CN117257935A - 一种含抗cd47抗体或其抗原结合片段的制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂及其制备方法和应用，本发明的抗CD47抗体能有效阻断CD47与SIRPα结合，但其与红细胞表现出极弱水平结合，展现出与CD47阳性肿瘤细胞的靶向特异性，本发明的制剂具有较高稳定性。

Description

一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂及其制备方法和 应用
本申请请求2022年06月21日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为202210709122.2，发明名称为“一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂及其制备方法和应用”的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入本申请。
技术领域
本发明涉及生物制剂领域，具体而言，涉及一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂及其制备方法和应用。
背景技术
癌症免疫疗法是近年来生物科学领域的重头大戏，基于T细胞的CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体等的免疫检查点抑制剂疗法和CAR-T、TCR-T等细胞疗法皆是近年来大热的免疫疗法。这些都是围绕如何恢复T细胞功能来进行，换言之，主要围绕如何提高获得性免疫系统能力。但是，以免疫检查点(checkpoint)为靶点，激活T细胞功能，以提高获得性免疫系统的能力，进而攻克癌症的道路仍充满曲折。固有免疫系统在肿瘤免疫治疗中的作用长期没有得到发挥。事实上，在整个肿瘤浸润区域，巨噬细胞在肿瘤组织约占50％，更重要的是巨噬细胞的数量同肿瘤的预后呈现反向联系，这进一步说明巨噬细胞在肿瘤中有很重要的作用。巨噬细胞发挥吞噬效应需要两个信号同时起作用：一个是靶向细胞表面的“吃我”信号的激活，另一个是相同目标表面“别吃我”信号的失活。任何一个信号的缺少都不足以引发吞噬效应的发生。越来越多的证据表明，CD47是一类“别吃我”信号，它通过与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα，SIRPα)相互结合抑制巨噬细胞的吞噬作用。肿瘤细胞也可以通过CD47的表达逃避巨噬细胞吞噬作用(例如参见EP2242512及其中引用的相关文献)。
CD47也称为整联蛋白相关蛋白(IAP)，是具有氨基末端的免疫球蛋白结构域和羧基末端的多重跨膜区的50kDa膜蛋白。它与多种配体相互作用，包括但不限于单调节蛋白α(SIRPα)，SIRPγ，整联蛋白和血小板反应蛋白-1(TSP-1)。SIRPα主要在骨髓细胞上表达，包括巨噬细胞，骨髓树突细胞(DC)，粒细胞，肥大细胞及其前体(前体包括造血干细胞)。CD47/SIRPα相互作用传递“不要吃我”信号，抑制自体吞噬作用。对患者肿瘤和匹配的邻近正常(非肿瘤)组织的分析显示，CD47蛋白在癌细胞上过表达，这有效地帮助它们逃避先天免疫监视和消除。阻断CD47-SIRPα与抗CD47抗体的相互作用已经显示出有效诱导体外肿瘤细胞的吞噬作用并抑制体内各种血液和实体肿瘤的生长。因此，CD47是癌症治疗的有效靶标，并且需要其适当的拮抗剂来制备人类治疗剂。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，其包括以下组分：抗CD47抗体或其抗原结合片段、缓冲液和辅料。所述抗体或其抗原结合片段含有以下CDRs：如SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的LCDR3，如SEQID NO:10或与SEQ ID NO:10具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的HCDR1，如SEQ IDNO:11或与SEQ ID NO:11具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的HCDR2，如SEQ ID NO:12或与SEQ ID NO:12具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的HCDR3；按组分在所述制剂中的质量体积百分数计，所述辅料包括：1％～20％的糖类和0.01％～0.5％的表面活性剂。
第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂的制备方法，其包括：将所述制剂的组分混合。
第三方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的制剂在制备用于防治CD47阳性肿瘤的产品中的应用。
第四方面，本发明实施例提供了一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的冻干制剂，其由如前述实施例所述的制剂冷冻干燥后获得。
第五方面，本发明实施例提供了一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，其由如前述任意实施例所述的冻干制剂复溶后获得。
第六方面，本发明实施例还提供了用作药物的如前述任意实施例所述的制剂，所述药物用于防治CD47阳性肿瘤。
第七方面，本发明实施例还提供了一种治疗CD47阳性肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如前述任意实施例所述的制剂。
本发明具有以下有益效果：
本申请创新性发明了一种含有抗CD47抗体或抗CD47抗体片段的制剂，该制剂中包含的抗CD47抗体或抗CD47抗体片段在体外未发生红细胞血凝集，其与红细胞表现出极弱水平的低结合或不结合；且该抗体能有效阻断CD47与SIRPα结合，激活介导巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性，展现出与CD47阳性肿瘤细胞的靶向特异性，具有高效、安全性好、无药物副作用等优点。
此外，制剂中其他组分及其配比都是发明人经一系列创造性劳动后提出并验证的，适用于搭配上述抗CD47抗体或抗CD47抗体片段使用，能够有效维持抗CD47抗体或抗CD47抗体片段的功能，延长其使用期限，具有较高稳定性，为抗CD47抗体的相关研究和应用提供了途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为试验例1中的DSC图谱。
图2为试验例2中的DSC图谱。
图3是试验例5中CD47抗体(7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、阳性对照抗体Hu5F9-G4和hIgG4-同型对照)与人CD47结合的平均荧光强度。
图4是试验例5中CD47抗体(7A11H52、7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55、阳性对照抗体Hu5F9-G4和hIgG4-同型对照)与人CD47结合的平均荧光强度。
图5是试验例6中CD47抗体(7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、7A11H52、阳性对照抗体Hu5F9-G4和hIgG4-同型对照)与猴CD47结合的平均荧光强度。
图6是试验例6中CD47抗体(7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55、阳性对照抗体Hu5F9-G4和hIgG4-同型对照)与猴CD47结合的平均荧光强度。
图7是试验例7中CD47抗体(7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42和hIgG4-同型对照)对人CD47的CD47/SIRPα结合抑制结果。
图8是试验例7中CD47抗体(7A11H52、7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55)对人CD47的CD47/SIRPα结合抑制结果。
图9是试验例8中CD47抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力测定结果。
图10是试验例9中CD47抗体的RBC凝集能力测定结果。
图11是试验例10中CD47抗体与人类红细胞结合能力的测定结果。
图12是试验例11中CD47抗体与人类血小板结合分析结果。
图13是试验例12中CD47抗体对激活巨噬细胞吞噬红细胞的作用分析结果。
图14是试验例13中CD47抗体对人B淋巴细胞皮下移植瘤模型的抗肿瘤结果。
图15是试验例14中CD47抗体对人恶性黑色素瘤模型的抗肿瘤结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
具体地，本发明实施例提供了一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，其包括以下组分：抗CD47抗体或其抗原结合片段、缓冲液和辅料。
在本发明中，“抗体或其抗原结合片段”此技术术语是结合特定抗原的蛋白，其泛指包含互补决定区(CDR区)的蛋白及蛋白片段。“抗体”指全长抗体。
术语“抗原结合片段”是包含抗体CDR的的物质，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因为其结合至靶抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。在一些实施方式中，抗原结合片段具有特异性识别并结合CD47的作用。在一些实施方式中，抗原结合片段是具有阻断CD47与其配体结合，激活免疫细胞功能的片段，在一个方面中，此类片段选自Fab(由完整的轻链和Fd构成)，Fv(由VH和VL构成)，ScFv(单链抗体，VH和VL之间由一连接肽连接而成)或单域抗体(仅由VH组成)。所述片段可通过常规方法制备获得，例如可通过重组核酸技术产生，或可通过抗原结合分子(包括完整抗体)的酶裂解或化学裂解产生。
术语“互补性决定区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。有三种重链CDR和三种轻链CDR。术语“CDR”和“CDRs”用于指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或其抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。
在本发明中，重链的互补决定区用HCDR表示，轻链的互补决定区用LCDR表示。本领域常用的CDR标示方法包括：Kabat编号方案、IMGT编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号系统。Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。在本发明具体实施例中，采用Kabat注释标准标示CDR区，但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段含有以下CDRs：如SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的HCDR2，如SEQ ID NO:12或与SEQ ID NO:12具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的HCDR3，序列信息如下。
SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3
KSSQSLLNSRTRKNYLA WASTRES KQSYNLRT
SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12
SNWMN MIHPSDSETRLNQKFKD GTTVVDAFAY
在一些实施例中，与SEQ ID NO:1具有至少95％同源性的氨基酸序列包括但不限于KSSQSLLNTRTRKNYLA(SEQ ID NO:21)。与SEQ ID NO:11具有至少95％同源性的氨基酸序列包括但不限于MIHPSDSETRLNQKFQG(SEQ ID NO:22)。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:21所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:12所示的HCDR3；或者所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:1所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2所示的LCDR2，如SEQ IDNO:3所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，和如SEQID NO:12所示的HCDR3；或者所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:1所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10所示的HCDR1，如SEQ ID NO:22所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:12所示的HCDR3。
在一些实施例中，按组分在所述制剂中的质量体积百分数(w/v)计，所述辅料包括：1％～20％的糖类和0.01％～0.5％的表面活性剂。
本发明提供了抗CD47抗体或其抗原结合片段，该抗体在体外未发生红细胞血凝集，更难能可贵的是与红细胞表现出极弱水平的低结合或不结合；能够有效地阻断CD47与SIRPα结合、激活介导巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性，展现出了显著的与CD47阳性肿瘤细胞的靶向特异性，亲和力高、特异性强，不会引起红细胞凝集，且与人类红细胞、血小板表现出极弱的结合，安全性好。
本发明实施例提供的制剂组合是发明人经一系列创造性劳动，提出并验证的组合配方，有利于使得上述抗CD47抗体或其抗原结合片段稳定而有效地发挥其作用，有效阻断CD47与SIRPα结合，使得抗CD47抗体能更好的应用于临床。
在一些实施例中，表面活性剂的质量体积百分数可以为0.01％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％、0.22％、0.24％、0.26％、0.28％、0.3％、0.32％、0.34％、0.36％、0.38％、0.4％、0.42％、0.44％、0.46％、0.48％、0.5％中的任意一种或任意两种之间的范围。例如，表面活性剂的质量体积百分数0.02％，也即0.02％(w/v),表示每100mL体积溶液含0.02g的表面活性剂；其它依此类推，下同。
在一些实施例中，所述表面活性剂选自吐温20(聚山梨酯-20)、吐温80(聚山梨酯-80)和泊洛沙姆188中的任意一种。
在一些实施例中，当所述表面活性剂为吐温80时，所述吐温80在所述制剂中的质量体积百分数为0.01％～0.1％，优选为0.01％～0.04％，更优选为0.02％～0.04％。
当所述表面活性剂为泊洛沙姆188时，所述泊洛沙姆188在所述制剂中的质量体积百分数为0.05％～0.5％，优选为0.1％～0.2％，更优选为0.1％。
在一些实施例中，所述表面活性剂为0.02％(w/v)的吐温80。
在一些实施例中，糖类的质量体积百分数(w/v)可以为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述糖类包括蔗糖和海藻糖中的至少一种。
在一些实施例中，所述糖类为蔗糖。
在一些实施例中，所述蔗糖的浓度为3％～15％，更优选为6％～10％，更进一步优选为8％。在一些实施例中，所述蔗糖在所述制剂中的质量体积百分数为8％。
在一些实施例中，所述糖类为海藻糖。
在一些实施例中，所述海藻糖的浓度为3％～15％，更优选为6％～10％，更进一步优选为8.8％。
在一些实施例中，所述糖类为8％(w/v)的蔗糖。
“缓冲液”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的溶液。将pH控制在适当范围中的缓冲液的例子包括但不限于：包含醋酸盐、组氨酸、柠檬酸盐或磷酸盐等的缓冲液。
在一些实施例中，缓冲液为由柠檬酸一水合物与柠檬酸钠二水合物配置而成的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，由L-组氨酸与L-组氨酸盐酸盐一水合物配置而成的组氨酸-组氨酸盐缓冲液，由冰醋酸与三水醋酸钠配置而成的醋酸-醋酸钠缓冲液，或者由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠配置而成的磷酸-磷酸盐缓冲液；
在一些实施例中，所述缓冲液选自：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、组氨酸-组氨酸盐缓冲液和磷酸-磷酸盐缓冲液中的任意一种，pH为4.5～7.5，pH具体可以为4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、和7.5中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、组氨酸-组氨酸盐缓冲液和磷酸-磷酸盐缓冲液中的任意一种，pH为5.0～7.5。
优选地，所述缓冲液为组氨酸-组氨酸盐缓冲液，pH为5.5～6.0。
优选地，所述组氨酸-组氨酸盐缓冲液的pH为5.5。相对于其他缓冲液而言，组氨酸-组氨酸盐缓冲液能够更有效地使得抗体分子维持构象稳定。
在一些实施例中，组氨酸-组氨酸盐缓冲液由L-组氨酸与L-组氨酸盐酸盐一水合物配置而成的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液。
在一些实施例中，所述缓冲液的浓度为10～40mM，具体可以为10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM、22mM、24mM、26mM、28mM、30mM、32mM、34mM、36mM、38mM、40mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
优选地，所述缓冲液的浓度为15～25mM。
更优选地，所述缓冲液的浓度为20mM。
在一些实施例中，所述缓冲液为pH为6.0的20mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液。
在一些实施例中，所述制剂还包括甲硫氨酸。
在一些实施例中，所述甲硫氨酸的浓度为1～20mM，具体可以为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
优选地，所述甲硫氨酸的浓度为4.5～5.5mM。
更优选地，所述甲硫氨酸的浓度为5mM。
在一些实施例中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段的浓度为20～60mg/mL具体可以为20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
优选地，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段的浓度为45～55mg/mL。
更优选地，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段的浓度为50mg/mL。
在一些实施例中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段包括有重链可变区和轻链可变区。
在一些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4～9中任一项所示或与SEQ ID NO:4～9任一项所示具有至少95％同源性的序列；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13～18中任一项所示或与SEQ ID NO:13～18任一项所示具有至少95％同源性的序列。抗体及其重链可变区和轻链可变区对应的序列如下：
抗体名称 VH VL
7A11H11 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：5
7A11H12 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：6
7A11H22 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：6
7A11H32 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：6
7A11H42 SEQ ID NO：17 SEQ ID NO：6
7A11H52 SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：6
7A11H14 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：8
7A11H15 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：9
7A11H33 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：7
7A11H34 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：8
7A11H35 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：9
7A11H55 SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：9
SEQ ID NO:4所示序列如下：
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK；
SEQ ID NO:5所示序列如下：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK；
SEQ ID NO:6所示序列如下：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK；SEQ ID NO:7所示序列如下：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCKSSQSLLNTRTRKNYLAWYQQKPGKAPKLLI YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK；SEQ ID NO:8所示序列如下：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSQSLLNTRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK；SEQ ID NO:9所示序列如下：
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIY WASTRESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK；
SEQ ID NO:13所示序列如下：
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGSSFTSNWMNWVKRRPGQGLEWIGMIHP SDSETRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARGTTVVDAFAYWG QGTLVTVSA；
SEQ ID NO:14所示序列如下：
QVQLVQPGAEVKKPGASVKLSCKASGSSFTSNWMNWVRQAPGQGLEWIGMIH PSDSETRLNQKFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSPRSEDTAVYYCARGTTVVDAFAYW GQGTTVTVSS；
SEQ ID NO:15所示序列如下：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGSSFTSNWMNWVRQAPGQGLEWIGMIH PSDSETRLNQKFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTVVDAFAYW GQGTTVTVSS；
SEQ ID NO:16所示序列如下:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGSSFTSNWMNWVRQAPGQGLEWIGMIHP SDSETRLNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTVVDAFAYWG QGTTVTVSS；
SEQ ID NO:17所示序列如下:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGSSFTSNWMNWVRQAPGQGLEWIGMIHP SDSETRLNQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTVVDAFAYWG QGTTVTVSS；
SEQ ID NO:18所示序列如下:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTSNWMNWVRQAPGQGLEWIGMIH PSDSETRLNQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTVVDAFAYWG QGTTVTVSS。
在一些实施例中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段还包括恒定区。
在一些实施例中，所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD中的任一种；轻链恒定区为κ或λ链。
在一些实施例中，所述恒定区的种属来源选自鼠、兔、羊、猴、或人。
在一些实施例中，所述抗CD47抗体为7A11H14抗体，7A11H14的重链如SEQ ID NO:19所示，轻链如SEQ ID NO:20所示：
7A11H14的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:19)：
QVQLVQPGAEVKKPGASVKLSCKASGSSFTSNWMNWVRQAPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSPRSEDTAVYYCARGTTVVDAFAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
7A11H14的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:20)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSQSLLNTRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些实施例中，所述抗体为CDR移植抗体、多聚体抗体或双特异性抗体中的任一种或几种。
在一些实施例中，所述抗原结合片段为F(ab’)2、Fab、scFv和Fv中的任一种或几种。
在一些实施方式中，所述CD47为人CD47、鼠CD47或猴CD47。
本发明提供的含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂适用于申请号为“202011544262.6”、发明名称为“一种靶向CD47的抗体及其应用”的中国申请(2020年12月23递交)中公开的多个抗CD47抗体或其抗原结合片段。也适用于以中国专利申请202011544262.6为优先权的PCT专利申请(申请号：PCT/CN2021/140404，申请日：2021-12-22)，这些专利申请的全文通过引用并入本发明。
本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂的制备方法，其包括：将所述制剂的组分混合。
在一些实施例中，当所述制剂中的抗CD47抗体或其抗原结合片段为抗CD47抗体或其抗原结合片段的溶液时，所述制备方法还包括：采用所述制剂中的缓冲液对抗CD47抗体或其抗原结合片段的溶液进行置换；置换后与辅料混合。
本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的制剂在制备用于防治CD47阳性肿瘤的产品中的应用。
本发明实施例还提供了用作药物的如前述任意实施例所述的制剂，所述药物用于防治CD47阳性肿瘤。
本发明实施例还提供了一种治疗CD47阳性肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如前述任意实施例所述的制剂。
本文中的“防治”包括预防和/或治疗，治疗可以理解为改善病情或治愈。
本文中的“CD47阳性肿瘤”包括表达CD47的肿瘤，具体包括但不限于实体肿瘤和血液肿瘤，例如，血液系统恶性肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、肝细胞癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤和肾脏肿瘤等。
本发明实施例还提供了一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的冻干制剂，所述冻干制剂由如前述任意实施例所述的制剂冷冻干燥后获得。
此外，本发明实施例还提供了一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，其由如前述任意实施例所述的冻干制剂复溶后获得。
实验材料：实施例1～4以及试验例1～3中示例性地展示了制剂中的抗CD47抗体为7A11H14时的技术效果，7A11H14来源于申请号为202011544262.6，发明名称为“一种靶向CD47的抗体及其应用”的中国申请(2020年12月23递交)中公开的(重链可变区的序列如SEQID NO:14所示，轻链可变区的序列如SEQ ID NO:8所示，恒定区为含有S228P变异的人类IgG4的Fc区)，其包括如SEQ ID NO:19所示的重链，和如SEQ ID NO:20所示的轻链。需要说明的是，在其他实施例中，制剂中的抗CD47抗体或其抗原结合片段也可以采用申请号为202011544262.6，发明名称为“一种靶向CD47的抗体及其应用”的中国申请中公开的其他抗CD47抗体或抗原结合片段，均可达到相同或相似的技术效果。
实施例1
一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，其包括：50mg/mL抗CD47抗体，20mM组氨酸-组氨酸盐缓冲体系(pH6.0)，8％(w/v)蔗糖以及0.02％(w/v)吐温80。
可以理解的是，各组分限定的浓度为各组分在制剂中的浓度，本发明中“w/v”是质量体积百分数，例如8％(w/v)蔗糖表示每100mL体积溶液含8g的蔗糖，其它依此类推。
实施例2
一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，其包括：50mg/mL抗CD47抗体，20mM组氨酸-组氨酸盐缓冲体系(pH6.0)，8.8％(w/v)蔗糖以及0.02％(w/v)吐温80。
实施例3
一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，其包括：50mg/mL抗CD47抗体，20mM组氨酸-组氨酸盐缓冲体系(pH6.0)，8.8％(w/v)蔗糖，0.04％(w/v)吐温80，以及5mM甲硫氨酸。
实施例4
一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，其包括：50mg/mL抗CD47抗体，20mM组氨酸-组氨酸盐缓冲体系(pH6.0)，8.8％(w/v)蔗糖，以及0.1％(w/v)泊洛沙姆188。
试验例1不同缓冲液和pH对抗CD47抗体稳定性的影响
将抗CD47抗体分别以50mg/mL的浓度超滤置换至以下表1配制20mM柠檬酸缓冲液(20mM Citrate)、20mM醋酸缓冲液(20mM acetate)、20mM组氨酸缓冲液(20mM histidine)和20mM磷酸缓冲液(20mM PB)中，分别将溶液按照表1的pH调节为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5。
用配制完成的各个pH缓冲液分别对小试样品进行超滤置换。置换完成后，将各样品的浓度稀释至50mg/ml过滤分装西林瓶中加塞轧盖后放样(将样品置于40℃稳定性箱中孵育4周)，通过差式量热扫描(DSC)、分子筛色谱(SEC)和毛细管等电聚焦电泳(CIEF)检测抗体在40℃放置4周的稳定性。具体试验方案见表1。
表1各实验组的缓冲液和pH信息
备注：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系为由柠檬酸一水合物与柠檬酸钠二水合物配置而成的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；组氨酸-组氨酸盐缓冲体系为由L-组氨酸与L-组氨酸盐酸盐一水合物配置而成的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，醋酸-醋酸钠缓冲体系为由冰醋酸与三水醋酸钠配置而成的醋酸-醋酸钠缓冲液，磷酸-磷酸盐缓冲液体系为由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠配置而成的磷酸-磷酸盐缓冲液；
(1)差式量热扫描(DSC)
采用差式量热扫描仪MicroCalTM VP DSC进行样品转变熔点温度(Tm)和起始解折叠温度(Tm onset)检测。设置实验参数使得扫描温度以200℃/h的扫描速率从10℃上升到95℃。数据分析采用MicroCalTM VP DSC自动分析软件。
表2.DSC结果
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结果见图1和表2，实验结果显示：在相同缓冲体系中，Tm onset值随着pH的升高而增加。在磷酸-磷酸盐缓冲液体系中Tm onset值最高(63.2℃～63.6℃)，在组氨酸-组氨酸盐缓冲体系和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系Tm onset值分别为56.0℃～61.4℃和54.9℃～61.2℃，在醋酸-醋酸钠缓冲体系中Tm onset值最低(51.4℃～60.1℃)。
数据表明，在组氨酸-组氨酸盐缓冲体系、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系和磷酸-磷酸盐缓冲液体系中抗体构象稳定性较好。
(2)分子筛色谱(SEC-HPLC)
在安捷伦高效液相色谱系统上使用SEC色谱柱(300×7.8mm,5μm)运行的。样品温度设置为5℃，柱温设置为25℃。流动相组成为50mM PB,300mM NaCl,pH 6.8±0.1，流速设置为1.0mL/min。使用流动相将样品稀释至10mg/mL浓度进样(100μg样品)至系统并运行20min，检测波长设置为280nm。使用安捷伦CDS软件进行数据分析。
表3.SEC-HPLC检测结果
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结果见表3，结果显示：在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系中SEC-HPLC主峰纯度下降1.9％～6.7％；醋酸-醋酸钠缓冲体系中SEC-HPLC主峰纯度下降2.1～2.9％；组氨酸-组氨酸盐缓冲体系中SEC-HPLC主峰纯度下降1.7％～1.9％；磷酸-磷酸盐缓冲液体系中SEC-HPLC主峰纯度下降3.7％～6.6％。
综上所示，抗CD47抗体在组氨酸-组氨酸盐缓冲体系中具有较好的稳定性。
(3)毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)
采用ProteinSimple公司的毛细管等电聚焦电泳分析仪和氟涂层电泳毛细管对CD47抗体进行的测定。预混液为0.5μL等电点标记物(pI7.05)，0.5μL等电标记物(pI9.50)，4.0μL两性电解质3-10，35μL 1％甲基纤维素，37.5μL 8M尿素溶液和2.5μL超纯水。用超纯水将样品稀释到1.0mg/mL。取20μL稀释液和80μL预混液加到离心管中，混合并离心。样品进样温度为10℃，聚焦第一阶段为1500V一分钟，第二阶段为3000V八分钟，报告主峰、酸蜂和碱峰面积百分比。
表4.iCIEF检测结果
结果见表4，结果显示：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系中iCIEF主峰下降14％～22.7％，醋酸-醋酸钠缓冲体系中iCIEF主峰下降10.9％～13.3％，组氨酸-组氨酸盐缓冲体系中iCIEF主峰下降11.2％～16.5％，磷酸-磷酸盐缓冲液体系中SEC-HPLC主峰纯度下降26.2％～30.0％。
其中，组氨酸-组氨酸盐缓冲体系中，pH5.5、pH6.0的条件下，主峰纯度下降幅度小(分别下降11.2％、11.4％)。
试验例2不同辅料对抗CD47抗体稳定性的影响
将CD47抗体超滤置换至添加不同辅料的缓冲液中，在40℃条件放置4周、或经振摇(300rpm，25℃)3天、或冻融循环(-70℃至室温)5轮，然后分别用外观、DSC、SEC-HPLC、iCIEF和不溶性微粒测试(HIAC)分析溶液中CD47抗体蛋白的分布情况，并分别以未经处理的初始样品和未添加糖类的样品作为对照。详细的制剂配方信息如表5所示。
表5.详细的制剂配方信息
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(1)外观
外观检测包括颜色、澄明度和有无可见颗粒。
表6.外观检测结果
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详细结果详见表6，结果显示：在T0点，制剂配方F01-F31外观均为无色、微乳光、无可见颗粒。经振摇(300rpm，25℃)3天、或冻融循环(-70℃至室温)5轮、或40℃孵育2周后，制剂配方F01-F31均无可见颗粒的产生。经40℃孵育4周后，制剂配方F01-F08、F10-F20、F22-F31外观仍为无色、微乳光、无可见颗粒，但制剂配方F21出现小于等于5颗的可见颗粒，制剂配方F09出现5颗以上的可见颗粒。
(2)差式量热扫描(DSC)
采用差式量热扫描仪MicroCalTM VP DSC进行样品转变熔点温度(Tm)和起始解折叠温度(Tm onset)检测。设置实验参数使得扫描温度以200℃/h的扫描速率从10℃上升到95℃。数据分析采用MicroCalTM VP DSC自动分析软件。
表7.DSC分析结果
制剂配方编号 Tm onset(℃) Tm1(℃) Tm2(℃)
F01 60.3 69.8 77.6
F02 57.0 71.3 76.9
F03 58.7 70.7 76.7
F04 58.2 69.7 76.4
F05 58.3 68.9 76.4
F06 57.9 69.1 76.3
F07 58.0 69.2 76.0
F08 57.9 69.2 76.1
F09 59.7 69.6 75.9
结果见表7和图2，实验结果显示：在相同缓冲体系中，添加不同种类的辅料，制剂配方F01-F09的Tm onset值没有明显差别，范围在57.9℃～60.3℃。
数据表明CD47抗体蛋白在不同的制剂配方中具有相近的热稳定性。
(3)不溶性微粒测试(HIAC)
在生物安全柜中用HACH不溶性微粒分析仪检测样品中不溶性微粒的尺寸和颗粒数。使用前先用超纯水清洗系统，测试超纯水中的不溶性微粒。环境通过测试后(10μm微粒数小于25粒每25毫升)测试样品。每个样品连续进样4次，每次进样1mL，舍弃第1次进样检测结果，结果报告后3次连续检测结果中每毫升粒径≥2μm，≥5μm，≥10μm和≥25μm的粒子数量平均值。
表8.样品经振荡处理后的HIAC分析结果
表9.经40℃孵育4周处理后的HIAC分析结果
详细结果参见表8和表9，结果显示：经振摇(300rpm，25℃)3天后，制剂配方F05不溶性微粒数在几种水平上(≥5μm；≥10μm)高于其他制剂配方；经40℃孵育4周后，所有制剂配方微粒数无明显增长。
(4)分子筛色谱(SEC-HPLC)
在安捷伦高效液相色谱系统上使用SEC色谱柱(300×7.8mm,5μm)运行的。样品温度设置为5℃，柱温设置为25℃。流动相组成为50mM PB,300mM NaCl,pH 6.8±0.1，流速设置为1.0mL/min。使用流动相将样品稀释至10mg/mL浓度进样至系统并运行20min，检测波长设置为280nm。使用安捷伦CDS软件进行数据分析。
表10-1.40℃孵育4周SEC-HPLC检测结果
备注：表10-1为将样品置于40℃稳定性箱中孵育4周后检测结果
表10-2.冻融5轮SEC-HPLC检测结果
备注：表10-2为冻融循环(-70℃至室温)5轮后检测结果
表10-3.振摇3天SEC-HPLC检测结果
备注：表10-3为振摇(300rpm，25℃)3天后检测结果
详细结果详见表10-1、10-2、10-3，结果显示：经冻融循环(-70℃至室温)5轮后，所有制剂配方SEC-HPLC结果均无明显变化，表明CD47抗体蛋白在所有候选制剂配方中均表现出良好的冻融稳定性。经振摇(300rpm，25℃)3天后，制剂配方F01和F04中SEC-HPLC主峰纯度分别下降3.0％和0.8％，其他配方中主峰纯度下降0.0％～0.4％。经40℃孵育4周后，制剂配方F06中SEC-HPLC主峰纯度下降3.0％，其他制剂配方中主峰纯度下降1.3％～2.4％。
综上所述，SEC-HPLC分析表明，制剂配方F01、F04和F06中CD47抗体蛋白的稳定性较差。
(5)毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)
采用ProteinSimple公司的毛细管等电聚焦电泳分析仪和氟涂层电泳毛细管对CD47抗体进行的测定。预混液为0.5μL等电点标记物(pI7.05)，0.5μL等电标记物(pI9.50)，4.0μL两性电解质3-10，35μL 1％甲基纤维素，37.5μL 8M尿素溶液和2.5μL超纯水。用超纯水将样品稀释到1.0mg/mL。取20μL稀释液和80μL预混液加到离心管中，混合并离心。样品进样温度为10℃，聚焦第一阶段为1500V一分钟，第二阶段为3000V八分钟，报告主峰、酸蜂和碱峰面积百分比。
表11.iCIEF检测结果
结果见表11，结果显示：制剂配方F06的稳定性较差。
试验例3抗CD47抗体的生产
将人源化可变结构域与分泌信号和人类κ以及人类FcIgG4S228P恒定结构域组合，将其克隆到哺乳动物表达系统中，并且转染到293细胞中以生成人源化mAb。将人源化变体表达为全长IgG分子、分泌到培养基中并使用蛋白质A纯化。
在Expi293细胞中瞬时表达并纯化人源化抗体和阳性对照抗体Hu5F9-G4(Hu5F9-G4序列已在美国专利US2015/0183874A1中公开)。
对于Expi293细胞中抗体的瞬时表达，使用载体pCDNA3.4，首先将抗体的重链和轻链克隆到单独的pCDNA3.4载体中，使用PEI(购自Polysciences)化学转染试剂、按照化学转染的方法将带有抗体分子重链和轻链的pCDNA3.4载体转入Expi293细胞中，按照生产商提供的方案瞬时转染培养的Expi293细胞。
瞬时转染前一天Expi293(ThermoFisher Scientific；A14635)细胞传代，用Dynamis培养基(gibco；A2617502)按2E6的密度接种1L摇瓶(conning；431147)，放入细胞培养摇床(Adolf Kuhner；ISF4-XC)中37℃；8％CO2；120rpm培养；
转染当天，Expi293细胞用细胞计数仪(Countstar；IC1000)计数，用新鲜Dynamis培养稀释调整细胞密度为2.9E6；准备转染；PEI：DNA＝3:1；混匀5min，将二者轻柔混匀20次，静置15～30min。将DNA-PEI混合物加入Expi293细胞中，混匀，放入细胞培养摇床(AdolfKuhner；ISF4-XC)中37℃；8％CO2；120rpm培养；转染4h之后补加双抗(gibco；15140122)和抗凝剂(gibco；0010057)；
收获上清纯化：转染连续培养7天，之后收样，先低速1000rpm；10min；4℃离心(湘仪H2050R)，再高速12000rpm；30min；4℃；收集细胞培养上清，0.22um过滤。将培养上清应用于Protein ASepharose柱(GE Healthcare)。柱用PBS洗涤，然后用洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 3.0)洗脱蛋白质。收集的组分用1M Tris pH9.0中和。最后，将纯化的样品与PBS进行透析。
试验例4 CD47抗体亲和力测定
1、实验方法
采用生物膜干涉技术(ForteBio)测定本发明抗体结合人CD47(hCD47)的平衡解离常数(KD)。ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep，P等人，High throughputsolution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitopebinning.MAbs；2013.5(2)：p.270-8)进行，具体为：传感器在分析缓冲液中线下平衡30分钟，然后线上检测60秒建立基线，在线加载试验例3获得的经纯化的抗体至AHC传感器(ForteBio)上进行ForteBio亲和测量，再将具有加载的抗体的传感器暴露于100nM的CD47抗原中作用5分钟，之后将传感器转移至分析缓冲液解离5分钟用于解离速率测量。使用1：1结合模型进行动力学的分析。
2、实验结果
CD47抗体亲和力测定结果如表12所示，结果显示CD47抗体具有高亲和力。
表12 CD47抗体亲和力测定结果
抗体名称 KD(M) kon(1/Ms) kd(1/s)
7A11H11 5.90E-10 5.90E-10 5.90E-10
7A11H12 4.59E-10 4.59E-10 4.59E-10
7A11H14 5.62E-10 5.62E-10 5.62E-10
7A11H15 2.12E-10 1.48E+06 3.13E-04
7A11H35 8.81E-10 8.81E-10 8.81E-10
7A11H22 7.40E-10 7.40E-10 7.40E-10
7A11H33 3.60E-10 3.60E-10 3.60E-10
7A11H42 3.09E-10 3.09E-10 3.09E-10
试验例5抗CD47抗体亲和力测定
1、实验方法
在基于流式细胞术的测定法中测量本发明CD47抗体与人CD47的结合。具体步骤为：
采用表达人CD47的癌细胞系CCRF-CEM(上海中国科学院细胞库)属于人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞。将CCRF-CEM细胞(0.1×106个细胞)与不同浓度(最高浓度为30ug/mL，三倍稀释，共10个浓度)的实验抗体(本发明CD47抗体以及Hu5F9-G4抗体)，在含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，冰上孵育30分钟。然后将细胞洗涤至少两次，用FCM buffer(1XPBS+3％BSA)配制PE Goat anti human IgG Fc(1:500x稀释)荧光二抗，按100uL/孔加入对于的96孔板中，4度冰箱孵育30min。取出96孔板，250g离心5min，小心去上清后，加入FCMbuffer 200uL/孔，再次250g离心5min，小心去上清，将细胞洗涤至少两次用1xPBS 100uL/孔重悬，并通过流式细胞术进行分析，并根据其MFI用GraphPad拟合浓度依赖的曲线。以Hu5F9-G4抗体作为阳性对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体与人CD47结合的EC50结果如表13所示，CD47抗体(7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、阳性对照抗体Hu5F9-G4和hIgG4-同型对照)与人CD47结合的平均荧光强度如图3所示，CD47抗体(7A11H52、7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55、阳性对照抗体Hu5F9-G4和hIgG4-同型对照)与人CD47结合的平均荧光强度如图4所示，结果显示，本发明CD47抗体与阳性对照抗体对细胞水平的人CD47具有相当的特异性结合能力。
表13CD47抗体与人CD47的结合能力测定结果
抗体名称 EC50(nM)
7A11H11 0.8218
7A11H12 0.7157
7A11H22 0.8202
7A11H32 0.7172
7A11H42 0.7269
7A11H52 0.9148
7A11H14 0.9334
7A11H15 0.7234
7A11H33 0.7598
7A11H34 1.195
7A11H35 0.8623
7A11H55 1.209
Hu5F9-G4 0.7289
试验例6抗CD47抗体与猴CD47的结合
1、实验方法
通过转染携带全长猴CD47的pCDNA3.4载体，产生过表达猴CD47的CHO细胞稳定细胞株(CHO-cynoCD47细胞)，将CHO-cynoCD47细胞(0.1×106个细胞)与不同浓度(最高浓度为10ug/mL，三倍稀释，共10个浓度)的实验抗体(本发明CD47抗体以及Hu5F9-G4抗体)，在含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，冰上孵育30分钟。然后将细胞洗涤至少两次，用FCMbuffer(1XPBS+3％BSA)配制PE Goat anti human IgG Fc(1:500x稀释)荧光二抗，按100uL/孔加入对于的96孔板中，4度冰箱孵育30min。取出96孔板，250g离心5min，小心去上清后，加入FCM buffer 200uL/孔，再次250g离心5min，小心去上清，将细胞洗涤至少两次用1x PBS 100uL/孔重悬，并通过流式细胞术进行分析，并根据其MFI用GraphPad拟合浓度依赖的曲线。以Hu5F9-G4抗体作为阳性对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体与猴CD47结合的EC50结果如表14所示，CD47抗体(7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、7A11H52、阳性对照抗体Hu5F9-G4和hIgG4-同型对照)与猴CD47结合的平均荧光强度如图5所示，CD47抗体(7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55、阳性对照抗体Hu5F9-G4和hIgG4-同型对照)与猴CD47结合的平均荧光强度如图6所示，结果显示，相比，本发明抗体与阳性对照抗体对细胞水平形式猴具有相当的特异性结合能力。
表14CD47抗体与猴CD47结合的EC50结果
抗体名称 EC50(nM)
7A11H11 8.932
7A11H12 7.353
7A11H22 8.546
7A11H32 17.12
7A11H42 5
7A11H52 4.506
7A11H14 4.957
7A11H15 7.271
7A11H33 4.847
7A11H34 8.609
7A11H35 4.379
7A11H55 4.616
Hu5F9-G4 5.123
试验例7抗CD47抗体对人CD47配体SIRPα与CD47相互作用的阻断
1、实验方法
通过流式细胞术测定本发明CD47抗体阻断人CD47与SIRPα的结合能力。具体步骤为：
抗体稀释：用FCM buffer(1XPBS+3％BSA)将本发明CD47抗体和对照抗体Hu5F9-G4稀释成90ug/mL，然后3倍梯度稀释成10个浓度，将亚型对照hIgG4稀释成30ug/mL、1.1ug/mL、0.04ug/mL，配体hSIRPα-mFC(AcroBiosystems)稀释至10ug/mL。
将CCRF-CEM(上海中国科学院细胞库)细胞按0.1×106个细胞/孔加入到96孔V型板，并且在CD47抗体量增加的条件下监控hSIRPα-mFC结合。使用PE Goat anti mouse IgGFc二抗(Biolegend)确定结合的SIRPα。以Hu5F9-G4抗体作为阳性对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体(7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、Hu5F9-G4和hIgG4-同型对照)对人CD47的CD47/SIRPα结合抑制结果如图7所示，CD47抗体(7A11H52、7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55)对人CD47的CD47/SIRPα结合抑制结果如图8所示，结果显示，本发明CD47抗体能够在细胞水平显著抑制阻断CD47与SIRPα的结合，与阳性对照抗体相比，本发明CD47抗体表现出相当的阻断能力。
试验例8 CD47抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞能力的检测
1、实验方法
在基于流式细胞术的测定法中测定本发明CD47抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力。具体步骤为：
取捐赠者的新鲜血液，分离得到外周血单核细胞(PBMC)，并通过hCD14磁珠(Miltenyi/130-050-201)从PBMC中分离CD14阳性单核细胞，配置含rhGM-CSF(R&D；7954-GM-010)的完全培养基，rhGM-CSF终浓度为50ng/mL，CD14阳性单核细胞的浓度为5E5/mL，按20mL/皿加入到细胞培养皿中；转移至5％CO2 37℃细胞培养箱中，每3天对半更换新鲜培养基；(含50ng/mLGM-CSF)继续培养4天。在第8天将巨噬细胞上清吸到15mL离心管中，同时加入预冷的DPBS，直接用细胞刮刀收集细胞；
选择人CD47高表达的肿瘤细胞系Jurkat(上海中国科学院细胞库)作为靶细胞类型，将靶肿瘤细胞按照CellTraceTM CFSE试剂盒的说明，进行荧光标记。将标记好的肿瘤细胞与上述已经完成分化的巨噬细胞按照1：1的比例共培养，同时加入终浓度10ug/mL、1ug/mL、0.1ug/mL抗体在37℃孵育2小时。然后将细胞洗涤至少两次，将细胞小心吹下，加入别藻青蛋白(allophycocyanin，APC)标记的CD14抗体(购自Biolegend；B259538)，在含0.1％BSA的PBS中冰上(避光)孵育30分钟。将细胞洗涤至少两次并通过流式细胞术进行分析。被吞噬的细胞群体为活细胞中CD14阳性并且荧光染料CFSE(carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester，羧基荧光素双乙酸盐，琥珀酰亚胺酯)也为阳性的细胞群体。以Hu5F9-G4抗体作为阳性对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力测定结果如图9所示，结果显示，本发明CD47抗体具有促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力，且促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力与阳性对照抗体Hu5F9-G4的能力相当。
试验例9CD47抗体对人类红细胞(RBC)血凝集分析
1、实验方法
进行红细胞血凝集分析来表征CD47抗体的RBC凝集能力。通过观察抗体避免人RBC发生沉降的能力就RBC凝集对CD47抗体进行筛选。具体方法为：
人类红细胞在PBS中稀释到2％，与滴入的CD47抗体(浓度依次为200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、25ug/mL、12.5ug/mL、6.25ug/mL、1.5625ug/mL、0.78125ug/mL、0.390625ug/mL、0.195313ug/mL、0.097656ug/mL)在圆底96孔板内在37℃孵育2小时。未沉淀的红细胞的存在是证明红细胞血凝聚的证据，与未凝聚的红细胞沉淀形成清晰的红点相比，未沉淀的红细胞呈雾状。以Hu5F9-G4抗体作为阳性对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体的RBC凝集能力测定结果如图10所示，结果显示，当CD47抗体浓度达到200ug/mL时均未引起细胞凝聚，表明本发明CD47抗体具有显著降低红细胞血凝聚的作用，CD47抗体在临床治疗癌症中能够显著降低其副作用、安全性好。
试验例10CD47抗体与人类红细胞(RBC)结合分析
1、实验方法
CD47单抗存在与人类红细胞结合的特性，对CD47抗体抑制剂来说，存在药效受红细胞干扰及肿瘤脱靶的潜在风险。若能筛选到与红细胞结合活性低的抗体则能够降低脱靶的风险，提高其安全性。具体步骤如下：
(1)抗体稀释：用FACS buffer将CD47抗体稀释成初始浓度20μg/mL，体积180uL，
3倍梯度稀释(60+120)，11个浓度；
(2)细胞计数并铺板：将RBC细胞离心250g 5min后弃去上清，用FACS buffer调整细胞密度为2E+06，按100uL/管均分到96孔V型板中；
(3)将上述稀释好的抗体加入细胞中，100uL/孔，2℃～8℃孵育0.5h；
(4)取出96孔板，250g离心5min，小心去上清后，加入FACS buffer 200uL/孔，再次250g离心5min，小心去上清；
(5)用FACS buffer配制PE goat anti-human IgG Fc(biolegend)荧光二抗(1:500稀释)，按100uL/孔加入对应的96孔板中，重悬细胞，2℃～8℃孵育30min；
(6)取出96孔板，250g离心5min，小心去上清后，加入FACS buffer 200uL/孔，再次250g离心5min，小心去上清；
(7)用1xPBS 100uL/孔重悬，FACS检测。使用流式细胞仪(Beckman，cytoflex)分析数据，GraphPad Prism作图。以Hu5F9-G4抗体作为阳性对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体与人类红细胞结合能力的测定结果如图11所示，结果显示，与阳性对照抗体相比，本发明CD47抗体与人类红细胞的结合活性显著降低，其作为药物时的安全性提高。
试验例11CD47抗体与血小板结合分析
1、实验方法
同CD47单抗结合人类红细胞一样，CD47单抗存在与血小板结合的活性特征，存在血小板降低带来的诸多副作用。与血小板结合低的抗体能够降低脱靶的风险，提高其安全性。具体方法如下：
抗体稀释：用FACS buffer将抗体稀释成20μg/ml，体积240ul；
细胞计数并铺板：将全血细胞稀释20倍，按100uL/管均分到96孔V型板中；
将上述稀释好的抗体加入到细胞中，100uL/孔，2℃-8℃孵育0.5h；
取出96孔板，250g离心5min，小心去上清后，加入FACS buffer 200ul/孔，再次250g离心5min，小心去上清；
用FACS buffer配制PE荧光二抗1:500稀释(PE goat anti-human IgG Fc；biolegend；409304)，按100ul/孔加入对于的96孔板中，同时每孔中加入1ul APC antihuman CD61(biolegend；336411),重悬细胞，2℃-8℃孵育30min；
取出96孔板，250g离心5min，小心去上清后，加入FACS buffer 200ul/孔，再次250g离心5min，小心去上清；
用1xPBS 200uL/孔重悬，FACS检测。以Hu5F9-G4抗体作为阳性对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体与血小板结合分析结果如图12所示，结果显示本发明的CD47抗体与血小板的结合活性显著低于阳性对照抗体，显示出了更优的安全性。
试验例12CD47抗体对激活巨噬细胞吞噬红细胞的作用分析
1、实验方法
检测方法同试验例8，将红细胞替换为肿瘤细胞作为靶细胞，检测本发明的CD47抗体是否对巨噬细胞吞噬红细胞存在激活作用。以Hu5F9-G4抗体作为阳性对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体对激活巨噬细胞吞噬红细胞的作用分析结果如图13所示，结果显示本发明的CD47抗体极低介导巨噬细胞对红细胞的吞噬，且介导作用明显低于阳性对照抗体，显示出了更优的安全性。
试验例13抗肿瘤活性分析
1、实验方法
选用70只NOD SCID雌性小鼠(购于浙江维通利华实验动物技术有限公司)构建人B淋巴细胞皮下移植瘤模型(Raji)和人恶性黑色素瘤模型(A375)，评估本发明的CD47抗体的抗肿瘤活性。以Hu5F9-G4抗体和TJC-4抗体作为阳性对照抗体，hIgG4为同型对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体对人B淋巴细胞皮下移植瘤模型的抗肿瘤结果如图14所示，结果显示本发明的CD47抗体在抗人B淋巴细胞皮下移植瘤效果上显著好于阳性对照抗体。
CD47抗体对人恶性黑色素瘤模型的抗肿瘤结果如图15所示，结果显示与阳性对照抗体相比，本发明的CD47抗体在抗人恶性黑色素瘤效果上更加有优势。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，其包括以下组分：抗CD47抗体或其抗原结合片段、缓冲液和辅料；
所述抗体或其抗原结合片段含有以下CDRs：如SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:12或与SEQ ID NO:12具有至少95％同源性的氨基酸序列所示的HCDR3；
按组分在所述制剂中的质量体积百分数计，所述辅料包括：1％～20％的糖类和0.01％～0.5％的表面活性剂；
可选地，所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:21所示的LCDR1，如SEQ IDNO:2所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10所示的HCDR1，如SEQ IDNO:11所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:12所示的HCDR3；或者
所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:1所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:12所示的HCDR3；或者
所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:1所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10所示的HCDR1，如SEQ ID NO:22所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:12所示的HCDR3。
2.根据权利要求1所述的含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，所述表面活性剂选自吐温20、吐温80和泊洛沙姆188中的任意一种；
优选地，所述表面活性剂为吐温80，所述吐温80在所述制剂中的质量体积百分数为0.01％～0.1％，优选为0.01％～0.04％，更优选为0.02％；或者
优选地，所述表面活性剂为泊洛沙姆188，所述泊洛沙姆188在所述制剂中的质量体积百分数为0.05％～0.5％，优选为0.1％～0.2％，更优选为0.1％。
3.根据权利要求1或2所述的含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，所述糖类包括蔗糖和海藻糖中的至少一种；
优选地，所述糖类为蔗糖；所述蔗糖的浓度优选为3％～15％(w/v)，优选为6％～10％(w/v)，更优选为8％(w/v)；或者
优选地，所述糖类为海藻糖；所述海藻糖的浓度优选为3％～15％(w/v)，优选为6％～10％(w/v)，更优选为8％(w/v)。
4.根据权利要求1至3任一项所述的含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，所述制剂还包括甲硫氨酸；
优选地，所述甲硫氨酸的浓度为1～20mM，优选为4.5～5.5mM，更优选为5mM。
5.根据权利要求1至4任一项所述的含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，所述缓冲液选自：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、组氨酸-组氨酸盐缓冲液和磷酸-磷酸盐缓冲液中的任意一种，pH为4.5～7.5；
优选地，所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、组氨酸-组氨酸盐缓冲液和磷酸-磷酸盐缓冲液中的任意一种，pH为5.0～7.5；
优选地，所述缓冲液为组氨酸-组氨酸盐缓冲液，pH优选为5.5～6.0，pH更优选为6.0；
优选地，所述缓冲液的浓度为10～40mM；优选15～25mM，更优选为20mM。
6.根据权利要求1～5任一项所述的含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段的浓度为20～60mg/mL；
优选地，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段的浓度为45～55mg/mL；
更优选地，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段的浓度为50mg/mL。
7.根据权利要求1～6任一项所述的含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段包括有重链可变区和轻链可变区；
优选地，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO:4～9中任一项所示或与SEQ ID NO:4～9任一项所示具有至少95％同源性的序列；所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO:13～18中任一项所示或与SEQ ID NO:13～18任一项所示具有至少95％同源性的序列；
优选地，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:8所示的序列，和所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的序列。
8.根据权利要求1～7任一项所述的含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段还包括恒定区；
优选地，所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD中的任一种；轻链恒定区为κ或λ链；
优选地，所述恒定区的种属来源选自鼠、兔、羊、猴、或人；
优选地，所述抗体为CDR移植抗体、多聚体抗体或双特异性抗体中的任一种或几种；
优选地，所述抗原结合片段为F(ab’)2、Fab、scFv和Fv中的任一种或几种；
更选地，所述抗CD47抗体包括如SEQ ID NO:19所示的重链，和如SEQ ID NO:20所示的轻链。
9.根据权利要求8所述的含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，其包括：
(a)50mg/mL的抗CD47抗体，所述抗CD47抗体包括如SEQ ID NO:19所示的重链，和如SEQID NO:20所示的轻链；
(b)pH为6.0的20mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液；
(c)8％(w/v)的蔗糖；和
(d)0.02％(w/v)的吐温80。
10.如权利要求1～9任一项所述的含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂的制备方法，其包括：将所述制剂的组分混合；
优选地，当所述制剂中的抗CD47抗体或其抗原结合片段为抗CD47抗体或其抗原结合片段的溶液时，所述制备方法还包括：采用所述制剂中的缓冲液对抗CD47抗体或其抗原结合片段的溶液进行置换；置换后与辅料混合。
11.如权利要求1～9任一项所述的制剂在制备用于防治CD47阳性肿瘤的产品中的应用。
12.一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的冻干制剂，其由如权利要求1～9任一项所述的制剂冷冻干燥后获得。
13.一种含抗CD47抗体或其抗原结合片段的制剂，其由如权利要求12所述的冻干制剂复溶后获得。
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