KR20160052809A

KR20160052809A - 특히, 대숙주성 이식편병(gvhd)을 예방하기 위한 항 cd4 항체

Info

Publication number: KR20160052809A
Application number: KR1020167011429A
Authority: KR
Inventors: 스테판 프리케; 프랭크 엠리히; 나드야 힐거
Original assignee: 프라운호퍼-게젤샤프트 추르 푀르데룽 데어 안제반텐 포르슝 에 파우
Priority date: 2010-12-02
Filing date: 2011-12-02
Publication date: 2016-05-12
Also published as: JP6276818B2; CA2819520A1; ES2824767T3; DK3351255T3; ES2701760T3; EP3351255B1; US20180030414A1; WO2012072268A2; JP2017039732A; JP2014501731A; PL2672979T3; JP6008863B2; US20130330334A1; HUE040300T2; EP3351255A1; US9745552B2; US10227564B2; WO2012072268A8; KR20140027075A; CA2819520C

Abstract

본 발명은, 다른 것 중에서, a) 항 CD4 항체로 면역 세포를 함유하는 세포 이식편을 배양하는 단계(상기 배양은 1분 내지 7일 동안 실행)와, b) 결합되지 않은 항체를 상기 이식편으로부터 제거하는 단계를 포함하는, 면역 세포를 함유하는 세포 이식편(cell graft)을 변형하는 생체외(in vitro) 방법뿐만 아니라, 대응하는 변형된 이식편과 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 감소된 수의 잠재적인 T-세포 에피토프를 갖지만, 중쇄 면역글로불린 가변 영역(VH)과 경쇄 면역글로불린 가변 영역(VL)을 포함하는 항인(anti human) CD4 항체와 같은, CD4에 결합하는 능력을 유지하는 항-CD4 항체를 제공하기 위해 CD4 인간 백혈구 항원에 반응성이 있는 항체의 변형에 관한 것으로, 상기 면역글로불린 가변 영역의 CDRs 밖에 위치한 적어도 하나의 T 세포 에피토프는 상기 면역글로불린 가변 영역으로부터 제거된다. 항-CD4 항체의 작용 모드와 특이성은 변형(들)에 의해 영향을 받지 않는 것이 바람직하다.

Description

특히, 대숙주성 이식편병(GVHD)을 예방하기 위한 항 CD4 항체{ANTI CD4 ANTIBODIES TO PREVENT IN PARTICULAR GRAFT - VESUS - HOST - DISEASE(GVHD)}

본 발명은, 이식편(graft)과 그 이식(transplantation)의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 변형된 이식편, 이를 얻는 방법, 및 관련 사용 방법에 관한 것이다. 다른 것들 중에서, 본 발명은, 면역성이 있는 생육 가능한 세포를 함유하는 이식편에 관한 것이다.

추가 양상에서, 본 발명은, 감소된 수의 T 세포 에피토프(epitope)에 의해 면역성 특징이 변형된, 변형된 항인(anti human) CD4-항체에 관한 것이고, 이와 관련된 주제에 관한 것이다.

현재, 동종 이형의 조혈 줄기 세포 이식(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation)(HSCT)은 혈액암(hematological malignancies)이 걸린 많은 환자를 위한 유일한 치료 요법이다. 골수(bone marrow)(Aschan, 2006), 동원된 말초 줄기 세포(peripheral mobilized stem cell)(Bacigalupo 등, 2002), 및 제대혈(umbilical cord blood)(Kestendjieva 등, 2008)은 HSCT를 위한 공통 소스이다. 매우 복잡한 치료 접근법을 사용함에도 불구하고, HSCT는 여전히 대숙주성 이식편병(graft versus host disease)(GvHD), 전염병, 정맥 폐쇄증(veno-occlusive disease), 공여체 이식편 거부(donor graft rejection), 및 기저 질환의 재발과 같은 많은 합병증에 의해 일어나는 상당한 사망률과 연관되어 있다.

종래에 면역억제제의 사용은 전체 면역 체계의 억제를 일으키고, 이는 감염 또는 악성 종양의 발달 가능성을 향상시킨다. 또한 일부 경우에, 이러한 약물의 효능은 감소하거나 또는 심지어 사라질 수 있다. 예를 들어, 스테로이드 난치성 GvHD는 동종 이형의 조혈 줄기 세포 이식을 따르는 큰 문제점 중 한 가지이다(Auletta 등, 2009; von Bonin 등, 2009). GvHD를 치료하기 위해, T-세포 반응의 중요 요소에 대한 면역억제 전략이 이미 실행되었다(von Bonin 등, 2009). 그러나, 많은 환자 때문에, 이러한 전략은 류머티스학에 주로 사용되거나(Kameda 등, 2009; Senolt 등, 2009) 또는 신장 이식 후 환자를 위해 주로 사용되었다. 급성 GvHD의 치료를 위해, OKT3^®(Benekli M 등, 2006; Knop 등, 2007) 또는 인터류킨 2 수용체 항체(Chen 등, 2004; Ji 등, 2005)와, 항 CD20 항체(Bates 등, 2009)를 갖는 만성 GvHD에 대해서 대부분의 경험이 이용 가능하다. 그러나, 이러한 항체는 감염성 합병증의 출현 때문에 보다 적은 장기간의 성공 및 독성과 관련이 될 수 있다. 임상 용도를 위한 단일클론 항체의 사용은 실종된 인간화 때문에 제한되었다. 쥣과 동물의 항체 또는 다른 종으로부터의 항체는 인간에게서 매우 면역성이 클 수 있는 150 kDa 범위의 분자량을 갖는 거대 분자이다. 쥣과의 항인(anti human) 단일클론 항체를 투여한 후, 생명을 위협하는 과민성 합병증이 관찰되었다(Chester 등, 1995). 또한, 항체의 면역 잠재력은 항체의 펩티드 구조에 달려 있다. 예를 들어, IgG4는 IgG1 아이소타입(isotype)보다 면역성이 약한데, 이는, 보충 활성화에 대한 낮은 잠재력 때문이다. 게다가, 항체의 인간화(humanization)는 이들의 원래 쥣과 대응물보다 면역성이 약한 키메릭 아이소타입(chimeric isotype)으로 안내한다(Hosono 등, 1992). 현재까지, 완전히 인간 항체가 키메릭 항체와 비교해서 임상적으로 이점을 갖는다는 것을 보여주는 분명한 데이터는 존재하지 않는다.

따라서, 새로운 세포 공급원의 사용, 항체 또는 이와 다른 생체물질을 이용한 치료를 포함하는 대안적이거나 향상된 치료 접근법 또는 절차에 관한 연구가 여전히 필요하다.

한 가지 가능한 접근법은 CD4 양성 T 보조 세포에 집중한다. 상기 세포는 인체에서 병리학 및 생리학적 면역 반응 모두를 조정한다. 따라서, 항 CD4 항체를 투여하여 CD4 양성 T 보조 세포에게 영향을 미치는 것은 면역 체계의 표적 조절로 이끌어야만 한다.

이전에, 쥣과의 항인 CD4 단일클론 항체인 Max16H5(IgG1)은 자가 면역 질병이 걸린 환자에게서 임상 용도로 사용되거나 이식 거부에 대한 보호 요법으로 사용되었다(Chatenoud 등, 1995; Emmrich 등, 1991a; Emmrich 등, 1991b). 또한, 인간의 신장 이식에서, Max16H5(IgG1)은 이식편 거부(graft rejection)를 효과적으로 줄이기 위한 잠재력을 가졌다(Reinke 등, 1991; Reinke 등, 1995). 항 CD4 특정 단일클론 항체의 투여는, 삼중 형질전환 쥐 모델(triple transgenic mouse model)에서, 면역 활성의 억제를 일으킬 뿐만 아니라, 파상풍 변독소(tetanus toxoid)에 대한 내성의 유도를 일으킬 수 있다(Laub 등, 2002). 쥐 단일클론 항체에 의한 내성의 유도가 또한 증명되었다(Kohlhaw 등, 2001). 상기 단일클론 항체 Max16H5는, 본 명세서에 참조로 포함되어 있고, 다른 것들 중에서, 생체내 진단제를 생산하기 위해 인간 CD4 분자에 대한 특이성을 갖는 표지 리간드(labeled ligand)를 사용하는 것에 관한 EP 1 454 137에 또한 기재되어 있다.

T 보조 세포 상의 CD4+ 분자는 항원 제시 세포(APCs) 상의 HLA 분자의 일정 영역에 직접 결합하여 완전한 T 세포 활성화를 허용한다. 비결핍 단일클론 항체에 의해 이러한 결합을 방해하여, 전체적인 입체 방해, APC와 T 세포 사이의 세포-세포 접촉의 단축(Fehervari 등, 2002), 또는 단백질 티로신 포스포릴화(protein tyrosine phosphorylation)의 억제에 의한 음성 신호의 유도(Harding 등, 2002) 또는 T 세포 에너지의 유도(Madrenas 등, 1996)에 의해 이러한 활성화를 억제할 수 있다. 이 중에서, Fehervari 등과 Harding 등은 본 발명의 방법과 사용을 기재하지 않는다. 다른 것들 중에서, 이들은 항 CD4 항체로 줄기 세포 이식편을 배양하지 않지만, 비장(spleen)(쥣과)과 연막(buffy coat)(인간)으로부터 분리된 CD4+ 세포를 분리했다.

또한, WO 2004/112835는, 다른 것들 중에서, CD4에 대한 항체를 포함하는 항체의 사용을 필요로 하는 방법을 기술한다. 상기 문서에서, 항 CD4 항체는 면역 내성을 유도하기 위해 장기간 동안 조절 T 세포를 생성하도록 사용되었다.

상기 내용으로부터, 종래 기술의 방법론의 불리한 점을 부족하게 할 수 있는, 각기, 유망한 대안적이고 향상된 치료 접근법의 필요성이 여전히 존재한다.

또한, 치료 단백질의 효능이 원치 않는 면역 반응에 의해 치료 단백질로 제한되는 여러 경우가 있다. 여러 쥐 단일클론 항체는 많은 인간의 질병 환경에서 치료 요법으로의 가망성을 보여주었지만, 특정한 경우에는, 상당한 정도의 인간의 항쥐 항체(human anti-murine antibody)(HAMA) 반응(Schroff 등, 1985)의 유도 때문에 실패했다. 단일클론 항체에 대해서, HAMA 반응을 줄이기 위한 시도에서 많은 기술이 개발되었다 (예를 들어, WOA9106667 참조). 이러한 재조합 DNA 접근법은 일반적으로 최종 항체 구조에서 쥐의 유전 정보를 감소시키는 반면, 최종 구조에서 인간의 유전 정보를 증가시켰다. 그럼에도, 결과적인 "인간화" 항체는, 여러 경우에서, 여전히 환자에게서 면역 반응을 이끌어 내었다(Isaacs J. D., 1990).

항체는, 면역 반응이 올려질 수 있는 치료제로서 투여된 유일한 종류의 폴리펩티드 분자가 아니다. 심지어 인간 기원의 단백질 및 인간 내에서 발생한 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질은 여전히 인간에게서 면역 반응을 유도할 수 있다.

면역 반응의 유도에 대한 열쇠는, MHC 클래스 II 분자, 소위 "T-세포 에피토프" 상의 제시(presentation)를 통해 T 세포의 활성을 자극할 수 있는 단백질 내 펩티드의 존재이다.

MHC 클래스 II 분자는 보조 T 세포 선택과 활성화에서 중심 역할을 수행하는 매우 다형성인 단백질의 그룹이다. 인간의 백혈구 항원 그룹 DR(HLA-DR)은 이러한 그룹의 단백질 중 주요 아이소타입(isotype)이다. 그러나, 아이소타입 HLA-DR과 HLA-DP는 유사한 기능을 실행한다. 인간 개체군에서, 개인은 2 내지 4개의 DR 대립 유전자(allele), 2개의 DQ, 및 2개의 DP 대립 유전자를 갖는다. 많은 DR 분자의 구조가 해결되고, 이러한 것은 펩티드의 아미노산 곁 사슬(포켓 잔기)과 맞물리는 많은 포켓을 구비하는 개방 단부형 펩티드 결합 그루브로 나타난다(Stern 등, 1994). 클래스 II 분자의 서로 다른 알로타입(allotype)을 식별하는 다형(polymorphism)은 펩티드 결합 그루브 내에서 펩티드에 대한 매우 다양한 서로 다른 결합 표면에 기여하고, 개체군 수준에서는, 외부 단백질을 인지하고 병원체에 면역 반응을 올리는 능력에 관해서 최대한의 유연성을 보장한다.

치료 단백질에 대한 면역 반응은 MHC 클래스 II 펩티드 제시 경로를 통해 진행한다. 여기에서, 외인성 단백질(exogenous protein)은 항원 제시 세포에 의해 삼켜지고, DR, DQ 또는 DP 타입의 MHC 클래스 II 분자와 관련된 세포 표면에서 제시를 위해 처리된다. MHC 클래스 II 분자는 대식세포 및 다른 것 중에서 수지상 세포(dendritic cell)와 같은 전문적인 항원 제시 세포에 의해 발현된다. T 세포의 표면에서 동족 T 세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 착물의 결합은, CD4 분자와 같은 다른 특정 보조 수용체(co-receptor)의 교차 결합과 함께, T 세포 내에서 활성화 상태를 유도할 수 있다. 활성화는 사이토카인(cytokine)의 방출을 유도하여 항체를 생성하도록 B 세포와 같은 다른 림프구를 더 활성화하거나 또는 전체 세포 면역 반응으로서 T 킬러 세포를 활성화한다.

T 세포 에피토프 식별은, WO 98/52976과 WO 00/34317에서 인지된 바와 같이 에피토프 제거를 위한 첫 번째 단계이다. 이러한 교시(敎示)에서, 예측된 T 세포 에피토프는 해당 단백질 내에서 적절한 아미노산 치환을 사용하여 제거된다. 계산적인 교시 외에, MHC 클래스 II 분자를 결합하기 위한 합성 펩티드의 능력을 측정하기 위한 생체외 방법이 있다. 예시적인 방법은, MHC 클래스 II 결합 표면의 공급원으로서 한정된 MHC 알로타입의 B-세포주를 사용하고, MHC 클래스 II 리간드 확인에 적용될 수 있다(Marshall 등, 1994; O'Sullivan 등, 1990; Robadey 등, 1997). 그러나, 이러한 교시는, 매우 다양한 MHC 알로타입에 대한 잠재적인 다중 에피토프의 차폐를 위해 적합하게 되지 않고, 또한, T 세포 에피토프로서 작용하는 결합 펩티드의 능력도 확증할 수 없다.

최근에, 합성 펩티드와 공동으로 재조합형 MHC 분자의 가용성 착물을 개발하는 기술이 활용케 되었다(Kern 등, 1998; Kwon 등, 2001). 이러한 시약과 절차는, 특정 MHC-펩티드 착물을 결합할 수 있고 매우 다양한 MHC 알로타입에 대한 잠재적인 다중 에피토프의 차폐를 위해 조절되지 않은 인간 또는 실험 동물 대상의 말초 혈액 샘플로부터 T 세포 클론의 존재를 확인하는데 사용된다.

CD4는 대부분의 흉선 세포(thymocyte)와 일 부분의 말초 T 세포를 포함하는 T 림프구 계통의 세포 상에서 주로 발현된 표면 당단백질(glycoprotein)이다. 이러한 발산성 세포 분포의 기능적인 중요성이 알려져 있지 않지만, 일부 비임파상 세포(non-lymphoid cell)에 의해 낮은 수준의 CD4가 또한 발현된다. 성숙한 T 세포 상에서, CD4는 항원 제시 세포에서 발현된 MHC 클래스 II 분자와의 상호 작용을 통해 공인식 기능(co-recognition function)을 수행한다. CD4+ T 세포는, 바이러스성, 세균성, 진균성, 및 기생 감염에 대한 T-의존 반응 동안 T와 B 세포 기능을 조절하는 주로 보조세포 하위집합(helper subset)을 구성한다.

자가면역 질병이 발병하는 동안, 보다 구체적으로, 자가 항원에 대한 내성이 파괴되면, CD4+ T 세포는 염증 반응에 기여하고, 이러한 염증 반응은 관절과 조직의 파괴를 가져온다. 이러한 과정은 조혈 계통의 염증 세포의 보충, 항체, 염증성 사이토카인, 및 조정제(mediator)의 생산, 및 킬러 세포의 활성화에 의해 촉진된다.

CD4 항체는 이 기술 분야에 알려져 있다. 예시적인 CD4 항체, 단일클론 쥐 항인 CD4-항체 30F16H5는 DE 3919294에 기재되어 있다. 상기 항체는 혼성세포주(hybridoma cell line) ECACC 88050502로부터 얻을 수 있다.

쥐의 항-CD4 항체의 면역원성(immunogenicity)을 줄이기 위해, 인간화된 항-CD4 항체는 쥐 항체의 초가변 영역(hypervariable region)을 인간 면역글로불린에 의해 제공된 틀로 클론닝하여 미리 설계되었다(예를 들어, Boon 등, 2002). 쥐의 항-CD4와 비교하여 면역원성을 감소시켰지만, 이러한 인간화 항체는 여전히 여러 경우에 면역 반응을 유도했다.

또한, 이 기술 분야로부터 항체의 이러한 "인간화"는 흔히 주어진 표적(target)에 대해서 더 낮거나 또는 상당히 더 낮은 친화도를 갖는 항체를 생성한다.

따라서, 본 발명의 추가 목적은, 쥐의 항-CD4 항체에 대한 면역 반응을 줄이기 위해 항인 CD4-항체의 변형된 형태를 제공하는 것이다. 보다 구체적으로, 인간 피실험자에게서 면역 반응을 유도하기 위해 감소되거나 또는 결여된 잠재력을 일으킬 수 있는, 감소된 수의 T 세포 에피토프를 갖는 항-CD4 항체를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 단백질은, 변형되지 않은 항체에 대한 면역 반응을 올릴 수 있는 인간 피실험자 내에 증가된 순환 시간을 표시하는 것으로 예측될 수 있고, 항-CD4에 대한 많은 표시에 대한 경우에서와 같이 만성 또는 재발하는 질병 설정에서 특히 유리할 수 있다. 다른 것이 "인간화" 형태를 포함하는 항-CD4 항체 분자를 제공했지만, 이러한 교시 중 어떠한 것도 단백질의 면역 특성에 대한 T 세포 에피토프의 중요성을 인지하지 않고, 본 발명의 개요에 따라 특정하고 제어된 방식으로 상기 특성에 직접 영향을 미치도록 고안되지도 않았다.

일 양상에서, 본 발명은, a) 항 CD4 항체로 면역 세포를 함유하는 세포 이식편을 배양하는 단계(상기 배양은 1분 내지 7일 동안 실행)와, b) 결합되지 않은 항체를 상기 이식편으로부터 제거하는 단계를 포함하는, 면역 세포를 함유하는 세포 이식편을 변형하는 생체외 방법에 관한 것이다.

다른 양상에서, 본 발명은, 면역 세포를 함유하는 변형된 세포 이식편에 관한 것으로, 상기 이식편은, i) 본 발명의 생체외 방법에 따라 얻어질 수 있고/있거나 ii) 상기 이식편의 접근 가능한 CD4 에피토프의 40% 내지 100%에 결합된 항 CD4 항체를 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은, 의학에서 사용하기 위한, 특히, 환자에게서 이식을 통해 치료 가능한 한 가지 이상의 질병을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 본 발명의 면역 세포를 함유하는 변형된 세포 이식편에 관한 것이다.

다른 양상에서, 본 발명은, 면역 세포를 함유하는 세포 이식편의 생체외 변형을 위해 항 CD4 항체를 사용하는 방법에 관한 것으로, 상기 변형은 1분 내지 7일 동안 상기 항체로 상기 이식편을 배양하는 단계를 포함한다.

기타 양상에서, 본 발명은, 청구항 및 아래에 한정된 방법, 사용, 및 이식편에 관한 것이다. 기타 양상에서, 본 발명은, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 항체에 관한 것이다.

본 발명의 소위 추가 양상은 다음과 같이 요약된다. 즉, 본 발명의 이러한 추가 양상의 한 가지 일면은, 중쇄 면역글로불린 가변 영역(VH)과 경쇄 면역글로불린 가변 영역(VL)을 포함하는 항인 CD4 항체에 관한 것으로, 여기에서, 상기 면역글로불린 가변 영역의 CDRs 밖에 위치한 적어도 하나의 T 세포 에피토프는, 상기 면역글로불린 가변 영역으로부터, 특히, 아래에서 한정된 바와 같이 항인 CD4 항체로 제거된다. 본 발명의 상기 추가 양상의 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 혼성세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 항체의 CDRs를 갖거나, 또는 상기 항체는 SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:12의 CDRs를 갖는다. 특정 실시예에서, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은, SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 및 10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은, SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다. 다른 일면에서, 본 발명의 상기 추가 양상은, 상기 항체와, 약제학적으로 허용 가능한 담체(carrier)를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다. 다른 일면에서, 본 발명의 상기 추가 양상은 또한 환자를 치료법으로 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한 상기 항체의 사용 방법과, 상기 항체를 사용하는 치료 방법에 관한 것이다. 다른 일면에서, 본 발명의 상기 추가 양상은, 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 암호화(encoding)하는 핵산과, 상기 핵산을 포함하는 벡터(vector)에 관한 것이고, 특히, 상기 핵산은 발현 제어 서열(expression control sequence)에 작용 가능하게 연결된다. 본 발명의 상기 추가 양상은, 또한, 상기 핵산 및/또는 상술한 적어도 하나의 벡터를 포함하는 숙주 세포(host cell)에 관한 것이고, 적절한 발현 제어 서열(들)의 제어 하에 발현을 허용하는 조건에서 상술한 숙주 세포를 배양하는 단계와, 세포의 배지(medium)로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명의 상기 추가 양상의 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 상기 추가 양상은 또한 항인 CD4 항체에 관한 것으로, 상기 항체는 발현 벡터인 pANTVhG4와 pANTVκ를 사용하여 얻어진다. 일반적으로, 상기 추가 양상과 관련하여 기술된 정의, 일면, 및 실시예는 또한 본 발명에 일반적으로 적용될 수 있다. 상기 추가 양상에서, 항-CD4 항체의 작용 모드와 특이성은 변형예(들)에 의해 영향을 받지 않는 것이 바람직하다.

본 발명은, 면역 세포를 함유하는 세포 이식편을 변형하는 생체외 방법을 제공하는 효과를 갖는다.

도 1은, 인간과 같은 피실험자에 대한 차후 이식뿐만 아니라, 이식편의 항체 배양의 원리를 개략적으로 예시하는 도면.
도 2는, 안정한 C57Bl/6 백그라운드의 공여체(donor)로서 삼중 형질전환 쥐(triple transgenic mice/TTG)의 해석을 포함한다. TTG 쥐는 인간 CD4와 HLA-DR을 발현하는 반면, 쥣과의 CD4 분자는 녹아웃(knocked out)된다. 이러한 것은 이식 후 특정 인간 표면 분자의 결정을 가능하게 하고{키메라 현상(chimerism)의 독특한 분석} 쥐에서 항인 CD4 항체의 직접적인 시험을 가능하게 한다.
도 3은, 실험 디자인의 해석을 도시한다. 골수 세포와 비장세포가 TTG 쥐에서 취해지고, 혼합되며, 항인 CD4 항체의 전처리 또는 전처리 없이 치사량으로 조사된 TTG 쥐에서 이식되었다. 이러한 실험은 C57Bl/6 야생형 쥐로부터 공여체 세포를 사용하여 비교되었다. 이식 후 치료 효과(생존, 기관 회복, 키메라 현상, GvHD)가 연구되었다.
도 4는, 항 CD4 항체의 전배양과 함께 또는 전배양 없이 Balb/c 쥐에서 TTG 쥐로부터 BM/비장세포의 이식 후 생존율을 나타낸다. 전처리 세포를 받은 쥐에서, 생존율은 크게 증가되었다(0% 내지 83%, p<0.001). 관찰된 효과는 Balb/c 쥐에서 TTG로부터 이식을 위해 특정했고, 이는 공여체로서 야생형 C57Bl/6을 사용하였기 때문으로, 효과는 반복될 수 없었다. 이러한 결과는 인간의 CD4에 대한 항체의 특정 결합을 보여주고, 이에 따라 야생형 공여체 세포는 영향을 받지 않는다.
도 5는, 항 CD4 항체의 (A+C) 전처리로 또는 (A+B) 전처리 없이 Balb/c 쥐에서 TTG 쥐로부터 BM/비장세포의 이식 후 조혈 회복을 예시한다. 전처리 세포를 받은 쥐에서, 조혈계는 이식 후 초기 값으로 회복되었다. 전배양된 세포가 없이 이식된 수용체와 비교해서, 단핵구와 과립구의 재구성은 림프구 재구성(C) 이전이었다.
도 6은, 항 CD4 항체의 전처리 또는 전처리 없이 Balb/c 쥐에서 TTG 쥐로부터 BM/비장세포의 이식 후 GvHD 스코어{Cooke 등(1996)에 따라 체중을 포함하는}를 나타낸다. 전처리 세포를 받은 쥐에서, 항체를 받은 쥐에서 GvHD 스코어는 항 CD4 항체의 전처리 없이 골수와 비장세포를 받은 동물에서보다 더 낮았고 이는 GvHD 발전이 없음을 나타낸다. 생착(engraftment)은 또한 면역이력 분석(immunohistorical analysis)을 통해 확인되었다. 골수강(bone marrow cavity)에는, 이식된 동물에서 우세한 형태의 조혈작용(hematopoiesis)과 T 세포를 발현하는 인간 CD4의 안정한 생착이 있었다.
도 7은, 항인 CD4 항체의 전배양 없이 Balb/c 쥐에서 TTG 쥐로부터 BM/비장세포를 이식한 후, 인간 CD4, 쥣과 CD4, 및 쥣과 CD8의 생착을 필요로 하는 실험에 관한 것이다. 이식 후 12일째, 인간 CD4, 쥣과 CD4, 및 쥣과 CD8 세포가 안정하게 감지될 수 있었고 쥐는 심각한 GvHD에 걸린다.
도 8은, 항인 CD4 항체의 전배양 없이 Balb/c 쥐에서 TTG 쥐로부터 BM/비장세포를 이식한 후, (H-2Kb)의 TTG/C57Bl/6의 쥣과 MHC 클래스 I과 인간 HLA-DR3의 생착을 필요로 하는 실험에 관한 것이다. 이식 후 12일째, H-2Kb의 TTG/C57Bl/6의 MHC 클래스 I과 인간 HLA-DR3가 안정하게 감지될 수 있었고 쥐는 심각한 GvHD에 걸린다.
도 9는, 항인 CD4 항체를 전배양한 Balb/c 쥐에서 TTG 쥐로부터 BM/비장세포를 이식한 후, (H-2Kb)의 TTG/C57Bl/6의 쥣과 CD4의 감소와 인간 CD4, 쥣과 CD4의 생착을 필요로 하는 실험에 관한 것이다. 이식 후, GvHD의 발생 없이 안정한 생착이 관찰될 수 있었다.
도 10은, 항 CD4 항체의 전배양과 함께 또는 전배양 없이 Balb/c 쥐에서 TTG 쥐로부터 BM/비장세포의 이식 후 생존율을 나타낸다. IgG1-아이소타입 조절 항체를 사용하여, 예방 GvHD 효과는 관찰될 수 없었다.
도 11은, 포유류 세포에서 변형된 경쇄와 중쇄를 발현하기 위한 예시적인 벡터를 도시한다. dhfr은, 증가하는 농도의 메토트렉세이트(methotrexate)에 세포를 노출시켜 유전자를 증폭하기 위해 사용된 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자이고, CMV P는 CMV IE 촉진제이다.
도 12는, 예시적인 변형된 중쇄 가변 영역의 DNA와 아미노산 서열을 도시하는 도면.
도 13은, 예시적인 변형된 경쇄 가변 영역의 DNA와 아미노산 서열을 도시하는 도면.
도 14는, 부모 쥐 항-CD4 항체와 비교해서 키메릭 항인 CD4-항체의 상대적인 결합을 도시하는 도면.
도 15는, 부모 쥐 항-CD4 항체 및 키메릭 항-CD4 항체와 비교해서 예시적인 변형 항-CD4 항체의 상대적인 결합을 도시하는 도면.
도 16은, 부모 쥐 항-CD4 항체 및 키메릭 항-CD4 항체와 비교해서 예시적인 변형 항-CD4 항체의 상대적인 결합을 도시하는 도면.

본 발명은, 예를 들어, 면역 세포를 함유하는 세포 이식편을 항체로 생체외 처리하는 것에 관한 것으로, 이러한 생체외 처리는 직접적인 생체내 적용을 피하도록 한다. 즉, 본 발명은, 예를 들어, (바람직하게는 단기간) 면역 세포를 함유하는 이러한 세포 이식편의 이식 전에, 항인 CD4 항체로 골수 이식편을 배양하는 것이 아이소타입 또는 처리되지 않은 대조군에 비해서 이식 후 GvHD의 발병을 막는다는 것을 보여줄 수 있었다.

종래 기술의 연구와 반대로, 본 발명의 연구는, 예를 들어, 대숙주성 이식편병(GvHD)을 예방하기 위한 관용 유도(tolerance induction) 또는 면역억제의 목적으로, 예를 들어, T 세포, 특히, CD4 세포를 함유하는 세포 현탁액과 같은 (줄기 세포) 이식편의 단기간 배양을 다룬다.

이론으로 얽매이도록 의도되지 않으면서, 본 발명의 발명자는, CD4 양성 (면역) 세포를 포함하는 (줄기 세포) 이식편의 항 CD4 항체 배양과, 변형된 이식편을 생성하도록 결합되지 않은 항체를 차후 제거하는 것을 고려하는데, 항체 표지 세포는 항체에 의해 선택적으로 비활성화되거나, 또는 특정 항원과 마주하자마자 비활성화되거나 규제 세포가 되도록 제조되어, 예를 들어, GvHD는 시작되지 않는다. 항 CD4 항체는 CD4를 갖는 면역 세포(림프구와 같은)에 결합되어, 그 유리한 결과를 발휘하는 것으로 추정된다. 또한, 본 명세서에 기술된 바람직한 항 CD4 항체는, 예를 들어, 추후 비활성화를 위한 세포를 제조하기 위해 (a) 특정 에피토프(들)의 결합 때문에, 특히 유리한 특징을 나타내는 것이 실행 가능한 것으로 간주된다.

당업자에게 쉽게 명백해지는 바와 같이, 유리된 항 CD4 항체, 즉, 이식편에 위치한 항원에 결합되지 않은 항 CD4 항체의 투여를 실질적으로 줄이거나 피하는 것이 유리하다. 일반적으로, 본 발명은, 다음의 이점, 즉, i) 수용체에 대한 항체의 직접적인 투여가 필요하지 않고, ii) T 세포, 특히, CD4 세포를 함유하는 세포 현탁액, 조직, 및 기관과 같은 이식편의 단기간 배양, iii) 본 발명의 이식편의 이식 후 GvHD 예방, iv) 본 발명의 이식편의 이식 후 다른 면역학적 합병증(예를 들어, 사이토카인 유리 증후군)의 예방, v) 종래의 면역억제 약물의 회피 또는 감소와, 전신 투여(systemic application)에 비해 크게 감소한 양의 항체로 인한 비용의 감소, vi) 본 발명의 이식편의 이식을 받은 환자의 생존의 향상, vii) 예상되는 면역학적 합병증으로 인해 정상적인 이식편으로는 이식될 수 없는, 환자(고령의 환자와 같은)를 위한 이식편의 이식의 촉진, 및 viii) 이식을 위한 HLA 부적합(mismatch) 공여체 또는 본 발명을 갖지 않는 것보다 덜 우수한 HLA 적합 공여체를 사용하는 것 중 하나 이상에 관한 것으로 간주된다.

제 1 양상에서, 본 발명은, a) 항 CD4 항체로 면역 세포를 함유하는 세포 이식편을 배양하는 단계(상기 배양은 1분 내지 7일 동안 실행)와, b) 결합되지 않은 항체를 상기 이식편으로부터 제거하는 단계를 포함하는, 면역 세포를 함유하는 세포 이식편을 변형하는 생체외 방법에 관한 것이다.

항체 및 또한 항 CD4 항체는 일반적으로 이 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "항체"에 의해, 특히, 항원과 특정하게 화합, 상호작용, 또는 이와 달리 결합할 수 있는 면역글로불린계의 단백질이 의미되고, 항원에 대한 항체의 상기 화합, 상호작용, 또는 이와 다른 결합(결합과 같은)은 상보성-결정 영역(complementarity determining region)(CDRs)에 의해 조정된다. 이와 유사하게, "항원"이라는 용어는, 본 명세서에서 상기 항체와 특정하게 화합, 상호작용, 또는 이와 달리 결합할 수 있는 물질을 나타내기 위해 사용된다. 본 발명의 항 CD4 항체의 관계에서, 항원은 CD4, 특히, 인간의 CD4인 것으로 의미된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "CDR"이라는 용어는, 항체의 "상보성-결정 영역", 특히, 항체 특이성을 결정하는데 기여하는 면역글로불린 가변 영역 내의 초가변 영역 중 하나를 가리킨다. CDR은 당업자에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 중쇄 면역글로불린 가변 영역과 경쇄 면역글로불린 가변 영역 모두는 세 개의 CDRs를 함유한다.

본 발명의 문맥에서, "항체"라는 용어는, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', 및 F(ab')2 단편을 포함하는 항체 단편에 관한 것으로 또한 간주된다. 이러한 단편은 표준 방법(예를 들어, Coligan 등, 1991~1997, 본 명세서에 참조로 포함)에 의해 제조될 수 있다. 본 발명은 또한 이 기술 분야에서 잘 알려져 있는 항체 유도 분자 종의 여러 재조합 형태를 또한 고려한다. 이러한 종(species)은, VH와 VL 영역을 연결하는 펩티드 링커를 포함하는 단일 사슬 Fv 형태(예를 들어, scFv)를 포함하는 안정화된 Fv 단편, 또는 사슬간 디설파이드 결합(dsFv)에 의해 안정화되고 VH와 VL 영역의 결합(conjoining)을 용이하게 하도록 설계된 추가 시스테인 잔기를 함유하는 Fv를 포함한다. 이와 동일하게, 다른 조성물이 이 기술 분야에서 익숙하고, "소형체(minibody)"로도 불리는 종과, 단일 가변 영역 "dAbs"을 포함할 수 있다. 다른 종은 여전히 변형된 항체 V-영역부의 결합가(valency)를 증가시키는 수단, 즉, 예를 들어, 이합체화 영역(예를 들어, "류신 지퍼") 또는 또한 화학적 변형 전략의 엔지니어링에 의해 다중 항원 결합 위치를 갖는 종을 통합할 수 있다. 게다가, "항체"라는 용어는 또한 이중체(diabody), 삼중체(triabody) 또는 사중체(tetrabody), 탠댑(tandabs), 유연체(flexibody), 이중특이성 항체(bispecific antibody), 및 키메릭 항체와 같이, 이 기술 분야에서 모두 알려져 있는, scFv의 다합체(multimer)에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체는 임의의 이가 또는 다가 항체를 또한 포함하는 것으로 간주된다. 항체는 또한 임의의 항체 유도체와 당업자에게 알려져 있는 임의의 다른 유도체를 포함한다.

일부 실시예에서, 항체는 다중클론성 항체이다. 바람직한 실시예에서, 항체는 단일클론성 항체이다.

본 발명에 따라, "항 CD4 항체"라는 용어는, CD4에 결합하는 능력을 갖는 항체를 가리킨다. 항 CD4 항체는 항인 CD4 항체인 것이 바람직하다. "CD4" 또는 "분화 4의 클러스터(cluster of differentiation 4)"는 단백질, 보다 정확하게는 표면 글리코단백질을 가리키고, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다 (Bowers 등, 1997 참조). 본 발명의 문맥에서, CD4는, 단편 또는 이와 다르게 변형된 형태가 본 발명의 항체의 문맥에서 여전히 항원으로 작용하면, 전체 길이 CD4의 단편, 또는 이와 다르게 변형된 형태의 CD4를 또한 가리킬 수 있다.

바람직한 항 CD4 항체는, Max16H5, OKT4A, OKTcdr4a, cMT-412, YHB.46으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 상기 항체는 Max16H5인 것이 가장 바람직하다. Max16H5의 생성을 위한 세포는, 수납 번호 ECACC 88050502로 ECACC(유럽 세포 배양물 기탁기관)에 기탁되었다. 상기 항체는 또한 본 명세서에 참조로 포함되어 있는 DE 3919294에 기재되었다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체 "Max16H5"는, "Max.16H5", "MAX16H5" 또는 "MAX.16H5", 또는 "30F16H5"로도 불릴 수 있다(여기서, 맨 나중의 명칭은 또한 상기 항체를 생성하는 기탁된 세포의 명칭이다). Max.16H5는 또한 세포주 MAX.16H5/30F16H5로부터 얻어질 수 있다.

본 발명에서 사용하기 위해 더 바람직한 항 CD4 항체는 16H5.chimIgG4이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 상기 항체는 "16H5.chim" 또는 "CD4.16H5.chimIgG4"로도 불릴 수 있다(여기서, 나중의 명칭은 또한 상기 항체를 생성하는 기탁된 세포의 명칭이다). "16H5.chimIgG4는 세포주 CD4.16H5.chimIgG4로부터 얻어질 수 있다.

상세히, 본 발명과의 관계에서 특정의 바람직한 항 CD4 항체는, 예를 들어, 생물학적 물질의 다음 기탁물 중 임의의 기탁물로부터 얻어질 수 있다:

- 수납 번호가 ECACC 88050502인 유럽 세포 배양물 기탁기관의 기탁물,

- 2011년 12월 2일 DSMZ에 기탁된, 기탁물 "MAX.16H5/30F16H5",

- 2011년 12월 2일 DSMZ에 기탁된, 기탁물 "CD4.16H5.chimIgG4".

이러한 모든 기탁물은 세포 또는 세포주를 각기 필요로 하고, 이로부터 본 발명과의 관계에서 특정한 항 CD4 항체가 얻어질 수 있다. 기탁물 ECACC 88050502는, 예를 들어, 출원서 DE 3919294에 또한 기술되어 있다.

본 발명의 방법, 변형된 이식편, 또는 사용을 위한 변형된 이식편의 일부 실시예에서, 상기 항 CD4 항체는, i) Max16H5, OKT4A, OKTcdr4a, cMT-412, YHB.46으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 특히, 상기 항 CD4 항체는 Max16H5이고/이거나, ii) 항체 30F16H5이고/이거나, iii) 수납 번호 ECACC 88050502로 기탁된 세포주로부터 얻어질 수 있고/있거나, iv) 2011년 12월 2일 DSMZ에 기탁된 세포주 MAX.16H5/30F16H5로부터 얻어질 수 있고/있거나, v) 항체 16H5.chimIgG4이고/이거나, vi) 2011년 12월 2일 DSMZ에 기탁된 세포주 CD4.16H5.chimIgG4로부터 얻어질 수 있고/있거나, vii) 항체 16H5.chimIgG4의 VH와 VK를 포함하는 항체이고/이거나, viii) 2011년 12월 2일 DSMZ에 기탁된 세포주 CD4.16H5.chimIgG4로부터 얻어질 수 있는 항체의 VH와 VK를 포함하는 항체이고/이거나, ix) 도 12에 기재된 VH와 도 13에 기재된 VK의 임의의 조합을 포함하는 항체로서, 특히, 상기 조합은 VH1/VK1, VH2/VK2, VH4/VK2, 및 VH4/VK4로부터 선택되며, 특히, 상기 조합은 VH2/VK2이다.

특정 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 "MAX.16H5"이다. 특정 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 ECACC 88050502의 세포로부터 얻어질 수 있는 항체이다. 특정 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 2011년 12월 2일 DSMZ에 출원인에 의해 이루어진 생물학적 물질의 기탁으로부터 얻어질 수 있는 항체이다. 특정 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 2011년 12월 2일 DSMZ에 출원인에 의해 기탁된 세포로부터 얻어질 수 있는 항체이다. 특정 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 수납 번호 ECACC 88050502를 갖는 유럽 세포 배양물 기탁기관의 기탁물로부터 얻어질 수 있는 항체이다. 특정 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 2011년 12월 2일 DSMZ에 기탁된 세포 "MAX.16H5/30F16H5"로부터 얻어질 수 있는 항체이다. 특정 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 2011년 12월 2일 DSMZ에 기탁된 세포 "CD4.16H5.chimIgG4"로부터 얻어질 수 있는 항체이다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 도 12의 VH1을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 도 12의 VH2를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 도 12의 VH4를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 도 13의 VK1을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 도 13의 VK2를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 도 13의 VK4를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 SEQ ID NO:10을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 SEQ ID NO:8을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 SEQ ID NO:4를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 SEQ ID NO:20을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 SEQ ID NO:18을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 SEQ ID NO:14를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 도 12의 VH1 및/또는 도 13의 VK1을 포함한다. 일부 특히 바람직한 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 도 12의 VH2 및/또는 도 13의 VK2를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 도 12의 VH4 및/또는 도 13의 VK2를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 도 12의 VH4 및/또는 도 13의 VK4를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 SEQ ID NO: 10 및/또는 SEQ ID NO: 20을 포함한다. 일부 특히 바람직한 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 SEQ ID NO: 8 및/또는 SEQ ID NO: 18을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 18을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 14를 포함한다.

일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 항체 16H5.chimIgG4의 VH와 VK를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 SEQ ID NO: 2와 SEQ ID NO: 12의 CDRs를 포함한다. 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 사용하기 위한 항 CD4 항체는 아래에서 상세하게 기재된 본 발명의 상기 추가 양상의 또는 상기 추가 양상에 따른 항 CD4 항체이다. 바람직하게, 상기 항 CD4 항체는 그 실시예에 기술된 것과 같고, 여기서 바람직한 실시예가 특히 바람직하다. 일반적으로, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 본 명세서에 기재된 임의의 항 CD4 항체일 수 있다.

바람직한 특정 실시예에서, 항 CD4 항체는 CD4 분자의 제 1 및/또는 제 2 영역을 인지하는 항체로부터 선택된다. 바람직한 특정 실시예에서, 항 CD4 항체는 CD4 분자의 동일한 영역을 Max16H5로 인지하는 항체로부터 선택된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "결합되지 않은 항체(unbound antibody)"는, 배양 단계 후에, 이식편에 결합되지 않은 항체를 나타낸다. 즉, "결합되지 않은 항체"는, 이식편에서 그 리간드와 기본적으로 결합되지 않은 항체를 나타낸다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "생체외 방법(in vitro method)"은 살아 있는 피실험자 밖에서 수행되는 방법을 나타낸다. 특히, "생체외 방법"은, 조직 또는 기관을 포함하거나 조직 또는 기관인 이식편의 경우에서와 같이, "탈체 방법(ex vivo method)"을 또한 포함하지만, 특히 살아 있는 피실험자 내부에서 수행되는 "생체내 방법"을 제외한다.

바람직하게, 본 발명에 따라, 배양(단계)은 상기 이식편에 대한 상기 항체의 결합을 허용하는데 충분한 시간 동안 실행된다. 바람직하게, 상기 배양은, 상기 이식편의 접근 가능한 CD4 에피토프의 40% 내지 100%, 특히 50% 내지 100%, 특히 60% 내지 100%, 특히 70% 내지 100%, 더 특정하게 80% 내지 100%, 더 특정하게 90% 내지 100%, 더 특정하게 95% 내지 100%, 더 특정하게 99% 내지 100%에, 항 CD4 항체의 결합을 허용하는데 충분한 시간 동안 실행된다. 가장 바람직하게, 상기 배양 후에, 항 CD4 항체는 상기 이식편의 접근 가능한 필수적으로 모든 CD4 에피토프에 결합된다.

적절한 배양 기간은 당업자에 의해 용이하게 결정될 것이다. 일반적으로, 적절한 배양 기간은 사용된 이식편의 유형에 의존할 것이다. 바람직한 배양 기간은 또한 사용된 항체의 양에 의존할 것이다. 일반적으로, 이식편이 예를 들어, 세포 현탁액이면, 이식편이 예를 들어, 기관일 경우보다 더 짧은 배양 기간이 필요할 것이다.

일반적으로, 이식편이 조직 또는 기관을 포함하거나 조직 또는 기관일 경우, 항체가 (예를 들어, 확산을 통해) 각각의 구획(compartment) 안으로 운반되도록 하기 위해 더 긴 배양 기간이 바람직하다.

게다가, 임의의 경우, 당업자는, 예를 들어, 유동 세포 계수법(flow cytometry)을 필요로 할 수 있는, 이 기술 분야에서 잘 알려져 있는 방법에 따라 항 CD4 항체의 결합(상태)을 쉽게 시험할 수 있다.

일반적으로, 생체외 처리로 인해 이식편에 대한 임의의 가능한 손상을 최소화하기 위해, 짧은 배양 기간이 긴 배양 기간보다 바람직하다.

본 발명에 따라, 상기 배양은, 예를 들어, 1분 내지 7일 동안 실행될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 배양은 1분 내지 150분 동안, 특히, 10분 내지 150분 동안, 더 특정하게 30분 내지 150분 동안, 더 특정하게 40분 내지 120분 동안, 더 특정하게 45분 내지 90분 동안, 특히 50분 내지 70분 동안 실행된다. 다른 실시예에서, 상기 배양은, 150분 내지 7일 동안, 특히 150분 내지 5일 동안, 더 특정하게 150분 내지 3일 동안, 더 특정하게 150분 내지 1일 동안, 특히, 150분 내지 8시간 동안 실행된다.

본 발명의 방법 및 사용 방법에 따라 결합되지 않은(항 CD4) 항체의 제거에 관해서, 상기 단계를 수행하는 여러 가지 방법이 당업자에게 알려져 있다. 이식편에서 결합되지 않은 항체를 제거하는 한 가지 예시적인 방법은, 이식편을 세척하는 것에 의한 방법이다. 세척은, 예를 들어, 이식편이 세포 현탁액을 포함하거나 세포 현탁액인 경우, 원심분리를 사용하여 일어날 수 있다.

제거 단계에서, 바람직하게는 적어도 40%, 더 특정하게 적어도 50%, 더 특정하게 적어도 60%, 더 특정하게 적어도 70%, 더 특정하게 적어도 80%, 더 특정하게 적어도 90%의 결합되지 않은 (항 CD4) 항체가 이식편으로부터 제거된다. 바람직하게, 100% 이하의 결합되지 않은 (항 CD4) 항체가 이식편으로부터 제거된다.

상기 배양 단계에서 사용된 항체의 양은 특정하게 제한되지 않는다. 적절한 양이 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 예를 들어, 사용된 이식편의 유형에 의존할 수 있다. 바람직하게 본 발명에 따라, 상기 배양은 0.1㎍ 내지 100㎎의 항체 양으로 실행된다.

일부 실시예에서, 특히, 이식편이 세포 현탁액인 경우, 상기 배양은 0.1 ㎍/㎖ 세포 현탁액 내지 150 ㎍/㎖ 세포 현탁액, 특히 7 ㎍/㎖ 세포 현탁액 내지 100 ㎍/㎖ 세포 현탁액, 더 특정하게 30 ㎍/㎖ 세포 현탁액 내지 100 ㎍/㎖ 세포 현탁액, 특히 40 ㎍/㎖ 세포 현탁액 내지 60 ㎍/㎖ 세포 현탁액의 항체 농도로 실행된다.

일부 실시예에서, 특히 이식편이 조직이거나 이식편이 기관인 경우, 상기 배양은 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎, 특히 1 ㎎ 내지 10 ㎎, 더 특정하게 2 ㎎ 내지 9 ㎎, 더 특정하게 3 ㎎ 내지 8 ㎎, 특히 4 ㎎ 내지 6 ㎎의 항체 양으로 실행된다.

일부 실시예에서, 특히 이식편이 조직이거나 이식편이 기관인 경우, 상기 배양은 0.1 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖, 특히 1 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖, 더 특정하게 2 ㎎/㎖ 내지 9 ㎎/㎖, 더 특정하게 3 ㎎/㎖ 내지 8 ㎎/㎖, 특히 4 ㎎/㎖ 내지 6 ㎎/㎖의 배양 용액 중 항체의 농도로 실행된다. 바람직하게, 명시된 부피는 상기 조직 또는 기관의 부피뿐만 아니라, (항체 함유) 용액의 부피를 포함한다 (상기 조직 또는 기관이 배양됨).

일부 실시예에서, 특히 이식편이 조직이거나 이식편이 기관인 경우, 상기 배양은 10 ㎍/㎖ 내지 150 ㎍/㎖, 특히 20 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 더 특정하게 30 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 특히 40 ㎍/㎖ 내지 60 ㎍/㎖의 항체 농도를 갖는 용액에서 상기 조직 또는 기관을 배양시켜 실행된다. 바람직하게, 명시된 부피는 상기 조직 또는 기관의 부피뿐만 아니라, (항체 함유) 용액의 부피를 포함한다 (상기 조직 또는 기관이 배양됨).

항체 함유 용액으로 조직 및/또는 기관 배양시, 당업자는 적절한 용기에 의한 것과 같이 이러한 배양을 쉽게 수행할 것이다.

항체의 적절한 양의 선택은 당업자의 의견 내에 있는 것이 바람직하다. 일반적으로, 이식편이 조직 또는 기관을 포함하거나 조직 또는 기관인 경우, 항체의 더 많은 양 또는 더 큰 농도가 각각 바람직하다. 게다가, 사용된 항체의 정확한 양 또는 농도의 각각의 선택은 또한 이러한 조직 또는 기관의 크기에 의존할 것이다.

바람직한 실시예에서, 상기 생체외 방법 또는 사용은, GvHD, 공여체 이식편 거부, 및 기관 거부로 이루어진 그룹 중 어느 하나의 가능성, 특히, 상기 이식편의 이식시 GvHD의 가능성을 줄이기 위한 것이다. 바람직한 실시예에서, 상기 생체외 방법 또는 사용은, 상기 변형된 이식편의 이식시 수용체의 조직에 대해, 이식된 면역적격 세포(immunocompetent cell) 내에서 내성(tolerance)을 이루기 위한 것이다. 바람직한 실시예에서, 상기 생체외 방법 또는 사용은, 상기 변형된 이식편의 이식시 변형된 이식편에 대해, 수용체의 조직 내에서 내성 또는 부분적인 내성을 이루기 위한 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "부분적인 내성(partial tolerance)"은 감소된 면역 반응에서 부분적인 면역내성 결과이다. 바람직한 실시예에서, 상기 생체외 방법 또는 사용은, 상기 이식편 내에서 세포 활성화를 억제하기 위한 것이다.

면역 세포를 포함하는 세포 이식편을 포함한 이식편은 당업자에게 매우 잘 알려져 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "면역 세포를 포함하는 세포 이식편"은 면역 세포를 포함하는 이식편이다. 면역 세포를 포함하는 세포 이식편은 특정하게 제한되지 않는다.

본 발명에 따라, 이식편은 세포 현탁액, 조직 및/또는 기관을 포함할 수 있다. 이식편은 세포 현탁액, 조직 및/또는 기관인 것이 바람직하다. 이식편은 세포 현탁액, 조직, 및 기관으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 더 바람직하다.

또한, 본 발명의 바람직한 일부 실시예에서, 이식편은 줄기 세포를 포함한다. 줄기 세포를 포함하는 이식편은 본 명세서에서 줄기 세포 이식편으로도 불릴 수 있다.

본 발명에 따라, 이식편은 CD4 항원을 갖는 세포를 포함한다. 바람직하게, 이식편은 면역 세포, 특히 CD4 항원을 갖는 면역 세포를 포함한다. 이러한 세포는 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 이러한 면역 세포는 CD4 양성 T 림프구 또는 그 선구물질 세포이다. 바람직한 특정 실시예에서, 이러한 면역 세포는 T 보조 세포 및 단핵구와 대식세포계에 속하는 세포(단핵구 및 대식세포와 같은)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시예에서, 상기 이식편은 조직, 바람직하게는 줄기 세포를 함유하는 조직을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라, 적절한 조직은 혈액, 근육, 지방 조직, 결합 조직, 상피 조직, 배아 조직, 및 세포 조직을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

다른 실시예에서, 상기 이식편은 기관, 바람직하게는 줄기 세포를 함유하는 기관을 포함하는 것이 바람직하다. 적절한 기관은 피부, 장, 신장, 및 간을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 기관은 장인 것이 바람직하다.

바람직한 실시예에서, 상기 이식편은 세포 현탁액, 바람직하게는 줄기 세포를 함유하는 세포 현탁액을 포함하는 것이 바람직하다. 적절한 세포 현탁액과 이를 얻기 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 세포 현탁액 이식편은, 골수를 포함하는 뼈의 천자(puncture), 예를 들어, 장골능 또는 흉골의 천자에 의해 얻어지거나, 또는 전신에서 줄기 세포 적소(stem cell niches), 예를 들어, 지방 조직, 치근, 모근, 및 앞에 기재된 임의의 다른 공급원으로부터 취해질 수 있다.

바람직한 실시예에서, 세포 현탁액, 특히 줄기 세포를 함유하는 세포 현탁액은 골수 세포, 비부착성 골수 세포, 말초 혈액 세포, 제대혈 세포, 바르톤 젤리(Wharton's jelly)의 세포, 태반 유도 세포, 모근 유도 세포, 및/또는 지방 조직 유도 세포를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 세포 현탁액, 특히 줄기 세포를 함유하는 세포 현탁액은, 림프구, 단핵구 및/또는 대식세포를 포함한다.

바람직한 특정 실시예에서, 이식편, 특히 세포 현탁액은, 임의의 골수 줄기 세포, 말초 혈액 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, NA-BMCs와 같은 골수의 성인 줄기 세포, 배아 줄기 세포 및/또는 재프로그램된 성인 줄기 세포(즉, 유도 다능성 세포)를 포함한다.

일부 특정 실시예에서, 이식편은 배아 줄기 세포로 이루어지지 않거나 이를 포함하지 않는다. 일부 특정 실시예에서, 이식편은 분화전능성 줄기 세포(totipotent stem cell)로 이루어지지 않거나 이를 포함하지 않는다.

바람직한 실시예에서, 이식편은 골수 현탁액, 특히 골수 줄기 세포를 포함하는 골수 현탁액이다. 일반적으로, 이식편, 특히 골수 현탁액은, 혈액 세포, 제대혈 세포, 공여체 림프구, 말초 혈액 줄기 세포, 골수의 성인 줄기 세포, 배아 줄기 세포 및/또는 재프로그래된 성인 줄기 세포(즉, 유도 다능성 세포)에 포함된 줄기 세포 중 임의의 것을 더 포함할 수 있다.

이식편, 특히 골수 현탁액은, 혈액 세포, 제대혈 세포, 공여체 림프구, 말초 혈액 줄기 세포, 및/또는 골수의 성인 줄기 세포에 포함된 줄기 세포 중 임의의 것을 더 포함할 수 있다.

일반적으로, 세포 현탁액은 또한 줄기 세포(의 임의의 조합)를, 선택적으로 임의의 다른 세포(의 조합)와 함께 포함하는 임의의 세포 현탁액을 포함하는 것으로 의도된다.

이식편은 또한 앞에서 지칭된 하나 이상의 이식편의 조합, 예를 들어, 기관과 세포 현탁액의 조합과 같은 이식편의 조합일 수 있다.

추가 양상에서, 본 발명은, 본 발명의 상체외 방법에 따라 얻어질 수 있는 면역 세포를 함유하는 변형된 세포 이식편에 관한 것이다.

이와 마찬가지로, 본 발명은 면역 세포를 함유하는 변형된 세포 이식편에 관한 것으로, 상기 이식편은 상기 이식편의 접근 가능한 CD4 에피토프의 40% 내지 100%에 결합된 항 CD4 항체를 포함한다. 바람직하게, 면역 세포를 함유하는 변형된 세포 이식편은, 상기 이식편의 접근 가능한 CD4 에피토프의 50% 내지 100%, 특히 60% 내지 100%, 특히 70% 내지 100%, 더 특정하게 80% 내지 100%, 더 특정하게 90% 내지 100%, 더 특정하게 95% 내지 100%, 더 특정하게 99% 내지 100%에 결합된 항 CD4 항체를 포함한다. 가장 바람직하게, 면역 세포를 함유하는 세포 이식편의 필수적으로 모든 접근 가능한 CD4 에피토프는 항 CD4 항체에 결합된다.

추가 양상에서, 본 발명은 약물에 사용하기 위한 본 발명의 변형된 이식편에 관한 것이다.

추가 양상에서, 본 발명은 이식에 의해 치료될 수 있는 하나 이상의 질병을 환자에게서 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 변형된 이식편에 관한 것이다.

이식에서 면역 세포를 함유하는 세포 이식편을 포함하는 이식편을 사용하는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명은, 이 기술 분야에 알려진 바와 같이, 이식과 관련된 심각한 부작용을 피하도록 의도된 변형된 이식편을 제공한다. 따라서, 본 발명의 변형된 이식편은 변형되지 않은 이식편에 대해서 알려진 바와 같이 사용된다.

바람직하게, 상기 환자는 포유류 환자, 특히, 인간이다. 바람직하게, 이식에 의해 치료될 수 있는 상기 하나 이상의 질병은, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)(AML); 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoid leukemia)(ALL); 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia)(CML); 골수 이 형성 증후군(myelodysplastic syndrome)(MDS)/골수 증식 증후군(myeloproliferative syndrome); 악성 림프종(malign lymphomas), 특히, 호지킨 질병(Morbus Hodgkin), 높은 등급의 비호지킨 림프종(high grade Non-Hodgkin Lymphoma)(NHL), 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma)(MCL), 저 악성 비호지킨 림프종(low malign NHL), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphatic leukemia)(CLL), 다발성 골수증(multiple myeloma)으로부터 선택된 악성 림프종; 중증 재생 불량성 빈혈(severe aplastic anemia); 지중해 빈혈(thalassemia); 겸상 적혈구성 빈혈(sickle cell anemia); 면역학적 결함, 특히, 중증 복합형 면역 부전증(severe combined immunodeficiency)(SCID), 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome)(WAS), 및 혈구 포식 세포 림프조직 구증다증(hemophagocytic lymphohistiocytosis)(HLH)으로부터 선택된 면역학적 결함; 선천성 대사 장애증(inborn errors of metabolism), 특히, 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorders)과 퍼옥시좀 기능 장애(disorders of peroxisomal function)로부터 선택된 선천성 대사 장애증; 자가면역 질환; 류머티즘 장애(rheumatologic diseases); 및 상기 질병 중 임의 질병의 재발성(recidivisms)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

훨씬 더 바람직하게, 상기 하나 이상의 질병은, 특히, 급성 골수성 백혈병(AML); 급성 림프구성 백혈병(ALL); 만성 골수성 백혈병(CML); 골수 이 형성 증후군(MDS)/골수증식 증후군; 악성 림프종, 특히, 호지킨 질병, 높은 등급의 비호지킨 림프종(NHL), 외투 세포 림프종(MCL), 저 악성 비호지킨 림프종(NHL), 만성 림프성 백혈병(CLL), 다발성 골수증으로부터 선택된 악성 림프종; 중증 재생 불량성 빈혈; 지중해 빈혈; 및 겸상 적혈구성 빈혈로부터 선택된 하나 이상의 혈액암이다.

일반적으로 본 명세서에서, 상기 하나 이상의 질병은 또한 본 명세서에 기재된 질병의 임의의 조합뿐만 아니라, 상기 질병 중 임의 질병의 재발성을 포함한다.

후자의 양상에서, 바람직하게, 이식편은 본 발명의 생체외 방법과 관련하여 앞에 기술된 바와 같이 추가 한정된다. 즉, 이식편은, 세포 현탁액, 조직과 기관으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직할 수 있다. 더 바람직하게, 상기 이식편은, 골수 세포, 비부착성 골수 세포, 말초 혈액 세포, 제대혈 세포, 바르톤 젤리의 세포, 태반 유도 세포, 모근 유도 세포, 및/또는 지방 조직 유도 세포를 포함하는 세포 현탁액; 림프구, 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는 세포 현탁액; 줄기 세포를 함유하는 조직; 및 줄기 세포를 함유하는 기관으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시예에서, 치료는, GvHD, 공여체 이식편 거부, 및 기관 거부로 이루어진 그룹 중 어느 하나를 발생시킬 줄어든 가능성, 특히, 상기 이식편의 이식시 GvHD를 발생시킬 줄어든 가능성을 의미한다. 다른 실시예에서, 치료는, 상기 변형된 이식편의 이식시 수용체의 조직에 대해, 이식된 면역적격 세포 내의 내성을 의미한다. 다른 실시예에서, 치료는, 상기 변형된 이식편의 이식시 변형된 이식편에 대한 내성을 의미한다. 다른 실시예에서, 치료는, 상기 변형된 이식편의 이식시 변형된 이식편에 대한 수용체의 조직 내에서의 내성 또는 부분적인 내성을 의미한다. 다른 실시예에서, 치료는, 상기 이식편 내에서 세포 활성화를 억제하기 위한 것이다. 바람직한 실시예에서, 치료는 상기 내용 중 임의의 조합을 의미하거나/임의의 조합을 위한 것이다.

이식편에 함유된 세포의 양은 특정하게 제한되지 않는다. 당업자는 이식편과, 이식을 위한 이식편의 세포의 적절한 양을 쉽게 선택할 수 있을 것이다. 또한, 적절한 안내는, 예를 들어, "Deutsche Bundesarztekammer"에 의해 개발된 이식용 특정 가이드라인(예를 들어, 환자에게서 인간의 조혈 줄기 세포를 위한)으로부터 또한 이용 가능하다.

바람직하게, 본 발명에 따라, 특히, 이식편이 세포 현탁액인 경우, 2×10⁶ 세포 내지 2×10¹⁰ 세포, 특히, 4×10⁶ 내지 1×10⁹ 유핵 세포, 더 특정하게, 1×10⁷ 내지 1×10⁸ 유핵 세포의 양이 상기 환자, 바람직하게는, 인간 환자에게 투여된다.

이식편이 조직 또는 기관을 포함하거나 조직 또는 기관인 경우, 임의의 적절한 양의 상기 조직 또는 기관이 상기 환자에게 투여될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조직 또는 기관에서 세포 수는 결정하기가 어렵다. 특히, 이러한 이유 때문에, 이식편에 함유된 세포의 양은 특정하게 제한되지 않는다. 적절한 양은, 예를 들어, 특별한 유형의 환자, 이식편 및/또는 치료될 질병을 고려하여, 당업자에 의해, 각각 쉽게 결정되거나 선택될 것이다. 기관의 경우, 전체 기관의 투여가 바람직하다.

본 발명의 방법, 변형된 이식편, 및 사용을 위한 변형된 이식편에서, 이식편은 가용성 생체활성 분자, 특히, 면역억제, 면역내성 및/또는 조절 T 세포의 형성을 촉진하는 약제(agent) 또는 이러한 약제의 임의의 조합으로 추가 배양될 수 있다. 이러한 약제는, GvHD, 공여체 이식편 거부, 및 기관 거부로 이루어진 그룹 중 어느 하나의 가능성, 특히, 상기 이식편의 이식시 GvHD의 가능성을 감소시키거나 또는 상기 변형된 이식편의 이식시 내성을 이루는 것과 같이, 본 발명의 방법, 사용, 변형된 이식편, 또는 상술한 사용을 위한 변형된 이식편의 특징 또는 이점을 각각 지지하는 것이 바람직하다. 이러한 약제는 특히 사이토카인을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 이러한 약제(들)는, II-2, TGF-β, 라파마이신, 레티논산, 4-1BB 리간드, 및 항-CD28 항체로 이루어진 그룹, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.

이와 마찬가지로, 본 발명의 사용을 위한 변형된 이식편에서, 이식편은 임의의 약물(medicament) 또는 약물의 조합과 함께 환자에게 선택적으로 투여될 수 있다. 상기 약물(들)은 이식 전, 이식과 함께 및/또는 이식 후에 투여될 수 있다. 적절한 투여 방식과 경로는 특정하게 제한되지 않고 당업자에 의해 쉽게 선택될 것이다. 이러한 약물(들)은, GvHD, 공여체 거부, 및 기관 거부로 이루어진 그룹 중 어느 하나의 가능성을 감소시키는 것과 같이, 본 발명의 방법, 사용, 변형된 이식편, 상술한 사용을 위한 변형된 이식편의 특징 또는 이점을 각각 지지하는 것이 바람직하다. 이러한 약물의 비제한적인 예는 라파마이신과 레티논산을 포함한다.

추가 양상에서, 본 발명은, 본 발명의 변형된 이식편, 특히 본 발명의 생체외 방법에 따라 얻어질 수 있는 변형된 이식편으로, 이러한 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 바람직한 실시예에서, 상기 이식편, 환자, 치료, 및/또는 질병은 상술한 바와 같다.

추가 양상에서, 본 발명은, 이식편, 특히, 면역 세포를 함유하는 세포 이식편의 생체외 변형을 위해 항 CD4 항체를 사용하는 방법에 관한 것으로, 변형은 상기 이식편을 상기 항체로 1분 내지 7일 동안 배양하는 단계를 포함하고, 특히, 변형은 결합되지 않은 항체를 상기 이식편으로부터 제거하는 단계를 더 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 사용 방법은 본 발명의 방법을 위해 본 명세서에 기술된 바와 같이 추가 한정된다.

추가 양상에서, 본 발명은, 환자에게서 이식에 의해 치료 가능한 하나 이상의 질병의 치료를 위한 약물의 제조를 위해 본 발명의 변형된 이식편을 사용하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시예에서, 상기 사용 방법은 본 발명의 방법을 위해 본 명세서에 기술된 바와 같이 추가 한정된다. 특히, 이식편, 환자, 치료, 및/또는 질병은 상술한 바와 같이 것이 바람직하다.

본 발명의 방법, 사용, 변형된 이식편, 또는 사용을 위한 변형된 이식편의 더욱 추가적인 양상에서, 항 CD4 항체는 임의의 다른 CD4 리간드로 치환된다. 바람직한 CD4 리간드는, 펩티드 리간드(자연 발생 펩티드 리간드와 펩티드 구조물을 포함하는)뿐만 아니라 앱타머(aptamer)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 CD4 리간드는 이 기술 분야에 알려져 있다.

*더욱 추가적인 양상에서, 본 발명의 방법, 사용, 변형된 이식편, 및 사용을 위한 변형된 이식편에서 지칭되는 이식편은, 줄기 세포를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 즉, 후자의 양상에 따라, 면역 세포를 함유하는 세포 이식편은 임의의 이식편으로 치환될 수 있고 줄기 세포를 포함하는 이식편뿐만 아니라, 줄기 세포를 포함하지 않는 이식편을 포함한다. 즉, 본 발명의 이식편 또는 본 발명에 따라 사용된 이식편은 임의의 이식편이거나 면역 세포를 함유하는 세포 이식편일 수 있다. 즉, 특정 실시예에서, 본 발명의 이식편 또는 본 발명에 따라 사용된 이식편은 줄기 세포를 포함하는 반면, 다른 실시예에서는, 본 발명의 이식편 또는 본 발명에 따라 사용된 이식편은 줄기 세포를 포함하지 않는다. 특정 실시예에서, 이식편은 독립된 CD4⁺ 세포를 포함하지 않는다.

예에서 보다 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명자는, 예를 들어, 인간의 CD4와 HLA-DR3에 대해 CD4-/-C57Bl/6 형질전환 쥐{삼중 형질전환 쥐, TTG; Laub 등(2000) 참조}를 사용했다. TTG 쥐는 완전한 기능상의 쥣과 면역 체계를 갖지만, 인간의 CD4 대신 쥣과의 CD4를 갖지 않고, 쥣과의 MHC-II 외에 인간의 HLA-DR3가 존재한다. 이러한 설정에서, 골수 세포가 TTG 이식편으로 취해지고 Balb/c 야생형 쥐에 이식하기 전 항인 CD4 항체로 배양될 수 있다. 이러한 전체 MHC 클래스 I 부적합 이식 모델에서, GvHD 유도(GvHD induction)는 매우 가능성이 높고 항 CD4 항체에 대한 도전이다.

Balb/c 쥐에서 TTG/C57B16 공여체 세포의 생착(engraftment)은 유동 세포 계수법으로 확인되었다. H-2Kd(C57Bl/6), 인간의 CD4, HLA-DR의 안정한 생착, 및 이식 후 쥣과 CD4의 감소는 완전한 공여체(TTG) 조혈작용을 나타내고, 이식 후 12일째 처음으로 관찰되었다. GvHD는 생존 분석, 스코어링 시스템, 및 조직학(histology)으로 확인되었다. GvHD의 심각도(severity)는 C57Bl/6 야생형 공여체 세포보다 TTG 공여체 세포를 사용하여 더 컸다. 항 CD4 항체로 처리된 GvHD 쥐의 생존은 0에서 83%로 크게 증가했다. 항체 처리가 없으면, GvHD 쥐는 19~35일 이내에 죽었다. 사용된 항 CD4 항체는 완전한 MHC 부적합 모델(Balb/c 쥐에서 TTG 쥐)에서 쥣과 HSCT 다음에 GvHD 발병을 효과적으로 억제한다. 이러한 독특한 이식 모델은, TTG 쥐를 공여체로 사용하는 안정한 쥣과 GvHD 모델에 의해, 쥐에서 항인 CD4 항체의 직접적인 시험을 허용한다. TTG 쥐에서 골수 이식편의 항인 CD4 전처리 후 GvHD의 유발이 없었다. 이러한 발견은 반응성 T 세포 클론을 억제하기 위한 전략을 개선하기 위해 적절한 것으로 간주된다.

더욱 추가적인 양상에서, 본 발명은, i) 항체 16H5.chimIgG4, ii) 2011년 12월 2일 DSZM에 기탁된 세포주 CD4.16H5.chimIgG4로부터 얻어질 수 있는 항체, iii) 항체 16H5.chimIgG4의 VH와 VK를 포함하는 항체, iv) 2011년 12월 2일 DSMZ에 기탁된 세포주 CD4.16H5.chimIgG4로부터 얻어질 수 있는 항체의 VH와 VK를 포함하는 항체, v) 도 12에 기재된 VH와 도 13에 기재된 VK의 조합을 포함하는 항체로서, 상기 조합은 VH1/VK1, VH2/VK2, VH4/VK2, 및 VH4/VK4로부터 선택되고, 특히, 상기 조합은 VH2/VK2인, 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항 CD4 항체에 관한 것이다.

이러한 더욱 추가적인 양상의 특정한 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 "MAX.16H5"이다. 특정 실시예에서, 본 발명에 사용된 항 CD4 항체는 2011년 12월 2일 DSMZ에 출원인에 의해 이루어진 생물학적 물질의 기탁으로부터 얻어질 수 있는 항체이다. 특정 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 2011년 12월 2일 DSMZ에 출원인에 의해 기탁된 세포로부터 얻어질 수 있는 항체이다. 특정 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 2011년 12월 2일 DSMZ에 기탁된 세포 "MAX.16H5/30F16H5"로부터 얻어질 수 있는 항체이다. 특정 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 2011년 12월 2일 DSMZ에 기탁된 세포 "CD4.16H5.chimIgG4"로부터 얻어질 수 있는 항체이다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 도 12의 VH1을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 도 12의 VH2를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 도 12의 VH4를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 도 13의 VK1을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 도 13의 VK2를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 도 13의 VK4를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 SEQ ID NO:10을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 SEQ ID NO:8을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 SEQ ID NO:4를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 SEQ ID NO:20을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 SEQ ID NO:18을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 SEQ ID NO:14를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 도 12의 VH1 및/또는 도 13의 VK1을 포함한다. 일부 특히 바람직한 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 도 12의 VH2 및/또는 도 13의 VK2를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 도 12의 VH4 및/또는 도 13의 VK2를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 도 12의 VH4 및/또는 도 13의 VK4를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 SEQ ID NO: 10 및/또는 SEQ ID NO: 20을 포함한다. 일부 특히 바람직한 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 SEQ ID NO: 8 및/또는 SEQ ID NO: 18을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 18을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 14를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항 CD4 항체는 항체 16H5.chimIgG4의 VH와 VK를 포함한다.

일반적으로, 본 발명은 또한 실시예에 관한 것으로, 상기 실시예에서 "포함한다" 또는 이와 동등한 용어는 "갖는다" 또는 이와 동등한 용어로 대체된다. 예를 들어, 본 발명은 일반적으로 또한 실시예에 관한 것으로, 상기 실시예에서 "포함하는" 또는 이와 동등한 용어는 "갖는" 또는 이와 동등한 용어로 대체된다.

아래에서, 본 발명의 추가 양상이 상세하게 기술된다.

한 가지 일면에서, 본 발명의 상기 추가 양상은 중쇄 면역글로불린 가변 영역(VH)과 경쇄 면역글로불린 가변 영역(VL)을 포함하는 항인 CD4 항체에 관한 것으로, 여기에서, 상기 면역글로불린 가변 영역의 CDRs 밖에 위치한 적어도 하나의 T 세포 에피토프는, 상기 면역글로불린 가변 영역으로부터 제거된다.

이러한 항체는 이들의 부모 항체보다 면역성이 낮아서, T 세포를 자극하거나 활성화할 가능성이 낮고, 이에 따라, 항체에 대해서, 예를 들어, 인간 환자에게서 원하지 않는 T 세포 매개 면역 반응을 일으킬 가능성이 낮다.

또한, 상기 항체는 인간의 CD4 항체를 결합하기 위해 대응하는 변형되지 않은 항체의 능력을 실질적으로 유지하는 것이 유리하고, 이들의 유리한 특징 중 적어도 하나를 더 유지하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 추가 양상에 사용된 바와 같이, "항체"에 의해, 특히, 항원과 화합, 상호작용, 또는 이와 달리 결합할 수 있는 면역글로불린계의 단백질이 의미된다.

본 발명의 상기 추가 양상의 문맥에서, "항체"라는 용어는, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', 및 F(ab')2 단편을 포함하는 항체 단편에 관한 것으로 또한 간주되는 것이 바람직하다. 이러한 단편은 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 상기 추가 양상은 또한 이 기술 분야에서 잘 알려져 있는 항체 유도 분자 종의 여러 재조합 형태를 또한 고려하는 것이 바람직하다. 이러한 종은, VH와 VL 영역을 연결하는 펩티드 링커를 포함하는 단일 사슬 Fv 형태(예를 들어, scFv)를 포함하는 안정화된 Fv 단편, 또는 사슬간 디설파이드 결합(dsFv)에 의해 안정화되고 VH와 VL 영역의 결합을 용이하게 하도록 설계된 추가 시스테인 잔기를 함유하는 Fv를 포함한다. 이와 동일하게, 다른 조성물이 이 기술 분야에서 익숙하고, "소형체"로도 불리는 종과, 단일 가변 영역 "dAbs"을 포함할 수 있다. 다른 종은 여전히 변형된 항체 V-영역부의 결합가를 증가시키는 수단, 즉, 예를 들어, 이합체화 영역(예를 들어, "류신 지퍼") 또는 또한 화학적 변형 전략의 엔지니어링에 의해 다중 항원 결합 위치를 갖는 종을 통합할 수 있다. 게다가, "항체"라는 용어는 또한 이중체, 삼중체 또는 사중체, 탠댑, 유연체, 이중특이성 항체, 및 키메릭 항체와 같은 scFv의 다합체에 관한 것이 바람직하다. 본 발명의 상기 추가 양상에 따라, "항인 CD4-항체"라는 용어는, 상술한 바와 같이, 인간의 CD4에 결합하는 능력을 갖는 항체를 가리키는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 상기 추가 양상에 사용된 바와 같이, "변형되지 않은 항체" 또는 "부모 항체"라는 용어는, 항인 CD4-항체를 가리키는 것이 바람직하고, 본 발명의 상기 추가 양상의 항체와 반대로, 상기 면역글로불린 가변 영역의 CDRs 밖에 위치한 T 세포 에피토프는 면역글로불린 가변 영역으로부터 제거되지 않는다. "항원"이라는 용어는, 항체와 상호작용할 수 있는 물질을 나타내기 위해 본 발명의 상기 추가 양상에 사용되는 것이 바람직하다. 본 발명의 상기 추가 양상의 항체의 문맥에서, 항원은 바람직하게 CD4, 특히 인간 CD4인 것으로 의미되는 것이 바람직하다. "CD4" 또는 "분화 4의 클러스터(cluster of differentiation 4)"는 단백질, 보다 정확하게는 표면 글리코단백질을 가리키고, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 문맥에서, CD4는, 단편 또는 이와 다르게 변형된 형태가 본 발명의 상기 추가 양상의 항체의 문맥에서 여전히 항원으로 작용하면, 전체 길이 CD4의 단편, 또는 이와 다르게 변형된 형태의 CD4를 또한 가리키는 것이 바람직할 수 있다. "면역 글로불린 영역"이라는 용어는, 특히, 면역글로불린 폴드(immunoglobulin fold)를 포함하는 단백질 영역을 나타내도록 본 발명의 상기 추가 양상에서 사용되는 것이 바람직하다. 면역글로불린 영역과 단백질은 이 기술 분야에서 잘 알려져 있다. "VH"라는 용어는, 항체의 중쇄의 중쇄 가변 영역을 가리키도록 본 발명의 상기 추가 양상에서 사용되는 것이 바람직하다. "중쇄 가변 영역"은 "중쇄 면역글로불린 가변 영역"으로도 불린다. 이러한 용어는 또한 이 기술 분야에서 잘 알려져 있다. "VL"이라는 용어는, 항체의 경쇄의 경쇄 가변 영역을 가리키도록 본 발명의 상기 추가 양상에서 사용되는 것이 바람직하다. "경쇄 가변 영역"은 "경쇄 면역글로불린 가변 영역"으로도 불린다. 이러한 용어는 또한 이 기술 분야에서 잘 알려져 있다.

중쇄 면역글로불린 가변 영역과 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 항원과 상호작용할 수 있는 결합 표면을 함께 제공하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 추가 양상에서 사용된 바와 같이, VH는, 길이가 약 110 내지 125개의 아미노산 잔기이고, 그 서열은 VL과 공동으로 CD4 항원을 결합할 수 있는 본 발명의 상기 추가 양상에서 명시된 VH 사슬 중 임의의 것에 대응하는, 폴리펩티드를 의미하는 것이 바람직하다. 이와 유사하게, VL은, 길이가 약 95 내지 130개의 아미노산 잔기이고, 그 서열은 VH와 공동으로 CD4 항원을 결합할 수 있는 본 발명의 상기 추가 양상에서 명시된 VL 사슬 중 임의의 것에 대응하는, 폴리펩티드를 의미하는 것이 바람직하다.

전체 길이의 면역글로불린 중쇄는 약 50 내지 70 kDa의 분자량을 갖는 것이 바람직하고, 일반적으로, N-말단에서 VH 유전자에 의해 암호화되고 C-말단에서 일정한 영역 유전자(예를 들어, [감마], [알파] 또는 [엡실론]) 중 하나에 의해 암호화된다. 이와 유사하게, 전체 길이의 경쇄는 약 25 kDa의 분자량을 갖는 것이 바람직하고, 일반적으로, N-말단에서 V 영역 유전자에 의해 암호화되고 C-말단에서 [카파] 또는 [람다] 일정한 영역 유전자에 의해 암호화된다.

항체의 경쇄는 "람다"("λ") 타입 사슬이거나 "카파"("κ") 타입 사슬일 수 있다. 따라서, 경쇄 가변 영역은 "람다"("Vl", "Vλ") 타입 경쇄 가변 영역이거나, "카파"("Vk", "Vκ") 타입 경쇄 가변 영역일 수 있다.

여러 단일클론 항체와 공통으로, 경쇄는 "카파"("κ") 타입 사슬인 것이 바람직하다. 따라서, VL은 Vk("VK", "Vκ") 타입 사슬인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 추가 양상의 문맥에서, 많은 서로 다른 중쇄 면역글로불린 가변 영역 서열과 경쇄 면역글로불린 가변 영역 서열이 제공되어 있다. 본 명세서는 완전한 항체 분자에 포함되어 있을 수 있는 상기 가변 영역 서열의 가능한 조합에 제한을 두지 않는다.

본 발명의 상기 추가 양상의 항체는 두 개의 동일한 중쇄 면역 글로불린 가변 영역 및 두 개의 동일한 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 것이 바람직하고, 여기서, 상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역과 경쇄 면역 글로불린 가변 영역은 본 발명의 상기 추가 양상에 기재된 가변 영역으로부터 선택된다.

본 발명의 상기 추가 양상에 따라, "T 세포 에피토프"라는 용어는, MHC 분자, 바람직하게는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 능력을 갖는 펩티드 서열을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 서열은, MHC 클래스 II와의 착물에서, T 세포를 자극하고/자극하거나 T 세포와 결합(반드시 활성화시키지는 않으면서)할 수 있다.

바람직하게, "T 세포 에피토프"라는 용어는, MHC 클래스 II 분자와 결합시, T 세포 수용체(TCR)에 의해 인식될 수 있고, 적어도 원칙적으로는, T 세포 반응을 촉진하기 위해 TCR에 결합하여 대응하는 T 세포를 자극하거나 활성화시킬 수 있는 펩티드 서열을 나타낸다.

항체의 T 세포 에피토프를 확인하게 위해, 이 기술 분야에서 당업자에게 알려져 있고/있거나 본 명세서에 기술되거나 첨조로 포함된 임의의 인 실리코 방법(in silico method) 또는 생체외 방법이 사용될 수 있다.

바람직하게, T 세포 에피토프는 8개 이상의 아미노산, 더 바람직하게는 8개 내지 20개의 아미노산, 더 바람직하게는 8개 내지 11개의 아미노산, 특히 바람직하게는 9개의 아미노산으로 이루어진다.

본 발명의 상기 추가 양상에 사용된 "펩티드"라는 용어는, 펩티드 결합에 의해 연결된 두 개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물인 것이 바람직하다. 일부 펩티드는 오직 몇 개의 아미노산 단위를 함유할 수 있다. 이 기술 분야에서, 짧은 펩티드, 예를 들어, 10개 미만의 아미노산 단위를 갖는 펩티드는 때로 "올리고펩티드"로 불리는 반면, 더 많은 수의 아미노산 잔기, 예를 들어, 10개 내지 100개 또는 100개 이상을 함유하는 펩티드는 일반적으로 "폴리펩티드"라 불린다.

본 발명의 상기 추가 양상 전반에서, T 세포 에피토프는, 항체에 대한 상기 에피토프를 기초로 한 T 세포 매개 면역 반응이 감소되거나, 바람직하게는, 사라졌을 때, 제거된 것으로 기술되는 것이 바람직하다.

바람직하게, 항체에 대한 T 세포 매개 면역 반응은, MHC 분자, 바람직하게는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 T 세포 에피토프의 잠재력이 감소(바람직하게는 제거)되었을 때, 감소(바람직하게는 제거)된다.

예 2에 기술된 예시적인 방법에 따라, 변형된 T 세포 에피토프는 MHC 클래스 II 대립 유전자 결합을 위해 인 실리코 시험될 수 있다. 이 방법에서, T 세포 에피토프는, 더 적은 수의 MHC 클래스 II 대립 유전자가 변형된 T 세포 에피토프에 결합하거나, MHC 클래스 II 대립 유전자가 변형된 T 세포 에피토프에 결합하지 않는 것으로 예측되면(예 2 참조), "제거된" 것으로 간주된다.

T 세포 매개 면역 반응의 감소 또는 제거를 측정하는 다른 방법이 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, 정제된 MHC 클래스 II 분자 또는 동형 불멸 B 세포주(homozygous immortalized B cell line) 중 어느 하나를 사용하는 생체외 MHC 클래스 II 결합 분석, 또는 탈체 T 세포 증식 분석을 포함한다.

T 세포 에피토프의 제거는, 감소된, 바람직하게는 결여된, 항체의 의해 표시되는 면역원성을 초래할 수 있다. "면역원성"이라는 용어는, 특히, 숙주 동물에서(특히, 숙주 동물이 인간인 경우) 체액성 또는 T 세포 매개 반응을 유발, 유도 또는 이와 달리 촉진하는 능력 및/또는 적절한 생체외 분석에서 반응을 이끌어내는 능력에 관한 것이다. 예를 들어, 면역원성은, 대응하는 부모 항체, 예를 들어, 변형되지 않은 잠식성 또는 키메릭 (잠식성 V-영역; 인간의 일정한 영역) 단일클론 항체에 비해 감소하면, 감소한 것으로 기술된다.

본 발명의 상기 추가 양상에 사용된 바와 같이, "CDR"이라는 용어는, 항체의 "상보성-결정 영역", 특히, 항체 특이성을 결정하는데 기여하는 면역글로불린 가변 영역 내의 초가변 영역 중 하나를 가리키는 것이 바람직하다. CDR은 당업자에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 중쇄 면역글로불린 가변 영역과 경쇄 면역글로불린 가변 영역 모두는 세 개의 CDRs를 함유한다.

면역글로불린 가변 영역에서 CDRs는, 예를 들어, 당업자에게 잘 알려져 있는 Kabat에 의해 개발된 방법에 따라 확인 및 한정될 수 있다. 본 발명의 상기 추가 양상의 바람직한 실시예에 따라, CDRs은 Kabat에 따라 한정된다{Kabat 등 (1991)}.

본 발명의 상기 추가 양상에 사용된 바와 같이, T 세포 에피토프의 제거는, 제거될 T 세포 에피토프의 서열이 상기 면역글로불린 가변 영역의 임의의 CDRs와 중첩하지 않으면, "면역글로불린 가변 영역의 CDRs 밖에 위치하는" 것으로 기술되는 것이 바람직하다. 또한, 제거된 T 세포 에피토프는, 제거될 T 세포 에피토프의 서열이 상기 면역글로불린 가변 영역의 임의의 CDRs와 중첩하지만, 이러한 T 세포 에피토프에 행해진 모든 변화가 면역글로불린 가변 영역의 CDRs 밖에서 이루어진 경우에, "면역글로불린 가변 영역의 CDRs 밖에 위치한" 것으로 또한 기술된다.

본 발명의 상기 추가 양상의 항인 CD4-항체는 다중클론 항체이거나 단일클론 항체일 수 있다. 항체는 단일클론 항체인 것이 바람직하다.

바람직한 실시예에 따라, 항체는 혼성세포주(hybridoma cell line) ECACC 88050502에 의해 생성된 단일클론 항체로부터 얻어진다.

혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 항체는 CD4 항체이고, 보다 구체적으로는 단일클론 쥐 항인 CD4-항체로서, 30F16H5로도 불리고, 예를 들어, DE 3919294에 기재되어 있다. 상기 항체는 ECACC에 기탁된 혼성 세포주로부터 얻어질 수 있다(수납 번호 88050502).

본 발명의 상기 추가 양상의 항체는, 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 단일클론 항체의 서열을 사용하거나, 또는 혼성 세포주 ECACC 88050502를 사용하여, 당업자에게 알려진 임의의 적절한 방법에 의해 얻어지면, 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 단일클론 항체로부터 "유도"될 것으로 기술된다.

항체는 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 항체의 CDRs를 갖거나, 항체는 SEQ ID NO: 2와 SEQ ID NO: 12의 CDRs를 갖는 것이 바람직하다.

SEQ ID NO: 2와 SEQ ID NO: 12의 CDRs는 도 12(a)와 도 13(a)에서 이탤릭체로 강조된 서열을 갖고, 상기 도면은 부모 항인 CD4-항체 30F16H5의 바람직한 면역글로불린 가변 영역 서열(SEQ ID NO: 2와 SEQ ID NO: 12)을 도시한다. 도 12(a)와 도 13(a) 각각에는 세 개의 CDRs가 도시되어 있다. 여기에서, 도 12(a)의 CDRs는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 31-35, 50-66, 및 99-109에 의해 형성되고, 도 13(a)의 CDRs는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 24-33, 50-55, 및 88-96에 의해 형성된다.

혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 항체, 또는 SEQ ID NO: 2와 SEQ ID NO: 12의 CDRs를 갖는 항체는, 부모 항체 30F16H5의 친화도에 필적하는 친화도(affinity)를 갖고 인간 CD4에 결합하는 높은 잠재력을 갖는다.

본 발명의 상기 추가 양상의 항체의 다른 바람직한 실시예에서, 상기 면역글로불린 가변 영역으로부터 하나 이상의 T 세포 에피토프의 제거로 인한 차이를 제외하고, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 항체의 중쇄 면역글로불린 가변 영역과 동일하거나, SEQ ID NO: 2와 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 항체의 경쇄 면역글로불린 가변 영역과 동일하거나, SEQ ID NO: 12와 동일한 서열을 포함한다.

예 2b에 기술된 바와 같이, 현재 발명자는, 부모 항인 CD4-항체 30F16H5의 T 세포 에피토프를 발견하여 본 명세서에 기재하고, 상기 영역은, 예를 들어, 아래 표 5와 표 6에 나타나 있다.

본 발명의 상기 추가 양상에서 EH1 내지 EH10("T cell epitope of heavy chain variable region" 1 to 10)으로 불리는 이러한 T 세포 에피토프는 표 5에 개별 도시되고(SEQ ID NOs: 21-30), 본 발명의 상기 추가 양상에서 EL1 내지 EL11 EH10("T cell epitope of light chain variable region" 1 to 11)으로 불리는 T 세포 에피토프는 표 6에 개별 도시된다(SEQ ID NOs: 31-41). 이러한 T 세포 에피토프 각각은, 각각의 부모 가변 영역 SEQ ID NO: 2와 SEQ ID NO: 12의 서열에서 이들의 위치를 기준으로 또한 설명될 수 있다.

*따라서, 본 발명의 상기 추가 양상의 바람직한 실시예에서, 적어도 하나의 T 세포 에피토프는, SEQ ID NO: 2의 위치 4 내지 12 (EH1), SEQ ID NO: 2의 위치 10 내지 18 (EH2), SEQ ID NO: 2의 위치 11 내지 19 (EH3), SEQ ID NO: 2의 위치 20 내지 28 (EH4), SEQ ID NO: 2의 위치 37 내지 45 (EH5), SEQ ID NO: 2의 위치 70 내지 78 (EH6), SEQ ID NO: 2의 위치 73 내지 81 (EH7), SEQ ID NO: 2의 위치 83 내지 91 (EH8), SEQ ID NO: 2의 위치 107 내지 115 (EH9), SEQ ID NO: 2의 위치 110 내지 118 (EH10)에서 중쇄 면역글로불린 가변 영역의 T 세포 에피토프와, SEQ ID NO: 12의 위치 2 내지 10 (EL1), SEQ ID NO: 12의 위치 3 내지 11 (EL2), SEQ ID NO: 12의 위치 10 내지 18 (EL3), SEQ ID NO: 12의 위치 11 내지 19 (EL4), SEQ ID NO: 12의 위치 45 내지 53 (EL5), SEQ ID NO: 12의 위치 53 내지 61 (EL6), SEQ ID NO: 12의 위치 59 내지 67 (EL7), SEQ ID NO: 12의 위치 61 내지 69 (EL8), SEQ ID NO: 12의 위치 62 내지 70 (EL9), SEQ ID NO: 12의 위치 70 내지 78 (EL10), 및 SEQ ID NO: 12의 위치 97 내지 105 (EL11)에서 경쇄 면역글로불린 가변 영역의 T 세포 에피토프로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특정 환경에서, 본 발명의 상기 추가 양상에 기재된 것에 대한 서열의 추가 영역은, 예를 들어, 본 발명의 경우와 유사한 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드를 발현하는 병원체로 감염된 경우, 면역 에피토프가 될 수 있는 것으로 이해된다.

본 발명의 상기 추가 양상의 바람직한 실시예에 따라, 적어도 하나의 T 세포 에피토프는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 변화로 제거된다.

특히, 본 발명의 상기 추가 양상에 사용된 바와 같이, 적어도 하나의 아미노산 잔기의 "변화(alteration)" 또는 "변형(modification)"은 바람직하게 다음 중 임의의 것일 수 있다.

- 다른 아미노산 잔기에 의한 적어도 하나의 원래 존재하는 아미노산 잔기의 치환,

- 적어도 하나의 아미노산 잔기의 첨가,

- 적어도 하나의 원래 존재하는 아미노산 잔기의 삭제,

- 적어도 하나의 아미노산 잔기의 화학적인 변형,

또는 이들의 조합.

적어도 하나의 아미노산 잔기의 "변화"라는 용어에 대한 기준은, 필요시, 일반적으로 특정 아미노산(들)의 치환, 첨가 또는 삭제에 의해 추가 변화(들)가 동일한 T 세포 에피토프 내에서 또는 항체 분자의 다른 곳에서 일어나서, 인간 CD4에 결합하기 위한 해당하는 변형되지 않은 항체의 능력을 실질적으로 유지하는 상황을 또한 포함한다. 보다 구체적으로, 이러한 추가 변화(들)는 항체의 유리한 특징 중 한 가지 이상을 추가로 유지하기 위해서 일어날 수 있다.

바람직하게, 하나 이상의 변화는, EH1 내지 EH10 및/또는 EL1 내지 EL11 중 어느 하나 또는 모두로부터, 바람직하게는 EH1 내지 EH10 및 EL1 내지 EL11 중 어느 하나 또는 모두로부터 하나 이상의 잔기에서 일어난다.

변화(들)는 "포켓 잔기"로 공통 표시된 하나 이상의 아미노산에서 일어나는 것이 특히 바람직한데, 이는, 이러한 변화가 MHC 결합 그루브의 포켓에 연관되어 있기 때문이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 상기 포켓 잔기는 면역원성에 특히 관련된 잔기를 구성하고, 따라서, 항체에 대한 T 세포 매개 면역 반응을 줄이거나, 바람직하게는, 제거할 가능성이 더 크다. 일반적으로, 부모 항체의 가장 면역성이 큰 영역 내에서 아미노산 변화가 수행되는 변형 항체 분자를 제공하는 것이 특히 바람직하다.

그러나, 아미노산 변화는, 주어진 에피토프 내에서 단독으로 또는 단일 에피토프 내에서 함께, MHC 클래스 II 결합 그루브에 대해 포켓 잔기와 동일한 위치에서 수행될 뿐만 아니라, 펩티드 서열 내의 어느 지점에서도 수행될 수 있다. 이러한 모든 변화는 본 발명의 상기 추가 양상의 범위 내에 속한다.

또한, 당업자에게 분명한 바와 같이, 에피토프의 제거를 이루는 대안적인 다중 변화 세트에 이를 수 있다. 그러나, 생성된 서열은 본 발명의 상기 추가 양상에 기재된 특정 조성과 광범위하게 상응하도록 유지되고, 이에 따라, 본 발명의 범위 내에 속할 것이다. 최소 상응 영역에서 본 발명의 명시된 서열과 약 70%, 또는 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 99% 이상 상응하는 서열에 도달하고 또한 조작상으로 동일하게 유지되는 것이 일반적일 것이다. 이러한 서열은 동일하게 본 발명의 범위 내에 있을 것이다.

바람직하게, 적어도 하나의 아미노산 잔기의 변화는 하나 이상의 아미노산의 치환이다.

따라서, 본 발명의 상기 추가 양상의 항체의 바람직한 실시예에서, 적어도 하나의 T 세포 에피토프 내에 있는 적어도 하나의 아미노산은 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 제거하기 위해 다른 아미노산으로 치환된다.

주어진 T 세포 에피토프 내에서 단일 아미노산 치환은 에피토프가 제거될 수 있는 바람직한 경로인 것으로 이해된다. 게다가, 단일 에피토프 내에서 치환의 조합이 완료될 수 있고, 예를 들어, 개별적으로 한정된 에피토프가 서로 중첩된 경우 특히 적합할 수 있다.

*여러 실시예에서, 중쇄 및/또는 경쇄에서, 2개 이상의 아미노산 치환, 또는 3개 이상의 아미노산 치환, 또는 4개 이상의 아미노산 치환, 또는 5개 이상의 아미노산 치환, 또는 6개 이상의 아미노산 치환, 또는 7개 이상의 아미노산, 또는 8개 이상, 또는 9개 이상, 또는 10개 이상, 또는 11개 이상, 또는 12개 이상의 아미노산 치환이 일어난다. 일부 실시예에서, 중쇄와 경쇄에서, 1 내지 21개, 5 내지 20개, 또는 7개 내지 14개의 아미노산 치환이 일어난다.

앞에서 지칭된 T 세포 에피토프 EH1 내지 EH10 및 EL1 내지 EL11 각각에서, 적어도 하나의 치환이 존재하고 항체가 인간 CD4에 결합하는 그 능력을 유지하면, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 치환이 존재할 수 있다.

치환의 수는, 각기, 결합하거나 결합되도록 예측된 MHC II 대립 유전자의 수가 크게 감소하도록 선택되는 것이 바람직하다. 바람직하게, 상기 수는, 치환이 존재하지 않을 때 결합된 대립 유전자의 수와 비교해서, 적어도 50%, 더 바람직하게는 40%, 더 바람직하게는 30%, 더 바람직하게는 20%, 더 바람직하게는 10%, 더 바람직하게는 5%, 더 바람직하게는 2%, 더 바람직하게는 1%, 가장 바람직하게는 0%로 감소한다.

예 2b에 예시된 바와 같이, 특정 분석(assay)에서, "결합된 MHC II 대립 유전자의 수"는, 분석에서 조사된 MHC 클래스 II 대립 유전자의 주어진 패널 중에서 MHC II 대립 유전자의 수(예를 들어, 34개의 MHC 클래스 II 대립 유전자)이고, 이는 논쟁 중인 T 세포 에피토프에 대한 결합 페티드인 것으로 밝혀졌다. 상기 수는, 부모 항체의 변형되지 않은 T 세포 에피토프와 비교해서, 변형된 T 세포 에피토프에 대해 수가 감소하면, "감소된" 것으로 기술된다.

본 명세서에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 T 세포 에피토프가 제거된 여러 변형 항인 CD4-항체가, 아미노산 치환을 필요로 하는 MHC 클래스 II 에피토프 제거에 의해 생성되었다. 이러한 점에서 특히 유용한 치환의 예는, 특정한 개별 치환, 즉, 도 12(e)와 도 13(e)에서 강조된 개별 치환을 나타내는 도 12와 도 13에 제공되고, 상기 특정한 개별 치환은 SEQ ID NO: 2{도 12(a) 참조} 또는 SEQ ID NO: 12{도 13(a) 참조}에서 각각 이루어질 수 있다. 이러한 치환은 또한 표 5(중쇄 면역글로불린 영역에 관한)와 표 6(경쇄 면역글로불린 영역에 관한)에 기술되어 있다.

따라서, 본 발명의 상기 추가 양상의 바람직한 실시예에 따라, 적어도 하나의 치환은, SEQ ID NO:　2에서 T9S, V10E, A12K, Q19K, S28T, K38R, R40A, L70I, A72R, V73D, S91T, T115L, L116V, 및 SEQ ID NO: 12에서 I10T, M11L, L46A, V59S, I62S, S69D, R76S, L105I로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특히 바람직한 실시예에서, 0, 1, 2, 또는 3 치환은 EH1과 EH6 각각 안에 있고, 0, 1 또는 2 치환은 EH12, EH5, 및 EH10 각각 안에 있으며, 0 또는 1 치환은 EH3, EH4, EH7, EH8, 및 EH9 각각 안에 있고, 0, 1 또는 2 치환은 EL2, EL3, EL7, EL8, 및 EL9 각각 안에 있으며, 0 또는 1 치환은 EL1, EL4, EL5, EL6, EL10, 및 EL11 각각 안에 있고, 단, 적어도 하나의 치환이 존재함을 조건으로 한다.

본 발명의 상기 추가 양상의 실시예에 따라, 6, 8, 또는 10 T 세포 에피토프는 중쇄 면역글로불린 가변 영역으로부터 제거되고/제거되거나 5, 9, 10, 또는 11 T 세포 에피토프는 본 발명의 상기 추가 양상의 항체의 경쇄 면역글로불린 가변 영역으로부터 제거된다.

보다 구체적으로, 6, 8, 또는 10 T 세포 에피토프는 중쇄 면역글로불린 가변 영역으로부터 제거되고, 5, 9, 10, 또는 11 T 세포 에피토프는 본 발명의 상기 추가 양상의 항체의 경쇄 면역글로불린 가변 영역으로부터 제거된다.

일 실시예에 따라, 모든 T 세포 에피토프는 면역글로불린 가변 영역으로부터 제거된다.

또한, 본 발명의 상기 추가 양상에 따라, 예시적인 치환 그룹은 면역글로불린 가변 영역에서 만들어졌고, 상기 그룹은 SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 및 10{도 12(b)~(e)에 도시}과 SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 및 20{도 13(b)~(e)에 도시}으로 이루어진다.

따라서, 본 발명의 상기 추가 양상의 바람직한 추가 실시예는 항인 CD4-항체로서, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 및 10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하고/포함하거나 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.

더 바람직하게, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 및 10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.

훨씬 더 바람직하게, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 4와 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 14와 동일한 서열을 포함하며, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 4와 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 20과 동일한 서열을 포함하며, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 6과 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 14와 동일한 서열을 포함하며, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 6과 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 16과 동일한 서열을 포함하며, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 6과 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 20과 동일한 서열을 포함하며, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 8과 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 16과 동일한 서열을 포함하며, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 8과 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 20과 동일한 서열을 포함하며, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 10과 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 14와 동일한 서열을 포함하며, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 10과 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 16과 동일한 서열을 포함하며, 또는, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 10과 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 20과 동일한 서열을 포함한다.

예 2로부터 이해될 수 있는 바와 같이, 이러한 특정한 가변 영역 서열 조합을 포함하는 항체는, 특히 CD4 항체에 대한 이들의 결합 친화도에 관해서 유리한 특징을 나타낸다.

특히 바람직하게, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 4와 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 14와 동일한 서열을 포함하며, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 6과 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 16과 동일한 서열을 포함하며, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 10과 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 16과 동일한 서열을 포함하며, 또는, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 10과 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 20과 동일한 서열을 포함한다.

본 명세서에 기재된 예 2c에 도시된 바와 같이, 이러한 실시예에 따른 항체는 인간 CD4에 대한 결합을 나타내고, 이러한 결합은 참조로 사용된 부모 단일클론 항 CD4-항체 30F16H5와 비교해서 향상되었다.

일반적으로, 앞에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 변형된 항체는 인간 CD4에 결합하는 능력을 나타낸다. 본 발명의 상기 추가 양상에 사용된 바와 같이, 항체는, 그 표적 항원 CD4에 대한 친화도가, 변형되지 않은 단일클론 항 CD4-항체에 의해 표시된 친화도의 적어도 5%, 더 바람직하게는 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 20%, 더 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 100%이면, 인간 CD4에 결합하는 그 능력을 "실질적으로 유지하는" 것으로 바람직하게 기재된다.

항체의 친화도를 측정하기 위한 여러 가지 방법이 당업자에게 잘 알려져 있다. 적절한 방법은, 본 명세서의 예 2c에 기술된 바와 같이 경쟁 ELISA를 통한 친화도의 측정, 또는 스캐챠드 분석(Scatchard analysis) 또는 비아코어(Biacore)(퍼킨 엘마) 또는 이와 유사한 기기를 사용하는 분석을 포함한다.

본 발명의 상기 추가 양상의 바람직한 실시예에서, 그 표적 항원 CD4에 대한 친화도는 부모 항-CD4 단일클론 항체에 의해 표시된 친화도보다 더 크거나 더 작은 자릿수 내에 있다.

예를 들어, CD4에 대한 본 발명의 상기 추가 양상의 항체의 결합 친화도는 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 항체의 결합 친화도보다 더 크거나 더 작은 한 자릿수 내에 있는 것이 바람직하다.

더 바람직하게, 결합 친화도는 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 항체의 결합 친화도보다 두 배 더 크거나 더 작다.

특히 바람직한 실시예에 따라, 항체는 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 항체보다 더 큰 결합 친화도를 갖는다.

바람직하게, 본 발명의 상기 추가 양상에 기재된 변형된 항체는 또한 부모 항인 CD4-항체의 적어도 하나, 가장 바람직하게는 모든 기능 활성을 유지한다. 따라서, 본 발명의 상기 추가 양상의 실시예는, 변형되지 않은 부모 항체의 치료 효능과 연관된 유리한 기술적 특징 중 하나 이상, 가장 바람직하게는, 모든 기술적 특징이 나타나는 반면, 항체는 MHC 클래스 II 분자와 결합하는 감소된 능력을 갖고/갖거나 환자에게서 더 약한 면역 반응을 유도하거나 면역 반응을 전혀 유도하지 않는, 변형된 항체를 포함한다.

바람직하게, 항인 CD4-항체 중쇄는 인간 IgG4 일정 영역부(region domain)를 포함하고, 경쇄는 인간 카파 일정 영역부를 더 포함한다. 따라서, 바람직한 다른 실시예에서, 본 발명의 상기 추가 양상의 항체의 중쇄 가변 영역은 인간의 IgG4 일정 영역부에 연결되고, 본 발명의 상기 추가 양상의 항체의 경쇄 가변 영역은 인간의 카파 일정 영역부에 연결된다. IgG4는 ADCC(항체 의존성 세포 매개 세포독성)와 CDC(보완 유도 세포사)와 같은 작동자 기능(effector function)을 자극하는 낮은 경향을 갖고, 이에 따라, 환자에게서 전염증성 반응(pro-inflammatory response)을 자극할 수 없다.

특정 실시예에서, 항인 CD4-항체는, SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 및 10으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 서열에 인접한 인간의 IgG4 일정 영역부와, SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 및 20으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 서열에 인접한 인간의 카파 일정 영역부를 더 포함한다.

상술한 바와 같이, 중쇄와 경쇄 가변 영역 각각에 대한 이러한 예시적인 서열은 바람직한 가변 영역 서열이다.

본 발명의 상기 추가 양상의 다른 일면에 따라, 본 발명의 상기 추가 양상의 항체는, 발현 벡터 pANTVhG4와 pANTVκ를 사용하여 얻어진다.

비제한적인 예로서, 본 발명의 상기 추가 양상의 항체는, 예 2에 설명된 바와 같이 발현 벡터 pANTVhG4와 pANTVκ를 사용하여 얻어질 수 있다. 게다가, 변형된 항체가 발현 벡터 pANTVhG4와 pANTVκ에 함유된 것과 같은 특정한 항체 서열을 기초로 구성되는, 당업자에게 잘 알려져 있는 임의의 다른 적절한 방법(들)이 사용될 수 있다.

다른 일면에서, 본 발명의 상기 추가 양상은, 다음 단계를 포함하는 본 발명의 상기 추가 양상의 항인 CD4-항체를 제조하는 방법에 관한 것이다:

(i) 혼성 세포주 ECACC 88050502 또는 그 부분으로부터 유도될 수 있는 항체의 아미노산 서열을 제공하는 단계와,

(ii) 생체외 또는 인 실리코 기술 또는 생물학적 분석을 사용하여 MHC 분자에 대한 펩티드의 결합을 결정하는 단계를 포함하는 임의의 방법에 의해 항체 또는 그 일부의 아미노산 서열 내에서 하나 이상의 T 세포 에피토프를 식별하는 단계와,

(iii) 생체외 또는 인 실리코 기술 또는 생물학적 분석으로 측정된 MHC 분자에 대한 펩티드의 결합을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 변형된 식별된 T 세포 에피토프 내에서 하나 이상의 아미노산을 갖는 새로운 서열 변종(variant)을 설계하는 단계와,

(iv) 이러한 서열 변종을 재조합 DNA 기술에 의해 구성하고 본 발명의 상기 추가 양상의 항인 CD4-항체의 특성을 갖는 하나 이상의 서열 변종을 식별하기 위해 상기 서열 변종을 시험하는 단계.

단계 (ii)에 따른 T 세포 에피토프의 식별은 이 기술 분야에서 이전에 기술된 방법에 따라 실행될 수 있다. 적절한 방법은, 예를 들어, WO 98/59244; WO 00/34317; 미국 출원 제 20030153043호에 기재되어 있고, 이들은 모두 본 명세서에 참조로 포함된다. 상술한 방법에서, 서열 변종은, 이러한 새로운 T 세포 에피토프가, 다시, MHC 클래스 II 분자에 대한 펩티드의 결합을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 변형되지 않으면, 서열 변종에 의한 새로운 T 세포 에피토프의 생성을 방지하는 방식으로 생성되는 것이 바람직하다. 실제, 단백질 서열에 대한 변화 수행시, 임의의 적절한 수단에 의해 에피토프 및/또는 MHC 클래스 II 리간드의 존재를 위한 고려된 서열을 재시험하여, 고려된 변화가 새로운 면역 에피토프를 도입하는 것이 방지되는 것이 바람직하다.

여러 실시예에서, 본 발명의 상기 추가 양상의 변형된 항체는 본 발명의 상기 추가 양상에 명시된 VH와 VL 유전자의 서로 다른 조합의 발현으로 생성된다. 중쇄와 경쇄의 이러한 모든 조합은 본 발명의 상기 추가 양상에 의해 포함된다.

일반적으로, 완전 항체 분자의 구성은 이 기술 분야에 잘 알려져 있는 항체 분자를 정제하고 다루기 위한 재조합 DNA 기술과 방법에 의해 이루어질 수 있다. 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려진 규격 문헌에 완전하게 설명되어 있다.

본 발명의 이러한 상기 추가 양상의 바람직한 분자는 임의의 여러 가지 방법으로 제조될 수 있지만 가장 바람직하게는 일반적인 재조합 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 항체 V-영역 중 임의의 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA)를 추론하기 위해 본 발명의 상기 추가 양상에 제공된 단백질 서열과 정보를 사용하는 것은 비교적 용이한 절차이다. 이는, 예를 들어, DNAstar 소프트웨어 묶음[DNAstar 인코포레이티드, 매디슨, 위스콘신, 미국] 또는 이와 유산한 것과 같은 컴퓨터 소프트웨어 도구를 사용하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드 또는 이에 상당하는 것을 암호화하는 능력을 갖춘 임의의 이러한 DNA 서열은, 본 발명의 이러한 상기 추가 양상의 실시예로 간주되어야 한다.

일반적인 계획으로, 임의의 VH 또는 VL 사슬 유전자는 유전자 합성을 사용하여 제조되고 적절한 발현 벡터로 클론될 수 있다. 다시, 발현 벡터는 숙주 세포와 선택된 세포에 도입되고 배양된다. 항체 분자는 배지로부터 쉽게 정제되고 치료 투여에 적합한 조제물(preparation)로 제조된다.

비제한적인 예를 통해, 이러한 한 가지 계획은, 합성 올리고뉴클레오티드의 패널을 사용하는 유전자 합성 공정을 수반한다. 유전자는 리가아제 사슬 반응(ligase chain reaction)(LCR)을 이용하여 조립되고, 여기서, 상보적 말단을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드가 어닐(anneal)된 다음, 폴리메라아제 사슬 반응(PCR)을 이용하여 증폭과 필-인(fill-in)이 일어난다. PCR은 증가된 농도의 플랭킹 올리고뉴클레오티드(flanking oligonucleotide)의 첨가에 의해 프라이머로 작용하도록 가동된다. PCR 생성물은, 5'와 3' 면역글로불린 유전자 플랭킹 영역(flanking region)을 함유하는 벡터로부터 추가 PCR에 의해 전체 길이의 항체 유전자로 조립되고, 완전한 항체의 발현을 위해 발현 벡터로 서브 클로닝된다. 조립된 VH와 VL 유전자는 돌연변이 유발(mutagenesis) 및 본 발명의 상기 추가 양상에 기재된 것 중 임의의 것과 같은 다중 변종 항체 서열의 구성을 위한 템플릿(template)으로 작용할 수 있다. 다른 방법론과 시스템이 쉽게 적용될 수 있지만, Higuchi 등(1998)에 의해 설명된 바와 같이 "중첩 연장 PCR"의 전략을 사용하는 것이 특히 편리하다.

가변 영역 카세트를 함유하는 전체 길이의 면역글로불린 유전자는 중첩하는 PCR을 사용하여 가장 편리하게 조립되고 원하는 면역글로불린 일정 영역부(region domain)를 함유하는 발현 벡터로 서브 클론된다. 발현 벡터는, 예를 들어, 전기 천공법(electroporation) 기술을 사용하여 포유류 또는 이와 다른 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다. NS0 세포주는, 유럽 동물 세포 배양물 기탁기관(ECACC)으로부터 얻어진 비-면역글로불린 생성 쥐 골수종이고, 이 절차를 위해 특히 적합한 예의 숙주 세포주이다. 항체를 분비하는 세포주는 확장되고 항체는, 예를 들어, 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 쉽게 정제될 수 있다{Harlow E & Lane D (2006)}. 정제된 항체의 농도는, 해당 항체의 인간 카파 일정 영역을 검출하는 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)을 이용하여 결정될 수 있다.

본 발명의 상기 추가 양상이 변형된 항-CD4 항체와 관련이 있는 한, 이러한 변형된 항체 또는 변형된 항체의 단편을 함유하는 조성물 및 관련 조성물은 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

따라서, 본 발명의 상기 추가 양상은 또한 본 발명의 상기 추가 양상의 항인 CD4-항체와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상기 추가 양상의 항인 CD4-항체의 치료 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 사용될 수 있다. 부형제, 담체, 보조제(adjuvant), 및 완충제(buffer)를 포함하는, 약에 관례상 사용되는 물질을 포함하는, 본 발명의 상기 추가 양상에 따른 약제 조성물이 종래 방법으로 제조된다. 상기 조성물은, 예를 들어, 비경구적으로, 경구적으로, 근육 내에서, 피하적으로, 정맥 안으로, 또는 효과를 얻는데 유용한 다른 경로를 통해 투여될 수 있다. 종래의 부형제는, 비경구, 경구, 및 약제와 해롭게 반응하지 않는 다른 투여 경로에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 담체 물질을 포함한다. 비경구적 투여를 위해서는, 주사 가능한 멸균 용액, 바람직하게는 오일 또는 수용액뿐만 아니라, 현탁액, 에멀션, 또는 좌약을 포함한 임플란트가 특히 적합하다. 앰플은 편리한 단위 투약이다. 약제 조제물은 멸균될 수 있고, 원하면, 안정화제, 습윤제, 에멀션화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 또는 활성 화합물과 해롭게 반응하지 않는 다른 물질과 혼합될 수 있다.

본 발명의 상기 추가 양상에 기재된 변형된 항체는, 다발성 경화증, 류머티스성 관절염, 전신성 혈관염, 포도막염, 염증성 장 질환, 및 경피증을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 특히 자가면역 질환을 포함하는 인간의 많은 중요 질병과, 또한 이식에 사용하는데 유용하다. 그래서, 본 발명의 상기 추가 양상의 항체는 치료법에 사용될 수 있다. 비제한적인 예는, 본 발명의 상기 추가 양상에 따라 유효량의 변형된 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 자가면역 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 여러 실시예에서, 자가면역 질환은, 다발성 경화증, 류머티스성 관절염, 전신성 혈관염, 포도막염, 염증성 장 질환, 또는 경피증이다. 다른 예는, 본 발명의 상기 추가 양상에 따라 유효량의 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 기관의 이식 전 또는 이식 후에 환자를 면역억제하는 방법이다. 일 실시예에서, 이식용 기관은 신장 이식이다. 본 발명의 상기 추가 양상은 또한 변형된 항체 조성물을 사용하여 인간을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 개인에게 투여하기 위해, 임의의 변형된 항체 조성물은 적어도 80%의 순수하고 발열물질(pyrogen)과 기타 오염물질을 함유하지 않도록 제조되는 것이 바람직할 것이다.

따라서, 한 가지 추가 일면에서, 본 발명의 상기 추가 양상은, 피실험자, 바람직하게는 환자에게 항체를 투여하는 단계를 포함하는 치료법의 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 방법은, 자가면역 질환, 특히, 다발성 경화증, 류머티스성 관절염, 전신성 혈관염, 포도막염, 염증성 장 질환, 및 경피증으로부터 선택되는 자가면역 질환을 치료하기 위한 것이다. 다른 바람직한 실시예에 따라, 상기 방법은, 기관, 특히 신장의 이식 전 또는 이식 후에 환자를 면역억제하기 위한 것이다. 환자는 인간인 것이 바람직하다. 유효량의 항체가 투여되는 것이 바람직하다.

관련된 일면에서, 본 발명의 상기 추가 양상은, 환자를 치료법으로 치료하기 위한 약물 제조를 위해 본 발명의 상기 추가 양상의 항인 CD4-항체를 사용하는 것에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 약물은, 자가면역 질환, 특히, 다발성 경화증, 류머티스성 관절염, 전신성 혈관염, 포도막염, 염증성 장 질환, 및 경피증으로부터 선택되는 자가면역 질환을 치료하기 위한 것이다. 다른 바람직한 실시예에 따라, 약물은 기관, 특히, 신장의 이식 전 또는 이식 후에 환자를 면역억제하기 위한 것이다. 환자는 인간인 것이 바람직하다.

다른 관련된 일면에서, 본 발명의 상기 추가 양상은, 치료법의 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 상기 추가 양상의 항체에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 방법은, 자가면역 질환, 특히, 다발성 경화증, 류머티스성 관절염, 전신성 혈관염, 포도막염, 염증성 장 질환, 및 경피증으로부터 선택되는 자가면역 질환을 치료하기 위한 것이다. 다른 바람직한 실시예에 따라, 방법은, 기관, 특히, 신장의 이식 전 또는 이식 후에 환자를 면역억제하기 위한 것이다. 환자는 인간인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 추가 양상의 치료 방법과 의학 용도에서, 사용된 본 발명의 상기 추가 양상의 항-CD4 항체의 실제 투약(dosage)은, 치료 중인 질환의 유형과 심각도를 포함하는 다양한 인자와, 선택된 다른 치료 양식(modality) 또는 양식들에 의존할 것이다. 투약 식이요법(dosage regimen)을 위한 안내는 이 기술 분야에 알려져 있는 인간화 항-CD4의 투약으로부터 얻어진다.

또 다른 일면에서, 본 발명의 상기 추가 양상은, 본 발명의 상기 추가 양상의 항인 CD4-항체의 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 핵산은 SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 13, 15, 17, 및 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 상기 추가 양상의 부분은, 본 발명의 상기 추가 양상의 항인 CD4-항체의 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 핵산에 관한 것으로, 이는 유전 암호(genetic code)의 퇴보(degeneracy) 때문에 SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 13, 15, 17, 및 19와 다르다.

폴리뉴클레오티드에 대한 퇴보는, 유전 암호에서 많은 아미노산이 하나 이상의 코돈(codon)으로 명시된다는, 이 기술 분야에서 잘 인지된 사실을 가리킨다. 암호(code)의 퇴보는, 네 개의 서로 다른 염기의 64개의 가능한 삼중 서열로 암호화된 20개의 서로 다른 아미노산을 설명한다.

다른 일면에서, 본 발명의 상기 추가 양상은 상술한 바와 같이 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 핵산은 발현 제어 서열에 작용 가능하게 연결되는 것이 바람직하다.

일부 실시예에서, 발현 벡터는, 발현 제어 서열에 작용 가능하게 연결된, 감소된 수의 T 세포 에피토프를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 12의 변형된 치환 변종을 포함하는 V-영역 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 여러 실시예에서, 발현 벡터는, 도 11에 도시된 바와 같이 pANTVhG4 벡터(VH에 대해)와 pANTVκ(VL에 대해)를 포함하거나, 상기 벡터로부터 유도된다.

다른 일면에서, 본 발명의 상기 추가 양상은 상술한 핵산 및/또는 상술한 적어도 하나의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 상술한 바와 같이 핵산을 각각 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 숙주 세포는 상술한 바와 같이 각각 핵산을 포함하는 두 개의 벡터를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 추가 양상은 또한, 적절한 발현 제어 서열(들)의 제어 하에 발현을 허용하는 조건에서 상술한 숙주 세포를 배양하는 단계와, 세포의 배지로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명의 상기 추가 양상의 항인 CD4-항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

다음 항목 1 내지 33에는, 본 발명의 상기 추가 양상의 특정 실시예가 기술된다:

1. 중쇄 면역글로불린 가변 영역(VH)과 경쇄 면역글로불린 가변 영역(VL)을 포함하는 항인 CD4-항체에 있어서,

상기 면역글로불린 가변 영역의 CDRs 밖에 위치한 적어도 하나의 T 세포 에피토프는, 상기 면역글로불린 가변 영역으로부터 제거되는, 항인 CD4-항체.

2. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인, 항인 CD4-항체.

3. 제 2항에 있어서, 상기 항체는 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 상기 단일클론 항체로부터 유도되는, 항인 CD4-항체.

4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 상기 항체의 CDRs를 갖거나, 상기 항체는 SEQ ID NO: 2와 SEQ ID NO: 12의 CDRs를 갖는, 항인 CD4-항체.

5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 가변 영역으로부터 하나 이상의 T 세포 에피토프의 제거로 인한 차이를 제외하고,

상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역은, 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 상기 항체의 상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역과 동일하거나, SEQ ID NO: 2와 동일한 서열을 포함하고,

상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역은, 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 상기 항체의 상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역과 동일하거나, SEQ ID NO: 12와 동일한 서열을 포함하는, 항인 CD4-항체.

6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 T 세포 에피토프는,

EQ ID NO: 2의 위치 4 내지 12 (EH1), SEQ ID NO: 2의 위치 10 내지 18 (EH2), SEQ ID NO: 2의 위치 11 내지 19 (EH3), SEQ ID NO: 2의 위치 20 내지 28 (EH4), SEQ ID NO: 2의 위치 37 내지 45 (EH5), SEQ ID NO: 2의 위치 70 내지 78 (EH6), SEQ ID NO: 2의 위치 73 내지 81 (EH7), SEQ ID NO: 2의 위치 83 내지 91 (EH8), SEQ ID NO: 2의 위치 107 내지 115 (EH9), SEQ ID NO: 2의 위치 110 내지 118 (EH10)에서 중쇄 면역글로불린 가변 영역의 T 세포 에피토프와,

SEQ ID NO: 12의 위치 2 내지 10 (EL1), SEQ ID NO: 12의 위치 3 내지 11 (EL2), SEQ ID NO: 12의 위치 10 내지 18 (EL3), SEQ ID NO: 12의 위치 11 내지 19 (EL4), SEQ ID NO: 12의 위치 45 내지 53 (EL5), SEQ ID NO: 12의 위치 53 내지 61 (EL6), SEQ ID NO: 12의 위치 59 내지 67 (EL7), SEQ ID NO: 12의 위치 61 내지 69 (EL8), SEQ ID NO: 12의 위치 62 내지 70 (EL9), SEQ ID NO: 12의 위치 70 내지 78 (EL10), 및 SEQ ID NO: 12의 위치 97 내지 105 (EL11)에서 경쇄 면역글로불린 가변 영역의 T 세포 에피토프로

이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항인 CD4-항체.

7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 제거하기 위해 상기 적어도 하나의 T 세포 에피토프 내에서 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는, 항인 CD4-항체.

8. 제 7항에 있어서, 상기 치환은, SEQ ID NO:　2에서 T9S, V10E, A12K, Q19K, S28T, K38R, R40A, L70I, A72R, V73D, S91T, T115L, L116V, 및

SEQ ID NO: 12에서 I10T, M11L, L46A, V59S, I62S, S69D, R76S, L105I로

이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항인 CD4-항체.

9. 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

0, 1, 2, 또는 3 치환은 EH1과 EH6 각각 안에 있고,

0, 1 또는 2 치환은 EH12, EH5, 및 EH10 각각 안에 있으며,

0 또는 1 치환은 EH3, EH4, EH7, EH8, 및 EH9 각각 안에 있고,

0, 1 또는 2 치환은 EL2, EL3, EL7, EL8, 및 EL9 각각 안에 있으며,

0 또는 1 치환은 EL1, EL4, EL5, EL6, EL10, 및 EL11 각각 안에 있고,

단, 적어도 하나의 치환이 존재함을 조건으로 하는, 항인 CD4-항체.

10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,

6, 8, 또는 10 T 세포 에피토프는 상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역으로부터 제거되고/제거되거나

*5, 9, 10, 또는 11 세포 에피토프는 상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역으로부터 제거되는, 항인 CD4-항체.

11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역은, SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 및 10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하고/포함하거나

상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역은, SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 항인 CD4-항체.

12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서,

상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 4와 동일한 서열을 포함하고, 상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 14와 동일한 서열을 포함하거나,

상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 4와 동일한 서열을 포함하고, 상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 20과 동일한 서열을 포함하거나,

상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 6과 동일한 서열을 포함하고, 상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 14와 동일한 서열을 포함하거나,

상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 6과 동일한 서열을 포함하고, 상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 16과 동일한 서열을 포함하거나,

상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 6과 동일한 서열을 포함하고, 상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 20과 동일한 서열을 포함하거나,

상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 8과 동일한 서열을 포함하고, 상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 16과 동일한 서열을 포함하거나,

상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 8과 동일한 서열을 포함하고, 상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 20과 동일한 서열을 포함하거나,

상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 10과 동일한 서열을 포함하고, 상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 14와 동일한 서열을 포함하거나,

상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 10과 동일한 서열을 포함하고, 상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 16과 동일한 서열을 포함하거나, 또는

상기 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 10과 동일한 서열을 포함하고, 상기 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 SEQ ID NO: 20과 동일한 서열을 포함하는, 항인 CD4-항체.

13. 제 12항에 있어서,

14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, CD4에 대한 상기 항체의 결합 친화도는 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 상기 항체의 결합 친화도보다 더 크거나 더 작은 한 자릿수 내에 있는, 항인 CD4-항체.

15. 제 14항에 있어서, CD4에 대한 상기 항체의 결합 친화도는 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 항체의 결합 친화도보다 두 배 이내에서 더 크거나 더 작은, 항인 CD4-항체.

16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 상기 항체는 혼성 세포주 ECACC 88050502에 의해 생성된 항체보다 CD4에 더 큰 결합 친화도를 갖는, 항인 CD4-항체.

17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,

(a) 상기 항체는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 감소된 능력을 갖고,

(b) 상기 항체는 환자에게서 더 약한 면역 반응을 유도하며,

(c) 단백질은 전체 길이의 항체이고,

(d) 상기 항체는 키메릭 항체(chimeric antibody)이며/이거나,

(e) 치환(들)은 부모 분자의 가장 면역성이 큰 영역 내에 있다.

18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 인간의 IgG4 일정 영역부(constant region domain)에 연결되고, 상기 경쇄 가변 영역은 인간의 카파 일정 영역부에 연결되는, 항인 CD4-항체.

19. 제 18항에 있어서, 상기 항체는 발현 벡터 pANTVhG4와 pANTVκ를 사용하여 얻어지는, 항인 CD4-항체.

20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 항체를 제조하는 방법에 있어서,

(iv) 이러한 서열 변종을 재조합 DNA 기술에 의해 구성하고 항목 1 내지 20 중 어느 한 항목의 항체의 특성을 갖는 하나 이상의 서열 변종을 식별하기 위해 상기 서열 변종을 시험하는 단계를

포함하는, 항체 제조 방법.

21. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 항체와, 약제학적으로 허용 가능한 담체(carrier)를 포함하는, 약제 조성물.

22. 환자를 치료법으로 치료하기 위한 약물의 제조를 위해 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 항체를 사용하는 방법.

23. 제 22항에 있어서, 상기 약물은 자가면역 질환, 특히, 다발성 경화증, 류머티스성 관절염, 전신성 혈관염, 포도막염, 염증성 장 질환, 및 경피증으로부터 선택되는 자가면역 질환을 치료하기 위한 것이거나, 상기 약물은 기관, 특히, 신장의 이식 전 또는 이식 후에 환자를 면역억제하기 위한 것인, 항체 사용 방법.

24. 치료법(therapeutic treatment)의 방법에 사용하기 위한, 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 항체.

25. 제 24항에 있어서, 상기 약물은 자가면역 질환, 특히, 다발성 경화증, 류머티스성 관절염, 전신성 혈관염, 포도막염, 염증성 장 질환, 및 경피증으로부터 선택되는 자가면역 질환을 치료하기 위한 것이거나, 상기 약물은 기관, 특히, 신장의 이식 전 또는 이식 후에 환자를 면역억제하기 위한 것인, 항체.

26. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 인간인, 항체 사용 방법 또는 항체.

27. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 핵산.

28. 제 27항에 있어서, SEQ ID NOs 3, 5, 7, 9, 13, 15, 17, 및 19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 핵산.

29. 제 27항 또는 제 28항의 핵산을 포함하는 벡터(vector).

30. 제 29항에 있어서, 상기 핵산은 발현 제어 서열에 작용 가능하게 연결되는, 벡터.

31. 상기 항목 중 어느 한 항목의 항체에 있어서, 상기 항체는,

i) 항체 16H5.chimIgG4,

ii) 2011년 12월 2일 DSZM에 기탁된 세포주 CD4.16H5.chimIgG4로부터 얻어질 수 있는 항체인, 항체.

32. 제 27항 또는 제 28항의 핵산 및/또는 제 29항 내지 제 31항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 벡터를 포함하는 숙주 세포.

33. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 항체를 제조하는 방법에 있어서,

적절한 발현 제어 서열(들)의 제어 하에 발현을 허용하는 조건에서 제 32항의 숙주 세포를 배양하는 단계와,

세포의 배지로부터 상기 항체를 정제하는 단계를

포함하는, 항체 제조 방법.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 실시예의 대안 실시예에 관한 것으로, "ECACC 88050502"라는 용어는 "MAX.16H5/30F16H5"로 대체된다. 이와 마찬가지로, 본 발명은 또한 실시예에 관한 것으로, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "세포주 ECACC 88050502"라는 용어, 또는 이에 상당하는 용어는, "세포주 MAX.16H5/30F16H5" 또는 이에 상당하는 용어로 대체된다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 실시예의 대안 실시예에 관한 것으로, "ECACC 88050502"라는 용어는 "CD4.16H5.chimIgG4"로 대체된다. 이와 마찬가지로, 본 발명은 또한 실시예에 관한 것으로, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "세포주 ECACC 88050502"라는 용어, 또는 이에 상당하는 용어는, "세포주 CD4.16H5.chimIgG4" 또는 이에 상당하는 용어로 대체된다.

다음에서, 본 발명은, 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않은 도면과 예를 통해 예시된다.

예

예 1:

동물

공여체(donor) C57Bl/6 CD4k/o 쥐, C57Bl/6 야생형 쥐, 및 수용체(recipient) Balb/c 야생형 쥐는 라이프치히(Leipzig) 대학의 동물 시설에서 번식되었다. 쥐의 스트레인(mice strain)은 표준 조건에서 유지되었다. C57Bl/6 CD4k/o 쥐는, 쥐과의 CD4 분자가 녹아웃되고 인간의 CD4를 발현하는, 안정적인 C57Bl/6 백그라운드(background)를 갖는다. CD4 이식 유전자(transgene)는 쥣과의 CD4 개선제 요소에 묶인 그 자체의 촉진제를 포함하여, T 세포 서브세트 특정 발현을 일어나게 한다. CD8+ 세포는 TTG 쥐에서 영향을 받지 않는다. 또한, 이러한 쥐는 쥣과의 MHC II 착물 외에 HLA-DR3 분자를 발현한다. TTG 쥐는 CD4와 HLA-DR에 관해서 변형된 완전한 기능성 쥣과 면역 체계를 갖는다. 쥐는 임의로 공급되었다. 공여체로서, C57Bl/6과 Balb/c 쥐는 찰스 리버(독일, 술츠펠트; http://jaxmice.jax.org)로부터 구입되었다.

모든 쥐는, 라이프치히 동물 보호 위원회 대학과 라이프치히의 동물 보호 지역 위원회의 가이드라인에 따라 길러지거나, 처리되거나, 다루어졌다 (동물 실험 등록 번호 28/08).

통계 분석

*모든 데이터는 평균 ± SD로 제공된다. 통계 분석과 그래픽 프리젠테이션은 시그마플롯 10.0/시그마스탯 3.5 소프트웨어(SYSTAT, 에어크라트, 독일)를 사용하여 이루어졌다.

조사 프로토콜

쥐의 조사(irradiation)를 위해, 동물 조사를 위한 X-선 장치(D3225, 상용 전압, 걸메이 메디컬, 캠벌리, 영국)가 조절되었다. 다섯 마리의 동물이 이들의 중량에 따라 플렉시 글라스 용기(plexiglass container)(0.5 ㎝ × 64.0 ㎝에 대해 다섯 개의 공간으로 분할된)에서 평행하게 조사되었다. 평균 조사량은 8.5 Gy였다.

골수 세포와 비장 세포의 준비

골수 세포(BMCs)는 멸균 조건 하에 C57Bl/6 CD4k/o 쥐 또는 C57Bl/6 야생형 쥐의 경골(tibiae)과 대퇴골(femora)에서 신선하게 얻어졌다. 따라서, 뼈와 말단 및 인접 단부로부터 조심스럽게 준비된 근육 조직과 힘줄은 제거되었다. 세침(thin needle)(0.4×19㎜)을 이용하여, 골수 세포는 멸균 PBS로 헹구어지고 50㎖ 관에 수거되었다. 바늘을 통한 조심스러운 재현탁(resuspension)에 의해 단일 세포 현탁이 이루어졌다. 이어서, 세포는 10분 동안 300 x g에서 PBS(1×)에 한번 세척되고 PBS(1×)에 다시 재현탁되어, 카운팅 챔버 및 Tuerk 염색 용액을 이용한 염색을 사용하여 세포 수를 결정하였다. 이 다음으로, 골수 세포는 10분 동안 300 x g에서 PBS(1×)에 한번 더 세척되고, 세포 펠릿(cell pellet)은 FCS가 없는 둘베코의 변형된 이글(Eagle)의 최소 필수 배지{DMEM; 페르비오(Perbio), 본, 독일}에 재현탁되었다. C57Bl/6 CD4k/o 쥐 또는 C57Bl/6 야생형 쥐로부터 단일 세포 비장 세포 현탁액의 생성을 위해, 비장은 쥐가 죽은 후 멸균 조건에서 즉시 제거되고, 세포 스트레이너(cell strainer)(100 ㎛)를 통해 압박되며, PBS(1×)의 50㎖ 관에 수거되었다. 단일 세포 현탁액은 10분 동안 300 x g에서 PBS(1×)에 두 번 세척되었다. 이어서, 적혈구(erythrocyte)는 멸균 PBS에 0.155 몰의 NH₄Cl, 0.01 몰의 KHCO₃, 및 0.01 몰의 EDTA-Na(pH 7.3)를 함유하는 용해 완충액(lysis buffer)에 용해되었다. 세포는 다시 세척되고, FCS 없는 DMEM 배지에 재현탁되었으며, 세포 수가 결정되었다. 골수 세포와 비장 세포는 항체 배양 전에 원하는 세포 수로 조절되었다.

당업자에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 본 발명의 예에서 비장 세포의 사용은 조작 상의 원인으로 일어나는데, 비장 세포의 추가 첨가는, 특히 인간 피실험자가 관련되어 있으면, 본 발명에 따라 실제로 요구되지 않는다.

항체 배양

항체 배양을 위해, 필요한 양의 Max16H5 항체는 사용하기 바로 전에 1 ㎎/㎖ {DMEM(FCS 없는)}의 최종 농도로 용해되었다. 이어서, C57Bl/6 CD4k/o 또는 C57Bl/6 야생형 쥐로부터 얻어진 1.4×10⁸개의 골수 세포와 1.4×10⁸개의 비장 세포는, 어둠 속에서 실온에서 1시간 동안 FCS가 없는 15㎖ DMEM의 800㎍의 Max16H5로 배양되었다. 대조군으로, 항체 처리를 하지 않은 C57Bl/6 CD4k/o 쥐 또는 C57Bl/6 야생형 쥐의 골수 세포와 비장 세포는 동일 조건 하에 FCS가 없는 DMEM에서 또한 배양되었다. 1시간 배양 후, 세포는 10분 동안 300 x g에서 세포를 펠릿화하도록 원심분리되고, 10분 동안 300 x g에서 PBS(1×)에 한번 세척되어 결합되지 않은 항체를 제거한다.

세포 이식

공동 이식(co-transplantation) 실험을 위해, Max16H5로 처리된 CD4k/o 쥐의 2×10⁷개의 골수 세포는, Max16H5로 처리된 CD4k/o 쥐의 2×10⁷개의 비장 세포에 첨가되었다. 세포 농도는 150㎕ 멸균 0.9% NaCl의 최종 부피로 조절되었다. 이와 동일한 것이, Max16H5로 또한 처리된 C57Bl/6 야생형 쥐의 골수 세포와 비장 세포에 대해서도 수행되었다. 대조군으로, CD4k/o 쥐의 2×10⁷개의 처리되지 않은 골수 세포가 CD4k/o 쥐의 2×10⁷개의 처리되지 않은 비장 세포에 첨가되거나, C57Bl/6 야생형 쥐의 2×10⁷개의 골수 세포가 C57Bl/6 야생형 쥐의 2×10⁷개의 비장 세포에 첨가되었다. 이어서, 이식편은, 치사량으로 조사된 수용체 Balb/c 야생형 쥐의 측면 꼬리 정맥으로의 정맥내 주사로 동종 이형 이식되었다. Cooke 등(1996)에 따른 생존, GvHD 증상과, 중량이 이식 후 매일 평가되었다.

유동 세포 계수법

이식 전과 이식 후에, 수용체 Balb/c 야생형 쥐는 유동 세포 계수법으로 분석되었다.

공여체 CD4k/o 쥐의 비장 세포와 골수 세포의 특징화

세포 계수 분석을 위해, 세포는 2.5㎕의 컨쥬게이트 단일클론성 항체로 배양되었다 (쥣과 CD3-FITC, 인간 CD4-APC [모두 베크만 콜터, 크레펠트, 독일]; 쥣과 CD8-PerCP, MHC-I (H-2D[b])-PE, 쥣과 CD4-PECy7, 쥣과 CD19-APCCy [BD 바이오싸이언스, 하이델베르크, 독일]). 20분 배양 후, PBS/1% FBS에서 두 번의 세척 단계가 이어졌다 (1250 rpm, 5분, 실온[RT]). 마지막으로, 펠릿은 200㎕의 PBS로 재현탁되었다. 추가로, 비장 세포와 골수 세포의 생존 능력(viability)은 7-아미노-악티노마이신 D(7AAD)으로 염색하여 이식 전에 시험되었다. 1×10⁶개의 세포는 실온에서 30분 동안 300㎕의 PBS에 용해된 5㎕(0.25㎍/시험)의 7AAD로 배양되고 즉시 측정되었다. 데이터는 BD FACSCantoIITM 유동 세포 계산기(Flow Cytometer) 상에서 얻어졌고, BD FACSDIVA^TM 소프트웨어를 사용하여 분석되었다(모두 BD 바이오싸이언스, 하이델베르크, 독일).

수용체 Balb/c 야생형 쥐의 유동 세포 계수법과 혈액학

이식 절차 전과 이식 절차 후, 수용체 쥐는 유동 세포 계수법을 통해 분석되었다. 특정한 시간 지점에서, 에테르 마취 하에 각 쥐의 눈확 정맥(retro orbital vein)으로부터 혈액(150㎕)이 채취되었다. 혈액은 헤파린화 모세관(heparinized capillaries)을 통해 모아졌다(그라이너 바이오케미카, 플라흐트, 독일). 헤모글로빈 농도는 애니멀 블러드 카운터(SCIL, 비에른하임, 독일)를 사용하여 측정되었고, 이는 혈액 채취 후 2시간 이내에 쥐의 혈액에 대하여 캘리브레이트(calibrate)되었다. 세포 계수 분석을 위해, 100㎕의 혈액 세포는, 샘플에 따라 2.5㎕의 컨쥬게이트 단일클론성 항체로 배양되었다 (쥣과 CD4- PECy7, MHC-I (H-2D[b])-PE, MHC-I (H-2K[d])-FITC, 쥣과 CD8-PerCP, 쥣과 CD19-APCCy7 [BD 바이오싸이언스, 하이델베르크, 독일]; 쥣과 CD3-FITC, 인간의 CD4-APC [베크만 쿨터, 크레펠트, 독일]; 인간의 HLA-DR3-FITC [면역도구, 프리소이테, 독일]. 20분의 배양 후, 제조업자의 지시에 따라 적혈구 용해(erythrocyte lysing)가 이어졌다 (BD FACS 용해 용액 [BD 바이오싸이언스, 하이델베르크, 독일]). PBS/1% FBS를 첨가하여 샘플은 두 번 세척되었다 (1250 rpm, 5분, 실온[RT]). 마지막으로, 펠릿은 200㎕의 PBS로 재현탁되었다. 조절 T 세포를 감지하기 위한 쥣과 FoxP3의 세포 계수 분석을 위해, 쥣과 T_reg 검출 킷 (밀텐이 바이오텍 게엠베하, 베르기슈 글라드바흐, 독일)이 사용되었다. 1×10⁶개 세포가 90㎕ MACS 완충액(0.5% FCS, PBS에서 2mM EDTA, [밀텐이 바이오텍 게엠베하, 베르기슈 글라드바흐, 독일])에서 재현탁되고, 세포 표면 표지는 10㎕ CD4-FITC 및 CD25-PE 항체로 염색되었다 (밀텐이 바이오텍 게엠베하, 베르기슈 글라드바흐, 독일). 4℃에서 10분 동안 어둠 속에서 배양 후 세포는 2㎖ MACS 완충액으로 세척되고 4℃에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리되었다. 상청액을 제거한 후 1×10⁶개 세포는 1㎖의 새로 제조된 고정(fixation)/투과화(permeabilization) 용액(포름알데히드 함유)에서 4℃에서 30분 동안 배양에 의해 투과화되었다. 세포는 2㎖ 냉 MACS 완충액에 세척되고 4℃에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리되었다. 세포간 FoxP3 염색을 위해 상청액 제거 후 투과화 단계가 이어졌다. 1×10⁶개 세포는 2㎖ 냉 투과화 완충액에 세척되고 4℃에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리되었다. 세포 펠릿은 80㎕의 냉 투과화 완충액에서 재현탁되고 4℃에서 5분 동안 배양되었다. 이어서, 10㎕의 항-FoxP3-APC(밀텐이 바이오텍, 베르기슈 글라드바흐, 독일) 항체가 첨가되고, 조심스럽게 혼합되고 4℃에서 30분 동안 배양되었다. 세포는 2㎖의 냉 투과화 완충액으로 세척되고 4℃에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리되었으며, 상청액이 제거되고 세포는 100㎕ MACS 완충액에서 재현탁되었다. 데이터는 BD FACSCantoIITM 유동 세포 계산기(Flow Cytometer) 상에서 얻어졌고, BD FACSDIVA^TM 소프트웨어를 사용하여 분석되었다(모두 BD 바이오싸이언스, 하이델베르크, 독일).

면역 조직학(immunohistology)

쥐의 기관은, 스테인리스강 비이커(2-메틸부탄 함유; 칼 로쓰, 칼스루헤, 독일)에 담기고, 15분 동안 액체 질소에 잠기고, 절단을 위해 준비될 때까지 -80℃에서 저장되었다. 절단은 저온 유지장치(cryostat)(라이카 바이오시스템즈, 누스로흐, 독일)를 사용하여 수행되고, 물체(object)는 수퍼프로스트 슬라이드(써모 싸이언티픽, 브라운슈바이그, 독일)로 운반되고 면역 조직학적 분석까지 -80℃에서 즉시 저장되었다. 상기 물체 슬라이드는 습식 챔버에서 10분 동안 PBS에 용해된, 0.3% w/v H₂O₂로 배양된 다음, PBS로 세 번 세척되었다. 기관은 실온(RT)에서 60분 동안 PBS에서 10% w/v FBS로 처리되고, PBS로 즉시 세척되며, 10분 동안 아비딘 용액(avidin solution)(다코 노쓰 어메리카, 카핀데리아, 미국)으로 배양되고, PBS로 세척되었다. 제조물은 비오틴 용액(biotin solution)(다코 노쓰 어메리카)으로 10분 동안 배양되고, PBS로 세척되며, 일차 항체 항인 CD4 항체(미국, 바이오로지컬, 매사추세츠, 미국) 또는 1:100으로 희석된, 아이소타입 대조군(Rat IgG1, κ, BD 바이오싸이언스, 샌 디에고, 미국)으로 실온(RT)에서 1시간 동안 배양되었다. 다음으로, 슬라이드는 실온(RT)에서 30분 동안, 1:100으로 희석된, 이차 항체(비오틴-컨쥬게이트 고트 항쥐 IgG₁, BD 바이오싸이언스, 샌 디에고, 미국)로 덮이고, PBS로 세척되었다. 물체 슬라이드는 30분 동안 스트렙타비딘-호스래지쉬 페록시다아제(Streptavidin-Horseradish Peroxidase)(BD 바이오싸이언스, 샌 디에고, 미국)로 덮이고, PBS로 세 번 세척되며(각각의 세척 단계 동안 2분), 색의 분명한 강도가 이루어질 때까지 5분 동안 DAB 용액(BD 바이오싸이언스, 샌 디에고, 미국)으로 배양된 다음 ddH₂O로 세 번 세척되었다. 샘플은 1분 동안 메이어의 헤마라운 용액(Mayer's hemalaun solution)(머크, 다름슈타트, 독일)으로 덮인 다음, 수돗물로 10분 동안 세척되어 청색 염색을 보이게 하였다. 증가하는 알코올 계열(40~100 w/v)을 통과한 물체 슬라이드는 5분 동안 자일렌(칼 로쓰)으로 배양되고, 마지막으로 엔텔란^®(머크)으로 덮였다. 슬라이드는 현미경으로 분석되었다 (짜이스, 악시오, 이미저 A1, 대물 렌즈 920 EX 플랜-네오플루아, 악시오캠 MRc5 짜이스, 악시오 비전 릴리스 4.6.3; 괴팅겐, 독일).

조직학(histology)

모든 형질전환 쥐의 간, 뼈, 및 장은 조직학적으로 분석되었다. 기관은 죽은 후 즉시 준비되었고, 헤마톡시린-에오신(HE)과 카올린-아닐린-오렌지 G(KAO) 염색을 위해 포르말린(4% w/v; 머크)으로 운반되었다. 포르말린 박스는 포르말린 침전을 방지하기 위해 어둠 속에서 보관되었다. 뼈는 적어도 7일 동안 실온에서 오스테오소프트^®에서 배양되었다. 모든 샘플은 2시간 동안 수돗물로 세척된 다음 70 내지 100% w/v 알코올 희석액에 9시간 동안 잠기었다. 최종 배양은 1시간 동안 이소프로판올(JT 베이커, 데벤터, 네델란드)로, 밤새 메틸벤조에이트(리델 데-훼엔, 셀제, 독일)로 이루어졌다. 이후, 기관은 3일 동안 파라핀에 묻히고 얇게 베어졌다(6 lm). 슬라이드는 실온(RT)에서 5분 동안 자일렌으로 두 번 배양되고, 감소하는 알코올 계열(100~50% w/v)을 통과하며, 마지막으로 실온에서 ddH₂O로 운반되었다. 물체 슬라이드는 메이어의 헤마라운 용액에 5분 동안 놓이고 청색의 염색(blue staining)에 도달하도록 수돗물로 세척되었다. 1% w/v 에오신 Y으로 배양 후, 슬라이드는 증가하는(70~100% w/v) 알코올 계열을 통과하고, 마지막으로 엔텔란^®(머크)으로 덮였다. 물체 슬라이드는 현미경으로 분석되었다(니콘, 이클립스 TE2000-E 920, 대물 렌즈 플랜 플루어 920/0.45 Ph1 DM ∞/0-2 WD 7.4 히스토, 소프트웨어 니콘, 루시아G 5.00; 뒤셀도르프, 독일). 뼈는 할미-코넥니에 따라 기술된 바와 같이 KAO로 염색되었다.

예 2:

재조합 DNA 기술은, 이 기술 분야에서 잘 알려진 방법과, 적절하게는, 이러한 방법에 사용된 효소를 사용하기 위한 공급업자의 지시를 사용하여 수행되었다. 일반적인 방법의 출처는, 샘브룩과 러셀에 의해 편집되고 오스벨에 의해 편집된 잘 알려진 책과 같은 표준 문헌을 포함했다. 상세한 실험실 방법은 또한 아래 기술된다. WO 9859244에 기술된 것과 같은 인 실리코 방법은, MHC 클래스 II 분자(이러한 것은 T 세포 에피토프로 간주되었다)에 결합하도록 예측된 펩티드에 대한 쥐 항-CD4의 가변적인 중쇄 및 경쇄 서열을 분석하는데 사용되었다.

예 2a: 키메릭 항-CD4 항체

mRNA는, 제조업자의 지시에 따라, 폴리 에이 트랙트 시스템 1000 mRNA 추출 킷: (프로메가 코포레이션. 매디슨, 위스콘신)을 사용하여 쥐의 항-CD4 혼성 세포로부터 추출되었다. mRNA는 다음과 같이 역 전사되었다: 카파 경쇄에 대해, 5.0 마이크로리터의 mRNA는, 1.0 마이크로리터의 20 pmol / 마이크로리터 MuIgκVL-3' 프라이머 OL040(표 2) 및 5.5 마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물(프로메가 코포레이션. 매디슨, 위스콘신)과 혼합되었다. 람다 경쇄에 대해서는, 5.0 마이크로리터의 mRNA는, 1.0 마이크로리터의 20 pmol / 마이크로리터 MuIgκVL-3' 프라이머 OL042(표 2) 및 5.5 마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물(프로메가 코포레이션. 매디슨, 위스콘신)과 혼합되었다. 감마 중쇄에 대해, 5 마이크로리터의 mRNA는, 1.0 마이크로리터의 20 pmol / 마이크로리터 MuIgVH-3' 프라이머 OL023(표 1) 및 5.5 마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물(프로메가 코포레이션. 매디슨, 위스콘신)과 혼합되었다. 세 가지 모든 반응 혼합물은, 5분 동안 70℃에서 설정된, 예열된 열 사이클러 블록에 놓여졌다. 이러한 반응 혼합물은, 각각에 4.0 마이크로리터의 ImPromII 5x 반응 완충액(프로메가 코포레이션. 매디슨, 위스콘신), 0.5 마이크로리터의 RNasin 리보뉴클레아제 억제제(프로메가 코포레이션. 매디슨, 위스콘신), 2.0　마이크로리터의 25　mM MgCl₂(프로메가 코포레이션. 매디슨, 위스콘신), 1.0 마이크로리터의 10　mM dNTP 혼합물(인비트로겐, 페이즐리, 영국), 및 1.0 마이크로리터의 Improm II 역 전사효소(프로메가 코포레이션. 매디슨, 위스콘신)를 첨가하기 전에 5분 동안 얼음에서 냉각되었다. 반응 혼합물은, 1시간 동안 42℃에서 설정된, 예열된 PCR 블록으로 운반되기 전에 5분 동안 실온에서 배양되었다. 이 시간 후 역 전사효소는 15분 동안 PCR 블록에서 70℃에서 배양시켜 열 비활성화되었다.

중쇄와 경쇄 서열은 다음과 같이 cDNA로부터 확대되었다: PCR 마스터 혼합물(master mix)은, 37.5 마이크로리터의 10× HiFi 익스팬드 PCR 완충액(로슈, 만하임, 독일), 7.5 마이크로리터의 10mM dNTP 혼합물(인비트로겐, 페이즐리, 영국), 및 3.75 마이크로리터의 HiFi 익스팬드 DNA 폴리메라아제(로슈, 만하임, 독일)를, 273.75 마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 첨가하여 제조되었다. 이러한 마스터 혼합물은, 얼음 위의 15개의 얇은 벽 PCR 반응관으로 21.5 마이크로리터의 부분 표본(aliquot)으로 분배되었다. 이러한 여섯 개의 관에, 2.5 마이크로리터의 MuIgVH-3' 역 전사 화합물 혼합물과 1.0 마이크로리터의 중쇄 5' 프라이머 풀(primer pool) HA 내지 HF(프라이머 서열과 프라이머 풀 성분에 대해서는 표 1 참조)가 첨가되었다. 다른 일곱 개의 관에는, 2.5 마이크로리터의 MuIgκVL-3' 역 전사 반응과 1.0 마이크로리터의 경쇄 5' 프라이머 풀 LA 내지 LG(표 2)가 첨가되었다. 최종 관에는, 2.5 마이크로리터의 MuIgκVL-3' 역 전사 반응과 1.0 마이크로리터의 람다 경쇄 프라이머 MuIgλVL5'-LI가 첨가되었다. 반응은 열 사이클러의 블록에 놓여서 2분 동안 95℃까지 가열되었다. PCR 반응은, 30초 동안 94℃, 1분 동안 55℃, 및 30초 동안 72℃의 40 사이클 동안 수행되었다. 마지막으로, PCR 생성물은 72℃에서 5분 동안 가열된 다음, 4℃에서 유지되었다.

코드	서열	길이	이름-풀
OL007	ATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT	25	MuIgV_H5'-HA
OL008	ATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT	26	MuIgV_H5'-HB
OL009	ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCT	29	MuIgV_H5'-HC
OL010	ATGGCTGTCYTRGBGCTGYTCYTCTG	26	MuIgV_H5'-HC
OL011	ATGGVTTGGSTGTGGAMCTTGCYATTCCT	29	MuIgV_H5'-HC
OL012	ATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT	26	MuIgV_H5'-HD
OL013	ATGGRCAGRCTTACWTYYTCATTCCT	26	MuIgV_H5'-HD
OL014	ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT	26	MuIgV_H5'-HD
OL015	ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT	26	MuIgV_H5'-HE
OL016	ATGAAGWTGTGGBTRAACTGGRT	23	MuIgV_H5'-HE
OL017	ATGGRATGGASCKKIRTCTTTMTCT	25	MuIgV_H5'-HE
OL018	ATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT	25	MuIgV_H5'-HF
OL019	ATGTACTTGGGACTGAGCTGTGTAT	25	MuIgV_H5'-HF
OL020	ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG	23	MuIgV_H5'-HF
OL021	ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG	28	MuIgV_H5'-HF
OL022	CCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG	26	MuIgV_H3'-2

(SEQ ID NOs: 70-85)

코드	서열	길이	이름-풀
OL024	ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT	24	MuIgkV_L5'-LA
OL025	ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT	25	MuIgkV_L5'-LB
OL026	ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT	29	MuIgkV_L5'-LC
OL027	ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT	32	MuIgkV_L5'-LD
OL028	ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG	31	MuIgkV_L5'-LD
OL029	ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT	29	MuIgkV_L5'-LE
OL030	ATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG	31	MuIgkV_L5'-LE
OL031	ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC	28	MuIgkV_L5'-LE
OL032	ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG	26	MuIgkV_L5'-LF
OL033	ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG	26	MuIgkV_L5'-LF
OL034	ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG	25	MuIgkV_L5'-LF
OL035	ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT	27	MuIgkV_L5'-LF
OL036	ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT	29	MuIgkV_L5'-LG
OL037	ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT	29	MuIgkV_L5'-LG
OL038	ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG	27	MuIgkV_L5'-LG
OL039	ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG	27	MuIgkV_L5'-LG
OL040	ACTGGATGGTGGGAAGATGGA	21	MuIgkV_L3'-1
OL041	ATGGCCTGGAYTYCWCTYWTMYTCT	25	MuIgλV_L5'-LI
OL042	AGCTCYTCWGWGGAIGGYGGRAA	23	MuIgλV_L3'-1

(SEQ ID NOs: 86-104)

확대 생성물(amplification product)은 pGEM-T 이지 벡터 시스템 I(프로메가 코포레이션, 매디슨, 위스콘신) 킷을 사용하여 pGEM-T 이지 벡터로 클론되고, 서열이 나열되었다. 생성된 쥐의 VH 및 VL 서열은 SEQ ID NOs: 1과 2(도 12) 및 SEQ ID NOs: 11과 12(도 13)로 도시된다.

키메릭 항체를 생성하기 위해, VH 영역 유전자는 프라이머 OL330과 OL331(표 3)을 사용하여 PCR에 의해 확대되었고, 이러한 것은, 템플릿으로 cDNA 클론 중 하나로부터 플라스미드 DNA를 사용하여 5' MluI와 3' HindIII 제한 효소 위치에서 실행(engineer)하도록 설계되었다. 0.5㎖ PCR 관 안으로, 5 마이크로리터의 10× Hi-Fi 익스팬드 PCR 완충액(로슈, 만하임, 독일), 1.0 마이크로리터의 10mM dNTP 혼합물(인비트로겐, 페이즐리, 영국), 0.5 마이크로리터의 프라이머 OL330, 0.5 마이크로리터의 프라이머 OL331, 1.0 마이크로리터의 템플릿 DNA, 및 0.5 마이크로리터의 HiFi 익스팬드 DNA 폴리메라아제(로슈, 만하임, 독일)가, 41.5 마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 첨가되었다.

코드		서열	길이
OL	330	GATCACGCGTGTCCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGGAGTC	39
OL	331	GTACAAGCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGAGG	33

(SEQ ID NOs: 105-106)

VL 영역은, BssHII와 BamHI 제한 효소 위치에서 실행(engineer)하도록 올리고뉴클레오티드 OL332와 OL333(표 4)을 사용하여 유사한 방법으로 확대되었다. 반응은 열 사이클러의 블록에 놓였고 95℃로 2분 동안 가열되었다. 폴리메라아제 사슬 반응(PCR) 반응은, 30초 동안 94℃, 1분 동안 55℃, 및 30초 동안 72℃의 30 사이클 동안 수행되었다. 마지막으로, PCR 생성물은 72℃에서 5분 동안 가열된 다음, 4℃에서 유지되었다. VH와 VL 영역 PCR 생성물은 다음으로 각각 MluI/HinDIII와 BssHII/BamHI 위치에서 각각 벡터 pANTVhG4와 pANTVκ(도 11)로 클론되었다. pANTVhG4와 pANTVκ는 모두 인간의 Ig 발현 카세트를 함유하는 pAT153-계 플라스미드이다. pANTVhG4에서 중쇄 카세트는, 하류의(downstream) 인간 IgG 폴리A 영역을 갖는, hCMVie 촉진제에 의해 작동되는 인간 게놈 IgG4 일정 영역 유전자로 이루어진다. pANTVhG4는, 하류의 SV40 폴리A 영역을 갖는 SV40 촉진제에 의해 작동되는 햄스터 dhfr 유전자를 또한 함유한다.

*pANTVκ의 경쇄 카세트는, 하류의 경쇄 폴리A 영역을 갖는 hCMVie 촉진제에 의해 작동되는 게놈 인간 카파 일정 영역으로 이루어진다. 인간의 Ig 리더 서열과 일정 영역 사이의 클로닝 위치는 가변 영역 유전자의 삽입을 허용한다.

코드		서열	길이
OL	332	CATGGCGCGCGATGTGACATCCAGATGACTCAGTC	35
OL	333	TGCGGGATCCAACTGAGGAAGCAAAGTTTAAATTCTACTCACGTCTCAGCTCCAGCTTGGTCC	63

(SEQ ID NOs: 107-108)

NS0 세포(ECACC 85110503, 포톤, 영국)는, 전기천공법(electroporation)을 통해 이러한 두 개의 플라스미드로 공동 세포 감염되고(co-transfect), DMEM (인비트로겐, 페이즐리, 영국) + 5% FBS (초저 IgG Cat 번호 16250-078 인비트로겐, 페이즐리, 영국) + 페니실린/스트렙토마이신 (인비트로겐, 페이즐리, 영국) + 100　nM 메토트렉세이트(Methotrexate) (시그마, 풀, 영국)에서 선택되었다. 메토트렉세이트 저항성 콜로니(colony)가 분리되고, 항체는 제조업자의 권고 조건을 따라 1㎖ 하이트랩 맵실렉트 슈어 컬럼(HiTrap MabSelect Sure column)(GE 헬쓰케어, 아머샴, 영국)을 사용하는 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제되었다.

NS0 상청액은 정제된 인간의 IgG1/카파(시그마, 풀, 영국)를 표준 물질(standard)로 사용하여 IgG Fc/카파 ELISA에서 항체 발현을 위해 정량되었다. 면역흡착(Immunosorb) 96 웰 플레이트(well plates)(날진, 헤리퍼드, 영국)는, 1시간 동안 37℃에서 1×PBS(pH 7.4)에 1:1500으로 희석된 쥐의 항인 IgG Fc-특정 항체(I6260 시그마, 풀, 영국)로 코팅되었다. 플레이트는, 2% BSA/PBS에 희석된, 샘플과 표준 물질을 첨가하기 전에 PBS + 0.05% 트윈(Tween) 20에 세 번 세척되었다. 플레이트는, PBS/트윈에서 세 번 세척하고 2% BSA/PBS에 1:1000으로 희석된 100㎕/웰의 감지 항체 염소 항인 카파 경쇄 페록시다아제 컨쥬게이트(A7164 시그마, 풀, 영국)를 첨가하기 전에, 1시간 동안 실온(RT)에서 배양되었다. 플레이트는 PBS/트윈으로 다섯 번 세척하기 전에 1시간 동안 실온(RT)에서 배양되었고 결합된 항체는 OPD 기질(시그마, 풀, 영국)을 사용하여 검출되었다. 분석(assay)은, 3M HCl을 첨가하여 중단되기 전 5분 동안 어둠 속에서 수행되었다. 다음으로, 분석 플레이트는 490nm에서 MRX TCII 플레이트 판독기(다이넥스 테크놀러지스, 워딩, 영국)에서 판독되었다.

키메릭 항체는, B-태그 마이크로 바이오티닐화 킷(시그마, 풀, 영국)을 사용하여 바이오티닐화된, 쥐의 항-CD4 항체를 사용하여 ELISA-계 경쟁 분석에서 시험되었다. 10 ㎍/㎖ 내지 0.009 ㎍/㎖의 키메릭 IgG4 또는 대조군 쥐 항체의 희석 계열은, 1 ㎍/㎖ CD4의 50 ㎕/웰로 예비 코팅된 Nunc MaxiSorp 96 웰 평면 바닥 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)(피셔, 러프버러, 영국)에서 실온에서 1시간 동안 100 ㎕/웰을 배양하기 전, 일정한 농도의 바이오티닐화 항-CD4(0.2 ㎍/㎖)와 예비 혼합되었다. 바이오티닐화 mAb의 결합은, 스트렙타비딘-HRP(시그마)의 1/500 희석의 100 ㎕/웰로 실온에서 1시간 동안 배양한 다음, 100 ㎕/웰 OPD 기질(시그마)로 검출하여, 결정되었다. 이 반응을 50 ㎕/웰의 3M HCl로 멈춘 후, 다이넥스 테크놀러지스(워딩, 영국) MRX TC II 플레이트 판독기를 사용하여 490 nm에서의 흡광도가 측정되었다.

얻어진 결과(도 14)는, 키메릭 IgG4와 쥐의 항-CD4 항체가 각각 0.25 ㎍/㎖와 0.18 ㎍/㎖의 IC50 값을 갖는 매우 유사한 결합 프로파일을 갖는다는 것을 보여준다. 따라서, 올바른 가변 영역 서열이 식별되고 클론되었다.

예 2b: 변형된 항-CD4 항체의 설계

가변 영역의 전체 길이에 걸쳐 있는 연속되는 9mer 펩티드가, 34 MHC 클래스 II 대립 유전자의 패널에 대한 결합을 위해 인 실리코 시험되었다. 각각의 개별 대립 유전자에 대한 스코어는 0 내지 1의 스케일로 정규화되었고, 알려진 MHC 클래스 II 결합 펩티드의 패널을 이용한 광범위한 확인(validation)은, 0.55의 컷오프(cut-off) 값이 예측된 결합 펩티드와 결합하지 않은 펩티드를 효과적으로 구별하는 것을 증명하였다. 상세하게, 가변 영역(variable domain) 내에서 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 서열은 소프트웨어 iTope^™를 사용하여 확인되었다. iTope^™ 소프트웨어는 34개의 인간의 MHC 클래스 II 대립 유전자(allele)의 결합 그루브 내에서 펩티드의 아미노산 측쇄와 특정한 결합 포켓 사이의 유리한 상호작용을 예측한다. 키 결합 잔기(key binding residue)의 위치는 시험용 단백질 서열에 걸쳐 있는 하나의 아미노산에 의해 중첩하는 9mer 펩티드를 인 실리코 생성하여 이루어진다. 각각의 9mer는 잠재적인 '적합도(fit)' 및 MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브와 아미노산 측쇄의 상호작용을 기초로 스코어가 매겨졌다. 소프트웨어에 의해 계산된 펩티드 스코어는 0과 1 사이에 있다. 높은 평균 결합 스코어(iTope^™ 스코어링 기능에서 > 0.55)를 생성한 펩티드가 강조되었고, MHC 클래스 II 결합 펩티드의 > 50%, 즉, 34개의 대립 유전자 중 17개가 높은 결합 친화도를 가지면(스코어 > 0.6), 이러한 펩티드는, CD4⁺T 세포 에피토프를 함유하기 위한 고 위험으로 간주된 "불규칙한 높은 친화도(promiscuous high affinity)" MHC 클래스 II 결합 펩티드로 정의되었다. 적절한 친화도의 MHC 클래스 II 결합 펩티드는 높은 친화도를 갖지만 17 미만의 친화도를 갖는 매우 많은 대립 유전자를 결합한다. 다음으로, 높고 적절한 친화도의 결합제는, MHC 클래스 II 대립 유전자에 대한 결합을 감소시키거나 제거하는 서열에 행해질 수 있는 변화를 위해 iTope^™ 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 아미노산 선택 수행시, 임의의 주어진 위치에서 인간의 항체에서 자연히 발견되는 일정 범위의 아미노산이 고려되었다. 대안적으로, 예를 들어, 다음과 같이 공적으로 이용 가능한 소프트웨어가 사용될 수 있다.

ProPred (www.imtech.res.in/raghava/propred/),

Rankpep (bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/) 또는

NetMHCII (www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/).

쥐의 중쇄 가변 영역에서 10개의 MHC 클래스 II 결합 펩티드가 식별되었고 (표 5), 쥐의 경쇄 가변 영역에서는 11개의 MHC 클래스 II 결합 펩티드가 식별되었다 (표 6). 표 5와 표 6은, MHC 클래스 II 결합을 감소시키기 위해 도 12와 도 13의 서열에 사용된 일련의 서열 변종과 식별된 MHC 클래스 II 결합 서열을 나열한다. MHC 클래스 II 결합 서열이 식별된 경우, 키 MHC 클래스 II 결합 위치에서 펩티드의 아미노산은 MHC 클래스 II 결합을 감소시키거나 제거하기 위해 대안적인 아미노산으로 바뀌었다. 일부 경우에, 한 가지 이상의 돌연변이가 결합을 완전하게 제거하는데 필요했고, 다른 경우에는, 수반된 대립 유전자의 개수가 적고 결합 스코어가 컷오프 값에 근접하더라도, MHC 클래스 II 결합은 완전하게 제거될 수 없었다.

쥐		VH4		VH3		VH2		VH1
서열	*	서열	*	서열	*	서열	*	서열	*
LQQSGTVLA	26	LQQSGTELK	13	LQQSGSELK	0	LQQSGSELK	0	LQQSGSELK	0
VLARPGASV	29	ELKRPGASV	0	ELKRPGASV	0	ELKRPGASV	0	ELKRPGASV	0
LARPGASVQ	20	LKRPGASVK	2	LKRPGASVK	2	LKRPGASVK	2	LKRPGASVK	2
MSCKASGYS	18	MSCKASGYT	7	MSCKASGYT	7	VSCKASGYT	0	VSCKASGYT	0
VKQRPGQGL	24	VKQAPGQGL	1	VKQAPGQGL	1	VKQAPGQGL	1	VRQAPGQGL	1
LTAVTSAST	17	LTAVTSAST	17	LTAVTSAST	17	LTADTSAST	4	ITRDTSAST	0
VTSASTAYM	31	VTSASTAYM	31	VTSASTAYM	31	DTSASTAYM	0	DTSASTAYM	0
LSSLTNEDS	20	LSSLTNEDS	20	LSSLTNEDT	2	LSSLTNEDT	2	LSSLTNEDT	2
LDYWGQGTT	21	LDYWGQGTT	21	LDYWGQGTL	0	LDYWGQGTL	0	LDYWGQGTL	0
WGQGTTLTV	27	WGQGTTVTV	0	WGQGTLVTV	0	WGQGTLVTV	0	WGQGTLVTV	0
SEQ ID NOs: 21-30		SEQ ID NOs: 42-55, 138

(*) 결합된 대립 유전자의 개수

쥐		VK4		VK3		VK2		VK1
서열	*	서열	*	서열	*	서열	*	서열	*
IVLTQSPAI	27	IVLTQSPAI	27	IVLTQSPAT	3	IVLTQSPAT	3	IVLTQSPAT	3
VLTQSPAIM	11	VLTQSPAIM	11	VLTQSPATL	0	VLTQSPATL	0	VLTQSPATL	0
IMSASPGEK	10	IMSASPGEK	10	TLSASPGEK	0	TLSASPGEK	0	TLSASPGEK	0
MSASPGEKV	24	MSASPGEKV	24	LSASPGEKV	2	LSASPGEKV	2	LSASPGEKV	2
LLIYDTSNL	6	LLIYDTSNL	6	LLIYDTSNL	6	LLIYDTSNL	6	ALIYDTSNL	0
LASGVPVRF	19	LASGVPSRF	2	LASGVPSRF	2	LASGVPSRF	2	LASGVPSRF	2
VRFIGSGSG	29	SRFIGSGSG	0	SRFIGSGSG	0	SRFSGSGSG	0	SRFSGSGSG	0
FIGSGSGTS	14	FIGSGSGTD	0	FIGSGSGTD	0	FSGSGSGTD	0	FSGSGSGTD	0
IGSGSGTSY	22	IGSGSGTDY	22	IGSGSGTDY	22	SGSGSGTDY	0	SGSGSGTDY	0
YSLTISRME	17	YSLTISSME	0	YSLTISSME	0	YSLTISSME	0	YSLTISSME	0
FGAGTKLEL	16	FGAGTKLEI	0	FGAGTKLEI	0	FGAGTKLEI	0	FGAGTKLEI	0
SEQ ID NOs: 31-41		SEQ ID NOs: 56-69

(*) 결합된 대립 유전자의 개수

예 2c: 변형된 항-CD4 항체의 생성

초기 변형된 항체 VH와 VK 영역 유전자는, 이 기술 분야에서 알려진 방법을 사용하여 예 2a의 부모 쥐 항-CD4 가변 영역의 중첩 PCR 돌연변이 유발(mutagenesis)에 의해 생성되었다 {SEQ ID NO: 1(도 12)과 SEQ ID NO: 11(도 13)} (도 12와 도 13). 추가 변종은 SEQ ID NO: 3(도 12)과 SEQ ID NO: 13(도 13)으로부터 중첩 PCR 돌연변이 유발에 의해 구성되었다. 다음으로, 조립된 변종은 도 11의 발현 벡터로 직접 클론되었다. 모든 클론은 DNA 서열 결정법(sequencing)으로 입증되었다. 상세하게, PCR 돌연변이 생성은 다음과 같은 수행되었다: 센스(sense)와 안티-센스(anti-sense) DNA 스트랜드 모두에서, 변경될 템플릿 뉴클레오티드 서열의 영역에 걸쳐 있는, 프라이머 쌍(primer pairs)이 설계되었다. 프라이머는, 도입/변경되고, 템플릿 서열과 동일한 서열에 의해 접하며, 프라이머를 올바른 위치에 고정하도록 작용할 서열을 포함했다. 돌연변이가 된 PCR 생성물을 발현 벡터(즉, VH 유전자에 대해서는 MluI 및 HinDIII, VK 유전자에 대해서는 BssHII 및 BamHI)로 클로닝하는데 적합한 제한 위치를 포함한 5'와 3' 말단 프라이머가 또한 요구되었다. 표 3, 4, 및 7은, 면역성이 제거된 변종(de-immunized variant)의 구성을 위해 사용된 모든 프라이머를 나열한다. 중첩 PCR을 위해, 유전자의 작은 단편(fragment)은 이들의 말단에서 인접하는 단편을 중첩하는 개별적으로 확대된 PCR이고, 돌연변이는 중첩의 영역에서 프라이머에 의해 도입된다. 다음으로, 짧은 PCR 단편은 정제되고 5'와 3' 말단 프라이머를 사용하는 단일 PCR 반응에서 조립된다. 변종 4 유전자를 생성하기 위해, 쥣과의 가변 영역은 템플릿으로 사용되었고 후속하는 모든 변종을 위해, 변종 4 유전자는 PCR 반응을 위한 템플릿으로 사용되었다: VH 변종 4를 위해, 두 개의 개별 PCR은 OL335 + OL337 및 OL336 + OL338을 사용하여 수행되었고, 단편은 OL334 + OL338을 사용하여 결합되었다. VH 변종 3을 위해, 두 개의 개별 PCR은 OL339 + OL341 및 OL340 + OL342를 사용하여 수행되었고, 단편은 OL339 + OL342를 사용하여 결합되었다. VH 변종 2를 위해, 세 개의 개별 PCR은 OL330 + OL344, OL343 + OL346, 및 OL354+OL342를 사용하여 수행되었고, 단편은 OL330 + OL342를 사용하여 결합되었다. VH 변종 1을 위해, 세 개의 개별 PCR은 OL339 + OL348, OL347 + OL350, 및 OL349 + OL342를 사용하여 수행되었고, 단편은 OL339 + OL342를 사용하여 결합되었다. VK 변종 4를 위해, 네 개의 개별 PCR은 OL332 + OL352, OL351 + OL354, OL353 + OL356, 및 OL355 + OL357을 사용하여 수행되었고, 단편은 OL332 + OL357을 사용하여 결합되었다. VK 변종 3을 위해, PCR은 OL358 + OL357을 사용하여 수행되었다. VK 변종 2를 위해, 두 개의 개별 PCR은 OL358 + OL360 및 OL359 + OL357을 사용하여 수행되었고, 단편은 OL358 + OL357을 사용하여 결합되었다. VK 변종 1을 위해, 두 개의 개별 PCR은 OL358 + OL362 및 OL361 + OL357을 사용하여 수행되었고, 단편은 OL358 + OL357을 사용하여 결합되었다. 사용된 PCR 조건은 키메릭 가변 영역 유전자의 확대를 위해 예 2a에 기술된 것과 같았다. 생성된 PCR 단편은, VH 유전자를 위한 MluI 및 HinDIII 또는 VK 유전자를 위한 BssHII 및 BamHI 중 어느 하나로 소화되었고, 적절한 발현 벡터로 클론되었다.

코드	서열	길이
OL334 OL335 OL336 OL337 OL338 OL339 OL340 OL341 OL342 OL343 OL344 OL345 OL346 OL347 OL348 OL349 OL350 OL351 OL352 OL353 OL354 OL355 OL356 OL357 OL358 OL359 OL360 OL361 OL362	GTTGCTACGCGTGTCCACTCCGAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGACTGaGCTGaaAAGGCCTGG ACTGaGCTGaaAAGGCCTGGGGCTTCCGTGaAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAcCTTTGC ACAGGGTCTACAATGGATTGG CCAATCCATTGTAGACCCTGTCCAGGggcCTGTTTTA CCCAGAAAGCTTACCTGAGGAGACTGTGAcAGTGGTGCC GTTGCTACGCGTGTCCACTCCGAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGtCTGAGCTGAAAAGG CAAATGAGGACaCcGCGGTCTATT AATAGACCGCgGtGTCCTCATTTG CCCAGAAAGCTTACCTGAGGAGACTGTGACAagGGTGCC CTTCCGTGAAGgTGTCCTGCAAGGC GCCTTGCAGGACAcCTTCACGGAAG AACTGACTGCAGaCACATCCGCCAG CTGGCGGATGTGtCTGCAGTCAGTT TGCACTGGGTAAgACAGGCCCCTGG CCAGGGGCCTGTcTTACCCAGTGCA GTTCAAGGACAAGGCCAAAaTcACTagAGACACATCCGCCAGCACT AGTGCTGGCGGATGTGTCTctAGTgAtTTTGGCCTTGTCCTTGAAC CTCCAGGGGAGAAGGcCGCCATGACC GGTCATGGCGgCCTTCTCCCCTGGAG TCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTtcTCGCTTCA GTTGGATGTGTCATAAATCAGGA TCTGGGACCgaTTACTCTCTCACAATCAGCaGcATGGAGGCTG CAGCCTCCATgCtGCTGATTGTGAGAGAGTAAtcGGTCCCAGA ATTGCGGGATCCAACTGAGGAAGCAAAGTTTAAATTCTACTCACGTTTgAtCTCCAGCTTG CCCAGGCGCGCGATGTCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAAcCCTGTCTGCA TTCTCGCTTCAgcGGCAGTGGG CCCACTGCCgcTGAAGCGAGAA CTCCCCCAGAgcCCTGATTTAT ATAAATCAGGgcTCTGGGGGAG	65 65 21 37 39 60 24 24 39 25 25 25 25 25 25 46 46 26 26 51 23 43 43 61 55 22 22 22 22

(SEQ ID NOs: 109-137)

변종 중쇄와 경쇄의 모든 조합(즉, 총 16개의 쌍)은 전기 천공(electroporation)을 통해 NS0 세포로 안정하게 세포 감염되었다. 세포 감염 세포(transfected cell)는 100nM 메토트렉세이트를 사용하여 처음 선택되고, 200nM 메토트렉세이트로 확대되었으며, 예 2a에서와 같이 IgG 발현을 위해 시험되었다. VK3 사슬을 갖는 변종 또는 VH3/VK1 및 VH1/VK2를 갖는 변종으로 발현이 관찰되지 않았다. 각 변종을 위한 최상의 발현 라인이 확대되고 액체 질소 하에 동결되었다. NSO 안정 세포 감염(transfection)으로부터의 항인 CD4-항체 변종은 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 통해 세포 배양 상청액으로부터 정제되었다. 상청액은 0.1 부피의 10× PBS (pH 7.4)로 pH 조절되었고, 1㎖ 맵 실렉트 슈어 단백질 A 컬럼(GE 헬쓰케어, 아머샴, 영국) 위로 통과되었다. 컬럼은 50 mM 구연산염 완충액(pH 3.0)으로 용리(elution)하기 전에 10 부피의 PBS(pH 7.4)로 세척되었다. 1㎖ 분율이 수거되고, 0.1㎖의 1M 트리스-HCl(pH 9.0)로 즉시 중화되었다. 단백질 함유 분율(280nm에서의 흡광도에 의해 측정된)이 모이고, 완충액은 PBS(pH 7.4)로 교체되며, 정제된 항체는 +4℃에서 저장되었다. 정체된 항체의 농도는 280nm에서의 UV 흡광도에 의해 측정되었다. 정제된 항체는, 경쟁 ELISA를 통해 이들의 표적인 인간의 CD4에 대한 결합이 시험되었다. Nunc MaxiSorp 96 웰 평면 바닥 마이크로타이터 플레이트(피셔)는 PBS(pH 7.4)에 용해된 1㎍/㎖ CD4의 50 ㎕/웰로 4℃에서 밤새 코팅되었다. 쥐 항체와 에피토프 결핍 항체 샘플의 복제 적정액(duplicate titration)이 생성되고 (0.005 ㎍/㎖ 내지 12 ㎍/㎖ 범위에서), PBS(pH 7.4)/2% BSA에 용해된 바이오티닐화 쥐 항체의 일정 농도(0.2 ㎍/㎖)와 혼합되었다. 적정액(최종 부피는 100 ㎕/웰)은 예비 세척된{PBS(pH 7.4)/0.05% 트윈 20으로 4×) 분석 플레이트에 첨가되고 1시간 동안 실온에서 배양되었다. 다음으로, 플레이트는 상술한 바와 같이 세척되고, PBS(pH 7.4)/0.05% 트윈 20에 용해된 스트렙타비딘 HRP(시그마)의 1/500 희석의 100 ㎕/웰이 첨가되며 실온에서 1시간 더 배양되었다. 추가 세척 후에, 결합된 바이오티닐화 쥐 항체는 100 ㎕/웰의 3,3'-5,5' 테트라메틸벤지딘 기질(시그마)로 검출되었다. 50 ㎕/웰 3M HCl로 반응을 멈춘 후, 흡광도는 다이넥스 테크놀러지스 MRX TCII 플레이트 판독기로 450nm에서 측정되고, 시험용 항체의 결합 곡선은 쥐의 참조 표준 물질(reference standard) 및 정제된 키메릭 항체와 비교되었다. 결과는 도 15와 도 16에 나타나 있다. 흡광도는 샘플 농도에 대해 작성되고 직선은 각각의 데이터 세트를 통해 맞추어졌다. 직선 방정식은, CD4에 대한 바이오티닐화 쥐 항체의 결합을 50% 억제하는데 필요한 농도(IC50)를 계산하기 위해 사용되었다. 시험용 샘플의 IC50 값은 결합 효율의 ~배 차이(fold difference)를 계산하기 위해 쥐 항체의 값으로 나누어졌다. 이러한 값은, 항체 중 일곱 개(밑줄로 강조된)는 쥐 기준 항체의 적어도 두 배 내에서 결합하고 네 개의 항체(VH1/VK1, VH2/VK2, VH4/VK2, 및 VH4/VK4)는 향상된 결합을 나타냄을 보여주는 표 8에 보고된다.

항-CD4 변종의 상대적인 결합
	VK1	VK2	VK3	VK4
VH1	0.14	-	-	5.06
VH2	8.66	0.96	-	1.44
VH3	-	1.77	-	1.44
VH4	3.89	0.73	-	0.49

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DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH(DSMZ)

DSMZDSMACC3147

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DSMZDSMACC3148

20111202

<110> Fraunhofer-Gesellschaft zur Forderung der angewandten Forschung e.V. <120> Tolerance induction or immunosupression to prevent in particular Graft-versus-Host-Disease (GvHD) by short-term pre-incubation of transplanted cell suspensions, tissues or organs coated with ligands to cell surface molecules <130> F67480PC <150> EP 10015236.2 <151> 2010-12-02 <160> 138 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Anti-CD4 Heavy Chain <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 1 gag gtt cag ctc cag cag tct ggg act gtg ctg gca agg cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tcc gtg cag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac agc ttt gcc aac tac 96 Ser Val Gln Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ala Asn Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta caa tgg att 144 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 ggt gct ctt tat cct gga aat gtt gat act acc tac aac cag aag ttc 192 Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Val Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag gac aag gcc aaa ctg act gca gtc aca tcc gcc agc act gcc tac 240 Lys Asp Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc agc agc ctg aca aat gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca aga atg ggt act act tta gaa gcc ccc ctt gac tat tgg ggc caa 336 Thr Arg Met Gly Thr Thr Leu Glu Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc act ctc aca gtc tcc tca 360 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain VH4 <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 3 gag gtt cag ctc cag cag tct ggg act gag ctg aaa agg cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Lys Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tcc gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt gcc aac tac 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gta aaa cag gcc cct gga cag ggt cta caa tgg att 144 Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 ggt gct ctt tat cct gga aat gtt gat act acc tac aac cag aag ttc 192 Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Val Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag gac aag gcc aaa ctg act gca gtc aca tcc gcc agc act gcc tac 240 Lys Asp Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc agc agc ctg aca aat gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca aga atg ggt act act tta gaa gcc ccc ctt gac tat tgg ggc caa 336 Thr Arg Met Gly Thr Thr Leu Glu Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc act gtc aca gtc tcc tca 360 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain VH3 <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 5 gag gtt cag ctc cag cag tct ggg tct gag ctg aaa agg cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tcc gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt gcc aac tac 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gta aaa cag gcc cct gga cag ggt cta caa tgg att 144 Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 ggt gct ctt tat cct gga aat gtt gat act acc tac aac cag aag ttc 192 Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Val Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag gac aag gcc aaa ctg act gca gtc aca tcc gcc agc act gcc tac 240 Lys Asp Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc agc agc ctg aca aat gag gac acc gcg gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca aga atg ggt act act tta gaa gcc ccc ctt gac tat tgg ggc caa 336 Thr Arg Met Gly Thr Thr Leu Glu Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc ctt gtc aca gtc tcc tca 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 360 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tat tgg ggc caa 336 Thr Arg Met Gly Thr Thr Leu Glu Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc ctt gtc aca gtc tcc tca 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain VH1 <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 9 gag gtt cag ctc cag cag tct ggg tct gag ctg aaa agg cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tcc gtg aag gtg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt gcc aac tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gta aga cag gcc cct gga cag ggt cta caa tgg att 144 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 ggt gct ctt tat cct gga aat gtt gat act acc tac aac cag aag ttc 192 Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Val Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag gac aag gcc aaa atc act aga gac aca tcc gcc agc act gcc tac 240 Lys Asp Lys Ala Lys Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 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Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ile Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc cga atg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt gat tac ccg ctc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 318 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 13 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain VK4 <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 13 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc ctg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gcc gcc atg acc tgc agt gcc agg tca agt gta agt tac ttg 96 Glu Lys Ala Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 tac tgg tac cag cag aag cca ggg tcc tcc ccc aga ctc ctg att tat 144 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 gac aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct tct cgc ttc att ggc agt 192 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc gat tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt gat tac ccg ctc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag atc aaa 318 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain VK3 <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 15 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca acc ctg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gcc gcc atg acc tgc agt gcc agg tca agt gta agt tac ttg 96 Glu Lys Ala Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 tac tgg tac cag cag aag cca ggg tcc tcc ccc aga ctc ctg att tat 144 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 gac aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct tct cgc ttc att ggc agt 192 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc gat tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt gat tac ccg ctc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag atc aaa 318 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain VK2 <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 17 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca acc ctg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gcc gcc atg acc tgc agt gcc agg tca agt gta agt tac ttg 96 Glu Lys Ala Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 tac tgg tac cag cag aag cca ggg tcc tcc ccc aga ctc ctg att tat 144 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 gac aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct tct cgc ttc agc ggc agt 192 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc gat tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt gat tac ccg ctc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag atc aaa 318 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain VK1 <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 19 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca acc ctg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gcc gcc atg acc tgc agt gcc agg tca agt gta agt tac ttg 96 Glu Lys Ala Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 tac tgg tac cag cag aag cca ggg tcc tcc ccc aga gcc ctg att tat 144 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Ala Leu Ile Tyr 35 40 45 gac aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct tct cgc ttc agc ggc agt 192 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc gat tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt gat tac ccg ctc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag atc aaa 318 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 21 Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 22 Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 56 Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 57 Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 58 Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 59 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 60 Ala Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 61 Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 62 Ser Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 63 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 64 Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 65 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 66 Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 67 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 68 Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 69 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile 1 5 <210> 70 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 atgrasttsk ggytmarctk grttt 25 <210> 71 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 atgraatgsa sctgggtywt yctctt 26 <210> 72 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 atggactcca ggctcaattt agttttcct 29 <210> 73 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 atggctgtcy trgbgctgyt cytctg 26 <210> 74 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 atggvttggs tgtggamctt gcyattcct 29 <210> 75 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 atgaaatgca gctggrtyat sttctt 26 <210> 76 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 atggrcagrc ttacwtyytc attcct 26 <210> 77 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 atgatggtgt taagtcttct gtacct 26 <210> 78 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 atgggatgga gctrtatcat sytctt 26 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 atgaagwtgt ggbtraactg grt 23 <210> 80 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (15) <223> I <400> 80 atggratgga sckkrrtctt tmtct 25 <210> 81 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 atgaacttyg ggytsagmtt grttt 25 <210> 82 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 atgtacttgg gactgagctg tgtat 25 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 atgagagtgc tgattctttt gtg 23 <210> 84 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 atggattttg ggctgatttt ttttattg 28 <210> 85 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (21) <223> I <400> 85 ccagggrcca rkggatarac rgrtgg 26 <210> 86 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 atgragwcac akwcycaggt cttt 24 <210> 87 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 atggagacag acacactcct gctat 25 <210> 88 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 atggagwcag acacactsct gytatgggt 29 <210> 89 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (27) <223> I <400> 89 atgaggrccc ctgctcagwt tyttggrwtc tt 32 <210> 90 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 atgggcwtca agatgragtc acakwyycwg g 31 <210> 91 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 atgagtgtgc ycactcaggt cctggsgtt 29 <210> 92 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 atgtggggay cgktttyamm cttttcaatt g 31 <210> 93 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 atggaagccc cagctcagct tctcttcc 28 <210> 94 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (6) <223> I <220> <221> modified_base <222> (12) <223> I <220> <221> modified_base <222> (18) <223> I <400> 94 atgagrmmkt crmttcartt cytggg 26 <210> 95 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (12) <223> I <220> <221> modified_base <222> (24) <223> I <400> 95 atgakgthcy crgctcagyt yctrrg 26 <210> 96 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 atggtrtccw casctcagtt ccttg 25 <210> 97 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 atgtatatat gtttgttgtc tatttct 27 <210> 98 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct 29 <210> 99 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 atggatttwc argtgcagat twtcagctt 29 <210> 100 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 atggtyctya tvtccttgct gttctgg 27 <210> 101 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 atggtyctya tvttrctgct gctatgg 27 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 actggatggt gggaagatgg a 21 <210> 103 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 atggcctgga ytycwctywt mytct 25 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (15) <223> I <400> 104 agctcytcwg wggarggygg raa 23 <210> 105 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 gatcacgcgt gtccactccg aagtgcagct ggtggagtc 39 <210> 106 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 gtacaagctt acctgaggag acggtgactg agg 33 <210> 107 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 catggcgcgc gatgtgacat ccagatgact cagtc 35 <210> 108 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 tgcgggatcc aactgaggaa gcaaagttta aattctactc acgtctcagc tccagcttgg 60 tcc 63 <210> 109 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 109 gttgctacgc gtgtccactc cgaggttcag ctccagcagt ctgggactga gctgaaaagg 60 cctgg 65 <210> 110 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 110 actgagctga aaaggcctgg ggcttccgtg aagatgtcct gcaaggcttc tggctacacc 60 tttgc 65 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 111 acagggtcta caatggattg g 21 <210> 112 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 112 ccaatccatt gtagaccctg tccaggggcc tgtttta 37 <210> 113 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 113 cccagaaagc ttacctgagg agactgtgac agtggtgcc 39 <210> 114 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 114 gttgctacgc gtgtccactc cgaggttcag ctccagcagt ctgggtctga gctgaaaagg 60 60 <210> 115 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 115 caaatgagga caccgcggtc tatt 24 <210> 116 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 116 aatagaccgc ggtgtcctca tttg 24 <210> 117 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 117 cccagaaagc ttacctgagg agactgtgac aagggtgcc 39 <210> 118 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 118 cttccgtgaa ggtgtcctgc aaggc 25 <210> 119 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 119 gccttgcagg acaccttcac ggaag 25 <210> 120 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 120 aactgactgc agacacatcc gccag 25 <210> 121 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 121 ctggcggatg tgtctgcagt cagtt 25 <210> 122 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 122 tgcactgggt aagacaggcc cctgg 25 <210> 123 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 123 ccaggggcct gtcttaccca gtgca 25 <210> 124 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 124 gttcaaggac aaggccaaaa tcactagaga cacatccgcc agcact 46 <210> 125 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 125 agtgctggcg gatgtgtctc tagtgatttt ggccttgtcc ttgaac 46 <210> 126 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 126 ctccagggga gaaggccgcc atgacc 26 <210> 127 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 127 ggtcatggcg gccttctccc ctggag 26 <210> 128 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 128 tcctgattta tgacacatcc aacctggctt ctggagtccc ttctcgcttc a 51 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 129 gttggatgtg tcataaatca gga 23 <210> 130 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 130 tctgggaccg attactctct cacaatcagc agcatggagg ctg 43 <210> 131 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 131 cagcctccat gctgctgatt gtgagagagt aatcggtccc aga 43 <210> 132 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 132 attgcgggat ccaactgagg aagcaaagtt taaattctac tcacgtttga tctccagctt 60 g 61 <210> 133 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 133 cccaggcgcg cgatgtcaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaaccctgt ctgca 55 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 134 ttctcgcttc agcggcagtg gg 22 <210> 135 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 135 cccactgccg ctgaagcgag aa 22 <210> 136 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 136 ctcccccaga gccctgattt at 22 <210> 137 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 137 ataaatcagg gctctggggg ag 22 <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 138 Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 1 5

Claims

수용체 내로의 세포 이식편의 이식에 의한 수용체의 조직에 대한 세포 이식편에 포함된 면역 세포 내에서 내성을 수반하는 생체외(in vitro) 방법에 있어서,
a) 면역 세포를 함유하는 세포 이식편을 항 CD4 항체(anti CD4 antibody)로 배양하는 단계로서, 상기 배양은 1분 내지 7일 동안 실행되는, 상기 배양 단계와,
b) 결합되지 않은 항체를 상기 이식편으로부터 제거하는 단계
를 포함하여 변형된 세포 이식편을 수득하며,
여기에서 단계 a)에서 사용된 면역 세포를 포함하는 세포 이식편이 인간에 해로움을 야기하지 않는 방법으로 수득되는 것인, 생체외 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 배양은,
i) 1분 내지 150분 동안, 또는
ii) 150분 내지 7일 동안
실행되는, 생체외 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 배양은
i) 0.1㎍/㎖ 내지 10㎎/㎖의 항체 양으로, 또는
ii) 상기 이식편이 세포 현탁액(cell suspension)인 경우, 0.1 ㎍/㎖ 세포 현탁액 내지 150 ㎍/㎖ 세포 현탁액의 항체 농도로, 또는
iii) 상기 이식편이 조직 또는 기관인 경우, 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎의 항체 양으로
실행되는, 생체외 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은,
i) 상기 변형된 세포 이식편의 이식에 의하여, GvHD, 공여체 이식편 거부(donor graft rejection), 및 기관 거부(organ rejection)로 이루어진 그룹 중 어느 하나의 가능성을 감소시키는 단계와,
ii) 상기 변형된 세포 이식편의 이식에 의하여, 수용체의 조직에 대해, 이식된 면역적격 세포(immunocompetent cell) 내에서 내성(tolerance)을 이루는 단계와,
iii) 상기 변형된 세포 이식편의 이식에 의하여, 변형된 이식편에 대해, 수용체의 조직 내에서 내성 또는 부분 내성을 이루는 단계와,
iv) 상기 변형된 세포 이식편 내에서 세포 활성화를 억제하는 단계
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 목적을 위해 사용되는, 생체외 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 세포 이식편은 세포 현탁액, 조직, 및 기관으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 생체외 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 세포 이식편은 줄기 세포를 포함하는, 생체외 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 세포 이식편은, 골수 세포(bone marrow cell), 비부착성 골수 세포(non adherent bone marrow cell), 말초 혈액 세포(peripheral blood cell), 제대혈 세포(cord blood cell), 바르톤 젤리(Wharton's jelly)의 세포, 태반 유도 세포(placenta-derived cell), 모근 유도 세포(hair-root-derived cell), 및 지방 조직 유도 세포(fat-tissue-derived cell)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 세포 현탁액; 림프구(lymphocyte), 단핵구(monocyte), 및 대식세포(macrophage)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 세포 현탁액; 줄기 세포를 함유하는 조직; 줄기 세포를 함유하는 기관; 면역 세포를 함유하는 조직; 및 면역 세포를 함유하는 기관으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는,
생체외 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항 CD4 항체는,
i) 2011년 12월 2일 DSMZ에 수탁번호 DSM ACC3148로 기탁된 세포주 MAX.16H5/30F16H5로부터 얻어질 수 있거나, 또는
ii) 2011년 12월 2일 DSMZ에 수탁번호 DSM ACC 3147로 기탁된 세포주 CD4.16H5.chimIgG4로부터 얻어질 수 있거나, 또는
iii) 2011년 12월 2일 DSMZ에 수탁번호 DSM ACC 3147로 기탁된 세포주 CD4.16H5.chimIgG4로부터 얻어질 수 있는 항체의 카파 타입의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체이거나, 또는
iv) SEQ ID NOs: 4, 6, 8 및 10으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 또는 SEQ ID NOs: 14, 16, 18 및 20으로부터 선택되는 카파 타입의 경쇄 가변 영역의 임의의 조합을 포함하는 항체이거나, 또는
v) SEQ ID NOs: 4, 6, 8 및 10으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NOs: 14, 16, 18 및 20으로부터 선택되는 카파 타입의 경쇄 가변 영역의 임의의 조합을 포함하고, 여기에서 상기 조합은, SEQ ID NO: 10/ SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 8/ SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 4/ SEQ ID NO: 18, 및 SEQ ID NO: 4/ SEQ ID NO: 14로부터 선택되는, 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이식편은, 면역억제(immunosuppression), 면역내성(immunotolerance), 및 조절 T 세포 형성(formation of regulatory T cell)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상을 촉진하는 약제(agent)로부터 선택된, 가용성 생체활성 분자(soluble bioactive molecules)로 추가 배양되는, 생체외 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 세포 이식편의 생체외 항체 배양과 후속하는 수용체 조직과의 생체 내 접촉 사이에서 시간 차이가 실행되는, 생체외 방법.
면역 세포를 함유하는 변형된 세포 이식편에 있어서,
상기 이식편은, 상기 이식편의 접근 가능한 CD4 에피토프(epitope)의 40% 내지 100%에 결합된 항 CD4 항체를 포함하는, 변형된 세포 이식편.
면역 세포를 함유하는 변형된 세포 이식편에 있어서,
상기 이식편은, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 얻어질 수 있는, 변형된 세포 이식편.
이식에 의해 치료가능한 하나 또는 그 이상의 질병들의 치료를 위한 제 12 항에 따른 변형된 세포 이식편을 포함하며, 여기에서 상기 질병이 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)(AML), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoid leukemia)(ALL), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia)(CML), 골수 이 형성 증후군(myelodysplastic syndrome)(MDS)/골수 증식 증후군(myeloproliferative syndrome), 악성 림프종(malign lymphomas), 호지킨 질병(Morbus Hodgkin), 높은 등급의 비호지킨 림프종(high grade Non-Hodgkin Lymphoma)(NHL), 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma)(MCL), 저 악성 비호지킨 림프종(low malign NHL), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphatic leukemia)(CLL), 다발성 골수증(multiple myeloma), 중증 재생 불량성 빈혈(severe aplastic anemia), 지중해 빈혈(thalassemia), 겸상 적혈구성 빈혈(sickle cell anemia), 면역학적 결함, 중증 복합형 면역 부전증(severe combined immunodeficiency)(SCID), 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome)(WAS), 혈구 포식 세포 림프조직 구증다증(hemophagocytic lymphohistiocytosis)(HLH), 선천성 대사 장애증(inborn errors of metabolism), 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorders), 퍼옥시좀 기능 장애(disorders of peroxisomal function), 자가면역 질환, 류머티즘 질병(rheumatologic diseases), 및 상기 질병 중 임의 질병의 재발성(recidivisms)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 질병인 약제 조성물.
이식에 의해 치료 가능한 하나 또는 그 이상의 질병을 환자에게서 치료하기 위한, 제 12 항에 기재된 변형된 세포 이식편을 포함하며, 여기에서 상기 질병이 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 골수 이 형성 증후군(MDS)/골수 증식 증후군, 악성 림프종, 호지킨 질병, 높은 등급의 비호지킨 림프종(NHL), 외투 세포 림프종(MCL), 저 악성 비호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병(CLL), 다발성 골수증, 중증 재생 불량성 빈혈, 지중해 빈혈, 겸상 적혈구성 빈혈, 면역학적 결함, 중증 복합형 면역 부전증(SCID), 비스코트-올드리치 증후군(WAS), 혈구 포식 세포 림프조직 구증다증(HLH), 선천성 대사 장애증, 리소좀 축적 질환, 퍼옥시좀 기능 장애, 자가면역 질환, 류머티즘 질병, 및 상기 질병 중 임의 질병의 재발성으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 질병인 약물(medicine).
제 14 항에 있어서, 상기 이식편은 세포 현탁액, 조직, 및 기관으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약물.
제 14 항에 있어서, 상기 이식편은 줄기 세포를 포함하는, 약물.
제 14 항에 있어서, 상기 이식편은, 골수 세포, 비부착성 골수 세포, 말초 혈액 세포, 제대혈 세포, 바르톤 젤리의 세포, 태반 유도 세포, 모근 유도 세포, 및 지방 조직 유도 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 세포 현탁액; 림프구, 단핵구, 및 대식세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 세포 현탁액; 줄기 세포를 함유하는 조직; 줄기 세포를 함유하는 기관; 면역 세포를 함유하는 조직; 및 면역 세포를 함유하는 기관으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약물.
제 14 항에 있어서, 상기 치료는,
i) 상기 변형된 세포 이식편의 이식에 의하여, GvHD, 공여체 이식편 거부, 및 기관 거부로 이루어진 그룹 중 어느 하나의 발생 가능성의 감소를 수반하는 단계와,
ii) 상기 변형된 세포 이식편의 이식에 의하여, 수용체의 조직에 대해, 이식된 면역적격 세포 내에서 내성을 수반하는 단계와,
iii) 상기 변형된 세포 이식편의 이식에 의하여, 변형된 세포 이식편에 대해, 수용체의 조직 내에서 내성 또는 부분 내성을 수반하는 단계와,
iv) 상기 변형된 세포 이식편 내에서 세포 활성화를 억제하는 단계
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 특징을 특징으로 하는, 약물.
제 14 항에 있어서, 상기 이식편은 세포 현탁액이고, 2X10⁶ 세포 내지 2X10¹⁰ 유핵 세포(nucleated cell)의 양이 상기 환자에게 투여되는, 약물.
제 14 항에 있어서,
상기 항 CD4 항체는,
i) 2011년 12월 2일 DSMZ에 수탁번호 DSM ACC3148로 기탁된 세포주 MAX.16H5/30F16H5로부터 얻어질 수 있거나, 또는
ii) 2011년 12월 2일 DSMZ에 수탁번호 DSM ACC 3147로 기탁된 세포주 CD4.16H5.chimIgG4로부터 얻어질 수 있거나, 또는
iii) 2011년 12월 2일 DSMZ에 수탁번호 DSM ACC 3147로 기탁된 세포주 CD4.16H5.chimIgG4로부터 얻어질 수 있는 항체의 카파 타입의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체이거나, 또는
iv) SEQ ID NOs: 4, 6, 8 및 10으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 또는 SEQ ID NOs: 14, 16, 18 및 20으로부터 선택되는 카파 타입의 경쇄 가변 영역의 임의의 조합을 포함하는 항체이거나, 또는
v) SEQ ID NOs: 4, 6, 8 및 10으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NOs: 14, 16, 18 및 20으로부터 선택되는 카파 타입의 경쇄 가변 영역의 임의의 조합을 포함하고, 여기에서 상기 조합은, SEQ ID NO: 10/ SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 8/ SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 4/ SEQ ID NO: 18, 및 SEQ ID NO: 4/ SEQ ID NO: 14로부터 선택되는, 약물.
제 14 항에 있어서,
상기 이식편은, 면역억제, 면역내성, 및 조절 T 세포 형성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상을 촉진하는 약제로부터 선택된, 가용성 생체활성 분자로 추가 배양되는, 약물.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 항 CD4 항체는,
i) 2011년 12월 2일 DSMZ에 수탁번호 DSM ACC3148로 기탁된 세포주 MAX.16H5/30F16H5로부터 얻어질 수 있거나, 또는
ii) 2011년 12월 2일 DSMZ에 수탁번호 DSM ACC 3147로 기탁된 세포주 CD4.16H5.chimIgG4로부터 얻어질 수 있거나, 또는
iii) 2011년 12월 2일 DSMZ에 수탁번호 DSM ACC 3147로 기탁된 세포주 CD4.16H5.chimIgG4로부터 얻어질 수 있는 항체의 카파 타입의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체이거나, 또는
iv) SEQ ID NOs: 4, 6, 8 및 10으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 또는 SEQ ID NOs: 14, 16, 18 및 20으로부터 선택되는 카파 타입의 경쇄 가변 영역의 임의의 조합을 포함하는 항체이거나, 또는
v) SEQ ID NOs: 4, 6, 8 및 10으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NOs: 14, 16, 18 및 20으로부터 선택되는 카파 타입의 경쇄 가변 영역의 임의의 조합을 포함하고, 여기에서 상기 조합은, SEQ ID NO: 10/ SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 8/ SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 4/ SEQ ID NO: 18, 및 SEQ ID NO: 4/ SEQ ID NO: 14로부터 선택되는, 변형된 세포 이식편.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
상기 이식편은, 면역억제, 면역내성, 및 조절 T 세포 형성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상을 촉진하는 약제로부터 선택된, 가용성 생체활성 분자로 추가 배양되는, 변형된 세포 이식편.