JPWO2005094846A1 - プリオン病治療剤およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

プリオン病の治療に有効で、かつ安全性の高い剤を提供する。本発明は、間葉系細胞を有効成分として含むプリオン病治療剤およびその製造方法に関する。本発明はまた、異常プリオン増殖阻害活性を付与された間葉系細胞、特に、抗プリオン抗体遺伝子が導入された間葉系細胞を有効成分として含むプリオン病治療剤およびその製造方法に関する。本発明の治療剤は、プリオン病の進行を止めるだけでなく、当該疾患によって喪失した神経機能を回復させることができる。

Description

本発明は、間葉系細胞、特に異常プリオン増殖阻害活性を有する間葉系細胞を有効成分とするプリオン病治療剤、およびその製造方法に関する。本発明はまた、異常プリオン増殖阻害活性を有する遺伝子が導入された細胞、特に間葉系細胞、およびその製造方法に関する。本発明はさらに、前記治療剤および／もしくは細胞、または抗プリオン抗体を用いたプリオン病治療法に関する。本発明はさらにまた、間葉系細胞を用いたプリオン病の病変部位に物質を送達するための剤にも関する。

現在、異常プリオンタンパク質（ＰｒＰ^Ｓｃ）の蓄積によって引き起こされるプリオン病に注目が集まっている。プリオン病は様々な動物種で見られ、ヒトのクールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、ヒツジおよびヤギのスクレイピー、ミンク伝染性脳症、シカ慢性消耗性疾患、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ネコ海綿状脳症などが知られている。いずれも発症までの潜伏期間が長く、神経細胞の脱落を伴う脳の萎縮が見られ、種々の神経症状を呈するという共通の特徴を持つ。

プリオンタンパク質は正常な細胞の表面に普通に存在するタンパク質である。正常なプリオンタンパク質（ＰｒＰ^ｃ）とＰｒＰ^Ｓｃは、同一のアミノ酸配列を持つがその立体構造が異なっており、その結果両者の生物学的、物理学的特性は全く異なったものとなっている。現在のところ、ＰｒＰ^ｃがＰｒＰ^Ｓｃとの接触によりＰｒＰ^Ｓｃに変化し、その結果ＰｒＰ^Ｓｃが増殖し、神経細胞を変性させることでプリオン病が発症するという仮説が有力であるが、正確なメカニズムは未だ不明である。プリオン病は、ＰｒＰ^Ｓｃの摂取または投与により種間バリアを超えて伝染する特性を有しており、中でもＢＳＥのヒトへの感染が近年大きな問題となっている。

ＢＳＥは、ＰｒＰ^Ｓｃを含むウシの特定部位の摂取などにより人体へ感染し、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）を発症する。ｖＣＪＤは精神症状と高次機能障害（記憶力低下、計算力低下、失見当識、行動異常、性格変化、無関心、不安、不眠、失認、幻覚など）で初発し、数ヶ月で痴呆、妄想、失行が急速に進行、さらに起立、歩行が不能になり、３〜７ヶ月で無動性無言状態に陥り、１〜２年で全身衰弱、呼吸麻痺、肺炎などで死亡する病気である。ＢＳＥ感染によるｖＣＪＤは、２００５年３月までに全世界で１５４例が報告されており、２００５年２月４日には日本人初の感染者が報告されるなど、ｖＣＪＤの影響は徐々に広がりを見せている。推移予測によると近未来には数千名から数万名の患者が発症すると推定されているため、日本においても将来的には少なくとも年間数万名の患者が予想される。

かかる状況を受けて、プリオン病の治療に関して様々な研究がなされているが、未だ有効な治療法が確立されていないのが現状である。
初期の研究においては、既知の化合物の中からプリオン病に有効なものを検索する試みがなされ、このうちアンホテリシンＢ（Xi YG et al. 1992. Nature 356(6370):598-601）、コンゴレッド（Caughey B et al. 1992. J Neurochem 59(2):768-71）、アントラサイクリン（Tagliavini F et al. 1997. Science 276(5315):1119-22）、キナクリン、チロロン、クロロキン、Ｅ−６４ｄなどのシステインプロテアーゼ阻害剤（Doh-Ura K et al. 2000. J Virol 74(10):4894-7）、プロマジン、クロルプロマジン、アセプロマジンなどのフェノチアジン誘導体（Korth C et al. 2001. Proc Natl Acad Sci U S A 98(17):9836-41）、ポルフィリンやフタロシアニンなどのテトラピロール類（Caughey WS et al. 1998. Proc Natl Acad Sci U S A 95(21):12117-22）、ペントサンポリサルフェート、リアクティブ・グリーンおよびリアクティブ・レッドなどのリアクティブ・ダイ、キニーネ、８−ハイドロキシキノリン−２−カルボクスアルデヒド８−キノリルヒドラゾン、２−ピリヂンカルボックスアルデヒド２−キノリルヒドラゾンおよび２，２’−バイキノリンなどのキニーネ類（特開２００３−４０７７８号公報）などが、培養細胞や動物実験の結果から有効である可能性が示唆されていたが、その有用性は依然として確立されていない。

特許文献１には、ＧＡＰＤＨの酸性アイソフォームを減少させ、および／または塩基性アイソフォームを増加させることで、ＰｒＰ^ｃ、ひいてはＰｒＰ^Ｓｃの発現を抑制することができることに着目し、ＧＡＰＤＨのアンチセンス核酸またはデプレニルの投与によりプリオン病の予防および治療が可能であることが記載されている。しかし、かかる方法では、ＰｒＰ^Ｓｃの発生は減少するかもしれないが、同時にＰｒＰ^ｃの発現も抑制され、ＰｒＰ^ｃの本来の機能の達成に支障が出る恐れがある。

非特許文献１には、ＰｒＰ^ｃの変異体がドミナントネガティブ効果によりＰｒＰ^Ｓｃの形成をin vitroで阻害したことが記載されており、プリオン病治療への有効性が示唆されているが、in vivoでの有効性はまだ確認されていない。
また、抗プリオン抗体がin vitroでＰｒＰ^Ｓｃの形成を阻害し、in vivoにおいてもスクレイピーのモデルマウスにおいてＰｒＰ^Ｓｃ低減効果ならびに延命効果を有することが最近報告され（非特許文献２）、プリオン病の抗体療法が注目を集めたが、その後、抗プリオン抗体の投与により海馬および小脳のニューロンにアポトーシスが生じたことが報告されるなど（非特許文献３）、その有用性は依然不透明な状態にある。

以上の通り、精力的な研究が世界的に行われているにもかかわらず、現在のところプリオン病に有効な治療法は未だ存在せず、新たな治療剤や治療法の登場が強く求められていた。
特開２００４−８１０３４ 国際公開第０３／０３８０７４号パンフレット Kaneko K et al. 1997. Proc Natl Acad Sci U S A. 94(19):10069-74 White AR et al. 2003. Nature 422(6927):80-3 Solforosi L et al. 2004. Science 303(5663):1514-6

本発明は、プリオン病の治療に有効で、安全性の高い剤の提供を目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、抗プリオン抗体をプリオン病モデルマウスに持続投与することにより、顕著な治療効果が得られることを見出した。さらに、上記抗体をコードする遺伝子を骨髄幹細胞に導入し、該遺伝子を発現させることに成功するとともに、骨髄幹細胞が患部に生着することを見出し、本発明を完成させた。

即ち、本発明は、間葉系細胞を有効成分として含む、プリオン病の治療のための剤に関する。
本発明はまた、間葉系細胞が、異常プリオン増殖阻害活性を有する、上記剤に関する。
本発明はさらに、間葉系細胞が、異常プリオン増殖阻害活性を有する抗プリオン抗体の遺伝子が導入されたものである、上記剤に関する。
本発明はさらにまた、抗体遺伝子が、抗体重鎖遺伝子と抗体軽鎖遺伝子とからなり、抗体重鎖遺伝子が、
（１ａ）配列番号１、３、５、３０、３２および３４からなる群から選択される配列を含む核酸、
（１ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（１ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
（１ｃ）前記（１ａ）または（１ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
（１ｄ）前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択され、抗体軽鎖遺伝子が、
（２ａ）配列番号２、４、６、３１、３３および３５からなる群から選択される配列を含む核酸、
（２ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（２ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
（２ｃ）前記（２ａ）または（２ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
（２ｄ）前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択され、前記抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子を発現させて得た抗体が、異常プリオン増殖阻害活性を有する、上記剤に関する。

また、本発明は、静脈内投与用である、上記剤に関する。
さらに、本発明は、間葉系細胞が骨髄細胞、臍帯血細胞および末梢血細胞からなる群から選択される、上記剤に関する。
さらにまた、本発明は、抗体重鎖遺伝子と抗体軽鎖遺伝子とからなる抗プリオン抗体遺伝子であって、抗体重鎖遺伝子が、
（１ａ）配列番号１、３、５、３０、３２および３４からなる群から選択される配列を含む核酸、
（１ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（１ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
（１ｃ）前記（１ａ）または（１ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
（１ｄ）前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択され、抗体軽鎖遺伝子が、
（２ａ）配列番号２、４、６、３１、３３および３５からなる群から選択される配列を含む核酸、
（２ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（２ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
（２ｃ）前記（２ａ）または（２ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
（２ｄ）前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択され、前記抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子を発現させて得た抗体が、異常プリオン増殖阻害活性を有する、前記抗プリオン抗体遺伝子に関する。

本発明はまた、上記抗プリオン抗体遺伝子を含むベクターに関する。
本発明はさらに、ＲＧＤ配列を含むアデノウイルスベクターである、上記ベクターに関する。
本発明はさらにまた、上記抗プリオン抗体遺伝子によりコードされる抗体の可変領域と、マウス以外の動物の抗体の定常領域とを含む、抗プリオンキメラ抗体に関する。
また、本発明は、（１ａ）配列番号３０、３２および３４からなる群から選択される配列を含む核酸、
（１ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（１ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
（１ｃ）前記（１ａ）または（１ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
（１ｄ）前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される抗体重鎖遺伝子、および、
（２ａ）配列番号３１、３３および３５からなる群から選択される配列を含む核酸、
（２ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（２ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
（２ｃ）前記（２ａ）または（２ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
（２ｄ）前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される抗体軽鎖遺伝子によりコードされる、上記抗プリオンキメラ抗体に関する。

さらに、本発明は、上記抗プリオンキメラ抗体をコードする核酸に関する。
本発明はまた、細胞に、異常プリオン増殖阻害活性を付与する遺伝子を導入することを含む、異常プリオン増殖阻害活性を有する細胞の作製方法に関する。
本発明はさらに、異常プリオン増殖阻害活性を付与する遺伝子が、抗プリオン抗体遺伝子である、上記方法に関する。
本発明はさらにまた、細胞に、上記ベクターを介して、上記遺伝子を導入することを含む、異常プリオン増殖阻害活性を有する細胞の作製方法に関する。
また、本発明は、細胞が、間葉系細胞である、上記方法に関する。
さらに、本発明は、上記方法で作製された、異常プリオン増殖阻害活性を有する細胞に関する。
さらにまた、本発明は、上記方法を含む、プリオン病の治療のための剤の製造方法に関する。

本発明はまた、抗プリオン抗体を放出する、プリオン病治療用持続製剤に関する。
本発明はさらに、抗プリオン抗体が、上記抗プリオン抗体遺伝子によりコードされる抗体、および／または、上記の抗プリオンキメラ抗体である、上記製剤に関する。
本発明はさらにまた、浸透圧ポンプの形態である、上記製剤に関する。
また、本発明は、抗プリオン抗体分泌細胞を含む、上記製剤に関する。
さらに、本発明は、抗プリオン抗体分泌細胞が、上記方法で作製された、異常プリオン増殖阻害活性を有する細胞である、上記製剤に関する。
さらにまた、本発明は、上記の剤、ベクター、抗プリオンキメラ抗体および製剤からなる群から選択される治療剤の治療有効量を投与することを含む、プリオン病を治療する方法に関する。
本発明はまた、抗プリオン抗体を持続放出することを含む、プリオン病を治療する方法に関する。
本発明はさらに、上記持続製剤および／またはベクターを投与することを含む、上記方法に関する。
本発明はまた、抗プリオン抗体遺伝子を対象の細胞に導入することを含む、上記方法に関する。
本発明はさらにまた、間葉系細胞の、プリオン病の病変部位に物質を送達するための剤の製造への使用に関する。
また、本発明は、間葉系細胞を含む、プリオン病の病変部位に物質を送達するための剤に関する。

本発明の治療剤の投与または治療法により、これまで不可能と考えられてきたプリオン病の治療が可能となるので、医学および獣医学領域において多大な貢献が期待できる。しかも、本発明の剤に用いる間葉系細胞（間葉系幹細胞）は、骨髄、臍帯血または末梢血から作製することができるので、ＥＳ細胞を用いる場合のように倫理的な問題が生じることもなく、また、自己由来の細胞から容易に作製することができるので、投与の際も拒絶反応などの好ましくない生体反応を惹起するおそれが少ない。さらに、従来の治療剤が主としてＰｒＰ^Ｓｃ増殖抑制作用を有するのみで、症状の進行を遅延させることができるにすぎないところ、本願発明の剤は、かかる作用に加え、患部へ遊走した間葉系細胞がそこに定着し、自らが神経細胞へ分化して変性した神経組織を再建するので、症状の進行を遅らせるのみならず、症状を改善するという、従来の治療剤では到底不可能であった優れた効果を奏することができる。また、本発明の送達剤は、プリオン病の病変部位に治療剤や標識物質などの所望の物質を送達することができるので、プリオン病の治療のみならず、その研究や診断に大いに寄与するものである。本発明の上記効果は、例えば、本発明の治療剤をプリオン病モデルマウスに投与することにより容易に確認することができる。

抗体遺伝子とプライマーとの位置関係を示した模式図である。 抗体遺伝子の発現ベクターへのクローニング手順を示した模式図である。 抗体遺伝子をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞による抗体の発現をウェスタンブロット法により評価した結果を示した図である。 抗体遺伝子をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞により産生された抗体の、プリオンタンパク質への結合能を表したグラフである。 抗体遺伝子を含むコスミドの模式図である。 ＣＤ４５（＋）細胞およびＣＤ４５（−）細胞について行ったＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。

ＣＤ４５（＋）細胞およびＣＤ４５（−）細胞の形態学的な違いを示した写真図である。 ４３Ｃ５抗体の遺伝子を含むアデノウイルスベクターＡｘ４３Ｃ５ＨおよびＡｘ４３Ｃ５Ｌを同時感染させたＩＣＲマウスのＭＳＣによる抗体遺伝子の発現をウェスタンブロット法により評価した結果を示した図である。レーン１はコントロール、レーン２は抗体遺伝子導入細胞である。 ７２−５抗体の遺伝子を含む発現ベクター（ｐＣＡｃｃ／７２−５ＨおよびｐＣＡｃｃ／７２−５Ｌ）、または４４Ｂ１抗体の遺伝子を含む発現ベクター（ｐＣＡｃｃ／４４Ｂ１ＨおよびｐＣＡｃｃ／４４Ｂ１Ｌ）を導入したヒトおよびマウスＭＳＣにより産生された抗体のアイソタイプを示す写真図である。 ＬａｃＺ遺伝子を導入したＩＣＲ／ＭＳＣをＸ−ｇａｌ染色した結果を示した写真図である。 ＤｓＲｅｄ遺伝子を導入したヒトＭＳＣまたはＩＣＲ／ＭＳＣについて行ったＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。

７２−５抗体または４４Ｂ１抗体を、所定期間プリオン病モデルマウスに脳内投与した後の脳組織の状態を示す写真図である。陰性対照としてＫＬＨを用いた。 ７２−５抗体または４４Ｂ１抗体を、所定期間プリオン病モデルマウスに脳内投与した後のＰｒＰ^Ｓｃの蓄積量を、陰性対照であるＫＬＨ投与対象と比較した図である。図中の数値は、ＫＬＨを１．００とした場合の各抗体投与対象のＰｒＰ^Ｓｃの蓄積量比を示す。 プリオン病モデルマウス（感染マウス）または正常ＩＣＲマウス（非感染マウス）における、ＬａｃＺ発現ＭＳＣの移植後の状態を示した写真図である。

本明細書中に別記のない限り、本発明に関して用いられる科学的および技術的用語は、当業者に通常理解されている意味を有するものとする。一般的に、本明細書中に記載された細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子およびタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して用いられる用語、およびその技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものとする。一般的に、別記のない限り、本発明の方法および技術は、当該技術分野においてよく知られた慣用の方法に従って、本明細書中で引用され、議論されている種々の一般的な、およびより専門的な参考文献に記載されたとおりに行われる。かかる文献としては、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) および Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, および2000の補遺); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology - 4^th Ed., Wiley & Sons (1999); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); および Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)などが挙げられる。

酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従い、当該技術分野において通常なされているとおりに、または本明細書に記載のとおりに行うものとする。本明細書中に記載された分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および薬化学に関して用いられる用語、ならびにその実験手順および技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものである。標準的な技術を、化学合成、化学分析、薬剤の製造、製剤および送達、ならびに対象の処置に用いるものとする。
なお、本発明における用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、プリオン病の処置が企図される場合には、典型的には、該疾患に罹患している対象または実験的に罹患させた対象、例えばマウス、ラット、スナネズミ、モルモットなどの齧歯類、ネコ、ピューマ、トラなどのネコ科動物、シカ、オオシカなどのシカ科動物、ミンク、ヒツジ、ヤギ、ウシ、サル、ヒトなどである。

本発明においては、間葉系細胞を有効成分として含む、プリオン病治療のための剤が提供される。
本発明において、プリオン病とは、ＰｒＰ^Ｓｃを病原とするあらゆる疾患を含む。かかる疾患としては、例えば、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、ヒツジおよびヤギのスクレイピー、ミンク伝染性脳症、シカ慢性消耗性疾患、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ネコ海綿状脳症などが含まれるが、これらに限られない。上記疾患は、先天性または後天性（伝染性のものを含む）であってもよく、例えば、ＢＳＥ感染牛の摂食により発症すると考えられる変異型ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）や、ヒト乾燥硬膜などの使用による医原性ＣＪＤも含まれる。また、本発明におけるプリオン病は、現在まだ知られていない、ＰｒＰ^Ｓｃを病原とする任意の疾患を包含する。

本発明における間葉系細胞とは、好ましくは骨髄細胞（骨髄細胞の単画球分画成分）、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞、間葉系幹細胞、またはこれら細胞に由来する細胞等を指す。また、本発明の間葉系細胞には、例えば、間葉系に関連する細胞、中胚葉幹細胞等が含まれる。なお、本発明において「間葉系細胞」として記述された細胞が、将来的に間葉系細胞以外の細胞として分類される場合であっても、本発明においては当該細胞を好適に利用することができる。

骨髄中には幹細胞として、造血幹細胞と「間葉系幹細胞（ＭＳＣ：Mesenchymal Stem Cell）」とがある。ここで「幹細胞」とは、一般に、生体を構成する細胞の生理的な増殖・分化などの過程において、自己増殖能と、特定の機能を持つ細胞に分化する能力とをあわせ有する未分化細胞のことである。造血幹細胞は、赤血球、白血球、あるいは血小板に分化する幹細胞である。間葉系幹細胞は、神経幹細胞を経て神経に分化する場合、神経幹細胞を経ないで直接的に神経に分化する場合、ストローマ細胞を経て神経に分化する場合、内臓に分化する場合、血管系に分化する場合、または骨、軟骨、脂肪、あるいは筋肉に分化する場合があることが知られている。

本発明では、主として間葉系幹細胞を利用するが、造血幹細胞や、体内の他の幹細胞（前駆細胞）を利用できる可能性があることにも言及しておく。間葉系幹細胞は骨髄から採取された骨髄細胞などから分離して得られる。なお、間葉系幹細胞を分離していない骨髄細胞も、有効性は若干劣るものの、間葉系幹細胞と同じように治療に用いることができる。
また、間葉系幹細胞のような細胞が、末梢血中から調製できる可能性も考えられる。実際、本発明者らは、末梢血のなかに混じっている細胞から培養してきた細胞を、神経幹細胞や神経系細胞（神経細胞、グリア細胞）のマーカーを出現する細胞へ誘導できることに成功した。一方、本発明者らは既に、骨髄液または臍帯血から分離される単核細胞分画から調製した中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）、またはＥＳ細胞を、基礎的培養液で培養すると、該中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）または該ＥＳ細胞が神経幹細胞、神経細胞またはグリア細胞へ分化誘導することを見出している（特許文献２参照）。したがって、末梢血中の細胞を培養することにより、間葉系幹細胞と同等の機能を有する細胞を調製し、本発明に利用することも可能である。

本発明において、中胚葉幹細胞とは、発生学的に中胚葉と分類される組織を構成している細胞を指し、血液細胞も含まれる。また、中胚葉幹細胞とは、自己と同じ能力を持った細胞をコピー（分裂、増殖）することができ、中胚葉の組織を構成している全ての細胞へ分化し得る能力を持った細胞を指す。中胚葉幹細胞は、例えば、ＳＨ２（＋）、ＳＨ３（＋）、ＳＨ４（＋）、ＣＤ２９（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ１１ｂ（−）、ＣＤ１４（−）、ＣＤ３４（−）、ＣＤ４５（−）の特徴を有する細胞であるが、これらマーカーに特に制限されない。また所謂、間葉系に関連する幹細胞も、本発明の中胚葉幹細胞に含まれる。

上記の間葉系に関連する細胞とは、間葉系幹細胞、間葉系細胞、間葉系細胞の前駆細胞、間葉系細胞から由来する細胞のことを意味する。
間葉系幹細胞とは、例えば、骨髄、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、血液、臍帯血、更には、種々の組織の初期培養物から得ることができる幹細胞のことである。また末梢血中の細胞を培養して得ることができる間葉系幹細胞と同等の機能を有する細胞も本発明の間葉系幹細胞に含まれる。
本発明において好ましい間葉系細胞としては、骨髄細胞、骨髄幹細胞を好適に示すことができる。その他、本発明の細胞の好ましい例として、臍帯血細胞、末梢血細胞、胎児肝細胞等を挙げることができる。

本発明における骨髄細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、胎児肝細胞の好ましい態様としては、骨髄、臍帯血、末梢血、または胎児肝より分離して得た細胞の一分画であって、神経系細胞へ分化し得る細胞を含む細胞分画を挙げることができる。
他の一つの態様において、該細胞分画は、ＳＨ２（＋）、ＳＨ３（＋）、ＳＨ４（＋）、ＣＤ２９（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ１４（−）、ＣＤ３４（−）、ＣＤ４５（−）の特徴を有する中胚葉幹細胞を含む細胞分画である。
本発明において、上記以外の細胞分画の例としては、Ｌｉｎ（−）、Ｓｃａ−１（＋）、ＣＤ１０（＋）、ＣＤ１１Ｄ（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ４５（＋）、ＣＤ７１（＋）、ＣＤ９０（＋）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤＷ１２３（＋）、ＣＤ１２７（＋）、ＣＤ１６４（＋）、フィブロネクチン（＋）、ＡＬＰＨ（＋）、コラゲナーゼ−１（＋）の特徴を有する間質細胞を含む細胞分画、あるいはＡＣ１３３（＋）の特徴を有する細胞を含む細胞分画を挙げることができる。
また、本発明においては、上記細胞分画に含まれる細胞は、神経系細胞へ分化し得る細胞であることが好ましい。

本発明における細胞分画には、骨髄細胞より分離して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化し得ることを特徴とする細胞が含まれる。その他の態様として、例えば臍帯血細胞、末梢血細胞、または胎児肝細胞より分離して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化し得ることを特徴とする細胞が含まれる。その他の態様として、例えば活性物質や薬剤を用いて末梢血中に放出させられた骨髄中の間葉系幹細胞であって、神経系細胞へ分化し得ることを特徴とする細胞が含まれる。本発明の細胞分画に含まれる細胞の神経系細胞への分化は、いわゆる血液系細胞の神経系細胞への形質転換により生じるのか、それとも骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞などの中に存在する神経細胞に分化できる未熟な細胞の分化によるものであるかは明確ではないが、神経系細胞へ分化する細胞は、主として、幹細胞、即ち、自己増殖能と多分化能を有する細胞であると考えられる。また、神経系細胞へ分化する細胞は、ある程度他の胚葉へ分化している幹細胞であり得る。

本発明の細胞分画に含まれる細胞は、栄養因子によって増殖することは要せず（栄養因子によって増殖することは可能である）、神経自己移植技術の開発という点では簡便で、かつ現実性の高いものであり、その医療産業上の有益性は多大なものであるといえる。本発明における骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞（細胞分画）は、一般的には、脊椎動物に由来する。好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ミンク、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、シカ、ブタ、イヌ、サル、ヒトなど）由来であるが、特に制限されない。

本発明における細胞分画は、例えば、脊椎動物から採取した骨髄細胞、臍帯血細胞を、２０００ｒｐｍで比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行い、遠心後、比重１．０７〜１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味し、通常１０〜３０分間程度である。回収する細胞分画の比重は、好ましくは１．０７〜１．０８ｇ／ｍｌの範囲、例えば、１．０７７ｇ／ｍｌである。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるがこれらに制限されない。また、脊椎動物から採取した臍帯血細胞を上記と同様に調製し、細胞分画として利用することもできる。

具体例を示せば、まず、脊椎動物より採取した骨髄液（５〜１０μｌ）を溶液（ＩＬ−１５を２ｍｌ＋Ｆｉｃｏｌを３ｍｌ）に混合し、遠心（２０００ｒｐｍで１５分間）し、単核細胞分画（約１ｍｌ）を抽出する。この単核細胞分画を細胞の洗浄のために培養溶液（ＮＰＢＭ ２ｍｌ）に混合して、再度、遠心（２０００ｒｐｍで１５分間）する。次いで、上澄みを除去した後、沈降した細胞を回収する。本発明の細胞分画の採取源としては、大腿骨以外にも、胸骨や、骨盤を形成している腸骨から採取することもできる。これらの骨以外でも大きい骨であれば採取可能である。また、骨髄バンクに保存してある骨髄液や臍帯血から採取することも可能である。臍帯血細胞を利用する場合には、骨髄バンクに保存してある臍帯血から採取することも可能である。

本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞より単離・精製して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化し得る中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を含む細胞分画である。中胚葉幹細胞を含む細胞分画は、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記ＳＨ２等の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。

また、神経系細胞へ分化し得る中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を含む細胞分画は、脊椎動物から採取した骨髄細胞、臍帯血細胞を、９００ｇで比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行い、遠心後、比重１．０７〜１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味し、通常、１０〜３０分間程度である。回収する細胞分画の比重は、細胞の由来する動物の種類（例えば、ヒト、ラット、マウス）により変動し得る。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるが、これらに制限されない。

具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した骨髄液（２５ｍｌ）または臍帯血を同量のＰＢＳ溶液に混合し、遠心（９００ｇで１０分間）し、沈降細胞をＰＢＳに混合して回収（細胞密度は４×１０^７細胞／ｍｌ程度）することにより、血液成分を除去する。その後、そのうち５ｍｌをＰｅｒｃｏｌ液（１．０７３ｇ／ｍｌ）と混合し、遠心（９００ｇで３０分間）し、単核細胞分画を抽出する。細胞の洗浄のために、抽出した単核細胞分画を培養溶液（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％anti-biotic-antimycotic solution）に混合し、遠心（２０００ｒｐｍで１５分間）する。次いで、遠心後の上澄みを除去し、沈降した細胞を回収し、培養する（３７℃、５％ＣＯ_２ in air）。

本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞、臍帯血細胞より分離して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化しうる間質細胞を含む細胞分画である。間質細胞は、例えば、Ｌｉｎ（−）、Ｓｃａ−１（＋）、ＣＤ１０（＋）、ＣＤ１１Ｄ（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ４５（＋）、ＣＤ７１（＋）、ＣＤ９０（＋）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤＷ１２３（＋）、ＣＤ１２７（＋）、ＣＤ１６４（＋）、フィブロネクチン（＋）、ＡＬＰＨ（＋）、コラーゲナーゼ−１（＋）の特徴を有する細胞である。間質細胞を含む細胞分画は、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記Ｌｉｎ等の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。

また、脊椎動物から採取した骨髄細胞、臍帯血細胞を、８００ｇで比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行い、遠心後、比重１．０７〜１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味し、通常、１０〜３０分間程度である。回収する細胞分画の比重は、好ましくは１．０７〜１．０８ｇ／ｍｌの範囲、例えば、１．０７７ｇ／ｍｌである。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏl液を用いることができるがこれらに制限されない。

具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した骨髄液または臍帯血を同量の溶液（ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ＋０．６％クエン酸ナトリウム＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）溶液に混合し、そのうちの５ｍｌをＦｉｃｏｌ＋Ｐａｑｕｅ液（１．０７７ｇ／ｍｌ）と混合し、遠心（８００ｇで２０分間）し、単核細胞分画を抽出する。この単核細胞分画を細胞の洗浄のために培養溶液（αＭＥＭ、１２．５％ＦＢＳ、１２．５％ウマ血清、０．２％ｉ−イノシトール、２０ｍＭ葉酸、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１μＭ ヒドロコルチゾン、１％anti-biotic-antimycotic solution）に混合し、遠心（２０００ｒｐｍ、１５分間）する。次いで、遠心後の上澄みを除去した後、沈降した細胞を回収し、培養する（３７℃、５％ＣＯ_２ in air）。

本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、または胎児肝細胞より分離して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化し得るＡＣ１３３（＋）の特徴を有する細胞を含む細胞分画である。この細胞分画は、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記ＡＣ１３３（＋）の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。
また、その他の態様として、脊椎動物から採取した胎児肝細胞を、２０００回転で比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行い、遠心後、比重１．０７〜１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる細胞分画を回収し、この細胞分画から、ＡＣ１３３（＋）の特徴を有する細胞を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味し、通常、１０〜３０分間程度である。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるがこれらに制限されない。

具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した肝臓組織をＬ−１５溶液内で洗浄し、酵素処理（Ｌ−１５＋０．０１％ＤＮａｓｅＩ、０．２５％トリプシン、０．１％コラーゲナーゼを含む溶液中で、３７℃で３０分間）し、ピペッティングにより単一細胞にする。この単一細胞となった胎児肝細胞を遠心分離する。これにより得られた細胞を洗浄し、洗浄後の細胞からＡＣ１３３抗体を利用してＡＣ１３３（＋）細胞を回収する。これにより胎児肝細胞から神経系細胞へ分化しうる細胞を調製することができる。抗体を利用したＡＣ１３３（＋）細胞の回収は、マグネットビーズを利用して、または、セルソーター（ＦＡＣＳなど）を利用して行うことができる。

これら中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）、間質細胞、あるいはＡＣ１３３陽性細胞を含む細胞分画は、脊髄脱髄領域への移植後に、効率よく再有髄化する。特に、上記中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を含む細胞分画は、プリオン病モデルへ投与しても、良好に生着し、神経系細胞あるいはグリア細胞に分化することができる。
また、上記細胞分画に含まれる神経系細胞に分化し得る細胞として、例えば、上記細胞分画に含まれる神経幹細胞、中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）、および間質細胞、ＡＣ１３３陽性細胞が含まれるが、神経系細胞に分化し得る限り、これらに制限されない。
また、本発明におけるプリオン病の治療剤の有効成分としては、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞だけでなく、上記細胞分画も含まれる。

本発明の剤に用いられる間葉系細胞、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞または末梢血細胞は、そのまま投与に用いることも可能であるが、治療効率を向上させるために、該細胞に種々の改変を加えることができる。したがって、本発明の別の側面では、かかる改変を受けた間葉系細胞を有効成分として含むプリオン病治療のための剤が提供される。
上記改変の例としては、該細胞へのＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性を付与するような遺伝子の導入が挙げられる。ここで、ＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性とは、例えば、生体内におけるＰｒＰ^Ｓｃの存在量の絶対的増加および／またはＰｒＰ^ｃの存在量に対する相対的増加を抑制し、阻止し、あるいはＰｒＰ^Ｓｃの存在量の絶対的および／または相対的減少をもたらすことができる能力を意味する。かかる効果は、直接的、または、間接的に達成されてもよいが、生体に好ましくない影響を与えないものが好ましい。また、上記活性は抑制の程度の大きいものがより好ましく、ＰｒＰ^Ｓｃの存在量を減少させることができるものが最も好ましい。

ＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性を付与し得る遺伝子としては、例えばＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子などが挙げられる。かかるポリペプチドは、抗プリオン抗体、プロトカドヘリン４３およびＯＢ−カドヘリン−１などのカドヘリン（特表２０００−５１２１３１号公報）、プラスミノゲン、プラスミノゲン断片およびその誘導体（特表２００４−５０１６２６号公報）などを包含するが、これらに限定されるわけではない。

本発明において、抗プリオン抗体とは、ＰｒＰ^ｃおよび／またはＰｒＰ^Ｓｃに結合可能な抗体を意味する。本明細書においては、特に別記のない限り、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン、または、その抗原結合部分を包含する。抗原結合部分としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｄＡｂおよび相補性決定領域断片などが挙げられるが、ＰｒＰ^ｃおよび／またはＰｒＰ^Ｓｃに結合可能なこれら以外の部分をも包含する。本発明に用いられる抗プリオン抗体はＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性を有するものが好ましく、例えば、非特許文献２、非特許文献３、Enari M et al. 2001. Proc Natl Acad Sci U S A 98(16):9295-9、Peretz D et al. 2001. Nature 412(6848):739-43、Gilch S et al. 2003. J Biol Chem 278(20):18524-31などに記載されたものや、いずれも独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、２００１年９月１４日に寄託されたハイブリドーマクローン７２−５（受託番号：FERM P-18516）、および４４Ｂ１（受託番号：FERM P-18515）により産生されるものなどが挙げられる。また、かかる活性を有することがまだ知られていないが、実際には当該活性を有する抗プリオン抗体も本発明に好適に用いることができる。このような抗体は、スクレイピー感染細胞株などを用いる評価系によってスクリーニングすることができる（上記Enari M et al.、Gilch S et al.などを参照）。

本発明における抗プリオン抗体は、キメラ抗体、霊長類化抗体およびヒト化抗体を包含する。このような抗体はヒトにおいて免疫原性に乏しく、従って非ヒト動物からの抗体に比較して、ヒトへのin vivo投与に適している。抗プリオンキメラ抗体はこれまで知られておらず、本発明者らによって初めて作製されたものであり、勿論本発明に含まれる。典型的なキメラ抗体は、１種の動物、典型的にはヒトの定常領域に融合された別の動物、典型的にはマウスの免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖可変領域（ＣＤＲおよびＦＲを包含する）を含有するものであり、本発明においては、例えば、前記文献に記載のものや、ハイブリドーマクローン７２−５および４４Ｂ１などにより産生される抗プリオン抗体の可変領域にヒト抗体の定常領域を融合させたものなどが挙げられる。

本発明の抗プリオンキメラ抗体の一態様としては、
（１ａ）配列番号３０、３２および３４からなる群から選択される配列を含む核酸、
（１ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（１ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
（１ｃ）前記（１ａ）または（１ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
（１ｄ）前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される抗体重鎖遺伝子、および、
（２ａ）配列番号３１、３３および３５からなる群から選択される配列を含む核酸、
（２ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（２ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
（２ｃ）前記（２ａ）または（２ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
（２ｄ）前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される抗体軽鎖遺伝子によりコードされるものが挙げられる。
霊長類化およびヒト化抗体は、典型的には、非霊長類またはヒト抗体の可変領域フレームワーク中にグラフトされたマウス抗体からの重鎖および／または軽鎖ＣＤＲを包含し、通常ヒト定常領域をさらに包含する。

また、抗プリオン抗体またはその断片を新たに作製し、ＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性についてスクリーニングすることで、本発明に有用な抗体を得ることも可能である。プリオンタンパク質は抗原性が極めて弱く、通常の免疫法では抗体を作製することが難しかったが、Buelerらによるプリオン遺伝子ノックアウトマウス（Ｐｒｎｐ−／−マウス）の開発（Bueler H et al. 1992. Nature 356(6370):577-82）により、同マウスをプリオンタンパク質またはそのエピトープを含む抗原で定法に従い免疫することによって、抗プリオン抗体を作製することが可能となった。もっとも、本発明においては、Ｐｒｎｐ−／−マウスを用いる以外の方法によって作製された抗プリオン抗体が除外されるわけではない。抗原としては、例えば、ＰｒＰ^Ｓｃ感染組織のホモジネート、その精製物またはこれらの変性産物、プリオンタンパク質の一部のアミノ酸配列を含む合成ペプチド、組換えプリオンタンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。

抗プリオン抗体遺伝子のクローニングには、当該技術分野で周知の任意の技法を用いることができる。例えば、抗プリオン抗体産生細胞のＲＮＡをもとにｃＤＮＡライブラリを構築し、抗体に特異的なプライマーを用いて、求める抗体遺伝子を得ることができる。より具体的には、例えば、抗体の定常領域に特異的なプライマーを作製し、ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA End）法などの公知の手法により、未知の可変領域の核酸配列を含むポリヌクレオチドを得ることができるが、本発明の抗プリオン抗体遺伝子はかかる方法で得られるものに限られない。得られたポリヌクレオチドは、所定の制限酵素で消化し、任意の周知のベクターにクローニングすることができる。

本発明で用いることができる抗プリオン抗体遺伝子としては、例えば、抗体重鎖遺伝子と抗体軽鎖遺伝子とからなるものであって、抗体重鎖遺伝子が、
（１ａ）配列番号１、３、５、３０、３２および３４からなる群から選択される配列を含む核酸、
（１ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（１ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
（１ｃ）前記（１ａ）または（１ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
（１ｄ）前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択され、抗体軽鎖遺伝子が、
（２ａ）配列番号２、４、６、３１、３３および３５からなる群から選択される配列を含む核酸、
（２ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（２ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
（２ｃ）前記（２ａ）または（２ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
（２ｄ）前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択され、前記抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子を発現させて得た抗体が、ＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性を有するものが挙げられる。
これらの遺伝子のうち、発現させた場合にＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性のより高いものが本発明においては好ましい。

本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」という用語は、当該技術分野において周知のパラメータである。核酸のハイブリダイゼーションのパラメータは、標準的なプロトコル集、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press (2001)や、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)などに記載されている。

具体的には、本明細書において用いるストリンジェントな条件は、６５℃での、３．５×ＳＳＣ、フィコール０．０２％、ポリビニルピロリドン０．０２％、ウシ血清アルブミン０．０２％、ＮａＨ_２ＰＯ_４２５ｍＭ（ｐＨ７）、ＳＤＳ０．０５％、ＥＤＴＡ２ｍＭからなるハイブリダイゼーションバッファーによるハイブリダイゼーションを指す。なお、上記のうち、ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７であり、ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムであり、またＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが移された膜は、２×ＳＳＣにて室温において、次いで０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳにて６８℃までの温度において洗浄する。あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ExpressHyb（登録商標）緩衝液（Clontech社製）などの市販のハイブリダイゼーションバッファーを用いて、製造者によって記載されたハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で行ってもよい。

同程度のストリンジェンシーを生じる結果となる使用可能な他の条件、試薬等が存在するが、当業者はかかる条件に通じていると思われるため、これらについては、本明細書中に特段記載はしていない。しかしながら、本発明の変異体をコードしている核酸の相同体または対立遺伝子の明確な同定ができるよう、条件を操作することが可能である。

ＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性を付与する遺伝子の間葉系細胞への導入に際しては、公知の種々の方法を用いることができる。例えば、該遺伝子をウイルスベクターに組み込み、該ベクターを間葉系細胞に感染させて導入する方法や、燐酸カルシウムトランスフェクション法（Berman et al. 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7176）、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、プロトプラスト融合（Deans et al. 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1292）、電気穿孔（エレクトロポレーション）、リポソーム融合、ポリブレンによるトランスフェクションおよび細胞膜のレーザー微穿孔による遺伝子の直接的な送達を包含する、周知の多数の技法によって、上記遺伝子を間葉系細胞に導入することができる。当業者はまた、前記遺伝子を細胞のゲノムに組込み、当該遺伝子の発現を可能にするように細胞内に適切に導入することのできる上記以外のいかなる技術をも本発明に用いることができる。

本明細書に用いる場合、「ベクター」は、異なる遺伝的環境間の移送のため、または宿主細胞における発現のために、消化またはライゲーションによって所望の核酸分子を導入できる任意の核酸を意味する。ベクターは典型的にはＤＮＡから構成されるが、ＲＮＡベクターを用いることもできる。ベクターは、プラスミド、ファージミド、およびウイルスゲノムを含むがこれに限定されるものではない。クローニングベクターは、自律的に、あるいはゲノムへの組込みの後に、宿主細胞中で複製することができるものであり、それはさらに１または２以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によって特徴づけられ、当該ベクターはその部位で決定可能な様式で切断され、そこに所望の核酸配列を連結することができ、これにより、新規な組換えベクターは宿主中で目的とする核酸分子を複製することが可能となる。プラスミドの場合には、宿主細菌内のプラスミドのコピー数が増えることにより、所望の核酸分子が何度も複製されもてよく、あるいは細胞分裂によって宿主が再生される前に宿主あたり１回だけ複製されてもよい。ファージの場合には、複製は溶菌相の間は積極的に、あるいは溶原相の間は受動的に起きてもよい。

発現ベクターは、その中に所望の核酸配列が消化およびライゲーションにより挿入され、それが調節配列に対して作動可能に連結されて、転写物として発現されるようにするものである。
本発明に用いられる遺伝子は、１または２以上の遺伝子から構成されていてもよく、２以上の遺伝子から構成されている場合には、これらの遺伝子を単一の発現ベクターに挿入することも、また、２以上のベクターに分けて挿入することもできる。
発現ベクターはさらに、当該ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされたか、またはされていない細胞を同定するのに適当な１または２以上のマーカー配列を含んでもよい。マーカーは、例えば抗生物質または他の化合物に対する抵抗性または感受性のどちらかを亢進または低下させるタンパク質をコードしている遺伝子、その活性が当該技術分野における標準的な分析法によって検出可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはアルカリ性ホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニー、またはプラークの表現型に視覚的に影響する遺伝子を含む。好ましい発現ベクターは自律的な複製と、それに対してベクターが作動可能に連結されているＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物の発現が可能なベクターである。

本明細書においては、コード配列および調節配列は、当該コード配列の発現または転写が、当該調節配列の影響または支配下にあるように位置される様式において連結されている場合、「作動可能に」連結されているということとする。もし当該コード配列を機能的なタンパク質に翻訳することが望まれる場合には、２つのＤＮＡ配列は、もし５’調節配列におけるプロモーターによる誘導の結果、当該コード配列の転写が生じ、またもし当該２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異を誘導する結果とならず、（２）当該コード配列の転写を指示するための当該プロモーターの能力を妨害せず、あるいは（３）タンパク質に翻訳されるべき対応するＲＮＡ転写物の能力を妨害しない場合には、「作動可能に」連結されているといわれる。したがってプロモーター領域は、もし当該プロモーター領域が、結果として得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように、そのＤＮＡ配列を転写できれば、作動可能にコード配列に連結されていることになる。

本発明において有用なベクターは、所望により、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子から誘導される適当な転写または翻訳調節配列と機能的に結合した本発明の変異体をコードしている核酸分子を含む。かかる調節配列は、遺伝子発現において調節的役割を有する配列、例えば転写プロモーターまたはエンハンサー、転写を調節するためのオペレーター配列、メッセンジャーＲＮＡ内部のリボゾーム結合部位をコードしている配列、ならびに、転写、翻訳開始または転写終了を調節する適切な配列を包含する。

遺伝子発現に必要な調節配列の詳細な性質は、生物種または細胞種によって異なってもよいが、一般的には、少なくとも、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの、各々転写および翻訳の開始に関与する５’非転写、および５’非翻訳配列を含み得る。特に、かかる５’非転写調節配列は、作動可能に連結された遺伝子の転写調節のためのプロモーター配列を含む、プロモーター領域を含み得る。調節配列はまた、エンハンサー配列か、または所望の上流のアクチベーター配列を含んでもよい。本発明のベクターは、任意に５’リーダーまたはシグナル配列を含んでもよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および自由裁量の範囲内にある。

特に有用な調節配列は、種々の哺乳動物、ウイルス、微生物、および昆虫遺伝子由来のプロモーター領域を包含する。このプロモーター領域は、対象となる遺伝子の転写の開始を指令し、そして抗プリオン抗体遺伝子を含むＤＮＡの全ての転写をもたらす。有用なプロモーター領域は、ＣＡＧプロモーター、レトロウイルスのｄＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)エンハンサー／プロモーター領域、ＲＳＶのＬＴＲプロモーター、ｌａｃプロモーター、およびアデノウイルスから分離したプロモーターを包含するが、真核生物、原核生物、ウイルス、または微生物細胞での遺伝子発現に有用な、当業者に公知の他の任意のプロモーターを用いることもできる。

真核生物細胞内で、遺伝子およびタンパク質を発現するのにとりわけ有用なその他のプロモーターは、哺乳動物細胞プロモーター配列およびエンハンサー配列、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０ウイルス、およびヒトサイトメガロウイルスから誘導されるものを包含する。典型的にはＳＶ４０などのウイルスのウイルス複製起点に隣接して見出される、ウイルスの初期および後期プロモーターが、特に有用である。特定の有用なプロモーターの選択は、その細胞株、および、特定の細胞株内部で本発明の変異体を発現させるために使用する核酸構築物についての、他の様々なパラメータに依存する。さらに、本発明において有用な充分高いレベルで、標的細胞に遺伝子を発現させることが知られている任意のプロモーターを選択することができる。

上記発現ベクターは、所望により、発現ベクターから生成されるｍＲＮＡの、タンパク質への効率的な翻訳を可能にするリボゾーム結合部位、ＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性を付与する遺伝子に機能的に結合していてもよい種々のシグナルペプチドをコードしている核酸配列を包含する、種々のさらなる調節配列を含むことができる。シグナルペプチドは、もし存在するならば、翻訳されたポリペプチドの細胞外分泌の改善を可能にする前駆体アミノ酸として発現される。
したがって、本発明の核酸構築物は、プロモーター配列またはプロモーターおよびエンハンサー配列のいずれかと作動可能に結合し、さらにｍＲＮＡの終止およびポリアデニル化を指令するポリアデニル化配列に機能的に結合した、本発明の核酸分子の様々な型を包含する。本発明の核酸構築物は、所望の細胞内部でのその構築物の効率的な複製および発現を可能にするその他の遺伝子配列を含み得る。かかる配列は、ウイルス遺伝子等から誘導されるイントロンを包含し得る。

本発明において、間葉系細胞への遺伝子導入に好適に用いることができるウイルスベクターとしては、例えば、特開２００２−３３０７８９号公報に記載の改変アデノウイルスが挙げられる。該アデノウイルスは、野生型アデノウイルスに対する主要なレセプターであるＣＡＲ（コクサッキーアデノウイルスレセプター）との結合能を実質的に有しないファイバータンパク質に、特定のタイプの細胞および／または組織に対する特異性を有する分子を接続した改変ファイバータンパク質、および／または、実質的にＣＡＲとの結合能を有しないファイバータンパク質を、特定のタイプの細胞および／または組織に対する特異性を有するように改変した改変ファイバータンパク質を有するものであるが、本発明においては、実質的にＣＡＲとの結合能を有しないファイバータンパク質にＲＧＤ（Arg-Gly-Asp）モチーフを含む分子を接続した改変ファイバータンパク質を有するものが特に好ましい。

かかる改変アデノウイルスベクターは、当該技術分野で周知の分子生物学的手法、例えば、ウイルスゲノムの両端に共有結合した末端タンパク質を保持したままの、ゲノム−末端タンパク質複合体（以下ＤＮＡ−ＴＰＣと略す）を用いる方法（Yoshida et al. 1998. Hum Gene Ther 9:2503-2515等を参照）などによって作製することができる。かかる手法はいずれも当業者に良く知られたものである。典型的には、まず、ｐＡｘＣｗ、ｐＡｘＣＡｗｔ等のコスミドカセットに目的とする遺伝子を組み込んだコスミドを作製する一方、ウイルスからＤＮＡ−ＴＰＣを調製し、適当な制限酵素で切断しておく。次に、前述のコスミドおよび制限酵素処理したＤＮＡ−ＴＰＣを適切な宿主細胞、例えば２９３細胞にコトランスフェクトする。その後、適当な条件で一定期間培養し、培養液中にウイルス粒子として放出された組換えアデノウイルス粒子を回収することができる。

本発明に用いられる間葉系細胞には、上記の他、例えば、細胞の増殖や神経細胞への分化を促進する遺伝子、細胞の生存率を高める遺伝子、細胞の寿命を延長する遺伝子（例えばテロメラーゼ遺伝子：国際公開第０３／０３８０７５号パンフレット参照）、細胞周期を調節する遺伝子、細胞の遊走能を向上させる遺伝子、神経保護作用を有する遺伝子、アポトーシス抑制効果を有する遺伝子など、プリオン病の治療効果を高める効果を有する任意の遺伝子を導入することができる。
なお、間葉系細胞についてなされる上記改変は、他の任意の種類の細胞についても適宜行うことができ、こうして作製された改変細胞を、異常プリオンの増殖を阻害するために用いることもできる。かかる改変細胞も本発明に包含されるものとする。

本発明のプリオン病治療剤は、プリオン病の治療効果を高める効果を有する種々の物質を添加した剤（組成物）として投与することができる。かかる物質としては、例えばＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性を有するものが挙げられる。ＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害物質の例としては、アンホテリシンＢ、コンゴレッド、アントラサイクリン、キナクリン、チロロン、クロロキン、Ｅ−６４ｄなどのシステインプロテアーゼ阻害剤（上記Doh-Ura K et al.）、プロマジン、クロルプロマジン、アセプロマジンなどのフェノチアジン誘導体（上記Korth C et al.）、ポルフィリンやフタロシアニンなどのテトラピロール類（上記Caughey WS et al.）、ペントサンポリサルフェート、リアクティブ・グリーンおよびリアクティブ・レッドなどのリアクティブ・ダイ、キニーネ、８−ハイドロキシキノリン−２−カルボクスアルデヒド８−キノリルヒドラゾン、２−ピリヂンカルボックスアルデヒド２−キノリルヒドラゾンおよび２，２’−バイキノリンなどのキニーネ類（特開２００３−４０７７８号公報）などの化合物、ＰｒＰ^ｃのドミナントネガティブ変異体をコードする遺伝子構築物（非特許文献１）、ならびに、ＰｒＰ^ｃおよび／またはＰｒＰ^Ｓｃに結合する物質などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

ＰｒＰ^ｃおよび／またはＰｒＰ^Ｓｃに結合する物質には、抗プリオン抗体またはその断片（例えば、非特許文献２、非特許文献３、特開２００３−１４４１４８号公報、特開２００３−３２１４９８号公報、上記Enari M et al.、上記Peretz D et al.、上記Gilch S et al.などを参照）、プロトカドヘリン４３およびＯＢ−カドヘリン−１などのカドヘリン（特表２０００−５１２１３号公報）、プラスミノゲン、プラスミノゲン断片およびその誘導体（特表２００４−５０１６２６号公報）などが挙げられるが、このうちＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性を有するものが好ましい。

また、ある物質がＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性を有するか否かは、特開２００３−１４９２３７号公報などに記載された周知の方法を用いて決定することができ、かかる方法によって同定された任意のＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害物質（例えば、クロロフィルａ、クロロフィルｂ、銅クロロフィル、銅クロロフィリンナトリウム、鉄クロロフィリンナトリウムなど）を、本発明の剤に用いることができる。
プリオン病の治療効果を高める効果を有する物質としては、上記の他、例えば細胞の増殖や神経細胞への分化を促進する物質、細胞の生存率を高める物質、細胞の寿命を延長する物質、細胞周期を調節する物質、細胞の遊走能を向上させる物質、神経保護作用を有する物質、アポトーシス抑制効果を有する物質などが包含される。

本発明の治療剤の調製に際しては、前記のようにして作製した間葉系細胞（改変されたものを含む）をそのまま用いることもできるが、細胞を作製し、必要に応じて増殖させた後、これを凍結保存し、用事に解凍して治療剤の調製に用いることもできる。
本発明のプリオン治療剤は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、必要に応じて水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。また、注射のための無菌組成物は注射用蒸留水などのビヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなどが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０などと併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプル、バイアル、チューブ、ボトル、パックなどの容器に充填する。

対象の体内への投与はいずれの経路によってもよいが、好ましくは非経口投与であり、特に好ましくは局所投与または静脈内投与である。投与回数は１回が好ましいが、状況に応じて複数回投与することもできる。また、投与時間は短時間でも長時間持続投与でもよい。本発明の治療剤は、より具体的には、注射によりまたは経皮的に投与することができる。注射による投与の例としては、例えば、静脈内注射、動脈内注射、選択的動脈内注入、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、脳室内注射、脳内注射、髄液腔内注射などによるものが挙げられるが、これらに限られない。
静脈内注射の場合、通常の輸血の要領での投与が可能となり、対象を手術する必要がなく、さらに局所麻酔も必要ないため、対象および術者双方の負担を軽減することができる。また手術室以外での投与操作が可能である点で有利である。
本発明の抗プリオンキメラ抗体やベクターも、上記と同様の方法によって調剤し、投与することができる。

さらに本発明は、対象へ治療上有効量の本発明の治療剤、ベクター、抗プリオンキメラ抗体、および／または、以下で詳述する持続製剤を投与することを含む、プリオン病の治療方法に関する。
上記治療方法に用いられる剤に含まれる骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞等の間葉系細胞は、投与による拒絶反応の危険性を防止するために、免疫抑制などの特殊な操作を行わない限りは、対象自身の体内から採取されたもの、あるいはそれに由来するもの（対象由来の自家細胞）であることが好ましい（自家移植療法）。かかる態様は、免疫抑制剤の併用が回避できる点で好ましい。免疫抑制処置を行えば他家細胞の使用も可能であるが、自家細胞を用いる方が圧倒的に良好な治療効果が期待できる。

自家細胞の使用が困難な場合には、他の対象または他の医療用動物由来の細胞を利用することも可能である。細胞は冷凍保存したものであってもよい。
なお前記自家細胞は、対象の体内から未分化の状態で採取されたもの、対象の体内から未分化の状態で採取された間葉系幹細胞に遺伝子操作を加えたもの、または対象の体内から未分化の状態で採取された間葉系幹細胞を分化誘導させたもののいずれであってもよい。
また、本発明の治療方法において、本発明の剤（間葉系細胞、例えば骨髄細胞等を含むもの）の対象への投与は、例えば、上述の方法に従って、好適に実施することができる。また、医師または獣医師においては、上記方法を適宜改変して、本発明の剤を対象へ投与することが可能である。
また、本発明の上記治療方法の対象は必ずしもヒトのみに限定されない。通常、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、スナネズミ、モルモットなどの齧歯類、ネコ、ピューマ、トラなどのネコ科動物、シカ、オオシカなどのシカ科動物、ミンク、ヒツジ、ヤギ、ウシ、サルなど）においても間葉系細胞を用いて、同様に本発明の方法を実施することが可能である。

本発明の他の側面は、治療上有効量の抗プリオン抗体を持続放出することを含む、プリオン病の治療方法、ならびにかかる治療方法に用いる持続製剤に関する。
持続放出は、任意の持続製剤を用いて達成することができ、典型的には対象の体内で行われるが、これに限定されず、例えば、体外もしくは体表に設置した持続製剤もしくは持続放出デバイスを介して行うこともできる。持続製剤の例としては、浸透圧ポンプや、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある半透性ポリマーマトリックスなどが挙げられる。浸透圧ポンプとしては、例えばDURECT社のAlzet（登録商標）浸透圧ポンプなどを好適に用いることができる。同ポンプは内部に含まれた溶液を所定の流量パターンで放出することができるため、抗プリオン抗体を、生理学的に許容し得る溶媒、例えば生理食塩水、ＰＢＳなどに溶解して所望の放出特性を有するポンプに充填し、これを体内に設置することで、容易に抗体の持続放出を達成できる。持続放出性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号および欧州特許第58481号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981)、およびR. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)）、エチレンビニルアセテート（上記R. Langer et al.）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（特開昭60−54326号公報）などが挙げられる。持続製剤はまた、リポソームエントラップポリペプチドを包含する。抗プリオン抗体を含有するリポソームは、自体公知の方法により調製される（例えば、Epstein et al. 1985. Proc Natl Acad Sci USA 82:3688-3692 、Hwang et al. 1980. Proc Natl Acad Sci USA 77:4030-4034などを参照）。通常、リポソームは、小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、その脂質含量は、約３０ｍｏｌ％のコレステロールよりも高く、選択比率は、最適な抗体治療に関して調節される。

本発明の持続製剤はまた、抗プリオン抗体を分泌する細胞を含むことができる。かかる細胞には、例えば、クローン４４Ｂ１や７２−５などの抗プリオン抗体産生ハイブリドーマばかりでなく、抗プリオン抗体遺伝子を導入した任意の細胞が含まれる。かかる細胞を含む持続製剤は、細胞が生存する限り抗体を放出することができるため、侵襲的な方法を伴い得る製剤導入の頻度を減らすことが可能となり、有利である。このような細胞のうち、生体への悪影響の少ない自己由来の細胞が好ましく、また、増殖や生死が制御可能な細胞も好ましい。本発明の持続製剤において特に好ましい細胞は、抗プリオン抗体遺伝子が導入された間葉系細胞、より好ましくは間葉系幹細胞であり、かかる細胞を投与することにより、抗プリオン抗体が持続的に放出されるだけでなく、該細胞が損傷した神経組織が再建されるため、相乗的な効果が期待できる。上記細胞には、例えば、細胞の増殖や神経細胞への分化を促進する遺伝子、細胞の生存率を高める遺伝子、細胞の寿命を延長する遺伝子（例えばテロメラーゼ遺伝子）、細胞周期を調節する遺伝子、細胞の遊走能を向上させる遺伝子、神経保護作用を有する遺伝子、アポトーシス抑制効果を有する遺伝子など、プリオン病の治療効果を高める効果を有する任意の遺伝子を導入することができる。
抗プリオン抗体分泌細胞を含む上記製剤は、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、種々の細胞培養培地などの生理学的に許容し得る媒体中に上記細胞を含む懸濁液として、または、かかる懸濁液を生分解性カプセル中に含むカプセル剤として提供することができる。また、上記細胞は、凍結保存し用事に解凍して使用してもよい。その他の製剤化の例は、本発明の治療剤についてすでに記載した通りであり、当業者に公知である。

本発明の持続製剤は、体内の任意の部分、例えば、皮下組織中、筋肉内、腹腔内、脳内、脳室内、髄液腔内、動脈内、静脈内などに定法により導入することができる。放出期間は、プリオン病の進行の遅延または病態の改善がもたらされるものであれば特に限定されないが、例えば、１０〜５０日の期間であれば、良好な治療効果を得ることができる。また、放出量も、プリオン病の進行の遅延または病態の改善がもたらされるものであれば特に制限されないが、典型的には０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｋｇ／日である。抗プリオン抗体分泌細胞を含む製剤を用いる場合、投与量は、細胞の抗体産生能にもよるが、典型的には１×１０^４〜１×１０^７ 細胞／ｋｇ（局所投与）または１×１０^６〜１×１０^９細胞／ｋｇ（静脈内投与)であり、好ましくは１×１０^５〜１×１０^６細胞／ｋｇ（局所投与）または１×１０^７〜１×１０^８細胞／ｋｇ（静脈内投与）、より好ましくは５×１０^５〜１×１０^６細胞／ｋｇ（局所投与）または５×１０^７〜１×１０^８細胞／ｋｇ(静脈内投与)である。ただし、かかる用量は、治療における種々の条件、例えば、疾患の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、性別、食事、製剤の投与経路、投与時期および投与頻度、併用医薬の有無、反応への感受性、および治療に対する耐容／応答などに応じて適宜調節することができる。

本発明の当該側面の治療方法はまた、抗プリオン抗体遺伝子を対象の細胞に導入することを含む。抗プリオン抗体遺伝子が導入された細胞は、抗プリオン抗体を持続的に放出するようになるため、本発明の持続製剤として作用することができる。核酸分子を対象の所望の細胞内に導入する方法は良く知られており、これは、ベクターの使用および対象への様々な核酸構築物の注入などを包含する。導入される細胞としては、プリオン病改善効果が得られれば特に制限されないが、典型的には対象の脳内に存在する細胞を挙げることができる。
遺伝子を適切に送達し、所望の核酸分子の発現をもたらすことのできる数多くの種類のベクターが開発され、例えば、Current Comm. Mol. Biol., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1987)などの文献に記載されている。抗プリオン抗体遺伝子を含むベクターとしては、当該文献に記載されているもののほか、上述の種々のものを好適に用いることができる。ベクターを用いる場合、典型的には、本発明の核酸分子を含むベクターの治療有効量を、対象の循環内または局所に導入し、該ベクターが所望の細胞に特異的に感染できるようにする。別の好ましい態様では、ベクターを、対象の脳内に直接注入する。ベクターの投与量は、プリオン病の改善がもたらされる量であれば特に制限されないが、本発明のアデノウイルスベクターであれば、例えば成人１人あたりウイルス粒子１０^３〜１０^１５個を投与することができる。ただし、かかる用量は、治療における種々の条件、例えば、疾患の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、性別、食事、製剤の投与経路、投与時期および投与頻度、併用医薬の有無、反応への感受性、および治療に対する耐容／応答などに応じて適宜調節することができる。
本発明はさらに、プロモーター、抗プリオン抗体遺伝子、およびこれに続くポリアデニル化配列を有する核酸構築物を、対象に直接注入することをも企図する。かかる方法の有用な例は、Vile et al. 1994. Ann Oncol 5 Suppl 4:59に記載されている。かかる核酸構築物は、対象の筋肉またはその他の部位、または対象の脳内に直接注入することができる。

本発明の別の側面では、間葉系細胞の、プリオン病の病変部位に物質を送達するための剤の製造への使用、および、間葉系細胞を含む、プリオン病の病変部位に物質を送達するための剤が提供される。ここで、物質とは、間葉系細胞の内部に挿入できるものや、細胞表面に付着できるものであれば特に限定されず、例えば、異常プリオンの増殖を阻害する物質、細胞の増殖や神経細胞への分化を促進する物質、細胞の生存率を高める物質、細胞の寿命を延長する物質、細胞周期を調節する物質、細胞の遊走能を向上させる物質、神経保護作用を有する物質、アポトーシス抑制効果を有する物質などの、プリオン病の治療効果を高める効果を有する物質のほか、色素、酵素、蛍光物質、放射性同位体などの標識物質、周囲の細胞へ任意の遺伝子を導入するためのベクターなどが包含される。かかる物質の中でも、プリオン病の研究、診断、治療などに有用なものが好ましい。
上記送達剤は、すでに記載した本発明の治療剤と同様の方法で作製し、対象に投与することができる。

本発明を、以下の実施例を用いてより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：抗ＰｒＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
精製したリコンビナントＰｒＰ（ｒＰｒＰ）あるいはスクレイピーObihiro株感染マウス脳から精製した異常型プリオンタンパク質(ＰｒＰ^Ｓｃ)を抗原として、プリオンタンパク質ノックアウトマウス（Ｐｒｎｐ−／−マウス）を免疫し、得られた脾臓細胞とミエローマ細胞株（Ｐ３Ｕ１）とを融合させてハイブリドーマを得、これをＰｒＰとの結合性についてスクリーニングした（Kim et al. 2004. Virology 320:40-51参照）。

（１）抗原の調製
大腸菌発現ベクターｐＲＳＥＴＢ（Invitrogen社製）を用いて、大腸菌にマウスＰｒＰの２３〜２３１位に相当する組換えポリペプチド（ｒＰｒＰ）を発現させた。ｒＰｒＰは封入体中に発現されるので、これを８Ｍの塩酸グアニジンで可溶化し、Ｎｉ２＋−ＩＭＡＣで精製した。精製物を分子内にＳＳ結合を有するものについて逆相ＨＰＬＣでさらに精製したｒＰｒＰを抗原とした（上記Kim et al.参照）。

（２）マウスの免疫
対象動物として１０〜１２週齢のＰｒｎｐ−／−マウス（Yokoyama et al. 2001. J Biol Chem 276:11265-11271）を用いた。マウスに上記抗原２００μｇをフロイント完全アジュバントとともに皮下接種した。その後2週間ごとに、上記抗原１００μｇをフロイント不完全アジュバントとともに皮下接種した。最終免疫は上記抗原５０μｇを尾静脈より注射することにより行った。

（３）細胞融合およびハイブリドーマの選択
最初の免疫から４２日目に、深麻酔下の免疫マウスより脾臓を摘出し、単細胞懸濁液を調製した。得られた細胞をポリエチレングリコール１５００を用いてＰ３Ｕ１細胞と融合させた。得られたハイブリドーマの培養上清をｒＰｒＰおよび精製ＰｒＰ^Ｓｃを抗原としたＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ｒＰｒＰあるいは精製ＰｒＰ^Ｓｃと反応する抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングした。

実施例２：抗ＰｒＰモノクローナル抗体のＰｒＰ ^Ｓｃ 増殖阻害活性
実施例１で得られた抗体のうち、ＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性を有するものを選択した。プリオン持続感染細胞Ｉ３／Ｉ５（Race et al. 1987 J Gen Virol 68:1391-9）を０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＰｒＰモノクローナル抗体を含む培地で３日間培養した。培地を除去後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウムを含む緩衝液で溶解し、２０μｇ／ｍｌのプロテインキナーゼＫで３７℃にて２０分消化した。プロテインキナーゼＫの活性を２ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃｋを加えて停止した後、１００，０００×ｇ、２時間の遠心によりＰｒＰ^Ｓｃを回収した。ＰｒＰ^Ｓｃはウェスタンブロット法により検出した。

以下の実施例では、このうちＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性を示さなかった４３Ｃ５（ＩｇＧ１）、ならびに、ＰｒＰ^Ｓｃ増殖阻害活性を示した７２−５（ＩｇＧ１、受託番号：FERM P-18516）および４４Ｂ１（ＩｇＧ_２ａ、受託番号：FERM P-18515）の３種のハイブリドーマを用いた。

実施例３：抗プリオン抗体遺伝子の同定
（１）抗体遺伝子のクローニング
実施例２で選択したハイブリドーマから定法に従い全ＲＮＡを調製し、５’−ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA End）法およびＲＴ−ＰＣＲ法にて抗体遺伝子（重鎖、軽鎖）をそれぞれクローニングした。５’−ＲＡＣＥ法はSMART（登録商標）RACE cDNA Amplification Kit（CLONTECH社製）を用いて行った。抗体遺伝子クローニングのために以下に示すプライマーを作製した。図１に抗体遺伝子とプライマーとの対応関係を示す。

ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡは、次のようにして調製した。すなわち、４３Ｃ５、７２−５、４４Ｂ１それぞれの全ＲＮＡ１μｇに、５’−ＣＤＳプライマー1μｌ、SMART II A（登録商標）オリゴヌクレオチド（配列番号７）1μｌ、脱イオン水を加え5μｌとし、７０℃で２分間加温し、氷中で2分間急冷した。次に５× First-Strandバッファー２μｌ、ＤＴＴ（２０ｍＭ）１μｌ、dNTPミックス（１０ｍＭ）１μｌ、PowerScript（登録商標）逆転写酵素１μｌを加え全量を１０μｌとし、４２℃で９０分インキュベートした。次に７２℃で７分間加熱し、５’−ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡとした。５’−ＣＤＳプライマーは、下表２のものを用いた。

抗体の可変領域の５’−ＲＡＣＥは、下記の組成のマスターミックス（表４）およびＲＡＣＥ反応液（表５）を用い、クローンテック社のマニュアルにしたがって作製した。ユニバーサルプライマーとしては、以下の組み合わせからなる混合物（UPM：Universal Primer A Mix）を用いた。

５’−ＲＡＣＥ用プライマー（GSP：Gene Specific Primer、遺伝子特異的プライマー）としては、1940（４３Ｃ５、７２−５重鎖）、2002（４４Ｂ１重鎖）および1936（４３Ｃ５、４４Ｂ１軽鎖）を用いた。反応は、９４℃５秒、７２℃３分を５サイクル；９４℃５秒、７０℃１０秒、７２℃３分を５サイクル；６８℃１０秒、７２℃３分を２５サイクルの条件で行った。

ＲＴ−ＰＣＲは定法に従って行った。即ち、２μｌのｃＤＮＡ、１μｌの１０μＭプライマー、４．５μｌのＨ_２Ｏにマスターミックスを加えて５０μｌとした反応液を９４℃３分；９４℃３秒、６５℃３分を３０サイクル；６５℃３分の条件で反応させた。ｃＤＮＡは上記の５’ＲＡＣＥ用に調製したものを用いた。ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとしては、1941、1942、1943、1944（４３Ｃ５、７２−５重鎖定常領域）、2001、2003、2004、2006（４４Ｂ１重鎖定常領域）、1937、1938（４３Ｃ５、７２−５、４４Ｂ１軽鎖定常領域）および1980、1982、1999、2000、2007、2009（７２−５軽鎖可変領域）を用いた。

上記のようにして得られた各抗体遺伝子の可変領域および定常領域の増幅産物（ｃＤＮＡ）を、２％アガロースゲルによる電気泳動によりそれぞれ確認し、予想される分子量のバンドを切り出し、グラズビーズ法にて精製し、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクタープラスミドにサブクローニングした。なお、４４Ｂ１重鎖可変領域はトランスポゾンを含むシュード遺伝子を排除するために、トランスポゾン領域に特異的なＸｂａＩで５’−ＲＡＣＥ産物を消化し、分子量が変わらなかった約７００ｂｐ（４４Ｂ１ＶＨ−７００）、８００ｂｐ（４４Ｂ１ＶＨ−８００）の２本のバンドをアガロースゲルより切り出し、サブクローニングを行った。

（２）配列決定
上記で得られたプラスミドを、ミニプレップにより、BigDye（登録商標）Terminator cycle Sequencing kitのマニュアルに従って精製した。すなわち、４００ｎｇのプラスミドＤＮＡに、４μｌのBigDye（登録商標）、２μｌの５×シークエンス用バッファー、３．２μｌのシークエンス用プライマー（１ｐＭ／μｌ）および適量の脱イオン水を加え２０μｌとし、サーマルサイクラー（Perkin-Elmer GeneAmp（登録商標）System 2400）にてＰＣＲ反応を行った（３５サイクル：９６℃１０秒、５５℃５秒、６０℃４分）。次にPerforma DTRゲル濾過カートリッジで脱塩を行い、スピードバックで溶媒を除去、２０μｌのHi-Diホルムアミドを加え、９５℃で５分間加熱後、氷水中で２分間急冷しシークエンスサンプルを得た。配列決定はABI PRISM 3100を用いて行った。

この結果、４３Ｃ５重鎖（４３Ｃ５Ｈ：配列番号１）、４３Ｃ５軽鎖（４３Ｃ５Ｌ：配列番号２）、７２−５重鎖（７２−５Ｈ：配列番号３）、７２−５軽鎖（７２−５Ｌ：配列番号４）、４４Ｂ１重鎖（４４Ｂ１Ｈ：配列番号５）、４４Ｂ１軽鎖（４４Ｂ１Ｌ：配列番号６）の６種の配列を得た。表６に各配列におけるシグナルペプチド領域、可変領域および定常領域を塩基番号で示す。

実施例４：抗プリオン抗体遺伝子の発現
（１）発現ベクターへのクローニング
４３Ｃ５、７２−５のＩｇＧ１重鎖は、定常領域をＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩサイトおよびＸｍａＩ／ＢｇｌＩＩサイトの２パートで切り出しを行った。次に、発現ベクタープラスミドｐＣＡｃｃをＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、これに定常領域（ＣＨ１−２）ＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩおよび定常領域（ＣＨ２−３）ＸｍａＩ／ＢｇｌＩＩを３パートライゲーションで挿入し、ｐＣＡｃｃ／ＣＨを作製した。続いて、これをＥｃｏＲＩ／ＢｓｔＥＩＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＢｓｔＥＩＩサイトで切り出した可変領域のｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢｓｔＥＩＩサイトでライゲーションさせ、発現プラスミドｐＣＡｃｃ／４３Ｃ５Ｈ、ｐＣＡｃｃ／７２−５Ｈを作製した。

４３Ｃ５、４４Ｂ１のκ軽鎖は、可変領域をＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトで切り出し、定常領域はＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩサイトで切り出しを行った。これらのインサートｃＤＮＡをｐＣＡｃｃ／ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩに３パーツライゲーションで挿入し、発現プラスミドｐＣＡｃｃ／４３Ｃ５Ｌ、ｐＣＡｃｃ／４４Ｂ１Ｌを作製した。
７２−５κ軽鎖は、上記で作製したｐＣＡｃｃ／４３Ｃ５ＬをＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化し、これにＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトで切り出した可変領域を挿入して発現プラスミドｐＣＡｃｃ／７２−５Ｌを作製した。
４４Ｂ１ＩｇＧ_２ａ重鎖は、可変領域をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩサイト、定常領域をＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩサイトで切り出し、ｐＣＡｃｃ／ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩに３パーツライゲーションで挿入し、発現プラスミドｐＣＡｃｃ／４４Ｂ１Ｈを作製した（図２参照）。

（２）抗体の産生
６穴プレートに、２９３Ｔ細胞を５×１０^５細胞／ウェルで１２時間培養した。上記のようにして得られた発現プラスミドをミニプレップで精製し、それぞれの抗体に対応する重鎖と軽鎖についての発現プラスミドをそれぞれ２．５μｇ用意し、lipofectAMINE（登録商標）2000のプロトコルに従いリポフェクション法で２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。４８時間培養後、２９３Ｔ細胞を回収し、可溶化後、還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動したゲルをニトロセルロース膜に転写し、西洋ワサビ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、抗体の発現を確認した。図３に示すように還元条件下で分子量１７５〜１８０ｋＤａの抗体タンパク質が検出された。

別な実験では、トランスフェクト２９３Ｔ細胞により分泌された抗体をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により定量した。上記と同様に各抗体の発現プラスミドで２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、４８時間培養後、その上清を採取した。プレートに結合させる固相化抗体として抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。所定の濃度になるように０．１Ｍの炭酸バッファー（ｐＨ８．５）にて濃度調整した固相化抗体を５０μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、プレート表面に結合させた。次いで、プレート表面の非抗原結合部位をマスクするために、ヤギ血清（ブロッキング剤）を１５０μｌ／ウェル添加し、３７℃で１時間ブロッキング操作を行った。ブロッキング操作後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−ＰＢＳにて５分×３回、各ウェルを洗浄し、過剰のブロッキング剤を除いた。

ブロッキング後のプレートに、前記培養上清および検量線用のマウスＩｇＧを所定の濃度になるように希釈、調製し、各ウェルに５０μｌ添加した。３７℃で１時間反応を行い、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−ＰＢＳにて５分×３回、各ウェルを洗浄した。次いで、二次抗体として西洋ワサビ標識抗マウスＩｇＧ抗体を所定の濃度になるようにヤギ血清で希釈し、添加した。３７℃で１時間反応後、ウェルを洗浄し、発色基質（ＴＭＢ）を各ウェルに１００μｌ添加し、３７℃で１５分放置後、反応停止液である１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を５０μｌ／ウェルで添加し、４５０ｎｍにて測定した。その結果、４４Ｂ１、７２−５および４３Ｃ−５の抗体遺伝子でトランスフェクトされた細胞の培養上清中に発現抗体が分泌されていることが示された（表７参照）。

（３）組換え抗体の反応性
トランスフェクト細胞により分泌された抗体のプリオンタンパク質への反応性をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により検討した。図４に示すように、組換え抗体がプリオンタンパク質と反応することが確認された。

実施例５：抗プリオン抗体遺伝子含有アデノウイルスの作製
（１）抗プリオン抗体遺伝子含有コスミドの構築
インサートｃＤＮＡは実施例４で得たｐＣＡｃｃ／ＩｇＨ（ｐＣＡｃｃ／４３Ｃ５Ｈ、７２−５Ｈおよび４４Ｂ１Ｈ）、およびｐＣＡｃｃ／Ｌ（ｐＣＡｃｃ／４３Ｃ５Ｌ、７２−５Ｌおよび４４Ｂ１Ｌ）からＣｌａＩサイトで抗体遺伝子ｃＤＮＡを切り出し、グラスミルク法で精製した。コスミドベクターは、ＲＧＤファイバー改変型アデノウイルスを発現するｐＷＥＡｘ−Ｆ／ＲＧＤ／ＣｌａＩ／ＣＩＡＰを使用した（Nakamura T et al. 2002. Hum Gene Ther 13(5):613-26）。ベクター１μｇにインサートｃＤＮＡを１：１〜１０のｍｏｌ比で加え、ライゲーション反応を行った。次にGigapack III Gold Packagingキット（Invitrogen社製）を使用し、上記各ｃＤＮＡを含む６種のコスミド（ｐＷＥＡｘ−４３Ｃ５ＨＬ−Ｆ／ＲＧＤ、ｐＷＥＡｘ−４３Ｃ５ＬＬ−Ｆ／ＲＧＤ、ｐＷＥＡｘ−７２−５ＨＬ−Ｆ／ＲＧＤ、ｐＷＥＡｘ−７２−５ＬＬ−Ｆ／ＲＧＤ、ｐＷＥＡｘ−４４Ｂ１ＨＬ−Ｆ／ＲＧＤ、ｐＷＥＡｘ−４４Ｂ１ＬＬ−Ｆ／ＲＧＤ）を作製した（図５参照）。コスミドは制限酵素によるＤＮＡチェック後、５００ｍｌスケールで培養を行いNucleoBond BAC100で精製した。

（２）抗プリオン抗体遺伝子含有アデノウイルスの作製
各抗プリオン抗体の重鎖遺伝子または軽鎖遺伝子を含むアデノウイルスは、コスミド単独法またはＣＯＳ−ＴＰＣ法により作製した。
１）コスミド単独法
実施例５（１）で得た組換えコスミドＤＮＡ２０μｇをＰａｃＩで消化した。消化物を、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿の後、２０μｌの滅菌蒸留水に溶解した。こうして得たＰａｃＩ消化済みコスミド５μｇを１０ｃｍのシャーレで培養した２９３Ｔ細胞にリポフェクション法でトランスフェクトした。３７℃、５％ＣＯ_２で一晩培養し、ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（‐）を用いて細胞を回収した。回収した細胞懸濁液の原液、３倍希釈液、５倍希釈液のそれぞれをコラーゲンコート９６ウェルプレートに播いた。
２）ＣＯＳ−ＴＰＣ法
組換えコスミドＤＮＡ５μｇとアデノウイルスゲノムＤＮＡ−ＴＰＣ１μｇをリン酸カルシウム法で２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。３７℃、５％ＣＯ_２で一晩培養し、ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（‐）を用いて細胞を回収した。回収した細胞懸濁液の原液、３倍希釈液、５倍希釈液のそれぞれをコラーゲンコート９６ウェルプレートに播いた。

３）アデノウイルスの精製
５日後と１０日後に、上記で調製した各ウェルに５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを加えた。７日目以降、ウイルスが増殖し細胞が変性したウェルをチェックした。数日後すべての細胞が変性したウェルについて、培養液ごと細胞を回収した。回収した細胞は超音波破砕後遠心し、その上清を１次ウイルス液とした。
コラーゲンコート２４ウェルプレートにそれぞれ７０〜１００％コンフルエントまで培養した２９３Ｔ細胞を準備した。１次ウイルス液の各サンプルを１０μｌ／ウェルの割合で、２ウェル分の２９３Ｔ細胞感染させた。数日後すべての細胞が変性したウェルについて、培養液ごと細胞を回収した。回収した細胞液の一部は超音波破砕後遠心し、上清を２次ウイルス液とした。残りの細胞液は遠心後培地を捨て、ｃｅｌｌ ｐａｃｋとし、全ＤＮＡを抽出後、制限酵素で消化し、組換えアデノウイルスＤＮＡの構造を確認した。

２次ウイルス液については、１０ｃｍシャーレに２９３Ｔ細胞（９０％コンフルエント）を準備し、３０μｌの２次ウイルス液を加え感染させた。３〜４日後すべての細胞が変性したことを確認し、培養液ごと細胞を回収した。回収した細胞液の一部はｃｅｌｌ ｐａｃｋとし、全ＤＮＡを抽出後、制限酵素で消化し組換えアデノウイルスＤＮＡの構造を確認した。残りの細胞液は超音波破砕後遠心し上清を３次ウイルス液とし、−８０℃で保存した。３次ウイルス液については、その後、１０ｃｍシャーレに２９３Ｔ細胞（９０％コンフルエント）を３０枚準備し、３０μｌの３次ウイルス液を加え感染させた。３〜４日後すべての細胞が変性したことを確認し、培養液ごと細胞を回収した。超音波破砕後、ＣｓＣｌステップ勾配法でウイルス精製を行った。精製したウイルスは制限酵素を用いたＤＮＡチェック、ＰＣＲにより野生型アデノウイルスの混入がないことを確認し精製ウイルスとして−８０℃で保存した。
こうして、上記各ｃＤＮＡを含む６種のアデノウイルスベクター（Ａｘ４３Ｃ５Ｈ、Ａｘ４３Ｃ５Ｌ、Ａｘ７２−５Ｈ、Ａｘ７２−５Ｌ、Ａｘ４４Ｂ１ＨおよびＡｘ４４Ｂ１Ｌ）を得た。

実施例６：間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の調製
（１）マウスＭＳＣの調製
マウス（ＩＣＲまたはＣ５７ＢＬ／６系統、６週齢、雌）の大腿骨を深麻酔下に摘出し、ＰＢＳ（−）中で余剰の筋組織を除去した後、大腿骨頭および膝関節直上部を切断し、２ｍｌの培地（２％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン加ＩＭＤＭ）で、骨髄細胞を１０ｃｍディッシュ中に洗い出した。得られた骨髄細胞を、７０μｍメッシュを介して５０ｍｌチューブ（ファルコン社製）に集め、ＰＢＳで洗浄後（１０００ｒｐｍ、１０分）、培養用培地（２０％熱不活化ＣＳまたはＦＢＳ、５０μＭ ２−ＭＥ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン加ＩＭＤＭ）中に再懸濁し、６ウェルプレートに播種した（大腿骨１本／ウェル）。細胞を３３℃、５％ＣＯ_２で２４時間培養後、浮遊細胞を除去し、付着細胞をさらに培養に供した。これ以降は、３〜４日ごとに培地交換を行った。継代はトリプシン／ＥＤＴＡを１ｍｌ加え室温で５分間静置後、容易に剥離する細胞を回収し継代した。

次に、上記付着細胞のうちＣＤ４５（−）細胞を以下のようにして選択した。まず、培養１４（〜２１）日目の細胞を採取し、２％ＦＣＳ加ＩＭＤＭで３回洗浄後、１×１０^７細胞／ｍｌの濃度で、２％ＦＣＳ加ＩＭＤＭに再懸濁した。得られた細胞懸濁液（１ｍｌ）に１０μｌのＣＤ４５マイクロビーズ液を加え、室温で２０分間インキュベートした。その後、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）（Miltenyi Biotec社製）を用いた磁気細胞分離法により、ＣＤ４５（−）細胞を分離した。得られた細胞が、ＣＤ１１ｂ（−）、ＣＤ４５（−）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であることを、ＦＡＣＳ分析（図６）および形態学的観察（図７）により確認した。図７より、ＣＤ４５（＋）細胞のコロニーが比較的広がりのある大型の細胞と、小型の細胞とが入り混じったものであるのに対し、ＣＤ４５（−）細胞のコロニーが、間葉系幹細胞の特徴である、広がりのある大型の細胞のみの単一な細胞集団となっていることが分かる。

（２）ヒトＭＳＣの調製
ヒトＭＳＣはKobune M et al. 2003. Experimental Heamatology 31:1-8の記載に従って調製した。即ち、健康なヒトボランティアの後腸骨稜から骨髄単核細胞を採取し、１５０ｃｍ^２の組織培養用プラスチックフラスコにて一晩インキュベートした。その後、浮遊細胞を洗浄除去し、付着細胞を培養用培地（１０％熱不活化ウシ胎児血清加ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ_２、湿潤環境下で培養した。

実施例７：抗プリオン抗体遺伝子のＭＳＣへの導入
（１）アデノウイルスベクターによる導入
２４穴プレートにＩＣＲマウス由来のＭＳＣ（ＩＣＲ／ＭＳＣ）を５×１０^４細胞／ウェルの濃度で播種し、そこに実施例５で得たＡｘ４３Ｃ５ＨおよびＡｘ４３Ｃ５Ｌ、またはＡｘ４４Ｂ１ＨおよびＡｘ４４Ｂ１Ｌをそれぞれ１５００ｐｕ／細胞の濃度で加え、共感染させた。４８時間培養後、培養上清中の抗体の存在をウェスタンブロット法で評価した。４３Ｃ５についての結果を図８に示す。また、培養上清中の抗体量は、実施例４と同様にサンドイッチＥＬＩＳＡ法により定量した。結果を下表８に示す。

（２）エレクトロポレーションによる導入
ＩＣＲマウスまたはヒトＭＳＣを２×１０^５細胞／１００μｌの濃度で含む細胞懸濁液に、発現プラスミドｐＣＡｃｃ／７２−５ＨおよびｐＣＡｃｃ／７２−５Ｌ、あるいはｐＣＡｃｃ／４４Ｂ１ＨおよびｐＣＡｃｃ／４４Ｂ１Ｌを、各プラスミドあたり２．５μｇ加え、ヒトＭＳＣnucleofectorキット（Amaxa Biosystems社製）を用い、製造者のプロトコルに従って、U-23 high transfection efficiency条件下でエレクトロポレーションを行った。得られた細胞を６ウェルプレートに播種し、４８時間培養後、培養上清の一部を採取し、IsoStrip（ロッシュダイアグノスティックス社製）にて抗体の発現を確認した（図９）。その後さらに４８時間培養後、培養上清中の抗体量を、実施例４と同様にサンドイッチＥＬＩＳＡ法により定量した。結果を下表８に示す。

実施例８：プリオン病の病変部位に物質を送達するための剤の作製
（１）間葉系細胞へのＬａｃＺ遺伝子の導入
実施例６（１）で調製したＩＣＲ／ＭＳＣを、２４穴プレートに５×１０^３細胞／ウェルの濃度で播き、３３℃で１２時間、５％ＣＯ_２下で培養した。ＬａｃＺ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターＡｘＣＡＺ３−Ｆ／ＲＧＤを、０、１０００、３０００、１００００ｐｕ／細胞の濃度で、３７℃にて１時間感染させ、４８時間後にＸ−ｇａｌ染色を行った。その結果、３０００ｐｕ／細胞以上の濃度で、すべての細胞にＬａｃＺ遺伝子が導入されることが確認された（図１０）。

（２）間葉系細胞へのＤｓＲｅｄ遺伝子の導入
ＤｓＲｅｄ遺伝子の導入にはNucleofector（amaxa biosystems社製）のHuman MSC nucleofector kitを用いた。即ち、実施例６（１）で調製したＩＣＲ／ＭＳＣまたは実施例６（２）で調製したヒトＭＳＣ２×１０^５個を１００μｌのトランスフェクションバッファーに懸濁し、ＤｓＲｅｄ遺伝子を含む２μｇのｐＣＡｃｃ／ＤｓＲｅｄ発現ベクターを加え、エレクトロポレーション（プログラム：U-23 high transfection efficiency）を行った。得られた細胞を６ウェルプレートに細胞を播き、48時間培養後、ＦＡＣＳにて遺伝子導入効率を検討した。その結果、ヒトＭＳＣで１５．８４％、ＩＣＲ／ＭＳＣで５．７８％と良好な遺伝子導入効率が得られることが確認できた（図１１）。
上記（１）および（２）で得られたＭＳＣは、いずれもプリオン病の病変部位に遊走し得るので、当該部位にＬａｃＺ遺伝子やＤｓＲｅｄ遺伝子などの所望の遺伝子およびその遺伝子産物を送達することができる。

実施例９：抗プリオン抗体の海綿状脳症抑制効果
プリオン病モデルマウスを用いて、抗プリオン抗体７２−５および４４Ｂ１の海綿状脳症抑制効果を評価した。対象には、４週齢の雌ＩＣＲマウス（日本クレア株式会社）を用いた。対象に、スクレイピーobihiro株（北海道大学より入手）の１０％脳乳剤２μｌを脳内投与した。この処置により、通常６０〜９０日後頃から脳内にＰｒＰ^Ｓｃが検出されるようになる（ウェスタンブロット法では６０日後以降、免疫組織化学法では９０日後以降）。いずれの対象も、投与後１２５日までには、運動失調などの典型的な海綿状脳症の症状を発症した。臨床的に中期に分類される投与後１３７〜１４４日目に、７２−５、４４Ｂ１またはＫＬＨの各抗体を、Alzet（登録商標）浸透圧ポンプを用いて、それぞれ別個の対象の背側第三脳室内に注入した（２００μｌ／週、２８μｇ／マウス／日）。なおＫＬＨは、抗ＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）抗体（富士レビオ）を意味し、陰性対照として用いた。陰性対照が、削痩、起立不能などの末期の臨床症状を呈したら、対象を安楽死させ、脳組織試料を採取した。採取した組織は、組織学的分析、およびウェスタンブロット法に供し、脳組織の状態およびＰｒＰ^Ｓｃの蓄積量をそれぞれ評価した（結果を図１２および図１３にそれぞれ示す）。

図１２から明らかなとおり、陰性対照であるＫＬＨを投与した対象の脳組織（視床）には、海綿状脳症に特徴的な空洞が多数認められるのに対し、７２−５または４４Ｂ１を投与した対象の同様の脳組織においては、かかる空洞が殆ど見られなかった。また、７２−５または４４Ｂ１を投与した対象では、脳組織中のＰｒＰ^Ｓｃの蓄積量が、ＫＬＨ投与対象に比べて明らかに減少していた（図１３参照）。したがって、７２−５、４４Ｂ１等の抗プリオン抗体が、ＰｒＰ^Ｓｃの蓄積の蓄積を防ぐと共に、海綿状脳症病変の発生を抑制し得ることが明らかとなった。

実施例１０：ＭＳＣの生着
プリオン病モデルマウスを用いて、ＭＳＣの脳への生着能を評価した。対象には、実施例９に記載の処置を施したＩＣＲマウス（感染マウス）と、対照としてかかる処置を施していないＩＣＲマウス（非感染マウス）とを用いた。ＰｒＰ^Ｓｃ投与後１４０日目に、対象の視床に、実施例８で作製したＬａｃＺ発現ＭＳＣを１×１０^４個移植した。ＰｒＰ^Ｓｃ投与後１４２日目にマウスを安楽死させ、脳組織にＸ−ｇａｌ染色を施し、ＭＳＣの分布を評価した。図１４に示すとおり、いずれの対象においても、移植したＭＳＣが移植局所に生着していることが判明した。したがって、実施例９および１０の結果から、実施例７で得た抗プリオン抗体分泌ＭＳＣをプリオン病モデルマウスに移植することにより、プリオン病の改善が期待できる。

実施例１１：マウス−ヒトキメラ抗体の作製
実施例３で得た各マウス抗プリオン抗体（４３Ｃ５、７２−５および４４Ｂ１）をコードする核酸配列をもとに、これらの抗体の定常領域をヒトのものと置換したマウス−ヒトキメラ抗体（ｍ／ｈ４３Ｃ５、ｍ／ｈ７２−５およびｍ／ｈ４４Ｂ１）を作製した。ヒト抗体の定常領域をコードする核酸は、Shibagaki et al. 1998 Eur J Immunol 28:1125-1133およびShibagaki et al. 1998 Eur J Immunol 29:4081-4091に記載の方法で得た。すなわち、テンプレートとしてヒト−マウスキメラモノクローナル抗体Ｌ６を産生するミエローマ細胞株からのＲＮＡを、フォワードプライマーとして配列番号２８のオリゴヌクレオチドを、そしてリバースプライマーとして配列番号２９のオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いたＲＴ−ＰＣＲ法にて所望の核酸を得た（Linsley et al. 1991 J Exp Med 173:721-30参照）。こうして得た核酸の上流に、表６に示す各マウス抗体のシグナルペプチド領域および可変領域をコードする核酸を連結することによりマウス−ヒトキメラ抗体をコードする核酸を得、配列を決定した。各抗体をコードする核酸配列およびアミノ酸配列は下表９の通りである。

上記核酸は、例えば、実施例４と同様の手順により発現させることができ、また、実施例７と同様の方法でＭＳＣに導入し、発現させることができる。

実施例１２：ＭＳＣ細胞のプリオン病改善効果および患部への遊走能
実施例９に記載のプリオン病モデルマウスに、海綿状脳症発症後（スクレイピーobihiro株接種の１２５日後以降）、実施例７で得た抗プリオン抗体遺伝子発現ＭＳＣもしくは実施例８で得たＬａｃＺ発現ＭＳＣを、それぞれ例えば１×１０^４個静脈内投与する。２〜２０日後に、一部のマウスを安楽死させ、実施例９と同様に脳組織を採取し、組織学的分析、およびウェスタンブロット法に供し、各マウスの脳組織の状態およびＰｒＰ^Ｓｃの蓄積量をそれぞれ評価するとともに、残りのマウスについては、臨床状態の変化を観察する。これにより、ＭＳＣ細胞のプリオン病改善効果を容易に確認することができる。また、上記で採取した脳組織に、実施例１０と同様にＸ−ｇａｌ染色を施し、ＭＳＣの分布を調査することにより、ＭＳＣ細胞のプリオン病患部への遊走能を確認することができる。

実施例１３：抗プリオン抗体遺伝子含有ベクターおよび抗プリオン抗体分泌ＭＳＣ細胞のプリオン病改善効果
実施例５で得た抗プリオン抗体遺伝子含有アデノウイルス（例えば５×１０^８粒子）、または、実施例７で得た抗プリオン抗体遺伝子発現ＭＳＣ（例えば１×１０^４個）を、実施例９に記載のプリオン病モデルマウスに、海綿状脳症発症後（スクレイピーobihiro株接種の１２５日後以降）脳内投与する。２〜２０日後に、一部のマウスを安楽死させ、実施例９と同様に脳組織を採取し、組織学的分析、およびウェスタンブロット法に供し、各マウスの脳組織の状態およびＰｒＰ^Ｓｃの蓄積量をそれぞれ評価する。残りのマウスについては、臨床状態の変化を観察する。これにより、上記アデノウイルスまたはＭＳＣ細胞のプリオン病改善効果を容易に確認することができる。

Claims (30)

1. 間葉系細胞を有効成分として含む、プリオン病の治療のための剤。
2. 間葉系細胞が、異常プリオン増殖阻害活性を有する、請求項1に記載の剤。
3. 間葉系細胞が、異常プリオン増殖阻害活性を有する抗プリオン抗体の遺伝子が導入されたものである、請求項1または２に記載の剤。
4. 抗体遺伝子が、抗体重鎖遺伝子と抗体軽鎖遺伝子とからなり、抗体重鎖遺伝子が、
   （１ａ）配列番号１、３、５、３０、３２および３４からなる群から選択される配列を含む核酸、
   （１ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（１ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
   （１ｃ）前記（１ａ）または（１ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
   （１ｄ）前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
   からなる群から選択され、抗体軽鎖遺伝子が、
   （２ａ）配列番号２、４、６、３１、３３および３５からなる群から選択される配列を含む核酸、
   （２ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（２ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
   （２ｃ）前記（２ａ）または（２ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
   （２ｄ）前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
   からなる群から選択され、前記抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子を発現させて得た抗体が、異常プリオン増殖阻害活性を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の剤。
5. 静脈内投与用である、請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
6. 間葉系細胞が骨髄細胞、臍帯血細胞および末梢血細胞からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の剤。
7. 抗体重鎖遺伝子と抗体軽鎖遺伝子とからなる抗プリオン抗体遺伝子であって、抗体重鎖遺伝子が、
   （１ａ）配列番号１、３、５、３０、３２および３４からなる群から選択される配列を含む核酸、
   （１ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（１ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
   （１ｃ）前記（１ａ）または（１ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
   （１ｄ）前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
   からなる群から選択され、抗体軽鎖遺伝子が、
   （２ａ）配列番号２、４、６、３１、３３および３５からなる群から選択される配列を含む核酸、
   （２ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（２ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
   （２ｃ）前記（２ａ）または（２ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
   （２ｄ）前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
   からなる群から選択され、前記抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子を発現させて得た抗体が、異常プリオン増殖阻害活性を有する、前記抗プリオン抗体遺伝子。
8. 請求項７に記載の抗プリオン抗体遺伝子を含むベクター。
9. ＲＧＤ配列を含むアデノウイルスベクターである、請求項８に記載のベクター。
10. 請求項７に記載の抗プリオン抗体遺伝子によりコードされる抗体の可変領域と、マウス以外の動物の抗体の定常領域とを含む、抗プリオンキメラ抗体。
11. （１ａ）配列番号３０、３２および３４からなる群から選択される配列を含む核酸、
    （１ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（１ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
    （１ｃ）前記（１ａ）または（１ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
    （１ｄ）前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
    からなる群から選択される抗体重鎖遺伝子、および、
    （２ａ）配列番号３１、３３および３５からなる群から選択される配列を含む核酸、
    （２ｂ）遺伝子コードの縮重により前記（２ａ）の核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸、
    （２ｃ）前記（２ａ）または（２ｂ）の核酸の配列に変異を有するが、なお該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、および、
    （２ｄ）前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
    からなる群から選択される抗体軽鎖遺伝子によりコードされる、請求項１０に記載の抗プリオンキメラ抗体。
12. 請求項１０または１１に記載の抗プリオンキメラ抗体をコードする核酸。
13. 細胞に、異常プリオン増殖阻害活性を付与する遺伝子を導入することを含む、異常プリオン増殖阻害活性を有する細胞の作製方法。
14. 異常プリオン増殖阻害活性を付与する遺伝子が、抗プリオン抗体遺伝子である、請求項１３に記載の方法。
15. 細胞に、請求項８または９に記載のベクターを介して、請求項７に記載の遺伝子を導入することを含む、異常プリオン増殖阻害活性を有する細胞の作製方法。
16. 細胞が、間葉系細胞である、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
17. 請求項１３〜１６のいずれかの方法で作製された、異常プリオン増殖阻害活性を有する細胞。
18. 請求項１６に記載の方法を含む、プリオン病の治療のための剤の製造方法。
19. 抗プリオン抗体を放出する、プリオン病治療用持続製剤。
20. 抗プリオン抗体が、請求項７に記載の核酸によりコードされる抗体、および／または、請求項１０または１１に記載の抗プリオンキメラ抗体である、請求項１９に記載の製剤。
21. 浸透圧ポンプの形態である、請求項１９または２０に記載の製剤。
22. 抗プリオン抗体分泌細胞を含む、請求項１９または２０に記載の製剤。
23. 抗プリオン抗体分泌細胞が、請求項１７に記載の細胞である、請求項２２に記載の製剤。
24. 請求項１〜６のいずれかに記載の剤、請求項８または９に記載のベクター、請求項１０または１１に記載の抗プリオンキメラ抗体および請求項１９〜２３のいずれかに記載の製剤からなる群から選択される治療剤の治療有効量を投与することを含む、プリオン病を治療する方法。
25. 抗プリオン抗体を持続放出することを含む、プリオン病を治療する方法。
26. 請求項１９〜２３のいずれかに記載の製剤および／または請求項８もしくは９に記載のベクターを投与することを含む、請求項２５に記載の方法。
27. 抗プリオン抗体遺伝子を対象の細胞に導入することを含む、請求項２５に記載の方法。
28. 間葉系細胞の、プリオン病の病変部位に物質を送達するための剤の製造への使用。
29. 間葉系細胞を含む、プリオン病の病変部位に物質を送達するための剤。
30. 間葉系細胞を用いて、プリオン病の病変部位に物質を送達する方法。

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