CN115361971A - 抗体制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有药理学上可接受的浓度和稳定的储存寿命的抗CD47抗体的制剂。

Description

抗体制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年4月6日提交的美国临时专利申请号63/005,755的权益和优先权，其全部公开内容以全文引用的方式并入本文，用于所有目的。

背景技术

免疫球蛋白是免疫系统的多功能组分，其促进细胞和体液对多种抗原的反应。免疫疗法中的一种形式利用固有免疫系统的能力。通过与吞噬细胞受体(SIRPα)接合的细胞表面蛋白CD47，提供了关键的“不要吃我”信号，该信号可以关闭表达CD47的细胞的吞噬作用。阻断CD47介导的SIRPα对吞噬细胞的接合可以增强靶细胞的吞噬去除。抗CD47抗体治疗也已经显示能够使巨噬细胞吞噬癌细胞。

提供抗CD47抗体的稳定治疗制剂是开发临床相关疗法的关键步骤。然而，CD47是广泛表达的抗体，以一定水平存在于大多数人类细胞上。将抗CD47抗体结合到细胞表面上的靶标可以触发复合物进入细胞的内化，随后进行后续的复合物溶酶体降解。通常，与膜抗原结合的mAb的清除在低剂量下更快，因为未结合的靶标将“吸收”抗体，起到沉默的作用(这种现象称为“抗原沉默”)。结果是可能需要相对高剂量的抗体。

此外，由于抗体是大且复杂的分子，因此它们的制剂具有特殊的问题。对于保持生物活性的蛋白质，制剂必须完整保持至少蛋白质氨基酸的核心序列的构象完整性，同时保护蛋白质的多个官能团免受降解。蛋白质的降解途径可能涉及化学不稳定性，例如由于脱酰胺、外消旋、水解、氧化、β消除或二硫键交换引起的化学不稳定性；或由于变性、聚集、沉淀或吸附引起的物理不稳定性。

配制抗体治疗剂的方法需要首先理解蛋白质如何应对暴露于可能在制造或储存期间遇到应力源的情况，该应力源例如冷冻/解冻、搅拌/剪切、热稳定性。抗体具有在高浓度下聚集的倾向，使得制剂优化变得困难，并且目前经FDA批准用于抗体制剂的缓冲液和赋形剂的列表相对较短，这可能使高浓度优化的空间受限。

提供用于临床使用的稳定储存的抗体的特定制剂仍然是一个挑战。

相关公布包括美国专利8,562,997；9,399,682；9,017,675；9,382,320；9,151,760；8,758,750；8,361,736；8,709,429；9,193,955；和7,514,229，以及国际专利申请US2016/049016；US2016/030997；US2016/036520；US2015/046976；US2015/044304；US2015/057233；US2015/026491；US2015/019954；US2015/010650；US2014/035167；US2014/018743；US2014/038485；US2013/021937；和US2011/066580，它们各自以引用方式并入本文。

发明内容

提供抗CD47抗体的制剂，并且尤其是具有药理学上可接受的浓度和稳定的储存寿命的抗CD47抗体的水性和冻干制剂。

在一些实施方案中，制剂中(例如在液体制剂中)的抗CD47抗体不受之前冻干的影响。在一些实施方案中，制剂中的抗CD47抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，制剂中的抗CD47抗体是全长抗体。在一些实施方案中，制剂中的抗CD47抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，制剂中的抗CD47抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗体包含人IgG4恒定链。在一些实施方案中，抗体是莫洛利单抗(magrolimab)。

在一些实施方案中，抗CD47抗体包含以下区域：包含序列(SEQ ID NO:1)的HCDR1区域、包含序列(SEQ ID NO:2)的HCDR2区域、包含序列(SEQ ID NO:3)的HCDR3区域、包含序列(SEQ ID NO:4)的LCDR1区域、包含序列(SEQ ID NO:5)的LCDR2区域、和包含序列(SEQ IDNO:6)的LCDR3区域。在一些实施方案中，这种抗体包含人IgG4恒定区序列。

在一些实施方案中，该制剂是液体制剂，其包含：10mg/ml至160mg/ml(例如10mg/ml至100mg/ml，例如10mg/ml至80mg/ml)的抗CD47抗体；浓度为5mM至20mM的药学上可接受的缓冲液；稳定剂、和表面活性剂，其中制剂的pH为约pH 4至6.5。在一些实施方案中，抗CD47抗体是莫洛利单抗(magrolimab)。

在一些实施方案中，该制剂是液体制剂，其包含10mg/ml至20mg/ml的莫洛利单抗；10mM的乙酸盐缓冲液；5％w/v的山梨糖醇；0.01％至0.04％的聚山梨醇酯20，例如0.01％至0.02％的聚山梨醇酯20；该制剂的pH为4.5–5.5。

在一些实施方案中，该制剂是液体制剂，其包含10mg/ml至20mg/ml的莫洛利单抗；10mM的乙酸盐缓冲液；2％至12％w/v的蔗糖，例如9％w/v的蔗糖；0.01％至0.04％的聚山梨醇酯20，例如0.01％至0.02％的聚山梨醇酯20；该制剂的pH为4.5–5.5。

在一些实施方案中，该制剂是液体制剂，其包含10mg/ml至20mg/ml的莫洛利单抗；10mM的乙酸盐缓冲液；2％至12％w/v的海藻糖，例如9％w/v的海藻糖；0.01％至0.04％的聚山梨醇酯20，例如0.01％至0.02％的聚山梨醇酯20；该制剂的pH为4.5–5.5。

在一些实施方案中，制剂提供抗体在储存期间的稳定性，例如，在2-8℃下储存大于8周、大于16周、大于24周、大于48周、大于12个月、大于2年、大于3年、大于4年、大于5年的时间段之后保持至少50％的活性、至少75％的活性、至少95％的活性。在12个月、2年、3年、4年或5年后的稳定性可以为100±50％。

在一些实施方案中，提供了一种使用方法，该方法包括向有需要的患者施用有效剂量的抗体制剂，该抗体制剂包含10mg/ml至80mg/ml，例如20mg/ml至50mg/ml的莫洛利单抗；10mM的乙酸盐缓冲液；5％w/v的山梨糖醇；0.01％至0.04％的聚山梨醇酯20，例如0.01％至0.02％的聚山梨醇酯20；该制剂的pH为4.0–5.5，例如4.0–5.3，例如4.0–5.0。

在一些实施方案中，提供了一种使用方法，该方法包括向有需要的患者施用有效剂量的抗体制剂，该抗体制剂包含10mg/ml至80mg/ml，例如20mg/ml至50mg/ml的莫洛利单抗；10mM的乙酸盐缓冲液；9％w/v的蔗糖；0.01％至0.04％的聚山梨醇酯20，例如0.01％至0.02％的聚山梨醇酯20；该制剂的pH为4.0–5.5，例如4.0–5.3，例如4.0–5.0。

在一些实施方案中，提供了一种使用方法，该方法包括向有需要的患者施用有效剂量的抗体制剂，该抗体制剂包含10mg/ml至80mg/ml，例如20mg/ml至50mg/ml的莫洛利单抗；10mM的乙酸盐缓冲液；9％w/v的海藻糖；0.01％至0.04％的聚山梨醇酯20，例如0.01％至0.02％的聚山梨醇酯20，pH为4.0–5.5，例如4.0–5.3，例如4.0–5.0。

附图说明

图1：作为添加的聚山梨醇酯20的函数的莫洛利单抗制剂的表面张力。

图2A至图2D：主峰WCX-HPLC结果

图3A至图3D：前峰WCX-HPLC结果

图4A至图4D：SE-HPLC单体结果

图5A至图5D：SE-HPLC聚集体/前峰结果

图6：作为浓度的函数测量的莫洛利单抗的粘度

图7：用莫洛利单抗研究的各种稳定赋形剂

具体实施方式

在描述本发明的方法和组合物之前，应当理解，本发明不限于所描述的具体方法或组合物，因为它们当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而并非旨在进行限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。

在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另外明确指出，否则在该范围的上限与下限之间的每个居间值(到下限单位的十分之一)也被具体公开。指定范围内的任何指定值或居间值与该指定范围内的任何其他指定或居间值之间的每个较小范围均涵盖在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围外，并且其中任一个限值均包括在该较小范围内、两个限值均不包括在或均包括在该较小范围内的每个范围也涵盖在本发明之内，受限于该指定范围内的任何明确排除的限值。在指定范围包括所述限值中的一者或两者的情况下，排除那些包括的限值中的任一者或两者的范围也包括在本发明中。

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料，但是现在描述一些潜在的和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。应当理解，在存在矛盾的情况下，本公开取代并入的出版物的任何公开内容。

必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞，并且提及“该肽”包括提及一种或多种肽及其等同物，例如多肽，这是本领域技术人员已知的，等等。

提供本文所讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容都不应理解为承认本发明由于在先发明而无权先于这种出版物。另外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，实际出版日期可能需要独立确认。

“包含”意指在组合物/方法/试剂盒中需要的所述要素，但是可以包括其他要素以形成在权利要求书范围内的组合物/方法/试剂盒等。例如，如本领域将容易理解的，除了任何排除性前提条件所涵盖的要素之外，组合物可包含促进稳定性的试剂、促进溶解度的试剂、辅剂等。

“基本上由……组成”意指将所述的组合物或方法的范围限制于指定的材料或步骤上，该指定的材料或步骤不实质性影响本发明的基本和新颖特征。例如，“基本上由所公开的序列组成”的抗体，基于从其中它衍生出的序列，在序列的边界处具有所公开的序列加或减约5个氨基酸残基的氨基酸序列，例如比所述的边界氨基酸残基少约5个残基、4个残基、3个残基、2个残基或约1个残基，或者比所述的边界氨基酸残基多约1个残基、2个残基、3个残基、4个残基或5个残基。

“由……组成”意指从权利要求书中未指定的任何要素、步骤或成分的组合物、方法或试剂盒中排除。

分子和细胞生物化学中的一般方法可见于以下标准教科书：诸如MolecularCloning:A Laboratory Manual，第3版(Sambrook等人，CSH Laboratory Press 2001)；Short Protocols in Molecular Biology，第4版(Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons1999)；Protein Methods(Bollag等人，John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectors forGene Therapy(Wagner等人编辑，Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy编辑，Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits编辑，AcademicPress 1997)；以及Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures inBiotechnology(Doyle&Griffiths，John Wiley&Sons 1998)，其公开内容以引用方式并入本文。本公开中提及的用于基因操纵的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业供应商获得，诸如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech。

如本文所用，“抗体”包括提到能与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆抗体和单克隆抗体两者，例如完整的四聚体IgG蛋白。该术语还包括基因工程化形式，诸如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异源缀合物抗体。术语“抗体”还包括抗体的抗原结合形式，包括具有抗原结合能力的片段(例如，Fab'、F(ab')₂、Fab、Fv和rIgG)。该术语还指重组单链Fv片段(scFv)。术语“抗体”还包括二价或双特异性分子、双体抗体、三体抗体和四体抗体。

抗体还作为通过用各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段存在。因此，胃蛋白酶在铰链区中的二硫键下方消化抗体以产生Fab的二聚体F(ab)'₂，Fab本身是通过二硫键与V_H-C_H1接合的轻链。F(ab)'₂可以在温和条件下还原以使铰链区中的二硫键断裂，从而将F(ab)'₂二聚体转化成Fab’单体。该Fab’单体实质上是具有铰链区的一部分的Fab。虽然根据完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但是本领域技术人员将会知道，此类片段可以通过化学方式或通过使用重组DNA方法从头合成。因此，如本文所用的术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或者使用重组DNA方法(例如单链Fv)从头合成的抗体片段，或者使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段。

“人源化抗体”是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白分子。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自该受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔子的CDR的具有所需特异性、亲和力和能力的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基替代。人源化抗体还可以包含既不存在于受体抗体中也不存在于输入的CDR或框架序列中的残基。一般来讲，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且全部或基本上全部的框架(FR)区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分，尤其是IgG4 Fc区。

本文的“CDRs”可以由Chothia等人；Kabat等人；等等定义。参见Chothia C，LeskAM.(1987)Canonical structures for the hypervariable regions ofimmunoglobulins。J Mol Biol.,196(4):901-17，其以引用方式全文并入本文。参见KabatE.A,Wu T.T.,Perry H.M.,Gottesman K.S.和Foeller C.(1991).Sequences of Proteinsof Immunological Interest.第5版，NIH公布号91-3242，华盛顿哥伦比亚特区的美国卫生和公众服务部(US Dept.of Health and Human Services,Washington,D.C.)，其以引用方式全文并入本文。

术语“表位”包括能够与抗体特异性结合或以其他方式与分子相互作用的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团诸如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成，并且可能具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是“线性表位”或“构象表位”。术语“线性表位”是指如下表位：蛋白质与相互作用分子(如抗体)之间的所有相互作用点沿着蛋白质的主要氨基酸序列线性发生(连续的)。术语“构象表位”是指其中不连续的氨基酸以三维构象汇集在一起的表位。在构象表位中，相互作用点发生在蛋白质上彼此分离的氨基酸残基上。

“结合相同的表位”是指抗体或其他结合剂与CD47结合并具有与示例性抗体相同的表位的能力。可以使用标准表位作图技术测定示例性抗体和其他抗体与CD47的表位。本领域众所周知的表位作图技术包括Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris编辑，1996)Humana Press,Totowa,N.J.例如，可以通过以下步骤来测定线性表位：例如在固体载体上同时合成大量肽，该肽对应于蛋白质分子的部分，并且使肽与抗体反应，同时肽仍然附接到载体上。此类技术是本领域已知的并且描述于例如美国专利4,708,871；Geysen等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:3998-4002；Geysen等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:78-182；Geysen等人，(1986)Mol.Immunol.23:709-715。类似地，通过测定氨基酸的空间构象，例如通过氢/氘交换、x射线晶体学和二维核磁共振来容易地识别构象表位。参见例如Epitope Mapping Protocols，同上。蛋白质的抗原区域也可以使用标准抗原性和亲水性图来识别，诸如使用例如可从Oxford Molecular Group获得的Omiga 1.0版软件程序计算的那些。此计算机程序采用Hopp/Woods方法，Hopp等人,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA 78:3824-3828；用于确定抗原性曲线，以及Kyte-Doolittle技术，Kyte等人，(1982)J.Mol.Biol.157:105-132；用于亲水性图。

制剂

本公开的制剂包含10mg/ml至160mg/ml(例如10mg/ml至100mg/ml，例如10mg/ml至80mg/ml)的抗CD47抗体；和药学上可接受的赋形剂，该赋形剂包含浓度为5mM至20mM的缓冲液；稳定剂、和表面活性剂，其中制剂的pH为约pH 4至6.5。

术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法变型在指代组合物、载剂、稀释剂和试剂时可互换使用，并且表示所述材料能够施用于人或在人上施用，而不会产生不期望的生理效应至将阻止施用该组合物的程度。

“药学上可接受的赋形剂”意指可用于制备药物组合物的赋形剂，其通常是安全、无毒和期望的，并且包括兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者在气溶胶组合物的情况下，可以是气态的。根据本公开，各种药学上可接受的稀释剂、载剂和赋形剂以及用于制备和使用药物组合物的技术将是本领域技术人员已知的。例示性药物组合物和药学上可接受的稀释剂、载剂和赋形剂也在如下文献中描述：Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第20版(Lippincott,Williams&Wilkins 2003)；Loyd V.Allen Jr(编辑)，“Remington:The Science andPractice of Pharmacy,”第22版，2012，Pharmaceutical Press；Brunton,Knollman andHilal-Dandan,“Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics,”第13版,2017,McGraw-Hill Education/Medical；McNally and Hastedt(编辑),“Protein Formulation and Delivery,”第2版,2007,CRC Press；Banga,“Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and DeliverySystems,”第3版,2015,CRC Press；Lars Hovgaard,Frokjaer and van de Weert(编辑),“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins,”第2版,2012,CRC Press；Carpenter and Manning(编辑),“Rational Design of Stable ProteinFormulations:Theory and Practice,”2002,Springer(Pharmaceutical Biotechnology(Book 13))；Meyer(编辑),“Therapeutic Protein Drug Products:PracticalApproaches to Formulation in the Laboratory,Manufacturing,and the Clinic,”2012,Woodhead Publishing；以及Shire,“Monoclonal Antibodies:Meeting theChallenges in Manufacturing,Formulation,Delivery and Stability of Final DrugProduct,2015,Woodhead Publishing。

将掺入如本文所述的抗体用于非肠道给药的药物组合物与药学上可接受的非肠道媒介物相结合，配制成单位剂量可注射形式(例如溶液、悬浮液、乳液)，并且可以是无菌的且基本上是等渗的(250-350mOsm/kg水)，并且在GMP条件下制造。药物组合物可以单位剂型(即，单次施用的剂量)提供。药物组合物可使用一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂来配制。制剂取决于所选择的施用途径。对于注射，可以在水性溶液中配制抗体，例如在生理上相容的缓冲液中配制抗体，诸如磷酸盐缓冲盐水、氨基酸缓冲液(例如带电荷的氨基酸，包括但不限于组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸)、Tris缓冲液、Hank溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液、和5％人血清白蛋白或乙酸盐缓冲液(用于减少注射部位的不适)、以及本文列出的另外的缓冲液。溶液可含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。另选地，抗体可为在使用前用合适的媒介物(例如，不含热原的无菌水)重构的冻干形式。药物组合物的制剂和递送方法通常将根据待治疗的部位和疾病进行调整。示例性制剂包括但不限于适于非肠道给药(例如静脉内或皮下给药)的那些制剂。

“药学上可接受的盐和酯”意指药学上可接受的并且具有期望的药理特性的盐和酯。此类盐包括在化合物中存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应的情况下可以形成的盐。合适的无机盐包括与碱金属(例如钠和钾、镁、钙和铝)形成的那些。合适的有机盐包括与有机碱形成的那些，所述有机碱诸如胺碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。此类盐还包括与无机酸(例如，盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、马来酸，以及烷烃磺酸和芳烃磺酸，诸如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由化合物中存在的羧基基团、磺酰氧基基团和膦酰氧基基团形成的酯，例如C_1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或单酸单酯，或者二盐或二酯；并且类似地，当存在多于两个酸性基团时，此类基团中的一些或全部可以成盐或酯化。本发明中命名的化合物能够以未成盐或未酯化的形式存在，或者以成盐和/或酯化的形式存在，并且此类化合物的命名旨在既包括原始(未成盐和未酯化的)化合物，也包括其药学上可接受的盐和酯。另外，本发明中命名的某些化合物能够以多于一种立体异构形式存在，并且此类化合物的命名旨在包括所有单一立体异构体，以及此类立体异构体的所有混合物(无论是外消旋的还是其他的)。如本文所用，“缓冲液”是指通过其酸碱共轭组分的作用对抗pH改变的缓冲溶液。可用于药物制剂、特别是用于非肠道给药的制剂的缓冲液可用于本发明的制剂中，并且包括但不限于：乙酸盐缓冲液，例如乙酸/乙酸钠；组氨酸；磷酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐；天冬氨酸盐；琥珀酸盐；苹果酸盐；富马酸盐；葡糖酸盐；谷氨酸盐。在一些实施方案中，缓冲液是乙酸盐缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液是组氨酸缓冲液。

在一些实施方案中，制剂中的缓冲液的浓度为5mM到50mM。在一些实施方案中，制剂中的缓冲液的浓度为7.5mM到25mM。在一些实施方案中，制剂中的缓冲液的浓度为10mM到20mM。在一些实施方案中，制剂中的缓冲液是乙酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。

在水性制剂中，缓冲液的浓度可以为约5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM。在某些实施方案中，浓度为8mM至12mM，例如10mM。可以按需或根据需要将这类水性制剂冻干。

缓冲制剂的pH可以为pH 4至pH 6.5。在一些实施方案中，pH为pH4.5至pH 6。在一些实施方案中，pH为pH 4.7至pH 5.3。在一些实施方案中，pH为pH 4.75至pH 5.25。在一些实施方案中，pH为pH 4.9至pH5.1。

在一些实施方案中，制剂的pH为约pH 4.5、pH 4.6、pH 4.7、pH4.8、pH 4.9、pH 5、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH 5.4、pH 5.5。在某些实施方案中，pH为4.9至5.1，例如pH 5。

包括稳定剂、冷冻保护剂和/或冻干保护剂以改善抗体在储存、转移和使用时的条件下的稳定性。合适的稳定剂包括但不限于碳水化合物、氨基酸、助溶剂、抗氧化剂、螯合剂、盐、张力调节剂、离子强度调节剂。

该制剂可以含有任何所需的游离氨基酸，该游离氨基酸可以为L型、D型或这些类型的任何所需混合物。在一个方面，可以包含在制剂中的游离氨基酸包括例如组氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、以及它们的组合。一些氨基酸可以在制造、干燥、冻干和/或储存期间使蛋白质稳定而避免降解，例如通过氢键、盐桥、抗氧化剂特性或疏水相互作用或者通过蛋白表面的排斥而使蛋白质稳定。氨基酸可以充当张力调节剂，或者可以起到降低制剂的粘度的作用。在另一方面，游离氨基酸如组氨酸、甘氨酸和精氨酸可以充当冻干保护剂，并且当经受冻干作为制剂的组分时不结晶。游离氨基酸例如谷氨酸和组氨酸可以单独地或组合地在5至7.5的pH范围内用作水溶液中的缓冲剂。

本文的“糖类”是具有通式(CH₂O)的化合物及其衍生物，包括单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、还原糖、非还原糖等。本文的糖类的示例包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、葡聚糖、赤藓糖醇、甘油、阿拉伯糖替丁醇、甘露糖醇、蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖、麦芽糖、乳果糖、麦芽酮糖、葡萄糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异麦芽酮糖、山梨糖醇等。糖类可以是冻干保护剂。在一个方面，不结晶的糖类例如蔗糖或海藻糖是冻干保护剂。在一个方面，本文的糖类是非还原二糖，例如蔗糖、海藻糖或山梨糖醇。

术语“螯合剂”是指通过多于一个键与原子结合的试剂。在一个方面，本文的螯合剂的示例包括柠檬酸盐、EDTA、EGTA、二巯基丙醇、二亚乙基三胺五乙酸和N,N-双(羧甲基)甘氨酸。在另一方面，螯合剂是柠檬酸盐或EDTA。

术语抗氧化剂是指抑制其他分子氧化的试剂。本文的抗氧化剂的示例包括柠檬酸盐、硫辛酸、尿酸、谷胱甘肽、生育酚、胡萝卜素、番茄红素、半胱氨酸、膦酸化合物如羟乙磷酸、去铁胺和苹果酸。

对本公开的制剂所关注的特定稳定剂可包括一种或多种山梨糖醇，例如浓度为约2％至约12％，例如浓度为约2.5％至约10％；蔗糖，例如浓度为约2％至约12％，例如浓度为约2.5％至约10％；海藻糖，例如浓度为约2％至约12％，例如浓度为约2.5％至约10％；NaCl，浓度为约100mM至200mM；精氨酸，浓度为约15mM至75mM；或它们的组合，例如精氨酸和山梨糖醇、精氨酸和蔗糖、精氨酸和海藻糖、蔗糖和山梨糖醇等。

在一些实施方案中，稳定剂是浓度为约2.5％w/v、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％的山梨糖醇。在某些实施方案中，稳定剂为在水性缓冲液中浓度为约5％重量/体积的山梨糖醇。

“表面活性剂”是指使表面具有活性的试剂。表面活性剂包含在制剂中，主要用于减少蛋白质在固体/液体界面、液体/空气界面和蛋白/蛋白界面处的相互作用。它通过减少蛋白质对表面的吸附，以及减少由于来自搅拌、冷冻/解冻和剪切的应力而导致的聚集，来减少颗粒的形成。另外，它可以增强蛋白质的溶解度。通常，表面活性剂的类别是阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸钠(LABS)；月桂基硫酸钠；月桂基醚硫酸钠；石油磺酸盐；亚油酸磺酸盐；萘磺酸盐、支链烷基苯磺酸盐；直链烷基苯磺酸盐；醇硫酸盐；阳离子表面活性剂，例如硬脂基二甲基苄基氯铵；苯扎氯铵；季铵化合物；胺化合物，非离子表面活性剂，例如十二烷基二甲基氧化胺；椰油基二乙醇-酰胺醇乙氧基化物；直链伯醇聚乙氧基化物；烷基酚乙氧基化物；醇乙氧基化物；EO/PO多元醇嵌段聚合物；聚乙二醇酯；脂肪酸烷醇酰胺；两性：椰油基两性羧基甘氨酸盐；椰油酰胺丙基甜菜碱；甜菜碱；咪唑啉。

除上文所列举的那些之外，合适的非离子表面活性剂包括烷醇酰胺、氧化胺、嵌段聚合物、乙氧基化伯醇和仲醇、乙氧基化烷基酚、乙氧基化脂肪酯、脱水山梨糖醇衍生物、甘油酯、丙氧基化和乙氧基化脂肪酸、醇、和烷基酚、烷基葡糖苷乙二醇酯、聚合多糖、乙氧基化烷基酚的硫酸盐和磺酸盐、以及聚合物表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括乙氧基化胺和/或酰胺、磺基琥珀酸盐和衍生物、乙氧基化醇硫酸盐、醇硫酸盐、磺酸盐和磺酸衍生物、磷酸酯、和聚合物表面活性剂。

在一些实施方案中，制剂的表面活性剂是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、或普兰尼克(pluronic)F68。在某些实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯20。

选择表面活性剂的理想浓度，使其至少为使蛋白质的疏水表面完全饱和的浓度，尽管非完全饱和的浓度也能够提供有益效果。例如，表面张力测定法可用于评估表面活性剂与抗体的相互作用，从而测定表面活性剂完全吸附到蛋白质表面时的浓度。由于制剂中蛋白质的表面积增加，表面活性剂的量将随着蛋白质浓度的增加而增加。因此，表面活性剂的浓度可以随着蛋白质浓度的增加而增加。

在一些实施方案中，在具有20mg/ml至25mg/ml抗体的液体制剂中，表面活性剂的浓度为约0.002％至约0.02％；并且可以为约0.0075％至约0.015％。从约0.008％至约0.012％。在一些实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.004％、0.006％、0.01％、0.011％、0.012％、0.013％、0.014％、0.015％。

在一些实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.2至约2的表面活性剂:蛋白质摩尔比范围，并且可为约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、至多约2、至多约1.5、至多约1.2的表面活性剂:蛋白质摩尔比范围。此类实施方案中的表面活性剂可以是例如聚山梨醇酯。

“稳定的”制剂是可以在储存之后施用于患者的制剂。在多个方面，制剂在储存时基本上保留其物理和化学特性、以及其生物活性。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的，并在例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,VincentLee编辑，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.DrugDelivery Rev.10:29-90(1993)中进行了回顾。

稳定性可以通过多种不同方式进行定性和/或定量评估，包括评估可溶性聚集体形成(例如通过使用尺寸排阻色谱法测量浊度)和通过目视检查可见颗粒形成)；通过使用离子交换色谱法(IEC)或成像毛细管等电聚焦(icIEF)来评估电荷异质性，通过尺寸排阻色谱法(SE-HPLC)、CE-SDS或SDS-PAGE分析以比较减小的和完整的抗体，通过光阻法、微流成像、微流成像或显微镜来评估显微镜可见的颗粒的形成；评估抗体的生物活性或抗原结合功能；等。不稳定性可以涉及以下中的任何一种或多种：聚集、脱酰胺(例如，天冬酰胺脱酰胺)、氧化(例如，甲硫氨酸氧化)、异构化(例如，天冬氨酸异构化)、剪切/水解/断裂(例如铰链区断裂)、琥珀酰亚胺形成、未配对半胱氨酸、N-末端延伸、C-末端加工、糖基化差异等。

如本文所用，单克隆抗体的“生物活性”是指抗体与抗原结合的能力。它还可包括抗体与抗原结合并产生可测量的生物学应答，该生物学应答可以在体外或体内测量。

在一些实施方案中，稳定的药物制剂在约2℃至约8℃的温度下，在至少约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周或更多周以及至多3个月、6个月、9个月、12个月或更多个月后是稳定的。在某些实施方案中，稳定的药物制剂在约2℃至约8℃的温度下，在至少约1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、12个月或更多个月后是稳定的。在某些实施方案中，稳定的药物制剂在约2℃至约8℃的温度下，在至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更多个月后是稳定的。

在另一个实施方案中，制剂中的抗CD47抗体在储存后保留其生物活性的至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％。在一些实施方案中，通过抗体与CD47的结合来测量生物活性。在一些实施方案中，通过抗体与CD47在FACS CD47结合测定中的结合来测量生物活性。在一些实施方案中，通过所述抗CD47抗体的ADCP活性来测量生物活性。

在另一方面，本文提供了一种制品，该制品包括容纳如本文所公开的稳定药物制剂的容器。在一个实施方案中，所述容器是玻璃小瓶如1型玻璃小瓶、聚合物小瓶(例如具有环烯烃聚合物、环烯烃共聚物、高密度聚乙烯(HDPE)、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETG))、聚合物袋或小袋(例如低密度聚乙烯(LDPE)、乙烯醋酸乙烯酯(EVA))、或金属合金容器。

“剂量单位”是指适合作为用于待治疗的特定个体的单元剂量的物理上离散的单位。每个单位可以含有与所需药用载剂联合的预定量的活性化合物，该预定量经计算以产生期望的治疗效果。剂量单位形式的规格可以由以下项决定：(a)活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，和(b)配混这类活性化合物的领域中固有的限制。

本发明制剂的剂量单位可以为1ml、2ml、5ml、10ml、15ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml，浓度为约10mg/ml到约160mg/ml、浓度为约10mg/ml至约100mg/ml、浓度为约10mg/ml至约80mg/ml、浓度为约15mg/ml至约50mg/ml、浓度为约10mg/ml至约25mg/ml，浓度为约15mg/ml至约20mg/ml；并且浓度可以为约20mg/ml。在一些实施方案中，剂量单位为10ml。在一些实施方案中，剂量单位为20ml。在一些实施方案中，剂量单位为30ml。在一些实施方案中，剂量单位为40ml。在一些实施方案中，剂量单位为50ml。在一些实施方案中，剂量单位为60ml。

“治疗有效剂量”或“治疗剂量”是足以实现所需的临床结果(即，实现治疗功效)的量，并且可以利用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个制剂剂量单位。对于本发明而言，治疗有效剂量的抗CD47剂是通过增加靶细胞(例如，靶细胞)的吞噬作用而足以缓和、减轻、稳定、反转、预防、延缓或延迟疾病状态的进展的量；例如足以减少血液、骨髓等中的肿瘤细胞的数量的量。因此，治疗有效剂量的抗CD47剂在有效剂量下减少了靶细胞上的CD47对吞噬细胞上的SIRPα的结合，用于增加靶细胞的吞噬作用。

在一些实施方案中，制剂中的抗CD47抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，制剂中的抗CD47抗体是全长抗体。在一些实施方案中，制剂中的抗CD47抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，制剂中的抗CD47抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗体包含人IgG4恒定链。

在一些实施方案中，抗CD47抗体包含以下区域：包含序列(SEQ ID NO:1)的HCDR1区域、包含序列(SEQ ID NO:2)的HCDR2区域、包含序列(SEQ ID NO:3)的HCDR3区域、包含序列(SEQ ID NO:4)的LCDR1区域、包含序列(SEQ ID NO:5)的LCDR2区域、和包含序列(SEQ IDNO:6)的LCDR3区域。在一些实施方案中，这种抗体包含人IgG4恒定区序列。SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9提供示例性重链可变区序列；并且SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12提供示例性轻链可变区序列。

在一些实施方案中，抗体是莫洛利单抗，并且包含SEQ ID NO:8的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列、以及IgG4重链恒定区。任选地，IgG4恒定区具有氨基酸修饰(例如S228P氨基酸取代)以稳定铰链区。

使用方法

可施用组合物以用于治疗性治疗。组合物以足以显著增强靶细胞的吞噬作用的量施用于患者。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”，其可以提供整体存活率的改善。根据患者需要和耐受的剂量和频率，可以单次施用或多次施用所述组合物。治疗所需的具体剂量将取决于哺乳动物的身体状况和医疗病史，以及其他因素，诸如年龄、体重、性别、施用途径、效率等。

本文所述的制剂可用于例如治疗或减少癌症、减少治疗方案中的感染，该治疗方案包括使靶细胞与阻断CD47活性的有效剂量的制剂接触；等等。用于治疗癌症的本发明的药剂的有效剂量取决于许多不同因素而变化，这些因素包括施用的方式、目标部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物，以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人类，但是也可以治疗非人哺乳动物，例如伴侣动物(诸如狗、猫、马等)、实验室哺乳动物(诸如兔子、小鼠、大鼠等)，等等。可以滴定治疗剂量，以优化安全性和功效。

“患者”既包括人，也包括其他动物，特别是哺乳动物，包括宠物和实验动物，例如小鼠、大鼠、兔子等。因此，该方法既适用于人类疗法，也适用于兽医应用。在一个实施方案中，患者是哺乳动物，优选地是灵长类动物。在其他实施方案中，患者是人。

术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”在本文中可互换使用，是指以下细胞：其表现出自主的、不受调节的生长，使得它们表现出特征在于对细胞增殖明显失去控制的异常生长表型。本申请中的用于检测、分析或治疗的感兴趣细胞包括癌前(例如良性)细胞、恶性细胞、转移前细胞、转移细胞和非转移细胞。几乎每种组织的癌症都是已知的。短语“癌症负荷”是指受试者中的癌细胞量或癌体积。减少癌症负荷相应地是指减少受试者中的癌细胞数目或癌体积。如本文所用，术语“癌细胞”是指作为癌细胞或者来源于癌细胞(例如，癌细胞的克隆)的任何细胞。

癌症的“病理学”包括损害患者健康的所有现象。这包括但不限于：异常或不可控制的细胞生长、转移、干扰相邻细胞的正常功能、以异常水平释放细胞因子或其他分泌产物、抑制或加重炎症或免疫应答、瘤形成、癌前病变、恶性肿瘤、侵袭周围或远处的组织或器官(诸如淋巴结等)。

如本文所用，术语“癌症复发”和“肿瘤复发”及其语法变型是指在诊断癌症后赘生性细胞或癌性细胞的进一步生长。具体地讲，当在癌性组织中发生进一步的癌性细胞生长时，可能出现复发。类似地，当肿瘤细胞扩散到局部或远处的组织和器官中时，出现“肿瘤扩散”；因此，肿瘤扩散涵盖肿瘤转移。当肿瘤生长局部扩展，通过压制、破坏或阻止正常器官功能而损害所涉及组织的功能时，出现“肿瘤侵袭”。

如本文所用，术语“转移”是指癌性肿瘤在不直接与原始癌性肿瘤的器官相连的器官或身体部分中的生长。转移应理解为包括微转移，该微转移是在不直接与原始癌性肿瘤的器官相连的器官或身体部分中存在不可检测量的癌性细胞。转移还可以被定义为过程的几个步骤，诸如癌细胞从原始肿瘤部位离开，以及癌细胞向身体其他部分迁移和/或侵袭。

术语“诊断”在本文中用于指代鉴定分子或病理状态、疾病或病症，诸如鉴定乳腺癌、前列腺癌或其他类型癌症的分子亚型。

术语“预后”在本文中用于指代预测肿瘤性疾病(诸如卵巢癌)的可归因于癌症的死亡或进展(包括复发、转移性扩散和耐药性)的可能性。术语“预测”在本文中用于指基于观察、经验或科学推理来预言或估算的行为。在一个示例中，医师可以预测在手术移除原发性肿瘤和/或化疗一定时间段后患者将存活而无癌症复发的可能性。

在一个实施方案中，癌症是血液学癌症或骨髓增生异常综合征，例如非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征；多发性骨髓瘤等。在多个实施方案中，非霍奇金氏淋巴瘤选自滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、和套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，治疗MDS。在一些实施方案中，治疗AML。在其他实施方案中，癌症是恶性肿瘤、肉瘤、骨髓瘤、胶质瘤等。

如本文所用，术语“治疗”是指为了获得效果而施用药剂或执行某个规程。在完全或部分预防疾病或其症状方面，效果可以是预防性的，和/或在实现疾病和/或疾病症状的部分或完全治愈方面，效果可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”可包括治疗哺乳动物，特别是在人类中的肿瘤，并且包括：(a)预防疾病或疾病症状在受试者中发生，该受试者可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病(例如，包括可能与原发性疾病相关或由原发性疾病引起的疾病；(b)抑制疾病，即，阻止其发展；以及(c)缓解该疾病，即，引起该疾病消退。

治疗可以指癌症的治疗或改善或预防中的任何成功标记，包括任何客观或主观参数，诸如减轻；缓解；减弱症状或使患者更耐受疾病病症；减缓退化或衰退的速率；或使退化终点的衰弱程度较轻。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括医师检查的结果。因此，术语“治疗”包括施用本发明的化合物或试剂以预防或延迟、缓解、或阻止或抑制与癌症或其他疾病相关的症状或病症的发展。术语“治疗效果”是指在受试者中减少、消除或预防疾病、疾病的症状或疾病的副作用。

在某些实施方案中，“与……组合”、“联合疗法”和“组合产品”是指同时向患者施用如本文所述的第一治疗剂和化合物。当组合施用时，每种组分可以同时施用或在不同的时间点以任何顺序相继施用。因此，每种组分可以分开但在时间上足够接近地施用，以便提供期望的治疗效果。

在一些实施方案中，抗CD47抗体制剂的治疗剂量可以在约1mg/kg宿主体重至100mg/kg宿主体重的范围内，例如约10mg/kg至90mg/kg、例如约10mg/kg至60mg/kg、以及更常见的10mg/kg至50mg/kg。例如，剂量可以为约20mg/kg体重、30mg/kg体重、40mg/kg体重、45mg/kg体重、50mg/kg体重、60mg/kg体重，或者在20mg/kg至60mg/kg、20mg/kg至50mg/kg或30mg/kg至60mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每3天、每周、每两周、每三周施用一次，或者每月施用一次、每6周施用一次或每3至6个月施用一次。本发明的治疗实体通常多次施用。单次剂量之间的间隔可以是每日、每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者中的治疗实体的血液水平所指示的。剂量和频率根据多肽在患者中的半衰期而变化。

毒性可以通过标准药学规程在细胞培养物或实验动物中测定，例如，通过测定LD₅₀(50％群体致死剂量)或LD₁₀₀(100％群体致死剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养物测定和动物研究获得的数据可以用于制定对人类使用无毒性的剂量范围。本文所述蛋白质的剂量优选地在包括只有很小毒性或没有毒性的有效剂量的循环浓度范围内。剂量可以在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所利用的施用途径。确切的制剂、施用途径和剂量可以由个体医师根据患者的病症来选择。

包含本发明的制剂和使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。该试剂盒还可包含液体提取助剂；至少一种附加试剂，例如化学治疗药物、ESA等。试剂盒通常包括指示试剂盒的内容物的预期用途的标签。术语“标签”包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的，或者以其他方式伴随试剂盒的任何书面材料或记录材料。

实施例

提出以下实施例以便为本领域的普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人关于他/她们的发明的范围，也不旨在表示以下实验是所执行的全部或唯一实验。尽管已努力确保所用数值(例如，量、温度等)的准确性，但是应当说明存在一些实验误差和偏差。除非另有指示，否则份为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。

实施例1

测试了制剂的人源化5F9-G4抗体(莫洛利单抗)的稳定性。

最初检查了Hu5F9-g4在各种制剂条件(包括pH、张力调节剂和表面活性剂)下的稳定性。此研究用弱阳离子交换HPLC(WCX-HPLC)、尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析来进行，这些分析是对产品有效的指示稳定性的测定。

当引入搅拌应力时，产物变得浑浊。因此，将聚山梨醇酯20作为表面活性剂添加到Hu5F5-g4制剂中，以在应力期间稳定产物。另外的急性应力检查揭示产品不易受连续的冷冻/解冻循环、搅拌和广谱紫外光(UV-光)暴露的影响。

在冷冻(-70℃)、冷藏(5℃)和加速温度(例如25℃和37℃)下的静态储存条件下储存多达8周，检查Hu5F9-g4在不同制剂中的稳定性。大多数制剂在控温储存期间保持澄清并且不含颗粒。然而，在pH 4.0下存在离子张力调节剂(氯化钠)时，Hu5F9-g4在37℃下仅1周后变得浑浊并且显示出显著的化学降解和物理降解。WCX-HPLC分析揭示在pH 7±1下(尤其是在pH 6.0和pH 6.5下)、以及在不存在离子张力调节剂的情况下配制的产物在升温储存期间的化学不稳定性。通过SE-HPLC和SDS-PAGE评估Hu5F9-g4的物理稳定性。这些检查在产物的加速温度储存期间检测到高水平的低聚物或HMW物质，该产物用非离子张力调节剂和磷酸盐缓冲液配制，尤其是在较高pH下配制。相比之下，在-70℃储存期间，SE-HPLC分析在存在离子张力调节剂的情况下显示出更多的HMW物质。

选择具有10mM乙酸盐缓冲液，非离子张力调节剂(5％山梨糖醇)和聚山梨醇酯20(0.01％)的pH 5.0的制剂作为本研究的最佳候选制剂。这种制剂在应力期间表现出化学稳定性和物理稳定性。

所选A5S制剂的稳定性结果总结如下。这一研究中的大部分样品在冷冻/解冻、搅拌、紫外线暴露和温度应力之后保持澄清且没有颗粒。因此，对于候选制剂A5S未观察到可见的物理降解。在-70℃、5℃、25℃和37℃储存条件下，所选的候选制剂的浓度经8周保持在目标浓度之上。

在控温储存8周后，一些Hu5F9-g4制剂在稳定性研究期间显示出略高于目标的pH值。尽管如此，在控温储存期间所选的候选制剂的pH结果不偏离T＝0超过±0.2个pH单位。候选制剂的渗透压值为几乎等渗的。与含有NaCl的那些样品相比，用山梨糖醇配制的样品是略高渗的。所选的候选制剂(A5S)的渗透压为314mOsm。

测试的13种制剂中的每一种在紫外线胁迫后产生类似的WCX-HPLC数据。在这种胁迫条件期间，所选的候选制剂未观察到显著的降解。

与其他制剂相比，A5S的纯度百分比在-70℃、5℃、25℃和37℃储存8周后保持相对较高。

SE-HPLC分析揭示在搅拌、冷冻/融化和紫外线暴露后每个样品的纯度结果相似。因此，所选的候选制剂在经过这些急性应力条件之后未显示出显著的低聚或裂解。

SDS-PAGE检查表现出在-70℃、5℃、25℃和37℃储存期间所选候选物没有显著降解。在25℃和37℃储存8周的样品的SDS-PAGE结果显示，仅在无NaCl的较高pH下配制的样品中检测到HMW物质。

表1

Hu5F9-g4的初始制剂的组分

实施例2

最终制剂的评估

制剂筛选。研究了具有以下不同参数的制剂：

a.pH:4至8

b.缓冲液：10mM乙酸钠，10mM组氨酸，和10mM磷酸钠

c.稳定剂：5％山梨糖醇(非离子)和150mM NaCl(离子)

评估的制剂示于表2中。

表2：

评估的制剂组合物

*选择的表面活性剂基于搅拌研究

通过以下应力条件评估制剂：

a.热稳定性

b.冷冻/解冻(从-70℃至室温的5次循环)

c.搅拌4小时

d.环境光线暴露24小时

表面活性剂评估。在pH 6.5下，在PBS中浓度为11mg/mL的莫洛利单抗(hu5F9-g4)掺杂有0.01％w/v的聚山梨醇酯20、0.01％w/v的聚山梨醇酯80和0.10％F68普兰尼克(pluronic)。将这些溶液在室温下搅拌4小时，并且通过视觉外观和在600nm处的吸光度评估浊度(表2)，以及通过SE-HPLC评估聚集体的形成(表3)。浊度测量表明PS20和F68产生比PS80更小的浊度。然而，总体上，视觉外观结果表明经测试的所有3种表面活性剂均保护莫洛利单抗使其不形成颗粒。对于所测试的所有3种表面活性剂，SE-HPLC质量分布没有变化。

表3：浊度结果

表4：SE-HPLC结果

进行表面张力测定以评估聚山梨醇酯20与以下制剂的相互作用：20mg/mL莫洛利单抗，10mM乙酸盐，5％w/v的山梨糖醇，pH 5.0。表面张力曲线在图1中示出。聚山梨醇酯20在大约0.01mg/mL(0.001％)时开始与蛋白质相互作用。溶液中的蛋白质用约0.1mg/mL至0.2mg/mL(0.01％至0.02％)的聚山梨醇酯20完全饱和。

含有10mM乙酸钠，150mM NaCl，pH 4.0的制剂1导致快速降解。这种制剂在任何应力条件研究中未进行进一步评估。

冷冻/解冻、搅拌和环境光线暴露研究的结果总结在下表中。

表5

热稳定性。将制剂置于-70℃、5℃、25℃和37℃下8周以研究稳定性。通过蛋白质浓度、pH、视觉外观、SE-HPLC、WCX-HPLC和还原性及非还原性SDS-PAGE来评估制剂。

在8周后，除制剂1之外的所有制剂在所有测试温度下都是澄清的并且无颗粒。在37℃下1周后，制剂1是浑浊的，并且中断研究。

如表6所示，蛋白质浓度在8周后保持不变。

表6：蛋白质浓度结果

*在1周的时间点后不再分析此样品。

在研究结束时测量pH。通常，pH高于初始时间点但在测量的误差之内。

表7：pH结果

*在1周的时间点后不再分析此样品。

测定在各种储存温度下储存多达8周后所有制剂的WCX-HPLC主峰和前峰图谱，如图2和图3所示。在-70℃和5℃的储存温度下，多达8周内没有变化。在25℃和37℃下，具有最小的主峰减小量的制剂是在pH 5和pH 6下的制剂。在pH 4下，山梨糖醇制剂比NaCl制剂更稳定，而在pH6.5下，山梨糖醇制剂比NaCl制剂更不稳定。随着主峰减小，前峰/酸性物质增加，在pH和稳定剂方面具有相似的稳定性趋势。

在各种储存温度下储存多达8周后所有制剂的SE-HPLC单体和聚集体/前峰图谱分别如图4和图5所示。在5℃和25℃的储存温度下，多达8周内没有显著变化。在-70℃和37℃下，单体减少，同时聚集体增加。在-70℃下，含有NaCl或PBS的pH 6至pH 8的制剂导致较高的聚集体形成。在37℃下，pH 6-8的含有磷酸盐缓冲液和山梨糖醇的制剂具有较高的聚集体形成速率。

稳定制剂参数范围的结果汇总在表8中。

表8：

稳定的制剂赋形剂参数范围

所选制剂的长期稳定性。基于开发研究，选择用于长期研究的制剂为20mg/mL莫洛利单抗，10mM乙酸盐、5％w/v山梨糖醇、0.01％聚山梨醇酯20，pH 5.0。此制剂储存在带有氟聚合物涂覆的丁基塞子的1型玻璃小瓶中，并且如通过SE-HPLC、icIEF、还原性和非还原性CE-SDS、以及结合所测量的，其在5℃下至少3年是稳定的，如下表所详述。

表9：20mg/mL莫洛利单抗，10mM乙酸盐，5％w/v山梨糖醇、0.01％聚山梨醇酯20， pH5.0，储存在5℃下的稳定性

FVP＝不含可见颗粒

实施例3

莫洛利单抗的粘度测量

莫洛利单抗的粘度作为浓度的函数来测量。将蛋白质浓缩至超过120mg/mL，仍保留在溶液中，并且在视觉上是澄清的。蛋白质粘度低，在160mg/mL浓度下达到约20cP。结果在图6中描绘。

实施例4

莫洛利单抗制剂的浊度评估

用具有不同浓度的聚山梨醇酯20的莫洛利单抗进行振荡研究。当制剂中的聚山梨醇酯20为零时，溶液表现出增加的浊度和通过SEC-HPLC测得的聚集体形成、以及显微镜可见的颗粒。具有0.005％和更高浓度的聚山梨醇酯20，制剂质量特性没有变化。此结果与表面张力测定法数据关联良好。

实施例5

利用莫洛利单抗的赋形剂筛选

用莫洛利单抗研究各种稳定赋形剂，并且通过内荧光评估熔融温度。如图7所示的熔融温度和稳定性数据表明经测试的所有赋形剂均使莫洛利单抗稳定。熔融温度表明，莫洛利单抗在糖类赋形剂的存在下最稳定。

序列表

<110> 里兰斯坦福初级大学理事会

<120> 抗体制剂

<130> STAN-1737WO

<150> 63/005,755

<151> 2020-04-06

<160> 12

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 1

Asn Tyr Asn Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 2

Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

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Asp

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<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 3

Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr

1 5

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<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly

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<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

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<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 6

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体hu5F9-vh1

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

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<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体hu5F9-vh2

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

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Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

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Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体hu5F9-vh3

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

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Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

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Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Val Thr Val Ser Ser

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<210> 10

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体hu5F9-vl1

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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser

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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Phe Gln Gly

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Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体hu5F9-vl2

<400> 11

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体hu5F9-vl3

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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser

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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

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Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims (25)

1.一种药物稳定的水性制剂，其包含10mg/ml至100mg/ml的抗CD47抗体；

和药学上可接受的赋形剂，所述药学上可接受的赋形剂包含浓度为5mM至20mM的缓冲液；至少一种稳定剂、以及表面活性剂，其中所述制剂的pH为约pH 4至6.5。

2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述缓冲液以10mM至15mM的浓度存在。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的制剂，其中所述制剂中的所述缓冲液是乙酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。

4.根据权利要求3所述的制剂，其中所述缓冲液是乙酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的制剂，其中所述pH为pH 4至pH 6.5。

6.根据权利要求5所述的制剂，其中所述pH为pH 4.7至pH 5.3。

7.根据权利要求5所述的制剂，其中所述pH为pH 4.9至pH 5.1。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的制剂，其中所述稳定剂是浓度为2.5％至10％的山梨糖醇。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的制剂，其中所述稳定剂是浓度为2.5％至10％的蔗糖。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的制剂，其中所述稳定剂是浓度为2％至12％的海藻糖。

11.根据权利要求1至7中任一项所述的制剂，其中所述稳定剂是浓度为100mM至200mM的NaCl。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的制剂，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或普兰尼克F68。

13.根据权利要求12所述的制剂，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯20，所述表面活性剂的浓度为约0.005％至约0.05％。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的制剂，其中所述制剂在约2℃至约8℃的温度下至少12个月内是稳定的。

15.根据权利要求1至13中任一项所述的制剂，其中所述制剂在约2℃至约8℃的温度下至少16周内是稳定的。

16.根据权利要求15所述的制剂，其中所述制剂中的所述抗CD47抗体在储存之后保留其生物活性的至少50％。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的制剂，其中所述制剂中的所述抗CD47抗体是全长抗体。

18.根据权利要求17所述的制剂，其中所述抗体包含人IgG4恒定区序列。

19.根据权利要求17或18所述的制剂，其中所述抗体是人源化抗体，所述人源化抗体包含以下区域：包含序列(SEQ ID NO:1)的HCDR1区域、包含序列(SEQ ID NO:2)的HCDR2区域、包含序列(SEQ ID NO:3)的HCDR3区域、包含序列(SEQ ID NO:4)的LCDR1区域、包含序列(SEQ ID NO:5)的LCDR2区域、和包含序列(SEQ ID NO:6)的LCDR3区域。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的制剂，其中所述抗体是莫洛利单抗。

21.一种药学上可接受的稳定液体制剂，其包含10mg/ml至20mg/ml的莫洛利单抗；10mM的乙酸盐缓冲液；5％w/v的山梨糖醇；0.01％至0.04％的聚山梨醇酯20，pH为4.5–5.5。

22.一种药学上可接受的稳定液体制剂，其包含10mg/ml至20mg/ml的莫洛利单抗；10mM的乙酸盐缓冲液；9％w/v的蔗糖；0.01％至0.04％的聚山梨醇酯20，pH为4.5–5.5。

23.一种药学上可接受的稳定液体制剂，其包含10mg/ml至20mg/ml的莫洛利单抗；10mM的乙酸盐缓冲液；9％w/v的海藻糖；0.01％至0.04％的聚山梨醇酯20，pH为4.5–5.5。

24.一种制品，所述制品包含单位剂量的根据权利要求1至23中任一项所述的制剂。

25.一种治疗对其有需要的个体的方法，所述方法通过施用有效剂量的根据权利要求1至23中任一项所述的抗体制剂来治疗。

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