놀라운 3G4의 항-바이러스 효과는 핑크로 나타낸다.
도 13a, 13b, 13c, 13d, 13e, 13f, 13g, 13h, 13i, 13j, 13k, 13l, 13m, 13n, 13o, 13p, 13q 및 13r은 듀라마이신 유도체의 구조를 도시한 것이다. 실시예 XV로부터의 예시적인 듀라마이신 유도체에 대한 화학 구조가 도시되어 있다. 도 13a 내지 도 13o의 화합물 각각에 있어서, PE-결합 펩타이드, 듀라마이신을 세포 비침투성 그룹에 부착시켜 발휘되는 현저하고 비-특이적인 독성 효과로부터 작제물을 방지시켰다. 모 듀라마이신 사이클릭 펩타이드의 도식적인 구조를 도 13p에 나타낸다. 직쇄 서열은 서열 9에 나타내고, 서열내 변형된 아미노산의 구조는 도 13q에 도시한다. 도 13r은 예시적인 듀라마이신 항-바이러스 작제물을 나타내며, 여기서, 듀마라이신은 시도포비르에 연결되어 있다.
도 14a, 14b, 14c 및 14d는 듀라마이신 유도체의 결합 특이성을 도시한 것이다. 듀라마이신 유도체를 실시에 XV에 기술된 바와 같이 및 ELISA 및 경쟁 ELISA를 사용하여 측정한 이들의 특이성은 실시예 XVI에 기술한 바와 같이 제조하였다. 도 14a, PE에 대한 특이성을 나타내는 인지질 패널에 대한 듀마라이신 유도체의 인지질 결합 프로파일; 도 14b, 혈청은 PE 결합에 있어서 현저한 효과를 나타내지 않는다; 도 14c 및 14d, PE에 대한 듀라마이신 유도체의 특이성을 확인하는 경쟁적 ELISA로부터의 결과.
도 15는 듀라마이신 유도체에 의한 시험관내 CMV 복제의 억제를 도시한 것이다. CMV에 감염된 HHF-R2 세포를 듀라마이신 유도체(DLB)4NA 및 (DIM)nHIgG로 처리하였다. 대조군 웰은 처리하지 않고 두었다. 세포를 상이한 싯점, 즉 4일째(좌측 패널) 및 6일째(우측 패널)에서 관측하였다. 감염된 세포는 형광 현미경하에서 녹색으로 보인다. (DLB)4NA 및 (DIM)nHIgG는 단일 감염된 세포로부터의 바이러스 확산을 억제한다.
도 16은 항-PS 항체에 의한 내피 세포 분열의 선택적 억제를 도시한 것이다. 항-PS 항체 3SB, 9D2 및 3G4를 실시예 XVIII에서와 같이 시험관내에서 내피 세포상에서의 억제 효과에 대해 시험하였다. 3SB, 9D2 및 3G4 항체 각각은 정지기(융합성) 세포와 대치되는 것으로써 내피 세포 분열(아융합성)의 선택적 억제를 나타낸다. 9D2 및 3G4 항체 둘 다는 3SB보다 더 강한 억제 효과를 갖는다.
도 17a 및 도 17b는 종양을 지닌 마우스에서 3G4 항체의 항-혈관형성 및 혈관 표적화 효과를 도시한 것이다. MDA-MB-231 같은자리 종양을 지닌 누드 마우스를 100㎍/투여량의 3G4 항체(처리됨, 우측 패널) 또는 동일한 용량의 동형-매치된 대조군 항체(대조군, 좌측 패널)로 1주에 3회 치료하였다. 치료 종결시에, 동물을 관류시키고 종양을 신속히 동결시키고, 절단하여 쥐 CD31(랫트, 항-마우스 CD31), 쥐 혈관화의 판-내피 세포 마커(도 17a)로 염색하거나, 파라핀속에 매봉하고 H&E(도 17b)로 염색하였다. 대조군 및 치료된 동물로부터의 종양 단면의 비교는, 3G4의 투여가 항-혈관형성 효과(도 17a) 및 혈관 표적화 효과(도 17b)를 가져옴을 나타낸다.
도 18a 및 18b는 3G4 항체의 상보성 결정 영역(CDR)의 DNA 및 아미노산 서열을 도시한 것이다. 중쇄(도 18a; 서열 1 및 서열 2) 및 경쇄(도 18b; 서열 3 및 서열 4)에 대한 DNA 및 아미노산 서열을 나타내고 DNA 서열내 제한 부위를 나타낸다. 리더 서열은 도 18a 및 18b 각각에서 첫번째 화살표로 나타낸 곳에서 시작하는 성숙한 단백질과 구별된다. 각각의 가변 서열을 사람 불변 영역으로 이식하는 예시적인 수단이 설정되어 있으며, 여기서, 각각의 사람 불변 영역 서열의 첫번째 부분(서열 7 및 서열 8)은 도 18a 및 도 18b 각각에서 두번째 화살표로 나타낸다.
도 19a 및 19b는 IgG 항-PS 항체, 3G4와 IgM 항-PS 항체, 3SB의 PS 결합의 비교를 도시한 것이다. IgM 항체, 3SB(◆) 및 2개의 IgG 항체, 3G4(▲) 및 3B10(■)의 PS 결합을 3.375 nM까지의 항체 농도를 사용하여 ELISA로 측정하였다(도 19a). 0.06nM 이하의 농도에서 3SB(◆), 3G4(▲) 및 3B10(■) 항체의 PS 결합은 별도로 나타낸다(도 19b).
도 20은 인지질 리포좀의 경쟁을 사용하여 고정화시킨 PS에 대한 3G4 항체의 결합 억제를 도시한 것이다. 3G4 항체(0.1㎍/ml)를 순수한 인지질(PS-L, PE-L, PI-L, PC-L, CL-L, PA-L 및 PG-L) 또는 완충액 단독(대조군)으로부터 제조된 각종의 리포좀을 사용하여 30분 동안 예비 항온처리하였다. 다음에, 혼합물을 PS-피복된 ELISA 플레이트에 가하고, 세척하고 결합된 항체를 제2 항체 및 OPD를 사용하여 검출하였다. 나열된 리포좀의 존재하에서의 결합을 나타내고 어떠한 리포좀의 부재하에서의 3G4 항체 결합과 비교하였다.
도 21은 인지질에 대한 키메라 3G4의 결합을 도시한 것이다. 키메라 3G4 항체(ch3g4)를 실시예 XIX에 기술된 바와 같이 제조하엿다. 인지질(PS, PI, PE, PC, SM, CL, PG 및 PA)를 미세역가 플레이트의 플라스틱에 흡착시켰다. 차단시킨 후, 키메라 3G4 항체를 나타낸 농도에서 가하였다. 당해 플레이트를 세척하고 결합된 키메라 3G4 항체를 제2의 항체 결합 및 발색을 통해 검출하였다.
도 22는 생체내에서 종양 혈관 내피에 대한 키메라 3G4의 국재화를 도시한 것이다. 바이오티닐화된 ch3G4(상부 패널) 및 대조군 IgG(하부 패널)를 MD-MBA-435s 종양을 지닌 마우스에게 투여하였다. 종양 단면을 Cy3-접합된 스트렙트아비딘으로 염색하여 바이오티닐화된 항체(좌측 패널)를 검출하였다. MECA 32 항체에 이어 FITC-태그된 항-랫트 IgG 제2 항체를 사용한 염색을 수행하여 혈관 내피를 검출하였다(중간 패널). 적색 및 녹색 상을 합하고(우측 패널), 이때 종양 혈관 내피에 결합된 바이오티닐화된 단백질은 황색으로 나타난다. 국재화된 3G4 항체 및 혈관 내피의 MECA 32 마커의 일치된 염색은 겹쳐진 상위에 황색으로 나타낸다(상부 우측).
도 23은 3G4에 의한 PS-양성 세포의 대식세포 포식작용의 증진을 도시한 것이다. HL-60 종양 세포를 녹색 형광 염료 CFDA로 표지하고 PS 노출을 200μM H2O2로 유도시켰다. 처리된 세포를 수거하고 5㎍/ml 3G4 또는 동형-매치된 대조군 항체(BBG3)을 사용하여 1시간 동안 초음파처리하였다. 다음에, 표적 세포를 대식세포에 가하고, 이를 마우스 골수로부터 분리하여 5ng/ml GM-CSF를 함유하는 배지속에서 5일 동안 챔버 슬라이드내에서 배양하였다. 2시간 후, 슬라이드를 고정시키고 대식세포를 형광 현미경하에 가시적으로 계수하였다. 결과는 포식작용하는 대식 세포(하나 이상의 종양 세포에서 포식작용하는 대식 세포)의 퍼센트로 나타낸다.
도 24a 및 24b는 도세탁셀에 의한 내피 세포상에서 PS 노출의 유도를 도시한다. 사람 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)와 사람 미세혈관 내피 세포(HMVEC)를 10nM의 도세탁셀로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 수거하고, PBS로 세척하고 3G4와 함께 10㎍/ml에서 30분 동안 빙상에서 항온처리하였다. 다음에, 세포를 2회 세척하고, FITC 표지된 염소 항-마우스 IgG를 가하고 세포를 빙상에서 추가로 30분 동안 배양하였다. 다음에, 세포를 세척하고 FACS칼리부르 세포계산기(FACSCalibur cytometer: 캘리포니아 산 조세 소재의 Becton-Dickinson 제조원)을 사용하여 FACS로 분석하였다. 처리된 HUVEC(도 24a) 및 HMVEC(도 24b) 둘다는 비처리된 세포와 비교하여 3G4 결합에 있어 현저한 증가를 나타낸다.
도 25a, 25b 및 25c는 도세탁셀에 의한 종양 세포주에 있어 PS 노출의 유도를 도시한 것이다. 마우스 루이스 폐 암종 3LL, 마우스 결장 암종 Colo26 및 사람 유방암 MDA-MB-435 세포를 10nM의 도세탁셀로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 수거하고 PBS로 세척하고 3G4와 함께 10㎍/ml에서 30분 동안 빙상에서 항온처리하였다. 이후에 세포를 2회 세척하고, FITC 표지된 염소 항-마우스 IgG를 가하고 세포를 추가로 30분 동안 빙상에서 항온처리하였다. 이어서 세포를 세척하고 FACS칼리부르 세포계산기(캘리포니아 산 조세 소재의 Becton-Dickinson 제조원)를 사용하여 FACS로 분석하였다. 처리된 3LL (도 25a), Colo26(도 25b) 및 MDA-MB-435 세포(도 25c)는 비처리된 세포와 비교하여 3G4 결합에 있어서 현저한 증가를 나타낸다.
도 26은 도세탁셀에 의한 사람 유방암 MDA-MB-231 세포상에서 PS 노출의 유도를 도시한 것이다. 사람 유방암 MDA-MB-231 세포를 10nM의 도세탁셀로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 수거하고, PBS로 세척하고 키메라 3G4(ch3g4) 또는 대조군, 사람 IgG와 함께 30분 동안 빙상에서 항온처리하였다. 이후에 세포를 2회 세척하고, FITC 표지된 항-IgG를 가하고 세포를 위에서와 같이 FACS로 분석하였다. 대조군, 사람 IgG와 비교하여 ch3G4 결합이 현저히 증가한다.
도 27은 항-PS 항체를 사용한 처리가 mCMV-감염된 마우스의 생존을 증가시킴을 도시한 것이다. Balb/C 마우스를 mCMV로 감염시키고 실시예 XXI에서 기술한 바와 같이 3G4 또는 ch3G4로 치료하였다. 마우스를 감염후 90일 경과후 생존에 대해 모니터하였다.
도 28은 듀라마이신-바이오틴 유도체 DLB를 사용한 치료가 mCMV로 감염된 마우스의 생존을 증가시킴을 도시한 것이다. Balb/C 마우스를 mCMV로 감염시키고 실시예 XXII에 기술된 바와 같이 DLB로 치료하였다. 당해 마우스를 감염후 90일 경과시 생존에 대해 모니터하였다.
도 29a 및 29b는 박시니아 바이러스로 감염된 세포에 대한 키메라 3G4의 결합을 도시한 것이다. U937 세포를 박시니아 바이러스로 감염시키고 감염후 2일째에 키메라 3G4 항체(ch3G4) 또는 대조군 사람 IgG(HIgG)으로 염색시켰다. 도 29a, 감염되지 않은 U-937 세포. 도 29b, 박시니아 바이러스로 감염된 U937 세포. 도 29a 및 도29b에서의 피크는 다음과 같다: 좌측(적색) 피크, 제2 항체 단독 대조군; 중간(청색) 피크, 대조군 HIgG; 우측(녹색) 피크, ch3G4.
도 30a, 30b, 30c 및 30d는 3G4 항체에 의한 시험관내 피킨데 바이러스 감염의 억제를 도시한 것이다. 베로 세포를 피킨데 바이러스로 0.01pfu/세포의 m.o.i.로 감염시켰다. 감염된 세포에 100㎍/ml의 3G4 또는 동형 매치된 대조군 항체 GV39G(도 30b)를 처리한다(도 30a). 감염후 2일째에, 세포를 트립신으로 수거하고 슬라이드에 밀착되도록 한다. 세포를 아세톤으로 고정시키고 항-PIC 래빗 폴리클로날 형청에 이어 염소 항-래빗 바이오틴 접합된 제2 항체로 염색한다. 감염된 세포는 적-갈색으로 염색된다. 제2 항체 단독은 염색되지 않는다(도 30c). 3G4대 대조군 처리된 세포에서의 감염된 세포 %를 또한 나타낸다(도 30d).
도 31은 생체내에서 MethA 종양 성장을 억제하는 듀라마이신-사람 IgG(HIgG) 접합체를 도시한 것이다. MethA 종양 세포를 지닌 BALB/c 마우스 종양 세포에 듀라마이신-HIgG 접합체(D-SIAB)nHIgG를 처리하고, 여기서, 듀라마이신은 SAIB 링커를 사용하여 HIgG에 접합시키거나 실시예 XXV에 기술된 바와 같이 대조군 HIgG와 접합시킨다.
도 32는 듀라마이신 접합체가 세포독성이 아님을 도시하는 것이다. 천연적으로 존재하는 듀라마이신 화합물 및 바이오티닐화된 듀라마이신 작제물, DLB를 MTT 검정을 사용하여 사람 제대 혈관 내피 세포(HUVEC)상에서 세포독성 효과에 대해 시험한다.
도 33은 듀라마이신-항체 접합체가 세포사멸성 세포의 대식세포 포식작용을 증진시킴을 도시한 것이다. 듀라마이신-항체 접합체는, 듀라마이신을 C44, 마우스 IgG2a 항체에 연결시켜 듀라마이신-C44(DuC44)를 생성시킴으로써 작제하였다. 세포사멸성 HL-60 세포를 DuC44, 대조군 마우스 항체, BBG3 및 3G4 항체의 존재하에 마우스 골수 유도된 대식세포와 함께 항온처리하였다. 대식세포를 흡수에 대해 양성인 대식세포 퍼센트로 평가하였다. 데이타는 평균치 ± S.E.를 나타낸다.
고형 종양 및 암종은 사람에 있어 모든 암의 90% 이상을 차지한다. 비록 모노클로날 항체 및 면역독소의 용도를 림프종 및 백혈병의 치료요법에서 시험하였다해도(참조: Vitetta et al., 1991), 이들 제제는 암종 및 기타 고형 종양에 대한 임상적인 시도에서 실망스럽게도 효과적이지 않았다(참조: Abrams and Oldham, 1985). 항체계 치료의 비효율성에 대한 주요 원인은, 대식세포가 고형 종양내로 용이하게 이송되지 않기 때문이다. 심지어 종양 덩이내에서도, 이들 분자는 종양 세포, 섬유 기질, 사이질 압력 구배 및 결합 부위 장벽의 퍼센트에 기인하여 균일하게 분포하지 못한다(참조: Denekamp, 1990; Dvorak et al., 1991).
고형 종양을 치료하기 위한 새로운 방법을 개발하는데 있어서, 종양 세포외에 종양의 혈관화를 표적화하는 것을 포함하는 방법은 명백한 장점을 제공한다. 종양 혈관의 효과적인 폐쇄 또는 차단은 종양을 통한 혈류를 억제하여 종양 세포 사멸의 쇄도를 초래한다. 항체-독소 및 항체-응고제 작제물, 종양 혈관을 선택적으로 파괴하고/하거나 폐쇄하는 VTA의 예를 사용하여 종양 혈관화의 특이적인 표적화 및 파괴에 현저하게 영향을 미치고, 종양 괴사를 초래한다(참조: 각각 본원에서 참조로 인용된 Burrows et al., 1992; Burrows and Thorpe, 1993; WO 93/17715; WO 96/01653; Huang et al., 1997).
VTA는 고형 종양의 이미 존재하는 혈관에서의 이의 주요 작용을 발휘하며 새로운 혈관 형성을 방지하는 항-응고제와는 상이하다. 다른 암 치료요법을 능가하는 VTA의 다수의 장점이 존재한다. 첫째로, 하나의 혈관을 수백 또는 수천의 종양 세포로부터의 대사를 위한 영양물을 제공하고 이의 폐 생성물의 제거를 용이하게 하며, 단지 혈류 상부 및 하부에 대해 한 지점에서 손상되어야 한다. 따라서, VTA는 확립된 종양에 특히 효과적이다. 둘째로, 내피 세포 사멸은, 비록 이것이 유용한 메카니즘이라고 해도, 요구되지 않는다. 혈액 응고의 유형의 변화 및 국재적 개시는 충분할 수 있다. 셋째로, 내피 세포를 혈류에 인접시켜, 적절한 약물 전달을 보장한다. 넷째로, 표적은 약물 내성이 되도록 하는 유전 변형을 획득하는 것과는 달리 정상의 이배체 세포이다. 다섯째로, 생물학적 활성, 즉 혈류의 대리 마커는 측정가능하다.
여섯째로, 혈관 작용에 있어서 일시적인 효과는 현저한 항-종양 효과를 위해 충분할 수 있다. 연구들이, 생체내 종양 세포의 99% 이상을 허혈의 2시간 동안 사멸시킬 수 있음을 나타낸다. 최종적으로, 혈관형성 억제제와는 달리, VTA는 단지 간헐적인 투여만을 필요로 하여 수개월 또는 수년에 걸친 만성 투여외의 통상의 치료로 상승작용시킨다.
세포독성 VTA는 다음 특허에 기술되어 있다: 각각 본원에 인용된, 미국 특허 제5,660,827호, 제5,776,427호, 제5,855,866호, 제5,863,538호, 제5,965,132호, 제6,004,554호, 제6,051,230호, 제6,261,535호 및 제6,451,312호. 항체, 성장 인자 또는 기타 결합 리간드를 사용하여 종양 혈관화에 대해 응고제를 특정하게 전달하는 경우, 이러한 제제를 "응고리간드"라고 칭한다. 응고리간드 VTA는 다음 특허에 기술되어 있다: 각각 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,093,399호, 제6,004,555호, 제5,877,289호 및 제6,036,955호.
응고리간드에서 사용하기 위한 현재 바람직한 응고제는 절단된(truncated) 조직 인자(tTF)이다[참조: Huang et al., 1997; WO 96/01653; 미국 특허 제5,877,289호). TF는 혈액 응고의 주요 개시제이다(참조: Ruf et al., 1991; Edgington et al., 1991). 손상 부위에서, 혈액중 인자 VII/VIIa는 말초혈관 조직내 세포상에서 TF와 접촉하여 이에 결합한다. 인지질 표면의 존재하에 TF:VIIa 착물은 인자 IX 및 X를 활성화시킨다. 이는 다시 트롬빈 및 피브린을 형성시키고, 궁극적으로 혈액 응고를 초래한다(참조: Ruf and Edgington, 1994).
세포질성 및 전이막 영역을 결손하고 있는 조직 인자(tTF)의 재조합, 절단된 형태는 천연의 TF보다 약 5배 정도 낮은 응고 유발능을 갖는 가용성 단백질이다(참조: Stone et al., 1995; Huang et al., 1997). 이는 TF가 VIIa와의 복합체를 위해 IXa 또는 Xa를 효율적으로 활성화시키기 위해서는 인지질과 연합할 필요가 있기 때문이다. 그러나, tTF는 표적화 항체 또는 표적화제의 수단으로 종양 혈관 내피세포에 전달되는 경우, 이는 다시 지질 표면에 근접하게 되어 혈전유발 활성을 도로 찾게된다(참조: Huang et al., 1997; 미국 특허 제6,093,399호, 제6,004,555호, 제5,877,289호 및 제6,036,955호). 따라서, 종양 혈관구조를 선택적으로 혈전화시키는 응고 리간드가 개발되었다.
절단된 TF는 혈관의 표적화된 응고리간드에서 이의 용도를 지시하는 몇가지 장점을 지닌다: 사람 tTF는 용이하게 이용가능하고, 사람 단백질은 사람에 있어 무시할만 하거나 낮은 면역원성을 지질 것이며; 사람 tTF는 마우스를 포함하는 실험 동물에서 완전히 작용성이며; 표적화된 tTF는 응고 단백질의 캐스케이드의 활성화를 유발시키므로 매우 강력하며, 크게 증폭된 효과를 제공한다(참조; 미국 특허 제6,093,399호, 제6,004,555호 제5,877,290호 및 제6,036,955호).
종양 내피세포에서 유용하지만, 정상의 내피세포에서는 현저히 부재하는 적합한 표적 분자 범위가 기술되어 있다. 예를 들어, 엔도글린, E-셀렉틴, P-셀렉틴, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, TIE, LAM-1과 반응성인 리간드, VEGF/VPF 수용체, FGF 수용체, αv β3 인테그린, 플레이오트로핀(pleiotropin) 또는 엔도시알린(endosialin)(미국 특허 제5,855,866호, 제5,877,289호; Burrows et al., 1992; Burrows and Thorpe, 1993; Huang et al., 1997; Liu et al., 1997; Ohizumi et al., 1997; 이들 각각은 본원에 참조로 인용됨).
흡착된 표적물은 VEGF, FGF, TGFβ, HGF, PF4, PDGF, TIMP, TIE에 결합하는 리간드 또는 종양 관련 피브로넥틴 동형과 같은 다른 적합한 그룹이다(미국 특허 제5,877,289호, 제5,965,132호, 제6,051,230호 및 제6,004,555호). 피브로넥틴 동형은 수용체의 인테그린 부류에 결합하는 리간드이다. 종양 관련 피브로넥틴 동형은 종양 혈관구조 및 종양 기질 둘다의 표적가능한 성분이다. 모노클로날 항체 BC-1(참조: Carnemolla et al., 1989)는 종양 관련 피브로넥틴 동형에 특이적으로 결합한다.
천연 종양 환경에 의해 유발가능한 다른 표적 또는 사람에 의한 후속적인 중재는 미국 특허 제5,776,427호, 제5,863,538호 및 제6,036,955호에 기술된 바와 같이 표적가능한 실체이다. 정상 조직 및 종양 혈관 유도에서의 선행 억제와 함께 사용되는 경우, MHC 부류 II 항원이 또한 표적으로서 사용될 수 있다(미국 특허 제5,776,427호, 제5,863,538호 제6,004,554호 및 제6,036,955호).
임상 적용을 위한 현재 바람직한 하나의 표적물은 혈관 내피세포 부착 분자-1(VCAM-1)이다(미국 특허 제5,855,866호, 제5,877,289호, 제6,051,230호, 제6,004,555호 및 제6,093,399호). VCAM-1은 염증성 사이토킨 IL-1α, IL-4(참조: Thornhill et al., 1990) 및 TNFα(참조: Munro, 1993)에 의해 유발된 세포 부착 분자이며, 생체내에서 이의 역활은 급성 염증 부위(Bevilacqua, 1993)에 대한 림프크의 보충이다.
VCAM-1은 신경모세포종을 포함하는 다수의 사람 악성 종양(참조: Patey et al., 1996), 신장 암종(참조: Droz et al., 1994), 비-소 폐 암종(참조: Staal-van den Brekel et al., 1996), 호지킨 병(Hodgkin's disease)(Patey et al., 1996) 및 혈관육종(참조: Kuzu et al., 1993)을 포함하는 다수의 사람 악성 종양, 및 혈관종(angioma)(참조: Patey et al., 1996) 및 혈관종(hemangioma)(참조: Kuzu et al., 1993)과 같은 양성 종양에서 혈관 내피세포에 존재한다. 사람에서 VCAM-1의 구성적 발현은 갑상샘, 가슴샘 및 신장에서 소수의 혈관에 한정되고(참조: Kuzu et al., 1993; Bruijn and Dinklo, 1993), 마우스에서 심장 및 폐의 혈관에 한정된다(참조: Fries et al., 1993).
본원에 나타낸 특정 데이타는 미국 특허 제5,855,866호, 제5,877,289호 제6,051,230호, 제6,004,555호 및 제6,093,399호에 제공된 것들을 보충하며, 항-VCAM-1·tTF 응고리간드의 투여로부터 초래되는 혈전증 및 종양 경색의 선택적 유발을 나타낸다. 나타낸 결과는 L540 사람 호지킨 림프종을 가진 마우스를 사용하여 도출하였다. SCID 마우스에서 이종이식으로 성장시키는 경우, 당해 종양은 염증성 사이토킨의 발현(참조: Diehl et al., 1985) 및 VCAM-1의 존재 및 이의 혈관구조에 있어 다른 내피세포 활성화 분자와 관련하여 매우 밀접한 유사성을 나타낸다.
tTF가 항-VCAM-1 항체에 직접 연결되어 있는, 공유 결합된 항-VCAM-1·tTF 응고리간드를 사용하여, 본원에 응고리간드가 종양 혈관에 선택적으로 국재화하고, 이러한 혈관의 혈전증을 유발시키며, 종양 전체에 괴사가 진행되도록 하여 L540 호지킨 고형 조양을 가진 마우스에서 종양 성장을 지연시킴이 밝혀졌다. 종양은 일반적으로 응고리간드에 반응하기위해서 약 0.3cm 이상일 필요가 있는데, 이는 VCAM-1이 보다 작은 종양에는 부재하기 때문이다. 아마도, 소 종양에서, 종양 세포 또는 종양을 침윤하는 숙주 세포에 의해 분비된 사이토킨의 수준이 VCAM-1 유발을 위해서는 너무 낮기 때문이다. 이는 미국 특허 제5,855,866호, 제5,877,289호, 제6,051,230호, 제6,004,555호 및 제6,093,399호에서의 연구에 따른 것이며, 여기서, 발명들은 보다 큰 고형 종양에 가장 유용한 것으로 밝혀졌다.
비록 VCAM-1 염색이 종양의 말초혈관에서 초기에 더욱 잘 관측된다고 해도, 응고리간드는 혈관 수송 혈관에 명백히 결합하여 이를 폐쇄시키며, 이는 모든 혈관 영역내 혈류를 차단시킬 수 있었다. 더우기, 발명자중 한사람은, 응고리간드의 초기 투여로 유발된 트롬빈 생성이 추가로 중심 혈관에서 VCAM-1 유발을 이끌어(참조: Sluiter et al., 1993), 종양내 영역의 증폭된 시그날 및 명백한 파괴를 초래할 것으로 고려하였다. 추가의 표적가능한 마커의 응고제 유발된 발현의 이러한 유형, 및 이에 따른 시그날 증폭은 미국 특허 제6,036,955호에 기재되어 있다.
본원에 나타낸 바와 같이, 마우스의 심장 및 폐에서 VCAM-1을 발현하는 혈관에 대한 국재화가 항-VCAM-1 응고리간드의 투여시 관측되었다고 해도, 이러한 작제물이 이러한 비-종양 부위에서 혈전증을 유발하지는 않는다. 또한, 항-VCAM-1 응고리간드는 가역적인 특이성의 조절 응고리간드에서 보다 마우스에 대해 더욱 독성이 아니며, 이는, 심장 및 폐 혈관의 VCAM-1의 구성적 발현이 독성을 유도하지 않았음을 나타낸다. 이러한 데이타는, VCAM-1이 사람에 있어 종양 혈관 내피세포의 천연적으로 존재하는 마커라는 사실을 제공하면서, 응고리간드 치료요법의 당면한 임상 진행에서 중요하다. 그러나, 이러한 현상은 또한, 독특한 식견을 가진 발명자들이 종양 혈관구조 파괴에 대한 종합적으로 상이한 접근을 가져오도록 하였다.
A. 아미노인지질에 대한 노출된 항체를 사용한 종양 치료
본 발명자들은 심장 및 폐에서 혈관에 구성적으로 발현한 VCAM-1에 결합하고, 당해 혈관내에서 혈전증을 유발하지 않는 VCAM-1 응고리간드의 능력아래의 메카니즘을 이해하려고 노력하였다. 종양 환경의 친혈전 특성 및 심장 및 폐에서 어떠한 섬유소분해 경향과 일반적으로 관련되어 있는 이러한 중요한 관측에 대한 다수의 과학적 가능성이 존재한다.
일반적으로, 응고 시스템(섬유소 침착) 및 섬유소분해 시스템(효소에 의한 섬유소의 분해)사이의 생물학적 평형이 존재한다. 그러나, 악성 질병, 특히 암종에 있어서, 이러한 평형은 파괴되어 응고의 비정상적인 활성화(과다응고 또는 "친혈전 상태")를 초래한다. 연장된 연구에도 불구하고, 종양 환경의 친혈전 특성에 대한 명백한 설명은 최근까지 인식되지 못했다.
많은 가능한 선택의 상세한 분석후, 본 발명자들은, 항-VCAM-1 응고리간드의 정상 조직의 혈관내 혈전증 유발의 실패는 이러한 혈관의 관 표면르로부터의 아미노인지질, 포스파티딜세린(PS)의 부재에 기인한다고 결론지었다. 따라서, 이러한 이론을 완성시키기 위해서는, 포스파티딜세린이 정상 혈관에 부재한다는 것을 밝히는 것 뿐 아니라, 종양 관련 혈관의 관 측면상에서 이의 존재를 입증하여야 한다.
따라서, 본 발명자들은 종양을 지닌 마우스에 정맥내로 주입된 모노클로날 항-포스파티딜세린(항-PS) 항체의 분포를 평가하기위해 면역조직화학 염색을 사용하였다. 이러한 연구는, 심장 및 폐에서 VCAM-1을 발현하는 혈관이 PS를 결실하고 있는 반면, 종양내에 VCAM-1을 발현하는 혈관은 PS를 발현함을 밝혔다. 응고리간드 작용에 있어서 표면 PS 발현에 대한 필요성은 또한, PS에 결합하는 아넥신 V가 시험관내 및 생체내에서 항-VCAM-1·tTF 응고리간드 작용을 차단한다는 발명자들의 발견에 의해 추가로 지적된다.
즉, 정상 심장 및 폐 혈관에서 항-VCAM-1 응고리간드의 혈전 효과의 결실은 적어도 부분적으로는 다음과 같은 사실을 설명하였다: 아미노인지질인, 포스파티딜세린의 부재는, 응고 복합체가 조립될 수 있는 친응고 표면을 결실하고 있음을 의미한다. 표면 PS의 부재하에, 항-VCAM-1·tTF는 심장 및 폐 혈관을 발현하는 VCAM-1에 결합하지만 혈전증을 유발시킬 수는 없다. 반대로, 종양내에서 VCAM-1을 발현하는 혈관은 표면 PS의 동시 발현을 나타낸다. 즉, 응고리간드는 종양 혈관에 결합하여 국소적으로 응고 인자를 활성화시킴으로써 폐색 혈전을 형성한다.
항-VCAM-1 응고리간드의 종양 특이적인 혈전 효과를 서술하는것 외에, 종양 혈관의 관 표면상에서 아미노인지질인, 포스파티딜세린의 특이적인 발현은 또한, 이전 연구에서 이해되지 않았던 관찰된 친혈전 표현형을 본 발명자들이 설명하도록 하였다. PS 발현은 종양 혈관의 프로트롬빈 상태에서 중요한 역할을 수행한다.
대표적인 아미노인지질인, 포스파티딜세린이 종양 혈관의 관 표면에 특이적으로 발현되지만 정상의 혈관에서는 발현되지 않는다는 본 발명자들의 발견에 이어, 본 발명자들은, 다른 아미노인지질이 치료학적 중재에 대한 표적물로서 효과적이라고 결론지었다. 따라서, 본 발명자들은 아미노인지질 포스파티딜세린 및 포스파티딜에탄올아민(PE)을 표적화하는 것을 기초로 하는 종양 혈관구조 표적화 및 치료 방법을 개발하였다.
본 발명자들의 연구중 특히 놀랄만한 측면은 접합되지 않은 항-아미노인지질 항체의 투여가 종양 치료에 효과적이라는 것이다. 이러한 사실은 아미노인지질에 결합하는 응집되지 않거나 "노출된" 항체를 사용한 종양 치료의 새로운 중요한 방법을 가져왔다. 이러한 종양 혈관구조 표적화 및 치료 방법은 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,406,693호에 기술되어 있다. 비록, 당해분야에서 허용되는 동물 모델에서의 항-종양 효과가 미국 특허 제6,406,693호에 입증되어 있고, 본원에 연장되어 있다고 해도, 종양 혈관구조의 안전하고 효과적인 표적가능한 마커로서 작용하기 위한 아미노인지질의 능력은 미국 특허 제6,406,693호보다 앞선 연구로부터는 예측될 수 없었다.
종양 혈관구조의 특정 마커로서의 아미노인지질의 발견이 입증된 후, 본 발명자들은 종양 치료에서 사용하기 위한 아미노인지질-표적화된 면역독소 및 응고리간드의 영역을 개발하기 시작하였다. 미국 특허 제6,406,693호에서 설명된 바와 같이, 이는 종양 치료에서 사용하기 위한 노출된 항-아미노인지질 항체의 예측하지 못한 발견을 가져왔다. 종양 혈관구조로 독소 또는 응고제를 전달하는 측면에서 아미노인지질의 표적화 효능을 시험하는데 있어서, 본 발명자들은 뜻밖에, 노출된 항-PS 항체가 어떠한 추가의 효과기 잔기의 부재하에서 생체내 종양 혈관구조에 파괴적인 효과를 가진다는 사실을 발견하였다. 종양 혈관구조에 특이적으로 국재화하여 부수적인 파괴 효과를 발휘함으로써 종양 괴사를 초래하는 항-아미노인지질 항체의 능력은 가장 예측되지 않았었다.
본 발명은 다른 양태들중에서 종양 치료에서 노출된 항체로서 사용하기 위한 놀랄만하고 개선된 '제2 세대" 항-PS 항체를 제공한다. 제2 세대 항-PS 항체의 패널은 본원에 기술되어 있으며, 이의 모노클로날 항체 9D2 및 3G4(ATCC 4545)가 현재 이러한 유리한 특성을 지닌 추가 항체의 생성 및 선택을 위한 특정의 면역화 및 스크리닝 기술과 함께 현재 바람직하다. 항-PS 항체에 의한 종양 혈관에 대한 혈관 손상은 적어도 일부는 숙주 효과기를 통해 중재된다는 사실에 본원에서 밝혀졌다. 본 발명자들의 이러한 및 기타 식견은, 노출된 항체 치료가 본원에 교시된 바와 같이, 단독으로 사용되는 경우 및 다른 항암제와 배합하여 사용하는 경우 둘다에서 최적화되도록 한다.
B. 음이온성 인지질에 대한 항체를 사용한 종양 치료
미국 특허 제6,406,693호는, 아미노인지질 포스파티딜세린 및 포스파티딜에탄올아민이 일반적으로 상이한 세포내 혈장 막 이중층(bilayer)의 내부 표면에 대해 분리되며(참조: Gaffet et al., 1995; Julien et al., 1995) 이러한 지질 분리는 비대칭 트랜스이중층(transbilayer)를 생성한다는 사실을 설명하고 있다. 비록 막 비대칭의 존재가 잠깐 논의되었다고 하더라고, 이의 존재 이유 및 이의 생성 및 조절 메카니즘은, 특히 다른 혈소판이외의 세포에서 잘 이해되지 않고 있다(참조: Williamson and Schlegel, 1994).
본 발명자들은, PS가 종양 혈관 내피 세포의 표면으로 이동하여 세포사멸 또는 기타 세포-사멸 메카니즘과는 독립적으로 적어도 현저한 부분에서 존재한다는 사실을 일찍이 입증하였다(참조: 미국 특허 제6,406,693호). 따라서, 종양 환경에서 PS 표면 발현은 세포 사멸의 결과가 아니며, 이것이 세포 파괴를 즉시 개시하지도 않는다. 각종 고형 종양에서 완전한 혈관 내피세포상에 일정하게 검출되는 PS 노출에도 불구하고, 종양 혈관 내피세포는 명백하게 세포사멸성이 아니지만, 형태학적으로 정상이며(정상 조직에서와는 비록 상이함) 대사적으로 활성이다. 이는 PS 표적화를 기초로하는 치료학적 방법에 있어 중요하며, 종양 혈관 내피 세포에서 외부 막에 대한 PS 위치이동이 성공적인 치료요법(노출된 항체 또는 치료학적 접합체 사용)을 위한 표적가능한 실체로서 작용함을 의미한다.
미국 특허 제6,406,693호(및 하기 미국 특허 제6,312,694호)의 중요한 발견에도 불구하고, 종양 혈관 내피세포의 인지질계 표적화에 대한 제안은 PS 및 PE와 같은 아미노인지질의 표적화에 한정되었다. 상이한 인지질 및 아미노인지질에 대한 필수적인 특이성을 갖는 생물학적 기구의 개발을 통해, 본 발명자들은 본 발명에 이르러 종양 혈관 내피 세포상에서 놀랄만하게 상향조절되는 인지질의 새로운 범주를 확인하였다. 이들은 본원에서 종양 혈관구조의 특이적이고 안정한 마커로서 밝혀진 음이온성 인지질이며, 음이온성 인지질에 결합하는 노출된 항체 및 면역접합체 둘다를 사용하는 치료학적 중재를 허용한다.
음이온성 인지질은 정상 조건하에서 나머지 포유동물 세포의 표면에는 거의 부재한다. 혈장 막의 가장 풍부한 음이온성 인지질인 포스파티딜세린은 정상 조건하에서 대부분의 세포 유형에서 혈장 막의 내부 첨판으로 강력하게 분리된다(참조: Williamson and Schlegel, 1994; Zwaal and Schroit, 1997). 다른 주요 음이온성 인지질인 포스파티딜이노시톨(PI)은 또한 혈장 막은 내부 첨판에 주로 위치한다(참조: Calderon and DeVries, 1997). 소수의 음이온성 인지질인, 포스파티드산(PA) 및 포스파티딜글리세롤(PG)은 단지 소수의 세포 유형에서 시험되었으나, 이들은 또한 혈장 막의 내부 첨판에서 주로 위치하는 것으로 여겨진다(참조: Hinkovska-Galcheva et al., 1989). 다른 음이온성 인지질인 카디올리핀(CL)은 미토콘드리아 막에 존재하며 혈장 막으로부터 부재한다(참조: Daum, 1985).
중성 인지질은 또한 혈장 막에 비대칭적으로 분포한다. 중성 아미노인지질인, 포스파티딜에탄올아민(PE)은 주로 내부 첨판에 존재한다. 콜린-함유 중성 인지질인, 포스파티딜콜린(PC) 및 스핑고마이엘린(SM)은 주로 내부 첨판에 존재한다.
PE의 경우와 함께 PS 비대칭은 ATP-의존성 수송기인 아미노인지질 트랜스로카제(Mg2+ ATPase)에 의해 유지되며, 이는 외부 첨판으로부터 혈장 막의 내부 첨판으로의 아미노인지질의 수송을 촉매한다(참조: Seigneuret and Devaux, 1984). PS 및 PE 비대칭의 상실 또는 붕괴는 혈장막내 이러한 이지질의 외부 이동으로부터 초래되며 트랜스로카제의 억제(참조: Birbol et al., 1987; Comfurius et al., 1990), PS 수송기의 활성화 및/또는 이방향으로 모든 지질을 수송하는 Ca2 + 의존성 효소인 스크람블라제 효소의 활성화(참조: Zhao et al., 1998)에 의해 유발된다.
PS 비대칭의 상실은 세포 손상, 프로그램화된 세포 사멸 및 세포자살(참조: Blankenberg et al., 1998; Bombeli et al., 1997), 세포 노화(참조: Herrmann and Devaux, 1990), 혈소판의 활성화(참조: Rote et al., 1993; Zwaal et al., 1989), 손상(참조: Boyle et al., 1996) 및 악성 형질전환(참조: Sugimura et al)을 포함하는, 상이한 병리학적 및 생리학적 상태하에 관측된다. PS의 노출은 근육모세포(참조: Sessions and Horwitz, 1981) 및 영양막(참조: Adler et al., 1995), 세포 이주(참조: Vogt et al., 1996) 및 세포 탈과립(참조: Demo et al., 1999)에 있어 중요한 역활을 한다. 내피 세포는 트롬빈(참조: Qu et al., 1996), 칼슘 이온운반체 또는 포르볼 에스테르(참조: Julien et al., 1997), 고지질혈증(참조: Lupu et al., 1993) 및 상보성 단백질 C5b-9의 비-분해성 농축물(참조: Christiansen et al., 1997)에 의해 유발된 Ca2 + 유동 증가에 반응하여 PS를 구체화한다. 일시적인 PS 노출은 또한 외인성 활성인자 또는 세포 손상의 부재하에 양성 세포에서 또한 관측된다(참조: Utsugi et al., 1991).
몇몇 주요 결과들은 막 PS 노출을 수반한다. 포식세포 대식세포는 PS-양성의 노화 세포 및 세포사멸성 세포를 인지하여, 이에 부착하고 제거한다(참조: McEvoy et al., 1986; Tait and Smith, 1999). PS는 또한 트롬빈 활성화된 내피 세포에 대한 T 림프구의 부착을 중재한다(참조: Qu et al., 1996). 상보 시스템은 PS에 의해 활성화되며 PS-양성 세포의 분해에 기여한다(참조: Test and Mitsuyoshi, 1997). 최종적으로, PS 노출은 응고 복합체의 조립 및 활성화를 위해 음성적으로 하전된 지질 표면을 제공(참조: Bevers et al., 1985; Dachary-Prigent et al., 1996)함으로써 내피상에서 친응고 이동(참조: Williamson and Schlegel 1994; Bombeli et al., 1997)에 기여한다. 종양 내피세포의 친혈전 특성은 장기간 인식되어왔다(참조: Donati and Falanga, 2001).
*과학 문헌에서 PS에 대한 관심과 본 발명자들의 초기 연구가 PS 및 PE와 같은 아미노인지질에 한정되었다 하더라도(참조: 미국 특허 제6,406,693호 및 제6,312,694호), 본 발명자들은, 광범위한 범주의 인지질이 종양 혈관구조에 노출될 수 있다는 가설을 정립하였다. 종양 미세환경의 증가된 스트레스 조건으로 인하여, 본 발명자들은, 음이온성 인지질 범위가 종양 혈관 구조를 상향 조절하여 치료학적 중재에 대한 강력한 새로운 가능성을 제공할 수 있다고 추론하였다.
본 발명자들은, 종양 내피의 손상 및 활성화가
1) 내피세포를 활성화시키고 세포 부착 분자의 발현을 유도하는 인터루킨-1 및 종양 괴사 인자와 같은 종양 기원한 사이토킨(참조: Shaughnessy et al., 1989; Orr et al., 2000); 2) 내피세포에 부착된 림프구에 의해 생성된 반응성 산소 종(ROS); 및 3) 대사의 부산물로서 종양 세포 자체에 의해 생성된 ROS(참조: Shaughnessy et al., 1989; Soares et al., 1994)에 의해 또는 저산소증에 대한 노출에 이은 재산소화의 결과로서(참조: Zulueta et al., 1995) 유발됨을 인지하였다. 이러한 관측은, Ca2 + 유동이 결국 아미노인지질 트랜스로카제의 억제 또는 스크램블라제의 활성화를 통해 PS 및 PE의 노출을 유발하는 종양 내피세포내에 이러한 스트레스에 의해 생성될 수 있음을 제안하였다.
그러나, 본 발명자들은 이러한 식견을 아미노인지질 PS 및 PE에만이 아니라 음이온성 인지질이 종양 혈관구조에서 상향조절될 수 있다는 가설로 확장시켰다. 세포 표면 음이온성 인지질을 검출하기 위해서, 본 발명자들은 음이온성, 그러나 중성이 아닌 인지질과 반응하는 새로운 모노클로날 항체인 9D2를 생성하였다. 즉 9D2는 음이온성 아미노인지질인, PS와 결합하지만, 중성 아미노인지질인 PE와는 결합하지 않으므로 일반적인 아미노인지질 결합제와는 구별된다. 9D2 항체는 음이온성 인지질외에 PE에 강력하게 결합하는 중성 리간드인, 아넥신 V보다 음이온성 인지질에 더욱 특이적이다(참조: Blankenberg et al., 1998).
본원에 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명자들은, 9D2 및 아넥신 V가 다양한 유형의 고형 종양을 갖는 마우스에 정맥내 주사한 후 종양 내피세포에 특이적으로 국재화한다는 사실을 발견하였다. 이러한 발견은, 음이온성 인지질이 종양 혈관 내피세포의 표면에 노출되어 종양 치료요법(및 영상화)를 위한 표적 분자로서 사용될 수 있다는 본 발명자들의 가설을 증명한다. 즉, 본 발명은 노출된 항체 및 세포독성 약물, 사이코킨, 응고제 등의 전달 둘다에서, 음이온성 인지질을 포적화하고 종양을 치료하는데 사용하기 위한 새로운 방법 및 항체계 조성물의 범위를 제공한다. 미국 특허 제6,406,693호 및 제6,312,694호에서 교시된 바와 같이 PS를 표적화하는 것외에, 본 발명에 의해 표적화하기위한 현재 바람직한 음이온성 인지질은 PI, 주요 음이온성 인지질, PA 및 PG이며, 표적화 CL이 또한 특정 양태에서 고려된다.
본 발명으로부터 드러나는 주요 발견중 하나는, 은이온성 인지질이 종양 내피세포의 표면에 노출된다는 것이다(실시예 VI). 이러한 현상은 음이온성 인지질에 선택적으로 결합하는 2개의 독립적인 시약: 즉, 이러한 점을 증명하기 위해 특별히 본 발명자들에 의해 개발된 모노클로날 항체인 9D2 및 아넥신 V를 사용하여 입증하였다. 9D2 항체 및 경쟁하는 항체는 본 발명의 추가의 바람직한 성분이다.
9D2 항체 및 아넥신 V는 고 친화성 및 특이성으로 리포좀과 같이, 플라스틱에 흡착되거나 시험관내에서 활성화되거나 세포자살 내피 세포의 막 표면상에 존재하는 음이온성 인지질에 결합한다. 9D2는 PS, PA 및 CL에 강력하게 결합하지만, PI 및 PG에 대해서는 더욱 약하게 결합한다. 아넥신 V는 앞서 밝혀진 바와 같이(참조: Andree et al., 1990; Schlaepfer et al., 1987; Boustead et al., 1993; Blackwood and Ernst, 1990), PS, CL, PA, PI 및 PG외에 PE에 결합한다. 9D2 항체에 의한 음이온성 인지질의 인식은 혈청의 존재 및 부재하에서 동일하며, 이러한 사실은, 결합이 혈청 보조인자를 필요로하지 않음을 나타낸다. 음이온성 인지질에 대한 9D2의 결합은 Ca2 + 이온을 필요로 하지 않는 반면, 아넥신 V의 결합은 Ca2 +를 필요로 하였다.
PS-피복된 플레이트상에서 교차-차단 연구는, 9D2 및 아넥신 V가 PS에 대한 각각의 다른 결합을 차단하지 않음을 나타내었다. 이러한 사실은, 2개의 시약이 PS 분자상의 상이한 에피토프를 인지하거나 더욱 유사하게는 PS의 상이하게 포장된 형태를 인지함을 나타낸다. 아넥신 V는 평편한 PS 표면에 결합하는 것으로 여겨지는 반면, 항-PS 항체는 6각형의 포장된 PS에 결합하는 것으로 고려된다(참조: Rauch and Janoff, 1990). 이들 형태 둘다는 아마도 PS-피복된 플레이트에 존재한다. 이러한 실제적인 교차-차단 연구(실시예 VI)는 또한, 음이온성 인지질에 대한 결합에 효과적으로 경쟁하는, 즉, 동일한 에피토프에 필수적으로 결합하는 항체는 참조 항체(예를 들면, 9D2)가 제공되면 용이하게 확인될 수 있음을 나타내기 위해 제공된다.
본 출원은 또한, 9D2 항체 및 아넥신 V가 시험관내에서 시험된 모든 종양의 괴사 영역내 및 주변에서 종양 혈관 및 종양 세포에 특이적으로 국재화됨을 나타낸다(실시예 VI). 종양내 15 내지 40%의 혈관이 음이온성 인지질 양성 내피를 갖는다. 대조적으로, 정상 조직의 혈관중 어느것도 구체화된 음이온성 인지질을 갖지 않는다.
9D2에 의한 종양 혈관구조의 염색 특이성은 1) 대조군 랫트 IgM에 의한 종양 혈관 염색의 결손; 2) 음이온성 인지질로부터 제조되나, 중성 인지질로부터는 제조되지 않은 리포좀에 의한 시험관내 H2O2 치료된 내피 세포에 대한 9D2 또는 아넥신 V 결합의 차단; 3) 세제 또는 유기 용매가 제거된 염색을 사용한 종양 단편으로부터 인지질의 추출의 발견; 및 4) 정상 기관에서 휴지기 내피세포에 대한 9D2 또는 아넥신 V의 국재화의 결실에 의해 입증된다.
종양 혈관구조에서 9D2 또는 아넥신 V에 의해 국재화된 주요 음이온성 인지질은 PS인 것으로 여겨지는데, 이는 이것이 가장 풍부한 음이온성 인지질이며, 세포 표면에서의 이의 노출이 환경 영향 또는 손상에 의해 조절되기 때문이다. 그러나, 다른 음이온성 인지질(예를 들면, PI, PA, PG)은 또한 풍부하지 않음에도 불구하고 노출되는 경향이 있다.
비록 9D2에 의해 검출되지 않는다고 해도, 주요 중성 인지질인 PE는 종양 혈관에서 관측된 아넥신 국재화에 대하여, PS와 함께 기여하는 경향이 있다. PE는 또한 종양 내피세포에 노출되는 것으로 알려져 있으며, 혈장 막내 PE의 위치는 PS와 유사한 방식으로 조절된다(참조: 미국 특허 제6,406,693호). PE는, 비록 PS보다 낮은 비율이라고 하더라도(참조: Devaux, 1992), 아미노인지질 트랜스로카제에 의해 부분적으로 혈장 막의 내부 첨판으로 분리되며, 스크램블라제에 의해 외부 표면으로 수송된다(참조: Zhou et al., 1997). PS와 유사하게 PE는 세포사멸 및 세포 활성화 동안 노출된다(참조: Emoto et al., 1997; Umeda and Emoto, 1999).
종양 내피세포에서 음이온성 인지질의 노출 메카니즘을 시험하기 위하여, 시험관내에서 내피 세포를 종양 미세환경에 존재하는 것으로 알려진 각종 인자 및 조건으로 치료하는 일련의 연구를 수행하였다(실시예 VII). 모든 세포가 세포사멸인 경우, 저산소증에 이은 재-산소화, 산도, 및 10 내지 22%의 수준으로 생존하는 내피 세포에서의 트롬빈 증가된 PS 노출이 관찰된다. 염증성 사이토킨(TNFα 및 IL-1)은 또한 PS 노출의 약하지만 정의된 유도를 유발하였다.
이러한 발견은, 종양에서, 혈관 내피에서 음이온성 인지질의 노출이 염증성 사이토킨, 트롬빈 및 산도와 함께 저산소증, 재산소화에 의해 유발된다는 가능성과 일치한다. 비록 상세한 메카니즘이 본 발명을 실시하기 위해 이해되어야 할 필요는 없다고 해도, ROS는 저산소증에 대한 노출시 또는 대사의 이중 산물로서 종양 세포에 의해 생성될 수 있다(참조: Zulueta et al., 1995). 종양 세포에 의해 방출된 사이토킨은 활성화된 대식세포, 다형핵 세포 및 혈소판의 종양 내피세포로의 부착 및 ROS의 추가의 분비를 중재하는 내피세포상에서 림프구 부착 분자를 유발할 수 있다. 이후에 ROS는 가능하게는 세포내 저장기로부터 Ca2 + 의 유입 또는 Ca2 + 의 방출을 유발시킴으로써 지질의 과산화(Herrmann and Devaux, 1990) 또는 티올을 함유하는 수송 분자의 산화를 통해 PS 위치변경을 유발할 수 있다(참조: Wang and Joseph, 2000).
PS 및 다른 음이온성 인지질의 노출은 부분적으로 종양 내피세포의 친응고 상태를 설명하며 장기간 인식되어 왔다(참조: Donati and Falanga, 2001). 음이온성 인지질은, 응고 인자가 농축되고 조립되는 표면을 제공한다(참조: Bevers et al., 1985; Dachary-Prigent et al., 1996). 이는 또한, 순환하는 대식세포(참조; McEvoy et al., 1986), T 림프구(참조: Qu et al., 1996) 및 종양내로 림프구 침투를 보조하는 다형핵 세포에 대한 부착 부위를 제공한다.
따라서, 음이온성 인지질에 결합하는 항체 및 기타 리간드는 종양 혈관의 표적화, 영상화 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 음이온성 인지질은 몇가지 이류로 종양 표적 혈관으로서 매력적이다: 이들은 풍부하다(PS는 세포당 3 x 106 분자로 존재한다); 이들은 종양 내피세포의 관 표면에 존재하며, 혈관내 종양 표적화제에 의한 결합을 위해 직접 접근가능하다; 이들은 다양한 고형 종양내 종양 내피 세포의 주요 퍼센트로 존재한다; 및 이들은 모든 정상 조직내 내피세포에 필수적으로 부재한다.
약물 또는 응고제를 사용하는 혈관 표적화제는 거대 고형 종양을 지닌 마우스에서 매우 효과적이며, 때때로 치료성인 것으로 밝혀졌다(참조: Huang et al., 1997; Nilsson et al., 2001; 미국 특허 제5,660,827호, 제5,776,427호, 제5,855,866호, 제5,863,538호, 제5,965,132호, 제6,004,554호, 제6,051,230호, 제6,261,535호, 제6,093,399호, 제6,004,555호, 제5,877,289호 및 제6,036,955호). 따라서, 본 발명은 사람에서 암의 진단 및 치료시 종양 혈관구조를 표적화하는데 사용하기 위한 음이온성 인지질에 대해 지시된 노출된 항체 및 혈관 표적화제를 제공한다.
비록 종양 치료에 있어 노출된 항체가 음이온성 인지질 및 아미노인지질 작용에 대해 지시되는 방법의 정확한 분자적 이해가 치료를 실시하기위해 필수적이지는 않다고 해도, 본 발명자는 관측된 내피세포 사멸에 대해 설명될 수 있는 몇가지 메타니즘을 고려하였다. 잘 알려진 메카니즘(특히 본원에 기술된 3G4의 경우)은 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC), 상보체-의존성 세포독성(CDC) 및 항체 중재된 식세포작용과 같은 Fc 도메인-중재된 면역 효과기 기능이다. 세포-중재된 세포독성, 상보체-중재된 분해 및/또는 세포사멸, 항체-유발된 세포 신호화 및/또는 세포골격에 대한 교란이 또한 포함된다.
음이온성 인지질 및 아미노인지질, 특히 3G4에 대한 완전한 항체의 혈관 내피세포 표면에 대한 결합은, 항체의 Fc 부분이 혈관 관내로 돌출됨을 의미한다. 항체 Fc 단편이 상보체 경로를 활성화시키므로, 관측된 세포 파괴는 상보체 지시된 분해의 결과일 수 있다. 따라서, 항체 결합은 상보체 의존성 응고 캐스케이드를 활성화시켜, 다수-상보체 복합체가 조립하도록 하고, 궁극적으로 표적 세포를 침투하는 분해 복합체를 생성시킨다. "상보체-활성화된 ADCC"는 파괴시 작동될 수 있으며, 여기서, 상보체는 항체-피복된 표적 세포에 결합하고, 호중구와 같이 상보체에 대한 수용체를 갖는 세포는 표적 세포를 분해한다.
접합되지 않은 또는 노출된 항체와 이의 항원 결합 단편은 종양 혈관 내피 세포의 표면에서 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 결합하므로, 이들은 관 표면에서 항체 피복물을 형성할 것이다. 이것은 세포독성 T 세포 및/또는 중성 킬러(NK) 세포와 같은 면역 효과기 세포를 유인하는데 작용할 수 있으며, 이는 이후에 혈관 내피세포상에서 세포 중재된 세포독성 효과를 발휘할 것이다.
음이온성 인지질 및 아미노인지질에 대한 항체 결합은 또한 종양 혈관내피 세포에서 세포자살을 유발할 수 있다. 비록 실질적으로 세포자살을 유발시키는 PS에 대한 항체 결합은 보고가 알려져 있지 않다고 해도(오히려 PS는 세포자살로 부터 초래되는 마커이다), 본 발명자들은, 이것이 관측된 항-종양 효과에 대한 다른 가능한 메카니즘이라고 고려한다.
종양 혈관 내피 세포의 표면에서 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 대한 항체 결합이 세포의 세포골격 구성에서 장애를 유발할 수 있다는 것이 또한 가능하다. 세포골격은 표면 막의 구성시 중요한 역활을 하고, 항체 결합은 막을 교란(또는 추가로 교란)시킬 수 있으므로, 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 대한 항체의 결합은 이중 층과 상호작용하는 세포골격 단백질에 대한 변화를 전달한다. 세포골격 단백질의 공간 구성이 막 안정성 및 세포 형태를 조절한다는 것은 이미 알려져 있으며, 일부 세포골격 평형의 방해가 세포 완전성에 있어 광범위한 결과를 지닐 수 있음이 가능하다.
본 발명의 추가의 작동 메카니즘은, 내피 세포 표면에서 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 대한 항체 결합이 아직은 정의되지 않은 경로에 의해 시그날 형질 도입을 개시할 수 있다는 것일 수 있다. 항체 결합은 또한 공지된 시그날 형질도입 경로를, 예를 들면, 막 수용체, 시그날 형질도입 단백질, 막 채널 등의 구조 및/또는 상호작용을 변경시킴에 의해 장애를 유발시킬 수 있다. 세포 장애(세포자살)에 대한 시그날이 개시되거나 최소화될 수 있고/있거나 보전적/항상성 시그날이 억제될 수 있다.
비록 과학적으로 흥미가 있다고 해도, 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 대한 노출된 항체에 의해 달성된 혈관 장애의 정확한 특성을 측정하는 것은 치료를 실시하는데 필수적이지 않다. 항체의 이러한 범주의 투여는 생체내에서 특이적인 항-종양 효과를 유리하게 가져오는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 치료는 당해 현상하에 있는 각각의 분자 메카니즘을 이용할 수 있다. 즉, 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 결합하는 노출된 항체의 사용은 종양 치료요법에 앞서 중요하며 제조 및 비용에서 잇점을 제공한다.
C. 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 대한 항체
본 발명은 종양 혈관구조 마커의 새로운 범부를 확인하므로, 임의로 아미노인지질과 함께 하나 이상의 음이온성 인지질에 결합하는 음이온성 인지질, 노출된 항체 및 면역접합체를 본 발명에 이르러 종양 진단 및 치료에 사용할 수 있다.
C1 . 폴리클로날 항체
항체를 제조하고 특성을 밝히는 수단은 당업계에 잘 알려져 있다 참조: 예를 들면, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (본원에 참조문헌으로 인용됨). 폴리클론 항혈청을 제조하기 위해, 본원에 교시된 바와 같이 H2O2 및 기타 제제로 처리된 세포를 포함하는 면역원성 인지질 및/또는 아미노인지질을 포함하는 조성물로 동물을 면역화시키고 나서, 이렇게 면역된 동물로부터 항혈청을 수득한다. 광범위한 동물 종을 사용하여 항혈청을 제조할 수 있다. 통상적으로, 항-항혈청의 제조에 사용되는 동물은 토끼, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그 또는 염소이다. 토끼는 혈액량이 많기 때문에, 폴리클론 항체 제조에 사용하기에 바람직하다.
폴리클론 항체의 제조에 사용되는 면역원성 조성물의 양은, 상기 면역원의 성질 및 면역화시키는 동물에 따라 달라진다. 다양한 경로를 통해 본 발명의 면역원을 피하, 근육내, 경피, 정맥내, 복강내 및 비장내 투여할 수 있다. 폴리클론 항체의 제조는, 면역된 동물의 혈액 표본을 면역후 다양한 시점에서 추출하여 모니터링할 수 있다. 제2 (추가자극, booster) 주사를 투여할 수도 있다. 강화 및 적정 과정은, 적합한 역가 (suitable titer)가 얻어질 때까지 반복된다. 적정한 수준의 역가가 얻어지면, 면역된 동물의 피를 흘리게 해서 혈청을 분리하여 보관한다. 또한, 이 동물을 사용하여 모노클로날 항체를 제조할 수도 있다.
당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 특정의 조성물의 면역원성은 면역 반응의 비-특이적 자극제 (보조제로 알려져 있음)를 사용하여 강화시킬 수 있다. 보조제의 예로는, 죽은 미코박테리움 튜버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)를 함유하는 비-특이적 면역반응 자극제인 완전한 Freund 보조제; 불완전한 Freund 보조제; 및 알루미늄 하이드록사이드 보조제가 포함된다.
또한, 음이온성 인지질 및 아미노인지질을 담체와 연합시키거나 이에 커플링시킴으로써 성취할 수 있는 바와 같이, 숙주 면역 시스템을 증강시키는 것이 바람직할 수 있다. 예시적인 담체는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 소 혈청 알부민(BSA)이다. 오브알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 래빗 혈청 알부민과 같은 기타 알부민을 담체로서 사용할 수도 있다.
당업계에 알려져 있는 바와 같이, 특정의 조성물은 면역원성에 있어서 상이하다. 하지만, VEGF에 대한 항체의 제조는 특별히 어려운 것은 아니다. 예를 들어, 고도로 특이적인 항-포스파티딜세린 항체는 포스파티딜세린을 함유하는 폴리아크릴아미드 겔을 근육내 주사하고 포스파티딜세린-사이토크롬 c 소낭으로 면역화시킨 토끼에서 생성되었다(참조: Maneta-Peyret et al., 1988; 1989; 각각 본원에서 참조로 인용됨). 아크릴아미드 이식체의 사용은 항체의 생산을 증진시켰다(참조: Maneta-Peyret at al., 1988; 1989). 이러한 방식으로 생성된 항-포스파티딜세린 항체는 사람 혈소판에서 반응계내 포스파티딜세린을 검출할 수 있다(참조: Maneta-Peyret et al., 1988). 이노우에(Inoue), 로트(Rote) 및 라우치(Rauch)는 또한 항-PS 및 항-PE 항체를 개발하였다(하기 참조).
비록 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 대한 항체의 생성이 각종 수단에 의해 달성될 수 있다고 해도, 특정의 바람직한 방법이 본원의 실시예 IV에 기술되어 있다.
C2 . 모노클로날 항체
모노클로날 항체 (MAb)의 제조 방법은 여러 가지가 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 가장 표준적인 모노클로날 항체 제조 기법은 폴리클론 항체를 제조하는 데에 사용한 것과 동일한 라인을 사용하는 것으로 시작한다[참조: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (본원에 참조문헌으로 인용됨)]. 폴리클로날 항체 반응은, 동물을 면역원성 음이온성 인지질 및/또는 아미노인지질 조성물로 면역화시킴으로써 시발되며, 소정의 역가(titer)가 얻어지면 면역된 동물을 사용하여 MAb를 제조한다. 바람직하게는 본원에 기술된 특정의 선별 및 선택 기술을 사용하여 고려되는 특성을 지닌 항체를 선택할 수 있다.
MAb는 잘 알려져 있는 기법을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제4,196,265호(본원에 참조문헌으로 인용됨)]. 통상적으로, 이러한 기법은, 적합한 동물을 선택된 면역원 조성물로 면역 반응시키는 것을 포함한다. 상기 면역 조성물을 효과적인 방법으로 투여하여 항체-생성 세포를 자극한다. 마우스 및 랫트와 같은 설치류가 바람직한 동물이지만, 토끼, 양 및 개구리 세포도 사용할 수 있다. 랫트를 사용하면 소정의 잇점이 있으나[참조: Goding, 1986, pp.60-61 (본원에 참조문헌으로 인용됨)], 마우스가 바람직하며, BALB/c 마우스는 가장 통상적으로 사용되고 있고 안정되게 융합되는 확률이 일반적으로 높아서 가장 바람직하다.
면역반응시킨 후, 목적하는 항체를 생산하는 능력을 가진 체세포, 특히 B 림프구 (B 세포)를 선택하여 MAb 제조 프로토콜에 사용한다. 상기 세포는 절개된 비장, 편도선 또는 림프절에서 수득하거나, 말초 혈액 샘플에서 수득할 수 있다. 비장 세포 및 말초혈액 세포가 바람직한 데, 비장 세포에는 분열하는 플라스마블라스트(plasmablast) 단계에 있는 항체-생산 세포가 풍부하기 때문이고, 말초혈액 세포는 용이하게 입수할 수 있기 때문이다. 종종, 일련의 동물을 면역반응시키고, 가장 높은 항체 역가를 가지는 동물의 비장을 제거하여, 비장을 시린지로 균질화시켜 비장 림프구를 수득한다. 통상적으로, 면역된 마우스에서 수득한 비장은 대략 5×107 내지 2×108개의 림프구를 함유한다.
면역된 동물로부터 수득한 항체-생산 B 림프구를, 일반적으로 면역된 동물과 동일한 종의 불멸의 골수종 세포 (immortal myeloma cell)와 융합시킨다. 하이브리도마-생성 융합 공정에 사용하기에 적합한 골수종 세포주는 항체를 생산하지 않고, 융합 효율이 크며, 목적하는 융합 세포 (하이브리도마)만의 성장을 돕는 소정의 선택 배지에서 성장할 수 없는 효소 결핍된 것이 바람직하다.
당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 수많은 골수종 세포 중에서 하나를 사용할 수 있다 {참조: Goding, pp.65-66, 1986; Campbell, pp.75-83, 1984 (본원에 참조문헌으로 인용됨)}. 예를 들면, 면역된 동물이 마우스인 경우에는 P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GFG 1.7 및 S194/5XX0 Bul을 사용할 수 있고; 랫트를 사용하는 경우에는 R210.RCY3, Y3-Ag1.2.3, IR983F, 4B210 또는 상기한 마우스 세포주 중 하나를 사용할 수 있으며; 사람 세포 융합과 관련하여, U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6이 유용하다.
일반적으로, 항체-생산 비장 또는 림프절 세포 및 골수종 세포의 제조 방법은, 세포막 융합을 촉진시키는 제제 (화학적 제제 또는 전기적 제제)의 존재하에 체세포를 골수종 세포와 4:1 비율 (약 20:1 내지 약 1:1로 변할 수 있음)로 혼합시키는 단계를 포함한다. Sendai 바이러스를 이용한 융합 방법은 Kohler 및 Milstein (1975; 1976 - 본원에 참조문헌으로 인용됨)이 기재하고 있으며, 37%(v/v) PEG와 같은 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 융합 방법은 Gefter 등 (1977 - 본원에 참조문헌으로 인용됨)이 기재하고 있다. 전기 유도-융합 방법을 사용하는 것도 적합하다 {참조: Goding, pp.71-74, 1986 - 본원에 참조문헌으로 인용됨}.
대개, 융합 공정을 사용하는 경우, 생존가능한 하이브리드의 생산율은 약 1×10-6 내지 1×10-8이다. 하지만, 이러한 생존가능한 융합 하이브리드가 선택된 배지에서 배양됨으로써 융합되지 않은 모세포 (특히, 통상적으로 무한정 분열을 계속하는 융합되지 않은 골수종 세포)로부터 분화되기 때문에 문제가 없다. 상기한 선택적인 배지는, 조직 배양 배지에서 뉴클레오티드의 신생 합성 (de novo synthesis)을 차단하는 제제를 포함하는 배지이다. 바람직한 제제의 예로는, 아미놉테린, 메토트렉세이트 및 아자세린이 있다. 아미놉테린 및 메토트렉세이트는 퓨린 및 피리미딘 모두의 신생 합성을 차단하는 반면, 아자세린은 퓨린 합성만을 차단한다. 아미놉테린 또는 메토트렉세이트가 사용되는 경우, 상기 배지에 하이포크산틴 및 티미딘을 뉴클레오티드 공급원으로 보충시킨다 (HAT 배지). 아자세린이 사용되는 경우, 상기 배지는 하이포크산틴을 보충시킨다.
바람직한 선택 배지는 HAT 배지이다. 뉴클레오티드 회수 경로 (salvage pathway)를 작동시킬 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 골수종 세포는 상기한 회수 경로의 핵심 효소 (예를 들면, 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT))가 없기 때문에 생존할 수 없다. B 세포는, 상기 경로를 작동시킬 수 있으나, 배지에서의 생존 기간이 한정되어 있으며 일반적으로 약 2주내에 죽는다. 따라서, 상기한 선택배지에서 생존할 수 있는 세포는 골수종 세포 및 B 세포로부터 형성된 하이브리도마 뿐이다.
이러한 배양방법은 소정의 하이브리도마가 선별되는 하이브리도마 군을 제공한다. 통상적으로, 하이브리도마의 선별은, 미세적정 플레이트에서 단일 클론 희석물로 상기 세포를 배양한 후에 (약 2 내지 3주후) 개개의 단일 클론 상등액을 테스트하여 목적하는 항-VEGF 반응성을 가지는 지를 알아보는 단계를 통해 수행된다. 상기 분석법은, 민감하고 간단하며 신속하여야 하는 데, 예를 들면 방사선면역 분석, 효소 면역 분석, 세포독성 분석, 플래이크 분석, 점 면역결합 분석 등이다.
그리고 나서, 선별된 하이브리도마를 순차 희석시키고, 개개의 항-VEGF 항체-생산 세포주에 클로닝한 후, 이러한 클론을 무한 증식시켜 MAb를 제조할 수 있다. 2가지의 기본적인 방법을 사용하여 상기 세포주를 MAb 제조에 사용할 수 있다. 상기한 하이브리도마 샘플을 조직적합성 유형의 동물에 주사 (종종, 복강내 투여)하여, 융합에 사용할 체세포 및 골수종 세포를 제공할 수 있다. 주사 투여된 동물은, 상기 융합된 세포 하이브리드에 의해 제조되는 특정의 모노클로날 항체를 방출하는 종양을 발생시킨다. 혈청 또는 복수와 같은 상기 동물의 체액을 뽑아서 고농도의 MAb를 제공할 수 있다. 또한, 개개의 세포주를 실험실내에서 배양할 수 있는 데, 이 경우에는 MAb가 자연적으로 상기 배양 배지로 방출되어 고농도로 용이하게 수득할 수 있다.
상기한 2가지 중 어느 방법을 사용하여 제조된 MAb는, 예를 들면 여과, 원심분리 및 다양한 크로마토그래피 방법 (예를 들면, HPLC 또는 친화성 크로마토그래피)을 사용하여 추가 정제할 수 있는 데, 이러한 모든 정제 기법은 당업자들에게는 명백히 잘 알려져 있다. 이러한 정제 기법 각각은, 목적하는 항체를 기타의 혼합물 성분으로부터 분리하는 분획법을 포함한다. 항체의 제조에 특히 바람직한 분석 방법은, 예를 들면 단백질 A-세파로즈 및/또는 단백질 G-세파로즈 크로마토그래피 방법이 포함된다.
D. 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 대한 제2 세대 항체
본 발명은 아미노인지질 및 음이온성 인질에 결합하는 "제2 세대" 항체를 제공하며, 여기서 항체는 개선된 특성을 지니고/지니거나 선행기술의 항체와 관련된 단점으로부터 고생하지 않는다. 이러한 항체의 패널은 본원에 기술되어 있으며, 이들중 모노클로날 항체 9D2 및 3G4가 현재 바람직하며, 3G4(ATCC 4545) 항체가 특히 바람직하다. 본 발명은 또한 특별한 면역화 및 스크리닝 기술을 제공하며, 이러한 기술은 생성되는 유리한 특성 및/또는 단점을 거의 갖지 않는 "유사" 또는 "경쟁하는" 항체를 허용한다.
D1 . 항체 특성
본 발명의 제2 세대 항체는 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하며 이러한 인지질에 대한 항체와 일반적으로 관련된 병원성 특성을 갖지 않는다. 이는 부분적으로 본 발명자들에 의해 개발된 새로운 면역화 및 스크리닝 기술에 의해 가능해진다.
항-아미노인지질 증후군(APS)는 "항-카디오핀" 항체 및 "낭창 항응고 항체"로 명명되는 자동 항체와 관련되어 있다. 이러한 증후군은 정맥 및 동맥 혈전색전증, 저혈소판증 및 다수의 신경학적 증후군과 관련되어 있다. 따라서, 이러한 환자에서의 항-인지질 항체는 "병원성 항체"이다.
수년 동안 "항-아미노인지질 항체" 및 "항-PS 항체"로서 기술되었지만, 이러한 병원성 항체는 실제로 카디올리핀, PS 또는 둘다에 결합되지만 인지질 자체에는 결합되지 않는 단백질 보조인자로서 인식되고 있다(참조: Galli et at., 1990; 1993; McNeil et al., 1990; Rote, 1996). 항-카디올리핀 항체는 β2-당단백질 I 상의 특정 부위(281번 및 288번 잔기)를 인지하는 반면, 낭창 항응고 항체는 프로트롬빈을 인지한다. 유사하게, 질병 상태에서 발생하는 항-PE 항체는, 저 분자량 및 고 분자량 키니노겐(HK), 프레칼리크레인 및 인자 XI(참조: Sugi and McIntyre, 1995; 1996a; 1996b)와 같은, 단백질과 조합하여 PE에 결합한다. 이러한 유형의 단백질 인식을 근거로 하여, 환자에서 항-인지질 항체는 인지질로부터 단백질 보조인자를 제거하여 질병 증후군을 생성시킨다.
본 발명의 항체는 "진정한" 항-인지질 항체라기 보다는 단백질 보조인자와 조합하여 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하지 않는 것을 기초로 하여 특별히 선택되었다. 이와 같이, 본 발명의 항체는 인지질로부터 단백질 보조인자를 결합하거나 제거하지 않으며, 이에 따라 투여에 안전하다. 실제로, 고투여량으로 연장된 기간 동안 본 발명의 항체로 치료한 마우스는 응고 능력의 변화가 나타나지 않았지만, 항카디올리핀 또는 낭창 항응고 항체를 주사하는 경우 마우스는 APS와 반응한다.
당면한 메카니즘과 무관하게, 사람 개체군에서 발생하는 항-인지질 항체는 자가면역 질환, 예를 들면, 전신 홍반성 낭창(참조: Branch et al., 1987; Staub et al., 1989; Drouvalakis and Buchanan, 1998; Smirnov et al., 1995; Rauch et al., 1986; Raich and Janoff, 1990) 및 습관성 유산(참조: Rote et al., 1995; Rote, 1996; Vogt et al., 1996; 1997; Katsuragawa et al., 1997)과 연관되어 있다. 본 발명의 항체가 마우스 또는 원숭이에게 투여되는 경우 이러한 증후군 중 어느것도 관련되지 않는다.
또한, 9D2 및 3G4(ATCC 4545) 항체와 같은, 본 발명의 항체에 의해 인지된 에피토프는 아넥신 V에 의해 인지되는 것과 동일하지 않다. 이는 본원에서 인지질에 각각 다른 것의 결합을 교차-차단하지 않는 제제로서 밝혀졌다. 3G4 및 9D2 항체에 의해 인지되는 에피토프는 아마도 PS의 6각형으로 포장된 형태이며, 이는 면역원성 형태이다. 아넥신 V는 마찬가지로 6각형 형태 외에도 평평한 PS에 결합한다. 6각형 형태의 PS는 세포 활성화와 관련된 혈장막내의 돌출부 속으로 및 세포사멸성 세포상의 "수포(bleb)" 속으로 농축된다. 9D2 및 3G4(ATCC 4545) 항체와 같은, 본 발명의 항체의 제한된 분포는 항체의 응고에 대한 영향의 부재 및 검출가능한 독성의 부재에 추가로 기여한다.
유리한 특성 및/또는 감소되거나 본질적으로 부작용이 없는 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 대한 항체를 생성시키기 위하여, 본 발명은 바람직한 면역화 및 스크리닝 방법을 제공한다. 포함된 지방산 쇄 유형에 대한 보고된 특이성을 지닌 것들을 포함하여(참조: Levy et al., 1990. Oamar et al., 1990), 기타 면역화 기술 및 항체는 문헌[참조: Umeda et al., 1989; Igarashi et al., 1991; Rote et al., 1993]에 보고되어 있다. 그러나, 당해 면역화 기술 및 특히 혈청 의존성이 아닌 항체의 선택은 특별한 잇점을 제공한다.
우메다 등의 문헌[참조: Umeda et al.(1989)]은 포스파티딜세린의 입체 특이적 에피토프를 인지하는 모노클로날 항체의 생산을 기술하고 있다. 그러나, 우메다 시스템은 살모넬라-피복된 아미노인지질 샘플(참조: Umeda et al., 1989)을 사용한 포스파티딜세린의 마우스 비장으로의 직접적인 면역화를 사용하는 단점으로 고생한다. 우메다 등(1989)에 의해 보고된 많은 항체는 또한 항응고 활성을 나타내는데, 이는 본 발명의 항체와 관련되지 않은 단점이다. 3G4 항체의 결합 프로파일은 우메다 등(1989)의 PSC8 항체의 것과 상이하다.
본 발명의 항체는 또한 모든 또는 대부분의 음이온성 인지질을 인지하는 잇점을 지니며, 이는 결합을 위한 더 많은 표적을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제2 세대 항체는 표 4에서 본원에서 기술되고 혈청 의존성인 아닌 것으로 기술된 9D2 및 3G4(ATCC 4545) 항체와 실질적으로 동일하거나, 동일한 인지질 특이성을 갖는 것으로 정의할 수 있다.
이가라시 등(Igarashi et al.)(1989)은 또한 항-PS 항체의 유도를 보고하였지만, 다시 비장내 면역화를 사용하였고 항원이 다시 정맥내로 투여되는 경우 역가의 단지 약간의 증가만이 관찰되었다. 이가라시 등(1991)으로부터의 대부분의 MAb는 DNA와 교차 반응하며 다수는 낭창 항응고 활성을 억제하지만, 본 발명자에 의해 개발된 항체에서는 이러한 단점들중의 어느것도 존재하지 않는다. 본 발명의 바람직한 3G4 항체의 결합 프로파일은 또한 이가시 등(1991)의 표 1의 항체의 것들과는 상이하다.
기타의 것들은 하나 이상의 음이온성 인지질(참조: Alving et al., 1987; Rauch & Janoff, 1990)과 교차반응하는 쥐 모노클로날 항체의 낭창 항응고 활성을 보고하고 있지만, 본 발명자들은 낭창 항응고 활성이 배제된 항체를 수득하는 데 어떠한 곤란성을 경험하지 않았다. 이는, 본 발명에 따른 본 방법, 항체 및 경쟁 항체의 분명한 잇점을 나타낸다.
라우치 등(Rauch et al.)(1986), 하세가와 등(Hasegawa et al.)(1994), 라비라잔 등(Ravirajan et al.)(1995) 및 메논 등(Menon et al.)(1997)에 기술된 바와 같이, 환자로부터의 항체의 사용을 피하는 외에도, 본 출원은 또한 본 발명에 의해 제공된 항체의 유리한 특성을 로트 등(Rote et al.)(1993)에 의해 기술된 3SB 항체와 같은, 문헌으로부터 존재하는 항체와 나란히 비교하여 입증한다. 3SB 항체는 본원에서 기술된 다양한 방법에 사용하기에 적합한 특성을 지니지만, 본 발명자에 의해 개발된 항체는 비교 연구, 예를 들면, 3SB 항체(실시예 XIII)와 대조되는 것으로서 3G4 항체의 증가된 항-바이러스 효과에 의해 본원에서 나타낸 바와 같이, 3SB 항체에 비해 현저하게 수행된다.
본 발명의 항체는 또한 이의 친화성으로 특성화될 수 있다. 본 발명 이전에는, 문헌의 항체는 (기록되는 경우) 상대적으로 약한 친화성을 가졌다. 특정한 양태에서, 본 발명의 제2 세대 항체는 따라서, PS에 대한 9D2 및 3G4(ATCC 4545) 항체의 친화성, 특히 표 3에서 기술되고 혈청 의존성이 아닌 것으로 본원에서 기술된 바와 같은 ELISA에서 측정하는 경우의 친화성과 적어도 동등한 PS에 대한 친화성을 갖는 것들로서 정의된다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 제2 세대 항체는 표 3에 기술된 바와 같이 PS에 대해 9D2 또는 3G4(ATCC 4545) 항체의 친화성과 적어도 동등한 PS에 대한 친화성을 갖고, 표 4에 기술된 바와 같고 혈청 의존성이 아닌 것으로 기재된 9D2 또는 3G4(ATCC 4545) 항체와 실질적으로 동일하거나 동일한 인지질 특이성을 갖는 것으로 정의된다. 가장 바람직하게는, 제2 세대 항체는 표 3에 기술된 바와 같이 PS에 대해 3G4(ATCC 4545) 항체와 적어도 동등한 PS에 대한 친화성을 갖고, 표 4에 기술된 바와 같고 혈청 의존성이 아닌 것으로 기재된 3G4(ATCC 4545) 항체와 동일한 인지질 특이성을 갖는 것들이다.
D2 . CDR 기술
항체는 가변 및 불변 영역으로 구성된다. 항체와 관련해서 본원에서 사용된 용어 "가변성"은 가변 영역의 특정 부분이 항체중의 서열내에서 확장적으로 상이하고 이의 특정 항원에 각각 특정 항체의 특이성 및 결합에 사용되는 것을 의미한다. 그런나, 가변성은 항체의 가변 영역 전반에 거쳐 균일하게 분포하지는 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 영역(하기한 카멜화된 항체 이외의) 둘다에서 "초가변 영역"으로 명명되는 3개의 분절내에 집중된다.
가변 영역의 더욱 고도로 보전된 부위를 골격 영역(FR)이라고 부른다, 본래의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 FR(FR1, FR2, FR3 및 FR4 각각)을 포함하며, 이는 루프 연결을 형성하고 일부 경우 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, β-시트 배열을 주로 채택한다.
각각의 쇄내의 초가변 영역은 FR에 의해 근접하여 함께 유지되고, 기타 쇄로부터의 초가변 영역과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다[본원에서 참조로 구체적으로 인용된 Kabat et al., 1991]. 불변 영역은 항원에 항체가 결합하는데 있어 직접적으로 관려하지 않지만, 항체 의존성 세포 독성에 있어서 항체의 관여와 같은 각종 효과기 작용을 나타낸다.
본원에서 사용된 "초가변 영역"은 항원-결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 경쇄 가변 영역에서 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(즉, 24-34번 잔기(L1), 50-56번 잔기(L2) 및 89-97번 잔기(L3) 및 중쇄 가변 영역에서 31-35번 잔기(H1), 50-56번 잔기(H2) 및 95-102번 잔기(H3): 본원에 참조문헌으로 상세히 인용됨); 및/또는 경쇄 가변 영역에서 "초가변 루프"(즉, 26-32번 잔기(L1), 50-52번 잔기(L2)및 91-96번 잔기(L3) 및 중쇄 가변 영역에서 26-32번 잔기(H1), 53-55번 잔기(H2) 및 96-101번 잔기(H3))를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 잔사는 본원에서 정의된 초가변 영역 잔기이외의 가변 영역 잔기의 것들이다.
3G4 항체(ATCC 4545)의 Vh 및 Vκ쇄의 DNA 및 추론된 아미노산 서열은 각각 서열 1, 2, 3 및 4로서 제공된다. 이러한 서열은 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 CDR1-3을 포함한다. 본원에 제공된 서열 및 기타 정보의 관점 및 선행기술의 지식의 관점에서, 3G4-유사 범위 및 개선된 항체 및 항원 결합 영역이 본 발명에서 제조되고, 이에 따라 본 발명에 의해 포함된다.
특정 양태에서, 본 발명은 ATCC 4545로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 하나 이상의 CDR을 제공한다. 기타 양태에서, 본 발명은 CDR, 항체, 또는 이의 항원 결합 영역을 제공하며, 이는 적어도 제1 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 결합하고, ATCC 4545로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 하나 이상의 CDR을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열, 또는 이의 변이체 또는 돌연변이화된 형태를 갖는 하나 이상의 CDR에 관한 것이다. 본 발명의 기타 양태는 CDR, 항체, 또는 이의 항원 결합 영역에 관한 것이며, 이는 적어도 제1의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 결합되고 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열 또는 이의 변이체 또는 돌연변이화된 형태를 갖는 하나 이상의 CDR를 포함하며, 여기서 이러한 변이체 또는 돌연변이화된 형태는 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 대한 결합을 유지한다.
하나의 특정 양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 제공하며, 여기서 3G4 항체(ATCC 4545)의 골격 영역은 마우스로부터 사람 IgG, 예를 들면, 사람 IgG1 또는 기타 IgG 아부류로 변하여 사람에서 면역원성을 감소시킨다. 다른 양태에서, 3G4 항체(ATCC 4545)의 서열을 당해 분야에 공지된 바와 같이 T-세포 에피토프의 존재에 대하여 시험한다. 당면한 서열은 이후에 변화시켜 T-세포 에피토프를 제거한다; 즉, 항체를 "탈면역화"한다.
3G4 항체(서열 1, 2, 3 및 4)의 Vh 및 Vκ쇄의 DNA 및 아미노산 서열의 유용성은, 광범위한 항체가 본 발명에 의해 CDR 기술을 사용하여 제조될 수 있음을 의미한다. 특히, 무작위적인 돌연변이가 CDR 및 스크리닝된 생성물에서 이루어져 고친화성 및/또는 고 특이성을 지닌 항체가 확인된다. 본 발명에서 기술된 유리한 스크리닝 기술을 제공하는 것이 본 발명에서 사용하기에 특히 적합하다.
이러한 기술을 사용하여 9D2 및 3G4(ATCC 4545) 항체와 같은, 제조되는 모 항체에 비하여 증진된 생물학적 특성을 갖는 항체 변이체를 생성시킨다. 이러한 변이체 또는 제2 세대 화합물은 통상적으로 모 항체의 하나 이상의 치환된 초가변 영역 잔사를 포함하는 치환성 변이체이다. 이러한 치한성 변이체를 발생시키는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화성 성숙화이다.
파지 디스플레이를 사용하는 친화성 성숙화에서, 수개의 초가변 영역 부위(예를 들면, 6-7 부위)를 돌연변이시켜 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성시킨다. 이화 같이 발생된 항체 변이체는 각각의 입자내에서 포장된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 필라멘트성(filamentous) 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체는 본원에 기술된 바와 같이 이들의 생물학적 활성(예: 결합 친화성)에 대하여 스크리닝한다. 변형에 대한 후보 초가변 영역을 확인하기 위하여, 알라닌 스캐닝돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 상당히 기여하는 가변 영역 잔사를 확인할 수 있다.
또한, CDR 슈플링 및 이식 기술(CDR shuffling and implantation technology)을 본 발명의 항체, 바람직하게는 9D2 및 3G4(ATCC 4545) 항체와 함께 사용할 수 있다. CDR 슈플링은 CDR 서열을 특정 골격 영역(참조: Jirholt et al., 1998, 본원에서 구체적으로 인용됨)내로 삽입한다. CDR 이식 기술은 CDR 서열의 단일 마스터 골격(참조: Soderlind et al., 1999, 2000, 각각 본원에서 구체적으로로 인용됨) 내로의 무작위적 조합을 허용한다. 이러한 기술을 사용하여, 3G4(ATCC 4545) 항체의 CDR 서열을, 예를 들면, 다수의 상이한 서열을 생성하도록 돌연변이화되며, 이는 목적하는 특성, 예를 들면, 고 친화성을 위한 스캐폴드 서열(scaffold sequence) 및 수득한 항체 변이체 내로 혼입된다.
본 발명 기술의 정보의 관점에서, 항체, 바람직하게는 9D2 및 3G4(ATCC 4545) 항체의 항원 결합 단편을 또한 최소화시켜 안정성을 증진시킨다. 이는 면역글로불린 VH 및 VH-유사 영역을 기본으로 한 일본쇄 영역 결합 단백질을 제조함으로써 성취할 수 있다[참조: Nuttall et al., 2000, 본원에서 구체적으로 인용됨].
또한, 또는 부가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조는 항체와 표적 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 예를 들면, PS 사이의 접촉점들을 확인하기 위해 기술하고 분석할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보들이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널이 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝에 적용되며 하나 이상의 관련 검정에서 유사하지만 상이하거나 심지어 우수한 특성을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선택한다.
D3 . 카멜화된 항체
본 발명의 항체의 추가의 예는 "카멜화된(camelized)" 항체이다. 카멜 및 라마(Camelidae, camelids)로부터의 항체는 경쇄가 없고 이에 따라 중쇄만으로 형성된 독특한 종류의 항체를 포함한다. 이들은 "카멜화된 항체"라고 불러왔다. 이러한 항체의 항원-결합 부위는 VHH(VHH)라고 언급되는, 하나의 단일 영역이다.
3G4(ATCC 4545) 항체의 Vh 및 Vκ쇄의 DNA 및 아미노산 서열이 본원에서 제공되기 때문에(서열 1, 2, 3 및 4), 3G4 항체의 카멜화된 버젼을 또한 제조할 수 있다. 돌연변이 및 구조적 채택은 VH-VL 쌍의 VH를 충분한 가변성을 보유하면서 단일 영역 VHH내에 재성형시킬 수 있다[참조: 본원에서 참조문헌으로 구체적으로 인용된 Muyldermans et al., 2001]. 이러한 VHH 작제물은 강력한 항원-결합 능력을 지닌 작고, 강하며 효율적인 인지 단위(참조: Riechmann and Muyldermans, 1999)이며, 통상적인 VH-VL 쌍에 접근할 수 없는 신규한 에피토프와 상호작용하는 추가의 잇점을 제공할 수 있다. 따라서, 카멜화된 항체는 Fv 단편에 유사하지만 추가의 잇점을 지닐 수 있다.
미국 특허 제5,800,988호, 미국 특허 제6,005,079호, 국제특허원 제WO 94/04678호, 제WO 94/25591호, 문헌[참조: Riechmann & Muyldermanns (1999)] 및 문헌[참조: Muyldermanns et al. (2001)]은 카멜화된 항체의 생산을 추가로 기술하고 가능하게할 목적으로 본원에서 각각 참조문헌으로서 상세히 인용한다. 따라서, 3G4 항체로부터의 CDR 은 카멜리다에 항체의 중쇄 면역글로불린의 가변 영역의 골격에 이식할 수 있다.
D4 . CDR 서열
따라서, 본 발명의 추가의 양태는 9D2 및 3G4, 및 바람직하게는 3G4(ATCC 4545), 중쇄 및 경쇄와 같은 항체 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 암호화하는 분리된 DNA 분절 및 재조합 벡터, 및 이러한 CDR 영역을 발현하는 DNA 기술의 적용을 통한 재조합 숙주 세포 및 파지의 창조와 용도에 관한 것이다.
본 발명은 따라서, ATCC 4545로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 하나 이상의 CDR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 적어도 제1의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 결합하며 ATCC 4545로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 하나 이상의 CDR을 포함하는 CDR, 이의 항체 또는 항원 결합 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 서열 2 또는 4의 아미노산 서열; 또는 이의 변이체 또는 돌연변이화된 형태를 갖는 하나 이상의 CDR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 기타 양태는 적어도 제1의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 결합하고 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는, CDR, 또는 이의 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 변이체 또는 돌연변이된 형태에 관한 것이며, 여기서 이러한 변이체 또는 돌연변이된 형태는 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 대한 결합을 유지한다.
본 발명의 기타 양태에서, 분리된 폴리뉴클레오타이드는 서열 1 또는 서열 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 변이체 또는 돌연변이된 형태를 포함한다. 특히, 분리된 폴리뉴클레오타이드는 서열 1 또는 서열 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 변이체 또는 돌연변이된 형태를 포함하며, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 적어도 제1 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 결합하는 CDR, 이의 항체 또는 항원 결합 영역을 암호화하며, 이러한 변이체 또는 돌연변이된 형태는 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 대한 결합을 유지한다.
본 발명은 따라서, 총 게놈성 DNA로부터 유리되고 항-음이온성 인지질 또는 항-아미노인지질 항체 중쇄 및 경쇄(예: 9D2 및 3G4, 및 바람직하게는 3G4(ATCC 4545), 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 발현할 수 있는 특정한 포유동물, 바람직하게는 사람 또는 쥐로부터 분리가능한 폴리뉴클레오타이드 및 DNA 분절에 관한 것이다. 본원에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드 분절" 및 "DNA 분절"은 특정한 종의 총 게놈성 DNA로 부터 분리되어 유리된 폴리뉴클레오타이드 및 DNA 분자를 말한다. 용어 "폴리뉴클레오타이드 분절" 및 "DNA 분절"내에는 DNA 분절 및 이러한 분절의 더 작은 분절이 포함되며, 또한 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 등을 포함하는 재조합 벡터도 포함된다.
유사하게, 9D2 및 3G4, 바람직하게는 3G4, 중쇄 및 경쇄와 같은 항-음이온성 인지질 또는 항-아미노인지질 항체 중쇄 및 경쇄의 정제된 CDR 영역을 암호화하는 암호화 분절 또는 분리된 유전자 부분을 포함하는 DNA 분절은 이러한 암호화 서열 및 특정한 양태에서, 기타의 천연 발생 유전자 또는 단백질 암호화 서열로부터 실질적으로 분리된 조절 서열을 포함하는 DNA 분절을 의미한다. 당해 양태에서, 용어 "유전자"는 단순성을 위해, 작용성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 암호화 단위를 의미하는 데 사용된다. 당해 기술분야의 숙련가들에 의해 이해되는 바와 같이, 이러한 기능적 용어는 천연 항체-암호화 서열 및 적합한 항원 결합 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 발현하거나 발현하도록 채택할 수 있는 더 작게 조작된 분절을 포함한다.
"다른 암호화 서열로부터 실질적으로 분리된"은 관심있는 암호화 분절 또는 분리된 유전자 부위가 DNA 분절의 암호화 영역의 중요한 부분을 형성하고 DNA 분절이 천연 발생 암호화 DNA(예: 대형 염색체 분절 또는 기타 기능적 유전자 또는 cDNA 암호화 영역)의 큰 부위를 포함하지 않을 수 있음을 의미한다. 물론, 이는 원래 분리된 DNA 분절을 의미하며, 사람에 의해 이후에 분절에 가해진 유전자 또는 암호화 영역을 배제하지 않는다.
특정 양태에서, 본 발명은 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 75%, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 및 가장 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동질성을 지닌 아미노산 서열영역을 포함하는 적어도 제1 서열영역을 포함하는 항-음이온성 인지질 또는 항-아미노인지질 항체 중쇄 및 경쇄[예: 9D2 및 3G4, 및 바람직하게는 3G4, 중쇄 및 경쇄]를 암호화하는 DNA 서열이 혼입된 분리된 암호화 분절 또는 독립된 유전자 부위 및 재조합 벡터에 관한 것이며, 여기서 상기 CDR 영역은 적어도 실질적으로 서열 2의 아미노산 서열 또는 서열 4의 CDR 영역의 생물학적 특성을 유지한다.
본원에서 기술된 바와 같이, 서열은 특정의 생물학적으로 작동성인 동등한 아미노산 또는 "보존성 치환"을 포함할 수 있다. 기타 서열은 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지되어 있고 본원에서 추가로 기술된 바와 같이, CDR 또는 CDR을 함유하는 항체의 특성을 증진시키기 위해 고의적으로 조작된 작용적으로 동등하지 않은 아미노산 또는 "비-보존적 치환"을 포함할 수 있다.
또한 아미노산 및 핵산 서열은 추가의 N- 또는 C-말단 아미노산, 또는 5' 또는 3' 서열과 같은 추가의 잔기를 포함할 수 있으며, 서열이, 바람직하게는 단백질 발현이 관련된 경우 생물학적 단백질 활성의 유지 또는 증진을 포함하는 상기한 기준을 충족시키는 한, 본 발명의 서열에 여전히 상응한다. 말단 서열의 추가는 암호화 영역 및 또한 조절 영역의 5' 또는 3' 부분 중 어느 하나의 각종 비-암호화 서열 플랭킹(flanking)을 포함한다.
본 발명의 핵산 분절은 따라서, 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 추가의 제한 효소 부위, 다중 클론닝 부위, 기타의 암호화 분절 등과 같은 기타 DNA 서열과 조합됨으로써, 이들의 전체 길이가 상당히 변할 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있다는 것이 고려되며, 총 길이는 바람직하게는 제조의 용이성 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 용도에 의해 제한된다.
따라서, 재조합 벡터는 본 발명의 추가의 양태를 형성한다. 특히 유용한 벡터는 DNA 분절의 암호화 부분이 프로모터의 조절하에 위치되는 벡터인 것으로 고려된다. 일반적으로, 전적이지는 않지만, 제조합 또는 이종 프로모터, 즉, 이들의 천연 환경에서 암호화 서열과 정상적으로 연합되지 않는 프로모토가 사용될 것이다. 이러한 프로모터는, 프로모터가 세포 유형, 기관 또는 심지어 동물에서의 DNA 분절의 발현을 효과적으로 지시하는 한, 발현을 위해 선택된 세균, 바이러스, 진핵세포 및 포유동물 프로모터를 포함할 수 있다.
단백질 발현을 위한 프로모터 및 세포 유형 조합물의 용도는 분자생물학 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 사용된 프로모터는 재조합 단백질 또는 펩타이드의 대규모 생산에서 유리한 바와 같은, 구성적이거나 유도가능하며, 도입된 DNA 분절의 고수준의 발현을 지시하는데 적합한 조건하에 사용할 수 있다.
본 발명의 핵산 서열의 발현은 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지되어 있고 본원에 추가로 기술된 하나 이상의 표준 기술로 편리하게 성취할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질의 재조합 발현에 관한 이후의 기술은 핵산 수준에서 또다른 암호화 서열과 작동적으로 관련되지 않은 항체 및 항체 단변에 동등하게 잘 적용된다.
E. 추가의 항체 제조 기술
E1 . 파지미드 라이브러리로부터의 항체
현재 재조합 기법을 이용하여, 일련의 항체를 암호화하는 재조합 유전자로부터 목적하는 특이성을 가지는 항체를 제조할 수 있다 {참조: Van Dijk 등, 1989 (본원에서 참조문헌으로 인용됨)}. 소정의 재조합 기법에서는, 면역화시킨 동물의 비장에서 분리한 RNA로부터 제조한 복합 면역글로불린 파지 발현 라이브러리를 면역 스크리닝하여 항체 유전자를 분리하는 것을 포함한다 {참조: Morrison 등, 1986; Winter 및 Milstein, 1991 (각각 본원에 참조문헌으로 인용됨)}.
상기 방법의 경우, 복합 면역글로불린 파지미드 라이브러리를 면역화시킨 동물의 비장에서 분리한 RNA로부터 제조하고, 상기 항원 및 대조 세포를 발현하는 세포를 사용하여 패닝(panning)하여 적합한 항체를 발현하는 파지미드를 선택한다. 이러한 방법이 기존의 하이브리도마 기법에 비해 가지는 잇점은, 1 라운드로 약 104배의 항체를 생산하여 스크리닝할 수 있으며, H 및 L쇄 복합에 의해 새로운 특이성을 만들어내서 적합한 항체가 생산되는 비율을 증가시킨다.
다양한 항체 분자를 세균내에서 생산하는 하나의 방법에서는, 벡터로서 박테리오파지 γ를 사용한다 {참조: Huse 등, 1989 (본원에서 참조문헌으로 인용됨)}. γ벡터를 사용하여 항체를 제조하는 경우, DNA 서열의 중쇄 및 경쇄군을 별개의 출발 벡터에 삽입하는 것을 포함한다. 그리고나서, 이 벡터를 임의적으로 배합하여, 항체 단편을 형성하는 중쇄 및 경쇄를 함께 발현시키는 단일 벡터를 형성시킨다. 선택된 항원으로 면역화시킨 동물로부터 비장 세포 (또는 이의 하이브리도마)에서 분리한 mRNA를 증폭, 바람직하게는 PCR 기법 또는 관련된 증폭 방법을 사용하여, 중쇄 및 경쇄 DNA 서열을 수득한다. 통상적으로, 중쇄 및 경쇄 분절을 출발 벡터에 삽입하는 것을 용이하게 하기 위해서 제한 부위를 증폭된 DNA 분절의 말단에 삽입하는 프라이머를 사용하여, 중쇄 및 경쇄 서열을 증폭시킨다.
전체 또는 일부의 합성 항체 결합 부위 (즉, 파라토프) 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 다른 방법에서는, 필라멘트성 파지 (예를 들면, M13, fl 또는 fd)에서 기원한 디스플레이 벡터를 사용한다. 이러한 필라멘트성 파지 디스플레이 벡터 ("파지미드"로 지칭)는, 다양하고 신규한 면역 특이성을 가지는 모노클로날 항체 라이브러리를 생산한다. 이러한 기법에서는, 필라멘트성 파지 복제의 조합 단계 (assembly stage) 동안에 유전자 생성물 및 유전자를 연결하는 수단으로서 필라멘트성 파지 코트 단백질 막 앵커 도메인을 사용하며, 복합 라이브러리로부터 항체를 클로닝하고 발현시키는 데에 사용될 수 있다 {참조: Kang 등, 1991; Barbas 등, 1991 (본원에서 참조문헌으로 인용됨)}.
이러한 필라멘트성 파지 디스플레이를 위한 일반적인 기법은 미국 특허 제5,658,727호(본원에서 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법에서는, 단일 벡터 시스템을 이용하여 항체 유전자 레파토리에서 예비-선택된 리간드-결합 특이성을 가진 것을 자극하여 클로닝하고 스크리닝하는 시스템을 제공한다. 분리된 라이브러리 구성원 중에서 예비-선택된 리간드-결합 능력을 가지는 것을 스크리닝하여, 상기 라이브러리 구성원을 암호화하는 유전자를 분리하는 기존의 수단과 발현된 항체 분자의 결합능력을 결합시킬 수 있다.
기능성 항체를 조합할 수 있도록 융합 폴리펩타이드를 세균 세포의 세포외질로 표적화하고, 목적하는 라이브러리 구성원을 스크리닝할 수 있도록 파지를 조합하는 동안에 필라멘트성 파지 입자의 코트에 융합 폴리펩타이드를 표적화함으로써, 발현 및 스크리닝을 결합할 수 있다. 융합 폴리펩타이드에 방출 신호 도메인의 존재하에 세포외질을 표적화한다. 필라멘트성 파지 코트 단백질 막 앵커 도메인 (즉, cpIII- 또는 cpVIII-유래 막 앵커 도메인)의 존재하에, 파지 입자를 표적화한다.
필라멘트성 파지-기초 복합 항체 라이브러리의 다양성의 증가는, 중쇄 및 경쇄 유전자를 셔플링 (shuffling)하거나, 상기 라이브러리의 클로닝된 중쇄 유전자의 상보성 결정 부위 하나 이상을 변경시키거나, 결함-경향이 있는 (error-prone) 폴리머라제 쇄 반응을 이용하여 상기 라이브러리에 무작위의 돌연변이를 도입하여 이루어질 수 있다. 파지미드 라이브러리를 스크리닝하는 추가의 방법은, 미국 특허 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,403,484호, 제5,223,409호 (각각 본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다.
거대 조합 항체 라이브러리를 선별하기 위한 다른 방법은 M13, fl 또는 fd와 같은 필라멘트성 박테리오파지의 표면상에 다양한 중쇄 및 경쇄 서열 집단의 발현을 이용하여 개발하였다(참조: 미국 특허 제5,698,426호; 본원에 참조로 인용됨). 다양한 중쇄(Hc) 및 경쇄(Lc) 서열의 2개 집단을 폴리머라제 쇄 반응(PCRTM)으로 합성한다. 이들 집단은 발현에 필요한 요소들을 함유하는 별개의 M13계 벡터내로 클로닝된다. 중쇄 벡터는 유전자 VIII(gVIII) 피복 단백질 서열을 함유함으로써 중쇄 서열의 해독은 gVIII-Hc 융합 단백질을 생산한다. 2개 벡터의 집단은 무작위적으로 합해짐으로써 Hc 및 Lc 서열을 함유하는 벡터의 부분만이 단일의 환형 벡터내로 연결된다.
상기한 결합 벡터는, 상기 2가지의 폴리펩타이드의 조합 및 M13 상에서의 발현을 위한 Hc 및 Lc 서열의 공-발현을 유도한다 {참조: 미국 특허 제5,698,426호 (본원에서 참조문헌으로 인용됨)}. 이러한 결합 단계에서는, 2가지의 다양한 군내의 상이한 Hc 및 Lc를 암호화하는 서열을 단일 벡터에 무작위로 넣는다. 각각의 독립된 벡터에서 기원한 벡터 서열은, 생존가능한 파지의 생산에 필수적이다. 또한, 슈도 gVIII 서열은 상기 2가지의 출발 벡터 중 하나의 벡터에만 함유되어 있기 때문에, 상기 벡터 서열이 단일 벡터내에 결합될 때까지는 파지 표면상에서 Lc-결합된 gVIII-Hc 융합 단백질로서 기능성 항체 단편을 공-발현시킬 수 없다.
상기 항체 라이브러리의 표면 발현은, 앰버 서프레서 계통 (amber suppressor strain)에서 발현된다. Hc 서열과 gVIII 서열 사이의 앰버 종료 코돈은 비-서프레서 계통에서는 상기 2가지 성분의 결합을 끊는다. 상기한 비-서프레서 계통에서 제조된 파지를 분리하고 서프레서 계통을 감염시키면, 발현하는 동안에 Hc 서열을 gVIII 서열에 결합시킨다. 감염후에 서프레서 계통을 배양함으로써, gVIII 융합 단백질 (gVIII-Fab 융합 단백질)로서 상기 라이브러리내의 모든 항체 종의 M13 표면상에서 공-발현시킬 수 있다. 이와 달리, 상기 DNA를 비-서프레서 계통에서 분리한 후, 서프레서 계통을 도입시켜 동일한 효과를 거둘 수도 있다.
상기한 표면 발현 라이브러리를 스크리닝하여, 표준 친화성 분리 공정을 이용하여 예비선택된 분자에 결합하는 특정 Fab 단편을 찾아낸다. 이러한 방법에는, 예를 들면, 패닝 (panning) {참조: Parmley 및 Smith, 1988 (본원에서 참조문헌으로 인용됨)}, 친화성 크로마토그래피 및 고상 블로팅 공정이 포함된다. 패닝은, 높은 역가를 가지는 파지를 용이하고 신속하게 소량을 스크리닝할 수 있기 때문에 바람직하다. 또한, 이 공정을 통해, 이 공정을 사용하지 않은 경우에는 검출불가능하고 실질적으로 균일한 군으로 증폭시켜야 했던 군 내의 소량의 Fab 단편 종을 선별할 수 있다. 선택된 Fab 단편은, 파지 군을 증폭시킨 후에 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 밝히는 것을 특징으로 한다.
다양한 항체 라이브러리를 제조하고 바람직한 결합 특이성을 가지는 것을 스크리닝하는 다른 방법은 미국 특허 제5,667,988호 및 제5,759,817호 (각각 본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다. 상기 방법에서는, 변성된 (degenerate) 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 연장 반응을 이용하여 면역글로불린 변이중쇄 및 경쇄 변이도메인의 CDR 부위에 변이(degeneracy)를 혼입하고 파지미드 표면상에 돌연변이된 폴리펩타이드를 디스플레이하여, 파지미드 라이브러리 형태로 헤테로다이머-면역글로불린 분자 라이브러리를 제조하는 것을 포함한다. 그리고 나서, 상기 디스플레이 단백질을 스크리닝하여, 예비-선택된 항원에 결합하는 능력을 가진 단백질을 선별한다.
일반적으로, 헤테로다이머-면역글로불린 분자를 제조하는 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(1) 목적하는 중쇄 또는 경쇄 V 부위-암호화 유전자를 파지미드 디스플레이 벡터에 도입하는 단계;
(2) 항체 V 부위 유전자의 CDR과 상동성을 가지는 부위를 함유하고, 파지미드 표면 디스플레이 단백질 상에 표현된 상이한 임시의 결합 부위를 발현할 수 있는 큰 집단의 디스플레이 벡터를 형성하도록 무작위-암호화 서열을 생산하는 변성 부위를 함유하는, 올리고뉴클레오티드를 사용하여 프라이머 연장법으로 상기한 파지미드 디스플레이 단백질 벡터에 무작위-결합 부위를 도입하는 단계;
(3) 필라멘트성 파지 입자 표면상에서 상기한 디스플레이 단백질 및 결합 부위를 발현시키는 단계; 및
(4) 친화성 기법 (예를 들면, 예비-선택된 항원에 대한 파지 입자의 패닝)을 사용하여 표면-발현된 파지 입자를 분리 (스크리닝)함으로써, 예비-선택된 항원을 결합하는 결합 부위를 함유하는 디스플레이 단백질을 포함하는 하나 이상의 파지미드 종을 분리하는 단계.
다양한 항체 라이브러리를 제조하고 목적하는 결합 특이성을 가지는 항체를 스크리닝하는 이 방법의 다른 변형 방법은, 미국 특허 제5,702,892호 (본원에서 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다. 이 방법에서는, 중쇄 서열만을 이용하며, CDRI 또는 CDRIII 초변이 부위를 암호화하는 모든 뉴클레오티드 부위에서 이러한 중쇄 서열이 무작위적이며, CDR에서의 유전자 변이성은 모든 생물학적 과정과 무관하게 발생한다.
상기 방법에서는, 2가지의 라이브러리를 조작하여, 중쇄 유전자 구조의 프레임워크내의 올리고뉴클레오티드 모티프를 유전적으로 셔플링 (shuffling)시킨다. CDRI 또는 CDRIII를 무작위로 돌연변이시켜, 중쇄의 초변이 부위를 재작제시켜 변이성이 큰 서열을 가지는 콜렉션을 수득한다. 돌연변이된 유전자 서열 콜렉션에 의해 암호화되는 중쇄 단백질은, 면역글로불린의 결합 특성을 모두 가지면서 2개의 면역글로불린 쇄 중에서 하나만을 필요로한다.
특히, 상기 방법은 면역글로불린 경쇄 단백질이 없는 조건하에서 수행된다. 파지 발현-변형된 중쇄 단백질 라이브러리를 부동화시킨 리간드와 함께 인큐베이션시켜, 부동화된 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 단백질을 암호화하는 클론을 선별한다. 그리고 나서, 결합된 파지를 부동화된 리간드와 분리시키고, 세균 숙주 세포내에서 성장시켜 증폭시킨다. 상이한 재조합 단백질을 각각 발현하는 개개의 바이러스성 플래이크가 늘어나고, 각 클론에 대해 결합 활성을 분석할 수 있다.
E2 . 사람 림프구로부터의 항체
인지질에 대한 항체는 사람 집단에서 발생한다. 그러나, 이들 항체는 통상적으로 질병과 연관되며, 본 발명에서 이들의 용도는 바람직하게는 제외된다. 그러나, 건강한 대상체로부터의 사람 림프구를 본 발명에서 사용하기 위한 항체 생성용 출발 물질로서 적절히 사용할 수 있다.
실험실내 면역반응(in vitro immunization)에서, 또는 항원 자극을 사용하여 본 발명에 사용하기 위한 사람 항체를 생성시킬 수도 있다, 이러한 기술을 사용하여, 시험관내 음이온성 인지질 및 아미노인지질로 항체-생성 세포를 단순히 자극함으로써 정상적인 건강한 대상으로부터 말초 혈액 림프구를 자극할 수 있다.
상기 "실험실내 면역반응"은, 일반적으로 림프구의 혼합군 (혼합된 림프구 배양물, MLC)내의 면역화되지 않은 B 림프구를 항원-특이적 활성화시키는 것을 포함한다. 또한, 실험실내 면역반응은, B 세포 성장 및 분화 인자 및 림포카인(lymphokine)에 의해 지지될 수 있다. 이 방법으로 제조되는 항체는 종종 IgM 항체이다 {참조: Borrebaeck & Moller, 1986 (본원에 참조문헌으로 인용됨)}.
주로 IgG (또는 IgA) 항체를 생산하는 사람 림프구를 수득할 수 있는 다른 방법이 기술되어 있다 {참조: 미국 특허 제5,681,729호 (본원에 참조문헌으로 인용됨)}. 일반적인 의미에서, 이 방법은, 사람 림프구를 면역결핍 동물에 이식하여, 당해 동물체내에 사람 림프구를 "자리잡게하는 (take)" 단계; 상기 동물을 목적하는 항원으로 면역화시켜, 상기 항원에 특이적인 항체를 생산하는 사람 림프구를 생산하는 단계; 및 상기 항체를 생산하는 사람 림프구를 상기 동물로부터 회수하는 단계를 포함한다. 이렇게 생산된 사람 림프구를 사용하여 상기 항체를 생산하는 사람 림프구를 불멸화시키는 단계; 상기 항체를 생산하는 수득된 불멸화된 사람 기원의 림프구를 클로닝하는 단계; 및 목적하는 항원에 특이적인 모노클로날 항체를 클로닝한 불멸화된 사람 기원의 림프구로부터 회수하는 단계에 의해, 모노클로날 항체를 생산할 수 있다.
상기 기술에서 사용될 수 있는 면역결핍 동물은, 사람 림프구를 상기 동물에게 이식하였을 때에 거부 반응을 보이지 않는 동물이다. 이러한 동물은, 물리적, 화학적 또는 생물학적 처리를 통해 인공적으로 조작하여 만들 수 있다. 모든 면역결핍 동물을 사용할 수 있다. 사람 림프구는 사람의 말초혈액, 비장, 림프절, 편도선 등에서 입수할 수 있다.
이식된 사람 림프구를 동물내에 "자리잡게 하는것(taking)"은, 사람 림프구를 당해 동물에 단순히 투여함으로써 가능할 수 있다. 투여 경로는 제한되지는 않으나, 예를 들면 피하 투여, 정맥내 투여 또는 복강내 투여일 수 있다. 사람 림프구의 투여량은 제한되지 않으나, 통상적으로 동물 1 마리당 106 내지 108 림프구일 수 있다. 그리고 나서, 상기한 면역결핍 동물을 목적하는 항원으로 면역화시킨다.
면역화시킨 후, 기존의 모든 방법을 사용하여 혈액, 비장, 림프절 또는 기타의 림프 조직에서 사람 림프구를 회수한다. 예를 들면, 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 원심분리 방법 (특정 중력: 1.077)을 사용하여 단핵 세포를 분리할 수 있으며, 플라스틱 디쉬 흡수법(plastic dish adsorption method)을 사용하여 상기 단핵세포를 제거할 수 있다. 면역결핍 동물에서 기원하는 오염원 세포는, 상기 동물 세포에 대해 특이적인 항혈청을 사용하여 제거할 수 있다. 이러한 항혈청은, 예를 들면, 면역결핍 동물의 비장 세포를 이용하여 제2의 상이한 동물을 면역화시킨 후, 이렇게 면역된 상이한 동물로부터 혈청을 회수함으로써 수득할 수 있다. 항혈청을 이용한 상기한 처리방법은 모든 단계에서 사용될 수 있다. 또한, 마커로서 사람 세포 표면 상에 발현되는 사람 면역글로불린을 이용한 면역학적 방법을 이용하여, 사람 림프구를 회수할 수 있다.
이러한 방법에 의해, 하나 이상의 선택된 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 특이적인 IgA 및 IgG 항체를 주로 생산하는 사람 림프구를 수득할 수 있다. 그리고 나서, 불멸화 (immortalization), 선택, 세포 성장 및 항체 생산을 통해, 상기 사람 림프구로부터 모노클로날 항체를 수득한다.
E3 . 사람 항체 라이브러리를 함유하는 형질전환 마우스
현재, 항체 생산을 위해 재조합 기법을 사용할 수 있다. 위에서 기술한 복합 면역글로불린 파지 발현 라이브러리에 추가하여, 다른 분자 클로닝 방법에서는 사람 항체 라이브러리를 함유하는 형질전환 마우스로부터 항체를 제조한다. 이러한 기법에 대해서는 미국 특허 제5,545,807호 (본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다.
대부분의 측면에서, 이러한 방법에서는, 사람 기원의 면역글로불린의 적어도 일부를 암호화하거나 재배열하여 면역글로불린의 레파토리(repertoire)를 암호화할 수 있는 유전 물질을 배아주(germline)에 삽입한 형질전환 동물의 생산을 포함한다. 삽입된 유전 물질은, 사람 공급원에서부터 생산될 수도 있고, 합성되어 생산될 수도 있다. 상기한 유전 물질은 공지된 면역글로불린의 적어도 일부를 암호화할 수 있으며, 변형된 면역글로불린의 적어도 일부를 암호화하는 변형된 것일 수도 있다.
상기 삽입된 유전 물질을 형질전환 동물내에서 발현시켜, 삽입된 사람 면역글로불린 유전 물질에서 적어도 일부가 기원한 면역글로불린을 생산한다. 삽입된 유전 물질이 배아주내의 잘못된 위치 또는 잘못된 기하학적 배열로 혼입되었다 하더라도, 상기한 유전 물질은 형질전환 동물내에서 재배열되어, 삽입된 유전에서 일부 기원하는 일부분을 지닌 면역글로불린의 레파토리를 생산할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
상기 삽입된 유전 물질은, 플라스미드 및/또는 코스미드와 같은 원핵생물 벡터내에 클로닝된 DNA 형태일 수 있다. 보다 큰 DNA 단편은 인공적인 효모 염색체 벡터를 사용하거나 {참조: Burke 등, 1987 (본원에 참조문헌으로 인용됨)}, 염색체 단편을 도입함으로써 삽입할 수 있다 {참조: Richer 및 Lo, 1989 (본원에 참조문헌으로 인용됨)}. 상기 삽입된 유전 물질은, 기존의 방식 (예를 들면, 수정란 또는 배아 줄기 세포내에 주사 또는 기타의 공정을 사용)으로 숙주내에 도입시킬 수 있다.
바람직한 양태에서는, 면역글로불린의 불변 영역을 암호화하는 유전 물질을 초기에는 지니지 않는 숙주 동물을 사용함으로써, 면역글로불린을 생산하는 경우 수득한 형질전환 동물은 삽입된 사람의 유전 물질만을 이용할 것이다. 이는, 관련된 유전 물질이 없는 천연적으로 발생한 돌연변이 숙주를 사용하거나, 관련된 유전 물질이 제거된 숙주를 최종적으로 제조하기 위한 세포주에서와 같이 인공적으로 제조한 돌연변이체를 제조함으로써 가능하다.
상기 숙주 동물이 면역글로불린의 불변 영역을 암호화하는 유전 물질을 함유하는 경우, 형질전환 동물은 천연적으로 존재하는 유전 물질 및 삽입된 유전 물질을 가지게 되며, 천연적으로 존재하는 유전 물질, 삽입된 유전 물질 및 유전 물질 유형 둘다의 혼합물에서 기원하는 면역글로불린을 생산할 것이다. 이 경우, 상기한 형질전환 동물로부터 기원하는 하이브리도마를 스크리닝함으로써, 예를 들면 항체 유전자 발현의 대립형질 제외 또는 염색체 차등 손실 현상을 이용하여, 목적하는 면역글로불린을 수득할 수 있다.
적합한 형질전환 동물을 제조한 후, 이 동물을 목적하는 면역원으로 간단하게 면역화시킨다. 삽입되는 물질의 성질에 따라, 이 동물은, 외부에서 기원하는 유전 물질이 면역글로불린의 일부분만을 암호화하는 키메라 면역글로불린(예를 들면, 마우스/사람 기원)을 생산할 수 있고; 외부에서 기원하는 유전 물질이 면역글로불린의 전체를 암호화하는 전적으로 외부성 면역글로불린 (예를 들면, 전체가 사람에서 기원)을 생산할 수도 있다.
면역반응시킨 후에 형질전환 동물로부터 폴리클론 항혈청을 생산할 수 있다. 목적하는 면역글로불린을 생산하는 면역글로불린-생산 세포를 상기 동물로부터 회수한다. 바람직하게는, 예를 들면, 상기 동물의 비장 세포를 골수종 세포와 융합한 후, 수득되는 하이브리도마를 스크리닝하여 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별함으로써, 형질전환 동물로부터 모노클로날 항체를 생산한다. 이러한 공정에 사용하기에 적합한 기법은 하기에 기재되어 있다.
이와 달리, 목적하는 항체가 체액 (예를 들면, 혈청이나, 젖, 초유 또는 타액과 같은 상기 동물의 외부 배출물)에서 생산되는 방식으로, 상기 유전 물질을 상기 동물에 혼입할 수 있다. 예를 들면, 적어도 일부의 사람의 면역글로불린을 암호화하는 유전 물질을 젖 단백질을 암호화하는 포유동물의 유전자에 실험실 내에서 삽입하고 나서, 이 유전자를 상기 포유 동물의 수정란에 도입 (예를 들면, 주사)함으로써, 삽입된 사람의 면역글로불린 유전 물질로부터 적어도 일부분이 기원하는 면역글로불린을 함유하는 젖을 생산하는 포유동물 암컷 성체로 발생할 수 있다. 그리고 나서, 상기 젖으로부터 목적하는 항체를 수거할 수 있다. 이러한 공정을 수행하기에 적합한 기법은 당업자들에게는 명백할 것이다.
대개, 전술한 형질전환 동물은 동일한 동형 (특히, IgM 및 가능하게는 IgD와 같은 B 세포 성숙에 필수적인 동형)의 사람 항체를 생산하는 데에 사용된다. 사람 항체를 생산하는 다른 바람직한 방법은, 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호 및 제5,770,429호 (각각 본원에서 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다. 상기 문헌에서는, B 세포 발생에 필요한 동형에서 기타의 다른 동형으로 변환(switching)될 수 있는 형질전환 동물이 기재되어 있다.
B 림프구의 발생에 있어서, 이 세포는, 생산적으로 재배열된 VH 및 VL 영역에 의해 결정되는 결합 특이성을 가지는 IgM을 초기에 생산한다. 그리고 나서, 각 B 세포 및 이의 자손 세포는 동일한 L 쇄 및 H 쇄 및 V 영역을 가지는 항체를 합성하지만, H쇄의 동형을 변환시킬 수 있다. μ또는 δ불변 영역의 사용은 대체 스플라이싱 (alternative splicing)에 의해 주로 결정되어, IgM 및 IgD가 단일 세포내에서 함께 발현될 수 있도록 한다. 다른 중쇄 동형 (γ, α및 ε)은, 유전자 재배열 현상으로 인해 C μ또는 C δ엑손을 결실한 후에 자연적으로만 발현된다. 대개, 이러한 유전자 재배열 과정 ("동형 스위칭")은, 각 중쇄 유전자 (델타 제외)의 바로 상향에 위치하는 소위 스위치 분절 사이에서의 재조합에 의해 이루어진다. 이러한 개개의 스위치 분절은 길이가 2 내지 10kb이고, 주로 짧은 반복 서열로 이루어져 있다.
이러한 이유로 인해, 동형 스위칭에 사용될 각 스위치 영역에서 상향으로 약 1 내지 2kb 내에 전이유전자(transgene)가 전사 조절 서열을 혼입하는 것이 바람직하다. 이러한 전사 조절 서열은, 프로모터 및 인핸서 요소를 포함하는 것이 바람직하며, 스위치 영역과 자연적으로 연결된(즉, 배아주 배열(configuration)에서 발생하는) 5'-플랭킹 (즉, 상향) 영역을 포함하는 것이 보다 바람직하다. 하나의 스위치 영역으로부터 5' 플랭킹 서열이 전이유전자 작제를 위한 상이한 스위치 영역에 작적으로 연결될 수 있다고 해도, 소정의 양태에서는, 전이유전자 작제물내에 혼입된 각 스위치 영역이 천연적으로 존재하는 배아주 배열에서 바로 상향에 있는 5' 플랭킹 영역을 가지는 것이 바람직하다. 면역글로불린 스위치 영역 서열과 관련된 서열 정보는 이미 알려져 있다 {참조: Mills 등, 1990; Sideras 등, 1989 (본원에서 참조문헌으로 각각 인용됨)}.
미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호 및 제5,770,429호에 기재된 방법에서는, 형질전환된 동물내에 함유된 사람의 면역글로불린 전이유전자가 B 세포 발생 경로에서 정확하게 기능을 발휘하여, 동형 스위칭을 가져왔다. 따라서, 이 방법에서는, 동형 스위칭이 발생하고 다음 중 하나 이상이 발생되도록 전이유전자를 작제한다: (1) 높은 수준 및 세포 유형-특이적 발현; (2) 기능 유전자 재배열; (3) 대립형질 제외 (allelic exclusion)의 활성화 및 이에 대한 반응; (4) 주요 레파토리의 충분한 발현; (5) 신호 형질도입; (6) 체세포 초돌연변이 (hypermutation); 및 (7) 면역 반응 동안의 전이 유전자 항체 좌위의 우성화(domination).
전이유전자의 기능에 가장 필요한 것은, 다양한 항원에 대한 제2 면역 반응을 유발하기에 충분할 정도로 다양한 주요 항체 레파토리(primary antibody repertoire)의 생성이다. 재배열된 중쇄 유전자는, 각각 다수의 엑손에 의해 암호화되는 다중 도메인-불변 영역의 무작위 배열 (tandem array), 변이영역 엑손 및 신호 펩타이드 엑손으로 이루어져 있다. 각각의 불변 영역 유전자는, 상이한 부류의 면역글로불린의 불변 영역을 암호화한다. B 세포 발생 동안, V 영역-인접 불변 영역이 제거되어, 새로운 부류의 중쇄가 발현된다. 각각의 중쇄 부류의 경우, 다른 RNA 스플라이싱 방식으로 인해 전이막 및 방출된-면역글로불린 둘 다가 생성된다.
사람의 중쇄의 유전자 좌위는, 2Mb인 대략 200V 유전자 분절, 약 40kb에 이르는 대략 30D 유전자 분절, 3kb 전장(span)내에 밀집된 6개의 J 분절, 및 대략 300kb에 걸쳐 퍼져 있는 9개의 불변 영역 유전자 분절으로 이루어져 있다. 전체 유전자 좌위는, 14번 염색체의 긴 암(long arm)의 말단 부위의 약 2.5Mb에 걸쳐 있다. μ, δ, γ3, γ1 및 α1 불변 영역 뿐만 아니라, 6가지의 공지된 VH 패밀리 구성원, D 및 J 유전자 분절을 함유하는 중쇄 전이유전자 단편은 이미 공지되어 있다 {참조: Berman 등, 1988 (본원에서 참조문헌으로 인용됨)}. 이와 유사하게, 사람의 경쇄 유전자 좌위에서 기원하는 모든 필요한 유전자 분절 및 조절 서열을 함유하는 게놈 단편이 작제된다.
대개, 성공적으로 재배열된 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 전이유전자의 발현은, 비-사람 형질전환 동물에서 내인성 면역글로불린 유전자의 재배열을 억제함으로써 우성 효과를 가진다. 하지만, 소정의 양태에서는, 예를 들면 전이유전자와 내인성 Ig 서열 사이에 트랜스-스위칭시킴으로써, 사람의 변이영역 및 비-사람 (예를 들면, 쥐) 불변 영역을 포함하는 하이브리드 면역글로불린 쇄가 형성될 수 없도록 내인성 Ig 유전자 좌위를 완전히 불활성화시키는 것이 바람직하다. 배아 줄기 세포 기술 및 동종 재조합 기법을 이용하여, 내인성 면역글로불린 레파토리를 용이하게 제거할 수 있다. 또한, 안티센스 기술과 같은 다양한 기술을 이용하여, 내인성 Ig 유전자를 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서는, 트랜스-스위칭된 면역글로불린이 바람직할 수 있다. 트랜스-스위칭된 키메라 면역글로불린을 포함하는 항체는, 비-사람 (예를 들면, 쥐) 불변 영역을 가지는 것이 바람직한 다양한 경우, 예를 들면 숙주내에서 효과기(effector) 기능을 보유하기 위해 사용될 수 있다. 쥐의 불변 영역의 존재로 인해, 쥐의 효능인자 기능 (예를 들면, ADCC, 쥐의 보체 고정)을 제공함으로써 마우스의 질환 모델에서 상기 키메라 항체를 테스트할 수 있어서 사람의 불변 영역에 비해 잇점이 있다. 상기한 동물을 테스트한 이후에, 상기 공급원 (하이브리도마 클론)으로부터 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 등을 통해 사람의 가변 영역을 암호화하는 서열을 분리할 수 있으며, 사람 치료에 보다 적합한 사람 서열 항체를 암호화하는 목적하는 사람의 불변 영역을 암호화하는 서열에 연결할 수 있다.
E4 . 사람화된 항체
일반적으로, 사람 항체는 사람 치료요법에 있어서 3가지 이상의 우수한 잇점을 가지고 있다. 첫째, 효과기 부위가 사람 부위이기 때문에, 사람의 면역 시스템의 다른 부분과 보다 잘 작용하여, 예를 들면 보체-의존 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존 세포성 세포독성 (ADCC)에 의해 표적 세포를 보다 효과적으로 파괴한다. 둘째, 사람의 면역 시스템은 사람 항체를 외부 물질로 인식하지 않는다. 셋째, 사람의 순환계내에서의 반감기가 천연적으로 존재하는 사람 항체와 유사하므로, 보다 적은 양 및 보다 적은 횟수로 투여할 수 있다.
본원에서는, 사람 항체를 제조하는 여러 방법을 제공한다. 사람 항체에 더불어, "사람화된 항체"는 많은 장점이 있다. 일반적으로, "사람화된(humanized)" 항체는, 사람의 불변 및/또는 변이 영역 도메인 또는 특정 변이를 갖는, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 또는 기타의 종에서 기원한 키메라 또는 돌연변이 모노클로날 항체이다. 소위 "사람화된" 항체의 제조 기법은 당업자들에게는 명백히 알려져 있다.
또한, 사람화된 항체는 전술한 잇점들도 가진다. 첫째, 효과기 부위는 여전히 사람 부위이다. 둘째, 사람의 면역 시스템은 이의 골격 또는 불변 영역을 외부 물질로 인식하지 않기 때문에, 주사된 항체에 대한 항체 반응이 전체적인 외부 마우스 항체에 비해 훨씬 작다. 셋째, 주사된 마우스 항체와는 달리, 주사된 사람화된 항체의 반감기는 천연적으로 존재하는 사람 항체와 더욱 유사하여, 보다 적은 양 및 보다 적은 횟수로 투여할 수 있다.
사람화된 항체를 제조하는 수많은 방법들이 이미 알려져 있다. 단백질 디설파이드 결합을 통해 결합된 항체 도메인을 통제하에 재배열하여 형성한 새로운 인공 단백질 분자, 즉 "키메라" 항체가 사용될 수 있다 {참조: Konieczny 등, 1981 (본원에서 참조문헌으로 인용됨)}. 또한, 재조합 DNA 기법을 사용하여, 마우스 항체의 가변 영역과 중쇄 도메인과 사람 항체의 경쇄 및 중쇄 불변 영역 사이에 유전자 융합물을 작제할 수 있다 [참조: Morrison 등, 1984 (본원에서 참조문헌으로 인용됨)}.
분자적인 수단을 사용하여, 쥐의 모노클로날 항체의 항원-결합 부위 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 암호화하는 DNA 서열을, 사람 항체의 중쇄 및 경쇄의 프레임워크를 암호화하는 DNA 서열에 이식시킬 수 있다 {참조: Jones 등 1986, Riechmann 등, 1988, 각각 본원에 참조로 인용됨}. 이렇게 발현된 재조합 산물을 "재형성된 (reshaped)" 즉 사람화된 항체라고 부르며, 사람 항체의 중쇄 또는 경쇄의 프레임워크과 쥐의 모노클로날 항체의 항원 인식 부위 (CDR)을 포함한다.
사람화된 항체를 제조하는 다른 방법은 미국 특허 제5,639,641호(본원에서 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다. 이 방법에서는, 재표면화 (resurfacing)를 통해, 가변 영역내의 사람 표면의 표현으로 인해 치료 효과가 더 향상된 사람화된 설치류의 항체를 제공한다. 이 방법에서는, (1) 항체 중쇄 및 경쇄 변이 영역 풀(pool)을 위치 배열시켜, 1 세트의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 표면-노출된 위치를 생성하는 단계(여기서, 모든 가변 영역에 대한 정렬 위치는 약 98% 이상 동일하다); (2) 1 세트의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 표면 노출된 아미노산 잔기를 설치류 항체(또는 이의 단편)에 대해 정의하는 단계; (3) 상기한 설치류 표면 노출된 아미노산 잔기 세트와 가장 비슷하게 일치하는 1세트의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 골격 표면 노출된 아미노산 잔기를 확인하는는 단계; (4) 상기한 설치류 항체의 상보성 결정 영역의 특정 원자의 5Å 이내에 있는 아미노산 잔기를 제외하고, 단계 (2)에서 정의된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 표면 노출된 아미노산 잔기의 세트를, 단계 (3)에서 확인된 중쇄 및 경쇄 및 중쇄 변이 영역 프레임워크 표면 노출된 아미노산 잔기 세트로 치환하는 단계; 및 (5) 결합 특이성을 가지는 사람화된 설치류 항체를 생산하는 단계를 포함한다.
사람화된 항체를 제조하는 이와 유사한 방법이 미국 특허 제5,693,762호, 제5,693,761호, 제5,585,089호 및 제5,530,101호 (본원에서 각각 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다. 이들 방법에서는, 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 공여자의 면역글로불린으로부터의 추가의 아미노산 및 수용하는 사람 면역글로불린으로부터의 프레임워크 영역을 가지는, 사람화된 면역글로불린을 생산하는 것을 포함한다. 대개, 각각의 사람화된 면역글로불린은, CDR 이외에도, CDR과 반응하여 결합 친화성을 발휘할 수 있는 공여자 면역글로불린 프레임워크로부터의 아미노산 (예를 들면, 분자 모델링에 의해 예측되는, 공여자의 면역글로불린내의 CDR에 바로 인접한 하나 이상의 아미노산 또는 약 3Å 이내의 아미노산)을 포함한다. 미국 특허 제5,693,762호, 제5,693,761호, 제5,585,089호 및 제5,530,101호 (본원에서 각각 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있는 다양한 위치 기준 중에 하나 또는 어떠한 조합을 사용하거나, 또는 이들을 모두 사용하여 상기한 중쇄 및 경쇄를 설계할 수 있다. 본래의 항체에 사람화된 면역글로불린을 결합하는 경우, 사람화된 면역글로불린은 사람에서는 실질적으로 비-면역원성이며, 원래의 항원에 대한 공여자 면역글로불린과 실질적으로 동일한 친화성을 유지한다.
사람화된 항체를 제조하는 다른 방법이 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,733,743호 (본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다. 이 방법은, 사람화된 항체의 개념과 본원에 기재되어 있는 파지미드 라이브러리를 결합한 것이다. 일반적으로 설명하면, 상기 방법에서는, 목적하는 항원에 대해 지시된 항체 또는 항체군의 항원-결합 부위로부터의 서열을 이용한다. 따라서, 설치류의 단일 항체의 경우, 이 항체의 항원-결합 부위의 일부를 포함하는 서열이 사람 항체의 다양한 레파토리의 서열과 결합하여 전체 항원-결합 부위를 생성할 수 있다.
원래의 설치류 항체의 서열 일부만이 항원과 유사한 방식으로 접촉한다는 점에 있어서, 본 공정에 따라 제조되는 항원-결합 부위는 CDR 이식에 의해 제조되는 것과는 상이하다. 상기 선택된 사람 서열은 서열면에 있어서는 상이할 가능성이 크며, 원래의 결합 부위의 서열에서 비롯한 항원과 접촉할 수도 있다. 하지만, 항원의 원래의 서열 일부분의 결합, 항원 및 항원-결합 부위의 형상에 의한 제한으로 인해, 상기한 사람 서열이 상기 항원의 동일한 부위 또는 에피토프에 새로이 접촉하게 할 가능성도 있다. 따라서, 이러한 과정을 "에피토프-각인된 선택(epitope imprinted selection (EIS)"라고 부른다.
동물 항체를 이용하는 것으로 시작하는 한 공정에서는, 부분적인 사람 항체를 선택할 수 있다. 이러한 항체는, 사람 항체와 서열면에서 충분히 유사하여, 치료요법에 직접 사용하거나, 몇몇 핵심 잔기를 변형시킨 후에 직접 사용할 수 있다. 사람 서열과 상기 선택된 항체의 설치류 성분 사이의 서열상의 차이는, 예를 들면 개개의 잔기의 부위 지시된 돌연변이 (site directed mutagenesis) 또는 전체 루프의 CDR 이식에 의해, 사람 서열 잔기와 상이한 잔기를 대체함으로써 최소화할 수 있다. 하지만, 전체가 사람 서열인 항체를 제조할 수도 있다. 따라서, EIS를 통해, 동물 항체 또는 부분적인 사람 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 부분적인 사람 항체 또는 전체 사람 항체를 제조하는 방법을 제공할 수 있다. EIS에서는, 항체 단편의 레파토리가, 상기 파지를 항원에 결합시켜 선택한 항원-결합 활성을 가진 단편을 암호화하는 유전자 및 필라멘트상(filamentous phase)의 표면상에서 디스플레이될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 것으로 생각되는 항체를 사람화시키는 다른 방법들은 미국 특허 제5,750,078호, 제5,502,167호, 제5,705,154호, 제5,770,403호, 제5,698,417호, 제5,693,493호, 제5,558,864호, 제4,935,496호 및 제4,816,567호 (각각 본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다.
E5 . PCR TM 에 의한 돌연변이 유발
부위 특이적 돌연변이유발(site-specific mutagenesis)은, 주요한 DNA의 특이적인 돌연변이유발을 통해 개개의 항체를 제조하는 데에 유용한 기술이다. 또한, 이 방법을 통해, 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 변화를 DNA에 도입에 의해, 사람화되는지를 상기한 사항들을 고려하여, 서열 변이체를 제조 및 시험할 수 있다.
많은 방법들이 돌연변이유발에 적합하게 사용될 수 있으나, 현재로서는 폴리머라제 쇄 반응 (PCRTM)을 사용하는 것이 바람직하다. 이 방법은, 소정의 DNA 서열에 목적하는 돌연변이를 도입하는 효율적이고 신속한 방법을 제공한다. 특히 아래의 내용에서는, 소정의 서열에 의해 암호화되는 아미노산을 변경하는 데에 사용될 수 있는 바와 같이, 소정의 서열에 점 돌연변이 (point mutation)을 도입하기 위한 PCRTM의 사용을 기재하고 있다. 또한, 이 방법을 변형하여, 제한 효소 부위를 DNA 분자에 도입하는 데에도 적합하게 사용할 수 있다.
본 방법에서는, 증폭된 분절의 한쪽 말단에 점 돌연변이가 도입되도록 합성 올리고뉴클레오티드를 설계한다. PCRTM을 거친 후, Klenow 단편을 처리하여 상기 증폭된 단편을 평활 말단화(blunt ended)하고, 평활-말단화된 단편을 연결(ligation)하고, 서열 분석을 용이하게 하기 위해 이를 벡터내에 아클로닝한다.
돌연변이시키고자 하는 주형 DNA를 제조하기 위해, 돌연변이시킬 부위에 인접하는(flanking) 제한효소 부위를 사용하여, 높은 카피 수(copy number)의 벡터 (예를 들면, pUC19)에 상기 DNA를 아클로닝(subcloning)한다. 그리고 나서, 플라스미드 미니프렙(miniprep)을 사용하여 주형 DNA를 제조한다. 모 서열 (parent sequence)에 기초하지만, 목적하는 점 돌연변이를 가지고 있으며, 제한효소 부위가 5' 말단에 인접해 있는, 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 자동 합성기를 사용하여 합성한다. 일반적으로, 대략 15 염기 정도의 주형 DNA와 상동인 프라이머 (primer)가 필요하다. 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 프라이머를 정제할 수 있으나, 이는 PCRTM을 사용하는 데에 있어서 반드시 필요한 것은 아니다. 그리고 나서, 상기한 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 인산화시킨다.
목적하는 점 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, PCRTM에 의해 상기한 주형 DNA를 증폭시킨다. 상기한 증폭 버퍼에서의 MgCl2의 농도는, 일반적으로 약 15mM일 것이다. 일반적으로, 다음에 기재된 바와 같이, 약 20 내지 25 사이클의 PCRTM을 수행하여야 한다: 95℃에서의 35초간의 변성 (denaturation) 단계, 50℃에서 2분간의 하이브리드화 단계, 및 72℃에서 2분간의 연장(extension) 단계. 일반적으로, PCRTM에서는 72℃에서 약 10분간의 마지막 사이클 연장 단계를 포함한다. 최종 연장 단계 후, 약 5 유닛의 클레노우(Klenow) 단편을 상기 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 약 30℃에서 추가로 15분 동안 항온처리시켜야 한다. 클레노우 단편의 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성은, 말단을 매끈하게 하여 평활 말단 클로닝에 적합하도록 하는 데에 필수적이다.
일반적으로, 이렇게 수득한 반응 혼합물은 비-변성 아가로즈 또는 아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하여, 상기 증폭 과정을 통해 예상된 생성물을 생산하였는 지를 확인하여야 한다. 그리고 나서, 상기 반응 혼합물에 대해, 대부분의 광 오일(mineral oil)을 제거한 다음, 클로로포름으로 추출하여 잔류 오일을 제거한 후, 완충된 페놀을 사용하여 추출하고 나서, 100% 에탄올로 침전시켜 농축시킨다. 그리고 나서, 상기 올리고뉴클레오티드에서 사용되는 인접한 서열에서 절단하는 제한 효소를 이용하여 상기 증폭된 단편의 약 절반을 분해(digest)시켜야 한다. 이렇게 분해된 단편을 낮은 겔화/용융 아가로즈 겔(low gelling/melting agarose gel) 상에서 정제한다.
상기 단편을 아클로닝하고 점 돌연변이를 확인하기 위해, 평활 말단 연결을 통해 적합하게 분해된 벡터에 상기한 2개의 증폭 단편을 아클로닝하여야 한다. 이를 통해 이.콜라이 (E.coli)를 형질전환시킬 수 있는 데, 이로부터 미니프렙(miniprep)을 이용하여 플라스미드 DNA를 제조할 수 있다. 플라스미드 DNA의 증폭 부위를 DNA 서열분석으로 분석하여, 정확한 점 돌연변이가 생성되었는 지를 확인할 수 있다. 이는 매우 중요한 데, 그 이유는 Taq DNA 폴리머라제가 DNA 단편에 추가의 돌연변이가 생기도록 할 수 있기 때문이다.
또한, 점 돌연변이의 도입은 연속적인(sequential) PCRTM 단계를 사용하여 이루어질 수도 있다. 이 공정에서, 돌연변이를 가지는 상기 2개의 단편을 서로 어닐링 (annealing)시키고, 상호 프라임-합성 (mutually primed synthesis)에 의해 연장시킨다. 그리고 나서, 제2 PCRTM 단계를 이용하여 이 단편을 증폭함으로써, 상기 프로토콜에서 필요로하는 평활 말단 연결을 피할 수 있다. 이 방법에서는, 주형 DNA의 제조, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 생성 및 제1 PCRTM 증폭 단계를 상기한 바와 같이 수행한다. 하지만, 이 공정에서는, 상기 선택된 올리고뉴클레오티드가 약 15 내지 약 20개 염기 길이가 주형 DNA와 상동성을 가져야 하며, 약 10 염기 이상이 중복되어야 한다.
제2 PCRTM 증폭에서는, 각각의 증폭 단편 및 인접 서열 프라이머를 이용하고, 상기한 조건하에서 약 20 내지 약 25 사이클의 PCRTM을 수행한다. 상기 단편을 다시 아클로닝하고, 상기한 단계를 이용하여 점 돌연변이가 정확한 지를 검사한다.
상기한 2가지의 방법 중 어느 방법을 사용하는 경우에도, 가능한 한 작은 단편을 증폭시켜 돌연변이를 도입하는 것이 일반적으로 바람직하다. 물론, GC 함량 및 올리고뉴클레오티드의 길이에 의해 일반적으로 영향을 받는 올리고뉴클레오티드의 융점과 같은 매개변수들을 주위깊게 고려하여야 한다. 이러한 방법, 및 필요한 경우에는 최적화 방법의 실행은 당업자들에게는 명백할 것이며, 다양한 문헌에 추가로 기재되어 있다 {참조: Current Protocols in Molecular Biology, 1995 (본원에 참조문헌으로 인용됨)}.
부위-특이적 돌연변이 유발을 수행하는 경우, 하기 표 A를 참조하여 수행할 수 있다.
[표 A]
Figure 112012087199067-pat00001
E6 . 항체 단편 및 유도체
음이온성 인지질 또는 아미노인지질에 대한 원래의 항체의 공급원과는 무관하게, 완전한 항체, 다량체(multimer)이거나, 이의 다양한 작용성 항원-결합 부위가 본 발명에서 사용될 수 있다. 작용성 부위의 예로는, 항체의 scFv, Fv, Fab', Fab 및 F(ab')2 단편이 포함된다. 이러한 작제물을 제조하는 기법들은 당업자들에게는 잘 알려져 있으며, 본원에 추가로 예시되어 있다.
항체 작제물의 선택은, 여러 가지 요소에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린의 Fc 부분의 특성인, 신장내의 완전한 항체를 능동적으로 재흡수함으로써 반감기를 연장시킬 수 있다. 따라서, IgG계 항체는 Fab' 대응물에 비해 혈액 청소율이 더 적을 것으로 예상된다. 하지만, Fab' 단편계 조성물은 일반적으로 조직 투과성이 보다 우수하다.
항체 단편은, 비-특이적 티올 프로테아제(파파인, papain)을 사용하여 전체 면역글로불린을 단백질분해함으로써 수득할 수 있다. 파파인-분해로 인해, 각각 단일 항원-결합 부위를 가지는 2개의 동일한 항원-결합 단편("Fab 단편") 및 잔여(residual) "Fc 단편"이 생성된다.
우선, 시스테인, 2-머캅토에탄올 또는 디티오트레이톨을 가진 활성 부위에 있는 설피드릴 그룹을 환원시켜, 파파인을 활성화시켜야 한다. 상기 스톡 효소 (stock enzyme) 내의 중금속은, 효소 활성을 최대화하기 위해서 EDTA (2mM)을 사용하여 킬레이션(chelation)시켜 제거하여야 한다. 통상적으로, 효소와 기질은 1:100의 중량비로 함께 혼합한다. 항온처리한 후, 요오도아세트아미드를 이용하여 상기 티올 그룹을 비가역적으로 알킬화시키거나 단순히 투석시켜, 상기 반응을 종료시킬 수 있다. 단백질 A-세파로즈 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리된 다양한 분획 및 SDS-PAGE에 의해, 상기 분해의 종료 여부를 모니터링하여야 한다.
토끼 및 사람 기원의 IgG에서 F(ab')2 단편을 제조하는 통상의 공정은, 효소 펩신을 이용한 한정된 단백질 분해이다. 37℃, pH4.5, 아세테이트 완충액 내에서의 100× 항체 과량 (w/w)의 조건은, 중쇄내 디설파이드 결합의 C 말단부에서 항체가 분해됨을 암시해준다. 마우스 IgG의 분해율은 서브클래스에 따라 달라질 수 있으며, 일부 분해되거나 완전 분해된 IgG 없이 활성 F(ab/)2 단편을 고 수율로 수득하기는 어렵다. 특히, IgG2b은 완전히 분해 (degradation)되기 쉽다. 다른 서브 클래스는 최적의 결과를 얻기 위한 항온처리 조건이 상이한 데, 이는 당업자들에게는 잘 알려져 있다.
완전한 항체를 펩신으로 처리함으로써, 2개의 항원-결합 부위를 가지며 항원과 교차 결합할 수 있는 능력을 여전히 보유한 F(ab')2 단편이 생성된다. 펩신으로 랫트의 IgG를 분해하는 경우, 0.1M 아세테이트 완충액 pH 4.5에서의 투석 및 이후 1%(w/w)의 펩신과 함께 4시간 동안의 항온처리를 포함한 조건이 필요하며, 16시간동안 4℃에서 0.1M 포르메이트, pH 2.8에 대한 첫번째 투석후에 아세테이트 완충액으로 투석하게 되면, IgG1 및 IgG2a 분해가 향상된다. IgG2b 는, 37℃에서 4시간 동안 pH7.8의 0.1M 인산나트륨 완충액에서 스타필로코커스 V8 프로테아제 (3% w/w)에서 항온처리함으로써 보다 일관된 결과를 가져온다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은, 항체 힌지 부위로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇몇 잔기가 추가됨으로써, F변 단편과 상이하다. F(ab')2 항체 단편은, 사이에 힌지 시스테인을 가지고 있는 1쌍의 Fab' 단편으로서 원래 생성된 것이다. 또한, 항체 단편의 기타의 화학적 커플링에 대해서는 이미 알려져 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 공유결합으로 단단하게 연결된 이량체로 이루어져 있다. 이러한 배열에서, 각 변이 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여, VH-VL 이량체의 표면상에서 항원-결합 부위를 정의한다. 모두 총괄하여, 6개의 초가변 영역이 항체에 대한 항원-결합 특이성을 가지게 한다. 하지만, 전체 결합 부위보다 낮은 친화성에서도, 하나의 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)만으로도 항원을 인식하여 결합할 수 있다.
"일본쇄 Fv" (또는 "sFv") 항체 단편(현재 "일본쇄"로 알려짐)은, 단일 폴리펩타이드 쇄에 존재하는 VH 및 VL 항체 도메인을 포함한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는, sFv가 항원 결합에 필요한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다.
하기 특허들은, 항체의 scFv, Fv, Fab', Fab, F(ab')2 단편을 포함한 항체의 작용성, 항원-결합 부위의 제조 및 용도에 관한 본원의 교시를 보충하기 위해 본원에 참조문헌으로 인용되어 있다: 미국 특허 제5,855,866호, 제5,877,289호, 제5,965,132호, 제6,093,399호, 제6,261,535호 및 제6,004,555호. WO98/45331호에서는, 항체의 가변 영역, 초가변 영역 및 상보성 결정 (CDR) 영역의 제조에 대해서 추가 기술 및 교시하기 위한 목적을 위해 본원에 참조문헌으로 인용되어 있다.
"디아보디 (diabody)"는 2개의 항원-결합 부위를 가지는 작은 항체 단편으로서, 동일한 폴리펩타이드 쇄(VH-VL)의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 너무 짧아서 상기한 동일한 쇄의 2개의 도메인이 쌍을 이루게 할 수 없는 링커를 사용하여, 상기 도메인이 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 이루게 하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 한다. 디아보디는 EP 제404,097호 및 WO93/11161 (각각 본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다. 이-특이적 또는 일-특이적일 수 있는 "선형 항체"는, 1쌍의 항원 결합 부위를 형성하는 1쌍의 무작위 Fd 분절 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다 {참조: Zapata 등, (1995) - 본원에 참조문헌으로 인용됨}.
Fab' 또는 항체의 항원-결합 단편을 사용하는 경우, 이 단편을 변형시켜 반감기를 증가시키면 추가의 잇점이 있다. 상기 항체 분자 자체의 조작 또는 변형 및 불활성 담체에 접합시키는 것과 같은 다양한 기법들이 사용될 수 있다. 제제를 표적에 전달시키는 목적 보다는 반감기를 증가시키는 목적만을 위해서는 Fab' 및 기타의 단편들이 조직을 통과하도록 선택하기 위해 어떠한 접합 방법도 조심스럽게 수행되어져야 한다. 그럼에도 불구하고, PEG 등과 같은 비-단백질 중합체에 접합시키는 것도 고려할 수 있다.
따라서, 접합이 아닌 변형 공정은, 체내에서의 이화작용률을 보다 안정되고/되거나 감소시키기 위해 항체 단편의 구조를 변형시키는 것을 기초로 한다. 이러한 변형을 위한 한가지의 메카니즘은, L-아미노산 대신에 D-아미노산을 사용하는 것이다. 상기한 변형 공정의 도입은 수득한 분자를 과감하게 시험하여 목적하는 생물학적 특성을 여전히 보유하고 있는 지를 확인하는 과정이 후속되어야 한다는 것을 당업자들은 잘 알고 있을 것이다. 또한, 안정화 변형 공정에서는, 생물 분자의 반감기를 연장시키기 위해 일반적으로 사용되는 N 말단 및/또는 C 말단 둘 다에 안정화 잔기를 추가하는 것이 포함된다. 예를 들면, 아실화 또는 아민화에 의해 말단부를 변형시킬 수도 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 온건한 유형의 접합 변형 공정은, 회수 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프를 상기 항체 단편에 혼입시키는 것을 포함한다. 이를 달성하기 위한 기법에서는, 상기 항체 단편에 부착된 펩타이드 태그로서 상기 에피토프를 혼입하거나, 상기 항체 단편의 적합한 영역을 돌연변이시키는 것을 포함한다. 국제공개공보 제WO96/32478호는 이러한 기법을 추가로 예시할 목적으로 본원에 참고문헌으로 상세히 인용된다. 통상적으로, 회수 수용체 결합 에피토프는, 상기 항체 단편상의 유사 위치에 이동된 Fc 도메인의 하나 또는 2개의 롭 (lop)으로부터의 3 이상의 아미노산으로된 영역이다. 국제공개공보 제WO98/45331호의 회수 수용체 결합 에피토프는 본 발명에 사용할 수 있는 것으로서 본원에 참고로 인용된다.
F. 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 결합하는 면역접합체
본 발명자들은 종양 혈관구조를 표적화하는데 사용하기 위한 아미노인지질에 결합하는 광범위한 면역접합체를 일찌기 개발하였다(미국 특허 제6,312,694호, 본원에서 참조로 상세히 인용됨). 당해 제제는 안넥신 및 키니노겐과 같은 아미노인지질-결합 단백질, 및 PS 및 PE와 같은 아미노인지질에 대한 항체를 사용함으로써 종양 및 종양내 혈관구조에 대해 부착된 치료제를 전달시킨다. 본 발명은 이제 3G4(ATCC 4545) 및 9D2와 같은 개선된 특성을 지닌 선택된 항-PS 항체를 제공하며, 본 발명에 이르러 이들 및 경쟁하는 항체를 사용하여 면역접합체의 항체 부분으로써 사용할 수 있다.
아미노인지질에 결합하는 혈관 표적화제의 사용외에(미국 특허 제6,312,694호), 음이온성 인지질, 및 아미노인지질이 종양 혈관구조내에서 안정하고 표적가능한 실체라는 본 발견은 새로운 범위의 종양 혈관 표적화제의 사용을 제공한다. 아미노인지질에 대해 지시하는 초기 연구에서 제시되지는 않았지만, 신규 화합물은 음이온성 인지질에 대해 지시된 항체를 사용하여 독소, 사이토킨, 응고제 및 종양 및 종양내 혈관구조에 상향조절된 음이온성 인지질에 대한 다른 치료제를 전달한다. 노출된 항체와 관련하여 상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 이러한 측면의 개발은 상이한 인지질, 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 대한 필수적인 특수성을 지닌 생물학적 기구, 특히 항체의 생성을 필요로 한다.
본 발명은 PS, PE, PI, PA 및 PG, 및 더욱 특히 PS 및 PE와 같은 음이온성 인지질 및 아미노인지질이 항-바이러스 치료요법에 대한 안전하고 효과적인 표적임을 나타내므로, 본 발명에 이르러 이러한 성분, 특히 PS 및 PE에 결합하는 항체 및 펩타이드를 광범위하게 공지된 항-바이러스제에 연결시킬 수 있다. 이러한 항-바이러스 접합체는 항-바이러스 면역접합체 또는 "면역비로사이드(immunovirocides)"로 명명될 수 있는 항체계 접합체 및 펩타이드계 접합체 둘다를 포함한다.
본 발명의 이러한 측면에서, 음이온성 인지질에 대한 어떠한 항체도 사용하여 면역접합체, 면역독소 또는 응고리간드를 제조할 수 있으며, 여기서, 제2 세대 항체, 특히 9D2 유사 및 3G4 유사 항체와 같은 항체, 이들의 유리한 음이온성 인지질 결합 프로파일이 바람직하다. 이러한 면역접합체에서 사용하기 위한 제제는 바람직하게는 항-세포성 또는 세포독성제, 응고제(응고 인자), 사이토킨, 방사치료요법제, 항-혈관형성제, 세포사멸-유도제, 항-튜불린 약물 및 항-바이러스제(및 본원에 상세히 기술된 것으로서 듀라마이신 유도체와 같은 PE-결합 펩타이드)를 포함한다. 항-바이러스 면역접합체에 있어서, 비록 특정하게 사용될 수 있다고 하더라도, 본원에 기술된 제2 세대 항체를 사용하는 것이 요구되지는 않는다. 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대한 어떠한 항체도 항-바이러스제에 연결시켜 본 발명에 따른 항 바이러스 면역접합체 또는 면역비로사이드를 형성시킬 수 있다.
F1. 항-세포 및 세포독성제
소정의 용도의 경우, 치료제는 세포, 특히 종양 내피 세포 또는 종양 세포의 성장 또는 분열을 억제 또는 사멸하는 능력을 가진 세포 독성 또는 약리학적 제제, 특히 세포 독성, 세포 정지(cytostatic) 또는 항-세포 제제이다. 일반적으로, 본 발명의 이러한 양태에서는, 음이온성 인지질에 대한 항체, 바람직하게는 9D2계 또는 3G4계 항체에 접합될 수 있고 활성 형태로 표적 내피세포에 전달될 수 있는, 모든 약리학적 제제의 사용을 고려한다.
항-세포제의 예로는, 세포 독소 뿐만 아니라 화학 치료제가 포함된다. 사용될 수 있는 화학 치료제에는, 호르몬 (예를 들면, 스테로이드); 항-대사제 (예를 들면, 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트 또는 아미노프테린); 안트라사이클린; 미토마이신 C; 빈카 알카로이드; 데메콜키친; 에토포시드; 미트라마이신; 항-종양 알킬화제 (예를 들면, 클로르암부실 또는 멜팔란)가 포함된다. 다른 양태에서는, 사이토킨과 같은 제제가 포함될 수 있다. 기본적으로, 내피 세포와 같은 표적 내피 세포 부위의 혈액 성분을 표적화, 내재화, 방출 및/또는 표시할 수 있는 방식으로 항체와 성공적으로 접합 또는 연합될 수 있는 한, 모든 항-세포제가 사용될 수 있다.
항종양 약물, 사이토킨, 항-대사제, 알킬화제, 호르몬 등과 같은 화학치료제를 표적화하고자 하는 경우, 일관되게 독성 화합물이 효율적으로 작용하는 경로를 통해 표적 항원이 내재화되지 않는 상황이 있을 수 있다. 독소루비신, 다우노마이신, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 네오카르지노스타틴, 매크로마이신, 트레니몬 및 알파-아마니틴과 같은 다양한 종류의 화학치료제 및 기타 약리학적 제제가 항체에 성공적으로 접합되어 약리학적으로 작용하는 것으로 밝혀졌다.
*다른 경우에서는, DNA 합성 억제제 (예를 들면, 다우노루비신, 독소루비신, 아드리아마이신 등)의 사용으로 인한, 세포독소계 치료요법이 나타낼 수 있는 부작용을 제거할 수 있다. 따라서, 상기 제제들은 본 발명의 특정 측면에서 사용하기에 바람직한 항-세포 제제의 예이다. 세포정지제(cytostatic agent)의 측면에서, 이러한 화합물은 표적 세포의 천연 세포 주기를 일반적으로 방해하여, 바람직하게는 세포 주기에서 벗어나도록 한다.
많은 세포독성 제제들이, 음이온선 인지질에 대한 항체, 바람직하게는 9D2계 또는 3G4계 항체에 접합될 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 예는, 다양한 A 쇄 독소(특히, 리신 A 쇄); 리보좀-불활성화 단백질(예를 들면, 사포린 또는 겔로닌); 알파-사르신; 아스페르길린; 리스트릭토신; (예를 들면, 태반 리보뉴클레아제); 디프테리아 독소; 및 슈도모나스 외부 독소를 포함하는 수많은 유용한 식물-, 곰팡이- 또는 세균-기원 독소가 포함된다.
독소중에서, 겔로닌 및 리신 A 쇄의 사용이 바람직하다. 혈관화된 종양의 종양내 혈관에 결합하고, 흡착되거나 국재화하기위해 접근가능하게 발현된 마커에 결합하는 면역접합체의 효과기 또는 독소 부분으로서 겔로닌의 사용은 본원에 참조로 상세히 인용된 미국 특허 제6,051,230호에 기술되어 있으며, 미국 특허 제6,451,312호는 표적화제로서 VEGF에 연결된 겔로닌에 관한 것이다.
리신 A 쇄로서, 추가의 바람직한 독소 잔기는 , 탄수화물 잔기가 변형 처리되거나 제거되도록 처리된 독소 A 쇄인, 소위 "탈당화된 A 쇄(dgA)"이다. 탈당화된 리신 A 쇄가 바람직한데, 그 이유는 강력하고 반감기가 길며 임상 규모 및 임상 수준으로 제조하기에 경제성이 있기 때문이다.
약리학적 관점에서 볼때, 적합한 생물학적 반응을 제공하면서 가장 작은 분자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 적합한 항-세포 반응을 제공하는 크기가 보다 작은 A 쇄 펩타이드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우, 나가라제(Nagarase)(제조원: Sigma)를 사용하여 30개의 N 말단 아미노산을 제거하여, 적합한 독성 활성을 그대로 유지하는 "절단된 (truncated)" 리신 A 쇄를 만들 수 있다는 것이 알려져 있다. 필요한 경우, 이러한 절단된 A 쇄를 이용하여 본 발명에 따른 접합체에 사용할 수 있다는 것이 제안되어 있다.
이와 달리, 독소 A 쇄 잔기에 재조합 DNA 기술의 적용하는 것은 본 발명에 따른 추가의 잇점을 제공할 것임을 발견할 수 있다. 현재, 생물학적 활성의 리신 A 쇄를 클로닝 및 발현시킬 수 있기 때문에, 적합한 독소 활성을 발휘하는 보다 작은 펩타이드 또는 변이체 펩타이드를 확인 및 제조할 수 있다. 또한, 현재 리신 A 쇄가 클로닝되어 있으므로, 부위-지시된 돌연변이 유발 방법을 사용하여, A 쇄-기원한 펩타이드를 용이하게 제조 및 스크리닝할 수 있으며, 본 발명과 관련한 용도로 사용하기에 유용한 추가의 잔기를 수득할 수 있다.
F2. 사이토킨
사이토킨 및 케모킨은 본 발명의 항체에 결합하기 위한 제제의 특수 예이다. IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-13, TGF-β, M-CSF, G-CSF, TNFβ, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, IFN-α 및 IFN-β를 포함하는 광범위한 사이토킨이 사용될 수 있다. 더욱 바람직한 사이토킨은 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFNγ, 단핵구 화학친화성 단백질-1(MCP-1), 혈소판 기원 성장 인자-BB(PDGF-BB) 및 C-반응성 단백질(CRP) 등을 포함한다. 특히 바람직한 예는 TNFα, TNFα 유도인자 및 IL-12이다.
TNFα는 혈관 침투성을 증가시킨다. 이러한 제제는 특히 수득되는 면역접합체가 암 치료용 배합 치료요법에 사용되는 경우, 본 발명의 항체에 부착하는 것으로 고려된다. 항체는 종양 환경으로 부착된 TNFα를 전달할 것이며, 종양내 증진된 혈관 침투성 유발은 종양내로 제2의 항암제의 침투를 촉진시킴으로써 전체적인 항-종양 효과를 증폭시킬 수 있다. scFv 작제물은 이러한 양태에 사용하기 위해 고려된다. 이는 특히 TNFα가 삼량체로 작용하며 svFv 작제물이 용이하게 삼량체화할 수 있기 때문이다.
예를 들어, IL-12는 항체에 부착하여 종양 혈관을 공격하는 숙주 방어를 재지시하는데 사용될 수 있다. IL-12를 사용하는 경우, 항원 결합 영역의 scFv 형이 바람직할 수 있다. 케모킨 LEC(또한 NCC-4, HCC-4 또는 LMC로 공지된 간-발현된 케모킨)이 다른 바람직한 성분이다(참조: Giovarelli et al., 2000). LEC는 수지상 세포, 단핵구, T 세포, NK 세포 및 호중구에 대한 화학주성이므로 숙주 중재한 항-종양 반응을 증진시킬 수 있다.
F3. 응고 인자
은이온성 인지질에 대한 항체, 또는 본 발명의 바람직한 9D2 및 3G4(ATCC 4545) 항체를 기준으로한 제2 세대 항체는 응고를 직접 또는 간접적으로 자극할 수 있는 성분에 연결시켜, 응고리간드를 형성할 수 있다. 미국 특허 제6,093,399호, 제6,004,555호, 제5,877,289호 및 제6,036,955호는 응고제와 항체의 작동적 연합에 의해 응고리간드를 형성하는 것을 기술하기 위한 목적으로 본원에 참조로 상세히 인용된다.
본 발명의 항체는 응고제 또는 응고 인자에 직접 연결될 수 있고, 응고제 또는 응고 인자에 결합하여 이를 방출하는 제2 결합 부위에 연결될 수도 있다. 본원에서의 용어 "응고제 (coagulant)" 및 "응고 인자 (coagulation factor)"는 각각, 바람직하게는 종양 혈관체와 같은 특정의 생체내 환경에 제공된 경우, 적합한 조건하에서 직접적 또는 간접적으로 응고를 자극할 수 있는 성분을 언급하는데 사용된다.
바람직한 응고 인자로는, 절단된 TF (tTF), 이량체 TF 분자, 다량체 TF 분자 및 돌연변이 TF 분자와 같은 조직 인자(Tissue Factor) 조성물이다. "절단된 TF (tTF)"는, 특성 변화를 일으키기에 충분한 아미노산 서열을 제거함으로써 세포막-결합을 할 수 없는 TF 작제물이다. 이 경우에 "충분한 양"은, 세포막에 TF 분자가 들어오거나 TF 단백질의 기능성 막 결합을 중개할 수 있을 정도의 충분한 전이막 통과-아미노산 서열의 양을 의미한다. 따라서, "충분한 양의 전이막 통과-서열 (transmembrane spanning sequence)"의 제거로 인해, 인지질 막-결합 능력이 없어서 인지질 막에 유의성있게 결합하지 않는 실질적인 가용성 단백질인, 절단된 조직 인자 단백질 또는 폴리펩타이드가 생성된다. 따라서, 절단된 TF는, 표준 TF 검정에서 실질적으로 인자 VII를 인자 VIIa로 변환시킬 수 없으나, 인자 VIIa의 존재하에 인자 X를 활성화시키는 것을 포함한 소위 촉매 활성은 그대로 유지한다.
미국 특허 제5,504,067호, 제6,156,321호, 제6,132,729호 및 제6,132,730호는 이러한 절단된 조직 인자 단백질을 추가로 기술할 목적으로 본원에 참고문헌으로 인용된다. 바람직하게는, 본 발명의 이러한 양태에서의 조직 인자에는, 일반적으로 단백질 전이막 영역 및 세포질 영역 (아미노산 220 내지 263)이 없다. 하지만, 상기한 절단된 TF 분자가, 정확한 219개 길이의 아미노산 분자에 한정될 필요는 없다.
또한, 이량체로서의 조직 인자 조성물이 유용할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위해, 절단된, 돌연변이된 또는 기타의 조직 인자 작제물을 이량체 형태로 제조할 수 있다. 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 이러한 TF 이량체는, 2개의 암호화 부위를 프레임-내 (in-frame)에서 제조하여 발현 벡터로 부터 발현하는, 분자 생물 및 재조합 발현에 관한 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이와 동일하게, TF 이량체 제조와 관련하여, 다양한 화학적인 접합 기법들이 사용될 수 있다. 접합시키기 이전에, 개개의 TF 단량체를 유도체화할 수 있다. 이러한 모든 기법들은 당업자들에게는 잘 알려져 있을 것이다.
필요한 경우, 생물학적으로 방출가능한 결합 (예를 들면, 선택적으로 절단가능한 링커 또는 아미노산 서열)을 통해, 조직 인자 이량체 또는 다량체를 결합할 수 있다. 예를 들면, 종양 환경내에서 선별적으로 위치하거나 활성화되는 효소에 대한 절단 부위를 포함하는 펩타이드 링커를 고려할 수 있다. 이러한 펩타이드 링커의 예로는, 유로키나제, 플라스민, 트롬빈, 인자 IXa, 인자 Xa 또는 메탈로프로테이나제(예를 들면, 콜라게나제, 젤라티나제 또는 스트로멜리신)에 의해 절단된 펩타이드 링커가 있다.
특정 양태에서, 조직 인자 이량체는, 추후에 소정의 조건하에서만 인지질 막을 조직 인자와 기능적으로 연합시키도록, 방해된 (hindered) 소수성 막 삽입 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 절단된 조직 인자와 관련하여 기술한 바와 같이, 일반적으로 소수성 막-연합 서열은, 소수성에 의해 인지질 환경과의 연합을 촉진하는 일련의 아미노산이다. 이와 동일하게, 강력한 막 삽입 잔기를 제공하기 위해 지방산을 사용할 수 있다.
이러한 막 삽입 서열은, TF 분자의 N 또는 C 말단부에 위치하거나, TF 작제물의 기능적 특성을 방해하지 않는 한 다른 위치에 부착될 수 있다. 상기한 방해된 삽입 잔기를 사용하는 목적은, TF 작제물이 종양 환경내에 국재화하여 소수성 부착물이 접근가능하고 막과의 물리적 결합을 촉진할 때까지는 상기 삽입 잔기가 기능을 나타내지 않기 때문이다. 또한, 이 경우에, 생물학적으로 방출가능한 결합 및 선택적으로 절단가능한 서열이 특히 유용한 것으로 고려되며, 이때, 상기 결합 또는 서열은, 종양 환경내에 국재화하거나 특정 효소 또는 기타의 생활성 분자에 노출되었을 때에만, 절단되거나 변형된다.
다른 양태의 경우, tTF 작제물은 다량체 또는 중합체일 수 있다. 이 경우, "중합체 작제물"은 3 이상의 조직 인자 작제물을 함유한다. "다량체 또는 중합체 TF 작제물"은, 제1 TF 분자 또는 유도체가 적어도 제2 및 제3 TF 분자 또는 유도체에 작동가능하게 부착되어 있는 작제물이다. 다량체는, 약 3 내지 약 20개의 이러한 TF 분자를 포함할 수 있다. 또한, 다량체 또는 중합체내의 개개의 TF 단위는, 바람직한 선택적으로 분해가능한 펩타이드 링커 또는 기타의 생물학적으로 방출가능한 결합에 의해 연결될 수도 있다. 또한, 상기한 TF 이량체에서와 같이, 상기 작제물은 재조합 조작 및 발현이나 표준 합성 화학을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명에서 유용한 또 다른 TF 작제물은, 인자 VII을 활성화시키는 능력을 결실한 돌연변이체이다. 이러한 "인자 VII 활성-돌연변이"는, 기능성 인자 VII/VIIa에 결합하고 단백질 분해적으로 인자 X를 활성화시키지만 인자 VII를 단백질 분해적으로 활성화시키는 능력이 실질적으로 없는, TF 돌연변이체로 정의된다. 따라서, 이러한 작제물은 인자 VII 활성화 활성이 없는 TF 돌연변이체이다.
종양-특이적 응고를 촉진하는데 있어서 이러한 인자 VII 활성화-돌연변이의 능력은, 종양 혈관 구조로의 이들의 특이 전달 및 혈장에서의 낮은 농도의 인자 VIIa의 존재에 기초한 것이다. 상기한 인자 VII 활성화-돌연변이 접합체를 투여하면, 이러한 돌연변이체는 혈관화된 종양의 혈관구조내에 국재화할 것이다. 국재화되기 전에는, 인자 VII를 인자 VIIa로 변환시킬 수 없기 때문에, 일반적으로 TF 돌연변이체는 다른 체내 부위에서는 응고를 촉진시킬 수 없다. 하지만, 종양 부위내에 국재화 및 축적되면, TF 돌연변이체는 혈장으로부터 충분한 양의 인자 VIIa와 접하게 되어, 외인성 응고 경로 (extrinsic coagulation pathway)가 시작되게 함으로써 종양-특이적 혈전증을 초래한다. 외인성 인자 VIIa는 또한 환자에게 투여할 수 있다.
본 발명과 관련하여, 다양한 인자 VII 활성화-돌연변이체 중 하나 이상을 제조 및 사용할 수 있다. 인자 VII/VIIa에 대한 TF 분자 상의 인식 부위와 관련한 상당한 양의 과학적 지식들이 알려져 있다. 따라서, TF 분자의 아미노산 약 157 내지 약 167 사이에 인자 VII 활성화 영역이 일반적으로 위치한다고 이해되고 있다. 하지만, 이 부위 밖의 잔기들도 인자 VII 활성화 활성과 관련성이 있는 것으로 밝혀질 수 있으므로, TF 서열의 아미노산 약 106번 내지 약 209번 사이에 일반적으로 위치한 하나 이상의 잔기에 돌연변이를 도입하는 것을 고려할 수도 있다 {참조: 제WO94/07515호 및 제WO94/28017호; 각각 본원에서 참조로 인용됨}.
미국 특허 제6,093,399호, 제6,004,555호, 제5,877,289호 및 제6,036,955호에 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명과 관련하여, 하기에 예시된 기타의 다양한 응고 인자들이 사용될 수 있다. 트롬빈, 인자 V/Va 및 이의 유도체, 인자 VIII/VIIIa 및 이의 유도체, 인자 IX/IXa 및 이의 유도체, 인자 X/Xa 및 이의 유도체, 인자 XI/XIa 및 이의 유도체, 인자 XII/XIIa 및 이의 유도체, 인자 XIII/XIIIa 및 이의 유도체, 인자 X 활성화 인자 및 인자 V 활성화제가 본 발명에 사용될 수 있다.
러셀(Russell)의 살모사 독액(viper venom)에 존재하는 인자 X 활성화제를 본 발명에서 사용할 수 있다. 러셀의 살모사 독액에 존재하는 인자 X 활성화제에 특이적인 모노클로날 항체를 제조하여 이특이적 결합 리간드의 일부분으로서 상기 제제를 특이적으로 전달하는 데에 사용할 수 있다.
트롬복산 A2는, 혈소판 마이크로좀 (microsome)내에서 사이클로옥시게나제 및 트롬복산 합성효소를 순차적으로 반응시켜 엔도퍼옥시드(endoperoxide)로부터 형성된다. 트롬복산 A2는 혈소판에 의해 용이하게 생성되며, 혈소판을 응고시킬 수 있는 능력을 가지는 강력한 혈관 수축제이다. 트롬복산 A2 및 이의 활성 유사체를 본 발명에서의 사용을 위해 고려할 수 있다.
트롬복산 합성효소, 및 혈소판-활성화 프로스타글란딘을 합성하는 기타의 효소들도 본 발명에서 "응고제"로서 사용할 수 있다. 사람의 트롬복산 합성효소에 대한 cDNA가 알려져 있는 바와 마찬가지로, 트롬복산 합성효소에 대한 모노클로날 항체 및 트롬복산 합성효소의 면역친화성 정제에 대해서도 알려져 있다.
α2-항플라스민 또는 α2-플라스민 억제제는, 플라스미노겐 활성화제에 의해 유도되는 피브린 응괴 분해를 효과적으로 억제하는 사람 혈장내에 천연적으로 존재하는 프로데인아제 억제제이다. α2-항플라스민은 특히 강력한 억제제이며, 본 발명에서 사용하기 위해 고려된다.
α2-항플라스민의 cDNA 서열이 알려져 있기 때문에, 재조합 발현 및/또는 융합 단백질이 바람직하다. α2-항플라스민에 대한 모노클로날 항체가 알려져 있기 때문에, 본 발명의 이특이적 결합 리간드 양태에서 사용될 수 있다. 이러한 항체는, 표적 부위에 외인성 α2-항플라스민을 전달하거나 외인성 α2-항플라스민을 축적하는 데에 사용할 수 있고, 표적 영역 내에 α2-항플라스민을 농축시키기 위해 사용될 수 있다.
F4. 항- 튜불린 약물
소정의 약물들은 튜불린의 활성을 방해함으로써 효과를 나타낸다. 유사분열 및 세포 생존에 있어서 튜불린의 기능이 필수적이기 때문에, 소정의 "항-튜불린 약물"은 강력한 화학치료제이다. 본 발명에서 사용하기에 잘 알려져 있고 현재 바람직한 항-튜불린 약물로는, 콜키친, 탁산 (예를 들면, 탁솔), 빈카 알카로이드 (예를 들면, 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 빈데신) 및 콤브레타스타틴이 있다. 기타의 적합한 항-튜불린 약물로는, 사이토칼라신 (B, J, E를 포함), 돌라스타틴, 아우리스타틴 PE, 파클리탁셀, 우스틸록신 D, 리조신, 1069C85, 콜세미드, 알벤다졸, 아자톡신 및 노코다졸이 있다.
미국 특허 제5,892,069호, 제5,504,074호 및 제5,661,143호 (각각 본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있는 바와 같이, 콤브레타스타틴은 일반적으로 세포의 유사분열을 억제하는 에스트라디올 유도체이다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 콤브레타스타틴의 예로는, 콤브레타스타틴 A, B 및/또는 D에 기초한 것과 미국 특허 제5,892,069호, 제5,504,074호 및 제5,661,143호에 기재된 것이 있다. 이의 예로는, 콤브레타스타틴 A-1, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, B-1, B-2, B-3 및 B-4가 있다.
미국 특허 제5,569,786호 및 제5,409,953호에서는, 콤브레타스타틴 A-1, A-2, A-3, B-1, B-2, B-3 및 B-4 각각의 분리, 구조 특성화 및 합성; 제형; 및 상기 콤브레타스타틴을 이용하여 신생물 성장을 치료하는 방법을 기재하고 있다. 상기한 콤브레타스타틴 중 하나 이상을 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다.
미국 특허 제5,892,069호, 제5,504,074호, 제5,661,143호 및 제4,996,237호 (각각 본원에 참조문헌으로 상세히 인용됨)에 기재되어 있는 콤브레타스타틴 A-4를 사용할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,561,122호는 본 발명과 함께 사용하기 위해 고려되는 적합한 콤브레타스타틴 A-4 전구약물을 기재하기 위해 본원에 참조로 인용된다.
미국 특허 제4,940,726호 (본원에 참조문헌으로 상세히 인용됨)에서는, 거대환 락톤으로 명명된 콤브레타스타틴 D-1 및 콤브레타스타틴 D-2가 기재되어 있는 데, 이는 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용할 수 있다. 본원에 참조로 상세히 인용된 미국 특허 제5,430,062호는, 본 발명과 함께 사용될 수 있는 항암 활성을 가진 스틸벤 유도체 및 콤브레타스타틴 유사체에 관한 것이다.
F5. 항- 혈관형성제
항-혈관형성제는 본 발명의 항체 및 펩타이드에 대한 부착에 유용하다. 많은 항암제는 이들의 작용 메카니즘의 일부로서 항-혈관형성 효과를 지닌다. 표 E에 기술된 것들을 포함하는 배합 치료요법에 사용하기 위해 기술된 이러한 제제중 하나 이상을 또한 본원에 기술한 바와 같이, 본 발명의 항체에 접합할 수 있다. 특정의 다른 제제도 주요 작용 메카니즘으로서 항-혈관형성 효과를 갖도록 발견, 설계 또는 선택할 수 있다. 이러한 제제의 예는 하기에 기술되며, 이들중 어느 것을 사용하여 면역접합체를 제조하거나 본 발명내의 배합 치료요법에 별도로 사용할 수 있다.
다양한 질환 상태에서 나타나는 혈관형성을 치료하기에 유용한 수많은 타이로신 키나제 억제제가 알려져 있다. 이러한 예로는, 4-아미노피롤로[2,3-d]피리미딘 (미국 특허 제5,639,757호 - 본원에 참조문헌으로 상세히 인용됨)이 있으며, 본 발명과 함께 사용할 수 있다. VEGFR2 수용체를 통해 타이로신 키나제 신호 형질도입을 조절할 수 있는 유기 분자의 추가의 예는, 혈관형성 질환 치료시 본 발명과 함께 복합 사용하기 위한 추가의 배합물을 기재하기 위해 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된 미국 특허 제5,792,771호의 퀴나졸린 화합물 및 조성물이 있다.
또한, 기타의 화학적 부류의 화합물들이 혈관형성을 억제하는 것으로 밝혀졌으며, 본 발명과 함께 사용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 지혈성 4,9(11)-스테로이드 및 C21-산소화 스테로이드와 같은 스테로이드 {참조: 미국 특허 제5,972,922호 (본원에 참조문헌으로 상세히 인용됨)}가 배합 치료에 사용될 수 있다. 미국 특허 제5,712,291호 및 제5,593,990호 (본원에 참조문헌으로 상세히 인용됨)에서는, 탈리도미드 및 관련 화합물, 전구체, 유사체, 대사물 및 가수분해 생성물을 기재하고 있는 데, 이들은 본 발명과 함께 사용되어 혈관형성을 억제할 수 있다. 미국 특허 제5,712,291호 및 제5,593,990호에 기재된 화합물은 경구 투여할 수 있다. 배합 치료요법과 관련하여 유용하게 사용될 수 있는 또 다른 항-혈관형성제의 예는 하기의 표 B에 나열되어 있다. 하기 나열되어 있는 제제들은 예시에 불과하며 이에 한정되는 것은 아니다.
[표 B]
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혈관형성을 억제하는 데에 사용될 수 있는 소정의 바람직한 성분들로는, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 바스쿨로스타틴, 칸스타틴 및 마스핀이 있다. "안지오스타틴"으로 명명된 단백질은 각각 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,776,704호; 제5,639,725호 및 제5,733,876호에 기술되어 있다. 안지오스타틴은 환원하는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정한 것으로써 약 38kD 및 약 45kD의 분자량을 갖는 단백질이며 플라스미노겐 분자의 대략 1 내지 4개의 크링글 부위(kringle region)을 함유한다. 안지오스타틴은 일반적으로 완전한 쥐 플라스미노겐 분자의 98번 아미노산에서 시작하여 쥐 플라스미노겐의 단편의 것과 실질적으로 유사하다.
안지오스타틴의 아미노산 서열은 종에 따라 약간씩 상이하다. 예를 들면, 비록 사람의 활성 안지오스타틴의 서열이 사람의 완전항 사람 플라스미노겐 아미노산 서열의 아미노산 번호 97번 또는 99번에서 시작할 수 있다 해도, 사람의 안지오스타틴의 아미노산 서열은 상기한 쥐의 플라스미노겐 단편의 아미노산 서열과 실질적으로 유사하다. 또한, 쥐의 종양 모델에서 관찰된 바와 같이, 사람의 플라스미노겐은 항-혈관형성 활성을 가지기 때문에 사용될 수 있다.
특정의 항-혈관형성 치료요법은 종양 퇴행을 유발하는 것으로 이미 밝혀졌으며 안지오스타틴은 이러한 제제중 하나이다. 엔도스타틴, 즉 콜라겐 XVIII의 20kDa COOH-말단 단편, 세균 다당류 CM101, 및 항체 LM609는 또한 혈관정지 활성을 지닌다. 그러나, 이들의 다른 특성의 측면에서, 이들은 혈관형성을 억제할 뿐 아니라 대부분의 정의되지 않은 메카니즘을 통해 종양 혈관의 파괴를 개시하므로, 항-혈관 치료요법 또는 종양 혈관 독소로서 언급된다.
안지오스타틴 및 엔도스타틴은 마우스에 있어서 종양 성장을 억제할 뿐만 아니라 종양 퇴행을 유도하기 때문에 집중 연구 대상이 되어 왔다. 엘라스타제, 대식세포 메탈로엘라스타제(MME), 매트릴라이신 (MMP-7) 및 92kDa 젤라티나제 B/제IV형 콜라게나제 (MMP-9)를 포함한, 플라스미노겐에서 안지오스타틴을 생산하는 것으로 관찰된 많은 프로테아제들이 있다.
MME는 종양에서 플라스미노겐으로부터 안지오스타틴을 생산할 수 있으며, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GMCSF)는 안지오스타틴의 생성을 유도하는 마크로파지에 의해 MME의 발현을 상향조절한다. 안지오스타틴의 생성에 있어서 MME가 수행하는 역할에 대해서는, 환자에게서 수집한 간세포 암종의 임상 샘플에서 실제로 MME가 발현되는 것을 밝힌 사실에 의해 지지된다. 안지오스타틴을 생산할 수 있다고 생각되는 기타의 다른 프로테아제는 스트로멜라이신-1 (MMP-3)이다. MMP-3는 플라스미노겐으로부터 안지오스타틴-유사 단편을 실험실내에서 생산하는 것으로 관찰되었다. 안지오스타틴에 대한 작용 메카니즘에 대해서는 아직 분명하지는 않지만, 안지오스타틴이 내피세포상의 미확인 세포 표면 수용체에 결합하여 내피세포가 프로그램된 세포사멸 또는 유사분열 억제가 되도록 유도하는 것으로 가정하고 있다.
엔도스타틴은, 비록 이의 생물학은 명확치 않다고 해도, 항-혈관형성 및 항-종양 제제로서 보다 더 강력한 것으로 보인다. 엔도스타틴은 마우스에 있어서 수많은 종양 모델에서 종양 퇴행을 유발하는 데에 효과적이다. 종양은 엔도스타틴에 대한 내성을 가지지 않으며, 수주기에 걸친 치료후에 종양은 잠복기에 들어가서 종양 체적이 증가하지 않는다. 이러한 잠복기 상태에서는, 세포사멸을 겪는 종양 세포의 비율이 증가하여 종양 크기가 기본적으로 유지되는 종양군이 되었다.
미국 특허 제5,854,205호 (특허권자: Folkman 및 O'Reilly - 본원에 참조문헌으로 상세히 인용됨)는, 엔도스타틴 및 내피세포 증식과 혈관형성의 억제제로서의 이의 용도에 관한 것이다. 엔도스타틴 단백질은 제XVIII형 콜라겐의 C 말단 단편에 상응하며, 다양한 공급원으로부터 분리될 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,854,205호에서는, 엔도스타틴이 제XVIII형 콜라겐, 제XV형 콜라젠 또는 BOVMPE 1 예비-위액 에스테라제 (pregastric esterase)의 단편의 아미노산 서열을 가질 수 있음을 교시하고 있다. 미국 특허 제5,854,205호에서는, 엔도스타틴 및 기타의 다른 항-혈관형성 단백질 (특히, 안지오스타틴)의 배합물이 혈관형성-의존 종양의 덩이를 효과적으로 퇴행시킬 수 있음을 개시하고 있다.
CM101은, 종양에서 신생혈관 염증을 유도하는 능력이 있는 것으로 잘 알려져 있는 세균 다당류이다. CM101은, 보체 시스템의 활성화를 자극하는 퇴행된 (dedifferentiated) 내피 상에 퇴화(dedifferentiate)된 수용체와 결합하여 가교 결합한다. 또한, CM101은 종양을 선택적으로 표적화하는 사이토킨-유발 염증 반응을 개시한다. CM101은 VEGF 및 이의 수용체의 발현을 하향 조절하는 특유한 항-병리학적 혈관형성 제제이다. CM101은 항암 약물로서 현재 임상 시험에 있으며, 본 발명과 함께 배합 사용될 수 있다.
트롬보스폰딘 (TSP-1) 및 혈소판 인자 4 (PF4)가 본 발명에서 또한 사용될 수 있다. 이들은, 헤파린과 관련된 혈관형성 억제제이며, 혈소판 α-과립에서 발견된다. TSP-1은 세포외 매트릭스의 구성성분인 450kDa의 다중 도메인의 큰 당단백질이다. TSP-1은, HSPG, 피브로넥틴, 라미닌 및 상이한 유형의 콜라겐을 포함한, 세포외 매트릭스에서 발견되는 많은 프로테오글리칸 분자에 결합한다. TSP-1은, 실험실내에서 내피세포의 이동 및 증식을 억제하고, 생체내에서 혈관형성을 억제한다. 또한, TSP-1은 형질전환된 내피세포의 악성 표현형 및 종양 형성을 억제한다. 종양 억제 유전자 p53은, TSP-1의 발현을 직접 조절하는 것으로 밝혀졌는 데, p53 활성을 잃게 되면 TSP-1 생산이 급격히 감소하게 되고 이에 부수하여 종양 개시된 혈관형성이 증가한다.
PF4는, 실험실내에서 내피세포 증식을 강력하게 억제할 수 있고 생체내에서 혈관형성을 강력하게 억제할 수 있는 CXC ELR 케모카인 패밀리에 속하는 70aa 단백질이다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달되거나 종양내 투여된 PF4는 종양 성장을 억제할 수 있다.
인터페론 및 메탈로프로테이나제 억제제는, 본 발명에 따라 전달될 수 있는 자연발생적인 2가지의 혈관형성 억제제이다. 인터페론의 항-내피 활성에 대해서는 1980년대부터 알려져 있었지만, 억제 메카니즘에 대해서는 아직 불확실하다. 인터페론은 내피세포의 이동을 억제할 수 있으며, 종양 세포에 의한 혈관형성 프로모터 생산을 억제할 수 있는 능력에 의해 중개될 수 있는 소정의 생체내 항-혈관형성 활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 특히, 혈관 종양은 인터페론에 민감한 데, 예를 들면 증식하는 혈관종은 IFNα에 의해 성공적으로 치료될 수 있다.
메탈로프로테이나제의 조직 억제제 (TIMP)는, 혈관형성을 억제할 수 있고 본 발명의 치료 프로토콜에서 사용될 수 있는, 자연발생적인 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)의 억제제 패밀리이다. MMP는, 혈관 네트워크를 연장 또는 리모델링할 때에 내피세포 및 섬유아세포가 이동하는 매트릭스를 분해하기 때문에 혈관형성에서 핵심 역할을 수행한다. 사실상, MMP 중의 하나인 MMP-2는 이러한 목적을 위해 인테그린 αvβ3를 통해 활성화된 내피와 관련되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 상호 작용이 MMP-2 단편에 의해 방해되면, 혈관형성이 하향조절되어 종양 성장이 억제된다.
혈관형성을 억제하는 수많은 약리학적 제제가 있는 데, 이들 중 하나 이상은 본 발명의 일부로서 사용될 수 있다. 이러한 제제로는, AGM-1470/TNP-470, 탈리도미드 및 카복시아미도트리아졸 (CAI)이 포함된다. 푸마길린은, 1990년에 혈관형성의 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌으며, 그 이후로 푸마길린의 합성 유사체인 AGM-1470 및 TNP-470이 개발되었다. 이들 2가지 약물 모두는, 실험실내에서 내피세포 증식을 억제하고, 생체내에서 혈관형성을 억제한다. TNP-470은 사람 임상 실험에서 광범위하게 연구되어 왔는 데, 실험 데이터를 보면 장기간 투여가 최적인 것으로 나타났다.
탈리도미드는 원래 진정제로서 사용되었는데, 강력한 최기 물질 (teratogen)인 것으로 밝혀졌으며, 사용되지 않았다. 1994년에, 탈리도미드는 혈관형성 억제제인 것으로 밝혀졌다. 현재, 탈리도미드는 항암제 및 혈관생성 눈 혈관 질환 치료제로 임상 시험 중에 있다.
CAI는, 액틴의 재구성, 내피세포 이동 및 콜라겐 IV상에서의 확산을 방지하는 칼슘 채널 차단제로서 작동하는, 저분자량의 혈관형성의 합성 억제제이다. CAI는, 생리적으로 가능한 농도에서 신생혈관생성을 억제하며, 암 환자들이 경구 투여시 참을 수 있다. CAI를 이용한 임상 시험 결과, 치료전에 진행성 질환을 가진 암 환자의 49%에서 질환이 안정되었음을 보였다.
헤파린 또는 헤파린 단편 존재하의 코르티손은, 내피세포 증식을 차단함으로써 마우스에서 종양 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 상기 스테로이드 및 헤파린의 부가적인 억제 효과와 관련된 메카니즘은, 헤파린이 내피세포에 의한 상기 스테로이드의 흡수를 증가시킬 수 있는 것으로 생각되지만, 명확하지는 않다. 상기 혼합물은 새로이 형성된 모세혈관 아래의 기저막의 분해를 증가시키는 것으로 관찰되었으며, 이를 통해 부가적인 지혈 효과를 설명할 수 있을 것이다. 헤파린-코르티손 컨쥬게이트는 생체내에서 강력한 지혈 효과 및 항종양 효과 활성을 가진다.
특정의 혈관형성 억제제도 본 발명의 종양 표적화 방법을 사용하여 종양에 전달할 수 있다. 이들은 항-침윤 인자, 레티놀산 및 패클리탁셀 (미국 특허 제5,716,981호-본원에 참조문헌으로 인용됨); AGM-1470 (Ingber 등, 1990-본원에 참조문헌으로 인용됨); 상어의 연골 추출물 (미국 특허 제5,618,925호-본원에 참조문헌으로 인용됨); 음이온 폴리아미드 또는 폴리우레아 올리고머(미국 특허 제5,593,664호-본원에 참조문헌으로 인용됨); 옥신돌 유도체 (미국 특허 제5,576,330호-본원에 참조문헌으로 인용됨); 에스트라디올 유도체 (미국 특허 제5,504,074호-본원에 참조문헌으로 인용됨); 및 티아졸로피리미딘 유도체 (미국 특허 제5,599,813호-본원에 참조문헌으로 인용됨)가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 복합 사용을 위한 항-혈관형성 조성물로서 사용될 수 있다.
αvβ3 인테그린의 길항제를 포함하는 조성물은 본 발명의 일부로서 혈관형성을 억제하는 데에 사용될 수 있다. 미국 특허 제5,766,591호(본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재된 바와 같이, 사이클릭 폴리펩타이드를 포함한 RGD-함유 폴리펩타이드 및 이의 염은 αvβ3 인테그린 길항제의 적합한 예이다.
안지오포이에틴은 Tie2에 대한 리간드이므로, Tie2 수용체를 통한 신호화를 변형시킴에 따른 치료학적 방해의 다른 방법을 또한 이와 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, Tie2 활성화(참조: Lin et al., 1998a)를 차단할 수 있는 가용성 Tie2 수용체를 사용할 수 있다. 재조합 아데노바이러스 유전자 치료요법을 사용한 이러한 작제물의 전달은 암 치료 및 전이 감소에 효과적인 것으로 밝혀졌다(참조: Lin et al., 1998a).
VEGF 패밀리 구성원과 동일하게, 안지오포이에틴은 혈관 내피에 특이적인 성장 인자이다{참조: Davis 및 Yancopoulos, 1999; Holash 등, 1999 (각각 본원에 참조문헌으로 인용됨)}. 최초로 기재된 안지오포이에틴은, 천연 수용체 활성인자 또는 효능제인 안지오포이에틴-1 (Ang-1) 및 천연 수용체 길항인자인 안지오포이에틴-2 (Ang-2)로서, 이들 둘 다는 내피세포의 티로신 키나제 수용체인 Tie2를 통해 작용한다.
2가지의 새로운 안지오포이에틴인 안지오포이에틴-3 (마우스) 및 안지오포이에틴-4 (사람)이 또한 확인되었다 {참조: Valenzuela 등, 1999}. 안지오포이에틴-3은 길항인자 (Ang-2와 유사)로서 작용하는 것 같고, 안지오포이에틴-4는 효능제 (Ang-1과 유사)로서 작용하는 것 같다 {참조: Valenzuela 등, 1999}. 또한, 안지오포이에틴-3로 명명된 단백질은 사람의 심장에서 클로닝되었으며, 내피세포에 대해서는 유사분열 유도 효과는 나타내지 않는 것으로 보고되었다{참조: Kim 등, 1999}.
VEGF가 혈관 발생의 초기 단계에 필수적인 데에 반해, 안지오포이에틴-1은 일반적으로 혈관생성의 말기 단계에 필요하다. 따라서, VEGF는 내피세포 분화, 증식 및 원시적인 혈관형성을 촉진한다. 안지오포이에틴-1은 Tie2 수용체를 통해 적용하여 성숙한 혈관의 유지 및 안정화를 촉진한다. 따라서, 안지오포이에틴-1은 성숙화 인자 또는 안정화 인자로서, 내피세포 및 주위의 지지 세포 사이의 상호작용을 촉진하여 미성숙 혈관을 성숙 혈관으로 전환하는 것으로 생각된다 {참조: Holash 등, 1999}.
F6. 세포사멸 유도제
본 발명은 또한 종양 세포 및 종양 혈관 내피세포를 포함하는 종양내 어떠한 세포에서 세포사멸을 유도하는 제제를 전달하는데 사용할 수 있다. 많은 항암제는 이의 작용 메카니즘의 일부로서 세포사멸 유도 효과를 지닌다. 표 F에 기재된 것들을 포함하는 배합 치료요법에 사용하기 위해 기술된 이러한 제제중 하나 이상을 또한 본원에 기술된 바와 같이 본원의 항체에 접합시킬 수 있다. 특정의 다른 제제는 주요 메카니즘으로서 세포사멸 유도 효과를 지니는 것으로 발견, 설계 또는 선택되었다. 이러한 제제의 예는 하기에 기술되어 있으며, 이들중 어느것도 면역접합체를 제조하거나 본 발명의 배합 치료요법과는 별개로 사용할 수 있다.
많은 형태의 암에서는 종양 억제 유전자 (예를 들면, p53)에 돌연변이가 있는 것으로 보고되어 왔다. p53의 불활성화로 인해, 세포사멸을 촉진할 수 없게 된다. 이로 인해, 암 세포가 세포사멸로 예정되는 대신에 종양 생성이 진행된다. 따라서, 세포 사멸을 촉진하기 위해 종양 억제제(tumor suppressor)의 전달을 본 발명에서 사용하기 위해 고려된다. 이러한 종양 억제인자의 예로는, p53, 망막아세포종 유전자 (Rb), 윌름스 종양(Wilm's tumor; (WT1), Bax 알파, 인터루킨-1b-전환 효소 및 패밀리, MEN-1 유전자, 제1형 신경섬유종증 (NF1), cdk 억제제 p16, 결장직장암 유전자 (DCC), 가족성 선암 폴립종 유전자 (FAP), 다중 종양 억제 유전자 (MTS-1), BRCA1 및 BRCA2가 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
사용하기에 바람직한 것은, p53 (미국 특허 제5,747,469호, 제5,677,178호 및 제5,756,455호; 각각 본원에 참조문헌으로 인용됨), 망막아세포종 유전자, BRCA1 (미국 특허 제5,750,400호, 제5,654,155호, 제5,710,001호, 제5,756,294호, 제5,709,999호, 제5,693,473호, 제5,753,441호, 제5,622,829호 및 제5,747,282호; 각각 본원에 참조문헌으로 인용됨), MEN-1 유전자 (GenBank 수탁 번호 제U93236호) 및 아데노바이러스 E1A 유전자 (미국 특허 제5,776,743호 - 본원에 참조문헌으로 인용됨)이다.
세포사멸 또는 프로그램화된 세포 사멸을 억제하는 다른 온코유전자는 bcr-ab1, bcl-2(bcl-1, 사이클린 D1과 구별, GenBank 수탁 번호 M14745, X06487; 각각 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,650,491호 및 제5,539,094호) 및 Bcl-xl, Mcl-1, Bak, A1, A20을 포함하는 과 구성원을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. bcl-2의 과발현은 우선 T 세포 림프구에서 발견되었다. bcl-2는 세포사멸 경로에서의 단백질인, Bax를 결합시키고 이를 불활성화시킴으로서 온코유전자로서 작용한다. bcl-2 작용의 억제는 Bax의 불활성화를 방지하며, 세포사멸 경로가 진행되도록 한다. 따라서, 예를 들면, 안티센스 뉴클레오타이드 서열을 사용한 이러한 부류의 온코유전자의 억제는 세포사멸의 증진이 요구되는 측면에서 본 발명에 사용하기위해 고려된다(각각 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,650,491호; 제5,539,094호 및 제5,583,034호).
본 발명의 항체에 의해 전달될 수 있는 다른 조성물은 TRAIL 및 TRAIL 폴리펩타이드 (미국 특허 제5,763,223호 - 본원에 참조문헌으로 인용됨)로 명명된 종양 괴사 인자-관련 세포사멸 유도 리간드; 미국 특허 제5,605,826호(본원에 참조문헌으로 인용됨)의 24KD 세포사멸-관련 단백질 분해효소 및 Fas-관련 인자 FAF-1 (미국 특허 제5,750,653호 - 본원에 참조문헌으로 인용됨)를 암호화하는 유전자를 포함한다. 또한, 본 발명의 한 양태에서는, 세포사멸을 자극하는 것으로 보고되어 있는 인터루킨-1β-전환 효소 및 패밀리 구성원의 제공이 고려된다.
카르보스티릴 유도체 (미국 특허 제5,672,603호 및 제5,464,833호; 본원에 참조문헌으로 인용됨), 측쇄 아포젠 펩타이드 (미국 특허 제5,591,717호; 본원에 참조문헌으로 인용됨), 포스포티로신 억제제 및 비-가수분해성 포스포티로신 유사체 (미국 특허 제5,565,491호 및 제5,693,627호; 본원에 참조문헌으로 인용됨), RXR 레티노이드 수용체의 효능제 (미국 특허 제5,399,586호 - 본원에 참조문헌으로 인용됨) 및 항산화제 (미국 특허 제5,571,523호 - 본원에 참조문헌으로 인용됨)와 같은 화합물들이 사용될 수도 있다. 또한, 제니스테인과 같은 티로신 카이네이즈 억제제를, 본 발명의 항체에 연결시킬 수도 있다(본원에 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,587,459호에 의해 지지됨).
F7. 항- 바이러스제
음이온성 인지질 및 아미노인지질로서, 특히 PS 및 PE는 바이러스 감염된 세포에 노출되므로, 9D2 및 3G4(ATCC 4545) 항체와 같은 본 발명의 항체를 또한 하나 이상의 항-바이러스제에 연결시킬 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 당면한 추가의 이유 및 이의 장점은 PE-결합 펩타이드, 항-바이러스 접합체와 관련하여 하기에 더욱 상세히 기술되어 있다.
항체 또는 펩타이드에 연결시키기 위한 항-바이러스제의 예는 또한 본 발명의 PE-결합 펩타이드, 항-바이러스 접합체와 관련하여 더욱 상세히 기술된다. 표 G에 것들을 포함하는 하나 이상의 항-바이러스제를 본원에 기술한 바와 같이 본 발명의 항체에 접합시킬 수 있다. 이러한 항-바이러스제는 또한 본 발명의 항-바이러스 치료요법과 함께 별도로 사용될 수 있다.
G. 생물학적 작용 등량체
일반적으로 상기한 재료를 출발점으로 시작하여, 항체 및 효과기의 균등물 또는 개량물을 제조할 수 있다. 상기한 항체의 구조에 대한 변형 및 변화를 줌으로써, 이와 유사하거나 바람직한 특성을 가지는 분자를 수득할 수 있다. 예를 들면, 상호 결합력이 크게 손실되지 않으면서 단백질 구조에 있어서 소정의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체할 수 있다. 또한, 이러한 생각은 독소, 항-혈관형성 제제, 세포사멸 유도제, 응고제 등에도 적용된다.
단백질의 생물학적 기능 활성을 정의하는 것은 단백질의 상호작용 능력 및 성질이기 때문에, 단백질 서열 (또는 이를 암호화하는 DNA 서열)에 있어서 소정의 아미노산 서열이 치환되어도 유사한 특성 (효능제로서의 특성)을 가진 단백질을 수득할 수 있다. 따라서, 생물학적 유용성 또는 활성은 크게 손실되지 않으면서 상기한 항체 또는 치료제의 서열 (또는 이를 암호화하는 DNA 서열)이 다양하게 변화될 수 있다. DNA 서열을 돌연변이시켜 제조되는 생물학적 작용성 균등물은, 상기한 표 A에 기재된 코돈 정보 및 부위-특이적 돌연변이 생성에 대한 보충적인 기술적인 상세한 내용을 사용하여 제조할 수 있다.
또한, "생물학적 작용성 균등물(biologically functional equivalent)" 단백질 또는 펩타이드의 정의에 있어서, 이러한 개념은 상기 분자의 소정의 부위에서 이루어질 수 있는 변화의 수에 제한이 있어서, 수용할 수 있을 정도의 균등한 생물학적 활성을 가지는 분자라는 개념이라는 것이 당업자에게 명백하게 이해될 것이다. 따라서, 본원에서의 "생물학적 작용성 균등물 단백질 및 펩타이드"는, 소정의 아미노산 (대부분 또는 모든 아미노산은 아님)이 치환될 수 있는 단백질 및 펩타이드를 의미한다. 물론, 상이하게 치환된 다수의 상이한 단백질/펩타이드는 본 발명에 따라 용이하게 제조 및 사용될 수 있다.
일반적으로, 아미노산 치환은, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등의 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성에 기초한다. 아미노산 측쇄 치환기의 크기, 형상 및 유형을 분석하면, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘은 모두 (+)-전하 잔기이고; 알라닌, 글리신 및 세린은 모두 크기가 비슷하고; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 모두 유사한 형상을 가지고 있다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 사항들을 고려하여, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 알라닌, 글리신 및 세린; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 본원에서 생물학적 기능성 균등물로서 정의된다.
보다 정량적으로 변경을 주는 경우, 아미노산의 수 인덱스 (hydropathic index)를 고려할 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성 및 전하 특성에 기초하여 각각의 수 인덱스를 가지고 있다. 이들은 이소루이신 (+4.5), 발린 (+4.2), 류신 (+3.8), 페닐알라닌 (+2.8), 시스테인/시스틴 (+2.5), 메티오닌 (+1.9), 알라닌 (+1.8), 글리신 (-0.4), 트레오닌 (-0.7), 세린 (-0.8), 트립토판 (-0.9), 티로신 (-1.3), 프롤린 (-1.6), 히스티딘 (-3.2), 글루타메이트 (-3.5), 글루타민 (-3.5), 아스파르테이트 (-3.5), 아스파라긴(-3.5), 라이신 (-3.9) 및 아르기닌 (-4.5)이다.
단백질에 상호 작용성 생물학적 기능을 부여함에 있어서 아미노산의 수 인덱스의 중요성은 당업계에 잘 알려져 있다 {참조: Kyte 및 Doolittle, 1982 - 본원에 참조문헌으로 인용됨}. 소정의 아미노산이 유사한 수 인덱스 또는 수치를 가지는 다른 아미노산과 치환되어도 유사한 생물학적 활성을 여전히 유지할 수 있는 것으로 알려져 있다. 상기한 수 인덱스에 기초하여 변화를 준 경우, 수 인덱스 ±2 이내에서 아미노산 치환이 이루어진 경우가 바람직하며, ±1 이내인 경우가 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 경우가 더욱 바람직하다.
따라서, 아미노산을 유사한 친수성 수치를 가지는 다른 아미노산으로 치환하여 생물학적으로 균등한 단백질을 수득할 수 있는 것으로 이해된다. 미국 특허 제4,554,101호 (본원에 참조문헌으로 인용됨)에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 하 친수성 수치가 아미노산 잔기에 지정되었다: 아르기닌 (+3.0), 라이신 (+3.0), 아스파르테이트 (+3.0±1), 글루타메이트 (+3.0±1), 세린 (+0.3), 아스파라긴 (+0.2), 글루타민 (+0.2), 글리신 (0), 트레오닌 (-0.4), 프롤린 (-0.5±1), 알라닌 (-0.5), 히스티딘 (-0.5), 시스테인 (-1.0), 메티오닌 (-1.3), 발린 (-1.5), 류신 (-1.8), 이소루이신 (-1.8), 티로신 (-2.3), 페닐알라닌 (-2.5) 및 트립토판 (-3.4).
친수성 수치에 기초하여 변화를 주는 경우, 친수성 수치 ±2 이내에서 아미노산 치환이 이루어진 경우가 바람직하며, ±1 이내인 경우가 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 경우가 더욱 바람직하다.
H. 접합체
9D2 및 3G4(ATCC 4545)와 같은 개선된 특성을 지닌 선택된 항-PS 항체를 포함하는, 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 대한 항체를 항-세포성 제제 또는 세포독성제에 접합시키거나 부착시키거나, 또는 공유결합으로 연합시켜서 "면역독소"를 제조하거나, 직접 또는 간접적으로 응고제에 접합시키거나 부착시켜서 "응고리간드"를 제조하거나, 뉴클레오사이드와 같은 항-바이러스제에 접합시키거나 부착시켜서 항-바이러스 면역접합체 또는 "면역살바이러스제(immunovirocides)"를 제조할 수 있다. 듀라마이신과 같은 PE-결합 특성을 또한 불활성 담체, 표적화제 또는 항-바이러스제에 접합시키거나, 부착시키거나 또는 공유결합으로 연합시켜 PE-결합 펩타이드 유도체 및 항-바이러스 펩타이드 접합체를 제조할 수 있다.
비록 공유 결합이 바람직하다고 해도, 공유 부착의 다른 수단을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 연결된 작제물은 아비딘:바이오틴 브릿지를 사용하여 생성시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 알려져있는 것 외에, 공동 소유의 미국 특허 제6,093,399호는 생물학적 제제 및 치료제에 항체 및 표적화제를 작동적으로 부착시키는데 있어서 아비딘:바이오틴의 사용을 추가로 기술하고 이를 가능하게 하기 위한 목적을 위해 참조문헌으로 본원에 상세히 인용된다.
2개의 제제가 또한 제2 결합 영역, 바람직하게는 항체 또는 이의 항원 결합 영역에 의해 결합될 수 있다. 이는, 표적화제가 제2 결합 영역을 통해 응고제에 연결되는 응고리간드에 의해 예시되며(참조: 본원에 각각 참조문헌으로 상세히 인용된 미국 특허 제6,093,399호, 제6,004,555호, 제5,877,289호 및 제6,036,955호), 이들은 암 치료시 제조 및 성공적으로 사용되고 있다. 제1 표적화제가 항체 또는 항원 결합 영역인 경우, 또한 항체, 또는 항원 결합 영역인 제2 결합 영역의 사용으로 이특이적 항체 작제물이 생성된다. 일반적인 이특이적 항체의 제조 및 사용은 당해 분야에 공지되어 있으며 본원에 추가로 기술된다.
면역접합체 기술은 일반적으로 현재 당해 분야에 공지되어 있다. 그러나, 특정의 잇점이 제조 및 후속적인 임상 투여를 위한 정제 둘다에서 특정의 바람직한 기술의 적용을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, IgG계 작제물이 통상적으로 우수한 결합능 및 이들의 Fab' 대응물보다 더욱 느린 혈액 청소율을 나타내는 한편, Fab' 단편계 작제물은 일반적으로 우수한 조직 침투능을 나타낼 것이다.
추가로, 항체 및 펩타이드 접합에 성공적으로 사용될 수 있는 다수 유형의 디설파이드-결합 함유 링커가 공지되어 있다고 해도, 상이한 약리학적 특성 및 능력을 기준으로, 특정의 링커가 일반적으로 다른 링커보다 바람직할 것이다. 예를 들어, 입체적으로 "방해된" 디설파이드 결합을 함유하는 링커가, 이들의 우수한 생체내 안정성으로 인하여, 작용 부위에서 결합이전에 응고제의 방출을 방지하므로, 바람직하다.
각각의 유형의 가교-결합제 및 가교-결합이 수행되는 방법은 수득되는 접합체의 약력학에 따라 변하는 경향을 띌 것이다. 접합체가 우수한 "방출" 특성을 지니는 것이 요구되는 의도된 작용 부위외의 신체내 어느 곳에서도 발견되는 조건하에서 완전한 상태로 존재할 접합체를 갖는 것이 요구될 수 있다. 따라서, 특히 사용된 특수 가교-결합 시약 및 가교-결합된 구조물을 포함하는 특정의 가교-결합 도식이 일부 중요하게 될 것이다.
접합된 특정의 제제에 따라, 항체 또는 PE-결합 펩타이드 및 제2 또는 치료제를 공유 부착시키는 펩타이드 스페이서를 제공하는 것이 필요하거나 바람직할 수 있다. 특정의 펩타이드 스페이서는 디설파이드 결합된 루프 구조내로 폴딩(folding)될 수 있다. 이후에, 루프내 단백질분해적 절단은 이종이량체 폴리펩타이드를 생성시키며, 여기서, 항체 및 치료제는 단일의 디설파이드 결합에 의해 연결된다. 이러한 독소의 예는 리신 A-쇄 독소이다.
특정의 다른 독소 화합물이 이용되는 경우, 절단이 불가능한 펩타이드 스페이서가 융합 단백질의 항체 및 독소 화합물에 공유결합으로 부착시키기 위해 제공될 수 있다. 절단되지 않는 펩타이드 스페이서와 함께 사용될 수 있는 독소는 자체로 단백질분해적 절단에 의해 세포독성 디설파이드-결합된 형태로 전환될 수 있는 것들이다. 이러한 독소 화합물의 예는 슈도모나스 내독소 화합물이다.
각종의 화학치료요법 및 기타 약리학적 제제는 본 발명에 이르러 항체에 성공적으로 접합되어 약리학적으로 작용하는 것으로 밝혀졌다. 시험된 항신생물 제제의 예는 독소루비신, 다우노마이신, 메토트렉세이트, 빈블라스틴 및 각종의 기타 제제를 포함한다. 더우기, 네오카르지노스타틴, 마크로마이신, 트레니몬 및 α-아마니틴과 같은 다른 제제의 부착도 기술되어 있다. 이러한 부착 방법은 본원에서 사용하기 위해 변경될 수 있다.
항체 또는 PE-결합 펩타이드에 대한 어떠한 공유 결합도 작용 부위와 구별되는 부위에서 이상적으로 이루어질 수 있다. 따라서, 조성물은 현저한 손상없이 각각의 부위가 요구된 작용을 수행하도록 하는 어떠한 작동적 방식으로도 "연결"됨으로써, 특히 수득되는 작제물은 여전히 요구된 항원 또는 PE에 결합하고 부착된 제제는 실질적으로 생물학적 활성을 유지하고/하거나 작제물로부터 방출되는 경우 생물학적 활성을 회복한다.
H1 . 생화학적 가교 결합제
상기한 일반적인 정보 이외에도, 소정의 바람직한 생화학적 교차-링커를 사용하여 하나 이상의 치료제 또는 기타 제제에 항체 또는 PE-결합 펩타이드를 접합시킬 수 있다. 교차결합 시약은, 2가지의 상이한 분자의 작용성 그룹을 서로 결합하는 분자 가교를 형성하기 위해 사용된다. 단계별로 2가지의 상이한 단백질을 연결시키기 위해, 원하지 않는 단독중합체 형성을 제거하는 헤테로-이작용성 교차-링커를 사용할 수 있다. 헤테로-이작용성 교차-링커의 예는 하기 표 C에 기재되어 있다.
[표 C]
Figure 112012087199067-pat00003
헤테로-이작용성 교차 링커는 2개의 반응성 그룹을 함유하고 있다 - 1급 아민 그룹과 일반적으로 반응하는 그룹(예를 들면, N-하이드록시 숙신이미드); 및 티올 그룹과 일반적으로 반응하는 그룹(예를 들면, 피리딜 디설파이드, 말레이미드, 할로겐 등). 1급 아민 반응성 그룹을 통해 교차-링커는 하나의 단백질 (예를 들면, 선택된 항체, 단편 또는 PE-결합 펩타이드)의 라이신 잔기와 반응할 수 있으며, 티올 반응성 그룹을 통해 이미 제1 단백질에 결합된 교차-링커는 다른 단백질 의 시스테인 잔기(자유 설프하이드릴 그룹)와 반응할 수 있다.
따라서, 일반적으로 조성물은 가교-결합을 목적으로 하여 시판되는 작용성 그룹을 가지거나 가지도록 유도체화된다. 이는, 다양한 그룹이 이러한 방식으로 사용될 수 있다는 점에 있어서 제한되는 것으로 고려되지 않는다. 예를 들면, 결합 또는 가교-결합을 위해, 1급 또는 2급 아민 그룹, 하이드라지드 또는 하이드라진 그룹, 카복실 알코올, 포스페이트, 카바메이트 또는 알킬화 그룹이 사용될 수 있다.
교차-링커의 2개의 반응성 그룹 사이의 스페이서 암 (spacer arm)은 다양한 길이 및 화학적 조성물을 가질 수 있다. 스페이서 암의 길이가 길면 상기한 접합체 성분의 유연성이 보다 우수한 반면, 가교내에 있는 소정의 특정 성분 (예를 들면, 벤젠 그룹)은 상기 반응성 그룹에 초과되는 안정성을 부여하거나 다양한 작용 양태에 대한 화학적 연결의 내성(예를 들면, 환원제에 대해 내성인 디설파이드 결합)을 크게 할 수 있다. 펩타이드 스페이서 (예를 들면, L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala)를 사용할 수도 있다.
혈액속에서 상당한 정도의 안정성을 가지는 교차 링커를 사용하는 것이 바람직하다. 접합시 성공적으로 사용될 수 있는 다양한 유형의 디설파이드 결합-함유 링커는 알려져 있다. 입체적으로 방해를 받고 있는 디설파이드 결합을 함유하는 링커는, 생체내에서 보다 큰 안정성을 가지게 되어 작용 부위에 결합하기 전에 상기 제제가 방출되는 것을 방지함이 입증될 수 있다. 따라서, 이러한 링커는 연결 제제의 바람직한 그룹이다.
가장 바람직한 가교-결합 시약 중 하나는, 인접한 벤젠 환 및 메틸 그룹에 의해 "입체적으로 방해를 받고 있는" 디설파이드 결합을 함유하는 이작용성 교차-링커인 SMPT이다. 디설파이드 결합의 입체적 방해(steric hindrance)는, 티올레이트 음이온(예를 들면, 조직 및 혈액내에 존재할 수 있는 글루타티온)에 의해 결합이 공격받는 것을 방지하여 부착된 상기 제제를 종양 부위에 전달하기 이전에 상기 접합체가 탈커플링 (decoupling)되는 것을 방지하는 데에 도움이 되는 것으로 여겨진다. 또한, SMPT 제제는 본 발명의 접합체와 관련하여 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
이미 알려져 있는 다른 많은 가교-결합 시약과 마찬가지로, SMPT 가교-결합 시약은, 1급 아민 또는 시스테인의 SH와 같은 작용성 그룹 (예를 들면, 라이신의 엡실론 아미노 그룹)에 가교-결합능을 부여한다. 다른 가능한 유형의 교차-링커는, 절단가능한 디설파이드 결합을 함유하는 헤테로-이작용성 광반응 페닐아지드 (예를 들면, 설포숙신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트)를 포함한다. N-하이드록시-숙신이미딜 그룹은 1급 아민 그룹과 반응하고, 페닐아지드 (광분해 후)는 모든 아미노산 잔기와 비선택적으로 반응한다.
방해를 받는 교차-링커 이외에도, 방해를 받지않는 링커를 본원에서 사용할 수도 있다. 보호된 디설파이드를 함유하거나 생성하는 것으로 고려되지 않는 기타의 유용한 교차-링커로는, SATA, SPDP 및 2-이미노티올란이 있다. 이러한 교차-링커의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다.
접합된 후, 접합되지 않은 항체 또는 펩타이드 및 다른 제제와 기타의 오염물로부터 접합체를 분리한다. 임상적으로 유용하게 사용할 수 있도록 충분한 정도의 순도를 가지는 접합체를 제공하기 위해서, 수많은 정제 기법들을 사용할 수 있다. 크기 분리에 기초한 정제법 (예를 들면, 겔 여과, 겔 투과 또는 고성능 액체 크로마토그래피)이 일반적으로 가장 많이 사용된다. 블루-세파로즈 분리법과 같은 기타의 크로마토그래피 기법도 또한 사용할 수 있다.
H2 . 생물학적으로 방출가능한 링커
혈액내에서 상당한 정도의 안정성을 가질 결합 잔기는 모두가 바람직하지만, 질병, 예를 들면, 종양 부위에 표적화되기 전에 부착된 치료제가 실질적으로 방출되는 것을 방지하기 위해서 소정의 양태에서, 생물학적으로 방출가능한 결합 및/또는 선택적으로 절단가능한 스페이서 또는 링커를 고려할 수 있다. "생물학적으로 방출가능한 결합" 및 "선택적으로 절단가능한 스페이서 또는 링커"는 순환계내에서 상당한 정도의 안정성을 가진다.
따라서, 본 발명에 따른 항체 또는 PE-결합 펩타이드는 생물학적으로 방출가능한 결합을 통해 하나 이상의 치료제 또는 제2 제제에 연결될 수 있다. ScFv 단편이 소정의 양태에서는 바람직하지만, 완전한 항체를 포함한 모든 형태의 표적화제 또는 항체를 사용할 수 있다.
"생물학적으로 방출가능한 결합" 또는 "선택적으로 가수분해가능한 결합"에는, 특정의 조건하에서만 우호적으로 방출가능하거나 절단가능하거나 가수분해가능한 모든 결합이 포함된다. 이러한 결합으로는, 미국 특허 제5,474,765호 및 제5,762,918호 (각각 본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있는 바와 같이, 디설파이드 결합, 트리설파이드 결합 및 산-불안정성(acid-labile) 결합이 포함된다.
특히, 본 발명의 항체 또는 PE-결합 펩타이드에 치료제를 부착하기 위해 산-민감성 스페이서의 사용을 고려할 수 있다. 이러한 양태에서, 치료제는 세포내의 산성 구획 (acidic compartment) 내에서 방출된다. 산-불안정성 방출이 세포외에서도 일어날 수 있으나, 바람직하게는 종양 부위 또는 바이러스 감염된 세포에 표적된 후에 방출되는 것이 바람직하다. 현재 바람직한 특정 예로는, 산-불안정성 스페이서를 통해 콜키친 또는 독소루비신에 연결된 2C3-유사 항체가 포함된다. 상기 항체의 탄수화물 잔기를 통한 부착도 고려될 수도 있다. 이러한 양태에서, 치료제는 약물은 세포내의 산성 구획내에서 방출된다.
또한, 항체 또는 PE-결합 펩타이드를 유도체화하여, 생물학적으로 방출가능한 결합을 통해 치료제를 부착할 수 있는 기능성 그룹을 도입할 수도 있다. 따라서, 항체 또는 PE-결합 펩타이드를 유도체화하여, 하이드라지드, 하이드라진, 1급 아민 또는 2급 아민 그룹에서 종료하는 측쇄를 도입할 수 있다. 치료제는, 시프(Schiff) 염기 결합, 하이드라존 또는 아실 하이드라존 결합 또는 하이드라지드 링커를 통해 접합시킬 수 있다 {참조: 미국 특허 제5,474,765호 및 제5,762,918호 (각각 본원에 참조문헌으로 상세히 인용됨)}.
미국 특허 제5,474,765호 및 제5,762,918호 (각각 본원에 참조문헌으로 상세히 인용됨)에 기재되어 있는 바와 같이, 효소-민감성 결합 (펩타이드 결합, 에스테르, 아미드, 포스포디에스테르 및 글리코시드를 포함)인 하나 이상의 생물학적으로 방출가능한 결합을 통해 항체 또는 PE-결합 펩타이드를 치료제에 작동가능하게 부착시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서는, 질병 부위, 특히 종양 환경내에 우선적으로 위치하는 펩티다제 및/또는 프로테이나제에 대한 제1 절단 부위를 적어도 포함하는 펩타이드 링커를 사용한다. 따라서, 부착된 치료제의 항체- 또는 펩타이드-중재된 전달의 결과, 질병 부위 또는 종양 환경내에서 특히 절단되어 활성 치료제가 특이적으로 방출된다. 소정의 펩타이드 링커는, 리모델링에 관여하는 하나 이상의 효소에 의해 인식되는 절단 부위를 포함한다.
간질 콜라게나제, 젤라티나제 또는 스트로멜라이신과 같은, 유로키나제, 프로-유로키나제, 플라스민, 플라스미노겐, TGFβ베타, 스타필로키나제, 트롬빈, 인자 IXa, 인자 Xa 또는 메탈로프로테이나제에 대한 절단 부위를 포함하는 펩타이드 링커가 특히 바람직하다. 생물학적으로 방출가능한 결합 및 선택적으로 절단가능한 링커 및 펩타이드를 포함하는 면역접합체의 제조방법 및 사용 방법에 대한 추가 기재를 위해, 미국 특허 제6,004,555호, 제5,877,289호 및 제6,093,399호를 본원에 참조문헌으로 상세히 인용하였다. 특히, 미국 특허 제5,877,289호는, 간질 콜라게나제, 젤라티나제 또는 스트로멜라이신과 같이 종양 환경내에서 유로키나제, 플라스민, 트롬빈, 인자 IXa, 인자 Xa 또는 메탈로프로테이나제에 의해 절단되는 선택적으로 절단가능한 펩타이드를 포함하는 면역접합체의 제조 방법 및 사용 방법에 대한 추가 기재를 위해 본원에 참조문헌으로 특별히 인용하였다.
현재 바람직한 선별적으로 절단가능한 펩타이드 링커는, 간질 콜라게나제, 젤라티나제 또는 스트로멜라이신과 같은, 플라스민 또는 메탈로프로테이나제("매트릭스 메탈로프로테이나제" 또는 "MMP"로도 알려져 있음)에 대한 절단 부위를 포함하는 링커이다. 본 발명과 관련하여 유리하게 사용할 수 있는 추가의 펩타이드 링커는, 예를 들면, 프로-유로키나제를 분해하는 것과 같은 플라스민 분해 서열, TGFβ, 플라스미노겐 및 스타필로키나제; 인자 Xa 절단가능한 서열; 젤라티나제 A에 의해 절단가능한 것과 같은 MMP 절단가능한 서열; 송아지 피부 콜라겐(α1(I) 쇄), 송아지 피부 콜라겐(α2(I) 쇄), 소 연골 콜라겐(α1(II) 쇄), 사람 간 콜라겐(α1(III) 쇄), 사람 α2M, 사람 PZP, 랫트 α1M, 랫트 α2M, 랫트 α1I3(2J), 랫트 α1I3(27J), 및 사람 섬유아세포 콜라게나제 자가분해성 절단가능한 부위와 같은 콜라게나제 절단가능한 서열을 포함한다. 당해 분야의 숙련가에게 유용한 것으로 알려진 것외에, 공동 소유의 미국 특허 제6,342,219호, 제6,524,583호, 제6,342,221호 및 제6,416,758호의 표 2로부터의 내용 및 서열은 이러한 절단가능한 서열의 사용을 추가로 기술하고 가능하게 하기 위한 목적을 위해 본원에 참조로 상세히 인용된다.
H3 . 이특이적 항체
일반적으로 이특이적 항체를, 하나의 암이 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하고 이특이적 항체가 항원 결합부위와는 별개의 부위에서 치료제에 부착하는 한, 사용할 수 있다.
일반적으로, 이특이적 항체의 제조는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 하나의 방법은 한편으로는 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대하여 특이성을 지닌 항체의 별개의 제조 및 다른 한편으로는 치료제에 대해 특이성을 지닌 항체의 별개의 제조를 포함한다. 그리고 나서, 상기 2가지의 선택된 항체에서 펩틱 F(ab'γ)2 단편을 제조한 후, 각각 환원시켜 별개의 Fab'γ SH 단편을 제공한다. 커플링될 상기 2개의 파트너 중 하나에 있는 SH 그룹을 가교-결합 시약 (예를 들면, O-페닐렌디말레이미드)으로 알킬화시켜 하나의 파트너에 유리 말레이미드 그룹을 제공한다. 그리고 나서, 티오에테르 연결을 사용하여, 이 성분을 다른 성분과 접합시켜 목적하는 F(ab'γ)2 헤테로접합체를 제조한다. SPDP 또는 단백질 A를 이용한 가교-결합이 수행되거나, 삼특이적 작제물이 제조되는 다른 기술도 공지되어 있다.
이특이적 특이성 항체를 제조하는 다른 방법은, 2개의 하이브리도마를 융합시켜 콰드로마(quadroma)를 형성시키는 방법이다. 본원에서 용어 "콰드로마"는, 2개의 B 세포 하이브리도마의 생산성있는 융합체를 기술하는 데 사용된다. 현재의 표준 기술을 사용하여, 2개의 항체를 생산하는 하이브리도마를 융합시켜 딸세포를 만든 후, 2개의 클론 형태의 면역글로불린 유전자 세트의 발현이 유지되는 세포를 선택한다.
콰드로마를 생산하는 바람직한 방법은, 하나 이상의 모(parental) 하이브리도마 중 효소-결핍 돌연변이를 선택하는 방법을 포함한다. 제1 돌연변이 하이브리도마 세포주를, 예를 들면 요오도아세트아미드에 치명적으로 노출시켜 계속 생존하지 못하도록 한 제2 하이브리도마 세포에 융합시킨다. 세포 융합으로 인해, 상기 치명적으로 처리된 하이브리도마로부터 이의 효소 결핍 유전에 대한 유전자를 획득하여 제1 하이브리도마를 구하고, 제1 하이브리도마에 융합시킴으로써 제2 하이브리도마를 구한다. 동일한 동형이지만 상이한 서브클래스의 면역글로불린을 융합시키는 것이 바람직하지만, 반드시 필요한 것은 아니다. 바람직한 콰드로마의 분리를 위한 다른 분석법의 경우, 혼합된 서브클래스 항체를 사용할 수 있다.
보다 상세하게는, 콰드로마 발생 및 스크리닝 방법 중 하나는, 제1의 선택된 mAb를 방출하는 하이브리도마 주를 수득하는 단계 및 필수적인 대사 효소인 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HGPRT)가 결합되도록 하는 단계를 포함한다. 상기 하이브리도마 세포의 결함성 돌연변이체를 수득하기 위해, 8-아자구아닌의 농도를 증가시키면서 (1×10-7M 내지 1×10-5M) 세포를 성장시킨다. 이러한 돌연변이체를 제한된 희석으로 아클로닝시킨 후, 하이포크산틴/아미노프테린/티미딘 (HAT) 민감성에 대해 시험한다. 배양 배지는, 예를 들면, 10% FCS, 2mM L-글루타민 및 1mM 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM으로 이루어질 수 있다.
표준 세포 융합 기술을 이용하여, 제2의 목적하는 MAb를 생산하는 상보성 하이브리도마 세포주를 사용하여 콰드로마를 생산한다. 간략하게는, 4.5×107 HAT-민감성 제1 세포를, 융합 이전에 얼음 위에서 30분간 치사량의 비가역성의 생화학적 억제제인 요오도아세트아미드 (포스페이트로 완충된 염수 중 5mM)로 미리 처리된 2.8×107 HAT-내성 제2 세포와 혼합한다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용하여 세포 융합을 유도하고, 상기 세포를 96-웰 미세배양 플레이트에 둔다. HAT-함유 배지를 사용하여 콰드로마를 선택한다. 예를 들면, 고상 동형-특이성 ELISA 및 동형-특이적 면역 형광 염색법을 사용하여, 이특이적 항체를 함유하는 배양물을 확인한다.
이특이적 항체를 동정하는 한 확인 양태에서는, 모 하이브리도마 항체 중 하나와 특이적으로 반응하고 2가지의 항체 모두에 대해 교차-반응성이 없는, 시약으로 미세역가 플레이트(Falcon, Becton Dickinson Labware)의 웰을 피복한다. 상기 플레이트를 세척하고 차단한 후, 세척할 상층물 (SNs)을 각 웰에 첨가한다. 실온에서 2시간 동안 플레이트를 항온처리한 후, 상층물을 따라버리고, 플레이트를 세척하고 나서, 희석된 염기성 포스파타제-항-항체 접합체를 실온에서 2시간동안 첨가하였다. 플레이트를 세척하고나서, 포스파타제 기질 (예를 들면, P-니트로페닐 포스페이트 (세인트 루이스 소재의 Sigma 제조원))을 각 웰에 첨가시킨다. 플레이트를 항온처리하고, 3N NaOH를 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시킨 후, ELISA 판독기를 사용하여 OD410 수치를 측정한다.
다른 확인 양태에서는, 폴리-L-라이신으로 미리 처리된 미세적정 플레이트를 사용하여 표적 세포 중 하나를 각 웰에 결합시킨 후, 예를 들면 1% 글루타르알데히드를 사용하여 이 세포를 고정시키고 나서, 이특이적 항체의 완전한 세포에 결합할 수 있는 능력을 시험한다. 또한, 항체의 특성화의 분야에서 공통적으로 사용되는 FACS, 면역형광 염색법, 이디오타입-특이적 항체, 항원-결합 경쟁 검정 및 기타의 방법들을 본 발명과 함께 사용하여 바람직한 콰드로마를 확인할 수 있다.
콰드로마를 분리한 후, 이특이적 항체를 다른 세포 생성물로부터 분리하여 정제한다. 이는, 면역글로불린 정제 분야에서 당업자에게 잘 알려져 있는 다양한 단백질 분리 공정에 의해 수행될 수 있다. 항체의 제조 및 특성 분석 수단은 당업계에 잘 알려져 있다 {참조: 예를 들면, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988}.
예를 들면, 선택된 콰드로마로부터의 상층물을 단백질 A 또는 단백질 G 세파로즈 칼럼을 통과시켜 IgG (동형에 의존)에 결합시킨다. 그리고 나서, 결합된 항체를, 예를 들면 pH5.0 시트레이트 완충액을 사용하여 용출시킨다. BsAb를 함유하는 용출 분획을 등장 완충액에 대해 투석시킨다. 이와 달리, 용출물을 항-면역글로불린-세파로즈 칼럼을 통과시킨다. 그리고 나서, BsAb를 3.5M 염화마그네슘으로 용출시킨다. 예를 들면, 표적 세포의 상기한 동형-특이성 ELISA 및 면역 형광 염색 검정을 통해, 상기 정제된 BsAb에 대해 결합 활성을 시험한다.
또한, 정제된 BsAb 및 모 항체를 SDS-PAGE 전기영동을 통해 특성 분석 및 분리한 후, 은 또는 쿠마시(Coomassie)로 염색시킨다. 이는, 모 항체 중 하나가 다른 하나에 비해 분자량이 커서, BsAb 밴드가 2개의 모 항체 밴드 사이에서 이동하는 경우에 가능하다. 샘플을 환원시켜, 2개의 상이한 분자량을 가지는 중쇄의 존재를 확인한다.
H4 . 융합 단백질 및 재조합 발현
9D2 및 3G4(ATC 4545) 항체 및 개선된 특성과 PE-결합 펩타이드를 지니는 다른 경쟁 항체를 포함하는 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 대한 항체를 또한 사용하여 분자 생물학 기술로 융합 단백질을 창조할 수 있다. 어떠한 융합 단백질도 본원에 기술된 어떠한 항체, PE-결합 펩타이드 및 제2 또는 치료제 및 당해 분야에 공지된 것을 사용하여 제조할 수 있다. 융합 단백질 기술은 CDR 서열에서 최적화와 같은 다른 변형, 선택적으로 분해가능한 펩타이드 서열 등을 통한 연결을 사용하여 융합 단백질을 제조하도록 용이하게 조절될 수 있다.
이를 위해 재조합 DNA 기술을 이용하는 것이 현재 당업자들의 표준 관행이다. 이러한 방법으로는, 예를 들면, 실험실내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전자 재조합 방법이 포함된다. 또한, 자동화 합성기를 사용하여 DNA 및 RNA를 합성할 수 있다 {참조: 예를 들면, 문헌(Sambrook 등, 1989)에 기재된 방법}.
일반적으로, 이러한 융합 단백질의 제조에는, 목적하는 융합 단백질을 암호화하는 단일 암호화 부위를 제조하기 위해, 프레임내에 제1 및 제2 DNA 암호화 부위 및 이 부위의 기능성 연결 또는 결합 부위를 제조하는 것을 포함한다. 본 발명의 이러한 양태에 있어서, 항체 서열을 치료제를 암호화하는 DNA 서열과 프레임내에 결합시킬 것이다. 일반적으로, 상기 면역접합체의 어느 부위가 N 말단부 또는 C 말단부로서 제조되는 지는 특별히 관련이 없는 것으로 이해된다.
일단 목적하는 암호화 부위가 생성되면, 발현 벡터가 만들어진다. 발현 벡터는 삽입된 DNA의 상향에 하나 이상의 프로모터를 가지고 있어서, 삽입된 DNA의 전사를 촉진하여 암호화된 재조합 단백질의 발현을 촉진한다. 이것이 "재조합 발현"의 의미이다.
소위 "재조합" 형태의 면역접합체를 수득하기 위해, 이를 재조합 세포내에서 발현시킨다. 원핵 또는 진핵 시스템에서 발현시키기 위해, 재조합 발현 분야에 있어서의 당업자들이 잘 알고 있는 기법을 이용하여 DNA 분절을 조작할 수 있다. 발현에 있어서, 실질적으로 모든 발현 시스템이 사용될 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명의 면역접합체는 진핵 발현 시스템 (예를 들면, CHO 세포)에서 성공적으로 발현될 수 있으나, 세균 발현 시스템 (예를 들면, E.coli pQE-60)이 작제물의 대규모 제조 및 후속적인 정제에 특히 유용할 것으로 생각된다. 또한, cDNA는 세균 시스템에서 발현될 수 있는 데, 이때 암호화된 단백질은 β-갈락토시다제, 유비퀴틴, 쉬스토소마 자포니큠 (Schistosoma japonicum) 글루타티온 S-트랜스퍼라제 등과의 융합체로서 발현된다. 수득된 재료 사용의 용이성 및 수득량에 있어서, 세균 발현 시스템이 진핵 발현 시스템에 비해 유리한 것으로 생각된다.
미생물 발현 측면에서, 재조합 숙주 세포내에서의 유전자 발현과 관련한 본원의 기재 내용을 보충하기 위해 미국 특허 제5,583,013호, 제5,221,619호, 제4,785,420호, 제4,704,362호 및 제4,366,246호를 참조문헌으로 인용하였다.
재조합 방법으로 생산된 면역접합체는, 사람에게 투여하기 위해 정제 및 제형화할 수 있다. 이와 달리, 상기 면역접합체를 암호화하는 핵산을 유전자 치료법을 통해 전달할 수 있다. 노출된 재조합 DNA 또는 플라스미드를 사용할 수 있으나, 리포좀 또는 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 수용체-중재된 세포내합임 (endocytosis)을 통해 세포내로 들어가서 숙주 세포의 게놈에 통합되어 바이러스 유전자를 안정되게 및 효과적으로 발현할 수 있는 특정 바이러스의 능력은, 당해 바이러스가, 외부 유전자를 포유동물의 세포내로 전달하기 위한 매력적인 후보물질이 되도록 한다. 일반적으로, 본 발명에서 사용되기에 바람직한 유전자 치료 벡터는 바이러스 벡터이다.
레트로바이러스는 유전자 전달 벡터로서 가능성이 있는 데, 이는 자신의 유전자를 숙주의 게놈에 통합시킬 수 있으며, 다량의 외부 유전 물질을 전달할 수 있고, 다양한 종 및 세포를 감염시킬 수 있고, 특정 세포주에서 패키징될 수 있기 때문이다. 또한, 기타의 다른 바이러스들 {예를 들면, 미국 특허 제5,139,941호 (본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재된 바와 같이, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 및 아데노-관련 바이러스 (AAV)}도 유전자 전달을 위한 벡터로서 제공될 수 있도록 조작할 수 있다.
외부의 유전 물질을 수용할 수 있는 몇몇 바이러스들은 전달할 수 있는 뉴클레오티의 수 및 감염시키는 세포 유형에 제한이 있지만, 상기한 바이러스들은 성공적으로 유전자를 발현시키는 것으로 입증되었다. 하지만, 아데노바이러스는 자신의 유전자 물질을 숙주 게놈내에 통합시키지 않기 때문에 자신의 유전자 발현을 위해서 숙주의 복제가 필요없어서, 신속하고 효율적인 이종성 유전자 발현을 위해서 가장 이상적이다. 복제-결함 감염성 바이러스 (replication-defective infective virus)를 제조하는 기법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 소정의 양태에서는, 상기한 유전자 치료요법 벡터는 HSV일 것이다. HSV가 매력적인 벡터로 생각되게 하는 요인은, HSV의 게놈 크기 및 조직화이다. HSV는 크기가 크기 때문에, 다중 유전자 또는 발현 카세트의 혼입이 크기가 작은 기타의 다른 바이러스 시스템에 비해 문제가 작다. 또한, 다양한 성능 (예를 들면, 강도, 일시성)을 가진 상이한 바이러스 조절 서열을 사용할 수 있기 때문에, 다른 시스템에 비해 더 큰 정도로 발현을 조절할 수 있다. 또한, HSV는 절단된 메시지 (spliced message)가 상대적으로 거의 적기 때문에 유전자 조작이 용이하다는 잇점이 있다. 또한, HSV는 상대적으로 조작이 용이하고 높은 역가로 성장시킬 수 있다.
물론, 바이러스 전달 시스템을 이용하는 경우, 바람직하지 않은 오염 물질 (예를 들면, 결함성 방해 바이러스 입자 또는 발열질(pyrogen)이 필수적으로 없을 정도로 충분하게 비리온 (virion)을 정제하여, 상기한 벡터 작제물을 수용하는 세포, 동물 또는 개체내에서 바람직하지 않은 반응이 유발되지 않도록 한다. 상기한 벡터를 정제하는 바람직한 방법에서는, 부양성 밀도 구배 (예를 들면, 세슘 클로라이드 구배 원심분리)를 사용한다.
I. 결합 및 작용 검정
본 발명은 동물 및 사람의 치료에 특히 유용하지만, 많은 실험실내 양태에서의 실질적인 사용을 포함한 많은 다른 특이적이고 실용적인 용도를 가지고 있다. 이러한 특정 용도는, 항체, 펩타이드 및 면역접합체의 특이적인 결합 특성과 관련된 것이다. 본 발명의 작제물 각각이 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 펩타이드 성분을 포함하고 있다는 점에서, 이들은 유용한 결합 검정을 포함하는 각종 결합 양태에서 사용될 수 있다.
부착된 제제로 인한 장점이 있으나, 이로 인해 결합 분석에 있어서 제1 항체 또는 펩타이드 부위의 유용성이 상실되는 것은 아니다. 따라서, 적합하게 유용한 결합 분석으로는, 본원에서 추가로 기재되어 있는 바와 같은, 면역 블롯, 웨스턴 블롯, 점 블롯, RIA, ELISA, 면역조직화학, 형광-활성화된 세포 분류(FACS), 면역침전법, 친화성 크로마토그래피 등의 당업계에서 공통적으로 사용되고 있는 기법들이 포함된다.
소정의 표준 결합 검정은, 면역 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA 및 관련된 검정법에서 사용되고 있는 것과 같이, 항원을 고체 지지 매트릭스 (예를 들면, 니트로셀룰로즈, 나일론 또는 이의 배합)에 고정시키는 검정법이다. 다른 중요한 검정은, 본 발명의 성분들을 사용하여 세포 표면에 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질을 지닌 세포를 검정하는, 세포를 사용하는 것들이다. 이러한 검정은 예를 들면, 약물 설계에 관한 임상전 시험, 작용 메카니즘의 시험 및/또는 배합 사용을 위한 치료제를 선택하는데 적용시킬 수 있다.
추가의 시험관내 검정은 비정상적인 세포 활성화 및/또는 세포사멸과 관련한 질병의 진단시 유용하며, 여기서, 세포 표면에서 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질의 존재에 대한 시험은 금방-얼린(FRESH-FROZEN) 및 포르말린-고정된, 파라핀-매봉된 조직 블락과 함께 면역조직 화학에서; 형광 활성화된 세포 분류; 유동 혈구계산 및 유동 마이크로플루오로메트리(flow microfluorimetry)에서 사용될 수 있다.
본 발명의 작제물은 면역침전법, 이특이적 항체의 경우 동시에 하나 이상의 항원의 1 단계의 신속한 정제를 포함하는 친화성 크로마토그래피와 같은 항원 정제 양태, 및 본원에 제시된 정보를 제공하는 당해 분야의 숙련가에게 공지될 많은 다른 결합 검정에서 추가의 실제적인 용도를 지닌다.
본 발명 항체의 또 다른 실용적인 용도는, 많은 시험관내 및 생체외 검정 및 시스템을 포함하는 기능성 검정에서의 대조군로서의 사용이다. 본 발명의 항체, 펩타이드 및 접합체의 결합 및 작용 특성은 본원에 기술된 바와 같이 특히 특이적이므로, 이러한 대조군으로서의 용도는 실질적으로 매우 중요하다. 본 발명의 이러한 실용적인 사용으로서 얻을 수 있는 잇점을 가지는 검정으로는, 예를 들면, 세포 표면에서 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질의 검출에 관한 검정을 포함한다. 또한, 이러한 검정 시스템들은, 특성이 잘 정의된 생물 물질의 제공이 특히 중요한, 실험실내 또는 생체외 약물 스크리닝 검정으로 개발될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 작제물은 유사하거나, 균등하거나 개선된 결합 특성을 갖는 소분자의 선택시, 예를 들면, 약물 스크리닝 및 개발시 양성 대조군으로서 사용된다.
J. 약제학적 조성물
본 발명의 치료제는 일반적으로 약제학적 조성물로 제형화될 것이다. 이러한 약제학적 조성물은 생물학적 또는 치료학적 유효량의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질중에 용해되거나 분산된 본 발명의 제 1 치료제 하나 이상을 포함할 것이다. 배합 치료요법 또한 고려되며, 동일한 유형의 직면한 약제학적 조성물은 단일 및 배합 의약 둘다를 위해 사용할 수 있다.
용어 "약제학적 또는 약리학적으로 허용가능한"은, 동물 또는 사람에게 적합하게 투여된 경우에 부작용, 알레르기 반응 또는 기타의 다른 바람직하지 않은 반응이 발생되지 않는 분자체 및 조성물을 의미한다. 수의용으로서의 용도도 본 발명에 포함되며, "약제학적으로 허용가능한" 제형에는 임상 용도용 및/또는 수의 용도용 제형이 모두 포함된다.
본원에서의 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"에는, 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수-지연제 등이 포함된다. 약제학적 활성 물질을 위한 상기한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 기존의 매질 및 제제가 활성 성분과 병행할 수 없는 경우를 제외하고는, 치료 조성물에 서 이의 사용을 고려할 수 있다. 사람에게 투여하는 경우, FDA 사무국의 생물 표준에서 요구하고 있는 멸균성, 발열성, 일반적인 안전성 및 순도 기준을 충족하도록 제제를 제조하여야 한다. 또한, 상기 조성물에 보충적인 활성 성분을 첨가할 수도 있다.
"단위 용량" 제형은, 특정 시간 전달에 맞게 투여되는 성분의 투여량(dose) 또는 아-투여량(sub-dose)을 함유하는 제형이다. 예를 들어, 예시적인 "단위 용량"은, 1일 투여량 또는 단위이거나, 1일 아-투여량, 또는 1주 투여량 또는 단위이거나, 1주 아-투여량 등을 포함하는 제형이다.
J1 . 주사 제형 ( Injectable Formulations )
본 발명의 치료제는 특히 종양 치료를 위해 비경구 투여용 {예를 들면, 정맥 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 경피 주사 또는 기타 투여 경로 (종양 또는 질병 부위에 연동 투여 및 직접 점적 (강내 투여)을 포함)를 통한 주사용}으로 대부분 제형화 될 것이다. 활성 성분으로서 상기 항체 또는 면역접합체 또는 펩타이드 접합체를 함유하는 수성 조성물의 제조는 본원의 기재에 근거하여 당업자들에게 잘 알려져 있을 것이다. 통상적으로, 상기한 조성물은 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있으며; 주사 이전에 액체를 첨가하여 용액 또는 현탁액을 제조하기에 적합한 고형 형태로서 제조될 수 있으며; 에멀젼 형태로 제조될 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 제형에는, 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함한 제형; 및 멸균 주사 용액 또는 분산액을 즉석으로 제조하기 위한 멸균 분말이 포함된다. 이러한 모든 경우에 있어서, 주입가능성 (syringability)가 존재하는 정도에서 상기 제형들은 멸균되어 있고 및 유액성이어야 한다. 제조 및 보관 조건하에서 안정하여야 하며, 미생물 (예를 들면, 세균 및 진균)의 오염 활성에 대해 보존되어야 한다.
치료제는, 중성 또는 염 형태의 멸균 수성 조성물로 제형화될 수 있다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로서의 용액은, 계면 활성제 (예를 들면, 하이드록시프로필셀룰로즈)와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염으로는, 산 부가염 (상기 단백질의 유리 아미노 그룹으로 형성) 및 무기산 (예를 들면, 염산 또는 인산) 또는 유기산 (예를 들면, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등)으로 형성된 염이 포함된다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은, 무기 염기 (예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철) 및 유기 염기 (예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등)로부터 유도될 수 있다.
적합한 담체로는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 수성 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 및 분산 매질이 포함된다. 많은 경우, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제(isotonic agent)를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 피복제 (예를 들면, 레시틴)의 사용, 분산의 경우 필요로 하는 입자 크기의 유지 및/또는 계면 활성제의 사용을 통해, 적합한 유동성(fluidity)을 유지할 수 있다.
통상적인 저장 및 사용 조건하에서, 상기한 모든 제제들은 미생물의 성장을 방지하기 위해 방부제를 함유하여야 한다. 다양한 항세균제 및 항진균제 (예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등)를 사용하여 미생물의 작용을 방지할 수 있다. 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 사용하여 주사용 조성물의 지속적인 흡수를 가능하게 할 수 있다.
제형 이전 또는 제형 후, 치료제를 광범위하게 투석시켜, 목적하지 않는 저분자량의 분자를 제거하고/하거나, 적합한 경우에는 목적하는 비히클로 보다 용이하게 제형화하기 위해 동결건조시켜야 한다. 상기한 기타의 성분을 가지고 있는 적합한 용매 중에 필요한 용량의 활성 성분을 혼입한 후에 여과 멸균시켜, 주사용 멸균 용액을 제조한다. 일반적으로, 기본 분산 매질 및 상기한 필수적인 기타의 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 각종 멸균 활성 성분을 혼입함으로써, 분산제를 제조한다.
주사용 멸균 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우 바람직한 제조 방법은, 활성 성분 분말 및 미리 멸균 여과된 용액으로부터의 바람직한 추가의 성분을 생산하는, 진공 건조 기법 및 동결 건조 기법이다.
일반적으로, 본 발명에 따른 적합한 약제학적 조성물은, 목적하는 용도에 따라 최종 농도 범위를 조정하기 위한 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제 (예를 들면, 멸균 수용액)와 혼합된 양의 치료제를 포함한다. 일반적인 제조 방법은 하기 문헌에 예시된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다 {참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. Mack Publishing Company, 1980 (본원에 참조문헌으로 인용됨)}. 사람에게 투여하는 경우, FDA 사무국의 생물 표준에서 요구하고 있는 멸균성, 발열성, 일반적인 안전성 및 순도 기준을 충족하도록 제제를 제조하여야 한다. 제형화한 후, 치료제를 용량 제형과 병행가능한 방식으로 투여하고, 치료학적으로 효과적인 양을 사용하여 투여한다.
J2 . 지속방출형 제형
제형은 다양한 투여 형태 (예를 들면, 상기한 주사용 용액 형태)로 용이하게 투여되며, 기타의 약제학적으로 허용가능한 형태 (예를 들면, 정제, 필제, 캡슐제 또는 경구 투여용 고체, 좌제, 페사리제, 비강 용액제 또는 분무제, 에어로졸제, 흡입제, 국부 제형, 리포좀 형태 등)도 사용가능하다. 투여 제형의 유형은 치료할 질병 또는 질환에 따라 달라진다.
약제학적 "서방형" 캡슐 또는 "지속방출형" 조성물 또는 제제를 사용할 수 있다. 일반적으로, 서방형 제형은 오랜 기간에 걸쳐 연장된 수준의 약물을 전달하도록 설계되며, 본 발명에 따른 치료제의 전달에 사용할 수 있다. 통상적으로, 서방형 제형은 질병 부위 (예를 들면, 종양 또는 바이러스 감염부위) 근처에 전달된다.
지속 방출형 제제 중 적합한 예로는, 치료제를 함유하는 고형 소숫성 중합체로 된 반투과성 매트릭스를 포함하며, 여기서, 매트릭스는 성형 제품 형태 (예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐)이다. 서방성 매트릭스의 예로는, 폴리에스테르; 하이드로겔 (예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)); 폴리락티드 (예를 들면, 미국 특허 제3,773,919호); L-글루탐산 및 γ에틸-L-글루타메이트와의 공중합체; 분해불가능한 에틸렌-비닐 아세테이트; 분해가능한 락트산-글리콜산 공중합체 [예를 들면, Lupron DepotTM (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트를 포함하는 주사용 마이크로스피어)]; 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다.
에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상동안 분자가 방출될 수 있도록 하는 반면, 특정의 하이드로겔 (hydrogel)은 이보다 짧은 기간동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 체내에서 장기간 동안 머무르는 경우, 이들은 37℃에서 습기에 노출되기 때문에 변성되거나 응집되어 생물학적 활성의 감소 및/또는 면역원성의 변화를 가져올 수 있다. 관련된 메카니즘에 따라 안정화시키는 바람직한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 응집 메카니즘이 티오-디설파이드 상호교환을 통해 분자간 S-S 결합을 형성시키는 경우, 설프하이드릴 잔기를 변경시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 적합한 첨가제를 사용하여 습기 함유량을 조절하고, 특이적인 중합체 매트릭스 조성물을 발생시키는 등을 통해 안정화시킬 수 있다.
J3 . 리포좀 ( Liposomes ) 및 나노 입자 ( Nanocapsule )
소정의 양태에서는, 치료제와 함께 리포좀 및/또는 나노 입자를 사용할 수 있다. 리포좀의 제형 및 사용에 대해서는 아래에서 요약되어 있는 바와 같이 당업자들에게 일반적으로 잘 알려져 있다. 본 발명은 하기 기술된 항체, 리포좀 및 화학치료제의 특정 배합물을 제공한다. 또한, 리포좀 제형은 전체 발명의 치료제중 어느 것의 통상적인 성분으로서 사용될 수 있다.
리포좀은, 수성 배지에서 분산된 인지질에서 형성되며, 다중라멜라 집중 이중층 소포 [multilamellar concentric bilayer vesicle, 다중라멜라 소포 (MLV)로도 부름]를 바로 형성된다. 일반적으로, MLV의 직경은 25nm 내지 4㎛이다. MLV를 초음파처리하면, 중심부에 수용액을 함유한 직경 200 내지 500Å의 단일라멜라 소낭 (SUV)이 형성된다.
인지질은, 지질:물의 몰비에 따라, 물에 분산된 때에 리포좀이 아닌 다양한 구조를 형성할 수 있다. 낮은 비율에서는, 리포좀이 바람직한 구조이다. 리포좀의 물리적 특징은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온에 따라 달라진다. 리포좀은 이온 물질 및 극성 물질에 대해서는 투과성이 낮으나, 높은 온도에서 투과성을 크게 변화시키는 상 변이를 거친다. 상 변이(phase transition)는, 겔 상태로 알려져 있는 밀집되어 패키지된 질서정연한 구조에서 유체 상태로 알려져 있는 느슨하게 패키지된 질서정연한 정도가 낮은 구조로 변화되는 것을 포함한다. 상 변이는 특정의 상 전이 온도에서 발생하며, 이로 인해 이온, 당 및 약물에 대한 투과성이 증가된다.
리포좀은 4가지의 상이한 메카니즘을 통해 세포와 상호작용한다: 망막내피 시스템의 식세포 (예를 들면, 대식세포 및 호중구)에 의한 엔도사이토시스 (endocytosis); 비특이적인 약한 소수성 힘 또는 정전기력에 의하거나, 세포 표면 성분과의 특이적인 상호작용에 의한, 세포 표면으로의 흡착(adsorption); 리포좀의 지질 이중막을 혈장막으로 삽입하고 이와 동시에 리포좀의 내용물을 세포질로 방출시킴으로써, 혈장 세포막과의 융합; 및 리포좀 내용물의 어떠한 연합과는 상관없이, 리포좀 지질의 세포막 또는 세포내막으로의 이동 또는 반대로의 이동. 하나 이상의 메카니즘이 동시에 작동할 수 있으나, 리포좀 제형을 다양하게 함으로써 작동하는 메카니즘을 변경시킬 수 있다.
일반적으로, 나노 캡슐은 안정되고 재생가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과다 부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미세 입자 (크기 약 0.1㎛)는 생체내에서 분해될 수 있도록 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이러한 요건을 충족하는 생분해가능한 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노 입자는 본 발명에서 사용할 수 있으며, 이러한 입자는 용이하게 제조할 수 있을 것이다.
J4 . 안과용 제형( Ophthalmic Formulations )
눈의 많은 질병, 특히 혈관형성 성분을 지닌 것들은 본 발명에 의해 치료될 수 있다. 예를 들어, 하기에 기술한 바와 같은, 안구 신생혈관 질병, 노화 관련 안구 퇴화, 당뇨병성 망막증, 조기 망막병증, 각막 이식 거부, 신생혈관 백내장, 레트로렌탈 섬유아종 및 각막 신생혈관 또는 망막/코로이달 신생혈관화와 관련된 기타 질병이 있다.
본 발명의 치료제는 따라서, 초자체내 및/또는 수정체내 투여를 포함한 안과용 용액으로서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물의 제조에 사용하기에 유익할 수 있다. 상기한 질환 및 기타의 질환을 치료하는 경우, 치료제는, 기존의 약제 관행에 따라 안과용 제제 형태로 치료를 받아야할 필요가 있는 환자의 눈에 투여된다 {참조: 예를 들면, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pp.1488-1501 (Mack Publishing Co., Easton, PA)}.
안과용 제제는, 약제학적으로 허용가능한 용액, 현탁액 또는 연고 중 약 0.01 내지 약 1중량% (바람직하게는, 약 0.05 내지 약 0.5 중량%)의 농도의 치료제를 함유한다. 사용되는 특정 화합물, 치료할 환자의 상태 등에 따라 농도는 어느 정도 변하게 되며, 치료를 담당하는 자가 각 개체에 가장 적합한 농도를 결정할 것이다. 바람직하게는, 안과용 제제는, 예를 들면 방부제, 완충제, 긴장도(tonicity) 제제, 항산화제 및 안정화제, 비-이온성 습윤제 또는 투명화제, 점도 강화제 등과 같은 추가의 성분들을 필요로하는 경우에 함유하는 멸균 수용액 형태일 것이다.
이러한 용액에 사용하기에 적합한 방부제에는, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로로부탄올, 티메로살 등이 포함된다. 적합한 완충제로는, 붕산, 중탄산나트륨 및 중탄산칼륨, 붕산나트륨 및 붕산칼륨, 탄산나트륨 및 탄산칼륨, 아세트산나트륨, 이인산나트륨 등이 포함되며, 완충제의 양은 pH를 약 6 내지 8 (바람직하게는, pH 약 7 내지 7.5)을 유지하기에 충분한 양으로 한다. 적합한 긴장도 제제는 덱스트란 40, 덱스트란 70, 덱스트로즈, 글리세린, 염화칼륨, 프로필렌 글리콜, 염화나트륨 등이며, 안구용 용액의 염화나트륨 당량은 0.9±0.2%이 되도록 한다.
적합한 항산화제 및 안정화제에는, 나트륨 바이설파이트, 나트륨 메타바이설파이트, 나트륨 티오설파이트, 티오우레아 등이 포함된다. 적합한 습윤제 및 투명화제에는, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 282 및 틸록사폴이 포함된다. 적합한 점도 강화제에는, 덱스트란 40, 덱스트란 70, 젤라틴, 글리세린, 하이드록시에틸셀룰로즈, 하이드록스메틸프로필셀룰로즈, 라놀린, 메틸셀룰로즈, 페트롤라툼, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카복시메틸셀룰로즈 등이 포함된다. 안과용 제제는 통상의 방법 (예를 들면, 점적 형태 또는 안구용 용액으로 눈을 씻는 방법)에 따라 치료를 필요로 하는 환자의 눈에 국소 투여될 것이다.
J5 . 국소용 제형( Topical Formulation )
넓은 의미로는, 국소 투여용 제형은 구강(볼내) 및 피부를 통한 전달을 포함한다. 또한, "국소 전달 시스템"은 전달할 성분을 함유하는 경피용 패치를 포함한다. 또한, 피부를 통한 전달은, 원하는 경우, 이온삼투요법 (iontophoresis) 또는 전자 전달법을 통해 이루어질 수 있다.
구강내 국소 투여용으로 적합한 제형으로는, 향기가 있는 대개 수크로즈 및 아카시아 또는 트라가칸트 기재 (basis)하에 상기 성분을 포함하는 로젠지 (lozenge); 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로즈 및 아카시아와 같은 불활성 기재하에 활성 성분을 포함하는 패스틸 (pastille); 및 적합한 액체 담체내에 투여될 성분을 포함하는 구강세척제가 포함된다.
피부-국소 투여용으로 적합한 제형으로는, 약제학적으로 허용되는 담체내에 투여될 성분을 포함하는 연고, 크림, 젤 및 패이스트가 포함된다. 연고, 크림 및 젤과 같은 국소 투여용 치료제의 제형으로는, 당업계에 잘 알려져 있는, 유성 또는 수용성 연고-기재(basis) 제제가 포함된다. 예를 들면, 이러한 조성물은 식물성 오일, 동물성 지방, 보다 바람직하게는 석유에서 수득한 반고체 탄수화물을 포함할 수 있다. 사용되는 특정 성분은, 백색 연고, 노란색 연고, 세틸 에스테르 왁스, 올레산, 올리브 오일, 파라핀, 바셀린, 백색 바셀린, 경랍, 전분 글리세라이트, 백색 왁스, 노란색 왁스, 라놀린, 무수 라놀린 및 글리세릴 모노스테아레이트를 포함할 수 있다. 또한, 글리세롤 에테르 및 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥실 40 스테아레이트 및 폴리소르베이트를 포함한, 다양한 수용성 연고 기재가 사용될 수 있다.
직장 투여용 제형은, 예를 들면 코코아 버터 또는 살리실레이트를 포함하는 적합한 기재를 갖춘 좌제 형태일 수 있다. 질 투여용 제형은, 당업계에서 적합한 것으로 알려져 있는 담체와 같은 활성 성분을 함유하는, 페사리, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 거품 또는 분무식 제형 형태일 수 있다.
J6 . 비강 제형
비강 및 호흡기 통로를 통한 국소 전달은, 다양한 상태를 치료하는 데에, 특히 본 발명의 항-바이러스 치료에 사용하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이러한 전달 경로는 전신성 순환계로 제제를 전달하는 데에도 적합하다. 따라서, 비강 용액, 스프레이, 에어로졸 및 흡입물과 같은 비강 투여에 적합한 담체내에 활성 성분을 함유하는 제형은 본 발명의 범위내에 속한다. 담체가 고체인 경우, 상기 제형은 입자 크기가 예를 들면 20 내지 500 미크론인 조악한 분말을 포함하는 데, 이러한 분말의 투여는 예를 들면 분말 용기를 코 가까이 대고 분말 용기로부터 빨리 흡입하여 비강 통로를 통해 흡입함으로써 이루어진다.
담체가 액체인 적합한 제형은 비강 투여에 유용하다. 통상적으로, 비강용 용액은 점적 또는 스프레이 형태로 비강 통로로 투여되도록 설계된 수용액이며, 대부분 비강 방출과 유사하여 정상적인 섬모 활동이 유지되도록 제조된다. 따라서, 비강용 수용액은 일반적으로 등장액이거나 약간 완충되어 pH 5.5 내지 6.5를 유지토록 한다. 또한, 안과용 제제에서 사용된 것과 유사한 항-미생물 방부제 및 필요한 경우에 적합한 약물 안정화제를 포함할 수 있다. 다양한 비강용 제제가 시판되고 있으며, 예를 들면 항생제 및 항-히스타민제가 포함되며, 천식 예방에 사용되고 있다.
흡입물 및 흡입제는, 약물 또는 화합물을 환자의 기관지로 전달하도록 설계된 약제학적 제제이다. 증기 또는 연무 (mist)를 투여하면 손상 부위에 도달한다. 또한, 이러한 경로를 사용하여 제제를 전신성 순환계에 전달할 수 있다. 비강 또는 구강 호흡 통로를 사용하여 흡입물을 투여할 수 있다. 흡입 용액의 투여는, 점적이 충분히 미세하고 크기가 일정하여 연무가 기관지에 도달하는 경우에만 효과적이다.
흡입물로도 알려져 있으며 호흡물 (insufflation)로도 종종 불리는 다른 생성물 그룹은, 액화된 가스 추진체내에 약물 용액 또는 현탁액을 가지는 특별 전달 시스템 (예를 들면, 약제학적 에어로졸)을 사용하여 호흡기 통로로 이동되는 미세한 분말 또는 액체 약물을 포함한다. 적합한 밸브 및 구강 적응기를 통해 방출된 때, 환자의 호흡기 통로로 계량된 양의 흡입물을 추진한다. 입자 크기가 이러한 유형의 제제의 투여에 가장 중요하다. 폐강내로 투과하기 위한 최적의 입자 크기는 0.5 내지 7㎛인 것으로 보고되어 있다. 미세한 연무는 가압 에어로졸에 의해 생산되어, 이의 사용은 잇점이 있는 것으로 생각된다.
K. 진단 및 치료용 키트
또한, 본 발명에서는 본 발명의 치료 방법, 배합 치료 및/또는 영상화 및 치료 양태에서 사용하기 위한 적어도 본 발명의 제 1 치료제, 예를 들면, 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 항체, 면역접합체 또는 펩타이드 접합체를 포함하는 진단 및 치료용 키트를 제공한다. 일반적으로, 이러한 키트는, 적어도 제 1의 적합한 용기(또는 용기 수단)내에, 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 하나 이상의 치료제, 항체, 면역접합체 또는 펩타이드 접합체의 약제학적으로 허용가능한 제형을 함유한다. 또한, 이러한 키트는 예를 들면, 임상전, 임상 및/또는 수의학적 양태에서 사용하기 위한 수기 또는 전자 지침서를 포함할 수 있다.
키트는 또한 배합 치료요법 및/또는 진단 및 영상화를 위한 것들을 포함하는, 기타 조성물, 약제학적으로 허용되는 제형 및 제2의 생물학적 및 치료제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이러한 키트는 하나 이상의 범위의 화학치료제, 방사선 치료제 또는 항-혈관형성제, 항-종양제, 항-종양 혈관화 또는 항-종양 기질 항체, 면역독소 또는 응고리간드, 항-바이러스제 및/또는 진단 성분 또는 제제를 함유할 수 있다. 배합 치료요법에 사용하고/하거나 진단 및 영상화에 사용하기 위한 수기 또는 전자 지침서가 또한 포함될 수 있다.
상기한 키트는, 추가 성분을 포함하거나 포함하지 않는, 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 제1 항체, 면역접합체 또는 펩타이드 접합체를 함유하는 단일 용기를 가지거나; 목적하는 각각의 제제를 함유하는 상이한 용기를 가질 수도 있다. 배합 치료제가 제공되는 경우, 단일 용액은 몰 당량 배합 또는 하나의 성분이 다른 성분보다 과량으로 예비-혼합될 수 있다. 또는, 환자에게 투여하기 이전에, 키트는 본 발명의 제 1 치료제 및 제 2 생물학적 또는 치료제(예: 제 2 항암제 또는 항-바이러스제)를 키트의 구별가능한 용기내에 별도로 유지시킬 수 있다.
진단 성분은 하나 이상의 치료제를 포함하는 제1 용기 또는 다른것과 구별되는 적어도 제2의 용기내에 대부분 유지될 것이다. 진단 키트는 주요 치료제로서 동일한 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 표지된 항체 또는 펩타이드, 또는 치료될 질병을 진단하는데 적합한 다른 제제를 포함할 수 있다. 당해 키트는 시험관내에서 사용하기 위한 또는 생체내에서 사용하기 위한 진단 제제, 또는 이러한 제제 둘다를 포함할 수 있다. 당해 키트는 예를 들면, 전 임상, 임상 및/또는 가축 진단 양태에서 사용하기 위한 수기 또는 전자 지침을 포함할 수 있다.
항체 용액 또는 재구성용 분말이 바람직하다고 해도, 시험관내 면역검출을 위해 항체를 미세역가 플레이트의 웰과 같은 고체 지지체에 결합시킬 수 있다. 면역검출 키트는 바람직하게는 적어도 제1의 면역검출 시약을 포함한다. 당해 키트의 면역검출 시약은 생체내에서 사용되는 것과 같은 제공된 항체와 연합하거나 이에 연결되는 검출가능한 표지를 포함하는 각종 형태중 어느 하나를 취할 수 있다. 제2 결합 리간드와 연합하거나 이에 부착된 검출가능한 표지가 또한 고려될 수 있다. 예시적인 제2 리간드는 제1 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 항체이다.
본 발명의 키트에 사용하기 위한 추가의 적합한 면역검출 시약은 제1 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 항체와 제2 항체에 대해 결합 친화성을 갖고 검출가능한 표지에 연결된 제3 항체를 포함한다. 다수의 예시적인 표지는 당해 분야에 공지되어 있으며 이러한 표지는 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다. 당해 키트는 완전히 접합된 형채, 중간 형태, 또는 키트 사용자에 의해 접합된 별개의 잔기의 항체-표지 접합체를 함유할 수 있다. 이러한 영상 키트는 바람직하게는 생체내 검출가능한 표지에 이미 부착된 표적화제 또는 항체를 바람직하게는 포함할 것이다. 그러나, 표지 및 부착 수단은 별도로 공급될 수 있다.
진단 키트의 형태는 또한 표지되거나 표지되지 않은, 검출 검정용 표준 커브를 제조하는데 사용될 수 있는 것으로서, 적합하게 분취된 생물학적 조성물과 같은 대조군 제제를 추가로 포함할 수 있다. 당해 키트의 성분들은 수성 매질 또는 동결건조된 형태로 패키징될 수 있다.
상기한 키트의 성분들이 하나 이상의 액체 용액내에 제공되는 경우, 액체 용액은 수용액인 것이 바람직하며, 멸균 수용액이 특히 바람직하다. 하지만, 상기한 키트의 성분들이 무수 분말 형태로서 제공될 수도 있다. 제제 또는 성분들이 무수 분말로서 제공되는 경우, 적합한 용매를 첨가하여 이 분말을 재구성시킬 수 있다. 이러한 용매는 키트내 다른 용기내에 제공될 수도 있다.
일반적으로, 치료 및 전달 키트의 용기로는, 치료제 또는 다른 바람직한 제제가 위치하고, 바람직하게는 적합하게 일정 분량이 포함되는, 하나 이상의 바이알, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 기타의 용기 수단이 포함된다. 2개 이상의 별개의 성분이 바람직한 경우, 상기한 키트는 2개 이상의 이러한 용기를 포함할 것이다. 또한, 상기 키트는 약제학적으로 허용가능한 멸균 완충액 또는 기타의 희석제를 함유하기 위한 제3 또는 제4 용기 수단을 포함할 수 있다.
또한, 상기한 키트는, 치료제를 동물 또는 환자에게 투여하기 위한 수단 (예를 들면, 하나 이상의 바늘 또는 주사기, 눈 점적기, 피펫 또는 기타의 유사 장치)을 함유할 수 있으며, 이러한 수단으로부터 상기 제형이 동물에게 주사되거나 체내의 질병 부위에 도입될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는, 목적하는 바이알 및 기타의 장치가 위치하고 유지되는, 통상적으로 밀집된 구획내에 바이알 (또는 이와 유사한 것) 및 기타의 성분을 함유하는 수단 (예를 들면, 주사 또는 송풍 성형된 플라스틱 용기)을 포함한다.
L. 면역검출 및 영상화
본 발명은 시험관내 및 생체내 진단 및 영상화 방법을 또한 제공한다. 이러한 방법은 예를 들면, 혈관형성 질병 및 바이러스 감염 및 바람직하게는 종양 치료 및 영상화 방법에 관련된 진단, 예후 및/또는 영상화 정보에서 사용하기 위해 적용가능하다. 본 발명의 방법은 시험관내 진단 시험을 포함하는데, 예를 들어, 여기서, 샘플은 비침입적으로 수득되고 바람직하게는, 고 배출 검정 및/또는 애매한 및 구조에서의 임상 진단이 요구되는 경우에 바람직하다. 시험관내 진단 및 영상화 분야에서, 본 발명의 항체 및 펩타이드는 하나 이상의 검출가능한 제제에 연결되어 임의로 처리전 제1 단계로서 진단 부위 또는 종양의 영상을 형성하는데 사용된다.
L1 . 면역검출 방법 및 키트
본 발명은 아미노인지질 및 음이온성 인지질을 결합하거나, 정제하거나, 일반적으로 정량화하거나 검출하기 위한, 예를 들면, 활성화된 세포사멸성 세포 및 관련 질병을 진단하는데 사용하기 위한 면역검출 방법에 관한 것이다. 9D2 및 3G4(ATCC 4545)와 같은 본 발명의 항체를 사용하여 분리된 목적 샘플, 생검 또는 면봉(sweb) 및/또는 균질화된 조직 샘플에서 아미노인지질 및 음이온성 인지질을 생체내(하기 참조) 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 면역검출 방법은 명백한 진단 용도를 지니지만 항원 샘플의 역가와같은 비-임상 샘플에 대한 적용도 지닌다.
각종의 유용한 면역검출 방법의 단계는 본원에 참조로 상세하게 인용된 문헌(참조: Nakamura et al., 1987)과 같은 과학 문헌에 기술되어 있다. 일반적으로, 면역결합 방법은 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질을 함유하는 것으로 예측되는 샘플, 바람직하게는 세포 표면에 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질을 지닌 것으로 예측되는 세포를 수득하는 단계, 및 당해 샘플을 9D2 또는 3G4(ATCC 4545)와 같은 본 발명의 항체와 면역 복합체를 형성시키기에 효과적인 조건하에 접촉시키는 단계를 포함한다. 이후에 결합 공정동안 형성된 면역 복합체를 검출하고 바람직하게는 정량화한다.
분석한 샘플은 실험실에서 특정의 시험 조건에 노출된 세포와 같은 세포 샘플일 수 있다. 당해 샘플은 또한 동물 또는 환자, 예를 들면, 하나 이상의 세포 유형의 활성화 또는 세포사멸과 연관된 질병을 가진 것으로 예측되는 것들로부터의 생물학적 샘플일 수 있다. 이러한 샘플은 조직 단편 또는 표본, 생검, 면봉 또는 도말 시험 샘플, 균질화된 조직 추출물 또는 이들의 분리되거나 정제된 형태이 수 있다.
면역 복합체 (1차 면역 복합체)를 형성하기에 효과적인 조건하에서 충분한 시간 동안 상기 항체와 선택된 생물학적 샘플을 접촉시키는 것은, 항체를 상기 샘플에 단순히 첨가하고, 상기 항체가 예를 들면, 존재하는 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질과 면역 복합체를 형성하기에 충분한 시간동안 상기 혼합물을 항온처리하는 것이다. 이후, 조직 분절, 또는 ELISA 플레이트와 같은 샘플-항체 조성물을 세척하여 비-특이적으로 결합된 항체종을 제거하여, 상기 1차 면역 복합체내에 특이적으로 결합된 항체만을 검출할 수 있다.
*면역 복합체 형성여부의 검출은 당업계에 널리 알려져 있으며, 다양한 방법을 통해 수행할 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법들은 표지 또는 마커 (예를 들면, 당업계에 알려져 있는 방사성, 형광성, 생물학적 또는 효소성 태그 또는 표지)의 검출에 기초한다. 이러한 표지의 사용과 관련된 미국 특허로는, 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,227,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호 (각각 본원에서 참조문헌으로 인용됨)가 포함된다. 색원체 기질과 접촉하자마자 채색된 생성물을 생산하는 효소의 사용이 일반적으로 바람직하다. 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 2차 결합 리간드 (예를 들면, 2차 항체 또는 바이오틴/아비딘 리간드 결합 배열)를 사용할 수도 있다.
검출방법에 사용되는 9D2 및 3G4(ATCC 4545)와 같은 본 발명의 항체는 검출가능한 표지에 연합될 수 있으며, 이 표지를 간단히 검출하여, 조성물내의 1차 면역 복합체의 양을 측정할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 2차 결합 리간드를 이용하여 상기한 1차 면역 복합체를 검출한다. 이 경우, 2차 결합 리간드는 검출가능한 표지에 연결할 수 있다. 2차 결합 리간드가 항체인 경우도 종종 있으므로, "2차 항체"로도 불릴 수 있다. 2차 면역 복합체가 형성되기에 효과적인 조건하에서 충분한 시간 동안, 상기한 1차 면역 복합체를 상기 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 그리고 나서, 2차 면역 복합체를 일반적으로 세척하여 비특이적으로 결합된 2차 항체 또는 리간드를 제거하고, 2차 면역 복합체내에 잔류하는 표지를 검출한다.
다른 방법에서는, 2개의 단계를 이용하여 1차 면역 복합체를 검출한다. 제1 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 제2 결합 리간드 (예를 들면, 항체)를 사용하여, 상기한 바와 같이 2차 면역 복합체를 형성한다. 세척 후, 면역복합체(3차 면역 복합체)가 형성되기에 효과적인 조건하에서 충분한 시간 동안, 2차 면역 복합체를 2차 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 제3 결합 리간드와 접촉시킨다. 3차 리간드 또는 항체가 검출가능한 표지에 결합함으로써, 형성된 3차 면역 복합체를 검출할 수 있다. 이러한 시스템은, 원하는 경우, 신호 증폭을 제공할 수 있다.
임상적 진단 또는 모니터링은 각종 질환의 환자, 특히 세포 표면에 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질 노출이 증가된 것과 관련된 질병을 지닌 환자에 적용할 수 있다. 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질의 검출, 또는 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질의 수준에 있어서의 증가는, 정상 대상체로부터의 상응하는 생물학적 샘플에서의 수준과 비교하여, 이러한 질병을 지닌 환자의 지표이다..
하지만, 당업자들에게 알려져 있는 바와 같이, 상기한 임상 진단은 분리시의 방법에 기초한 것은 아니다. 양성 확인을 나타내는 바이오마커의 유의성있는 발현과 바이오마커의 낮은 수준 또는 배경 발현사이의 차이를 당업자들은 잘 알고 있다. 사실상, 배경 발현 수준 (background expression level)은 "컷-오프(cut-off)"를 형성하여, 이러한 수준 이상으로 염색되는 것이 유의성있는 또는 양성으로 계측된다.
L2 . 생체내 영상화
본 발명은 각종의 생체내 진단 및 영상화 양태를 제공한다. 본 발명의 특정 양태는 신규하고 놀랄 정도로 효과적인 생체내 진단 및 영상화용 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 새로운 항-PS 항체, 바람직하게는 9D2 또는 3G4(ATCC 4545) 항체 또는 유사 특성을 지니는 경쟁 항체의 하나 이상의 패널을 생체내 검출가능한 제제에 연결시켜 본 발명의 면역진단 접합체를 형성한다. 비록 항체가 당해 분야에서 중요한 발전을 이루었다 해도, 수득되는 면역진단제는 본 발명에 이르러 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질의 검출과 관련된 앞서 기술한 진단 또는 영상화 양태에서 사용할 수 있다.
이와 관련하여, 9D2 또는 3G4(ATCC 4545) 항체 또는 유사 특성을 지니는 경쟁 항체를 포함하는 본 발명의 항체를 포함하는 면역진단제는 특히, 혈관 혈전증, 폐 색전증, 심근경색, 동맥 섬유증, 프로스테틱 심혈관 물질과 관련된 문제, 발작 등과 같은 심장내 또는 근처혈관 색전증의 영상화에 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 조성물은 또한 예를 들면, 농양과 같은 상태, 망막증, 관절의 염증 및 동맥, 말초 혈관 및 중추 색전증과 같은 간 질병에서 활성화된 혈소판을 영상화하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 면역진단 조성물, 바람직하게는 9D2 또는 3G4(ATCC 4545) 항체 또는 유사 특성을 지니는 경쟁 항체를 포함하는 조성물은 또한 증가되거나 부적절한 세포사멸이 발생하는 각종 질병을 진단 및 영상화하는데 사용할 수 있으므로 세포사멸성 세포를 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 생체내 진단 및 영상화용의 신규 방법 영역에 제공되며, 이는 본원에 제공된 항체의 패널의 사용에 한정되지는 않는다. 예를 들어, PI, PA 및 PG와 같은 음이온성 인지질이 종양 혈관구조의 겁근가능하고 안정하게 표적가능한 마커라는 예측하지 못한 발견의 측면에서, 본 발명은 고형 종양의 혈관구조에 특이적으로 국재화할 PI, PA 또는 PG에 결합하는 면역진단제의 투여를 포함하는 종양의 진단 및 영상화 방법을 제공한다. 또한, 바이러스 감염된 세포를 본 발명에 이르러 검출할 수 있고, 바이러스 감염을 PS, PE, PI, PA 및 PG, 및 바람직하게는 PS 및 PE와 같은 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질에 결합하는 면역진단 접합체를 사용하여 진단할 수 있다.
본 발명의 생체내 영상화 조성물 및 방법은 영상화 등 또는 치료전 안전한 영상을 형성시키기 위해 신체내 부위를 예비 영상화하는데 사용할 수 있다. 바람직하게는, 영상화는 종양 영상화이다. 당해 조성물 및 방법은 또한 혈관형성 질병, 죽상경화증, 바이러스 감염을 포함하는 세포 활성화 및/또는 세포사멸을 포함하는 것들과 같은 아미노인지질 및 음이온성 인지질과 관련된 기타 질병 또는 상태, 및 진단 또는 예후 목적 또는 치료를 설계하기 위해 내부 영상이 바람직한 이러한 기타 상태를 영상화 및 진단하는데 적용할 수 있다.
이러한 양태, 항체 및 펩타이드, 바람직하게는 9D2 또는 3G4(ATCC 4545) 및 유사 항체와 같은 본 발명의 항체는 검출가능한 표지에 작동적으로 부착하거나, 연결되거나 또는 접합된다. "검출가능한 표지"는, 특정의 기능적 특성 또는 화학적 특성에 의해 검출할 수 있는 화합물 또는 원소이며, 이를 사용함으로써 이들이 부착된 성분을 검출할 수 있으며, 원하는 경우에는 정량화할 수 있다. 생체내 진단 프로토콜 또는 "영상화 방법"에 사용되는 항체 접합체에서, 비-침윤성 방법을 사용하는 검출할 수 있는 표지가 필요하다.
항체 및 결합 리간드에 부착하는 방법과 마찬가지로 {참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,021,236 및 제4,472,509호 (각각 본원에 참조문헌으로 인용됨)}, 많은 적합한 영상화 제제가 당업계에 알려져 있다. 소정의 부착 방법에서는, 상기 항체에 부착된 DTPA와 같은 유기 킬레이트화제 등을 이용하여 금속 킬레이트 복합체를 사용한다 {참조: 미국 특허 제4,472,509호}. 또한, 커플링 제제 (예를 들면, 글루타르알데히드 또는 페리오데이트)의 존재하에 모노클로날 항체와 효소를 반응시킬 수 있다. 상기한 커플링 제제 존재하에 또는 이소티오시아네이트와 반응시켜, 플루오레세인 마커를 가진 복합체를 제조한다.
검출가능한 표지의 예로는 파라마그네틱 이온이 있다. 이 경우, 적합한 이온으로는, 크로뮴 (III), 망간 (II), 철 (III), 철 (II), 코발트 (II), 니켈 (II), 구리 (II), 네오디뮴 (III), 사마륨 (III), 이테르븀 (III), 가돌리늄 (III), 바나듐 (II), 테르븀 (III), 디스프로슘 (III), 홀뮴 (III) 및 에르븀 (III)이 포함되며, 가돌리늄이 특히 바람직하다.
X선 영상화 같이 다른 양태에서 유용한 이온으로는, 란탄 (III), 금 (III), 납 (II) 및 특히 비스무스 (III)가 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다. 형광 표지로는 로다민, 플루오레세인 및 레노그라핀이 포함된다. 로다민 및 플루오레세인은 이소티오시아네이트 중간체를 통해 종종 결합된다.
방사성 동위원소를 진단용으로 사용하는 경우, 적합한 예로는 14탄소, 51크로뮴, 36염소, 58코발트, 구리76, 152Eu, 갈륨67, 3수소, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 인듐1 11, 철59, 32인, 레늄186, 레늄188, 75셀레늄, 35황, 테크네튬99 m 및 이테륨90이 있다. 125I가 소정의 양태에서는 종종 바람직하며, 99m테크네튬 및 인듐111은 낮은 에너지 및 적합성으로 인해 장기간 동안 검출하기에 종종 적합하다.
본 발명에서 사용할 방사성 표지된 항체 또는 펩타이드는 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 항체에 방사성 동위원소를 결합시키는 데에 사용될 수 있는 중간 기능성 그룹은, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 및 에틸렌 디아민테트라아세트산 (EDTA)이다.
또한, 모노클로날 항체는 요오드화나트륨 또는 요오드화칼륨 및 화학적 산화제 (예를 들면, 나트륨 하이포클로라이트) 또는 효소성 산화제 (예를 들면, 락토퍼옥시다제)와 접촉시켜 요오드화시킬 수 있다. 본 발명에 따른 항-종양 항체는, 리간드 교환 공정 {예를 들면, 주석 용액으로 페르테크네이트를 환원시킨 후, 환원된 테크네튬을 세파로즈 칼럼상에서 킬레이트화시키고, 상기 항체를 상기 칼럼에 접촉시키는 공정} 또는 직접적인 표지 기법 {예를 들면, 페르테크네이트, SNCl2와 같은 환원제, 나트륨-칼륨 패탈레이트 용액과 같은 완충액 용액 및 상기 항체를 항온처리시키는 방법}을 이용하여 테크네튬99 m으로 표지시킬 수 있다.
앞서 검출가능하게 표지된 항체 및 결합 리간드의 어떠한 유형도 영상화 단독을 위해서 또는 치료전 질병 부위 또는 종양의 영상을 형성하기 위해 본 발명의 영상화 양태에서 사용할 수 있다. 어떠한 방식으로든, 당해 방법은 일반적으로 비-침입적 방법으로 검출가능한 마커에 접합되는 항체 또는 결합 리간드의 진단학적 유효량을 동물 또는 환자에게 투여함을 포함한다. 항체- 또는 결합 리간드-마커 접합체는 종양 또는 종양 혈관계와 같은 질환 부위에서 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질을 발현하는 세포에 국재화되고 결합되기에 충분한 시간을 허용한다. 이후에, 환자는 검출 장치에 노출되어 검출가능한 마커를 동정하여, 질병 부위 또는 종양의 영상을 형성한다.
가돌리늄과 같은 핵자기 회전 공명 동위 원소는 핵자기 영상화 장치를 사용하여 검출하며; 테크니쿰99 m 또는 인듐111과 같은 방사활성 물질은 감마 신틸레이션 카메라 또는 검출기를 사용하여 검출한다. 미국 특허 제5,627,036호에는 또한 검출가능하게 표지된 작제물을 개개의 혈액 속으로 안전하고 효가적으로 도입시키는 것에 대한 추가의 안내, 및 예를 들면 감마 신틸레이션 카메라 또는 자기 공명 장치를 사용하여 검출가능하게 표지된 제제의 분포를 외삽적으로 측정하기 위한 수단을 제공할 목적으로 본원에서 참고문헌으로 구체적으로 인용된다.
영상화 양태를 위한 용량은 일반적으로 치료요법에 대해서는 적지만, 환자의 연령 및 체중에 좌우된다. 환자당 항체- 또는 결합 리간드-접합체를 약 0.1, 0.5 또는 약 1mg 내지 약 9 또는 10mg, 보다 바람직하게는 약 1mg 내지 약 5-10mg의 1회 투여량이 유용한 것으로 고려된다.
L3 . 암 치료요법용 대용 마커
생체내 진단 및 영상화에 관해서, 본 발명은 암 치료요법용 대용 마커로서 사용하기 위한 조성물 및 용도를 추가로 제공한다. 이러한 양태는 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 결합하는 항체의 용도, 가장 바람직하게는 생체내 검출가능한 제제에 결합되는 9D2 또는 3G4(ATCC4545) 항체 또는 경쟁 항체의 용도와 관련된다.
현재 사용되는 많은 항암 치료요법은 세포사멸 및 괴사를 유도한다. 아미노인지질 및 음이온성 인지질, 특히 PS는 예비-세포사멸성 및 세포사멸성 세포의 마커이다. 따라서, 적합한 항체, 바람직하게는 9D2, 3G4(ATCC4545) 또는 경쟁 항체를 사용한 영상화는, 예비-세포사멸성 및 세포사멸성 세포를 동정하는 데 사용되어 치료요법의 진행에 관한 정보를 제공한다. 이는 본원에서 사용된 "암 치료요법을 위한 대용 마커"가 의미하는 바이다.
본 발명의 항체, 바람직하게는 유사한 특성을 갖는 9D2 또는 3G4(ATCC 4545) 항체 또는 경쟁 항체를 포함하는 항체의 사용은 암 치료요법을 위한 대용 마커로서 특별한 잇점을 제공한다. 예를 들면, 예비-세포사멸성 세포를 동정하는 능력이 특히 유리하다. 항체의 특이성은 또한 의사에게 보다 의미있는 영상화 데이타를 제공하게 된다. 또한, 이러한 항체의 안전성 프로파일은 인상적이며 아넥신, 예를 들면, 응고와 관련된 결함으로 고생하는 아넥신에 비하여 잇점을 제공한다.
따라서, 상기한 생체내 진단 및 영상화 방법중의 어느 것도 암 치료요법이 진행중인 환자에서 단순히 사용함으로써 암 치료요법을 위한 대용 마커로서 예후적 용도로 채택할 수 있다.
M. 종양 치료
본 발명의 중요한 측면은 악성 종양 및 혈관화된 종양의 치료에 관한 것이다. 이는, 혈관형성이 더욱 중요하거나 중요하지 않은 종양 및 전혈전 혈관을 지닌 종양을 포함한다. 속귀신경집종, 신경종, 신경아종, 트라코마, 화농육아종 및 BPH와 같은 양성 종양의 치료가 본 발명에 포함된다. 백혈병과 같은 혈액 기원 종양 및 골수의 각종 급성 또는 만성 신생물 질병의 치료도 또한 포함된다.
본 발명은 혈관 성분을 지니거나 지니지 않는 어떠한 악성 종양의 치료에도 광범위하게 적용된다. 치료용 종양은 고형 종양, 특히 산소 및 영양물의 제공을 위한 혈관 성분이 요구되는 암종을 포함한다. 본 발명에 의해 치료될 수 있는 예시적인 고형 종양은 폐, 유방, 난소, 위, 췌장, 후두, 식도, 전립선, 간, 귀밑샘, 담즙관, 결장, 직장, 자궁목, 자궁, 자궁내막, 신장, 방광, 전립선, 갑상샘, 편평 세포 암종, 샘암종 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 고형 종양이 있는 어떠한 환자의 치료시 사용하기 위해 고려된다. 일반적으로, 본 발명은, 비록 사람에서 발견되는 가장 큰 종양을 또한 치료할 수 있다고 해도, 약 0.3 내지 0.5cm 및 그 이상의 크기를 포함하는 모든 크기의 종양, 크기가 0.5cm 이상인 종양 및 크기가 약 1.0 내지 약 2.0cm인 종양을 지닌 환자를 치료하는데 사용할 수 있다.
비록, 본 발명이 방지 또는 예방 치료로서 일반적으로 고려되지 않는다고 해도, 본 발명의 용도는 단지 중간 또는 큰 크기의 종양을 지닌 환자의 치료에만 특정하게 한정되지 않는다. 본 발명의 이러한 측면에는 많은 이유가 존재한다. 예를 들면, 중간 크기 이상의 1차 종양을 지닌 환자는 또한 작은 크기일 것으로 고려되는 다른 각종의 전이성 종양을 지니거나 전이성 종양 시딩(seeding)의 초기 단계이를수 있다. 본 발명의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 PE-결합 펩타이드 유도체 또는 배합물은 일반적으로 환자의 순환계내에 투여하는 경우, 비록 이것이 치료의 주요 목적은 아닐 수 있다고 해도, 이들은 천역적으로 2차의 , 작고 전이성인 암에서 효과를 나타낼 것이다. 또한, 심지어 종양 덩이가 단일의 작은 종양 상태일 경우에도, 특정의 유리한 항-종양 효과가 본 치료의 사용으로 이루어질 것이다.
본 발명과 관련하여 사용하기 위한 적합한 환자에 대해 본원에 제공된 안내는, 특정의 환자 프로파일이 본 발명에 의한 치료를 위한 환자의 선택을 보조할 수 있는 교시로서 의도된다. 특정 환자, 또는 환자 범주의 예비-선택이든 어떠한 방식으로든 암을 지닌 모든 환자의 치료와 관련하여 본 발명의 근본적인 무용성을 부정하지는 않는다. 추가의 고려사항은, 본 발명의 항체 치료요법에 의해 제공된 종양에 대한 공격이 추가로 치료학적으로 치료되게 함으로써 연속적인 치료가 전체적인 상승 효과를 가져오거나 심지어 전체적인 완화 또는 치유를 가져온다는 사실이다.
특정 유형의 종양이 본 발명을 사용한 치료로부터 제외된다고는 여겨지지 않는다. 그러나, 종양 세포의 유형은 3차 치료제, 특히 화학치료제 및 항-종양 세포 면역독소와 함께 본 발명의 사용과 관련될 수 있다. 본 발명은 종양 혈관구조의 표적화 작용 모드 및 파괴에 포함되고 혈관구조는 실질적으로 또는 전체적으로 모든 고형 종양에서 동일하므로, 본 발명의 방법은 종양 세포 자체의 특정 표현형 또는 유전형에 상관없이 모든 고형 종양의 치료에 광범위하게 또는 전적으로 적용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 본원에 나타낸 데이타는, 이것이 광범위한 상이한 종양 모델에서 중요한 결과는 나타내므로 놀랄만하다.
치료학적으로 효과적인 투여량은 광범위한 치료제를 사용한 임상 데이타로부터 및 본원의 상세한 연구에서 나타낸 바와 같이, 동물 모델로부터의 데이타를 사용하여 용이하게 측정할 수 있다. 고형 종양을 지닌 실험 동물은 흔히 임상 환경으로 해석되기 전에 적절한 치료학적 투여량을 최적화하기 위해 흔히 사용된다. 이러한 모델은 효과적인 항암 치료요법을 예측하는데 있어 매우 신뢰성이 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 실시예에서 사용된 것과 같은 고형 종양을 지닌 마우스는 예비-임상 시험에서 광범위하게 사용된다. 본 발명자들은 이러한 당해분야에서 허용된 마우스 모델을 사용하여 최소의 독성으로 유리한 항-종양 효과를 제공하는 치료제의 작업 범위를 결정하였다.
종양 치료요법의 측면에서, 전체적인 발명과 함께 부수적인 안정성을 고려하여, 다른 항-혈관 치료요법을 사용하여 성공하기 위해 과학적 및 특허 문헌을 참조할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,855,866호; 제5,877,289호; 제5,965,132호; 제6,051,230호; 제6,004,555호; 제5,776,427호; 제6,004,554호; 제6,036,955호 및 제6,093,399호는 본 발명의 치료요법에 적용될 수 있어서 이러한 제제의 사용을 추가로 기술한 목적으로 본원에 참조문헌으로 인용된다. 미국 특허 제6,312,694호 및 제6,406,693호는 PS 및 PE에 대한 접합되지 않은 항체 및 관련 면역접합체를 사용한 투여량 및 치료에 있어서의 안내를 위해 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된다.
당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 임상 치료를 진행하기 전해 전-임상 시험과 관련한 안내서로서 사용될 수 있는 신뢰성있는 문헌이 있다. 그러나, 허용된 모델에서 이미 입증된 안정성으로 인하여, 본 발명의 예비-임상 시험은 효능을 확인하는 것 보다는 최적화 문제가 될 것이다. 즉, 예비-임상 시험은 가장 유리한 제제, 투여량 또는 배합물을 선택하기 위해 사용될 수 있다.
검출가능한 종양 혈관구조 퇴행, 혈전증 및/또는 파괴 및 종양 괴사를 포함하는 지속적으로 검출가능한 항-종양 효과를 가져오는 어떠한 항체 투여량, 배합 방법 또는 약제는 여전히 유용한 발명이 될 것이다. 퇴행, 혈전, 파괴 및 괴사 효과는 바람직하게는 종양 혈관에서 약 10% 내지 약 40-50%, 종양 조직에서 관측된 효과의 약 50% 내지 약 99%로 상향되어 관측된다. 본 발명은, 종양의 혈관 하향, 예를 들면, 혈관에서 작용한 종양으로부터 방출된 사이토킨과 같은 하나 이상의 서브 세트의 배출 혈관을 표적화하여 이들의 혈관형성 프로파일을 변경시키는데 또한 효과적이다.
치료요법의 항-종양 효과가 이러한 범위의 낮은 쪽에 있는 상황에서조차, 본 치료요법은 여전히 특정 종양의 측면에서 모든 다른 공지된 치료요법보다 동등하거나 심지어 더욱 효과적일 수 있다는 것은 또한 이해될 것이다. 특정 종양이 중간 또는 장기간에 효과적으로 치료될 수 없지만, 특히 다른 방법이 일반적으로 적어도 효과적인 것으로 일반적으로 제안되는 경우에, 본 발명의 치료요법의 유용성이 무시되지 않는다는 사실이 임상학자에게는 불행히도 명백하지 않다.
혈관화된 종양의 치료를 위한 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, PE-결합 펩타이드 유도체 또는 배합 치료요법의 적절한 투여량을 설계하는데 있어서, 임상 투여를 위한 적절한 투여량에 도달하기 위하여 본원에 기술된 동물 연구로부터 용이하게 예측할 수 있다. 이러한 전환을 달성하기 위해서는, 실험 동물의 단위 체중당 투여된 제제의 양을 계수하고, 바람직하게는 실험 동물 및 사람 환자사이의 체 표면적에 있어서의 차이를 계수하여야 한다. 모든 이러한 계산은 잘 알려져 있으며 당해 분야의 숙련가에게 통상적인 것이다.
예를 들어, 마우스 연구에서 사용된 치료제의 성공적인 투여량을 취하고 체중 및 표면적을 기준으로 한 표준 계산을 적용시킴에 있어서, 사람 환자에서 사용하기 위한 제제의 유효 투여량은 환자당 항체 약 1mg 내지 약 500mg, 및 환자당 약 10mg 내지 약 100mg일 수 있다.
따라서, 이러한 정보를 사용하여, 본 발명자들은 사람 투여용으로 유용한 저 투여량이 환자당 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 약 30mg일 것이며, 사람 투여용으로 유용한 고 투여량은 환자당 약 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 또는 약 500mg일 것으로 고려하고 있다. 사람 투여용으로 유용한 중간 투여량은 환자당 약 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 또는 약 225mg인 것으로 고려하고 있다. 일반적으로, 환자당 약 50-100mg, 약 10-80mg, 약 20-70mg, 약 25-60mg, 또는 약 30-50mg의 투여량 범위가 바람직할 것이다. 그러나, 앞서 인용된 예시적인 투여량중 어느 것을 사용한 특정의 범위 또는 특정하게 지시된 범위사이의 중간 투여량이 고려된다.
지정된 범위에도 불구하고, 본원에 나타낸 매개변수 및 상세한 안내의 제공에도, 활성 또는 최적 범위에서 추가의 변형이 본 발명내에 포함될 것임은 이해될 것이다. 따라서, 보다 적은 투여량이 특정의 제제와 배합시 더욱 적절할 수 있고, 고 투여량이, 특히 본 작제물의 안정성이 증가된 경우, 여전히 내성일 수 있음은 잘 이해될 것이다. 사람 또는 사람화된 항체 및 사람 효과기의 사용은, 본 발명이, 추가로 건강한 조직에서의 현저한 독성의 변화 또는 부작용을 감소시키면서 임상적 용도를 위해 보다 안전하게 될 수 있다.
본 발명의 치료학적 양태의 의도는 허용되지 않는 독성과 관련된 수준 이하의 투여량을 여전히 유지하면서 현저한 항-종양 효과를 생산하는 것이다. 투여량 자체를 변화시키는 것외에, 투여 섭생은 또한 채료 방법을 최적화하기 위해 채택도리 수 있다. 현재 바람직한 투여 방법은 항체, 또는 이들을 함유하는 치료학적 콕테일을 약 1-500mg, 및 바람직하게는 약 10-100mg으로 약 7일의 기장내에 약 3회 투여하는 것이다. 예를 들면, 투여량은 약 1일, 3일 또는 4일 및 6일 또는 7일째에 제공될 수 있다.
특정 투여량 자체의 투여시, 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 조성물(멸균성, 발열성, 순도 및 일반적인 안정성의 FDA 표준에 따른)을 환자에게 전신계적으로 제공하는 것이 바람직하다. 정맥내 주사가 일반적으로 바람직하며, 가잔 바람직한 방법은 약 1 또는 2시간 등의 시간 시간에 걸쳐 연속적으로 주입하는 것을 사용하는 것이다. 비록 본 발명을 사용한 치료전에 이러한 매개변수를 결정할 필요는 없다고 해도, 본원에 상세히 기술한 연구는 주사한지 약 12 내지 24시간내에 특이적으로 관측되는 적어도 일부의 혈전을 초래하며, 종양 세포 자체는 약 24 내지 72시간내에 사멸하기 시작한다는 것을 주목하여야 한다. 광범위한 종양 괴사는 일반적으로 약 48 내지 96시간 이후에 관측되며 60% 이상의 괴사를 포함하는 종양 괴사가 관측된다.
기본적으로 광범위한 사용이전에, 임상적 시도가 수행될 것이다. 환자 치료 및 모니터링을 포함하는 임상 시도를 수행하는 각종 요소는 본 발명의 기술 측면에서 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있을 것이다. 하기 정보는 이러한 시도의 달성시 사용하기 위한 일반적인 지침으로서 제공된다.
제1 치료를 위해 선택된 환자는 하나 이상의 통상적인 치료요법이 과정에 반응하는데 실패할 것이고, 물리학적 시험, 실험적 기술 및/또는 방사선 과정에 의해 측정된 것으로써 객관적으로 측정가능한 질병을 지닐 것이다. 어떠한 화학치료요법도 연구 도입전 적어도 2주째에 중지하여야 한다. 쥐 모노크로날 항체 또는 항체 부위를 사용하는 경우, 환자는 마우스 면역글로불린에 대한 알레르기의 병력을 지니지 않을 수 있다.
특정의 장점은 3개의 관내강 포트를 지닌 내지 중추 혈관 카테테르의 사용시 발견될 것이다. 치료제는 예를 들면, 0.22μ 여과기를 사용하여 여과시킬 수 있으며, 염수를 사용하여 최종 100ml의 용적으로 희석시킬 수 있다. 사용전에, 시험 샘플을 또한 유사한 방식으로 여과할 수 있으며, A280을 측정함으로써 여과 전 및 여과 후 이의 농도를 추정하여야 한다. 예측된 회수는 87% 내지 99%의 범위내이어야 하며, 단백질 손실에 대한 조절이 계수될 수 있다.
작제물은 각각의 환자에게 2 내지 7일 간격으로 2 내지 4회 주입하면서 대략 4 내지 24시간의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 투여는 또한 7일에 걸쳐 일정한 속도의 주입으로 수행될 수 있다. 어떠한 투여량으로 제공된 주입도 관측된 독성에 따른다. 따라서, 제II 등급 독성이 단일 주입후 또는 일정 속도 주입을 위한 특정의 기간에 이르게되는 경우, 추가의 투여량을 보류하거나 독성이 개선되지 않는 한 일정한 속도의 주입을 중지하여야 한다. 증가되는 투여량은, 환자의 대략 60%가 어떠한 범주에서도 허용가능하지 않은 제III 또는 제IV 독성을 나타낼 때까지 환자 그룹에게 투여할 수 있다. 이러한 값의 2/3인 투여량이 안정 투여량으로 정의된다.
물리적 실험, 종양 측정 및 실험적 시험은 물론 치료전 및 1개월 까지의 간격에서 수행할 수 있다. 실험실적 시험은 완전한 혈액수, 혈청 크레아티닌, 크레아틴 키나제, 전해질, 우레아, 질소, SGOT, 빌리루빈, 알부민 및 총 혈청 단백질을 포함할 수 있다. 치료한지 60일 후의 혈청 샘플은 치료가 투여된 작제물, 및 이의 일부에 대한 항체의 존재에 대해 방사면역검정으로 평가할 수 있다. 예를 들어, ELISA 또는 RIA와 같은, 어떠한 표준 검정을 사용한 혈청의 면역학적 분석은 평가될 치료제의 약력학 및 청소율을 허용할 것이다.
항-종양 반응을 평가하기 위하여, 환자를 최종 주입후 48시간 내지 1주 및 다수 30일 후 시험하여야 한다. 촉지가능한 질병이 존재하는 경우, 모든 덩이의 2개의 수직 직경을 치료동안 매일, 치료요법 종결후 1주 및 30일 째에 측정하여야 한다. 촉지가능한 질병을 측정하기 위해, 일련의 CT 스캔을 흉부, 복부 및 태반을 통해 1cm 간격으로 48시간 내지 1주일째에 및 다시 30일째에 수행될 수 있다. 조직 샘플은 또한 조직학적으로 및/또는 유동 세포측정기에 의해, 질병 부위 또는 적절한 경우, 심지어 혈액 또는 유액 샘플로부터의 생검을 사용하여 평가할 수 있다.
임상 반응은 허용되는 측정으로 정의할 수 있다. 예를 들어, 완전한 반응은 치료후 1개월째에 모든 측정가능한 종양의 출현에 의해 정의될 수 있다. 부분적인 반응은 치료후, 종양 부위가 확장되지 않은지 1개월째에 모든 평가가능한 종양절의 수직 직경의 생성물 합의 50% 이상의 감소로 정의할 수 있다. 유사하게, 혼합된 반응은, 치료후, 하나 이상의 부위에서 진행된지 1개월때에 모든 측정가능한 병변의 수직 직경의 생성물의 50% 이상의 감소로 정의할 수 있다.
위에서 기술한 것들과 같은 임상 시도로부터의 결과 측면에서, 더욱 더 정교한 치료 양태를 제형화할 수 있다. 이 경우, 용량에 있어서의 일부 변화가 치료되는 환자의 상태에 따라 필수적으로 이루어질 수 있다. 투여를 책임지는 주치의는, 본 기술의 측면에서, 개개의 환자에 대해 적절한 투여량을 결정할 수 있다. 이러한 최적화 및 조절은 당해 분야에서, 및 과도한 양의 실험을 반영하지 않는 수단에 의해 통상적으로 수행된다.
N. 배합 종양 치료요법
본 발명의 치료 방법은 환자가 나타내는 특정 종양, 질병 또는 질환의 치료시 일반적으로 사용되는 다른 어떠한 방법과도 조합될 수 있다. 특정이 치료학적 시도가 환자의 상채 자체에 대해 해로운 것으로 알려지지 않고, 본 발명의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질계 치료를 현저하게 방해하지 않는 한, 본 발명과의 조합이 고려된다.
비 악성 질병에 대한 배합 치료요법도 또한 고려된다. 이의 특정 예는 양성 전립성 증식증(BPH)이며, 이는 당해 분야에서 현재 실행되는 다른 치료와 함게 치료될 수 있다.
고형 종양 치료와 관련하여, 본 발명은 수술, 화학치료요법, 방사선 치료요법, 케모킨 치료요법, 항-혈관형성 등과 같은 전통적인 시도와 함게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 항체, 면역접합체 또는 펩타이드 접합체가 외과 또는 방사선 치료와 함께, 또는 이전에 또는 이후에 사용되는 배합 치료요법을 제공하거나, 통상의 화학치료요법 또는 방사선치료요법제, 케모킨, 항-혈관형성제, 세포사멸-유도체, 표적화된 면역독소 또는 응고리간드 등과 함께, 이전에 또는 이후에 환자에게 투여된다. 적합한 치료제의 많은 예가 본 발명의 면역접합체 측면과 함께 상기 기술되어 있다. 치료학적 접합체중 일부로서 사용하기 위해 초기에 기술된 어떠한 제제도 별개도, 본 발명의 배합 치료요법에서 또한 사용할 수 있다.
수술 측면에서, 어떠한 외과적 시술도 본 발명과 함께 시행될 수 있다. 방사선치료요법과 관련하여, 종양 세포내에 국소적으로 DNA 손상을 유발하기 위한 메카니즘, 예를 들면, γ-조사, X-선, UV-조사, 극초단파 및 심지어 전자 방사 등이 고려된다. 종양 세포로 방사선동위원소을 직접 전달하는 것도 또한 고려되며, 표적화 항체 또는 기타 표적화 수단과 함께 이를 사용할 수 있다.
암 치료에서 물질의 배합물의 일반적인 사용은 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,710,134호(본원에 참조문헌으로 인용됨)는 비-독성 물질 또는 "전구약물"과 배합시 종양에 있어서의 괴사를 유도하는 성분들을 기술하고 있다. 괴사 과정에 의해 유리된 효소는 비독성 "전구약물"을 독성 "약물"로 분해하며, 이는 종양 세포를 사멸시킨다. 또한, 미국 특허 제5,747,469호(본원에 참조문헌으로 인용됨)는 p53 및 DNA 손상제를 암호화하는 바이러스 벡터의 배합 사용을 기술하고 있다. 이러한 어떠한 유사한 시도도 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
*하나 이상의 제제를 본 발명의 항체, 면역접합체 및 펩타이드계 치료제와 함께 사용하는 경우, 각각의 치료가 별개로 수행될 때 관측된 효과가 추가되는 배합된 결과에 있어 요구사항은 없다. 비록, 적어도 추가의 효과가 일반적으로 바람직하다고 해도, 단일 치료요법중 하나이상의 어떠한 증가된 항-종양 효과도 유리할 수 있다. 또한, 특정하게 가능하거나 유리하다고 해도, 상승 효과를 나타내기 위하여 배합 치료에 대해 특히 요구되는 것은 없다.
N1 . 제2 항암제의 선택
본원에 사용된 것으로서, 본 발명의 "1차 치료제"는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 면역접합체 또는 PE-결합 펩타이드 유도체 및 접합체이다. 본원에 사용된 것으로서 "제2 치료제"는 제2의 명잭한 치료제 또는 항암제, 즉, 1차 치료제외의 "다른 기타" 치료제 또는 항암제이다. 제2 치료제는 본 발명의 배합 치료에 사용될 수 있다. 또한, 제2 치료제 또는 "2차 항암제"는 하기 지침에 따라 부가적이고 강력한 상승 효과보다 큰 추가의 효과를 당성하기 위한 측면에서 선택될 수 있다.
배합된 항-종양 치료요법을 실행하기 위해, 본 발명의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 면역접합체 또는 PE-결합 펩타이드계 치료제를 다른, 즉, 제2의 명백한 항암제와 배합하여 동물 또는 환자내에 배합된 항-종양 작용을 유발하기에 효과적인 방식으로 동물 또는 환자에게 단순 투여할 수 있다. 따라서, 당해 제제는 종양 또는 종양 혈관구조내에서 배합된 존재 및 종양 환경내에서 배합된 작용을 나타내기에 효과적인 양 및 기간동안 제공될 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 본 발명의 1차 치료제 및 제2의 명백한 항암제는 동물에게 실질적으로 동시에, 단일 조성물로서 또는 상이한 투여 경로를 사용한 2개의 명백한 조성물로서 투여될 수 있다.
달리는, 예를 들면, 수분 내지 수주 범위의 간격으로, 본 발명의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 면역접합체 또는 PE-결합 펩타이드계 치료제를 투여한 후 제2의 명백한 항암제를 투여할 수 있다. 본 발명의 1차 치료제 및 제2의 명백한 항암제를 동물에게 별개로 적용하는 특정 양태에서, 각각의 전달시간사이에 현저한 기간이 경과하지 않아서, 각각의 제제가 여전히 종양에서 유리한 배합 효과를 발휘할 수 있도록 보장하여야 한다. 이러한 예에서는, 종양을 제제 둘다와 각각 서로 약 5분 내지 약 1주, 더욱 바람직하게는 각각 약 12 내지 72시간내에 접촉시켜야 하며, 단지 약 12 내지 48시간의 지연 시간이 가장 바람직하다.
별개로 시간이 지정된 배합 치료요법을 위한 제2의 치료제는 하기 기술된 것들을 포함하는 특정 범위를 기준으로 선택할 수 있다. 그러나, 투여전 또는 투여후동안 하나 이상의 제2의 명백한 항암제를 선택하기 위해서는, 경우에 따라 실질적으로 연속 투여시 이들의 사용을 방해하지 않는 것이 바람직하다.
둘째로, 본 발명의 1차 치료제 "이전에" 투여하기 위해 선택되며 증가된 강력한 상승 효과를 달성하도록 설계된 제2의 명백한 항암제는, 종양 혈관구조내 아미노인지질 또는 음이온성 인지질의 발현을 유도하는 제제를 포함한다. 예를 들어, 국재화된 칼슘 생산을 자극하고, PS 및 기타 인지질을 혈장 막의 외부 표면으로 이동시키는 막 트랜스포터(transporter)를 활성화시키며, 종양 내피를 손상시키고, 전세포사멸 변화를 유도하고/하거나 종양 내피에서 세포사멸을 유발하는 제제는 일반적으로 증가된 아미노인지질 및 음이온성 인지질 발현을 초래할 것이다. 이러한 제제의 예는 도세탁셀 및 파클리탁셀이다. 이후, 아미노인지질 및 음이온성 인지질은 본 발명의 항체를 사용하여 표적화될 수 있으므로, 전체적인 치료 효과를 증폭시키며 또한 숙주 효과기(보체, ADCC, 항체-중재된 식세포작용, CDC)를 통해 공격을 증가시킬 수 있다.
종양 혈관에는 존재하지만 정상의 나머지 혈관에는 존재하지 않는 것과 같은 혈관형성의, 재모델화 또는 활성화된 내피 세포에 대한 선택성을 갖는 약물을 또한 사용하여 종양 내피 세포의 표면상에 PS 및 다른 인지질의 노출을 선택적으로 유발할 수 있다. 이러한 제제의 예는 콤브레타스타틴 및 도세탁셀이다. 이는 또한 증가된 항체 결합 및 증진된 숙주 효과기 메카니즘의 개시를 이끈다.
둘째로, 본 발명의 1차 치료제에 "이어서" 투여하기 위해 선택되고, 증가된 강력한 상승 효과를 달성하기 위해 설계된 제2의 명백한 항암제는 제1 치료제의 효과로부터 유리한 제제를 포함한다. 본 발명의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 면역접합체 또는 펩타이드계 치료제는 종양 파괴를 유발할 것이다. 따라서, 연속 투여용의 효과적인 제2의 명백한 항암제는 전이를 억제하는 항-혈관형성제, 생체내에서 악성 세포로부터 접근가능하게 되는 세포내 항원에 특이적인 항체와 같은 괴사성 종양 세포를 표적화하는 제제(참조: 각각 본원에 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,019,368호, 제4,861,581호 및 제5,882,626호); 및 말초에서 생존할 수 있는 어떠한 종양 세포도 공격하는 화학치료요법제 및 항-종양 세포 면역접합체를 포함한다.
일부 상황에서, 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7), 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8) 또는 수개월(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)이 각각의 투여사이에 경과되는 경우에 치료 기간을 현저히 연장시키는 것이 바람직할 수 있다. 치료가 실질적으로 종양을 파괴하도록 의도된 경우의 상황, 예를 들면, 본 발명의 1차 치료제 및 다른 치료가 항-혈관형성제의 투여와 같은 미세전이 또는 종양 재-성장을 방지하도록 의도외는 상황에서 유리할 수 있다. 그러나, 항-혈관형성제는 수술후 관찰되는 시간에 투여하여 효과적으로 상처를 치유할 수 있다. 항-혈관형성제도 환자의 생존기간동안 투여할 수 있다.
1차 치료제 또는 제2의 명백한 항암제의 1회 이상의 투여가 이용되는 것이 또한 예측된다. 1차 치료제 및 제2의 명백한 항암제는 상호교환적으로, 격일 또는 격주; 또는 하나의 제제 치료 순서가 제공된 후 다른 치료의 순서가 이어지도록 투여될 수 있다. 어떠한 경우에서도, 배합 치료요법을 사용하여 종양 퇴행을 달성하기 위해서는, 투여 시간에 상관없이 항-종양 효과를 발휘하기에 효과적인 배합양으로 제제둘 둘다를 전달하는 것이 전적으로 요구된다.
실질적으로 동시에 투여되거나 연속적으로 투여되는 것에 상관없이, 본 발명의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 및 치료제는 하나 이상의 화학치료제 또는 약물과 함께 투여될 수 있다. 화학치료 약물은 증식하는 종양 세포를 사멸시킬 수 있으며, 전체 치료에 의해 생성된 괴사 부위를 증가시킬 수 있다. 따라서, 약물은 본 발명의 1차 치료제의 혈전 작용을 증진시킬 수 있다.
대부분의 암 화학치료 약물은 분열하는 산소처리된 세포에 대해 선택적이다. 이들은, 화학치료 약물이 본 발명의 1차 치료제로부터의 상이한 표적에서 작용하여 더욱 완전한 항-혈관 또는 항-종양 효과를 가져오므로 배합 치료요법에서 유리하다. 예를 들어, 화학치료 약물은 종양 말초에서 신속하게 분열하는, 산소처리된 종양 세포에 대해 선택적으로 효과적인 반면, 본 발명의 제제는 활성화된 반응성 산소종이 풍부한 주로 "스트레스받은" 종양 중심에서의 혈관 또는 종양 세포에 주로 작용한다. 종양 말초에서 잘-산소처리된 혈관형성 혈관에 대해 선택적인 항-혈관형성 약물은 또한 배합시 효과적일 수 있는데, 이는 본 발명의 제제가 종양 중심의 비교적 저산소성의 정지기 혈관에서 작용하기 때문이다.
종양 혈관에서 혈청의 형성을 유도함으로써, 본 발명의 1차 치료제는 또한 종양내 약물의 보유 또는 포획에 의해 화학치료요법 약물의 작용을 증진시킬 수 있다. 따라서, 화학치료제는 종양내에 보유되는 반면, 나머지 약물은 체내로부터 소거된다. 따라서, 종양 세포는 장기간동안 고 농도의 약물에 노출된다. 종양내 약물의 이러한 포획은 약물의 투여량을 감소시킬 수 있으며 치료를 더욱 안전하게 하고 또한 더욱 효과적이도록 한다.
본 발명에서 배합 사용을 위한 추가의 약물은 1차 치료제의 작용에 의해 약물에 "감작화된" 세포상에서 작용함으로써 자체의 항-종양 효과를 달성하기에 요구되는 제2 약물의 투여량을 감소시키는 것들이다. 예를 들어, 이는, 제2 약물의 주요 성분의 작용이 종양 혈관에서 발휘되고 본 발명의 항체 또는 제제가 약물에 대해 세포를 감작화시키는 경우에 발생할 수 있다. 이는, 본 발명의 1차 치료제가 직접적으로 또는 사이토킨의 자극을 통해 제2 약물에 대해 종양 세포를 감작화시키는 경우 발생한다.
배합 치료요법용의 다른 적합한 제2 항암제는, 예를 들면, 면역 시스템의 면역억제 성분의 활성을 선택적으로 억제함으로써 숙주 효과기 세포의 활성을 증진시키는 것들이다. 이러한 제제는, 본 발명의 1차 치료제가 자체의 메카니즘의 일부로서 효과기 세포에 의한 공격을 자극하여 더욱 공격적으로 작업하도록 한다. 이러한 제제의 예는 도세탁셀이다.
비록 1차 치료제의 상세한 작용 메카니즘의 이해가 본 발명의 치료를 수행하는데 필수적이지는 않다고 해도, 이러한 메카니즘에 관한 데이타 및 충분한 결론을 사용하여 본 발명에서 배합된 사용을 위한 특정의 제2 항암제를 선택할 수 있다. 결국, 선택된 배합 치료요법의 효능은 원래의 데이타 및 제안된 작용 메카니즘을 지지하며, 또한 배합 치료요법을 실행하기 위한 제2의 항암제의 바람직한 범주로 이끈다.
세포사멸을 유발하는 약물을 배합 치료요법에 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 도세탁셀은 미소관에 결합하여 세포 분열을 파괴함으로써 세포사멸 및 이에 따른 PS 노출을 유발한다. 아임상 농도에서 도세탁셀을 사용한 종양 혈관 및 종양 세포내 내피 세포의 처리는 본원에서 시험관내 3G4 항체의 강력한 결합에 의해 입증되는 바와 같이, 세포 표면에서 PS 발현을 유발하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명자는 또한 본 발명의 항체의 항-종양 효과가 증가된 항체-중재된 식세포작용에 의해 밝혀진 바와 같이 면역 효과기 작용의 Fc 도메인-중재된 증강을 포함함을 측정하였다. 따라서, 항체는 또한 ADCC, CDC, 사이토킨 생산의 자극과 같은 다른 Fc 도메인 중재된 작용 및 이러한 메카니즘의 조합을 발휘할 수 있다. 이는 또한, 다른 연구에서 도세탁셀을 사용한 유방암 환자의 치료가 혈청 IFN-γ, IL-2, IL-6 및 GM-CSF 사이토킨 수준을 증가시켜 당해 환자에서 중성 킬러(NK) 및 림프구 활성화된 킬러(LAK) 세포의 활성을 향상시킴으로서 항-종양 면역 반응을 증강시킴을 밝힌바와 같이(참조: Tsavaris 등, 2002), 도세탁셀과 관련된다.
따라서, 본 발명자들은, 도세탁셀이 PS 발현 및 투여횐 항체의 결합 둘다를 유발할 것이고, 또한 항-종양 효과를 중재하는 면역 효과기의 활성을 증진시킨 것이라고 결론지었다. 앞서의 고려를 기초로 하여, 본 발명자들은, 3G4 항체에 의해 예시되는 바와 같이 본 발명의 항체 도세탁셀과의 배합물이 같은자리 MDA-MB-435 사람 유방암 이종이식을 지닌 마우스에서 도세탁셀 또는 3G4 단독보다 현저히 우수함을 입증하였다(참조: 실시예 XX).
따라서, 세포사멸을 유발하는 도세탁셀 및 다른 화학치료제는 본 발명의 배합 치료에 사용하기에 바람직한 제제이다. 도세탁셀과 같이 세포사멸을 유발하는 화학치료 약물과 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질에 대한 항체의 배합물은 종양 혈관구조 내피 세포와 종양 세포 구획을 상승적으로 공격하여, 낮은 독성으로 현저하게 증진된 치료 효능을 가져온다. 이러한 배합물은 유방암 치료, 특히 도세탁셀과 본 발명의 항체를 사용한 규칙적인 화학치료요법의 조합으로 고려된다.
N2 . 내독소
내독소 및 탈독성화된 내독소 유도체가 바람직하게는 저 투여량으로 배합 치료에서 사용될 수 있다(참조: 본원에서 참조문헌으로 상세히 인용된 PCT 공보 제WO 03/028840호). 동물에서 사용하기 위한 및 특히 사람에게 사용하기 위해 바람직한 각종의 탈독소화된 내독소는 시판되고 있다. 탈독소화되고 정제된 내독소 및 이의 배합물은 각각 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된 미국 특허 제4,866,034호; 제4,435,386호; 제4,505,899호; 제4,436,728호 및 제4,505,900호에 기술되어 있다.
비-독성 유도체 모노포스포릴 지질 A(MPL)가 본 발명에서 사용될 수 있는 탈독소화된 내독소의 한가지 예이다. MPL은 사람에게 안전한 것으로 알려져 있으며; 보조제로서 MPL을 사용한 임상 시도는 심지어 입원치료하지 않는 환자 기준으로 사람용을 위해 100㎍/m2이 안정한 것으로 밝혀져있다.
N3 . 사이토킨
사이토킨 치료요법은 배합된 치료 섭생을 위한 효과적인 파트너인 것으로 입증되었다. 각종 사이토킨이 본 발명의 배합 시도에서 사용될 수 있다. 사이토킨의 예는 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-β, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNFα, IFN-β, IFN-γ를 포함한다. 사이토킨은 표준 섭생에 따라 환자의 상태 및 사이토킨의 관련 독성과 같은 임상 지시와 일치하게 투여한다. 우테로글로빈(uteroglobin)을 사용하여 전이를 예방하거나 억제할 수 있다(참조: 본원에 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,696,092호).
N4 . TNF α 및 TNF α의 유도제
TNFα 및 TNFα의 유도제를 또한 본 발명과 배합하여 사용할 수 있다. TNFα는 혈관 침투성을 증가시키므로, 항암제의 종양내 침투를 용이하게 하는데 유용하다. 비록 종양 국재화가 본 발명에서와 같이 아미노인지질 및 음이온성 인지질을 표적화하는 경우, 문제되지 않는다고 해도, TNFα의 배합 사용은 종양에 대한 다른 화학치료제 및 면역접합체의 접근을 용이하게 하며, 심지어 본 발명의 항체의 멀리 떨어진 종양 세포에 대한 결합을 증가시킨다.
약화되거나 가공된 아데노바이러스, DMXAA(및 FAA), CM101 및 탈리도미드와 같은 저 수준의 내독소, Rac1 길항제도 또한 사용할 수 있다. Rac1 길항제는 또한 CD14와는 독립적으로 TNF 상향 조절을 유발하는 세포당 약 5000개 DNA 입자로서 본 발명의 배합 치료에 사용될 수 있었(참조: Sanlioglu 등, 2001). CM101, 탈리도미드 및 DMXAA는 또한 표준 또는 감소된 투여량으로 본 발명과 배합하여 사용될 수 있다.
N5 . 화학치료제
당면한 메카니즘에 상관없이, 각종의 화학치료제를 본원에 기술된 배합 치료에서 사용할 수 있다. 배합 사용을 위해 고려되는 화학치료제는 예를 들면, 타목시펜, 탁솔, 빈블라스틴, 에토포시드(VP-16), 아드리아마이신, 5-플루오로우라신(5FU), 캄프토테신, 악티노마이신-D, 미토마이신 C, 콤브레타스타닌을 포함하며, 더욱 특히 도세탁셀(탁소테레), 시스플라틴(CDDP), 사이클로포스파미드, 옥소루비신, 메토트렉세이트, 파클리탁셀 및 빈크리스틴, 및 이의 유도체 및 전구약물을 포함한다.
당해 분야의 숙련가에게 잘 이해될 수 있는 바와 같이, 화학치료제의 적절한 투여량은, 화학치료제가 단독으로 또는 다른 화학치료제와 배합하여 투여되는 임상 치료에서 이미 사용된 양을 포함한다. 그러나, 더욱 적은 투여량도 본 발명에 의해 제공된 장점으로 인하여 가능하다. 단지 예시적인 방법으로, 시스플라틴과 같은 제제 및 다른 DNA 알킬화제를 사용할 수 있다. 시스플라틴은 암 치료용으로 광범위하게 사용되며, 유효 투여량은 임상 적용에서 20mg/m2를 매 3주마다 5일 동안 총 3회의 과정이다. 시스플라틴은 경구적으로 흡수되지 않으므로 정맥내, 피하내, 종양내 또는 복강내 주사를 통해 전달되어야 한다.
추가의 유용한 제제는 DNA 복제, 세포분열, 염색체 분리 및/또는 튜불린 활성을 방해하는 화합물을 포함한다. 이러한 화학치료적 화합물은 독소루비신, 에토포시드, 베라파밀, 포도필로톡신, 콤브레타스타닌 등으로 또한 알려진 아드리아마이신을 포함한다. 신생물 치료를 위한 임상 세팅에 광범위하게 사용시, 이들 약물은 아드리아마이신의 경우 21일 간격으로 25 내지 75mg/m2 범위의 투여량으로 볼내 주입, 정맥내 주사를 통해, 에토포시드의 경우 35 내지 50mg/m2 범위의 투여량으로 정맥내 또는 정맥내 용량의 2개를 경구적으로 투여한다.
폴리뉴클레오타이드 전구체의 합성 및 충실도를 파괴하는 제제를 또한 사용할 수 있다. 집중적으로 시험되고 용이하게 입수가능한 제제가 특히 유용하다. 그 자체로서, 5-플루오로우라실(5-FU)와 같은 제제가 신생물 조직에 의해 바람직하게 사용되며, 이러한 제제는 신생물 세포에 대한 표적화를 특히 용이하도록 한다. 비록 매우 독성이라고 해도, 5-FU는 국소를 포함하는 광범위한 담체중에 적용가능하지만, 3 내지 15mg/kg/일 범위의 투여량으로 정맥내 투여하는 것이 일반적으로 사용된다.
배합 치료요법과 관련하여 유용한 예시적인 화학치료제는 표 D에 나열되어 있다. 표에 나열된 제제들 각각은 예시적인 것이며 이로 제한되지는 않는다. 당해 분야의 숙련가들은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, chapter 33, 특히 pages 624-652)를 참조한다. 용량에 있어서의 일부 변화는 치료될 환자의 상태에 따라 필수적으로 이루어질 것이다. 투여에 책임있는 주치의는 개개 환자에 대한 적절한 투여량을 결정할 것이다.
[표 D1]
Figure 112012087199067-pat00004
[표 D2]
Figure 112012087199067-pat00005
[표 D3]
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[표 D4]
Figure 112012087199067-pat00007
N6 . 항- 혈관형성제
용어 "혈관형성"은 일반적으로 새로운 혈관이 조직 또는 기관내로 생성되는 것을 말한다. 정상의 생리학적 상태하에서, 사람 또는 동물은 특정의 제한된 상황에서만 혈관형성이 이루어진다. 예를 들어, 혈관형성은 일반적으로 상처 치유, 태아 및 배아 발생 및 황체 및 태반에서 관측된다. 그러나, 새로운 현상은, 혈관형성이 부신 조직, 전립성 및 난소에서와 같이 특정의 정상 상황에서 중요함을 나타낸다. 항-혈관형성이 유일한 작용의 모드가 아닌 본 발명의 치료제는 요구되거나 "생리학적" 혈관형성이 본 발명을 사용하는 경우에 억제되지 않을 항체 A4.6.1(참조: Brem, 1998; Baca et al., 1997; Presta et al., 1997)와 같은 우세한 항-혈관형성 치료요법보다 유리하다.
조절되지 않는(영구적이고/거나 조절되지 않는) 혈관형성은 각종 질병 상태와 관련되며, 종양 발달 및 전이동안 발생한다. 조절된 혈관형성 및 조절되지 않는 혈관형성 둘다는 유사한 방식으로 진행되는 것으로 사료된다. 기저 막으로 둘러싸여 있는 내피 세포 및 혈관주위세포는 미세 혈관을 형성한다. 혈관형성은 내피 세포 및 백혈구에 의해 방출된 효고에 의한 기저막의 붕괴와 함께 개시된다. 혈관의 내강을 채우고 있는 내피 세포는 기저막을 통해 돌출된다. 혈관형성 자극은 내피세포가 파괴된 기저막을 따라 이주하도록 유도한다. 이주하는 세포는 모 혈관에서 떨어진 "싹(sprout)"을 형성하며, 여기서, 내피 세포는 유사분열을 하고 증식한다. 내피 싹은 서로 변합하여 모세 루프를 형성하고 새로운 혈관을 창조한다.
혈관형성이 일부 정상 조직에 필요한 새로운 현상임에도 불구하고, 혈관형성 치료요법은 여전히 종양 및 기타 질병의 치료에 중요하다. 따라서, 항-혈관형성 치료제는 본 발명의 배합 치료에 사용하기 위해 의도된다. 낮은, 비교적 잦은 투여량의 본 발명의 치료제와 혈관형성을 억제하는 제제의 배합이 특히 고려된다. 배합 치료요법과 관련하여 유용한 항-혈관형성제의 예는 위에서 나열되어 있다(면역접합체와 관련하여). 표 B의 것들을 포함하는, 하나 이상의 이러한 제제는 본 발명의 배합 치료요법에서 사용될 수 있다. 안지오스타틴, 엔도스타틴, 바스큘로스타틴, 칸스타틴 및 마스핀이 현재 바람직하다.
많은 공지된 항암제 또한 이들의 작용 메카니즘의 일부로서 항-혈관형성 효과를 지닌다. 표 E에 예시되는 바와 같은 이러한 제제는 특히 본 발명의 배합 치료요법 양태에서 사용하기 위해 고려된다(이들은 또한 위에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 항체에 접합될 수 있다).
[표 E]
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또한, αvβ3 인테그린에 대한 항체 LM609는 종양 퇴행을 유도하며 배합 치료요법에서 사용될 수 있다. LM609와 같은 인테그린 αvβ3 길항제는 혈관형성 내피세포의 세포사멸을 유도하여 영향받지 않는 정지기 혈관을 초래한다. LM609 또는 다른 αvβ3 길항제는 또한 내피 세포 및 섬유아세포의 이주시 중용한 역활을 하는 것으로 고려되는 단백질분해 효소, MMP-2 및 αvβ3 의 상호작용을 억제함으로써 작용할 수 있다.
LM609에 의한 혈관형성 내피의 세포사멸은 나머지 혈관 네트워크에서 캐스케이드 효과를 지닐 수 있다. 종양 시그날이 완전히 반응하여 활산하는 종양 혈관 네트워크의 억제는 실제로 네트워크의 부분적 또는 완전한 붕괴를 개시함으로써 종양 세포 사멸 및 종양 용적의 감소를 초래한다. 엔도스타틴 및 안지오스타틴이 유사한 양식으로 작용하는 것은 가능하다. LM609가 정지기 혈관에는 영향을 미치지 않지만 종양 퇴행을 유발할 수 있다는 사실은, 종양내 모든 혈관이 항-종양 효과를 수득하기 위한 치료에 대해 표적화될 필요가 없음을 강력히 시사한다.
본원에 참조문헌으로 상세히 인용된 미국 특허 제5,520,914호에 기술된 바와 같이, 안지오게닌에 대한 항체를 또한 사용할 수 있다. FGF는 혈관형성과 연관되므로, FGF 억제제를 또한 사용할 수 있다. 특정의 예는 아라카란 설페이트와 같은 글리코스아미노글리칸을 포함하는, 이들의 주요 반복 단위로서 2-O-설페이트된 루론산으로 연속하여 변경되는 N-아세틸글루코스아민을 갖는 화합물이다. 이러한 화합물은 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된 미국 특허 제6,028,061호에 기술되어 있으며 본원에서 배합시 사용될 수 있다.
N7 . VEGF 억제제
VEGF는 저산소증 및 온코진성 돌연변이에 의해 유발된 다작용성 사이토킨이다. VEGF는 배아생성에서 혈관 네트워크의 발달 및 유지의 주요 자극인자이다. 이는 강력한 침투-유도, 내피세포 화학주성제제, 내피 생존 인자 및 내피 세포 증식 인자로 작용한다. 이의 작용은, VEGF의 1개 또는 둘다의 대립유전자의 표적화된 파괴가 배아 치사를 초래하므로, 일반적인 배아 발달에 요구된다.
하나 이상의 VEGF 억제 방법의 사용은 본 발명의 배합 치료의 바람직한 측면이다. 병리학적 상태에서 혈관형성의 주요 자극제로서 VEGF의 인식은 VEGF 활성을 차단하기 위한 다양한 방법을 이끌었다. 개발된 어떠한 VEGF 억제제도 본 발명에 이르러 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, VEGF 시그날링을 방해하도록 설계된 하나 이상의 하기 중화 항-VEGF 항체, 가용성 수용체 작제물, 안티센스 방법, RNA 아프타머 및 타이로신 키나제 억제제를 사용할 수 있다.
적합한 제제는 중화 항체(참조: Kim et al., 1992; Presta et al., 1997; Sioussat et al., 1993; Kondo et al., 1993; Asano et al., 1995), 가용성 수용체 작제물(참조: Kendall and Thomas, 1993; Aiello et al., 1995; Lin et al., 1998; Millauer et al., 1996), 타이로신 키나제 억제제(참조: Siemeister et al., 1998), 안티센스 방법, RNA 아프타머 및 VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 리보자임(참조: Saleh et al., 1996; Cheng et al., 1996)을 포함한다. 혈관형성 특성을 지닌 VEGF의 변이체를 제WO 98/16551호에 기술된 바와 같이 또한 사용할 수 있다. 전술한 참조문헌 각각은 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된다.
VEGF에 대한 차단 항체가 특히 단순성을 위해 특정 양태에서 바람직할 것이다. VEGF에 대한 모노클로날 항체는 마우스에서 사람 종양 이종이식 성장 및 복수 형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다(참조: Kim et al., 1993; Mesiano et al., 1998; Luo et al., 1998a; 1998b; Borgstrom et al., 1996; 1998; 각각 본원에 참조문헌으로 인용됨). 항체 a4.6.1은 VEGFR1 및 VEGFF2 둘다에 대한 VEGF를 차단할 수 있는 고 친화성 항-VEGF 항체이다(참조: Kim et al., 1992; Wiesmann et al., 1997; Muller et al., 1998; Keyt et al., 1996; 각각 본원에 참조문헌으로 인용됨). A4.6.1은 최근에 일가 파아지 디스플레이 기술에 의해 사람화되었으며 현재 항암제로서 제I 상 임상 시도중이다(참조: 본원에 참조문헌으로 인용된 Brem, 1998; Baca et al., 1997; Presta et al., 1997).
알라닌 스캐닝 돌연변이유발 및 A4.6.1의 Fab 단편에 의해 결합된 VEGF의 X-선 결정학은, A4.6.1이 결합하는 VEGF상의 에피토프가 아미노산 89 내지 94번 주변의 중심에 위치함을 나타낸다. 이러한 구조적 데이타는, A4.6.1이 VEGFR2에 대한 결합으로부터 VEGF를 완전히 억제하지만, 대부분 입체적 장애에 의해 VEGFR1에 대한 결합으로부터 VEGF를 억제함을 입증한다(참조: 본원에 참조문헌으로 인용된 Mulletr et al., 1998; Keyt et al., 1996).
A4.6.1은 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 그러나, 2C3(4545)라고 명명된 새로운 항체가 바람직하며, 이는 VEGF와 2개의 VEGF 수용체중 단지 하나와의 상호작용을 선택적으로 차단한다. 2C3은 내피 세포의 VEGF-중재된 성장을 억제하며, 강력한 항-종양 활성을 지니고 VEGF와 VEGFR2(KDR/Flk-1)과의 상호작용을 선택적으로 차단하지만 VEGFF1(FLT-1)과의 상호작용을 차단하지 않는다. A4.6.1과는 대조적으로, 2C3은 대식구 화학주성(VEGFR1에 의해 중재됨)을 동시 억제하지 않으면서 VEGFR2-유도된 혈관형성을 특이적으로 억제하므로, 안전한 치료제인 것으로 고려된다. 미국 특허 제6,342,219호, 제6,342,221호, 제6,416,758호 및 제6,416,758호는 2C3 항체 및 항-혈관형성 치료요법 및 VEGF 억제에 있어서 이의 용도를 추가로 기술할 목적을 위해 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된다.
N8. 세포사멸-유도제
본 발명의 치료제는 또한 종양 세포 및 종양 혈관 내피 세포를 포함하는, 종양내 어떠한 세포에서의 세포사멸을 유도하는 치료 방법과 배합된다. 세포사멸을 유도하는 예시적인 제제는 상기 나열되어 있다(면역접합체와 관련). 하나 이상의 이러한 세포사멸-유도제는 본 발명의 항체와 연결됨이 없이, 본 발명의 배합 치료요법에서 사용될 수 있다.
많은 공지된 항암제는 또한 이들의 작용 메카니즘의 일부로서 세포사멸-유도 효과를 지닌다. 표 F에 예시되는 이들 제제는 특히 본 발명의 배합 치료요법 측면에서 사용하기 위해 고려된다(이들은 또한 위에서 기술한 바와 같이 본 발명의 항체에 접합될 수 있다).
[표 F]
Figure 112012087199067-pat00009
N9 . 면역독소 및 응고리간드
본 발명은 또한 다른 면역독소 또는 응고리간드와 배합하여 사용될 수 있으며, 여기서, 표적화 부위는 종양 세포, 종양 혈관구조 또는 종양 기질의 마커에 지시된다. 종양 세포, 종양 혈관구조 또는 종양 기질에 대해 PE-결합 펩타이드를 표적화하는데 사용하기 위해 본원에 기술된 표적화제 어느 것도 이러한 양태에서 사용할 수 있다. 면역 독소에서, 부착된 제제는 항-세포 또는 세포독성제, 사이토킨, 방사치료요법제, 항-혈관형성제, 세포사멸-유도제 및 항-튜불린 약물을 포함한다. 응고리간드에서, 부착된 제제는 응고제이다. 미국 특허 제5,855,866호, 제5,965,132호, 제6,261,535호, 제6,051,230호, 제6,451,312호(면역독소), 제6,093,399호, 제6,004,555호, 제5,877,289호 및 제6,036,955호(응고리간드)가 이러한 작제물을 예시하기 이해 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된다.
N10 . ADEPT 및 전구약물 치료요법
9D2, 3G4(ATCC 4545) 등을 포함하는 본 발명의 항체를 또한 전구약물과 함께 사용할 수 있으며, 여기서, 항체는 항체와 접촉시에만 더욱 활성인 형태로 전구약물을 전환시키는 전구약물-활성화 효소와 같은 전구약물-활성화 성분과 작동적으로 연합된다. 이러한 기술은 일반적으로 "ADEPT"라고 명명되며, 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된 제WO 95/13095호; 제WO 97/26918호, 제WO 97/24143호, 및 미국 특허 제4,975,278호 및 제5,658,568호에 기술되어 있다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "전구약물"은 모 약물과 비교하여, 종양 혈관 내피 세포를 포함하는, 표적 세포에서 감소된 세포독성 또는 달리는 항세포 효과를 발휘하는 생물학적으로 또는 약제학적으로 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 말한다. 바람직하게는, 전구약물 또는 전구체 형태는 "본래의" 또는 모 형태와 비교하여 현저히 감소되거나, 더욱 바람직하게는, 무시할 정도의 세포독성 또는 항세포 효과를 발휘한다. "전구약물"은 활성화되거나 전환되어 약물의 더욱 활성인 모 형태로 수득될 수 있다.
전구약물을 제조 및 사용하는 기술적 능력은 통상의 기술자의 기술내에 있다. 문헌(참조: Willman et al. (1986) 및 Stella et al. (1985))는 각각 각종의 전구약물의 제조 및 사용에 관한 교시 및 상기 기술을 추가로 보충할 목적을 위해 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된다. 본 발명의 내용에서 사용될 수 있는 예시적인 전구약물 작제물의 예는 포스페이트-함유 전구약물(미국 특허 제4,975,278호), 티오포스페이트-함유 전구약물, 설페이트-함유 전구약물, 펩타이드계 전구약물(미국 특허 제5,660,829호; 제5,587,161호; 제5,405,990호; 제WO 97/07118호), D-아미노산-개질된 전구약물, 글리코실화된 전구약물(미국 특허 제5,561,119호; 제5,646,768호, 제5,041,424호), β-락탐-함유 전구약물, 임의 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물(미국 특허 제4,975,278호), 임의 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 및 5-플우로로사이토신(미국 특허 제4,975,278호) 및 5-플루오로우리딘 전구약물 등을 포함하며, 여기서, 이들 특허 각각은 본원에 참조로 상세히 인용된다.
전구약물 형태로 사용될 수 있는 치료제 또는 세포독성 약물의 유형은 크게 제한되지 않는다. 더욱 세포독성인 제제가 이러한 전달, 예를 들면, 전구약물로서 사용하기에 덜 바람직한 응고제의 전달 형태에 바람직할 것이다. 전구약물을 형성하는데 요구되는 모든 것들이 작제물로 설계되므로 전구약물은 실질적으로 불활성이며 "방출되거나" 또한 활성화된 약물은 실질적인, 또는 적어도 충분한 요구되는 목적의 활성을 지닌다.
원래의 전구약물에서 각종 개선은 또한 알려져 있으며 제WO 95/03830호; 유럽 특허 제751,144호(안트라사이클린); 제WO97/07097호(사이클로프로필인돌); 및 제WO96/20169호에 기술된 바와 같이 본원에 사용하기 위해 고려된다. 예를 들어, 감소된 Km을 갖는 전구약물은 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된 미국 특허 제5,621,002호에 기술되어 있으며, 이는 본 발명의 내용에서 사용될 수 있다. 세포내적으로 수행되는 전구약물 치료요법은 본원에 참조문헌으로 상세히 인용되고 본원에서 실시될 수 있는 제WO 96/03151호에 의해 예시되어 있는 바와 같이, 공지되어 있다.
ADEPT에서 사용하기 위해, 전구약물을 더욱 활성인 약물로 활성화시키거나 전환시키는 제제를 본 발명의 항체에 작동적으로 부착시킨다. 따라서 항체는 혈관형성 또는 종양 부위내에서 전구약물 전환능을 국재화함으로써, 활성 약물은 단지 이러한 부위에서만 생성되며 순환계 또는 건강한 조직내에서는 생성되지 않는다.
전구약물 활성화에서 작용하기 위한 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 효소는 포스페이트-함유 전구약물과 배합하여 사용하기 위한 알칼린 포스파타제(미국 특허 제4,975,278호); 설페이트-함유 전구약물과 배합하여 사용하기 위한 아릴설파타제(미국 특허 제5,270,196호); D-아미노산-개질된 전구약물과 배합하여 사용하기 위한, 펩티다제 및 세라티아 프로테아제와 같은 프로테아제, 터몰라이신, 서브틸리신, 카복시펩티다제(미국 특허 제5,660,829호; 제5,587,161호; 제5,405,990호) 및 카텝신(카텝신 B 및 L 포함); D-아미노산-개질된 전구약물과 배합하여 사용하기 위한 D-알라닐카복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물과 배합하여 사용하기 위한 β-갈락토시다제 및 뉴라미나제와 같은 카보하이드레이트-절단 효소(미국 특허 제5,561,119호; 제5,646,298호); β-락탐-함유 전구약물과 배합하여 사용하기 위한 β-락타마제; 이들의 아미노 질소에서 페녹시아세트아미드 또는 페닐아세트아미드 그룹으로 유도체화된 약물과 배합하여 사용하기 위한 페니실린 V 아미다제(미국 특허 제4,975,278호) 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제; 및 5-플루오로사이토신계 전구약물(미국 특허 제4,975,278호)과 배합하여 사용하기 위한 사이토신 데아미나제(미국 특허 제5,338,678호; 제5,545,548호)를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 이들 특허 각각은 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된다.
촉매적 항체 또는 "아브자임(abzyme)"으로 알려져 있는 효소 활성을 지닌 항체를 또한 전구약물을 활성 약물로 전환시키기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 항체, 특히 9d2 및 3g4 등의 항체를 기준으로한 아브자임은 따라서 본 발명의 다른 측면을 형성한다. 아브자임을 제조하는 기술적 능력은 또한 마브자임 교시를 보충하기 위한 목적으로 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된 문헌[참조: Massey et al. (1987)]에 예시된 바와 같이 당해 분야의 숙련가의 기술내에 존재한다. 질소 머스타드 아릴 카바메이트와 같이, 카바메이트 위치에서 전구약물의 파괴를 촉매할 수 있는 촉매적 항체가, 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된 유럽 특허 제745,673호에 기술된 바와 같이, 또한 고려된다.
O. 항체-피복된 리포좀 및 치료요법
리포좀 제형은 종종 치료제 및 약제로 사용된다. 그러나, 초기 연구에서 리포좀의 생분포는, 이러한 제형이 사람에서 사용하기 위해 광범위하게 적용될 수 없음을 의미하였다. "은밀화(stealth) 또는 은밀화된(stealthed)" 리포좀 및 제형의 기술은 개발되었으며, 이는 리포좀이 더욱 오래 순환하도록 한다. 은밀화 리포좀에서 사용하기 위한 바람직한 제제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이며, 수득되는 리포좀은 또한 페길화(PEGylated) 리포좀으로 명명된다.
은밀화 리포좀은 암 환자에서 종양으로 세포독성제를 전달하는데 사용하기 이해 제안되었다. 약물의 범위는 시스플라틴(참조: Rosenthal et al., 2002), TNFα(참조: Kim et al., 2002), 독소루비신(참조: Symon et al., 1999) 및 아드리아마이신(참조: Singh et al., 1999)를 포함하는 은밀화 리포좀내포 혼힙되며, 각각의 문헌은 본원에 참조문헌으로 상세히 인용된다. 그러나, 최근의 보고는 전이성 유방암의 치료시 은밀화 리포좀 독소루비신 및 비노렐빈의 예측치못한 저 효능을 나타낸다(참조: Rimassa et al., 2003).
본 발명은 은밀화 리포좀이 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS 또는 PE에 결합하는 항체와 작용적으로 관련되거나 "피복된", 당해 기술분야의 각종 단점을 극복하는, 개선된 은밀화 리포좀 제형을 제공한다. 본 발명의 경쟁 항체인, 9D2, 3G4(ATCC 4545) 등은 이러한 용도에 바람직하지만, 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는, 어떠한 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 사용할 수 있다, 2가 항체 또는 항원 부분은 본 발명의 이러한 측면에서 필요하지 않다,
어떠한 은밀화 리포좀은 새로원 리포좀성 제형의 기초를 형성할 수 있으며, 바람직하게는 페길화 리포좀이 사용될 것이다. 은밀화 리포좀은 "피복"된다; 즉 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 항체와 작동적으로 또는 작용적으로 연합된다. 작동적 또는 작용적 연합은 항체가 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS 또는 PE에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하도록 제조하여, 은밀환 리포좀 및 이의 어떠한 내용물을 종양 세포 혈관 내포 세포와 같은 PS- 및/또는 PE-양성 세포로 운반하거나 표적화하도록 한다.
본 발명의 항체 피복된 은밀화 리포좀은 단독으로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 그러나, 이러한 리포좀은 또한 하나 이상의 제2 치료요법제, 예를 들면 항암제 또는 화학치료요법제(제1 치료요법제는 자체의 항체이다)을 포함할 수 있다. 제2 치료요법제는 일반적으로 리포좀의 "코어"내에 존재하는 것으로 기술된다. 제2의 항암제 또는 화학치료요법제 중의 어떠한 하나 이상은 당해 기술분야에 공지되어 있고/있거나 항체에 대한 연결을 위해 본원에 기술되어 있다. 예를 들면, 모든 화학치료제 또는 방사선치료제, 사이토킨, 항-혈관형성제 또는 세포사멸-유도체이다. 화학치료제내에 현재 바람직한 것은 항-튜불린 약물, 도세탁셀 및 파클리탁셀이다.
더우기, 본 발명의 항체-피복된 은밀화 리포좀을 또한 바이러스 감염 및 질병을 치료하는데 사용하기 위한 하나 이상의 항-바이러스 약물에 부하시킬 수 있다. 항암제와 함께, 당해 분야에 공지되어 있고/있거나 항체에 접합시키기 위해, 또는 배합 치료요법을 위해 본원에 기술된 하나 이상의 제2의 항-바이러스 약물은 본 발명으 항체-피복된 은밀화 리포좀내에서 사용될 수 있다. 시초파비르 및 AZT가 현재 바람직한 예이다.
P. 항-혈관, 항-혈관형성 및 기타 치료제
본 발명은 또한, 전혈전성 혈관을 지닌 질병 및 질환을 포함하는, 비정상의 혈관구조가 포함된 기타 질병의 치료에 사용될 수 있다. 비록, 치료학적 메카니즘은 아니라고 해도, 본 발명의 항체, 면역접합체 및 펩타이드계 치료제는 또한 각종 질병 및 질환에 기여하는 것과 같은, 비정상적인 혈관형성을 지닌 동물 및 사람을 치료하는데 사용될 수 있다.
항-혈관형성, 전혈전성 혈관구조 또는 다른 항-혈관 메카니즘에 기초하는 것에 상관없이, 본 발명은 관절염, 류마티스 관절염, 건선, 죽상경화증, 당뇨병성 망막증, 노화-관련 황반 변성, 그레이브스 질병, 혈관형성술후 재협착을 포함하는 혈관 재협착, 동정맥기형(AVM), 수막종, 혈관종 및 신생혈관 녹내장을 포함하는, 암 분야이외의 우세하고/하거나 임상적으로 중요한 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 개입용의 다른 표적은 혈관섬유종, 죽상경화판, 각막 이식 신생혈관화, 혈우병 관절, 비대 흉터, 오슬러-웨버 증후군(osler-weber syndrome), 발열성 육아종 수정체뒤섬유증식, 피부경화증, 트라코마, 혈관 병변, 윤활막염, 피부염, 각종의 기타 염증 질병 및 질환, 및 심지어 자궁내막증을 포함한다. 본 발명에 의해 치료가능한 추가의 질병 및 질환, 및 이러한 질병의 단일화된 기초는 하기에 설정된다.
비정상적인 혈관구조 및 혈관형성이 포함된 하나의 우세한 질병은 류마티스 관절염이며, 여기서, 관절의 윤활막 내층내 혈관에는 혈관형성이 일어난다. 새로운 혈관 네트워크의 형성외에, 내피 세포는 판누스 성장 및 연골 파괴를 초래하는 인자 및 반응성 산소 종을 방출한다. 혈관형성에 포함된 인자는 류마티스 관절염의 임상적인 염증 상태에 할성적으로 기여하거나 유지하는데 도움을 줄 수 있다. 혈관형성과 관련된 인자는 또한 골관절염에서 역활을 담당하여 관절의 파괴에 기여한다. VEGF를 포함하는 각종 인자들이 류마티스 관절염 및 골관절염의 발병기전에 포함되는 것으로 밝혀졌다.
비정상적인 혈관구조 및 혈관형성에 포함되는 질병의 다른 중요한 예는 안구 신생혈관 질병이다. 당해 질병은 새로운 혈관의 망막 또는 각막과 같은 눈 구조내로의 침입에 의해 특징화된다. 이는 실명의 가장 일반적인 원인이며 대략 20가지의 눈 질병에 관련된다. 노화-관련 황반 변성에서, 관련된 시각 문제는 망막 색소 내피아래쪽의 섬유혈관 조직이 증식되는 브루크 막(Bruch's membrane)내 결손을 통한 콜로이드성 모세관의 내증식이 원인이다. 혈관형성 손상은 또한 당뇨병성 망막증, 조숙의 망막병증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장 및 수정체뒤섬유증식과 연관된다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 각막 신생혈관화와 연관된 다른 질병은 유행각막결막염, 비타민 A 결핍증, 접촉 렌즈 과도착용, 아토피성 각막염, 우세한 가장자리 각막염, 익상편 각막염 건조, 소그렌스(sjogrens), 장미 여드름, 플릭텐증(phylectenulosis), 매독, 마이코박테이아 감염, 지질 변성, 화학물질 화상, 세균성 궤양, 진균성 궤양, 헤르페스 단성 감염, 페르페스 조스터 감염, 원생동물 감염, 카포시 육종, 무어렌 궤양(Mooren ulcer), 테리엔 모서리 변성(Terrien's marginal degeneration), 모서리 각질용해, 류마티스 관절염, 전신계 낭창, 다발동맥염, 외상, 베게너 사르코이드(Wegeners sarcoidosis), 공막염, 스티븐스 존슨 질병(Steven's Johnson disease), 페리피고이드(periphigoid) 방사상 각막절개, 및 각막도 거부를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 망막/맥락막 신생혈관화와 관련된 질병은 당뇨병성 망막증, 황반 변성, 낫적혈구 빈혈, 사르코이드, 매독, 탄력섬유거짓황색종, 페제트병, 정맥 페색, 동맥 폐색, 목동맥 폐쇄 질병, 만성 포도막염/유리체염, 마이코박테리아 감염, 림스병(Lyme's disease), 전신계 심재홍반루프스, 조기의 망막증, 얼스 병(Eales disease), 베체트 병(Bechets disease), 감염 원인의 망막 또는 맥락막, 추정된 안구 히스토플라스마종, 베스트 질병(Bests disease), 근시, 광학 피트(pets), 스타가르트병(Stargarts disease), 파르스플래니티스(parsplanitis), 만성 망막 탈착, 고점도 증후군, 톡소포자충증, 외상 및 레이저후 합병증을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 다른 질병은 당뇨병과는 관련 여부에 상관없이, 피부홍조와 관련된 질병(각의 신생혈관화) 및 모든 형태의 증식성 유리체망막병증을 포함하는 섬유혈관 또는 섬유 조직의 비정상적인 증식에 의해 유발되는 질병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
만성 염증은 또한 비정상적인 혈관구조 및 병리학적 혈관형성을 포함한다. 궤양결장염 및 크론병(Crohn's disease)과 같은 질병 상태는 새로운 혈관의 염증 조직내로의 내성장을 지닌 조직학적 변화를 나타낸다. 바르토넬라증, 남아메리카에서 발견된 세균 감염은 혈관 내피 세포의 증식에 의해 특징화되는 만성 단계를 초래할 수 있다.
비정상적인 혈관구조 및 혈관형성과 연관된 다른 병리학적 역활은 죽상경화증에서 발견된다. 혈관의 내강내에 형성된 플라크는 혈관형성 자극 활성을 지닌 것으로 밝혀졌다. 사람 관상 죽상경화증의 진행, 및 폐색성 관상 질병에 있어서 재소통 과정시, VEGF와 같은 혈관형성 마커의 병리생리학적 유이성이 특히 입증되어 있다. 본 발명은 이러한 상태의 효과적인 치료를 제공한다.
어린이의 가장 흔한 혈관형성 질병중 하나는 혈관종이다. 가장 많은 경우에, 종양은 양성이고 개입없이 퇴행한다. 더욱 심각한 경우에서, 종양은 큰 해면 및 침윤 형태로 진행되고 임상적인 합병증을 초래한다. 혈관종의 전신계 형태인 혈관종증은 치사율이 높다. 현재 사용되는 치료요법을 사용하여 치료될 수 없으나 본 발명에 의해 치료되는 치료요법 내성인 혈관종도 존재한다.
혈관형성은 또한 오슬러-베버-렌듀 질병(Osler-Weber-Rendu disease) 또는 유전적 출혈성 모세혈관확장증과 같은 유전병에서 발견되는 손상에 관여한다. 이는 다수의 소 혈관종(angioma), 혈액 종양 또는 림프관 종양으로 특성화되는 유전병이다. 혈관종은 피부 및 점막에서 발견되며, 흔히 코피(코출혈) 또는 위장 출혈을 동반하며 때때로 폐 또는 간 동정맥루가 동반된다.
혈관형성은 또한 재생 및 상처 치유와 같은 정상적인 생리학적 과정에 포함된다. 혈관형성은 배란 및 또한 수정후 주머니배의 착상에 있어 중요한 단계이다. 본 발명에 따른 혈관형성의 방지는 무월경을 유도하거나, 배란을 차단하거나, 주머니배에 의한 착상을 방지하는데 사용될 수 있다. 상처 치유시, 과도한 회복 또는 섬유증식은 외과 수술의 치명적인 부작용일 수 있으며 혈관형성에 의해 유도되거나 악화될 수 있다. 유착은 수술의 흔한 합병증이며 소장 폐색과 같은 문제를 야기한다. 이는 또한 본 발명에 의해 치료될 수 있다.
모든 유형의 종양과 함께 앞서의 질병 및 장애들 각각은 또한 본 발명에 따른 치료에 고려된다. 미국 특허 제5,712,291호는 특히 혈관형성이 특정 제제를 사용함에 의해 억제되며, 상기 제제 및 유사 제제의 사용으로 비정상적인 혈관형성과 관련된 광범위한 범위의 질병에 대한 치료가 충분히 수행될 수 있다는 당해 분야의 지식을 추가로 입증하기 위해 본원에 참조로 인용된다. 미국 특허 제6,524,583호는 또한 이러한 원리가 혈관형성의 억제 및 혈관형성의 억제 및 항체계 치료요법을 사용한 혈관형성 질환의 치료에 적용된다는 사실을 특히 입증하기 위해서 및 유사 목적을 위해 본원에 참조조 인용된다. 즉 종양을 지닌 마우스(참조: 도 제17A)에서 3G4 항체(ATCC 4545)의 항혈관형성 효과는 3G4 및 유사 항체가 광범위한 혈관형성 질병을 치료하는데 적합하다는 중요한 증거이다.
본 발명은 또한 아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질, 특히 PS 및 PE가 역활을 하는 다른 질병을 치료하는데 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, PS는 세포 부착에 포함되므로, 염증 반응 및 패혈성 쇼크(shock) 및 PS에 대한 항체는 염증 및 패혈성 쇼크의 치료에 사용될 수 있다. 3G4(ATCC4545) 또는 유사 항체의 사용은 이러한 양태, 특히 이러한 항체의 Fab 이량체의 경우에 바람직하다. 듀라마이신 Fab 이량체는 또한 패혈성 쇼크를 치료하는데 사용하기 위해 고려된다.
아미노인지질 및/또는 음이온성 인지질, 특히 PS는 또한 청소 메카니즘의 일부로써 낫적혈구 빈혈에 포함된다. 3G4(ATCC 4545)의 사용 또는 유사 항체, 특히 이의 Fab 이량체가 바람직하다.
대부분의 세균은 음이온성 인지질인 PA를 발현한다. 따라서, 임의로 다른 음이온성 인지질에 결합하면서 PA에 결합하는 항체는 항-세균제로 사용될 수 있다. 비록 본 발명의 항체가 이. 콜라이에서 제조됨으로서 모든 환경에서 살세균제가 아니라고 해도, 생체내에서 항세균 역활은 보체를 고정시키는 능력으로부터 귀결되는 것으로 여겨진다. 따라서, 항체 단편외에 완전한 항체는 항-세균제로 사용된다. 3G4(ATCC 4545) 및 유사 항체는, 표 4로부터의 기타 PA-결합 항체와 같은 비록 보체를 고정시키고 PA에 결합하는 어떠한 항체도 사용할 수 있다고 해도, 이러한 양태에서 사용하기에 바람직하다.
항체가 신체 자체의 인지질에 대해 생성되는 항인지질 증후군 및 루프스, 자가면역 장애는 유산 및 저혈소판증(저 혈소판수)을 포함하는 응고 질환과 관련되어 있다. 따라서, 이러한 환자에서 항-인지질 항체는 혈전증을 유발하는 병원성 항체이다. 그러나, 본 발명의 항체는 이러한 부작용을 나타내지 않으면서 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합한다. 따라서, 본 발명의 항체는 항인지질 증후군, 관련 질병 및 이의 합병증을 치료하는데 사용하기 위해 고려된다.
항인지질 증후군을 지닌 환자에서 순환하는 병원성 항-인지질 항체는 PS, PE 및 β2-당단백질 I, 프로트롬빈, 키니노겐, 프레칼리크레인 및 인자 XI와 같이 단백질과 결합한 기타 인지질에 결합하는 것으로 여겨진다(참조: Rote, 1996; Sugi and McIntyre, 1995; 1996a; 1996b). β2-당단백질 I 및 PS에 결합한 프로트롬빈은 각각 항-카디올리핀 항체 및 낭창 항체에 대한 주요 항원인 것으로 보고된다. 본 발명의 항체는 특히 단지 혈청 단백질의 존재하에서 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하지 않는 것을 기준으로 선택된다. 따라서, 인지질 성분에 대한 결합에 의해, 본 발명의 항체는 이러한 환자에서 병원성 항체를 길항하거나 병원성 항체와 경쟁함으로써, 체내에서 인지질- 단백질 표적물로부터 병원성 항체를 교체하는데 사용하기 위해 고려된다.
Q. PE -결합 펩타이드 유도체 및 접합체
항체 및 면역접합체외에, 본 발명은 또한 PE-결합 펩타이드 유도체 및 종양 및 특히 바이러스 질환의 치료시 각종 용도를 제공한다. 현재 바람직한 PE-결합 펩타이드 작제물 및 유도체는 듀라마이신이라 불리는 펩타이드를 기준으로 한 것들이다. PE-결합 펩타이드와 듀라마이신 유도체의 3가지 일반적인 범주가 본 발명에 의해 제공되며, 이들중 2개는 작제물의 표적화 부위로서 PE-결합 펩타이드 또는 듀라마이신을 사용하며, 다른 것은 작제물의 효과기 부분으로서서 주로 듀라마이신 또는 기타 제제를 사용한다.
표적화제로서 PE-결합 펩타이드, 바람직하게 듀라마이신의 사용은 수득되는 작제물에 대한 선택적인 결합력을 부여하는 이들의 능력을 기초로 한다. 따라서, PE-결합 펩타이드, 특히 듀라마이신을 함유하는 작제물 또는 접합체는 종양 혈관 내피 세포, 악성 종양 세포, 증식 세포 및/또는 바이러스 감염된 세포와 같은 PE-발현 세포에 특이적으로 결합할 것이다.
듀라마이신과 같은 PE-결합 펩타이드는 PE 표적화 작용외에 생물학적 활성을 지니므로, 듀라마이신과 같은 PE-결합 펩타이드를 치료제에 접합시켜 치료학적 접합체를 생성시킬 필요가 없다. 그러나, 듀라마이신과 같은 PE-결합 펩타이드는 이들의 천연 형태에서 독성과 관련되어 있으므로, 당해 펩타이드는 독성을 감소시키도록 개질되어야 한다. 독성은 군집을 형성하고 세포막내에 공극을 형성시키며, 일반적으로 세포 내로 침투 또는 관통하기 위한 펩타이드의 능력과 연결된다. 이에 따라, 이들 기능은, PE-결합 펩타이드가 군집을 형성하고, 세포내로 침투하여 비특이적으로 독성이 되는 것을 현저하게 또는 실질적으로 방지하기 위해 약화되어야 한다. 바람직하게는 PE에 결합하는 능력은 실질적으로 유지하는 반면, 군집을 형성하고 세포를 침투하는 PE-결합 펩타이드의 능력은 실질적으로 억제함으로써 세포독성을 현저히 감소시키거나 무효화시킨다.
본 발명에 의해 제공된 독성이 감소된 PE-결합 펩타이드의 제1 범주는, PE-결합 펩타이드, 특히 듀라마이신이 상대적으로 또는 실질적으로 세포 침투성이 되도록 하는 것이다. 이것은 바람직하게는 양성 또는 음성 전하 또는 극성 그룹을 갖는 소 그룹일 수 있거나 불활성 담체의 형태일 수 있는 세포 침투성 그룹에 부착시킴에 의해 달성된다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "세포 침투성 그룹" 및 "세포 침투성 PE-결합 펩타이드"는 절대적이라기 보다는 상대적이며, 개질된 PE-결합 펩타이드, 바람직하게는 듀라마이신을 말하는데, 여기서, 군집을 형성하고 세포를 침투하는 능력은 현저하게 및 바람직하게는 실질적으로 감소되어 있다. 수득되는 세포 침투성 PE-결합 펩타이드는 세포 외부에서 PE 및 관련된 막 분자를 포획함으로써 및/또는 펩타이드-피복된 세포에서 숙주 방어가 생성되도록 함으로써 작용할 수 있다.
*PE-결합 펩타이드 유도체의 범주내에서, 특정의 작제물은 숙주 방어의 회복을 향상시킴으로써 이들의 치료학적 활성을 증진시킨다. 예를 들어, PE-결합 펩타이드, 바람직하게는 듀라마이신이 면역글로불린에 부착되는 경우, 당해 면역글로불린은 불활성 담체 및 면역 효과기로서 작용할 수 있다. 이는 소위 "비가역적 특이성"의 면역글로불린 및 Fc 영역과 같은 항원 결합능이 없는 면역글로불린 유도체에 적용된다. 부착된 면역글로불린 또는 면역글로불린 유도체에 의해, 이러한 작제물은 예를 들면, 면역 효과기 세포에 부착하고/하거나 활성화시킴에 의해 PE-발현 세포에 대한 숙주 방어를 재지시할 수 있을 것이다.
본 발명의 PE-결합 펩타이드 유도체의 제2의 일반적인 범주에서, 당해 펩타이드는 작은 세포 침투성 그룹 또는 불활성 담체를 사용하기 보다는 여전히 세포 침투 및 수득되는 독성을 감소시키기 위해 개질되며, 수득되는 작제물의 혈액 및 조직 분포를 변화시키는 제제가 사용된다. 바람직한 예는, PE-결합 펩타이드, 바람직하게는 듀라마이신이 종양 세포, 종양 또는 종양내 혈관 또는 종양 기질의 성분에 결합하는 표적화제에 부착되는 것이다. 비록 PE-결합 펩타이드 자체가 여전히 표적화 특성을 지닌다고 해도, 본 발명의 측면에서, 표적화제는 종양 환경과 같은 표적 조직에 대해 작제물을 주로 지시하며, 듀라마이신과 같은 부착된 PE-결합 펩타이드는 전달시 치료학적 효과를 발휘한다.
PE-결합 펩타이드 유도체의 제3의 일반적인 범주는 PE-발현 세포에 대해 유도체를 국재화시키기 위한 표적화제로서 PE-결합 펩타이드, 바람직하게는 듀라마이신의 사용에 관한 것이다. 바이러스 감염된 세포는 정상의 감염되지 않은 세포와는 대치되는 것으로써, 세포 표면에서 PE를 발현하므로, 듀라마이신과 같은 PE-결합 펩타이드의 항-바이러스제에 대한 연결은 효과적이고, 표적화된 항-바이러스제를 제공할 것이다. 비록, PE-결합 펩타이드 일부, 바람직하게는 듀라마이신이 추가의 치료학적 효과를 가질 수 있다고 해도, 부착된 항-바이러스제는 이러한 작제물내에서 주요 치료제가 되도록 설계된다.
가교-결합, 펩타이드 스페이서, 바이오틴-아비딘 작제물 및 재조합 발현을 포함하는, 위에서 기술한 접합 기술의 어느것도 본 발명에 따라 듀라마이신 유도체를 제조하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 듀라마이신 분자내 유리한 부착 부위는 듀라마이신 서열(서열 9; 도 13P; Hayashi et al., 1990)내 아미노산 2번 위치의 라이신 잔기이다. 그러나, 이러한 부위에서 연결은 본 발명의 요구조건이 아니다.
따라서, PE-결합 펩타이드, 바람직하게는 듀라마이신은 가교-결합 목적을 위해 유용한 작용성 그룹을 가지도록 유도체화할 수 있다. 광범위한 그룹, 예를 들어, 1차 또는 2차 아민 그룹, 하이드라지드 또는 하이드라진 그룹, 카복실 알콜, 포스페이트, 카바메이트 및 알킬화제가 이러한 방식으로 사용될 수 있다. 따라서, 항-바이러스제를 포함하는 부착용 제제는 시프스 염기 연결(Schiff's base linkage), 하이드라존 또는 아실 하이드라존 결합 또는 하이드라지드 링커를 통해 접할될 수 있다(참조: 미국 특허 제5,474,765호 및 제5,762,918호, 각각 본원에서 참조로 상세히 인용됨).
Q1. PE-결합 및 항-미생물 펩타이드
어떠한 PE-결합 펩타이드도 본 발명의 이러한 국면에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 저 분자량 및 고 분자량 키니노겐은 PE에 결합하는 것으로 공지되어 있다. 사람 단백질을 포함하는 이러한 각종의 결합 단백질에 대한 단백질 및 DNA 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며, 이러한 사실로부터 PE-결합 펩타이드의 사용을 용이하게 한다. 예를 들어, 고분자량 및 저분자량 키니노겐에 대한 사람 유전자 및 단백질은, 각각 본원에 참조로 상세히 인용된 문헌[참조: Kitamura et al. (1985) 및 Kellermann et al. (1986)]에 기재되어 있다.
미국 특허 제6,312,694호는 키니노겐과 같은 PE-결합 펩타이드, 및 이의 PE-결합 단편을 사용한 특정의 PE-결합 접합체를 기술하고 있다. 미국 특허 제6,312,694호에서는, PE-결합 단백질 또는 이의 PE-결합 단편이 항-세포제, 독소 및 응고 인자에 작동적으로 부착된다. 본 발명의 경우에, PE-결합 펩타이드는 불활성 담체, 종양 표적화제 또는 항바이러스제에 부착된다. 비록 부착용의 본 발명의 제제 및 이의 사용 방법이 놀랄만하게 개선되었다 하더라도, 미국 특허 제6,312,694호는 키니노겐의 PE-결합 펩타이드 단편과 같은 PE-결합 펩타이드를 추가로 기술하고 가능하도록 할 목적으로 본원에 참조로 상세히 인용된다.
본 발명에 사용하기 위한 현재의 바람직한 PE-결합 펩타이드는 PE-결합 분자, 듀라마이신을 기초로 하는 것들이다. 듀라마이신(2622U90, Moli1901)은 란티바이오틱스 계열(참조: 미국 특허 제4,452,782호; Shotwell et al., 1958; Nakamura and Racker, 1984)로부터의 항미생물 펩타이드이며, 란티바이오틱스 계열의 다른 구성원이 본 발명에서 사용될 수 있다. PE-결합 펩타이드가 작제물의 표적화제로서 사용되는 경우, 불활성 담체 또는 항-바이러스제에 연결될 때, 란티바이오틱스 PE-결합 펩타이드는 실질적으로 PE-결합 활성을 보유한다. 작제물내에서 치료제로서 사용되는 경우, 특히 종양 표적화제에 부착되는 경우, PE-결합 활성의 일부 상실에 대해 더욱 내성이다.
PE에 실질적으로 결합하는 것들을 확인하거나 동정하기 위한 후보 펩타이드를 시험하는 것은 본 기재의 측면에서 직접적인 문제이며 예를 들면, 본원에 기술된 하나 이상의 어떠한 ELISA를 사용하여서도 달성할 수 있다. 본원에서 PE-결합 펩타이드로서 사용하기 위한 란티바이오틱스는 바람직하게는 듀라마이신과 동일한 PE-결합 활성을 나타낼 것이며, 더욱 더 바람직하게는, 또한 듀라마이신과 같은 다른 인지질보다 PE에 대해 실질적으로 동일한 특이성을 나타낼 것이다. 이러한 특성은 또한 본 발명의 기술, 특히 작업 실시에의 측면에서 용이하게 측정될 수 있다.
위의 기준을 기초로 하여, 하기 란티바이오틱스를 본 발명의 작제물 및 접합체의 일부로서 사용할 수 있다: 듀라마이신, 신나마이신, 악타가르딘, 안코베닌, 에피데르민, 갈리데르민, 란티오펩틴, 메르사시딘, 니신, Pep5 및 서브틸린. 듀라마이신이 본 발명의 모든 측면에서 사용하기에 가장 적합한 PE-결합 펩타이드이다. 듀라마이신은 또한 천식, 만성 기관지염 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염(참조: 미국 특허 제5,849,706호; 제5,716,931호; 제5,683,675호; 제5,651,957호 및 제5,512,269호; 이들 각각은 본원에 참조로 인용된다) 및 낭종 섬유증(참조: McNulty et al., 2003)을 치료하는데 사용하는 것으로 제시되어 있는 항미생물제이다. 그러나, 듀라마이신은 이전에 세포 침투성 그룹에 대한 접합체, 특히 바이러스 감염을 치료하는데 사용하는 것으로 기술되거나 제안되어 있지 않다.
신나마이신(Ro09-0198)은 PE에 결합하는 관련 분자이다(참조: Wakamatsu et al., 1986; Choung et al., 1988a; 1988b). 표지된 신나마이신은 시험관내에서 T 세포의 세포사멸동안에 PE의 전이이중막 이동(참조: Aoki et al., 1994; Emoto et al., 1996) 및 PE 노출을 연구하기 위한 프로브로서 사용되어 왔다. 그러나, 본 발명에 따라서 신나마이신 유도체의 치료학적 사용은 앞서 기술되거나 제시되지 않았다. 따라서, 신나마이신을 기초로 하는 본 발명의 PE-결합 펩타이드 유도체를 함유하는 약제학적 조성물, 및 이의 각종 의학적 용도는, 특히 이러한 조성물이 바이러스 감염을 치료하는데 사용하기 위해 요구되는 경우에, 당해 분야에서 가장 먼저 제시한 것이다.
하기 항-미생물 펩타이드를 또한 본 발명의 접합체에서, 특히 종양 표적화제에 대해 부착된 치료제, 예를 들면, 페디오신 AcH/PA1과 같은 시스티바이오틱스, 류코신 A/Ual 187, 메센테리신 Y 105, 사카신 A, 사카신 P, 락타신 F, 세레인 7/8 및 카노박테리오신 A, BM1 및 B2와 같은 카노박테리오신; 및 티올바이오틱스, 특히 락토콕신 B, A, Ma, Na, Ga 및 G로서 사용될 수 있다.
Q2 . 세포 비침투성 그룹
PE-결합 펩타이드, 바람직하게 듀라마이신의 세포 비침투성 그룹에 대한 부착은 집단을 형성하기 위한 펩타이드의 능력을 감소시켜, 실질적으로 정상 세포로의 침투로부터 PE-결합 펩타이드를 예방함으로서 독성을 감소시킬 것이다. 그러나, PE-결합 특성은 유지됨으로써, 펩타이드가 표면에 노출된 PE를 갖는 비정상의 또는 감염된 세포에 국재화되도록 할 수 있다.
예시적인 세포 비침투성 그룹은 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 카복실, 페놀성, 4급 암모늄 이온 및 아민 그룹과 같이 생리학적 pH에서 양성 또는 음성 전하는 생성하는 그룹을 포함한다. 추가의 예는 단순 당 및 다당류, 아미노산 및 폴리알콜과 같은 극성 그룹이다. 듀라마이신은 특히 바이오틴에 연결되어 바이오티닐화된 PE-결합 펩타이드를 형성할 수 있는데, 이러한 PE-결합 펩타이드는 바이러스 감염 치료를 위해 의도된 약제학적 조성물 또는 의약내에 분산될 수 있다. 세포 침투성 그룹은 또한 폴리펩타이드, 단백질 또는 면역글로불린일 수 있으며, 이들중 어느것도 불활성 담체 또는 표적화제로서 작용할 수 있다.
Q3 . 불활성 담체
PE-결합 펩타이드, 바람직하게는 듀라마이신은 불활성의 세포 침투성 담체에 대한 부착에 의해 세포 침투성이 될 수 있다. 광범위한 불활성의 세포 침투성 담체는 PE-결합 펩타이드, 바람직하게는 듀라마이신에 접합하여, PE-결합 활성이 실직적으로 파괴되지 않는 한, 세포 침투성 PE-결합 펩타이드를 제조할 수 있다. 불활성 담체는 바람직하게는 생물학적으로 상용성이어서, 이들이 동물 또는 환자에게 투여시 어떠한 현저한 부작용도 초래하지 않아야 한다.
담체 단백질이 사용될 수 있으며, 예시적인 단백질은 알부민 및 글로불린이다. 뉴트라비딘 및 스트렙타비딘이 흔히 바람직할 것이다. 다당류 및 PEG를 포함하는, 천연 또는 합성 중합체와 같은 비-단백질 담체도 또한 사용될 수 있다
특정의 양태에서, 당해 담체는 면역글로불린 또는 이의 일부일 것이다. 사람 면역글로불린(HIgG)이 사람 투여용으로 바람직할 것이다. 면역글로불린은 또한 후술된 바와 같이 표적화 작용을 부여할 수 있다. 불활성 담체로서, 면역글로불린은 "비가역적 특이성"중 하나이며, 여기서, 이는 접합체에 대한 표적화 작용을 부여하지 않는다. 그러나, 특정의 장점은 면역글로불린의 특정 유형의 선택을 통해 달성할 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린의 Fc 부위를 사용하여 숙주 면역 세포를 보충함으로서 숙주 방어를 추가로 자극할 수 있다.
Q4 . 표적화제
불활성 담체에 부착하는 것외에, PE-결합 펩타이드, 바람직하게 듀라마이신은 표적화제, 특히 종양 세포, 종양 또는 종양내 혈관구조 또는 종양 기질의 성분에 결합하는 표적화제에 부착시킴에 의해 세포 침투성이 되도록 할 수 있다. 표적화제는 표적 조직, 바람직하게는 종양 환경에 대해 작제물을 지시하며, 부착된 PE-결합 펩타이드, 바람직하게는 듀라마이신은 전달시 치료학적 효과를 발휘한다.
적합한 표적화제는 종양 세포에 결합하는 항체 및 기타 제제와 같은 성분이다. "종양 세포에 결합하는" 제제는 본원에 종양 세포의 어떠한 접근가능한 성분 또는 성분들에 결합하거나, 자체로 결합된 성분에 결합하거나, 달리는 본원에 추가로 기술된 바와 같이, 종양 세포와 연합된 성분에 결합하는 표적화제로서 정의된다.
이러한 종양 세포-표적화제 및 결합 리간드의 대부분은 세포 표면 종양 항원 또는 마커에 결합하는 제제, 특히 항체일 것으로 고려된다. 많은 이러한 항체는 항원 결합 및 종양 표적화에 사용하기 위한 다양한 항체에서와 같이, 공지되어 있다. 따라서, 본 발명은 정의된 종양 세포 표면 항원에 결합하고/하거나 완전한 종양 세포에 결합하는 표적화제를 포함한다. 미국 특허 제5,877,289호; 제6,004,555호; 제6,036,955호 및 제6,093,399호의 표 I 및 표 II의 확인된 종양 세포 표면 항원 및 완전한 종양 세포는 적합한 종양 세포 표면 항원을 예시하기 위한 목적으로 본원에 참조로 상세히 인용된다.
종양 세포 결합 영역의 예는 세포 표면 종양 항원 p185HER2, 우유 점액소 코어 단백질, TAG-72, 루이스 또는 암종배아 항원(CEA)에 결합하는 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 것들이다. 종양 세포 결합 영역의 다른 그룹은 항체 9.2.27, OV-TL3, MOv18, B3(ATCC HB 10573), KS1/4(벡터 pGKC2310(NRRL B-18356) 또는 벡터 pG2A52(NRRL B-18357)를 포함하는 세포로 부터 입수), 260F9(ATCC HB 8488) 또는 D612(ATCC HB 9796)에 결합하는 종양 관련 항원에 결합하는 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 것들이다. D612는 미국 특허 제5,242,813호에 기술되어 있으며, ATCC 수탁 번호가 제HB 10573호이고; 재조합 및 키메라 KS1/4 항체는 미국 특허 제4,975,369호에 기술되어 있으며; 이들 각각은 본원에 참조로 인용된다.
종양 세포의 표적가능한 성분은 세포질 및/또는 핵 종양 세포 항원을 포함하는 괴사로 부터 또는 달리는 손상된 종양 세포로부터 방출된 성분을 포함한다. 이들은 바람직하게는 침투성이 되도록 유도할 수 있는 세포, 또는 포유동물의 정상적인 생 세포의 외부에 존재하지 않거나 접근불가능한 실질적으로 모든 신생물 세포 및 정상 세포의 세포 유령에 존재하는 불용성의 세포내 항원이다.
알란 엡슈타인(Alan Epstein) 및 동료들에게 허여된 미국 특허 제5,019,368호, 제4,861,581호 및 제5,882,626호는 각각 생체내 악성 세포로부터 접근가능하도록 된 세포내 항원에 특이적인 항체를 제조하여 사용하는 방법을 추가로 기술 및 교시할 목적으로 본원에 참조로 상세히 인용된다. 기술된 항체는 포유동물 악성 세포의 내부 세포 성분으로서 충분히 특이적이나, 외부 세포 성분에는 특이적이지 않다. 예시적인 표적은 히스톤을 포함하나, 괴사 종양 세포로부터 특이적으로 방출된 세포외 성분 모두가 포함된다.
혈관화된 종양을 지닌 동물 또는 환자에게 투여시, 각각의 항체는 생체내 존재하여 적어도 일부의 악성 세포가 괴사가 되도록 하는 종양 재모델화의 과정으로 인하여 혈관화된 종양이 천연적으로 괴사성 종양 세포를 함유한다는 사실로 인해 악성 세포에 국재화한다. 또한, 종양 괴사를 향상시키는 다른 치료요법제와 함께 이러한 항체의 사용은 표적화 및 연속적인 치료요법의 효능을 증진시키도록 제공된다. 따라서, 이러한 유형의 항체는 본원에 기술된 바와 같이 표적화제로서 사용될 수 있다.
종양 내피 및 기질에는 존재하지만 정상 세포, 내피 및 기질에는 거의 존재하지 않는 마커에 결합하는 적합한 표적화제가 유용하다. 종양 혈관구조 표적화를 위해, 표적화 항체 또는 리간드는 흔히 혈관화된 종양의 종양내 혈관에 의해 발현되거나, 이에 흡수되거나, 이러한 혈관에서 유도되거나 달리는 이러한 혈관에 굴재된 마커에 흔히 결합할 것이다. 따라서, "종양 혈관구조의 성분"은 종양 혈관구조 내피 세포 표면 분자, 및 이러한 세포 표면 수용체 또는 분자에 결합할 수 있는 성장 인자와 같은 어떠한 성분 둘다를 포함한다. 하기 특허는 종양 혈관구조의 발현되고, 흡수되고, 유도되고, 국재화된 마커에 대해 지시된 표적화제의 제조 및 사용에 관한 본 발명의 교시를 추가로 지지하기 위한 목적으로 본원에 참조로 상세히 인용된다: 미국 특허 제5,855,866호; 제5,776,427호; 제5,660,827호; 제5,855,866호; 제5,877,289호; 제6,004,554호; 제5,965,132호; 제6,036,955호; 제6,093,399호; 및 제6,004,555호.
종양 및 종양내 혈관의 표면 발현된 표적의 예는 혈관 세포 표면 수용체 및 세포 부착 분자를 포함한다(참조: Thorpe and Ran, 2000, 본원에 참조로 상세히 인용됨, 표 1 참조). 적합한 예는 예를 들면, TEC-4, TEC-11, E-9 및 Snef 항체에 의해 표적화된 엔도글린; 예를 들면, H4/18 항체에 의해 표적화된 E-셀렉틴; 예를 들면 E1/6 및 1.4c3 항체에 의해 표적화된 VCAM-1; 예를 들면, FB5 항체에 의해 표적화된 엔도시알린; 예를 들면, LM609 및 펩타이드 표적화제에 의해 표적화된 ανβ3 인테그린; 다수의 항체 및 특히 VEGF에 의해 표적화된 VEGF 수용체 VEGFR1; 3E7 및 GV39와 같은 다수의 항체에 의해 표적화된 VEGF 수용체 복합체; 및 J591과 같은 항체에 의해 표적화된 PSMA를 포함한다. 엔도글린, TGFβ 수용체, E-셀렉틴, P-셀렉틴, VCAM-1, ICAM-1, LAM-1과 반응성인 리간드, VEGF/;VPF 수용체, FGF 수용체, ανβ3 인테그린, 플레이오트로핀, 엔도시알린과 같은 예는, 각각 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,855,866호; 제5,877,289호; 제6,004,555호; 제6,093,399호에 기술되어 있고 참조가능하다.
추가의 적합한 예는, 각각 특정의 펩타이드 표적화제에 의해 표적화된 NG2와 같은 프로테오글리칸 및 MMP2 및 MMP9와 같은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)를 포함한다(참조: Thorpe and Ran, 2000). 이들은 혈관 재모델화의 부위인, 종양내 표적가능한 실체로서 발현된 재모델화 효소의 예이다. 추가로 적합한 표적은 트롬보모듈린인 Thy-1 및 시스타틴이다. 종양 내피에서 상승된 서열을 확인하는 연구는 또한, 본원에서 참조로 상세히 인용된 미국 특허 제6,004,555호 및 제6,093,399호에 따른, 표적가능한 종양 혈관 마커로서 트롬보모듈린인, MMP 11(스트로멜라이신), MMP 2(겔라티나제) 및 각종의 콜라겐을 지닌다.
다른 적합한 표적은 PSMA(전립선 특이적인 막 항원)이다. 초기에 모노클로날 항체 7E11으로 정의된 PSMA는 원래 전립선 암의 마커로서 확인되었으며 제2형 인테그랄 막 당단백질인 것으로 알려져 있다. 7E11은 생 세포내에서 결합에 유용하지 않은 PSMA의 세포내 에피토프에 결합한다. 본 발명의 측면에서, PSMA는 세포외 도메인에 대한 항체를 사용하여 표적화한다. 이러한 항체는 폐, 결장 및 유방을 포함하는 각종의 암종에서 종양 혈관 내피와 반응하나 정상의 혈관 내피와는 반응하지 않는다.
PSMA의 외부 도메인에 결합하는 많은 항체는 용이하게 입수가능하며 본 발명에서 사용할 수 있다. 모노클로날 항체 3E11, 3C2, 4E10-1.14, 3C9 및 1G3은 PSMA 단백질의 세포외 도메인의 차별화된 영역에 대해 특이성을 나타내며 본원에서 사용하기에 적합하다. PSMA의 세포외 도메인에 대한 3개의 추가 항체는 J591, J415 및 PEQ226.5이며, 이들은 종양 관련 혈관구조에서 PSMA 발현을 확인하고 본 발명에서 사용할 수 있다. PSMA 및 이의 변이체를 암호화하는 핵산은 미국 특허 제5,935,818호 및 제5,538,866호에서 용이하게 입수가능하며, 경우에 따라, 추가의 항체를 생성시킬 수 있다.
본원에 참조로서 상세히 인용된 미국 특허 제6,150,508호는 본 발명에서 사용될 수 있는 PSMA의 세포외 도메인에 결합하는 각종의 다른 모노클로날 항체를 기술한다. 세포 표면에서 발현된 PSMA와 반응성인 35개의 예시적 모노클로날 항체중 하나 이상을 사용할 수 있다. 이들은 3F5.4G6(ATCC HB12060); 3D7-1.I.(ATCC HB12309); 4E10-1.14(ATCC HB12310); 3E11(ATCC HB12488); 4D8(ATCC HB12487); 3E6(ATCC HB12486); 3C9(ATCC HB12484); 2C7(ATCC HB12490); 1G3(ATCC HB12489); 3C4(ATCC HB12494); 3C6(ATCC HB12491); 4D4(ATCC HB12493); 1G9(ATCC HB12495); 5C8B9(ATCC HB12492); 3G6(ATCC HB12485); 및 4C8B9(ATCC HB12492)를 포함한다.
PSMA의 세포외 도메인을 인지하는 추가의 항체, 또는 이의 결합 부위는, 각각 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,107,090호 및 제6,136,311호에 기술되어 있다. 특히, E99, J415, J533 및 J591(ATCC HB-12101, HB-12109, HB-12127 및 HB-12126)인 4개의 하이브리도마 세포주가 기술되어 있으며, 따라서, 이들중 하나 이상은 청구된 특허청구의 범위에 따라서 표적화제로서 사용될 수 있다.
"흡수된" 표적에 결합하는 표적화제는 종양 또는 종양내 혈관구조 세포 표면 수용체에 결합하는 리간드 또는 성장 인자에 결합하는 것들과 같은 다른 적합한 그룹이다. 이러한 항체는 VEGF, FGF, TGFβ, HGF, PF4, PDGF, TIMP 또는 종양 관련 피브로넥틴 동형(각각 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,877,289호; 제5,965,132호; 제6,093,399호 및 제6,004,555호)에 결합하는 것들을 포함한다.
다른 적합한 표적화 항체, 또는 이의 단편은 리간드-수용체 복합체 또는 성장 인자-수용체 복합체에는 존재하지만 개개의 리간드 또는 성장인자 및 수용체 둘다로부터는 부재하는 에피토프에 결합하는 것들이다. 이러한 항체는 세포 표면에 존재하는 것으로서, 리간드-수용체 또는 성장 인자-수용체 복합체를 인지하여 결합할 것이나, 복합체화되지 않은 수용체 또는 유리된 성장 인자 또는 유리된 리간드에 결합하지 않을 것이다. 본원에 사용된 것으로서 "결합된 수용체 복합체"는 성장 인자 수용체와 같이, 리간드 또는 성장 인자가 이의 수용체에 특이적으로 결합하는 경우, 생산된 최종 복합체를 말한다.
이러한 측면은 VEGF/VEGF 수용체 복합체로 예시된다. 이러한 리간드-수용체 복합체는 비-종양 관련 내피 세포외에 종양 관련 내피 세포에 현저한 수로 존재할 것이므로, 항-복합체 항체에 의해 표적화될 수 있다. 항-복합체 항체는 모노클로날 항체 2E5, 3E5 및 4E5, 및 이의 단편을 포함한다.
사이토킨 및 응고제에 의해 천연적으로 및 인공적으로 유도성인 항원이 또한 표적화될 수 있다. 예시적인 사이토킨-유도성 항원은 E-셀렉틴, VCAM-1, ICAM-1, 엔도글린, LAM-1에 반응성인 리간드 및 심지어, 예를 들면, 단핵구, 대식구, 비만세포, 헬퍼 T 세포, CD8-양성 T-세포, NK 세포 또는 심지어 종양 세포에 의해 방출될 수 있는 IL-1, IL-4, TNF-α, TNF-β 또는 IFN-γ에 의해 유도된 MHC 제II 부류 항원이다.
추가의 유도성 항원은 트롬빈, 인자 IX/IXa, 인자 X/Xa, 플라스민 또는 메탈로프로테이나제(매트릭스 메탈로프로테이나제, MMP)에 의해서와 같이 혈액응고제에 의해 유도성인 것들을 포함한다. 일반적으로, 트롬빈에 의해 유동성인 항원이 사용될 것이다. 이러한 항원 그룹은 P-셀렉틴, E-셀렉틴, PDGF 및 ICAM-1을 포함하며, P-셀렉틴 및/또는 E-셀렉틴의 유도 및 표적화가 일반적으로 바람직하다.
다른 양태에서, 본 발명의 혈관구조 및 기질 표적화제(하기 참조)는 항체라기 보다는 자체가 생물학적 리간드, 또는 이의 일부인 표적화제일 것이다. 이러한 관점에서 "생물학적 리간드"는 사이토킨, 호르몬, 성장 인자 등에 의해 예시되는 바와 같은 기질 또는 혈관 세포에 접근가능한 수용체와 같은 세포 표면 분자에 결합하거나 이와 연합하는 분자일 것이다. 어떠한 성장 인자 또는 리간드도, 이것이 종양 혈관구조 내피 세포의 표면에 존재하는 특이적인 생물학적 수용체에 대한 질병-관련 기질 또는 혈관구조에 결합하는한 사용가능하다.
본 발명의 이러한 측면에서 사용하기에 적합한 성장 인자는 예를 들면, VEGF/VPF(혈관 내피 성장 인자/혈관 침투성 인자), FGF(단백질의 섬유아세포 성장 인자), TGFβ(형질전환 성장 인자 B), 종양 관련 피브로넥틴 동형, 분산 인자/간세포 성장 인자(HGF), 혈소판 인자 4(PF4), PDGF(혈소판 기원한 성장 인자), TIMP 또는 심지어 IL-8, IL-6 또는 인자 XIIIa를 포함한다. VEGF/VPF 및 FGF가 흔히 바람직할 것이다.
추가의 적합한 표적화제는 종양 관련 기질에 결합하는 것들이다. 종양 진행동안, 주변 조직의 세포외 매트릭스는 2개의 주요 과정을 통해 재모델화된다: 정상 조직의 세포외 매트릭스 성분의 단백질분해성 분해; 및 종양 세포 및 종양-유도된 사이토킨에 의해 활성화된 기질 세포에 의한 세포외 매트릭스 성분의 새로운 합성. 이러한 2개의 과정은 "종양 세포외 매트릭스" 또는 종양 기질"을 생성하며, 이는 종양 진행을 허용하며 정상 조직의 세포외 매트릭스 또는 기질로부터 정성적으로 및 정량적으로 구별된다.
따라서, "종양 기질"은 정상 조직에 존재하지 않는 표적화가능한 성분을 지진다. 본 발명에서 사용하기 위한 특정의 바람직한 종양 기질 표적화제는 기저 막 마커, 제IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 설페이트, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 활성화된 혈소판, LIBS, RIBS 및 테나신에 결합하는 것들이다. 다음 특허는 종양 표적화제의 제조 및 사용에 관한 본 발명의 교시를 추가로 보충하기 위한 목적을 위해 본원에 참조로 상세히 인용된다: 미국 특허 제5,877,289호; 제6,093,399호; 제6,004,555호 및 제6,036,955호.
종양 관련 기질의 성분은 기질, 세포외 매트릭스 및 연결 조직의 구조 및 작용 성분을 포함한다. 따라서, 종양 기질 표적화제는 기저 막 마커, 제IV형 콜라겐, 라미닌, 피브린, 헤파란 설페이트, 프로테오글리칸, 당단백질, 헤파린 및 헤파린형 성분과 같은 음이온성 다당류 및 피브로넥틴과 같은 성분에 결합하는 것들을 포함한다.
예시적인 유용한 항체는 다양한 양성 및 악성 종양의 기질내에서 발현된 고분자량 세포외 당단백질인 테나신에 결합하는 것들이다. 따라서, 항-테나신 항체는 표적화제로서 사용될 수 있다(참조: 미국 특허 제6,093,399호 및 제6,004,555호, 본원에서 참조로 상세히 인용됨).
추가로 적합한 표적화제는 평활근 세포, 페리사이트, 섬유아세포, 대식세포 및 침윤하는 림프구 또는 백혈구에 결합하는 항체 및 리간드를 포함한다. "활성화된 혈소판"은, 혈소판이 활성화되는 경우 기질에 결합하므로, 종양 기질의 추가 성분이며, 따라서, 이러한 혈소판은 본 발명에 의해 표적화될 수 있다.
추가의 적합한 기질 표적화제, 항체 및 이의 항원 결합 영역은 사이토킨에 의해 유도가능한 것들 및 특히 트롬빈과 같은 응고제에 의해 유도가능한 것들과 같은 "유도성" 종양 기질 성분에 결합한다. 바람직한 항-기질 항체의 그룹은 피브리노겐상에서 RIBS, 수용체 유도된 결합 부위에 결합하는 것들이다. 따라서, 'RIBS"는 표적가능한 항원이며, 기질내 이의 발현은 활성화된 혈소판에 의해 지시된다. 활성화된 혈소판에서 LIBS, 즉, 리간드 유도된 결합 부위에 결합하는 항체가 또한 유용하다.
종양 관련 기질의 특히 바람직한 표적가능한 성분은 현재 종양 관련 피브로넥틴(FN) 동형이다. 피브로넥틴은 세포외 매트릭스 및 체액 둘다의 다작용성의 고분자량 당단백질 성분이다. 이들은 정상 세포 형태, 세포 이주, 지혈 및 혈전증, 상처 치유 및 종양발생성 형질전환의 확립 및 유지와 같은 많은 상이한 생물학적 과정에 포함된다.
피브로넥틴 동형은 인테그린 계열의 수용체에 결합하는 리간드이다. "종양 관련 피브로넥틴 동형"은 종양 혈관구조 및/또는 종양 기질의 일부인 것으로 고려될 수 있다. 피브로넥틴 동형은 강력한 구조적 비균질성을 지니며, 이는 전사, 전사후 및 해독후 수준에서 유발된다.
피브로넥틴내 구조적 다양성은 20개 이상의 상이한 동형을 생성하는 제1 피브로넥틴 전사체의 3개 영역(ED-A, Ed-B 및 IIICS)의 대안적인 스플라이싱(splicing)에 의해 처음 유발된다. 조직 및 발달 특이적인 방식으로 조절될 뿐 아니라, 피브로넥틴-전-mRNA의 스플라이싱 패턴은 혈질전환된 세포 및 암에서 조절저하(deregulate)되는 것으로 알려져 있다. 실제로, ED-A, ED-B 및 IIICS 서열을 함유하는 피브로넥틴 이형은 정상 세포에서보다 형질전환되고 악성인 종양 세포에서 더욱 큰 정도로 발현된다.
특히, ED-B 서열(B + 이형)을 함유하는 피브로넥틴 이형은 태아 및 종양 조직에서 뿐 아니라 상처 치유동안에 고도로 발현되나, 정상 성인 조직에서의 발현은 제한되어 있다. B+피브로넥틴 분자는 성숙한 혈관에서는 검출불가능하나, 정상 상태(즉, 자궁내막의 발달), 병리학적 혈관형성(예를 들면, 당뇨성 망막병증) 및 종양 성장에서 혈관형성 혈관내에서 상향조절(upregulate)된다. 따라서, 소위 B+이형의 피브로넥틴(B-FN)은 본 발명과 함께 사용하기에 특히 적합한다.
ED-B 서열은 단일 엑손에 의해 암호화되고 91개 아미노산을 포함하는 완전한 제III형의 동질성 반복부이다. B+이형 자체의 존재는 종양 유도된 신생항원을 구성하지만, 또한, ED-발현은 제III형 반복부 7(ED-B 선행부)내에서 정상적으로 잠재성인 항원을 노출시키며; 이러한 에피토프는 ED-B를 결실하고 있는 피브로넥틴 분자내에서 발현되지 않으므로, 이는, ED-B 발현이 직접 및 간접적으로 둘다 신생항원의 발현을 유도한다는 결론을 가져온다. 이러한 잠재적 항원 부위는 모노클로날 항체, BC-1(참조: Eurepean Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, UK, 제88042101호)의 표적을 형성한다. BC1 항체는 본 발명의 혈관 표적화 성분으로 사용할 수 있다.
ED-B 이형에 대한 특이성을 지닌 개선된 항체는 본원에 참조로 상세히 인용된 문헌 제WO 97/45544호에 기술되어 있다. 이러한 항체는 실모양 박테리오파지의 표면에 나타난 사람 항체 가변 영역의 라이브러리로부터 일본쇄 Fvs(scFvs)로 수득된다(참조: 제WO 92/01047호, 제WO 92/20791호, 제WO 93/06213호, 제WO 93/11236호 및 제WO 93/19172호).
항원이 고체 표면["패닝(panning)"]에 피복되어 있는 경우, 항체 파아지 라이브러리를 사용하여, 특이적 scFvs를 ED-B 도메인을 함유하는 재조합 피브로넥틴-단편 및 재조합 ED-B 자체에서 직접적인 선택 둘다에 의해 분리할 수 있다. 항원의 이러한 동일한 공급원을 또한 사용하여 "친화성 성숙"에서 모 클론보다 개선된 특성을 갖는 "제2 세대" scFvs를 제조한다. 분리된 scFvs는 바람직하게는 N-글리카나제를 사용한 선행 치료없이 사람 피브로넥틴의 B+ 이형과 강하게 및 특이적으로 반응한다.
따라서, 제WO 97/45544호의 항체는 이와 함께 사용하기 위해 고려된다. 항-종양 적용시, 이러한 사람 항체 항원-결합 도메인은 사람 투여시 부작용이 거의 없기 때문에 유리하다. 언급한 항체는 ED-B 도메인에 직접 결합한다. 바람직하게는, 항체는 사람 피브로넥틴 ED-B 및 마우스의 것과 같은 비-사람 피브로넥틴 ED-B 둘다에 결합하여 동물 모델에서 시험 및 분석을 허용한다. 항체 단편은 일본쇄 Fv(scFv), Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb 및 다이아바디(diabody)로 연장된다.
피브로넥틴의 ED-도메인에 대해 특이적인 추가의 개선된 항체도 제WO 99/58570호에 기술된 바와 같은 서브-나노몰 분해 상수로 제조하였으므로 본원에서 사용하기에 더욱 바람직하다. 이러한 표적화제는 본원에 이러한 항체 및 관련된 항체를 제조 및 사용하기 위한 방법을 교시할 목적으로 참조로 상세힌 인용된 제WO 99/58570호에 기술되어 있다. 이들 항체는 피브로넥틴의 ED-B 도메인의 특징적인 에피토프에 대한 특이적인 친화성을 지니며 ED-B 에피토프에 대해 개선된 특이성을 지닌다.
이러한 개선된 재조합 항체는 항체 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 scFv 포맷에서 유용하다. H10 및 L19외에, 이들중 후자는 서브-나노몰 농도 범위에서 피브로넥틴의 ED-B 도메인에 대한 해리 상수를 지니며, 본원에 참조로 상세히 인용된 제WO 99/58570호의 기술을 사용하여 유사 항체를 제조할 수 있다. 항체 상-디스플레이 라이브러리(antibody phase-display library)로부터 피브로넥틴의 ED-B 도메인에 대해 특이적인 사람 scFv 항체 단편의 분리 및 서브-나노몰 지닌 ED-B 에 대해 결합하는 사람 scFv 항체 단편의 분리는 제WO 99/58570호의 실시예 1 및 2에 특별히 기술되어 있다.
따라서, 바람직한 항체는 피브로넥틴의 ED-B 도메인의 특징적인 에피토프에 대한 특이적 친화성을 지닌 것들을 포함하며, 여기서, 항체는 ED-B 에피토프에 대해 개선된 친화성을 지니며, 이러한 친화성은 아나노몰 범위이고, 당해 항체는 ED-B(+) 피브로넥틴을 인지한다. 다른 바람직한 포맷은, 항체가 scFv 또는 재조합 항체이고 친화성이 이의 CDR 잔기에서 제한된 수의 돌연변이의 도입으로 개선된 경우이다. 돌연변이될 예시적인 잔사는 VH 도메인의 31-33, 50, 52 및 54번 잔기 및 이의 VL 도메인의 32 및 50번 잔기를 포함한다. 이러한 항체는 L19 항체 또는 L19의 작용적으로 동등한 변이체에 의해 예시되는 바와 같이 27 내지 54pM의 Kd를 갖는 피브로넥틴의 ED-B 도메인에 결합할 수 있다.
Q5 . 항-바이러스 접합체
정상 상태에서, PE는 세포 표면에서 노출되지 않는다. 그러나, 다양한 질병 상태에서, PE는 하나 이상의 세포 유형의 세포 표면에 노출된다. 예를 들면, 종양 혈관구조내 내피 세포는 PE-양성이 되며, 본원에서 HuIgG에 접합된 듀라마이신을 사용한 성공적인 종양 치료에 의해 예시되는 바와 같이 PE-지시된 치료요법에 의해 표적화될 수 있다. PE는 또한 바이러스 감염된 세포의 세포 표면에 노출되며, 따라서, PE는 본 발명의 PE-결합 펩타이드 유도체를 사용한 치료학적 중재에 대한 추가의 표적물이다. 또한, 본 출원은, 바이오틴 및 HuIgG에 연결된 것들에 의해 예시되는 바와 같이 듀라마이신 유도체가 시험관내 및 생체내 둘다에서 효과적인 항-바이러스제임을 나타낸다.
AZT, 아사이클로비르, 간시클로비르, 시도포비르(사이토신 유도체) 및 새로운 항-바이러스 약물을 포함하는 몇몇 항-바이러스 약물은 독성/효능에 의해 제한된다. 바이러스 감염동안 PE내 변화에 관한 이들의 관찰 및 원래의 PE-결합 펩타이드 유도체의 효능 측면을 기초로 하여, 본 발명자들은 감소된 독성 및 증가된 효능을 갖는 새로운 항-바이러스 치료요법을 설계함으로써 항-바이러스 영역에서의 문제점들에 촛점을 맞추어 왔다. 본 발명의 새로운 항-바이러스 치료요법에서, 항-바이러스 약물은 PE-결합 펩타이드에 연결되며, 이는 바이러스 감염된 세포에 대한 부착된 항-바이러스 약물을 전달하는 작용을 한다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 항-바이러스 유도체인 PE-결합 펩타이드의 개발과 관련한 다음 관찰을 수행한다. 데이타는 PE-결합 펩타이드 유도체, 즉 듀라마이신-L-바이오틴이 전신계 투여후에도 생체내에서, 특히 폐내에서 대식세포에 의해 흡수될 수 있다는 사실을 나타내기 위해 본원에 제시된다. 감염시, 많은 바이러스들은 우선 세망내피 세포 시스템(RES)의 세포를 통과하고, 대식세포는 바이러스 흡수의 주 세포이다. 따라서, 항-바이러스 약물을 듀라마이신과 같은 PE-결합 펩타이드에 결합시킴으로써, 약물의 항-바이러스 효과는 침입한 바이러스를 청소하는데 관여하는 주요 세포 유형(대식세포)에 지시된다.
PE-결합 펩타이드 유도체는 전신계 투여후 폐내 대식세포에 국재화되므로 천연적으로 효과적일 것이다. 에어로졸을 통하는 더욱 직접적인 수단에 의한 폐로의 투여가 또한 예상된다. 따라서, 본 발명은 바이러스 치료 분야에서 중요한 결점들을 해결하고 광범위하고 실제적인 항-바이러스 치료제를 제공한다.
따라서, 본 발명의 신규한 항-바이러스 치료요법은 바람직하게는 2개의 제제를 연결시키기 위해 생물학적으로 방출가능하거나 가수분해적으로 분해가능한 결합을 사용하여 항-바이러스 약물에 연결시킨 듀라마이신과 같은 PE-결합 펩타이드를 포함한다. 장래에 항-바이러스제로서 개발된 어떠한 제제를 포함하는 어떠한 범위의 항-바이러스 제제도 PE-결합 펩타이드에 연결시켜 본 발명에 따른 유리한 항-바이러스 치료제를 형성할 수 있다. 소위 전통적인 항-바이러스제외에, 다른 DNA/RNA 억제제도 PE-결합 펩타이드에 부착시켜 항-바이러스 치료효과를 형성할 수 있다. 예시적인 항-바이러스제는 표 G에 나열되어 있으며, 이들중 하나 이상은 PE-결합 펩타이드에 부착되어 본 발명의 항-바이러스 접합체를 제조할 수 있거나 본 발명의 항-바이러스 배합 치료요법에서 별도로 사용할 수 있다.
[표 G]
Figure 112012087199067-pat00010
항-바이러스제 및 약물의 범위내에서, AZT 및 시도포비르는 현재 PE-결합 펩타이드에 결합시키기에 바람직하다. 선택된 항-바이러스 약물, PE-결합 펩타이드에 상관없이, 항-바이러스 접합체는 폐내 대식세포에, 바이러스 감염된 세포에 결합할 것이고 바이러스 입자에 결합할 수 있다. 사용된 링커 또는 접합 기술에 따라, 항-바이러스 약물은 표적 세포의 표면에서 방출된 후 세포내로 흡수될 수 있다. 바람직하게는, 접합체 자체는 대식세포 또는 바이러스 감염된 세포와 같은 세포내로 흡수된다. 흡수는 천연적으로 일어나거나 바이러스 매개될 수 있다. 일단 세포내로 흡수되면, 항체 접합체를 사용하는 경우에서와 같이, 링커의 가수분해에 의해 활성인 항-바이러스제가 방출된다.
듀라마이신-시도포비르 항-바이러스제에 대한 적합한 연결 선택의 한가지 예는 도 13R에 나타내었다. 이러한 예에서, 듀라마이신-시도포비르 접합체는 폐내 대식세포에 결합되고 세포내로 흡수된다. 링커의 가수분해로 포스포르아미데이트의 분해 및 활성 시도포비르 또는 시도포비르를 절단하는 세포 투과성 유도체(도 13R에서 R)의 방출이 초래된다.
예를 들면, 디설파이드 산 불안정성이거나, 효소적으로 분해가능하거나 가수분해가능한 것과 같은 생물학적으로 분해가능한 결합을 함유하는 다른 연결물을 사용할 수 있다. 따라서, 치료제에 대한 항체를 연결시키는데 사용하기 위해 기술된 생물학적으로 방출가능하거나 선택적으로 가수분해할 수 있는 결합을 본 발명의 PE-결합 펩타이드, 항-바이러스 유도체와 함께 사용할 수 있다. 링커의 선택은, 펩타이드가 위에서 기술한 바와 같이 유도체화되어 작용성 그룹에 도입됨으로써 선택된 항-바이러스제의 부착을 허용하는 한 듀라마이신과 같은 특정의 PE-결합 펩타이드에 한정되지 않는다.
R. 항-바이러스 치료 방법
본 발명은 또한 바이러스 감염을 치료하기 위해 임의로 항-바이러스제와 접합된 항체, 면역접합체 및 PE-결합 펩타이드 유도체의 범위를 제공한다. 치료 용법 및 특히 투여량은 일반적으로 본 발명의 암 치료 측면에 대해 위에서 기술한 바와 같으며, 이러한 적용성은 본 발명의 전체적인 장점이다. 비록 특정의 작용 메카니즘의 이해가 본 발명의 항-바이러스 치료를 실시하는데 필수적이지 않다고 해도, 본원의 작업 실시예에 의해 지지되는 것으로써, 바이러스 치료에 기초적인 특정의 이유는 다음과 같다.
가장 중요한 메카니즘은 바이러스 복제 및 숙주 세포의 활성화와 연관되는 것으로 여겨진다. 바이러스 감염동안에, 바이러스는 세포내에서 이의 복제 과정동안 세포를 활성화시킨다. 이러한 세포 활성화 과정은 헤르페스 바이러스, C형 간염 및 HIV-1의 경우에서 밝혀지는 바와 같이 바이러스 복제에 필수적이다. 바이러스 진행(progression)은 바이러스 및 숙주 둘다의 유전자 발현을 활성화시킨다. 예를 들어, 피킨데 바이러스 및 마쿠포 바이러스의 복제는 복제 주기에서 말기에 악티노마이신 D에 의해 억제되며, 이러한 사실은 숙주 세포 유전자 전사가 바이러스 복제의 완성에 요구됨을 나타낸다.
바이러스에 의한 숙주 세포의 활성화는 세포가 PS 및 PE와 같은 음이온성 인지질 및 아미노인지질을 외부화하도록 한다. 특히, 본 발명자들은, 바이러스 활성화가 세포내 Ca2 +가 유출되도록 하며, 이는 스크람발라제를 활성화시키고 음이온성 인지질 및 아미노인지질, 특히 PS 및 PE를 외부화함을 밝혔다. 음이온성 인지질 및 아미노인지질, 바람직하게는 PS 및 PE에 결합한 항체, 펩타이드 유도체 및 접합체는 이후에 결합하여 활성화 과정을 방해하고 바이러스가 적절히 복제할 수 있도록 하는 것을 방지한다.
본 발명의 예들은, 본 발명이 바이러스 감염 과정의 말기에 작용하여, 바이러스 성숙 또는 배출을 차단함을 나타낸다. 본 발명자들의 연구는, 본 발명의 제제의 억제 효과가 상이한 배출 메카니즘을 사용하는 바이러스에서 작동하는 것을 나타내는 바와 같이, 광범위하게 적용가능함을 나타낸다. 예를 들어, 본 실시예는, 골지체 유도된 외세포독성 비히클로부터 배출된 헤르페스 바이러스(CMV)의 차단 및 혈장막으로부터 직접 버드 아웃된(bud out) 아레나바이러스(피킨데 바이러스) 및 파라믹소바이러스(RSV)의 차단을 입증한다.
바이러스 감염된 세포는 일반적으로 세포내에 있는, 즉 혈장막의 내부 표면에 국한된 음이온성 인지질 및 아미노인지질, 특히 PS 및 PE를 내부화한다. 바이러스의 배출동안에, 인지질은 배출 부위에 재배치하여, 바이러스 버딩 또는 혈장막으로부터의 세포외유출 동안 막 굽힘(bending)을 조정하고, 음이온성 인지질 및 아미노인지질이 이러한 과정 동안에 외부화된다. 따라서, 본 발명의 항체, 펩타이드 유도체 및 접합체는 외부화된 음이온성 인지질 및 아미노인지질, 특히 PS 및 PE에 결합하며 감염된 세포로부터 바이러스의 배출을 차단한다. 본 발명의 작제물의 바이러스 감염된 세포에 대한 결합은 본 실시예에서 또한 나타낸다.
*본 발명의 항체, 펩타이드 유도체 및 접합체는 또한 외부화된 음이온성 인지질 및 아미노인지질, 특히 PS 및 PE에 추가로 결합하여, 바이러스 유전자 발현 및/또는 복제에 필요한 하나 이상의 신호화 경로를 방해할 수 있다.
또한, 엔벨로프된 비리온 자체는 자체의 외부 표면에 PS 및 PE와 같은 음이온성 인지질 및 아미노인지질을 지닌다. 이러한 바이러스는 인지질 비대칭을 유지하거나 회복하기 위한 트랜스로카제를 결실하고 있으므로, PS 및 PE와 같은 인지질의 연속된 노출이 예상된다. 따라서, 본 발명의 항체, 펩타이드 유도체 및 접합체는 옵소닌작용(opsonization), 보체 결합, 대식세포와 같은 숙주 세포에 의한 식세포작용 및 유리된 바이러스 입자의 청소를 유발할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면에서, 바이러스는 감염 및/또는 신시아 형성(syncitia formation)을 위해 음이온성 인지질 및 아미노인지질을 필요로 하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 항체, 펩타이드 유도체 및 접합체는 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 결합함으로써 바이러스 생 주기의 이러한 측면을 추가로 차단시킬 수 있다.
*앞서의 측면 및 본 실시에의 측면에 따라, 본 발명에 대한 바이러스 치료의 범위는 엔벨로프되거나 그렇지 않거나, 또는 DNA 바이러스이거나 RNA 바이러스이거나에 상관없이 어떠한 바이러스에도 연장된다. 본 발명의 음이온성 인지질- 및 아미노인지질-결합 항체, 펩타이드 유도체 및 접합체는 적어도 부분적으로는 세포내 바이러스 복제를 차단하고/하거나 세포로부터의 배출을 방지하므로, 본 발명은 엔벨로프된 바이러스 단독의 치료 또는 특정의 어떠한 바이러스에 한정되지 않으며, 이는 중요한 장점이다. 예를 들어, 본 발명에 연속하여 공지된 작업은, 아넥신 V 및 PS 소포가 대식세포의 HIV-1 감염을 억제할 수 있지만 T 세포의 HIV-1 감염을 억제하거나 소포 구내염 바이러스 G 및 암포트로픽(amphotropic) 쥐 백혈병 바이러스와 같은 다른 바이러스를 억제할 수 없다(참조: Callahan et al., 2003).
천연적으로, 본 발명의 항체, 펩타이드 유도체 및 접합체는 엔벨로프된 바이러스, 특히 엔벨로프의 외부 표면에서 PS 및 PE의 음이온성 인지질 및 아미노인지질을 갖는 바이러스에서 작용하지 않으며, 여기서, 항체, 펩타이드 유도체 및 접합체는 바이러스 청소 및/또는 표적 세포의 바이러스 도입의 억제를 유발한다.
따라서, 본 발명의 중요한 측면은, 본 발명이 바이오-테러리즘(bio-terrorism)의 일부로서 생성된, 재조합 바이러스, 가공된 바이러스 및 합성 바이러스의 치료에 공통적으로 적용가능하며, 적합하다는 것이다. 더우기, 본 발명은 동물 및 사람의 치료에 한정되지 않는다. 바이러스 분류군에서 발견된 숙주의 범주는 조류(algae), 아카에아(archaea), 세균, 진균, 무척추동물, 마이코플라즈마, 식물, 원생동물, 스피로플라스마 및 척추동물을 포함하므로, 본 발명은 농업적으로 중요한 바이러스에서를 포함하는 이러한 셋팅에서 바이러스 감염 및 복제를 억제하는데 사용할 수 있다. 척추동물에서 바이러스 감염 및 연관된 질병의 치료가 현재 바람직하며, 척추동물을 감염시키는, 표 H의 하나 이상의 바이러스중 어느 것도 억제될 수 있으며, 본 발명을 사용하여 바이러스 감염을 치료할 수 있다.
[표 Ha]
Figure 112012087199067-pat00011
[표 Hb]
Figure 112012087199067-pat00012
[표 Hc]
Figure 112012087199067-pat00013
포유동물에서 바이러스 감염 및 관련 질병을 치료하는데 있어서 본 발명의 용도, 특히 경주마 및 애완 동물, 및 사람 소모용 식품을 직접적으로 생산(예를 들면, 고기)하거나, 간접적으로 생산(예를 들면, 우유 및 계란)하는데 사용되는 동물 및 조류와 같은 가치있거나 귀중한 동물의 측면에서 바람직하다. 사람 치료외에, 본 발명의 예시적인 양태는 말, 개, 고양이 등의 치료를 포함하며, 소, 돼지, 수돼지, 양, 염소, 버팔로, 바이슨(bison), 야마(llama), 양, 엘크 및 기타 거재 동물과, 송아지 및 새끼양을 포함하는 이들의 새끼의 치료를 포함한다.
사람의 치료는, 천연적으로 존재하는 바이러스에 대해서 또는 바이오-테러리즘에 의해 생성된 것들에 상관없이, 특히 바람직하다. 천연적으로 존재하는 바이러스, 및 수득된 질병의 측면에서, 본 발명은 이의 적용에 비제한적이다. 따라서, 표 J의 바이러스 하나 이상을 본 발명을 사용하여 억제할 수 있고, 따라서, 초래되는 감염 및 질병을 치료할 수 있다.
[표 J]
Figure 112012087199067-pat00014
본 발명은 특히 바이러스성 폐렴, 단핵구증 유사 증후군, 및 관련 선천성 기형(난청 및 정신지연)과 같은 CMV 관련 질병; 기관지염 및 바이러스성 폐렴, 인플루엔자, 일반 감기 및 SARS를 포함하는, RSV에 의해 유발되는 질병과 같은 호흡기 질병; AIDS; 간염; 바이러스 감염과 관련된 암; 단핵구증 및 천연두의 치료에 사용하기 위해 고려된다.
다른 양태에서, 본 발명자는 사람에 있어 병원성인, 아레나바이러스의 억제를 고려한다. 아레나바이러스는 라싸열에 관련된 올드 월드 바이러스(라싸 바이러스) 및 림프구 맥락수막염(LCMV)을 포함한다. 라싸열은 서부 아프리카 풍토병이며, 매년 300,000명의 사람을 감염시켜 3000명의 사망을 유발한다. 라싸열의 감염은 약 10일이내에 열 및 권태를 초래한다. 복부 통증, 오심, 구토 및 설사가 일반적이다. 건성인두염 및 감기로 진행될 수 있다. 신경계 증상도 일반적으로 약하다. 부종 및 흉막 삼출액과 같은 혈관 누출 증상은 더욱 심각한 경우에 존재한다. 출혈은 환자의 약 1/4에서 관찰된다. 당해 질병은 쇼크 및 사망에 이르는 심혈관계내 변화를 유발할 수 있다.
아레나바이러스는 또한 아르헨티나 출혈열, 볼리비아 출혈열(마쿠포 바이러스) 및 베네쥬엘라 출혈열(구아나리토 바이러스)에 관여하는 항원적으로 구별된 뉴 월드 바이러스(주닌 바이러스)를 포함한다. 이러한 바이러스 모두는 강력한 바이오-테러리즘 무기의 CDC 범주 A 리스트에 있다.
비록 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 연결되지 않는다고 해도, 바이러스에 직접 결합하는 다른 항체가 입증된 약물로 개발되고 있다. 이는 면역억제된 환자에서 CMV 감염을 억제하는데 사용되는 사이토감(CytoGam) 및 호흡기 세포융합 바이러스로부터 신생아를 보호하는데 사용되는 시나기스(Synagis)의 경우이다. 따라서, 조직내 바이러스에 접근하여 이를 중화시키는 모노클로날 항체의 사용에 있어 문제는 없다.
항-종양 양태에 적합한 투여량은 또한 항-바이러스 치료에 적합하다. 유사하게, 다중 투여가 만성 감염에 사용될 수 있으며, 고 투여량이 급성 감염에 사용될 수 있다. IV, IM, SC를 포함하는 암 치료 측면에서 기술된 것으로서, 페 또는 기도에 대한 에어로졸로서 또는 유사 방법과 같은 어떠한 적합한 투여 경로도 사용될 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 치료제는 광범위한 항-바이러스 활성을 지닌 가치있는 제제이다. 다수의 강력하게 치명적인 바이러스에 대해 효과적인 것 외에, 당해 제제는 또한 바이러스의 정확한 본질이 알려져 있지 않은 경우에서도, 바이러스에 노출된 후 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-바이러스 치료요법은 특정 백신의 개발, 생산 또는 전달에 포함되는 시간 및 비용과 현저히 대조되는 것으로서 치료요법의 전달 및 병원체의 동정 사이에 연장된 기간을 필요로 하지 않는다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 포함한다. 당해 분야의 숙련가들은 본 발명을 실시하는데 있어서 본 발명자에 의해 발견된 기술을 잘 작용시키기 위해 하기 나타낸 실시예에 기술된 기술을 인지할 수 있고, 따라서, 이의 실시를 위한 바람직한 모델을 구성하는 것으로 고려될 수 있다. 그러나, 당해 분야의 숙련가들은 본 기술의 측면에서, 많은 변화가 기술된 특정 양태에서 이루어질 수 있으며 여전히 본 발명의 취지 및 영역에 벗어남이 없이 유사한 또는 동일한 결과를 수득할 수 있다.
[실시예]
실시예 I
항- VCAM -1- tTF 응고리간드를 사용한 종양 치료
본 실시예는 종양 혈관구조에 표적화된 응고제("응고리간드")를 종양을 지닌 동물에 투여하여 수득되는 항-종양 효과를 가져오는 생체내 종양 혈관구조의 특정 응고를 나타낸다. 이러한 응고리간드에서, VCAM-1(혈관 내피 부착 분자-1, VCAM-1)에 지시된 항체는 사람 응고제의 변형된 형태인, 절단된 조직 인자(tTF)을 종양 혈관구조에 전달하기 위한 표적화제로서 사용된다.
쥐 VCAM-1에 대한 랫트 IgG1 항체를 분비하는 MK2.7 하이브리도마를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, 미들랜드 록크빌 소재, ATCC CRL 1909)로부터 입수하였다. 쥐 바이러스 단백질 p30 gag에 대해 랫트 IgG1 항체를 분비하는 R187 하이브리도마를 ATCC로부터 입수하고, 이를 항-VCAM-1 항체에 대한 이형 매치된 대조군으로서 사용하였다.
피하 L540 사람 호지킨 종양을 지닌 마우스로부터의 종양 및 주요 기관의 혈관을 항-VCAM-1 항체를 사용하여 VCAM-1 발현에 대해 면역조직화학적으로 시험하였다. 전체적으로, VCAM-1 발현은 양성 대조군으로서 사용된 항-엔도글린 항체, MJ 7/18에 의해 염색된 총 종양 혈관중 20 내지 30%에서 관측되었다. VCAM-1의 구성적 혈관 발현은 종양을 지닌 동물 및 정상 동물 둘다에서 심장 및 폐에서 발견되었다. 강력한 기질 염색은, VCAM-1 발현이 엄격하게 혈관외적인 경우 전립선에서 관측되었다.
피하 L540 종양을 지닌 마우스에 항-VCAM-1 항체를 정맥내 주사하고 2시간 후, 마우스를 방혈시켰다. 종양 및 정상 기관을 제거하고 동결시킨 단편을 제조하고 면역조직화학적으로 실험하여 항체의 위치를 측정하였다. 항-VCAM-1 항체를 종양의 내피, 심장 및 폐에서 검출하였다. 염색은, 내피의 염색이 비가역적인 특이성의 종 이형 매치된 항체, R187을 주입한 마우스의 종양 및 기관에서 관측되지 않는 것과 같이 특이적이었다. 항-VCAM-1 항체의 국재화는 전립선 또는 심장 및 폐를 제외한 어떠한 정상 기관에서도 발견되지 않았다.
항-VCAM-1-t·tTF 접합체 또는 "응고리간드"를 절단된 조직 인자(tTF)를 사용하여 제조하였다. 항-VCAM-1-t·tTF 응고리간드의 정맥내 투여는 종양을 지닌 마우스내 정상 조직에서의 혈관과 대치되는 바와 같이 종양 혈관의 선택적인 혈전증을 유발한다.
항-VCAM-1-t·tTF 응고리간드를 직경이 0.4 내지 0.6cm인 피하 L540 종양을 지닌 마우스에 투여하였다. 응고리간드의 주입전에, 종양은 괴사 영역이 없는 균일한 형태학을 갖는 건강한 상태였다. 종양은 잘 혈관화되어 있으며, 일시적으로 혈전증이 된 혈관 또는 빈혈이 전혀 없었다. 응고리간드를 주입한지 4시간내에, 혈관의 40 내지 70%가, 종양 혈관의 단지 20 내지 30%의 초기 염색에도 불구하고, 혈전증이 되었다. 혈전증이 된 혈관은 폐쇄성 혈소판 응집체를 포함하였고, 적혈구 및 피브린으로 채워져 있었다. 몇몇 영역에서, 혈관은 파괴되었고, 적혈구가 종양 사이질내로 흩뿌려져 존재하였다.
응고리간드 주입후 24시간째에, 혈관은 여전히 폐쇄되었으며 강력한 출혈이 종양을 통해 분산되었다. 종양 세포는 서로서로 분리되었으며, 농축 핵을 지니고, 세포분해를 겪었다. 72시간째에, 종양 전체에 앞선 괴사가 발생하였다. 초기 응고리간드-유발된 트롬빈 침착은 중심 혈관에서 VCAM-1 표적 항원의 증가된 유도를 초래하였으며 따라서 표적화 및 종양 파괴를 증폭시켰다.
종양 혈관에서 항-VCAM-1-t·tTF의 혈전 작용은 항원 특이적이다. 동등한 양으로 투여된 대조군 시약(tTF 단독, 항-VCAM-1 항체 단독, tTF 및 항-VCAM-1 항체 또는 비가역적 특이성의 대조군 응고리간드)중 어느것도 혈전증을 유발하지는 않았다.
종양 혈관의 혈전증외에, 이러한 연구는, 항-VCAM-1-t·tTF 응고리간드의 정맥내 투여가 정상 기관내 혈관의 혈전증을 유발하지 않음을 또한 나타낸다. 정상 또는 L540 종양을 지닌 마우스의 심장 및 폐내 혈관에서 VCAM-1의 발현에도 불구하고, 항-VCAM-1-t·tTF 응고리간드 투여후 혈전증이 발생하지 않았다. 혈전증, 조직 손상 또는 변형된 형태의 징후가 4 또는 24시간 전 5 내지 45㎍을 주입한 25마리의 마우스에서 관측되지 않았다. 주요 종양 혈전증을 갖는 동일한 마우스로부터의 심장 및 폐의 정상적인 조직학적 외관이 존재하였다. 모든 다른 주요 기관(뇌, 간, 신장, 비장, 췌장, 장, 전립선)은 또한 변형되지 않는 형태를 지녔다.
응고리간드-처리된 마우스로부터의 기관 및 종양의 동결된 단편은 항-TF 항체, 10H10, 또는 항-랫트 IgG 항체로 진행시키는 경우 동시 염색 패턴을 제공하였으며, 이는, 응고리간드가 심장, 페 및 종양내 혈관에 국재화하였음을 확증하였다. 염색 강도는, 응고리간드가 고 농도에서 단편에 직접 적용된 후 항-TF 또는 항-랫트 IgG를 사용하여 진행시킨 경우에 관측한 것과 동등하였으며, 결합 포화도가 생체내에서 획득되었음을 나타낸다.
이러한 연구는, 심장 및 폐에서 정상 혈관구조에 있어 VCAM-1에 대한 응고리간드의 결합이 혈전증을 유발하는데 충분하지 않으며, 종양 혈관구조가 응고를 지지하는 추가의 인자를 제공함을 나타낸다.
항-VCAM-1·tTF 응고리간드의 항-종양 활성은 0.3 내지 0.4cm3 L540 종양을 지닌 SCID 마우스에서 측정하였다. 약물을 4일 간격으로 3회 정맥내 투여하였다. 항-VCAM-1·tTF 치료된 마우스의 평균 종양 용적은 모든 다른 그룹과 비교하여 치료한지 21일 째에 현저히 감소하였다(P < 0.001). 특이적인 응고리간드로 치료된 총 15마리의 마우스중 9마리는 종양 용적의 50% 이상의 감소를 나타내었다. 이러한 효과는, 접합되지 않은 tTF, 대조군 IgG 응고리간드 및 유리 항 VCAM-1 항체 및 tTF의 혼합물이 종양 성장에 영향을 미치지 않으므로, 특이적이다.
실시예 II
종양 혈관에서 포스파티딜세린 발현
심장 및 폐에서 VCAM-1 양성 혈관구조에서 항-VCAM-1·tTF의 혈전 효과의 상실을 설명하기 위해, 본 발명자들 중의 일부는 정상 혈관과 종양 혈관간의 상이한 아미노인지질 및 음이온성 인지질, 예를 들면, PS 및 PE의 개념을 개발하였다. 상세하게는, 본 발명자들은, 정상 조직내 내피 세포가 아미노인지질 및 음이온성 인지질, 예를 들면, PS 및 PE를 혈장 막 인지질 이층의 내부 표면으로 분리시키고, 여기서, PS는 혈전 반응에 관여할 수 없는 반면, 종양내 내피 세포는 혈장막의 외부 표면에 아미노인지질 및 음이온성 인지질을 이동시키며, 여기서, PS는 응고리간드의 응고 작용을 지지할 수 있다는 가설을 세웠다. 세포 표면에서의 PS 발현은 응고 인자의 막에 대한 부착을 가능하게 하고 응고 개시 복합체의 조립을 조정하므로 응고되도록 한다.
본원에서 개발된 것으로서, 종양 혈관 내피 세포의 표면에 대한 아미노인지질 및 음이온성 인지질 위치변경의 본 발명자들의 모델은, PS 발현이 세포 사멸 이후에 발생할 수 없고 세포 사멸을 불가피하게 개시하지 않는다는 점에서 놀라운 것이다. 따라서, 종양 내피 세포 표면에서 아미노인지질 및 음이온성 인지질 발현은 아미노인지질 및 음이온성 인지질, 예를 들어, PS 및 PE가 치료학적 중재용으로 표적가능한 실체로서 공급되도록 하기에 충분히 안정하다.
종양 혈관 내피가 혈장막의 관 표면에 PS를 발현한다는 가설을 확증하기 위해, 본 발명자들은 하기 면역조직화학 연구를 수행하여 L540 종양을 지닌 마우스에 정맥내 주사한 후 항-PS 항체의 분포를 측정하였다.
A. 방법
마우스 모노클로날 IgM 항체 둘다의 항-PS 및 항-카디올리핀 항체는 실시예 IV에 기술되어 있는 바와 같이 문헌[참조: 본원에 참조로 인용된 Rote et al., 1993)에 의해 생산되고 특성화되었다. 3SB의 주요 반응성은 PS와의 반응이지만, 이는 또한 정상 세포에서 내부 첨판으로 강하게 분리된 혈장 막의 비교적 주요 성분인 음이온성 인지질, 포스파티드산과 반응성이 있다.
L540 종양을 지닌 마우스에 20㎍의 항-PS 또는 항-카디올리핀 마우스 IgM 항체를 주사하였다. 10분 후, 마우스를 마취시키고 이들의 혈액 순환을 헤파린 처리한 염수로 관주시켰다. 종양 및 정상 조직을 제거하여 순간 동결시켰다. 기관 및 종양의 일련의 단편을 항-PS 항체의 검출을 위해 HRP-표지된 항-마우스 IgM 또는 항-VCAM-1 항체에 이어 HRP-표지된 항-랫트 Ig로 염색하였다.
동결시킨 단편에서 막 인지질을 보존하기 위해, 다음 프로토콜을 진행시켰다. 동물을 2.5mM Ca2 +를 함유하는 DPBS로 관주시켰다. 조직을 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 피복시킨 슬라이드위에 올려놓고 24시간내로 염색시켰다. 슬라이드의 고정 또는 세척을 위한 유기 용매, 포름알데하이드 또는 검출제는 사용하지 않았다. 슬라이드를 2.5mM Ca2 + 및 0.2% 젤라틴을 함유하는 DPBS로 재-수화시켰다. 동일한 용액을 또한 사용하여 단편을 세척함으로써 과량의 시약을 제거하였다. 단편을 실온에서 3.5시간 동안 HRP-표지된 항-마우스 IgM으로 항온처리하여 항-PS IgM을 검출시켰다.
B. 결과
이러한 면역조직화학 연구는, 항-PS 항체가 10분내에 VCAM-1을 결실할 수 있는 종양의 중심 영역내 혈관을 포함하는 대부분의 종양 혈관에 위치함을 나타내었다. VCAM-1에 대해 양성인 혈관은 또한 PS에 대해 양성이었다. 즉, 종양내 VCAM-1을 발현하는 혈관에서 PS의 발현이 일치한다.
생체내 국재화 연구에서, 심장 및 폐의 VCAM-1 양성 혈관구조를 포함하는 정상 기관내 혈관의 어느것도 염색되지 않았으며, 이는 PS가 내피 세포의 외부 표면에 부재함을 나타낸다. 대조적으로, 정상 조직 및 종양의 단편을 시험관내에서 항-PS 항체로 직접 염색하는 경우, 내피 또는 기타 세포 유형의 정상 및 종양사이에서 가시화되는 차이가 이들 세포에서는 존재하지 않고 오히려 종양내 내피 세포의 표면에서 발현함을 나타낸다.
PS 검출의 특이성은 2개의 독립된 연구로 확인하였다. 우선, 상이한 음성적으로 하전된 지질인 카디올리핀에 대해 지시된 마우스 IgM 모노클로날 항체는 생체내에서 종양 또는 어떠한 기관에도 위치하지 않았다. 둘째로, 동결된 단편을 사용한 아세톤의 예비처리는 항-PS 항체를 사용한 염색을 무효화시켰으며, 이는 아마도 결합된 항-PS 항체와 함께 지질을 추출하였기 때문일 것이다.
실시예 III
응고리간드 활성을 차단하는 아넥신 V
본 실시예는 고 친화성 PS 결합 리간드, 아넥신 V를 사용한 연구로부터 시험관내 및 생체내에서 PS 작용을 차단시키기 위한 응고리간드 활성에 있어 표면 PS 발현 역활을 추가로 입증한다.
A. 시험관내에서 인자 X의 응고리간드 활성화를 차단하는 아넥신 V
응고리간드에 의해 유도된 인자 Xa 형성에 영향을 미치는 아넥신 V의 능력은 발색 검정으로 측정하였다. IL-1α로 자극시킨 bEnd.3 세포를 항-VCAM-·tTF로 항온처리하고 사포닌을 침투시켰다. 아넥신 V를 0.1 내지 10㎍/ml 범위의 농도로 가하고 세포를 30분 동안 항온처리한 후, 희석시킨 프로플렉스(Proplex) T를 첨가하였다. 아넥신 V의 존재 또는 부재하에 생성된 인자 Xa의 양을 측정하였다. 각각의 처리는 2회 수행하였고 2회 이상 반복하였다.
응고리간드 작용에 있어서 표면 PS 발현에 대한 요구는, 고 친화성으로 PS에 결합하는 아넥신 V가 bEnd.3 세포에 결합된 항-VCAM-1·tTF의 능력을 실험관내에서 차단한다는 본 발명자들의 발견으로 또한 지적된다.
항-VCAM-1·tTF와 함께 예비항온처리된 침투성 세포에 가해진 아넥신 V는 용량 의존적 방식으로 인자 Xa의 형성을 억제하였다. 아넥신 V의 부재하에, 세포 결합된 응고리간드는 60분당 10,000세포당 인자 Xa 95ng을 생산하였다. 증가량의 아넥신 V(ml 범위당 ㎍)의 첨가는 인자 Xa의 생산을 억제하였다. ml당 10㎍에서, 아넥신 V는 인자 Xa 생산을 58% 억제하였다. 검정동안 아넥신 V의 농도를 증가시킴에 의한 추가의 억제는 관측되지 않았으며, 이는, 아넥신 V가 10㎍/ml에서 모든 유용한 결합 부위를 포화시킴을 나타낸다.
B. 생체내에서 응고리간드 활성을 차단하는 아넥신 V
생체내에서 응고리간드 유도된 혈전증을 억제하는 아넥신 V의 능력을 L540 호지킨을 지닌 SCID 마우스에서 실험하였다. 종양은 마우스에서 성장하며 그룹당 2마리의 마우스(직경이 0.5cm인 종양 크기)에 꼬리 정맥을 통해 다음 시약중 하나를 정맥내 주사하였다: a) 염수; b) 아넥신 V 100㎍; c) 항-VCAM-1·tTF 40㎍; d) 아넥신 V 100㎍에 이어 2시간 후 항-VCAM-1·tTF 40㎍.
최종 주사후 4시간째에 마취시키고 헤파린 처리한 염수로 관주하였다. 종양을 제거하고, 4% 포르말린으로 고정시키고, 파라핀으로 매봉시키고 헤마톡실렌-에오신으로 염색시켰다. 혈전화된 혈관 및 혈전화되지 않은 혈관의 수를 계수하고 혈전증의 퍼센트를 계산하였다.
아넥신 V는 또한 생체내에서 항-VCAM-1·tTF 응고리간드의 활성을 차단한다. 종양을 지닌 마우스의 그룹을 대조군 시약 또는 시험 시약중 하나로 치료하였다. 마우스에 (a) 염수; (b) 100㎍의 아넥신 V; (c) 40㎍의 항-VCAM-1·tTF 응고리간드; 또는 (d) 100㎍의 아넥신 V에 이어 2시간 후 40㎍의 항-VCAM-1·tTF 응고리간드. 동일한 결과를 그룹당 마우스 둘 다에서 수득하였다.
염수 주사한 마우스로부터 기원한 종양에서 일시적인 혈전증, 빈혈 또는 괴사는 관측되지 않았다. 아넥신 V만을 사용한 치료는 종양 형태학을 변경시키지 않았다.
본원에 나타낸 다른 자료에 따라, 40㎍의 항-VCAM-1·tTF 응고리간드는 총 마우스 혈관의 70%에서 혈전증을 유발하였다. 대부분의 혈관은 패킹된 적혈구 및 응괴로 폐색되었고, 종양 세포는 서로 분리되었다. 응고리간드 유도된 항-종양 효과, 즉, 혈관내 혈전증 및 종양 세포 형태에서의 변화는 마우스를 아넥신 V로 예비 치료함으로써 완전히 제거되었다.
이러한 발견은, 응고 리간드의 항종양 효과가 종양 혈관구조의 차단을 통해 매개된다는 것을 확인해준다. 이러한 데이타는 또한 PS가 생체내에서의 응고리간드-유도된 혈전증에 필수적임을 입증해준다.
실시예 IV
아미노인지질 및 음이온성 인지질에 대한 항체의 생성
본 실시예는 종양 혈관 내피 세포에서 아미노인지질 및 음이온성 인지질 위치이동에 있어서의 관찰 측면에서 본 발명자들에 의해 설계되고 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 대한 항체의 생성에 있어 잘 작용하는 것으로 밝혀진 면역화 프로토콜을 기술한다. PS 및 PE와 같이, 아미노인지질 및 음이온성 인지질과 반응성인 다수의 항체를 관측하였다. 본 실시예 및 다음 실시예에서, 단순성을 위해, PS와 반응성인 항체는, 비록 이러한 특정 항체의 결합이 PS에 한정되지 않고 본원에 나타낸 바와 같이 다른 특정의 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 연장된다고 해도, "항-PS 항체"로 명명할 수 있다.
A. 면역화 프로토콜
더욱 강력한 면역원으로서 면역 시스템에 대한 아미노인지질 및 음이온성 인지질을 나타내기 위하여, 아미노인지질 및 음이온성 인지질을 아미노인지질-양성 및 음이온성 인지질-양성 세포로 제형화하였다. 다른 막 성분들로 둘러싸여있는, 막-삽입된 아미노인지질 및 음이온성 인지질은 상승하는 항체에 대한 우수한 구조 및 청소율(clearance)을 지닌다.
PS에 의한 당해 경우에서 예시되는 바와 같이, 아미노인지질 및 음이온성 인지질을 발현시키는 자가 세포를 사용하여 면역적합성 동물을 면역화하는 것이 목적이며, 여기서, 동물은 모든 자체 표면 항원에 대해 항체를 생산하지 않지만 외부 요소로서 막-노출된 인지질, 예를 들면 PS를 인지한다. 이러한 공정은 모든 아미노인지질 양성 또는 음이온성 인지질 양성인 세포를 지닌 면역적합성 BALB/c 마우스 및 루이스 랫트와 같은 어떠한 표준 실험 동물의 사용에도 적용가능하다.
BALB/c 마우스 및 마우스 내피 세포, bEnd.3(치사된 마우스(BALB/c 균주) 내피 세포)를 우선 선택하였다. bEnd.3을 10% CO2 항온처리기속에서 9ml/500ml HEPES 완충액이 들어있는 10% DMEM속에서 배양하였다. bEnd.3 세포를 T175 TC 플라스크내에서 목적한 수의 세포가 수득될 때까지 증식시켰다. 통상적으로, 약 70 내지 80%의 합치성(confluency)인 플라스크 각각에는 약 3 x 106 개의 세포가 들어있고, 각각의 마우스에는 1 x 106 내지 20 x 106 개의 세포, 1 x 107 개의 세포까지를 주사하였다.
bEnd.3 세포를 50μM 내지 200μM의 과산화수소로 1 또는 2시간 동안 37℃에서 처리하여 면역화전 PS와 같은 음이온성 인지질을 노출시켰다. H2O2의 원료는 [9.8M]; 30%(v/v)이다. 이를 1:1000으로 희석시킨 다음 0.4ml를 40ml 배지가 든 T175 TC 플라스크에 가하여 최종 농도가 100μM H2O2가 되도록 하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 유지시켰다. 하베스트(harvest)하기 위해, 세포를 따뜻한 PBS로 3X 세척하고, 10mM EDTA를 가하여 배지중 모든 BSA 또는 혈청 단백질을 제거하였다. 세포를 온화한 트립신 처리로 제거하고, 세척하며 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 통기시키고 세포를 첨가제 없이 DMEM속에 적절한 용적이 되도록 재현탁시키고(각각의 마우스에 200㎕당 약 1 x 107 개의 세포를 주사한다) 빙상에 유지시켰다.
이러한 방식으로 처리한 세포를 1ml 짜리 주사기 및 23 게이지 바늘을 사용하여 각각의 마우스에 복강내 주사하였다(세포 현탁액 200㎕). 마우스를 3 내지 4주 간격으로 3 내지 7회 면역화시켰다. 마우스를 각각의 부스트후 10일 째에 방혈시키고, 제2 부스트로부터 염색하여 면역 혈청을 수집하였다. 항-PS 에 대한 혈청 역가는 ELISA로 시험하였다.
자가 PS-양성 세포를 사용한 이러한 면역화는 자가항체의 제한되지 않은 생성을 초래하지는 않지만, PS와 반응성이거나 다른 아미노인지질 및 음이온성 인지질과 배합된 PS와 반응성인 항체의 생산에 제한되었다.
다른 연구에서, 암컷 루이스 랫트를 200μM의 과산화수소로 2시간 동안 처리한 bEnd.3 내피 세포로 면역화시켰다. 이러한 처리는 125I-표지된 아넥신 V로 검측된 바와 같이 70 내지 90%의 세포에서 외부 표면에 대한 음이온성 인지질의 위치변화를 유발하였다. 처리된 세포를 세척하고, 탈착시키고 계수하였다. 2백만개의 세포를 멸균 PBS에 현탁시키고 주사동안 3주간의 간격으로 5회 복강내 주사하였다. 음이온성 인지질에 대한 폴리클로날 항체의 역가는 각각의 면역화후 2일째에 측정하였다.
B. 고 역가 항혈청
PS와 같은 음이온성 인지질과 반응성인 항체의 매우 높은 역가를 지닌 마우스를 수득하였다(표 1). 마우스는 어떠한 독성 신호도 나타내지 않았다. 비록 이러한 면역화 프로토콜이 전체적으로 랫트에서 보다 마우스에서 더욱 효과적이라고 해도, 랫트의 면역화가 효과적이며 9D2 항체를 생산한다(하기 참조).
[표 1]
Figure 112012087199067-pat00015
추가의 면역화에서, 각종 마우스를 과산화수소 처리된 bEnd.3 세포로 3회 면역화하고 혈청을 처음 면역화후 54일째에 시험하였다. 혈청내 PS와 반응성인 IgG 항체를 항-마우스 IgG로 검출하고, 혈청내 Fc 특이적인 제2 항체, 및 IgM 항체를 항-마우스 IgG mu 특이적인 제2 항체로 검출하였다. PS와 반응성인 IgG 및 IgM 항체와 다수의 효과적인 항혈청을, 항혈청과 IgG 항체가 일반적으로 더욱 효과적인 이러한 면역화 프로토콜을 사용하여 수득하였다.
이제 이러한 방법을 사용하여 예를 들면, 하기 기술된 3G4 항체와 효과적으로 경쟁하는 것에 대해 스크리닝한 것들을 포함하는 특정 항-PS 항체를 추가로 생성시킬 수 있다. 통상적으로, PS에 대한 목적한 항혈청의 IgG 역가가 200,000 초과에 이르지만, PC 역가가 50,000 미만인 경우, 융합을 수행하여 모노클로날 항체를 생성시킬 수 있다.
또한, 이러한 방법들은, 아미노인지질 및 음이온성 인지질의 발현을 유도하기 위해 다른 방법들이 사용될 수 있는 것과 같이, H2O2를 사용하여 세포 처리를 개시하는 것에 한정되지 않는다. 예를 들어, TNF 및 악티노마이신 D를 사용한 처리는 다른 유용한 방법이다. 하나의 경우에서, 아합치성(약 85% 합치성) bEnd.3 세포를 10ng/ml 마우스 TNF 및 1㎍/ml 악티노마이신 D로 37℃에서 16시간 동안 배양처리기 속에서 처리하였다. 다음 세포를 위에서 요약한 바와 같은 면역 공정에 적용시켰다.
C. IgG 및 IgM 모노클로날 항체
비장 파트너 P3X63AG8.653 세포(ATCC, Rockville, MD 소재)를 사용하여 면역화시킨 동물로부터 비장세포를 융합시켜 하이브리도마를 수득하였다.
종양 치료에 유용한 모노클로날 항체를 제조하기 위한 본 발명자들의 기술의 중요한 측면은 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하지만 중성 인지질에는 결합하지 않는 항체를 선택하기 위한 스크리닝을 포함하는 선별 전략이다. 다른 중요한 측면은 혈청의 부재에서와 같이 혈청의 존재하에서 강하게 PS-피복된 플레이트에 결합하는 항체를 선택하는 것이다. 이는 항-인지질 증후군을 유발하거나 이러한 증후군에 기여하는 것으로 여겨지는 PS 및 혈청 단백질의 복합체을 인지하는 항체를 제외하도록 수행한다.
예를 들어, PS와 반응성인 모노클로날 항체를 분리하기 위한 전략은 항-마우스 IgG, Fc 감마 특이적인 제2 항체를 사용하여 PS 피복된 플레이트상에서 하이브리도마 상층액을 스크리닝함을 포함한다. 스크리닝은 우선 4개의 인지질(PS, 포스파티딜세린; PE, 포스파티딜에탄올아민; CL, 카디올리핀; 및 PC, 포스파티딜콜린) 및 bEnd3 세포에 대해 수행하였다. 천연 인지질인 PC와 반응성인 클론을 bEnd3 세포와 비 반응성인 클론에서와 같이 버렸다. 고도로 결합하는 항-PS 클론을 선택하였다. PS만 반응성이거나 PS에 대해 강하게 우선적인 웰을 우선 아-클로닝하고 다른 음이온성 인지질에 대한 결합과 함께 PS 반응성을 나타내는 웰을 두번째로 아-클로닝하였다.
특정의 다음 연구에서, 로트(Rote, 1993) 등이 기술한 바와 같이 생산한 3SB, D11 및 BA3라고 명명된 마우스 모노클로날 IgM 항체를 또한 포함시켰다. 3SB 항체는 항-PS 항체로서 문헌에 기술되어 있으며 D11 항체는 문헌에 항-카디올리핀(항-CL) 항체로서 기술되어 있다. 이러한 항체의 생성 및 특성화의 세부사항은 로트 등의 문헌(참조: Rote et al. 1993, 본원에 참조로 인용됨)에 보고되어 있다.
본 발명자에 의해 생성된 각각의 선택된 하이브리도마의 동형을 측정하였다. IgG 부류의 항체는 통상적으로 높은 친화성, 생체내 낮은 청소율 및 정제 단순성, 변형 및 취급을 포함하는, IgM을 능가하는 다수의 장점을 지니므로, 이들의 생성이 특히 바람직하다. 동질성 IgG 동형을 사용하는 웰에 촛점을 맞추기 위해, IgM 또는 상이한 Igs의 혼합물을 함유하는 웰을 버리거나 재-클로닝하였다. 고도로 양성인 클론의 아-클로닝을 3회 내지 4회 반복하였다.
ELISA에 의해 측정된 것으로서, 대표적인 IgG 및 IgM 항체의 동형을 표 2에 나타낸다. 본 발명자들은 3G4로 명칭을 변경하기 전에, 초기에 3G4 항체를 "F3-G4"로 명명하였다. 이는 생물학적 물질에서 어떠한 변화도 반영하지 않는다. 혈청 의존성 또는 항체의 독립성은 또한 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure 112012087199067-pat00016
D. ELISA 프로토콜 및 모노클로날 항체 특성화
본 항체를 ELISA로 추가로 연구하고 3SB 및 D11과 비교하였다. 본 연구에 사용된 항-PS ELISA를 다음과 같이 수행한다. 특별한 차이점을 정의하지 않는 한, 이는 본 출원의 연구를 통해 사용된 ELISA의 포맷이다.
ELISA를 항원 PS(2.5ml의 병속 P-6641 25mg 10mg/ml(용매는 클로로포름:MeOH 95:5이다))을 사용하여 시험한다. 다른 인지질을 동일한 프로토콜을 이용하여 사용할 수 있다. PS(또는 다른 인지질) 원료 용액을 분취하여 -30℃에서 기밀 용기에 저장할 수 있다. 바람직한 96웰 플레이트는 다이나테크 U 바닥 임뮬론 1(Dynatech U bottom Immulon 1: Dynatech Labs 제조원, 제품번호: 011-010-3550)이다.
본원에 사용된 표준 차단 완충액은 PBS에 용해된 10% 소 혈청이다. 다른 차단 용액이 적합하나, 어떠한 세제도 차단 및 세척 용액으로부터 제외되어야 한다. 1차 항체는 시험 샘플 또는 혼합물이다. 바람직한 제2 항체는 염소, 항-마우스 IgG-HRP이다. 전개 용액은 10ml의 0.2M Na2PO4, 10ml의 시트르산, 1개의 10mg OPD 정제 및 10㎕의 과산화수소이다. 정지 용액은 0.18M H2SO4이다.
당해 프로토콜은 다음과 같이 96웰 플레이트를 PS로 피복시킴을 포함한다: n-헥산중 PS 원료 용액을 10㎍/ml로 희석시키고 잘 혼합한다. 50㎕를 각각의 웰에 가하고 이를 1시간 동안 증발시킨다. 200㎕의 10% 혈청(또는 다른 차단 완충액)을 각각의 웰에 가하고, 이를 덮고 실온에서 2시간 또는 4℃에서 밤새 유지시킨다. 플레이트를 PBS로 3회 세척한다. 제1 항체(차단 완충액속에 희석시킴)를 가하고 2시간 동안 37℃에서 항온처리한다. PBS로 3회 세척한다. 제2 항체(통상적으로 염소, 항-마우스 IgG-HRP 또는 다른 적절한 제2 항체) 100㎕/웰을 가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 플레이트를 PBS로 3회 세척한다. 100㎕의 전개 용액을 각각의 웰에 가함으로써 ELISA를 전개시키고, 10분 동안 전개시킨 후, 100㎕의 정지 용액을 각각의 웰에 가하고 490nm에서 O.D.를 판독한다.
하기 결과는 9D2, 1B12, 3G4 및 1B9에 대해 나타낸 것이다. PS에 대한 이들 항체의 친화도를 측정하여 3SB와 비교한다. 새로운 항체의 특정 상대 친화도는 3SB와 비교하여 현저히 개선되어 있다(표 3).
[표 3]
Figure 112012087199067-pat00017
항체의 특이성은 다음 인지질로 피복한 플레이트를 사용하는 ELISA에 의해 측정하였다: PS, 포스파티딜세린; PE, 포스파티딜에탄올아민; PI, 포스파티딜이노시톨; PA, 포스파티드산; PG, 포스파티딜글리세롤; PC, 포스파티딜콜린; CL, 카디올리핀; 및 SM, 스핀고마이엘린. 3SB 및 D11과 비교한 것으로서, 9D2, 1B12, 3G4 및 1B9의 특이성 프로파일을 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure 112012087199067-pat00018
1B9, 2G7 및 7C5 항체는 필수적으로 동일하다. 이들 항체는 단지 PS만 인지하며 PS에 대한 결합을 위해 혈청 또는 혈청 단백질을 필요로 한다. 각종 인지질에 대한 1B9, 2G7 및 7C5의 결합을 10% 소 혈청의 존재하에서만 검정한 반면, 다른 항체의 결합은 혈청의 부재 또는 존재하에서 시험하였다. 1B9, 2G7 및 7C5외의 항체의 경우, 혈청의 존재는 특정의 인지질에 대한 결합에 있어 우세하게 변하지 않는다. 3G4, 3B10 및 9D2를 포함하는 인지질 그룹은 혈청의 부재하에서 PS에 대한 결합의 바람직한 특성을 지닌다.
3SB 항체는 혈청의 존재 및 부재하에 완전한 세포에서 PS를 인지한다. 3SB의 주요 반응성은 PS와 이루어지지만, 또한 혈장 막의 비교적 적은 성분인, 포스파티드산과의 반응성을 지닌다(참조: Hinkovska-Galcheva et al., 1989). 3SB는 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜이노시톨과의 반응성, 및 포스파티딜콜린 및 스핀고마이엘린과의 반응성을 필수적으로 결여하고 있다(표 4).
PS는 혈장 막의 가장 풍부한 음이온성 인지질이며 정상 조건하에서 정상 세포내 혈장 막의 내부 소편으로 강하게 분리된다. PS는 아미노인지질이다. PE도 또한 아미노인지질이나, PE는 음이온성이 아닌 중성이다. 중성의 아미노인지질외에, PE는 PS와 유사하게 작용하며 일반적으로 혈장 막의 내부 소편으로 강하게 분리된다.
PI는 혈장 막의 다른 주요 음이온성 인지질이며, 이는 또한 정상 조건하에서 정상 세포내 내부 소편으로 강하게 분리된다. PA 및 PG는 혈장 막의 주요 음이온성 인지질이며, 이는 또한 일반적으로 내부 소편으로 분리된다. CL은 미토콘드리아 막내에 존재하는 음이온성 인지질이며 통상적으로 혈장막에 부재한다.
PC 및 SM은 혈장 막의 콜린 함유 중성 인지질이다. PC 및 SM 각각은 주로 정상 조건하에서 외부 소편에 위치한다.
정상 혈관과 종양 혈관사이에 차별화된 아미노인지질 및 음이온성 인지질 발현에 대한 발명자들의 모델을 유지하는데 있어서, 선택된 프로토콜을 사용하여 전개시킨 항체중 어느 것도 중성 인지질인 PC 및 SM과 반응하지 않았다. 1B9 항체는 PS에 대해 특이적인 반면, 9D2, 1B12 및 3G4는 표 4에 나타낸 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 우선적으로 결합하였다. 9D2 항체는 또한 실시예 VI에 기술되어 있다.
실시예 V
종양 혈관의 전체적 마커인 외부화된 포스파티딜세린
본 실시예는, PS의 노출이 마우스에서 10개의 상이한 고형 종양의 각각에서의 내피 세포에서 일어나며 실시예 II에서 기술한 L540 종양 모델에 제한되지 않음을 나타낸다.
생체내에서 외부화된 PS는 각종 유형의 사람 또는 쥐 종양을 지닌 마우스로 PS에 대해 지시된 모노클로날 항체를 정맥내 주사함으로써 검출하였다. 항-PS 항체는 모든 10마리의 상이한 종양 모델에서 혈관 내피에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 동일한 마우스에서 기원한 정상 기관내 혈관 내피는 염색되지 않았다. 이형-매치된 대조군 모노클로날 항체는 종양 또는 정상 세포에 국재화되지 않았다. 세포사멸성 세포는 또한 면역조직화학적으로 확인되었으며, 여기서, 종양내 극소수의 내피 세포가 세포사멸의 마커로서 발현되었다.
따라서, 본 실시예는 정상 혈관이 아닌 종양내에서 혈관 내피 세포가 PS를 내재화시킴을 나타낸다. 노출된 PS를 지닌 대부분의 종양 내피 세포는 세포독성이 아니다. 따라서, PS는 종양 혈관 영상화 및 치료요법에 사용할 수 있는 종양 혈관 구조의 풍부하고 접근가능한 마커이다.
A. L540 , H358 및 HT29 종양
본 연구에 사용된 항-PS 항체는 3SB로 명명된 마우스 모노클로날 IgM 항체이었다(실시예 IV, Rote et al., 1993). 3SB는 주로 PS에 결합하나, 또한 PS와 유사한 분포를 갖는 상대적으로 적은 음이온성 인지질인 PA와 반응한다. 사용된 항-CL 항체는 D11로 명명된 마우스 모노클로날 IgM 항체이었다(실시예 IV, Rote et al., 1993).
종양 및 정상 혈관 내피에서 PS 노출을 우선 3마리의 동물 종양 모델: L540 사람 호지킨 림프종, NCI H358 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 및 HT29 사람 결직장 암종에서 먼저 실험하였다. 생체내에서 종양을 성장시키기 위해, 2x106개 세포를 SCID 마우스의 우측 옆구리에 주사하고 종양이 직경 0.8 내지 1.2cm가 되도록 하였다.
거대 종양(800mm3 이상의 용적)을 지닌 마우스에 꼬리 정맥을 통해 항-PS 또는 항-CL 항체 20㎍을 정맥내 주사하였다. 주사한지 1시간 후, 마우스를 마취시키고 이들의 혈액 순환을 헤파린처리한 염수로 관주시켰다. 종양 및 정상 기관을 제거하고 동결단편을 제조하기 위해 순간-동결시켰다. 마우스 IgM을 염소 항 마우스 IgM(μ 특이적)-HRP 접합체를 사용한 후 카바졸을 사용한 전개에 의해 검출하였다. 단편당 10개 이상의 무작위 영역을 x40배 배율로 시험하였고 양성 혈관의 평균 퍼센트를 계산하였다.
항-PS 항체는 마우스 IgM의 검출에 의해 나타내어진 바와 같이, 생체내에서 모든 3개의 종양(HT 29, L540 및 NCI-H358)의 혈관구조로 특이적으로 존재한다. 이러한 제1 연구에서, 종양내 염색된 혈관의 평균 퍼센트는 HT 29에 대해 80%, L540에 대해 30% 및 NCI-H358에 대해 50%이었다. 종양의 모든 영역내 혈관이 염색되었고 작은 모세혈관 및 큰 혈관 둘다가 염색되었다.
정상 조직내 항-PS 항체를 사용한 혈관 염색은 관측되지 않았다. 신장에서, 관은 항-PS 및 항-CL 수용체 둘다에서 염색되었고, 이는 이러한 기관을 통한 IgM의 분비와 관련된다. 항-CL 항체는 신장을 제외한 어떠한 종양 또는 정상 조직에서도 검출되지 않았다. 이러한 발견은, 단지 종양 내피가 혈장 막의 외부 부위로 PS를 노출시킴을 나타낸다.
B. 소 및 대 L540 종양
종양 혈관구조가 막의 내부 측면으로 PS를 분리시키는 능력을 상실하는 시기를 평가하기 위하여, 항-PS 국재화를 140 내지 1,600mm3의 용적 범위의 L540 종양에서 시험하였다.
마우스를 이들의 종양 크기에 따라 3개 그룹으로 나누었다: 140-300, 350-800 및 800-1,600mm3. 항-PS Ab는 소 L540 종양(300mm3 이하)을 지닌 3마리의 마우스에서는 검출되지 않았다. 항-PS Ab는 중간 크기의 L540 종양의 그룹내 5마리중 3마리의 동물에서 및 큰 L540 종양을 지닌 모든 마우스(4마리의 동물중 4마리)에서 국재화되었다(표 5). [판 내피 마커 메카 32(pan endothelial marker Meca 32)에 의해 확인한 것으로서] 전체로부터 PS-양성 혈관의 퍼센트는 L540 중간 그룹에서 10 내지 20%이었고 큰 L540 종양 그룹에서 20 내지 40%이었다(표 5).
[표 5]
Figure 112012087199067-pat00019
C. L540, H358, HT29, 콜로26, B16 및 3LL 종양
동일한 항-PS(3SB) 및 항-CL(D11) 항체를 사용하여, 종양 및 정상 혈관 내피상에서의 PS 노출을 추가의 3마리 동물 종양 모델을 사용하는 추가의 연구에서 시험하였다(총 6마리): L540 사람 호지킨 림프종, NCI H358 사람 비-소세포 폐 암종(NSCLC), HT29 사람 결장직장 암종, 콜로26 마우스 결장 암종, B16 마우스 흑색종 및 3LL 마우스 폐 종양.
이들 연구에서, 종양을 SCID 마우스에서 피하 성장시키고 0.4 내지 0.7cm3의 용적에 이르도록 하였다. 그룹당 3마리 이상의 마우스를 사용하였다. 항-PS 또는 항-CL 마우스 IgM 항체(30㎍/마우스)를 염수 200㎕중에 정맥내 주사하였다. 30분 후, 마우스를 참수시키고 방혈시키고 이들의 혈액 순환을 헤파린 처리한 염수로 관주시켰다. 주요 기관 및 종양을 수거하고 동결단편의 제조를 위해 순간 동결시켰다. 마우스 IgM을 염소 항 마우스 IgM(μ 특이적)-HRP 접합체를 사용하여 검출한 후 카바졸로 발현시켰다.
일련의 종양 단편을 마우스 혈관의 판-내피 마커에 대해 지시된 모노클로날 항체인 MECA 32로 염색시켰다. PS-양성 혈관을 형태학적으로 및 항-마우스 IgM 및 MECA 32를 사용한 이들의 일치하는 염색으로 확인하였다. 단편당 10개 이상의 임의 영역(0.317mm2/영역)을 2명의 독립적인 관측자의 맹검 양식으로 시험하였다. PS에 대해 양성으로 염색된 MECA 32-양성 혈관 퍼센트를 계산하였다. 각각의 유형의 3개 종양을 2개의 별개 연구 각각에서 시험하였다. 평균치 및 표준 에라(SE)를 계산하였다. 각각의 그룹에서 전체 및 PS-양성 혈관의 수에 있어서의 내부-종양 편차는 대략 10%이었다.
본 연구에서 모든 6개의 종양은 PS-양성 혈관을 함유하였다(표 6). 3SB에 의한 PS의 검출은, 종양 내피의 염색이 항-CL 항체로 관측되지 않으므로 특이적이다(표 6; 도 1). 항-PS 또는 항-CL 항체의 혈관 국재화는 신장 이외의 정상 기관에서 관측되지 않았다(항-PS 및 항-CL 수용체 둘다에서 관 염색은 이러한 기관을 통한 IgM의 분비를 반영한다).
[표 6]
Figure 112012087199067-pat00020
이러한 연구에서, PS-양성 혈관의 퍼센트는 콜로 26 종양에서 10% 내지 B16 종양에서 40%의 범위이었다. 항-PS IgM은 종양의 모든 영역내 모세혈관 및 소정맥의 관 표면에 존재하였다. PS-양성 혈관은 괴사의 내부 및 주변 영역에서 특히 우세한 것으로 여겨진다. 양성 혈관은 일반적으로 광 현미경에 의해 명백해지는 형태학적 비정상성을 나타내지 않았다. 괴사 부위에 위치하는 예비 혈관은 퇴화의 형태학적 신호를 나타내었다. 항-PS 항체(항-CL 항체는 아님)는 또한 괴사 및 세포사멸성 종양 세포로 국재화하였다.
이러한 조절된 연구는, PS가 각종 종양내 혈관 내피의 관 표면에 지속적으로 노출되지만, 정상 조직에서는 그렇지 않으며, 종양 혈관구조 발현은 모델 특이적이 아님을 입증한다.
D. 세포사멸성이지 않은 대부분의 PS -양성 종양 혈관
이중 표지화 기술을 사용하여 종양 단편내 세포사멸성 내피 세포를 확인하였다. 내피 세포를 판-내피세포 마커인 MECA 32로 확인하였다. 세포사멸성 세포를 2개의 독립적인 마커인, 사멸하는 세포에서 세포질 변화를 확인하는 카스파제-3의 활성 형(참조: Krajewska et al., 1997) 및 핵 변형된 세포를 확인하는 단편화된 DNA(참조: Gavrieli et al., 1992)를 사용하여 면역조직화학적으로 확인하였다.
활성 카스파제-3을 토끼 항-카스파제-삼특이적인 항체(R&D 제조원, 미네소타주 미네아폴리스 소재)에 이어 알칼린 포스파타제에 접합된 항-토끼 IgG(AP 제조원, 일리노이주 록크포드 피어스 소재)와 함께 항온처리함으로써 검출하였다. 다른 종양 단편은 검출 시약으로서 항-디옥시게닌-알칼린 포스파타제 접합체를 사용하는 터널 검정(Tunel asay: ApopTagTM 키트, 메릴랜드 온코어 소재)으로 분석하였다. 단편을 세포사멸성 마커(핑크) 및 내피 세포 마커, MECA(갈색)으로 이중염색하였다. 둘다의 색상은, 내피 세포 및 세포사멸성 세포의 마커가 동시에 존재하는 경우에, 동일한 세포에서 선명하게 가시적이었다.
6개 유형의 종양중 5개의 종양(HT29, H358, B16, 콜로 26, L540)의 내피 세포는 세포사멸 마커중 어느 것도 나타내지 않았다(표 7). 6번째 유형의 종양, 3LL은 괴사 영역내 위치하는 소수의 세포사멸성 내피 세포를 나타내었다. 대조적으로 세포사멸성 악성 세포는 모든 유형의 종양에서 일반적이었다. 세포사멸성 종양 세포의 퍼센트는 L540 종양에서 1 내지 2% 내지 3LL 종양에서 12.6 내지 19.5%의 범위였다.
[표 7]
Figure 112012087199067-pat00021
E. MDA-MB-231 및 Meth A 종양
종양 혈관 내피에서의 PS 노출을 또한 마우스내에서 성장하고 있는 MDA-MB-231 사람 유방암 종양 및 피하로 성장하는 마우스 Meth A 섬유아종에서 시험하였다. 본 연구에 사용된 항체는 실시예 IV에 기술된 바와 같이 생성된 9D2 항체이며, 이는 음이온성 인지질과 반응성이다.
실시예 VI에 상세히 기술되어 있는 바와 같이, L540, NCI-H358 및 B16 종양, 및 SCID 마우스의 유방 지방 덩이내에서 같은자리로(orthotopically) 자라고 있는 MDA-MB-231 유방 종양 및 마우스 Meth A 섬유아종이 피하에 성장하고 있는 모델에서 9D2를 종양 혈관에 국재화시켰다. 9D2는 5개의 종양 모두의 종양 혈관에 국재화된다. 종양내 혈관 내피는 뚜렷한 막 염색을 나타내었다. 9D2 항체는 또한 괴사 및 세포사멸성 종양 세포의 막 및 세포질에 국재화되었다. 9D2 항체의 혈관 국재화는 시험한 10마리의 정상 기관중 9개에서 관측되지 않았으며, 신장내 관에서 비특이적인 염색이 관측되었다.
같은자리 MDA-MB-231 유방 종양을 지닌 마우스에 바이오티닐화된 9D2 항체를 정맥내 주사하는 이중-염색 연구를 또한 수행하고 동결된 단편은 후에 FITC-접합된 MECA32로 염색하였다(실시예 VI). 약 40%의 MECA 32-양성 혈관이 9D2에 결합하였다.
F. MD - MBA -435 종양
추가의 유방암 모델에서, 종양 혈관 내피에서 PS 노출을 마우스에서 성장하는 MDA-MB-435 사람 유방암 세포에서 시험하였다. 본 연구에 사용된 항체는 3G4 항체(ch3G4)의 키메라 버젼이다. 3G4 항체 생성은 실시예 IV에 기술되어 있고, 키메라 3G4 항체의 생산은 실시예 XIX에 상세히 기술되어 있다. MDA-MB-435 모델에서 종양 혈관 내피에 대한 ch3G4의 국재화는 실시예 XIX에 더욱 상세히 기술되어 있고 도 22에 나타나 있다.
요약하면, 종양을 MD-MBA-435 세포를 사용하여 확립하고 바이오티닐화된 버젼의 키메라 3G4 항체와 비가역적 특이성의 대조군 IgG를 투여하였다. 종양 단편을 Cy3-접합된 스트렙트아비딘으로 염색하여 바이오티닐화된 단백질을 검출하였다. MECA 32 항체에 이은 FITC-표적화된 항-랫트 IgG 제2 항체로 이중 염색을 수행하여 혈관 내피를 검출하였다. 당해 검출 방법은 바이오티닐화된 단백질 및 혈관 내피를 적색 및 녹색으로 표지함으로써, 내피에 결합된 바이오티닐화된 단백질은 황색의 집중된 상으로 나타난다(도 22). 본 연구는 종양 혈관 내피에 대한 키메라성 3G4 항체의 특이적 국재화를 나타내었다.
G. RIP - Tag 종양
10번째 모델에 대해, 종양 혈관 내피에서 PS 노출을 다단계 발암의 "RIP-Tag" 형질전환 마우스 모델(RIP1-Tag 2)에서 시험하였다. 당해 형질전환 마우스 모델에서, 모든 마우스는 인슐린-생산 베타-세포내 SV40 T 항원(Tag) 온코진의 발현 결과로서 12 내지 14주령째에 췌장의 섬 종양으로 진행하였다. 종양은 초-증식성 섬으로부터 다 단계로 성장하였으며, 악성으로 진행되기 위해서 혈관형성 스위치(angiogenic switch)를 필요로 한다. 매트릭스 메탈로프로테인아제-9는 혈관형성 스위치(REF)를 조절한다.
9D2 국재화 연구를 UCSF에서 병리학 교수인 도날드 맥도날드 박사(Dr. Donald McDonald)와 합동으로 RIPI-Tag2 모델에서 수행하였다. 9D2를, 모든 마우스가 작고 고도로 혈관화된 고형 종양을 지닌 경우 10주령 시기를 시작으로 RIP1-Tag2 마우스에 정맥내 주사하였다. 두꺼운(80μm) 종양 단편의 이중 염색을 수행하여 종양 및 정상 췌장내 국재화된 9D2 및 CD31을 확인하였다. 췌장 종양내 대략 50%의 혈관(CD31 양성)이 국재화된 9D2를 지닌 반면, 정상 섬내 혈관은 염색되지 않았다. 대조군 랫트 IgM을 주사한 마우스는 약하고 흔하게 염색되는 종양 혈관을 지녔다. 9D2 및 대조군 랫트 IgM의 내피세포 너머의 혈관외 조직으로의 일부 유출이 또한 명백하였다.
따라서, 본 실시예는, 종양내 혈관 내피 세포가 PS 및 음이온성 인지질의 이들의 관 표면에 외재화시키며, 여기서, 이들은 생체내 항-PS 항체에 의해 결합될 수 있음을 확증한다. PS는 정상 조직내 혈관 내피 세포의 외부 표면에는 존재하지 않으며, 이는 PS-인지 항체, 아넥신 V 및 다른 리간드가 세포독성 약물, 응고제 및 고형 종양내 혈관의 선택적인 영상화 또는 파괴를 위한 방사성 핵종을 전달하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
PS-양성 종양 내피는 대부분의 경우, 본 연구에 사용된 종양에서 가시적으로 여겨진다. 이는 세포사멸의 마커를 나타내지 않으며, VCAM-1, E-셀렉틴 및 다른 급속하게 변하는 단백질의 발현에 의해 나타나는 바와 같이 형태학적으로 완전하고 대사적으로 활성이다. 비록 세포사멸의 지시인자로 고려된다고 하더라도, PS 노출은 악성 세포(참조: Rao et al., 1992), (참조: Utaugi et al., 1991) 활성화된 혈소판(참조: Rote et al., 1993), 및 이주, 매트릭스 침입 및 융합의 각종 단계에서 배아 영양막(참조: Adler et al., 1995)을 포함하는 몇몇 유형의 생 세포에서 관측되었다.
PS 노출 및 세포 사멸에 대한 관여사이의 상관관계의 결여는 또한 프로-세포사멸 자극(pro-apoptotic stimulus)(참조: Hammill et al., 1999)의 제거후 PS 비대칭을 회복하고 정상적으로 성장하는 프레-세포사멸(pre-apoptotic) B 림프종 세포에서 또한 관찰된다. 정상적인 생 세포에서, PS 노출은 아마도 리간드-수용체 상호작용과 같은 표면 현상에 의해 개시되며, 이는 세포내로 Ca2 + 유동을 유발한다(참조: Dillon et al., 2000). Ca2 + 유동은 스크람블라제(scramblase)를 활성화시키고(참조: Zhao et al., 1998) 아미노인지질 트랜스로카제를 동시에 억제한다(참조: Comfurius et al., 1990).
종양 세포에서의 PS는 몇가지 이유로 인해 암 영상화 또는 치료요법용 표적으로서 매력적이다: 이는 풍부하다(세포당 대략 3x106 개 분자); 이는 종양 내피의 관 표면에 존재하며, 혈액내 혈관 표적화제에 의한 결합에 직접적으로 접근가능하다; 이는 다양한 고형 종양내 높은 퍼센트의 종양 내피 세포에 존재하며, 지금까지 시험된 모든 정상 조직에서의 내피로부터는 부재한다. 따라서, 종양 혈관구조에서 PS에 대해 지시된 혈관 표적화제 및 영상화제는 사람에게서 암의 검출 및 치료에 사용될 수 있다.
실시예 VI
종양 혈관의 표면에 노출된 음이온성 인지질
음이온성 인지질은 정상 조건하에서 포유동물 세포의 혈장 막의 외부 소편에 거의 존재하지 않는다. 예를 들어, 세포 표면에서 포스파티딜세린의 노출은 세포사멸, 괴사, 세포 손상, 세포 활성화 및 악성 형질전환 동안 일어난다. 본 실시예는, 음이온성 인지질에 결합하는 중성 리간드 및 특이적 항체 둘다의 국재화에 의해 입증되는 것으로써, 생체내에서 종양 혈관구조에서 음이온성 인지질이 상향조절됨을 나타낸다.
음이온성 인지질을 특이적으로 인지하는 모노클로날 항체, 9D2를 다양한 같은자리 또는 다른자리(ectopic) 종양을 지닌 마우스에 주사하였다. 다른 마우스에게는 음이온성 인지질에 결합하는 중성 리간드인, 아넥신 V를 주사하였다. 9D2 및 아넥신 V는 둘다 모든 종양내 혈관 내피에 및 괴사내부 및 주변 영역의 종양 세포에 특이적으로 국재화하였다. 종양 혈관의 내피세포중 15 내지 40%가 염색되었다. 정상 내피에서는 국재화가 검출되지 않았다.
종양 미세환경에 존재하는 것으로 알려진 각종 인자 및 종양-관련 상태를, 9D2 및 아넥신 V 결합에 의해 판단되는 것으로서, 배양된 내피 세포의 음이온성 인지질의 노출을 유발하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 저산소증/재산소화, 산성도, 트롬빈 및 염증 사이토킨 모두를 음이온성 인지질에 노출시켰다. 과산화수소는 또한 강력한 유도인자이었다. 염증성 사이토킨 및 저산소증/재산소화를 사용한 배합 치료는 추가 효과보다 더 컸다. 따라서, 생체내에서 종양 내피에 음이온성 인지질의 입증된 노출은 사이토킨 및 반응성 산소 종에 의한 손상 및 활성화에 의해 유발되는 것으로 여겨진다. 메카니즘에 상관없이, 음이온성 인지질은 이제 종양 혈관 표적화, 영상화 및 치료요법에 사용할 수 있는 종양 혈관의 마커이다.
A. 물질 및 방법
1. 물질
Na125I를 아머샴(Amersham, 일리노이주 알링톤 하이츠 소재의 제조원)로부터 입수하였다. 둘베코 변형된 이글스 조직 배양 배지(Dulbecco's modified Eagle's tissue culture medium) 및 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 둘베코 PBS를 기브코(Gibco, 뉴욕주 그랜드 아이슬랜드 소재의 제조원)로부터 입수하였다. 태아 소 혈청은 하이클론(Hyclone 제조원, 유타주 로간 소재)로부터 입수하였다. L-α-포스파티딜세린, L-α-포스파티딜콜린, 카디올리핀, L-α-포스파티딜에탄올아민, L-α-포스파티딜이노시톨, 스핀고마이엘린, 포스파티드산, 포스파티딜글리세롤, O-페닐렌디아민, 과산화수소 및 트롬빈은 시그마(Sigma, 미주리주 세인트 루이즈 소재의 제조원)로부터 입수하였다. 24개 웰을 지닌 평편 바닥 플레이트는 팔콘(Becton Dickinson and Co., 뉴저지주 링컨 파크 소재의 제조원)으로부터 입수하였다.
재조합 간세포 성장 인자(HGF 또는 분산 인자(scatter factor)) 및 악티노마이신 D는 칼바오이켐(Calbiochem, 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 제조원)으로부터 입수하였다. 재조합 쥐 인터루킨-1 알파, 베타 및 종양 괴사 인자 알파(TNF α)는 R&D 시스템(R&D Systems, 미네소타주 미네아폴리스 소재의 제조원)으로부터 입수하였다. 유니버설 타입 I의 인터페론(모든 유형의 인터페론이 치환된 하이브리드 단백질)은 피비엘 바이오메티칼 래보러토리즈(PBL Biomedical laboratories, 뉴저지주 뉴 브룬스윅 소재의 제조원)으로부터 입수하였다. 재조합 사람 혈관 내피 성장 인자 121(VEGF), 사람 혈소판-기원한 성장 인자-BB, 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-10(IL-10) 및 사람 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2)는 페프로 테크(Pepro Tech, 뉴저지주 로키 힐 소재의 제조원)으로부터 입수하였다.
2. 항체
MECA 32, 판 마우스 내피 세포 항체는 이. 부쳐(E. Butcher, 캘리포니아주의 스텐포드 대학) 박사로부터 입수하였으며 면역조직화학 연구용 양성 대조군으로서 제공되었다. 본 항체의 세부사항은 발표되어 있다(참조: Leppink et al., 1989). 토끼 항-랫트 면역글로불린, 랫트-항 마우스 면역글로불린 및 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 접합된 염소-항 마우스 및 항-랫트 제2 항체는 다코(Daco, 캘리포니아주 카핀테리아 소재의 제조원) 또는 잭슨 임뮤노리서치 랩(Jackson Immunoresearch Labs, 펜실바이나주 웨스트 그로브 소재의 제조원)으로부터 입수하였다.
본 연구에 사용된 9D2 항체는 실시예 IV에 기술된 바와 같이 생성시켰다. 9D2는 음이온성 인지질과 반응성인 랫트 모노클로날 항체이다. 9D2의 인지질 특이성의 추가의 특성화는 본 실시예의 결과 단락에 제공된다.
3. 세포
말기 단계의 환자로부터 기원한 L540Cy 호지킨 림프종 세포는 비. 디일(Prof. V. Diehl, 독일 퀼른 소재)로부터 제공받았다. NCI-H358 사람 비-소세포 폐 암종은 아디 카츠다(Adi Gazdar, 텍사스주 달라스 소재의 사우쓰웨스턴 메디칼 센터) 박사로부터 제공받았다. Meth A 마우스 섬유아종 및 MDA-MB-231 사람 유방암종은 아메리칸 타입 세포 컬렉션(American Type Cell Collection, 메릴랜드 록크빌 소재)로부터 입수하였다. 마우스 뇌 내피종주, bEnd.3은 베르너 리사우(Werner Risau, 독일 뮌헨 소재의 막스 플랑크 인스티튜트)씨가 제공하였으며 10% FBS가 보충된 DMEM속에 유지시켰다. 성숙한 소 대동맥 내피(ABAE) 세포는 클론에틱스(Clonetics, 캘리포니아주 샌디에고 소재; 메릴랜드주 워커빌 소재의 제조원)으로부터 입수하였다. ABAE 세포는 10% 혈청과 2ng/ml의 bFGF가 보충된 DMEM속에 유지시켰다.
4. 조직 배양
L540Cy 림프종을 제외한 bEnd.3, ABAE 세포 및 모든 종양 세포를 10% 태아 송아지 혈청, 2mM L-글루타민, 2 단위/ml의 페니실린 G 및 2㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 속에 유지시켰다. L540Cy 세포를 동일한 첨가제를 함유하는 RPMI 1640에 유지시켰다. 세포를 1주일동안 1회 아-배양시켰다. bEnd.3 세포의 트립신치료는 0.2% EDTA를 함유하는 PBS중 0.125% 트립신을 사용하여 수행하였다. 시험관내 연구를 위해, 내피 세포를 24 웰 플레이트내 1ml의 배양 배지내에 10x103 개 세포/mL의 밀도로 종균배양하고 검정에 사용하기 전 48 내지 96시간동안 배양하였다. 배지를 각각의 연구전 24시간 재교환하였다.
5. 플라스틱-고정된 인지질과의 반응성
인지질을 n-헥산에 50㎍/ml의 농도로 용해하였다. 100㎕의 당해 용액을 96웰 미세역가 플레이트의 웰에 가하였다. 공기중에서 용매를 증발시킨 후, 당해 플레이트를 2시간 동안 2mM Ca2 +를 함유하는 DPBS(결합 완충액)속에 희석시킨 10% 태아 송아지 혈청으로 차단시켰다.
9D2 항체 또는 아넥신 V를 6.7nM의 초기 농도에서 10% 혈청의 존재하에 결합 완충액속에서 희석시켰다. 일련의 2배 희석물을 플레이트(100㎕/웰)속에서 제조하였다. 다음에, 당해 플레이트를 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 세척하고 9D2 및 아넥신 V를 HRP에 접합시킨 염소 항-랫트 IgM 및 래빗 항-사람 아넥신 V에 이어 HRP에 접합된 염소 항-토끼 IgG 로 각각 검출하였다(모두 1:1000으로 희석됨). 제2 시약을 색원체성 기질 OPD를 사용 한 후 미세플레이트 판독기(Molecular Devices, 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 제조원)를 사용하여 490nm에서 플레이트를 판독함으로써 검출하였다.
9D2 항체 결합의 특이성은 비가역적 특이성의 대조군 랫트 IgM(Pharmingen, 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 제조원)을 사용하여 확인하였다. Ca2 + 의존성인 인지질에 대한 아넥신 V의 결합 특이성은 5mM EDTA를 함유하는 DPBS속에서 시약을 희석시킴에 의해 측정하였다. 추가의 음성 대조군은 0.2%의 세제 Tween 20을 함유하는 결합 완충액으로 플레이트를 세척하는 것으로 이루어졌다. 당해 치료는 지질을 추출함으로서 플라스틱에 흡착된 인지질을 제거한다. 9D2 항체 또는 아넥신 V중 어느 것도 세제로 세척된 플레이트에 결합하지 않았다.
6. 배양된 내피 세포의 표면상에 음이온성 인지질의 검출
내피 세포를, 이들이 대략 70%의 합치성에 이를때까지 성장시켰다. PS 노출을 유도하기 위해, 세포를 37℃에서 1시간 동안 H2O2(200μM)로 처리하였다. 대조군 및 처리된 슬라이드를 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 DPBS로 세척하고 동일한 완충액속에 희석시킨 0.25%의 글루타르알데하이드로 고정시켰다. 과량의 알데하이드 그룹을 50mM의 NH4Cl과 함께 5분 동안 항온처리하여 퀀칭시켰다. 인지질의 검출시 세제 및 유기 용매의 효과를 시험하기 위해, 일부 슬라이드를 아세톤(5분) 또는 1%(v/v)의 트리톤TM X-100을 함유하는 PBS로 예비-배양하였다.
세포를 DPBS(Ca2 +, Mg2 + 및 0.2%(w/v) 젤라틴 함유)로 세척하고 1㎍/ml의 바이오티닐화된 아넥신 V(Pharmingen, 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 제조원) 또는 1㎍/ml의 9D2 항체와 함께 항온처리하였다. 2시간 항온처리한 후, 세포를 0.2% 젤라틴 완충액으로 세척하고 스트렙트아비딘-HRP(1:500 희석)과 함께 항온처리하였다. 비가역적 특이성의 랫트 IgM 및 스트렙트아비딘 단독을 당해 연구에서 음성 대조군으로 사용하였다. 모든 단계를 실온에서 수행하였다. HRP 활성은 pH 5.5의 시트레이트-포스페이트 완충액중 O-페닐렌디아민(0.5mg/ml) 및 과산화수소(0.03% w/v)를 가함으로써 측정하였다. 15분 후, 100㎕의 상층액을 96 웰 플레이트에 이전시키고, 100㎕의 0.18M H2SO4를 가하고 흡광도를 490nm에서 측정하였다. 달리는, PS-양성 세포를 카바졸 기질을 첨가함으로써 불용성의 적갈색 침전물을 수득함으로써 검출하였다. 각가의 연구를 2회 수행하고 2회 이상 반복하였다.
7. 리포좀에 의한 인지질에 대한 9D2 및 아넥신 V 결합의 억제
인지질 인식의 특이성은 다양한 리포좀을 사용한 경쟁적 검정으로 확인하였다. 리포좀을 클로로포름중 단일 인지질 5mg의 용액으로부터 제조하였다. 당해 용액을 질소하에 건조시켜 환저 유리 플라스크내 박층을 형성시켰다. 10ml의 트리스 완충액(0.1M, pH 7.4)을 가하고 플라스크를 2분동안 5회 초음파처리하였다. 9D2 또는 아넥신 V(6.66nM)을 실온에서 1시간 동안 200㎍/ml의 리포좀 용액과 함께 예비-항온처리하였다. 당해 혼합물을 인지질-피복된 플레이트 또는 내피 세포 단층에 가하였다. 상이한 리포좀의 존재 또는 부재하에서 고정화된 인지질 또는 세포 표면에 결합하는 9D2의 능력을 위에서 기술한 바와 같이 측정하였다.
8. 고정화된 PS에 대한 결합에 있어 9D2 및 아넥신 V의 경쟁
바이오티닐화된 9D2 항체 및 아넥신 V를, 실온에서 1시간 동안 N-하이드록시석신이미드 바이오틴(Sigma, 미주리주 소재의 제조원)의 10배 몰 과량과 정제된 단백질을 항온처리하여 제조하였다. 유리 바이오틴을 PBS에 대해 투석하여 제거하였다. 바이오티닐화 공정은 어느 단백질의 PS-결합능도 손상시키지 않았다. 경쟁 연구를 위해, 변형되지 않은 및 바이오티닐화된 단백질을 10배 몰 과량의 변형되지 않은 단백질과 예비혼합시켰다. 다음에, 혼합물을 PS-피복된 플레이트에 가하였다. 결합된 시약을 1:1000으로 희석된 스트렙트아비딘-HRP 접합체로 검출하였다. 경쟁인자의 부재하에서 각각의 시약의 PS에 대한 결합은 100% 값으로 취하였다.
9. 피하 이식된 종양의 성장
국재화 연구를 위해, 2x107 L540 사람 호지킨 림프종 세포 또는 1 x 107 세포의 다른 종양 유형을 SCID 마우스(Charles River, 메릴랜드주 윌밍턴 소재의 제조원)의 우측 옆구리내로 피하 주사하였다. 종양을 0.4 내지 0.7cm3의 용적에 이르도록 하였다. 그룹당 최소 3마리의 동물을 사용하였다. 연구를 3회 이상 반복하였다.
10. 사람 MDA-MB-231 유방 암종의 같은자리 모델
암컷 nu/nu 또는 SCID 마우스를 챨스 리버(Charles River 제조원)으로부터 입수하였다. MDA-MB-231 사람 유방 암종 세포를 공개된 프로토콜(Price, 1996)에 따라 유방 지방 덩이에 이식하였다. 요약하면, 마우스를 마취시키고 측면 가슴위 피부를 5mm 절개하였다. 유방 덩이를 노출시켜 0.1ml의 염수속에 재현탁시킨 1 x 107개 MDA-MB-231 세포를 주사하기 위해 정확한 부위를 보증하였다.
*11. 종양을 지닌 마우스에서 생체내 음이온성 인지질의 검출
9D2 또는 아넥신 V를 동결시킨 조직의 단편에 직접 적용시키는 면역조직화학 기술은 혈장 막의 내부 소엽 및 외부 소엽상의 음이온성 인지질 사이에서 구별되지 않은다. 외부에 위치한 인지질을 검출하기 위해, 앞서 기술한 바와 같은 방법들을 필수적으로 수행하였다(실시예 V; 참조: Ran et al., 1998). 종양을 지닌 SCID 마우스에 50㎍의 9D2 또는 바이오티닐화된 9D2 항체 또는 100㎍의 바이오티닐화된 아넥신 V를 정맥내 주사하였다. 60분 후 마우스를 참수시키고 이들의 혈액 순환을 방혈시키고 앞서 기술한 바와 같이 헤파린처리한 염수로 관주시켰다(참조: Burrows et al., 1992). 모든 주요 기관 및 종양을 수거하고 동결단편의 제조를 위해 순간-동결시켰다.
단편을 10% 혈청을 함유하는 PBS로 차단시켰다. 슬라이드 공정동안 인지질의 상실을 방지하기 위해, 세제 및 유기 용매를 차단 및 세척 완충액으로부터 제외시켰다. 랫트 IgM을 염소 항 랫트 IgM(μ 특이적)-HRP 접합체를 사용하고 카바졸 또는 DAB로 전개시켜 검출하였다(참조: Fries et al., 1993). 바이오티닐화된 시약을 HRP에 접합된 스트렙트아비딘으로 검출하였다.
염수 또는 비가역적 특이성을 지닌 랫트 IgM을 주사한 마우스로부터 기원한 종양 단편을 음성 대조군으로 제공하였다. 추가의 대조군은 1% 트리톤 용액 또는 아세톤중에 슬라이드를 10분 동안 항온처리하는 것으로 이루어진다. 당해 처리는 인지질을 추출한다. 이러한 조건하에서 어떠한 신호도 검출되지 않는다. 고 파워 영역당 다수의 양성 혈관을 x100의 배율로 측정하였다. 단편당 10개 이상의 영역을 시험하고 양성 혈관의 평균 퍼센트를 계산하였다. 9D2 또는 아넥신 V의 존재에 대한 당해 방법에 의한 단편의 염색은 생체내에서 시약에 의한 결합에 접근가능한 내재화된 음이온성 인지질을 지닌 세포를 검출한다.
12. PS-양성 종양 혈관의 확인 및 정량화
9D2 항체 또는 아넥신 V가 국재화된 구조물을 DAB-염색된 단편상의 형태학적 외관에 의해서 및 일련의 단편의 동결된 조직에서 판-내피 세포 마커, MECA 32를 사용한 동시 염색에 의해 혈관으로서 확인하였다. DAB-염색된 단편의 정량화는, 종양의 일련의 단편내 MECA 32, 9D2 또는 아넥신 V에 의해 염색된 혈관을 계수함으로써 수행하였다. 9D2 항체, 대조군 랫트 IgM 또는 아넥신 V를 주사한 6마리의 마우스로부터 기원한 각각의 종양의 6개 슬라이드를 시험하였다. 단편당 10개 이상의 무작위적 영역(0.317mm2/영역)을 2개의 독립된 관측으로 맹검 양식으로 기록하였다. 9D2, 아넥신 V 또는 MECA 32로 염색된 혈관의 평균 수 및 표준 오차를 계산하였다. 각각의 종양 유형의 그룹에서 측정한 9D2 또는 아넥신 V-양성 혈관의 평균수를 동일한 종양 그룹내 MECA 32-양성 혈관의 평균수와 비교하였다. 9D2 또는 아넥신 V-양성 혈관의 퍼센트를 계산하였다.
추가의 연구에서, MDA-MB-231 종양(0.3 내지 0.7cm3 용적)을 지닌 마우스에 50㎍의 바이오티닐화된 9D2, 대조군 IgM 또는 아넥신 V(그룹당 6마리의 마우스)을 정맥내 주사하였다. 먼저, 바이오티닐화된 시약을 스트렙트아비딘-Cy3 접합체와 항온처리하고, PBS속에서 세척한 다음 MECA 32 항체에 이어 FITC-표지된 항-랫트 IgG 제2 항체와 항온처리하였다. Cy3(적색) 및 FITC(녹색) 형광에 대해 적적한 여과기로 취한 단일 상들 각각을 디지탈 카메라로 포획하고 컴퓨터로 전송하였다. 황색(통합된 녹색 및 적색 형광의 산물)을 입증하는 10개의 무작위적 영역의 상을 메타뷰 소프트웨어(Metaview software)를 이용하여 겹쳐놓았다. 동일한 방법을 사용하여 대조군 랫트 IgM 또는 염수를 주사한 마우스로부터의 종양을 분석하였다. 국재화된 9D2 또는 아넥신 V를 지닌 혈관의 퍼센트를 다음과 같이 계산하였다: 녹색(총) 혈관의 평균수/영역당 황색 혈관의 평균수 X 100.
B. 결과
1. 9D2 항체 및 아넥신 V의 인지질 특이성
9D2 항체는 음이온성 인지질(PS, PA, CL, PI, PG)를 특이적으로 인지하며 ELISA시 중성 인지질(PE, PC 및 SM)과 현저히 반응하지 않는다(도 2A; 표 8). ELISA에서 인지질에 대한 9D2의 결합 강도의 순서는 PA>PS=CL>PG=PI이었다. 당해 결합은, 비가역적 특이성의 몇몇 대조군 랫트 IgM를 사용한 경우 결합이 관측되지 않으므로, 항원 특이적이다. ELISA 플레이트에 흡착된 음이온성 인지질중 어느 것에 대한 9D2의 결합은 음이온성 인지질중 어느것으로부터 제조한 리포좀에 의해서는 차단되나 중성 인지질중 어느 것으로부터 제조한 리포좀에 의해서는 차단되지 않는다.
[표 8]
Figure 112012087199067-pat00022
아넥신 V는 또한 음이온성 인지질에 결합하지만, 이러한 결합은 9D2의 것보다 덜 특이적이며, 여기서, 9D2는 중성 인지질인 PE에 강력하게 결합한다. ELISA에서 인지질에 대한 아넥신 V의 결합 강도의 순서는 PI>PS=PE=PA=CL>PG이었다(표 8). 아넥신 V에 대한 이러한 발견은 앞서의 데이타와 일치한다(참조: Andree et al., 1990).
9D2의 결합은 5mM EDTA의 존재에 의해 영향받지 않으며, 이는 음이온성 인지질에 대한 결합에 있어 Ca2 + 를 필요로하지 않음을 나타낸다. 대조적으로 음이온성 인지질에 대한 아넥신 V의 결합은, 음이온성 인지질 또는 PE에 대한 결합에 있어 Ca2+ 에 대한 공지된 이의 의존성으로부터 예측할 수 있는 바와 같이(참조: Schlaepfer et al., 1987; Blackwood and Ernst, 1990), 5mM EDTA의 존재하에 소거된다.
9D2 또는 아넥신 V중 어느것도 인지질로 피복되었으나 염수중 0.2% 트윈으로 세척시킨 ELISA 플레이트에 결합하지 않으며, 이는 이들의 결합이 흡착된 인지질에 대한 것임을 입증한다. 9D2 및 아넥신 V는 헤파린, 헤파린 설페이트 또는 일본쇄 또는 이본쇄 DNA에 검출가능하게 결합하지 않았다.
2. PS에 대한 각각의 다른 결합을 교차 차단하지 않는 9D2 항체 및 아넥신 V
9D2 항체 또는 아넥신 V가 PS에 대한 결합에 대해 경쟁하는지를 시험하기 위해, 교차-차단 연구를 PS-피복시킨 플레이트에서 바이오티닐화된 단백질을 사용하여 수행하였다. 바이오티닐화된 9D2 항체 및 아넥신 V의 결합을 10배 몰 과량의 변형되지 않은 9D2 및 아넥실 V 각각으로 차단시켰다(표 9). 그러나, 변형되지 않은 아넥신 V는 PS 플레이트에 결합하기 위한 바이오티닐화된 9D2의 능력에 영향을 미치지 않았다. 유사하게, 변형되지 않은 9D2 항체의 첨가는 PS 플레이트에 결합시키기 위한 바이오티닐화된 아넥신 V의 능력을 변화시키지 않았다(표 9).
[표 9]
Figure 112012087199067-pat00023
이들 결과는, 9D2 항체 및 아넥신 V가 PS-피복된 플레이트에 대한 다른 결합 각각을 차단하지 않음을 나타내며, 이는, 이들이 PS 분자상의 상이한 에피토프를 인지하거나 플라스틱에 흡착된 PS의 상이한 구조를 인지하기 때문이다.
3. 세포 표면에서 외부화된 음이온성 인지질에 대한 결합
세포 표면에 대한 9D2 항체 및 아넥신 V의 결합은 마우스 bEnd. 3 내피 세포 또는 소 ABAE 세포를 사용하여 시험하였다. 9D2 또는 아넥신 V는 정지기 조건하에서 어떠한 세포 유형의 침투되지 않은 단층에 결합하지 않았다. 이는, 혈장 막의 대부분의 음이온성 인지질이 세포질성 영역에 대해 일반적으로 격리됨을 나타낸다. 대조적으로, 90 내지 100%의 내피 세포에서 세포사멸을 유발하는 조건하에 세포를 TNFα 및 악티노마이신 D와 예비 항온처리한 경우, 강한 염색이 관측되었다.
9D2 및 아넥신 V가 세포 표면의 인지질에 결합하는지를 확인하기 위해, H2O2 처리된 bEnd.3 세포를 다양한 경쟁 리포좀의 존재 또는 부재하에서 9D2 항체 또는 아넥신 V와 함께 항온처리하였다. 음이온성 인지질을 아-독성 농도(100 내지 200μM)의 H2O2로 예비처리하는 경우, 비 세포사멸의 생 bEnd.3 세포에서 노출되었다.
H2O2 처리된 bend.3 세포에 대한 9D2 항체의 결합은 음이온성 인지질을 함유하는 리포좀에 의해 억제되지만 중성 인지질을 함유하는 리포좀에 의해 억제되지 않는다(도 3). 세포에 대한 9D2의 결합 억제 크기는 PA>PS>CL>PG>PI의 순서로 변하며, 이는 플라스틱 고정된 인지질을 사용하여 수득한 결과와 밀접하게 일치한다(도 2A 및 도2B). 유사하게, H2O2 처리된 세포에 대한 아넥신 V의 결합은 PS, PA, PE, CL을 함유하는 리포좀에 의해 차단되며, PI 및 PG를 함유하는 리포좀에는 더욱 적은 정도로 차단되었다. SM 또는 PC를 함유하는 리포좀을 세포에 대한 아넥신 V를 차단하지 않았으며, 이는 모두 플라스틱 고정된 인지질을 사용하여 수득한 결과와 일치하였다.
이러한 결과는, 9D2가 H2O2 처리된 내피 세포에서 음이온성 인지질에 결합하지만, 아넥신 V는 음이온성 인지질외에 PE에 결합함을 입증한다.
4. 생체내에서 외부화된 음이온성 인지질의 검출
9D2 또는 아넥신 V를 동결된 조직의 단편에 직접 적용하는 직접적인 면역조직화학 기술은 혈장 막의 내부 소엽 및 외부 소엽에서의 음이온성 인지질을 구별하지 않는다. 외부에 위치한 인지질을 검출하기 위해, 9D2 및 아넥신 V를 종양을 지닌 마우스에 정맥내 주사하고 종양 혈관에 대한 국재화를 간접적인 면역조직화학으로 측정하였다.
각종 유형의 고형 종양을 지닌 마우스에 9D2 항체 또는 바이오티닐화된 아넥신 V를 정맥내 주사하고 1시간 후 방혈시킨 다음 종양 및 정상 조직을 제거하고 동결된 단편을 제조하였다. 조직의 동결된 단편을 절단하고 HRP-표지된 항-랫트 IgM 또는 HRP-표지된 스트렙트아비딘으로 염색하여 주사후 9D2 및 아넥신 V가 세표에 결합하는지를 측정하였다. 혈관을 형태학적으로, 및 일련의 단편에서 판-내피 세포 항체, MECA 32로 양성 염색으로부터 확인하였다.
5. 종양을 지닌 마우스에서 9D2 항체 및 아넥신 V의 생분포
5개의 종양 모두에서 종양 혈관에 국재화된 9D2 항체 및 아넥신 V를 본 연구에 포함시켰다(도 4; 표 10). 종양은 SCID 마우스의 유방 지방 덩이내에서 같은자리로 성장하는 사람 MDA-MB-231 유방 종양; 피하에서 성장하는 사람 L540 호지킨 종양; 피하에서 성장하는 사람 NCI-H358 NSCLC; 피하에서 성장하는 마우스 B16 흑색종 및 피하에서 성장하는 마우스 Meth A 섬유아종.
[표 10]
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9D2 및 아넥신 V는 동일한 패턴의 염색을 필수적으로 제공하였다. 종양 혈관에 대한 9D2 항체의 국재화는 특이적인데, 이는 종양 내피의 염색이 비가역적 특이성의 랫트 IgM을 사용하는 경우 관측되지 않기 때문이다. 아마도, 종양 혈관밖으로 대조군 랫트 IgM의 유출이 동일한 정도로 일어나지만, 혈관외 IgM의 염색은 간접적인 면역조직화학에 의해 인지되기에는 과도하게 확산되거나 너무 약하다.
9D2 항체 또는 아넥신 V의 혈관 국재화는 10개의 시험한 정상 기관중 9개에서는 관측되지 않았다(표 10). 신장에서, 관의 염색이 관측되었으며 이는 항원 특이적인 것으로 여겨지지 않는다. 관이 9D2 및 대조군 랫트 IgM 수용체 둘다에서 염색되며, 이는, 아마도, IgM 또는 이의 대사산물이 이러한 기관을 통해 분비되기 때문이다. 생리학적 혈관형성 부위인 난소는 시험하지 않았다.
9D2 및 아넥신 V 양성 혈관의 퍼센트는 MDA-MB-231 종양에서 40% 내지 H358 종양에서 15% 범위이었다. 음이온성 인지질-양성 혈관은 종양의 모든 영역내 모세혈관 및 혈관의 관 표면에 존재하나, 괴사내 및 주변 영역에서 특히 우세하다. 대부분의 음이온성 인지질-양성 혈관은 광학 현미경에 의해 명백해지는 형태학적 비정상성을 나타내지 않았다. 일시적인 혈관, 특히 괴사 부위에 위치하는 혈관은 황폐의 형태학적 신호를 나타내었다. 9D2 항체 및 아넥신 V는 또한 괴사 및 세포사멸성 종양 세포에 국재화한 반면, 대조군 IgM의 국재화는 관측되지 않았다(도 4).
이러한 발견은, 음이온성 인지질이 다양한 종양내 혈관 내피 세포의 관 표면상에 존재하지만 정상 조직내 관상 내피 세포의 관 표면상에는 존재하지 않음을 입증한다.
6. 이중 염색 연구
같은자리 MDA-MB-231 유방 종양을 지닌 마우스에 바이오티닐화된 9D2 항체, 바이오티닐화된 대조군 IgM 또는 바이오티닐화된 아넥신 V를 정맥내 주사하는 이중 염색 연구를 또한 수행하였다. 1시간 후, 마우스를 방혈하여, 이들의 종양을 제거하고 동결시킨 단편을 절단하였다. 종양 단편을 Cy3-접합된 스트렙트아비딘으로 염색하여 바이오티닐화된 단백질을 검출하고 FITC-접합된 MECA32로 염색하여 혈관 내피를 검출하였다. 이러한 검출 방법은 바이오티닐화된 단백질 및 혈관 내피를 적색 및 녹색으로 표지시켰다. 바이오티닐화된 단백질이 내피에 결합된 경우, 전환된 상은 노란색으로 나타난다.
이러한 연구에서, 바이오티닐화된 9D2 및 아넥신 V는 대부분 혈관 내피에 결합하는 것으로 여겨지는데, 이는 염색 패턴이 MECA 32의 것을 사용한 염색 패턴에 수렴하기 때문이다. 9D2 및 아넥신 V에 결합한 MECA 32 양성 혈관중 약 40%가 간접적인 면역조직화학에 의해 수득한 결과와 밀접하게 일치하였다. 그러나, 종양 간질내로 바이오티닐화된 단백질의 유출은 이중 염색에 의해 검출된 반면, 간접적인 면역조직화학에 의해서는 명백하지 않았다.
바이오티닐화된 단백질은 소수(약 5%)의 혈관 주변의 혈관 내피 외부에서 가시적이다. 비가역적 특이성의 바이오티닐화된 랫트 IgM을 주사한 마우스로부터의 종양에서, 바이오티닐화된 IgM은 또한 유사한 퍼센트(약 5%)의 혈관에서 종양 간질내로 유출되었으나, 대부분 혈관 내피에 의해 결합된 것으로 여겨진다. 아마도, 간접적인 면역조직화학 기술이 아닌, 이중 염색 기술에 의한 일혈된 9D2 및 아넥신 V의 검출은 2개의 염색 패턴을 비교할 수 있는 더 높은 정확성 및 선행 기술의 더욱 높은 민감도를 반영한다. 주사하지 않은 대조군 종양은 스트렙트아비딘-Cy3에 의해 완전히 염색되지 않았으며, 이는, 적색 형광이 국재화된 단백질에 상응함을 나타낸다.
실시예 VII
종양 환경에서의 음이온성 인지질 막 위치이동
종양 혈관에 대해 독특한 생체내 표면 마커로서의 아미노인지질 및 음이온성 인지질의 발견은 본 발명자들을 고무시켜 이러한 분자의 위치이동 및 외부 막 발현에 있어서 종양 미세환경의 효과를 시험하도록 하였다. 본 실시예는, 종양내 환경을 모사하는 특정의 조건으로 시험관내에서 내피 세포를 노출시키는 것이 앞서 관측된 완전한 생 세포에서 아미노인지질 및 음이온성 인지질 표면 발현의 2배임을 나타낸다.
A. 물질 및 방법
1. 아넥신 V의 요오드화
재조합 사람 아넥신 V를 ET12a-파니오닉 인지질 1 플라스미드(시애틀 소재의 워싱톤대 제이. 타이트(J. Tait)박사로부터 입수)로 형질전환시킨 이. 콜라이(E. coli)로부터 정제하였다. 단백질의 순도 및 PS에 대한 결합은 SDS-PAGE 및 PS-피복된 플라스틱상에서 각각 확인하였다. 토끼 폴리클로날, 친화 정제된 항-아넥신 V 항체를 사용하여 PS에 결합된 아넥신 V를 검출하였다. 아넥신 V를 125I로 보치(Bocci, 1964)에 의해 기술된 바와 같이 클로르아민 T를 사용하여 방사선표지시켰다. 특이적 활성은 브래드포드 검정(참조: Bradford assay, 1976)에 의해 측정한 것으로써, 단백질 ㎍당 대략 1 x 106 cpm이었다.
2. 내피 세포 처리
내피 세포를 표 11에 나열한 농도에서 사이토킨 또는 성장 인자로 처리하였다. 모든 시약은 10% 혈청을 함유하는 배지중에서 희석시키고 37℃에서 24시간 동안 항온처리하였다.
저산소증의 효과를 연구하기 위해, 세포를 24웰 플레이트에 종균배양하고 밀봉된 챔버(Billups Rothenberg Inc., 캘리포니아주 델 마르 소재의 제조원)내 습윤화시킨 저산소성 대기(1% O2, 5% CO2, 94% N2)로 이전시키기 전에 48시간 동안 습윤화시킨 정상산소 대기(21% O2, 5% CO2)속에서 항온처리하였다. 세포를 저산소성 챔버내에서 24시간 동안 37℃에서 항온처리한 후 정상산소 환경으로 4시간 동안 37℃로 복귀시켰다. 세포를 동일자로 종균배양한 동일한 계대배양물로부터의 대등한 배양물과 비교하고 정상산소 조건하에서 전체적으로 유지시켰다. 동일한 연구에서, IL-1α(10 ng/ml) 및 TNFα(20ng/ml)를 배지에 가한 후 저산소성 챔버로 이전시켰다.
산성 미세환경의 효과를 시험하기 위해, 세포를 요구량의 HCl로 상이한 pH(7.3 내지 6.2의 범위)로 조절한, 중탄산염이 결여된 성장 배지에 노출시켰다. 세포를 CO2의 부재하에 37℃에서 항온처리하였다. 배양 배지가 24시간의 배양 기간 동안 지정된 pH를 유지하는지를 확인하였다. 이러한 시험 조건은 소 또는 마우스 내피 세포에 대해 독성이 아니며 부착된 단층의 생존성 또는 세포 형태에 어떠한 영향도 미치지 않는다.
3. 125 I- 표지된 아넥신 V에 의한 배양된 내피 세포에서 PS 의 검출
상기한 시약으로 처리한 후, 처리된 세포 및 대조군 세포를 결합 완충액중 125I-표지된 아넥신 V(200㎕/웰) 7.1몰과 함께 항온처리하였다. 실온에서 2시간 동안 항온처리한 후, 세포를 완전히 세척하고 0.5M의 NaOH중에 용해하였다. 0.5ml의 총 용적을 플라스틱 튜브에 이전시키고 감마 계수기로 계수하였다. 비특이적 결합을 5mM EDTA의 존재하에 측정하고 실험 값으로부터 감하였다. 결과는 1x106 세포당 정상화된 세포 결합된 아넥신 V의 순수한 pmole로 나타내었다.
아넥신 V의 최대 결합을 악티노마이신 D 및 TNFα(각각의 성분 ml당 50ng)으로 동시 처리한 세포에서 측정하였다. 앞서 보고한 바와 같이, 이들 제제는 내피 세포의 90 내지 100%에서 세포사멸 및 PS 노출을 유발한다(참조: Lucas et al., 1998). 125I-아넥신 V의 비처리된 세포에 대한 기본 결합을 10% 혈청이 들어있는 배지의 존재하에 측정하였다. 처리되지 않은 배양물에 결합된 125I-아넥신 V의 양을 처리된 배양물의 값에서 감하였다. PS의 노출을 다음 식에 따라 계산하였다: 시험 조건하에서 세포-결합된 아넥신 V(pmole)/ 최대 아넥신 V 결합(pmole) X 100. 각각의 연구를 2회 수행하고 3회 이상 수행하였다. 평균 값을 계산하였다. 3개의 별개 시험으로부터의 평균 값의 SE는 5% 미만이었다.
B. 결과
1. H2O2에 의한 유도
마우스 bEnd.3 내피 세포를 50,000세포/웰의 초기 밀도로 종균배양하였다. 24시간 후 세포를 증가된 농도의 H2O2(10μM 내지 500μM)와 함께 1시간 동안 37℃에서 항온처리하고 비처리한체 두었다. 항온처리 말기에, 세포를 0.2% 젤라틴을 함유하는 PBS로 3회 세척하고 0.25% 글루타르알데하이드로 고정시켰다. 동일한 웰을 항-PS IgM으로 염색하거나 트립신처리하고 트립판 블루 배출 시험으로 가시성에 대해 평가하였다. 항-PS 염색을 위해, 2% 젤라틴으로 10분 동안 차단한 후, 세포를 2㎍/ml의 항-PS 항체로 항온처리한 다음, 항-마우스 IgM-HRP 접합체로 검출하였다.
고 농도의 H2O2에 대한 내피 세포의 노출은 약 90%의 세포에서 PS 위치이동을 유발한다. 그러나, 이는 기질로부터 세포의 탈착으로 달성되며 세포 생존능은 약 50 내지 60%로 감소한다. 세포 생존능의 감소와 표면 PS 발현의 관계는, 비록약 90%의 PS 위치이동이 세포 생존능의 단지 50 내지 60%의 감소와 함께 관측된다는 점에서 여전히 관심을 불러일으킨다고 해도, 이해가능하다.
저 농도의 H2O2는 세포 생존능에 있어 어떠한 적절한 감소없이도 현저한 PS 발현을 가져왔다. 예를 들어, PS는 20μM의 낮은 농도로 H2O2를 사용하여 모든 H2O2로 처리된 웰에서 약 50%의 세포의 세포 표면에서 검출되었다. 이러한 낮은 H2O2 농도에서, 세포는 플라스틱에 서로 완전히 부착되어 있으며 어떠한 형태학적 변화나 세포독성 신호도 나타내지 않는다은 것을 주목하는 것이 중요하다. 상세한 분석은 필수적으로 100%의 세포-세포 접촉, 적절한 세포 형태 및 완전한 세포골격의 보유를 나타내었다.
따라서, 낮은 수준의 H2O2에 의해 유발된 50%의 PS 표면 발현은, 세포 생존성이 대조군의 처리되지 않은 세포(즉, 95%)과 동일한 세포 집단에서 관측되었다. 높은 H2O2 농도와 관련된 PS 발현은 세포 손상에 의해 동반되며, 높은 H2O2 농도에 노출된 PS-양성 세포는 탈착하여 부유하며 세포골격이 파괴되어 있다.
낮은 농도의 H2O2의 존재하에서 세포 생존능의 유지는 또다른 실험실로부터의 자료와 일치한다. 예를 들어, 쇼어 등(Schorer et al. (1985))은, 15μM H2O2로 처리한 사람 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)가 평균 90 내지 95%의 생존능(5% 내지 10% 손상으로 보고됨)을 나타내는 반면, 1500μM H2O2에 노출된 사람 제대 정맥 내피 세포는 단지 0% 내지 50%의 생존능(50% 내지 100% 손상됨)을 나타낸다고 보고하였다.
시험관내에서 종양 환경을 모사하기 위한 H2O2의 사용은 또한, 종양 환경이 H2O2 및 다른 반응성 산소종을 생산하는, 대식세포, PMN 및 과립구와 같은 염증 세포가 풍부한 경우에 적절하다. 비록 이전에 안정한 종양 혈관 마커와 연관되지 않았다고 하더라도, 종양 세포는 H2O2의 존재를 필요로하는 반응성 산소 종을 포함하는 메카니즘에 의한 내피 세포 손상을 중재하는 것으로 알려져 있다(참조: Weiss et al., 1981; Yamada et al., 1981; Schorer et al., 1985). 실제로, 많은 연구들은, 시험관내에서 PMS의 자극이 세포 사멸(크롬 방출 검정으로 측정) 또는 세포 탈착을 유발하지 않고 준치사 내피 세포 손상을 유발시키기에 충분한 농도의 H2O2를 생산하며; 이러한 H2O2 농도는 생체내에서 국소적으로 획득가능함(참조: Schorer et al., 1985)을 나타낸다.
본 시험관내 위치이동 데이타는 항-PS 항체가 생체내에서 종양 혈관 내피 세포에 특이적으로 국재화하며 정상 조직내 세포에 결합하지 않는다는 것을 보여주는 초기의 결과와 상관관계가 있다. 생체와 유사한 농도의 H2O2가 세포 통합성을 파괴하지 않고 내피 세포 표면에 대한 PS 위치이동을 유발한다는 사실은 원래의 생체내 자료외에 발명자들의 치료학적 시도를 가치있게 하는 것과 중요하게 관련되어 있다.
사람, 소 및 쥐 내피 세포는 모두 정상 조건하에서 PS-음성인 것으로 알려져 있다. 앞서 문서화된 어떠한 PS 발현도 세포 손상 및/또는 세포 사멸과 관련되어 있다. 이는, 정상 생존능이 유지되는 본 연구의 경우에서만은 아니다. 이는, 종양 혈관 내피에서 PS 위치이동인 세포 손상과는 관련되지 않은 생화학적 메카니즘에 의해 중재됨을 나타낸다. 이는 형태학적으로 완전한 내피 세포에서 PS 표면 발현의 첫번째 입증이며 PS 발현이 세포사멸 경로와 연관되지 않을 수 있다는 첫번째 암시인 것으로 여겨진다. 본 발명의 작동성으로 돌아가서, 이러한 관측은 다시, PS가 일시적인 것이 아닌, 지속적인 종양 혈관 마커이며 치료학적 중재에 적합한 후보물질임을 입증한다.
2. 트롬빈에 의한 유도
트롬빈은 또한, 비록 H2O2와 동일한 정도는 아니라고 해도, PS 발현을 증가시키는 것으로 관측되었다. 이러한 자료는 또한 본 발명에 의해 개발된 PS 발현의 종양 유발 모델의 통합 부분이다: 정상 조직에서 트롬빈-유발된 PS 표면 발현은 또한, PS 발현이 응고 개시 복합체의 조립을 조정하므로 추가로 응고를 유발한다.
종양 환경은 전혈전성이어서, 종양 혈관이 응고되도록 하는 것으로 알려져있다(참조: 미국 특허 제5,877,289호). 트롬빈은 응고 캐스케이드의 생성물이므로, 이는 종양 혈관내에 존재한다. 실제로, 트롬빈의 존재는 VCAM 발현을 유발하여, 종양 혈관구조의 표적가능한 마커로서 VCAM를 개발하는 본 발명자의 능력에 기여한다(참조: 미국 특허 제5,855,866호; 제5,877,289호). 따라서, 트롬빈이 또한 PS 발현을 유발함을 보여주는 본 자료는 노출된 항체를 지닌 아미노인지질의 표적화 및 치료학적 접합체 둘다와 관련되어 있으며, 조직 인자를 함유하는 항-VCAM 응고리간드의 유리한 효과는 추가로 설명한다(실시예 I).
3. 산화 스트레스의 기타 제제
시험관내에서 마우스 bEnd.3 또는 소 ABAE 세포를 많은 종양의 미세환경에서 존재하는 다양한 농도의 인자 및 조건(참조: Lichtenbeld et al., 1996; Harris et al., 1996), 예를 들면, 저산소증/재산소화, 트롬빈, 산도, 염증성 사이토킨 및 과산화수소로 24시간동안 처리하였다(표 11).
PS 및 음이온성 인지질의 외부화는, 125I-아넥신 V 결합을 측정함으로써 정량화한다. 아넥신 V 결합의 양은 90 내지 100%의 세포의 세포사멸이 악티노마이신 D 및 TNF-α를 사용한 배합 처리에 의해 유발된 세포의 양과 비교하였다. 악티노마이신 D 및 TNF-α는 세포 유형 둘다에서 106 세포당 아넥신 6.2 pmole(세포당 아넥신 V 3.8 x 106 분자)의 결합을 유발하였으며, 이는 문헌의 보고(참조: Rao et al., 1992)와 일치하였다. 이러한 값을 외부화된 음이온성 인지질의 최대치로 취하였다.
[표 11]
Figure 112012087199067-pat00025
표 11에서, 사용된 사이토킨, 성장 인자 및 트롬빈의 농도를 문헌 값으로부터 선택하여 배양된 내피 세포에서 최대 자극 효과를 가지도록 하였다. 이러한 농도는 형태학적 외관, 탈착의 결여 및 트립판 블루의 흡수 결여에 의해 판단되는 바와 같이 시험기간(24 시간)에 걸쳐 독성을 유발하지 않는다. 사용된 H2O2의 농도는 선택된 조건하에서 세포독성을 유발하지 않았다.
125I-아넥신 V의 기본 결합을 성장 배지 단독의 존재하에 측정하였다. 최대 PS 노출은 악티노마이신 D 및 TNFα를 사용한 배합 치료로 세포사멸을 유발시킨 후 측정하였다. 3회의 별도 연구로부터 2개의 평균을 나타낸다. 표준 오차는 5% 미만이다.
처리되지 않은 세포는 아넥신 V 또는 항-PS(9D2) 항체 결합에 의해 판단되는 바와 같이 외부화된 PS를 크게 결여하고 있다(표 11). 성장 배지 단독의 존재하에서 기본 결합은 ABAE에 대해서 및 bEnd.3 세포에 대해 125I-아넥신 V가 각각 0.44 및 0.68 pmole이었다. 이는 ABAE 및 bEnd.3 세포에 대한 최대 결합의 약 7.1% 및 10.9%에 상응하며, 이는 대략 10%의 세포가 동일한 조건하에서 바이오티닐화된 아넥신 V와 결합한다는 발견과 잘 관련되어 있다.
VEGF, HGF, FGF, TGFβ1, PDGF, IL-6, IL-8 및 IL-10은 처리되지 않은 세포에 대한 기본 수준 이상으로 125I-아넥신 V의 결합을 증가시키지 않았다. 염증성 중재인자(IL-1α, IL-1β, TNFα 및 인터페론)은 ABAE 세포에 대해 5 내지 8%의 최대수준으로 및 bEnd3 세포에 대해 3 내지 14%의 최대 수준 범위로 PS 및 음이온성 인지질 위치이동을 작지만 재생가능하게 증가시켰다.
저산소증/재산소화, 트롬빈 또는 산성 외부 조건(pH 6.8 내지 6.6)은 ABAE 세포에 대해 8 내지 20%의 최대 수준 범위로 및 bend.3 세포에 대해 17 내지 22%의 최대 범위로 PS 및 음이온성 인지질의 매우 높은 내재화를 유발하였다. PS 및 음이온성 인지질 위치이동에 있어서의 최대 증가는 과산화 수소를 100 내지 200μM로 처리한 후 관측되었다. 이러한 처리는 125I-아넥신 V 결합에 의해 판단되는 바와 같이 세포 유형 둘다에서 PS의 거의 완전한(95%) 외부화를 유발한다(표 11). ABAE 및 bEnd.3 세포의 70% 이상은 면역조직화학적으로 판단되는 것으로써 바이오티닐화된 아넥신 V에 결합하였다.
PS 및 음이온성 인지질 위치이동은 검정 기간(24시간) 동안에 매트릭스에 부착된채로 잔존하며, 세포-세포 접촉을 유지하고 트립판 블루 염료를 배출시키는 자체의 능력을 보유하는 저산소증/재산소화, 트롬빈, 산도, TNFα, IL-1 또는 H2O2를 사용한 처리로 생성된다. 정상의 PS 및 음이온성 인지질 배향은 유발-인자가 제거된 후, 또는 배양 조건이 정상화된 후 세포의 대부분에서 24 내지 48시간 후 회복된다. 이러한 결과는, H2O2의 직접적인 적용에 의해 또는 저산소증/재산소화, 산도, 트롬빈 또는 염증성 사이토킨에 의해 간접적인 적용에 의해 생성된 온화한 산화성 스트레스가 내피 생 세포에서 PS 및 음이온성 인지질의 일시적인 위치이동을 개시함을 나타낸다.
4. 염증성 사이토킨 및 저산소증/재산소화의 배합 효과
증진된 PS 및 음이온성 인지질 노출은, ABAE 및 bEnd.3 세포를 IL-1α 또는 TNFα의 존재하에 저산소증/재-산소화에 적용시키는 경우 관측되었다. 사이토킨의 부재하에서, 저산소증/재산소화는 세포사멸 농도의 악티노마이신 D 및 TNFα로 처리한 세포에 대한 15% 내지 17.5%의 최대 수준으로의 ABAE 세포에 의한 PS-노출을 증가시킨다. IL-1α 또는 TNFα의 아-독성 농도의 존재하에서, 저산소증/재산소화는 각각 최대치의 26% 및 33%까지 음이온성 인지질-노출을 증가시켰다(도 5: 표 11). 저산소증/재산소화의 부재하에서 사이토킨의 효과와의 비교는, 사이토킨 및 저산소증/재산소화의 조합이 PS-노출에 있어서의 부가적 효과보다 큼을 나타낸다. 유사한 효과가 bEnd.3 세포에서도 관측되었다.
따라서, 종양 환경에서, 저산소증/재-산소화에 의해 유발된 PS 및 음이온성 인지질의 노출은 염증성 사이토킨 및 가능하게는 산도 및 트롬빈과 같은 다른 자극에 의해 증가될 수 있다.
이러한 시험관내 연구는 생체내에서 종양 내피 세포상에서 PS 노출 메카니즘에 대한 관심을 가져왔다. 이것은, 각종 인자가 생체내 종양에서 상태를 모사하는, 세포독성을 유발하지 않고 내피 세포에서 PS 노출을 유발함을 나타낸다. 저산소증에 이은 저산소화, 산도 및 트롬빈은 생 내피 세포에서 PS 노출을 최대 증가시켰다. 염증성 사이토킨(TNFα 및 IL-1α)는 또한 PS 노출의 약하지만 명백한 유도를 유발시켰다.
이러한 조건은 i) PS 양성 내피가, 저산소증, 산도, 트롬빈처리된 혈관 및 침윤된 숙주 백혈구가 공통적으로 관측되는 경우 괴사내 및 괴사 주변 영역에서 우세하며; ii) 저산소증/재산소화가 시험관내에서 내피세포상 TNFα 및 IL-1의 약한 PS-활성을 증폭시킨다는 관측은, 저산소증 및 사이토킨-분비 종양 및 숙주 세포가 함께 존재하는 종양내 생체내 상황과 관련되어 있으며; iii) 저산소증/재산소화 및 트롬빈이 NADPH 산소 유사 막 효소의 활성화를 통해 내피 세포내 반응성 산소종(ROS)을 생성한다고 보고(참조: Zulueta et al., 1995)되어 있으므로 생체내에서 종양내 자극을 주로 유발하는 것으로 여겨진다. 악성 세포에 의해 생성된 ROS는 내피 세포 손상에 기여할 수 있다(참조; Shaughnessy et al., 1989). 과산화수소는 본 연구에서 발견된 배양된 내피 세포에서 PS 노출의 가장 강력한 유도인자이며, ROS의 관여에 대한 간접적 지지를 제공하였다.
외부화된 PS는 응고 인자가 농축되고 조립되는 음성 인지질 표면을 제공한다. 이는 장기간동안 인지되어 온 종양 내피에서 전응고 상태에 기여할 수 있다. PS는 또한 종양내로의 백혈구 침윤을 보조하는 대식구(참조: McEvoy et al., 1986), T 임파구(참조: Qu et al., 1996) 및 다형핵 세포가 순환하기 위한 부착점을 제공한다. 종양 내피에서 PS에 대한 활성화된 대식세포, 다형핵 세포 및 혈소판의 부착은 반응성 산소종의 추가의 분비 및 PS 노출의 추가의 증폭을 가져올 수 있다.
실시예 VIII
아넥신 접합체의 항-종양 효과
아미노인지질 및 음이온성 인지질이 종양 혈관구조의 안정한 마커라는 놀라운 발견은, 항체-치료제 작제물이 암 치료에 사용될 수 있음을 의미한다. 표적화제로서 항체를 사용하는 것외에, 아넥신 및 기타 특이적인 결합 단백질을 또한 사용하여 종양 혈관구조에 치료제를 특이적으로 전달할 수 있다. 하기 자료는, 아넥신-TF 작제물의 생체내 투여로부터 초래되는 항-종양 효과를 나타낸다.
A. 방법
아넥신 V-tTF 접합체를 제조하고 고형 종양을 지닌 nu/nu 마우스에 투여하였다. 종양은 약 1.2cm3 이상의 종양을 형성한 사람 HT29 결직장암종 세포로부터 형성되었다. 아넥신 V-tTF 응고리간드(10㎍)을 정맥내 투여하고 24시간 동안 순환되도록 하였다. 염수-처리된 마우스를 대조군 동물로서 별도로 유지시켰다. 1일 처리기간 후, 마우스를 참수시키고 방혈시키고 종양 및 주요 기관을 분석을 위해 수거하였다.
B. 결과
아넥신 V-tTF 접합체는 HT29 종양을 지닌 마우스에서 특이적인 종양 혈관 응고를 유발하는 것으로 밝혀졌다. 아넥신 V-tTF 접합체로 처리한 동물의 종양 혈관의 대략 55%가 단일 주사후 혈전을 생성하였다. 대조적으로, 대조군 동물의 종양 혈관구조에서 혈전증은 최소로 발생하였다.
실시예 IX
3 SB 항- PS 항체의 항-종양 효과
본 실시예는, 동계 및 이계 종양 모델을 사용한 항-PS 항체의 항-종양 효과를 나타낸다. 본 연구에 사용된 3SB 항체는 PS(및 PA)에 결합하지만, 필수적으로 PE와의 반응성을 결여하고 있다. 이러한 항-PS 항체는 종양 혈관 손상을 유발하며, 혈전증, 및 종양 괴사를 동반하였다.
항-PS 항체의 효과는 우선 3SB 항체를 사용하여 동계 및 이계 종양 모델에서 시험하였다. 동계 모델의 경우, 1 x 107개의 쥐 결직장 암종 콜로 26(런던 소재의 ICRF의 이안 하트(Ian Hart) 박사로 부터 입수) 세포를 BALB/c 마우스의 우측 옆구리에 피하주사하였다. 이계 모델에서는, 사람 호지킨 림프종 L540 이종을, 1x107개 세포를 수컷 CB17 SCID 마우스의 우측 옆구리내로 피하주사함으로써 확립하였다. 종양을 치료전 약 0.6 내지 0.9cm3의 크기로 성장하도록 하였다.
*종양을 지닌 마우스(그룹당 4마리의 동물)에 20㎍의 3SB 항-PS 항체(IgM), 대조군 마우스 IgM 또는 염수를 복강내 주사하였다. 치료를 48시간 간격으로 3회 반복하였다. 동물을 종양 측정 및 체중에 대해 매일 모니터하였다. 종양 용적을 실시예 I에 기술한 바와 같이 계산하였다. 종양이 2cm3에 이를 때, 또는 종양이 괴사 또는 궤양의 신호는 나타내는 경우 이전에 마우스를 참수시켰다.
동계 및 이계 종양 둘다의 성장은 3SB 항-PS 항체로 치료함에 의해 효과적으로 억제되었다(도 6A 및 도6B). 항-PS 항체는 종양 혈관 손상을 유발하며, 혈전 및 종양 괴사가 동반된다. 차단된 혈관 주변의 종양 덩이의 분해 및 응괴의 존재가 명백하다.
정량적으로, 3SB 항-PS 항체 치료는 큰 콜로 26을 지닌 마우스(도 6A) 및 L540을 지닌 마우스(도 6B)에서 대조군 종양 용적의 60%까지 종양 성장을 억제하였다. 종양 성장의 지연은 염수 또는 대조군 IgM으로 치료한 마우스에서 발견되지 않았다. 항-PS 항체로 치료한 마우스에서는 어떠한 독성도 관측되지 않았으며, 정상 기관은치료되지 않거나 염수 치료된 마우스와 구별할 수 없는, 변형되지 않은 형태를 유지하였다.
종양 퇴화는 1회 처리후 24시간째에 시작하였고 종양은 다음 6일 동안 크기가 계속해서 감소하였다. 이는 동계 및 면역접합성 + 종양 모델 둘다에서 관측되었으며, 이러한 사실은, 당해 효과가 면역 상태와는 독립적인 메카니즘에 의해 중재되었음을 나타낸다. 더우기, 종양 부하의 감소는 1500mm3보다 큰 종양을 지닌 대조군 마우스와 비교하여 민첩하고 일반적으로 건강한 동물 외관의 증가와 관련되어 있다.
L540 종양의 항-PS 치료로 수득한 결과가 하기 이유로 인하여 추가로 도출된다. 명백하게, L540 종양 치료에서 관측된 종양 괴사는 L540 종양에서 PS에 대해 양성으로 염색된 혈관의 퍼센트가 HT29 및 NCI-H358 종양에서 보다 적다는 사실에도 불구하고 발생하였다. 이는, 심지어 더욱 빠른 괴사가, 다른 종양 유형을 치료하는 경우에서 초래될 수 있음을 내포한다. 또한, L540 종양은 명백한 조직학적 단편을 제공하고 실제로 괴사에 대해 내성인 것으로 알려져 있으므로 실험 모델로서 일반적으로 선택된다.
실시예 X
음이온성 인지질에 대한 항체(9 D2 )의 항-종양 효과
본 실시예는 생체내 항-종양 연구에 있어서 PS 및 다른 음이온성 인지질에 결합하는 9D2 항체의 효과를 입증한다.
음이온성 인지질에 결합하는 고 용량(>150㎍)의 랫트 항체인, 9D2를 H538 종양을 지닌 누드 마우스에 주사하였다. 면역국재화 연구는, 이것이 비록 낮은 수준이지만, 종양 내피(4+)에 강하게 국재화하며, 정상 혈관에 의한 9D2의 비-특이적 결합이 고 용량으로 인하여 관측되었음(비가역적 특이성의 대조군 IgM 항체에 대해 관측한 바와 같이)을 나타낸다.
9D2를 L540 종양을 지닌 SCID 마우스내에 복수 생산을 위해 복강내 주사하는 경우, 종양은 괴사되고 쇠약해지기 시작한다. 대조군 항체(MK 2.7, 랫트 IgG)를 L540 종양을 지닌 SCID 마우스에 주사시, 유사한 효과는 관측되지 않는다.
이어서, 생체내에서 L540 종양의 성장에 있어 9D2 및 항-PS 항체의 효과를 더욱 상세히 측정하였다. 종양이 200 내지 250㎕(0일째)에 이를때 치료를 개시한다. 0 내지 7일에 걸쳐, 마우스에 약 150㎍의 IgM(200㎕ 상층액) 또는 200㎕의 10% DMEM을 복강내 주사하였다. 7일 내지 22일에 걸쳐, 마우스에 약 300㎍의 IgM(400㎕ 상층액) 또는 400㎕의 10% DMEM을 복강내 주사하였다. 22일이 치료 마치막날이며 마우스를 참수시켰다.
표 12에 나타낸 바와 같이, 10일 내지 22일에 걸쳐 종양 성장은 일반적으로 약 40% 내지 50%로 억제되었다. 연구 마지막 날에, 대조군 마우스 9마리 중에서 9마리에서 생긴 것과는 대조적으로, 치료 그룹중 단지 4마리 마우스에서 2000㎕의 용적보다 큰 종양을 지닌다.
[표 12]
Figure 112012087199067-pat00026
다른 생체내 연구에서, CB17 SCID 마우스에서 L540 종양의 성장에서 랫트 항-PS 항체의 효과는 종양 세포 주사후 45일 동안 수반하였다. 이러한 종양을 지닌 마우스에 매일 300㎍의 항-PS 항체를 복강내 투여하거나 대조군으로서 300㎕의 10% DMEM을 매일 복강내 치료하였다. 종양 치료의 각종 매개변수는 대조군의 것과 비교하여 치료된 그룹에서 현저히 우수하였다(표 13).
[표 13]
Figure 112012087199067-pat00027
추가의 연구에서, 9D2 항체를 주당 3회 100㎍의 투여량으로 L540 종양을 지닌 마우스에 복강내 주사하였다. 주당 2회 캘리퍼스로 종양 크기를 측정하였다. 대조군 그룹과 비교하여 항-종양 효과를 표 7에 나타낸다. 괄호안의 수는 그룹당 마우스의 총 수에 대한 퇴화된 종양을 지닌 마우스의 수를 나타낸다.
실시예 XI
항- PS 항체 3 G4 의 항-종양 효과
본 실시예는 동계 및 이계 종양 모델에서 항-PS 항체 3G4를 사용한 추가의 항-종양 효과를 입증한다. 본 연구에 사용된 3G4 항체는 PS 및 다른 음이온성 인지질에 결합하는 IgG 항체이다(실시예 IV).
A. 동물 종양 연구용 프로토콜
3G4의 효과를 동계 및 이계 종양 모델에서 시험하였다. 동물 종양 치료 연구를 위한 일반적인 프로토콜은 다음과 같이 수행한다. 특정 차이점을 명시하지 않을 경우, 이는 본 출원의 연구 전체에 사용된 프로토콜이다.
동물은 챨스 리버스 래버러토리즈(Charles Rivers Laboratories)에서 입수한다. 마우스는 4 내지 5주령 암컷인, C. B-17 SCID 또는 Fox Chase SCID 마우스이다. 마우스를 자동개폐 우리에 가두고, 멸균된 먹이와 물을 제공하면서, 멸균 치료한다. 모든 공정은 라미나 유동 후드(laminar flow hood)에서 수행하였다. 마우스를 1주간 순응시킨 후 귀에 표지하고 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플(대략 75 내지 100㎕)를 취하여 ELISA에 의해 유출을 체크한다. 유출 ELISA 시험에서 실패한 마우스는 시험 프로토콜에 사용하지 않았다. 귀에 표지하고 혈액 샘플을 제거한지 2 내지 3일 후 마우스의 유방 지방 덩이(MFP)내로 또는 우측 옆구리내 피하로 종양 세포를 같은자리로 주사한다.
같은자리 모델에서, 0.1ml의 DMEM중 1 x 107 세포를 전형적으로 마취시킨 마우스의 MFP내로 주사한다. 마우스를 마우스 콕테일 0.075ml를 복강내 주사하여 마취시킨다. 마우스 콕테일은 5ml 케타민(100mg/ml); 2.5ml의 크실라진(20mg/ml); 1ml의 아세프로마진(10mg/ml); 11ml 멸균수이다. 용량은 30분 동안 복강내 경로를 통해 체중 20 내지 30g당 0.1ml이다.
*앞발/뒷발 꼬집어서 응답이 없는 것으로 측정하여 마우스가 마취되면, 마우스를 이의 측면에 누이고 우측 전완/후면 영역 주변 및 머리 바로 뒷면을 70% 에탄올로 세척한다. 2 내지 3mm를 우측 전환(측면 흉부) 바로 뒤에서 절개하면, 피부 덮개를 벌릴 때 백색의 지방 덩이가 나타난다. 0.1ml의 세포를 1ml의 주사기 및 27번 게이지의 바늘을 사용하여 지방 덩이에 주사하여 지방 덩이내에 수포를 생성시킨다. 9mm의 멸균 상처 클립을 사용하여 절개부를 봉합한다. 마우스를 다시 우리에 두고 마취로부터 깨어나서 움직일 때까지 관측한다. 수술후 건강상태를 측정하며, 어떠한 괴로운 신호가 관측되는 경우, 동물에게 음료중 아세트아미노펜(0.24mg/ml) + 코데인(0.024mg/ml)을 제공한다. 상처 클립을 1주후 제거한다. 당해 방법을 사용하여 세포가 피하 영역이 아닌 선택된 부위내로 정확히 위치하도록 한다. 종양은 14 내지 15일 후 용적이 대략 200㎕(LxWxW)가 되며 발생율은 필수적으로 100%이다.
피하 모델에서, 마우스에 0.2ml당 1 x 107개 세포를 통상적으로 주사한다. 마우스를 마취시키지는 않지만 안정된 그립(grip)을 사용하여 마우스의 우측 옆구리가 노출되도록 구속시킨다. 23번 게이지 바늘이 달린 1ml의 주사기를 사용하여 200㎕내 1 x 107개 세포를 주사한 직후 마우스의 피부 및 수포가 관측될 것이다. 이는 주사 부위로부터 소량의 유액 유출을 관측하기에는 일반적이지 않다. 이러한 유출을 감소시키기 위해 피하주사로부터 침을 제거시 비틀림 운동을 사용할 수 있다. 종양 용적은 LxWxH로 측정한다.
관주 프로토콜에서는, 마우스에 0.2ml의 염수중 1000U의 헤파린을 정맥내 주사한다. 이후에 마우스에 0.1ml의 마우스 콕테일을 주사하여 진정시킨다. 앞발/뒷발을 꼬집을 때 반사작용이 없는 것으로 측정하여 마우스가 충분이 진정되면, 흉부강을 열어 심장 및 폐를 노출시킨다. 30 게이지 바늘을 튜브에 부착시키고 관주 펌프를 좌측 심실에 삽입한다. 우측 심실을 잘라 혈액이 떨어지도록 한다. 염수를 분당 1ml의 속도로 12분 동안 펌핑한다. 관주 말기에, 바늘과 튜브를 제거한다. 조직을 면역조직화학 또는 병리학의 추가 연구를 위해 제거한다.
B. 종양 치료 결과
동계 모델을 위해 Meth A 마우스 섬유아존 종양 세포를 사용하였다. 이계 모델에서, 사람 MDA-MB-231 유방 종양 세포를 유방 지방 덩이에 종균배양한다. 다른 이계 모델에서, 다수의 사람 호지킨 림프종 L540 이계를, 세포를 주사하고 종양을 치료전 500mm3의 크기로 성장하도록 함으로써 확립시켰다. 종양을 지닌 마우스(그룹당 10마리 동물)에 대조군과 대치되는 것으로써 3G4 항-PS 항체(IgG) 100㎍을 주사하였다. 치료를 1주 3회 반복하였다. 동물을 종양 측정을 위해 1주에 2회 모니터한다.
동계 및 이계 종양 둘다의 성장은, 3G4 항-PS 항체로 치료함으로써 효과적으로 억제되었다. 처음 20일 내지 30일동안의 치료는 도 8A, 8B 및 8C에 나타낸다. 항체는 종양 혈관 손상, 국재화된 혈전증 및 종양 괴사를 유발하였다.
동계, Meth A 종양 세포의 치료는 특히 성공적이며, 유방 지방 덩이에서 성장하는 사람 MDA-MB-231 유방 종양 세포의 치료는 종양 퇴화를 유발하였다(도 8A 및 도 8B). 심지어 괴사에 내성인 것으로 알려진 거대한 L540 종양을 지닌 마우스에서도 3G4 항체 치료는 대조군과 비교하여 종양 성장을 억제하였다. 종양 성장의 지연은 대조군 마우스에서 발견되지 않았다. 항-PS 항체로 치료한 마우스에서 독성은 관측되지 않았다.
종양을 또한 MD-MBA-435s 세포를 사용하여 확립하였으며 위에서 기술한 바와 같이 치료하였다. 이러한 종양의 성장은 또한 3G4 항체를 사용한 치료에 의해 효과적으로 억제되었다. 60일 동안 거대 L540 종양, MDA-MB-231 및 MD-MBA-435s 종양 세포의 치료는 도 8D, 도 8E 및 도 8F에 나타낸다. 항체는 종양 혈관 손상, 혈전증 및 괴사, 및 종양 성장 지연을, 독성 현상없이, 유발시켰다.
MD-MBA-435s 루세리파제 세포를 앤젤 시라 지메네즈(Angels Sierra Jimenez; 스페인 바르셀로나) 박사로부터 입수하고 10% DMEM에서 성장시켰다. 마우스에 위에서 기술한 바와 같이 종양 세포를 주사하고 주사한지 2주후에, 종양을 측정하고 용적을 기록하였다. 유사한 평균 용적(200mm3)의 종양을 지닌 마우스를 실시예 XIX에 기술되어 있는 바와 같이 생산한 3G4 항체 및 키메라 3G4 항체를 사용하여 치료하고 대조군에는 치료하지 않았다. 치료는 15일째에 복강내 주사(800㎍)하여 개시하고 35일째 400㎍의 최종 주사때까지 2일 내지 3일간 매일 200㎍을 주사하여 지속시켰다. 종양 용적 및 마우스 체중을 주사일에 측정하였다. 마우스를 참수시키고 염수로 12분동안 관주시켰다. 기관 및 종양을 제거하고, 액체 질소에서 순간-동결시키고 면역조직화학적 분석을 위해 종양을 단편화하였다.
본 연구는, 3G4 항체 및 키메라 3G4 항체가 대조군과 대치되는 것으로서 종양 성장을 효과적으로 지연시킴을 보여주었다(도 8G).
실시예 XII
CMV 에 대한 항- PS 항체의 항-바이러스 효과
놀라운 스위칭은 종양 혈관구조로부터 바이러스 감염을 잘 조절하며, 본 발명자는 이후에 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 대한 항체가 또한 항-바이러스 효과를 발휘할 것으로 판단하였다. 더우기, 본 실시예는, 우선 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염의 치료시 3G4 항체를 사용하여 이러한 판단이 사실임을 나타낸다.
A. 방법
1. 시험관내 CMV-감염된 세포의 치료
6웰 플레이트내 사람 이배체 포피 섬유아세포(HHF-R2)의 합치성 단층을 앞서 기술한 바와 같이(참조: Bresnahan et al., 1996), MOI = 0.01에서 녹색 형광 단백질(GFP)를 발현하는 사람 CMV AD169로 감염시켰다. 요약하면, 세포를 37℃에서 90분 동안 웰당 1ml의 총 용적의 바이러스와 함께 항온처리하였다. 감염동안, 플레이트를 매 30분 약하게 와동시켰다. 감염시킨 후, 세포 상층액을 제거하고 DMEM/10% FBS/펜-스트렙(2ml/웰)을 각각의 웰에 가하였다.
3G4 또는 동형 매치된 대조군 항체 GV39G의 희석물(100㎍/ml 및 50㎍/ml)를 웰에 가하였다. 감염된 세포를 총 19일 동안 37℃에서 항온처리하였다. 각각의 웰중 배지 및 항체를 매 3일마다 교체하였다. 19일째에, 각각의 웰로부터 세포 및 상층액을 수거하고 플라크 검정을 수행할 때까지 -80℃에서 동결시켰다.
2. 형광 현미경
재조합 CMV는 SV40 프로모터의 조절하에서 GFP를 발현한다. 따라서, 감염된 세포는 형광 현미경하에서 녹색으로 보인다. 이러한 연구에서, CMV-감염된 세포로 처리한 항체는 2일, 3일 및 9일째에 형광 현미경하에 관측하였다.
3. 플라크 검정
플라크 검정은 표준 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 요약하면, 동결시킨 세포 현탁액을 37℃에서 재빨리 해동시키고 원심분리하여 파편을 1000rpm에서 1분 동안 제거하였다. 상이한 희석의 세포 상층액을 6웰 플레이트내 HHF-R2 세포의 아-합치성 단층에 가하고 세포를 37℃에서 90분 동안 항온처리하였다(플레이트를 매 30분마다 온화하게 와동시켰다). 감염에 이어, 세포 상층액을 제거하고 2ml의 DMEM/10% FBS를 교체하였다. 4일 째에, 각각의 웰중 상층액을 제거하고 세포를 0.01% 저 융점 아가로즈/DMEM/10% FBS로 덮었다. 플레이트를 감염후 총 14일 동안 37℃에서 항온처리하였다. 14일 째에, 감염된 단층을 10% 완충된 포르말린으로 고정시키고 메틸렌 블루로 염색하여 플라크를 가시화시켰다.
B. 결과
1. CMV의 바이러스 확산을 억제하는 3G4
3G4가 CMV 감염 및 복제에 있어서의 억제 효과를 가지는지를 시험하기 위해서, 합치성 사람 섬유아세포를, CMV를 저 m.o.i>에서 가하기 전에 3G4로 예비처리하였다. 당해 연구에 사용된 CMV는 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현한다. 따라서, 감염된 세포는 형광 현미경하에 관측시 녹색으로 나타난다.
50㎍/ml 및 100㎍/ml의 항체 둘다를 사용한 처리 3일 째에, 처리되지 않은 웰 및 3G4 또는 이형 매치된 대조군 항체, GV39G로 처리한 웰 둘다에 단일의 감염된 세포가 존재한다. 따라서, 섬유아세포를 3G4로 처리하는 것은 세포내로의 바이러스 도입을 현저히 억제하지 않는 것으로 여겨진다.
그러나, 9일 째에, 3G4 처리된 것과 대조군, GV39C 처리한 세포에서 감염된 세포의 수에 있어 현저한 차이가 존재한다(도 9A 및 도 9B; 상부 우측 패널을 중간 및 하부 우측 패널과 비교). 바이러스가 대조군 웰에서 단층의 대략 80%로 확산되는 반면, 당해 바이러스는 3G4 처리한 웰내 원래 단일 감염된 세포로 제한된다. 따라서, 3G4는 원래의 감염된 세포로부터 주변 세포로의 CMV의 확산을 제한한다. 바이러스 확산의 이러한 억제는, 세포를 100㎍/ml(도 9A) 및 50㎍/ml(도 9B)로 처리하는 경우 관측된다.
2. 항체 농도 의존성인 바이러스 억제
3G4의 어느 정도의 농도가 저 m.o.i.에서 항-바이러스 효과에 필요한지를 측정하기 위하여, 감염된 세포를 상이한 농도의 3G4 및 대조군 항체, GV39G로 처리하였다. 도 10에서 알 수 있는 바와 같이, 세포 대 세포 확산의 완전한 억제는 100㎍/ml 및 50㎍/ml에서 3G4를 사용하여 관측된다. 세포를 25, 12.5 및 6.25㎍/ml의 3G4로 처리하는 경우, GFP 양성 CMV-감염된 세포의 수가 증가한다. 비록 3G4가 이러한 낮은 농도에서 일차 감염된 세포로부터 바이러스 확산을 전체적으로 억제하지는 못한다고 해도, 더욱 적은 GFP-양성 CMV-감염된 세포가 GV39G-처리된 대조군 웰과 비교하여 3G4 처리된 웰에서 관측되므로 여전히 의미있는 항-바이러스 효과를 갖는다(도 10).
3. 저 M.O.I.에서 바이러스 로드( load )의 정량화
3G4의 항-바이러스 효과는 바이러스 로드에 이은 항체-처리를 측정하기 위한 플라크 검정을 수행함으로써 정량화하였다. 대조군은 처리되지 않은 세포인, GV39G 항체 및 C44 항체를 사용하는 추가의 항체 대조군인, 콜치킨에 대한 마우스 IgG2a 동형 항체를 포함하였다.
감염된 세포(m.o.i.=0.01pfu/세포)를 100㎍/ml의 3G4로 처리함으로써 대조군인, GV39G 처리된 세포와 비교하여 바이러스 역가에 있어 6 log10의 현저한 감소를 가져왔다(도 11A). 이러한 억제는 바이러스 복제의 대략 99.9999% 억제로 해독된다. 50㎍/ml의 농도에서, 3G4를 사용한 처리는 GV39G 처리와 비교하여 바이러스 역가에 있어 3.5 log10 감소를 가져온다. 25㎍/ml 및 12.5㎍/ml에서 3G4를 사용하는 경우에도, 당해 결과는 여전히 놀라운 것이며, 심지어 6.25㎍/ml에서도 억제 효과는 여전히 관측된다(도 11A).
4. 고 M.O.I.에서 바이러스 로드의 정량화
높은 3 m.o.i.에서 감염된 섬유아세포의 3G4 처리는 바이러스 역가의 현저한 감소를 초래한다. 100㎍/ml에서, 3G4를 사용한 처리는 대조군인 GV39G-처리된 세포와 비교하여 바이러스 역가에 있어 5 log10 감소를 초래한다(도 11B). 50㎍/ml에서, 3G4는 GV39G와 비교하는 경우 3log까지 바이러스 복제를 억제하였다(도 11B).
5. 말기 단계에서 복제의 억제
CMV 복제 주기의 어느 단계가 3G4에 의해 차단되는지를 측정하기 위해, 지정된 첨가 연구를 수행하였다. 이를 위해, 3G4를 감염후 상이한 싯점에서 고 m.o.i>에서 감염된 섬유아세포에 가하였다. 바이러스 로드(세포 및 상층액 둘다)를 표준 플라크 검정을 사용하여 정량화하였다.
감염후 24시간때까지 3G4를 첨가하면 바이러스 역가가 5-6 log10 감소하였다(도 11C). 그러나, 3G4의 첨가는 48시간까지 지연된 경우, 3G4의 억제 효과는 2log10으로 감소하였고 첨가가 72 내지 96시간으로 지연되는 경우, 억제 효과는 추가로 감소하였다. 이는, 3G4가 감염후 24 내지 48시간 사이에 일어나는 CMV 복제의 말기 단계를 방해함을 나타낸다. 따라서, 3G4는 감염이나 초기 또는 초기 유전자 발현을 현저히 방해하지 않는다. 이는 오히려 바이러스 복제 주기의 말기, 예를 들면, 말기 유전자 발현, 바이러스 DNA 합성, 바이러스 패키징 또는 배출에서 작용한다.
실시예 XIII
RSV 에 대한 항- PS 항체의 항-바이러스 효과
실시예 XII에 나타낸 CMV에 대한 현저한 항-바이러스 효과외에, 본 실시예는, 호흡계 신시티얼 바이러스(Respiratory Syncitial Virus: RSV) 복제의 억제시 3개의 상이한 항-PS 항체의 사용을 입증한다.
A. 방법
1. 시험관내 RSV-감염된 세포의 처리
A-549 세포를 3개의 코스타 12-웰 조직 배양 플레이트내에서 100%의 합치성으로 성장시켰다. 200μL의 최소 필수 이글 배지를 모든 웰에 가하였다. 항-인지질 항체(Ab)(100㎕중 100㎍)을 각각의 플레이트의 9개 웰에 가하고 30분 후 초기 9개 웰중 6개의 웰을 100μL의 용적에서 RSV 긴 균주로 1 MOI에서 감염시켰다. 3개의 나머지 웰을 감염시키지 않은, 항체-처리된 웰 채로 두었다. 항체가 없는 3개의 다른 웰을 위에서 기술한 바와 동일한 MOI에서 RSV로 감염시켰다.
각각의 플레이트를 사용하여 3개의 상이한 항체를 시험하였다: 3G4, 3SB 및 1B9(실시예 IV). 세포를 5% CO2 속에서 2시간 동안 항온처리한 후 600μL의 배지를 가하여 각각의 웰에서 1mL의 용적이 되도록 하였다. A-549 세포 플레이트를 대조군으로서 동일한 조건으로 유지시켰다. 상층액을 감염시킨지 4, 24 및 72시간째에 수집하였다. 각각의 싯점에서 각각의 플레이트로부터 4개의 웰을 샘플링하였다. 단지 Ab 처리한 세포가 있는 1개의 웰, 2개의 웰은 Ab-처리된/RSV-감염시킨 세포를 지니며 1개의 웰은 단지 RSV-감염된 세포만을 지녔다. 샘플을 플라크 검정까지 -80℃에서 동결시켰다.
2. 플라크 검정
플라크 검정을 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다(참조: Kisch et al., 1963; Graham et al., 1988). 요약하면, 동결된 세포 현탁액을 37℃에서 신속하게 해동시켰다. 3개의 10배 희석물을 희석시키지 않은 세포 상층액으로부터 제조하였다: 10-1, 10-2 및 10-3. 100μL의 각각의 희석물 및 희석시키지 않은 샘플을 모두 3회 80% 합치성 Hep-2 세포주내로 종균배양하였다. 플레이트를 5% CO2, 40℃ 항온배양기내에 5일 동안 두었다. 5일 째에, 플레이트를 전개시키고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여 각각의 웰에 플라크가 나타나도록 하였다. 플라크를 해부용 현미경을 사용하여 계수하여 pfu(플라크 형성 단위)/mL의 RSV 바이러스 로드를 계산하였다.
B. 결과
도 12에 나타난 바와 같이, RSV-감염된 세포를 3SB 또는 1B9로 처리하면 바이러스 복제에 있어서 log 감소가 수득되었다. 항-바이러스 효과는 심지어 감염된 세포를 3G4로 처리하는 경우에 더욱 현저하였다. 3G4로 처리함에 의해 바이러스 역가가 2 log10 감소하였다(도 12). 억제는 CMV에서 관측되는 것보다 더 낮았으며, 이는 대부분 3G4의 농도가 낮기(25 내지 50㎍/ml) 때문인 것으로 여겨진다.
실시예 XIV
일본쇄 항- PS 항체
항-종양제 단독으로서, 부착된 치료제를 종양에 전달하기 위한 표적화제로서, 및 항-바이러스제로서를 포함하는, 본원에 기술된 항-PS 항체의 많은 용도를 제공하면서, 본 실시예는 예를 들면, VH 및 VL 도메인이 일반적으로 펩타이드 링커에 의해 결합된 폴리펩타이드 일본쇄내에 존재하는 일본쇄(scFv) 항-PS 항체를 생성하는데 적합한 기술을 기재한다.
A. 파아지 항체 라이브러리의 제조
세균 라이브러리의 제2 스톡(약 1 x 1010 클론)을 100㎍/ml의 암피실린 및 1% 글루코즈를 함유하는 100ml의 2xTY내로 종균배양한다. 이를 600nm에서 OD 값이 0.5가 될 때까지 37℃에서 교반하면서 성장시킨다.
M13K07 헬퍼 파아지를 1013 pfu에서 가하고 37℃의 수욕조내에서 30분 동안 교반하지 않고 항온처리하였다. 감염된 세포를 3,500g에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 100㎍/ml의 암피실린 및 75㎍/ml의 가나마이신을 함유하는 200ml의 2xTY속에 재현탁시키고 30℃에서 밤새 교반하면서 항온처리하였다.
배양물을 10,800g에서 10분 동안 원심분리하였다. 1/5 용적의 PEG/NaCl을 상층액에 가하고, 잘 혼합하고 4℃에서 1시간 동안 두었다. 다음에, 10,800g에서 30분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 40ml의 PBS속에 재현탁시키고 8ml PEG/NaCl을 가하였다. 이를 혼합하고 4℃에서 20분 동안 두었다. 이후에, 10,800g에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인하였다. 펠렛을 2ml의 10% 사람 혈청속에 재현탁시키고 11,600g에서 10분 동안 미세원심분리기에서 원심분리하여 대부분의 잔여 세균 파편을 제거하였다.
예비-팬(pre-pan)하기 위해, 10% 사람 혈청중 파아지 항체 라이브러리를 PC 피복된 접시에 가하고 실온에서 60분동안 항온처리하였다.
B. 바이오티닐화된 리포좀에서의 선별
20μmol의 포스파티딜이노시톨 및 20μmol의 바이오티닐화된 포스파티딜세린을 10ml의 헥산속에 용해하였다. 당해 용액을 회전 증발기를 사용하여 플라스크의 표면상의 박층으로 건조시켰다. 2ml의 PBS를 가하고 욕조를 4℃에서 30분 동안 초음파처리하였다.
100μmol의 파아지 scFv 및 100㎕의 바이오티닐화된 리포좀을 10% 사람 혈청의 존재하에 혼합하고 실온에서 1시간동안 온화하게 회전시켰다. 100㎕의 스트렙트아비딘 M-280 다이나비드를 사용하여 600㎕의 2.5% 카제인/0.5% BSA를 실온에서 30분 동안 가하여 차단시켰다. 비드를 차단 완충액으로부터 MPC-E(자기 입자 농축기: Dynal 제조원)를 4 내지 5분 동안 사용하여 분리하였다.
비드를 100㎕의 PBS에 재현탁시켰다. 100㎕의 차단된 스트렙트아비딘 다이나비드를 바이오티닐화된 항원에 결합한 파아지에 가하고, 실온에서 15분동안 온화하게 회전시켰다. MPC-E를 5분동안 사용하여 분리하고 상층액을 부어 버렸다. 1ml의 PBS로 5회 세척하였다. 각각의 세척동안, 비드를 재현탁시키고 MPC-E로 제거하였다.
최종적으로, 파아지를 300㎕의 100mM 트리에탈아민속에 30분 동안 재현탁시킴으로써 비드로부터 용출시켰다. 150㎕의 1M 트리스 pH=7.4를 중화를 위해 가하였다. 비드를 MPC-E를 사용하여 다시 분리시켰다.
150㎕의 파아지 상층액을 사용하여 10ml의 TG1 세균을 대수기 상태(log phase)로 감염시켰다. 10ml의 배양물을 20㎍/ml의 암피실린의 존재하에서 37℃에서 1시간 동안 진탕시켰다. 암피실린을 50㎏/ml의 최종 농도로 가하고 1시간 동안 진탕시켰다. 1013pfu의 M13 헬퍼 파아지를 당해 배양물에 가하고, 100㎍/ml의 암피실린을 함유하는 100ml의 2TY 배지에 이전시키고 37℃에서 1시간 동안 진탕시켰다. 가나마이신을 100㎍/ml의 최종 농도로 가하고 30℃에서 밤새 진탕시켰다.
파아지 제조 공정을 반복하고 선택 공정을 3 내지 4회 다시 반복시켰다.
C. 모노클로날 일본쇄 항체 ELISA
플레이트로부터 개개의 HB2151 콜로니(선별 4회 후)을 96-웰 플레이트에서 100㎍/ml 암피실린 및 1% 글루코즈를 함유하는 500㎕ 2xTY 내로 접종하고, 진탕(300rpm)으로 성장시켰다. 당해 플레이트로부터 5㎕를 웰당 100㎍/ml의 암피실린을 함유하는 500㎕의 2xTY를 함유하는 제2의 96-웰 플레이트에 이전시키고 37℃에서 3시간 동안(OD600=0.9) 진탕 성장시켰다.
각각의 웰에 100㎍/ml의 암피실린, 10mM IPTG(최종 농도는 1mM이다)를 함유하는 50㎕ 2xTY를 가하고, 이를 30℃에서 밤새 진탕시키면서 성장시켰다. 이를 1,800g에서 10분 동안 원심분리하고 100㎕의 상층액을 다음 ELISA에서 사용하였다.
96 웰 플레이트(DYNEX IMMULONR1B)를 에탄올속에 10㎍/ml의 농도로 용해시킨 PS(P6641 10mg/ml 용매는 클로로포름:MeOH 95:5이다)로 피복시켰다. 10㎍/ml PC를 동일한 방법으로 피복시켰다. 당해 플레이트를 4℃에서 냉실속에서 증발시켰다. 250㎕의 2.5% 카제인을 각각의 웰에 가하고, 당해 플레이트를 덮고 37℃에서 1시간 동안 차단하였다.
웰을 PBS를 사용하여 3회 세척하고, 가용성 scFv를 함유하는 100㎕/웰 10% 사람 혈청 및 100㎕/웰 상층액을 가하고 60분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 용액을 따라버리고 PBS로 6회 세척하였다. 5% 카제인/0.5% BSA-PBS(1:5000 희석)중 100㎕의 9E10을 각각의 웰에 가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고 PBS로 6회 세척하였다. 100㎕의 HRP-소-항-마우스 항체(1:10000 희석)을 각각의 웰에 가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고 PBS로 5회 세척하였다. 100㎕의 0.05% OPD를 각각의 웰에 가하고 5분 동안 전개시켰다. 100㎕의 0.18M H2SO4를 가하여 반응을 정지시키고 O.D. 490에서 판독하였다.
항원-양성 클론을 2xTYAG 플레이트상에 스트리킹(streaking)하고 30℃에서 밤새 성장시킨다. 양성의 단일 콜로니를 3ml의 2xTYAG 배지에 집어넣고 12시간 동안 37℃에서 성장시킨다. 플라스미드를 추출하고 scFv 유전자 삽입물을 효소 분해 및 PCR로 점검한다. 정확한 크기의 삽입물을 지닌 것을 서열분석한다.
정확한 크기의 삽입물을 지닌 콜로니를 100ml의 2xTYAG 배지에서 성장시키고 37℃의 OD 600=0.5에서 진탕시켰다. 이를 900ml의 2xTYA내로 이전시키고 OD 600=0.9가 될 때까지 성장시켰다. 1M IPTG를 1mM의 최종 농도로 가하고 30℃에서 밤새 진탕시켰다. 상층액을 앞에서와 동일한 ELISA 방법으로 점검하였다. scFv 단백질을 Ni++-아가로즈 친화성 크로마토그래피를 사용하여 원형질막 분획으로부터 정제하였다.
D. 결과
4회의 패닝 후, 다음 클론들은 PS 플레이트상에 우수한 ELISA 시그날을 제공하였으며 정확한 크기의 삽입물을 지닌다: 3E5, 3A2, G5, C8, E4 및 4D5. 이들을 아클로닝하였으며, 여기서, E4는 5개의 양성 아클론을 제공하였고 4D5는 5개의 양성 아클론을 제공하였다(표 14)
[표 14]
Figure 112012087199067-pat00028
Figure 112012087199067-pat00029
양성 클론이 확인되면, 이들을 서열분석하였다. ScFv 핵산 및 클론 3A2의 단백질 서열은 각각 서열 5 및 서열 6으로 설정한다. 양성 클론을 대규모로 성장시키고 scFv를 니켈 아가로즈 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 정제된 scFv를 파스트-겔(Phast-gel) 전기영동을 사용하여 수득하였다.
실시예 XV
PE -결합 펩타이드 유도체의 합성
본 실시예는 종양 및 바이러스 질병 치료시 사용하기 위한 예시적인 PE-결합 펩타이드 유도체 및 접합체의 설계 및 합성에 관한 것이다. 예시적인 듀라마이신 유도체에 대한 구조는 도 13A 내지 도 13O의 패널에 나타나 있으며 이들은 다음 기술과 일치한다.
A. DLB
물 속의 0.1M NaHCO3 0.387ml에 용해시킨 0.5mg(0.25μmole)의 듀라마이신을 NHS-LC-바이오틴(Sigma 제조원) 0.113mg(0.25μmole)에 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리한 다음 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 샘플을 실리카 컬럼상에 로딩하고, 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 세척하고 0.1% TFA 및 70% CH3CN으로 용출시켰다. 용출물을 수집하고 원심분리로 농축시켰다. 총 수율은 0.5mg이었다(도 13A).
B. DIB
물속의 0.1M NaHCO3 0.286ml에 용해시킨 0.5mg(0.25μmole)의 듀라마이신을 0.034mg(0.25μmole)의 2-이미노티올란 하이드로클로라이드(2-IT)에 가하였다. 당해 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 0.13mg(0.26μmole)의 요도아세틸-LC-바이오틴(Pierce 제조원)을 가하고 반응물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 샘플을 실리카 컬럼상에 로딩하고, 0.1% TFA로 세척하고 0.1% TFA 및 70% CH3CN으로 용출시켰다. 용출물을 수집하고 원심분리로 농축시켰다. 총 수율은 0.5mg이었다(도 13B).
C. ( DLB ) 4 NA
1.9mg(0.94μmole)의 듀라마이신을 수중 0.1M NaHCO3 0.5ml속에 용해시켰다. 여기에, 200㎕의 디메틸포름아미드(DMF)중 0.4mg(0.88μmole)의 NHS-LC-바이오틴(Sigma 제조원)을 가하였다. 당해 혼합물을 실온에서 4시간 동안 항온처리하였다. 1ml중의 10mg(0.17μmole) 뉴트라비딘(NA)을 반응 혼합물에 가하고 실온에서 2시간 동안 항온처리한 다음 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이후 반응 혼합물을 PBS 완충액중 G-25 컬럼(용적 50ml)상에 로딩하였다. 분획을 수집하고 SDS PAGE(파스트 겔)로 분석하였다. 단백질을 함유하는 분획(7-16)을 함께 혼주(pooling)하고, 0.22μm의 여과기를 통해 여과함으로써 멸균시키고 농도를 280nm에서 흡광도를 측정함으로써 측정하였다. 총 수율은 5.1mg이었다.
이어서 샘플을 FPLC로 분획화하였다. 3개의 피크를 수집하며, 이들은 다음에 상응하였다: 피크 1: [(DLB)4NA]3(분획 17-23); 피크 2: [(DLB)4NA]2(분획 24-33) 및 피크 3: (DLB)4NA (분획 35-48). 모든 샘플을 0.22μm 여과기를 통해 여과함으로써 멸균시켰다. 수득된 최종 수율은 다음과 같다: 0.34mg의 [(DLB)4NA]3; 0.59mg의 [(DLB)4NA]2 및 0.41mg의 (DLB)4NA.(도 13C).
D. ( DLB ) 4 NA -F
PSB 완충액중 0.61mg의 (DLB)4NA를 DMF중 0.005mg의 N-하이드록시석신이미딜 플루오레세인(NHS-플루오레세인)(Sigma 제조원)에 가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서 반응 혼합물을 PD10 컬럼(10ml)에서 분획화하였다. (DLB)4NA-F를 단백질을 함유하는 분획(3 및 4)속에서 용출시키고, 이를 함께 혼주시키고 0.22μm 여과기를 통해 여과함으로써 멸균시켰다. 총 수율은 0.5mg이었다(도 13D).
E. ( DIM ) n HIgG
우선, 사람 IgG(HIgG)를 다음과 같이 정제하였다: 1.3ml HIgG(이는 보레이트 완충액과 1mM EDTA, pH 9중 100mg/ml의 HIgG, 22.5mg/ml의 글리신 및 3mg/ml의 알부민을 함유하였다)를 FPLC(S200, 250ml) 컬럼에 적용시켰다. 분획을 수집하고 파스트 겔상의 SDS PAGE로 분석하였다. 단량체성 IgG(21-32)를 함유하는 분획을 함께 혼주시키고 0.22μm 여과기를 통한 여과로 멸균시켰다. 280nm에서 흡광도로 측정한 총 수율은 111mg이었다.
정제된 HIgG(13ml의 보레이트 완충액, pH 9중 55mg)를 DMF중 0.5ml의 SMCC(Pierce 제조원)중 1.003mg에 가하였다. 당해 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 동시에, 6mg의 듀라마이신(3μmole; 0.5ml 0.1M NaHCO3속에 용해) 및 0.413mg 2-IT(0.1M NaCO3중 3μmole)을 함유하는 다른 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 반응이 완료된 후, 2개의 반응 혼합물을 합하고 실온에서 2시간 동안 및 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 반응 생성물을 파스트 겔상에서 SDS PAGE로 분석하였다. 반응 생성물을 보레이트 완충액, pH 9중 FPLC 컬럼위에 로딩하였다. 삼량체(5-14), 이량체(15-24), 및 단량체(25-37)에 상응하는 FPLC 분획을 혼주하고 0.22μm 여과기를 통한 여과로 멸균시켰다. 단량체의 총 수율은 54.6mg이었다. 5개 내지 7개의 듀라마이신 그룹을 HigG의 각각의 분자에 부착시켰다(도 13E).
F. ( DIM ) n HIgG -F
1mg(0.7ml)의 (DIM)nHIgG를 DMF중 5㎕의 NHS-플루오레세인에 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하고 PD-10 컬럼상에서 탈염시켰다. 단백질을 함유하는 분획(2-3)을 혼주시키고 0.22μm 여과기를 통해 여과함으로써 멸균시켰다. 총 수율은 0.9mg이었다(도 13F).
G. ( DIM ) n HIgG -B 및 [( DIM ) n HIgG ] 2 -B
[(DIM)nHIgG]2의 바이오티닐화된 유도체를 합성시키기 위해, 0.66mg(1ml)의 [(DIM)nHIgG]2를 DMF중 1mg/ml의 NHS-LC-바이오틴(Pierce 제조원) 8㎕에 가하였다. 당해 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 반응 혼합물을 PD-10 컬럼상에서 탈염시켰다. 단백질을 함유하는 분획(3 및 4)을 혼주시키고 0.22μm 여과기를 통한 여과로 멸균시켰다. 최종 수율은 0.46mg이었다.
단량체 (DIM)nHIgG의 바이오티닐화를 동일한 방식으로 수행하였다. 요약하면, 1.06mg(0.75ml)의 (DIM)nHIgG를 DMF중 1mg/ml의 NHS-LC-바이오틴 12㎕에 가하였다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후, 반응 생성물을 PD-10 컬럼상에서 탈염시켰다. 단백질을 함유하는 분획(3 및 4)을 혼주시키고 0.22μm의 여과기를 통한 여과에 의해 멸균시켰다. 최종 수율은 0.62mg이었다(도 13G).
H. ( DIB ) 4 NA
2mg(0.99μmole)의 듀라마이신을 0.5ml의 0.1M NaHCO3에 용해시키고 0.136mg(0.99μmole)의 2-IT에 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 0.483mg(0.95μmole)의 요도아세틸-LC-바이오틴(Pierce)을 가하고 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 1ml의 H2O중 10mg(0.17μmole)의 뉴트라비딘을 가하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 반응 혼합물을 FPLC로 분획화하였다. 3개의 상이한 피크를 수집하여 혼주시켰다: [(DILB)4NA]3(분획 17-23); [(DILB)4NA]2(분획 24-33) 및 (DILB)4NA (분획 35-48). 모든 샘플을 0.22μm 여과기를 통해 여과함으로써 멸균시켰다. 수득된 총 수율은0.87mg의 [(DILB)4NA]3; 1.25mg의 [(DILB)4NA]2 및 1.83mg의 (DILB)4NA.(도 13H).
I. ( DIB ) 4 NA -B
0.023mg(0.3μmole)의 (DILB)4NA를 0.9㎍의 NHS-LC-바이오틴(Pierce 제조원)에 가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후 PD-10 컬럼상에서 탈염시켰다. 총 수율은 0.04mg이었다(도 13I).
J. DS -1
5mg(2.5μmole)의 듀라마이신을 수중 0.5ml의 0.1M NaHCO3에 용해시키고 1,3 프로판 설톤 0.319mg(2.6μmole)에 가하였다. 혼합물을 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 샘플을 실리카 컬럼위에 로딩하고 0.1% TFA로 세척하고 0.1% TFA 및 70% CH3CN으로 용출시켰다. 용출물을 수집하고 감압하에 원심분리함으로써 농축시켰다. 총 수율은 5mg이었다(도 13J).
K. DS -2
수중 0.3ml의 0.1M NaHCO3속에 용해시킨 1mg(0.497μmole)의 듀라마이신을 0.072mg(0.523μmole)의 2-IT에 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 0.125mg(0.49μmole)의 SBF-클로라이드(Pierce)를 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 및 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 당해 펩타이드를 실리카 컬럼위에서 정제하였다. 용출물을 수집하고 감압하에 원심분리하였다. 총 수율은 1mg이었다(도 13K).
L. DS -3
수중 0.4ml의 0.1M NaHCO3속에 용해시킨 1mg(0.497μmole)의 듀라마이신을 0.109mg(0.592μmole)의 2-설포벤조산 사이클릭 무수물에 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 및 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 당해 펩타이드를 실리카 컬럼위에서 정제하였다. 용출물을 수집하고 감압하에 원심분리하였다. 총 수율은 1mg이었다(도 13L).
M. DS -4
수중 0.5ml의 0.1M NaHCO3속에 용해시킨 0.25mg(0.124μmole)의 듀라마이신을 0.017mg(0.124μmole)의 2-IT에 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이후 혼합물을 0.049mg(0.124μmole) 엘만 시약(Ellman"s reagent)에 가하였다. 당해 혼합물을 실온에서 2시간 동안 및 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 250㎕의 1mg/ml의 4-아미노-5-하이드록시-2,7-나프탈렌 디설폰산 일-나트륨 염 수화물을 100㎕의 1mg/ml의 2-IT에 가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 50㎕의 당해 반응 혼합물을 앞서의 반응물에 가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 펩타이드를 실리카 컬럼위에서 정제하였다. 용출물을 수집하고 감압하에 원심분리에 의해 정제하였다(도 13M).
N. DS -5
0.5ml의 0.1M NaHCO3속에 용해시킨 5mg(2.5μmole)의 듀라마이신을 0.356mg(2.6μmole)의 1,3 부탄 설톤에 가하였다. 혼합물을 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 샘플을 실리카 컬럼상에 로딩하고, 0.1% TFA로 세척하고 0.1% TFA 및 70% CH3CN으로 용출시켰다. 용출물을 수집하고 감압하에 원심분리하여 농축시켰다. 수율은 5mg이었다(도 13N).
O. DC -1
수중 0.5ml의 0.1M NaHCO3속에 용해시킨 0.25mg(0.124μmole)의 듀라마이신을 0.017mg(0.124μmole)의 2-IT에 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이후 혼합물을 0.049mg(0.124μmole) 엘만 시약에 가하였다. 당해 혼합물을 실온에서 2시간 동안 및 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 펩타이드를 실리카 컬럼위에서 정제하였다. 용출물을 수집하고 감압하에 원심분리에 의해 정제하였다(도 13O).
실시예 XVI
PE 에 특이적으로 결합하는 듀라마이신 유도체
본 실시예는, 실시예 XV에서 합성된 듀라마이신 유도체가 PE에 대해 특이적이므로 세포-침투성 표적화 또는 항-바이러스 시약에 결합시킴에 의해 설계하여 종양 및 바이러스 질병의 치료에 사용할 수 있음을 나타낸다.
듀라마이신 유도체의 특이성, 특히 PE, 바람직하게는 다른 인지질에 대한 결합을 시험하기 위하여, 일련의 경쟁 ELISA를 수행하였다. PE에 결합시키기 위한 DIB 또는 DLB와 경쟁하는 듀라마이신 유도체의 능력을 다음 방법으로 시험하였다.
PE 및 PC를 별개로 에탄올속에 용해시켰다. 최종 농도는 5㎍/ml이었다. 100㎕를 96웰 ELISA 플레이트(DYNEX IMMULONR 1B)의 각각의 웰에 가하였다. 당해 플레이트를 냉실에서 4℃에서 증발시켰다. 250㎕의 2.5% 카제인을 각각의 웰에 가하고, 덮고 37℃에서 1시간 동안 차단시켰다. 차단 완충액을 따라버리고 100㎕의 2.5% 카제인을 각각의 웰에 가하였다. 듀라마이신 화합물을 (DIM)nHIgG, (DIB)4NA, (DLB)4NA, DS, 듀라마이신 및 DIB와 같은 플레이트를 따라 일련의 희석물로서 가하였다.
(DIM)nHIgG 출발 농도는 1.4mg/ml이고, (DIB)4NA 출발 농도는 800㎍/ml이며, (DLB)4NA 출발 농도는 800㎍/ml이었다. 이들을 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고 PBS로 5회 세척하였다. 100㎕의 HRP-스트렙트아비딘(1:5000 희석)을 각각의 웰에 가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고 PBS로 5회 세척하였다. 100㎕의 0.05% OPD를 각각의 웰에 가하고 5분 동안 전개시켰다. 100㎕의 0.18M H2SO4를 가하여 반응을 정지시키고 O.D. 490에서 판독하였다.
수득되는 데이타를 표로 만든 후 그래프적으로 플롯팅하였다. 도 14C 및 도 14D의 데이타에 의해 예시되는 바와 같이, 증가하는 농도의 듀라마이신 유도체는 490nm에서 흡광도를 감소시켰으며, 이러한 사실은 듀라마이신 유도체가 포스파티딜에탄올아민에 대한 결합에 있어 DIB 및 DLB와 경쟁함을 나타낸다.
듀라마이신 작제물의 인지질 결합 프로파일은 추가의 ELISA로 확인하였다. 각각의 시험 지질인 PS, PE, PI, CL, PC, PG, SM 및 콜레스테롤을 별개로 에탄올속에 용해시키고 ELISA 플레이트를 피복시키는데 사용하였다. 듀라마이신 화합물을 플레이트를 따라 일련의 희석물로 가하였다. 항온처리 및 세척 단계 후, 제 2의 검출 시약을 각각의 웰에 가하고 반응성을 위에서 기술한 바와 같은 비색계 검정을 사용하여 측정하였다.
듀라마이신 바이오틴 유도체, DIB 및 DLB에 대한 대표적인 인지질 결합 프로파일을 도 14A에 나타낸다. 이는, DIB 및 DLB가 PE에 대해 특이적이며 각각의 PS, PI, CL, PC, PG 및 SM 각각에 대한 결합은 무시할 정도이거나 검출불가능함을 나타낸다. (DIM)nHIgG-B 및 [(DIM)nHIgG]2-B는 필수적으로 DLB와 동일한 결합 프로파일을 갖는다. PS에 대한 최소 결합이 DIB의 최대 농도에서 검측되었다 하더라도(도 14A), 이는 본 연구에서는 의미가 없는데, 이는 PS에 대한 결합이 PE 결합에 대한 포화 및 최대의 1/2인 DIB의 농도에서 검출불가능하기 때문이다. 따라서, 듀라마이신 작제물은 포스파티딜에탄올아민에 특이적으로 결합한다.
혈청은 듀라마이신 유도체에 의한 PE 결합에 있어 현저한 효과가 없다는 것이 또한 밝혀졌다. 이는 혈청(BSA)의 존재 및 부재하에서 PE-피복된 ELISA에 대한 듀라마이신 바이오틴 유도체, DLB의 결합에 의해 예시되며, 여기서, 결합 프로파일은 현저한 차이를 나타내지 않는다(도 14B).
실시예 XVII
PE -결합 펩타이드 유도체의 항-바이러스 효과
실시예 XII 및 실시예 XIII에 의해 나타낸 바와 같은, 항-PS 항체에 의해 중재된 항-바이러스 효과외에, 본 실시예는 다른 일반적인 아미노인지질, PE에 특이적으로 결합하는 펩타이드 유도체의 항-바이러스 효과를 입증한다.
A. 방법
1. 시험관내에서 CMV-감염된 세포의 치료
6-웰 플레이트에서 사람 이배체 음경피 섬유아세포(HHF-R2)의 합치성 단층을 실시예 XII에 기술한 바와 같이 MOI=0.01로 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 사람 CMV AD169 로 감염시켰다(참조: Bresnahan et al., 1996). 당해 세포를 37℃에서 90분 동안 웰당 1.5ml의 총 용적으로 바이러스로 감염시켰다. 감염 동안, 플레이트를 매 30분 동안 온화하게 와동시켰다. 감염이 이어, 세포 상층액을 제거하고 DMEM/10% FBS/펜-스트렙(웰당 2ml)을 각각의 웰에 가하였다.
듀라마이신 유도체 (DLB)4NA, (DIM)nHIgG, DS-1, DS-2, DS-3 및 DC-1의 상이한 희석물을 바이러스를 첨가하기 전에 웰에 가한 후 감염시켰다. 감염된 세포를 총 14일 동안 37℃에서 항온처리하였다. 각각의 웰에서 배지 및 듀라마이신 유도체를 매 3일 동안 교체하였다.
2. 형광 현미경
실시예 XII에서와 같이, 재조합 CMV는 SV40 프로모터의 조절하에서 GFP를 발현한다. 따라서, 감염된 세포는 형광 현미경하에 녹색으로 나타난다. 본 연구에서는, 듀라마이신 유도체로 처리한 CMV-감염된 세포를 4일 및 6일째에 형광 현미경하에서 관측하였다.
B. 결과
4일 째에, 비처리된 웰과 (DLB)4NA 및 (DIM)nHIgG로 처리한 웰에 단일 감염된 GFP-양성 녹색 세포가 존재한다(도 15, 좌측 패널). 즉, HHF-R2 세포의 듀라마이신 유도체를 사용한 처리는 세포내로의 바이러스 도입을 억제하는 것으로 여겨지지 않는다. 듀라마이신 유도체 DS-1, DS-2 및 DS-3이 세포내 바이러스의 도입을 억제하는 일부 예비적 증거가 존재한다.
(DLB)4NA 및 (DIM)nHIgG로 처리한지 6일 후, 비처리한 웰 대 듀라마이신 유도체로 처리한 웰에 있어서 감염된 GFP-양성 세포의 수에는 현저한 차이가 있다(도 15, 중간 패널). 6일째에, 바이러스는 비처리된 웰에서 세포 주변으로 4일째에 관측된 단일 감염된 세포로부터 확산되었다(도 15, 상단, 좌측 패널을 우측 패널에 대해 비교). 그러나, (DLB)4NA 및 (DIM)nHIgG로 처리한 웰에서 6일 째에, 바이러스는 원래의 단일 감염된 세포로 한정되었다(도 15, 중간 및 하단, 좌측 패널을 중간 패널에 대해 비교).
따라서, (DLB)4NA 및 (DIM)nHIgG는 원래의 감염된 세포로부터 주변 세포로 CMV의 확산을 제한한다. 이러한 바이러스 확산의 억제는, 세포를 상이한 농도의 (DLB)4NA(100㎍/ml 및 50㎍/ml) 및 (DIM)nHIgG(200㎍/ml 및 100㎍/ml)로 처리하였던 경우에 관측된다.
실시예 XVIII
3 G4 항체의 장점
실시예 IV에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명자의 유일한 프로토콜을 사용하여 개발한 3G4 항체는 우세한 항-PS 항체인 3SB를 포함하는 문헌[참조: Rote et al. (1993)]의 항-PS 항체보다 많은 장점을 지닌다. 본 실시예는 특정의 이러한 장점을 기술한다.
A. 부류 및 특이성
3G4는 IgG 항체인 반면 3SB는 IgM이다. IgG 부류의 항체는 보다 높은 친화성, 생체내에서 더욱 낮은 청소율 및 정제, 변형 및 취급의 단순성을 포함하는, IgM보다도 다수의 장점을 지닌다. IgM 항체인, 3SB와 3G4의 PS 결합과 다른 IgG 항체인 PS 결합의 비교는 도 19A 및 도 19B에 나타낸다.
3G4는 대략 동일한 강도로 음이온성 인지질인, PS, PA, PI, PG 및 CL과 강력하게 반응하며, 아미노인지질인, PE와 덜 강하게 결합한다. PC 및 SM의 반응성은 없으며 결합 특이성 프로파일은 PS=PA=PI=PG>CL>>PE이다(실시예 IV; 표 4). 3G4 는 헤파린, 헤파란 설페이트 또는 이본쇄 또는 일본쇄 DNA에 검출가능하게 결합하지 않으며, 웨스턴 블롯상에서 bEnd.3 세포로부터 추출된 세포 단백질에도 검출가능하게 결합하지 않는다. 3G4의 결합은 5mM EDTA의 존재에 의해 영향받지 않으며, 이러한 사실은 Ca2 +가 음이온성 인지질에 대한 3G4 결합을 필요로 하지 않음을 나타낸다. 3G4는 인지질로 피복되지만 이후 염수중 0.2% 트윈 20으로 세척된 ELISA 플레이트에 결합하지 않았으며, 이는 당해 결합이 흡착된 인지질에 대한 것임을 입증한다.
3G4에 의해 인지된 에피토프는 음이온성 인지질의 포스포글리세롤 코어내에 있으며, 이는 모든 포유동물 종으로부터의 인지질에서 동일하다. 따라서, 항체는 마우스 및 사람 인지질 둘다와 반응하며, 이는 전-임상 및 임상 진행을 위해 중요하다. 3G4는 천연 리간드인, 아넥신 V보다 음이온성 인지질에 대해 더욱 특이적이다. 3G4와는 달리, 아넥신 V는 또한 Ca2 +의 생리학적 농도에서 중성 인지질에 강력하게 결합한다.
음이온성 인지질에 대한 3G4의 특이성은, 상이한 인지질로부터 형성된 인지질을 사용하여 고정화된 PS에 대한 3G4 결합을 경쟁시키는 검정으로 입증되었다. 리포좀은 클로로포름중 단일 인지질 5mg의 용액으로부터 제조하였다. 당해 용액을 질소하에 건조시켜 환저 유리 플라스크내에 박층을 형성시켰다. 이후에, 10ml의 트리스 완충액(0.1M, pH 7.4)을 가하고 플라스크를 2분 동안 5회 초음파처리하였다. 3G4 항체(0.1㎍/ml)를 완충액 또는 상이한 인지질 리포좀에 가하고 실온에서 30분 동안 예비-항온처리하였다. 당해 혼합물을 PS-피복된 플레이트(표준 차단 후)에 가하고, 1시간 동안 항온처리하고, 세척하며 제 2 항체를 가하였다. 1시간 후, 플레이트를 세척하고 OPD를 사용하여 5분 동안 현상시켰다.
실시예 IV에 나타낸 바와 같이, 3G4는 고정화된 경우 PS, PA, PI, PG 및 CL에 결합하며 고정화된 PE에 더욱 적은 정도로 결합하나, 고정화된 PC에는 결합하지 않는다. 상이한 리포좀의 존재 또는 부재하에서 고정화된 PS에 결합하는 3G4의 능력은 도 20에 나타낸다. 이러한 리포좀 경쟁 연구로부터의 결과는, ELISA 플레이트에 흡착된 PS에 대한 3G4의 결합이 PS, PA, PI, PG 및 CL로부터 제조된 리포좀에 의해 차단되었지만, PE 및 PC로부터 제조된 리포좀은 3G4 결합에 있어 검출가능한 감소를 초래하지 않음을 나타낸다(도 20). 또한, SM 리포좀은 억제성이 아니었다.
B. 세포 증식의 억제
3G4는 PS 및 다른 음이온성 인지질을 외재화하는, 활성화된 세포, 분열하는 세포, 손상된 세포, 세포사멸성 세포 및 악성 세포에 결합한다. 3G4 항체는 시험관내에서 내피 세포의 증식을 억제하며, 정지기 세포와 대치되는 것으로써 분열하는 내피 세포의 현저한 선택적인 억제를 나타낸다.
시험관내에서 bEnd.3 세포의 성장시 항-PS 항체 3G4, 9D2, 3B10, 1B9, 2G7, 7C5 및 3SB의 효과를 측정하였다. bEnd.3 세포(10,000/웰)을 48 웰 플레이트에 종균배양하고 부착되도록 하였다. 20% DMEM 단독(대조군) 또는 항체(20㎍ 내지 40㎍의 총 IgG/웰)를 함유하는 20% DMEM을 종균배양한지 4시간만에 가하였다. 각각의 클론을 2개의 별개 플레이트에서 3회 시험하였다. 세포를 48시간 및 96시간 후에 탈착시키고, 세포 수를 각각의 웰에서 측정하고 처리당 평균 세포수를 계산하였다.
3G4 및 9D2 항체가 특히 효과적이었고, 이어서, 3SB 및 3B10이 효과적이었으며, 1B9, 2G7 및 7C5는 억제 효과가 거의 없었다. 각각의 항체는 정지기(합치성) 세포와 대치되는 것으로서, 분열하는(아합치성) 내피 세포의 선택적인 억제를 나타낸다. 비교 연구에서, 3G4는, 최대 억제 효과를, 이어서 9D2가 억제 효과를 나타내었으며, 이들 각각은 3SB보다 더욱 억제성이었다(도 16).
C. 항-종양 효과
3G4는 생체내에서 종양 혈관 내피 세포의 표면에 결합한다. 각종 종양을 지닌 마우스에 정맥내 주사하는 경우, 3G4는 종양에 특이적으로 및 지속적으로 국재화하였으나, 정상 기관에는 국재화되지 않았다. 염색은 종양 혈관 내피(도 22), 괴사 영역 및 개개의 악성 세포에서 관측되었다. 이는 종양에 3G4에 대한 다수의 결합 부위가 존재하며, 이러한 결합 부위는 종양 내피 및 종양 세포 둘다의 동시 표적화를 허용한다.
3G4는 생체내에서 혈관형성 및 종양 성장을 억제하며 종양을 지닌 마우스에서 검출가능한 기관 독성을 나타내지 않는다. 초기 연구에서, 3G4는 동계 및 이계 종양 모델에서 현저한 항-종양 효과를 나타내었으며, 여기서, 항체는 종양 혈관 손상을 유발하고, 혈관 및 종양 괴사시 감소한다(실시예 XI). 확립된 종양의 퇴화는 시험한 동물중 30% 내지 50%에서 관측된다.
3G4 항체의 대표적인 항-혈관형성 및 혈관 표적화 효과는 각각 도 17A 및 도 17B에 나타낸다. 3G4로 치료한 MDA-MB-231 같은자리 종양을 지닌 누드 마우스로부터의 종양 단면의 분석은 모든 치료된 종양에 있어 항-혈관형성 효과를 나타낸다. 도 17A는 대조군 항체롸 대조되는 것으로써 3G4로 치료한 마우스로부터의 종양의 대표적인 상을 나타낸다. 대조군 종양은, 괴사 신호가 없음을 나타내며 판-내피세포 마커인, CD31에 의해 입증되고 종양 혈관에서 검출되는 바와 같이 고도의 혈관구조를 지닌다(도 17A, 좌측 패널). 대조적으로, 3G4로 치료한 마우스로부터의 종양은 80 내지 90%의 괴사를 지니며, CD31 양성 구조물이 완전히 소멸되어 있으며, 이러한 사실은, 당해 치료가 실질적인 항-혈관형성 효과를 생산함을 나타낸다(도 17A, 우측 패널).
3G4의 항암 활성의 다른 성분은 종양 혈관 손상의 유도인자이다. 이는 동일한 대조군 연구로부터 기원한 H&E 염색된 종양의 대표적인 상을 제공하는 도 17B에 나열되어 있다. 대조군 종양에서 혈관은 잘 관류하고 있고, 형태학적으로 완전하고 가시적으로 분열하는 종양 세포에 둘러싸여 있다(도 17B, 좌측 패널). 대조적으로, 3G4-치료된 동물에서 혈관은 흔히 명백한 내피 층을 지니는 것으로 관측되었으며, 탈착된 내피 세포 및 유사하게는 탈누드화된 혈관에 부착된 숙주 세포에 의해 차단된다(도 17B, 우측 패널). 3G4 치료된 종양에서 대표적인 혈관은, 주변 종양 세포의 전-괴사 층에 의해 나타나는 바와 같은, 작용의 상실을 나타낸다(도 17B, 우측 패널).
요약하면, 3G4를 사용한 같은자리 MDA-MB-231 종양의 치료에 이은 조직학적 시험은, 1) 종양내 혈관종 약 50%의 혈관에서 혈관 내피의 붕괴; 2) 종양 내피에 대한 백혈구의 부착 및 종양 간질내로 단핵 세포의 침윤; 3) 혈소판 응집 및 적혈구 세포에 의한 종양 혈관의 폐색; 4) 3G4로 치료된 마우스 대 치료되지 않은 마우스로부터의 종양에 있어 미세혈관 밀도의 70% 감소; 및 5) 말초 종양 세포, 통상적으로 VTA의 생존과 함께 종양의 중심 괴사를 나타낸다. 즉, 3G4 항체의 주요 항-종양 작용은 종양 혈관구조에 있어서의 효과를 통해 발휘된다. 다른 메카니즘, 특히 항체-의존적 세포의 세포독성은 종양 세포 자체에 대해 지시되며, 항-종양 효과에 기여한다. 이는 중요하며, 말초 가장자리에서 종양 세포를 포함하는 종양 세포를 더욱 사멸시킬 수 있다.
연구에 이어서, 종양 성장에 있어서의 3G4의 효과를 동계(마우스 Meth A 섬유아종), 정맥내 이종이식(L540 사람 호지킨 림프종) 및 같은자리 종양(사람 MDA-MB-231 유방암 및 사람 MDA-MB-435 유방암)을 포함하는 다른 쥐 모델에서 시험한다. 3G4 항체의 마우스 치료는 이러한 종양 각각의 90%, 65% 및 50%, 및 70% 성장 지연을 초래하였다. 작은(0.1cm 직경) 종양 및 잘 확립된(0.3cm 직경, 200mm3) 종양도 유사하게 억제되었다. 항-PS 치료는 Meth A를 지닌 마우스의 50% 및 MBA-MD-231 종양을 지닌 마우스의 30%에서 장기간의 완전한 완화를 유발하였다. 3G4는 면역적격 마우스에서 최대 억제 효과를 지닌다. 사람 유방 종양이 마우스의 유방 지방 덩이내에서 성장하고 있는 사람 유방 종양(MDA-MB-231 및 MDA-MB-435)의 같은자리 모델은 사람 유방내에서 성장하는 사람 유방 암의 실제적이고 사실적인 모델이다.
D. 안정성 프로파일
3G4 항체는 문헌에 기술된 항-인지질 항체와는 상이하다. 통상적으로, 항-인지질 항체는 응고 캐스케이드를 방해하는 병원성 항체로 고려된다. 이들은 시험관내에서 응고 반응을 억제하며 생체내에서 혈전증을 유발한다. 대조적으로, 3G4, 9D2 등의 항체는 병원성 효과가 없는 치료학적 항체이다.
1. 응고
3G4, 9D2 및 유사 항체의 중요한 측면은, 목적한 항체가 바람직하게는 혈청의 부재하에서와 같이 혈청의 존재하에서도 강력하게 PS-피복된 플레이트에 결합하는 항체를 확인하기 위해 스크린을 사용하여 선택되어야 한다는 본 발명자들의 인식으로부터 유도된다. 이러한 새로운 진보는, 복합체가 항-인지질 증후군 및 관련 병인의 원인 또는 중요 인자인 것으로 여겨지므로, PS 및 혈청 단백질의 복합체를 인지하는 항체를 확인하거나 제외시키는 능력을 제공한다.
시험관내 혈액 응고 연구에서, 조직 인자(TF)로 유도된 응고의 약한 억제는 고 투여량의 3G4 항체를 사용하여 관측하였다. 낮은 용량을 사용하는 다른 연구에서, 3G4로 치료한 마우스로부터의 재침착된 혈장은 조직 인자의 존재하에서 BBG3 치료된 마우스로부터의 재침착된 혈장에서와 동일한 비율로 응고되었다. 또한, 100㎍/ml의 3G4를 세포 및 조직 인자에 시험관내에서 첨가하는 것은 프로플렉스(proplex; 고유의 응고 경로)에서 응고 인자 Xa의 생성율에 영향을 미치지 않았다.
시험관내에서 고 항체 수준을 사용한 TF-유도된 응고의 약한 억제에도 불구하고, 3G4 항체를 생체내에서 시험하였으며 정상 또는 종양을 지닌 마우스에서 혈전 합병증을 유발하지 않는다(참조: 실시예 XI). 3G4 항체를 또한 생체내 원숭이에서 시험하였으며 현재까지 현저한 부작용은 관측되지 않는다.
2. 낮은 또는 무 독성의 다른 표시
3G4가 마우스에서 독성이 없거나 독성이 낮다는 첫번째 증거는, 3G4가 독성의 증거없이 마우스내에서 하이브리도마로서 성장한다는 발견으로부터 왔다. 또한, 1mg의 정제된 3G4를 복강내 주사하는 경우, 독성은 관측되지 않았다.
전신계적 생체내 연구를 본 발명에서 수행하였으며, 당해 연구에서는, 3마리의 8주령 BALB/c 마우스의 그룹에 100㎍의 정제된 3G4 또는 이형-매치된 대조군 IgG3(BBG3)를 2 내지 3주 동안 1주당 3회 복강내 주사하였다. 독성의 물리적 신호는 관측되지 않았으며, 기관 독성 또는 형태학적 비정상의 조직학적 신호는 3G4로 치료된 마우스로부터 제거괸 주요 기관의 단면에서 검출되지 않았다. 다음 매개변수들을 특별히 시험하였다.
체중 측면에서, 3G4로 치료된 마우스는 BBG3로 치료된 마우스와 동일한 비율로 체중이 증가하였다. 앞서의 연구에서 체중 감소는 관측되지 않았다. 독성, 예를 들면, 탈모, 식욕 감퇴 등의 독성의 물리적 신호는 없었다. 적혈구, 혈소판, 백혈구, 절대 림프구 수 또는 절대 호중구 수를 포함하는 혈액 세포 수에 있어서 변화는 없다. 골수 세포충실성을 분석하기 위해, 3G4 또는 BBG3-처리된 마우스(6회 주사, 100㎍)로부터 기원한 골수의 파라핀 단면을 총 세포충실성 및 세포 조성에 대해 시험하였다. 치료된 마우스에서 골수는 필수적으로 완전히 세포성이다(젊은 포유동물의 경우에서 예측되는 바와 같다). 적혈구, 과립구, 림프구 원시세포 및 거대핵세포는 정상 수로 존재하였다.
요약하면, 고 투여량의 3G4(0.1mg)으로 2 내지 3주동안 1주에 3회 치료한 200마리 이상의 마우스에서 독성의 예는 관측되지 않았다. 심지어 2mg의 고 투여량을 제공하는 경우에도, 독성의 신호는 관측되지 않았다. 마우스는 정상의 물리학적 신호, 골수 세포충실도, 백혈구 세포 수, 조직학적 및 응고 기능을 유지한다.
3G4 항체를 또한 안정성 연구에서 원숭이에게 투여하였으나 부작용은 관측되지 않았다.
혈액 청소율 역학 연구를 또한 마우스에서 수행하였다. 3G4를 볼톤 헌터 시약(Bolton Hunter reagent)을 사용하여 방사요오드처리하고 마우스에 정맥내 주사하였다(25㎍). 혈액 샘플을 다양한 말기 싯점에서 꼬리 정맥을 통해 제거하였다. 3G4의 혈액 청소율은 마우스에서 통상적인 마우스 IgG이었다. 청소율의 α-상에 있어서의 반감기는 3시간인 반면 β-상에서의 반감기는 5일이었다. 분산 용적은 정상(100mg/kg)이었다. 본 연구는, 3G4가 정상의 숙주 조직을 방해하지 않으며 이의 가속된 청소율을 이끈다는 것을 나타낸다.
E. 항-바이러스 효과
3G4 항체는 또한 현저한 항-바이러스 효과를 발휘한다. 실시예 XIII에서 알수 있는 바와 같이, RSV-감염된 세포를 3G4로 치료하면 3SB를 사용하여 관측된 것보다 더욱 우수한 효과를 나타낸다. 따라서, 이러한 결과는 문헌에서의 우세한 항-PS 항체인 3SB보다 가장 우수한 3G4 항체의 다른 장점을 강조한다[참조: Rote et al. (1993)].
3G4 항체는 또한 시험관내(실시예 XII)에서 CMV를 억제하고 생체내(실시예 XXI)에서 mCMV로 감염된 마우스의 생존을 향상시키는데 있어 매우 효과적임이 밝혀졌다. 또한, 3G4 항체는 또한 라사 열의 감염 인자인 피킨데 바이러스 감염을 억제하는 것으로 밝혀졌다(실시예 XXIV). 바이러스 감염을 수반하는 것으로 본원에서 밝혀진 세포 표면 PS 노출, 및 박시니아 바이러스로 감염된 세포에 결합하는 3G4 항체의 능력(실시예 XXIII)은, 3G4 항체가 광범위한 스펙트럼의 항-바이러스제로서 매우 강력한 효능을 지님을 나타낸다.
실시예 XIX
3 G4 항체, CDR 서열 및 키메라
즉, 3G4 항체는 항-혈관형성, 항-종양 혈관 및 항-바이러스제의 복합 특성을 지닌다. 세포 분열, 혈관형성, 종양 성장 및 바이러스 감염성에 있어서 3G4의 억제 활성은 명백한 독성의 결여와 함께, 혈관형성 장애, 암, 당뇨병 및 바이러스 감염의 치료를 포함하는 당해 항체의 광범위한 치료학적 지침을 나타낸다.
3G4 항체와 실질적으로 동일한 에피토프를 인지하는 항체는 예를 들면, 면역화에 의해 하나 이상의 항-혈관형성, 항-종양 혈관 및 항-바이러스 치료요법에 사용하기 위해 생성시킬 수 있고 항체 경쟁 연구에 의해 확인할 수 있다. 3G4 항체와 필수적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 또한 본원에 제공된 3G4 항체의 지식으로부터 생성될 수 있다. 본 실시예는 3G4 항체의 상보성 결정 영역(CDR)의 서열 및 서열 정보의 용도를 제공한다.
A. 3 G4 항체 서열
항체 가변 영역의 원 서열은 3G4 항체 및 변이된 서열을 생산하는 하이브리도마로부터 RACE에 의해 수득되었다. 3G4 항체 CDR1-3의 중쇄(Vh)의 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열 1 및 서열 2에 나타낸다.
서열 1 및 서열 2는 도 18A에 나타낸 바와 같이 마우스 리더 서열 및 불변 쇄 서열의 일부를 포함한다. 리더 서열은 서열 2의 1번 내지 19번 아미노산으로 표시되며, 성숙한 단백질은 도 18A에서 화살표로 나타낸 위치에서 시작한다. 충분한 상보성 결정 영역 서열 정보는 VSS를 포함하는 서열 일부까지의 성숙한 단백질의 서열에 포함되며, 이후의 아미노산은 항원 결합에 필수적인 것이 아니다. 그 자체로, 핵산 서열내 BstEII 부위는 작용성 마우스 가변 영역을 제조하기 위한, 예를 들면, 사람 불변 영역에 이식하는데 사용하기 위한 편리한 부위로서 사용될 수 있다(도 18A).
실제로, 3G4-2BVH 서열은 론자(Lonza) pEE 벡터를 사용하여 BstEII 부위에서 사람 γ1 불변 영역에 이식된다. 수득되는 생성물은 마우스 리더 서열을 함유하고 이의 VH는 도 18A에 나타낸 방식으로 사람 CH1 서열에 연결되며, 여기서, ASTLGPSVFPLAPSSKSTSG(서열 7)은 사람 CH1 서열의 첫번째 부분을 나타낸다.
3G4 항체 CDR1-3의 경쇄의 가변 영역(Vκ)의 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열 3 및 서열 4로 나타낸다. 서열 3 및 서열 4는 다시 도 18B에 나타낸 바와 같은 마우스 리더 서열 및 고정 쇄 서열의 일부를 포함한다. 리더 서열은 서열 4의 1번 내지 22번 아미노산이며, 성숙한 단백질은 도 18B에서 화살표로 나타낸 바와 같이 시작한다. 충분한 상보성 결정 영역 서열 정보는 TVF를 종결하는 서열 일부까지의 성숙한 단백질의 서열에 포함되며, 이후 아미노산은 항원 결합에 필수적이지 않다. 그 자체로서, 핵산 서열내 BbsI 부위는 작용성 마우스 가변 영역을 제조하기 위한, 예를 들면, 사람 불변 영역상에 이식시키는데 사용하기 위한 편리한 부위로서 사용될 수 있다(도 18B).
실제로, 3G4-2BVL 서열은 론자 pEE 벡터를 사용하여 BbsI 부위에서 사람 κ 불변 영역에 이식된다. 수득되는 생성물은 마우스 리더 서열을 함유하며 이의 VL는 도 18B에 나타낸 방식으로 사람 CL1 서열에 연결되며, 여기서, IFPPSDEQLKSGTAS(서열 8)은 사람 κ 불변 영역 서열의 첫번째 부분을 나타낸다.
B. 3 G4 키메라 항체의 생성 및 특성화
쥐 상보성 결정 영역 및 사람 불변 영역을 함유하는 키메라 작제물을 생산하고(ch3G4) 필수적으로 원래의 쥐 항체와 동일하게 행동하는지를 입증한다.
쥐 3G4 항체를 사람-마우스 키메라 항체[캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Avanir(Xenerex) Biosciences 제조원)로 전환시켰다. 쥐 VH를 클로닝하고 론자 2BVH 벡터의 BstEII 부위에서 사람 γ1 불변 영역에 이식하였다. 쥐 Vκ를 클로닝하고 론자 2BVL 벡터의 BbsI 부위에서 사람 K 불변 영역에 이식하였다. 서열을 검증하였다. 전체 작제물을 CHO 세포내에서 발현시켜 정제하였다.
수득되는 ch3G4는 쥐 3G4가 인지질로 피복된 ELISA 플레이트에 결합하는 것과 같이 잘 결합하였다. 인지질의 패널에 대한 키메라 3G4의 시험관내 결합 프로파일을 도 21에 나타내며, 여기서, PS, PA, CL, PI 및 PG에 대한 결합은 유사한 것으로 밝혀졌다. 당해 결합은, 결합이 비가역적인 특이성의 대조군 항체를 사용하여 관측되지 않으므로, 항원-특이적이었다. 특정의 연구에서, 키메라 3G4 대 3G4 항체의 명백하게 더욱 큰 결합이 관측되었으며; 이는 제2 항체의 우수한 결합에 기인할 수 있다.
생체내에서, ch3G4는 종양 혈관 내피에 국재화하며 항 종양 효과를 발휘한다. 마우스에서 성장하는 MDA-MB-435 사람 유방암 세포에서 ch3G4의 항-종양 효과는 실시예 XI에 기술되어 있으며 도 8G에 나타낸다. 키메라 항체를 사용한 MDA-MB-435 종양을 지닌 마우스의 치료는 대조군과 대조되는 것으로써 종양 성장을 효과적으로 지연시켰다.
ch3G4의 국재화는 마우스에서 성장하고 있는 MDA-MB-435 사람 유방 암 세포에서 시험하였다. 마우스에 바이오티닐화된 ch3G4 또는 비가역적 특이성의 대조군 IgG를 정맥내 주사하였다. 1시간 후, 마우스를 마취시키고, 이들의 종양을 제거하여 동결시킨 단면을 절단하였다. 바이오티닐화된 시약을 우선 스트렙트아비딘-Cy2 접합체와 함께 항온처리하고, PBS속에서 세척한 후 MECA32 항체에 이어 FITC-태그처리된 제 2 항체와 항온처리하였다. Cy3(적색) 및 FITC(녹색) 형광성 각각에 대해 적절한 여과기를 사용하여 취한 단일 상을 디지탈 카메라로 찍어서 컴퓨터로 이전시켰다. 황색(합쳐진 녹색 및 적색 형광성의 생성물)을 입증하는 전환된 상을 메타뷰 소프트웨어(Metaview software)의 보조로 겹쳤다.
이러한 이중 염색 방법에서, 바이오티닐화된 단백질 및 혈관 내피는 적색 및 녹색에 의해 표지된다. 바이오티닐화된 단백질이 내피에 결합되는 경우, 전환된 상은 황색으로 보인다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 바이오티닐화된 ch3G4는 종양 혈관 내피에 결합하는데, 이는 염색 패턴이 MECA 32의 것과 함께 집중되기 때문이다.
실시예 XX
도세탁셀과의 배합 치료요법에서 3 G4 항체
본 실시예는 3G4 항체 및 화학치료 약물인 도세탁셀을 사용한 종양 치료용 배합 치료요법에 관한 것이다. 이러한 제제는 종양 혈관구조 내피 세포 및 종양 세포 대응물을 공격하도록 설계되며, 낮은 독성으로 상승적 치료를 가져온다. 당해 결과는, 이러한 배합 치료요법이 또한 현저히 증가된 치료 효능을 지님을 나타내었다.
A. Fc 도메인 중재된 항-종양 효과
3G4 항체를 시험관내에서 종양 세포에서의 억제 효과에 대해 시험하였다. 종양 세포에서 직접적인 억제 효과는 관측되지 않았다. 따라서, 3G4 항체의 항-종양 효과는 항체 중재된 식세포작용, ADCC, CDC 및 사이토킨 생성의 자극, 또는 배합된 이들 메카니즘과 같은 면역 효과기 작용의 Fc 도메인-중재된 증강을 포함한다.
대식세포에 의한 PS-양성 세포의 식세포작용에 있어서 3G4의 효과를 평가한다. 형광성 종양 세포를 H2O2로 처리하여 PS 노출을 유도하였다. 다음 처리된 세포와 처리되지 않은 세포를 수거하고 3G4 항체 또는 대조군 항체(BBG)와 접촉시켰다. 이후 마우스 골수 대식세포를 가하고, 형광성 종양 세포를 식세포작용하는 대식세포의 능력을 형광 현미경으로 분석하였다.
3G4는 대식세포에 의한 PS-양성 세포의 식세포작용을 3배이상 증가시킬 수 있음이 측정되었다(도 23). 이러한 발견은, 3G4 항체의 Fc 도메인이 항체의 항-종양 효과에 기여한다는 본 발명자들의 추론을 지지한다. 즉, Fc 도메인은 숙주 면역 효과기 작용을 활성화시키며, 이후, 항-종양 효과를 발휘한다. 따라서, 3G4 항체는 NK 세포의 세포분해 활성을 증진시켜서 더욱 효과적인 ADCC를 이끈다.
B. 내피 세포에서 PS 노출을 유도하는 도세탁셀
아임상 농도의 도세탁셀에 의한 내피세포에서의 PS 노출의 유도를 FACS 분석에 의해 시험관내에서 시험하였다. 사람 제대 동맥 내피 세포(HUVEC) 및 사람 미세혈관 내피 세포(HMVEC)를 10nM의 도세탁셀로 24시간 동안 처리하고 FACS로 시험하였다. 처리된 HUVEC 및 HMNVEC는 처리되지 않은 세포와 비교하여 3G4 결합에 있어 현저한 증가를 나타내었다(각각 도 24A 및 도 24B). 48시간 및 72 시간 동안의 도세탁셀 항온처리를 또한 수행하였다.
C. 종양 세포에서 PS 노출을 유도하는 도세탁셀
아임상 농도의 도세탁셀에 의한 PS 노출의 시험관내 유도를 종양 세포주의 패널을 사용하여 FACS 분석으로 시험하였다. 마우스 루이스 폐암 3LL, 마우스 결장 암종 콜로 26(Colo 26) 및 사람 유방암 MDA-MB-435 세포를 10nM의 도세탁셀로 24시간 동안 처리하고 FACS로 시험하였다. 시험한 모든 종양 세포주는 처리되지 않은 세포와 비교하여 3G4 결합에 있어 현저한 증가를 나타내었다(각각 도25A, 도25B 및 도25C). 48시간 및 72 시간동안의 도세탁셀 항온처리를 또한 수행하였다. 마우스 흑색종 B16 및 마우스 섬유아종 Meth A 종양 세포주를 추가로 시험하였으며, 처리되지 않은 세포와 비교하여 3G4 결합에 있어 현저한 증가를 나타내었다.
사람 유방암 MDA-MB-231 세포를 10nM의 도세탁셀로 24시간 동안 처리하고 키메라 3G4 항체(ch3G4) 또는 대조군, 사람 IgG와 항온처리하고 FACS로 분석하였다. 이 결과는, 항체 결합에 있어서의 현저한 증가가 항원-특이적이며 키메라 항체는 모 3G4 항체와 유사하게 작용함을 나타낸다(도 26).
D. 3 G4 및 도세탁셀을 사용한 상승적 종양 치료
본 발명자들은 내피세포 및 종양 세포를 도세탁셀로 아임상 농도에서 처리하면 3G4 결합이 현저하게 증가함을 보여주었다. 이들은, 또한 3G4 항체가 PS가 표면에 노출되어 있는 종양 세포의 대식세포-중재된 식세포작용을 촉진시킴을 나타낸다. 따라서, 도세탁셀에 의해 중재된 증가된 3G4 결합은 NK 세포의 분해 활성을 증가시켜 더욱 효과적인 ADCC를 이끄는 것과 같이, 3G4 항체의 Fc 도메인에 의해 중재된 다른 항-종양 효과 및 종양 세포의 식세포작용을 증강시킬 수 있다. 다른 것의 연구는 또한, 유방암 환자를 도세탁셀로 치료하면 혈청 IFN-γ, IL-2, IL-6 및 GM-CSF 사이토킨 수준에 있어서의 증가 및 NK 및 LAK 세포 활성의 증강을 가져옴을 나타낸다(참조: Tsavaris et al., 2002).
따라서, 3G4와 도세탁셀의 배합 치료요법의 항-종양 효과를 사람 MBA-MB-435 유방 암종을 지닌 SCID 마우스에서의 같은자리 모델에서 시험하였다. 같은자리 MDA-MB-435 사람 유방 종양을 지닌 마우스에 3G4 단독(100㎍/투여량), 도세탁셀 단독(10mg/kg) 또는 3G4와 배합된 도세탁셀(100㎍/투여량 및 10mg/kg, 각각)을 3주동안 1주당 3회씩 복강내 투여하였다. 치료는 종양 세포 이식후 6일째에 개시하였다.
당해 연구는, 3G4 및 도세탁셀의 배합 치료요법이 90%의 성장 억제를 가져옴을 나타내었다. 3G4 및 도세탁셀의 성장 억제는 3G4 단독(p<0.005) 및 도세탁셀 단독(p<0.01)보다 현저히 우수하였다.
E. 수지상 세포에 있어서 Fc γR에 대한 세포사멸성 종양 세포의 3 G4 표적화
3G4 및 도세탁셀로 치료한 마우스로부터의 종양은 대조군 종양과 비교하여 또한 비정상적인 양의 림파구를 함유하였다. 비록 이러한 현상이 종양 세포를 붕괴함으로써 면역 세포의 통상의 화학친화력을 나타낸다고 하더라도, 이는 또한 면역 효과기 세포에서 FcγR에 대한 Fc 결합을 통해 중재된 3G4에 의한 면역계의 활성화를 반영할 수 있다.
종양내 면역 세포 침윤물에서 3G4 및 도세탁셀 투여의 효과를 특성화하기 위해, 이러한 침윤물내에 존재하는 세포 유형을 동결시킨 단면 및/또는 종양 조직의 파라핀 단면을 대식구, 호중구, 과립구, NK 세포 및 활성화된 림프구(캘리포니아 샌디에고 소재의 Pharmingen 제조원)의 특이적인 마커에 대해 지시된 항체를 사용하여 면역염색함으로써 확인할 수 있다. 이러한 침윤물의 정도, 표현형 및 활성화 상태를 평가할 수 있다. IL-2 및 INF를 포함하는 면역 세포를 침윤시킴에 의한 사이토킨 생산을 또한 면역조직화학 기술을 통해 분석할 수 있다. 혈청 사이토킨 수준은 ELISA로 평가할 수 있으며 세포내 염색을 사용하여 사이토킨 생산에 관여하는 특이적인 세포 구획을 확인할 수 있다. 따라서, 종양 세포 증식 및 세포사멸에 있어서 침윤하는 면역 세포의 효과를 전신계적으로 평가할 수 있다.
앞서의 데이타 측면에서, 본 발명자들은 수지상 세포에서 Fc 감마 수용체(Fc(γ)R)에 대한 세포사멸성 종양 세포의 3G4-중재된 표적화에 의한 유방 암의 면역치료요법의 효능을 증진시키는 방법을 고려하고 있다. 효과적인 세포 및 체액성 면역 반응을 유발하는 효율적인 항원 표현(representation)은 종양 백신 및 면역치료요법의 개발에 중요하다. 수지상 세포(DC)는 종양 관련 항원에 대한 세포독성 T 림프구를 자극하는 가장 강력한 항원-전달 세포(APC)이다. 수지상 세포(DC)에 의한 종양 항원 표현의 개선은 더욱 강력한 종양 백신을 개발하도록 할 수 있다.
DC의 Fc(γ)R 수용체 중재된 내재화에 의한 항원성 표현은 액상 항원 세포흡수작용과 비교하여 1,000배 증진될 수 있다. 세포사멸성 종양 세포(ATC)는 수지상 세포 로딩을 위한 우수한 항원 공급원인데, 이는 다중 종양 특이적 항원(알려져 있거나 알려져 있지 않은 항원 둘다)은 순수한 T 세포에 표현되어 특정의 에피토프의 상실에 기인하여 덜 유사한 면역 이탈 변이체를 발생시킬 수 있기 때문이다. 동물 연구에서, ATC로 펄싱된 DC는 시험관내 및 생체내에서 강력한 항-종양 면역성을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 최근의 데이타는, ATC 단독이 어느정도 항-종양 면역성을 활성화시키는데 비효율적임을 입증하며, 이는 이들의 불충분한 흡수 및 DC 성숙을 유도하지 못하는 능력 때문이다.
최근 연구는 또한 항-종양 항체를 세포사멸성 종양 세포에 결합시킴에 의해 형성된 ATC-면역 복합체가 DC상에서 Fc(γ)R을 표적화할 수 있음을 입증한다. ATC 단독과 비교하여, ATC-면역 복합체는 DC에 의해 더욱 효율적으로 내재화되며, DC 활성화 및 성숙을 유도하는데 더욱 효과적이고, 더욱 중요하게는, ATC-면역 복합체는 MHC I 및 II-제한된 항원 표현 둘다를 현저히 증진시킴으로써, 강력한 항-종양 T 헬퍼 및 CTL 면역원성을 유도할 수 있었다.
따라서, 본 발명자는 체액성 및 세포성 항-종양 면역원성 둘다를 증가시키고, ATC계 DC 종양 백신의 효능을 증강시키기위해 본 발명의 항-PS 항체를 사용하는 것을 계획한다. PS는 세포사멸성 종양 세포의 공통적이고 가장 풍부한 특이적 마커이므로, 본 발명의 항체 패널, 특히 3G4는 ATC상에서 PS에 결합할 수 있다. 본 발명자는 이미, 3G4가 세포사멸성 종양 세포의 DC 흡수를 3G4-ATC 복합체의 Fc(γ)R 중재된 내재화를 통해 300%까지 증진시킬 수 있음을 입증하였다. Fc(γ)R을 통해 중재된 DC에 의한 ATC의 흡수를 증진시킴으로써, 3G4과 유사 항체는 MHC I 및 II 제한된 항원 표현 둘다를 크게 증진시킬 수 있고, 체액성 및 세포성 항-종양 면역원성을 유도하며, ATC계 DC 종양 백신의 효능을 증강시킬 수 있음은 명백하다. 이는 생체내에서 T h1, CTL 및 항체 반응의 유도시 3G4-ATC 면역 복합체를 사용하여 로딩된 DC의 효능을 확립하고, 생체내에서 3G4-ATC 면역 복합체를 사용하여 로딩한 DC의 면역화에 의해 유도된 항-종양 면역원성의 효능을 측정함으로써 입증할 수 있다.
실시예 XXI
생체내에서 CMV 감염을 치료하는 항- PS 항체
실시예 XII에 나타낸 시험관내 CMV에 대한 항-바이러스 효과에 이어서, 본 실시예는 CMV 바이러스인, mCMV의 쥐 버젼으로 감염시킨 마우스의 증진된 생존을 입증한다.
Balb/C 마우스(6주령, 그룹당 5마리)를 5 x 105 pfu의 mCMV RVG102로 복강내 감염시켰다. 당해 마우스를 3G4 항체(1mg/마우스), 또는 위에서 기술한 사람 -마우스 키메라 항체인, ch3G4(1mg/마우스)로 첫날 복강내 치료하였다. 치료하지 않은 마우스는 대조군으로 제공하였다. 당해 마우스를 이후 매 4일 마다 0.5mg/마우스의 항체 또는 키메라 항체를 26일째까지 치료하였다. 마우스를 감염시킨지 90일 경과 후 생존에 대해 모니터하였다.
3G4 항체의 모 형 및 키메라 형 둘다를 사용한 치료는 mCMV 감염된 마우스의 증가된 생존을 가져왔다. 3G4 또는 ch3G4로 치료한 마우스는, 단지 25%의 마우스만이 감염 후 생존하는 치료하지 않은 마우스와 비교하여, 각각 100% 및 80% 생존되었다(도 27).
실시예 XXII
생체내에서 CMV 감염을 치료하는 PE -결합 펩타이드 유도체
실시예 XVII에 나타낸 CMV에 대한 시험관내 항-바이러스 효과외에, 본 실시예는, 듀라마이신-바이오틴 유도체인, DLB가 mCMV로 감염된 마우스의 생존을 증가시킴을 입증한다.
Balb/C 마우스(6주령, 그룹당 5마리)를 5 x 105 pfu의 mCMV RVG102로 복강내 감염시켰다. 마우스에 1일째에 및 매 4일마다 20㎍/마우스의 듀라마이신 유도체, DLB를 복강내 치료하였다. 치료하지 않은 마우스는 대조군으로 제공하였다. 당해 마우스를 감염후 90일 후 생존에 대해 모니터하였다.
듀라마이신-바이오틴 유도체인, DLB를 사용한 치료는 mCMV-감염된 마우스의 생존을 증진시켰다. DLB로 치료한 마우스는, 단지 25%의 마우스만 감염후 생존하는 비처리 마우스와 비교하여, 100% 생존하였다(도 28).
실시예 XXIII
바이러스 감염된 세포에 결합하는 항- PS 항체
본 실시예는, 바이러스 감염이 세포 표면에서 PS 노출을 유도하며 항-PS 항체가 바이러스로 감염된 세포에 결합함을 나타낸다. 박시니아 바이러스로 감염된 세포는 FACS 분석에서 입증된 세포 표면에 대한 키메라 3G4 항체의 증가된 결합에 의해 밝혀진 바와 같이 PS-양성이 된다.
U937 세포를 2의 고 m.o.i에서 트립신처리한 박시니아 바이러스로 감염시켰다. 요약하면, 박시니아 바이러스를 동량의 0.25mg/ml의 트립신으로 30분 동안 37℃에서 처리하였다. 당해 바이러스를 총 0.5ml 용적으로 U937 세포에 가하였다. 1.5시간 후, 신선한 배지를 세포에 가하고 당해 세포를 T25 플라스크내에서 37℃로 2일간 항온처리하였다. 감염되지 않은 세포는 대조군으로서 제공하였다.
감염된 U937 세포 및 감염되지 않은 U937 세포를 주요 항체인, 키메라 3G4 항체(ch3G4) 또는 대조군으로서 사람 IgG(HIgG)로 염색하였다. 세포를 세척하고 정상 마우스 혈청으로 차단한 후 주요 항체로 45분 동안 빙상에서 염색하였다. 3회 세척 후, 세포를 1:400 희석의 염소 항-사람 FITC-접합된 제 2 항체로 염색하고 FACS스캔으로 분석하였다.
FACS 분석으로부터의 결과는, 감염되지 않은 U937 세포에서 수득한 결과와 비교하여, 박시니아 바이러스(도 29B, 우측(녹색) 피크)로 감염된 U-937 세포에서 ch3G4의 사용으로 현저한 이동이 존재함을 나타낸다. 따라서, 본 연구는, 박시니아 바이러스를 사용한 세포의 감염이 세포 표면에서 PS 노출을 이끌고 항-PS 항체인, 3G4의 키메라 버젼이 바이러스로 감염된 세포에 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 XXIV
피킨데 바이러스에 대한 항- PS 항체의 항-바이러스 효과
CMV 및 RSV에 대한 항-바이러스 효과 외에, 본 실시예는, 항-PS 항체가 시험관내에서 피킨데 바이러스 감염을 억제함을 추가로 나타낸다. 피킨데 바이러스는 사람에게 비-병원성이며, 라사 열에 대한 동물 모델로 사용되는 신세계 아레나바이러스이다.
베로 세포의 합치성 단층을 0.01pfu/세포의 낮은 m.o.i.에서 피킨데 바이러스로 감염시킨 후, 3G4 항체 또는 이형-매치된 대조군 항체인, GV39G로 처리하였다. 요약하면, 세포를 37℃에서 90분 동안 웰당 1ml의 총 용적으로 바이러스와 함께 항온처리하였다. 감염동안, 플레이트를 매 30분마다 온화하게 와동시켰다. 감염 후, 세포 상층액을 제거하고 DMEM/10% FBS/펜-스트렙을 각각의 웰에 가하였다(2ml/웰). 2일째에, 세포를 트립신을 사용하여 수거하고 바이오코트 챔버 슬라이드(Biocoat chamber slide)에 부착되도록 하였다. 이들을 고정시키고 폴리클로날 래빗 항-PIC 혈청으로 염색하였으며 이후, 제2 바이오틴 접합된 염소 항-래빗으로 염색하였다(제2 항체 단독은 도 30C에 나타낸 바와 같이 염색되지 않았다). 100개 세포 영역당 감염된 세포의 수를 계수하였다.
3G4로 처리한 세포에서, 바이러스는 암적색으로 염색된 단일 세포로 한정되며, 약 100개 세포내 약 1개의 수이다(도 30A) 이들은 아마도 CMV로 관찰되는 바와 같이, 바이러스에 의해 원래 감염된 세포일 수 있다(실시예 XII). 그러나, 대조군인, GV39G 항체로 처리한 세포에서, 당해 바이러스는 모든 세포에 확산되어 이를 감염시켰다(도 30B).
바이러스 복제의 이러한 억제 패턴은, 3G4를 사용하여 CMV-감염된 사람 섬유아세포를 치료하는 경우에 관측된 것과 유사하다. 따라서, 항-PS 항체, 3G4는 도 30D에서 정량화되는 바와 같이, 세포로부터 세포로 피킨데 바이러스의 확산을 효과적으로 방지한다.
실시예 XXV
PE -결합 펩타이드 유도체를 사용한 종양 치료
시험관내 및 생체내 둘다에서의 듀라마이신 유도체의 항-바이러스 효과에 이어, 본 실시예는, 듀라마이신 유도체의 종양 혈관구조로의 국재화 및 관련된 항-종양 효과를 입증한다.
A. 듀라마이신 - HuIgG 접합체를 사용한 종양 치료
사람 IgG(HIgG)를 우선 실시에 XV에 기술된 바와 같이 정제하였다. 정제된 HIgG를 SIAB 링커를 사용하여 듀라마이신에 연결시키고 수득되는 (D-SIAB)nHIgG 접합체를 정제하였다.
마우스 섬유아종 세포주 Meth A를 성장시키고, 대수기에서 수거하고 DPBS에 재현탁시켰다. 대략 106개의 MethA 종양 세포를 6 내지 8주령의 BALB/c 수컷 마우스의 등 중간에 피하 주사하였다. 이식후 5일째에, 마우스를 2개 그룹으로 무작위로 분리하였다(n=15). 10일째로부터 1개 그룹에 150㎍의 듀라마이신-HuIgG 접합체를 연속 2주동안 복강내 주사하였다. 다른 그룹은 대조군으로서 동일한 양의 HuIgG를 주사하였다. 종양 용적을 매주 2회 측정하고 식 1/2ab2(여기서, "a"는 종양의 장축이고 "b"는 종양의 단축이다)를 사용하여 계산하였다. 종양의 크기가 대략 1400mm3에 이르면 마우스를 참수시켰다.
듀라마이신-HIgG 접합체는, 사람 IgG 대조군과 비교하여, 150㎍/일의 투여량에서 BALB/c 마우스내 MethA 종양 성장을 억제하였다.
B. 종양 혈관구조에 국재화된 듀라마이신 - HuIgG 접합체
상기한 바와 동일한 MethA 마우스 모델을 사용하여, 종양 크기가 500mm3에 이르면 100㎕의 PBS중 100㎍의 (D-SIAB)nHIgG를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 동량의 사람 IgG를 대조군으로서 주사하였다. 4시간 후, 마우스를 마취시키고 정상 염수로 5분 동안 및 1% 파라포름알데하이드로 10분 동안 관주하였다. 종양 및 기타 주요 기관을 절재하고 액체 질소속에 동결시켰다. OCT속에 매봉한 후, 조직을 10㎛ 단면으로 냉동절단하고 실란화한 슬라이드에 두었다. 냉 아세톤으로 10분 동안 고정시킨 후, 슬라이드를 염소 항 사람 IgG로 표지된 퍼옥시다제로 염색하여 듀라마이신-HuIgG의 생분포를 검출하였다. Meca32 및 염소 항-랫트 IgG로 표지된 퍼옥시다제를 사용하여 조직의 혈액 혈관구조를 검출하였다.
당해 연구는, 듀라마이신-HIgG 접합체가 치료된 동물내 종양 혈관구조에 국재화함을 나타내었다.
실시예 XXVI
듀라마이신 접합체의 생분포 및 특성
본 실시예는, 시험관내 세포-비침투성 듀라마이신 유도체의 독성 결여, 생체내 투여된 듀라마이신 유도체의 생분포 및 대식세포에 의한 세포사멸성 세포의 식세포작용을 증가시키는 듀라마이신-항체 접합체의 능력을 입증한다.
A. 세포독성이 아닌 듀라마이신 - 바이오틴 접합체
본 발명의 듀라마이신 유도체 및 접합체를 모 듀라마이신 분자의 비 특이적 독성 효과를 최소화하도록 설계한다. 많은 예에서, 이는 듀라마이신을 세포 비침투성 그룹에 연결시킴에 의해 달성된다(실시예 XV).
바이오티닐화된 듀라마이신 작제물 DLB를 실시예 XV에 기술된 바와 같이 제조하였다. 개질되지 않은 듀라마이신 화합물 및 DLB를 MTT 검정을 사용하여 HUVEC에서 세포독성 효과에 대해 시험하였다. 개질되지 않은 듀라마이신은 투여량 의존적인 독성을 나타내지만, DLB는 비독성이었으며, 이는 처리되지 않은 대조군과 일치한다(도 32).
B. 폐에서 대식세포에 대한 듀라마이신 - 바이오틴 접합체의 국재화
사람 유방암 세포주 MDA-MB-435를 성장시키고, 대수기에서 수거하고 DPBS 속에 재현탁시켰다. 대략 107개 세포에 6 내지 8주령 암컷 가슴샘이 없는 누드 마우스(athymic nude mice)의 유방 지방 덩이내에 주사하였다. 100㎕의 PBS중 100㎍의 듀라마이신-바이오틴을 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 4시간 후, 마우스를 마취시키고 정상 염수로 5분 동안 및 1% 파라포름알데하이드로 10분 동안 관주시켰다. 심장, 폐, 간, 신장, 뇌, 장, 고환 및 비장을 포함하는 주요 기관을 절개하고 액체 질소속에 동결시켰다. OCT속에 매봉한 후, 조직을 10㎛ 단면으로 냉동절단하고 실란화된 슬라이드에 위치시켰다. 냉 아세톤속에 10분동안 고정시킨 후, 슬라이드를 스트렙트아비딘으로 표지된 Cy3으로 염색하여 듀라마이신-바이오틴 작제물의 생분포를 검출하였다. 염소 항 랫트 IgG로 표지된 Meca32 및 FITC를 사용하여 조직의 혈액 혈관구조를 검출하였다.
MDA-MB-435 종양을 지닌 누드 마우스내로 듀라마이신-바이오틴 접합체를 정맥내 주사하여 폐내 대식세포 및 종양 세포, 신장 세관내에 약물을 침착시킨다. 간에서는 최소한으로 침착되며 뇌, 장 및 고환에서는 검출가능하게 분포되지 않는다. 폐내 대식세포로의 국재화는 본 발명의 항-바이러스 양태에서 이용될 수 있다.
C. 세포사멸성 세포의 식세포작용을 증진시키는 듀라마이신 -항체 접합체
세포사멸성 세포의 식세포작용을 증가시키는 듀라마이신-항체 접합체(듀라마이신-C44, DuC44)의 능력은 이후 시험하였다.
대식세포를 마우스 골수로부터 분리하여 배양하였다. 분리, 배양 및 BM 대식세포의 자극에 사용된 배지는 2mM 글루타민, 0.37%(w/v) NaHCO3, 10%(v/v) 심장-불활성화된 FCS, 및 0.5ng/ml 마우스 GM-CSF를 함유하는 DMEM이었다. 골수 세포를 25-게이지 침을 통해 지시된 완전 배지의 분출을 사용하여 절개된 대퇴골로부터 무균적으로 플러싱시켰다. 이후 세포를 완전 배지 ml당 대략 3 x 105개 세포의 밀도로 조절하고 8개 웰 챔버 슬라이드내로 0.5ml 분취량속에 분포시켰다.
세포를 습윤화시킨 챔버내 5% CO2속에서 37℃로 1시간 동안 항온처리하여 대식세포가 부착 및 확산하도록 하였다. 부착하지 않은 세포를 5ml의 가온된 PBS를 각각의 웰에 가하여 제거하고, 플레이트를 적당하게 테이핑하여 부착되지 않은 세포를 재현탁시키고 슬라이드를 손으로 튀겨서 부착하지 않은 세포를 버림으로써 제거하였다. 세포를 37℃에서 7.5%(v/v) CO2 대기하에 5일 동안 유지시켰다. 완전 배지를 세포를 사용할 때까지 격일로 교환하였다.
다음 방법을 사용하여 형광성 세포 트레이서로 HL-60 표적 세포를 표지하였다. 10mM CFDA SE 스톡 용액을 90μL의 DMSO중 하나의 바이알 염료의 성분을 용해시키고 PBS 속에서 10μM로 희석시킴으로써 사용직전에 제조하였다. 원심분리를 사용하여 HL-60 세포 펠렛을 수득하고 상층액을 흡입제거하였다. 세포를 CFDA/PBS 속에 재현탁시키고 37℃에서 15분 동안 항온처리하였다. 샘플을 원심분리하고 상층액을 흡입제거하였다. 세포를 배지에 재현탁시키고 추가로 30분 동안 배양하였다. 세포 생존성 및 형광성은 95% 이상인 것으로 확인되었다.
당해 식세포작용 검정에서, 표지된 HL-60 세포를 UV 254nm에 5분 동안 노출시키고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하여 세포사멸을 유도하였다. 104개의 세포사멸성 HL-60 세포를 1시간 동안 대식세포와 함께 항온처리하였다. 듀라마이신-C44 접합체를 10㎍/ml의 농도로 포함시켰다. 동일한 농도의 마우스 항체 BBG3을 음성 대조군으로 사용하고, 3G4 항체를 또한 비교를 위해 포함시켰다. 훽스트 (Hoechst) 33342를 배지에 최종 45분내에 10㎍/ml의 농도로 가하였다.
슬라이드를 PBS로 3회 세척하고 4% 포름알데하이드속에 15분 동안 고정시켰다. 슬라이드를 랫트 항-마우스 CD11 항체(CD11은 대식세포 마커이다)로 염색하고, 0.2% 젤라틴속에 1시간 동안 희석시키고, 세척하고 텍사스 레드 표지된 염소 항-랫트 제2 항체로 염색하였다.
세포를 형광 현미경하에 분석하였다. 대식세포는 CD11 마커에 기인하여 적색 세포로 확인된다. 식세포작용처리된 세포사멸성 세포를 지닌 대식세포는 표적 세포내 형광 트레이서로 인해 녹색 세포로 확인된다. 적색 및 녹색 세포를 계수하고 식세포작용은 흡수에 대해 양성인 대식세포의 퍼센트로 정량화한다.
당해 연구는, 듀라마이신-항체 접합체인, DuC44가 대식세포에 의한 세포사멸성 HL-60 세포의 식세포작용을 증진시켰음을 나타낸다(도 33). 따라서, 듀라마이신 부위는 세포사멸성 세포의 표면에 결합하여, 대식세포에 의해 인식되는 접합체의 항체 부위가 돌출되도록 한다. 따라서, 듀라마이신-항체 접합체는 3G4 항체와 유사하게 작용하였다. 예측한 바와 같이, Fc 영역을 결여하고 있는 3G4 항체의 (Fab)2 단편은 상기 대조군 수준 이상의 식세포작용을 유발하지 않았다.
앞서의 연구는, 생체내 투여후 듀라마이신-바이오틴 접합체가 폐내 대식세포로 국재화됨을 나타내므로, 본 연구에서 나타낸 세포사멸성 세포의 대식세포-중재된 식세포작용의 자극은 폐 바이러스 감염 치료에서와 같은, 본 발명의 치료학적 용도에 있어 중요한 영향을 미친다.
본원에 기술되고 청구된 조성물 및 방법 모두는 본 기술의 측면에서 과도한 실험없이 제조될 수 있고 발휘될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태의 측면에서 기술되었다 할지라도, 당해 분야의 숙련가에게는 본 발명의 개념, 취지 및 영역을 벗어남이 없이 본원에 기술된 조성물과 방법, 및 방법의 단계들에 또는 단계들의 순서에 적용시킬 수 있다. 더욱 특정하게, 화학적으로 및 생리학적으로 관련된 특정의 제제가 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본원에 기술된 제제로 치환될 수 있음은 명백할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 명백한 이러한 유사한 치환 및 변형 모두는 첨부된 청구의 범위에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 취지, 영역 및 개념내에 있다.
참조문헌
하기 참조문헌들은, 이들이 예시적인 공정 또는 본원에 설정된 것에 대한 보충적인 다른 세부사항을 제공하는 정도로만, 본원에 참조로서 상세하게 인용된다.
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ATCC PTA-4545 20020710
SEQUENCE LISTING <110> The University of Texas System <120> Selected Antibodies and Duramycin Peptides Binding to Anionic Phospholipids and Aminophospholipids and Their Use in Treating Viral Infections and Cancer <130> 5-1998-067385-5 <140> PCT/US03/021925 <141> 2003-07-15 <150> 60/396,263 <151> 2002-07-15 <160> 9 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 519 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atgggatgga cctggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgag 60 gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gagaagcctg gcgcttcagt gaagctatcc 120 tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tacaacatga actgggtgaa acagagccat 180 ggaaagagcc ttgaatggat tggacatatt gatccttact atggtgatac ttcctacaac 240 cagaagttca ggggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcaaga gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgtaaa ggggggttac 360 tacgggcact ggtacttcga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctcagct 420 acaacaacag ccccatctgt ctatcccttg gtcccgggcg gatcccccgg gctgcaggaa 480 ttcgatatca agcttatcga taccgtcgac ctcgagggg 519 <210> 2 <211> 152 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Gly Trp Thr Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Lys Gly Gly Tyr Tyr Gly His Trp Tyr Phe Asp Val 115 120 125 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Thr Thr Thr Ala 130 135 140 Pro Ser Val Tyr Pro Leu Val Pro 145 150 <210> 3 <211> 435 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 atggacatga gggctcctgc acagattttg ggcttcttgt tgctcttgtt tccaggtacc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccttat ctgcctctct gggagaaaga 120 gtcagtctca cttgtcgggc aagtcaggac attggtagta gcttaaactg gcttcagcag 180 ggaccagatg gaactattaa acgcctgatc tacgccacat ccagtttaga ttctggtgtc 240 cccaaaaggt tcagtggcag taggtctggg tcagattatt ctctcaccat cagcagcctt 300 gagtctgaag attttgtaga ctattactgt ctacaatatg ttagttctcc tcccacgttc 360 ggtgctggga ccaagctgga gctgaaacgg gctgatgctg caccaactgt cttcatcttc 420 gggcggatcc cccgg 435 <210> 4 <211> 144 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Ile Leu Gly Phe Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Phe Pro Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Gly Ser Ser Leu Asn Trp Leu Gln Gln Gly Pro Asp Gly 50 55 60 Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 Tyr Val Ser Ser Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 115 120 125 Lys Arg Ala 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Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser 180 185 190 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr 195 200 205 Leu Gly Ile Thr Gly Leu Trp Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 210 215 220 Leu Ala Trp Asp Thr Ser Pro Arg Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala 245 250 255 Ala Glu Gln Lys Leu 260 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly 20 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Streptomyces cinnamoneus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(18) <223> Xaa = Abu <400> 9 Ala Lys Gln Ala Ala Ala Phe Gly Pro Phe Xaa Phe Val Ala Asp Gly 1 5 10 15 Asn Xaa Lys

Claims (45)

  1. 듀라마이신 펩타이드가 세포 비침투성 그룹에 공유결합으로 연결되어 있으며, 여기서 상기 세포 비침투성 그룹에 대한 상기 듀라마이신 펩타이드의 공유결합 연결은 정상 세포를 침투하여 비-특이적으로 독성이 되는 상기 듀라마이신의 능력을 실질적으로 억제함으로써 상기 듀라마이신 펩타이드의 천연 형태의 독성을 감소시키고; 여기서 상기 세포 비침투성 그룹은 불활성 담체, 극성 그룹, 또는 생리학적 pH에서 양성 또는 음성 전하를 갖는 그룹인, 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 세포 비침투성 그룹이 바이오틴, 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 카복실, 페놀, 4급 암모늄 이온, 아민, 당, 올리고당, 다당류, 아미노산, 펩타이드 또는 폴리펩타이드인 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 세포 비침투성 그룹이 불활성 담체인 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 불활성 담체가 알부민 또는 불활성 면역글로불린 담체 단백질인 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 불활성 면역글로불린 담체 단백질이 사람 IgG인 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민-결합 펩타이드는 리포좀 또는 나노입자 조성물로서 제형화되는 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 리포좀 또는 나노입자 조성물은 은밀화(stealthed)되거나 페길화(PEGylated)된 리포좀 조성물인 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민-결합 펩티드는 에어로졸 조성물로서 제형화되는 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드.
  9. 제1항에 있어서, 상기 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민-결합 펩티드는 추가의 치료제를 추가로 포함하는 조성물로서 제형화되는 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, 추가의 치료제가 항-혈관형성제, 항암제 또는 항-바이러스제인 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, 추가의 치료제가 도세탁셀, 파클리탁셀, 5-플루오로우라실, 겜시타빈, 이리노테칸, 시스플라틴 또는 카르보플라틴인 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드.
  12. 제10항에 있어서, 추가의 치료제가 뉴클레오사이드, 역전사효소 억제제 및 프로테아제 억제제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항-바이러스제인 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드.
  13. 제12항에 있어서, 항-바이러스제가 리바비린, 시도포비르 또는 AZT인 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드.
  14. 제1항에 따른 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드를 포함하는, 암을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 따른 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드를 포함하는, 바이러스 감염을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  16. 세포 비침투성 그룹에 공유결합으로 연결된 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드를 포함하며, 여기서 상기 PE-결합 펩타이드는 듀라마이신 펩타이드 또는 신나마이신 펩타이드이고, 여기서 상기 세포 비침투성 그룹에 대한 상기 PE-결합 펩타이드의 공유결합 연결은, 정상 세포를 침투하여 비-특이적으로 독성이 되는 상기 PE-결합 펩타이드의 능력을 실질적으로 억제함으로써 상기 PE-결합 펩타이드의 천연 형태의 독성을 감소시키고; 여기서 상기 세포 비침투성 그룹은 불활성 담체, 극성 그룹, 또는 생리학적 pH에서 양성 또는 음성 전하를 갖는 그룹인, 암을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, PE-결합 펩타이드가 듀라마이신 펩타이드인 약제학적 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 세포 비침투성 그룹이 바이오틴, 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 카복실, 페놀, 4급 암모늄 이온, 아민, 당, 올리고당, 다당류, 아미노산, 펩타이드 또는 폴리펩타이드인 약제학적 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 세포 비침투성 그룹이 불활성 담체인 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 불활성 담체가 알부민 또는 불활성 면역글로불린 담체 단백질인 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 불활성 면역글로불린 담체 단백질이 사람 IgG인 약제학적 조성물.
  22. 제16항에 있어서, 리포좀 또는 나노입자 조성물인 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 은밀화되거나 페길화된 리포좀 조성물인 약제학적 조성물.
  24. 제16항에 있어서, 에어로졸 조성물로서 제형화되는 약제학적 조성물.
  25. 제16항에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 추가의 치료제가 항-혈관형성제 또는 항암제인 약제학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 추가의 치료제가 도세탁셀, 파클리탁셀, 5-플루오로우라실, 겜시타빈, 이리노테칸, 시스플라틴 또는 카르보플라틴인 약제학적 조성물.
  28. 듀라마이신 펩타이드 또는 신나마이신 펩타이드가 세포 비침투성 그룹에 공유결합으로 연결된, 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타이드를 포함하며,
    여기서 상기 세포 비침투성 그룹에 대한 상기 PE-펩타이드의 공유결합 연결은 정상 세포를 침투하여 비-특이적으로 독성이 되는 상기 PE-결합 펩타이드의 능력을 실질적으로 억제함으로써 상기 PE-결합 펩타이드의 천연 형태의 독성을 감소시키고;
    여기서 상기 세포 비침투성 그룹은 불활성 담체, 극성 그룹, 또는 생리학적 pH에서 양성 또는 음성 전하를 갖는 그룹인, 아데노비리다에, 아레나비리다에, 아스트로비리다에, 비르나비리다에, 부니아비리다에, 칼리시비리다에, 시르코비리다에, 코로나비리다에, 필로비리다에, 플라비비리다에, 헤파드나비리다에, 헤르페스비리다에, 이리도비리다에, 오르토믹소비리다에, 파포바비리다에, 파라믹소비리다에, 파르보비리다에, 피코르나비리다에, 폭스비리다에, 레오비리다에, 레트로비리다에, 라브도비리다에 및 토가비리다에의 바이러스 과(virus family)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 바이러스에 의한 감염, 또는 후천성 면역결핍증(AIDS), 기관지염, 바이러스 폐렴, 닭 폭스, 뎅기열, 에볼라 출혈열, 생식 헤르페스, 한타바이러스 출혈열, 간염, 인플루엔자, 주닌 아르겐티니안 출혈열, 라싸 출혈열, 마큐포 출혈열, 홍역, 모노뉴클레오시스, 사이토메갈로바이러스(CMV) 질병, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 대상포진, 천연두, 황색 열, 웨스트 나일병(West Nile Disease), 웨스턴 말 뇌염, 폐렴, 급성 호흡기병, 위장염, 뇌염, 우두, 수막염, 수막뇌염, 베네쥬엘라 출혈열, 리프트 밸리열(Rift valley fever), 마르부르크 출혈열, 진드기매개 뇌염, 크리메안-콩고 출혈열 및 브라질리아 출혈열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 질병을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, PE-결합 펩타이드가 신나마이신 펩타이드인 약제학적 조성물.
  30. 제28항에 있어서, PE-결합 펩타이드가 듀라마이신 펩타이드인 약제학적 조성물.
  31. 제28항에 있어서, 세포 비침투성 그룹이 바이오틴, 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 카복실, 페놀, 4급 암모늄 이온, 아민, 당, 올리고당, 다당류, 아미노산, 펩타이드 또는 폴리펩타이드인 약제학적 조성물.
  32. 제28항에 있어서, 세포 비침투성 그룹이 불활성 담체인 약제학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 불활성 담체가 알부민 또는 불활성 면역글로불린 담체 단백질인 약제학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 불활성 면역글로불린 담체 단백질이 사람 IgG인 약제학적 조성물.
  35. 제28항에 있어서, 리포좀 또는 나노입자 조성물인 약제학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 은밀화되거나 페길화된 리포좀 조성물인 약제학적 조성물.
  37. 제28항에 있어서, 에어로졸 조성물로서 제형화되는 약제학적 조성물.
  38. 제28항에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 추가의 치료제가 항-바이러스제인 약제학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 항-바이러스제가 뉴클레오사이드, 역전사효소 억제제 및 프로테아제 억제제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 항-바이러스제가 리바비린, 시도포비르 또는 AZT인 약제학적 조성물.
  42. 제28항에 있어서, 바이러스 복제를 억제하기 위한 약제학적 조성물.
  43. 제28항에 있어서, 바이러스 확산을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
  44. 제28항에 있어서, 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡계 신시티얼 바이러스(RSV), 간염, 인플루엔자, 사람 면역결핍성 바이러스(HIV), 헤르페스, 파라믹소바이러스 또는 아레나바이러스 감염을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  45. 제28항에 있어서, 간염, 인플루엔자, 후천성 면역결핍증(AIDS), 바이러스 폐렴 또는 호흡기병 또는 라싸 열(Lassa fever)을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물.
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