CN109069536A - 通过预先使用修饰的移植物来预防移植物排斥 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在治疗一种或多种受试者中可通过移植治疗的疾病的方法中使用的未修饰的移植物、修饰的移植物和/或CD4拮抗剂(优选CD4抗体)，其中所述方法包括：第一步，向所述受试者中引入修饰的移植物，以及第二步，向所述受试者中引入所述未修饰的移植物，其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰对CD4有损害。本发明还涉及未修饰的移植物、修饰的移植物和/或CD4拮抗剂的各种其他用途。
Description
本发明大体涉及移植物及其移植领域。具体来说，本发明涉及在治疗可通过移植治疗的疾病的方法中使用的修饰的移植物和未修饰的移植物及相关应用。所述方法大体包括向受试者中引入修饰的移植物的步骤，以及第二步，向所述受试者中引入未修饰的移植物。本发明采用了例如在所述修饰移植物中抑制CD4。
在某些方面，本发明涉及实体器官移植物及其移植领域。本发明涉及修饰的移植物，其中引入其之后进行例如实体器官移植。根据本发明，可避免对常规免疫抑制药物的需求。本发明还描述了获得本发明所用的修饰的移植物的方法。在某些方面，本发明涉及在移植实体器官前通过抗人CD4抗体来修饰含有免疫活性活细胞的同种异体移植物。
背景技术
在许多情况下，实体器官移植仍然是许多患有器官功能障碍的患者的唯一治愈性治疗方法。实体器官移植是医学上公认的方法，并实行了大约50年[Sayegh，2004]。K.Landsteiner于1901年研究了血型A、B、O[Landsteiner，1901；Durand&Willis，2010]，然后Alfredo von Castello和Adriano Sturli研究了血型AB[de Castello&Sturli，1902]。Alexis Carrel(1873-1944)在1906年首次进行了动物体内肾脏移植[Carrel&Guthrie，1906]。实体器官移植发展的一个里程碑是1944年Peter Medawar爵士(1915-1987)对皮肤移植过程中的组织相容性和免疫反应进行了研究[Medawar，1944]。Joseph E.Murray分别于1954年和1959年实现了第一次同基因和同种异体人肾移植[Murray等，1976]，并且JeanDausset于1958年检测到造成移植物排斥的HLA抗原[Dausset，1958]。1962年，使用了免疫抑制药物硫唑嘌呤实现了死者的肾移植[Calne等，1962]。在德国，Wilhelm Brosig于1963年完成了第一次(临床上)亲属之间的肾移植[Eigler，2002]。Richard Lillehei于1966年完成了第一次胰腺移植[Kelly等人，1967]，Tom Starzl于1967年首次成功移植了肝脏[Starzl等人，1968；Starzl等人，1982]。同样在1967年，Christiaan N.Barnard(1922-2001)在南非开普敦进行了第一次心脏移植[Barnard等人，1967]，随后Denton A.Cooley于1969年首次进行了心脏和肺移植[Cooley等人，1969]。为了预防移植物排斥，于1983年首次使用了环孢菌素A[Kapturczak，2004]。从1963年的第一次器官移植到2013年，在德国进行了116,650例实体器官移植[Eurotransplant，2015a]。
在2015年1月，需要12,500个实体器官，这比现有器官多[Eurotransplant，2015b]。此外，同种异体实体器官移植可能与严重的并发症有关。由于遗传差异、副作用、毒性、感染而导致的移植物排斥以及由于免疫抑制药物的终身治疗而导致的继发性肿瘤的发展是严重的副作用[Hsu&Katelaris，2009]。此外，还应考虑因等待(匹配)实体器官移植物而对患者造成的心理影响[Schulz&Koch，2005]。
通过常规免疫抑制药物来预防移植物排斥的策略未能区分不同的T细胞克隆，因此不能区分负责移植物排斥和负责维持健康免疫反应(例如，破坏细菌、病毒、肿瘤细胞)的T细胞克隆。通常，使用常规免疫抑制药物会导致对整个免疫系统的抑制，这增加了感染和/或恶性肿瘤发展的可能性[Fricke等人，2012,2014]。
仍然需要研究这样的用于预防在实体器官移植后移植物排斥的替代或改进的治疗方法或程序，既不降低所需的健康免疫反应，又不使用常规免疫抑制药物。
在专利申请WO 2012/072268中描述的在先工作中(已通过整体引用并入本发明)显示，例如，修饰移植物的体外方法包括步骤a)用抗CD4抗体孵育移植物，其中所述孵育进行1分钟至7天，和b)从所述移植物中去除未结合的抗体，所述方法允许预防移植物抗宿主病(GvHD)并由于诱导免疫耐受而同时不降低同种异体造血干细胞移植中的移植物抗肿瘤效应。这种免疫耐受被认为是通过MAX.16H5 IgG1或CD4.16H5.chimIgG4.CD4+分子直接结合抗原呈递细胞(APC)的HLA分子的恒定区以允许T细胞完全活化从而调节CD4+T细胞来实现的[In:Murphy KM，Travers P，Walport M.，由Seidler L,Hauβer-Siller I.(Hrsg)进行英文翻译:Immunologie,7.Edition -Heidelberg,Berlin:Spektrum,Akad.Verl.2008]。通过非耗尽的单克隆抗体来干扰这种结合可通过完全的空间阻断、通过缩短APC和T细胞之间的细胞-细胞接触[参见Harding，2002年]、通过抑制蛋白酪氨酸磷酸化诱导负信号[June等人，1990]或诱导T细胞无反应性[参见Madrenas，1996a；Madrenas，1996b]来抑制这种活化。
CD4是一种主要在T淋巴细胞谱系的细胞上表达的表面糖蛋白，其包括大部分胸腺细胞和一部分外周T细胞[Harrison，1993；Luckheeram等人，2012]。一些非淋巴细胞也表达低水平的CD4[Stewart等人，1986]。在成熟的T细胞上，CD4通过与抗原呈递细胞上表达的MHC II类分子相互作用而实现共识别信号的作用[Harrison，1993]。CD4+T细胞主要构成辅助子集，该辅助子集在对如病毒、细菌、真菌和寄生虫感染而产生T依赖性响应期间调节T细胞和B细胞功能[Jiang&Dong，2013]。在自身免疫疾病的发病过程中，特别是当对自身抗原的耐受遭到破坏时，CD4+T细胞促成炎症反应，尤其会导致组织破坏[Bellone，2005]。这些过程通过募集造血谱系的炎性细胞、产生抗体、炎性细胞因子和介质以及通过激活杀伤细胞来促进[Bellone，2005]。
以前，鼠抗人CD4单克隆抗体MAX.16H5 IgG1用于患有自身免疫性疾病患者或作为抗移植排斥的保护性疗法[Emmrich，1991a；Emmrich，1991b；Reinke，1991]。在人肾移植中，MAX.16H5 IgG1具有有效降低移植物排斥的潜力[Reinke，1991；Reinke，1994；Reinke，1995]。使用MAX.16H5 IgG1不仅导致免疫活性受到抑制，而且在三重转基因小鼠模型中诱导了对破伤风类毒素的耐受[Laub，2000；Laub，2001；Laub，2002；Strauss，1994；Fricke，2014]。文献中提到的科学家促进了这些转基因小鼠的发展[Laub，2000；Laub，2001；Laub，2002；Strauss，1994]。在小鼠CD4缺陷背景下，表达人CD4和HLA-DR17(HLA-DR3的分裂抗原)的CD4/DR3小鼠最初是在德国汉诺威医学院实验动物科学研究所进行孵育[Fricke，2014]。使用这些小鼠，可直接使用抗人CD4抗体，并且可以通过人和鼠CD4分子来区分宿主和供体造血[Fricke，2014；Cooke，1998年；O’Connell，2010年；Liu，2006]。在T细胞活化环境中，与没有先前MAX.16H5 IgG1孵育的对照组相比，MAX.16H5 IgG1预孵育的CD4+T细胞显示出表达较低的IL-2mRNA水平且不激活Lck依赖性信号转导[Fricke，2014]。
将抗体直接应用于人类可能导致对治疗性蛋白质的不希望的免疫反应[deGroot&Scott，2007]。几种小鼠单克隆抗体在许多人类疾病环境中作为治疗方法都显示出了前景，但在某些情况下其由于诱导显著程度的人抗鼠抗体(HAMA)反应而导致失败[Becker，2012]。将抗体直接应用于患者可能会导致严重的过敏反应[de Groot&Scott，2007]。
在以前的工作中，鼠GvHD和肿瘤移植模型显示出可允许直接测试抗人CD4抗体用于长期预防GvHD的用途[Fricke，2014]。然而，有利的是，GvL(“移植物抗白血病”)效应没有降低[Fricke，2014]。在不希望受理论束缚的情况下，可能可以认为该效应是CD4表位特异性的[Fricke，2014]。有利的是，当移植物用MAX.16H5 IgG1进行短期预孵育(2小时)并去除未结合的抗体时，GvHD得到阻止[Fricke，2014]。不需要直接应用抗体[Fricke，2014]。
然而，仍然需要引入移植物的方法，特别是引入未修饰的移植物。而且，仍然需要有效的方法来治疗可通过移植物移植治疗的疾病。通常，仍然需要没有现有技术方法的缺点的、有前景的替代性或改进性的治疗方法。
发明内容
在一个方面，本发明涉及一种在治疗受试者中一种或多种可通过移植治疗的疾病的方法中使用的未修饰的移植物，其中所述方法包括：第一步，向所述受试者中引入修饰的移植物，以及第二步，向所述受试者中引入未修饰的移植物，其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4。
在第二个方面，本发明涉及一种在治疗一种或多种可通过移植治疗的疾病的方法中使用的修饰的移植物，其中所述方法包括：第一步，向所述受试者中引入所述修饰的移植物，以及第二步，向所述受试者中引入未修饰的移植物，其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4。
在第三个方面，本发明涉及一种在治疗一种或多种可通过移植治疗的疾病的方法中使用的CD4拮抗剂，其中所述方法包括：第一步，向所述受试者中引入修饰的移植物，以及第二步，向所述受试者中引入未修饰的移植物，其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4。
在第四个方面，本发明涉及一种未修饰的移植物、修饰的移植物和/或CD4拮抗剂，其用于：i)手术移植方法，ii)诱导移植耐受的方法，其中未修饰的移植物用于诱导对未修饰的移植物的移植耐受，iii)转移一种或多种细胞悬液的方法，特别是从供体到受试者的含有细胞悬液的干细胞，iv)将一种或多种组织从供体转移到受试者的方法，v)将一个或多个部分器官从供体转移到受试者的方法，vi)将一个或多个器官从供体转移到受试者的方法，vii)将造血系统重建细胞从供体转移到受试者的方法，随后可选地将一个或多个器官从所述供体转移到所述受试者中、和/或viii)用于增强受试者中免疫重建的方法，随后可选地将一个或多个器官转移到所述受试者中；其中所述方法包括：第一步，向所述受试者中引入修饰的移植物，以及第二步，向所述受试者中引入未修饰的移植物，其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4。
通常在本发明中的优选实施方式中，所述CD4拮抗剂是CD4抗体。通常在本发明中的优选实施方式中，所述修饰的移植物和所述未修饰的移植物来自HLA相关供体。
附图简要说明
图1示出了从TTG供体小鼠移植皮肤后24小时和50天的Balb/c(TTG)小鼠和野生型Balb/cwt(对照组)小鼠。在Balb/c(TTG)小鼠中未观察到移植物排斥现象。
图2含有对作为供体的C57Bl/6-三重转基因小鼠(TTG)的解释说明。TTG小鼠表达人CD4和HLA-DR，同时敲除了鼠CD4分子。这允许在移植后测定特定的人表面分子并允许在小鼠中直接测试抗人CD4抗体。
图3示出了对本发明实验设计的解释说明。从TTG小鼠中取出骨髓细胞和脾细胞，合并，在含有抗人CD4抗体或无抗体的培养基中孵育2小时，并移植到经致死照射的Balb/cwt小鼠中。将实验结果与使用来自C57Bl/6野生型小鼠的供体细胞获得的结果进行比较。对移植后的治疗效果进行研究。
此外，SEQ ID NO 1-10描述了本发明中使用的特定抗CD4抗体的示例性修饰的重链可变区的DNA和氨基酸序列。
SEQ ID NO 11-20描述了本发明中使用的特定抗CD4抗体的示例性修饰的轻链可变区的DNA和氨基酸序列。
具体实施方式
本发明解决了上述问题并克服了现有技术方法中的上述缺陷。这包括第一份报告，其显示：通过抗人CD4抗体MAX.16H5IgG1离体调节同种异体造血干细胞移植物，然后进行第三方皮肤移植避免了在完整MHC错配移植模型中的皮肤移植物排斥。
在不希望受理论束缚的情况下，本发明人认为，可通过调节CD4T辅助细胞来实现分化或区分负责移植物排斥的T细胞克隆和负责维持健康免疫反应的T细胞克隆。
令人惊讶的是，并与上文所述的先前工作相比，本发明人发现，例如，在MAX.16H5IgG1单次孵育同种异体移植物后，即使当细胞在第三方受体中转移而不重复孵育MAX.16H5IgG1时，GvHD也未被再次诱导。此外，也没有阻止GvL。就本发明人所知，通过保持GvL效应来诱导对GvHD的耐受的这种疗法是令人惊讶的。在不希望受理论束缚的情况下，本发明人认为，免疫作用的维持(例如，免于GvHD)在移植当天受到诱导并通过调节性T细胞来保持是有利的。
其中，本发明人提供了第一份报告，其显示：通过抗人CD4抗体MAX.16H5 IgG1离体调节同种异体造血干细胞移植物，然后进行第三方皮肤移植避免了在完整MHC错配移植模型中的皮肤移植物排斥。
目前用于预防移植物排斥的药物与副作用相关，且不区分不同的T细胞克隆，并因此不区分负责移植物排斥和负责维持健康免疫反应(例如，破坏细菌、病毒、肿瘤细胞)的T细胞克隆[Fricke,2014]。
此外，在鼠干细胞移植和皮肤移植模型中测试了抗人CD4抗体MAX.16H5 IgG1。将来自人CD4+C57Bl/6小鼠的离体修饰的移植物(参见图2)移植到Balb/cwt小鼠中。119天后，将来自人CD4+C57Bl/6小鼠的第三方皮肤移植到这些受体小鼠中。在接受MAX.16H5IgG1短期(2小时)预孵育移植物的受体中，这些皮肤移植物的存活率显著增加(参见图1)。不必将抗体直接应用于受体。抗人CD4抗体MAX.16H5IgG1在实体皮肤移植物的存活方面上是长期有效的。通过针对实体器官短期预孵育抗体而无需常规免疫抑制药物所观察到的诱导免疫耐受的性质是有利的且令人惊讶的。
这些发现被认为：例如，使同种异体器官移植更安全，且避免了因遗传差异而引起的移植物排斥，减少了副作用、毒性和感染以及减少了由于免疫抑制药物终生治疗而导致的继发性肿瘤发展的概率。
在本专利申请中，本发明人可，例如，表明先前使用修饰的移植物适合于实现对未修饰的移植物的耐受，例如，在实体器官移植中(参见图3)。
因此，本发明的方法是在以下方面有用：例如，i)用于降低供体移植物排斥，以及第三方或其他方的器官的器官排斥的可能性；ii)用于在移植的免疫活性细胞内实现对第三方或其他方器官的耐受；iii)用于在受体组织内实现对第三方或其他方器官的耐受或部分耐受；和/或iv)用于沉默针对第三方或其他方器官的细胞活化。
通过针对实体器官短期预孵育抗体而无需常规免疫抑制药物所观察到的诱导免疫耐受是有利的。这些发现被认为：例如，使同种异体器官移植更安全，避免了因遗传差异而引起的移植物排斥，及减少了副作用、毒性和感染，以及减少了继发性肿瘤的发展的概率，因为免疫抑制药物的终生治疗可能不是必要的。
在某些实施方式中，本发明用抗体对含有免疫细胞的细胞移植物进行体外处理，从而避免将它们直接应用于体内。详细来说，例如，本发明可使用短期孵育(干细胞)移植物(比如，含有T细胞的细胞悬液，特别是CD4+细胞)来达到诱导耐受或免疫抑制的目的。在不希望受理论束缚的情况下，可以认为，例如，对包含CD4阳性(免疫)细胞的(干细胞)移植物用抗CD4抗体孵育且随后去除未结合的抗体(优选仅去除未结合的抗体)从而产生修饰的移植物，其中抗体标记的细胞未被激活，特别是在一旦遇到特异性抗原时不被激活。优选地，在修饰的移植物中的该抗体标记的细胞是无反应性细胞。因此，例如，GvHD未被启动。
在不希望受理论束缚的情况下，可设想到，例如，CD4拮抗剂(比如，抗CD4抗体)可(例如，通过与它们结合)抑制携带CD4的免疫细胞(比如，淋巴细胞)，从而发挥其有益作用。而且，如技术人员容易明白的是，实质上减少或避免施用游离CD4拮抗剂(比如，抗CD4抗体，即不与位于移植物上的抗原结合的抗CD4抗体)是有利的。
在任何情况下，都认为CD4可通过任何其他方式进行拮抗。这种抑制CD4的替代方式是本领域技术人员熟知且易于应用的。CD4拮抗剂已得到充分研究，且本领域技术人员可知晓和获得许多选择-以及例如，将在本发明下面对其进行进一步说明。
通常，实施本发明被认为涉及以下一个或多个优点：i)不需要将CD4拮抗剂(比如，抗CD4抗体)直接应用于移植物受体上；ii)适当使用短期孵育的移植物，比如，含有T细胞(特别是CD4+细胞)的细胞悬液、组织和器官；iii)预防GvHD；iv)在移植本发明的移植物后预防其他免疫并发症(例如，细胞因子释放综合征)；v)由于避免使用常规免疫抑制药物来进行治疗，或与全身应用相比减少剂量和显著减少抗体量，因此降低成本；vi)接受(a)根据本发明所述的移植物的患者的存活率得到改善；vii)促进了移植物移植到患者体内，所述患者由于预期的免疫并发症而无法移植常规移植物到体内，比如，老年患者；viii)移植来自HLA错配供体的移植物或来自在不使用本发明时不太好的HLA匹配供体的移植物；ix)维持GvL效应；和/或x)促进移植物重复移植到受试者体内。
通常，本发明涉及如权利要求和下文所定义的主题。
即在第一个方面，本发明涉及一种在治疗受试者中一种或多种可通过移植治疗的疾病的方法中使用的未修饰的移植物，其中所述方法包括：第一步，向所述受试者中引入修饰的移植物，以及第二步，向所述受试者中引入所述未修饰的移植物，其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4(或分别涉及CD4抑制)。
在第二个方面，本发明涉及一种在治疗一种或多种可通过移植治疗的疾病的方法中使用的修饰的移植物，其中所述方法包括：第一步，向所述受试者中引入所述修饰的移植物，以及第二步，向所述受试者中引入未修饰的移植物，其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4(或分别涉及CD4抑制)。
在第三个方面，本发明涉及一种在治疗一种或多种可通过移植治疗的疾病的方法中使用的CD4拮抗剂，优选为抗CD4抗体；其中所述方法包括：第一步，向所述受试者中引入修饰的移植物，以及第二步，向所述受试者中引入未修饰的移植物，其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4(或分别涉及CD4抑制)。
优选地，所述修饰涉及使用所述CD4拮抗剂。优选地，所述修饰受所述CD4拮抗剂的影响。
通常在本发明中，所述受试者也可指受体。在本发明中，优选地，所述受试者是动物，尤其是哺乳动物，特别是人。
同样，在本发明中，优选地，所述供体(移植物从中分离出和/或衍生)是动物，尤其是哺乳动物，特别是人。通常在本发明中，所述修饰的和未修饰的移植物可来自相同供体或不同供体。关于供体的优选实施方式在本发明其他地方进行阐明。
优选地，所述一种或多种可通过移植治疗的疾病选自急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)、骨髓增生异常综合征(MDS)/骨髓增生综合征、恶性淋巴瘤(特别选自霍奇金淋巴瘤(Morbus Hodgkin)、高级非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、低恶性NHL、慢性淋巴性白血病(CLL)、多发性骨髓瘤)、严重的再生障碍性贫血、地中海贫血症、镰状细胞性贫血、免疫缺陷(特别选自严重联合免疫缺陷(SCID)、维-奥(Wiskott-Aldrich)综合征(WAS)和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH))、先天性新陈代谢异常(特别选自溶酶体贮积症和过氧化物酶体功能紊乱)、自身免疫性疾病、风湿病或任何上述疾病的复发症。
更优选地，所述一种或多种疾病是一种或多种血液系统恶性肿瘤，特别选自急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)、骨髓增生异常综合征(MDS)/骨髓增生综合征、恶性淋巴瘤(特别选自霍奇金淋巴瘤(Morbus Hodgkin)、高级非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、低恶性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴性白血病(CLL)、多发性骨髓瘤)、严重的再生障碍性贫血、地中海贫血症以及镰状细胞性贫血。
在本发明的某些实施方式中，所述可通过移植治疗的疾病是任何需要移植的病症。
在本发明的某些优选实施方式中，所述可通过移植治疗的疾病是涉及器官功能障碍的疾病。因此，所述疾病可能，例如，需要移植来替换不能按预期发挥功能的器官。
在本发明的某些实施方式中，所述可通过移植治疗的疾病是移植排斥，例如器官排斥。其他实例是GvHD和供体移植物排斥。即，在后一种情况下，根据本发明，先前移植的移植物(比如，器官)可被另一种移植物(比如，器官)替换。
通常在本发明中，所述一种或多种可通过移植治疗的疾病还包括上述任何一种疾病的复发症以及本发明提及的任何疾病的组合。
如本发明所用的“含有免疫细胞的细胞移植物”实质上是指包含免疫细胞的移植物。通常，含有免疫细胞的细胞移植物没有特别限制，同时特定实施方式对应于下文所述的那些，例如，在修饰的移植物的上下文中。
通常，移植物以及含有免疫细胞的细胞移植物是本领域技术人员公知的。在移植中使用包括含有免疫细胞的细胞移植物的移植物也是本领域熟知的。根据本发明，所述移植物可包含细胞悬液、组织和/或器官。优选地，所述移植物是细胞悬液、组织和/或器官。更优选地，所述移植物选自细胞悬液、组织或器官。通常在本发明中，移植物也可以是移植物的组合，比如，上面提到的一种或多种移植物的组合，例如，器官和细胞悬液的组合。在另一个优选实施方式中，所述移植物不是人工移植物。在优选实施方式中，应了解，移植物以及含有免疫细胞的细胞移植物旨在用于体内治疗目的，特别是旨在用于治疗涉及器官功能障碍的疾病。所述疾病可能，例如，需要移植来替换不能按预期发挥功能的器官。因此，在另一个优选实施方式中，移植物以及含有免疫细胞的细胞移植物不包括旨在和/或仅用于动物模型中的机理研究且不旨在治疗疾病的细胞和包含细胞的组合物。
在本发明优选实施方式中，所述每种移植物均选自细胞悬液、组织或器官。因此，在本发明中，所述修饰的移植物可选自细胞悬液、组织或器官。因此，在本发明中，所述未修饰的移植物可选自细胞悬液、组织或器官。在特定实施方式中，所述修饰的移植物是细胞悬液，且所述移植物是细胞悬液。在特定实施方式中，所述修饰的移植物是细胞悬液，且所述移植物是组织。在特定实施方式中，所述修饰的移植物是细胞悬液，且所述移植物是器官。
在一些特定实施方式中，所述移植物不包括非衍生自和/或重编自成体干细胞的胚胎干细胞。因而，在一些特定实施方式中，任何包含在所述移植物中的胚胎干细胞都是衍生自和/或重编自成体干细胞的胚胎干细胞。在一些特定实施方式中，所述移植物不由全能胚胎干细胞组成或不包含全能胚胎干细胞。在本发明某些实施方式中，所述移植物不由胚胎干细胞组成或不包含胚胎干细胞。在本发明特定实施方式中，所述移植物不包含衍生自人胚胎的胚胎干细胞。
如本发明使用的未修饰的移植物是如本领域技术人员所熟知的常规移植物。特别地，本领域技术人员将容易理解，这种未修饰的移植物未被修饰为本发明所述的修饰的移植物，即不包含本发明对修饰的移植物的修饰。因此，该未修饰的移植物可描述为未通过使用CD4拮抗剂进行修饰。因此，该未修饰的移植物可描述为不包含CD4拮抗剂(比如，抗CD4抗体)。因此，该未修饰的移植物可描述为不包含抑制CD4的修饰。本发明将在下面描述未修饰的移植物的优选特定实施方式。
例如，本发明有利地使用了修饰的移植物。通常，本发明中使用的修饰的移植物可如本领域所熟知的用于未修饰的移植物，例如，在将其引入(例如，移植)受试者的方面上。
如本发明使用的修饰的移植物是已被修饰的移植物(优选被人工修饰的移植物)，例如，通过如本发明所述的方法进行修饰，优选通过本发明所述的体外方法，优选通过使用CD4拮抗剂。因而，可以说所述修饰涉及使用CD4拮抗剂。同样，可以说所述修饰会受CD4拮抗剂的影响。本发明的修饰的移植物可在本发明的使用之前或在本发明的使用过程中进行修饰。
通常在本发明中，所述修饰的移植物的修饰抑制CD4。因而，所述修饰的移植物优选地描述为包含抑制CD4的修饰。因此，可以说本发明所述的修饰的移植物已被/被修饰以抑制CD4。
通常，本发明中提及的抑制可能不仅指绝对抑制，还包括部分抑制。本领域技术人员可容易地确定足够的抑制程度。例如，抑制程度的特定实施方式对应于本发明其他各处所述的修饰移植物的实施方式(例如，包括与结合移植物的抗体相关的百分比值)。优选抑制的特定优选程度实现了本发明公开的至少一种有利效果。
如本发明使用的“修饰的移植物，其中所述修饰抑制CD4”(“......涉及CD4抑制”，或其他类似和/或等同术语)优选是指修饰的移植物，其中CD4的表达和/或功能，优选功能，被抑制(或受损)。抑制CD4的方法是本领域技术人员已知的，且没有特别限制。其涉及使用(或分别受其影响)任何CD4拮抗剂，特别是本发明所述的CD4的任何拮抗剂。因此，在本发明的任何方面，可使用CD4拮抗剂(或例如，也使用CD4拮抗剂的混合物)。
在本发明的某些实施方式中，如本领域技术人员容易理解的，术语“其中所述修饰抑制CD4”和类似术语被术语“其中所述修饰通过CD4来抑制细胞功能”代替。在优选实施方式中，术语“其中所述修饰抑制CD4”和类似术语被术语“其中所述修饰抑制或损害CD4下游的细胞功能，特别是通过结合和/或募集”所替代。可通过CD4抑制的细胞功能是本领域技术人员容易知道的，特别是鉴于其对CD4及CD4在细胞中的作用模式的了解而知道的。在本发明中的某些实施方式中，至少一种该类细胞功能被抑制。
同样，在本发明中的某些实施方式中，术语“其中所述修饰涉及CD4抑制”和类似术语被术语“其中所述修饰涉及CD4介导的功能抑制”代替。在优选实施方式中，术语“其中所述修饰涉及CD4抑制”和类似术语被术语“其中所述修饰涉及功能抑制或损害”代替。在另一个优选实施方式中，术语“其中所述修饰涉及CD4抑制”和类似术语被术语“其中所述修饰涉及CD4介导的功能抑制或损害”代替。
通常，在本发明的上下文中使用的CD4拮抗剂的非限制性实施方式包括调节CD4表达和/或功能的CD4拮抗剂。因此，在某些实施方式中，本发明中的CD4拮抗剂可调节，特别是可抑制，CD4的表达。因此，在某些实施方式中，本发明中的CD4拮抗剂可调节，特别是可抑制，CD4的功能(尤其是通过与其结合)。因此，本发明的CD4拮抗剂可以是CD4配体。通常，CD4拮抗剂(例如，CD4抑制剂或CD4配体)分别是本领域已知的。许多CD4拮抗剂，特别是与CD4结合的CD4配体是可商购的。
CD4拮抗剂在现有技术中众所周知。非限制性实例包括本发明所述的那些。通常在本发明中，所述CD4拮抗剂(例如，所述CD4抑制剂或CD4配体)分别可以是细胞外或细胞内的药剂(比如，配体)。通常在本发明中，且特别地在第三方面，所述CD4抑制可直接或间接由所述CD4拮抗剂引起。
在本发明的优选实施方式中，所述CD4拮抗剂与CD4结合。
在本发明的特别优选实施方式中，所述CD4拮抗剂是抗CD4抗体。抗CD4抗体在现有技术中众所周知。许多抗CD4抗体是可商购的。
抗体以及抗CD4抗体是本领域熟知的。如本发明使用的，通过“抗体”尤其是指能够与抗原特异性结合、相互作用或以其他方式关联的免疫球蛋白家族中的蛋白质，其中抗体与抗原之间的所述结合、相互作用或以其他方式关联(比如，结合)是由互补决定区(CDR)来介导的。类似地，术语“抗原”在本发明中用于指能够与所述抗体特异性结合、相互作用或以其他方式关联的物质。在本发明的抗CD4抗体的上下文中，抗原意指CD4，特别是人CD4。如本发明使用的术语“CDR”是指抗体的“互补决定区”，即指免疫球蛋白可变结构域内有助于确定抗体特异性的高变区中的一个。CDR是本领域技术人员公知的。通常，重链免疫球蛋白可变结构域和轻链免疫球蛋白可变结构域都含有三个CDR。在本发明的上下文中，术语“抗体”被认为还涉及抗体片段，所述抗体片段包括，例如，Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段。这些片段可通过标准方法来制备[例如；Coligan等人，1991-1997，通过引用并入本文]。本发明还涉及本领域熟知的各种重组形式的抗体衍生的分子种类。这些种类包括含有单链Fv形式(例如，ScFv)的稳定的Fv片段或通过链间二硫键连接稳定的Fv(dsFv)，所述单链Fv形式包含连接VH和VL结构域的肽接头，所述dsFv含有额外的半胱氨酸残基，其被改造以促进VH和VL结构域的连接。同样地，其他组合物在本领域中是常见的并可包括被称为“微型抗体”的种类；以及单可变域“dAbs”。其他种类仍然可包含用于增加修饰的抗体V区结构域的化合价的手段，即具有多个抗原结合位点的种类，例如该手段通过改造二聚化结构域(例如“亮氨酸拉链”)或化学修饰策略来实现。此外，术语“抗体”还涉及scFv的多聚体，比如，双抗体、三抗体或四抗体、tandabs、柔性抗体(flexibodies)、双特异性抗体和嵌合抗体，这些都是本领域已知的。如本发明使用的抗体被认为还包括任何二价或多价抗体。它们还包括技术人员已知的任何抗体衍生物和任何其他衍生物。在一些实施方式中，所述抗体是多克隆抗体。在优选实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。“抗体”的其他实施方式可参考WO 2012/072268。
根据本发明所述，术语“抗CD4抗体”是指具有结合CD4能力的抗体。优选地，在本发明中，抗CD4抗体是抗人CD4抗体。“CD4”或“分化簇4”是指蛋白质，更确切地说是指表面糖蛋白，这是本领域技术人员公知的[参见以上，还参见Bowers等人，1997]。在本发明的上下文中，CD4还可指全长CD4的片段，或CD4的其他修饰形式，条件是在本发明的抗体的上下文中该片段或其他修饰形式仍然起到抗原的作用。
可根据本发明使用的抗CD4抗体的特定优选实例在本发明其他地方已有描述。
CD4拮抗剂的非限制性(其他)实例是肽配体(包括天然存在的肽配体和肽构建体)。
某些其他实施方式包括适体。在另一个实施方式中，CD4拮抗剂是环(CNSNQIC)。在另一个实施方式中，CD4拮抗剂是4,4’-二异硫氰基-2,2’-二氢芪二磺酸。
通常，在本发明的优选实施方式中，所述修饰的移植物包含CD4拮抗剂。
在本发明的其他方面，其涉及第一、第二和第三个方面，所述方法包括向所述受试者中引入未修饰的移植物的步骤，其中之前已向所述受试者中引入修饰的移植物，其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4。在优选实施方式中，所述方法包括向所述受试者中引入未修饰的移植物的步骤，其中之前已向所述受试者中引入修饰的移植物，其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4。通常，这些相关方面的优选实施方式对应于本发明所述的相应方面的实施方式。
在本发明的第四个方面，本发明涉及一种未修饰的移植物、修饰的移植物和/或抗CD4抗体，其用于以下任何一种或多种方法，所述方法包括：i)手术移植方法，ii)诱导移植耐受的方法，其中修饰的移植物用于诱导对未修饰的移植物的移植耐受，iii)转移一种或多种细胞悬液的方法，特别是从供体到受试者的含有细胞悬液的干细胞，iv)将一种或多种组织从供体转移到受试者的方法，v)将一个或多个部分器官从供体转移到受试者的方法，vi)将一个或多个器官从供体转移到受试者的方法，vii)将造血系统重建细胞从供体转移到受试者的方法，随后可选地将一个或多个器官从所述供体转移到所述受试者中，和viii)用于增强受试者中免疫重建的方法，随后可选地将一个或多个器官转移到所述受试者中。
通常，上述方法优选包括：第一步，向所述受试者中引入修饰的移植物，以及第二步，向所述受试者中引入未修饰的移植物，其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4(或分别涉及CD4抑制)。
可选地，在关于所述第四个方面的其他变例中，所述方法包括向所述受试者中引入未修饰的移植物的步骤，其中之前已向所述受试者中引入修饰的移植物，其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4(或分别涉及CD4抑制)。后一方面的优选实施方式对应于第四个方面的实施方式。
详细来讲，在一个特定实施方式中，第四个方面涉及一种在手术移植方法中使用的未修饰的移植物、修饰的移植物和/或抗CD4抗体。
在一个特定实施方式中，第四个方面涉及一种在诱导移植耐受的方法中使用的未修饰的移植物、修饰的移植物和/或抗CD4抗体，其中修饰的移植物用于诱导对未修饰的移植物的移植耐受。
在一个特定实施方式中，第四个方面涉及一种在转移一种或多种细胞悬液的方法(特别是从供体到受试者的含有细胞悬液的干细胞)中使用的未修饰的移植物、修饰的移植物和/或抗CD4抗体。
在一个特定实施方式中，第四个方面涉及一种在将一种或多种组织从供体转移到受试者的方法中使用的未修饰的移植物、修饰的移植物和/或抗CD4抗体。
在一个特定实施方式中，第四个方面涉及一种在将一个或多个部分器官从供体转移到受试者的方法中使用的未修饰的移植物、修饰的移植物和/或抗CD4抗体。
在一个特定实施方式中，第四个方面涉及一种在将一个或多个器官从供体转移到受试者的方法中使用的未修饰的移植物、修饰的移植物和/或抗CD4抗体。
在一个特定实施方式中，第四个方面涉及一种在将造血系统重建细胞从供体转移到受试者的方法中使用的未修饰的移植物、修饰的移植物和/或抗CD4抗体，所述方法随后可选地将一个或多个器官从所述供体转移到所述受试者中。
在一个特定实施方式中，第四个方面涉及一种在用于增强受试者中免疫重建的方法中使用的未修饰的移植物、修饰的移植物和/或抗CD4抗体，所述方法随后可选地将一个或多个器官转移到所述受试者中。
在某些实施方式中，第四个方面涉及一种在任一种所述方法中使用的未修饰的移植物。在某些实施方式中，第四个方面涉及一种在任一种所述方法中使用的修饰的移植物。在某些实施方式中，第四个方面涉及一种在任一种所述方法中使用的抗CD4抗体。
通常在本发明中，第四个方面的实施方式(以及与其相关的所述变例)对应于本发明所述的其他方面的实施方式。
通常在本发明中，在本发明第一、第二、第三或第四个方面的实施方式中，在记载在含有所述方法的上下文中的所述第二步之前，执行记载在含有各个方法的上下文中的所述第一步。
在本发明第一、第二、第三或第四个方面的特定实施方式中，在所述第二步之前的30分钟至50年，特别是在第二步之前的一个小时至10年(比如，至9、8、7、6、5、4、3或2年)，比如，在所述第二步之前的一天至1年(比如，至11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个月)，进行所述第一步。在某些实施方式中，在所述第二步之前的一个小时至两个月，进行所述第一步。在某些实施方式中，在所述第二步之前的至少一个小时，特别是在所述第二步之前的至少三周，进行所述第一步。
在特定实施方式中，在所述第二步之前的至少一个小时，特别是在所述第二步之前的至少一天、至少一个月、至少一年，进行所述第一步。在本发明特定实施方式中，在所述第二步之前的至少12个小时，特别是在所述第二步之前的至少一天、至少一周、至少三周、至少六个月，进行所述第一步。
在特定实施方式中，在所述第二步之前的最多30年，特别是在所述第二步之前的最多10年、最多1年、最多1个月，进行所述第一步。在特定实施方式中，在所述第二步之前的最多20年，特别是在所述第二步之前的最多5年、最多2年、最多6个月、最多12周，进行所述第一步。
类似地，在本发明其他相关方面中，其中本发明所述方法被定义为包括向所述受试者中引入未修饰的移植物的步骤，其中之前已向所述受试者中引入修饰的移植物，所述之前引入的时间已在上面优选地进一步详细定义。优选地，本发明的所述方法被定义为包括向所述受试者中引入未修饰的移植物的步骤，其中之前已向所述受试者中引入修饰的移植物，所述之前引入的时间已在上面优选地进一步详细定义。
通常，在本发明第一、第二、第三或第四个方面的优选实施方式中，所述修饰的移植物包含干细胞。
在本发明的优选实施方式中，所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，所述移植物被CD4拮抗剂修饰，特别地，其中所述修饰抑制CD4。
通常，在本发明的优选实施方式中，所述修饰的移植物，特别地，含有免疫细胞的细胞移植物，包含CD4拮抗剂。
在本发明特定优选实施方式中，所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，所述细胞移植物包含与其CD4表位结合的抗CD4抗体。
在本发明某些优选实施方式中，所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，所述细胞移植物包含与其CD4表位的40％至100％结合的抗CD4抗体。这种移植物优选地可通过本发明公开的体外方法获得。
优选地，所述含有免疫细胞的修饰的细胞移植物包含与所述移植物的可接近CD4表位的50％至100％，特别地60％至100％，特别地70％至100％，更特别地80％至100％、更特别地90％至100％、更特别地95％至100％、更特别地99％至100％结合的抗CD4抗体。最优选地，含有免疫细胞的细胞移植物的基本所有可接近的CD4表位都与抗CD4抗体结合。
在本发明特定实施方式中，所述修饰的移植物通过或可通过体外方法获得，所述体外方法包括步骤a)用抗CD4抗体来孵育含有免疫细胞的细胞移植物，且可选地包括步骤b)从所述移植物中去除未结合的抗体。
在一个优选实施方式中，所述修饰的移植物通过或可通过体外方法获得，所述体外方法包括步骤a)用抗CD4抗体来孵育含有免疫细胞的细胞移植物，且可选地包括步骤b)从所述移植物中去除未结合的抗体，从而减少所述移植物中未结合抗体的量。在一个更优选实施方式中，所述移植物中未结合抗体的量至少减少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或减少100％。
在一个优选实施方式中，所述修饰的移植物通过或可通过体外方法获得，所述体外方法包括步骤a)用抗CD4抗体来孵育含有免疫细胞的细胞移植物，且可选地包括步骤b)通过洗涤所述修饰的移植物至少一次或至少2次(比如，2、3、4、5或6次)，以从所述移植物中除去未结合的抗体。通过洗涤所述修饰的移植物，减少了所述移植物中未结合抗体的量。在一个更优选实施方式中，所述移植物中未结合抗体的量至少减少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或减少100％。合适的洗涤液是本领域技术人员已知的，并包括缓冲盐溶液。
在优选实施方式中，应了解，在洗涤步骤中，一定量的CD4阳性免疫细胞可能会非特异性地丢失或去除。在又一个优选实施方式中，所述修饰的移植物含有免疫细胞，特别是与抗CD4抗体结合的CD4阳性免疫细胞，比如，CD4+-T细胞。在更优选实施方式中，孵育之前所述修饰的移植物含有包含免疫细胞的细胞移植物中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的CD4阳性免疫细胞。
在另一个优选实施方式中，所述修饰的移植物分别通过或可通过体外方法获得，所述体外方法包括步骤a)用抗CD4抗体来孵育含有免疫细胞的细胞移植物，且可选地包括步骤b)从所述移植物中仅去除未结合的抗体。因此，所述含有免疫细胞的修饰的细胞移植物可根据本发明所述的体外方法来获得。
如本发明所用的“体外方法”是指在活体外进行的方法。它还特别包括“离体方法”，例如在移植物包含或是组织或器官的情况下，但特别排除在活体内进行的“体内方法”。
如本发明使用的“未结合的抗体”是指在孵育步骤后不与移植物结合的抗体。换言之，它是指与移植物上的配体基本上不结合的抗体。
用于本发明的所述体外方法可以是修饰含有免疫细胞的细胞移植物的方法，所述方法包括步骤a)用抗CD4抗体来孵育含有免疫细胞的细胞移植物，特别是其中所述孵育进行1分钟至7天，b)从所述移植物中去除未结合的抗体。优选地，所述体外方法的步骤a)中的所述孵育进行1分钟至1天。
在一个优选实施方式中，用于本发明的所述体外方法可以是修饰含有免疫细胞的细胞移植物的方法，所述方法包括步骤a)用抗CD4抗体来孵育含有免疫细胞的细胞移植物，特别是其中所述孵育进行1分钟至7天，b)从所述移植物中去除未结合的抗体，从而减少所述移植物中未结合抗体的量。在一个更优选实施方式中，所述移植物中未结合抗体的量至少减少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或减少100％。优选地，所述体外方法的步骤a)中的所述孵育进行1分钟至1天。
在另一个优选实施方式中，用于本发明的所述体外方法可以是修饰含有免疫细胞的细胞移植物的方法，所述方法包括步骤a)用抗CD4抗体来孵育含有免疫细胞的细胞移植物，特别是其中所述孵育进行1分钟至7天，b)通过洗涤修饰的移植物至少1次或至少2次(比如，2、3、4、5或6次)来从所述移植物中去除未结合的抗体。通过洗涤所述修饰的移植物，减少了所述移植物中未结合抗体的量。在一个更优选实施方式中，所述移植物中未结合抗体的量至少减少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或减少100％。优选地，所述体外方法的步骤a)中的所述孵育进行1分钟至1天。
在优选实施方式中，应了解，在洗涤步骤中，一定量的CD4阳性免疫细胞可能会非特异性地丢失或去除。在又一个优选实施方式中，通过本方法获得的所述修饰的移植物含有免疫细胞，特别是与抗CD4抗体结合的CD4阳性免疫细胞，比如，CD4+-T细胞。在更优选实施方式中，孵育之前所述修饰的移植物含有包含免疫细胞的细胞移植物中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的CD4阳性免疫细胞。
在另一个优选实施方式中，用于本发明的所述体外方法可以是修饰含有免疫细胞的细胞移植物的方法，所述方法包括步骤a)用抗CD4抗体来孵育含有免疫细胞的细胞移植物，特别是其中所述孵育进行1分钟至7天，b)从所述移植物中仅去除未结合的抗体。优选地，所述体外方法的步骤a)中的所述孵育进行1分钟至1天。
通常，所述体外方法的优选实施方式可参考WO 2012/072268，并可通过引用整体并入本发明。
在本发明使用的所述体外方法的步骤a)中，所述孵育(步骤)优选进行一段时间来足以使所述抗体与所述移植物结合。优选地，所述孵育进行一段时间来足以使抗CD4抗体与所述移植物的可接近CD4表位的40％至100％、特别地50％至100％、特别地60％至100％、特别地70％至100％、更特别地80％至100％、更特别地90％至100％、更特别地95％至100％、更特别地99％至100％结合。更优选地，在所述孵育之后，抗CD4抗体与所述移植物中基本所有可接近的CD4表位结合。在优选实施方式中，应了解，不移除或基本上不移除所述移植物中可接近的CD4表位或CD4阳性免疫细胞(或携带CD4抗原的免疫细胞)。因此，在其他优选实施方式中，不会从未修饰的移植物中消耗或基本上不消耗携带CD4抗原的免疫细胞，和/或通过或可通过体外方法获得的修饰的移植物包含或基本上包含携带未修饰移植物的CD4抗原的免疫细胞。
本领域技术人员可以容易地确定合适的孵育时间。通常，适当的孵育时间取决于所用移植物的类型。优选的孵育时间也可取决于所用抗体的量。通常，当所述移植物是例如细胞悬液时，其所需的孵育时间比所述移植物是例如器官时短。通常，当所述移植物包含或是组织或器官时，优选较长的孵育时间以使所述抗体可被输送-例如，通过扩散-进相应的腔室内。
此外，在任何情况下，本领域技术人员可根据本领域熟知的方法容易地检测抗CD4抗体的结合(状态)，所述方法可涉及，例如流式细胞术。
在某些实施方式中，所述体外方法的步骤a)中的所述孵育进行1分钟至7天。优选地，所述体外方法的步骤a)中的所述孵育进行1分钟至1天。
通常，相对于较长的孵育时间，本发明优选较短的孵育时间，以尽量减少由于体外处理对移植物造成的任何可能的损害。
特别地，所述孵育可进行1至150分钟，特别地5分钟至150分钟，更特别地10分钟至150分钟、更特别地30分钟至150分钟、更特别地40分钟至120分钟、更特别地45分钟至90分钟，尤其地50分钟至70分钟。
在可选实施方式中，所述孵育可进行150分钟至7天，特别地150分钟至5天，更特别地150分钟至3天、更特别地150分钟至1天，尤其地150分钟至8小时。在其他优选实施方式中，孵育可进行1分钟至1天。
至于根据例如本发明使用的体外方法的步骤b)中所述的“去除”未结合的(抗CD4)抗体，进行所述步骤的各种方式是本领域技术人员已知的。从移植物中去除未结合的抗体的一种示例性方法是洗涤移植物。例如，洗涤可通过使用离心来进行，其中所述移植物包含或是细胞悬液。在一个优选实施方式中，通过洗涤移植物来减少所述移植物中未结合抗体的量。在一个更优选实施方式中，所述移植物中未结合抗体的量至少减少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或减少100％。优选地，根据例如本发明使用的体外方法中的步骤b)，仅去除未结合的(抗CD4)抗体。在去除未结合的抗体期间，特别是洗涤期间，一些CD4阳性免疫细胞可能会非特异性地丢失。在优选实施方式中，孵育之前所述修饰的移植物含有包含免疫细胞的细胞移植物中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的CD4阳性免疫细胞。
在所述步骤中，从所述移植物中去除优选地至少40％，更特别地至少50％，更特别地至少60％，更特别地至少70％，更特别地至少80％，更特别地至少90％的未结合的(抗CD4)抗体。优选地，从所述移植物中去除高达100％的未结合的(抗CD4)抗体。
在上述孵育步骤中使用的抗体量没有特别限制。适当的量可由本领域技术人员容易地进行确定，并可取决于例如使用的移植物的类型。优选地，根据本发明，使用0.1μg至100mg的抗体量来进行所述孵育。在优选的量中，优选地，根据本发明，特别是在所述移植物是细胞悬液的情况下，向所述受试者，特别是人受试者，施用2x106至2x1010个有核细胞，特别地4x106至1x109个有核细胞，更特别地1x107至1x108个有核细胞。因此，在又一个实施方式中，使用0.1μg/1x109个有核细胞至100mg/2x106个有核细胞，更优选地0.1μg/1x109个有核细胞至100mg/2x107个有核细胞的抗体量来进行所述孵育。
在特定实施方式中，用0.1μg/ml至10mg/ml的抗体量来进行所述体外方法的步骤a)中的所述孵育。
在某些实施方式中，特别是在所述移植物是细胞悬液时，使用0.1μg/ml细胞悬液至150μg/ml细胞悬液的抗体浓度来进行所述孵育，特别地7μg/ml细胞悬液至100μg/ml细胞悬液，更特别地30μg/ml细胞悬液至100μg/ml细胞悬液，尤其地40μg/ml至60μg/ml细胞悬液的抗体浓度来进行所述孵育。
在一些实施方式中，特别是在所述移植物是组织或所述移植物是器官时，使用0.1mg至10mg，特别地1mg至10mg，更特别地2mg至9mg、更特别地3mg至8mg，尤其地4mg至6mg的抗体量来进行所述孵育。
在一些实施方式中，特别是在所述移植物是组织或所述移植物是器官时，使用孵育液中0.1mg/ml至10mg/ml，特别地1mg/ml至10mg/ml，更特别地2mg/ml至9mg/ml、更特别地3mg/ml至8mg/ml，尤其地4mg/ml至6mg/ml的抗体浓度来进行所述孵育。优选地，指定的体积包括所述组织或器官的体积以及(含抗体)溶液的体积，在该溶液中所述组织或器官被孵育。
在一些实施方式中，特别是在所述移植物是组织或所述移植物是器官时，通过在具有10μg/ml至150μg/ml，特别地20μg/ml至100μg/ml，更特别地30μg/ml至100μg/ml，尤其地40μg/ml至60μg/ml抗体浓度的溶液中孵育所述组织或器官来进行所述孵育。优选地，指定的体积包括所述组织或器官的体积以及(含抗体)溶液的体积，在该溶液中所述组织或器官被孵育。
当使用CD4拮抗剂(例如，含抗CD4抗体的溶液)来孵育组织和/或器官时，本领域技术人员优选容易进行这样的孵育，例如，通过合适的容器。
在任何情况下，选择适量的CD4拮抗剂(比如，抗CD4抗体)完全在本领域技术人员的专业知识范围内。通常，在移植物包含或是组织或器官的情况下，优选较高量或浓度的拮抗剂(例如，抗体)。此外，使用的拮抗剂(例如，抗体)的精确量或浓度的选择也取决于这种组织或器官的大小。
在下文中，描述了用于本发明的修饰的移植物的其他特定实施方式：
在本发明的一些优选实施方式中，所述修饰的移植物包含干细胞。包含干细胞的移植物在本发明中还可称作干细胞移植物。
根据本发明，所述修饰的移植物可包含携带CD4抗原的细胞。优选地，所述修饰的移植物包含免疫细胞，特别是携带CD4抗原的免疫细胞。这类细胞是本领域技术人员公知的。在某些优选实施方式中，这些免疫细胞是CD4阳性T淋巴细胞或其前体细胞。在某些优选实施方式中，这些免疫细胞包括但不限于T辅助细胞和属于单核细胞和巨噬细胞谱系的细胞，比如，单核细胞和巨噬细胞。这种细胞的另一个实例是小胶质细胞。
在一些实施方式中，所述修饰的移植物包含且优选是组织，特别是含有干细胞的组织。根据本发明，合适的组织包括但不限于血液、肌肉、脂肪组织、结缔组织、上皮、胚胎和细胞组织。
在一些实施方式中，所述修饰的移植物包含且优选是器官，优选是含有干细胞的器官。合适的器官包括但不限于皮肤、肠、肾和肝。优选地，所述器官是肠。
在优选实施方式中，所述修饰的移植物包含且优选是细胞悬液，优选是含有干细胞的细胞悬液。合适的细胞悬液和获得它们的方法是本领域技术人员公知的。例如，可通过穿刺含有骨髓的骨头来获得细胞悬液移植物，例如，髂嵴或胸骨穿刺或从遍布全体的干细胞壁龛取出，例如，脂肪组织、牙根、头发根和上面提及的任何其他来源。
在优选实施方式中，所述修饰的移植物，特别是细胞悬液，特别是含有干细胞的细胞悬液，包含T细胞、单核细胞和巨噬细胞。在另一个优选实施方式中，所述修饰的移植物，特别是细胞悬液，包含T细胞和非免疫细胞，比如，干细胞。在另一个优选实施方式中，含有干细胞的组织、含有干细胞的器官或含有干细胞的细胞悬液包含免疫细胞，更优选地携带CD4抗原的免疫细胞，特别是CD4阳性T淋巴细胞或其前体细胞。
在另一个优选实施方式中，所述移植物或细胞移植物(比如，含有干细胞的组织、含有干细胞的器官或含有干细胞的细胞悬液)，包含携带CD4抗原的免疫细胞，特别是CD4阳性T淋巴细胞或其前体细胞。
在某些优选实施方式中，所述移植物，特别是细胞悬液，包含任何骨髓干细胞、外周血干细胞、脐带血干细胞、骨髓成体干细胞(比如，NA-BMCs)，胚胎干细胞(尤其衍生自和/或重编自成体干细胞)，以及任何多能干细胞，其中，后者包括诱导的多能细胞，比如，衍生自和/或重编自成体干细胞的细胞(即包括多能胚胎干细胞)。
在优选实施方式中，所述修饰的移植物是骨髓悬液，特别地包含骨髓干细胞。通常，所述修饰的移植物，特别是骨髓悬液，可另外包含血细胞、脐带血细胞、供体淋巴细胞、外周血干细胞、骨髓成体干细胞、胚胎干细胞(尤其衍生自和/或重编自成体干细胞)和任何多能干细胞中包含的任何干细胞，其中，后者包括诱导的多能细胞，比如，衍生自和/或重编自成体干细胞的细胞(即包括多能胚胎干细胞)。
所述修饰的移植物，特别是骨髓悬液，可另外包含血细胞、脐带血细胞、供体淋巴细胞、外周血干细胞和/或骨髓成体干细胞中包含的任何干细胞。
通常，细胞悬液还包括任何包含(任何组合的)干细胞的细胞悬液，可选地还包括任何(组合的)其他细胞。
在本发明的优选实施方式中，所述修饰的移植物选自含有T细胞和单核细胞/巨噬细胞的细胞悬液，所述细胞悬液包含骨髓细胞、非粘附骨髓细胞、外周血细胞和/或脐带血细胞；包含淋巴细胞、单核细胞和/或巨噬细胞的细胞悬液；含有干细胞的组织；含有干细胞的器官；含有免疫细胞的组织；以及含有免疫细胞的器官。
本发明所述未修饰的移植物的其他实施方式对应于上述修饰的移植物的其他特定实施方式。
通常在本发明中，所述移植物中(例如，所述修饰的移植物中)含有的细胞的量不受特别限制。本领域技术人员将能够容易地选择适当量的移植物和移植物的细胞用于移植。此外，还可获得合适的指南，例如来自“Deutsche”开发的特定移植指南，例如，用于将人造血干细胞移植入患者。
在本发明优选实施方式中，所述修饰的移植物是细胞悬液，且相应的所述方法(或用途，分别地)包括向所述受试者施用2x106至2x1015个有核细胞，其中，本领域技术人员可以容易地选择优选量。示例性的优选范围包括1x107至1x1014个有核细胞、1x107至1x1014个有核细胞、1x108至1x1013个有核细胞、1x109至1x1012个有核细胞、1x1010至1x1011个有核细胞、1x106至1x108个有核细胞、1x107至1x109个有核细胞、1x108至1x1010个有核细胞、1x109至1x1011个有核细胞、1x1010至1x1012个有核细胞、1x1011至1x1013个有核细胞、1x1012至1x1014个有核细胞，以及1x1013至1x1015个有核细胞。
本发明所述未修饰的移植物的其他实施方式对应于上述修饰的移植物的所述优选实施方式。
当本发明使用的所述移植物包含或是组织或器官时，可向所述受试者施用任何合适量的所述组织或器官。如本领域技术人员所理解的，组织或器官中的细胞数量难以确定。特别是由于这个原因，对移植物中含有的细胞量没有特别限制。本领域技术人员可以容易地确定或选择适当的量，例如，考虑到待治疗的特定类型的受试者、移植物和/或疾病。在移植物是器官的情况下，优选施用整个器官。
在本发明第一、第二、第三或第四个方面的优选实施方式中，相应的所述方法i)意味着在所述未修饰的移植物内对受体组织的耐受或部分耐受；和/或ii)意味着在受体组织内对所述未修饰的移植物的耐受或部分耐受；和/或iii)意味着在移植未修饰的移植物时降低GvHD、供体移植物排斥或器官排斥中任一种发展的可能性。
因此，在本发明一些实施方式中，相应的所述方法意味着在所述未修饰的移植物内对受体组织的耐受或部分耐受。因此，在本发明一些实施方式中，相应的所述方法意味着在受体组织内对所述未修饰的移植物的耐受或部分耐受。因此，在本发明一些实施方式中，相应的所述方法意味着在移植未修饰的移植物时降低GvHD、供体移植物排斥或器官排斥中任一种发展的可能性。
在本发明一些实施方式中，使用所述修饰的移植物意味着在移植所述移植物时降低GvHD、供体移植物排斥或器官排斥中任一种发展的可能性，特别是降低GvHD发展的可能性。在其他实施方式中，所述用途意味着移植所述修饰的移植物时在移植的免疫活性细胞内对受体组织的耐受。在其他实施方式中，所述用途意味着在移植所述修饰的移植物时对所述修饰的移植物的耐受。在其他实施方式中，所述使用意味着移植所述修饰的移植物时在受体组织内对所述修饰的移植物的耐受或部分耐受。在其他实施方式中，所述用途用于在所述移植物内沉默细胞活化。在优选实施方式中，所述用途用于在所述移植物内降低CD4阳性免疫细胞的活化能力。在优选实施方式中，所述用途用于在所述移植物内获得CD4阳性免疫细胞的无反应性。在优选实施方式中，所述用途意味着/用于任何上述的组合。
在本发明一些优选实施方式中，使用所述修饰的移植物导致在移植所述移植物时降低GvHD、供体移植物排斥或器官排斥中任一种发展的可能性，特别是降低GvHD发展的可能性。在其他优选实施方式中，所述用途导致在移植所述修饰的移植物时移植的免疫活性细胞对受体组织的耐受。在其他优选实施方式中，所述用途导致在移植所述修饰的移植物时对所述修饰的移植物的耐受。在其他优选实施方式中，所述用途导致在移植所述修饰的移植物时受体组织对所述修饰的移植物的耐受或部分耐受。在其他优选实施方式中，所述用途用于在所述移植物内防止细胞活化或降低细胞的活化能力。在优选实施方式中，所述用途用于在所述移植物内降低CD4阳性免疫细胞的活化能力。在优选实施方式中，所述用途用于在所述移植物内获得CD4阳性免疫细胞的无反应性。在优选实施方式中，所述用途意味着/用于任何上述的组合。
在本发明中，通常，所述受试者(或受体，分别)相对于供体可以是同种异体的或异种的。
如本领域技术人员容易理解的，当受体和相应的供体是相同种属的独立个体时，它们被称为同种异体的，而当受体和相应的供体来自不同种属时，它们被称为异种的。
因此，在本发明某些优选实施方式中，所述受试者对于所述未修饰的移植物的供体和所述修饰的移植物的供体是同种异体的。在本发明其他实施方式中，所述受试者对于所述未修饰的移植物的供体和所述修饰的移植物的供体是异种的。
类似地，在本发明中，通常，供体相对于彼此可以是同种异体的或异种的。
如本领域技术人员容易理解的，当供体是相同种属的独立个体时，它们被称为同种异体的，而当供体来自不同种属时，它们被称为异种的。
因此，在本发明某些实施方式中，所述修饰的移植物的供体相对于所述未修饰的移植物的供体是异种的。在本发明某些优选实施方式中，所述修饰的移植物的供体相对于所述未修饰的移植物的供体是同种异体的。
在本发明中，对所述修饰的移植物和未修饰的移植物的供体与受体之间的性质和关系没有特别限制。因而，在某些非限制性实例中，且例如当供体和受体是小鼠时，供体可包含相对于受体的完全HLA错配。因而，在某些优选非限制性实例中，且例如当供体和受体是小鼠时，供体可具有相对于受体的完全HLA错配。
在其他非限制性实例中，供体可以，例如，对受体来说是单倍同一性的(比如，在父母和婴儿之间移植)，并可以，例如，是HLA部分匹配的家庭成员、父母、兄弟姐妹或受体的子女。
在任何情况下，在本发明中优选供体和受体(或受试者，分别)是HLA相关的。
同样，在本发明中，对所述修饰的移植物和未修饰的移植物的供体之间的性质和关系没有特别限制。因而，在某些非限制性实例中，供体可包含，优选地具有相对于彼此的完全HLA错配。在其他非限制性实例中，一个供体可以，例如，对其他供体来说是单倍同一性的，并可以，例如，是HLA部分匹配的家庭成员、父母、兄弟姐妹或其他供体的子女。
在任何情况下，在本发明中优选的是，所述修饰的移植物和未修饰的移植物来自HLA相关的供体。因此，在本发明的上下文中，各个供体优选地是HLA相关的(即，彼此HLA相关的)。
如本发明使用的术语“HLA相关供体”优选理解为指包含且优选具有不超过50％的HLA错配的供体。在优选实施方式中，所述供体包含且优选具有不超过40％的HLA错配，优选地不超过30％的HLA错配，优选地不超过20％的HLA错配，优选地不超过10％的HLA错配，优选地无HLA错配。
类似地，当给定的供体和受体包含且优选具有不超过50％的HLA错配时，将其称为“HLA相关的”。在优选实施方式中，给定供体和受体包含且优选具有不超过40％的HLA错配，优选地不超过30％的HLA错配，优选地不超过20％的HLA错配，优选地不超过10％的HLA错配，优选地无HLA错配。
因此，且特别是在人的情况下，术语“HLA相关的”优选理解为指存在不超过50％的HLA错配，优选地不超过40％的HLA错配，优选地不超过30％的HLA错配，优选地不超过20％的HLA错配，优选地不超过10％的HLA错配，优选地无HLA错配。
因此，且特别是在人的情况下，术语“HLA相关的”优选理解为指存在不超过6个HLA错配，优选地不超过5个的HLA错配，优选地不超过4个的HLA错配，优选地不超过3个的HLA错配，优选地不超过2个的HLA错配，优选地不超过1个HLA错配，优选地无HLA错配。
在某些优选实施方式中，在人的情况下，所述百分比和/或错配的数量是相对于HLA基因座HLA-A、-B、C-、-DR、-DQ和-DP(对应于总共12个HLA基因座)确定的。在其他优选实施方式中，所述错配是相对于HLA基因座HLA-A、-B、C-、-DR和-DQ(对应于总共10个HLA基因座)确定的。在其他优选实施方式中，所述错配是相对于HLA基因座HLA-A、-B、C-和-DR(对应于总共8个HLA基因座)确定的。
通常在本发明中，用于确定HLA错配的方法不受特别限制，且对本领域技术人员来说是容易获得且显而易见的。
此外，如本领域技术人员容易理解的，在术语“HLA相关的”的上述定义中，HLA基因座可被相应的适当基因座取代，其中对非人供体和受体彼此进行比较。所述基因座是本领域技术人员容易知道的。
此外，本发明进一步设想的是其中修饰的移植物(例如，没有遗传操作或在遗传操作后)相对于未修饰的移植物是HLA相关的情况，反之亦然。因而，在本发明某些优选实施方式中，所述修饰的移植物和未修饰的移植物是“HLA相关的”，其中“HLA相关的”的特定实施方式对应于上述任何实施方式。此外，本发明进一步设想的是其中修饰的移植物和/或未修饰的移植物(例如，没有遗传操作或在遗传操作后)相对于受体是HLA相关的情况。因而，在本发明某些优选实施方式中，所述修饰的移植物相对于受体是HLA相关的。因而，在本发明某些优选实施方式中，所述未修饰的移植物相对于受体是HLA相关的。另外，“HLA相关的”特定实施方式对应于任何上述实施方式。
因此，本领域技术人员还将理解，如果各供体不是HLA相关的，则修饰的和未修饰的移植物可以是HLA相关的，且如果各供体和受体不是HLA相关的，则给定的修饰的移植物和/或未修饰的移植物相对于受体可以是HLA相关的。此外，本领域技术人员还将理解，如果供体是异种的，则(移植物或)供体也可以是HLA相关的，且如果供体和受体是异种，则(修饰的和未修饰的移植物或)给定的供体和受体也可以是HLA相关的。
对于后者，例如，(一个)供体(或移植物，分别)可进行遗传操作以实现一个或多个HLA匹配或进一步的HLA匹配。因此，在某些优选实施方式中，相对于受体的供体(或修饰的移植物和未修饰的移植物的供体，分别)例如在供体细胞的遗传操作之后，优选包含，优选具有不超过6个HLA错配，例如在供体细胞的遗传操作之后，优选包含，优选具有不超过3个HLA错配，例如在供体细胞的遗传操作之后，优选包含，优选具有不超过2个HLA错配，例如在供体细胞的遗传操作之后，优选包含，更优选具有不超过1个HLA错配，例如在供体细胞的遗传操作之后，优选不包含，更优选不具有HLA错配。后一上下文中的其他实施方式对应于如上所述的那些实施方式。
同样如上所述，在本发明中，所述修饰的移植物和未修饰的移植物优选来自HLA相关的供体，换言之，所述修饰的移植物的供体和所述未修饰的移植物的供体优选地是HLA相关的。
HLA相关供体的非限制性特定实例包括组织型匹配供体和相关双胞胎。因而，在某些实施方式中，所述HLA相关供体是组织型匹配供体(比如，组织HLA型匹配供体)。因此，在某些实施方式中，所述修饰的移植物和未修饰的移植物来自组织型匹配供体。在某些实施方式中，所述HLA相关供体是相关双胞胎，特别是同卵双胞胎。因此，在某些实施方式中，所述修饰的移植物和未修饰的移植物来自相关双胞胎，特别是来自同卵双胞胎。
通常，在特定优选实施方式中，所述修饰的和未修饰的移植物来自同一供体。因此，在优选实施方式中，所述HLA相关供体可以是一个且相同供体。因而，本发明使用的术语HLA相关供体实际上可以指一个(特定)供体。因而，在特定优选实施方式中，所述HLA相关供体是一个特定供体。因而，在本发明某些优选实施方式中，所述修饰的移植物和未修饰的移植物均来自同一供体。
在本发明优选实施方式中，所述抗CD4抗体i)选自Max16H5、OKT4A、OKTcdr4a、cMT-412或YHB.46，特别是其中所述抗CD4抗体是Max16H5；或ii)是抗体30F16H5；或iii)可从保藏号为ECACC 88050502的细胞系获得；或iv)可从2011年12月2日保藏于DSMZ的细胞系MAX.16H5/30F16H5获得；或v)是抗体16H5.chimIgG4；或vi)可从2011年12月2日保藏于DSMZ的细胞系CD4.16H5.chimIgG4获得；或vii)是包含抗体16H5.chimIgG4的VH和VK的抗体；或viii)是包含如下抗体的VH和VK的抗体：可从2011年12月2日保藏于DSMZ的细胞系CD4.16H5.chimIgG4获得的抗体；或ix)是包含选自SEQ ID NO：1-10的VH和选自SEQ ID NO：11-20的VK的任意组合的抗体，特别是其中所述组合选自VH1/VK1、VH2/VK2、VH4/VK2和VH4/VK4，尤其是其中所述组合是VH2/VK2，或x)是选自根据以上i)至ix)所述的抗体的抗体混合物。
因此，根据本发明所述使用的优选抗CD4抗体选自Max16H5、OKT4A、OKTcdr4a、cMT-412或YHB.46。特定优选的抗CD4抗体是Max16H5。产生Max16H5的细胞已保藏于ECACC(European Collection of Cell Cultures)，保藏号为ECACC 88050502。所述抗体还公开在DE 3919294中，其通过引用并入本发明。如本发明使用的抗体“Max16H5”也可称为“Max.16H5”、“MAX16H5”或“MAX.16H5”，或也称为“30F16H5”(其中后者的名称也是产生所述抗体的保藏细胞的名称)。Max.16H5也可从细胞系MAX.16H5/30F16H5获得(参见保藏号DSMACC3148)。用于本发明的另一种特定优选抗CD4抗体是16H5.chimIgG4。如本发明使用的所述抗体也可称为“16H5.chim”，或称为“CD4.16H5.chimIgG4”(其中后者的名称也是产生所述抗体的保藏细胞的名称)。16H5.chimIgG4可从细胞系CD4.16H5.chimIgG4获得(参见保藏号DSM ACC3147)。
详细来说，用于本发明的某些优选的抗CD4例如可从以下任何生物材料保藏物中获得：i)保藏于欧洲细胞培养物中心的保藏号为ECACC 88050502的保藏物(例如，在申请DE3919294中对其也有描述)；ii)2011年12月2日保藏于DSMZ的保藏物“MAX.16H5/30F16H5”、保藏号为DSM ACC3148；iii)2011年12月2日保藏于DSMZ的保藏物“CD4.16H5.chimIgG4”、保藏号为DSM ACC3147。所有这些保藏物分别涉及细胞或细胞系，从中可获得本发明上下文中的特定抗CD4抗体。
本发明还涉及本发明公开的实施方式的替代实施方式，其中术语“ECACC88050502”由“MAX.16H5/30F16H5”代替。同样，本发明还涉及一些实施方式，其中本发明使用的术语“细胞系ECACC 88050502”或等同术语由术语“细胞系MAX.16H5/30F16H5”或等同术语代替。本发明还涉及本发明公开的实施方式的替代实施方式，其中术语“ECACC88050502”由“CD4.16H5.chimIgG4”代替。同样，本发明还涉及一些实施方式，其中本发明使用的术语“细胞系ECACC 88050502”或等同术语由术语“细胞系CD4.16H5.chimIgG4”或等同术语代替。
在本发明的其他实施方式中，可使用的特定抗CD4抗体(包括修饰的抗体等)对应于专利申请WO2012/072268中描述的抗CD4抗体(特别参见其中描述的“其他方面”)，该文件通过引用整体并入本发明。这也特别适用于根据WO2012/072268第42页及以后公开的第1-33项的实施方式。
同样，获得/制备可用于本发明实施方式中的其他抗CD4抗体的特定方法(其实施方式)对应于WO2012/072268以及其中公开的参考文献中描述的方法。同样，评估可用于本发明实施方式中的抗CD4抗体的特定方法(其实施方式)(包括例如，测定抗体亲和力的方法)对应于WO2012/072268以及其中公开的参考文献中描述的方法。
在本发明中，术语“VH”通常是指抗体重链的重链可变区。“重链可变区”也称为“重链免疫球蛋白可变区”。这些术语在本领域也是公知的。术语“VL”通常是指抗体轻链的轻链可变区。“轻链可变区”也称为“轻链免疫球蛋白可变区”。这些术语在本领域也是公知的。VH优选是指长度为约110至125个氨基酸残基的多肽。类似地，VL优选是指长度为约95至130个氨基酸残基的多肽。
在本发明优选实施方式中，在引入所述受试者之前，另外使用可溶性生物活性分子来孵育所述未修饰的移植物和/或修饰的移植物。因此，在本发明优选实施方式中，在引入所述受试者之前，另外使用可溶性生物活性分子来孵育所述未修饰的移植物。因此，在本发明优选实施方式中，在引入所述受试者之前，另外使用可溶性生物活性分子来孵育所述修饰的移植物。
在每种情况下，特别地，这种生物活性分子是促进免疫抑制、免疫耐受和/或调节性T细胞形成的药剂。优选地，在每种情况下，这种生物活性分子是促进免疫抑制、免疫耐受和/或调节性T细胞的(有利的)形成和/或(有利的)活化的药剂。
优选的示例性药剂选自IL-2、TGF-β、雷帕霉素、视黄酸、4-1BB配体和抗CD28抗体或其任何组合的药剂。
通常，用于本发明的移植物可任选地与任何药物或药物组合一起施用于受试者。这均适用于修饰的和未修饰的移植物。
所述药物可在移植之前、同时和/或之后施用。合适的施用方式和途径不受特别限制，并且本领域技术人员可容易地进行选择。优选地，这些药物分别支持本发明上述方法、用途、修饰的移植物或修饰的移植物的特征或优点，比如，降低GvHD、供体移植物排斥和器官排斥中任一种的可能性。此类药物的非限制性实例包括雷帕霉素和视黄酸。
在本发明优选实施方式中，所述修饰的移植物用于i)实现所述修饰的移植物对所述受体组织的耐受或部分耐受；和/或ii)实现所述受体组织对所述修饰的移植物的耐受或部分耐受；和/或iii)在移植所述修饰的移植物时降低GvHD、供体移植物排斥和器官排斥中任一种的可能性。
在本发明优选实施方式中，所述修饰的移植物用于i)实现所述未修饰的移植物对所述受体组织的耐受或部分耐受；和/或ii)实现所述受体组织对所述未修饰的移植物的耐受或部分耐受；和/或iii)在移植所述未修饰的移植物时降低GvHD、供体移植物排斥和器官排斥中任一种的可能性。
在另一个方面，本发明的特征在于根据本发明所述的用途来治疗需要这种治疗的受试者的方法。在优选实施方式中，所述移植物、受试者、方法和/或疾病都如本发明上文所述。
在另一个方面，本发明的特征在于，在制备用于在受试者中治疗一种或多种可通过移植治疗的疾病的药物中使用的和/或用于本发明所述任何(医药)用途的一种未修饰的移植物、修饰的移植物和/或抗CD4抗体。在优选实施方式中，所述用途如本发明上文所述被进一步定义。因此，在优选实施方式中，所述移植物、受试者、方法和/或疾病都如本发明上文所述。
在又一个方面，用于本发明的移植物(特别是修饰的移植物)可包含或可不包含干细胞。即，根据后一方面，含有免疫细胞的细胞移植物可被任何移植物取代，并且包括含有干细胞的移植物以及不含干细胞的移植物。换句话说，本发明的移植物或根据本发明使用的移植物可以是任何移植物或可以是含有免疫细胞的细胞移植物。再换句话说，在某些实施方式中，根据本发明使用的移植物包含干细胞，而在其他实施方式中，根据本发明使用的移植物不包含干细胞。在某些实施方式中，所述移植物不包含分离的CD4+细胞。在某些实施方式中，所述移植物不包含纯化的D0.11.10CD4+T细胞。
通常，本发明各种方面的其他实施方式对应于WO2012/072268中描述的实施方式。
通常，与本发明的(次要)方面有关的其他机械的、实验的和理论的特征，也可参考WO2012/072268。
通常，本发明还涉及一些实施方式，其中术语“包含”或其等同术语由“具有(has)”或其等同术语代替。例如，本发明通常还涉及一些实施方式，其中术语“包含”或其等同术语由“具有(having)”或其等同术语代替。
在下文中，通过实施例进一步说明本发明，这些实施例不旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1：
动物和实验设计
供体三重转基因小鼠(人CD4+/+、鼠CD4-/-、HLA-DR3+/+)TTG-C57Bl/6繁殖于莱比锡大学动物中心[Fricke，2014；Schmidt，2015年]。受体Balb/cwt小鼠购自Charles River(德国苏尔茨费尔德；http://jaxmice.jax.org)[Fricke，2014；Schmidt，2015]。所有小鼠均在标准化条件下饲养[Fricke，2014；Schmidt，2015]。在转基因小鼠中，CD4转基因包括其自身的启动子，该启动子与鼠CD4增强子元件连接，从而导致T细胞亚群特异性表达[Fricke，2014；Schmidt，2015]。鼠CD8+细胞不受影响[Fricke，2014；Schmidt，2015]。除鼠MHC II复合物外，转基因小鼠还表达HLA-DR3分子[Fricke，2014；Schmidt，2015]。TTG-C57Bl/6小鼠具有完整的功能性鼠免疫系统[Fricke，2014；Schmidt，2015]。对小鼠进行随意喂养[Fricke，2014；Schmidt，2015]。根据莱比锡大学动物护理委员会的指导对所有小鼠进行安置、处理(treated)或处理(handled)，并获得莱比锡动物护理区域委员会的批准[Fricke，2014；Schmidt，2015]。
在移植到Balb/cwt前，用MAX.16H5IgG1或对照抗体将来自供体TTG-C57BI/6的同种异体造血干细胞移植物孵育2小时[Fricke，2014；Schmidt，2015]。每天测定存活率和GvHD发生率，每周测定植入、血液学(WBC亚群)和免疫重建(鼠CD4、人CD4、鼠CD8、HLA-DR3和H2Kb)[Fricke，2014；Schmidt，2015]。
辐照方案
对于小鼠的辐照，如前所述，调整X射线装置(D3225，Orthovoltage，GulmayMedical，坎伯利，英国)用于动物辐照[Fricke，2009]。在移植受体小鼠之前进行辐照。
骨髓细胞、脾细胞的制备和抗体孵育
作为同种型对照，使用来自LEAFTM纯化的小鼠IgG1的抗体(κ，同种型对照抗体，圣地亚哥，加利福尼亚州92121)[Fricke，2014]。如前所述，使用MAX.16H5IgG1抗体[Fricke，2014]。如其他地方所述，制备骨髓细胞(BM)和脾细胞[Fricke，2009；Fricke，2010；Fricke，2011；Fricke，2012，Fricke，2014，Schmidt，2015]。对于抗体孵育，将计算量的抗体在使用前在不含FCS的DMEM中稀释至终浓度1mg/ml[Fricke，2014]。然后，用800μg MAX.16H5 IgG1将来自供体的1.4x108个BM和1.4x108个脾细胞在不含FCS的15ml DMEM中于室温避光孵育2小时[Fricke，2014]。作为对照，在相同条件下制备来自供体的未经抗体预孵育的BM和脾细胞[Fricke，2014]。孵育2小时后，将细胞以300g离心10分钟以沉淀它们，并在PBS(1x)中以300g离心10分钟洗涤一次以除去未结合的抗体[Fricke，2014]。
细胞移植
对于共移植实验，将供体TTG-C57Bl/6小鼠的2x107个预孵育的骨髓细胞添加至2x107个MAX.16H5 IgG1预孵育的脾细胞中[Fricke，2014]。将细胞浓度调节至150μl无菌0.9％NaCl的终体积[Fricke，2014]。此后，通过静脉注射将移植物同种异体移植到致死性辐照受体Balb/cwt小鼠的侧尾静脉中[Fricke，2014]。移植后每天评估生存率、GvHD症状和体重[Fricke，2014]。
流式细胞术
在移植之前和之后，通过流式细胞术分析供体TTG-C57B1/6和受体Balb/cwt小鼠。对于细胞计数分析，如前所述制备并孵育细胞[Fricke，2009；Fricke，2010；Fricke，2011；Fricke，2012，Fricke，2014]。另外，在移植前通过用7-氨基-放线菌素D(7-AAD)染色来测试脾细胞和骨髓细胞的活力。用5μl(0.25μg/测试)7-AAD将1x106个细胞在300μl PBS中于室温孵育30分钟并立即进行测定。在移植之前和之后，通过流式细胞术分析受体Balb/cwt小鼠并测定全血细胞数。使用以下抗体：鼠CD4-PECy7、MHC-IH-2D[b]-PE和鼠CD8-PerCP[BDBiosciences，海德堡，德国]；鼠CD3-FITC和人CD4-APC[Beckman Coulter，克雷菲尔德，德国]；和人HLA-DR3-FITC[Immunotools，弗里斯奥伊特，德国]。对于鼠FoxP3的细胞计数分析，根据制造商的方案使用鼠Treg检测试剂盒(Miltenyi Biotec GmbH，贝吉施-格拉德巴赫，德国)。数据在BD FACSCantoTM II流式细胞仪上获得，并使用BD FACSDivaTM软件(均为BD Biosciences，海德堡，德国)进行分析[Fricke，2014]。
皮肤移植
对于同种异体皮肤移植，Balb/cwt(TTG)小鼠(显示C57B1/6血液嵌合体)和Balb/cwt小鼠用作受体，CD4/CD3小鼠(TTG)用作供体。通过管理机构批准的标准方案来麻醉受体小鼠。立即制备来自尾部的供体小鼠皮肤。在移植前仔细剃除受体小鼠肩部的毛皮。将5x5mm供体尾部皮肤(TTG)的全厚度移植物移植到Balb/c(TTG)或Balb/cwt受体上。移植的皮肤移植物通过外科手术无菌线固定并另外用粘性无菌绷带包扎。通过管理机构批准的标准方案来唤醒受体小鼠。手术后，将小鼠单独饲养以避免其他损伤。所有皮肤移植步骤都在无菌条件下于手术室进行，并得到管理机构的批准。每天监测小鼠。皮肤移植五十天(50天)后，收集组织用于组织学分析。
受体小鼠的组织学
如前所述进行组织学分析[Fricke，2011]。
统计分析
所有数据均以平均值±标准偏差来表示[Fricke，2012]。使用SigmaPlot 10.0/SigmaStat 3.5软件(SYSTAT，埃尔克拉特，德国)[Fricke，2012]和GraphPad Prism 5(v5.03，GraphPad Software Inc，圣地亚哥，加利福尼亚州)来进行统计分析和图形展示。使用SigmaPlot 11.0/SigmaStat 3.5软件来计算P值。检验变量是GvHD评分、体重、存活率和细胞数。使用对数秩检验进行生存率曲线分析，使用t检验、Mann-Whitney U检验或Holm-Sidak检验对其他参数进行分析[Fricke，2009]。
结果：(还参见图1)
假设来自显示免疫耐受的Balb/c(TTG)受体小鼠上第三方TTG供体小鼠的实体器官(例如，皮肤)在移植后不会被排斥。为此，使用TTG小鼠的尾部皮肤来移植5只Balb/c(TTG)小鼠(显示C57B1/6血液嵌合体)和4只Balb/cwt(对照)。必须提到的是，由于之前移植造血干细胞，作为对照小鼠的Balb/c(TTG)受体大约为6个月大。百分之六十(60％)的皮肤移植的Balb/c(TTG)小鼠存活，且100％的Balb/cwt小鼠存活。然而，与对照不同，接受来自TTG小鼠的第三方皮肤移植物的所有存活的Balb/c(TTG)小鼠(显示C57B1/6血液嵌合体，N＝3)未显示出移植物排斥(图1)。在Balb/cwt对照组(N＝4)中观察到TTG皮肤移植失败。
实施例2：
至于用于本发明的其他抗体，可制备嵌合抗CD4抗体，并可根据WO2012/072268的实施例2来设计和产生修饰的抗CD4抗体，该专利也通过引用整体并入本发明。
实施例3：
此外，关于用于人免疫系统的动物模型，本领域技术人员可在本发明的某些问题的上下文中补充使用该动物模型，对此可参考WO 2006/122545，其中包括相应专利家族的所有家族成员，例如EP 1887859和US 2008216182，所有这些都通过引用明确并入本发明。
参考文献列表(所有这些均通过引用明确地并入本发明)
DE 3919294
WO 2006/122545
WO 2012/072268
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序列表
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<120> 通过预先使用修饰的移植物来预防移植物排斥
<130> F68779PC
<150> EP 16000373.7
<151> 2016-02-15
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 小鼠抗CD4重链
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 1
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<213> 人造序列
<220>
<223> 合成结构
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<223> 重链 VH4
<220>
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<220>
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<220>
<221> CDS
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<400> 7
gag gtt cag ctc cag cag tct ggg tct gag ctg aaa agg cct ggg gct 48
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
tcc gtg aag gtg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt gcc aac tac 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn Tyr
20 25 30
tgg atg cac tgg gta aaa cag gcc cct gga cag ggt cta caa tgg att 144
Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
35 40 45
ggt gct ctt tat cct gga aat gtt gat act acc tac aac cag aag ttc 192
Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Val Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
aag gac aag gcc aaa ctg act gca gac aca tcc gcc agc act gcc tac 240
Lys Asp Lys Ala Lys Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gag ctc agc agc ctg aca aat gag gac acc gcg gtc tat tac tgt 288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
aca aga atg ggt act act tta gaa gcc ccc ctt gac tat tgg ggc caa 336
Thr Arg Met Gly Thr Thr Leu Glu Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
ggc acc ctt gtc aca gtc tcc tca 360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 8
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Val Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Lys Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Met Gly Thr Thr Leu Glu Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 360
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 重链 VH1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 9
gag gtt cag ctc cag cag tct ggg tct gag ctg aaa agg cct ggg gct 48
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
tcc gtg aag gtg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt gcc aac tac 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn Tyr
20 25 30
tgg atg cac tgg gta aga cag gcc cct gga cag ggt cta caa tgg att 144
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
35 40 45
ggt gct ctt tat cct gga aat gtt gat act acc tac aac cag aag ttc 192
Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Val Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
aag gac aag gcc aaa atc act aga gac aca tcc gcc agc act gcc tac 240
Lys Asp Lys Ala Lys Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gag ctc agc agc ctg aca aat gag gac acc gcg gtc tat tac tgt 288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
aca aga atg ggt act act tta gaa gcc ccc ctt gac tat tgg ggc caa 336
Thr Arg Met Gly Thr Thr Leu Glu Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
ggc acc ctt gtc aca gtc tcc tca 360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 10
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Val Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Lys Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Met Gly Thr Thr Leu Glu Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 318
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 小鼠抗CD4轻链
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(318)
<400> 11
caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cca ggg 48
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag aag gtc gcc atg acc tgc agt gcc agg tca agt gta agt tac ttg 96
Glu Lys Val Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
tac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aga ctc ctg att tat 144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
gac aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gtt cgc ttc att ggc agt 192
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ile Gly Ser
50 55 60
ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc cga atg gag gct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt gat tac ccg ctc acg 288
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 318
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 12
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 12
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ile Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 13
<211> 318
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 轻链 VK4
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(318)
<400> 13
caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc ctg tct gca tct cca ggg 48
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag aag gcc gcc atg acc tgc agt gcc agg tca agt gta agt tac ttg 96
Glu Lys Ala Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
tac tgg tac cag cag aag cca ggg tcc tcc ccc aga ctc ctg att tat 144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
gac aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct tct cgc ttc att ggc agt 192
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly Ser
50 55 60
ggg tct ggg acc gat tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt gat tac ccg ctc acg 288
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag atc aaa 318
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 14
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Ala Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 318
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 轻链 VK3
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(318)
<400> 15
caa att gtt ctc acc cag tct cca gca acc ctg tct gca tct cca ggg 48
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag aag gcc gcc atg acc tgc agt gcc agg tca agt gta agt tac ttg 96
Glu Lys Ala Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
tac tgg tac cag cag aag cca ggg tcc tcc ccc aga ctc ctg att tat 144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
gac aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct tct cgc ttc att ggc agt 192
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly Ser
50 55 60
ggg tct ggg acc gat tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt gat tac ccg ctc acg 288
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag atc aaa 318
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 16
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Ala Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 318
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 轻链 VK2
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(318)
<400> 17
caa att gtt ctc acc cag tct cca gca acc ctg tct gca tct cca ggg 48
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag aag gcc gcc atg acc tgc agt gcc agg tca agt gta agt tac ttg 96
Glu Lys Ala Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
tac tgg tac cag cag aag cca ggg tcc tcc ccc aga ctc ctg att tat 144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
gac aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct tct cgc ttc agc ggc agt 192
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tct ggg acc gat tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt gat tac ccg ctc acg 288
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag atc aaa 318
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 18
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Ala Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 318
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 轻链 VK1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(318)
<400> 19
caa att gtt ctc acc cag tct cca gca acc ctg tct gca tct cca ggg 48
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag aag gcc gcc atg acc tgc agt gcc agg tca agt gta agt tac ttg 96
Glu Lys Ala Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
tac tgg tac cag cag aag cca ggg tcc tcc ccc aga gcc ctg att tat 144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Ala Leu Ile Tyr
35 40 45
gac aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct tct cgc ttc agc ggc agt 192
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tct ggg acc gat tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt gat tac ccg ctc acg 288
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag atc aaa 318
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 20
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Ala Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Ala Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 环肽
<400> 21
Cys Asn Ser Asn Gln Ile Cys
1 5
PCT/RO/134表
Claims (15)
1.一种在治疗受试者中一种或多种可通过移植治疗的疾病的方法中使用的未修饰的移植物，
其中所述方法包括：第一步，向所述受试者中引入修饰的移植物，以及第二步，向所述受试者中引入所述未修饰的移植物，
其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4。
2.一种在治疗一种或多种可通过移植治疗的疾病的方法中使用的修饰的移植物，
其中所述方法包括：第一步，向所述受试者中引入所述修饰的移植物，以及第二步，向所述受试者中引入未修饰的移植物，
其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4。
3.一种在治疗一种或多种可通过移植治疗的疾病的方法中使用的CD4拮抗剂，优选为抗CD4抗体；
其中所述方法包括：第一步，向所述受试者中引入修饰的移植物，以及第二步，向所述受试者中引入未修饰的移植物，
其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4。
4.一种未修饰的移植物、修饰的移植物和/或CD4拮抗剂，其中所述拮抗剂优选为抗CD4抗体，其用于
i)手术移植方法，
ii)诱导移植耐受的方法，其中修饰的移植物用于诱导对未修饰的移植物的移植耐受，
iii)转移一种或多种细胞悬液的方法，特别是从供体到受试者的含有细胞悬液的干细胞，
iv)将一种或多种组织从供体转移到受试者的方法，
v)将一个或多个部分器官从供体转移到受试者的方法，
vi)将一个或多个器官从供体转移到受试者的方法，
vii)将造血系统重建细胞从供体转移到受试者的方法，随后可选地将一个或多个器官从所述供体转移到所述受试者中，
或
viii)用于增强受试者中免疫重建的方法，随后可选地将一个或多个器官转移到所述受试者中；
其中所述方法包括：第一步，向所述受试者中引入修饰的移植物，以及第二步，向所述受试者中引入未修饰的移植物，
其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，其中所述修饰抑制CD4。
5.根据前述权利要求中任一项所述使用的未修饰的移植物、修饰的移植物或CD4拮抗剂，
其中，在所述第二步之前的30分钟至50年，特别是在所述第二步骤之前的一小时至两个月，进行所述第一步。
或
其中，在所述第二步之前的至少一个小时，特别是在所述第二步骤之前的至少三周，进行所述第一步。
6.根据前述权利要求中任一项所述使用的未修饰的移植物、修饰的移植物或CD4拮抗剂，其中所述修饰的移植物包含干细胞。
7.根据前述权利要求中任一项所述使用的未修饰的移植物、修饰的移植物或CD4拮抗剂，
其中每个所述移植物均选自细胞悬液、组织或器官；
特别是，
i)其中所述修饰的移植物是细胞悬液，且所述移植物是细胞悬液，
或
ii)其中所述修饰的移植物是细胞悬液，且所述移植物是组织，
或
iii)其中所述修饰的移植物是细胞悬液，且所述移植物是器官。
8.根据前述权利要求中任一项所述使用的未修饰的移植物、修饰的移植物或CD4拮抗剂，其中所述修饰的移植物是含有免疫细胞的细胞移植物，所述修饰的移植物包含CD4拮抗剂，特别是抗CD4抗体，特别是与其CD4表位结合；
特别是，其中所述修饰的移植物
I)可通过体外方法获得，所述体外方法包括步骤a)用CD4拮抗剂，特别是用抗CD4抗体来孵育含有免疫细胞的细胞移植物，且可选地包括步骤b)从所述移植物中去除未结合的抗体，
和/或
Ⅱ)是含有免疫细胞的细胞移植物，所述修饰的移植物包含与其CD4表位的40％至100％结合的CD4拮抗剂，特别是抗CD4抗体。
9.根据权利要求8所述使用的未修饰的移植物、修饰的移植物或CD4拮抗剂；
其中所述体外方法的步骤a)中的所述孵育进行1分钟至7天，
特别是，其中所述孵育进行
i)1至150分钟，特别是5分钟至150分钟，更特别是10分钟至150分钟，更特别是30分钟至150分钟，更特别是40分钟至120分钟，更特别是45分钟至90分钟，尤其是50分钟至70分钟；
或
ii)150分钟至7天，特别是150分钟至5天，更特别是150分钟至3天，更特别是150分钟至1天，尤其是150分钟至8小时；
和/或
其中所述体外方法的步骤a)中的所述孵育用0.1μg/ml至10mg/ml的抗体量来进行。
10.根据前述权利要求中任一项所述使用的未修饰的移植物、修饰的移植物或CD4拮抗剂，其中所述方法
i)意味着在所述未修饰的移植物内对受体组织的耐受或部分耐受；
和/或
ii)意味着在受体组织内对所述未修饰的移植物的耐受或部分耐受；
和/或
iii)意味着在移植未修饰的移植物时降低GvHD、供体移植物排斥或器官排斥中任一种发展的可能性。
11.根据前述权利要求中任一项所述使用的未修饰的移植物、修饰的移植物或CD4拮抗剂，
I)其中所述修饰的移植物选自含有T细胞和单核细胞/巨噬细胞的细胞悬液，
所述细胞悬液包含骨髓细胞、非粘附骨髓细胞、外周血细胞和/或脐带血细胞；包含淋巴细胞、单核细胞和/或巨噬细胞的细胞悬液；含有干细胞的组织；含有干细胞的器官；含有免疫细胞的组织；以及含有免疫细胞的器官；
和/或
Ⅱ)其中所述修饰的移植物是细胞悬液，并且其中所述方法包括向所述受试者施用-2×106个细胞至2×1015个有核细胞。
12.根据前述权利要求中任一项所述使用的未修饰的移植物、修饰的移植物或CD4拮抗剂，其中
A)修饰的移植物和未修饰的移植物来自HLA相关供体；
特别是，
i)其中所述HLA相关供体包含不超过总共50％的HLA错配，优选地不超过40％的HLA错配，优选地不超过30％的HLA错配，优选地不超过20％的HLA错配，优选地不超过10％的HLA错配，优选地无HLA错配；
和/或
ii)其中所述HLA相关供体选自组织型匹配供体、相关双胞胎或是同一供体；
尤其是其中所述修饰的移植物和所述未修饰的移植物均来自相同供体，
和/或
B)其中所述修饰的移植物和所述未修饰的移植物是HLA相关的；
特别是其中所述HLA相关移植物包含不超过总共50％的HLA错配，优选地不超过40％的HLA错配，优选地不超过30％的HLA错配，优选地不超过20％的HLA错配，优选地不超过10％的HLA错配，优选地无HLA错配。
13.根据权利要求3至12中任一项所述使用的未修饰的移植物、修饰的移植物或CD4拮抗剂，其中所述CD4拮抗剂是抗CD4抗体；
特别是其中所述抗CD4抗体
i)选自Max16H5、OKT4A、OKTcdr4a、cMT-412或YHB.46，特别是其中所述抗CD4抗体是Max16H5；
或
ii)是抗体30F16H5；
或
iii)可从保藏号为ECACC 88050502的细胞系获得；
或
iv)可从2011年12月2日保藏于DSMZ的细胞系MAX.16H5/30F16H5获得；
或
v)是抗体16H5.chimIgG4；
或
vi)可从2011年12月2日保藏于DSMZ的细胞系CD4.16H5.chimIgG4获得；
或
vii)是包含抗体16H5.chimIgG4的VH和VK的抗体；
或
viii)是包含如下抗体的VH和VK的抗体：可从2011年12月2日保藏于DSMZ的细胞系CD4.16H5.chimIgG4获得的抗体；
或
ix)是包含选自SEQ ID NO：1-10的VH和选自SEQ ID NO：11-20的VK的任意组合的抗体，特别是其中所述组合选自VH1/VK1、VH2/VK2,、VH4/VK2和VH4/VK4，尤其是其中所述组合是VH2/VK2，
或
x)是选自根据以上i)至ix)所述的抗体的抗体混合物。
14.根据前述权利要求中任一项所述使用的未修饰的移植物、修饰的移植物或CD4拮抗剂，
其中在引入所述受试者之前，另外使用可溶性生物活性分子来孵育所述未修饰的移植物和/或修饰的移植物，
特别是使用促进免疫抑制、免疫耐受和/或调节性T细胞形成的药剂，
尤其是使用选自Il-2、TGF-β、雷帕霉素、视黄酸、4-1BB配体和抗CD28抗体或其任何组合的药剂。
15.根据前述权利要求中任一项所述使用的未修饰的移植物、修饰的移植物或CD4拮抗剂，
A)其中所述修饰的移植物用于
i)实现在所述修饰的移植物内对所述受体组织的耐受或部分耐受；
和/或
ii)实现在所述受体组织内对所述修饰的移植物的耐受或部分耐受；
和/或
iii)在移植所述修饰的移植物时降低GvHD、供体移植物排斥和器官排斥中任一种的可能性，
和/或
B)其中所述修饰的移植物用于
i)实现在所述未修饰的移植物内对所述受体组织的耐受或部分耐受；
和/或
ii)实现在所述受体组织内对所述未修饰的移植物的耐受或部分耐受；
和/或
iii)在移植所述未修饰的移植物时降低GvHD、供体移植物排斥和器官排斥中任一种的可能性。
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