CN110337449B

CN110337449B - 抗pd-l1抗体及其应用

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Publication number: CN110337449B
Application number: CN201880011694.5A
Authority: CN
Inventors: 武海; 姚盛; 周岳华; 姚剑; 蒙丹; 冯辉
Original assignee: Shanghai Junshi Biosciences Co Ltd; Suzhou Junmeng Biosciences Co Ltd
Current assignee: Shanghai Junshi Biosciences Co Ltd; Suzhou Junmeng Biosciences Co Ltd
Priority date: 2017-02-21
Filing date: 2018-02-13
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2038-02-13
Also published as: EP3587453A1; US11267890B2; CN110337449A; CN108456251A; WO2018153320A1; KR20190141128A; JP2020508079A; US20190367618A1; BR112019017023A2; JP7361610B2; EP3587453A4

Abstract

一种以高亲和力与PD‑L1特异性结合的抗体或其功能性片段，编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子，用于表达上述抗体或其功能性片段的表达载体和宿主细胞，以及上述抗体或其功能性片段的生产方法。一种包含上述抗体或其功能性片段的免疫缀合物以及药物组合物，以及使用上述抗体或其功能性片段增强T细胞的功能以上调细胞介导的免疫应答用于治疗T细胞功能失调性疾病的方法。

Description

抗PD-L1抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，本发明提供抗原性多肽，其可以用于产生能够结合PD-L1衍生的分子的抗体。本发明还涉及以高亲和力与PD-L1特异性结合的抗体或其功能性片段。本发明还提供了编码本发明抗体或其功能性片段的核酸分子，用于表达本发明抗体或其功能性片段的表达载体和宿主细胞，以及本发明抗体或其功能性片段的生产方法。本发明还提供了包含本发明抗体或其功能性片段的免疫缀合物以及药物组合物，以及使用本发明的抗体或其功能性片段增强T细胞的功能以上调细胞介导的免疫应答用于治疗T细胞功能失调性疾病的方法。

背景技术

程序性细胞死亡蛋白配体1(Programmed death-ligand 1,PD-L1)，又可称为分化簇274(cluster of differentiation 274，CD274)或者B7同源蛋白1(B7 homolog1，B7-H1)，属于肿瘤坏死因子超家族，是由290个氨基酸残基组成的I型跨膜糖蛋白，包含一个IgV样区、一个IgC样区、一个跨膜疏水区和一个30个氨基酸的胞内尾部,完整分子量为40kDa。PD-L1 mRNA在几乎所有组织中都有表达，但PD-L1蛋白只在少部分组织中持续表达，包括肝脏、肺脏、扁桃体以及免疫特赦组织如眼、胎盘等。PD-L1也表达于活化的T细胞，B细胞，单核细胞，树突状细胞，巨噬细胞等。

PD-L1的受体为PD-1，主要表达于CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、NKT细胞、B细胞和活化的单核细胞等免疫细胞表面。PD-L1与PD-1结合可以启动PD-1胞浆区ITIM(免疫受体酪氨酸抑制作用模块)酪氨酸残基的磷酸化，促使酪氨酸磷脂酶与SHP2结合，活化SHP2,使下游Syk和PI3K发生去磷酸化从而传递终止信号，限制抗原呈递细胞或者树突状细胞与T细胞的相互作用。这种结合还可以进一步抑制T细胞的代谢，抑制抗凋亡蛋白Bcl-X2的分泌，减少效应细胞因子IL-2,IFN-r的分泌，诱导T细胞耗竭和凋亡，从而降低免疫T细胞参与的免疫应答，行使负性调节功能。

T细胞识别抗原并活化后会分泌IFN-r。T细胞来源的IFN-r会扩增和维持T细胞功能，比如上调MHC分子，增强目标细胞的抗原处理和呈递，促进T细胞分化。IFN-r同时也会诱导免疫炎症部位组织的PD-L1表达，防止过度免疫对组织造成伤害。IFN-r可以诱导常规上皮细胞，血管内皮细胞，髓样细胞，幼稚T细胞等细胞表面PD-L1的表达。IFN-r诱导产生的干扰素调节因子1(IRF-1)也可以与PD-L1转录起始位点前200bp和320bp处的干扰素调节因子结合位点结合，从转录水平调节PD-L1。PD-L1可以与T细胞表面的PD-1结合行使负调节功能，从而保护炎性部位。

PD-L1的负性调控功能在肿瘤免疫中发挥着重要作用。2004年，Konishi等率先在非小细胞肺癌病人的组织样本中发现PD-L1的表达，随后PD-L1被发现表达于各种肿瘤病人的组织中，包括胃癌，肺癌，肝癌，肝内胆管癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，乳腺癌，子宫颈癌，头颈鳞状细胞癌，鼻咽癌，食管癌，膀胱癌，肾细胞癌，皮肤癌，口腔鳞状细胞癌等。细胞恶变过程中，由于基因突变、外源基因(病毒)表达或静止基因激活等原因会产生新的蛋白分子，这些蛋白质在细胞内降解后，某些降解的肽段可以表达于细胞表面，成为肿瘤抗原。免疫系统可以通过免疫监察识别肿瘤抗原并清除肿瘤细胞，而肿瘤细胞则利用PD-L1逃避免疫攻击。

肿瘤部位PD-L1的表达可以通过多种途径保护肿瘤细胞免受伤害。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分泌IFN-r可诱导肿瘤细胞及周围基质细胞表达PD-L1。而肿瘤细胞的PD-L1可以与TIL上PD-1结合，抑制TIL细胞的活化，并进一步导致其凋亡。体外实验证明，肿瘤细胞相关PD-L1可以增加肿瘤特异T细胞的调亡，而PD-L1单克隆抗体可以减弱这种作用。肿瘤相关PD-L1可以促进T细胞表达IL-10，进一步抑制免疫反应。PD-L1不仅仅是PD-1的配体，他也可以作为受体传递反向的信号保护肿瘤细胞免受FAS-FASL等其他抗肿瘤途径诱导的凋亡。

多种慢性和急性病毒也利用PD-L1信号逃避人体免疫检测。Wang等发现HIV感染者骨髓来源的树突状细胞上PD-L1的表达明显上调，经过抗病毒感染，抑制HIV复制后，PD-L1的表达下调，同时伴随T细胞数目的上调；Chen等研究发现慢性HBV感染者的T淋巴细胞和树突状细胞上PD-L1的表达也上调。病毒感染会诱导感染细胞高表达PD-L1，同时诱导CD8⁺T细胞表达PD-1，从而抑制T细胞作用，导致效应T细胞耗竭。

发明内容

本发明的一个目的是，提供增强T细胞功能的相关靶点的抗体和所述抗体的功能性片段，使用所述抗体或抗体功能性片段增强T细胞的功能以上调细胞介导的免疫应答用于治疗T细胞功能失调性疾病的方法。

为了实现上述目的，本发明的发明人做了深入研究，由此他们发现了特异性结合PD-L1并抑制PD-L1与PD-1结合，从而增强T细胞功能的抗体和所述抗体的功能性片段，本发明包括以下内容。

一方面，本发明的抗体或其功能性片段包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:7，8，9，13，14，15，19，20，21，22，23，24，28，29，30或所述序列之变体的重链CDR，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO:1，2，3，4，5，6，10，11，12，16，17，18，25，26，27或任何所述序列之变体的轻链CDR。

在另一方面，本发明进一步提供了能够结合PD-L1的抗体或其功能性片段，其中所述重链CDR的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：

组别	HCDR1	HCDR2	HCDR3
				A	SEQ ID NO:7	SEQ ID NO:8	SEQ ID NO:9
B	SEQ ID NO:13	SEQ ID NO:14	SEQ ID NO:15
				C	SEQ ID NO:19	SEQ ID NO:20	SEQ ID NO:21
D	SEQ ID NO:22	SEQ ID NO:23	SEQ ID NO:24
				E	SEQ ID NO:28	SEQ ID NO:29	SEQ ID NO:30

和/或所述轻链CDR的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：

组别	LCDR1	LCDR2	LCDR3
				F	SEQ ID NO:1	SEQ ID NO:2	SEQ ID NO:3
G	SEQ ID NO:4	SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:6
				H	SEQ ID NO:10	SEQ ID NO:11	SEQ ID NO:12
I	SEQ ID NO:16	SEQ ID NO:17	SEQ ID NO:18
				J	SEQ ID NO:25	SEQ ID NO:26	SEQ ID NO:27

在另一方面，本发明提供了能够结合PD-L1的抗体或其功能性片段，其重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：

在另一方面，本发明提供了能够结合PD-L1的抗体或其功能性片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:33,35,37,38,40或任何所述序列之变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO:31,32,34,36,39或任何所述序列之变体的轻链可变区。

在另一方面，本发明提供了能够结合PD-L1的抗体或其功能性片段，其为嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。

在另一方面，本发明提供编码本发明所述CDR、轻链可变区或重链可变区的核酸分子及其互补序列，包括但不限于编码SEQ ID NO:1-40、42、44、46和48所示氨基酸序列的核酸分子；以及含有这些核酸分子或其互补序列的表达载体和宿主细胞。

在另一方面，本发明提供了编码本发明的能够结合PD-L1的抗体或其功能性片段的分离的核酸分子及其互补序列，及包含所述核酸分子或其互补序列的表达载体和宿主细胞。

在另一方面，本发明提供了能够结合PD-L1的抗体或其功能性片段，或编码其的核酸分子，或表达载体或宿主细胞在制备增强T细胞的功能以上调细胞介导的免疫应答用的药物或在制备用于治疗T细胞功能失调性疾病,如肿瘤，炎性疾病等疾病的药物中的用途。

在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明所述的能够结合PD-L1的抗体或其功能性片段，编码本发明的能够结合PD-L1的抗体或其功能性片段的分离的核酸分子及表达载体或宿主细胞，或它们的任意组合，以及可药用的载体。

在另一方面，本发明提供了一种免疫缀合物，其包含与治疗剂偶联的本发明所述的能够结合PD-L1的抗体或其功能性片段，优选地所述治疗剂为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。

附图说明

图1A：pCDNA3.1质粒改造获得pSec CAGA2 ECD过程。

图1B：人PD-L1胞外区蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图2：Elisa检测人PD-L1胞外区蛋白与PD-1的结合。

图3：FACS检测人PD-L1胞外区蛋白与293F细胞上PD-1的结合。

图4：FACS检测候选杂交瘤细胞上清抑制PD-L1与PD-1结合的效果。

图5：候选杂交瘤细胞上清的Jurkat荧光素分析。

图6：嵌合抗体与人PD-L1的结合。

图7：嵌合抗体与293F细胞上PD-L1的结合。

图8：嵌合抗体抑制人PD-L1与293F细胞上PD-1的结合。

图9：嵌合抗体的Jurkat荧光素分析。

图10：人源化抗体与人PD-L1的结合。

图11：人源化抗体与293F细胞上PD-L1的结合。

图12：人源化抗体抑制人PD-L1与293F细胞上PD-1的结合。

图13：人源化抗体的Jurkat荧光素分析。

图14：Elisa检测比较人源化抗体与人PD-L1的结合。

图15：体内实验检测人源化抗体对肿瘤生长的抑制作用。

具体实施方式

本文提及的所有参考文献通过明确并入本文。

通用技术

除非另有定义，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，诸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(M.J.Gait，编辑，1984)；Animal Cell Culture(动物细胞培养)(R.I.Freshney，编辑，1987)；Methods inEnzymology(酶学中的方法)(Academic Press，Inc.)；.Current Protocols in MolecularBiology(当代分子生物学方案)(F.M.Ausubel等，编辑1987，和定期更新)；PCR：ThePolymerase Chain Reaction(PCR：聚合酶链反应)，(Mullis等，编辑，1994)；A PracticalGuide to Molecular Cloning(分子克隆实用指南)(Perbal Bernard V.，1988)；PhageDisplay：A Laboratory Manual(噬菌体展示：实验室手册)(Barbas等，2001)。

I.宿主免疫

1.1.淋巴细胞发育和活化

人类中两种主要类型的淋巴细胞是T(胸腺来源的)和B(骨髓来源的)。这些细胞来自于骨髓和胎肝(fetal liver)中已经定向为淋巴发育途径的造血干细胞。这些干细胞的后代沿着不同途径成熟为B或T淋巴细胞。人类中B淋巴细胞发育完全在骨髓内进行。另一方面，T细胞从离开骨髓通过血流移动到胸腺的不成熟的前体发育，在胸腺它们增殖并分化为成熟的T淋巴细胞。

从胸腺或骨髓出现的成熟的淋巴细胞处于静止或“静息”状态，即它们是有丝分裂不活跃的。当分散到血流中，这些“幼稚”或“处女”淋巴细胞移动到多种次级或外周淋巴器官，诸如脾、淋巴结或扁桃体。大部分处女淋巴细胞具有固有的短的寿命，在离开骨髓或胸腺一些天后死亡。然而，如果此类细胞接受存在抗原的信号，它们可活化并经历连续轮次的细胞分裂。然后所产生的后代细胞中的一些回复到静息状态成为记忆淋巴细胞-B和T细胞，其对于再次遇到刺激变应原而基本上是致敏的。活化的处女淋巴细胞的其它后代是效应细胞，其仅存活一些天，但执行特异性防御活性。

淋巴细胞活化是指有序系列事件，通过它当受刺激时静息淋巴细胞经过分裂和产生后代，后代中的一些变为效应细胞。完整应答包括诱导细胞增殖(有丝分裂发生)和表达免疫功能。当特异性配体结合它们表面上的受体时淋巴细胞被激活。该配体对于T细胞和B细胞是不同的，但产生的细胞内生理机制是类似的。

一些异源抗原本身可诱导淋巴细胞活化，特别是与B细胞上的表面免疫球蛋白或T细胞上其它糖蛋白交联的大的聚合抗原。然而，大部分抗原不是聚合的，即使大量直接结合B细胞也不能导致激活。这些更常见抗原当与附近活化的辅助T-淋巴细胞共刺激时激活B细胞。此类刺激可来自于T细胞分泌的淋巴因子，但是其最有效的传递是通过使B细胞直接与T细胞表面蛋白接触，该T细胞表面蛋白与某些B细胞表面受体相互作用产生次级信号。

1.2.T细胞

T淋巴细胞不表达免疫球蛋白，反而通过称为T细胞受体(TCR)的表面蛋白检测异源物质的存在。这些受体通过直接接触或通过影响其它免疫细胞的活性识别抗原。与巨噬细胞一起，T细胞是参与细胞介导的免疫的主要细胞类型。

不像B细胞，T细胞仅在特定环境中能够检测异源物质。具体而言，只有在异源蛋白首先被切割成小肽，其然后展示在第二宿主细胞(称为抗原呈递细胞(APC))表面上时，T淋巴细胞将识别该异源蛋白。许多类型的宿主细胞能够在某些条件下呈递抗原，但是某些类型更特异地适合这一目的并且在控制T细胞活性中特别重要，包括巨噬细胞和其它B细胞。抗原呈递部分依赖于特异性蛋白，称为主要组织相容性复合物(MHC)蛋白，其处于呈递细胞表面上。因此，为了刺激细胞介导的免疫，异源肽必须与MHC肽组合呈递到T细胞，这种组合必须被T细胞受体识别。

存在两种主要T细胞亚型，细胞毒性T淋巴细胞(Tc细胞或CTLs)和辅助T细胞(TH)细胞，其可粗略地通过基于细胞表面表达标记CD8和CD4来鉴别。Tc细胞在病毒防御中是重要的，能够通过识别某些细胞表面表达的病毒肽直接杀死病毒。TH细胞促进其它细胞类型的增殖、成熟和免疫功能，例如淋巴因子分泌从而控制B细胞、巨噬细胞和细胞毒性T细胞的活性。处女和记忆T淋巴细胞通常均处于静息状态，在这种状态它们不显示显著的辅助或细胞毒活性。当被激活时，这些细胞经历数轮有丝分裂以产生子代细胞。这些子代细胞中的一些返回静息状态作为记忆细胞，但其它变成效应细胞，活跃地表达辅助或细胞毒活性。这些子代细胞与它们的亲本相似：CD4+细胞仅能产生CD4+后代，而CD8+细胞仅能产生CD8+后代。效应T细胞表达不在静息T细胞上表达的细胞表面标记，诸如CD25，CD28，CD29，CD40L，转铁蛋白受体和II类MHC蛋白。当激活刺激撤回时，细胞毒性或辅助活性在数天的期间随着效应细胞的死亡或回复静息状态而逐渐消退。

与B细胞的活化相似，T淋巴细胞对大部分抗原的应答也需要两种类型的同时刺激。第一种是抗原，其如果被MHC蛋白适当展示在抗原呈递细胞，可被T细胞受体识别并结合。尽管这种抗原-MHC复合物的确向细胞内发送信号，其通常不足以导致T细胞活化。完全活化，诸如辅助T细胞所发生的，需要与其它特异性配体一起的共刺激，该配体称为辅助刺激因子，表达在抗原呈递细胞表面上。另一方面，细胞毒性T细胞的活化通常需要IL-2，其是活化的辅助T细胞分泌的细胞因子。

1.3.免疫应答

哺乳动物免疫系统与其它身体防御相区别的三种主要功能性质包括：(1)特异性-在大量靶分子中独特地识别和应答或不应答的能力，(2)识别-从非自身中确定自身的从而与所有数不清的蛋白和其它有机分子和平共存，但仍然对引入身体的异源物质强烈反应的能力，和(3)记忆-通过经验建模从而与特定异源病原体的后来的相遇将激发比初次相遇发生更快且强烈的应答的能力。当这些功能中的一个或多个受到破坏，将导致生理病症。

处女淋巴细胞从初级淋巴器官持续地释放到外周，每种携带能够进行抗原结合的表面受体。B细胞中抗原结合通过表面结合的免疫球蛋白介导，而T细胞中通过T细胞受体介导。但处女淋巴细胞被激活时，它们增殖产生子代细胞，子代细胞然后可进行进一步的活化和增殖循环。对给定抗原的应答的速度和强度大部分由克隆选择决定：子代细胞或特异于特定抗原的克隆越大，能够识别和参与免疫应答的细胞数目越多。每个免疫应答是复杂的，并由涉及数种细胞类型的顺次事件复杂地调节。当免疫原进入体内并遇到专门种类的细胞(称为抗原呈递细胞(APCs))时其被触发。这些APCs捕获微小量的免疫原并以能够被抗原特异性辅助T淋巴细胞识别的形式展示。然后辅助T细胞被激活并且反过来促进其它类型的淋巴细胞(诸如B细胞或细胞毒性T细胞)的活化。然后活化的淋巴细胞增殖并执行它们特异性的效应子功能。在这种过程的每个阶段，淋巴细胞和APC通过直接接触或通过分泌调节细胞因子相互通讯。

被APC捕获的外来抗原经历一系列变化称为抗原加工。此类加工(特别是蛋白免疫原的加工)涉及变性和部分蛋白水解消化，从而该免疫原被切割成短肽。然后所产生的有限数目的肽与II类MHC蛋白非共价结合并运输到APC表面，该过程称为抗原呈递。与APC直接接触的CD4+辅助T淋巴细胞可被活化，但其仅在表达能够识别并结合APC呈递的特定肽-MHC复合物的T细胞受体蛋白时才被活化。

辅助T(TH)细胞是免疫应答的主要协调者(orchestrators)，因为需要它们来活化两种其它淋巴效应细胞：细胞毒性T(Tc)细胞和抗体分泌浆细胞。TH活化在免疫应答早期发生并且需要至少两个信号。一个信号由T细胞抗原受体与APC表面通过CD3蛋白复合物传递的抗原性肽-MHC复合物的结合提供，而第二个通过APC的共刺激信号被认为是来自于T细胞表面上独立的信号传递蛋白与APC上特异性配体的结合。一种已知的此类相互作用是T细胞蛋白CD28和已知为B7的APC表面蛋白的家族。其它表面蛋白配对也可以介导共刺激。共刺激的过程随后更详细地描述。认为本发明的抗-PD-L1抗体通过拮抗由通过PD-L1的信号传导提供的负性共刺激信号增强共刺激。

总之，两个信号诱导辅助T细胞开始分泌细胞因子白细胞介素-2(IL-2)，也开始在其表面上表达特异性高亲合力IL-2受体。IL-2对于T淋巴细胞是高度强力的促有丝分裂因子，对活化的T细胞的增殖反应是必需的。IL-2对分泌它的细胞的效应-一种已知为自分泌效应的现象。还已经显示即使T细胞已经接收到两种信号，如果其本身IL-2受体被阻断其将不会增殖。IL-2也可通过所谓的旁分泌效应作用于紧邻的细胞。这种效应对于激活Tc细胞是特别重要的，Tc细胞通常不产生足够刺激它们自身增殖的IL-2。除了IL-2以外，活化的TH细胞分泌其它细胞因子并促进B细胞、巨噬细胞和其它细胞类型的生长、分化和功能。

APC和抗原特异性TH细胞之间的接触也具有对APC的效应-其中最重要的之一是释放IL-1。认为这种细胞因子以自分泌方式作用以增加II类MHC蛋白和多种粘附分子的表面表达由此增强TH细胞的结合和增强抗原的呈递。同时，IL-1以旁分泌的方式发挥对TH细胞的功能以促进IL-2分泌和IL-2受体的表达。

在TH细胞以上述方式活化的过程中，一些B细胞也可以通过它们的抗原受体结合免疫原，其是膜结合形式的抗体，它们将在晚些时候分泌。不像T细胞，B细胞以其游离的未加工的形式识别免疫原。特异性抗原结合提供一种类型的信号，其能够导致B细胞活化。

第二种类型由活化的TH细胞提供，该细胞通过在其表面上结合非免疫球蛋白受体表达辅助激活B细胞的蛋白。这些TH-来源的信号(其作用于B细胞而不论其抗原特异性)称为辅助因子。这些辅助因子包括IL-2，IL-4和IL-6。然而，辅助通过细胞-细胞接触更有效地获得，该细胞-细胞接触允许T细胞表面上的蛋白与B细胞上的那些直接接触。当一种被称为CD40配体(CD40L)的蛋白(其仅在TH细胞被激活后表达在TH细胞上)与B细胞上称为CD40的蛋白结合时，发生最有效形式的接触-介导的辅助。在称为旁观者(by-stander)活化的过程中，与活化的B细胞的接触甚至能够足以激活静息B细胞，即使该B细胞的表面免疫球蛋白尚未结合抗原。

Tc淋巴细胞发挥功能来清除在它们表面上表达异源抗原的细胞(诸如病毒感染的宿主细胞)。大部分Tc细胞表达CD8而非CD4，因而识别与I类而非II类MHC蛋白相关的抗原。当体细胞被病毒感染，一些致免疫的病毒蛋白可在细胞内进行加工，然后所产生的肽作为与I类MHC分子一起的表面复合物出现。然后这些肽-MHC复合物可被抗原特异性克隆的T细胞受体识别，提供Tc-细胞活化必需的两个信号中的一个。这种第一信号单独诱导Tc细胞上的高亲合力的IL-2受体。第二信号由从附近的活化的TH淋巴细胞分泌的IL-2提供。一旦接收到两个信号，活化的Tc细胞获得细胞毒活性，使其能够杀死其所结合的细胞，以及杀死其它携带相同肽-MHC I类复合物的细胞。在一些情况中，杀死由于Tc释放特异性毒素到靶细胞上发生；在其它情况中，Tc诱导靶细胞通过凋亡而自杀。活化的Tc细胞也增殖，产生额外的具有相同抗原特异性的Tc细胞。

2.PD-1途径：

调节T细胞活化的重要负性共刺激信号通过程序性死亡-1受体(PD-1)(CD279)及其配体结合配偶体PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)提供。PD-1的负调节作用通过易于自身免疫的PD-1敲除(Pdcd1-/-)揭示。Nishimura等，Immunity(免疫)11：141-51(1999)；Nishimura等，Science(科学)291：319-22(2001)。PD-1与CD28和CTLA-4相关，但缺少允许同二聚化的膜邻近半胱氨酸。PD-1的胞质结构域含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM，V/IxYxxL/V)。PD-1仅结合PD-L1和PD-L2。Freeman等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)192：1-9(2000)；Dong等，Nature Med.(自然医学)5：1365-1369(1999)；Latchman等，NatureImmunol.(自然免疫学)2：261-268(2001)；Tseng等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)193：839-846(2001)。

PD-1可在T细胞、B细胞、天然杀伤T细胞、活化的单核细胞和树突状细胞(DCs)上表达。PD-1被激活的人CD4+和CD8+T细胞、B细胞和骨髓细胞表达，但不被未刺激的这些细胞表达。这与CD28和CTLA-4更受限制的表达形成对比。Nishimura等，Int.Immunol.(国际免疫学)8：773-80(1996)；Boettler等，J.Virol.(病毒学杂志)80：3532-40(2006)。已经从活化的人T细胞中克隆了至少4种PD-1的变体，包括缺少(i)外显子2，(ii)外显子3，(iii)外显子2和3或(iv)外显子2至4的转录本。Nielsen等，Cell.Immunol.(细胞免疫学)235：109-16(2005)。除了PD-1Δex3之外，所有变体在静息外周血单核细胞(PBMCs)中作为全长PD-1以相似水平表达。在用抗-CD3和抗-CD28活化人T细胞时，所有变体的表达显著被诱导。PD-1Δex3变体缺少跨膜结构域，并与可溶性CTLA-4相似，后者在自身免疫中发挥重要作用。Ueda等，Nature(自然)423：506-11(2003)。这种变体在患有类风湿性关节炎的患者滑膜液和血清中富集。Wan等，J.Immunol.(免疫学杂志)177：8844-50(2006)。

两种PD-1配体的差别在于它们的表达模式。PD-L1在小鼠T和B细胞、CDs、巨噬细胞、间充质干细胞和骨髓来源的肥大细胞上组成型表达。Yamazaki等，J.Immunol.(免疫学杂志)169：5538-45(2002)。PD-L1在广泛范围的非造血细胞(例如角膜、肺、血管上皮、肝非实质细胞、间充质干细胞、胰岛、胎盘合胞体滋养层细胞、角质化细胞)上表达[Keir等，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)26：677-704(2008)]，并在很多细胞类型活化后上调。类型I和类型II干扰素(IFN’s)上调PD-L1。Eppihimer等，Microcirculation(微循环)9：133-45(2002)；Schreiner等，J.Neuroimmunol.(神经免疫学杂志)155：172-82(2004)。当MyD88，TRAF6和MEK被抑制时，PD-L1在细胞中的表达降低。Liu等，Blood(血液)110：296-304(2007)。JAK2也参与PD-L1诱导。Lee等，FEBSLett.580：755-62(2006)；Liu等，Blood(血液)110：296-304(2007)。磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)(一种修饰磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和Akt信号传导的细胞磷酸酶)的丧失或抑制增加了癌症中转录后PD-L1表达。Parsa等，Nat.Med.(自然医学)13：84-88(2007)。

PD-L2表达比PD-L1更受限制。PD-L2在DCs、巨噬细胞和骨髓来源的肥大细胞上诱导表达。PD-L2也在大约二分之一至三分之二的静息腹膜B1细胞上表达，但不在常规的B2B细胞上表达。Zhong等，Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂志)37：2405-10(2007)。PD-L2+B1细胞结合磷脂酰胆碱，可能对于抵抗细菌抗原的先天免疫应答是重要的。通过IFN-γ对PD-L2的诱导部分地依赖于NF-κB。Liang等，Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂志)33：2706-16(2003)。PD-L2也可通过GM-CF、IL-4和IFN-γ在单核细胞和巨噬细胞上诱导。Yamazaki等，J.Immunol.(免疫学杂志)169：5538-45(2002)；Loke等，PNAS100：5336-41(2003)。

PD-1信号传导典型地对细胞因子产生比对细胞增殖具有更大效应，对IFN-γ、TNF-α和IL-2的产生具有显著效应。PD-1介导的抑制性信号传导也依赖于TCR信号传导的强度，在低水平的TCR刺激传递更大的抑制。这种降低可通过经CD28的共刺激[Freeman等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)192：1027-34(2000)]或IL-2的存在[Carter等，Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂志)32：634-43(2002)]而得到克服。

经PD-L1和PD-L2的信号传导可能是双向的证据正在增加。即，除了修饰TCR或BCR信号传导之外，信号传导也可能传递回表达PD-L1和PD-L2的细胞。尽管用天然人抗-PD-L2抗体(分离自患有Waldenstrom’s巨球蛋白血症的患者)处理树突状细胞未发现上调MHC II或B7共刺激分子，此类细胞的确产生更大量的促炎细胞因子，特别是TNF-α和IL-6，并刺激T细胞增殖。Nguyen等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)196：1393-98(2002)。用这种抗体处理小鼠也(1)增强对转板(transplated)的b16黑素瘤的抵抗并迅速诱导肿瘤-特异性的CTL。Radhakrishnan等，J.Immunol.(免疫学杂志)170：1830-38(2003)；Radhakrishnan等，Cancer Res.(癌症研究)64：4965-72(2004)；Heckman等，Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂志)37：1827-35(2007)；(2)阻断小鼠变应性哮喘模型中气道炎症疾病的发展。Radhakrishnan等，J.Immunol.(免疫学杂志)173：1360-65(2004)；Radhakrishnan等，J.Allergy Clin.Immunol.(变态反应临床免疫学杂志)116：668-74(2005)。)

向树突状细胞(“DC’s”)反向信号传导的进一步的证据来自于对骨髓来源的DC与可溶性PD-1(融合到Ig恒定区的PD-1EC结构域-“s-PD-1”)一起培养的研究。Kuipers等，Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂志)36：2472-82(2006)。这种sPD-1以可通过施用抗-PD-1逆转的方式抑制DC活化并增加IL-10的产生。

另外，数个研究显示了独立于PD-1的PD-L1或PD-L2的受体。B7.1已经被鉴定为PD-L1的结合配偶体。Butte等，Immunity(免疫)27：111-22(2007)。化学交联研究显示PD-L1和B7.1可通过它们的IgV-样结构域相互作用。B7.1:PD-L1相互作用可诱导向T细胞中的抑制性信号。在CD4+T细胞上通过B7.1连接PD-L1或在CD4+T细胞上通过PD-L1连接B7.1传递抑制性信号。当通过在抗-CD3加上B7.1包被的珠子刺激时，缺少CD28和CTLA-4的T细胞显示降低的增殖和细胞因子产生。在缺少针对B7.1的所有受体(即，CD28，CTLA-4和PD-L1)的T细胞中，T细胞增殖和细胞因子产生不再被抗-CD3加上B7.1包被的珠抑制。这表明在没有CD28和CTLA-4时B7.1在T细胞上特异性地通过PD-L1发挥作用。相似地，当在存在抗-CD3加上PD-L1包被的珠子进行刺激时，缺少PD-1的T细胞显示降低的增殖和细胞因子产生，表明在T细胞上PD-L1连接对B7.1的抑制性效应。当T细胞缺少所有针对PD-L1的已知受体(即，无PD-1和B7.1)时，T细胞增殖不再被抗-CD3加上PD-L1包被的珠子破坏。因此，PD-L1可通过B7.1或PD-1发挥对T细胞的抑制性效应。

B7.1和PD-L1的直接相互作用表明目前对共刺激的理解是不完全的，低估了这些分子的表达对T细胞的重要性。PD-L1-/-T细胞的研究显示T细胞上的PD-L1可下调T细胞细胞因子的产生。Latchman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)101：10691-96(2004)。因为在T细胞、B细胞、DCs和巨噬细胞上PD-L1和B7.1两者均表达，有可能存在这些细胞类型上的B7.1和PD-L1之间的定向相互作用。另外，非造血细胞上的PD-L1可与T细胞上的B7.1和PD-1相互作用，提出了PD-L1是否参与它们的调节的问题。B7.1:PD-L1相互作用的抑制性效应的一个可能解释是T细胞PD-L1可从与CD28相互作用中俘获或隔离APC B7.1。

因此，拮抗经PD-L1的信号传导，包括从与PD-1、B7.1或两者的相互作用中阻断PD-L1，由此阻止PD-L1发送负性共刺激信号到T细胞和其它抗原呈递细胞，可能增强应答感染(例如，急性的和慢性的)和肿瘤免疫的免疫。此外，本发明的抗-PD-L1抗体可与PD-1:PD-L1信号传导的其它组分的拮抗剂(例如拮抗性抗-PD-1和抗-PD-L2抗体)组合。

术语

本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长抗体，其具有免疫球蛋白Fc区)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，双抗体和单链分子，以及抗体片段(例如，Fab，F(ab′)2，和Fv)。本文中术语“免疫球蛋白”(Ig)和“抗体”可互换地使用。

基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，包含10个抗原结合位点；而IgA抗体包含2-5个基本的4链单元，其可与J链组合聚合形成多价装配物。在IgG的情况中，4链单元通常约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有可变结构域(VH)，接着是三个(对于每种α和γ链)和四个(对于μ和ε同种型)恒定结构域(CH)。每条轻链在N-末端具有可变结构域(VL)，接着是其另一端的恒定结构域。VL与VH排列在一起，而CL与重链的第一恒定结构域(CH1)排列在一起。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的VH和VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见如Basic and Clinical Immunology(基本和临床酶学)，第八版，Daniel P.Sties，AbbaI.Terr和Tristram G.Parsolw(编辑)，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定结构域氨基酸序列，可归入两种称作κ和λ的截然不同型中的一种。根据其重链恒定结构域(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的相对较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人表达下列亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。

术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的全部氨基酸。相反，其集中在三个称为高变区(HVR)的区段(在轻链和重链可变结构域中均有)。可变结构域中更为高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequencesof Immunological Interest(免疫学感兴趣的序列)，第五版.National Institute ofHealth(国立卫生研究所)，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中抗体的参与。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如，Kohler和Milstein，Nature(自然)，256：495-97(1975)；Hongo等，Hybridoma(杂交瘤)，14(3)：253-260(1995)，Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室指南)，(Cold Spring HarborLaboratory Press，第二版.1988)；Hammerling等，在：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)563-681，(Elsevier，N.Y.，1981))中、重组DNA法(参见例如，美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如，Clackson等，Nature(自然)，352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1992)；Sidhu等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)284(1-2)：119-132(2004)、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术(参见例如，WO1998/24893；WO1996/34096；WO1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature(自然)，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immunol.(免疫学年鉴)，7：33(1993)；美国专利Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016，Marks等，Bio/Technology(生物/技术)，10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature(自然)，368：856-859(1994)；Morrison，Nature(自然)，368：812-813(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnol.(自然：生物技术)，14：845-851(1996)；Neuberger，NatureBiotechnol.(自然：生物技术)，14：826(1996)；和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.，13：65-93(1995)。

术语“全长抗体，”“完整抗体”或“完全抗体”可互换地使用，是指基本上是其完整形式的抗体(与抗体片段相对比)。具体而言，完全抗体包括那些具有重链和轻链包括Fc区的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况中，完整抗体可具有一种或多种效应子功能。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.(蛋白质工程)8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由完整轻链及重链可变结构域(VH)和一条重链第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段在抗原结合方面是单价的，即其具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab’)2片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有不同抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了一些另外的残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段有所不同。F(ab’)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应子功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是由在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的区。

“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整结合位点。

“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含抗体VH和VL结构域连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成期望的抗原结合结构。关于sFv的综述参见Pluckthun于The Pharmacology ofMonoclonalAntibodies(单克隆抗体药理学)，vol.113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。

本发明的抗体的“功能性片段”包括完整抗体的一部分，通常包括该完整抗体的抗原结合区或可变区，或抗体的Fc区，其保留或具有修饰的FcR结合能力。抗体片段的实例包括线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。尤其是指抗体片段如Fv、scFv(sc指单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或者双抗体(diabody)、或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段，所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化，PEG化”)(被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab')2-PEG或Fab'-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”为聚乙二醇)，所述片段具有EGFR结合活性。优选地，所述功能性片段由其来源抗体的重链可变区或轻链可变区的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，对于PD-L1，优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100，在更优选方式中至少等于1/10。这种功能性片段将包含最少5个氨基酸，优选其来源的抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。

单克隆抗体在本文中具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)81：6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括PRIMATIZED抗体，其中该抗体的抗原结合区来自于由例如用感兴趣的抗原免疫猕猴产生的抗体。用于本文时，“人源化抗体”用作“嵌合抗体”的子集。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。

“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)227：381(1991)；Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581(1991)。可获得的制备人单克隆抗体的方法在Cole等，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等，免疫学杂志(J.Immunol.)147(1)：86-95(1991)中描述。还参见van Dijk和van de Winkel，现代药学评论(Curr.Opin.Pharmacol.)，5：368-74(2001)。人抗体可以如下制备，即将抗原施用于转基因动物，其经修饰而应答抗原激发生成此类抗体，但是其内源基因座已经失去能力，例如经免疫的异种移植小鼠(xenomice)(参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，103：3557-3562(2006)，关于经人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体。

“构架”或“FR”残基指除本文中所定义的HVR残基之外的那些可变结构域残基。

本发明提供了能够结合PD-L1的抗PD-L1抗体及其功能性片段。本发明的抗体或其功能性片段具有以下特性的至少一种：能够以高亲和力阻断PD-L1和PD-1的相互作用；能够与PD-L1以高特异性结合。

本发明还提供了人源化抗PD-L1抗体及其功能性片段。所述人源化抗体由免疫小鼠产生的鼠源抗体经由计算机模拟设计并结合噬菌体展示技术而得到。

在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。

本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或可仅包含抗原结合部分(例如，Fab、F(ab’)₂或scFv片段)，或可以被修饰以影响功能。本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗PD-L1抗体。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点可以是有用的，或在寡糖链上不存在岩藻糖部分以例如增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能的抗体。在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。

本领域技术人员可以将编码本发明所述抗PD-L1抗体的DNA分子克隆到载体中，进而转化宿主细胞。因此，本发明还提供了一种重组DNA载体，其含有编码本发明所述抗PD-L1抗体的DNA分子。

优选地，所述重组DNA载体是一种表达载体，本领域技术人员将所述抗体的DNA分子克隆到表达载体中，转化宿主细胞，通过诱导表达获得抗体。本发明的表达载体含有编码抗PD-L1抗体的重链可变区、轻链可变区和/或恒定区的DNA序列。然而，也可有分别构建两种表达载体，一种含有重链可变区和恒定区，另一种含有轻链可变区和恒定区，共同转染哺乳动物细胞。在一个优选的实施方案中，所述表达载体进一步含有启动子和编码分泌信号肽的DNA序列，以及至少一种用于筛选的抗药基因。

本发明所述宿主细胞可以为其为原核宿主细胞、真核宿主细胞或噬菌体。，所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核宿主细胞，可以为如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，如草地粘虫等昆虫细胞，如烟草等植物细胞，如BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本发明所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞。

本文使用的术语“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如根据本发明的抗体、核酸分子、核酸分子组合和/或缀合物)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。

根据本发明的药物组合物可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。

在一个相关方面，本发明提供了为抗PD-L1抗体与第二治疗剂的组合的药物组合物。在一个实施方案中，所述第二治疗剂是有利地与抗PD-L1抗体组合的任意试剂。可有利地与抗PD-L1抗体组合的示例性试剂包括但不限于抑制PD-L1活性的其他试剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)和/或干扰PD-L1上游或下游信号转导的试剂。

本文使用的术语“通过消除、抑制或降低PD-L1活性来预防或治疗疾病或病症”旨在表示由PD-L1表达所导致或者以PD-L1表达为症状/特征的疾病或病症，包括T细胞功能失调性疾病，如癌症和炎性疾病。在一些实施方案中，本发明所述的癌症包括但不限于胃癌，肺癌，肝癌，肝内胆管癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，乳腺癌，子宫颈癌，头颈鳞状细胞癌，鼻咽癌，食管癌，膀胱癌，肾细胞癌，皮肤癌和口腔鳞状细胞癌。

本文使用的“治疗有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。

本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物(如苍鹭、鹳、鹤等)，家畜(如鸭、鹅等)或实验动物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。

一方面，本发明的抗体或其功能性片段包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:7，8，9，13，14，15，19，20，21，22，23，24，28，29，30或所述序列之变体的重链CDR，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO:1，2，3，4，5，6，10，11，12，16，17，18，25，26，27或任何所述序列之变体的轻链CDR。在某些优选的实施方案中，本发明抗体或其功能性片段重链CDR的氨基酸序列选自SEQ ID NO:7，8，9，13，14，15，19，20，21，22，23，24，28，29和30所示序列，和/或轻链CDR的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1，2，3，4，5，6，10，11，12，16，17，18，25，26和27所示序列。

在一些优选的实施方案中，本发明抗体或其功能性片段的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7、13、19、22或28或任一所述序列的变体所示。在一些优选的实施方案中，本发明抗体或其功能性片段的重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8、14、20、23或29或任一所述序列的变体所示。本发明抗体或其功能性片段的重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9、15、21、24或30或任一所述序列的变体所示。

在一些优选的实施方案中，本发明抗体或其功能性片段的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7、13、19、22或28或任一所述序列的变体所示；重链CDR2的氨基酸序列如SEQID NO:8、14、20、23或29或任一所述序列的变体所示；和重链CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:9、15、21、24或30或任一所述序列的变体所示。

在一些优选的实施方案中，所述抗体或其功能性片段的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：

在一些优选的实施方案中，本发明抗体或其功能性片段的轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、4、10、16或25或任一所述序列的变体所示。在一些优选的实施方案中，本发明抗体或其功能性片段的轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、5、11、17或26或任一所述序列的变体所示。本发明抗体或其功能性片段的轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、6、12、18或27或任一所述序列的变体所示。

在一些优选的实施方案中，本发明抗体或其功能性片段的轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、4、10、16或25或任一所述序列的变体所示；轻链CDR2的氨基酸序列如SEQID NO:2、5、11、17或26或任一所述序列的变体所示；和轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:3、6、12、18或27或任一所述序列的变体所示。

在一些优选的实施方案中，所述所述抗体或其功能性片段的轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：

在一些优选的实施方案中，本发明抗体或其功能性片段的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7、13、19、22或28或任一所述序列的变体所示；重链CDR2的氨基酸序列如SEQID NO:8、14、20、23或29或任一所述序列的变体所示；和重链CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:9、15、21、24或30或任一所述序列的变体所示；以及轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:1、4、10、16或25或任一所述序列的变体所示；轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、5、11、17或26或任一所述序列的变体所示；和轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、6、12、18或27或任一所述序列的变体所示。

；和/或所述轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：

。

在一些优选的实施方案中，本发明抗体或其功能性片段的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：

在一些实施方案中，本发明抗体或其功能性片段包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:33,35,37,38,40或任何所述序列之变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO:31,32,34,36,39或任何所述序列之变体的轻链可变区。在某些实施方案中，本发明抗体或其功能性片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:33,35,37,38或40所示，和/或其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31,32,34,36或39所示。

在一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:33或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:31或其变体。

在另一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:33或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:32或其变体。

在又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:35或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:34或其变体。

在又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:37或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:36或其变体。

在又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:38或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:36或其变体。

在又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:40或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:39或其变体。

本发明的抗体或其功能性片段可以是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。

本发明的抗体或其功能性片段可以是人源化的。制备人源化抗体的方法是本领域技术人员公知的。例如，可以通过将本发明的CDR序列转移至人抗体可变区中来制备本发明的人源化抗PD-L1抗体。所述人源化抗体不会产生抗抗体反应(AAR)和人抗鼠抗体反应(HAMA)，不会因被抗抗体中和而被快速清除，并且具有免疫效应功能。

在一些优选的实施方案中，本发明的人源化抗PD-L1抗体或其功能性片段包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:33,35,37,38,40或任何所述序列之变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO:31,32,34,36,39或任何所述序列之变体的轻链可变区。在某些实施方案中，本发明人源化抗PD-L1抗体或其功能性片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:33,35,37,38或40所示，和/或其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31,32,34,36或39所示。

在本发明人源化抗体或其功能性片段的一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:33或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:31或其变体。

在本发明人源化抗体或其功能性片段的一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:33或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:32或其变体。

在本发明人源化抗体或其功能性片段的另一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:35或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:34或其变体。

在本发明人源化抗体或其功能性片段的另一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:38或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:36或其变体。

在本发明人源化抗体或其功能性片段的又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:37或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:36或其变体。

在本发明人源化抗体或其功能性片段的又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:40或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:39或其变体。

在本发明人源化抗体或其功能性片段的又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:44或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:42或其变体。

在本发明人源化抗体或其功能性片段的又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQ ID NO:48或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO:46或其变体。

本发明还提供了编码本发明抗体或其功能性片段的分离的核酸分子。因此，本发明提供编码本发明所述CDR、轻链可变区或重链可变区的核酸分子，包括但不限于编码SEQID NO:1-40、42、44、46和48所示氨基酸序列的核酸分子。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:43、47和/或45、49所示的核苷酸序列或其组合。在某些实施方案中，本发明的核酸分子如SEQ ID NO:43、47、45或49所示。

本发明还提供了包含所述核酸分子的表达载体以及包含所述表达载体的宿主细胞。

本发明提供了产生抗PD-L1抗体或其功能性片段的方法，其包括：在允许产生所述抗体或其功能性片段的条件下培养本发明的上述宿主细胞，以及回收因此产生的所述抗体或其功能性片段。

在另一方面，本发明涉及包含与治疗剂缀合的本发明抗体或其功能性片段的免疫缀合物。所述治疗剂优选地为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。

本发明还涉及包含本发明抗体或其功能性片段以及可药用载体的药物组合物。

在另一方面，本发明提供了用于通过消除、抑制或降低PD-L1活性来预防或治疗疾病或病症的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明抗体或其功能性片段，核酸，表达载体，宿主细胞，免疫缀合物或药物组合物。

本发明还提供了本发明的抗体或其功能性片段、核酸、表达载体、宿主细胞、免疫缀合物或药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。

提供了以下实施例以证明并进一步解释本发明的一些优选的实施方式和方面，不应被解释为限制其范围。

实施例1.克隆人PD-L1胞外结构区入真核表达质粒

从义翘神州购买含有人PD-L1基因cDNA序列的质粒HG10084-M,利用正向引物5’-GTACGCTAGCCACCATGAGGATATTTGCTGTC-3’(SEQ ID NO:50)，反向引物5’-GATCCTCGAGCGTGAGTCCTTTCATTTGG-3’(SEQ ID NO:51)，PCR扩增人PD-L1胞外片段(核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示)。扩增片段经NheI和XhoI双酶切后，克隆到自主构建的真核表达质粒系统(pSec CAGA2 ECD，在pCDNA3.1质粒的基础上改造得到，如图1A所示)，以此质粒通过PEI转染293E细胞，6天后，收集培养基上清液，通过亲和层析纯化得到人PD-L1胞外区蛋白。结果如图1B所示，人PD-L1胞外区蛋白大小在SDS-PAGE经考马斯亮蓝染色后显示75K道尔顿左右。

实施例2.ELISA检测人PD-L1重组蛋白与人PD-1的结合

2.1生物素标记人PD-L1重组蛋白

将人PD-L1重组蛋白(即实施例1获得的人PD-L1胞外区蛋白)与溶解于DMSO中的生物素-NHS以1：10的摩尔比按比例混合，4摄氏度放置2小时，将反应混合物通过10kD的超滤柱以分离生物素标记的人PD-L1和游离的生物素。

2.2ELISA检测生物素标记人PD-L1与PD-1的结合

为检验人PD-L1与PD-1的结合能力，在96孔酶标板上，铺板2μg/ml的PD-1在包被缓冲液中，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次。然后加入含有2％牛奶的PBS溶液封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗3次后加入100μl不同浓度的生物素标记的人PD-L1，室温孵育1小时后用洗涤缓冲液冲洗3次，用洗涤缓冲液以1比10000倍稀释HRP-链霉亲和素，室温孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗3次后，加入50μl TMB底物溶液显色，室温反应8分钟后，以100μl 2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。

结果如图2所示，表明生物素标记的人PD-L1重组蛋白能特异性地与PD-1结合。

实施例3.细胞水平检测PD-L1与PD-1的结合

3.1构建293F人PD-1稳转细胞株

将构建的带嘌呤霉素筛选体系的PD-1全长序列的真核表达质粒通过PEI转染至293F贴壁细胞中。转染24h后，通过嘌呤霉素(2μg/ml)进行筛选，直至形成293F PD-1稳转细胞库。同时通过有限稀释法，按每孔0.8个细胞，铺96孔板，15天后，挑选出293F PD-1单克隆，并进行传代，形成293F PD-1稳转细胞株。

3.2生物素标记的人PD-L1与293F PD-1稳转细胞株的结合

将不同浓度生物素标记的人PD-L1重组蛋白(即实施例1获得的人PD-L1胞外区蛋白)和293F PD-1稳转细胞悬液混合，在37摄氏度孵育30分钟。以FACS缓冲液(20mM Tris,100mM NaCl,2mM Ca²⁺,1％FBS,pH 7.4)洗脱3次后，加入链霉亲和素-别藻蓝蛋白(SA-APC，2μg/ml)在室温孵育30分钟。以FACS缓冲液洗脱3次后上细胞流式仪检测。

结果如图3所示，表明生物素标记的PD-L1可以与293F细胞上的PD-1特异性的结合。

实施例4.抗PD-L1鼠源抗体的制备

4.1免疫动物

将实施例1获得的人PD-L1重组蛋白作为抗原与等量免疫佐剂(福氏佐剂)混合，取5只6周大雌性FVB小鼠进行皮下免疫。在初次免疫以后，每周进行一次加强免疫，共进行四次免疫。

4.2细胞融合

在最后一针加强免疫后，取小鼠大腿根处淋巴结，在生理盐水中碾磨后取富含淋巴细胞的悬浮液，按常规电转方法(参见BTX公司电转仪手册)将其与SP2/0细胞融合。将融合细胞在含有HAT的RPMI-1640完全培养基(Sigma)中置于5％CO₂，37℃条件下培养。

实施例5.杂交瘤细胞的筛选实验

在12000株不同单克隆杂交瘤细胞中，通过酶标(Elisa)反应，筛选出950株所分泌的抗体可结合人PD-L1蛋白的克隆。在这950株克隆中，有139株可以结合293F细胞上表达的PD-L1；在这139株克隆胞中，有23株具备抑制生物素标记的人PD-L1与293上PD-1的结合的能力。我们集中在这23株克隆进行后续实验。

将上述获得的23株抗体直接与生物素标记的人PD-L1(10ug/ml)混合，室温孵育30分钟。然后将混合物与293F PD-1稳转细胞株悬液在37摄氏度孵育30分钟，以FACS缓冲液洗涤细胞3次后，加入5μg/ml的SA-APC并孵育30分钟。FACS缓冲液洗涤细胞3次后，通过流式细胞仪检测以验证杂交瘤细胞分泌的抗体是否可以抑制人PD-L1与293F细胞表面的PD-1的结合。

结果如图4所示，结果显示克隆1，2，4，6，16，17，18，21对PD-L1与293F细胞上PD-1的结合有较好的抑制效果。

实施例6.候选抗体的Jurkat荧光素分析

将表达PD-L1的CHO细胞铺到96孔板，每孔细胞量为5×10⁴，37℃，7％CO₂培养过夜，去除细胞上清，每孔中加入40ul抗体稀释液(起始浓度为60ug/ml，3倍浓度梯度稀释)，加入40ul可以持续表达PD-1和NFAT-荧光素酶报告基因的Jurkat报告细胞(购自Promega公司)，总细胞数为1×10⁵细胞，37℃，7％CO₂培养6小时，加入荧光素酶试剂，酶标仪检测发光值。

结果如图5所示，荧光素检测结果显示克隆4，6，16，17,18和21对PD-L1抑制Jurkat细胞中荧光素酶表达的现象有明显的回复作用。

实施例7.候选抗体与人PD-L1重组蛋白的结合常数测定

如表1所示，通过ForteBio仪器测定不同的鼠源抗体与人PD–L1之间的结合常数。结果显示实施例5制备的鼠源抗体4,6,16,17,18和21都能够特异性结合人PD-L1。

表1

样品	4	6	16	17	18	21
							KD(nM)	1.7	0.1	0.5	1.6	2.3	0.9

实施例8.候选抗体可变区序列的获得

考虑杂交瘤细胞表达抗体的表达量、活性、类型等，选择克隆6，16，18，21继续向下进行。培养候选杂交瘤细胞，1000rpm离心收集细胞，并以Trizol提取总RNA。以此为模板，合成第一链cDNA后，以第一链cDNA为后续模板扩增杂交瘤细胞所对应的可变区DNA序列。扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补(Larrick，J.W.等，1990，Scand.J.Immunol.，32，121-128和Coloma，J.J.等，(1991)BioTechniques，11，152-156)。在50μl反应体系中,分别加入cDNA 1μl,10×PCR缓冲液5μl,上游及下游引物各1μl(25pmol),dNTP 1μl,25mmolPL MgCl₂ 1μl,H₂O 39μl,95℃预变性10min,加Taq酶1μl,进入温度循环,进行PCR扩增。反应条件为94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸15s,共32个循环,然后72℃保温10min。

用NCBI Ig-Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/)在种系和重排Ig可变区序列数据库中搜索共有序列。基于Kabat(Wu,T.T及Kabat,E.A.1970J.Exp.Med.,132:211-250)及IMGT系统(Lefranc M.-P.等人，1999Nucleic AcidsResearch,27,209-212)，藉由序列批注及藉由基于因特网的序列分析(http://www.Imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html与http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)鉴定互补决定区(CDR)。

在杂交瘤细胞编码的轻和重链可变区及CDR的氨基酸序列如下表所示(对应序列表所公开的序列)：

将扩增产物测序后，得到候选杂交瘤重链和轻链可变区序列为：

克隆6：

轻链：SEQ ID NO:31；

LCDR1：SEQ ID NO:1；

LCDR2：SEQ ID NO:2；

LCDR3：SEQ ID NO:3；

轻链变体：SEQ ID NO:32；

LCDR1：SEQ ID NO:4；

LCDR2：SEQ ID NO:5；

LCDR3：SEQ ID NO:6；

重链：SEQ ID NO:33；

HCDR1：SEQ ID NO:7；

HCDR2：SEQ ID NO:8；

HCDR3：SEQ ID NO:9。

克隆16：

轻链：SEQ ID NO:34；

LCDR1：SEQ ID NO:10；

LCDR2：SEQ ID NO:11；

LCDR3：SEQ ID NO:12；

重链：SEQ ID NO:35；

HCDR1：SEQ ID NO:13；

HCDR2：SEQ ID NO:14；

HCDR3：SEQ ID NO:15。

克隆18：

轻链：SEQ ID NO:36；

LCDR1：SEQ ID NO:16；

LCDR2：SEQ ID NO:17；

LCDR3：SEQ ID NO:18；

重链：SEQ ID NO:37；

HCDR1：SEQ ID NO:19；

HCDR2：SEQ ID NO:20；

HCDR3：SEQ ID NO:21；

重链变体：SEQ ID NO:38；

HCDR1：SEQ ID NO:22；

HCDR2：SEQ ID NO:23；

HCDR3：SEQ ID NO:24。

克隆21：

轻链：SEQ ID NO:39；

LCDR1：SEQ ID NO:25；

LCDR2：SEQ ID NO:26；

LCDR3：SEQ ID NO:27；

重链：SEQ ID NO:40；

HCDR1：SEQ ID NO:28；

HCDR2：SEQ ID NO:29；

HCDR3：SEQ ID NO:30。

实施例9.构建嵌合抗体表达载体

从人血细胞(北京血液研究所)中克隆重链恒定区Fc片段和轻链k恒定区，连入pCDNA3.1质粒(见Walls MA，Hsiao H和Harris LJ(1993)，Nucleic Acids Research，Vol.21，No.122921-2929)以加以改造。实施例8中所述的克隆6，16，18，21的重链和轻链可变区序列片段由Genscript公司合成，重链经Bspq I酶切，轻链经Bspq I酶切后，连入相对应改造的pCDNA3.1质粒中，并经测序确定正确克隆。后续的实验材料均由此系列质粒转染细胞后，提取获得。

实施例10.Elisa检测嵌合抗体与人PD-L1的结合

96孔酶标板，0.5μg/ml的人PD-L1包被，37摄氏度恒温孵育60分钟。然后弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，加入含有2％BSA的PBS溶液封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗3次后加入梯度稀释的抗体，37摄氏度孵育60分钟后用洗涤缓冲液冲洗3次，然后加入1：10000倍稀释的生物素-抗IgG4抗体，37摄氏度孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗三次后，加入用洗涤缓冲液以1：10000倍稀释的HPR-链霉亲和素，室温孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗3次后，加入100μl TMB底物溶液显色，室温反应30分钟后，以100μl 2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。

由图6结果可知，嵌合抗体24，25可以与PD-L1特异性结合，其EC50分别为7.782ng/mL和9.233ng/mL。

实施例11.嵌合抗体与293F细胞上PD-L1的结合

将表达PD-L1的293F细胞消化后离心重悬到FACS缓冲液中，按细胞量为～2.5×10⁴，体积为50ul加入到1.5ml EP管中，加入50ul不同浓度的嵌合抗体稀释液混匀，室温孵育30min；用FACS缓冲液洗涤细胞两次后加入100ul山羊抗人IgG-PE抗体，避光孵育30min；用FACS缓冲液洗涤两次后进行FACS检测。

结果如图7所示，嵌合抗体24，25可以与293F细胞上的PD-L1特异性结合。其EC₅₀分别为0.09092μg/mL和0.1329μg/mL。

实施例12.嵌合抗体抑制人PD-L1与293F细胞上PD-1的结合

取重组表达的嵌合抗体(10ug/ml)与生物素标记的人PD-L1(即实施例1获得的人PD-L1胞外区蛋白，1ug/ml)混合，室温孵育30分钟。然后将混合物与293F PD-1稳转细胞株(1.5×10⁵细胞)悬液在37摄氏度孵育15分钟，以PBS洗脱3次后，加入5μg/ml的SA-APC并室温孵育30分钟。以PBS洗脱3次后，通过流式细胞仪检测以验证嵌合抗体是否可以抑制人PD-L1与293F细胞表面的PD-1结合。

结果如图8所示，嵌合抗体24和25能特异性抑制人PD-L1与293F细胞表面的PD-1结合。其IC₅₀分别为133.1μg/mL和21.17μg/mL。

实施例13.嵌合抗体的Jurkat荧光素分析

将表达PD-L1的CHO细胞铺到96孔板，每孔细胞量为5×10⁴，37℃，7％CO₂培养过夜，去除细胞上清，每孔中加入40ul抗体稀释液(起始浓度为60ug/ml，3倍浓度梯度稀释)，加入40ul可以持续表达PD-1和NFAT-荧光素酶报告基因的Jurkat报告细胞，总细胞数为1×10⁵细胞，37℃，7％CO₂培养6小时，加入荧光素酶试剂，酶标仪检测发光值。

结果如图9所示，嵌合抗体24和25能特异性抑制人PD-L1与PD-1结合,促进报告基因的表达。其EC₅₀值分别为0.1796μg/mL和0.06166μg/mL。

实施例14.抗体的人源化改造

根据上述获得的杂交瘤细胞分泌的抗体的可变区序列进行人源化改造。简言之，人源化改造过程涉及以下步骤：A、把各杂交瘤细胞分泌的抗体的基因序列与人胚胎系抗体基因序列进行比对，找出同源性高的序列；B、分析考察HLA-DR亲和性，选出亲和力低的人胚胎系框架序列；C、利用计算机模拟技术，应用分子对接分析可变区及其周边的框架氨基酸序列，考察其空间立体结合方式。通过计算静电力，范德华力，亲疏水性和熵值，分析各杂交瘤细胞分泌的抗体基因序列中可与PD-1作用以及维护空间构架的关键氨基酸个体，将其嫁接回已经选择的人胚胎系基因框架，并在此基础上标配出必须保留的框架区氨基酸位点，合成人源化抗体(Pini,A.等,(1998).Design and Use of a Phage Display Library:HUMAN ANTIBODIES WITH 10SUBNANOMOLAR AFFINITY AGAINST A MARKER OFANGIOGENESIS ELUTED FROM A TWO-DIMENSIONAL GEL.,Journal of BiologicalChemistry,273(34):21769-21776)。在此基础上我们得到了以下2个人源化抗体30和38：

人源化抗体30轻链：

SEQ ID NO:42,轻链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO:43,轻链可变区核苷酸序列；

人源化抗体30重链：

SEQ ID NO:44,重链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO:45,重链可变区核苷酸序列。

人源化抗体38轻链：

SEQ ID NO:46,轻链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO:47,轻链可变区核苷酸序列；

人源化抗体38重链：

SEQ ID NO:48,重链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO:49,重链可变区核苷酸序列。

实施例15.Elisa检测人源化抗体与人PD-L1的结合

96孔酶标板上铺板，PD-L1包被，37摄氏度恒温孵育60分钟。然后弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，加入含有2％BSA的PBS溶液封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗3次后100μl每孔加入生物素标记的IgG4抗体，37摄氏度孵育30分钟后用洗涤缓冲液冲洗3次，然后加入不同稀释倍数的人源化抗体，37摄氏度孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗三次后，用洗涤缓冲液以1：10000倍稀释HPR标记的鼠抗人IgG(H+L)，室温孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗3次后，加入100μl TMB底物溶液显色，室温反应30分钟后，以100μl 2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。

结果如图10所示，人源化抗体30和38结合PD-L1的EC₅₀值分别为558pg/mL和837pg/mL。

实施例16.人源化抗体与293F细胞上PD-L1的结合

将表达PD-L1的293F细胞消化后离心重悬到FACS缓冲液中，按细胞量为～2.5×10⁴，体积为50ul加入到1.5ml EP管中，加入50ul不同浓度的抗体(人源化抗体30，38)稀释液混匀，室温孵育30min；用FACS缓冲液洗涤细胞两次后加入100ul山羊抗人IgG-PE抗体，避光孵育30min；用FACS缓冲液洗涤两次后进行FACS检测。

结果如图11所示，人源化抗体30，38可以与293F细胞上的PD-L1特异性结合。EC₅₀值分别为0.2866μg/mL和0.3476μg/mL。

实施例17.人源化抗体抑制人PD-L1与293F细胞上PD-1的结合

取重组表达的人源化抗体(10ug/ml)与生物素标记的人PD-L1(即实施例1获得的人PD-L1胞外区蛋白，1ug/ml)混合，室温孵育30分钟。然后将混合物与293F PD-1稳转细胞株(1.5×10⁵细胞)在37摄氏度孵育15分钟，以PBS洗脱3次后，加入5μg/ml的SA-APC并在4摄氏度孵育15分钟。以PBS洗脱3次后，通过流式细胞仪检测以验证人源化抗体是否可以抑制人PD-L1与293F细胞表面的PD-1结合。

结果如图12所示，人源化抗体30和38能特异性抑制人PD-L1与293F细胞表面的PD-1结合。其IC₅₀值分别为0.6474μg/mL和08887μg/mL。

实施例18.人源化抗体的Jurkat荧光素分析

结果如图13所示，人源化抗体30和38能特异性抑制人PD-L1与PD-1结合,促进报告基因的表达。其EC₅₀值分别为0.07816μg/mL和0.08202μg/mL。

实施例19.Elisa检测比较人源化抗体与人PD-L1的结合

96孔酶标板上铺板，hPD-L1-his包被，37摄氏度恒温孵育90分钟。室温平衡约5分钟，洗板机洗板，300μL/孔*6次，加入含有2％BSA的PBS溶液37度封闭90分钟。洗板机洗板，300μL/孔*6次，100μl每孔加入检品溶液，37摄氏度孵育60分钟后洗板机洗板，300μL/孔*6次，用稀释液以1：5000倍稀释HPR标记的抗人IgG(FC特异性)-过氧化物酶抗体，37摄氏度孵育1小时，洗板机洗板，300μL/孔*6次，加入100μl TMB底物溶液显色，37摄氏度反应30分钟后，以100μl 2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。

结果如图14所示，人源化抗体30结合人PD-L1的EC₅₀值为11.09ng/mL，durvaluma的EC₅₀值为21.56ng/mL，atezolizumab的EC₅₀值为47.13ng/mL。

实施例20.人源化抗体对小鼠肿瘤生长的抑制作用

取15只6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠，右侧腋下注射1×10⁶个(50μL)MC38-B7H1结肠癌细胞，第5-7天可触摸到肿瘤形成后，测量小鼠肿瘤的体积。分成3组,每组5只。组1每只腹腔注射100μL KLH；组2腹腔注射150μg/100μL抗体30；组3腹腔注射150μg/100μL抗体38。每周注射2次，连续注射3周；每周测量3次。按照长×宽²/2计算肿瘤体积。

结果如图15所示，人源化抗体30和38明显抑制MC38-B7H1诱导的肿瘤的生长。

序列表

<110> 上海君实生物医药科技股份有限公司

<120> 抗PD-L1抗体及其应用

<160> 51

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 1

Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

1 5

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 2

Ser Gly Ser

1

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 3

Gln Gln His Tyr Glu Glu Pro Trp Thr

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 4

Gln Asp Val Ser His Gly

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 5

Trp Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 6

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 7

Gly Asp Ser Phe Thr Ser Gly Tyr

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<400> 8

Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Tyr

1 5

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 9

Ala Arg Gly Leu Asn Trp Asp Glu Lys Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 10

Glu Ser Val Glu Phe Tyr Gly Thr Ser Leu

1 5 10

<210> 11

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 11

Ala Ala Ser

1

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 12

Gln Gln Gly Arg His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 13

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Val

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<400> 14

Ile Asn Pro Asn Ile Asp Gly Gly

1 5

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 15

Ala Lys Pro Arg Gly Ser

1 5

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 16

Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Tyr Gln Lys His Ser

1 5 10

<210> 17

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 17

Trp Ala Ser

1

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 18

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 19

Gly Asp Ser Phe Thr Ser Gly Tyr

1 5

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<400> 20

Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 21

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 21

Ala Arg Cys Gly Gly Trp Leu Leu Pro Phe Thr Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 22

Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr

1 5

<210> 23

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<400> 23

Ser Tyr Thr Gly Ser Thr

1 5

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 24

Ala Arg Gln Ala Gly Trp Leu Ile Ser Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 25

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 25

Gln Asn Val Asp Thr Ser

1 5

<210> 26

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 26

Ser Ala Ser

1

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 27

Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 28

Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly Tyr

1 5

<210> 29

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<400> 29

Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr

1 5

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 30

Ala Thr Ser Thr Gly Trp Leu Asp Pro Val Asp Tyr

1 5 10

<210> 31

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区序列

<400> 31

Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Phe Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Arg Gly Lys Asn Asn Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Glu Glu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区序列

<400> 32

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Val Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser His Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 33

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区序列

<400> 33

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Phe Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Phe Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Tyr Tyr Phe Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Leu Asn Trp Asp Glu Lys Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

105

<210> 34

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区序列

<400> 34

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Phe Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Asp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Arg

85 90 95

His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 35

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区序列

<400> 35

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Val Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Ile Asp Gly Gly Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Asn Gly Lys Ala Lys Met Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val His

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ala

<210> 36

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区序列

<400> 36

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Ala Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asn Tyr Gln Lys His Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 37

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区序列

<400> 37

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Phe Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Asn Phe Pro Gly Asn Lys Leu Asp Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Tyr Leu

65 70 75 80

His Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Cys Gly Gly Trp Leu Leu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 38

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区序列

<400> 38

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Leu Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Asp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Gly Ile Ser Ile Thr Arg Asp Pro Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gln Ala Gly Trp Leu Ile Ser Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 39

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区序列

<400> 39

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Arg Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ala Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Ser

20 25 30

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 40

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区序列

<400> 40

Glu Gly Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Phe Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Leu Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Arg Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Thr Ser Thr Gly Trp Leu Asp Pro Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 41

<211> 710

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人PD-L1胞外片段

<400> 41

atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60

gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120

aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180

gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga tgaaggttca gcatagtagc tacagacaga 240

gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag atcacagatg 300

tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt gccgactaca 360

agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga attttggttg 420

tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac cccaaggccg 480

aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc accaccaatt 540

ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac acaacaacta 600

atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat acagctgaat 660

tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 710

<210> 42

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区序列

<400> 42

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Ser

20 25 30

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 43

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区的核苷酸序列

<400> 43

gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gagagccacc 60

atcaactgca aggccagcca gaacgtggac accagcgtgg cctggttcca gcagaagccc 120

ggccagcccc ccaaggccct gatctacagc gccagcttca gatacagcgg cgtgcccgac 180

agattcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcaggcc 240

gaggacgtgg ccgtgtactt ctgccagcag tactacggct accccttcac cttcggccag 300

ggcaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 44

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区序列

<400> 44

Gln Gly Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Leu Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Thr Ser Thr Gly Trp Leu Asp Pro Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 45

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区的核苷酸序列

<400> 45

cagggccagc tgcaggagag cggccccagc ctggtgaagc ccagccagac cctgagcctg 60

acctgcaccg tgagcggcga cagcatcacc agaggctact ggaactggat cagaaagcac 120

cccggcaagg gcctggagta catcggctac atcagctaca ccggcagcac ctacagcaac 180

ctgagcctga agtccagagt gaccatcagc agagacacca gcaagaacca gtactacctg 240

aagctgagca gcgtgaccgc cgccgacacc gccgtgtact actgcgccac cagcaccggc 300

tggctggacc ccgtggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354

<210> 46

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区序列

<400> 46

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Ser

20 25 30

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 47

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区的核苷酸序列

<400> 47

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgca gagccagcca gaacgtggac accagcgtgg cctggttcca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaaggccct gatctacagc gccagcttca gatacagcgg cgtgcccagc 180

agattcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctactt ctgccagcag tactacggct accccttcac cttcggccag 300

ggcaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 48

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区序列

<400> 48

Gln Gly Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Leu Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Thr Ser Thr Gly Trp Leu Asp Pro Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 49

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区的核苷酸序列

<400> 49

cagggccagc tgcaggagag cggccccagc ctggtgaagc ccagccagac cctgagcctg 60

acctgcaccg tgagcggcga cagcatcacc agaggctact ggaactggat cagaaagccc 120

cccggcaagg gcctggagta catcggctac atcagctaca ccggcagcac ctacagcaac 180

ctgagcctga agtccagagt gaccatcagc agagacacca gcaagaacca gtactacctg 240

aagctgagca gcgtgaccgc cgccgacacc gccgtgtact actgcgccac cagcaccggc 300

tggctggacc ccgtggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354

<210> 50

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

gtacgctagc caccatgagg atatttgctg tc 32

<210> 51

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 51

gatcctcgag cgtgagtcct ttcatttgg 29

Claims

1. 一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人PD-L1，其中，

（1）所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQID NO:9所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

（2）所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQID NO:9所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

（3）所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQID NO:12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

（4）所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQID NO:18所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

（5）所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQID NO:18所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

（6）所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQID NO:27所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

2. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 33、35、37、38或40所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO: 31、32、34、36或39所示的轻链可变区。

3. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中：

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 33所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 31所示；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 33所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 32所示；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 35所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 34；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 37所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 36所示；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 38所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 36；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 40所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 39所示。

4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。

5. 一种抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:48所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 46所示的轻链可变区。

6. 如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO: 44所示并且所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示。

7. 如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO: 48所示并且所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示。

8. 编码权利要求1 至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子及其互补序列。

9.如权利要求8所述的核酸分子及其互补序列，其中所述抗体的轻链可变区的编码核酸序列如43或47所示。

10.如权利要求8所述的核酸分子及其互补序列，其中所述抗体的重链可变区编码核酸序列如45或49所示。

11.如权利要求8所述的核酸分子及其互补序列，其中所述抗体的轻链可变区的编码核酸序列如43所示，重链可变区编码核酸序列如45所示；或所述抗体的轻链可变区的编码核酸序列如47所示，重链可变区编码核酸序列如49所示。

12.包含权利要求8-11中任一项所述的核酸分子或其互补序列的表达载体。

13.包含权利要求8-11中任一项所述的核酸分子或其互补序列的宿主细胞。

14. 药物组合物，其包含权利要求1 至7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求8-11中任一项所述的核酸分子、权利要求12的表达载体或权利要求13的宿主细胞，或它们的任意组合，以及可药用的载体。

15. 权利要求1-7的抗体或其抗原结合片段，或权利要求8-11中任一项所述的核酸分子、权利要求12的表达载体或权利要求13的宿主细胞在制备用于治疗T 细胞功能失调性疾病的药物中的用途，及在制备用于增强T 细胞的功能以上调细胞介导的免疫应答的药物中的用途。

16.权利要求15的用途，其中，所述疾病为癌症或炎性疾病。

17.免疫缀合物，其包含与治疗剂偶联的权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

18.权利要求17的免疫缀合物，其中，所述治疗剂为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。