TW201932493A - 不致顯著紅血球凝集的抗－ｃｄ４７抗體 - Google Patents

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Abstract

包括單株抗體、人類抗體、靈長類動物抗體、囓齒動物抗體、哺乳動物抗體、嵌合抗體、人類化抗體及CDR移植抗體在內之抗體以及其抗原結合片段及抗原結合衍生物結合至CD47蛋白，尤其人類CD47，調控，例如抑制、阻斷、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47之表現、活性及/或信號傳導，包括抑制CD47與SIRP α之相互作用；不引起人類紅血球之顯著血球凝集水準。該抗體可能不增強RBC之吞噬作用。

Description

不致顯著紅血球凝集的抗-CD47抗體
本揭示案係關於免疫生物學及疾病(包括癌症)領域。
CD47(分化簇47)亦稱整聯蛋白相關蛋白(IAP)，其係具有胺基末端免疫球蛋白結構域及羧基末端多重跨膜區之50kDa膜蛋白。該膜蛋白與多種配位體相互作用，該等配位體包括但不限於單調節蛋白α(SIRP α)、SIRP γ、整聯蛋白及血小板反應蛋白-1(TSP-1)。SIRP α主要在骨髓細胞上表現，該等骨髓細胞包括巨噬細胞、骨髓樹突細胞(DC)、粒細胞、肥大細胞以及此等細胞之前驅細胞，包括造血幹細胞。CD47/SIRP α相互作用傳遞「別吃我」之信號，從而阻止自體吞噬作用。
對患者腫瘤及匹配之鄰近正常(非腫瘤)組織之分析揭示CD47蛋白在癌細胞上過度表現，此有效地幫助癌細胞阻抑吞噬細胞之先天免疫監視及消除作用。已證實，阻斷CD47-SIRP α與抗CD47抗體之相互作用有效地在活體外誘導腫瘤細胞之吞噬作用，且有效地在活體內抑制各種血液腫瘤及實體腫瘤之生長。因此，CD47係癌症療法之經驗證標靶且需要其適當之拮抗劑來製備人類治療劑。
本揭示案提供識別且結合至CD47蛋白(尤其人類CD47)之抗體，包括單株抗體、人類抗體、靈長類動物抗體、囓齒動物抗體、哺乳動物抗體、嵌 合抗體、人類化抗體及CDR移植抗體以及其抗原結合片段及抗原結合衍生物。所揭示之抗體可調控，例如抑制、阻斷、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47之表現、活性及/或信號傳導，且此等抗體不引起人類紅血球之顯著血球凝集水準。所揭示之抗體、其片段及衍生物可調控，例如抑制、阻斷、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47與SIRP α(信號調節蛋白α)之間的相互作用。所揭示之抗體、其片段或衍生物可統稱為「本揭示案之抗CD47抗體」或「所揭示之抗CD47抗體」、「所揭示之抗體」及諸如此類。
所揭示之抗體可為分離之抗體，其包含至少一個抗體-抗原結合位點；該抗體結合人類CD47；抑制、阻斷、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47之表現、活性及/或信號傳導；且不引起細胞之顯著凝集。
在某些態樣中，提供編碼所揭示之抗CD47抗體之核酸構築體與核酸分子，包括載體。
在某些態樣中，提供包含所揭示之抗CD47抗體之醫藥組合物及套組。
在某些態樣中，揭示使用所揭示之抗CD47抗體、醫藥組合物及套組來治療癌症或其他腫瘤病狀、延遲癌症或其他腫瘤病狀之進展、預防癌症或其他腫瘤病狀復發或者減輕癌症或其他腫瘤病狀之症狀的方法；諸如治療血液惡性腫瘤及/或血液腫瘤，例如血液惡性腫瘤及/或血液腫瘤。在某些實施例中，所揭示之CD47抗體可用於治療CD47+腫瘤。作為非限制性實例，本文所述之抗CD47抗體用於治療非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、急性髓樣白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨 髓性白血病(CML)、多發性骨髓瘤(MM)、乳癌、卵巢癌、頭頸癌、膀胱癌、黑色素瘤、結腸直腸癌、胰臟癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤。實體腫瘤包括例如乳房腫瘤、卵巢腫瘤、肺腫瘤、胰臟腫瘤、前列腺腫瘤、黑色素瘤腫瘤、結腸直腸腫瘤、肺腫瘤、頭頸腫瘤、膀胱腫瘤、食道腫瘤、肝腫瘤及腎腫瘤。
在不限制本揭示案下，出於說明之目的，下面描述本揭示案之多個實施例。
項目1.一種包含至少一個抗體-抗原結合位點之抗CD47抗體，該抗體結合人類CD47，抑制、阻斷、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47之表現、活性及/或信號傳導，且不引起細胞之顯著凝集，其中該抗體係人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體、靈長類化抗體、雙特異性抗體、結合抗體、小模組化免疫藥物(Small Modular ImmunoPharmaceutical)、單鏈抗體、類駱駝抗體(cameloid antibody)、CDR移植抗體或其抗原結合片段或抗原結合功能變異體。
項目2.項目1之抗體，其中該抗體不引起人類紅血球之血球凝集。
項目3.前述項目中任一項之抗體，其中該抗CD47抗體阻斷人類CD47與人類信號調節蛋白α(SIRP α)之間的相互作用。
項目4.項目3之抗體，其中與不存在抗CD47抗體時CD47與SIRP α之間的相互作用水準相比，該抗體阻斷CD47與SIRP α之間的相互作用至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少95%或至少99%。
項目5.前述項目中任一項之抗體，其中小於顯著凝集水準係在抗 CD47抗體B6H12存在下之細胞凝集水準。
項目6.前述項目中任一項之抗體，其中在該抗體存在下之細胞凝集水準與在抗CD47抗體B6H12存在下之細胞凝集水準相比降低至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%。
項目7.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體在抗體量介於約0.3μg/ml至約200μg/ml之間時不引起細胞之顯著細胞凝集水準。
項目8.項目1至6中任一項之抗體，其中該抗體在抗體濃度介於約100μg/ml與約200μg/ml之間時不引起細胞之顯著凝集水準。
項目9.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體具有強效之抗腫瘤活性。
項目10.項目9之抗體，其中該強效之抗腫瘤活性係由在該抗體存在下巨噬細胞吞噬腫瘤細胞之能力與抗CD47抗體B6H12存在下巨噬細胞吞噬腫瘤細胞之能力相比增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%來衡量。
項目11.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體不促進CD47陽性細胞株之聚集。
項目12.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體包含選自SEQ ID NO：349、351、353、355、357、359、361-373、380-383、388-392之可變重鏈以及選自SEQ ID NO：350、352、354、356、358、360、374-379、384-387及393-396之可變輕鏈。
項目13.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：349、351、353、355、357、359、361-373、380-383、388-392中之一者示出之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致之可變重鏈，以及與SEQ ID NO：350、352、354、356、358、360、374-379、384-387及393-396中之一者示出之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致之可變輕鏈。
項目14.項目1至2中任一項或項目5至13中任一項之抗體，其中在該抗體存在下CD47之表現或活性與不存在該抗體時CD47表現或活性之水準相比降低至少50%、55%、60%、75%、80%、85%或90%。
項目15.項目14之抗體，其中在該抗體存在下CD47之表現或活性與不存在該抗體時CD47表現或活性之水準相比降低至少95%、96%、97%、98%、99%或100%。
項目16.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體係IgG同型。
項目17.前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體包含在胺基酸Asn297處經修飾之恆定區。
項目18.項目17之抗體，其中該抗體包含具有N297A之胺基酸修飾之恆定區。
項目19.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體包含在胺基酸Leu235或Leu234處經修飾之恆定區。
項目20.項目19之抗體，其中該恆定區具有Leu235Glu(L235E)或Leu235Ala(L235A)之胺基酸修飾，及/或Leu234Ala(L234A)之胺基酸修飾。
項目21.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體包含在胺基酸Arg435處經修飾之人類IgG3恆定區。
項目22.項目21之抗體，其中該人類IgG3恆定區具有Arg435His(R435H)之胺基酸修飾。
項目23.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體包含在鉸鏈區內經修飾以防止或減少鏈交換的人類IgG4恆定區。
項目24.項目23之抗體，其中該抗體包含具有Ser228Pro(S228P)之胺基酸修飾之人類IgG4恆定區。
項目25.項目23或項目24之抗體，其中該人類IgG4恆定區進一步在胺基酸235處經修飾。
項目26.項目25之抗體，其中該人類IgG4恆定區具有Leu235Glu(L235E)之胺基酸修飾。
項目27.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體包含經修飾以增強FcRn結合之人類IgG恆定區，其中該人類IgG恆定區具有下列之一或多種胺基酸修飾：Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu、Met428Leu或Asn434Ser(M252Y、S254T、T256E、M428L或N434S)。
項目28.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體包含經修飾以改變抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)之人類IgG恆定區。
項目29.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體包含經修飾以誘導異源二聚化之人類IgG恆定區，其中該抗體具有T366W或T366S之胺基酸修飾及/或L368A或Y407V、S354C或Y349C之胺基酸修飾。
項目30.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體係具有選自由以下組成之群的可變重鏈區(VH)及/或可變輕(VL)鏈區之人類化抗體或人類抗體：SEQ ID NO：366、367、368、369、373、377、378、379、381、382、383、385、386、387、399、400、401、402或403。
項目31.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體係具有與選自由以下組成之群中之一者示出之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈區(VH)及/或可變輕(VL)鏈區之人類化抗體或人類抗體：SEQ ID NO：366-373、375、377-379、381-383、385、389-392、394-396、399-403。
項目32.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體係人類化抗體。
項目33.前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體係人類抗體。
項目34.一種載體，其包含編碼項目1至33中任一項之抗體之核酸。
項目35.一種載體，其包含：編碼與選自由SEQ ID NO：337-348、413-421組成之群之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多(包括100%)一致的抗體之重鏈區(VH)及/或抗體之可變輕(VL)鏈區之核酸。
項目36.一種包含項目34或項目35之載體之原核細胞、酵母細胞、植物細胞或哺乳動物細胞株，其中該細胞表現項目1至33中任一項之抗體。
項目37.一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含項目1至33中任一項之抗體以及醫藥學上可接受之賦形劑。
項目38.一種治療患有癌症或其他腫瘤病狀之人類患者的癌症或其他腫瘤病狀、延遲該癌症或其他腫瘤病狀之進展、預防該癌症或其他腫瘤病狀復發或者減輕該癌症或其他腫瘤病狀之症狀的方法，其包括向該患者投與治療有效量之包含至少一個抗體-抗原結合位點之抗體，該抗體結合人類CD47，抑制、阻斷、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47之表現、活性及/或信號傳導，且不引起細胞之顯著凝集，或者向該患者投與治療有效量之包含該抗體及醫藥賦形劑之醫藥組合物。
項目39.項目38之方法，其中該抗體係根據項目1至33中任一項之抗體。
項目40.項目38之方法，其中該醫藥組合物係項目37之醫藥組合物。
項目41.項目38至40中任一項之方法，其中該癌症或其他腫瘤病狀係CD47+腫瘤。
項目42.項目38至41中任一項之方法，其中該癌症或其他腫瘤病狀係選自由以下組成之群：非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、急性髓樣白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)及多發性骨髓瘤(MM)。
項目43.項目38至41中任一項之方法，其中該癌症或其他腫瘤病狀係選自由以下組成之群：乳癌、卵巢癌、頭頸癌、膀胱癌、黑色素瘤、結腸直腸癌、胰臟癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、乳房腫瘤、卵巢腫瘤、肺腫瘤、胰臟腫瘤、前列腺腫瘤、黑色素瘤腫瘤、結腸直腸腫瘤、肺腫瘤、頭頸腫瘤、膀胱腫瘤、食道腫瘤、肝腫瘤及腎腫瘤。
項目44.項目38至41中任一項之方法，其中該癌症或其他腫瘤病狀係血液癌症。
項目45.項目44之方法，其中該血液癌症係白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
項目46.項目44之方法，其中該血液癌症為選自由以下組成之群之白血病：急性淋巴球性白血病(ALL)、急性髓樣白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓增生性病症/贅瘤(MPDS)及脊髓發育不良症候群。
項目47.項目44之方法，其中該血液癌症為選自由以下組成之群之淋巴瘤：霍奇金氏淋巴瘤、惰性及侵襲性非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)及濾泡性淋巴瘤(小細胞及大細胞)。
項目48.項目44之方法，其中該血液癌症為選自由以下組成之群之骨髓瘤：多發性骨髓瘤(MM)、巨細胞性骨髓瘤、重鏈骨髓瘤，以及輕鏈骨髓瘤或本瓊氏骨髓瘤(Bence-Jones myeloma)。
項目49.項目38至48中任一項之方法，其進一步包括向該患者投與一或多種額外藥劑。
項目50.項目49之方法，其中該額外藥劑係治療劑。
項目51.項目50之方法，其中該治療劑係抗癌劑。
項目52.前述項目中任一項之抗體，其中該抗體包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，該重鏈可變結構域包含i.重鏈CDR1，該重鏈CDR1包含選自由SEQ ID NO：49、51、53、55、57、59、 62-65、86-87組成之群之胺基酸序列；ii.重鏈CDR2，該重鏈CDR2包含選自由SEQ ID NO：145、147、149、151、153、155、158-161、182-183組成之群之胺基酸序列；及iii.重鏈CDR3，該重鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO：241、243、245、247、249、251、254-257、278-279組成之群之胺基酸序列，以及(b)輕鏈可變結構域(VL)，該輕鏈可變結構域分別包含i.輕鏈CDR1，該輕鏈CDR1包含選自由SEQ ID NO：50、52、54、56、58、60、76-79組成之群之胺基酸序列；ii.輕鏈CDR2，該輕鏈CDR2包含選自由SEQ ID NO：146、148、150、152、154、156、172-175組成之群之胺基酸序列；以及iii.輕鏈CDR3，該輕鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO：242、244、246、248、250、252、268-271組成之群之胺基酸序列。
項目53.項目52之抗體，其中該抗體包含下列中之任一項：(1)VH包含分別具有SEQ ID NO：49、145及241之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：50、146及242之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(2)VH包含分別具有SEQ ID NO：51、147及243之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：52、148及244之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(3)VH包含分別具有SEQ ID NO：53、149及245之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：54、150及246之胺基酸序列之 輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(4)VH包含分別具有SEQ ID NO：55、151及247之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：56、152及248之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(5)VH包含分別具有SEQ ID NO：57、153及249之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：58、154及250之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(6)VH包含分別具有SEQ ID NO：59、155及251之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：60、156及252之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(7)VH包含分別具有SEQ ID NO：62、158及254之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：76、172及268之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(8)VH包含分別具有SEQ ID NO：63、159及255之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：77、173及269之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(9)VH包含分別具有SEQ ID NO：64、160及256之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：78、174及270之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(10)VH包含分別具有SEQ ID NO：65、161及257之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：79、175及271之胺基酸序列之 輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(11)VH包含分別具有SEQ ID NO：65、161及257之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：76、172及268之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(12)VH包含分別具有SEQ ID NO：86、182及278之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：56、152及248之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；且(13)VH包含分別具有SEQ ID NO：87、183及279之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：56、152及248之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
根據本發明之此等態樣及其他態樣提供許多其他態樣。根據以下實施方式與所附申請專利範圍，本發明之其他特徵及其他態樣將變得更加明顯。
圖1A係描繪藉由ELISA之CD47蛋白與經純化鼠類抗體中之一些之結合的一系列圖。圖1B係顯示抗體結合Raji細胞上之CD47之一系列圖(圖1B)。2D3用作陽性對照。
圖2係顯示經純化鼠類抗體實現之RBC血球凝集之圖(圖2A及圖2B)。市售B6H12抗體及2D3分別用作陽性對照及陰性對照。
圖3係描繪如藉由流動式細胞量測術所評估之鼠類抗體結合CHO-K1/huCD47細胞株上之CD47的一系列圖。CHO-K1/huCD47係過度表現人類CD47蛋白之經工程改造之細胞株。
圖4係描繪如藉由流動式細胞量測術所評估之鼠類CD47抗體結合CHO-K1/cyno CD47細胞株上之CD47的一系列圖(圖4A及圖4B)。CHO-K1/cyno CD47係過度表現食蟹猴(cyno)CD47之經工程改造之細胞株。
圖5係描繪如藉由表面電漿子共振(SPR)所評估之CD47-his蛋白與經純化鼠類CD47抗體之結合的一系列圖。
圖6係描繪使用CHO-K1/huCD47細胞株，藉由流動式細胞量測術之鼠類CD47抗體阻斷SIRP α之能力的一系列圖。B6H12用作陽性對照。
圖7係描繪鼠類CD47抗體促進人類單核細胞衍生之巨噬細胞(MDM)對人類腫瘤細胞株CCRF-CEM之吞噬作用的能力的一系列圖(圖7A及圖7B)。在實驗中使用CCRF-CEM細胞作為CD47靶細胞株。B6H12用作陽性對照。
圖8係描繪如藉由流動式細胞量測術所評估之鼠類CD47抗體結合紅血球上之CD47的一系列圖。B6H12用作陽性對照。
圖9係描繪鼠類CD47抗體促進人類單核細胞衍生之巨噬細胞(MDM)對人類紅血球(RBC)之吞噬作用的能力的一系列圖。所有鼠類抗體均顯示出明顯之RBC吞噬活性。B6H12用作陽性對照。
圖10係顯示嵌合抗體無RBC血球凝集作用之圖。
圖11係描繪嵌合CD47抗體促進人類單核細胞衍生之巨噬細胞(MDM)對人類腫瘤細胞株CCRF-CEM之吞噬作用的能力的一系列圖。
圖12係顯示人類化108VH4.M4_VL1.M1之IgG1、IgG2及IgG4PE同型無RBC血球凝集作用之圖。
圖13係描繪如藉由SPR所評估之CD47-his蛋白與人類化 108VH4.M4_VL1.M1之IgG1、IgG2及IgG4PE同型結合的一系列圖。鼠類抗CD47抗體108C10A6用作陽性對照。
圖14係描繪如藉由流動式細胞量測術所評估之人類化108VH4.M4_VL1.M1之IgG1、IgG2及IgG4PE同型結合CHO-K1/huCD47細胞株上之CD47的一系列圖。
圖15係描繪如藉由流動式細胞量測術所評估之人類化108VH4.M4_VL1.M1之IgG1、IgG2及IgG4PE同型與RBC之結合的一系列圖。
圖16係描繪如藉由流動式細胞量測術所評估之人類化108VH4.M4_VL1.M1之IgG1、IgG2及IgG4PE同型與CHO-K1/cynoCD47之結合的一系列圖。
圖17係描繪使用CHO-K1/huCD47細胞株，藉由流動式細胞量測術之人類化108VH4.M4_VL1.M1之IgG1、IgG2及IgG4PE同型阻斷SIRP α之能力的一系列圖。
圖18係描繪人類化108VH4.M4_VL1.M1之IgG1、IgG2及IgG4PE同型促進人類MDM對人類腫瘤細胞株CCRF-CEM之吞噬作用的能力的一系列圖。
圖19係描繪人類化108VH4.M4_VL1.M1之IgG1、IgG2及IgG4PE同型促進人類MDM對人類腫瘤細胞株Raji之吞噬作用的能力的一系列圖。
圖20係描繪人類化108VH4.M4_VL1.M1之IgG1、IgG2及IgG4PE同型促進人類MDM對RBC之吞噬作用的能力的一系列圖。
圖21係顯示人類化108VH4.M4_VL1.M1之IgG1、IgG2及IgG4PE同型連同鼠類B6H12抗體在Raji腫瘤模型中之活體內抗腫瘤功效的圖。在此模型中， 用10mg/kg抗體劑量每週三次對小鼠進行治療。
圖22係顯示人類化108VH4.M4_VL1.M1之IgG1、IgG2及IgG4PE同型在小鼠模型中之藥物動力學之圖。藥物動力學參數列於表2中。
圖23係顯示人類化108VH4.M4_VL1.M1之IgG4PE同型在SHP-77腫瘤模型中之活體內抗腫瘤功效之圖。在此模型中，用10mg/kg抗體劑量每週三次對小鼠進行治療。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2018年1月24日申請之國際專利申請案第PCT/CN2018/074055號之優先權權益，該等專利申請案之內容以引用方式整體併入本文。
序列表之併入
本申請案包含序列表，該序列表已以ASCII格式採用電子方式提交，且特此以引用方式整體併入。於2018年1月23日創建之該ASCII複本命名為5200-002P1_SL.txt且大小為223,367位元組。
如本文所用，術語CD47、整聯蛋白相關蛋白(IAP)、卵巢癌抗原OA3、Rh相關抗原及MER6係同義詞且可互換使用。
術語紅血球(red blood cell，RBC)及紅血球(erythrocyte)係同義詞且在本文中可互換使用。
術語凝集係指細胞聚集，而術語血球凝集則係指一種特定細胞亞群(亦即紅血球)聚集。因此，血球凝集係凝集之一種類型。
抗體係指包含免疫球蛋白之結構特徵及功能特徵，尤其抗原結合特徵之多肽(例如四聚體多肽或單鏈多肽)。通常，人類抗體包含兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈。每條鏈均包含可變區。
如本文所用，術語「抗體」或「抗體分子」係指包含來自免疫球蛋白重鏈可變區之足夠序列及/或來自免疫球蛋白輕鏈可變區之足夠序列以便特異性結合至抗原的多肽或多肽組合。該術語包括全長抗體及其片段，例如Fab片段、F(ab’)片段或F(ab’)2片段。通常，抗體分子包含重鏈CDR1序列、CDR2序列及CDR3序列，以及輕鏈CDR1序列、CDR2序列及CDR3序列。抗體分子包括人類抗體、人類化抗體、CDR移植抗體及其抗原結合片段。
CDR移植抗體係藉由重組DNA技術製備，使得蛋白質或多肽包含抗體之CDR且仍然結合至抗原之抗體。CDR移植抗體在結構及胺基酸序列上與CDR所源自之抗體不一致。
在某些實施例中，抗體分子包括包含至少一個免疫球蛋白可變區區段，例如提供免疫球蛋白可變結構域之胺基酸序列或免疫球蛋白可變結構域序列的蛋白質。術語「抗體」包括例如多株抗體、單株抗體、嵌合化或嵌合抗體、人類化抗體、靈長類化抗體、去免疫化抗體及完全人類抗體。抗體可在多種物種中之任一種中製備或來源於其，例如哺乳動物，諸如人類、非人靈長類動物(例如猩猩、狒狒或黑猩猩)、馬、牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、兔、豚鼠、沙鼠、倉鼠、大鼠及小鼠。抗體可為純化之抗體或重組抗體。抗體亦可為含有至少一個免疫球蛋白結構域之經工程改造之蛋白或抗體樣蛋白(例如融合蛋白)。經工程改造之蛋白或抗體樣蛋白亦可為雙特異性抗體或三特異性抗體，或者二聚體、 三聚體或多聚體抗體，或者雙抗體(diabody)、DVD-Ig、CODV-Ig、Affibody®或Nanobody®。
如本文所用，術語抗體或抗體分子包括完整之單株抗體、多株抗體、單域抗體(例如鯊魚單域抗體(例如IgNAR或其片段))、由至少兩種完整之抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及抗體片段，只要抗體片段表現出所需之生物活性即可。因此，術語「抗體」包括功能變異體。
抗體或抗體分子可來源於哺乳動物，例如囓齒動物(例如小鼠或大鼠)、馬、豬或山羊。在某些實施例中，抗體或抗體分子使用重組細胞產生。在某些實施例中，抗體或抗體分子係攜帶人類恆定區結構域及/或可變區結構域之嵌合抗體，例如來自小鼠、大鼠、馬、豬或其他物種之嵌合抗體。
合適抗體(包括功能變異體)包括但不限於單株抗體、單特異性抗體、多株抗體、多特異性抗體、人類抗體、靈長類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人類化抗體、結合抗體(例如與其他蛋白質、放射性標記或細胞毒素結合或融合之抗體)、小模組化免疫藥物(「SMIP」)、單鏈抗體、類駱駝抗體，以及抗體片段。
在某些實施例中，抗體分子係人類化抗體。人類化抗體係指包含人類構架區及來自非人類(例如小鼠或大鼠)免疫球蛋白之一或多個CDR之免疫球蛋白。提供CDR之免疫球蛋白通常稱為「供體」，而提供構架之人類免疫球蛋白通常稱為「受體」，但在多個實施例中，未暗示來源或過程限制。通常，人類化抗體包含人類化輕鏈免疫球蛋白及人類化重鏈免疫球蛋白。
抗體分子可包含重(H)鏈可變區(本文中縮寫為VH)及輕(L)鏈可變區 (本文中縮寫為VL)。抗體可包含兩個重(H)鏈可變區及兩個輕(L)鏈可變區，或者其抗體結合片段。免疫球蛋白之輕鏈可為κ或λ類型。抗體分子可經醣基化。
抗體分子之VH或VL鏈亦可包括重鏈或輕鏈恆定區之全部或一部分，從而分別形成免疫球蛋白之重鏈或輕鏈。抗體分子可為兩條免疫球蛋白重鏈及兩條免疫球蛋白輕鏈之典型四聚體，其中兩條重鏈視情況由至少一個二硫鍵連接，且每對重鏈及輕鏈由二硫鍵連接。抗體分子亦可包含重(或輕)鏈免疫球蛋白可變區區段中之一者或兩者。如本文所用，術語「重(或輕)鏈免疫球蛋白可變區區段」係指可結合其抗原之完整重(或輕)鏈免疫球蛋白可變區或其片段。重鏈或輕鏈區段結合抗原之能力用分別與輕鏈或重鏈配對之區段量測。在某些實施例中，小於全長可變區之重鏈或輕鏈區段在與適當鏈配對時，結合親和力可為全長鏈分別與輕鏈或重鏈配對時觀察到之親和力的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。
可變重鏈區(VH)及可變輕鏈區(VL)可進一步細分為高變區(稱為「互補決定區」(CDR))及散佈在其間之較保守區域(稱為「構架區」(FR))。人類抗體具有三個VH CDR及三個VL CDR，其由構架區FR1至FR4隔開。已精確定義FR及CDR之範圍(Kabat,E.A.等人，(1991)SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版物編號91-3242；以及Chothia,C.等人，(1987)J.MOL.BIOL.196：901-917)。每個VH及VL通常由三個CDR及四個FR構成，按以下順序自胺基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。
抗體分子可具有重鏈恆定區，該重鏈恆定區選自例如IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE之重鏈恆定區；尤其選自例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之(例如人類)重鏈恆定區。抗體分子可具有選自例如κ或λ(例如人類)輕鏈恆定區之輕鏈恆定區。
抗體之恆定區可改變，例如突變，以改變抗體之性質(例如增加或減少下列中之一或多者：Fc受體結合、抗體醣基化、半胱胺酸殘基之數量、效應細胞功能及/或補體功能)。在某些實施例中，抗體具有效應功能且可固定補體。在其他實施例中，抗體不募集效應細胞或固定補體。在其他實施例中，抗體結合Fc受體之能力下降，或無結合Fc受體之能力。舉例而言，抗體為不支持與Fc受體結合之同型或亞型、片段或其他突變體，例如其具有誘變或缺失之Fc受體結合區。
在某些實施例中，本文所述之抗CD47抗體分子包含IgG4恆定區。在一些另外之實施例中，IgG4恆定區係野生型恆定區。在其他實施例中，IgG4恆定區包含突變，例如根據EU編號(Kabat,E.A.等人，出處同上)之S228P及L235E中之一種或兩種。在一些實施例中，本文所述之抗CD47抗體分子包含IgG1恆定區。
本文所揭示之組合物及方法涵蓋具有指定序列或與其實質上一致或相似之序列(例如與指定序列至少85%、90%、95%或更多一致之序列)的多肽與核酸。
在胺基酸序列之語境中，如本文所用之術語「實質上一致」係指第一胺基酸序列含有之足夠或最小數量之胺基酸殘基i)與第二胺基酸序列中之比對胺基酸殘基一致，或ii)係第二胺基酸序列中之比對胺基酸殘基之保守性取 代，使得該第一胺基酸序列及該第二胺基酸序列可具有共同結構域及/或共同功能活性。例如，含有共同結構域，且與參考序列(例如本文所提供之序列)具有至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
在核苷酸序列之語境中，如本文所用之術語「實質上一致」係指第一核酸序列含有之足夠或最小數量之核苷酸與第二核酸序列中之比對核苷酸相同，使得該第一核苷酸序列及第二核苷酸序列編碼具有共同功能活性之多肽或者編碼共同結構多肽結構域或共同功能多肽活性。例如，與參考序列(例如本文所提供之序列)具有至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列。
術語「功能變異體」係指具有與天然存在之序列實質上一致之胺基酸序列，或由實質上一致之核苷酸序列編碼，且具有天然存在之序列之一或多種活性的多肽。
兩個序列之間的一致性百分比係在考慮對兩個序列進行最佳比對需要引入之空位數目及每個空位長度下，該等序列共有之一致位置之數目的函數。
對序列之比較及確定兩個序列之間的一致性百分比可使用數學算法來完成。在一些實施例中，使用Needleman及Wunsch((1970)J.MOL.BIOL.48：444-453)算法來確定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比，該算法已併入GCG套裝軟體(可自http：//www.gcg.com獲得)內之GAP程式中，該程式使用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣，空位權重為16、14、12、10、8、6或4，長度權重為1、2、3、4、5或6。在其他實施例中，使用GCG套裝軟體(可自http：//www.gcg.com 獲得)內之GAP程式確定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比，該程式使用NWSgapdna.CMP矩陣，空位權重為40、50、60、70或80，長度權重為1、2、3、4、5或6。一組尤其較佳之參數(除非另外指明，否則應當使用之一組參數)係Blosum 62評分矩陣，其空位罰分為12，空位延伸罰分為4且移碼空位罰分為5。
兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間的一致性百分比可使用E.Meyers及W.Miller((1989)CABIOS 4：11-17)之算法確定，該算法已經併入ALIGN程式(版本2.0)中，該程式使用PAM120殘基權重表，空位長度罰分為12且空位罰分為4。
應當理解，本文所揭示之分子可具有對其功能無實質性影響之額外保守或非必需胺基酸取代。
術語「抗體」亦包括「抗原結合片段」及「抗體片段」或諸如此類，例如全長抗體之保留特異性結合至目標靶抗原之能力的一或多個片段。涵蓋在術語全長抗體之「抗原結合片段」內的抗原結合片段之實例包括(i)Fab片段，它係由VL、VH、CL及CH1四個結構域組成之單價片段；(ii)F(ab’)或F(ab’)2片段，它係包括由鉸鏈區處之二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH結構域及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL結構域及VH結構域組成之Fv片段；(v)由抗體單臂之VL結構域及VH結構域組成之scFv，該兩個結構域經由多肽連接子連接在一起以產生單鏈Fv(scFv)；(vi)dAb片段(Ward等人，(1989)NATURE 341：544-546)，該片段由VH結構域組成；以及(vii)保留功能之分離之互補決定區(CDR)。
抗體片段或抗原結合片段包括例如單鏈抗體、單鏈Fv片段(scFv)、Fd片段、Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。scFv片段係單條多肽鏈，它包 括scFv所源自之抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區兩者。此外，胞內抗體、微型抗體、三抗體及雙抗體亦包括在抗體之定義中，且適合在本文所述之方法中使用。參見例如Todorovska等人，(2001)J Immunol Methods 248(1)：47-66；Hudson及Kortt(1999)J Immunol Methods 231(1)：177-189；Poljak(1994)Structure 2(12)：1121-1123。抗原結合片段亦可包括重鏈多肽之可變區及輕鏈多肽之可變區。因此，抗原結合片段可包含抗體之輕鏈多肽及重鏈多肽兩者之CDR。
術語「抗體片段」亦可包括例如單域抗體，諸如駱駝單域抗體。參見例如Muyldermans等人，(2001)Trends Biochem Sci 26：230-235；PCT申請公開案第WO 94/04678號及第WO 94/25591號；以及美國專利第6,005,079號。術語「抗體片段」亦包括含有兩個經修飾以便形成單域抗體之VH結構域的單域抗體。
術語「免疫球蛋白」包括可在生物化學上區分之各種廣泛類別之多肽。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，其中有一些亞類(例如γ 1至γ 4)。此鏈之此種性質將抗體之「類別」分別確定為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白之亞類(同型)，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等，已充分表徵，且已知其賦予專門之功能。鑒於本揭示案，技術人員容易辨別此等類別及同型中之每一者的經修飾型式，因而，此等經修飾型式屬於本揭示案之範疇。所有免疫球蛋白類別均屬於本揭示案之範疇。輕鏈分類為κ或λ。每個重鏈類別均可與κ或λ輕鏈結合。
免疫球蛋白可變區區段可與參考序列或共有序列不同。如本文所用，所謂「不同」意謂參考序列或共有序列中之殘基經不同之殘基替換，或者缺乏或插入殘基。
免疫球蛋白之重鏈及輕鏈可以由二硫鍵連接。重鏈恆定區通常包含三個恆定結構域：CH1、CH2及CH3。輕鏈恆定區通常包含CL結構域。重鏈及輕鏈兩者之可變區均含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區通常介導抗體與宿主組織或因子之結合，該等宿主組織或因子包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。
「免疫球蛋白結構域」係指來自免疫球蛋白分子之可變結構域或恆定結構域之結構域。免疫球蛋白結構域通常包含由約7個β股形成之兩個β摺疊，以及保守之二硫鍵(參見例如A.F.Williams及A.N.Barclay(1988)ANN.REV.IMMUNOL.6：381-405)。
如本文所用，「免疫球蛋白可變結構域序列」係指可形成免疫球蛋白可變結構域之結構之胺基酸序列。例如，序列可包括天然存在之可變結構域之胺基酸序列的全部或一部分。例如，序列可省略一個、兩個或更多個N-末端或C-末端胺基酸、內部胺基酸，可包括一或多個插入或附加之末端胺基酸，或者可包括其他改變。在一個實施例中，包含免疫球蛋白可變結構域序列之多肽可與另一種免疫球蛋白可變結構域序列締合，形成靶結合結構(或「抗原結合位點」)，例如與靶抗原相互作用之結構。
用於改變抗體恆定區之方法係本領域已知的。功能改變(例如對諸如細胞上之FcR或補體之C1組分的效應子配位體之親和力改變)之抗體可藉由用不同殘基替換抗體恆定部分中之至少一個胺基酸殘基來產生(例如EP 388,151 A1、美國專利第5,624,821號及美國專利第5,648,260號)。可描述類似類型之改變，此等改變若應用於鼠或其他物種，則免疫球蛋白將減少或消除此等功能。
在一些實施例中，所揭示之抗體係融合蛋白。可重組構築融合蛋白，使得融合蛋白由編碼該融合蛋白之核酸表現。融合蛋白可包含一或多個CD47結合區段以及與一或多個CD47結合區段異源之一或多個區段。異源序列可為任何合適之序列，諸如抗原標籤(例如FLAG、多組胺酸、血凝素(「HA」)、麩胱甘肽-S-轉移酶(「GST」)或麥芽糖結合蛋白(「MBP」))。異源序列亦可為可用作診斷標記物或可偵測標記物之蛋白質，例如螢光素酶、綠色螢光蛋白(「GFP」)或氯黴素乙醯轉移酶(「CAT」)。在一些實施例中，異源序列可為使CD47結合區段靶向所關注細胞、組織或微環境之靶向部分。諸如藉由重組DNA技術構築此類融合蛋白之方法係本領域熟知的。
如本文所用，名詞前之詞語「一個」或「複數個」表示一或多個該特定名詞。除非上下文另外要求，否則單數術語應當包括複數，複數術語應當包括單數。
如本文所用，術語「個體」及「患者」可互換使用。患者或個體可為人類患者或人類個體。
對於術語「例如」及「諸如」及其語法等同詞，除非另外明確指出，否則應當理解遵循片語「不限於此」之含義。如本文所用，術語「約」用來說明由於實驗誤差而引起之變化。除非另外明確指出，否則本文報道之所有量測值均應當理解為受術語「約」修飾，無論是否明確使用了該術語。
除非另外限定，否則本文使用之所有技術術語及科學術語均具有與本發明所屬領域之普通技術人員通常所理解相同之含義。本文描述在本發明中使用之方法及材料；另外，亦可使用本領域已知之合適方法及材料。材料、方 法及實例僅為說明性的，而非意欲限制。
本文提及之所有公開案、專利申請案、專利、序列、資料庫條目及其他參考文獻均以引用方式整體併入。如發生衝突，以本說明書(包括定義)為准。
通常，結合本文所述之細胞及組織培養、分子生物學以及蛋白質及寡核苷酸或多核苷酸化學與雜交所利用之命名法以及其技術係本領域熟知及常用之命名法及技術。使用標準技術進行DNA重組、寡核苷酸合成，以及組織培養與轉型(例如電穿孔、脂質轉染)。酶促反應及純化技術根據製造商之說明書進行，或者如本領域通常實現或如本文所述進行。本文所述之技術及程序通常根據本領域熟知之習知方法進行，且如在本說明書通篇引用及討論之各種一般參考文獻及更具體之參考文獻中所述進行。參見例如Sambrook等人，(1989)MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。結合本文所述之分析化學、合成有機化學以及醫療及藥物化學所利用之命名法及其實驗室程序及技術係本領域熟知及常用之命名法及實驗室程序及技術。使用標準技術進行化學合成、化學分析，藥物製備、調配及遞送，以及對患者之治療。
CD47
CD47亦稱整聯蛋白相關蛋白(IAP)、卵巢癌抗原OA3、Rh相關抗原及MER6，其屬於免疫球蛋白超家族之多次跨膜受體。CD47之表現及/或活性一直與許多疾病及病症(例如癌症)有牽連。CD47與巨噬細胞上之SIRP α(信號調節蛋白α)相互作用，從而抑制吞噬作用。此係一種新發現之腫瘤免疫避免機制，在治療上靶向CD47在許多癌症中具有廣泛應用。
CD47之表現與許多不同惡性腫瘤之較差臨床結果相關聯，此等惡性腫瘤包括急性淋巴球性白血病(ALL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性髓樣白血 病(AML)、神經膠質瘤、卵巢癌、膠質母細胞瘤等。此外，CD47已確定為白血病及實體腫瘤兩者中之癌症幹細胞標記物(Jaiswal等人，2009 Cell,138(2)：271-85；Chan等人，2010 Curr Opin Urol,20(5)：393-7；Majeti R等人，2011 Oncogene,30(9)：1009-19)。
CD47阻斷抗體已在多種小鼠腫瘤模型中顯示出抗腫瘤活性。此外，已證實此等抗體與其他治療性抗體(包括Herceptin®及Rituxan®)在腫瘤模型中協同作用。
阻斷CD47與SIRP α之相互作用可增強巨噬細胞對表現CD47之細胞的吞噬作用(在Chao等人，2012 Curr Opin Immunol,24(2)：225-32中綜述)。缺乏CD47之小鼠對放射療法有顯著抗性，表明靶向CD47與放射療法組合之作用(Maxhimer等人，2009 Sci Transl Med,1(3)：3ra7)。
然而，據報道，先前技術之現有CD47抗體會引起人類RBC之血球凝集及貧血。血球凝集係同型相互作用之實例，使得在用二價CD47結合實體處理時，引起兩種表現CD47之細胞聚集或聚集。舉例而言，據報道，作為完整IgG或F(ab')2之CD47抗體MABL引起紅血球之顯著血球凝集，僅當MABL變為scFv或二價scFv時，此效應才得以減輕。(參見例如Uno S,Kinoshita Y,Azuma Y等人，Oncol Rep 2007；17：1189-94；Kikuchi Y,Uno S,Yoshimura Y等人，Biochem Biophys Res Commun 2004；315：912-8)。其他已知之CD47抗體(包括CC2C6、B6H12及BRC126)亦引起RBC之顯著血球凝集。
因此，RBC聚集及貧血代表用現有之完整IgG抗體及/或SIRP α-Fc融合蛋白在治療上靶向CD47之主要限制。
本揭示案之抗CD47抗體
本揭示案提供抗CD47抗體，包括單株抗體、人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體、靈長類化抗體、雙特異性抗體、結合抗體、小模組化免疫藥物、單鏈抗體、類駱駝抗體、CDR移植抗體、抗CD47抗體之功能變異體(諸如融合蛋白)及其片段及衍生物。此等抗體識別且結合至CD47蛋白，尤其人類CD47。此等抗體可調控，例如抑制、阻斷、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47之表現、活性及/或信號傳導；且此等抗體不引起細胞之顯著凝集水準(亦稱細胞凝集)，包括紅血球之血球凝集。此等抗體可調控，例如抑制、阻斷、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47與SIRP α(信號調節蛋白α)(例如人類CD47與人類SIRP α)之間的相互作用。此等抗體，包括其片段、功能變異體及衍生物，可統稱為「本揭示案之抗CD47抗體」、「所揭示之抗CD47抗體」、「所揭示之抗體」、「本揭示案之CD47抗體」或諸如此類。
在一些實施例中，所揭示之抗體包括全長IgG抗體。在一些實施例中，所揭示之抗體包括二價或多價實體。
所揭示之抗CD47抗體比引起人類紅血球之血球凝集的先前技術之現有抗CD47抗體(參見例如Kikuchi Y,Uno S,Yoshimura Y等人，Biochem Biophys Res Commun 2004；315：912-8)有顯著改進。先前技術之現有抗CD47抗體包括例如B6H12、CC2C6及BRC126(例如美國專利第9,045,541號，Uno S,Kinoshita Y,Azuma Y等人(2007)ONCOL.REP.17：1189-94；Kikuchi Y,Uno S,Yoshimura Y等人(2004)BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.315：912-8)。先前技術之現有抗CD47抗體係阻斷SIRP α但引起RBC之顯著血球凝集的抗體。所揭示之全長IgG抗 CD47抗體不使細胞以顯著水準凝集。
抗CD47抗體B6H12可購得。該抗體由例如ABSCAM(abscam.com/cd47)及Biolegend(Biolegend.com)銷售。
在一些實施例中，細胞之顯著凝集水準係指在先前技術之現有抗CD47抗體存在下之凝集水準。在其他實施例中，當在所揭示之抗CD47抗體存在下之凝集水準與在先前技術之現有抗CD47抗體諸如B6H12、CC2C6及BRC126(例如，美國專利第9,045,541號，Uno S,Kinoshita Y,Azuma Y等人(2007)ONCOL.REP.17：1189-94；Kikuchi Y,Uno S,Yoshimura Y等人(2004)BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.315：912-8)存在下之凝集水準相比降低至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%時，所揭示之抗CD47抗體不引起顯著凝集水準。在另外之實施例中，所揭示之抗CD47抗體在抗體濃度介於大於約0μg/ml與約100μg/ml之間或大於約0μg/ml與約200μg/ml之間(諸如抗體濃度為0.3μg/ml、0.8μg/ml、2.4μg/ml、7μg/ml、22μg/ml、67μg/ml及200μg/ml)時不引起細胞之顯著凝集水準。
在一些實施例中，所揭示之抗體不引起顯著紅血球凝集及貧血。
血球凝集係同型相互作用之實例，其中在用二價CD47結合實體處理時，引起兩種表現CD47之細胞聚集或聚集。所揭示之抗CD47抗體以不促進CD47陽性細胞株(諸如Raji細胞及CCRF-CEM細胞)聚集之方式結合CD47。缺乏顯著血球凝集增大靶向CD47之治療劑的功效。
在某些實施例中，所揭示之抗體不(顯著)增強巨噬細胞對RBC之吞 噬作用。
所揭示之抗CD47抗體表現出許多所需之特徵，諸如結合人類CD47及食蟹猴(cyno)CD47、強效阻斷CD47與SIRP α之間的相互作用，而不引起顯著血球凝集水準，以及強效活體外及活體內抗腫瘤活性。
與先前技術之現有抗CD47抗體相比，所揭示之抗體在減小腫瘤模型中之腫瘤方面亦顯著更強效。在某些實施例中，在所揭示之抗CD47抗體存在下巨噬細胞吞噬腫瘤細胞之能力與在先前技術之現有抗CD47抗體諸如B6H12、CC2C6及BRC126(例如美國專利第9,045,541號，Uno S,Kinoshita Y,Azuma Y等人，(2007)ONCOL.REP.17：1189-94；Kikuchi Y,Uno S,Yoshimura Y等人，(2004)BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.315：912-8)存在下巨噬細胞吞噬腫瘤細胞之能力相比增大至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%。在一些實施例中，所揭示之抗體係強效抗腫瘤劑。在一些實施例中，所揭示之抗體減小腫瘤。在一些實施例中，所揭示之抗體增大巨噬細胞吞噬腫瘤細胞之能力。
在某些實施例中，與不存在本文所述之抗CD47抗體時CD47與SIRP α之間的相互作用水準相比，所揭示之抗CD47抗體阻斷CD47與SIRP α之間的相互作用至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少95%或至少99%。
可在不進行過度實驗之情況下量化凝集水準，例如RBC之血球凝集水準。例如，本領域之技術人員將認識到，血球凝集水準係藉由在所揭示之抗CD47抗體存在下執行血球凝集分析之後量測RBC點面積來確定，如下面之實例 中所述。在某些實施例中，將在本文所揭示之抗CD47抗體存在下的RBC點面積與不存在抗CD47抗體之情況下(亦即在存在零血球凝集之情況下)的RBC點面積進行比較。以這種方式，相對於基線對照量化血球凝集。較大之RBC點面積對應於較高之血球凝集水準。較大之RBC紅點面積可能看起來模糊。作為替代，亦可利用RBC點之密度分析法來量化血球凝集。該比較亦可在所揭示之抗體與先前技術抗體(諸如B6H12)之間進行。
在某些實施例中，小於顯著血球凝集係在本文所揭示之抗CD47抗體存在下人類RBC之血球凝集與不存在該抗CD47抗體時之血球凝集大致相同。在其他實施例中，小於顯著血球凝集係在本文所揭示之抗CD47抗體存在下人類RBC之血球凝集為不存在該抗CD47抗體時之血球凝集的約5%、10%、15%、20%或25%。
在某些實施例中，提供抗CD47抗體，該抗CD47抗體包含：重鏈可變結構域(VH)，該重鏈可變結構域具有包含SEQ ID NO：49、51、53、55、57、59、62-65、86-87中任一者之胺基酸序列或包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體的重鏈CDR1；包含SEQ ID NO：145、147、149、151、153、155、158-161、182-183中任一者之胺基酸序列或包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體的重鏈CDR2；及包含SEQ ID NO：241、243、245、247、249、251、254-257、278-279中任一者之胺基酸序列或包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體的重鏈CDR3；以及輕鏈可變結構域(VL)，該輕鏈可變結構域具有包含SEQ ID NO：50、52、54、56、58、60中任一者之胺基酸序列或包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體的輕鏈 CDR1；包含SEQ ID NO：146、148、150、152、154、156、172-175中任一者之胺基酸序列或包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體的輕鏈CDR2；及包含SEQ ID NO：242、244、246、248、250、252、268-271中任一者之胺基酸序列或包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體的輕鏈CDR3。在某些實施例中，提供抗CD47抗體，該抗體包含：重鏈可變結構域(VH)，該重鏈可變結構域具有包含SEQ ID NO：49、51、53、55、57、59、62-65、86-87中任一者之胺基酸序列的重鏈CDR1；包含SEQ ID NO：145、147、149、151、153、155、158-161、182-183中任一者之胺基酸序列的重鏈CDR2；及包含SEQ ID NO：241、243、245、247、249、251、254-257、278-279中任一者之胺基酸序列的重鏈CDR3；以及輕鏈可變結構域(VL)，該輕鏈可變結構域具有包含SEQ ID NO：50、52、54、56、58、60、76至79中任一者之胺基酸序列的輕鏈CDR1；包含SEQ ID NO：146、148、150、152、154、156、172-175中任一者之胺基酸序列的輕鏈CDR2；及包含SEQ ID NO：242、244、246、248、250、252、268-271中任一者之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在某些實施例中，根據上述分離之抗CD47抗體中之任一種，該抗體包含下列中之任一種：(1)VH包含分別具有SEQ ID NO：49、145及241之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：50、146及242之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；或在CDR區中包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體；(2)VH包含分別具有SEQ ID NO：51、147及243之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2 及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：52、148及244之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；或在CDR區中包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體；(3)VH包含分別具有SEQ ID NO：53、149及245之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：54、150及246之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；或在CDR區中包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體；(4)VH包含分別具有SEQ ID NO：55、151及247之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：56、152及248之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；或在CDR區中包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體；(5)VH包含分別具有SEQ ID NO：57、153及249之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：58、154及250之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；或在CDR區中包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體；(6)VH包含分別具有SEQ ID NO：59、155及251之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：60、156及252之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；或在CDR區中包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體；(7)VH包含分別具有SEQ ID NO：62、158及254之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：76、172及268之胺基酸序列之 輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(8)VH包含分別具有SEQ ID NO：63、159及255之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：77、173及269之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；或在CDR區中包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體；(9)VH包含分別具有SEQ ID NO：64、160及256之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：78、174及270之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；或在CDR區中包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體；(10)VH包含分別具有SEQ ID NO：65、161及257之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：79、175及271之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；或在CDR區中包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體；(11)VH包含分別具有SEQ ID NO：65、161及257之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：76、172及268之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；或在CDR區中包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體；(12)VH包含分別具有SEQ ID NO：86、182及278之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：56、152及248之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；或在CDR區中包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體；且 (13)VH包含分別具有SEQ ID NO：87、183及279之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：56、152及248之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；或在CDR區中包含至多約3個(諸如約1、2或3個)胺基酸取代之其變異體。
在某些實施例中，根據上述分離之抗CD47抗體中之任一種，該抗體包含下列中之任一種：(1)VH包含分別具有SEQ ID NO：49、145及241之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：50、146及242之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(2)VH包含分別具有SEQ ID NO：51、147及243之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：52、148及244之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(3)VH包含分別具有SEQ ID NO：53、149及245之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：54、150及246之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(4)VH包含分別具有SEQ ID NO：55、151及247之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：56、152及248之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(5)VH包含分別具有SEQ ID NO：57、153及249之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：58、154及250之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3； (6)VH包含分別具有SEQ ID NO：59、155及251之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：60、156及252之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(7)VH包含分別具有SEQ ID NO：62、158及254之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：76、172及268之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(8)VH包含分別具有SEQ ID NO：63、159及255之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：77、173及269之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(9)VH包含分別具有SEQ ID NO：64、160及256之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：78、174及270之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(10)VH包含分別具有SEQ ID NO：65、161及257之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：79、175及271之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(11)VH包含分別具有SEQ ID NO：65、161及257之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：76、172及268之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(12)VH包含分別具有SEQ ID NO：86、182及278之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：56、152及248之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；且 (13)VH包含分別具有SEQ ID NO：87、183及279之胺基酸序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：56、152及248之胺基酸序列之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本揭示案提供包含選自SEQ ID NO：349、351、353、355、357、359、361-373、380-383、388-392之可變重鏈以及選自SEQ ID NO：350、352、354、356、358、360、374-379、384-387及393-396之可變輕鏈的抗CD47抗體。在某些實施例中，抗CD47抗體包含與SEQ ID NO：349、351、353、355、357、359、361-373、380-383、388-392中之至少一者示出之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈，以及與SEQ ID NO：350、352、354、356、358、360、374-379、384-387及393-396中之至少一者示出之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變輕鏈。
本文所提供之抗CD47抗體表現出抑制活性，例如藉由抑制CD47之表現(例如抑制CD47之細胞表面表現)、活性及/或信號傳導，或者藉由干擾CD47與SIRP α之間的相互作用。本文所提供之抗體在結合至CD47(例如人類CD47)或以其他方式與CD47(例如人類CD47)相互作用時，完全或部分地降低或以其他方式調控CD47之表現或活性。在抗體與人類CD47多肽及/或肽之間相互作用時，CD47之生物學功能得到完全、顯著或部分之減小或調控。
當在抗體存在下CD47表現或活性之水準與不存在相互作用(例如與本文所述之抗體結合)之情況下的CD47表現或活性之水準相比降低至少95%，例如96%、97%、98%、99%或100%時，認為抗體完全抑制CD47之表現或活性。
當在CD47抗體存在下CD47表現或活性之水準與不存在與本文所述之抗CD47抗體結合之情況下的CD47表現或活性之水準相比降低至少50%，例如55%、60%、75%、80%、85%或90%時，認為抗CD47抗體顯著抑制CD47之表現或活性。當在抗體存在下CD47表現或活性之水準與不存在相互作用(例如與本文所述之抗體結合)之情況下的CD47表現或活性之水準相比降低之百分比小於95%，例如，降低10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%或90%時，認為抗體部分抑制CD47之表現或活性。
足以治療或預防個體中之癌症之抗體量為例如足以減少CD47信號傳導之量。例如，足以治療或預防個體中之癌症之抗體量為足以減小巨噬細胞中由CD47/SIRP α信號傳導軸中之CD47/SIRP α相互作用所產生的吞噬作用抑制信號，亦即，所揭示之抗體促進巨噬細胞介導的對表現CD47之細胞之吞噬作用的量。
如本文所用，與巨噬細胞中由CD47/SIRP α信號傳導軸中之CD47/SIRP α相互作用所產生的吞噬作用抑制信號相關之術語「減小」係指在所揭示之抗CD47抗體存在下CD47信號傳導減弱。當在所揭示之抗CD47抗體存在下CD47信號傳導之水準與CD47信號傳導之對照水準(亦即不存在該抗體時CD47信號傳導之水準)相比降低之百分比大於或等於5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%或100%時，CD47介導之信號傳導減弱。使用多種標準技術中之任一種量測CD47信號傳導之水準，諸如作為非限制性實例，量測下游基因激活，及/或響應於CD47激活之螢光素酶報導基因分析。本領域之技術人員將會知道，CD47信號傳導之水準可使用多種分 析法來量測，包括例如市售套組。
在一些實施例中，所揭示之抗CD47抗體或其免疫活性片段係IgG同型。在一些實施例中，抗體之恆定區具有人類IgG1同型，具有胺基酸序列： (SEQ ID NO：408)
在一些實施例中，人類IgG1恆定區在胺基酸Asn297(加框，Kabat編號)處經修飾，以防止抗體之醣基化，例如Asn297Ala(N297A)。在一些實施例中，抗體之恆定區在胺基酸Leu235(Kabat編號)處經修飾，以改變Fc受體相互作用，例如Leu235Glu(L235E)或Leu235Ala(L235A)。在一些實施例中，抗體之恆定區在胺基酸Leu234(Kabat編號)處經修飾，以改變Fc受體相互作用，例如Leu234Ala(L234A)。在一些實施例中，抗體之恆定區在胺基酸234及235處均改變，例如Leu234Ala及Leu235Ala(L234A/L235A)(Kabat等人1991年出版之Sequences of Proteins of Immunological Interest之EU索引)。
在一些實施例中，抗體之恆定區具有人類IgG2同型，具有胺基酸序列： (SEQ ID NO：409)
在一些實施例中，人類IgG3恆定區在胺基酸Asn297(加框，Kabat編號)處經修飾，以防止抗體之醣基化，例如Asn297Ala(N297A)。在一些實施例中，人類IgG3恆定區在胺基酸435處經修飾，以延長半衰期，例如Arg435His(R435H)(Kabat等人1991年出版之Sequences of Proteins of Immunological Interest之EU索引)。
在一些實施例中，抗體之恆定區具有人類IgG4同型，具有胺基酸序列： (SEQ ID NO：410)
在一些實施例中，人類IgG4恆定區在鉸鏈區內經修飾，以防止或減 少鏈交換，例如Ser228Pro(S228P)。在其他實施例中，人類IgG4恆定區在胺基酸235處經修飾，以改變Fc受體相互作用，例如Leu235Glu(L235E)。在一些實施例中，人類IgG4恆定區在鉸鏈內及胺基酸235處經修飾，例如Ser228Pro及Leu235Glu(S228P/L235E)，具有胺基酸序列： (SEQ ID NO：411)
在一些實施例中，人類IgG恆定區經修飾以增強FcRn結合。增強與FcRn結合之Fc突變之實例為Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu(分別係M252Y、S254T、T256E)(Kabat編號，Dall'Acqua等人，2006/.Biol Chem，第281卷第33期，23514-23524)或Met428Leu及Asn434Ser(M428L、N434S)(Zalevsky等人，2010 Nature Biotech，第28卷第2期，157-159)(Kabat等人1991年出版之Sequences of Proteins of Immunological Interest之EU索引)。在一些實施例中，人類IgG恆定區經修飾以改變抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如下列文獻中所述之胺基酸修飾：Natsume等人，2008 Cancer Res,68(10)：3863-72；Idusogie等人，2001 J Immunol,166(4)：2571-5；Moore等人，2010 mAbs,2(2)：181-189；Lazar等人，2006 PNAS,103(11)：4005-4010；Shields等人，2001 JBC,276(9)：6591-6604； Stavenhagen等人，2007 Cancer Res,67(18)：8882-8890；Stavenhagen等人，2008 Advan.Enzyme Regul.,48：152-164；Alegre等人，1992 J Immunol,148：3461-3468；在Kaneko及Niwa,2011 Biodrugs,25(1)：1-11中綜述。
在一些實施例中，人類IgG恆定區經修飾以誘導異源二聚化。例如，在CH3結構域內之Thr366處具有胺基酸修飾，當用較龐大之胺基酸(例如Try(T366W))替換時，可優先與在Thr366、Leu368及Tyr407處具有體積較小之胺基酸，分別例如Ser、Ala及Val(T366S/L368A/Y407V)之胺基酸修飾的第二CH3結構域配對。藉由引入二硫鍵可進一步穩定經由CH3修飾實現之異源二聚化，例如藉由在相反之CH3結構域上將Ser354改變為Cys(S354C)且將Y349改變為Cys(Y349C)(在Carter,2001 Journal of Immunological Methods,248：7-15中綜述)。
在一些實施例中，所揭示之抗CD47抗體包含選自由SEQ ID NO：349、351、353、355、357、359、361-373、380-383、388-392組成之群之可變重(VH)鏈區。所揭示之抗CD47抗體視情況包含選自由SEQ ID NO：350、352、354、356、358、360、374-379、384-387及393-396之序列組成之群之可變輕(VL)鏈區。在一些實施例中，所揭示之抗CD47抗體包含選自由SEQ ID NO：349、351、353、355、357、359、361-373、380-383、388-392之序列組成之群的VH鏈區，以及選自由SEQ ID NO：350、352、354、356、358、360、374-379、384-387及393-396之序列組成之群的VL鏈區。所揭示之抗體亦包括如下抗體，其具有與SEQ ID NO：349、351、353、355、357、359、361-373、380-383、388-392中之至少一者示出之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈，以及與SEQ ID NO：350、352、354、356、358、360、374-379、384-387 及393-396中之至少一者示出之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變輕鏈。
在其他實施例中，所揭示之抗CD47抗體包含與以SEQ ID NO：350、352、354、356、358、360、374-379、384-387及393-396中之任一者提供的VL區配對的以SEQ ID NO：349、351、353、355、357、359、361-373、380-383、388-392中之任一者提供的VH區。
在其他實施例中，所揭示之抗CD47抗體包含與以SEQ ID NO：350、352、354、356、358、360、374-379、384-387以及393-396中之任一者提供的VL區配對的以SEQ ID NO：349、351、353、355、357、359、361-373、380-383、388-392中之任一者提供的VH區。
在某些實施例中，所揭示之抗CD47抗體以頭對側之取向結合至CD47，該取向將重鏈定位在表現CD47之細胞之膜附近，而輕鏈封閉CD47上之SIRP α結合位點。在其他實施例中，所揭示之抗CD47抗體以頭對側之取向結合至CD47，該取向將輕鏈定位在表現CD47之細胞之膜附近，而重鏈封閉CD47上之SIRP α結合位點。
亦提供分離之抗體或其免疫學活性片段，該抗體或片段與本文所述之CD47抗體競爭，以防止CD47與SIRP α相互作用。
本文所述之單株抗體能夠結合CD47，抑制SIRP α與CD47結合，減弱CD47-SIRP α介導之信號傳導，促進腫瘤細胞之吞噬作用，且抑制腫瘤生長及/或遷移。例如，使用本文在實例中描述之細胞分析法來測定抑制作用。
本文所述之示例性抗體包括鼠類CD47抗體，98E2E12、107F11F10 及108C10A6之嵌合形式，以及108C10A6之人類化變異體。
本揭示案之示例性單株抗體包括例如具有下面序列所示之可變重鏈區(VH)及/或可變輕(VL)鏈區的鼠類抗體。
SEQ ID NO：349-55F2C4-VH
SEQ ID NO：350-55F2C4-VL
SEQ ID NO：351-98E2E7/98E2E12-VH
SEQ ID NO：352-98E2E7/98E2E12-VL
SEQ ID NO：353-98G5F6/98G5F11-VH
SEQ ID NO：354-98G5F6/98G5F11-VL NIVMTQSPKSMSVSVGERVTLSCRASEIVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRFTGVPDRFTGSRSATDFSLTISNVQAEDLADYLCGQSYDSPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：355-107F11B11/107F11C4/107F11F10-VH
SEQ ID NO：356-107F11B11/107F11C4/107F11F10-VL DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLSWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGHSYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：357-108C10A6/108C10F5-VH
SEQ ID NO：358-108C10A6/108C10F5-VL NIVMTQSPRSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYISWYQQKPDQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISTVQAEDLADYHCGESYGHLYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：359-112E5D9/112E5F2/112E5H7-VH
SEQ ID NO：360-112E5D9/112E5F2/112E5H7-VL NIVMTQSPKSMSVSVGERVTMNCRASEIVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGAFNRYTGVPDRFTGSRSGTDFSLNISNVQAEDLADYLCGQSYDSPYTFGGGTKLEIK
示例性所揭示抗CD47單株抗體包括例如具有下面序列所示之可變重鏈區(VH)及/或可變輕(VL)鏈區的嵌合抗體。
SEQ ID NO：397-108C10A6_VH-huIgG1CH
SEQ ID NO：398-108C10A6_VL-hIgKCL
SEQ ID NO：404-98E2E12_VH-huIgG1CH
SEQ ID NO：405-98E2E12_VL-hIgKCL
SEQ ID NO：406-107F11F10-VH-huIgG1CH
SEQ ID NO：407-107F11F10-VL-hIgKCL
示例性所揭示之抗CD47抗體包括例如具有下面序列所示之可變重鏈區(VH)及/或可變輕(VL)鏈區的人類化抗體。
SEQ ID NO：366-108VH1
SEQ ID NO：367-108VH2
SEQ ID NO：368-108VH3
SEQ ID NO：369-108Vha
SEQ ID NO：373-108VH4.M4
SEQ ID NO：377-108VL1.M1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASENVGTYISWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYTGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCGESYGHLYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：378-108VL2.M1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASENVGTYISWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYHCGESYGHLYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：379-108VL3.M1 EIVLTQSPATLSLSPGERVTLSCRASENVGTYISWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYHCGESYGHLYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：399-108VH4.M4-huIgG1
SEQ ID NO：400-108VH4.M4-hIgG2
SEQ ID NO：401-108VH4.M4-hIgG4PE
SEQ ID NO：403-108VH4.M4-hIgG4P
SEQ ID NO：402-108VL1.M1-hIgKCL
SEQ ID NO：381-107VH1
SEQ ID NO：382-107VH2
SEQ ID NO：383-107VH3
SEQ ID NO：385-107VL1
SEQ ID NO：386-107VL1-M1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGHSYPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：387-107VL2.M1 DIQMTQSPSSLSASVGDRITITCRASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGHSYPYTFGGGTKLEIK
可使用本領域已知之任何合適程序來製備針對CD47，或針對其衍生物、片段、類似物同源物或異種同源物之單株抗體。(參見例如Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow E及Lane D,1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。完全人類抗體係其中輕鏈及重鏈兩者之整個序列(包括CDR)均來自人類基因之抗體分子。此類抗體在本文中稱為「人類抗體」或「完全人類抗體」。例如，使用下文提供之實例中所描述之程序製備人類單株抗體。亦可藉由使用下列技術來製備人類單株抗體：三體瘤(trioma)技術；人類B細胞雜交瘤技術(Kozbor等人，1983 Immunol Today 4：72)；以及用於產生人類單株抗體之EBV雜交瘤技術(Cole等人，1985,MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.，第77至96頁)。可利用人類單株抗體，且可藉由使用人類雜交瘤(Cote等人，1983.Proc Natl Acad Sci USA 80：2026-2030)或藉由用埃巴二氏病毒(Epstein Barr Virus)在活體外轉型人類B細胞(Cole等人，1985 MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.，第77至96頁)來產生人類單株抗體。
人類CD47之DNA序列係本領域已知的。人類CD47之DNA序列作為SEQ ID NO：412提供。
抗體可藉由熟知之技術來純化，諸如使用蛋白A或蛋白G之親和層析法，該親和層析法主要提供免疫血清之IgG部分。隨後，或作為替代，可將作為所尋求之免疫球蛋白標靶之特異性抗原或其抗原決定基固定在管柱上，以藉由免疫親和層析法將該免疫特異性抗體純化。免疫球蛋白之純化例如由D.Wilkinson(The Scientist,The Scientist,Inc.(Philadelphia PA)出版，第14卷，第8期 (2000年4月17日)，第25至28頁)討論。
調控、阻斷、抑制、減小、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47及/或CD47/SIRP α介導之細胞信號傳導的單株抗體例如藉由用膜結合之及/或可溶性CD47(諸如人類CD47，或者其免疫原性片段、衍生物或變異體)對動物進行免疫接種而生成。
作為替代，使用經含有編碼CD47之核酸分子之載體轉染的細胞對動物進行免疫接種，使得CD47表現且與轉染細胞之表面締合。作為替代，藉由針對與CD47之結合篩選含有抗體或抗原結合域序列之文庫來獲得抗體。該文庫係例如在噬菌體中，呈與在組裝之噬菌體顆粒之表面上表現的噬菌體外殼蛋白及噬菌體顆粒內所含之編碼DNA序列的蛋白質或肽融合物來製備(亦即「噬菌體展示文庫」)。接著篩選由骨髓瘤/B細胞融合產生之雜交瘤對CD47之反應性。
例如，使用雜交瘤方法，諸如Kohler及Milstein,Nature,256：495(1975)所述之方法來製備單株抗體。在雜交瘤方法中，通常用免疫接種劑對小鼠、倉鼠或其他適當宿主動物進行免疫接種，以引發產生或能夠產生將特異性結合至免疫接種劑之抗體的淋巴細胞。作為替代，可在活體外對淋巴細胞進行免疫接種。
免疫接種劑通常將包括蛋白抗原、其片段或其融合蛋白。通常，若需要人類來源細胞，則使用外周血淋巴細胞，而若需要非人類哺乳動物來源之細胞，則使用脾細胞或淋巴結細胞。接著使用合適融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與永生化細胞株融合，以形成雜交瘤細胞(Coding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press,(1986)，第59至103頁)。永生化細胞株通常 係轉型之哺乳動物細胞，尤其來源於囓齒動物、牛及人類之骨髓瘤細胞。通常採用大鼠或小鼠之骨髓瘤細胞株。雜交瘤細胞可在合適培養基中培養，該培養基較佳含有抑制未融合之永生化細胞生長或存活之一或多種物質。舉例而言，若親本細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則雜交瘤之培養基通常將包含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷(「HAT培養基」)，該等物質阻止缺乏HGPRT之細胞生長。
可使用如下永生化細胞株，該永生化細胞株有效融合，藉由所選擇之抗體產生細胞支持抗體之穩定高水準表現，且對諸如HAT培養基之培養基敏感。可使用之其他永生化細胞株係鼠骨髓瘤細胞株，此等細胞株可例如自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California及American Type Culture Collection,Manassas,Virginia獲得。亦已描述人類骨髓瘤細胞株及小鼠-人類雜合骨髓瘤細胞株用於製備單株抗體。(Kozbor,J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)，第51至63頁))。
接著可分析培養雜交瘤細胞之培養基中是否存在針對抗原之單株抗體。較佳地，由雜交瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析法(諸如放射免疫分析法(RIA)或酶聯免疫吸附分析法(ELISA))測定。此類技術及分析法在本領域中係已知的。單株抗體之結合親和力可例如藉由Munson及Pollard,Anal.Biochem.,107：220(1980)之斯卡查德分析(Scatchard analysis)來測定。另外，在單株抗體之治療應用中，鑑別對靶抗原具有高度特異性及高結合親和力之抗體係重要的。
在鑑別出所需之雜交瘤細胞之後，純系可藉由有限稀釋程序進行次選殖，且藉由標準方法生長。(Coding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press,(1986)，第59至103頁)。用於達成此目的之合適培養基包括例如杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)及RPMI-1640培養基。作為替代，雜交瘤細胞可在哺乳動物中作為腹水來活體內生長。
亞純系所分泌之單株抗體可藉由習知免疫球蛋白純化程序(諸如蛋白A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析)自培養基或腹水液中分離或純化。
單株抗體亦可藉由重組DNA方法，諸如美國專利第4,816,567號中描述之方法製備。編碼所揭示之單株抗體之DNA可使用習知程序容易地分離及測序(例如藉由使用能夠與編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)。產生所揭示之抗體之雜交瘤細胞充當此類DNA之極佳來源。一旦DNA分離，即可將其置於表現載體中，接著將表現載體轉染至宿主細胞諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎(HEK)293細胞、猿猴COS細胞、PER.C6®、NSO細胞、SP2/0、YB2/0或者不以其他方式產生免疫球蛋白之骨髓瘤細胞中，以在重組宿主細胞中獲得單株抗體之合成。亦可例如藉由用人類重鏈恆定結構域及輕鏈恆定結構域之編碼序列置換同源鼠類序列(參見美國專利第4,816,567號；Morrison,Nature 368,812-13(1994))，或者藉由將非免疫球蛋白多肽之編碼序列之全部或一部分共價接合至免疫球蛋白編碼序列，對DNA進行修飾。此類非免疫球蛋白多肽可取代所揭示抗體之恆定結構域，或者可取代所揭示抗體之一個抗原結合位點之可變結構域，從而產生嵌合二價抗體。
本文所揭示之抗體包括完全人類抗體或人類化抗體。此等抗體適合於投與人類，而不引起人類對所投與之免疫球蛋白之免疫反應。
抗CD47抗體例如使用下文提供之實例中所描述之程序產生。舉例而言，使用小鼠中之經修改免疫接種策略及隨後雜交瘤產生來鑑別所揭示之抗CD47抗體。
在替代性方法中，例如使用利用僅含有人類序列之抗體的噬菌體展示方法來開發抗CD47抗體。此等方法在本領域中(例如在WO92/01047及美國專利第6,521,404號中)係熟知的。在此方法中，使用天然或重組來源之cd47或其片段來篩選攜帶輕鏈及重鏈之隨機對之噬菌體的組合文庫。在另一種方法中，抗CD47抗體可藉由如下方法產生，其中該方法之至少一個步驟包括用人類CD47蛋白對轉殖基因之非人類動物進行免疫接種。在此方法中，此異種非人類動物之內源性重鏈及/或κ輕鏈基因座中之一些已停用，且無法出現響應於抗原而生成編碼免疫球蛋白之基因所需的重排。此外，至少一個人類重鏈基因座及至少一個人類輕鏈基因座已穩定地轉染至動物中。因此，響應於所投與之抗原，人類基因座重排以提供編碼對抗原具有免疫特異性之人類可變區之基因。因此，在免疫後，xenomouse產生分泌完全人類免疫球蛋白之B細胞。
本領域熟知用於產生異種非人類動物之多種技術。例如，參見美國專利第6,075,181號及第6,150,584號。此一般策略使用1994年公開之第一XenoMouseTM品系得到證實。參見Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994)。亦可參見美國專利第6,162,963號、第6,150,584號、第6,114,598號、第6,075,181號及第5,939,598號，以及日本專利第3 068 180 B2號、第3 068 506 B2號及第3 068 507 B2號，以及歐洲專利第EP 0 463 151 B 1號及國際專利申請案第WO 94/02602號、第WO 96/34096號、第WO 98/24893號、第WO 00/76310號及相關之家族成員。
在替代性方法中，其他人已利用「小基因座(minilocus)」方法，其中經由包含來自Ig基因座之片段(單個基因)來模擬外源Ig基因座。因此，一或多個VH基因、一或多個DH基因、一或多個JH基因、mu恆定區及第二恆定區(較佳γ恆定區)形成於用於插入動物中之構築體。參見例如美國專利第5,545,806號、第5,545,807號、第5,591,669號、第5,612,205號、第5,625,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,643,763號、第5,661,016號、第5,721,367號、第5,770,429號、第5,789,215號、第5,789,650號、第5,814,318號、第5,877,397號、第5,874,299號、第6,023,010號及第6,255,458號；以及歐洲專利第0 546 073 B1號；以及國際專利申請案第WO 92/03918號、第WO 92/22645號、第WO 92/22647號、第WO 92/22670號、第WO 93/12227號、第WO 94/00569號、第WO 94/25585號、第WO 96/14436號、第WO 97/13852號及第WO 98/24884號及相關之家族成員。
亦已證實自小鼠中生成人類抗體，其中經由微細胞融合，已引入大片染色體或整個染色體。參見歐洲專利申請案第773 288號及第843 961號。人類抗小鼠類抗體(HAMA)反應已引領該行業製備嵌合人類化抗體或其他人類化抗體。雖然嵌合抗體具有人類恆定區及免疫可變區，但預期將觀察到某些人類抗嵌合抗體(HACA)反應，尤其在抗體長期或多劑量利用之情況下。因此，本揭示案提供針對CD47之完全人類抗體，以消除或以其他方式減輕HAMA或HACA反應之問題及/或影響。
產生免疫原性降低之抗體亦經由人類化技術、嵌合化技術及展示技術使用適當文庫來實現。應當理解，可使用本領域熟知之技術將鼠類抗體或來自其他物種之抗體人類化或靈長類化。參見例如Winter及Harris Immunol Today 14：43 46(1993)，以及Wright等人，Crit,Reviews in Immunol.12125-168(1992)。可藉由重組DNA技術對所關注之抗體進行工程改造，以用對應之人類序列取代CH1、CH2、CH3、鉸鏈結構域及/或構架結構域(參見WO 92102190及美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,792號、第5,714,350號及第5,777,085號)。另外，Ig cDNA用於構築嵌合免疫球蛋白基因之用途係本領域已知的(Liu等人，P.N.A.S.84：3439(1987)及J.Immunol.139：3521(1987))。自產生抗體之雜交瘤或其他細胞中分離mRNA且用於產生cDNA。可使用特異性引子藉由聚合酶鏈式反應擴增所關注之cDNA(美國專利第4,683,195號及第4,683,202號)。作為替代，製備且篩選文庫以分離所關注之序列。接著將編碼抗體可變區之DNA序列與人類恆定區序列融合。人類恆定區基因之序列可在Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of immunological Interest,N.I.H.出版物編號91-3242中找到。人類C區基因可容易地自已知純系獲得。對同型之選擇將由期望之效應功能(諸如補體固定，或抗體依賴性細胞毒性中之活性)指導。較佳之同型係IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。可使用人類輕鏈恆定區中之任一種，κ或λ。接著藉由習知方法表現嵌合之人類化抗體。
抗體片段，諸如Fv、F(ab')2及Fab可藉由例如用蛋白酶或化學裂解使完整蛋白質裂解來製備。作為替代，設計出截短之基因。舉例而言，編碼F(ab')2片段之一部分之嵌合基因將包括編碼H鏈之CHI結構域及鉸鏈區之DNA序列， 接著係用於產生截短分子之轉譯終止密碼子。
H區、L區及J區之共有序列可用於設計用作引子之寡核苷酸，以將可用之限制性位點引入J區中，以便隨後將V區區段連接至人類C區區段。可藉由定點誘變修飾C區cDNA，以將限制性位點置於人序列中之類似位置處。
表現載體包括質體、逆轉錄病毒、YAC、EBV衍生之游離基因體及諸如此類。適宜之載體係編碼功能完整之人類CH或CL免疫球蛋白序列之載體，其中適當限制性位點經工程改造，使得可容易地插入及表現任何VH序列或VL序列。在此類載體中，剪接通常發生在插入之J區中之剪接供體位點與人類C區之前的剪接受體位點之間，以及出現於人類CH外顯子內之剪接區處。聚腺苷酸化及轉錄終止發生在編碼區下游之天然染色體位點處。得到之嵌合抗體可與任何強啟動子接合，該強啟動子包括逆轉錄病毒LTR，例如SV-40早期啟動子(Okayama等人，Mol.Cell.Bio.3：280(1983))、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)LTR(Gorman等人，P.N.A.S.79：6777(1982))及莫洛尼鼠(Moloney murine)白血病病毒LTR(Grosschedl等人，Cell 41：885(1985))。另外，可使用天然Ig啟動子及諸如此類。
此外，可使用本領域熟知之技術，經由展示類型技術產生人類抗體或來自其他物種之抗體，該展示類型技術包括但不限於噬菌體展示技術、逆轉錄病毒展示技術、核糖體展示技術及其他技術，且所得分子可經受額外成熟，諸如親和力成熟，因為此類技術係本領域熟知的。Wright等人，Crit,Reviews in Immunol.12125-168(1992)；Hanes及Pluckthun,PNAS USA 94：4937-4942(1997)(核糖體展示)；Parmley及Smith,Gene 73：305-318(1988)(噬菌體展示)，Scott,TIBS，第 17卷，241-245(1992)；Cwirla等人，PNAS USA 87：6378-6382(1990)；Russel等人，Nucl.Acids Research 21：1081-1085(1993)；Hoganboom等人，Immunol.Reviews 130：43-68(1992)；Chiswell及McCafferty,TIBTECH；10：80-8A(1992)；以及美國專利第5,733,743號。若利用展示技術來產生非人類抗體，則可如上所述將此類抗體人類化。
使用此等技術，可產生針對表現CD47之細胞、CD47之可溶形式、其抗原決定基或肽以及其表現文庫的抗體(參見例如美國專利第5,703,057號)，之後可如上所述針對本文所述之活性篩選此等抗體。
所揭示之抗CD47抗體可藉由含有DNA區段(諸如編碼上述單鏈抗體之DNA區段)之載體表現。可使用任何合適載體。
此等可包括載體、脂質體、裸DNA、佐劑輔助之DNA、基因槍、導管等。載體包括化學結合物，諸如WO 93/64701中所述，此等化學結合物具有靶向部分(例如細胞表面受體之配位體)與核酸結合部分(例如聚離胺酸)；病毒載體(例如DNA或RNA病毒載體)；融合蛋白，諸如PCT/US95/02140(WO 95/22618)中所述，此等融合蛋白係含有靶部分(例如對靶細胞有特異性之抗體)與核酸結合部分(例如魚精蛋白)之融合蛋白；質體、噬菌體等。載體可為染色體載體、非染色體載體或合成載體。
示例性載體包括病毒載體、融合蛋白及化學結合物。逆轉錄病毒載體包括莫洛尼鼠白血病病毒。可使用DNA病毒載體。此等載體包括痘病毒載體，諸如天花病毒載體或禽痘病毒載體、疱疹病毒載體諸如單純疱疹I病毒(HSV)載體(參見Geller,A.I.等人，J.Neurochem,64：487(1995)；Lim,F.等人，DNA Cloning： Mammalian Systems,D.Glover編輯(Oxford Univ.Press,Oxford England)(1995)；Geller,A.I.等人，Proc Natl.Acad.Sci.：U.S.A.90：7603(1993)；Geller,A.I.等人，Proc Natl.Acad.Sci USA 87：1149(1990)、腺病毒載體(參見LeGal LaSalle等人，Science,259：988(1993)；Davidson等人，Nat.Genet 3：219(1993)；Yang等人，J.Virol.69：2004(1995)以及腺相關病毒載體(參見Kaplitt,M.G.等人，Nat.Genet.8：148(1994)。
痘病毒載體將基因引入細胞質中。禽痘病毒載體僅引起核酸之短期表現。腺病毒載體、腺相關病毒載體及單純疱疹病毒(HSV)載體較佳用於將核酸引入神經細胞中。腺病毒載體引起之表現期(約2個月)比腺相關病毒引起之表現期(約4個月)短，後者又比HSV載體引起之表現期短。選擇之特定載體將視靶細胞及正在治療之病狀而定。可藉由標準技術，例如感染、轉染、轉導或轉型來引入。基因轉移模式之實例包括例如裸DNA、CaP04沈澱、DEAE葡聚糖、電穿孔、原生質體融合、脂質轉染、細胞顯微注射及病毒載體。
載體可用於靶向基本上任何所需之靶細胞。舉例而言，立體定位注射可用於將載體(例如腺病毒、HSV)引導至所需位置。此外，可使用微泵輸注系統(諸如SynchroMed輸注系統)藉由腦室內(icv)輸注來遞送顆粒。已證明基於整體流(稱為對流)之方法在將大分子遞送至大腦之延伸區域方面係有效的，且該方法可用於將載體遞送至靶細胞。(參見Bobo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2076-2080(1994)；Morrison等人，Am.J.Physiol.266：292-305(1994))。可使用之其他方法包括導管、靜脈內注射、非經腸注射、腹膜內注射及皮下注射，以及經口或其他已知之投與途徑。
此等載體可用於表現可依多種方式使用之大量抗體。例如，用於偵 測樣品中CD47之存在。該抗體亦可用於嘗試結合且破壞CD47及/或CD47/SIRP α相互作用以及CD47/SIRP α介導之信號傳導。
提供攜帶載體之原核細胞(諸如大腸桿菌(E.coli)及芽孢桿菌屬(Bacillus))、酵母細胞(諸如釀酒酵母(Sacharomyces cerevisiae))以及植物細胞，該載體包含編碼所揭示抗體之核酸。在一些實施例中，此類細胞表現所揭示之抗體。亦提供通常不攜帶編碼所揭示抗體之核酸之哺乳動物細胞株。此等哺乳動物細胞株攜帶包含編碼所揭示抗體之核酸之載體。在一些實施例中，此類細胞株表現所揭示之抗體。
多種技術可適用於產生對本揭示案之抗原蛋白有特異性之單鏈抗體(參見例如美國專利第4,946,778號)。此外，多種方法可適用於構築Fab表現文庫(參見例如Huse等人，1989 Science 246：1275-1281)，以允許快速有效地鑑別出對於蛋白質或其衍生物、片段、類似物或同源物具有所需特異性之單株Fab片段。含有蛋白抗原之獨特型之抗體片段可藉由本領域已知之技術產生，包括但不限於：(i)藉由用胃蛋白酶消化抗體分子而產生之F(ab')2片段；(ii)藉由還原F(a')2片段之二硫橋而生成之Fab片段；(iii)藉由用木瓜蛋白酶及還原劑處理抗體分子而生成之Fab片段，以及(iv)Fv片段。
所揭示之抗CD47抗體亦包括Fv、Fab、Fab’及F(ab')2 CD47片段、單鏈CD47抗體、單域抗體(例如奈米抗體或VHH)、雙特異性CD47抗體以及異源結合CD47抗體。
雙特異性抗體係對至少兩種不同抗原具有結合特異性之抗體。在本發明之情況下，該結合特異性之一係針對CD47之結合特異性。第二結合標靶為 任何其他抗原，且宜為細胞表面蛋白或受體或受體次單元。
用於製備雙特異性抗體之方法係本領域已知的。
按照慣例，雙特異性抗體之重組產生係基於兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對之共表現，其中兩條重鏈具有不同特異性(Milstein及Cuello,Nature,305：537-539(1983))。由於免疫球蛋白之重鏈及輕鏈隨機分配，所以此等雜交瘤(四源杂交瘤(quadromas))產生十種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有正確雙特異性結構。對正確分子之純化通常藉由親和層析步驟來完成。類似程序在1993年5月13日公開之WO 93/08829中以及Traunecker等人，EMBO J.,10：3655-3659(1991)中揭示。
具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)之抗體可變結構域可與免疫球蛋白恆定結構域序列融合。融合物較佳具有免疫球蛋白重鏈恆定結構域，其包含鉸鏈區、CH2區及CH3區之至少一部分。較佳使含有輕鏈結合所必需位點之第一重鏈恆定區(CH1)存在於至少一個融合物中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及編碼免疫球蛋白輕鏈(若需要)之DNA插入單獨之表現載體中，接著共轉染至合適宿主生物體中。關於生成雙特異性抗體之進一步細節，參見例如Suresh等人，Methods in Enzymology,121：210(1986)。
根據WO 96/27011中所述之另一種方法，可對一對抗體分子之間的界面進行工程改造，以使自重組細胞培養物中回收之異源二聚體的百分比最大化。較佳界面包含抗體恆定結構域之CH3區之至少一部分。在此方法中，來自第一抗體分子之界面的一或多個小胺基酸側鏈經較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)替換。藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)替換大胺基酸側鏈，在第二 級抗體體分子之界面上產生大小與一條或多條大側鏈相同或相似之補償「腔體」。此提供一種用於使異源二聚體之產率相對於其他不需要之最終產物(諸如同源二聚體)增加的機制。
雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。用於自抗體片段生成雙特異性抗體之技術已在文獻中描述。例如，可使用化學連接來製備雙特異性抗體。Brennan等人，Science 229：81(1985)描述一種程序，其中以蛋白水解方式使完整抗體裂解，生成F(ab')2片段。在二硫醇錯合劑亞砷酸鈉存在下還原此等片段，以穩定鄰位二硫醇且防止分子間二硫鍵形成。接著將生成之Fab'片段轉變為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接著將Fab'-TNB衍生物中之一種藉由用巰基乙胺還原而再轉變為Fab'-硫醇，且與等莫耳量之另一種Fab'-TNB衍生物混合，形成雙特異性抗體。產生之雙特異性抗體可用作對酶進行選擇性固定之試劑。
此外，Fab'片段可直接自大腸桿菌中回收，接著化學偶合，形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J.Exp.Med.175：217-225(1992)描述完全人類化雙特異性抗體F(ab')2分子之產生。每個Fab'片段分別自大腸桿菌分泌，且在活體外經受定向化學偶合，形成雙特異性抗體。由此形成之雙特異性抗體既能夠結合至過度表現ErbB2受體之細胞及正常人類T細胞，亦觸發人類細胞毒性淋巴細胞對人類乳房腫瘤標靶之溶解活性。
亦已描述直接自重組細胞培養物製備及分離雙特異性抗體片段之各種技術。例如，已使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體。Kostelny等人，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽藉由基因融合與兩 種不同抗體之Fab'部分連接。抗體同源二聚體在鉸鏈區處還原形成單體，接著再氧化以形成抗體異源二聚體。亦可利用此方法來製備抗體同源二聚體。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述之「雙抗體」技術已提供一種用於製備雙特異性抗體片段之替代性機制。該等片段包含藉由連接子與輕鏈可變結構域連接之重鏈可變結構域，該連接子太短而不允許同一條鏈上之兩個結構域之間配對。因此，一個片段之VH結構域及VL結構域被迫與另一個片段之互補VL結構域及VH結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。亦已報導用單鏈Fv(sFv)二聚體製備雙特異性抗體片段之另一種策略。Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)。
考慮具有多於兩個價數之抗體。例如，可製備三特異性抗體。Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。
示例性雙特異性抗體可結合至兩個不同之抗原決定基，其中至少一個抗原決定基起源於蛋白抗原CD47。作為替代，免疫球蛋白分子之抗-抗原性臂可與結合至白血細胞上之觸發分子之臂組合，該觸發分子諸如T細胞受體分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)，或IgG之Fc受體(FcyR)，諸如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)及FcyRIII(CD 16)，以便將細胞防禦機制集中於表現特定抗原之細胞。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑導向表現特定抗原之細胞。此等抗體具有抗原結合臂以及結合細胞毒性劑或放射性核素螯合劑(諸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)之臂。另一種所關注之雙特異性抗體結合本文所述之蛋白抗原，且進一步結合組織因子(TF)。
異源結合抗體亦在範疇之內。異源結合抗體由兩個共價接合之抗體 構成。例如，已提出此類抗體將免疫系統細胞靶向不需要之細胞(參見美國專利第4,676,980號)，且用於治療HIV感染(參見WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。預期可使用合成蛋白質化學中之已知方法(包括涉及交聯劑之方法)在活體外製備抗體。例如，可使用二硫化物交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築免疫毒素。用於達成此目的之合適試劑之實例包括亞胺基硫醇鹽及4-巰基丁醯亞胺甲酯，以及例如美國專利第4,676,980號中所揭示之試劑。
可期望在效應功能方面修飾所揭示之抗體，以便增強例如抗體在治療與異常CD47信號傳導相關聯之疾病及病症中的有效性。舉例而言，可將一或多個半胱胺酸殘基引入Fc區中，從而允許在該區中形成鏈間二硫鍵。由此生成之同型二聚體抗體可具有改善之內化能力及/或增加之補體介導之細胞殺傷及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。(參見Caron等人，J.Exp Med.,176：1191-1195(1992)；以及Shopes,J.Immunol.,148：2918-2922(1992))。作為替代，可對具有雙Fc區之抗體進行工程改造，從而該抗體可具有增強之補體溶解能力及ADCC能力。(參見Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design,3：219-230(1989))。
亦提供包含與細胞毒性劑諸如毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物)結合之本文所揭示抗體的免疫結合物。
可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒蛋白A鏈、α-帚麯黴素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、 苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒蛋白、絲林黴素、侷限麴菌素、酚黴素、依諾黴素及單端孢菌素。多種放射性核素可用於製備放射性結合抗體。實例包括212Bi、131I、131In、90Y及186Re。
抗體及細胞毒劑之結合物係使用多種雙功能蛋白質偶合劑製備，該等雙功能蛋白質偶合劑諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)、亞胺基四氫噻吩(IT)、亞胺酸酯之雙功能衍生物(諸如鹽酸己二醯亞胺酸二甲酯)、活性酯(諸如二琥珀醯亞胺辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯甲醯基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述製備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記之1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於將放射性核苷酸與抗體結合之示例性螯合劑。(參見WO94/11026)。
多種可能之部分可與本揭示案之所得抗體偶合。(參見例如「Conjugate Vaccines」,Contributions to Microbiology and Immunology,J.M.Cruse及R.E.Lewis,Jr(編)，Carger Press,New York,(1989))。
偶合可藉由將結合兩種分子之任何化學反應來完成，只要抗體與其他部分保留其各自之活性即可。該連接可包括許多化學機制，例如共價結合、親和結合、嵌入、配位結合與錯合。然而，較佳結合係共價結合。共價結合可藉由現有側鏈之直接縮合或藉由併入外部橋聯分子來實現。許多二價或多價連 接劑可用於將蛋白分子(諸如所揭示之抗體)偶合至其他分子。例如，代表性偶合劑可包括有機化合物，諸如硫酯、碳化二亞胺、琥珀醯亞胺酯、二異氰酸酯、戊二醛、重氮苯及六亞甲基二胺。該清單並不意欲窮舉本領域已知之各類偶合劑，而是示例較常用之偶合劑。(參見Killen及Lindstrom,Jour.Immun.133：1335-2549(1984)；Jansen等人，Immunological Reviews 62：185-216(1982)；以及Vitetta等人，Science 238：1098(1987)。其他連接子在文獻中有描述。(參見例如Ramakrishnan,S.等人，Cancer Res.44：201-208(1984)，該文獻描述MBS(M-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯)之使用。亦可參見美國專利第5,030,719號，該專利描述藉由寡肽連接子與抗體偶合之鹵化乙醯肼衍生物之使用。示例性連接子包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基-丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽；(ii)SMPT(4-琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)-甲苯(Pierce Chem.Co.，目錄號(21558G)；(iii)SPDP(琥珀醯亞胺基-6[3-(2-吡啶基二硫基)丙醯胺基己酸酯(Pierce Chem.Co.，目錄號216510)；(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀醯亞胺基6[3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯胺]己酸酯(Pierce Chem.Co.，目錄號2165-G)；以及(v)與EDC結合之磺基-NHS(N-羥基磺基-琥珀醯亞胺：Pierce Chem.Co.，目錄號24510)。
上述連接子含有具有不同屬性之組分，從而得到具有不同生理化學性質之結合物。例如，烷基羧酸酯之磺基-NHS酯比芳族羧酸酯之磺基-NHS酯更穩定。含有NHS-酯之連接子比磺基-NHS酯之溶解性差。此外，連接子SMPT含有空間位阻之二硫鍵，且可以形成穩定性增大之結合物。二硫鍵通常不如其他鍵那樣穩定，因為二硫鍵在活體外裂解，導致可用之結合物較少。特別地， 磺基-NHS可增強碳化二亞胺偶合之穩定性。碳化二亞胺偶合(諸如EDC)在與磺基-NHS一起使用時，形成比單獨碳化二亞胺偶合反應更耐水解之酯。
組合物與調配物
提供醫藥組合物，其包含所揭示之抗CD47抗體及醫藥學上可接受之賦形劑(載劑)。
可使用任何合適之賦形劑/載劑。可使用所揭示抗體或包含所揭示抗體之醫藥組合物之任何合適之投與途徑、劑量及給藥方案。
所揭示之抗CD47抗體(在本文中亦稱「活性化合物」)及其衍生物、片段、類似物及同源物可併入適於向患者投與之醫藥組合物中。製備此類組合物所涉及之原理及考慮因素以及選擇組分之指導原則在例如下列文獻中提供：Remington's Pharmaceutical Sciences：The Science And Practice Of Pharmacy，第19版(Alfonso R.Gennaro等人編輯)，Mack Pub.Co.,Easton,Pa.：1995；Drug Absorption Enhancement：Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends,Harwood Academic Publishers,Langhorne,Pa.,1994；以及Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences，第4卷)，1991,M.Dekker,New York。
在使用抗體片段之情況下，可使用特異性結合至靶蛋白之結合域之最小抑制片段。例如，基於抗體之可變區序列，可設計出保留結合靶蛋白序列之能力之肽分子。此類肽可化學合成且/或者藉由重組DNA技術產生。(參見例如Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：7889-7893(1993))。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之賦形劑」意欲包括與藥物投與相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及諸如此類。合適載劑/賦形劑描述於Remington's Pharmaceutical Sciences之最新版本中。此類載體或稀釋劑之實例包括但不限於水、鹽水、林格氏溶液(ringer's solution)、右旋糖溶液及5%人類血清白蛋白。
脂質體及非水性媒劑(諸如不揮發油)亦可用於調配包含所揭示之抗CD47抗體之組合物。此類介質及試劑用於醫藥活性物質之用途係本領域熟知的。除非任何習知介質或試劑與所揭示之抗CD47抗體不相容，否則涵蓋習知介質或試劑在組合物中之使用。
所揭示之抗體亦可調配為免疫脂質體。含有該抗體之脂質體藉由本領域已知之方法製備，諸如下列文獻中所述之方法：Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,77：4030(1980)；以及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號。
美國專利第5,013,556號中揭示循環時間延長之脂質體。特別有用之脂質體可藉由逆相蒸發法，用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物產生。藉由具有限定孔徑之過濾器擠出脂質體，以得到具有所需直徑之脂質體。如Martin等人，J.Biol.Chem.,257：286-288(1982)中所述，可經由二硫化物互換反應將所揭示抗體之Fab'片段結合至脂質體。
用於活體內投與之調配物必須無菌。此容易藉由例如經無菌過濾膜過濾實現。
將醫藥組合物調配為與其預期之投與途徑相容。包含一或多種所揭示之抗CD47抗體之醫藥組合物(有或無額外藥劑，以及包含額外藥劑之醫藥組合物)之投與途徑的實例包括非經腸途徑，例如靜脈內(IV)、皮內、皮下、經口(例如吸入)、經皮(亦即局部)、經黏膜，以及直腸投與。用於非經腸、皮內或皮下 應用之溶液或懸浮液可包含以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用於調節滲透壓之試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。可用諸如鹽酸或氫氧化鈉之酸或鹼調節pH值。非經腸製劑可封裝在安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑膠製成之多劑量小瓶中。
適用於注射用途之醫藥組合物包括無菌水性溶液(水溶性)或分散液，以及用於臨用時方製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投與，合適載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物都必須無菌，且應當為達到易於注射之程度之流體。其在製造條件及儲存條件下必須穩定，且必須防止諸如細菌及真菌之微生物之污染作用。載劑/賦形劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)及其合適混合物之溶劑或分散介質。例如，可藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散之情況下維持所需之粒度，以及藉由使用界面活性劑，維持適當流動性。可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及諸如此類，預防微生物作用。在許多情況下，在該組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇諸如甘露醇、山梨糖醇、氯化鈉。可藉由在該可注射組合物中包含延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁及明膠，延長該組合物之吸收。
無菌可注射溶液可藉由將所揭示之抗CD47抗體以所需之量與上面 列舉之成分中之一種或此等成分之組合(根據需要)一起併入適當溶劑中，接著過濾除菌來製備。通常，藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備分散液，該無菌媒劑含有基礎分散介質及所需之其他來自上面列舉之彼等成分的成分。就用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末而言，製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其產生活性成分加上來自其先前無菌過濾溶液之任何額外所需成分的粉末。
經口組合物一般包含惰性稀釋劑或可食用載劑。其可封裝在明膠膠囊中或壓製成錠劑。出於經口治療投與之目的，可將所揭示之抗CD47抗體與賦形劑合併，接著以錠劑、口含錠或膠囊之形式使用。經口組合物亦可使用流體載劑製備，以用作漱口水，其中該流體載劑中之化合物經口投與，且漱口且吐出，或者咽下。可包含醫藥學上相容之黏合劑及/或佐劑材料，作為該組合物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊、口含錠及諸如此類可含有以下成分中之任一種，或類似性質之化合物：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如海藻酸、Primogel或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，諸如膠體二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或者調味劑，諸如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調味劑。
對於吸入投與，所揭示之抗CD47抗體以氣溶膠噴霧之形式自含有合適推進劑，例如氣體(諸如二氧化碳)之加壓容器或分配器，或噴霧器遞送。
全身投與亦可藉由經黏膜或經皮方式進行。
對於經黏膜或經皮投與，在該調配物中使用適於欲滲透之障壁的滲透劑。此類滲透劑通常係本領域已知的，且包括例如用於經黏膜投與之清潔劑、膽汁鹽及梭鏈孢酸衍生物。經黏膜投與可藉由使用鼻噴霧劑或栓劑來完成。對 於經皮投與，將活性化合物調配成本領域公知之軟膏、藥膏、凝膠或乳膏。
所揭示之抗CD47抗體亦可呈栓劑(例如具有習知栓劑基質，諸如可可脂及其他甘油酯)或滯留型灌腸劑之形式製備，以便用於直腸遞送。
在一些實施例中，所揭示之抗CD47抗體利用將保護所揭示之抗CD47抗體免於自體內快速消除之載劑製備，諸如緩釋/控釋調配物，包括植入物及微膠囊化遞送系統。可使用可生物降解、生物相容之聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。製備此類調配物之方法對於本領域技術人員而言係顯而易見的。
例如，活性成分可包埋在例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或粗乳液中。
可製備緩釋製劑。緩釋製劑之合適實例包括含有抗體之固體疏水聚合物之半透性基質，此等基質係呈成形製品之形式，例如膜或微膠囊。緩釋基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥乙基酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與L-麩胺酸γ-乙基酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林構成之可注射微球)，以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能夠使分子之釋放超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白質之時段較短。
該等材料亦可自Alza Corporation及Nova Pharmaceuticals,Inc.購得。亦 可將脂質體懸浮液(包括靶向受感染細胞之脂質體，該脂質體具有針對病毒抗原之單株抗體)用作醫藥學上可接受之載劑。此等材料可根據本領域技術人員已知，例如如美國專利第4,522,811號中所述之方法製備。
經口組合物或非經腸組合物可按劑量單位形式調配，以便於投與及保持劑量之一致性。如本文所用之劑量單位形式係指適合用作待治療個體之單一劑量之物理離散單位；每個單位均含有經計算以產生期望治療效果之預定量之活性化合物，該活性化合物與需要之醫藥載劑締合。劑量單位形式之規格由下列決定且直接視下列而定：活性化合物之獨特特徵及欲實現之特定治療效果，以及配混此類活性化合物以治療個體之領域中所固有之侷限。該等醫藥組合物可連同投與說明書一起包含在容器、包裝或分配器中。
此等醫藥組合物可包含在套組(諸如診斷套組)中。
組合療法
在一些實施例中，將本文所述之抗CD47抗體與一或多種額外藥劑一起投與給患者。考慮任何合適之藥劑。
合適之額外藥劑包括用於預期應用(諸如癌症)之當前藥物療法及/或外科療法。舉例而言，抗CD47抗體可與一或多種額外化學治療劑或抗腫瘤劑一起投與。作為替代，額外化學治療劑係放射療法。在一些實施例中，化學治療劑係細胞死亡誘導劑。在一些實施例中，化學治療劑誘導跨質膜之磷脂不對稱性喪失，例如引起磷脂醯絲胺酸(PS)暴露於細胞表面。在一些實施例中，化學治療劑誘導內質網(ER)應激。在一些實施例中，化學治療劑係蛋白酶體抑制劑。在一些實施例中，化學治療劑誘導ER蛋白易位至細胞表面。在一些實施例中，化 學治療劑誘導鈣網蛋白易位及細胞表面暴露。
在一些實施例中，將抗CD47抗體及額外藥劑調配成單一治療組合物，因而所揭示之抗CD47抗體及額外藥劑為同時投與。作為替代，所揭示之抗CD47抗體及額外藥劑彼此分開，例如，各自調配成單獨治療組合物，且在治療方案期間將所揭示之抗CD47抗體及額外藥劑同時或在不同時間投與。舉例而言，抗CD47抗體在投與額外藥劑之前或之後投與，或者抗CD47抗體及額外藥劑以交替方式投與。所揭示之抗CD47抗體及額外藥劑可按單劑量或多劑量投與。
調配物亦可含有超過一種對於正在治療之具體適應症而言必需之活性化合物，較佳為具有彼此不產生不利影響之互補活性的彼等活性化合物。作為替代或除此之外，組合物可包含增強其功能之劑，諸如細胞毒性劑、細胞介素、化學治療劑或生長抑制劑。此類分子以有效達成預期目的之量適當地組合存在。
在某些實施例中，活性化合物(其包括所揭示之抗CD47抗體)在組合療法中投與，亦即，與可用於治療病理狀況或病症(諸如各種形式之癌症、自體免疫性病症及炎症性疾病)之其他藥劑(例如治療劑)組合投與。在該語境中，術語「組合」係指實質上並行(同時或相繼地)給予藥劑。若相繼給予，則在開始投與第二種化合物時，該兩種化合物中之第一種仍然可在治療部位處以有效濃度偵測到。
舉例而言，組合療法可包括一或多種所揭示之抗CD47抗體，該抗體與一或多種額外治療劑共同調配及/或共同投與，額外治療劑例如一或多種細胞 介素抑制劑及生長因子抑制劑、免疫抑制劑、消炎劑、代謝抑制劑、酶抑制劑及/或細胞毒性劑或細胞生長抑制劑，如下文更詳細描述。此類組合療法宜利用較低劑量之所投與治療劑，從而避免與各種單一療法相關聯之可能毒性或併發症。
在其他實施例中，所揭示之抗CD47抗體用作針對自體免疫性病症、炎症性疾病等之疫苗佐劑。用於治療此等類型之病症之佐劑組合適合與下列組合使用：來自參與自體免疫之靶向性自身抗原(亦即自體抗原)的眾多種抗原，例如髓鞘鹼性蛋白；炎症性自身抗原，例如澱粉樣肽蛋白，或移植抗原，例如同種異體抗原。抗原可包含來源於蛋白質之肽或多肽，以及下列中任一者之片段：糖類、蛋白質、多核苷酸或寡核苷酸、自體抗原、澱粉樣肽蛋白、移植抗原、過敏原，或其他大分子組分。在一些情況下，抗原組合物中包括超過一種抗原。
本領域已知之基因療法載體亦可與攜帶編碼所揭示之抗CD47抗體之核酸的載體一起使用，且該抗體可藉由人類患者中之合適表現系統表現。
使用所揭示之抗CD47抗體及組合物之方法
本文所述之抗CD47抗體可用於治療癌症或其他腫瘤病狀、延遲癌症或其他腫瘤病狀之進展、預防癌症或其他腫瘤病狀復發或者減輕癌症或其他腫瘤病狀之症狀；諸如治療血液惡性腫瘤及/或血液腫瘤。
本揭示案提供治療患有癌症或其他腫瘤病狀之人類患者的癌症或其他腫瘤病狀、延遲該癌症或其他腫瘤病狀之進展、預防該癌症或其他腫瘤病狀復發、或者減輕該癌症或其他腫瘤病狀之症狀的方法。該方法包括向患者投與治療有效量之所揭示之抗CD47抗體或向患者投與治療有效量的包含所揭示之 抗CD47抗體及醫藥賦形劑及/或載劑之醫藥組合物。該方法進一步包括向患者投與一或多種額外藥劑。在某些實施例中，一或多種額外藥劑係治療劑。在某些另外之實施例中，一或多種治療劑係抗癌劑。
在某些實施例中，本文所述之CD47抗體用於治療CD47+腫瘤。
在一些實施例中，所揭示之抗CD47抗體用於治療非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、急性髓樣白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、多發性骨髓瘤(MM)、乳癌、卵巢癌、頭頸癌、膀胱癌、黑色素瘤、結腸直腸癌、胰臟癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤。實體腫瘤包括例如乳房腫瘤、卵巢腫瘤、肺腫瘤、胰臟腫瘤、前列腺腫瘤、黑色素瘤腫瘤、結腸直腸腫瘤、肺腫瘤、頭頸腫瘤、膀胱腫瘤、食道腫瘤、肝腫瘤及腎腫瘤。
如本文所用，「血液癌症」係指血液之癌症，包括白血病、淋巴瘤及骨髓瘤等。
「白血病」係指血液之癌症，其中形成過多無法有效對抗感染之白血細胞，因而將構成血液之其他部分(諸如血小板及紅血球)擠走。據瞭解，白血病病例分為急性或慢性病例。作為非限制性實例，白血病之某些形式包括急性淋巴球性白血病(ALL)；急性髓樣白血病(AML)；慢性淋巴球性白血病(CLL)；慢性骨髓性白血病(CML)；骨髓增生性病症/贅瘤(MPDS)；及脊髓發育不良症候群。
「淋巴瘤」可指霍奇金氏淋巴瘤、惰性及侵襲性非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤及濾泡性淋巴瘤(小細胞及大細胞)等等。
骨髓瘤可指多發性骨髓瘤(MM)、巨細胞性骨髓瘤、重鏈骨髓瘤，以 及輕鏈骨髓瘤或本瓊氏骨髓瘤。
在其他態樣中，提供藉由向有需要之個體投與一或多種所揭示之抗CD47抗體來減輕癌症或其他腫瘤病狀之症狀的方法。抗體在投與之後不引起紅血球之顯著血球凝集水準。抗體之投與量足以減輕個體中之癌症或其他腫瘤病狀之症狀。
投與治療實體將包括合適賦形劑，以及摻入調配物中以提供改善之轉移、遞送、耐受性及其類似特性之其他試劑。眾多適當調配物可在所有醫藥化學家已知之處方集中找到：Remington's Pharmaceutical Sciences(第15版，Mack Publishing Company,Easton,PA(1975))，尤其其中由Blaug、Seymour所著之第87章。此等調配物包括例如散劑、糊劑、軟膏、凝膠劑、蠟、油、脂質、含有小泡之脂質(陽離子或陰離子型)(諸如LipofectinTM)、DNA結合物、無水吸收糊劑、水包油及油包水乳液、乳液碳蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠以及含有碳蠟之半固體混合物。倘若調配物中之活性成分未由調配物滅活且調配物與投與途徑在生理上係相容且耐受的，則前述混合物中之任一種在治療及療法中均可為適當的。亦參見Baldrick P.Regul.Toxicol Pharmacol.32(2)：210-8(2000)；Wang W.Int.J.Pharm.203(1-2)：1-60(2000)；Charman WN J Pharm Sci.89(8)：967-78(2000)；Powell等人PDA J Pharm Sci Technol.52：238-311(1998)及其中引用之有關醫藥化學家熟知之調配物、賦形劑及載劑之額外資訊。
與癌症及其他贅生性病症相關聯之症狀包括例如炎症、發燒、全身不適、發燒、疼痛(通常侷限於發炎區域)、食慾不振、體重減輕、水腫、頭痛、疲勞、皮疹、貧血、肌肉無力、肌肉疲勞及腹部症狀，諸如腹痛、腹瀉或便秘。
所揭示之抗CD47抗體之治療有效量通常係指用於實現治療目的所需之量。如上所述，此可為抗體與其靶抗原之間的結合相互作用，該相互作用在某些情況下干擾標靶之功能。治療目標包括例如癌症消退、癌症治癒、一或多種癌症症狀減輕，以及將患者之死亡日延後至少一天。
投與需要之所揭示抗CD47抗體之量視抗體對其特異性抗原之結合親和力而定，且亦視所投與之抗體自投與該抗體之其他個體的自由體積中消減之速率而定。作為非限制性實例，所揭示之抗CD47抗體之治療有效劑量之常見範圍可為約0.1mg/kg體重至約100mg/kg體重。在一些實施例中，將所揭示之抗體以0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg或更大之劑量投與給個體。常見之給藥頻率可在例如自每天兩次至每週一次之範圍內。
治療有效性與用於診斷或治療疾病(諸如癌症)之任何已知方法相關聯地確定。疾病之一或多種症狀減輕表明抗體賦予臨床益處，因而具有治療效果。
在某些實施例中，所揭示之抗CD47抗體(其包括單株抗體)可用作治療劑。此類劑可用於診斷、預測、監測、治療、緩解及/或預防與個體中之異常CD47表現、活性及/或信號傳導相關聯之疾病或病情。治療方案係藉由使用標準方法鑑別個體，例如患有與異常之CD47表現、活性及/或信號傳導相關聯之疾病或病症(例如癌症或其他贅生性病症)(或有患上該疾病或病症之風險)的人類患者來進行。將抗體製劑(較佳對其靶抗原具有高特異性及高親和力之抗體製劑)投與給個體，且通常將由於與標靶結合而起作用。投與抗體可消除或抑制或干 擾標靶(例如CD47)之表現、活性及/或信號傳導功能。投與抗體可消除或抑制或干擾標靶(例如CD47)與其天然結合之內源性配位體(例如SIRP α)之結合。舉例而言，抗體結合至標靶且調控、阻斷、抑制、減小、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47之表現、活性及/或信號傳導。
作為非限制性實例，與異常之CD47表現、活性及/或信號傳導相關之疾病或病症包括血液癌症及/或實體腫瘤。血液癌症包括例如白血病、淋巴瘤及骨髓瘤。作為非限制性實例，白血病之某些形式包括急性淋巴球性白血病(ALL)；急性髓樣白血病(AML)；慢性淋巴球性白血病(CLL)；慢性骨髓性白血病(CML)；骨髓增生性病症/贅瘤(MPDS)；及脊髓發育不良症候群。作為非限制性實例，淋巴瘤之某些形式包括霍奇金氏淋巴瘤、惰性及侵襲性非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤及濾泡性淋巴瘤(小細胞及大細胞)。作為非限制性實例，骨髓瘤之某些形式包括多發性骨髓瘤(MM)、巨細胞性骨髓瘤、重鏈骨髓瘤，以及輕鏈骨髓瘤或本瓊氏骨髓瘤。實體腫瘤包括例如乳房腫瘤、卵巢腫瘤、肺腫瘤、胰臟腫瘤、前列腺腫瘤、黑色素瘤腫瘤、結腸直腸腫瘤、肺腫瘤、頭頸腫瘤、膀胱腫瘤、食道腫瘤、肝腫瘤及腎腫瘤。
用於篩選具有所需特異性之抗體之方法包括但不限於酶聯免疫吸附分析法(ELISA)及本領域內已知之其他免疫介導技術。
在其他實施例中，針對CD47之抗體可用於本領域內已知的與CD47之定位及/或定量有關之方法中(例如用於量測適當生理樣品內之CD47水準及/或CD47與SIRP α兩者之水準，用於診斷方法中，用於使蛋白質成像及其類似方法)。
在其他實施例中，抗CD47抗體可用於藉由標準技術(諸如免疫親和、層析或免疫沈澱)分離CD47多肽。針對CD47蛋白(或其片段)之抗體可在診斷上用於監測組織中之蛋白水準，作為臨床試驗程序之一部分，例如以確定給定治療方案之功效。
藉由將抗體與可偵測物質偶合(亦即物理連接)，可促進偵測。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料及放射性材料。合適酶之實例包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；合適輔基複合物之實例包括鏈黴親和素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；合適螢光材料之實例包括傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹黃醯氯或藻紅蛋白；發光材料之實例包括魯米諾；生物發光材料之實例包括螢光素酶、螢光素及水母發光蛋白，合適放射性材料之實例包括125I、131I、35S或3H。
在一些實施例中，抗體含有可偵測之標記。抗體可為例如多株抗體或單株抗體。使用完整抗體或其片段(例如Fab、scFv或F(ab')2)。有關探針或抗體之術語「標記之」意欲涵蓋藉由將可偵測物質與探針或抗體偶合(亦即物理連接)而直接標記探針或抗體，以及藉由與直接標記之另一種試劑反應而間接標記探針或抗體。間接標記之實例包括使用螢光標記之二級抗體偵測一級抗體，以及用生物素對DNA探針進行末端標記，使得可用螢光標記之鏈黴親和素偵測該DNA探針。
術語「生物樣品」意欲包括自個體分離之組織、細胞及生物流體，以及個體體內存在之組織、細胞及流體。因此，術語「生物樣品」內包括血液及血液之級分或組分，包括血清、血漿或淋巴液。亦即，偵測方法可用於在活 體外以及在活體內偵測生物樣品中之分析物mRNA、蛋白質或基因組DNA。例如，用於偵測分析物mRNA之活體外技術包括北方雜交及原位雜交。用於偵測分析物蛋白之活體外技術包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)、西方墨點法(Western blot)、免疫沈澱及免疫螢光。用於偵測分析物基因組DNA之活體外技術包括南方雜交。用於進行免疫測定之程序在例如下列文獻中描述：「ELISA：Theory and Practice：Methods in Molecular Biology」，第42卷，J.R.Crowther(編輯)，Human Press,Totowa,NJ,1995；「Immunoassay」,E.Diamandis及T.Christopoulus,Academic Press,Inc.,San Diego,CA,1996；以及「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays」,P.Tijssen,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,1985。此外，用於偵測分析物蛋白之活體內技術包括向個體中引入標記之抗分析物蛋白抗體。例如，可用放射性標記物標記抗體，該放射性標記物在個體中之存在及其位置可藉由標準成像技術來偵測。
其他治療劑之設計與生成
基於本文關於CD47產生及表徵之抗體之活性，促進對超出抗體部分之其他治療模態之設計。此類模態包括但不限於高級抗體治療劑，諸如雙特異性抗體、免疫毒素及放射性標記之治療劑、生成肽治療劑、基因療法(尤其胞內抗體)、反義治療劑及小分子。
可生成如下雙特異性抗體，其包括(i)結合在一起之兩種抗體，一種對CD47有特異性且另一種對第二種分子有特異性；(ii)一條鏈對CD47有特異性且第二條鏈對第二種分子有特異性之單一抗體；或者(iii)對CD47及第二種分子有特異性之單鏈抗體。此類雙特異性抗體係使用熟知之技術產生(參見例如Fanger等人，Immunol Methods 4：72-81(1994)；Wright等人，Crit,Reviews in Immunol.12125-168(1992)；Traunecker等人，Int.J.Cancer(增刊)7：51-52(1992))。
可利用本領域熟知之技術來修飾抗體，以充當免疫毒素。參見例如Vitetta Immunol Today 14：252(1993)。亦可參見美國專利第5,194,594號。
製備放射性標記之抗體，此類經修飾之抗體亦可利用本領域熟知之技術容易地製備。參見例如Junghans等人，Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(第二版，Chafner及Longo編輯，Lippincott Raven(1996))。亦可參見美國專利第4,681,581號、第4,735,210號、第5,101,827號、第5,102,990號(RE 35,500)、第5,648,471號及第5,697,902號。
免疫毒素及放射性標記之分子中之每一種均有可能殺死表現CD47之細胞。
藉由利用與CD47及其抗體(諸如所揭示之抗CD47抗體)相關之結構資訊，或者篩選肽文庫，可生成針對CD47之治療性肽。肽治療劑之設計及篩選在下列文獻中加以討論：Houghten等人，Biotechniques 13：412-421(1992),Houghten PNAS USA 82：5131-5135(1985)；Pinalla等人，Biotechniques 13：901-905(1992)；Blake及Litzi-Davis BioConjugate Chem.3：510-513(1992)。
亦可製備免疫毒素、放射性標記之分子及肽部分。假設CD47分子(或形式，諸如剪接變異體或另選形式)在疾病過程中具有功能活性，則亦可藉由習知技術設計基因及其反義治療劑。此類模態可用於調控CD47之功能。所揭示之抗CD47抗體有助於設計及使用與其相關之功能分析法。國際專利申請案第WO 94/29444號中詳細討論了反義治療劑之設計與策略。基因療法之設計及策略係熟知的。亦提供涉及胞內抗體之基因治療技術之用途。參見例如Chen等人，Human Gene Therapy 5：595-601(1994)，以及Marasco Gene Therapy 4：11-15(1997)。國際專 利申請案第WO 97/38137號中亦討論與基因治療劑有關之一般設計及考慮因素。
自CD47分子之結構及其與其他分子(諸如SIRP α及/或所揭示之抗CD47抗體)等之相互作用收集的知識可用於合理地設計額外治療模態。就這一點而言，可利用合理之藥物設計技術，諸如X射線晶體學、計算機輔助(或協助)分子建模(CAMM)、定量或定性結構活性關係(QSAR)及類似技術來聚焦藥物發現工作。合理之設計允許預測可與分子或其特定形式相互作用之蛋白結構或合成結構，此等結構可用於修飾或調控IL-6Rc之活性。此類結構可化學合成，或者在生物系統中表現。此方法已在Capsey等人，Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs(Stockton Press,NY(1988))中綜述。此外，可設計與合成組合文庫，且將其用於篩選程序，諸如高通量篩選工作。
篩選方法
在某些實施例中，提供一種方法，其包括藉由鑑別破壞CD47與SIRP α之相互作用的化合物來鑑別干擾CD47與SIRP α結合之化合物。此等方法(在本文中亦稱「篩選分析法」)用於鑑別調控劑，亦即調控或以其他方式干擾CD47與SIRP α結合之候選化合物或測試化合物或藥劑(例如肽、肽模擬物、小分子或其他藥物)，或者調控或以其他方式干擾CD47及/或CD47-SIRP α之信號傳導功能的候選化合物或測試化合物或藥劑。亦提供鑑別可用於治療與異常之CD47及/或CD47-SIRP α表現、活性及/或信號傳導相關聯之病症之化合物的方法。篩選方法可包括本領域已知或使用之方法，或者本文所述之方法。例如，可將CD47固定在微量滴定盤上，接著在SIRP α存在下與候選化合物或測試化合物(例如CD47抗體)一起培育。隨後，可使用二級抗體偵測結合之SIRP α，且 可在讀盤機上偵測吸光度。
在某些實施例中，提供一種方法，包括鑑別促進巨噬細胞對腫瘤細胞之吞噬作用之化合物。此等方法可包括本領域已知或使用之方法，或者本文所述之方法。例如，在候選化合物(例如CD47抗體)存在下，將巨噬細胞與標記之腫瘤細胞一起培育。一段時間之後，可觀察巨噬細胞對腫瘤標記之內化，以鑑別吞噬作用。實例中提供關於此等方法(例如SIRP α阻斷分析法及吞噬作用分析法)之額外細節。
在某些實施例中，提供一些分析法，包括篩選調控CD47之信號傳導功能之候選化合物或測試化合物。可使用本領域已知之組合文庫方法中之多種方法中的任一種獲得測試化合物，該組合文庫方法包括生物文庫；空間可尋址之平行固相或溶液相文庫；需要去卷積之合成文庫法；「一珠一化合物(one-bead one-compound)」文庫法；以及使用親和層析選擇之合成文庫法。生物文庫方法侷限於肽文庫，而其他四種方法適用於肽、非肽寡聚體或化合物之小分子文庫。(參見例如Lam,1997.Anticancer Drug Design 12：145)。
如本文所用之「小分子」，係指分子量小於約5kD，最佳小於約4kD之組合物。小分子可為例如核酸、肽、多肽、肽模擬物、碳水化合物、脂質或者其他有機或無機分子。化學混合物及/或生物混合物(諸如真菌、細菌或藻類提取物)之文庫係本領域已知的，且可使用本文所揭示或本領域已知之分析法中的任一種篩選。
用於合成分子文庫之方法之實例可在本領域中找到，例如在下列文獻中找到：DeWitt等人，1993.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb等人，1994. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：11422。
化合物之文庫可呈現於溶液中(參見例如Houghten,1992.Biotechniques 13：412-421)或珠粒上(參見Lam,1991.Nature 354：82-84)、晶片上(參見Fodor,1993.Nature 364：555-556)、細菌上(參見美國專利第號5,223,409)、孢子上(參見美國專利5,233,409)、質體上(參見Cull等人，1992.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869)或噬菌體上(參見Scott及Smith,1990.Science 249：386-390，以及美國專利第5,233,409號)。
在某些實施例中，提供一種方法，其包括鑑別破壞抗CD47/CD47複合物之化合物。在一些實施例中，將候選化合物引入抗體-抗原複合物中，且確定候選化合物是否破壞該抗體-抗原複合物，其中該複合物之破壞表明候選化合物調控CD47之信號傳導功能及/或CD47與SIRP α之間的相互作用。在其他實施例中，提供可溶性CD47及/或CD47與SIRP α蛋白兩者，且將其暴露於至少一種中和性單株抗體。偵測抗體-抗原複合物之形成，且將一或多種候選化合物引入該複合物中。若引入一或多種候選化合物之後破壞抗體-抗原複合物，則該候選化合物可用於治療與異常之CD47及/或CD47-SIRP α信號傳導相關聯之病症。
確定測試化合物干擾或破壞抗體-抗原複合物之能力之方法可為例如使測試化合物與放射性同位素或酶促標記偶合，使得可藉由偵測複合物中之標記化合物而確定測試化合物與抗原或其生物活性部分之結合。例如，可用I125、S35、C14或H3直接或間接標記測試化合物，且藉由放射性發射直接計數或藉由閃爍計數偵測放射性同位素。作為替代，可使用例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸 酶或螢光素酶對測試化合物進行酶促標記，且藉由確定適當受質向產物之轉化而偵測酶促標記。
在一些實施例中，該分析法包括使抗體-抗原複合物與測試化合物接觸，且確定測試化合物與抗原相互作用或以其他方式破壞現有之抗體-抗原複合物的能力。確定測試化合物與抗原相互作用及/或破壞抗體-抗原複合物之能力包括確定測試化合物相較於結合至抗體，優先結合至抗原或其生物活性部分之能力。
在其他實施例中，該分析法包括使抗體-抗原複合物與測試化合物接觸，且確定測試化合物調控抗體-抗原複合物之能力。可例如藉由確定在測試化合物存在下抗原結合至抗體或與抗體相互作用之能力來確定測試化合物調控抗體-抗原複合物之能力。
在本文所揭示之任一種篩選方法中，該抗體可為調控或以其他方式干擾CD47活性及/或信號傳導之中和性抗體。
本文所揭示之篩選方法可作為基於細胞之分析法或無細胞分析法來執行。無細胞分析法適合使用可溶形式或膜結合形式之CD47及其片段。就包括膜結合形式之CD47之無細胞分析法而言，可使用增溶劑，使得膜結合形式之蛋白維持在溶液中。此類增溶劑之實例包括非離子型清潔劑，諸如正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛醯基-N-甲基葡糖醯胺、癸醯基-N-甲基葡糖醯胺、Triton® X-100、Triton® X-114、Thesit®、異十三烷基聚(乙二醇酯)n、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、3-(3-膽醯胺丙基)二甲基胺基-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS)或3-(3-膽醯胺丙基)二甲基胺基-2-羥基-1-丙烷磺酸 鹽(CHAPSO)。
在某些實施例中，將抗體或抗原固定，以便在引入候選化合物後促進一種或兩種複合形式與未複合形式分離，以及適應該分析法之自動化。可在適用於包含反應物之任意容器內觀察存在或不存在候選化合物時之抗體-抗原複合物。此類容器之實例包括微量滴定盤、試管及微量離心管。在一些實施例中，可提供融合蛋白，該融合蛋白添加允許該蛋白中之一種或兩種與基質結合的結構域。例如，可將GST-抗體融合蛋白或GST-抗原融合蛋白吸附至麩胱甘肽瓊脂糖珠(Sigma Chemical,St.Louis,MO)或谷胱甘肽衍生之微量滴定盤上，隨後將其與測試化合物合併，且將該混合物在有利於複合物形成之條件下(例如在生理之鹽及pH條件下)培育。
培育後，清洗珠粒或微量滴定盤孔，以除去任何未結合之組分，在使用珠粒之情況下基質固定，亦即可直接或間接地確定複合物。作為替代，複合物可自基質解離，且可使用標準技術確定抗體-抗原複合物形成之水準。
用於將蛋白質固定在基質上之其他技術亦可用於篩選分析法。例如，抗體(例如具有選自SEQ ID NO：349、351、353、355、357、359、361-373、380-383、388-392之可變重鏈以及選自SEQ ID NO：350、352、354、356、358、360、374-379、384-387及393-396之可變輕鏈的抗體)或抗原(例如CD47蛋白)可利用生物素與鏈黴親和素之結合來加以固定。可使用本領域內熟知之技術(例如Pierce Chemicals,Rockford,1L,USA之生物素化套組)由生物素-NHS(N-羥基-琥珀醯亞胺)製備生物素化之抗體分子或抗原分子，且固定在經鏈黴親和素塗佈之96孔盤(Pierce Chemicals)之孔內。作為替代，可將能與所關注之抗體或抗原反應、 卻不干擾所關注之抗體-抗原複合物形成之其他抗體衍生化至盤之孔中，且藉由抗體結合將未結合之抗體或抗原截留在孔中。除了上文所述用於GST固定之複合物之方法外，偵測此類複合物之方法亦包括使用能與抗體或抗原反應之此類其他抗體對複合物進行免疫偵測。
亦提供由此等篩選分析鑑別之化合物。
診斷調配物及預防性調配物
所揭示之抗CD47抗體可用在診斷調配物及預防性調配物中。在一些實施例中，將所揭示之抗CD47抗體投與有患上前述疾病中之一或多種(諸如但不限於癌症或其他腫瘤病狀)之風險的患者。可使用基因型標記物、血清學標記物或生物化學標記物確定患者或器官患上前述癌症或其他腫瘤病狀中之一或多者的傾向性。
在其他實施例中，將所揭示之抗CD47抗體投與經診斷患有與前述疾病中之一或多者(諸如但不限於癌症或其他腫瘤病狀)相關聯之臨床適應症的人類個體。診斷後，投與所揭示之抗CD47抗體，以減輕或逆轉與前述疾病中之一或多者相關聯之臨床適應症的作用。
所揭示之抗CD47抗體亦可用於偵測患者樣品中之CD47及/或SIRP α，因而可用作診斷劑。例如，所揭示之抗CD47抗體可用於活體外分析法，例如ELISA，以偵測患者樣品中之CD47水準及/或SIRP α水準。
在一些實施例中，將所揭示之抗CD47抗體固定在固體支撐物(例如微量滴定盤之一或多個孔)上。固定之抗體充當捕獲抗體，用於捕獲試驗樣品中可能存在之任何CD47及/或SIRP α。在使固定之抗體接觸患者樣品之前，沖洗 固體支撐物且使用阻斷劑(諸如乳蛋白或白蛋白)處理，以避免分析物之非特異性吸附。
隨後使用疑似含有抗原之試驗樣品或使用含有標準量抗原之溶液對該等孔進行處理。此類樣品係例如來自個體之血清樣品，該個體疑似具有認為可診斷某一病情之循環抗原水準。沖洗掉試驗樣品或標準品之後，使用可偵測地標記之二級抗體處理固體支撐物。該標記之二級抗體充當偵測抗體。量測可偵測標記之水準，藉由與由標準樣品建立之標準曲線進行比較來確定試驗樣品中之CD47及/或SIRP α之濃度。
基於使用所揭示之抗CD47抗體在活體外診斷分析中獲得之結果，可基於CD47及/或SIRP α之表現水準對個體中之疾病(例如與缺血、自體免疫性病症或炎症性病症相關聯之臨床適應症)進行分級。對於給定之疾病，自經診斷處於疾病發展之各個階段及/或處於疾病治療性治療之各個點的個體獲取血液樣品。使用為發展或療法之每個階段提供統計上顯著結果之樣品群體，指定可認為係每個階段之特徵之抗原濃度範圍。
對出版物及專利文獻之引用並不意欲承認任何出版物及專利文獻係相關之先前技術，其亦不構成對此等出版物及專利文獻之內容或日期的任何承認。
現已以書面說明之方式描述本發明，本領域之技術人員將認識到，可採用多種實施例實踐本發明，且上文之描述及下文之實例係出於說明之目的而非限制隨後申請專利範圍。
實例 實例1.抗CD47抗體之生成及選擇
抗CD47抗體係藉由用具有Fc標籤之重組人類CD47(CD47-Fc)之細胞外結構域對小鼠進行免疫接種而生成。使用200μl等量預混合之50μg CD47-Fc蛋白及完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich)皮下免疫接種小鼠。隨後，用200μl等量預混合之25μg CD47-Fc蛋白及不完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich)交替地以腹膜內及皮下方式加強此等小鼠，每兩週執行三次。融合前4天，用不含佐劑之25μg CD47-Fc以腹膜內方式加強所選擇之小鼠。在完成免疫接種計劃之後，收穫所有小鼠之淋巴結且解離，從而使B細胞分離，隨後與小鼠骨髓瘤細胞融合。藉由ELISA(圖1A)且藉由關於Raji細胞之流動式細胞量測術(圖1B)，針對與CD47之結合，篩選雜交瘤上清液與經純化之鼠類CD47單株抗體兩者。
實例2.鼠類CD47抗體之活體外表徵 抗CD47抗體之血球凝集活性
為評估鼠類抗體之血球凝集能力，將人類RBC與劑量範圍之抗CD47抗體或對照一起在96孔盤中培育。血球凝集之證據表現為存在未沈降之RBC，與未發生血球凝集之RBC之斑點狀點相比，看起來模糊。如圖2A及圖2B所示，儘管存在已知會引起血球凝集之B6H12抗體，但大多數鼠類抗體在任何測試濃度下均未表現出血球凝集活性。
簡言之，在實驗當天自健康供體分離人類紅血球(RBC)。用PBS洗滌細胞數次，且在分析緩衝液中將RBC稀釋至每毫升2億個細胞。將50μl細胞溶液與2×抗體溶液置於圓底96孔盤中，輕輕混合。將盤在37℃/5% CO2培育箱中培育2小時之後，拍攝分析盤之照片。
與人類CD47之結合
評估鼠類CD47抗體與人類CD47結合之能力。如圖3所示，鼠類CD47抗體與人類CD47結合。
在過度表現人類CD47之CHO細胞(GenScript，目錄號M00581)上評估與細胞表現之人類CD47的結合。在FACS緩衝液中製備抗CD47抗體之系列稀釋液。將CHO-K1/人類CD47細胞轉移至96孔U形底盤中，添加抗CD47抗體稀釋液。在4℃下培育30分鐘之後，將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，添加山羊抗人類IgG(H+L)二級抗體、Alexa Fluor® 647(Thermo Fisher，目錄號A-21445)，或添加PE山羊抗小鼠IgG(最小交叉反應性)抗體(BioLegend，目錄號405307)，在4℃下培育30分鐘。接著將細胞用洗滌緩衝液洗滌兩次。藉由FACSCalibur(BD Bioscience,San Jose,CA)及Flowjo軟體分析細胞之結合。
與食蟹猴CD47之結合
評估鼠類CD47抗體與食蟹猴(cyno)CD47結合之能力。如圖4A及圖4B所示，鼠類CD47抗體與cyno CD47結合。
簡言之，在過度表現cyno CD47之CHO細胞上評估與細胞表現之cyno CD47的結合。在FACS緩衝液中製備抗CD47抗體之系列稀釋液。將CHO-K1/食蟹猴CD47細胞轉移至96孔U形底盤中，添加CD47抗體稀釋液。在4℃下培育30分鐘之後，將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次。接著添加山羊抗人類IgG(H+L)二級抗體、Alexa Fluor® 647(Thermo Fisher，目錄號A-21445)，或添加PE山羊抗小鼠IgG(最小交叉反應性)抗體(BioLegehd，目錄號405307)；將反應物在4℃下培育30分鐘(min)。將細胞用洗滌緩衝液洗滌兩次，接著藉由使用FACSCalibur (BD Bioscience,San Jose,CA)及Flowjo軟體分析細胞之結合。
抗CD47抗體之SPR親和力
使用BIACORETM T200儀器(GE Healthcare)進行SPR分析，且使用BIACORETM T200評估軟體測定動力學常數。選擇實驗參數，以確保在最高抗原濃度下將達到飽及，且Rmax值將保持在100RU以下。使用EDC激活之胺偶合化學將GE抗人類IgG(Fc特異性，約7,000RU)固定在BIACORETM CM5晶片上。接著使用該表面捕獲抗CD47抗體(5μg/mL，捕獲時間為60秒)。接下來，使用系列稀釋液以系列濃度使人類CD47-His蛋白流過所捕獲之抗體。在每個循環之間使用50mM HCl移除捕獲之抗體及抗原，以確保在每種抗原濃度下新鮮之結合表面。使用1：1結合模型對所得之感測圖進行全域擬合，以計算結合速率與解離速率(分別為ka及kd)，以及親和力(KD)。結果示於圖5中。
SIRP α阻斷CD47抗體之活性
SIRP α係CD47之天然配位體。使用基於流動式細胞量測術之分析法量測鼠類抗體阻斷CD47-SIRP α相互作用之能力。將過度表現人類CD47之CHO-K1/huCD47與鼠類CD47抗體或對照抗體(B6H12)一起培育。如圖6所示，鼠類抗體強效地阻斷CD47-SIRP α相互作用。
簡言之，將人類CD47轉染之CHO細胞(GenScript，目錄號M00581)與人類SIRP α(R&D，目錄號4546-SA-050)及抗CD47抗體稀釋液一起培育。在4℃下培育30分鐘之後，將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次。接著添加人類SIRP αPE結合抗體(R&D，目錄號FAB4546P)，在4℃下培育30分鐘；將細胞用洗滌緩衝液洗滌兩次，接著藉由使用FACSCalibur(BD Bioscience,San Jose,CA)及Flowjo 軟體分析細胞之結合。
靶癌細胞株之吞噬作用
CD47係在腫瘤細胞上上調之細胞表面受體，且亦認為其藉由與其天然配位體SIPR α之相互作用而促進免疫逃避。評估鼠類抗體對靶細胞之吞噬作用的影響。
簡言之，用抗CD47抗體或同型對照處理靶細胞(PKH26標記之CCRF/CEM)1小時，接著在37℃/5% CO2培育箱中與效應細胞(自人類外周血分離且在活體外用M-CSF分化12至14天之原代人類巨噬細胞)以1：5之比率共培養1小時。共培養之後，用胰蛋白酶消化細胞，接著用抗CD11-APC染色，再藉由流動式細胞量測術進行分析。
吞噬作用百分比(%)作為CD11+ PKH26+事件在總PKH26+細胞中所占之百分比量測，如藉由流動式細胞量測術量測。
此外，如在圖7A及圖7B中所示，此等鼠類CD47抗體增大腫瘤細胞株CCRF-CEM之吞噬作用。
紅血球之吞噬作用
為評估鼠類CD47抗體之吞噬作用能力，首先評估鼠類抗CD47抗體結合至RBC上之CD47的能力(圖8)。所有鼠類CD47抗體均與RBC結合。如圖9所示，所有鼠類抗體均增加巨噬細胞之吞噬攝取。
簡言之，自健康供體分離人類紅血球且用CFSE標記。將標記之RBC與抗CD47抗體或同型對照一起預培育1小時，接著在37℃/5% CO2培育箱中與人類巨噬細胞(自人類外周血分離且在活體外用M-CSF分化12至14天)以5：1之 靶細胞-效應細胞比率共培養1小時。共培養之後，用胰蛋白酶消化細胞，接著用抗CD11-APC染色，且藉由流動式細胞量測術進行分析。
吞噬作用%作為CD11+ CFSE+事件在總CFSE+細胞中所占之百分比量化，如藉由流動式細胞量測術量測。
實例3.對抗CD47抗體進行測序
鑑別13種鼠類抗體(55F2C4、98E2E7、98E2E12、98G5F6、98G5F11、107F11B11、107F11C4、107F11F10、108C10A6、108C10F5、112E5D9、112E5F2、112E5H7)之重(VH)鏈可變區及輕(VL)鏈可變區之序列。自雜交瘤細胞中分離總RNA且逆轉錄成cDNA。藉由混合特異性引子擴增重鏈可變區及輕鏈可變區。藉由IMGT/V-QUEST分析序列。該等序列以SEQ ID NO：349至360揭示。
實例4.嵌合抗體生成
藉由用人類重鏈恆定結構域及輕鏈恆定結構域之編碼序列置換同源鼠類序列以生成嵌合抗體來修飾上述鼠類抗體之DNA(參見美國專利第4,816,567號；Morrison等人，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851)。將構築體轉染至哺乳動物細胞株中，以表現嵌合抗體。將條件培養基中之所分泌抗體負載至蛋白A管柱上。在若干次洗滌及溶析步驟之後，將經純化之嵌合抗體緩衝交換至1X PBS緩衝液中。分別藉由OD280及SEC-HPLC測定經純化嵌合抗體蛋白之濃度及純度。
三種嵌合抗體(108C10A6、98E2E12及107F11F10)之重鏈序列以SEQ ID NO：397、404及406揭示。三種嵌合抗體(108C10A6、98E2E12及107F11F10)之輕鏈序列以SEQ ID NO：398、405及407揭示。
如圖10及圖11所示，此等嵌合CD47抗體增大腫瘤細胞株CCRF-CEM之吞噬作用且無RBC血球凝集。
實例5.抗體人類化
使用CDR移植技術(參見例如美國專利第5,225,539號)將108C10A6、107F11B11及98E2E7抗體人類化。簡言之，將鼠類抗體108C10A6、107F11B11及98E2E7之可變鏈序列與結構生物資訊學研究合作組織(RCSB)蛋白質數據庫中可獲得之彼等可變鏈序列進行比較。基於最接近之VH結構及VK結構生成108C10A6、107F11B11及98E2E7之同源模型。鑑別且分析與108C10A6、107F11B11及98E2E7具有最高一致性之人類序列。Foote及Winter,J.Mol.Biol.224：487-499(1992)；Morea V.等人，Methods 20：267-279(2000)；Chothia C.等人，J.Mol.Biol.186：651-663(1985)。鑑別在上面建立CDR移植之重鏈及輕鏈的最適當人類構架。
對於重鏈，由Genbank登錄號BAH04539編碼之構架確定為最適合於所有三種抗體。對於輕鏈，由Genbank登錄號AAC41992、AAZ09096及ADU32611編碼之構架確定為分別最適合於108C10A6、107F11B11及98E2E7。進行直接移植，以生成每條鏈之表現構築體。108VH1、108VL1、107VH1、107VL1、98VH1及98VL1之DNA序列及蛋白序列在序列表(SEQ ID NO：18、27、33、37、41及46)中揭示。
在人類化抗體之親和力喪失的情況下，將若干個構架殘基回復突變成其鼠類對應物，以恢復抗體之結合親和力。對於108C10A6之VH，製備人類化變異體108VH2、108VH3、108VH4及108VHa(SEQ ID NO：9、19、20、22及21)。將108VH4之CDR2之脯胺酸53突變為丙胺酸，以除去潛在之酸不穩定之Asp-Pro 熱點(亦即108VH4.M4，SEQ ID NO：25)。對於108C10A6之VL，製備人類化變異體108VL1.M1、108VL2.M1及108VL3.M1(SEQ ID NO：10、29、30、31)。在此等人類化VL變異體中，VL-CDR1之離胺酸24突變為精胺酸。
在人類化抗體之親和力喪失之情況下，將幾個構架殘基回復突變成其鼠類對應物，以恢復抗體之結合親和力。對於107F11B11之VH，製備人類化變異體107VH2及107VH3(SEQ ID NO：7、34、35)。對於107F11B11之VL，製備人類化變異體107VL1.M1及107VL2.M1(SEQ ID NO：8、38、39)。在此等人類化VL變異體中，VL-CDR1之組胺酸24突變為精胺酸。
在人類化抗體之親和力喪失之情況下，將幾個構架殘基回復突變成其鼠類對應物，以恢復抗體之結合親和力。對於98E2E7之VH，製備人類化變異體98VH2、98VH3及98VHa(SEQ ID NO：3、42、43、44)。對於98E2E7之VL，製備人類化變異體98VL2及98VL3(SEQ ID NO：4、47、48)。
將相同抗體之人類化重鏈及輕鏈混合且匹配，以製備一系列人類化抗體。此等抗體係使用HEK293細胞短暫產生。收集上清液，使用SPR進行親和力評估。最後，選擇人類化抗體108VH4.M4_VL1.M1及108VH1_VL1.M1用於大規模生產及功能性譜分析。
構築四種型式之人類化抗體，亦即IgG4P(具有穩定Adair突變(Angal S.等人，Mol.Immuol.30：105-108(1993))，其中絲胺酸228(Kabat編號)轉變為脯胺酸)、IgG4PE(具有添加之L235E突變之IgG4P，該突變用於進一步降低抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)效應)、IgG2及IgG1。人類化抗體之IgG1、IgG2、IgG4P及IgG4PE同型之重鏈序列以SEQ ID NO：399、400、403及401揭示。輕鏈序列以 SEQ ID NO：402揭示。
實例6.人類化抗CD47抗體之活體外表徵 抗CD47抗體之血球凝集活性
為評估人類化抗CD47抗體之血球凝集活性，使用人類RBC作為標靶，執行與上述實例2中所述類似之血球凝集分析。如圖12所示，所有人類化CD47抗體均未表現出血球凝集活性。
抗CD47抗體之SPR親和力
為量測人類化抗CD47抗體之結合親和力，執行與上述實例2中所述類似之SPR測定。如圖13及表1中所示，所有人類化CD47抗體均顯示1至2nM之KD。
與人類CD47之結合
為量測人類化抗CD47抗體之結合親和力，執行與上述實例2中所述類似之流動式細胞量測術分析。如圖14及圖15所示，所有人類化抗CD47抗體均結合至CHO-K1細胞(圖14)及RBC(圖15)中過度表現之人類CD47。
與食蟹猴CD47之結合
為評估人類化抗CD47抗體與食蟹猴CD47之結合，執行與上述實例2中所述之分析類似之流動式細胞量測術分析。如圖16所示，人類化抗CD47抗體與食蟹猴CD47結合。
SIRP α阻斷抗CD47抗體之活性
為評估人類化抗CD47抗體阻斷CD47-SIRP α相互作用之能力，執行與上述實例2中所述分析類似之流動式細胞量測術分析。如圖17中所示，人 類化抗CD47抗體阻斷CD47-SIRP α相互作用。
靶癌細胞株之吞噬作用
為評估人類化抗CD47抗體增強靶細胞株之吞噬作用之能力，執行與實例2中所述分析類似之吞噬作用分析。如圖18及圖19所示，人類化抗CD47抗體增強CCRF-CEM(圖18)及Raji細胞(圖19)之吞噬作用。
紅血球之吞噬作用
為評估人類化CD47抗體是否增強RBC之吞噬作用，執行與實例2中所述分析類似之吞噬作用分析。如圖20所示，出乎意料地，人類化108VH4.M4_VL1.M1之IgG2及IgG4PE同型並未增強RBC之吞噬作用。
實例7.人類化抗CD47抗體在小鼠模型中之抗腫瘤活性
在淋巴瘤之Raji模型中評估人類化抗CD47抗體之抗腫瘤活性。將Raji細胞皮下植入NOD/SCID小鼠中，且隨機分成5組(每組8隻小鼠，第0天)。第1組：媒劑(僅PBS)；第2組：B6H12(陽性對照)；第3組：108VH4.M4_VL1.M1-hIgG1-Ka；第4組：108VH4.M4_VL1.M1-hIgG2-Ka；第5組：108VH4.M4_VL1.M1-hIgG4PE-Ka。當腫瘤可觸知時(100mm3)開始用每種抗體或媒劑(僅PBS)治療，當小鼠之腫瘤體積達至約3000mm3時將小鼠安樂死。每週量測腫瘤體積3次。腹膜內(i.p.)給與抗體，劑量為10mg/kg，每週3次，持續3週(每隻小鼠共給藥9次)。
如圖21所示，人類化抗體之IgG1、IgG2及IgG4PE同型在淋巴瘤之此動物模型中顯示出抗腫瘤活性。
數據表明，人類化抗CD47抗體比已知結合CD47之陽性抗體B6H12 顯著更強效，阻斷CD47與SIRP α之結合，且阻抑人類癌症之小鼠模型中之腫瘤生長。
未觀察到此等人類化CD47抗體之抗腫瘤活性與其結合CD47、阻斷CD47與SIRP α之相互作用或增強腫瘤細胞之吞噬作用的效力相關聯。
亦在小細胞肺癌之SHP-77模型中評估人類化抗CD47抗體108VH4.M4_VL1.M1-hIgG4PE之抗腫瘤活性。
如圖23所示，人類化抗體之IgG4PE同型在小細胞肺癌之此動物模型中顯示出抗腫瘤活性。
實例8.小鼠中人類化CD47抗體之藥物動力學研究 藥物動力學研究
用7至8週齡(平均體重20g)之SPF級雌性C57BL/6小鼠執行小鼠PK研究。經由側尾靜脈，藉由靜脈內團注，以3mg/Kg(體積10ml/kg)向小鼠投與人類化抗CD47抗體。在靜脈內注射之後，在每組(n=3)中，以多個時間間隔(注射後15min、1小時(h)、2h、4h、10h，12h、24h，以及2天、3天、5天、7天、10天、14天、21天、28天及35天)經由眶後竇採集血樣。立即藉由毛細血管採集全血，且在每個時間點收集至含有肝素之微量離心管中。抽取血漿，儲存在-80℃下直至分析。
量測血漿中之抗CD47抗體
藉由酶聯免疫吸附分析法(ELISA)量測血漿中之抗CD47抗體。用在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之捕獲抗體、山羊抗人類IgG Fc片段特異性抗體(Jackson ImmunoResearch)塗佈微量滴定盤(Costar,Corning)。偵測系統由過氧化物酶結合之 山羊抗人類IgG F(ab')2片段特異性抗體(Jackson ImmunoResearch)與作為受質之四甲基聯苯胺組成。允許在室溫下進行顯色，接著用1M HCl終止。使用MK3微盤讀數器(ThermoFisher)測定所有孔在450nm下之吸光度。生成標準曲線，且藉由自該標準曲線內插來量化樣品。藉由向血漿中添加已知量之抗CD47抗體來製備血漿標準品。此等標準品用於計算藉由血漿中之分析回收的抗CD47抗體之比例。執行藉由ELISA量測之抗CD47抗體濃度相對於添加之抗體濃度的線性回歸，且將計算之斜率用作級分回收率。接著針對回收率，校正樣品中抗CD47抗體之血漿濃度。
藥物動力學分析
使用標準曲線將吸光度單位轉換為每毫升之每種抗體之微克數(μg/ml)。藉由使用WinNonlin軟體(WinNonlin第5.2版，Pharsight Co.)相對於抽血時間將非隔室模型與血漿濃度(μg/ml)擬合，從而獲得藥物動力學參數。此等包括以下參數：t1/2，終末半衰期；CL，清除率；Cmax，最大濃度；Vss，穩態分佈容積；MRT，平均滯留時間；AUC，曲線下面積。測試抗體之藥物動力學顯示在圖22中。
核酸與胺基酸序列
示例性所揭示之抗體(VH/VL)之核酸序列
示例性所揭示之抗體(VH/VL)之胺基酸序列；CDR標有下劃線；人類CD47
本揭示案之示例性抗體之核酸序列 VH 108VH4.M4_VL1.M1-hIgG2 組1：
>108VH4.M4-hIgG2(SEQ ID NO：413)
>VL 108VL1.M1-hIgKCL(SEQ ID NO：414)
組2：
>VH 108VH4.M4-hIgG2(SEQ ID NO：415)
>VL 108VL1.M1-hIgKCL(SEQ ID NO：416)
組3：
>VH 108VH4.M4-hIgG2(SEQ ID NO：417)
>VL 108VL1.M1-hIgKCL(SEQ ID NO：418)
108VH4.M4_VL1.M1-hIgG4PE 組1：
>VH 108VH4.M4-hIgG4PE(SEQ ID NO：419)
>VL 108VL1.M1-hIgKCL(SEQ ID NO：414)
組2：
>VH 108VH4.M4-hIgG4PE(SEQ ID NO：420)
>VL 108VL1.M1-hIgKCL(SEQ ID NO：416)
組3：
>VH 108VH4.M4-hIgG4PE(SEQ ID NO：421)
>VL 108VL1.M1-hIgKCL(SEQ ID NO：418)
其他實施例
前面之描述僅揭示本發明之示例性實施例。
應當理解，雖然已結合本發明之實施方式描述本發明，但前面之描述意欲說明而非限制本發明之範疇，本發明之範疇係由所附申請專利範圍之範 疇限定。其他態樣、優點及修改在所附申請專利範圍之範疇內。因此，雖然僅說明及描述本發明之某些特徵，但本領域之技術人員將想到許多修改及變化。因此，應當理解，所附申請專利範圍意欲涵蓋落在本發明之真實精神內的所有此類修改及變化。
<110> 大陸商南京傳奇生物科技有限公司
<120> 不致顯著紅血球凝集的抗-CD47抗體
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<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 419
<210> 420
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 420
<210> 421
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 421

Claims (53)

  1. 一種包含至少一個抗體-抗原結合位點之抗CD47抗體，該抗體結合人類CD47，抑制、阻斷、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47之表現、活性及/或信號傳導，且不引起細胞之顯著凝集，其中該抗體係人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體、靈長類化抗體、雙特異性抗體、結合抗體、小模組化免疫藥物、單鏈抗體、類駱駝抗體、CDR移植抗體或其抗原結合片段或抗原結合功能變異體。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體不引起人類紅血球之血球凝集。
  3. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗CD47抗體阻斷人類CD47與人類信號調節蛋白α(SIRPα)之間的相互作用。
  4. 如申請專利範圍第3項之抗體，其中與不存在該抗CD47抗體時CD47與SIRPα之間的相互作用水準相比，該抗體阻斷CD47與SIRPα之間的該相互作用至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少95%或至少99%。
  5. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中小於顯著凝集水準係在抗CD47抗體B6H12存在下之細胞凝集水準。
  6. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中在該抗體存在下之該細胞凝集水準與在CD47抗體B6H12存在下之該細胞凝集水準相比降低至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%。
  7. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體在抗體量介於約0.3μg/ml至約200μg/ml之間時不引起細胞之顯著細胞凝集水準。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之抗體，其中該抗體在抗體濃度介於約100μg/ml與約200μg/ml之間時不引起細胞之顯著細胞凝集水準。
  9. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體具有強效之抗腫瘤活性。
  10. 如申請專利範圍第9項之抗體，其中該強效之抗腫瘤活性係由在該抗體存在下巨噬細胞吞噬腫瘤細胞之能力與抗CD47抗體B6H12存在下巨噬細胞吞噬腫瘤細胞之能力相比增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%來衡量。
  11. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體不促進CD47陽性細胞株之聚集。
  12. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體包含選自SEQ ID NO：349、351、353、355、357、359、361-373、380-383、388-392之可變重鏈以及選自SEQ ID NO：350、352、354、356、358、360、374-379、384-387及393-396之可變輕鏈。
  13. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：349、351、353、355、357、359、361-373、380-383、388-392中之一者示出之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更 多一致之可變重鏈，以及與SEQ ID NO：350、352、354、356、358、360、374-379、384-387及393-396中之一者示出之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致之可變輕鏈。
  14. 如申請專利範圍第1項至第2項中任一項或申請專利範圍第5項至第13項中任一項之抗體，其中在該抗體存在下CD47之表現或活性與不存在該抗體時CD47表現或活性之水準相比降低至少50%、55%、60%、75%、80%、85%或90%。
  15. 如申請專利範圍第14項之抗體，其中在該抗體存在下CD47之表現或活性與不存在該抗體時CD47表現或活性之水準相比降低至少95%、96%、97%、98%、99%或100%。
  16. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體係IgG同型。
  17. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體包含在胺基酸Asn297處經修飾之恆定區。
  18. 如申請專利範圍第17項之抗體，其中該抗體包含具有N297A之胺基酸修飾之恆定區。
  19. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體包含在胺基酸Leu235或Leu234處經修飾之恆定區。
  20. 如申請專利範圍第19項之抗體，其中該恆定區具有Leu235Glu(L235E)或Leu235Ala(L235A)之胺基酸修飾，及/或Leu234Ala(L234A)之胺基酸修飾。
  21. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體包含在胺基酸Arg435處經修飾之人類IgG3恆定區。
  22. 如申請專利範圍第21項之抗體，其中該人類IgG3恆定區具有Arg435His(R435H)之胺基酸修飾。
  23. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體包含在鉸鏈區內經修飾以防止或減少鏈交換之人類IgG4恆定區。
  24. 如申請專利範圍第23項之抗體，其中該抗體包含具有Ser228Pro(S228P)之胺基酸修飾之人類IgG4恆定區。
  25. 如申請專利範圍第23項或申請專利範圍第24項之抗體，其中該人類IgG4恆定區進一步在胺基酸235處經修飾。
  26. 如申請專利範圍第25項之抗體，其中該人類IgG4恆定區具有Leu235Glu(S228P/L235E)之胺基酸修飾。
  27. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體包含經修飾以增強FcRn結合之人類IgG恆定區，其中該人類IgG恆定區具有下列之一或多種胺基酸修飾：Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu、Met428Leu或Asn434Ser(M252Y、S254T、T256E、M428L或N434S)。
  28. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體包含經修飾以改變抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)之人類IgG恆定區。
  29. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體包含經修飾以誘導異源二聚化之人類IgG恆定區，其中該抗體具有T366W或T366S之胺基酸修飾及/或L368A或Y407V、S354C或Y349C之胺基酸修飾。
  30. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體係具有選自由以 下組成之群的可變重鏈區(VH)及/或可變輕(VL)鏈區之人類化抗體或人類抗體：SEQ ID NO：361-373、375-379、381-383、385-387、389-392、394-396、399-404。
  31. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體係具有與選自由以下組成之群之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈區(VH)及/或可變輕(VL)鏈區之人類化抗體或人類抗體：SEQ ID NO：361-373、375-379、381-383、385-387、389-392、394-396、399-404。
  32. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體係人類化抗體。
  33. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體係人類抗體。
  34. 一種載體，其包含編碼如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之抗體之核酸。
  35. 一種載體，其包含：編碼與選自由SEQ ID NO：337-348、413-421組成之群之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的抗體之重鏈區(VH)及/或抗體之可變輕(VL)鏈區之核酸。
  36. 一種包含如申請專利範圍第35項之載體之原核細胞、酵母細胞、植物細胞或哺乳動物細胞株，其中該細胞表現如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之抗體。
  37. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之抗體以及醫藥學上可接受之賦形劑。
  38. 一種治療患有癌症或其他腫瘤病狀之人類患者的癌症或其他腫瘤病 狀、延遲該癌症或其他腫瘤病狀之進展、預防該癌症或其他腫瘤病狀復發或者減輕該癌症或其他腫瘤病狀之症狀的方法，其包括向該患者投與治療有效量之包含至少一個抗體-抗原結合位點之抗體，該抗體結合人類CD47，抑制、阻斷、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47之表現、活性及/或信號傳導，且不引起細胞之顯著凝集，或者向該患者投與治療有效量之包含該抗體及醫藥賦形劑之醫藥組合物。
  39. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該抗體係如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之抗體。
  40. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該醫藥組合物係如申請專利範圍第37項之醫藥組合物。
  41. 如申請專利範圍第38項至第40項中任一項之方法，其中該癌症或其他腫瘤病狀係CD47+腫瘤。
  42. 如申請專利範圍第38項至第41項中任一項之方法，其中該癌症或其他腫瘤病狀係選自由以下組成之群：非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、急性髓樣白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)及多發性骨髓瘤(MM)。
  43. 如申請專利範圍第38項至第41項中任一項之方法，其中該癌症或其他腫瘤病狀係選自由以下組成之群：乳癌、卵巢癌、頭頸癌、膀胱癌、黑色素瘤、結腸直腸癌、胰臟癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、乳房腫瘤、卵巢腫瘤、肺腫瘤、胰臟腫瘤、前列腺腫瘤、黑色素瘤腫瘤、結腸直腸腫瘤、肺腫瘤、頭頸腫瘤、膀胱腫瘤、食道腫瘤、肝 腫瘤及腎腫瘤。
  44. 如申請專利範圍第38項至第41項中任一項之方法，其中該癌症或其他腫瘤病狀係血液癌症。
  45. 如申請專利範圍第44項之方法，其中該血液癌症係白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
  46. 如申請專利範圍第44項之方法，其中該血液癌症為選自由以下組成之群的白血病：急性淋巴球性白血病(ALL)、急性髓樣白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓增生性病症/贅瘤(MPDS)及脊髓發育不良症候群。
  47. 如申請專利範圍第44項之方法，其中該血液癌症為選自由以下組成之群的淋巴瘤：霍奇金氏淋巴瘤、惰性與侵襲性非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)及濾泡性淋巴瘤(小細胞及大細胞)。
  48. 如申請專利範圍第44項之方法，其中該血液癌症為選自由以下組成之群的骨髓瘤：多發性骨髓瘤(MM)、巨細胞性骨髓瘤、重鏈骨髓瘤以及輕鏈骨髓瘤或本瓊氏骨髓瘤(Bence-Jones myeloma)。
  49. 如申請專利範圍第38項至第48項中任一項之方法，其進一步包括向該患者投與一或多種額外藥劑。
  50. 如申請專利範圍第49項之方法，其中該額外藥劑係治療劑。
  51. 如申請專利範圍第50項之方法，其中該治療劑係抗癌劑。
  52. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，該重鏈可變結構域包含 i.重鏈CDR1，該重鏈CDR1包含選自由SEQ ID NO：49、51、53、55、57、59、62-65、86-87組成之群的胺基酸序列；ii.重鏈CDR2，該重鏈CDR2包含選自由SEQ ID NO：145、147、149、151、153、155、158-161、182-183組成之群的胺基酸序列；及iii.重鏈CDR3，該重鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO：241、243、245、247、249、251、254-257、278-279組成之群的胺基酸序列，以及(b)輕鏈可變結構域(VL)，該輕鏈可變結構域分別包含i.輕鏈CDR1，該輕鏈CDR1包含選自由SEQ ID NO：50、52、54、56、58、60、76-79組成之群的胺基酸序列；ii.輕鏈CDR2，該輕鏈CDR2包含選自由SEQ ID NO：146、148、150、152、154、156、172-175組成之群的胺基酸序列；及iii.輕鏈CDR3，該輕鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO：242、244、246、248、250、252、268-271組成之群的胺基酸序列。
  53. 如申請專利範圍第52項之抗體，其中該抗體包含下列中之任一者：(1)VH包含分別具有SEQ ID NO：49、145及241之該等胺基酸序列之該重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：50、146及242之該等胺基酸序列之該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(2)VH包含分別具有SEQ ID NO：51、147及243之該等胺基酸序列之該重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：52、148及244之該等胺基酸序列之該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(3)VH包含分別具有SEQ ID NO：53、149及245之該等胺基酸序列之該重 鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：54、150及246之該等胺基酸序列之該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(4)VH包含分別具有SEQ ID NO：55、151及247之該等胺基酸序列之該重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：56、152及248之該等胺基酸序列之該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(5)VH包含分別具有SEQ ID NO：57、153及249之該等胺基酸序列之該重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：58、154及250之該等胺基酸序列之該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(6)VH包含分別具有SEQ ID NO：59、155及251之該等胺基酸序列之該重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：60、156及252之該等胺基酸序列之該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(7)VH包含分別具有SEQ ID NO：62、158及254之該等胺基酸序列之該重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：76、172及268之該等胺基酸序列之該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(8)VH包含分別具有SEQ ID NO：63、159及255之該等胺基酸序列之該重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：77、173及269之該等胺基酸序列之該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(9)VH包含分別具有SEQ ID NO：64、160及256之該等胺基酸序列之該重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：78、174及270之該等胺基酸序列之該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(10)VH包含分別具有SEQ ID NO：65、161及257之該等胺基酸序列之該重 鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：79、175及271之該等胺基酸序列之該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(11)VH包含分別具有SEQ ID NO：65、161及257之該等胺基酸序列之該重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：76、172及268之該等胺基酸序列之該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；(12)VH包含分別具有SEQ ID NO：86、182及278之該等胺基酸序列之該重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：56、152及248之該等胺基酸序列之該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；且(13)VH包含分別具有SEQ ID NO：87、183及279之該等胺基酸序列之該重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且VL包含分別具有SEQ ID NO：56、152及248之該等胺基酸序列之該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
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