JP6276818B2 - 特に移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防するための抗ＣＤ４抗体 - Google Patents

Description

本発明は、移植片およびその移植の分野に関する。特に、本発明は、改変された移植片、それを得る方法、ならびに関連する使用に関する。とりわけ、本発明は、免疫適格性の生細胞を含む移植片に関する。

さらなる局面において、本発明は、減少した数のT細胞エピトープによって免疫特徴が改変されている改変された抗ヒトCD4抗体に、および関連する内容に関する。

発明の背景
現在、同種間の造血幹細胞移植(HSCT)が、多くの血液学的悪性疾患患者にとって唯一の治癒的治療である。骨髄(Aschan, 2006)、末梢に動員された幹細胞(Bacigalupo et al., 2002)、および臍帯血(Kestendjieva et al., 2008)が、HSCTの一般的な供給源である。極めて高度な治療アプローチの使用にもかかわらず、HSCTは依然として、移植片対宿主病(GvHD)、感染症、静脈閉塞症、ドナー移植片の拒絶、および基礎疾患の再発などのいくつかの合併症に起因するかなりの死亡率に関連付けられている。

従来の免疫抑制薬の使用は、免疫系全体の抑制を招き、これにより、感染症または悪性腫瘍の発症の可能性が高まる。また、場合によっては、これらの薬の有効性は、低下し得るか、または無効にさえなり得る。例えば、ステロイド抵抗性GvHDは、同種間の造血幹細胞移植後の主な問題の内の1つである(Auletta et al., 2009;von Bonin et al., 2009)。GvHD治療のために、T細胞反応の主要要素に対する免疫抑制戦略は既に実施されている(von Bonin et al., 2009)。しかしながら、患者数の多さが理由で、これらの戦略はリウマチ学において(Kameda et al., 2009;Senolt et al., 2009)または腎臓移植後の患者のために主に使用された。急性GvHDの治療法の場合、大半の経験は、OKT3(登録商標)(Benekli M et al., 2006;Knop et al., 2007)またはインターロイキン2受容体抗体(Chen et al., 2004;Ji et al., 2005)に関して得られ、慢性GvHDの場合は抗CD20抗体(Bates et al., 2009)を用いたものが得られる。しかしながら、これらの抗体は、感染性合併症が発生するため、長期に渡る成功はあまり伴わず、毒性と関連している可能性がある。臨床応用のためにモノクローナル抗体を使用することは、ヒト化の不足(missing humanization)が原因で制限された。マウス抗体または他の種に由来する抗体は、ヒトにおいて著しく免疫原性であり得る、150kDaの範囲の分子量を有する巨大分子である。マウス抗ヒトモノクローナル抗体を適用した後、生命を脅かすアナフィラキシー性の合併症が観察された(Chester et al., 1995)。また、抗体の免疫原性能力は、それらのペプチド構造に依存する。例えば、IgG4アイソタイプは、補体活性化の能力が低いため、IgG1アイソタイプより免疫原性が低い。さらに、抗体のヒト化により、元のマウス対応物よりも免疫原性が低いキメラアイソタイプが生じる(Hosono et al., 1992)。現在まで、完全な(totally)ヒト抗体がキメラ抗体と比べて臨床的に有利であることを示す明らかなデータはない。

したがって、新しい細胞供給源の使用、抗体または他の生物学的物質を用いた治療を含む、代替のまたは改良された治療アプローチまたは治療手順の研究が依然として必要とされている。

1つの考えられるアプローチは、CD4陽性Tヘルパー細胞に注目している。該細胞は、ヒトの身体において病理学的免疫反応および生理学的免疫反応の両方を連係して働かせる。したがって、抗CD4抗体の適用によってCD4陽性Tヘルパー細胞に影響を及ぼすことにより、免疫系に関する目標とした調整が起こるはずである。

以前、マウス抗ヒトCD4モノクローナル抗体Max16H5(IgG1)が、自己免疫病患者での臨床応用において、または移植拒絶に対する保護療法として使用されていた(Chatenoud et al., 1995;Emmrich et al., 1991a;Emmrich et al., 1991b)。さらに、ヒト腎臓移植において、Max16H5(IgG1)は移植片拒絶を効果的に低下させる能力を有していた(Reinke et al., 1991;Reinke et al., 1995)。抗CD4特異的モノクローナル抗体の適用は、免疫活性の抑制だけでなく、トリプルトランスジェニックマウスモデルにおける破傷風トキソイドに対する寛容の誘導も起こし得る(Laub et al., 2002)。ラットモノクローナル抗体による寛容の誘導もまた、実証されている(Kohlhaw et al., 2001)。前記モノクローナル抗体Max16H5はEP 1454137においても開示されている。EP 1454137は、参照により本明細書に組み入れられ、特に、インビボ診断薬を製造するための、ヒトCD4分子に対する特異性を有する標識リガンドの使用に関する。

Tヘルパー細胞上のCD4+分子は、抗原提示細胞(APC)上のHLA分子の定常領域に直接結合して、完全なT細胞活性化を可能にする。枯渇させないモノクローナル抗体によってこの結合の邪魔をすると、全体的な立体構造の妨害によって、APCとT細胞の細胞間接触を短くすることによって(Fehervari et al., 2002)、またはタンパク質チロシンリン酸化の阻害による負のシグナルの誘導(Harding et al., 2002) もしくはT細胞アネルギーの誘導(Madrenas et al., 1996)によって、この活性化が阻害され得る。ここでは、Fehervari et al.およびHarding et al.は、本発明の方法および使用を開示していない。特に、彼らは幹細胞移植片を抗CD4抗体と共にインキュベートしなかったが、脾臓(マウス)および軟膜(ヒト)から分離されたCD4+細胞を単離した。

さらに、WO 2004/112835は特に、CD4に対する抗体を含む抗体の使用を伴う方法を説明している。ここでは、免疫寛容を誘導する目的で長期間に渡って調節性T細胞を生じさせるために、抗CD4抗体が使用された。

上記の点を考慮すると、先行技術の方法論の不都合な点をなくし得る有望な代替の治療アプローチおよび改良された治療アプローチがそれぞれ依然として必要とされている。

さらに、治療用タンパク質の有効性が、その治療用タンパク質に対する不必要な免疫反応によって制限される多くの例がある。いくつかのマウスモノクローナル抗体は、いくつかのヒト疾患の状況において治療法として有望であったが、ある種の場合においては、かなりの程度のヒト抗マウス抗体(HAMA)応答が誘導されたために、失敗した(Schroff et al. (1985))。モノクローナル抗体に関して、HAMA応答を軽減させようとして、いくつかの技術が開発されてきた(例えば、WOA9106667を参照されたい)。一般に、これらの組換えDNAアプローチは、最終的な抗体構築物中のマウス遺伝情報を減少させると同時に、その最終構築物中のヒト遺伝情報を増加させた。それにもかかわらず、いくつかの場合において、結果として得られた「ヒト化」抗体は依然として、患者において免疫応答を誘発した(Isaacs J.D. (1990))。

抗体は、免疫応答がそれに対して開始される場合がある治療物質として投与される唯一のクラスのポリペプチド分子ではない。ヒト由来で、かつヒト内に存在するのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質でさえ、依然としてヒトにおいて免疫応答を誘導する場合がある。

免疫応答の誘導の鍵となるのは、MHCクラスII分子上での提示を介してT細胞の活性を刺激できるペプチド、いわゆる「T細胞エピトープ」のタンパク質内での存在である。

MHCクラスII分子は、ヘルパーT細胞の選択および活性化において中心的役割を果たす高度な多型性を示すタンパク質群である。ヒト白血球抗原群DR(HLA-DR)が、このタンパク質群の優勢なアイソタイプであるが;しかしながら、アイソタイプHLA-DQおよびHLA-DPは同様の機能を果たす。ヒト集団において、個体は、2〜4個のDR対立遺伝子、2個のDQ対立遺伝子および2個のDP対立遺伝子を有する。いくつかのDR分子の構造が解明されており、これらは、ペプチドのアミノ酸側鎖とかみ合ういくつかのポケット(ポケット残基)を有する、端の開いたペプチド結合溝として現れる(Stern et al. (1994))。クラスII分子の様々なアロタイプを同定する多型性は、ペプチド結合溝内のペプチドに対する異なる結合表面の広範な多様性に寄与し、かつ集団レベルでは、外来タンパク質を認識し、病原生物に対する免疫応答を開始する能力に関して最大限の柔軟性を保証する。

治療用タンパク質に対する免疫応答は、MHCクラスIIペプチド提示経路を介して進行する。その際、外来性タンパク質は、抗原提示細胞(APC)によって貪食され、DR、DQ、またはDP型のMHCクラスII分子と結合して細胞表面で提示されるように加工される。MHCクラスII分子は、とりわけマクロファージおよび樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞によって発現される。T細胞表面の同族T細胞受容体によるMHCクラスIIペプチド複合体の結合は、CD4分子のような他の特定の共受容体の交差結合と相まって、T細胞内の活性化状態を誘導し得る。活性化により、サイトカインが放出されて、さらに、B細胞のような他のリンパ球を活性化して抗体を産生させるか、または完全な細胞性免疫応答としてT キラー細胞を活性化させる。

T細胞エピトープの同定は、WO98/52976およびWO00/34317において認識されているとおり、エピトープ除去への最初の段階である。これらの教示において、予測されたT細胞エピトープは、関心対象のタンパク質内での適切な判断のアミノ酸置換を用いて除去される。コンピューター技術に加えて、合成ペプチドがMHCクラスII分子に結合する能力を測定するためのインビトロ方法も存在する。例示的な方法は、MHCクラスII結合表面の供給源として、所定のMHCアロタイプのB細胞株を使用し、この方法はMHCクラスIIリガンド同定に応用され得る(Marshall et al. (1994);O'Sullivan et al. (1990);Robadey et al. (1997))。しかし、このような技術は、多種多様なMHCアロタイプに対する複数の潜在的エピトープのスクリーニングには適合せず、それらはまた、結合ペプチドがT細胞エピトープとして機能する能力を確認することもできない。

近年、合成ペプチドと組み合わせた組換えMHC分子の可溶性複合体を活用する技術が、使用されるようになってきた (Kern et al. (1998);Kwok et al (2001))。これらの試薬および手順は、特定のMHC-ペプチド複合体に結合できるヒト対象または実験用動物対象由来の末梢血試料からT細胞クローンの存在を同定するのに使用され、多種多様なMHCアロタイプに対する複数の潜在的エピトープをスクリーニングするのには適合していない。

CD4は、胸腺細胞の大多数および末梢性T細胞の一部を含むTリンパ球系の細胞において主に発現される表面糖タンパク質である。一部の非リンパ系細胞によっても低レベルのCD4が発現されるが、このように広がった細胞分布の機能上の重要性は不明である。成熟したT細胞において、CD4は、抗原提示細胞において発現されるMHCクラスII分子との相互作用を通じて、共認識機能を果たす。CD4+T細胞は、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、および寄生虫感染に対するT依存性応答の間にT細胞およびB細胞の機能を調節するヘルパーサブセットを主に構成する。

自己免疫病の発生中、特に自己抗原に対する寛容が機能しない場合、CD4+T細胞は、関節および組織の破壊をもたらす炎症反応を引き起こすもととなる。これらのプロセスは、造血系の炎症細胞の動員、抗体、炎症性サイトカイン、およびメディエーターの産生によって、ならびにキラー細胞の活性化によって促進される。

CD4抗体は、当技術分野において公知である。例示的なCD4抗体であるモノクローナルマウス抗ヒトCD4抗体30F16H5が、DE 3919294において開示されている。前記抗体は、ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502から入手可能である。

マウス抗CD4抗体の免疫原性を低下させるために、ヒト免疫グロブリンによって提供されるフレームワーク中にマウス抗体の超可変領域をクローニングすることによって、ヒト化抗CD4抗体が以前に人工的に作製されている(例えば、Boon et al. (2002))。マウス抗CD4と比べて免疫原性を低下させるものの、これらのヒト化抗体はいくつかの場合において、依然として免疫応答を誘発した。

さらに、抗体のこのような「ヒト化」が、所与の標的に対する親和性が低下したまたはかなり低下した抗体をしばしばもたらすことが、当技術分野において公知である。

したがって、本発明のさらなる目的は、マウス抗CD4抗体に対する免疫反応を軽減するために、抗ヒトCD4抗体の改変された形態を提供することである。特に、ヒト対象において免疫応答を誘導する能力を低下させ得るかまたは該能力をなくさせ得る、減少した数のT細胞エピトープを有する抗CD4抗体を提供することが望ましい。このようなタンパク質は、非改変抗体に対する免疫応答を開始できるヒト対象内での循環時間が長くなると予想することができ、抗CD4のいくつかの適応症の場合のような慢性疾患状況または再発性疾患状況において特に有益であり得る。他の研究は、「ヒト化」形態を含む抗CD4抗体分子を提供したが、これらの教示のどれも、このタンパク質の免疫原性特性に対するT細胞エピトープの重要性を認識もせず、本発明のスキームに従った特殊かつ制御された方法で該特性に直接影響を及ぼすことを考えてもいなかった。

1つの局面において、本発明は、(a)免疫細胞を含む細胞移植片を抗CD4抗体と共にインキュベートする段階であって、該インキュベートする段階が1分間〜7日間実施される、段階、(b)該移植片から未結合抗体を除去する段階を含む、免疫細胞を含む細胞移植片を改変するインビトロ方法に関する。

別の局面において、本発明は、(i)本発明のインビトロ方法に従って得ることができ;かつ/または(ii)移植片の接触可能なCD4エピトープの40％〜100％に結合された抗CD4抗体を含む、免疫細胞を含む改変された細胞移植片に関する。

別の局面において、本発明は、医薬において使用するための、特に、移植によって治療可能な1種または複数種の疾患を対象において治療する方法において使用するための、本発明の免疫細胞を含む改変された細胞移植片に関する。

別の局面において、本発明は、免疫細胞を含む細胞移植片のインビトロでの改変のための抗CD4抗体の使用に関し、この改変は、該移植片を該抗体と共に1分間〜7日間インキュベートする段階を含む。

他の局面において、本発明は、特許請求の範囲および下記において定義する方法、使用、および移植片に関する。他の局面において、本発明は、本明細書において開示する特定の抗体に関する。

本発明のいわゆるさらなる局面は、次のとおりに要約される。本発明のこのさらなる局面の1つの面は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン(VH)のCDRの外側に位置する少なくとも1つのT細胞エピトープが、該免疫グロブリン可変ドメインから除去される、該免疫グロブリン可変ドメインおよび軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン(VL)を含む抗ヒトCD4抗体に関し、特に、下記に定義する抗ヒトCD4抗体に関する。本発明の前記のさらなる局面の好ましい態様において、前記抗体は、ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された抗体のCDRを有するか、または前記抗体は、SEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 12のCDRを有する。特定の態様において、重鎖免疫グロブリン可変ドメインは、SEQ ID NO: 4、6、8、および10からなる群より選択される配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、SEQ ID NO: 14、16、18、および20からなる群より選択される配列を含む。別の面において、本発明の前記のさらなる局面は、前記抗体および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。別の面において、本発明の前記のさらなる局面はまた、対象を治療的に処置するための医薬を製造するための前記抗体の使用および前記抗体を用いた治療方法に関する。別の面において、本発明の前記のさらなる局面は、前記抗体の重鎖および/または軽鎖の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸、ならびに該核酸を含むベクターであって、特に該核酸が発現制御配列に機能的に連結されている、ベクターに関する。本発明の前記のさらなる局面はさらに、前記核酸および/または少なくとも1つの前述のベクターを含む宿主細胞、ならびに本発明の前記のさらなる局面の抗体を調製する方法であって、適切な発現制御配列の制御下での発現を可能にする条件下で前述の宿主細胞を培養する段階、および該抗体を細胞の培地から精製する段階を含む、方法にも関する。本発明の前記のさらなる局面はまた、発現ベクターpANTVhG4およびpANTVκを用いて得られる抗ヒトCD4抗体にも関する。一般に、前記のさらなる局面に関連して説明される定義、面、および態様はまた、本発明全般に適用され得ることが想定される。好ましくは、前記のさらなる局面において、抗CD4抗体の特異性および作用様式は改変による影響を受けない。
[本発明1001]
(a)免疫細胞を含む細胞移植片を抗CD4抗体と共にインキュベートする段階であって、該インキュベートする段階が1分間〜7日間実施される、段階、
(b)該移植片から未結合抗体を除去する段階
を含む、
免疫細胞を含む細胞移植片を改変するインビトロ方法。
[本発明1002]
前記インキュベートする段階が、
(i)1分間〜150分間、具体的には5分間〜150分間、より具体的には10分間〜150分間、より具体的には30分間〜150分間、より具体的には40分間〜120分間、より具体的には45分間〜90分間、特に50分間〜70分間;または
(ii)150分間〜7日間、具体的には150分間〜5日間、より具体的には150分間〜3日間、より具体的には150分間〜1日、特に150分間〜8時間
実施される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記インキュベートする段階が、0.1μg〜100mgの抗体量を用いて、
特に、
(i)前記移植片が細胞懸濁液である場合、0.1μg/mlの細胞懸濁液〜150μg/mlの細胞懸濁液、具体的には7μg/mlの細胞懸濁液〜100μg/mlの細胞懸濁液、より具体的には30μg/mlの細胞懸濁液〜100μg/mlの細胞懸濁液、特に40μg〜60μg/mlの細胞懸濁液という抗体濃度を用いて;または
(ii)該移植片が組織もしくは器官である場合、0.1mg〜10mg、具体的には1mg〜10mg、より具体的には2mg〜9mg、より具体的には3mg〜8mg、特に4mg〜6mgという抗体量を用いて、
実施される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
(i)前記移植片を移植した際に、GvHD、ドナー移植片拒絶、および器官拒絶からなる群のいずれか1つ、特にGvHDが起こる可能性を低下させるため;
(ii)改変された該移植片を移植した際に、レシピエントの組織に対する移植された免疫担当細胞内での寛容を獲得するため;
(iii)改変された該移植片を移植した際に、改変された該移植片に対する該レシピエントの組織内での寛容もしくは部分的寛容を獲得するため;ならびに/または
(iv)該移植片内での細胞活性化を静めるため
のものである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記移植片が、
(i)細胞懸濁液、組織、および器官からなる群より選択され;かつ/または
(ii)幹細胞を含む、
前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記移植片が、骨髄細胞、非付着性骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、ワルトン膠質由来細胞、胎盤由来細胞、毛根由来細胞および/または脂肪組織由来細胞を含む、細胞懸濁液;リンパ球、単球および/またはマクロファージを含む、細胞懸濁液;幹細胞を含む組織;幹細胞を含む器官;免疫細胞を含む組織;ならびに免疫細胞を含む器官からなる群より選択される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
(i)本発明1001〜1006のいずれかの方法に従って得ることができ;かつ/または
(ii)改変された細胞移植片の接触可能なCD4エピトープの40％〜100％に結合された抗CD4抗体を含む、
免疫細胞を含む該細胞移植片。
[本発明1008]
医薬において使用するための、本発明1007の改変された移植片。
[本発明1009]
移植によって治療可能な1種または複数種の疾患を対象において治療する方法において使用するための、本発明1007の改変された移植片。
[本発明1010]
(i)細胞懸濁液、組織、および器官からなる群より選択され;かつ/または
(ii)幹細胞を含む、
本発明1007〜1009のいずれかの改変された移植片または使用するための改変された移植片。
[本発明1011]
骨髄細胞、非付着性骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、ワルトン膠質由来細胞、胎盤由来細胞、毛根由来細胞および/または脂肪組織由来細胞を含む、細胞懸濁液;リンパ球、単球および/またはマクロファージを含む、細胞懸濁液;幹細胞を含む組織;幹細胞を含む器官;免疫細胞を含む組織;ならびに免疫細胞を含む器官からなる群より選択される、本発明1010の改変された移植片または使用するための改変された移植片。
[本発明1012]
前記治療が、
(i)前記移植片を移植した際に、GvHD、ドナー移植片拒絶、および器官拒絶からなる群のいずれか1つを発症する可能性、特にGvHDが起こる可能性を低下させることを含意し;かつ/または
(ii)改変された該移植片を移植した際の、レシピエントの組織に対する移植された免疫担当細胞内での寛容を含意し;
(iii)改変された該移植片を移植した際の、改変された該移植片に対するレシピエントの組織内での寛容もしくは部分的寛容を含意し;かつ/または
(iv)該移植片内での細胞活性化を静めるためのものである、
本発明1009〜1011のいずれかの使用するための改変された移植片。
[本発明1013]
前記移植片が細胞懸濁液であり、かつ2×10⁶個の細胞〜2×10¹⁰個の有核細胞、具体的には4×10⁶〜1×10⁹個の有核細胞、より具体的には1×10⁷〜1×10⁸個の有核細胞という量が前記対象に与えられる、本発明1009〜1012のいずれかの使用するための改変された移植片。
[本発明1014]
前記抗CD4抗体が、
(i)Max16H5、OKT4A、OKTcdr4a、cMT-412、YHB.46からなる群より選択され、特に、Max16H5であるか;または
(ii)抗体30F16H5であるか;または
(iii)アクセッション番号ECACC 88050502で寄託された細胞株から得ることができるか;または
(iv)2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞株MAX.16H5/30F16H5から得ることができるか;または
(v)抗体16H5.chimIgG4であるか;または
(vi)2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞株CD4.16H5.chimIgG4から得ることができるか;または
(vii)抗体16H5.chimIgG4のVHおよびVKを含む、抗体であるか;または
(viii)2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞株CD4.16H5.chimIgG4から得ることができる抗体のVHおよびVKを含む、抗体であるか;または
(ix)具体的には組合せがVH1/VK1、VH2/VK2、VH4/VK2、およびVH4/VK4より選択され、特に該組合せがVH2/VK2である、図12で開示されているVHおよび図13で開示されているVKの任意の該組合せを含む抗体である、
前記本発明のいずれかの方法、改変された移植片、または使用するための改変された移植片。
[本発明1015]
前記移植片が、可溶性生物活性分子と共に、
具体的には、免疫抑制、免疫寛容、および/または調節性T細胞の形成を促進する作用物質と共に、
特に、Il-2、TGF-β、ラパマイシン、レチノイン酸、4-1BBリガンド、および抗CD28抗体からなる群より選択される作用物質、またはその任意の組合せと共に
さらにインキュベートされる、前記本発明のいずれかの方法、改変された移植片、または使用するための改変された移植片。
[本発明1016]
(i)抗体16H5.chimIgG4;
(ii)2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞株CD4.16H5.chimIgG4から得ることができる、抗体;
(iii)抗体16H5.chimIgG4のVHおよびVKを含む、抗体;
(iv)2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞株CD4.16H5.chimIgG4から得ることができる抗体のVHおよびVKを含む、抗体;
(v)組合せがVH1/VK1、VH2/VK2、VH4/VK2、およびVH4/VK4より選択され、特に該組合せがVH2/VK2である、図12で開示されているVHおよび図13で開示されているVKの該組合せを含む抗体
からなる群より選択される、抗CD4抗体。

移植片の抗体インキュベーションならびにヒトなどの対象へのその後の移植の原理を概略的に示す。 安定なC57Bl/6をバックグラウンドとするドナーとしてのトリプルトランスジェニックマウス(TTG)の説明を含む。TTGマウスはヒトCD4およびHLA-DRを発現し、マウスCD4分子がノックアウトされている。これにより、移植後の特殊なヒト表面分子の測定(キメラ化の独自の分析)およびマウスにおける抗ヒトCD4抗体の直接的試験が可能になる。 実験計画の説明を示す。骨髄細胞および脾細胞をTTGマウスから採取し、混合し、抗ヒトCD4抗体の前処理ありまたは前処理なしで、致死的な放射線を照射したTTGマウスに移植した。C57Bl/6野生型マウス由来のドナー細胞を用いることによって、これらの実験を比較した。移植後の治療的効果(生存、器官修復、キメラ化、GvHD)を調査した。 抗CD4抗体のプレインキュベーションを行うまたはプレインキュベーションを行わない、Balb/cマウスへのTTGマウス由来BM/脾細胞の移植後の生存率を示す。前処理した細胞を与えられたマウスにおいて、生存率は有意に上昇した(0％から83％に上昇、p<0.001)。野生型C57Bl/6 マウスをドナーとして使用してもこの効果を繰り返すことができなかったため、観察された効果はBalb/cマウスへのTTGからの移植に特有であった。この結果は、ヒトCD4に対する抗体の特異的結合を示し、したがって、野生型ドナー細胞は影響を受けない。 抗CD4抗体のプレインキュベーションを行う(A+C)またはプレインキュベーションを行わない(A+B)、Balb/cマウスへのTTGマウス由来BM/脾細胞の移植後の造血の回復を図示する。前処理した細胞を与えられたマウスにおいて、造血系は移植後に初期値まで回復した。プレインキュベートされた細胞を用いずに移植されたレシピエントと比べて、単球および顆粒球の復元は、リンパ球復元より前に起こった(C)。 抗CD4抗体のプレインキュベーションを行うまたはプレインキュベーションを行わない、Balb/cマウスへのTTGマウス由来BM/脾細胞の移植後のGvHDスコア(体重を含む。Cooke et al., 1996による)を示す。前処理した細胞を与えられたマウスにおいて、抗体を与えられたマウスのGvHDスコアは、抗CD4抗体の前処理なしの骨髄および脾細胞を与えられた動物のスコアよりも低かったことから、GvHDが発症していないことが示唆された。また、免疫組織学的解析によっても移植を確認した。骨髄腔において、移植された動物における一般的な形態の造血およびヒトCD4発現T細胞の安定な移植が認められた。 抗ヒトCD4抗体のプレインキュベーションを行わない、Balb/cマウスへのTTGマウス由来BM/脾細胞の移植後のヒトCD4、マウスCD4、およびマウスCD8の移植に関する実験に関する。移植後12日目に、ヒトCD4細胞、マウスCD4細胞、およびマウスCD8細胞を安定に検出することができ、マウスは重度のGvHDを発症している。 抗ヒトCD4抗体のプレインキュベーションを行わない、Balb/cマウスへのTTGマウス由来BM/脾細胞の移植後のヒトHLA-DR3およびH-2KbというTTG/C57Bl/6のマウスMHCクラスIの移植に関する実験に関する。移植後12日目に、ヒトHLA-DR3およびTTG/C57Bl/6のMHCクラスI(H-2Kb)、ならびにマウスは重度のGvHDを発症している。 抗ヒトCD4抗体のプレインキュベーションを行った、Balb/cマウスへのTTGマウス由来BM/脾細胞の移植後の、ヒトCD4、マウスCD8の移植、およびTTG/C57Bl/6のマウスCD4(H-2Kb)の減少に関する実験に関する。移植後、GvHDの発症を伴わない安定な移植を観察することができた。 抗CD4抗体のプレインキュベーションを行うまたはプレインキュベーションを行わない、Balb/cマウスへのTTGマウス由来BM/脾細胞の移植後の生存率を示す。IgG1アイソタイプ対照抗体を用いた場合、GvHD予防効果を観察することができなかった。 改変された軽鎖および重鎖を哺乳動物細胞において発現させるための例示的なベクターを示す。dhfrは、漸増濃度のメトトレキサートに細胞を曝露させることによる遺伝子増幅のために使用されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子であり;CMV PはCMV IEプロモーターである。 例示的な改変された重鎖可変領域のDNA配列およびアミノ酸配列を示す。 例示的な改変された重鎖可変領域のDNA配列およびアミノ酸配列を示す。 例示的な改変された重鎖可変領域のDNA配列およびアミノ酸配列を示す。 例示的な改変された重鎖可変領域のDNA配列およびアミノ酸配列を示す。 例示的な改変された重鎖可変領域のDNA配列およびアミノ酸配列を示す。 例示的な改変された軽鎖可変領域のDNA配列およびアミノ酸配列を示す。 例示的な改変された軽鎖可変領域のDNA配列およびアミノ酸配列を示す。 例示的な改変された軽鎖可変領域のDNA配列およびアミノ酸配列を示す。 例示的な改変された軽鎖可変領域のDNA配列およびアミノ酸配列を示す。 例示的な改変された軽鎖可変領域のDNA配列およびアミノ酸配列を示す。 マウス抗CD4親抗体と比べた、キメラ抗ヒトCD4抗体の相対的結合を示す。 マウス抗CD4親抗体およびキメラ抗CD4抗体と比べた、例示的な改変された抗CD4抗体の相対的結合を示す。 マウス抗CD4親抗体およびキメラ抗CD4抗体と比べた、例示的な改変された抗CD4抗体の相対的結合を示す。 マウス抗CD4親抗体およびキメラ抗CD4抗体と比べた、例示的な改変された抗CD4抗体の相対的結合を示す。

好ましい態様の詳細な説明
本発明は、例えば、インビボでの直接的適用を避ける、免疫細胞を含む細胞移植片の抗体によるインビトロ処理に関する。すなわち、本発明者らは、例えば、骨髄移植片を移植する前に、免疫細胞を含むこれらの細胞移植片を抗ヒトCD4抗体と共に(好ましくは短期間)インキュベーションすることにより、アイソタイプ対照または未処理の対照と比べて、移植後のGvHDの発症が予防されることを示すことができた。

先行技術の研究とは対照的に、提示する研究は、例えば移植片対宿主病(GvHD)を予防するための寛容誘導または免疫抑制を目指した、T細胞、特にCD4細胞を含む細胞懸濁液のような(幹細胞)移植片の短期間インキュベーションを例えば扱う。

理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明者らは、改変された移植片を得るための、CD4陽性(免疫)細胞を含む(幹細胞)移植片の抗CD4抗体インキュベーションおよびそれに続く未結合抗体の除去を考察し、その際、抗体で標識された細胞はその抗体によって選択的に不活性化されるか、またはそれらの細胞が特異的な抗原に遭遇するとすぐに不活性化されるかもしくは調節性細胞になるように準備されており、その結果、例えばGvHDが起こらない。抗CD4抗体は、CD4を有する免疫細胞(例えばリンパ球)に結合し、それによってその有益な効果を発揮すると想定される。さらに、本明細書において説明する好ましい抗CD4抗体は、(a)特異的なエピトープに結合するので、例えば、その後の不活性化のために細胞を準備するために、特に有利な特徴を示すことがあり得るとみなされている。

当業者には容易に明らかであるとおり、遊離抗CD4抗体、すなわち移植片上に位置する抗原に結合しない抗CD4抗体の投与を実質的に減少または回避することは、有利である。一般に、本発明は、次の利点の内の1つまたは複数に関係しているとみなされる:(i)レシピエントへの抗体の直接的な適用が必要とされないこと;(ii)T細胞、特にCD4細胞を含む細胞懸濁液、組織、および器官などの移植片の短期間インキュベーション;（iii)本発明の移植片を移植した後のGvHD予防;(iv)本発明の移植片を移植した後の他の免疫学的合併症(例えばサイトカイン放出症候群)の予防;(v)従来の免疫抑制薬の回避または減少によるコスト削減および全身投与と比べて顕著な抗体の減量;(vi)本発明の移植片の移植を受けた患者の生存率の向上;(vii)免疫学的合併症が予想されるため通常の移植片を移植できない、高齢患者などの患者も対象とした移植片移植が容易になること;ならびに(viii)移植のためのHLA不一致ドナーまたは本発明を用いない場合よりも少ない良好なHLA一致の使用。

第1の局面において、本発明は、(a)免疫細胞を含む細胞移植片を抗CD4抗体と共にインキュベートする段階であって、特に該インキュベートする段階が1分間〜7日間実施される、段階、(b)該移植片から未結合抗体を除去する段階を含む、免疫細胞を含む細胞移植片を改変するインビトロ方法に関する。

抗体、また抗CD4抗体は、通常、当技術分野において周知である。本明細書において使用される場合、「抗体」とは、とりわけ、抗原に特異的に合体するか、相互作用するか、またはそうでなければ結合することができる免疫グロブリンファミリーのタンパク質を意味し、抗原への抗体の該合体、相互作用、またはそうでなければ結合(例えば結び付く)は、相補性決定領域(CDR)によって媒介される。同様に、「抗原」という用語は本明細書において、前記抗体と特異的に合体するか、相互作用するか、またはそうでなければ結合することができる物質を意味するのに使用される。本発明の抗CD4抗体という文脈において、抗原はCD4、特にヒトCD4であることが意図される。

本明細書において使用される場合、「CDR」という用語は、抗体の「相補性決定領域」を、すなわち、抗体特異性の決定に寄与する、免疫グロブリン可変ドメイン内の超可変領域の内の1つを意味する。CDRは、当業者には周知である。典型的には、重鎖免疫グロブリン可変ドメインおよび軽鎖免疫グロブリン可変ドメインのどちらも3つのCDRを含む。

本発明の文脈において、「抗体」という用語は、例えば、Fv断片、Fab断片、Fab'断片、およびF(ab')2断片を含む抗体断片にも関するとみなされる。このような断片は、標準的な方法によって調製され得る(例えば、参照により本明細書に組み入れられるColigan et al., 1991-1997)。本発明はまた、当技術分野において周知である、様々な組換え形態の抗体由来分子種も企図する。このような種には、VHドメインおよびVLドメインを連結するペプチドリンカーを含む単鎖Fv型(例えばscFv)、または鎖間ジスルフィド結合によって安定化され、VHドメインおよびVLドメインの結合を容易にするために設計された付加的なシステイン残基を含むFv(dsFv)を含む、安定化されたFv断片が含まれる。同様に、他の組成物も当技術分野でよく知られており、「ミニボディ」と呼ばれる種、および単一の可変ドメイン「dAb」が含まれ得る。他の種、すなわち、例えば、二量体形成ドメイン(例えば「ロイシンジッパー」)の遺伝子操作によるか、または化学修飾戦略にもよる、複数の抗原結合部位を有する種は、改変抗体V領域ドメインの価数を増やすための手段をさらに含んでもよい。さらに、「抗体」という用語は、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ、またはテトラボディなどscFvの多量体、タンダブ(tandab)、フレキシボディ(flexibody)、二重特異性抗体、およびキメラ抗体にも関し、これらはすべて当技術分野において公知である。本明細書において使用される場合、抗体は、任意の二価抗体または多価抗体も含むとみなされる。これらはまた、任意の抗体誘導体および当業者に公知である他の任意の誘導体も含む。

いくつかの態様において、抗体はポリクローナル抗体である。好ましい態様において、抗体はモノクローナル抗体である。

本発明によれば、「抗CD4抗体」という用語は、CD4に結合する能力を有する抗体を意味する。好ましくは、抗CD4抗体は抗ヒトCD4抗体である。「CD4」または「分化クラスター4」とは、当業者に周知であるタンパク質、より正確には表面糖タンパク質を意味する(Bowers et al., 1997を参照されたい)。本発明の文脈において、CD4はまた、完全長CD4の断片またはCD4の別の様式で改変された形態も意味してよい。ただし、この断片または別の様式で改変された形態が、本発明の抗体に対して抗原として引き続き機能することを条件とする。

好ましい抗CD4抗体は、Max16H5、OKT4A、OKTcdr4a、cMT-412、YHB.46からなる群より選択される。最も好ましくは、該抗体はMax16H5である。Max16H5を産生させるための細胞は、アクセッション番号ECACC 88050502で、ECACC(European Collection of Cell Cultures)に寄託されている。また、該抗体は、参照により本明細書に組み入れられるDE 3919294においても開示されている。本明細書において使用される場合、抗体「Max16H5」はまた、「Max.16H5」、「MAX16H5」、もしくは「MAX.16H5」、またはさらに「30F16H5」と呼ばれてもよい(ここで、後者の名称は、該抗体を産生する寄託された細胞の名称でもある)。また、Max.16H5は、細胞株MAX.16H5/30F16H5から得ることもできる。

本発明で使用するためのさらに好ましい抗CD4抗体は、16H5.chimIgG4である。本明細書において使用される場合、該抗体はまた、「16H5.chim」または「CD4.16H5.chimIgG4」と呼ばれてもよい(ここで、後者の名称は、該抗体を産生する寄託された細胞の名称でもある)。16H5.chimIgG4は、細胞株CD4.16H5.chimIgG4から得ることができる。

詳細には、本発明に対する文脈におけるある種の好ましい抗CD4抗体は、例えば、以下の生物学的材料寄託物のいずれかから得ることができる:
-欧州細胞培養物コレクション(European Collection of Cell Cultures)に寄託されたアクセッション番号ECACC 88050502の寄託物;
-2011年12月2日にDSMZに寄託された寄託物「MAX.16H5/30F16H5」;
-2011年12月2日にDSMZに寄託された寄託物「CD4.16H5.chimIgG4」。
これらの寄託物はすべて、細胞または細胞株をそれぞれ含み、これらから、本発明に対する文脈における特定の抗CD4抗体を得ることができる。寄託物ECACC 88050502は、例えば、特許出願DE 3919294においても説明されている。

本発明の方法、改変された移植片、または使用するための改変された移植片のいくつかの態様において、前記抗CD4抗体は、(i)Max16H5、OKT4A、OKTcdr4a、cMT-412、YHB.46からなる群より選択され、特に、Max16H5であり;かつ/または(ii)抗体30F16H5であり;かつ/または(iii)アクセッション番号ECACC 88050502で寄託された細胞株から得ることができ;かつ/または(iv)2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞株MAX.16H5/30F16H5から得ることができ;かつ/または(v)抗体16H5.chimIgG4であり;かつ/または(vi)2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞株CD4.16H5.chimIgG4から得ることができ;かつ/または(vii)抗体16H5.chimIgG4のVHおよびVKを含む抗体であり;かつ/または(viii)2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞株CD4.16H5.chimIgG4から得ることができる抗体のVHおよびVKを含む、抗体であり;かつ/または(ix)具体的には組合せがVH1/VK1、VH2/VK2、VH4/VK2、およびVH4/VK4より選択され、特に該組合せがVH2/VK2である、図12で開示されているVHおよび図13で開示されているVKの任意の該組合せを含む抗体である。

特定の態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は「MAX.16H5」である。特定の態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、ECACC 88050502の細胞から得ることができる抗体である。特定の態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、2011年12月2日にDSMZに寄託された、本出願者らが作製した生物学的材料の寄託物から得ることができる抗体である。特定の態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、2011年12月2日にDSMZに本出願者らが寄託した細胞から得ることができる抗体である。特定の態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、欧州細胞培養物コレクション(European Collection of Cell Cultures)に寄託されたアクセッション番号ECACC 88050502の寄託物から得ることができる抗体である。特定の態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞「MAX.16H5/30F16H5」から得ることができる抗体である。特定の態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞「CD4.16H5.chimIgG4」から得ることができる抗体である。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、図12のVH1を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、図12のVH2を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、図12のVH4を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、図13のVK1を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、図13のVK2を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、図13のVK4を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 10を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 8を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 4を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 20を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 18を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 14を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、図12のVH1および/または図13のVK1を含む。いくつかの特に好ましい態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、図12のVH2および/または図13のVK2を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、図12のVH4および/または図13のVK2を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、図12のVH4および/または図13のVK4を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 10および/またはSEQ ID NO: 20を含む。一部のいくつかの特に好ましい態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 8および/またはSEQ ID NO: 18を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 4および/またはSEQ ID NO: 18を含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 4および/またはSEQ ID NO: 14を含む。

いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、抗体16H5.chimIgG4のVHおよびVKを含む。いくつかの態様において、本発明で使用される抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 12のCDRを含む。他の好ましい態様において、本発明で使用するための抗CD4抗体は、以下に詳細に開示する本発明の前記のさらなる局面の、またはこの局面による抗CD4抗体である。好ましくは、該抗CD4抗体は、その態様において説明されるとおりであり、好ましい態様が特に好ましい。一般に、本発明で使用される抗CD4抗体は、本明細書において開示される任意の抗CD4抗体でよい。

一定の好ましい態様において、抗CD4抗体は、CD4分子の第1および/または第2のドメインを認識する抗体より選択される。一定の好ましい態様において、抗CD4抗体は、Max16H5と同じCD4分子ドメインを認識する抗体より選択される。

本明細書において使用される場合、「未結合の抗体」とは、インキュベートする段階の後に、移植片に結合されていない抗体を意味する。言い換えると、これは、移植片上のリガンドに本質的に結合していない抗体を意味する。

本明細書において使用される場合、「インビトロ方法」とは、生きている対象の体外で実施される方法を意味する。これは特に、組織もしくは器官を含むかまたは組織もしくは器官である移植片の場合のような「エクスビボ方法」も含むが、特に、生きている対象の体内で実施される「インビボ方法」は除外する。

好ましくは、本発明によれば、インキュベートすること(段階)は、前記抗体の前記移植片への結合を可能にするのに十分な時間、実施される。好ましくは、該インキュベートする段階は、前記移植片の接触可能なCD4エピトープの40％〜100％、具体的には50％〜100％、具体的には60％〜100％、具体的には70％〜100％、より具体的には80％〜100％、より具体的には90％〜100％、より具体的には95％〜100％、より具体的には99％〜100％への抗CD4抗体の結合を可能にするのに十分な時間、実施される。最も好ましくは、前記インキュベートする段階の後、抗CD4抗体は、前記移植片の接触可能なCD4エピトープのほぼすべてに結合する。

適切なインキュベーション期間は、当業者によって容易に決定される。通常、適切なインキュベーション期間は、使用される移植片のタイプに依存する。好ましいインキュベーション期間は、使用する抗体の量にも依存し得る。一般に、例えば移植片が細胞懸濁液である場合、例えば移植片が器官である場合よりも、必要とされるインキュベーション期間は短いと考えられる。

一般に、移植片が組織もしくは器官を含むかまたは組織もしくは器官である場合、抗体が、例えば拡散によって個々の区画に輸送されるのを可能にするために、より長いインキュベーション期間が好ましい。

さらに、いずれにしても、当業者は、例えばフローサイトメトリーを含み得る当技術分野内で周知の方法に従って、抗CD4抗体の結合(の状態)を容易に試験することができる。

一般に、インビトロ処理が原因で移植片に起こり得る何らかの損傷を最小限にするためには、長いインキュベーション期間よりも短いインキュベーション期間が好ましい。

本発明によれば、前記インキュベートする段階は、例えば、1分間〜7日間、実施され得る。いくつかの態様において、前記インキュベートする段階は、1分間〜150分間、具体的には10分間〜150分間、より具体的には30分間〜150分間、より具体的には40分間〜120分間、より具体的には45分間〜90分間、特に50分間〜70分間、実施される。他の態様において、前記インキュベートする段階は、150分間〜7日間、具体的には150分間〜5日間、より具体的には150分間〜3日間、より具体的には150分間〜1日、特に150分間〜8時間、実施される。

本発明の方法および使用に従った、未結合の(抗CD4)抗体の除去に関して、前記段階を実施する様々な方法が当業者に公知である。未結合の抗体を移植片から除去する1つの例示的な方法は、移植片を洗浄することによる。移植片が細胞懸濁液を含むかまたは細胞懸濁液である場合、洗浄は、例えば、遠心分離を使用することによって行ってよい。

除去する段階において、未結合の(抗CD4)抗体の好ましくは少なくとも40％、より具体的には少なくとも50％、より具体的には少なくとも60％、より具体的には少なくとも70％、より具体的には少なくとも80％、より具体的には少なくとも90％が、移植片から除去される。好ましくは、未結合の(抗CD4)抗体の最高100％が、移植片から除去される。

上記のインキュベートする段階において使用される抗体の量は、特に限定されていない。適切な量は、当業者によって容易に決定されることができ、例えば、使用される移植片のタイプに依存し得る。好ましくは、本発明によれば、前記インキュベートする段階は、0.1μg〜100mgの抗体量を用いて実施される。

いくつかの態様において、特に移植片が細胞懸濁液である場合、前記インキュベートする段階は、0.1μg/mlの細胞懸濁液〜150μg/mlの細胞懸濁液、具体的には7μg/mlの細胞懸濁液〜100μg/mlの細胞懸濁液、より具体的には30μg/mlの細胞懸濁液〜100μg/mlの細胞懸濁液、特に40μg〜60μg/mlの細胞懸濁液という抗体濃度を用いて実施される。

いくつかの態様において、特に移植片が組織である場合または移植片が器官である場合、前記インキュベートする段階は、0.1mg〜10mg、具体的には1mg〜10mg、より具体的には2mg〜9mg、より具体的には3mg〜8mg、特に4mg〜6mgの抗体量を用いて実施される。

いくつかの態様において、特に移植片が組織である場合または移植片が器官である場合、前記インキュベートする段階は、0.1mg/ml〜10mg/ml、具体的には1mg/ml〜10mg/ml、より具体的には2mg/ml〜9mg/ml、より具体的には3mg/ml〜8mg/ml、特に4mg/ml〜6mg/mlのインキュベーション溶液中抗体濃度を用いて実施される。好ましくは、指定の体積は、前記組織または器官の体積、ならびに前記組織または器官がインキュベートされる(抗体を含有する)溶液の体積を含む。

いくつかの態様において、特に移植片が組織である場合または移植片が器官である場合、前記インキュベートする段階は、10μg/ml〜150μg/ml、具体的には20μg/ml〜100μg/ml、より具体的には30μg/ml〜100μg/ml、特に40μg/ml〜60μg/mlの抗体濃度を有する溶液中で前記組織または器官をインキュベートすることによって実施される。好ましくは、指定の体積は、前記組織または器官の体積、ならびに前記組織または器官がインキュベートされる(抗体を含有する)溶液の体積を含む。

組織および/または器官を抗体含有溶液と共にインキュベートする場合、当業者は、適切な容器を用いるなどしてこのようなインキュベーションを容易に実施する。

適切な量の抗体の選択は、当業者の専門知識で十分に対応できる範囲である。一般に、移植片が組織もしくは器官を含むかまたは組織もしくは器官である場合、多い抗体量または高い抗体濃度がそれぞれ好ましい。さらに、使用される抗体の正確な量または濃度の選択はそれぞれ、そのような組織または器官の大きさにも依存する。

好ましい態様において、上記のインビトロ方法または使用は、前記移植片を移植した際に、GvHD、ドナー移植片拒絶、および器官拒絶からなる群のいずれか1つ、特にGvHDが起こる可能性を低下させるためのものである。好ましい態様において、上記のインビトロ方法または使用は、前記改変された移植片を移植した際に、レシピエントの組織に対する移植された免疫担当細胞内での寛容を獲得するためのものである。好ましい態様において、上記のインビトロ方法または使用は、前記改変された移植片を移植した際に、改変された移植片に対するレシピエントの組織内での寛容または部分的寛容を獲得するためのものである。本明細書において使用される場合、「部分的寛容」は、免疫応答の低下をもたらす部分的免疫寛容である。好ましい態様において、上記のインビトロ方法または使用は、前記移植片内での細胞活性化を静めるためのものである。

免疫細胞を含む細胞移植片を含む移植片は、当業者に十分に周知である。本明細書において使用される場合、「免疫細胞を含む細胞移植片」は、免疫細胞を含む移植片である。免疫細胞を含む細胞移植片は、特に限定されない。

本発明によれば、移植片は、細胞懸濁液、組織、および/または器官を含んでよい。好ましくは、移植片は、細胞懸濁液、組織、および/または器官である。より好ましくは、移植片は、細胞懸濁液、組織、および器官からなる群より選択される。

さらに、本発明のいくつかの好ましい態様において、移植片は幹細胞を含む。本明細書において、幹細胞を含む移植片は、幹細胞移植片と呼ばれてもよい。

本発明によれば、移植片は、CD4抗原を有する細胞を含む。好ましくは、移植片は、免疫細胞、特にCD4抗原を有する免疫細胞を含む。このような細胞は、当業者に周知である。一定の好ましい態様において、これらの免疫細胞は、CD4陽性のTリンパ球またはその前駆細胞である。一定の好ましい態様において、これらの免疫細胞には、Tヘルパー細胞ならびに単球系およびマクロファージ系に属する細胞、例えば単球およびマクロファージが含まれるが、それらに限定されるわけではない。このような細胞の別の例は、ミクログリアである。

いくつかの態様において、前記移植片は、組織、好ましくは幹細胞を含む組織を含み、好ましくは組織、好ましくは幹細胞を含む組織である。本発明によれば、適切な組織には、血液、筋肉、脂肪組織、結合組織、上皮、胚組織、および細胞組織が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

他の態様において、前記移植片は、器官、好ましくは幹細胞を含む器官を含み、好ましくは器官、好ましくは幹細胞を含む器官である。適切な器官には、皮膚、腸、腎臓、および肝臓が含まれるが、それらに限定されるわけではない。好ましくは、前記器官は腸である。

好ましい態様において、前記移植片は、細胞懸濁液、好ましくは幹細胞を含む細胞懸濁液を含み、好ましくは細胞懸濁液、好ましくは幹細胞を含む細胞懸濁液である。それらを得るための適切な細胞懸濁液および方法は、当業者に周知である。例えば、細胞懸濁液移植片は、骨髄を含む骨の穿刺、例えば、腸骨稜もしくは胸骨の穿刺によって得ることができるか、または全身の至るところにある幹細胞ニッチ、例えば、脂肪組織、歯根、毛根、および前述の他の任意の供給源から採取することができる。

好ましい態様において、細胞懸濁液、特に幹細胞を含む細胞懸濁液は、骨髄細胞、非付着性骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、ワルトン膠質由来細胞、胎盤由来細胞、毛根由来細胞、および/または脂肪組織由来細胞を含む。好ましい態様において、細胞懸濁液、特に、幹細胞を含む細胞懸濁液は、リンパ球、単球、および/またはマクロファージを含む。

一定の好ましい態様において、移植片、特に細胞懸濁液は、骨髄幹細胞、末梢血幹細胞、臍帯血幹細胞、臍帯血幹細胞、骨髄の成体幹細胞、例えばNA-BMC、胚性幹細胞、および/または再プログラムされた成体幹細胞(すなわち、人工多能性細胞)のいずれかを含む。いくつかの特定の態様において、移植片は、胚性幹細胞からなりもせず、胚性幹細胞を含みもしない。いくつかの特定の態様において、移植片は、全能性幹細胞からなりもせず、全能性幹細胞を含みもしない。

好ましい態様において、移植片は、特に骨髄幹細胞を含む骨髄懸濁液である。通常、移植片、特に骨髄懸濁液は、血液細胞、臍帯血細胞、ドナーリンパ球、末梢血幹細胞、骨髄の成体幹細胞、胚性幹細胞、および/または再プログラムされた成体幹細胞(すなわち人工多能性細胞)中に含まれる幹細胞のいずれかをさらに含んでよい。

移植片、特に骨髄懸濁液は、血液細胞、臍帯血細胞、ドナーリンパ球、末梢血幹細胞、および/または骨髄の成体幹細胞中に含まれる幹細胞のいずれかをさらに含んでよい。

通常、細胞懸濁液はまた、任意でいずれかの他の細胞(の組合せ)と共に、幹細胞(の任意の組合せ)を含む任意の細胞懸濁液を含むことが意図される。

また、移植片は、前述の移植片の内の1つまたは複数の組合せのような移植片の組合せ、例えば、器官および細胞懸濁液の組合せでもよい。

さらなる局面において、本発明は、本発明のインビトロ方法に従って得ることができる免疫細胞を含む改変された細胞移植片に関する。

同様に、本発明は、移植片の接触可能なCD4エピトープの40％〜100％に結合された抗CD4抗体を含む、免疫細胞を含む改変された細胞移植片にも関する。好ましくは、免疫細胞を含む改変された細胞移植片は、該移植片の接触可能なCD4エピトープの50％〜100％、具体的には60％〜100％、具体的には70％〜100％、より具体的には80％〜100％、より具体的には90％〜100％、より具体的には95％〜100％、より具体的には99％〜100％に結合された抗CD4抗体を含む。最も好ましくは、免疫細胞を含む細胞移植片の接触可能なCD4エピトープのほぼすべてが、抗CD4抗体に結合される。

さらなる局面において、本発明は、医薬において使用するための本発明の改変された移植片に関する。

さらなる局面において、本発明は、移植によって治療可能な1種または複数種の疾患を対象において治療する方法において使用するための、本発明の改変された移植片に関する。

免疫細胞を含む細胞移植片を含む移植片の移植における使用は、当技術分野において周知である。本発明は、当技術分野において公知である、移植に伴う重大な副次的作用を回避することを意図する改変された移植片を提供する。したがって、本発明の改変された移植片は、非改変移植片に関して公知であるとおりに使用される。

好ましくは、前記対象は哺乳動物対象、特にヒトである。好ましくは、移植によって治療可能な前記1種または複数種の疾患は、急性骨髄性白血病(AML);急性リンパ性白血病(ALL);慢性骨髄性白血病(CML);骨髄異形成症候群(MDS)/骨髄増殖性症候群;特に、ホジキン病、高悪性度非ホジキンリンパ腫(NHL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、低悪性度NHL、慢性リンパ性白血病(CLL)、多発性骨髄腫より選択される悪性リンパ腫;重度の再生不良性貧血;サラセミア;鎌状赤血球貧血;特に、重症複合免疫不全(SCID)、ウィスコット・アルドリッチ症候群(WAS)、および血球貪食性リンパ組織球症(HLH)より選択される免疫学的異常;特に、リソソーム蓄積障害およびペルオキシソーム機能障害より選択される先天性代謝異常;自己免疫疾患;リウマチ疾患;ならびに上記のいずれかの度々の再発(recidivism)からなる群より選択される。

さらにより好ましくは、前記1種または複数種の疾患は、急性骨髄性白血病(AML);急性リンパ性白血病(ALL);慢性骨髄性白血病(CML);骨髄異形成症候群(MDS)/骨髄増殖性症候群;特に、ホジキン病、高悪性度非ホジキンリンパ腫(NHL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、低悪性度非ホジキンリンパ腫(NHL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、多発性骨髄腫より選択される悪性リンパ腫;重度の再生不良性貧血;サラセミア;および鎌状赤血球貧血より特別に選択される1種または複数種の血液学的悪性疾患である。

一般に本明細書において、前記1種または複数種の疾患は、上記のいずれかの度々の再発ならびに本明細書において言及する疾患の任意の組合せも含む。

後者の局面において、好ましくは、移植片は、本発明のインビトロ方法に関連して本明細書において前述したとおりにさらに定義される。すなわち、移植片は、好ましくは、細胞懸濁液、組織、および器官からなる群より選択され得る。より好ましくは、該移植片は、骨髄細胞、非付着性骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、ワルトン膠質由来細胞、胎盤由来細胞、毛根由来細胞および/または脂肪組織由来細胞を含む、細胞懸濁液;リンパ球、単球および/またはマクロファージを含む、細胞懸濁液;幹細胞を含む組織;ならびに幹細胞を含む器官からなる群より選択される。

いくつかの態様において、治療は、該移植片を移植した際に、GvHD、ドナー移植片拒絶、および器官拒絶からなる群のいずれか1つを発症する可能性、特にGvHDが起こる可能性を低下させることを含意する。他の態様において、治療は、該改変された移植片を移植した際の、レシピエントの組織に対する移植された免疫担当細胞内での寛容を含意する。他の態様において、治療は、該改変された移植片を移植した際の、改変された移植片に対する寛容を含意する。他の態様において、治療は、該改変された移植片を移植した際の、改変された移植片に対するレシピエントの組織内での寛容または部分的寛容を含意する。他の態様において、治療は、該移植片内での細胞活性化を静めるためのものである。好ましい態様において、治療は、上記の任意の組合せを含意するか、または上記の任意の組合せのためのものである。

移植片中に含まれる細胞の量は、特に限定されない。当業者は、移植のための移植片および移植片の細胞の適切な量を容易に選択できる。さらに、適切な手引きも、例えば、患者のヒト造血幹細胞に関する、「Deutsche Bundesarztekammer」によって詳しく説明された移植のための具体的なガイドラインから例えば入手可能である。

好ましくは、本発明によれば、特に、移植片が細胞懸濁液である場合、2×10⁶個の細胞〜2×10¹⁰個の有核細胞、具体的には4×10⁶〜1×10⁹個の有核細胞、より具体的には1×10⁷〜1×10⁸個の有核細胞という量が、前記対象、特にヒト対象に与えられる。

移植片が組織もしくは器官を含むかまたは組織もしくは器官である場合、該組織または器官の任意の適切な量が前記対象に与えられ得る。当業者には理解されるとおり、組織または器官中の細胞数を測定するのは難しい。特にこういう理由で、移植片中に含まれる細胞の量は、特に限定されない。適切な量は、例えば、対象、移植片、および/または治療すべき疾患の個々のタイプを考慮して、当業者によってそれぞれ容易に決定または選択される。器官の場合、器官全体を与えることが好ましい。

本発明の方法、改変された移植片、および使用するための改変された移植片において、移植片は、可溶性生物活性分子と共に、特に、免疫抑制、免疫寛容、および/もしくは調節性T細胞の形成を促進する作用物質と共に、またはそのような作用物質の任意の組合せと共にさらにインキュベートされてもよい。好ましくは、このような作用物質は、本明細書において前述した本発明の方法、使用、改変された移植片、または使用するための改変された移植片のそれぞれの特徴または利点、例えば、前記移植片を移植した際に、GvHD、ドナー移植片拒絶、および器官拒絶からなる群のいずれか1つ、特にGvHDが起こる可能性を低下させること、または例えば、前記改変された移植片を移植した際に寛容を獲得することを補助する。このような作用物質には、具体的にはサイトカインが含まれる。好ましい態様において、このような作用物質は、Il-2、TGF-β、ラパマイシン、レチノイン酸、4-1BBリガンド、および抗CD28抗体からなる群より選択されるか、またはそれらの任意の組合せである。

同様に、本発明の使用するための改変された移植片において、移植片は、任意の医薬または医薬の組合せと共に対象に任意で与えられてもよい。該医薬は、移植前に、移植と共に、および/または移植後に投与されてよい。適切な投与様式および投与経路は、特に限定されず、当業者は容易に選択する。好ましくは、このような医薬は、本明細書において前述した本発明の方法、使用、改変された移植片、または使用するための改変された移植片のそれぞれの特徴または利点、例えば、GvHD、ドナー移植片拒絶、および器官拒絶からなる群のいずれか1つが起こる可能性を低下させることを補助する。このような医薬の非限定的な例には、ラパマイシンおよびレチノイン酸が含まれる。

さらなる局面において、本発明は、本発明の改変された移植片、特に、本発明のインビトロ方法に従って得ることができる改変された移植片を用いて、そのような治療を必要とする対象を治療する方法を特徴とする。好ましい態様において、該移植片、対象、治療、および/または疾患は、本明細書において前述したとおりである。

さらなる局面において、本発明は、移植片、特に、免疫細胞を含む細胞移植片のインビトロでの改変のための抗CD4抗体の使用に関し、この改変は、該移植片を該抗体と共に1分間〜7日間インキュベートする段階を含み、特に、この改変は、該移植片から未結合の抗体を除去する段階をさらに含む。好ましい態様において、前記使用は、本発明の方法に関して本明細書において説明したとおりにさらに定義される。

さらなる局面において、本発明は、移植によって治療可能な1種または複数種の疾患を対象において治療するための医薬を製造するための、本発明の改変された移植片の使用に関する。好ましい態様において、前記使用は、本発明の方法に関して本明細書において説明したとおりにさらに定義される。特に、移植片、対象、治療、および/または疾患は、好ましくは、本明細書において前述したとおりである。

本発明の方法、使用、改変された移植片、または使用するための改変された移植片のさらに別の局面において、抗CD4抗体は、他の任意のCD4リガンドに置き換えられる。好ましいCD4リガンドには、ペプチドリガンド(天然に存在するペプチドリガンドおよびペプチド構築物を含む)ならびにアプタマーが含まれるが、それらに限定されるわけではない。このようなCD4リガンドは、当技術分野において公知である。

さらに別の局面において、本発明の方法、使用、改変された移植片、および使用するための改変された移植片において言及される移植片は、幹細胞を含んでも含まなくてもよい。すなわち、後者の局面によれば、免疫細胞を含む細胞移植片は任意の移植片で置き換えられてよく、幹細胞を含む移植片も幹細胞を含まない移植片も含む。言い換えると、本発明の移植片または本発明に従って使用される移植片は、任意の移植片でもよく、または免疫細胞を含む細胞移植片でもよい。さらに言い換えると、一定の態様において、本発明の移植片または本発明に従って使用される移植片は幹細胞を含むが、他の態様において、本発明の移植片または本発明に従って使用される移植片は幹細胞を含まない。一定の態様において、移植片は、単離されたCD4⁺細胞を含まない。

実施例でさらに説明するとおり、本発明者らは、例えば、ヒトCD4およびHLA-DR3に関してトランスジェニックであるCD4-/-C57Bl/6マウス(トリプルトランスジェニックマウス、TTG;Laub et al., 2000を参照されたい)を使用した。TTGマウスは、完全に機能的なマウス免疫系を有するが、ヒトCD4の代わりにマウスCD4を持たず、かつマウスMHC-IIに加えてヒトHLA-DR3が存在する。この状況において、骨髄細胞は、TTG移植片として採取され、Balb/c野生型マウスに移植する前に抗ヒトCD4抗体と共にインキュベートされ得る。この完全なMHCクラスI不一致移植モデルにおいて、GvHD誘発は高い確率で起こり(highly presumably)、抗CD4抗体に対するチャレンジである。

Balb/cマウスへのTTG/C57Bl6ドナー細胞の移植をフローサイトメトリーによって確認した。移植後のH-2Kd(C57Bl/6)、ヒトCD4、HLA-DRの安定な移植およびマウスCD4の減少から完全なドナー(TTG)造血が示され、これは移植後12日目に最初に観察された。生存状況の解析、スコア付けシステム、および組織像に基づいてGvHDを確認した。TTGドナー細胞を用いた場合の方が、C57Bl/6野生型ドナー細胞よりGvHDの重症度が高かった。抗CD4抗体で治療したGvHDマウスの生存率は、0％から83％まで著しく上昇した。抗体治療をしない場合、GvHDマウスは19〜35日以内に死亡した。使用された抗CD4抗体は、完全なMHC不一致モデルへのマウスHSCT(Balb/cマウスへのTTGマウス)の後、GvHD発症を効果的に抑制する。この独特な移植モデルにより、TTGマウスをドナーとして用いた安定なマウスGvHDモデルを用いて、マウスにおいて抗ヒトCD4抗体を直接試験することが可能になる。TTGマウス由来の骨髄移植片を抗ヒトCD4で前処理した後、GvHDの誘発はなかった。これらの知見は、反応性T細胞クローンを抑制するための戦略の改善に関連するとみなされる。

さらに別の局面において、本発明は、(i)抗体16H5.chimIgG4;(ii)2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞株CD4.16H5.chimIgG4から得ることができる、抗体;(iii)抗体16H5.chimIgG4のVHおよびVKを含む、抗体;(iv)2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞株CD4.16H5.chimIgG4から得ることができる抗体のVHおよびVKを含む、抗体;(v)組合せがVH1/VK1、VH2/VK2、VH4/VK2、およびVH4/VK4より選択され、特に該組合せがVH2/VK2である抗体からなる群より選択される、図12で開示されているVHおよび図13で開示されているVKの該組合せを含む抗体、からなる群より選択される、抗CD4抗体に関する。

このさらに別の局面の特定の態様において、本発明の抗CD4抗体は「MAX.16H5」である。特定の態様において、本発明の抗CD4抗体は、2011年12月2日にDSMZに寄託された、本出願者らが作製した生物学的材料の寄託物から得ることができる抗体である。特定の態様において、本発明の抗CD4抗体は、2011年12月2日にDSMZに本出願者らが寄託した細胞から得ることができる抗体である。特定の態様において、本発明の抗CD4抗体は、2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞「MAX.16H5/30F16H5」から得ることができる抗体である。特定の態様において、本発明の抗CD4抗体は、2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞「CD4.16H5.chimIgG4」から得ることができる抗体である。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、図12のVH1を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、図12のVH2を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、図12のVH4を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、図13のVK1を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、図13のVK2を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、図13のVK4を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 10を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 8を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 4を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 20を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 18を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 14を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、図12のVH1および/または図13のVK1を含む。いくつかの特に好ましい態様において、本発明の抗CD4抗体は、図12のVH2および/または図13のVK2を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、図12のVH4および/または図13のVK2を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、図12のVH4および/または図13のVK4を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 10および/またはSEQ ID NO: 20を含む。一部のいくつかの特に好ましい態様において、本発明の抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 8および/またはSEQ ID NO: 18を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 4および/またはSEQ ID NO: 18を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 4および/またはSEQ ID NO: 14を含む。いくつかの態様において、本発明の抗CD4抗体は、抗体16H5.chimIgG4のVHおよびVKを含む。

一般に、本発明は、「含む」という用語または同等の用語が、「有する」または同等の用語で置き換えられる態様にも関する。例えば、本発明は一般に、「含んでいる」という用語または同等の用語が、「有している」または同等の用語で置き換えられる態様にも関する。

以下に、本発明のさらなる局面を詳細に説明する。

1つの面において、本発明の前記のさらなる局面は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン(VH)および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン(VL)を含む抗ヒトCD4抗体であって、該免疫グロブリン可変ドメインのCDRの外側に位置する少なくとも1つのT細胞エピトープが、該免疫グロブリン可変ドメインから除去される、抗ヒトCD4抗体に関する。

このような抗体は、親抗体よりも免疫原性が低く、したがって、T細胞を刺激または活性化する可能性がより低く、それゆえ、例えば、ヒト対象において抗体に対する望まれないT細胞媒介性免疫応答を引き起こす可能性がより低い。

さらに、有利には、前記抗体は、対応する非改変抗体がヒトCD4に結合する能力を実質的に保持しており、好ましくは、それらの有利な特徴の内の少なくとも1つをさらに保持している。

本発明の前記のさらなる局面で使用される場合、「抗体」とは、とりわけ、抗原に合体するか、相互作用するか、またはそうでなければ結合することができる免疫グロブリンファミリーのタンパク質を意味する。

本発明の前記のさらなる局面の文脈において、「抗体」という用語は、好ましくは、例えば、Fv断片、Fab断片、Fab'断片、およびF(ab')2断片を含む抗体断片にも関するとみなされる。このような断片は、標準的な方法によって調製され得る。本発明の前記のさらなる局面はまた、好ましくは、当技術分野において周知である、様々な組換え形態の抗体由来分子種も企図する。このような種には、VHドメインおよびVLドメインを連結するペプチドリンカーを含む単鎖Fv型(例えばscFv)、または鎖間ジスルフィド結合によって安定化され、VHドメインおよびVLドメインの結合を容易にするために設計された付加的なシステイン残基を含むFv(dsFv)を含む、安定化されたFv断片が含まれる。同様に、他の組成物も当技術分野でよく知られており、「ミニボディ」と呼ばれる種、および単一の可変ドメイン「dAb」が含まれ得る。他の種、すなわち、例えば、二量体形成ドメイン(例えば「ロイシンジッパー」)の遺伝子操作によるか、または化学修飾戦略にもよる、複数の抗原結合部位を有する種は、改変抗体V領域ドメインの価数を増やすための手段をさらに含んでもよい。さらに、「抗体」という用語は、好ましくは、ダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディなどscFvの多量体、タンダブ(tandab)、フレキシボディ(flexibody)、二重特異性抗体、およびキメラ抗体にも関する。本発明の前記のさらなる局面によれば、「抗ヒトCD4抗体」という用語は、好ましくは、ヒトCD4に結合する能力を有する、上記に定義した抗体を意味する。さらに、本発明の前記のさらなる局面で使用される場合、「非改変抗体」または「親抗体」という用語は、好ましくは、本発明の前記のさらなる局面の抗体とは対照的に、前記免疫グロブリン可変ドメインのCDRの外側に位置するT細胞エピトープが免疫グロブリン可変ドメインから1つも除去されていない、対応する抗ヒトCD4抗体を意味する。「抗原」という用語は、好ましくは、抗体と相互作用できる物質を意味するために本発明の前記のさらなる局面において使用される。本発明の前記のさらなる局面の抗体の文脈において、抗原は好ましくは、CD4、特にヒトCD4であることが意図される。「CD4」または「分化クラスター4」とは、当業者に周知であるタンパク質、より正確には表面糖タンパク質を意味する。本発明の文脈において、CD4はまた、好ましくは、完全長CD4の断片またはCD4の別の様式で改変された形態も意味してよい。ただし、この断片または別の様式で改変された形態が、本発明の前記のさらなる局面の抗体に対して抗原として引き続き機能することを条件とする。「免疫グロブリンドメイン」という用語は、好ましくは、免疫グロブリンフォールドを含むタンパク質ドメインを特に意味するために本発明の前記のさらなる局面において使用される。免疫グロブリンドメインおよび免疫グロブリンタンパク質は、当技術分野において周知である。「VH」という用語は、好ましくは 、抗体の重鎖の重鎖可変領域を意味するために本発明の前記のさらなる局面において使用される。「重鎖可変領域」は、「重鎖免疫グロブリン可変ドメイン」とも呼ばれる。これらの用語もまた、当技術分野において周知である。「VL」という用語は、好ましくは、抗体の軽鎖の軽鎖可変領域を意味するために本発明の前記のさらなる局面において使用される。「軽鎖可変領域」は、「軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン」とも呼ばれる。これらの用語もまた、当技術分野において周知である。

好ましくは、重鎖免疫グロブリン可変ドメインおよび軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは一緒になって、抗原と相互作用できる結合表面を提供する。

本発明の前記のさらなる局面で使用される場合、VHは、好ましくは、長さ約110〜125アミノ酸残基であり、その配列が本発明の前記のさらなる局面において特定されたVH鎖のいずれかに相当し、VLと組み合わさってCD4抗原に結合できる、ポリペプチドを意味する。同様に、VLは、好ましくは、長さ約95〜130アミノ酸残基であり、その配列が本発明の前記のさらなる局面において特定されたVL鎖のいずれかに相当し、VHと組み合わさってCD4抗原に結合できる、ポリペプチドを意味する。

完全長免疫グロブリン重鎖は、好ましくは、約50〜70kDaの分子量を有し、通常、N末端がVH遺伝子によって、C末端が定常領域の内の1つ(例えば、[ガンマ]、[アルファ]、または[イプシロン])によってコードされている。同様に、完全長軽鎖は、好ましくは、約25kDaの分子量を有し、通常、N末端がV領域遺伝子によって、C末端が[カッパ]または[ラムダ]定常領域遺伝子によってコードされている。

抗体の軽鎖は、「ラムダ」(「λ」)タイプの鎖または「カッパ」(「κ」)タイプの鎖でよい。したがって、軽鎖可変領域は、「ラムダ」(「Vl」、「Vλ」)タイプ軽鎖可変領域または「カッパ」(「Vk」、「Vκ」)タイプ軽鎖可変領域でよい。

多数のモノクローナル抗体と同様に、軽鎖は、好ましくは「カッパ」(「κ」)タイプの鎖である。したがって、VLは、好ましくはVk(「VK」、「Vκ」)タイプの鎖である。

本発明の前記のさらなる局面の文脈において、いくつかの様々な重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が提供される。本発明の開示は、完全抗体分子中に含まれ得る前記可変ドメイン配列の起こり得る組合せを限定しない。

好ましくは、本発明の前記のさらなる局面の抗体は、2つの同一の重鎖免疫グロブリン可変ドメインおよび2つの同一の軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを含み、該重鎖免疫グロブリン可変ドメインおよび軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、本発明の前記のさらなる局面で開示される可変ドメインより選択される。

本発明の前記のさらなる局面によれば、好ましくは、「T細胞エピトープ」という用語は、MHC分子、好ましくはMHCクラスII分子に結合する潜在能力を有するペプチド配列を意味する。このような配列は、MHCクラスIIと複合して、T細胞を刺激し、かつ/または(必ずしも活性化することなく)T細胞に結合し得る。

好ましくは、「T細胞エピトープ」という用語は、MHCクラスII分子に結合された場合、T細胞受容体(TCR)によって認識されることができ、かつ少なくとも原則的に、T細胞応答を促進するのにTCRを従事させることにより、対応するT細胞の刺激または活性化を引き起こすことができる、ペプチド配列を意味する。

抗体のT細胞エピトープを同定するために、当業者に公知であるか、かつ/または本出願において説明もしくは言及されるインシリコ方法またはインビトロ方法のいずれかを使用してよい。

好ましくは、T細胞エピトープは、8個またはそれ以上のアミノ酸、より好ましくは8〜20個のアミノ酸、より好ましくは8〜11個のアミノ酸、特に好ましくは9個のアミノ酸からなる。

本発明の前記のさらなる局面で使用される「ペプチド」という用語は、好ましくは、ペプチド結合によって一つに連結されている2個またはそれ以上のアミノ酸を含む化合物である。いくつかのペプチドは、ごく少数のアミノ酸単位しか含まない場合がある。当技術分野では、短いペプチド、例えば、10個未満のアミノ酸単位を有するペプチドは「オリゴペプチド」と呼ばれることがあり、一方、より多数の、例えば、10〜100個または100個を超えるアミノ酸残基を含むペプチドは、「ポリペプチド」と通常呼ばれる。

本発明の前記のさらなる局面の全体を通して、好ましくは、T細胞エピトープは、抗体に対する該エピトープに基づくT細胞媒介性免疫応答が低下しているか、または好ましくは消失している場合、「除去されている」と言われる。

好ましくは、抗体に対するT細胞媒介性免疫応答は、T細胞エピトープがMHC分子、好ましくはMHCクラスII分子に結合する潜在能力が低下(好ましくは消失)している場合、低下(好ましくは消失)している。

実施例2で説明する例示的な方法によって、改変されたT細胞エピトープがMHCクラスII対立遺伝子に結合するかをインシリコで試験することができる。この方法において、T細胞エピトープは、改変されたT細胞エピトープに結合することが予測されるMHCクラスII対立遺伝子の数が少なくなっているか、またはない場合、「除去されている」とみなされる(実施例2を参照されたい)。

T細胞媒介性免疫応答の低下または消失を測定するための他の方法は当業者に周知であり、例えば、精製されたMHCクラスII分子もしくはホモ接合性不死化B細胞株のいずれかを用いるインビトロMHCクラスII結合アッセイ法、またはエクスビボT細胞増殖アッセイ法が含まれる。

T細胞エピトープの除去は、抗体が示す免疫原性の低下、好ましくは非存在をもたらし得る。「免疫原性」という用語は、とりわけ、宿主動物において、特に宿主動物がヒトである場合、体液性応答および/もしくはT細胞媒介性応答を引き起こすか、誘導するか、もしくはそうでなければ促進する能力、ならびに/または適切なインビトロアッセイ法において応答を誘発する能力に関する。例えば、免疫原性は、対応する親抗体、例えば、非改変のげっ歯動物モノクローナル抗体またはキメラ(げっ歯動物V領域;ヒト定常領域)モノクローナル抗体と比べて低下している場合、低下していると言われる。

本発明の前記のさらなる局面において使用される場合、好ましくは、「CDR」という用語は、抗体の「相補性決定領域」を、すなわち、抗体特異性の決定に寄与する、免疫グロブリン可変ドメイン内の超可変領域の内の1つを意味する。CDRは、当業者には周知である。典型的には、重鎖免疫グロブリン可変ドメインおよび軽鎖免疫グロブリン可変ドメインのどちらも3つのCDRを含む。

免疫グロブリン可変ドメイン中のCDRは、例えば、当業者に周知であるKabatによって作製された方法に従って同定および定義することができる。本発明の前記のさらなる局面の好ましい態様によれば、CDRはKabat (Kabat et al. (1991)に従って定義される。

本発明の前記のさらなる局面で使用される場合、除去されるT細胞エピトープは、好ましくは、除去されることになっているT細胞エピトープの配列が、該免疫グロブリン可変ドメインのCDRのいずれとも重ならない場合、「免疫グロブリン可変ドメインのCDRの外側に位置している」と言われる。さらに、除去されるT細胞エピトープは、除去されることになっているT細胞エピトープの配列が、該免疫グロブリン可変ドメインのCDRのいずれかと重なるが、そのようなT細胞エピトープに施された改変のすべてが免疫グロブリン可変ドメインのCDRの外側に施されている場合も、「免疫グロブリン可変ドメインのCDRの外側に位置している」と言われる。

本発明の前記のさらなる局面の抗ヒトCD4抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でよい。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。

好ましい態様によれば、抗体は、ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生されたモノクローナル抗体に由来する。

ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された抗体はCD4抗体であり、より具体的には、30F16H5とも呼ばれ、例えばDE 3919294において開示されているモノクローナルマウス抗ヒトCD4抗体である。該抗体は、ECACC(アクセッション番号 88050502)に寄託されたハイブリドーマ細胞株から得ることができる。

本発明の前記のさらなる局面の抗体は、ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生されたモノクローナル抗体の配列を用いて当業者に公知である任意の適切な方法によって、またはハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502を用いることによって得られた場合、ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生されたモノクローナル抗体に「由来する」と言われる。

好ましくは、抗体は、ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された抗体のCDRを有するか、または抗体は、SEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 12のCDRを有する。

SEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 12のCDRは、図12(a)および図13(a)においてイタリック体で強調した配列を有する。これらの図は、親抗ヒトCD4抗体30F16H5の好ましい免疫グロブリン可変ドメイン配列(SEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 12)を示す。図12(a)および図13(a)のそれぞれにおいて、3つのCDRを示している。ここで、図12(a)のCDRは、SEQ ID NO: 2のアミノ酸31〜35、50〜66、および99〜109によって形成され、図13(a)のCDRは、SEQ ID NO: 12のアミノ酸24〜33、50〜55、および88〜96によって形成されている。

ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された抗体の、またはSEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 12のCDRを有する抗体は、親抗体30F16H5の親和性に匹敵する親和性でヒトCD4に結合する高い潜在能力を有する。

本発明の前記のさらなる局面の抗体の別の好ましい態様において、前記免疫グロブリン可変ドメインからの1つまたは複数のT細胞エピトープの除去に起因する違いは例外として、重鎖免疫グロブリン可変ドメインは、ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された抗体の重鎖免疫グロブリン可変ドメインと同一であるか、またはSEQ ID NO: 2と同一の配列を含み;かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生される抗体の軽鎖免疫グロブリン可変ドメインと同一であるか、またはSEQ ID NO: 12と同一の配列を含む。

実施例2bで説明するとおり、本発明者らは、親抗ヒトCD4抗体30F16H5のT細胞エピトープを発見し、本明細書において開示し、これらの領域を、例えば、下記の表5および表6に示す。

本発明の前記のさらなる局面においてEH1〜EH10(「T cell epitope of heavy chain variable region(重鎖可変領域のT細胞エピトープ)」1〜10)と呼ばれるこのT細胞エピトープを個別に表5に示し(SEQ ID NO: 21〜30)、本発明の前記のさらなる局面においてEL1〜EL11EH10(「T cell epitope of light chain variable region(軽鎖可変領域のT細胞エピトープ)」1〜11)と呼ばれるT細胞エピトープを個別に表6に示す(SEQ ID NO: 31〜41)。これらの各T細胞エピトープはまた、それぞれの親可変領域SEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 12の配列上での位置に基づいてそれぞれ説明することもできる。

したがって、本発明の前記のさらなる局面の好ましい態様において、少なくとも1つのT細胞エピトープは、SEQ ID NO: 2の4位〜12位(EH1)、SEQ ID NO: 2の10位〜18位(EH2)、SEQ ID NO: 2の11位〜19位(EH3)、SEQ ID NO: 2の20位〜28位(EH4)、SEQ ID NO: 2の37位〜45位(EH5)、SEQ ID NO: 2の70位〜78位(EH6)、SEQ ID NO: 2の73位〜81位(EH7)、SEQ ID NO: 2の83位〜91位(EH8)、SEQ ID NO: 2の107位〜115位(EH9)、SEQ ID NO: 2の110位〜118位(EH10)における重鎖免疫グロブリン可変ドメインのT細胞エピトープ、ならびにSEQ ID NO: 12の2位〜10位(EL1)、SEQ ID NO: 12の3位〜11位(EL2)、SEQ ID NO: 12の10位〜18位(EL3)、SEQ ID NO: 12の11位〜19位(EL4)、SEQ ID NO: 12の45位〜53位(EL5)、SEQ ID NO: 12の53位〜61位(EL6)、SEQ ID NO: 12の59位〜67位(EL7)、SEQ ID NO: 12の61位〜69位(EL8)、SEQ ID NO: 12の62位〜70位(EL9)、SEQ ID NO: 12の70位〜78位(EL10)、およびSEQ ID NO: 12の97位〜105位(EL11)における軽鎖免疫グロブリン可変ドメインのT細胞エピトープからなる群より選択される。

一定の状況下で、本発明の前記のさらなる局面において開示されるものに対する配列の付加的領域は、例えば、本発明の事例のものと同様の配列を有するタンパク質またはペプチドを発現する病原体による感染が万一発生した場合には、免疫原性エピトープとなり得ることが理解される。

本発明の前記のさらなる局面の好ましい態様によれば、少なくとも1つのT細胞エピトープは、少なくとも1つのアミノ酸残基の変更によって除去される。

特に、本発明の前記のさらなる局面で使用される場合、少なくとも1つのアミノ酸残基の「変更」または「改変」は、好ましくは以下の内のいずれかでよい:
-他のアミノ酸残基による、少なくとも1つの元来存在するアミノ酸残基の置換、
-少なくとも1つのアミノ酸残基の付加;
-少なくとも1つの元来存在するアミノ酸残基の欠失;
-少なくとも1つのアミノ酸残基の化学修飾;
またはその組合せ。

少なくとも1つのアミノ酸残基の「変更」という用語への言及はまた、必要な場合には、通常は特定のアミノ酸の置換、付加、もしくは欠失によるさらなる変更が、ヒトCD4に結合する対応する非改変抗体の能力を実質的に保持するように、同じT細胞エピトープ内または抗体分子中の別の場所で行われる状況も含む。より好ましくは、このようなさらなる変更は、抗体の有利な特徴の内の1つまたは複数をさらに保持するために行われてもよい。

好ましくは、1つまたは複数の変更は、EH1〜EH10および/またはEL1〜EL11のいずれかまたはすべて、好ましくはEH1〜EH10およびEL1〜EL11のいずれかまたはすべてに由来する1つまたは複数の残基に対して行われる。

特に好ましくは、変更は、MHC結合溝のポケットによって結合されるため「ポケット残基」と一般に名付けられた1つまたは複数のアミノ酸に対して行われる。当業者によって理解されるとおり、該ポケット残基は、免疫原性に特定の関連性があり、それゆえ、抗体に対するT細胞媒介性免疫応答を低下させるか、または好ましくは消失させる可能性が高い残基を構成する。通常、親抗体の最も免疫原性が高い領域内でアミノ酸変更が行われている改変抗体分子を提供することが特に好ましい。

しかしながら、所与のエピトープ内の1つかまたは単一のエピトープ内での組み合わせのいずれかのアミノ酸変更は、MHCクラスII結合溝に関するポケット残基と対応する位置だけでなく、ペプチド配列内の任意の箇所に行ってもよい。このような変更はすべて、本発明の前記のさらなる局面の範囲に入る。

さらに、当業者には明らかであるとおり、エピトープの除去を達成する多数の代わりの変更セットを得ることができた。しかしながら、結果として生じる配列は、本発明の前記のさらなる局面で開示した特定の組成物との広範囲の相同性を存続しているはずであり、したがって、本発明の範囲に入る。最も相同性の低い領域において、本発明の指定された配列と約70％、または約90％、または約95％、または約99％もしくはそれ以上相同であったが、それでいて操作上では等価なままである配列を得ることが典型的であると思われる。このような配列は、同様に本発明の範囲に入る。

好ましくは、少なくとも1つのアミノ酸残基の変更は、1つまたは複数のアミノ酸の置換である。

したがって、本発明の前記のさらなる局面の抗体の好ましい態様において、少なくとも1つのT細胞エピトープ内の少なくとも1つのアミノ酸が、少なくとも1つのT細胞エピトープを除去するために別のアミノ酸によって置換される。

所与のT細胞エピトープ内の単一アミノ酸置換が、エピトープを消失させ得る好ましい経路であることが理解される。さらに、1つのエピトープ内での置換の組合せも企図されてよく、例えば、個別に定義されたエピトープが互いに重複している場合、特に適切であり得る。

様々な態様において、2個より多いアミノ酸置換、または3個より多いアミノ酸置換、または4個より多いアミノ酸置換、または5個より多いアミノ酸置換、または6個より多いアミノ酸置換、または7個より多いアミノ酸、または8個より多い、または9個より多い、または10個より多い、または11個より多い、または12個より多い置換が、重鎖および/または軽鎖において行われる。いくつかの態様において、1〜21個の間、5〜20個の間、または7〜14個の間のアミノ酸置換が重鎖および軽鎖において行われる。

少なくとも1個の置換が存在すること、および抗体がヒトCD4に結合する能力を保持することを条件として、前述のT細胞エピトープEH1〜EH10およびEL1〜EL11のそれぞれに0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、または9個の置換が存在してよい。

好ましくは、置換の数は、結合するまたは結合されると予測されるMHC II対立遺伝子の数がそれぞれ有意に減少するように選択される。好ましくは、前記数は、置換がまったく存在しない場合に結合される対立遺伝子の数と比べて、少なくとも50％、より好ましくは40％、より好ましくは30％、より好ましくは20％、より好ましくは10％、より好ましくは5％、より好ましくは2％、より好ましくは1％、および最も好ましくは0％に減少する。

実施例2bで例示するとおり、特定のアッセイ法において、「結合されるMHC II対立遺伝子の数」とは、問題となっているT細胞エピトープに対する結合ペプチドであることが判明する、そのアッセイ法で検査されるMHCクラスII対立遺伝子の所与のパネルの中のMHCクラスII対立遺伝子の数である(例えば、34個のMHCクラスII対立遺伝子)。該数は、親抗体の非改変T細胞エピトープと比べて、改変T細胞エピトープの場合に数が減少している場合、「減少している」と言われる。

本明細書において開示するとおり、1つまたは複数のT細胞エピトープが除去されている様々な改変抗ヒトCD4抗体は、アミノ酸置換を含むMHCクラスIIエピトープ除去手段によって作製された。この点に関して特に有用な置換の例は、具体的な個々の置換を開示する図12および図13において提供される。すなわち、図12(e)および図13(e)で強調される個々の置換であり、それぞれSEQ ID NO: 2(図12(a)を参照されたい)またはSEQ ID NO: 12(図13(a)を参照されたい)において行われ得る。これらの置換は、表5(重鎖免疫グロブリンドメインに関する)および表6(軽鎖免疫グロブリンドメインに関する)にも示される。

したがって、本発明の前記のさらなる局面の好ましい態様によれば、少なくとも1個の置換は、SEQ ID NO: 2中のT9S、V10E、A12K、Q19K、S28T、K38R、R40A、L70I、A72R、V73D、S91T、T115L、L116VおよびSEQ ID NO: 12中のI10T、M11L、L46A、V59S、I62S、S69D、R76S、L105Iからなる群より選択される。

特に好ましい態様において、少なくとも1個の置換が存在することを条件として、0個、1個、2個、または3個の置換は、EH1およびEH6のそれぞれの内部にあり;0個、1個、または2個の置換は、EH2、EH5、およびEH10のそれぞれの内部にあり;0個または1個の置換は、EH3、EH4、EH7、EH8、およびEH9のそれぞれの内部にあり;0個、1個、または2個の置換は、EL2、EL3、EL7、EL8、およびEL9のそれぞれの内部にあり;かつ0個または1個の置換は、EL1、EL4、EL5、EL6、EL10、およびEL11のそれぞれの内部にある。

本発明の前記のさらなる局面のある態様によれば、6個、8個、もしくは10個のT細胞エピトープが重鎖免疫グロブリン可変ドメインから除去され、かつ/または5個、9個、10個、もしくは11個のT細胞エピトープが本発明の前記のさらなる局面の抗体の軽鎖免疫グロブリン可変ドメインから除去される。

より好ましくは、6個、8個、または10個のT細胞エピトープが重鎖免疫グロブリン可変ドメインから除去され、かつ5個、9個、10個、または11個のT細胞エピトープが本発明の前記のさらなる局面の抗体の軽鎖免疫グロブリン可変ドメインから除去される。

1つの態様によれば、すべてのT細胞エピトープが免疫グロブリン可変ドメインから除去される。

さらに、本発明の前記のさらなる局面によれば、置換の例示的なグループは、免疫グロブリン可変ドメイン中で行われ、これらのグループは、SEQ ID NO: 4、6、8、および10(図12(b)〜(e)に示す)ならびにSEQ ID NO: 14、16、18、および20(図13(b)〜(e)に示す)に含まれる。

したがって、本発明の前記のさらなる局面のさらに好ましい態様は、重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 4、6、8、および10からなる群より選択される配列を含み;かつ/または軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 14、16、18、および20からなる群より選択される配列を含む、抗ヒトCD4抗体である。

より好ましくは、重鎖可変ドメインは、SEQ ID NO: 4、6、8、および10からなる群より選択される配列を含み、かつ軽鎖可変ドメインは、SEQ ID NO: 14、16、18、および20からなる群より選択される配列を含む。

さらにより好ましくは、重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 4と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 14と同一の配列を含むか;重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 4と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 20と同一の配列を含むか;重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 6と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 14と同一の配列を含むか;重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 6と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 16と同一の配列を含むか;重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 6と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 20と同一の配列を含むか;重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 8と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 16と同一の配列を含むか;重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 8と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 20と同一の配列を含むか;重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 10と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 14と同一の配列を含むか;重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 10と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 16と同一の配列を含むか;または重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 10と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 20と同一の配列を含む。

実施例2から理解できるとおり、これらの特定の可変ドメイン配列組み合わせを含む抗体は、特にCD4抗原に対する結合親和性に関して、有利な特徴を示す。

特に好ましくは、重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 4と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 14と同一の配列を含むか;重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 6と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 16と同一の配列を含むか;重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 10と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 16と同一の配列を含むか;または重鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 10と同一の配列を含み、かつ軽鎖免疫グロブリン可変ドメインはSEQ ID NO: 20と同一の配列を含む。

本明細書において開示する実施例2cにおいて示すとおり、これらの態様による抗体は、参照として使用された親モノクローナルマウス抗CD4抗体30F16H5と比べて向上している、ヒトCD4への結合を示す。

通常、上記に示唆したとおり、本発明の改変抗体は、ヒトCD4に結合する能力を示す。本発明の前記のさらなる局面で使用される場合、好ましくは、抗体は、その標的抗原CD4に対する親和性が非改変モノクローナル抗CD4抗体によって示される親和性の少なくとも5％、より好ましくは少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも100％である場合、ヒトCD4に結合する特性(capability)を「実質的に保持する」と言われる。

抗体の親和性を測定するための様々な方法が、当業者には周知である。適切な方法には、本明細書の実施例2cにおいて説明する競合ELISAによる親和性の測定、またはスキャッチャード解析、またはBiacore(Perkin Elmer)もしくは類似の機器を用いた解析が含まれる。

本発明の前記のさらなる局面の好ましい態様において、標的抗原CD4に対する親和性は、親抗CD4モノクローナル抗体によって示される親和性の10倍または10分の1の範囲内である。

例えば、本発明の前記のさらなる局面の抗体のCD4に対する結合親和性は、好ましくは、ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された抗体の結合親和性の10倍または10分の1の範囲内である。

より好ましくは、結合親和性は、ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された抗体の結合親和性の2倍に高くなっているか、または2分の1に低くなっている。

特に好ましい態様によれば、抗体のCD4に対する結合親和性は、ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された抗体よりも高い。

好ましくは、本発明の前記のさらなる局面で開示される改変抗体はさらに、親抗ヒトCD4抗体の機能的活性の内の少なくとも1つ、および最も好ましくはすべてを保持する。したがって、本発明の前記のさらなる局面の態様は、親非改変抗体の治療的有効性に関連する有益な技術的特徴の内の1つまたは複数、および最も好ましくはすべてが示されている一方で、その抗体がMHCクラスII分子に結合する能力は低下しており、かつ/または対象において弱い免疫応答を誘導するか、もしくは免疫応答をまったく誘導しない改変抗体を包含する。

好ましくは、抗ヒトCD4抗体重鎖は、ヒトIgG4定常領域ドメインをさらに含み、軽鎖はヒトκ定常領域ドメインをさらに含む。したがって、別の好ましい態様において、本発明の前記のさらなる局面の抗体の重鎖可変領域はヒトIgG4定常領域ドメインに連結されており、本発明の前記のさらなる局面の抗体の軽鎖可変領域はヒトκ定常領域ドメインに連結されている。IgG4は、ADCC(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity)およびCDC(complement-induced cell death)のようなエフェクター機能を刺激する傾向が低く、したがって、患者において炎症誘発性応答を促進することができない。特定の態様において、抗ヒトCD4抗体は、SEQ ID NO: 4、6、8、および10より選択される重鎖可変領域配列に隣接したヒトIgG4定常領域ドメインならびにSEQ ID NO: 14、16、18、20より選択される軽鎖可変領域配列に隣接したヒトκ定常領域ドメインをさらに含む。

本明細書において前述したとおり、重鎖可変領域および軽鎖可変領域それぞれに関するこれらの例示的な配列は、好ましい可変領域配列である。

本発明の前記のさらなる局面の別の面によれば、本発明の前記のさらなる局面の抗体は、発現ベクターpANTVhG4およびpANTVκを用いて得られる。

非限定的な例として、本発明の前記のさらなる局面の抗体は、実施例2で説明する発現ベクターpANTVhG4およびpANTVκを用いて得ることができる。さらに、発現ベクターpANTVhG4およびpANTVκ中に含まれるもののような特定の抗体配列に基づいて改変抗体が構築される、当業者に周知である他の任意の適切な方法も使用され得る。

別の面において、本発明の前記のさらなる局面は、以下の段階を含む、本発明の前記のさらなる局面の抗ヒトCD4抗体を調製する方法に関する:
(i)ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502から得られる抗体またはその一部分のアミノ酸配列を供給する段階;
(ii)インビトロ技術もしくはインシリコ技術または生物学的アッセイ法を用いるMHC分子へのペプチド結合の測定を含む任意の方法によって、該抗体またはその一部分の該アミノ酸配列内の1つまたは複数のT細胞エピトープを同定する段階;
(iii)配列変異体が、インビトロ技術もしくはインシリコ技術または生物学的アッセイ法によって測定されたMHC分子への該ペプチド結合が実質的に減少するかまたはなくなるように改変された同定されたT細胞エピトープ内の1つまたは複数のアミノ酸を有する、新しい該配列変異体を設計する段階;および
(iv)組換えDNA技術を用いてこのような配列変異体を構築し、本発明の前記のさらなる局面の抗ヒトCD4抗体の特性を有する1種または複数種の配列変異体を同定するために該配列変異体を試験する段階。

段階(ii)によるT細胞エピトープの同定は、当技術分野において以前に説明されている方法に従って実施することができる。適切な方法は、例えば、いずれも参照により本明細書に組み入れられるWO 98/59244;WO 00/34317;米国特許出願第20030153043号において開示されている。前述の方法において、配列変異体は、好ましくは、配列変異による新しいT細胞エピトープの作製を回避するように作製される。ただし、そのような新しいT細胞エピトープが、結果として、MHCクラスII分子へのペプチド結合が実質的に減少するかまたはなくなるように改変される場合は別である。実際には、タンパク質配列に変更を施す場合、任意の適切な手段により、企図される配列をエピトープおよび/またはMHCクラスIIリガンドの存在に関して再試験することによって、企図される変更が新しい免疫原性エピトープを誘導することを回避することが好ましい。

様々な態様において、本発明の前記のさらなる局面の改変抗体は、本発明の前記のさらなる局面において指定されるVH遺伝子およびVL遺伝子の様々な組合せを発現させることによって作製される。重鎖および軽鎖のこのような組合せはすべて、本発明の前記のさらなる局面に包含される。

通常、完全抗体分子の構成は、組換えDNA技術ならびに当技術分野において周知の抗体分子を精製および操作するための方法によって達成することができる。必要な技術は、当業者に周知である標準的な文献において十分に説明されている。

本発明のこの前記のさらなる局面の好ましい分子は、いくつかの方法のいずれかで調製することができるが、最も好ましくは、日常的な組換え方法を活用して行われる。本発明の前記のさらなる局面において提供したタンパク質配列および情報を用いて、好ましい抗体V領域のいずれかをコードするポリヌクレオチド(DNA)を導き出すことは、比較的容易な手順である。これは、例えば、DNAstarソフトウェア一式[DNAstar Inc, Madison, Wis., USA]または類似物などのコンピューターソフトウェアツールを用いて実行することができる。本発明の好ましいポリペプチドまたはその著しいホモログをコードする能力を有する任意のこのようなDNA配列は、本発明のこの前記のさらなる局面の態様としてみなされるべきである。

一般的スキームとして、遺伝子合成によってVH鎖遺伝子またはVL鎖遺伝子のいずれかが作製され、適切な発現ベクター中にクローニングされ得る。次に、発現ベクターは宿主細胞中に導入され、細胞が選択され、培養される。抗体分子は培地から容易に精製され、治療的投与に適した製剤中に配合される。

非限定的な例として、1つのこのようなスキームは、合成オリゴヌクレオチドのパネルを用いた遺伝子合成プロセスを含む。これらの遺伝子は、リガーゼ連鎖反応(LCR)によって組み立てられる。この反応では、相補的末端と特徴として有するオリゴヌクレオチドがアニールされ、続いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅および充填される。PCRは、プライマーとしての役割を果たす隣接オリゴヌクレオチドを高濃度で添加することによって推進される。PCR産物は、5'側および3'側の免疫グロブリン遺伝子隣接領域を含むベクターからのさらなるPCR、および全長抗体の発現用の発現ベクター中へのサブクローニングによって、組み立てられて完全長抗体遺伝子となる。組み立てられたVH遺伝子およびVL遺伝子は、本発明の前記のさらなる局面において開示されるもののいずれかのような多重変異体抗体配列の変異誘発および構築のための鋳型としての機能を果たし得る。(Higuchi et al. (1998))によって説明されている「オーバーラップ伸長PCR」の戦略を使用することが特に簡便であるが、他の方法論および系が容易に応用され得る。

可変領域カセットを含む完全長免疫グロブリン遺伝子は、最も簡便には、オーバーラップPCRを用いて組み立てられ、所望の免疫グロブリン定常領域ドメインを含む発現ベクター中にサブクローニングされる。発現ベクターは、例えばエレクトロポレーション技術を用いて、哺乳動物細胞または他の宿主細胞中に導入され得る。NS0細胞株は、欧州動物細胞培養物コレクション(European Collection of Animal Cell Cultures)(ECACC)から得られる、免疫グロブリンを産生しないマウス骨髄腫であり、この手順のために特に適切な宿主細胞株の例である。抗体を分泌する細胞株が増殖させられ、抗体は、例えばプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて容易に精製され得る (Harlow E & Lane D (2006))。精製された抗体の濃度は、関心対象の抗体のヒトκ定常領域を検出する酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を用いて測定され得る。

本発明の前記のさらなる局面が改変抗CD4抗体に関する限り、そのような改変抗体または改変抗体の断片を含む組成物および関連する組成物もまた、本発明の範囲内であるとみなされる。

したがって、本発明の前記のさらなる局面はさらに、本発明の前記のさらなる局面の抗ヒトCD4抗体および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物にも関する。

本発明の前記のさらなる局面の抗ヒトCD4抗体の治療用組成物は、薬学的に許容される賦形剤と共に使用され得る。本発明の前記のさらなる局面による薬学的組成物は、賦形剤、担体、佐剤、および緩衝剤を含む、薬学的調製物中で慣習的に使用される物質を含めて、従来調製される。組成物は、例えば、非経口的に、経腸的に、筋肉内に、皮下に、静脈内に、または効果をもたらすのに有用な他の経路によって投与され得る。従来の賦形剤には、作用物質と有害な反応を起こさない、非経口経路、経腸経路、および他の投与経路に適した薬学的に許容される有機または無機の担体物質が含まれる。非経口適用の場合、注射用の滅菌液剤、好ましくは油性液剤または水性液剤、ならびに懸濁剤、乳剤、または坐剤を含む埋め込み剤(implant)が特に適切である。アンプルは、簡便な単位投薬量である。薬学的調製物は、滅菌されてよく、所望の場合は、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、または活性化合物と有害な反応を起こさない他の物質と混合されてよい。

本発明の前記のさらなる局面において開示される改変抗体は、特に、限定されるわけではないが多発性硬化症、関節リウマチ、全身性血管炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患および強皮症を含む自己免疫性症状を含む、いくつかの重要なヒト疾患において、また移植での使用のために、有用である。したがって、本発明の前記のさらなる局面の抗体は、治療的処置において使用され得る。非限定的な例は、有効量の本発明の前記のさらなる局面による改変抗体を投与する段階を含む、患者の自己免疫性症状を治療する方法を包含する。様々な態様において、自己免疫性症状は、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性血管炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、または強皮症である。別の例は、有効量の本発明の前記のさらなる局面による抗体を患者に投与する段階を含む、器官の移植の前または後に患者の免疫を抑制する方法である。1つの態様において、移植用の器官は腎臓移植である。本発明の前記のさらなる局面はまた、改変抗体組成物を用いてヒトを治療的に処置するための方法にも関する。個体に投与する場合、改変抗体組成物のいずれかは、好ましくは、少なくとも80％純粋であり、かつ発熱物質および他の混入物を含まないように作製される。

したがって、1つのさらなる面において、本発明の前記のさらなる局面は、対象、好ましくは患者に抗体を投与する段階を含む、治療的処置の方法に関する。好ましくは、この方法は、自己免疫性症状、特に、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性血管炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、および強皮症より選択される自己免疫性症状を治療するためのものである。別の好ましい態様によれば、この方法は、器官、特に腎臓の移植の前または後に患者の免疫を抑制するためのものである。好ましくは、対象はヒトである。好ましくは、有効量の抗体が投与される。

関連する面において、本発明の前記のさらなる局面は、対象を治療的に処置するための医薬を製造するための、本発明の前記のさらなる局面の抗ヒトCD4抗体の使用に関する。好ましくは、この医薬は、自己免疫性症状、特に、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性血管炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、および強皮症より選択される自己免疫性症状を治療するためのものである。別の好ましい態様によれば、この医薬は、器官、特に腎臓の移植の前または後に患者の免疫を抑制するためのものである。好ましくは、対象はヒトである。

別の関連する面において、本発明の前記のさらなる局面は、治療的処置の方法において使用するための、本発明の前記のさらなる局面の抗体に関する。好ましくは、この方法は、自己免疫性症状、特に、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性血管炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、および強皮症より選択される自己免疫性症状を治療するためのものである。別の好ましい態様によれば、この方法は、器官、特に腎臓の移植の前または後に患者の免疫を抑制するためのものである。好ましくは、対象はヒトである。

本発明の前記のさらなる局面の治療の方法および医学的使用において、使用される本発明の前記のさらなる局面の抗CD4抗体の実際の投与量は、治療される障害のタイプおよび重症度、ならびに他の治療様式または選択される様式を含む様々な因子に依存する。投与計画の手引きは、当技術分野において公知のヒト化抗CD4の投与から得られる。

さらに別の面において、本発明の前記のさらなる局面は、本発明の前記のさらなる局面の抗ヒトCD4抗体の重鎖および/または軽鎖の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸に関する。好ましくは、核酸は、SEQ ID NO: 3、5、7、9、13、15、17、および19からなる群より選択される配列を含む。

また、本発明の前記のさらなる局面の一部は、遺伝コードの縮重が原因でSEQ ID NO: 3、5、7、9、13、15、17、および19とは異なる、本発明の前記のさらなる局面の抗ヒトCD4抗体の重鎖および/または軽鎖の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸である。

ポリヌクレオチドに関する縮重とは、遺伝コードにおいて多くのアミノ酸が複数のコドンによって指定されるという当技術分野で十分に認識されている事実を意味する。コードの縮重は、4種の異なる塩基からなる存在し得る64種のトリプレット配列にコードされる異なるアミノ酸が20種である理由を説明する。

別の面において、本発明の前記のさらなる局面は、前述の核酸を含むベクターに関する。好ましくは、この核酸は、発現制御配列に機能的に連結されている。

いくつかの態様において、発現ベクターは、発現制御配列に機能的に連結された、T細胞エピトープの数が減少しているSEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 12の置換された改変変異体を構成するV領域の重鎖または軽鎖をコードする核酸配列を含む。様々な態様において、発現ベクターは、図11に示すとおり、(VHのための)pANTVhG4ベクターおよびVLのためのpANTVκベクターを含むか、またはそれらに由来する。

別の面において、本発明の前記のさらなる局面は、前述の核酸および/または前述の少なくとも1つのベクターを含む宿主細胞に関する。好ましくは、宿主細胞は、それぞれが前述の核酸を含む1つまたは複数のベクターを含む。好ましくは、宿主細胞は、それぞれが前述の核酸を含む2つのベクターを含む。

本発明の前記のさらなる局面はさらに、本発明の前記のさらなる局面の抗ヒトCD4抗体を調製する方法であって、適切な発現制御配列の制御下での発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養する段階、および該抗体を細胞の培地から精製する段階を含む、方法にも関する。

以下の項目1〜33において、本発明の前記のさらなる局面の特定の態様を説明する。
1. 重鎖免疫グロブリン可変ドメイン(VH)および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン(VL)を含む抗ヒトCD4抗体であって、該免疫グロブリン可変ドメインのCDRの外側に位置する少なくとも1つのT細胞エピトープが、該免疫グロブリン可変ドメインから除去される、抗ヒトCD4抗体。
2. モノクローナル抗体である、項目1記載の抗体。
3. ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された前記モノクローナル抗体に由来する、項目2記載の抗体。
4. 前記ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された前記抗体のCDRを有するか、またはSEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 12のCDRを有する、項目1〜3のいずれか一項記載の抗体。
5. 前記免疫グロブリン可変ドメインからの1つまたは複数のT細胞エピトープの除去に起因する違いは例外として、
前記重鎖免疫グロブリン可変ドメインが、前記ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された前記抗体の重鎖免疫グロブリン可変ドメインと同一であるか、またはSEQ ID NO: 2と同一の配列を含み;かつ
前記軽鎖免疫グロブリン可変ドメインが、該ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された該抗体の軽鎖免疫グロブリン可変ドメインと同一であるか、またはSEQ ID NO: 12と同一の配列を含む、
項目1〜4のいずれか一項記載の抗体。
6. 少なくとも1つの前記T細胞エピトープが、
SEQ ID NO: 2の4位〜12位(EH1)、SEQ ID NO: 2の10位〜18位(EH2)、SEQ ID NO: 2の11位〜19位(EH3)、SEQ ID NO: 2の20位〜28位(EH4)、SEQ ID NO: 2の37位〜45位(EH5)、SEQ ID NO: 2の70位〜78位(EH6)、SEQ ID NO: 2の73位〜81位(EH7)、SEQ ID NO: 2の83位〜91位(EH8)、SEQ ID NO: 2の107位〜115位(EH9)、SEQ ID NO: 2の110位〜118位(EH10)における重鎖免疫グロブリン可変ドメインのT細胞エピトープ、ならびに
SEQ ID NO: 12の2位〜10位(EL1)、SEQ ID NO: 12の3位〜11位(EL2)、SEQ ID NO: 12の10位〜18位(EL3)、SEQ ID NO: 12の11位〜19位(EL4)、SEQ ID NO: 12の45位〜53位(EL5)、SEQ ID NO: 12の53位〜61位(EL6)、SEQ ID NO: 12の59位〜67位(EL7)、SEQ ID NO: 12の61位〜69位(EL8)、SEQ ID NO: 12の62位〜70位(EL9)、SEQ ID NO: 12の70位〜78位(EL10)、およびSEQ ID NO: 12の97位〜105位(EL11)における軽鎖免疫グロブリン可変ドメインのT細胞エピトープ
からなる群より選択される、項目1〜5のいずれか一項記載の抗体。
7. 少なくとも1つの前記T細胞エピトープ内の少なくとも1つのアミノ酸が、少なくとも1つの該T細胞エピトープを除去するために別のアミノ酸によって置換される、項目1〜6のいずれか一項記載の抗体。
8. 前記置換が、
SEQ ID NO: 2中のT9S、V10E、A12K、Q19K、S28T、K38R、R40A、L70I、A72R、V73D、S91T、T115L、L116V、および
SEQ ID NO: 12中のI10T、M11L、L46A、V59S、I62S、S69D、R76S、L105I
からなる群より選択される、項目7記載の抗体。
9. 少なくとも1個の置換が存在することを条件として、
0個、1個、2個、または3個の置換が、EH1およびEH6のそれぞれの内部にあり;
0個、1個、または2個の置換が、EH2、EH5、およびEH10のそれぞれの内部にあり;
0個または1個の置換が、EH3、EH4、EH7、EH8、およびEH9のそれぞれの内部にあり;
0個、1個、または2個の置換が、EL2、EL3、EL7、EL8、およびEL9のそれぞれの内部にあり;かつ
0個または1個の置換が、EL1、EL4、EL5、EL6、EL10、およびEL11のそれぞれの内部にある、
項目6〜8のいずれか一項記載の抗体。
10. 6個、8個、もしくは10個のT細胞エピトープが前記重鎖免疫グロブリン可変ドメインから除去され、かつ/または5個、9個、10個、もしくは11個のT細胞エピトープが前記軽鎖免疫グロブリン可変ドメインから除去される、項目1〜9のいずれか一項記載の抗体。
11. 前記重鎖免疫グロブリン可変ドメインが、SEQ ID NO: 4、6、8、および10からなる群より選択される配列を含み;かつ/または
前記軽鎖免疫グロブリン可変ドメインが、SEQ ID NO: 14、16、18、および20からなる群より選択される配列を含む、
項目1〜10のいずれか一項記載の抗体。
12. 前記重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 4と同一の配列を含み、かつ前記軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 14と同一の配列を含むか;
該重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 4と同一の配列を含み、かつ該軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 20と同一の配列を含むか;
該重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 6と同一の配列を含み、かつ該軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 14と同一の配列を含むか;
該重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 6と同一の配列を含み、かつ該軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 16と同一の配列を含むか;
該重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 6と同一の配列を含み、かつ該軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 20と同一の配列を含むか;
該重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 8と同一の配列を含み、かつ該軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 16と同一の配列を含むか;
該重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 8と同一の配列を含み、かつ該軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 20と同一の配列を含むか;
該重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 10と同一の配列を含み、かつ該軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 14と同一の配列を含むか;
該重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 10と同一の配列を含み、かつ該軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 16と同一の配列を含むか;または
該重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 10と同一の配列を含み、かつ該軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 20と同一の配列を含む、
項目10または11記載の抗体。
13. 前記重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 4と同一の配列を含み、かつ前記軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 14と同一の配列を含むか;
該重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 6と同一の配列を含み、かつ該軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 16と同一の配列を含むか;
該重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 10と同一の配列を含み、かつ該軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 16と同一の配列を含むか;または
該重鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 10と同一の配列を含み、かつ該軽鎖免疫グロブリン可変ドメインがSEQ ID NO: 20と同一の配列を含む、
項目12記載の抗体。
14. 前記抗体のCD4に対する結合親和性が、前記ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された前記抗体の結合親和性の10倍または10分の1の範囲内である、項目1〜13のいずれか一項記載の抗体。
15. 前記抗体のCD4に対する結合親和性が、前記ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された前記抗体の結合親和性の2倍または2分の1の範囲内である、項目14記載の抗体。
16. 前記抗体のCD4に対する結合親和性が、前記ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502によって産生された前記抗体よりも高い、項目14または15記載の抗体。
17. (a)前記抗体のMHCクラスII分子に結合する能力が低下しており;
(b)該抗体が対象においてより弱い免疫応答を誘導し;
(c)タンパク質が全長抗体であり;
(d)キメラ抗体であり;かつ/または
(e)親分子の最も免疫原性が高い領域内に置換がある、
項目1〜16のいずれか一項記載の抗体。
18. 重鎖可変領域がヒトIgG4定常領域ドメインに連結されており、かつ軽鎖可変領域がヒトκ定常領域ドメインに連結されている、項目1〜17のいずれか一項記載の抗体。
19. 発現ベクターpANTVhG4およびpANTVκを用いて得られる、項目18記載の抗体。
20. 以下の段階を含む、項目1〜19のいずれか一項記載の抗体を調製する方法:
(i)前記ハイブリドーマ細胞株ECACC 88050502から得られる前記抗体またはその一部分のアミノ酸配列を供給する段階;
(ii)インビトロ技術もしくはインシリコ技術または生物学的アッセイ法を用いるMHC分子へのペプチド結合の測定を含む任意の方法によって、該抗体またはその一部分のアミノ酸配列内の1つまたは複数のT細胞エピトープを同定する段階;
(iii)配列変異体が、インビトロ技術もしくはインシリコ技術または生物学的アッセイ法によって測定されたMHC分子への該ペプチド結合が実質的に減少するかまたはなくなるように改変された同定されたT細胞エピトープ内の1つまたは複数のアミノ酸を有する、新規の該配列変異体を設計する段階;および
(iv)組換えDNA技術によってこのような配列変異体を構築し、項目1〜20のいずれか一項記載の抗体の特性を有する1種または複数種の配列変異体を同定するために該配列変異体を試験する段階。
21. 項目1〜19のいずれか一項記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
22. 対象を治療的に処置するための医薬を製造するための、項目1〜19のいずれか一項記載の抗体の使用。
23. 前記医薬が、自己免疫性症状、特に、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性血管炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、および強皮症より選択される自己免疫性症状を治療するためのものであるか;または該医薬が、器官、特に腎臓の移植の前もしくは後に患者の免疫を抑制するためのものである、項目22記載の使用。
24. 治療的処置の方法において使用するための、項目1〜19のいずれか一項記載の抗体。
25. 前記方法が、自己免疫性症状、特に、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性血管炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、および強皮症より選択される自己免疫性症状を治療するためのものであるか;または該方法が、器官、特に腎臓の移植の前もしくは後に患者の免疫を抑制するためのものである、項目24記載の抗体。
26. 前記対象がヒトである、項目22〜25のいずれか一項記載の使用または抗体。
27. 項目1〜19のいずれか一項記載の抗体の重鎖および/または軽鎖の免疫グロブリン可変ドメインをコードする、核酸。
28. SEQ ID NO: 3、5、7、9、13、15、17、および19からなる群より選択される配列を含む、項目27記載の抗体。
29. 項目27または28記載の核酸を含む、ベクター。
30. 前記核酸が発現制御配列に機能的に連結されている、項目29記載のベクター。
31. (i)抗体16H5.chimIgG4、
(ii)2011年12月2日にDSMZに寄託された細胞株CD4.16H5.chimIgG4から得ることができる、抗体
である、これらの項目のいずれか一項記載の抗体。
32. 項目27もしくは28記載の核酸および/または項目29〜31のいずれか一項記載の少なくとも1つのベクターを含む、宿主細胞。
33. 適切な発現制御配列の制御下での発現を可能にする条件下で項目32記載の宿主細胞を培養する段階、および該抗体を細胞の培地から精製する段階を含む、項目1〜19のいずれか一項記載の抗体を調製する方法。

本発明はさらに、「ECACC 88050502」という用語が「MAX.16H5/30F16H5」で置き換えられる、本明細書において開示する態様の代替の態様にも関する。同様に、本発明はさらに、本明細書において使用される「細胞株ECACC 88050502」という用語または同等の用語が「細胞株MAX.16H5/30F16H5」という用語または同等の用語で置き換えられる態様にも関する。

本発明はさらに、「ECACC 88050502」という用語が「CD4.16H5.chimIgG4」で置き換えられる、本明細書において開示する態様の代替の態様にも関する。同様に、本発明はさらに、本明細書において使用される「細胞株ECACC 88050502」という用語または同等の用語が「細胞株CD4.16H5.chimIgG4」という用語または同等の用語で置き換えられる態様にも関する。

以下に、本発明の範囲を限定することを意図していない図面および実施例によって本発明を例示する。

実施例1:
動物
ドナーC57Bl/6 CD4k/oマウス、C57Bl/6野生型マウス、およびレシピエントBalb/c野生型マウスは、ライプツィヒ大学の動物施設で飼育された。標準化した条件下でマウス系統を維持した。C57Bl/6 CD4k/oマウスは、マウスCD4分子がノックアウトされヒトCD4を発現する、安定なC57Bl/6バックグラウンドを有する。CD4導入遺伝子は、マウスCD4エンハンサーエレメントに連結されたそれ自身のプロモーターを含み、したがって、T細胞サブセットに特異的な発現をもたらす。CD8+細胞は、TTGマウスにおいて影響を受けていない。さらに、これらのマウスは、マウスMHC II複合体に加えて、HLA-DR3分子を発現する。TTGマウスは、CD4およびHLA-DRに関して改変されている完全な機能的マウス免疫系を有する。マウスには自由に摂食させた。ドナーとして、C57Bl/6マウスおよびBalb/cマウスをCharles River(Sulzfeld, Germany;http://jaxmice.jax.org)から購入した。

マウスはすべて、ライプツィヒ大学の動物管理委員会およびライプツィヒの動物管理の地方委員会のガイドラインに従って、飼育するか、扱うか、または取り扱った(動物実験登録番号28/08)。

統計学的解析
データはすべて、平均値±SDとして提示される。統計学的解析およびグラフによる説明は、SigmaPlot 10.0/SigmaStat 3.5ソフトウェア(SYSTAT, Erkrath, Germany)を用いて行った。

放射線照射のプロトコール
マウスの放射線照射のために、X線装置(D3225, Orthovoltage, Gulmay Medical, Camberley, UK)を動物放射線照射用に調整した。体重に応じて、プレキシガラス容器(それぞれ0.5cm×64.0cmの5つの空間に分けられている)中で動物5匹に同時に放射線照射した。平均放射線量は8.5Gyであった。

骨髄細胞および脾細胞の調製
無菌条件下で、C57Bl/6 CD4k/oマウスまたはC57Bl/6野生型マウスの脛骨および大腿骨から骨髄細胞(BMC)を新しく得た。したがって、骨ならびに遠位端および近位端から慎重に前処理された筋系および腱を除去した。細い針(0.4×19mm)を用いて、骨髄細胞を無菌PBSですすぎ、50ml管中に採取した。針を通過させて慎重に再懸濁させることによって、単細胞懸濁液を得た。続いて、300×gで10分間、PBS(1×)中で細胞を一度洗浄し、PBS(1×)中に再び再懸濁し、計数チャンバーを使用し、Tuerk染色液によって染色して、細胞総数を測定した。この後、300×gで10分間、PBS(1×)中で骨髄細胞をもう一度洗浄し、FCSを含まないダルベッコ改変イーグル最小必須培地(DMEM;Perbio, Bonn, Germany)中に細胞ペレットを再懸濁した。C57Bl/6 CD4k/oマウスまたはC57Bl/6野生型マウスから単細胞の脾細胞懸濁液を作製するために、マウスの死亡後、無菌条件下で直ちに脾臓を摘出し、セルストレイナー(100μm)に押し通し、50ml管に入れたPBS(1×)中に採取した。300×gで10分間、PBS(1×)中でこの単細胞懸濁液を2回洗浄した。続いて、無菌PBS中に0.155mol NH₄Cl、0.01mol KHCO₃、および0.01mol EDTA-Na(pH7.3)を含む溶解緩衝液に赤血球を溶解した。細胞を再び洗浄し、FCSを含まないDMEM培地中に再懸濁し、細胞数を計測した。抗体インキュベーションの前に、骨髄細胞および脾細胞を所望の細胞数に調整した。

当業者に容易に理解されるとおり、本発明の実施例における脾細胞の使用は、操作上の理由から発生する−脾細胞の補足的使用は、特にヒト対象に関する限りでは、本発明によって実際には必要とされない。

抗体インキュベーション
抗体インキュベーションのために、必要とされる量のMax16H5抗体を使用直前にDMEM(FCSを含まない)に溶解して最終濃度を1mg/mlにした。続いて、C57Bl/6 CD4k/oマウスまたはC57Bl/6野生型マウスに由来する骨髄細胞1.4×10⁸個および脾細胞1.4×10⁸個を、FCSを含まない15mlのDMEMに溶かした800μgのMax16H5と共に暗所、室温で1時間インキュベートした。対照として、抗体治療を行っていないC57Bl/6 CD4k/oマウスまたはC57Bl/6野生型マウスの骨髄細胞および脾細胞もまた、同じ条件下で、FCSを含まないDMEM中でインキュベートした。1時間のインキュベーションの後、300×gで10分間細胞を遠心分離してそれらを沈殿させ(pellet)、300×gで10分間、PBS(1×)中で1回洗浄して、未結合抗体を除去した。

細胞移植
同時移植実験のために、Max16H5で処理したCD4k/oマウスの骨髄細胞2×10⁷個を、Max16H5で処理したCD4k/oマウスの脾細胞2×10⁷個に添加した。最終体積150μlの無菌0.9％NaCl中で細胞濃度を調整した。同様にMax16H5で処理したC57Bl/6野生型マウスの骨髄細胞および脾細胞に対して同じことを行った。対照として、CD4k/oマウスの非処理骨髄細胞2×10⁷個をCD4k/oマウスの非処理脾細胞2×10⁷個に添加するか、またはC57Bl/6野生型マウスの骨髄細胞2×10⁷個をC57Bl/6野生型マウスの脾細胞2×10⁷個に添加した。続いて、致死的に放射線照射したレシピエントBalb/c野生型マウスの外側尾静脈中に静注することによって、移植片を同種間移植した。移植後毎日、生存状況、Cooke et. al, 1996によるGvHD病状、および体重を評価した。

フローサイトメトリー
移植前および移植後に、レシピエントBalb/c野生型マウスをフローサイトメトリーによって解析した。

ドナーCD4k/oマウスの脾細胞および骨髄細胞の特徴決定
細胞数測定解析のために、複合モノクローナル抗体(マウスCD3-FITC、ヒトCD4-APC[いずれもBeckman Coulter, Krefeld, Germany];マウスCD8-PerCP、MHC-I(H-2D[b])-PE、マウスCD4-PECy7、マウスCD19-APCCy7[BD Biosciences, Heidelberg, Germany])2.5μlと共に細胞をインキュベートした。20分間のインキュベーション後、PBS/1％FBS中での2回の洗浄段階(1250rpm、5分、室温[RT])を行った。最後に、沈殿物をPBS 200μlで再懸濁した。さらに、7-アミノ-アクチノマイシンD(7AAD)で染色することによって、脾細胞および骨髄細胞の生存率を移植前に試験した。室温で30分間、PBS(300μl)に溶かした7AAD(5μl)(0.25μg/試験)と共に細胞1×10⁶個をインキュベートし、直ちに測定した。BD FACSCantoII(商標)フローサイトメーターを用いてデータを取得し、BD FACSDIVA(商標)ソフトウェアを用いて解析した(いずれも、BD Biosciences, Heidelberg, Germany)。

レシピエントBalb/c野生型マウスのフローサイトメトリーおよび血液学
移植処置前および移植処置後に、レシピエントマウスをフローサイトメトリーによって解析した。特定の時点に、エーテル麻酔下で各マウスの後眼窩静脈から血液(150μl)を採取した。ヘパリン処理済み毛細管(Greiner Biochemica, Flacht, Germany)を用いて血液を採取した。血液採取後2時間以内にマウス血液に合うように調整しておいたAnimal Blood Counter(SCIL, Viernheim, Germany)を用いてヘモグロビン濃度を測定した。細胞数測定解析のために、試料に応じた(according to samples)複合モノクローナル抗体(マウスCD4-PECy7、MHC-I(H-2D[b])-PE、MHC-I(H-2K[d])-FITC、マウスCD8-PerCP、マウスCD19-APCCy7[BD Biosciences, Heidelberg, Germany];マウスCD3-FITC、ヒトCD4-APC[Beckman Coulter, Krefeld, Germany];ヒトHLA-DR3-FITC[Immunotools, Friesoythe, Germany])2.5μlと共に血液細胞100μlをインキュベートした。20分間のインキュベーション後、製造業者の取扱い説明書に従って赤血球溶解を行った(BD FACS溶解溶液(Lysing Solution)[BD Biosciences, Heidelberg, Germany])。PBS/1％FBSを添加することにより、試料を2回洗浄した(1250rpm、5分、室温[RT])。最後に、沈殿物をPBS 200μlで再懸濁した。調節性T細胞を検出するためのマウスFoxP3の細胞数測定解析には、マウスT_reg検出キット(Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany)を使用した。MACS緩衝液(0.5％FCS、PBS中2mM EDTA[Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany])90μl中に細胞1×10⁶個を再懸濁し、10μlのCD4-FITC抗体およびCD25-PE抗体(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)で細胞表面マーカーを染色した。暗所、4℃で10分間のインキュベーションの後、MACS緩衝液2mlで細胞を洗浄し、300×g、4℃で5分間遠心分離した。上清を除去した後、新しく調製した固定/透過処理溶液(ホルムアルデヒドを含む)1ml中、4℃で30分間インキュベートすることによって、細胞1×10⁶個を透過処理した。300×g、4℃で5分間遠心分離することによって、冷たいMACS緩衝液2ml中で細胞を洗浄した。細胞内FoxP3を染色するために、上清除去の後に透過処理段階を続けた。細胞1×10⁶個を冷たい透過処理緩衝液2mlを用いて洗浄し、300×g、4℃で5分間遠心分離した。細胞ペレットを冷たい透過処理緩衝液80μl中に再懸濁し、4℃で5分間インキュベートした。続いて、抗FoxP3-APC(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)抗体10μlを添加し、慎重に混合し、4℃で30分間インキュベートした。細胞を冷たい透過処理緩衝液2mlを用いて洗浄し、300×g、4℃で5分間遠心分離し、上清を除去し、細胞をMACS緩衝液100μl中に再懸濁した。BD FACSCantoII TMフローサイトメーターを用いてデータを取得し、BD FACSDIVA(商標)ソフトウェアを用いて解析した(いずれも、BD Biosciences, Heidelberg, Germany)。

免疫組織学
マウスの器官をステンレス鋼ビーカー(2-メチルブタンを含む;Carl Roth, Karlsruhe, Germany)中に入れ、液体窒素中に15分間浸し、切片化の準備が整うまで-80℃で保存した。切片化はCryostat(Leica Biosystems, Nussloch, Germany)を用いて実施し;対象物をスーパーフロストスライド(Thermo Scientific, Braunschweig, Germany)上に移し、免疫組織学的解析をするまで-80℃で直ちに保存した。対象のスライドを0.3％ w/v H₂O₂と共にインキュベートし、ウェットチャンバー中で10分間PBSに溶解し、次いで、PBSで3回洗浄した。室温で60分間、PBS中10％ w/v FBSで器官を処理し、PBSで手短に洗浄し、アビジン溶液(Dako North America, Carpinteria, USA)と共に10分間インキュベートし、PBSで洗浄した。この調製物をビオチン溶液 (Dako North America)と共に10分間インキュベートし、PBSで洗浄し、1:100で希釈した1次抗体である抗ヒトCD4抗体(United States Biological, Massachusetts, USA)またはアイソタイプ対照(ラットIgG1、κ、BD Biosciences, San Diego, USA)と共に室温で1時間インキュベートした。次に、1:100で希釈した二次抗体(ビオチン結合ヤギ抗ラットIgG₁、BD Biosciences, San Diego, USA)で室温にて30分間スライドを覆い、PBSで洗浄した。対象のスライドをストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(BD Biosciences, San Diego, USA)で30分間覆い、PBSで3回洗浄し(各洗浄段階につき2分)、明らかに濃い色に達するまで5分間、DAB希釈物(BD Biosciences, San Diego, USA)と共にインキュベートし、次いで、ddH2Oで3回洗浄した。これらの試料をマイヤーのヘマラム溶液(Merck, Darmstadt, Germany)で1分間覆い、次いで、水道水で10分間洗浄して青い染色を可視化した。濃度が上昇するアルコール系列(40〜100％ w/v)を通過させた対象スライドをキシレン(Carl Roth)と共に5分間インキュベートし、最後にEntellan(登録商標)(Merck)で覆った。顕微鏡(Zeiss, Axio, Imager A1, 対物レンズ920 EX Plan-Neofluar, Axiocam MRc5 Zeiss, Axio Vision Release 4.6.3;Gottingen, Germany)下でスライドを解析した。

組織学
すべてのトランスジェニックマウスの肝臓、骨、および腸を組織学的に解析した。死亡直後に器官を前処理し、ヘマトキシリン-エオシン(HE)およびカオリン-アニリン-オレンジG(KAO)染色のためにホルマリン(4％ w/v;Merck)中に移した。このホルマリンの箱を暗所で保管して、ホルマリン析出を防いだ。室温で少なくとも7日間、Osteosoft(登録商標)中で骨をインキュベートした。試料はすべて、水道水で2時間洗い流し、次いで、70〜100％ w/vのアルコール希釈物に9時間浸した。イソプロパノール(JT Baker, Deventer, The Netherlands)と共に1時間、および安息香酸メチル(Riedel de-Haen, Seelze, Germany)と共に一晩、最終的なインキュベーションを行った。その後、器官をパラフィンに3日間包埋し、薄片を作った(6lm)。これらのスライドを室温で5分間、キシレンと共に2回インキュベートし、濃度が低下するアルコール系列(100〜50％ w/v)を通過させ、最後に室温のddH2O中に移した。対象のスライドをマイヤーのヘマラム溶液に5分間浸け、水道水で10分間洗浄して青い染色を得た。1％w/vエオシンYとのインキュベーション後、これらのスライドを濃度が上昇する(70〜100％ w/v)アルコール系列に通過させ、最後にEntellan(登録商標)(Merck)で覆った。対象のスライドを顕微鏡下で解析した(Nikon, Eclipse TE2000-E 920、対物レンズ Plan Fluor 920/0.45 Ph1 DM ∞/0-2 WD 7.4 Histo, Software Nikon, LuciaG 5.00; Dusseldorf, Germany)。Halmi-Konecnyによって説明されているとおりに、KAOで骨を染色した。

実施例2:
当技術分野において周知の方法、および必要に応じて、これらの方法で使用される酵素の使用に関する供給業者の取扱説明書を用いて、組換えDNA技術を遂行した。一般的方法の出所には、SambrookおよびRusselならびにAusubelによって編集された周知の書籍のような標準的文献が含まれた。詳細な実験室方法もまた、後述する。WO9859244で説明されているもののようなインシリコ方法を用いて、MHCクラスII分子に結合すると予測されるペプチド(これらはT細胞エピトープとみなされた)に対するマウス抗CD4の可変重鎖配列および可変軽鎖配列を解析した。

実施例2a:キメラ抗CD4抗体
Poly A Tract System 1000 mRNA抽出キット(Promega Corp.Madison WI)を製造業者の取扱い説明書に従って用いて、マウス抗CD4ハイブリドーマ細胞からmRNAを抽出した。次のとおりにmRNAを逆転写した。κ軽鎖の場合、5.0μlのmRNAを1.0μlの20pmol/μl MuIgκVL-3'プライマーOL040(表2)および5.5μlのヌクレアーゼ非含有水(Promega Corp.Madison WI)と混合した。λ軽鎖の場合、5.0μlのmRNAを1.0μlの20pmol/μl MuIgκVL-3'プライマーOL042(表2)および5.5μlのヌクレアーゼ非含有水(Promega Corp.Madison WI)と混合した。γ重鎖の場合、5μlのmRNAを1.0μlの20pmol/μl MuIgVH-3'プライマーOL023(表1)および5.5μlのヌクレアーゼ非含有水(Promega Corp.Madison WI)と混合した。3種の反応混合物はすべて、70℃に設定したサーマルサイクラーの予熱済みブロック中に5分間入れた。これらを氷上で5分間冷やした後、それぞれImPromII 5倍反応緩衝液(Promega Corp.Madison WI)4.0μl、RNasinリボヌクレアーゼ阻害剤(Promega Corp.Madison WI)0.5μl、25mM MgCl2(Promega Corp.Madison WI)2.0μl、10mM dNTP混合物(Invitrogen, Paisley UK)1.0μl、およびImpromII逆転写酵素(Promega Corp.Madison WI)1.0μlに添加した。これらの反応混合物を室温で5分間インキュベートした後、42℃に設定した予熱済みPCRブロックに1時間の間移しておいた。この時間の後、70℃で15分間、PCRブロック中でインキュベートすることにより、逆転写酵素を加熱不活性化した。

次のとおりに、重鎖配列および軽鎖配列をcDNAから増幅した。10×Hi-Fi Expand PCR緩衝液(Roche, Mannheim Germany)37.5μl、10mM dNTP混合物(Invitrogen, Paisley UK)7.5μl、およびHi-Fi Expand DNAポリメラーゼ(Roche, Mannheim Germany)3.75μlをヌクレアーゼ非含有水273.75μlに添加することによって、PCRマスター混合物を調製した。このマスター混合物を、氷上の薄壁PCR反応チューブ15本に21.5μlずつ分注した。これらのチューブのうちの6本に、MuIgVH-3'逆転写反応混合物2.5μlおよび重鎖5'プライマーのプールHA〜HFの1.0μlを添加した(プライマー配列およびプライマープールの構成成分については表1を参照されたい)。別の7本のチューブには、MuIgκVL-3'逆転写反応物2.5μlおよび軽鎖5'プライマーのプールLA〜LG(表2)の1.0μlを添加した。最後のチューブには、MuIgκVL-3'逆転写反応2.5μlおよびλ軽鎖プライマーMuIgλVL5'-LIの1.0μlを添加した。反応物をサーマルサイクラーのブロックに入れ、95℃まで2分間加熱した。94℃で30秒間、55℃で1分間、および72℃で30秒間というサイクルを40回行って、PCR反応を実施した。最後に、PCR産物を72℃で5分間加熱し、次いで、4℃で維持した。

pGEM-T easy Vector System I(Promega Corp.Madison WI)キットを用いてpGEM-Tイージーベクター中に増幅産物をクローニングし、配列決定した。得られたマウスVH配列およびマウスVL配列をSEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2(図12)ならびにSEQ ID NO: 11およびSEQ ID NO: 12 (図13)として示す。

キメラ抗体を生成させるために、プライマーOL330およびOL331(表3)を用いたPCRによってVH領域遺伝子を増幅した。これらは、cDNAクローンの内の1つに由来するプラスミドDNAを鋳型として用いて、制限酵素部位5'MluIおよび3'HindIIIにおいて遺伝子操作するように設計された。0.5ml容PCRチューブ中で、10×Hi-Fi Expand PCR緩衝液(Roche, Mannheim Germany)5μl、10mM dNTP混合物(Invitrogen, Paisley UK)1.0μl、プライマーOL330 0.5μl、プライマーOL331 0.5μl、鋳型DNA 1.0μl、およびHi-Fi Expand DNA ポリメラーゼ(Roche, Mannheim Germany)0.5μlを、ヌクレアーゼ非含有水41.5μlに添加した。

オリゴヌクレオチドOL332およびOL333(表4)を用いて同様の方法でVL領域を増幅して、制限酵素部位BssHIIおよびBamHIにおいて遺伝子操作した。反応物をサーマルサイクラーのブロックに入れ、95℃まで2分間加熱した。94℃で30秒間、55℃で1分間、および72℃で30秒間というサイクルを30回行って、ポリメラーゼ連鎖(PCR)反応を実施した。最後に、PCR産物を72℃で5分間加熱し、次いで、4℃で維持した。次いで、VH領域およびVL領域のPCR産物を、それぞれベクターpANTVhG4およびpANTVκ(図11)のそれぞれMluI/HinDIII部位およびBssHII/BamHI部位にクローニングした。pANTVhG4およびpANTVκの両方とも、ヒトIg発現カセットを含むpAT153ベースのプラスミドである。pANTVhG4中の重鎖カセットは、hCMVieプロモーターによって駆動され下流にヒトIgGポリA領域を有するヒトゲノムIgG4定常領域遺伝子からなる。pANTVhG4はまた、SV40プロモーターによって駆動され下流にSV40ポリA領域を有するハムスターdhfr遺伝子も含む。

pANTVκの軽鎖カセットは、hCMVieプロモーターによって駆動され下流に軽鎖ポリA領域を有するヒトゲノムκ定常領域から構成される。ヒトIgリーダー配列と定常領域の間にクローニング部位があることで、可変領域遺伝子の挿入が可能になる。

エレクトロポレーションによって、これら2つのプラスミドをNS0細胞(ECACC 85110503, Porton, UK)に同時トランスフェクトし、DMEM(Invitrogen, Paisley UK)＋5％FBS(超低IgG、カタログ番号16250-078、Invitrogen, Paisley UK)＋ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen, Paisley UK)＋100nMメトトレキサート(Sigma, Poole UK)中で選択した。メトトレキサート耐性コロニーを単離し、1ml容HiTrap MabSelect Sureカラム(GE Healthcare, Amersham UK)を製造者が推奨する条件に従って用いるプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製した。

精製ヒトIgG1/κ(Sigma,Poole UK)を標準物質として用いるIgG Fc/κ ELISAによって、NS0上清における抗体発現を定量した。1×PBS(pH7.4)中で1:1500に希釈したマウス抗ヒトIgG Fc特異的抗体(I6260 Sigma, Poole UK)で、37℃にて1時間、免疫吸着性(immunosorb)96ウェルプレート(Nalgene Hereford, UK)をコーティングした。PBS+0.05％Tween20中でプレートを3回洗浄した後、2％BSA/PBS中で希釈した試料および標準物質を添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした後、PBS/Tween中で3回洗浄し、2％BSA/PBS中で1:1000に希釈した検出用抗体のヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼ結合体(A7164 Sigma, Poole UK)を100μl/ウェルで添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした後、PBS/tweenで5回洗浄し、結合された抗体をOPD基質(Sigma, Poole UK)を用いて検出した。このアッセイ法は、暗所で5分間発色させた後、3M HClを添加することによって停止させた。次いで、アッセイ用プレートをMRX TCIIプレートリーダー(Dynex Technologies, Worthing, UK)において490nmで読み取った。

B-Tagマイクロビオチン標識キット(Sigma, Poole UK)を用いてビオチン標識したマウス抗CD4抗体を用いた、ELISAに基づく競合アッセイ法において、キメラ抗体を試験した。キメラIgG4または対照マウス抗体の10μg/ml〜0.009μg/mlの希釈系列を一定濃度のビオチン標識抗CD4(0.2μg/ml)と予備混合した後、50μl/ウェルの1μg/ml CD4で予めコーティングしたNunc MaxiSorp 96ウェル平底マイクロタイタープレート(Fisher, Loughborough, UK)中にウェルあたり100μl入れて、室温で1時間インキュベートした。100μl/ウェルのストレプトアビジン-HRP(Sigma)1/500希釈物と共に室温で1時間インキュベートし、続いて100μl/ウェルのOPD基質(Sigma)を用いて検出することによって、ビオチン標識mAbの結合を測定した。50μl/ウェルの3M HClを用いて反応を停止させた後、Dynex Technologies(Worthing, UK)MRX TC IIプレートリーダーを用いて490nmでの吸光度を測定した。

得られた結果(図14)から、キメラIgG4およびマウス抗CD4抗体が、それぞれ0.25μg/mlおよび0.18μg/mlのIC50値を示し、極めて類似した結合特性を有することが示される。したがって、正確な可変領域配列が同定されクローニングされた。

実施例2b:改変抗CD4抗体の設計
可変領域の全長に及ぶ連続した9merペプチドを、MHCクラスII対立遺伝子34個のパネルに対する結合に関してインシリコで試験した。個々の各対立遺伝子に対するスコアを0〜1の尺度に標準化し、公知のMHCクラスII結合ペプチドのパネルを用いて広範囲に渡って検証したところ、カットオフ値0.55によって、予想される結合ペプチドと非結合ペプチドとが有効に区別されることが実証された。詳細には、ソフトウェアiTope(商標)を用いて、可変ドメイン内の潜在的なMHCクラスII結合配列を同定した。iTope(商標)ソフトウェアは、あるペプチドのアミノ酸側鎖と34個のヒトMHCクラスII対立遺伝子の結合溝内の特異的結合ポケットとの好ましい相互作用を予測する。試験タンパク質配列の全体に及ぶアミノ酸1個ずつ重複した9merペプチドをインシリコで作製することによって、鍵となる結合残基の位置特定は達成される。潜在的な「フィット」およびアミノ酸側鎖とMHCクラスII分子の結合溝との相互作用に基づいて、各9merを採点した。ソフトウェアによって算出されたペプチドスコアは0〜1の間になる。高い平均結合スコアをもたらしたペプチド(iTope(商標)スコアリング機能において0.55より大きい)は強調され、MHCクラスII結合ペプチドの50％超、すなわち、対立遺伝子34個の内の17個が高い結合親和性(スコアが0.6より大きい)を有していた場合、そのようなペプチドは「相手を選ばない高親和性」MHCクラスII結合ペプチドと定義された。このようなペプチドは、CD⁴⁺T細胞エピトープを含むには高リスクとみなされている。中親和性のMHCクラスII結合ペプチドは、高い親和性で多数(ただし17個未満)の対立遺伝子に結合する。次いで、iTope(商標)ソフトウェアにより、配列に加えられ得る、MHCクラスII対立遺伝子への結合を減少させるかまたはなくすと思われる変更に関して、高親和性の結合物および中親和性の結合物を解析した。アミノ酸セレクションを作製する際、ヒト抗体の任意の所与の位置に天然に存在するアミノ酸の範囲を考慮に入れた。あるいは、例えば以下の、公的に入手可能なソフトウェアも使用され得る:
ProPred(www.imtech.res.in/raghava/propred/)、
Rankpep(bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/)、または
NetMHCII(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/)。

マウス重鎖可変領域において10種のMHCクラスII結合ペプチドが同定され(表5)、マウス軽鎖可変領域において11種が同定された(表6)。表5および表6は、同定されたMHCクラスII結合配列およびMHCクラスII結合を減少させるために図12および図13の配列で使用した一連の配列変異体を列挙したものである。MHCクラスII結合配列が同定された場合、MHCクラスII結合を減少させるか、またはなくすために、鍵となるMHCクラスII結合位置にあるペプチド中のアミノ酸を代替のアミノ酸で置き換えた。いくつかの場合においては、結合を完全になくすために複数の変異が必要とされ、他の場合においては、関与する対立遺伝子の数は少なく、結合スコアはカットオフ値に近かったものの、MHCクラスII結合を完全になくすことができなかった。

(^*)結合された対立遺伝子の数

(^*)結合された対立遺伝子の数

実施例2c:改変抗CD4抗体の作製
最初の改変抗体VH領域遺伝子およびVK領域遺伝子は、当技術分野において公知の方法を用いて実施例2aに由来するマウス親抗CD4可変領域(SEQ ID NO: 1(図12)およびSEQ ID NO: 11(図13)(図12および図13)をオーバーラップPCRで変異誘発することによって作製した。オーバーラップPCRによる変異誘発によって、SEQ ID NO: 3(図12)およびSEQ ID NO: 13(図13)からその他の変異体を構築した。次いで、組み立てられた変異体を図11の発現ベクター中に直接クローニングした。クローンはすべて、DNA配列決定によって確認した。詳細には、PCR変異誘発は次のとおりに実施した。センスDNA鎖およびアンチセンスDNA鎖の両方における、変更されるべき鋳型ヌクレオチド配列の領域にまたがるプライマー対を設計した。これらのプライマーは、鋳型配列と同一であり、かつ正確な位置にプライマーを固着させる機能を果たす配列に隣接された、導入/変更されるべき配列を含んだ。変異したPCR産物を発現ベクター中にクローニングするのに適した制限部位(すなわち、VH遺伝子のためのMluIおよびHinDIIIならびにVK遺伝子のためのBssHIIおよびBamHI)を含む5'末端プライマーおよび3'末端プライマーも必要とされた。表3、表4、および表7は、脱免疫変異体の構築のために使用される全プライマーを列挙している。オーバーラップPCRの場合、末端が隣接断片と重複している遺伝子の小断片を個別にPCR増幅し、プライマーによって重複領域に変異を導入する。次いで、短いPCR断片を精製し、5'末端プライマーおよび3'末端プライマーを用いた1回のPCR反応で1つに組み立てる。変異体4遺伝子を作製するために、マウス可変領域を鋳型として使用し、後続の変異体すべてに対して、変異体4遺伝子をPCR反応用の鋳型として使用した:VH変異体4の場合、OL335+OL337およびOL336+OL338を用いて2回の個別のPCRを実施し、OL334+OL338を用いてそれらの断片を連結した。VH変異体3の場合、OL339+OL341およびOL340+OL342を用いて2回の個別のPCRを実施し、OL339+OL342を用いてそれらの断片を連結した。VH変異体2の場合、OL330+OL344、OL343+OL346、およびOL354+OL342を用いて3回の個別のPCRを実施し、OL330+OL342を用いてそれらの断片を連結した。VH変異体1の場合、OL339+OL348、OL347+OL350、およびOL349+OL342を用いて3回の個別のPCRを実施し、OL339+OL342を用いてそれらの断片を連結した。VK変異体4の場合、OL332+OL352、OL351+OL354、OL353+OL356、およびOL355+OL357を用いて4回の個別のPCRを実施し、OL332+OL357を用いてそれらの断片を連結した。VK変異体3の場合、OL358+OL357を用いて1回のPCRを実施した。VK変異体2の場合、OL358+OL360およびOL359+OL357を用いて2回の個別のPCRを実施し、OL358+OL357を用いてそれらの断片を連結した。VK変異体1の場合、OL358+OL362およびOL361+OL357を用いて2回の個別のPCRを実施し、OL358+OL357を用いてそれらの断片を連結した。使用したPCR条件は、キメラ可変領域遺伝子の増幅に関して実施例2aで説明したとおりであった。生じたPCR断片をVH遺伝子のためのMluIおよびHinDIIIまたはVK遺伝子のためのBssHIIおよびBamHIのいずれかで消化し、適切な発現ベクター中にクローニングした。

変異体の重鎖および軽鎖のあらゆる組合せ(すなわち、合計16種のペア形成)をエレクトロポレーションによってNS0細胞中に安定にトランスフェクトした。100nMメトトレキサートを用いて、トランスフェクトされた細胞を最初に選択し、200nmメトトレキサート中に増殖させ、実施例2aのとおりにIgG発現に関して試験した。VK3鎖を有する変異体の場合も、変異体VH3/VK1およびVH1/VK2の場合も、発現は観察されなかった。各変異体について最も発現が優れている株を増殖させ、液体窒素下で凍結した。プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって、細胞培養上清からNSOの安定なトランスフェクションから得られる抗ヒトCD4抗体変異体を精製した。0.1体積量の10×PBS(pH7.4)を用いて上清のpHを調整し、1ml容のMab Select Sure Protein Aカラム(GE Healthcare, Amersham, UK)を通過させた。10体積量のPBS(pH7.4)でカラムを洗浄した後、50mMクエン酸緩衝液(pH3.0)を用いて溶出した。1mlの画分を採取し、1M Tris-HCl(pH9.0)0.1mlで直ちに中和した。タンパク質を含む画分(280nmの吸光度に基づいて測定される)を集め、PBS(pH7.4)にバッファー交換し、精製した抗体を+4℃で保存した。280nmのUV吸光度に基づいて、精製した抗体の濃度を測定した。競合ELISAによって、精製した抗体を、その標的であるヒトCD4への結合に関して試験した。PBS(pH7.4)中1μg/ml CD4を1ウェル当たり50μl用いて、Nunc MaxiSorp 96ウェル平底マイクロタイタープレート(Fisher)を4℃で一晩コーティングした。2通りの漸増濃度(titration)のマウス抗体試料およびエピトープを枯渇させた抗体試料を作製し(0.005μg/ml〜12μg/mlの範囲)、PBS pH7.4/2％BSAに溶かした一定濃度(0.2μg/ml)のビオチン標識マウス抗体と混合した。(PBS pH7.4/0.05％Tween20で4回)予洗したアッセイ用プレートに漸増濃度試料(最終体積100μl/ウェル)を添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、前述したとおりにプレートを洗浄し、PBS pH7.4/0.05％Tween20に溶かしたストレプトアビジンHRP(Sigma)1/500希釈物をウェル当たり100μl添加し、室温でさらに1時間インキュベートした。さらに洗浄した後、100μl/ウェルの3,3'-5,5'テトラメチルベンジジン基質(Sigma)を用いて、結合されたビオチン標識マウス抗体を検出した。50μl/ウェルの3M HClで反応を停止させた後、Dynex Technologies MRX TC IIプレートリーダーを用いて450nmの吸光度を測定し、試験抗体の結合曲線をマウス標準試料および精製したキメラ抗体と比較した。これらの結果を図15および図16に示す。試料濃度に対して吸光度をプロットし、データセットのそれぞれを通過するように直線をフィッティングした。これらの線の式を用いて、CD4へのビオチン標識マウス抗体の結合を50％阻害するのに必要とされる濃度を算出した(IC50)。試験試料のIC50値をマウス抗体のIC50値で割って、結合効率の差の倍率を算出した。これらの値を表8で報告する。表8は、抗体の内の7種(下線を引いて強調している)がマウス参照抗体の少なくとも2倍以内の効率で結合し、4種の抗体(VH1/VK1、VH2/VK2、VH4/VK2およびVH4/VK4)が結合の向上を示すことを示す。

参照文献の一覧

Claims (1)

1. (i)2011年12月2日にDSMZに寄託された受託番号DSM ACC3147に基づき特定された細胞株から得ることができる、抗体;
   (ii)2011年12月2日にDSMZに寄託された受託番号DSM ACC3147に基づき特定された細胞株から得ることができる抗体のVHおよびVKを含む、抗体;
   (iii)組合せがVH2/VK2である、図12で開示されているVHおよび図13で開示されているVKの該組合せを含む抗体
   からなる群より選択される、抗CD4抗体。

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