JP5960946B2 - がん幹細胞分子マーカー - Google Patents

Description

本発明は、検出対象となる細胞集団においてがん幹細胞を検出するための分子マーカーであって、該検出対象に含まれるがん幹細胞において検出されるが、がん幹細胞でないがん細胞および正常細胞において検出されない、前記分子マーカーに関する。

がん幹細胞は、がんの再発や転移の主要な原因と考えられており、がん治療においてがん幹細胞をターゲッティングすることの重要性が指摘されている。しかし腫瘍組織内におけるがん幹細胞の比率はわずかしかなく（非特許文献４）、がん幹細胞を特異的に認識、治療することは非常に難しい。がん幹細胞の検出技術とがん幹細胞を標的とする新たな治療法の開発は、がん医療にとって重要な課題となっている。
現在のところがん幹細胞マーカーとしては、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４４などの分子マーカーが知られている（非特許文献１〜７）が、ごく一部のがん細胞でしか有効性がないといわれており、より多くの種類のがんでがん幹細胞を検出するためには、新たな分子マーカーの同定が必要である。

先行技術文献

Shu Zhang et al., Cancer Res. 68:(11) 4311-4320, 2008 Shih-Hwa Chiou et al., Clin. Cancer Res. 14(13) 4085-4095, 2008 Gang-Ming Zou, J. Cell. Physiol. 217: 598-604, 2008 Cheong J. Lee et al., J Clin Oncol 26:2806-2812, 2008 Madhuri Kakarala et al., J Clin Oncol 26:2813-2820, 2008 Craig D. Peacock et al., J Clin Oncol 26:2883-2889, 2008 Xing Fan et al., J Clin Oncol 26:2821-2827, 2008

発明の概要

発明が解決しようとする課題
本発明はがん幹細胞の検出に有用な分子マーカーを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を続ける中で、少なくとも１の組織で、有用性がより高いという意味で好ましくは複数の組織で、該組織由来の正常細胞において発現が見られず、がん幹細胞において発現が見られる、つまりがん幹細胞遺伝子を同定する際の検体には通常正常組織が含まれるところ、該検体中の正常組織にはほとんど発現しないことががん幹細胞マーカー遺伝子には不可欠であるとの新たな知見に着目した。そしてこれまでに報告されているがん幹細胞に対するマーカー遺伝子は、ほとんどが正常組織においても高レベルに発現していることが判明したが、本発明者らのさらなる研究の中で、転写因子として知られている遺伝子であるSex determinig Region Y-box2（Ｓｏｘ２）遺伝子が、成人正常細胞における発現が見られないにもかかわらず、意外にもがん幹細胞において発現していることを見出した。そして、さらに研究を続ける中で、Sperm Mitochondria-associated Cysteine-rich Protein（Ｓｍｃｐ）遺伝子を始めとするその他の遺伝子も、成人正常細胞における発現がほとんどなく、がん幹細胞において発現していることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、検出対象となる細胞集団においてがん幹細胞を検出するための分子マーカーであって、該検出対象に含まれるがん幹細胞において検出されるが、がん幹細胞でないがん細胞および正常細胞において検出されない、前記分子マーカーに関する。
本発明はまた、検出対象が、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、胃、骨髄、大腸および末梢血単核球からなる群から選択される１または２以上の細胞または組織由来の細胞集団である、前記の分子マーカーに関する。
本発明はさらに、全ての検出対象の、がん幹細胞でないがん細胞および正常細胞において検出されない、前記の分子マーカーに関する。

本発明はさらにまた、分子マーカーが、Ｏｒ７ｃ１、Ｄｎａｊｂ８、Ｓｏｘ２、Ｓｍｃｐ、Ｉｎｔｓ１、Ｋｏｘ１２、Ｍｄｆ１、ＦＬＪ１３４６４、６６７Ｊ２３２、Ｓｕｒｆ６、Ｐｃｄｈ１９、Ｄｃｈｓ２、Ｐｃｄｈ２１、Ｇａｌ３ｓｔ１、Ｒａｓｌ１１ｂ、Ｈｅｓ６、Ｚｎｆ４１５、Ｎｋｘ２−５、Ｐａｍｃｉ、ＰｎｍｔおよびＳｃｇｂ３ａ１からなる群より選択される１または２以上の遺伝子の発現産物である、前記の分子マーカーに関する。
また、本発明は、判定対象において、前記の分子マーカーを指標として、がん幹細胞の有無を判定する方法に関する。
さらに、本発明は、細胞集団が正常細胞および／またはがん幹細胞でないがん細胞を含む、前記の方法に関する。
さらにまた、本発明は、細胞集団が、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、胃、骨髄、大腸および末梢血単核球からなる群から選択される１または２以上の細胞または組織由来である、前記の方法に関する。

本発明はまた、判定が、Ｏｒ７ｃ１、Ｄｎａｊｂ８、Ｓｏｘ２、Ｓｍｃｐ、Ｉｎｔｓ１、Ｋｏｘ１２、Ｍｄｆ１、ＦＬＪ１３４６４、６６７Ｊ２３２、Ｓｕｒｆ６、Ｐｃｄｈ１９、Ｄｃｈｓ２、Ｐｃｄｈ２１、Ｇａｌ３ｓｔ１、Ｒａｓｌ１１ｂ、Ｈｅｓ６、Ｚｎｆ４１５、Ｎｋｘ２−５、Ｐａｍｃｉ、ＰｎｍｔおよびＳｃｇｂ３ａ１からなる群より選択される１または２以上の遺伝子の発現産物を検出した場合に、がん幹細胞が有ると判定する、前記の方法に関する。

本発明はさらにまた、遺伝子の発現産物が、ｍＲＮＡおよび／または内在性ポリペプチドである、前記の方法に関する
また、本発明は、遺伝子の発現産物がｍＲＮＡであり、ＲＴ−ＰＣＲ法により検出することを含む、前記の方法に関する。
さらに、本発明は、遺伝子の発現産物が内在性ポリペプチドであり、該内在性ポリペプチドと特異的に反応する試薬により検出することを含む、前記の方法に関する。

さらにまた、本発明は、試薬が抗体である、前記の方法に関する。
本発明はまた、判定が、インビトロまたはインビボで行われる、前記の方法に関する。
本発明はさらに、ｉ）前記の分子マーカーの、候補化合物を細胞集団に投与する前の検出量Ａを測定する工程、
ｉｉ）候補化合物を細胞集団に投与する工程、
ｉｉｉ）ｉ）において測定した分子マーカーの、候補化合物を細胞集団に投与した後の検出量Ｂを測定する工程、および
ｉｖ）ＡとＢを比較し、ＡがＢより有意に大きい場合に、候補化合物をがん治療薬候補であると判定する工程、
を含む、がん治療薬のスクリーニング方法に関する。

本発明はさらにまた、がん幹細胞の有無を判定するためのキットであって、前記の分子マーカーを検出するための試薬を含む、前記キットに関する。
また、本発明は、検出するための試薬が、Ｏｒ７ｃ１、Ｄｎａｊｂ８、Ｓｏｘ２、Ｓｍｃｐ、Ｉｎｔｓ１、Ｋｏｘ１２、Ｍｄｆ１、ＦＬＪ１３４６４、６６７Ｊ２３２、Ｓｕｒｆ６、Ｐｃｄｈ１９、Ｄｃｈｓ２、Ｐｃｄｈ２１、Ｇａｌ３ｓｔ１、Ｒａｓｌ１１ｂ、Ｈｅｓ６、Ｚｎｆ４１５、Ｎｋｘ２−５、Ｐａｍｃｉ、ＰｎｍｔおよびＳｃｇｂ３ａ１からなる群より選択される１または２以上の遺伝子の発現産物であるｍＲＮＡを検出するための前記遺伝子に相補的な塩基配列を有するプローブおよび／またはプライマーである、前記のキットに関する。

さらにまた、本発明は、検出するための試薬が、Ｏｒ７ｃ１、Ｄｎａｊｂ８、Ｓｏｘ２、Ｓｍｃｐ、Ｉｎｔｓ１、Ｋｏｘ１２、Ｍｄｆ１、ＦＬＪ１３４６４、６６７Ｊ２３２、Ｓｕｒｆ６、Ｐｃｄｈ１９、Ｄｃｈｓ２、Ｐｃｄｈ２１、Ｇａｌ３ｓｔ１、Ｒａｓｌ１１ｂ、Ｈｅｓ６、Ｚｎｆ４１５、Ｎｋｘ２−５、Ｐａｍｃｉ、ＰｎｍｔおよびＳｃｇｂ３ａ１からなる群より選択される１または２以上の遺伝子の発現産物であるポリペプチドを検出するための抗体である、前記のキットに関する。
本発明はさらに、前記のキットを用いる、がんの判定方法に関する。

本発明はさらにまた、がん幹細胞の機能を阻害する、またはがん幹細胞を死滅させるための抗原として利用可能なポリペプチドであって、Ｏｒ７ｃ１、Ｄｎａｊｂ８、Ｓｏｘ２、Ｓｍｃｐ、Ｉｎｔｓ１、Ｋｏｘ１２、Ｍｄｆ１、ＦＬＪ１３４６４、６６７Ｊ２３２、Ｓｕｒｆ６、Ｐｃｄｈ１９、Ｄｃｈｓ２、Ｐｃｄｈ２１、Ｇａｌ３ｓｔ１、Ｒａｓｌ１１ｂ、Ｈｅｓ６、Ｚｎｆ４１５、Ｎｋｘ２−５、Ｐａｍｃｉ、ＰｎｍｔおよびＳｃｇｂ３ａ１によりコードされるポリペプチドまたはその一部、あるいは該ポリペプチドまたはその一部において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチドである、前記ポリペプチドに関する。
また本発明は、Ｏｒ７ｃ１、Ｄｎａｊｂ８、Ｓｏｘ２、Ｓｍｃｐ、Ｉｎｔｓ１、Ｋｏｘ１２、Ｍｄｆ１、ＦＬＪ１３４６４、６６７Ｊ２３２、Ｓｕｒｆ６、Ｐｃｄｈ１９、Ｄｃｈｓ２、Ｐｃｄｈ２１、Ｇａｌ３ｓｔ１、Ｒａｓｌ１１ｂ、Ｈｅｓ６、Ｚｎｆ４１５、Ｎｋｘ２−５、Ｐａｍｃｉ、ＰｎｍｔおよびＳｃｇｂ３ａ１からなる群より選択される１または２以上の遺伝子の発現産物由来のエピトープと特異的に反応する抗体に関する。
さらに、本発明は、前記のポリペプチドおよび／または前記の抗体を少なくとも１つ以上含む医薬組成物に関する。

さらにまた、本発明は、医薬組成物が、がん治療用またはがん予防用である、前記の医薬組成物に関する。
本発明はまた、前記のポリペプチドを抗原として、がん幹細胞の機能を阻害する、またはがん幹細胞を死滅させる方法に関する。
本発明はさらに、前記の抗体を用いる、前記の方法に関する。
本発明はさらにまた、前記のポリペプチドをコードする核酸に関する。
また、本発明は、前記の核酸を含む医薬組成物に関する。
さらに、本発明は、医薬組成物が、ＤＮＡまたはＲＮＡワクチン用である、前記の医薬組成物に関する。
本発明はさらにまた、ｉ）目的ポリペプチドを適切な長さのペプチドに断片化したものを作製する工程、
ｉｉ）ｉ）で得られた断片化ペプチドと、抗原提示細胞と、目的ポリペプチドおよび／またはｉ）で得られた断片化ペプチドで感作したＴ細胞とを共に培養する工程、
ｉｉｉ）ｉｉ）で得られたＴ細胞の活性化の度合いを測定する工程、
ｉｖ）ｉｉｉ）においてＴ細胞を活性化した断片化ペプチドを選別する工程、
を含む、主要組織適合抗原に抗原提示されるペプチドのスクリーニング方法であって、目的ポリペプチドが、前記のポリペプチドである、前記方法に関する。

また、本発明は、がん幹細胞において、Ｏｒ７ｃ１、Ｄｎａｊｂ８、Ｓｏｘ２、Ｓｍｃｐ、Ｉｎｔｓ１、Ｋｏｘ１２、Ｍｄｆ１、ＦＬＪ１３４６４、６６７Ｊ２３２、Ｓｕｒｆ６、Ｐｃｄｈ１９、Ｄｃｈｓ２、Ｐｃｄｈ２１、Ｇａｌ３ｓｔ１、Ｒａｓｌ１１ｂ、Ｈｅｓ６、Ｚｎｆ４１５、Ｎｋｘ２−５、Ｐａｍｃｉ、ＰｎｍｔおよびＳｃｇｂ３ａ１からなる群より選択される遺伝子の発現を抑制するために用いられる、核酸に関する。
さらに、本発明は、核酸が、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡである、前記の核酸に関する。
さらにまた、本発明は、前記の核酸を少なくとも１つ以上含む、医薬組成物に関する。
本発明はまた、医薬組成物が、がん治療用である、前記の医薬組成物に関する。
本発明はさらにまた、前記の核酸を用いて、がん幹細胞の機能を阻害する方法に関する。
発明の効果

本発明で提供する分子マーカーは、がん細胞に含まれるがん幹細胞と、がん幹細胞でないがん細胞を判別することができる。さらに前記の判別は、単一の分子マーカーの検出によって行うことも可能であることから、極めて簡便にがん幹細胞の判別ができる。
また本発明の分子マーカーは、肺がん細胞、乳がん細胞、大腸がん細胞など、複数のがん幹細胞に共通して用いることができるので、汎用性のあるがん幹細胞の分子マーカーとして極めて有効である。
さらに本発明の分子マーカーは、正常細胞において全く検出されないか、ほとんど検出されないため、がん幹細胞の判別、さらにはがん幹細胞を含む腫瘍組織の判別においても有用である。
また本発明の分子マーカーは、造腫瘍性との関連性が高く、それらを標的としたがん幹細胞の免疫療法や分子標的治療法、遺伝子導入治療法、がん治療に利用可能な薬剤、ペプチドなどのスクリーニングにも有用である。

図１は、肺がんセルラインにおけるＳＰ解析結果を示した図である。線で囲ってある部分がそれぞれのＳＰ画分であり、％は全細胞に対するＳＰ画分細胞の割合を示す。 図２は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでの腫瘍形成能実験の結果を示した図である。ａ）は移植後８週目のマウスの写真である。ｂ）はＬＨＫ２（肺がん細胞）を移植した全てのマウスの腫瘍径平均値±標準偏差、腫瘍が生着したマウス数／移植した全マウス数を示した表である。ｃ）は、ＬＨＫ２（肺がん細胞）、ＭＣＦ７（乳がん細胞）、ＳＷ４８０（大腸がん細胞）をそれぞれ１５００個移植した群の週毎の腫瘍の大きさの平均値をグラフにしたものである。 図３ａ）は、ヒト成人正常細胞、ｂ）は、がん細胞セルラインのＳＰ画分およびＭＰ画分におけるＳｏｘ２の発現を示した図である。 図４ａ）は、ヒト成人正常細胞、ｂ）は、がん細胞セルラインのＳＰ画分およびＭＰ画分におけるＳｍｃｐおよびＦＬＪ１３４６４の発現を示した図である。 図５は、調査した遺伝子の、各細胞における発現の一覧表を示した図である。図中、発現が見られなかったものは陰性、発現が見られたものは陽性、ごく僅かに発現が見られたものの、有意に発現しているとはいえない微量の発現を擬陽性と表している。なお、擬陽性のものは、「検出されない」と判定する。また図中、ＬＨＫ２は肺がん、ＭＦＨ０３は軟部組織肉腫、ＭＣＦ７は乳がん、ＬＨＫ２−ＳＯＸ２はＳＯＸ２遺伝子を過剰発現させたＬＨＫ２セルライン、ＳＷ４８０およびＫＭ１２は大腸がんのセルラインである。

図６は、他のがんセルラインにおけるＳｏｘ２の発現を示した図である。 図７は、他のがんセルラインにおけるＳｍｃｐの発現を示した図である。ＰＣＲサイクルをそれぞれ３５サイクルおよび４０サイクルに設定して調査した結果を示している。図中Ｃａｋｉ−１、ＡＣＨＮ、ＳＭＫＴＲ−１〜４は腎細胞がんのセルラインであり、Ｓｑ−１は肺がん扁平上皮がんのセルラインであり、１−８７、Ａ５４９、ＬＨＫ２は肺がん腺がんのセルラインであり、ＬＣ８１７は肺がん小細胞がんのセルラインであり、８６−２、Ｌｕ９９は肺がん大細胞がんのセルラインであり、ＨＰＣ３は膵臓がんのセルラインであり、ＬＣＣ（Ｍｏｕｓｅ）はマウス肺がん細胞である。 図８ａ）は、正常細胞およびがんセルラインＳＷ４８０、ＫＭ１２、ＬＨＫ２、ＭＣＦ７のＳＰ画分およびＭＰ画分におけるＩｎｔｓ１の発現を示した図である。ｂ）は、がんセルラインにおけるＩｎｔｓ１の発現を示した図である。図中がんのセルラインは図６および図７と同じである。 図９は、肺がん組織における免疫組織染色の結果を示した図である。Ｃａｓｅ１とＣａｓｅ２は、それぞれ異なるがん患者由来の肺扁平上皮がん組織の染色像である。青い部分はヘマトキシリン染色によって染色された核を表し、茶色い部分が抗ＳＯＸ２抗体によって染色されたＳＯＸ２抗原タンパク質である。 図１０は、乳がん組織における免疫組織染色の結果を示した図である。Ｃａｓｅ１は細胞質パターン、Ｃａｓｅ２は核パターンの染色像、ＣＫ５は抗ＣＫ５抗体で染色した染色像、ＳＯＸ２は抗ＳＯＸ２抗体で染色した染色像である。青い部分はヘマトキシリン染色によって染色された核を表し、茶色い部分が抗ＣＫ５抗体または抗ＳＯＸ２抗体によって染色された抗原タンパク質である。

図１１は、ａ）が脳、ｂ）が肺、ｃ）が膵臓、ｄ）が胃における免疫組織染色の結果を示した図である。青い部分はヘマトキシリン染色によって染色された核を表し、茶色い部分が抗ＳＯＸ２抗体によって染色されたＳＯＸ２抗原タンパク質である。黒矢印で示された部分は、ＳＯＸ２抗体によってわずかに染色された細胞を示す。 図１２は、ＳＯＸ２強制発現による造腫瘍能力の変化を観察したグラフである。左の写真は腫瘍移植９週間後のマウスの写真である。右のグラフは、１００００個の細胞を移植した群の９週間にわたる腫瘍の大きさの平均値をグラフにしたものである。グラフ中、黒四角はＳＯＸ２を強制発現したＬＨＫ２細胞を、黒菱形はモックトランスフェクトしたＬＨＫ２細胞を表している。 図１３は、ＳＯＸ２陽性乳癌患者とＳＯＸ２陰性乳癌患者における患者生存率を表したグラフである。 図１４ａ）は、ｓｈ−ＳＯＸ２遺伝子を導入した細胞と、ｓｈ−ＥＧＦＰを導入した細胞における、ＳＯＸ２遺伝子の発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲ法によって調べた結果である。ｂ）はそれぞれの細胞を、シスプラチン含有培地で２４時間培養した時の細胞生存率を、シスプラチン濃度毎に表したグラフである。 図１５はＳＯＸ２ポリペプチド由来ペプチドのＨＬＡ−Ａ２４結合アッセイの結果を示した図である。ポジティブコントロールとして用いたペプチドと同程度またはそれに近いＭＦＩを示したペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチドとして同定した。

図１６はＳＯＸ２＿１０９ペプチドの細胞傷害アッセイの結果を示した図である。ネガティブコントロールであるＨＩＶ由来ペプチドに対して顕著に大きな細胞傷害が検出されている。 図１７はＳＯＸ２＿１０９ペプチドのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示した図である。ネガティブコントロールであるＨＩＶ由来ペプチドでは、ＩＦＮγの放出は検出されなかったが、ＳＯＸ２＿１０９ペプチドにおいてはＩＦＮγの放出が確認された。 図１８ａ）は、ＳＭＣＰ遺伝子導入に用いたプラスミドの模式図と、移植したマウスの模式図であり、ｂ）は、ＳＭＣＰ発現遺伝子を導入したＬＨＫ２細胞およびモックトランスフェクトしたＬＨＫ２細胞を移植して５週間後のマウスの写真である。ｃ）は、マウスにＳＭＣＰ遺伝子を導入したＬＨＫ２細胞およびモックトランスフェクトしたＬＨＫ２細胞をそれぞれ１０００個および１００００個移植した後、各週における腫瘍の大きさを計測したグラフである。グラフ中、黒菱形はＳＭＣＰ遺伝子を強制発現したＬＨＫ２細胞を、黒四角はモックトランスフェクトしたＬＨＫ２細胞を表す。 図１９ａ）は２種類のＳＭＣＰに対するｓｉＲＮＡを導入した細胞と、ネガティブコントロールとして「invitrogen社 Stealth RNAi（登録商標）siRNA Negative Control Hi GC カタログNo.１２９３５−４００」を導入した細胞における、ＳＭＣＰ遺伝子の発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲ法によって調べた結果である。ｂ）は、それぞれの細胞を同じ条件で培養したときの細胞数の変化を表したグラフである。グラフ中、黒四角はネガティブコントロールのＬＨＫ２細胞、黒三角はＳＭＣＰ１を導入したＬＨＫ２細胞、黒丸はＳＭＣＰ３を導入したＬＨＫ２細胞を表す。 図２０は、２種類のＳＭＣＰに対するｓｉＲＮＡを導入した細胞と、ネガティブコントロールとして「invitrogen社 Stealth RNAi（登録商標）siRNA Negative Control Hi GC カタログNo.１２９３５−４００」を導入した細胞を２０００００個ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した後、各週における腫瘍の大きさを計測したグラフである。グラフ中、黒四角はネガティブコントロールのＬＨＫ２細胞、黒三角はＳＭＣＰ１を導入したＬＨＫ２細胞、黒丸はＳＭＣＰ３を導入したＬＨＫ２細胞を表す。

図２１は、ヒトの各組織細胞および培養癌細胞におけるＤＮＡＪＢ８のＲＴ−ＰＣＲの結果である。ポジティブコントロールとしてＧ３ＰＤＨを用いた。 図２２は、ＡＣＨＮ、ＭＣＦ７およびＲｅｎＣａ細胞のフローサイトメトリー解析の結果および、各癌細胞のＳＰおよびＭＰについてのＤＮＡＪＢ８のＲＴ−ＰＣＲ結果である。 図２３は、ＲｅｎＣａのＳＰ画分、ＭＰ画分および未分画のＲｅｎＣａをラットに移植したときの、時間と腫瘍体積の関係を表したグラフである。 図２４ａ）は、プラスミド構築物のマップである。四角部分は、モック、ｓｕｒｖｉｖｉｎおよびＤＮＡＪＢ８の配列が挿入される。ｂ）はａ）のプラスミドを導入した細胞の培養上清のウェスタンブロッティングの結果である。 図２５は、各プラスミドワクチンを投与したマウスにおける、移植した腫瘍の体積と時間の関係を表したグラフである。丸はワクチンの代わりにＰＢＳを投与したマウス（ネガティブコントロール）、四角は何も挿入していないプラスミドを投与したマウス、三角はｓｕｒｖｉｖｉｎを挿入したプラスミドを投与したマウス、縦線はＤＮＡＪＢ８を挿入したプラスミドを投与したマウスの結果を表す。

図２６ａ）は、各ペプチドに曝露した際の、ＨＬＡ−Ａ２４抗体の蛍光の変化を表したグラフであり、ｂ）は平均蛍光強度を表したグラフである。 図２７は、モックトランスフェクトしたＡＣＨＮ細胞と、ＤＮＡＪＢ８を強制発現させたＡＣＨＮ細胞における、ＳＰ画分の変化を表した図である。 図２８は、ヒトの各成熟組織細胞、胎児組織細胞および培養癌細胞におけるｏｒ７ｃ１のＲＴ−ＰＣＲの結果である。ポジティブコントロールとしてＧ３ＰＤＨを用いた。 図２９は、モックトランスフェクションしたＳｗ４８０細胞、ｏｒ７ｃ１を恒常発現させたＳｗ４８０細胞およびｏｒ７ｃ１をｓｉＲＮＡでノックダウンしたＳｗ４８０細胞の形態を位相差顕微鏡で観察した画像および前記各細胞のｏｒ７ｃ１についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を表した図である。ＲＴ−ＰＣＲのポジティブコントロールとしてＧ３ＰＤＨを用いた。 図３０は、野生型Ｓｗ４８０細胞およびｏｒ７ｃ１をｓｉＲＮＡでノックダウンしたＳｗ４８０細胞のＳＰ画分をフローサイトメトリー解析した結果を表した図である。

図３１は、モックトランスフェクションしたＳｗ４８０細胞とｏｒ７ｃ１を恒常発現させたＳｗ４８０細胞とをマウスに移植したときの腫瘍体積の経時変化を表したグラフならびにｏｒ７ｃ１をｓｉＲＮＡでノックダウンした細胞およびネガティブｓｉＲＮＡを用いた細胞をマウスに移植したときの腫瘍体積の経時変化を表したグラフである。 図３２は、各ペプチドに曝露した際の、ＨＬＡ−Ａ２４抗体の蛍光の変化を表したグラフである。 図３３は、実験例３２において結合が確認されたペプチドを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表した図である。 図３４は、^５１Ｃｒリリースアッセイにおける、Ｅ／Ｔ比と殺傷率の関係を表したグラフである。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の分子マーカーは、検出対象となる細胞集団においてがん幹細胞を検出するための分子マーカーであって、該検出対象に含まれるがん幹細胞において検出されるが、がん幹細胞でないがん細胞および正常細胞において検出されない。したがって、典型的には、がん細胞集団からがん幹細胞を検出するために用いる。さらに、例えば、任意の検出対象となる細胞集団を採取すると、正常細胞が混入して、がん幹細胞、がん幹細胞でないがん細胞および正常細胞が混在する細胞集団となる場合があるが、このような場合であっても、正確にがん幹細胞を検出することができる。
本発明における「がん幹細胞」とは、がん細胞のうち幹細胞の性質を有する細胞である。幹細胞とは細胞分裂を経ても分化能を維持している細胞のことをいう。がん幹細胞は、ヘキスト蛍光色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）で染色し、フローサイトメトリーを利用してＵＶレーザー（波長約３５０ｎｍ）を励起光に用いて検出すると、Side Population（ＳＰ）画分に濃縮される。ＳＰ画分とは、ヘキスト蛍光色素によって染色されるMain Population（ＭＰ）画分に対して、ＡＢＣトランスポーターなどを介して色素を細胞外に排出することで染色されない画分のことを指す。

本発明における「正常細胞」とは、生体または組織の活動において、正常な機能を有する細胞のことを指す。正常細胞は、体性幹細胞を含んでもよいが、好ましくは成熟細胞である。
本発明の分子マーカーは、好ましくは、複数のがん種のがん幹細胞に共通して検出されるものであり、複数のがん種において単一のマーカーとして用いることができる。例えば、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、胃、骨髄、大腸および末梢血単核球などの細胞または組織由来の複数のがん種のがん幹細胞に共通して発現しているので検出することができる。
さらに本発明の分子マーカーは、がん幹細胞でないがん細胞および正常細胞においては検出されない。好ましくは、例えば、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、胃、骨髄、大腸および末梢血単核球などの少なくとも１つ以上において、がん幹細胞でないがん細胞および正常細胞では検出されない。

本発明の分子マーカーは、がん幹細胞において発現または検出できるが、正常細胞において発現または検出できないことにより、がん幹細胞を含む細胞または組織において任意に採取した細胞集団において、がん幹細胞の検出が可能になる。
汎用性のある分子マーカーとして用いるために、複数のがん種において単一のマーカーとして用いることができることが好ましく、典型的には、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、胃、骨髄、大腸および末梢血単核球などの細胞または組織の少なくとも２つ以上において正常細胞では検出されず、好ましくは、少なくとも３つ以上において検出されない。最も好ましくは全ての細胞または組織における正常細胞で検出されない。

本明細書において、「遺伝子の発現」とは、該遺伝子の転写を起点とする一連の生体反応をいい、「発現産物」とは、例えばｍＲＮＡや内在性ポリペプチドなど、この一連の生体反応によって生成される分子をいう。
また本明細書において「発現している」とは、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫検定法、クロマトグラフィ法などの、当業者に知られた方法で発現産物が確認できることをいう。また、「検出されない」とは、前記の発現産物の確認方法において発現産物が確認できないことをいう。なお、例えばＲＴ−ＰＣＲなど、極めて高感度の検出方法において検出されたようなシグナルが出ても、シグナル強度に顕著な差があったり、免疫検定法など、本発明の態様における実用性という観点から十分な感度の検出方法においては検出レベル以下であるなどの場合は、本明細書でいうところの「検出されない」に包含される。

本発明で検出される遺伝子の発現産物は、好ましくは公知の配列を持つ遺伝子の発現産物であるが、そのホモログであってもよい。好ましくは以下のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列を持つ遺伝子の発現産物である。
Ｓｏｘ２：Gene accession No.NM_003106
Ｓｍｃｐ：Gene accession No.NM_030663
Ｉｎｔｓ１：Gene accession No.NM_001080453
Ｋｏｘ１２：Gene accession No.NM_152907
Ｍｄｆ１：Gene accession No.NM_005586
ＦＬＪ１３４６４：Gene accession No.AK023526
６６７Ｊ２３２：Gene accession No.AL833225
Ｓｕｒｆ６：Gene accession No.NM_006753
Ｐｃｄｈ１９：Gene accession No.NM_001105243
Ｄｃｈｓ２：Gene accession No.NM_017639
Ｐｃｄｈ２１：Gene accession No.NM_033100
Ｇａｌ３ｓｔ１：Gene accession No.NM_004861
Ｒａｓｌ１１ｂ：Gene accession No.NM_023940
Ｈｅｓ６：Gene accession No.NM_018645
Ｚｎｆ４１５：Gene accession No.NM_018355
Ｎｋｘ２−５：Gene accession No.NM_004387
Ｐａｍｃｉ：Gene accession No.NM_005447
Ｐｎｍｔ：Gene accession No.NM_002686
Ｓｃｇｂ３ａ１：Gene accession No.NM_052863
Ｏｒ７ｃ１：Gene accession No.NM_198944
Ｄｎａｊｂ８：Gene accession No.NM_153330

本発明における判定対象は、好ましくはヒト、ヒト由来組織および／またはヒト由来細胞であるが、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、チンパンジーなどの霊長類、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなど）、該動物由来の組織、および／または該動物由来の細胞であってもよい。
判定は、本発明の分子マーカーが検出された場合にがん幹細胞があると判定され、判定対象には正常細胞および／またはがん幹細胞でないがん細胞も含まれてよい。複数のがん種で単一のマーカーとして利用できるという観点から、好ましくはＳｏｘ２、Ｓｍｃｐ、Ｉｎｔｓ１、Ｋｏｘ１２、Ｍｄｆ１、ＦＬＪ１３４６４、６６７Ｊ２３２、Ｓｕｒｆ６、Ｐｃｄｈ１９、Ｄｃｈｓ２、Ｐｃｄｈ２１、Ｇａｌ３ｓｔ１、Ｒａｓｌ１１ｂ、Ｈｅｓ６、Ｚｎｆ４１５、Ｎｋｘ２−５、Ｐａｍｃｉ、Ｐｎｍｔ、Ｓｃｇｂ３ａ１、Ｏｒ７ｃ１、およびＤｎａｊｂ８、最も好ましくはＳｏｘ２の発現産物を検出して判定する。

本発明の分子マーカーがｍＲＮＡである場合、その検出にはプローブやプライマーなどのｍＲＮＡに特異的に結合する試薬が用いられる。検出感度の高さや操作の簡便性などの観点から、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ法で検出される。
本発明の分子マーカーが内在性ポリペプチドである場合、その検出には、抗体やリガンドなどのペプチドに特異的に結合する試薬が用いられる。例えば、抗体は、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体が用いられ得る。非特異的反応がより低いという観点から、モノクローナル抗体を用いることが好ましい。
判定は、インビボまたはインビトロでの判定であってもよい。本明細書において「インビトロでの判定」とは、生体から採取した組織または細胞を、例えば培養液など、生体外環境における生育を経た後に判定することをいう。それに対し「インビボでの判定」とは、生体内で直接判定すること、あるいは組織または細胞を生体から採取した後、すぐにもしくは固定化後に判定することをいう。組織または細胞の採取は、これに限定するものではないが例えば切開、細胞吸引、採血、採尿などで行う。
判定をインビボで行う場合、当業者において公知のインビボ検出法を用いて行ってよい。インビボでの判定は、例えば血液検査、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ、免疫組織染色など、公知の検出法を用いて行ってよい。

判定をインビトロで行う場合、これに限定するものではないが例えば免疫組織染色、ＲＴ−ＰＣＲなど、当業者間において公知のインビトロ検出法を用いて行ってよい。ＲＴ−ＰＣＲを行う場合、サイクル数は３０〜３５サイクルが好ましい。組織培養後の腫瘍組織での判定なども、インビトロでの判定に含まれる。
本発明の分子マーカーは、がん幹細胞に特異的に発現しているため、その検出量はがん幹細胞の個数と相関していると推測される。したがって、対象に対する候補化合物投与の前後において、本発明の分子マーカーの検出量が減少すれば、それはがん幹細胞の個数が減少したと考えられる。つまり、投与前後の分子マーカーの検出量を比較することにより、がん幹細胞に対する治療薬の候補となる化合物をスクリーニングすることが可能である。したがって、かかるスクリーニング方法も、本発明に包含される。

また、本発明は、上記分子マーカーを検出するための試薬を含むキットも包含する。キットには、例えばｍＲＮＡを検出するためにはプローブ、プライマーなど、ｍＲＮＡを特異的に検出する試薬が含まれ、ポリペプチドを検出するためには、リガンド、抗体など、ポリペプチドを特異的に検出する試薬が含まれる。キットには少なくとも１つ以上の前記試薬が含まれ得る。キットには、例えば反応用緩衝液、反応促進剤など、その使用態様に適した付随的な試薬が含まれ得る。
複数のがん種で単一に利用できるという観点から、遺伝子配列は、好ましくは、Ｓｏｘ２、Ｓｍｃｐ、Ｉｎｔｓ１、Ｋｏｘ１２、Ｍｄｆ１、ＦＬＪ１３４６４、６６７Ｊ２３２、Ｓｕｒｆ６、Ｐｃｄｈ１９、Ｄｃｈｓ２、Ｐｃｄｈ２１、Ｇａｌ３ｓｔ１、Ｒａｓｌ１１ｂ、Ｈｅｓ６、Ｚｎｆ４１５、Ｎｋｘ２−５、Ｐａｍｃｉ、Ｐｎｍｔ、Ｓｃｇｂ３ａ１、Ｏｒ７ｃ１、またはＤｎａｊｂ８、最も好ましくはＳｏｘ２の遺伝子産物を検出する試薬が含まれる。
本発明における「遺伝子に相補的な塩基配列を有するプローブおよび／またはプライマー」は、遺伝子配列の一部の配列に対して特異的に結合するように相補的な配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡであって、例えば蛍光標識、放射線標識などで随意に標識されていてよい。

上記キットを用いてがん幹細胞を検出することにより、判定対象ががんであるかどうかを判定する方法も本発明に包含される。
本発明の分子マーカーとして機能するポリペプチドは、がん幹細胞の機能を阻害したり、死滅させるための抗原として利用可能である。これらのポリペプチドは、例えば抗体認識部位やタンパク質結合部位など、機能的な部位を有していればよく、例えば、９〜１１アミノ酸程度の長さでもよい。また、例えばタンパク質の三次構造が抗体認識される場合、多量体として抗体認識される場合、修飾基の結合によって抗体認識部位となる場合など、機能的部位が何らかの修飾や変形などを経て現れる場合も、この機能的部位の構造を有していればよい。これらのポリペプチドは、好ましくは、Ｓｏｘ２、Ｓｍｃｐ、Ｉｎｔｓ１、Ｋｏｘ１２、Ｍｄｆ１、ＦＬＪ１３４６４、６６７Ｊ２３２、Ｓｕｒｆ６、Ｐｃｄｈ１９、Ｄｃｈｓ２、Ｐｃｄｈ２１、Ｇａｌ３ｓｔ１、Ｒａｓｌ１１ｂ、Ｈｅｓ６、Ｚｎｆ４１５、Ｎｋｘ２−５、Ｐａｍｃｉ、Ｐｎｍｔ、Ｓｃｇｂ３ａ１、Ｏｒ７ｃ１およびＤｎａｊｂ８からなる群より選択される遺伝子の発現産物由来である。
これらのポリペプチドを抗原としてがん幹細胞を死滅させる方法は、これに限定するものではないが、例えば、ＣＴＬ誘導による方法、ポリペプチド特異抗体を利用して免疫反応を起こす方法、ポリペプチドと結合することで機能を阻害する、あるいは拮抗する方法などが含まれる。

本発明の遺伝子の発現産物由来のエピトープと、それに特異的に反応する抗体と結合した場合、その結合抗体をシグナルとして免疫反応が活性化する。該エピトープは、それ自体ががん幹細胞に特異的に発現している分子マーカーまたはその構造の一部であるため、特異抗体が結合することで、がん幹細胞を特異的に認識する免疫カスケードの活性化を起こすことが可能であると強く示唆される。また、抗体にがん細胞を攻撃する薬剤などを結合するなどして使用することも可能である。これらによって、がん幹細胞を狙い撃つ、いわゆるミサイル療法への応用が可能である。
したがって、上記方法に用いる抗体ならびにポリペプチドおよび／または抗体を含む医薬組成物もまた、本発明に包含される。
医薬組成物としては、これに限定されるものではないが、例えばがんワクチン、抗がん剤などが挙げられる。これらの組成物は、本発明のポリペプチドおよび／または抗体の他に、必要に応じて、例えば抗腫瘍作用を有する薬剤、補助剤、医薬的に許容しうる担体などを適宜含有することができる。
さらに、上記のポリペプチドをコードする核酸、および該核酸を含む医薬組成物も、本発明に包含される。前記核酸を含む医薬組成物としては、これに限定されるものではないが、例えばＤＮＡワクチンなどが挙げられる。これらの組成物は、本発明の核酸の他に、必要に応じて、例えば抗腫瘍作用を有する薬剤、補助剤、医薬的に許容しうる担体などを適宜含有することができる。

本発明の分子マーカーであるポリペプチドの断片の中には、主要組織適合抗原（ＭＨＣ分子）と呼ばれるタンパク質によって、抗原提示されるものが存在する。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、ＭＨＣクラスＩ分子と結合した特定の抗原を認識して、抗原提示細胞をアポトーシスに導く免疫反応を起こす。
発明者らの研究によって、本発明の分子マーカー由来のポリペプチドのうち、一部のポリペプチドは、ヒトＭＨＣ分子の１つであるＨＬＡ−Ａ２４と高い親和性を示すことがわかっており、さらにその一部はＣＴＬを誘導して細胞をアポトーシスに導く能力を有することがわかった。この結果は、本発明のポリペプチドによってがん幹細胞に対する免疫記憶を与えることができることを強く示唆している。このことは、本発明のポリペプチドが、がん幹細胞を特異的に治療する方法に応用可能であることを実質的に示すものである。

本発明の分子マーカーは、がん幹細胞に特異的に発現しているため、そのポリペプチドの一部のいずれかがＭＨＣ分子によって抗原提示されていることが示唆される。このＭＨＣ分子に抗原提示されるポリペプチド（エピトープペプチド）をスクリーニングすることは、がんの治療において有用である。したがって、かかるスクリーニング方法も、本発明に包含される。
スクリーニングには、通常のエピトープマッピングの手法が適用できる。たとえば、目的ポリペプチドを適切な長さのペプチドに断片化したものを複数種類作製した後、目的ポリペプチドおよび／または断片化ペプチドと、抗原提示細胞とＴ細胞を共に培養してＴ細胞を感作する。その後、感作されたＴ細胞、抗原提示細胞および断片化ペプチドとを共に培養し、Ｔ細胞を再刺激する。その後、Ｔ細胞の活性化の度合いを測定し、活性化の度合いが高いペプチドを選別し、エピトープ配列を決定する。この際、活性化の度合いは細胞傷害活性やサイトカイン産生量の測定など、適宜当業者に周知の方法を選択することができる。また、Ｔ細胞のＨＬＡのタイプを特定することにより、特定のＨＬＡタイプに拘束される抗原ペプチドが選択される。

本発明の分子マーカーとして機能するＤＮＡは、がん幹細胞に特異的に発現するＤＮＡであり、その発現を抑制することで、がん幹細胞の有する機能を抑制することができると考えられる。よって、本発明の分子マーカーとして機能するＤＮＡの発現を抑制するための核酸もまた、本発明に含まれる。
発現を抑制する方法としては、これに限定するものではないが、例えばＲＮＡｉ、リプレッサーの発現などが挙げられる。よってＤＮＡの発現を抑制するための核酸には、これに限定するものではないが、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｈＤＮＡなどが含まれる。核酸は、ＤＮＡの発現を抑制するのに十分な塩基数があれば、いかなる長さであってもよい。

核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの他に、核酸アナログであってもよいが、汎用性などの観点から、好ましくはＤＮＡおよび／またはＲＮＡである。
本発明の分子マーカーとして機能するＤＮＡの発現を抑制することによって、がん幹細胞を特異的におよび／または効率よく攻撃できる可能性を示唆する。つまり、上記の核酸は遺伝子導入治療に応用できることが示唆される。よって本発明の核酸を含む医薬組成物もまた、本発明に包含される。
上記の医薬組成物は、これに限定するものではないが、例えば抗がん剤、転移抑制剤、ＤＮＡワクチンを含むがんワクチンなどのがん治療薬として用いることができる。これらの医薬組成物は、本発明の核酸の他に、必要に応じて、例えば抗腫瘍作用を有する薬剤、補助剤、医薬的に許容しうる担体などを適宜含有することができる。
また、本発明の核酸を用いて、がん幹細胞において、本発明の分子マーカーとして機能するＤＮＡの発現を抑制する方法も、本発明に包含される。
以下の実験例は本発明について、さらに具体的に説明するものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。当業者として通常の知識および技術を有するものは、本発明の精神を逸脱しない範囲で、下記実験例で示された態様に多様な改変を行うことができるが、かかる改変された態様も本発明に含まれる。

実験例１：がん細胞のＳＰ画分の単離
ａ）試薬の調整
培地は５％の抗ウシ胎児血清（ＦＣＳ）入りＤＭＥＭ培地を調整し、３７℃に温めておいた。ベラパミルは５０ｍＭに調整し、５％ＦＣＳ＋ＤＭＥＭで、５ｍＭに希釈した。ヘキスト３３３４２は５％ＦＣＳ＋ＤＭＥＭで２５０μｇ／ｍｌに調整した。ＤＮＡｓｅＩはＤＤＷで１ｍｇ／ｍｌに調整し、０．２μｍのフィルターでろ過滅菌した。
ｂ）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）用の細胞の調整
細胞を４ｍｌの５％ＦＣＳ＋ＤＭＥＭで懸濁し、細胞数を数えた。さらに５％ＦＣＳ＋ＤＭＥＭを加えて細胞濃度を１×１０^６個／ｍｌに調整し、ベラパミル（＋）用に１ｍｌをファルコンチューブに採取した。ベラパミル（＋）用および残りの細胞（ベラパミル（−）用）を３７℃で１０分間、ウォーターバスでインキュベートした。インキュベート後、ベラパミル（＋）用にはベラパミルの最終濃度が５０〜７５μＭになるようにベラパミル溶液を加え、その後ベラパミル（＋）用およびベラパミル（−）用に、ヘキスト３３３４２の最終濃度が２．５μＭ〜５．０μＭとなるようにヘキスト３３３４２溶液を加えた。

３７℃で９０分間振とうインキュベートし、すぐに氷上で冷却した。１１００〜１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離して上清を取り除いた。１×ＰＢＳ＋５％ＦＣＳ液で懸濁して、氷冷しておいたＦＡＣＳチューブに移した。再び１１００〜１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離して上清を取り除き、１×ＰＢＳ＋５％ＦＣＳ液で懸濁した。もう一度１１００〜１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離して上清を取り除き、１×ＰＢＳ＋５％ＦＣＳにＥＤＴＡを最終濃度２ｍＭとなるように加えたもの５００μｌで懸濁した。ＤＮＡｓｅＩ液を０．５μｌ加えてピペッティングし、ＦＡＣＳ用フィルターに通した。１ｍｇ／ｍｌのプロピジウム・アイオダイド（ＰＩ）を０．５μｌ加え、流動速度を１０００〜２０００個／秒でＦＡＣＳにかけた。
ｃ）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）
フローサイトメーターはBD FACS Aria II special edition（登録商標）（ベクトン・ディッキントン社製）を用いた。ＦＡＣＳの操作は取扱説明書にしたがって行った。最初にベラパミル（−）の細胞を流してＳＰ画分の細胞が検出できるかを確認し、確認できたらＳＰ画分にゲートをかけてベラパミル（＋）の細胞を流してＳＰ画分の細胞が消えているかを確認した。消えていればその画分の細胞はＳＰ画分細胞であると断定し、その画分の細胞の単離を行った。単離した細胞を４℃、１５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を取り除いた後、１００〜２００μｌの１×ＰＢＳで懸濁し、細胞数を数えた。
その結果、腺がんのＡ５４９、ＬＨＫ２、および小細胞がんのＬｃ８１７においてＳＰ画分の細胞が検出された。その結果を図１に示す。

考察
肺がんの中でも比較的転移を起こしやすい系統であるとされる腺がん、小細胞がんにおいてＳＰ画分の細胞が検出されたことは、がん幹細胞が転移の主要な原因であるとされる見解と一致する。

実験例２：腫瘍形成能実験
実験例１と同様の方法でＬＨＫ２、ＭＣＦ７およびＳＷ４８０セルラインそれぞれを用いて、分画したＳＰ細胞およびＭＰ細胞をマウスに接種して腫瘍形成能を確認した。同数のＳＰ細胞およびＭＰ細胞をそれぞれ氷上で１００μｌの１×ＰＢＳに懸濁し、１００μｌのマトリゲルに混ぜた。１００μｌの細胞マトリゲル混合液をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（オリエンタル工房社から入手）の背部皮下にＳＰおよびＭＰ細胞をそれぞれ、１箇所あたり１５００個接種し、腫瘍を形成し始めたら長径・短径の長さを測り、回転楕円体に近似して体積を算出して比較した。結果を図２に示す。
その結果、ＬＨＫ２から分画したＳＰ細胞は、わずか１５個の細胞移植で５匹中２匹に腫瘍を形成したり、１５０個の移植で５匹全てに腫瘍を形成するなど、１５０個の移植では１匹も腫瘍を形成することの無かったＭＰ細胞と比較して、はるかに高い腫瘍形成能を有していることがわかった。これはがん幹細胞が腫瘍形成の大きな要因であり、ＳＰ画分細胞にがん幹細胞が濃縮されるという見解と一致する。（参考文献Kondo T, Setoguchi T, Taga T. Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 20:781-786, 2004.)

実験例３：ＤＮＡマイクロアレイによる発現の確認
ａ）ｍＲＮＡの抽出
実験例１と同様の方法で単離したＳＰ細胞およびＭＰ細胞を、室温、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取り除いた。ｍＲＮＡの抽出はＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、キットのプロトコルにしたがって行った。
ｂ）ｍＲＮＡの増幅とラベリング
抽出したｍＲＮＡをSigma Genosys社から入手したＲＮＡ増幅キットを使用してｍＲＮＡを増幅し、さらにSigma Genosys社から入手したｍＲＮＡラベリングキットを用いて増幅したｍＲＮＡに、ＳＰ画分から抽出したものにＣｙ５を、ＭＰ画分から抽出したものにＣｙ３をそれぞれ標識、さらに色素を交換してＳＰ画分から抽出したものにＣｙ３を、ＭＰ画分から抽出したものにＣｙ５をそれぞれ標識した。

ｃ）マイクロアレイ
異なる色素で標識したＳＰ画分由来のｍＲＮＡとＭＰ画分由来のｍＲＮＡとを混合し、Sigma Genosis社から入手したＤＮＡチップ(Panorama（登録商標） Micro Array, Human)を用いて、マイクロアレイキットのプロトコルどおりにハイブリダイズさせ、ｍＲＮＡの発現を解析した。その結果、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｓｍｃｐ遺伝子、Ｉｎｔｓ１遺伝子、Ｋｏｘ１２遺伝子、Ｍｄｆ１遺伝子、ＦＬＪ１３４６４遺伝子、６６７Ｊ２３２遺伝子、Ｓｕｒｆ６遺伝子、Ｐｃｄｈ１９遺伝子、Ｄｃｈｓ２遺伝子、Ｐｃｄｈ２１遺伝子、Ｇａｌ３ｓｔ１遺伝子、Ｒａｓｌ１１ｂ遺伝子、Ｈｅｓ６遺伝子、Ｚｎｆ４１５遺伝子、Ｎｋｘ２−５遺伝子、Ｐａｍｃｉ遺伝子、Ｐｎｍｔ遺伝子、Ｓｃｇｂ３ａ１遺伝子、Ｏｒ７ｃ１遺伝子、およびＤｎａｊｂ８は、ＳＰ画分において発現しているがＭＰ画分では発現していないまたは発現していてもごくわずかであることが確認された。

実験例４：Ｓｏｘ２の発現
ａ）ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマー
実験例でＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーのリストを表１に示す。

ｂ）Ｓｏｘ２の正常細胞における発現
実験例３ｃ）で確認されたＳｏｘ２について、さらに有用性を確認するため、ヒト成人正常細胞において発現を調査した。ヒト成人正常組織由来ｍＲＮＡパネルをクロンテック社から入手し、これを用いてＲＴ-ＰＣＲを行った。ｍＲＮＡパネルには、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、末梢血単核球の各成人正常細胞および組織由来のｍＲＮＡが含まれている。

まず、SuperScript（登録商標） III逆転写酵素（インビトロジェン社製）を用いて、キットのプロトコルにしたがってｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
合成したｃＤＮＡを、順行プライマーおよび逆行プライマー（表1参照）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりＳｏｘ２のｃＤＮＡを増幅した。またコントロールとして、Ｇ３ＰＤＨのｃＤＮＡを同様の方法で増幅した。ＰＣＲ条件を表２に示す。

増幅した増幅物に対して１．５％アガロースゲルを用いて、１００Ｖで２５分間電気泳動を行った。結果を図３ａ）に示す。
ｃ）Ｓｏｘ２のがんセルラインにおける発現
肺がんセルラインであるＬＨＫ２、大腸がんセルラインであるＳＷ４８０およびＫＭ１２ＬＭならびに乳がんセルラインであるＭＣＦ７を実験例１と同様にＳＰ画分およびＭＰ画分に分離した。それぞれのＳＰ画分およびＭＰ画分から実験例３ａ）と同様にｍＲＮＡを抽出し、実験例４ｂ）と同様にｃＤＮＡを合成した。Ｓｏｘ２プライマー（表１参照）を用いて表２の条件でＳｏｘ２のｃＤＮＡを増幅し、増幅物に対して１．５％アガロースゲルを用いて、１００Ｖで２５分間電気泳動を行った。結果を図３ｂ）に示す。

考察
Ｓｏｘ２はヒトの成人正常組織において発現が確認されなかった。これはＳｏｘ２が組織中の正常細胞を認識しないマーカーであることを示し、またＳｏｘ２を利用することで腫瘍細胞特異的に治療を行える可能性を示唆している。またＬＨＫ２，ＳＷ４８０、ＫＭ１２ＬＭ、ＭＣＦ７の４系統のＳＰおよびＭＰ画分の細胞について調べた結果、どの系統でもＳＰ画分の細胞において強く発現し、ＭＰ画分の細胞においてはほとんど発現が見られなかったことは、Ｓｏｘ２がＳＰ画分の細胞、つまりがん幹細胞特異的なマーカーとして利用可能であることを示している。

実験例５：ＳｍｃｐおよびＦＬＪ１３４６４の発現
実験例３ｃ）で確認されたＳｍｃｐおよびＦＬＪ１３４６４について、さらに有用性を確認するため、ヒト成人正常組織および他のがん細胞において発現を調査した。ヒト成人正常組織はクロンテック社から入手した心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、胃、骨髄を含むヒト成人正常組織ｍＲＮＡパネルを用い、がん細胞として肺がんセルラインのＬＨＫ２，大腸がんセルラインのＳＷ４８０、ＫＭ１２ＬＭ、乳がんセルラインのＭＣＦ７、悪性線維性組織球腫セルラインのＭＦＨ０３を用いた。
各細胞および組織のｍＲＮＡから実験例４ｂ）と同様にｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを、Ｓｍｃｐ順行プライマーおよび逆行プライマー（表１参照）、ならびにＦＬＪ１３４６４順行プライマーおよび逆行プライマー（表１参照）を用いて、表２に示したＰＣＲ条件によりＳｍｃｐおよびＦＬＪ１３４６４のｃＤＮＡを増幅した。またコントロールとして、Ｇ３ＰＤＨのｃＤＮＡを上記と同様の方法で増幅した。増幅した増幅物に対して１．５％アガロースゲルを用いて、１００Ｖで２５分間電気泳動を行った。結果を図４ａ）に示す。

実験例４と同様にＳＷ４８０，ＫＭ１２、ＬＨＫ２、ＭＣＦ７のＳＰおよびＭＰ画分の細胞からｃＤＮＡを合成、ＳｍｃｐおよびＦＬＪ１３４６４増幅プライマーセットを用いてそれぞれのｃＤＮＡを増幅、増幅物に対してアガロース電気泳動を行った。結果を図４ｂ）に示す。
考察
ＳｍｃｐおよびＦＬＪ１３４６４はほとんどのヒトの成人正常組織において発現が見られなかったが、ＦＬＪ１３４６４は膵臓と胃において、Ｓｍｃｐは精巣において多少の発現が見られた。これは、ほとんどの組織においてＳｍｃｐおよびＦＬＪ１３４６４が組織中の正常細胞を認識しないマーカーであることを示し、正常細胞で発現が見られない組織においては腫瘍細胞特異的に治療を行える可能性を示唆している。また実験例４の結果と同様、ＳＷ４８０，ＫＭ１２、ＬＨＫ２、ＭＣＦ７においても、ＳｍｃｐがＳＰ画分細胞特異的に発現しており、ＦＬＪ１３４６４もＭＣＦ７においてＳＰ画分細胞特異的に発現していることから、ＳｍｃｐおよびＦＬＪ１３４６４についてもがん細胞特異的なマーカーとしての利用可能性を示す結果となった。

実験例６：他の遺伝子の発現
他の遺伝子に関しても実験例５と同様に各正常細胞における発現を確認した。結果を図５に一覧表として示す。

実験例７：Ｓｏｘ２の他のがん細胞セルラインにおける発現
実験例４において調査したがん細胞セルライン以外においてＳｏｘ２が発現しているかを詳細に調べるため、肺がん細胞セルライン１４種、腎細胞がんセルライン３種、前立腺がん細胞セルライン１種、子宮がん細胞セルラインＨｅＬａ細胞において、実験例４と同様にＳｏｘ２の発現を確認した。ポジティブコントロールとして胎児脳細胞、ネガティブコントロールとして２回蒸留水を用いた。結果を図６に示す。
考察
調査した全てのがん細胞セルラインにおいてＳｏｘ２の発現が確認された。このことは、現在知られている他のがん幹細胞分子マーカーよりもはるかに多種のがん細胞セルラインに対して、Ｓｏｘ２ががん幹細胞分子マーカーとして機能することを示している。また、多種多様なセルラインにおいて共通して発現していることは、Ｓｏｘ２が体内の部位にかかわらず、がん治療の標的になりうることを示唆している。

実験例８：Ｓｍｃｐの他のがん細胞における発現
実験例５と同様に、Ｓｍｃｐが他のがん細胞セルラインにおいて発現しているかを詳細に調べた。がん細胞セルラインとして腎細胞がんセルライン６種、肺がん細胞セルライン７種、前立腺がん細胞セルライン１種において実験例５と同様にＳｍｃｐの発現を確認した。ポジティブコントロールとして精巣細胞、ネガティブコントロールとしてマウスの肺がん細胞を用いた。ＰＣＲのサイクル数を３５サイクルおよび４０サイクルとして行った結果を図７に示す。
考察
調査した全てのがん細胞セルラインにおいてＳｍｃｐの発現が確認された。このことはＳｏｘ２と同様Ｓｍｃｐも既存のがん幹細胞分子マーカーよりもはるかに多種のがん細胞セルラインに対して分子マーカーとして機能することおよび治療の標的として利用可能性があることを示唆している。

実験例９：Ｉｎｔｓ１の正常細胞、他のがん細胞およびがんセルラインにおける発現
ａ）正常細胞および他のがん細胞における発現
実験例３ｃ）で確認されたＩｎｔｓ１について、さらに有用性を確認するため、実験例５と同様に、Ｉｎｔｓ１順行プライマーおよび逆行プライマー（表１参照）を用いて、ヒト成人正常細胞および他のがん細胞において発現を調査した。その結果を図８ａ）に示す。
ｂ）他のがんセルラインにおける発現
実験例８と同じセルライン用いて、他のがんセルラインにおけるＩｎｔｓ１の発現を確認した。結果を図８ｂ）に示す。

考察
Ｉｎｔｓ１は正常細胞では、膵臓と脾臓にごくわずかな発現が見られた他は発現が確認できなかった。この結果は、ほぼ全ての組織においてＩｎｔｓ１が組織中の正常細胞を認識しないマーカーであることを示し、正常細胞で発現が見られない組織において、または見られた膵臓および脾臓においても検出感度次第ではは、腫瘍細胞特異的に治療を行える可能性を示唆している。また実験例４の結果と同様、ＳＷ４８０，ＫＭ１２、ＬＨＫ２、ＭＣＦ７においても、ほぼＳＰ細胞特異的に発現しているので、がん幹細胞のマーカーとして有用であることが示唆される。
他のがんセルラインにおいては、一部を除いてほとんどのがんセルラインで発現が確認された。これはＩｎｔｓ１が既存のがん幹細胞分子マーカーよりもはるかに多種のがん細胞セルラインに対して分子マーカーとして機能することおよび治療の標的として利用可能性があることを示唆している。

実験例１０：抗ＳＯＸ２抗体を用いた肺がん組織の免疫組織染色
抗ＳＯＸ２ポリクローナル抗体（ZYMED社製）を用いて、肺がんの組織に対して免疫組織染色を行った。２０％ホルマリン固定液で固定されたヒト肺ガンのパラフィン包埋切片をエチルアルコールで脱パラフィン処理した。切片を０．０１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸して、１１０℃で５分間オートクレーブして抗原賦活化処理した。抗ＳＯＸ２ポリクローナル抗体０．５ｍｌを切片上に滴下し、室温で１時間インキュベーションした。その後ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。２次抗体としてペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（シンプルステインＭＡＸ−ＰＯ、ニチレイ社製）を切片上に滴下し、室温で３０分間インキュベートした。その後ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。切片を過酸化水素水とＤＡＢ基質の混合液（シンプルステインＭＡＸ−ＰＯ、ニチレイ社製）に浸し、１〜２分間発色反応させた。その後切片を流水で１分間洗浄し、ヘマトキシリンで１〜２分間核染色を行った。結果を図９に示す。

考察
ＳＯＸ２抗原タンパク質が茶色く染色されている。一部の細胞が濃く茶色に染色されているほか、腫瘍先進部に相当する部分において帯状に薄く染色された。この結果は抗ＳＯＸ２抗体を用いて免疫染色することで、肺がんにおいて組織中のがん幹細胞の形態、細胞数、位置を明らかにすることが可能であることを示している。

実験例１１：抗ＳＯＸ２抗体を用いた乳がん組織の免疫組織染色
実験例１０と同様に、Ｂａｓａｌｏｉｄ ｔｙｐｅの乳がんの組織に対して免疫組織染色を行った。比較例として、基底細胞のマーカーであるＣＫ（サイトケラチン）５の染色も行った。結果を図１０に示す。乳がん組織においてもＳＯＸ２抗原タンパク質が茶色く染色されて観察された。このことは乳がんにおいてもＳＯＸ２ががん幹細胞の形態、細胞数、位置を明らかにすることが可能であることを示している。Ｂａｓａｌｏｉｄ ｔｙｐｅの乳癌は、一般的に予後が悪く、転移率が高いと認識されているが、このことにＳＯＸ２が関与している可能性が示唆される。

実験例１２：抗ＳＯＸ２抗体を用いた正常組織の免疫組織染色
実験例１０と同様に、脳、肺、胃、膵臓の正常組織に対して免疫組織染色を行った。結果を図１１に示す。胃のごく一部で核の濃染像が認められたが、他の組織では発現が認められなかった。このことは、正常組織においては、ＳＯＸ２がほとんど発現していないことを示している。

実験例１３：ＳＯＸ２の強制発現による、造腫瘍能力の変化
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＳｏｘ２を強制発現した細胞（ＬＨＫ２−ＳＯＸ２細胞）およびモックトランスフェクトした細胞（ＬＨＫ２−ｍｏｃｋ細胞）をそれぞれ１００００個ずつ、１００μＬの細胞マトリゲル混合液として左右の背部皮下に接種し、腫瘍を形成し始めたら長径・短径の長さを測り、回転楕円体に近似して体積を算出して比較した。結果を図１２に示す。
考察
Ｓｏｘ２を強制発現した腫瘍組織において、強制発現していない腫瘍組織に比べて、顕著な造腫瘍性が観察された。この結果は、Ｓｏｘ２が発現すると、細胞の造腫瘍能力が高まることを示している。このメカニズムは、ｉＰＳ細胞の癌化にも関係していると考えられる。

実験例１４：ＳＯＸ２陽性乳癌患者の生存率調査
乳癌原発巣組織の免疫組織染色を行い、乳癌症例２０１例を、ＳＯＸ２陽性乳癌４０例とＳＯＸ２陰性乳癌１６１例とに分類した。図１３は、それぞれの分類における、生存率の経時変化を表したグラフである。ＳＯＸ２陽性乳癌患者は、ＳＯＸ２陰性乳癌患者と比較して、有意に生存率が低いことがわかった。

実験例１５：ＳＯＸ２の発現抑制
ｓｈＤＮＡオリゴヌクレオチドには、Ｓｏｘ２用として配列番号４３、４４のオリゴヌクレオチドをアニーリングしたもの、ネガティブコントロール用として配列番号４５、４６のオリゴヌクレオチドをアニーリングしたものをそれぞれ用いて、ベクターのプロトコルにしたがってRNAi-Ready pSIREN-RetroQベクターに導入し、ｓｈ−ＳＯＸ２プラスミドおよびｓｈ−ＥＧＦＰプラスミドをそれぞれ作成した。ＬＨＫ２セルラインに、ｓｈ−ＳＯＸ２プラスミドおよびネガティブコントロールとしてｓｈ−ＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクションし、シスプラチンをそれぞれ０、１０、３０、１００μＭの濃度で含有するＤＭＥＭ培地で、３７℃、２４時間培養した。その後、ＭＴＴ法によって細胞生存率を測定した。結果を図１４に示す。

考察
ｓｈ−ＳＯＸ２を導入した細胞において、Ｓｏｘ２遺伝子の発現が顕著に抑制された。さらに、Ｓｏｘ２遺伝子の発現が抑制された細胞は、抑制されていない細胞と比較して、シスプラチン含有培地での培養において、生存率が優位に低下した。このことは、Ｓｏｘ２遺伝子の発現抑制によって、細胞のシスプラチンに対する感受性が有意に高まったことを示している。

実験例１６：Ｓｏｘ２由来ペプチドのＨＬＡ−Ａ２４ペプチド結合アッセイ
Ｓｏｘ２のアミノ酸配列は、配列番号６２に示されている。ＨＬＡ−Ａ２４に結合するペプチドは、２番目のアミノ酸がチロシン、トリプトファン、フェニルアラニンまたはメチオニンであり、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニンまたはメチオニンであることが知られている。Ｓｏｘ２のアミノ酸配列に含まれる配列のうち、このＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有する９から１１アミノ酸配列を選択し、以下のペプチドを計１３種類合成した。
ＳＯＸ２＿１：ＭＹＮＭＭＥＴＥＬ（配列番号４７）
ＳＯＸ２＿５０：ＶＷＳＲＧＱＲＲＫＭ（配列番号４８）
ＳＯＸ２＿５８：ＫＭＡＱＥＮＰＫＭ（配列番号４９）
ＳＯＸ２＿８９：ＰＦＩＤＥＡＫＲＬ（配列番号５０）
ＳＯＸ２＿１０９：ＫＹＲＰＲＲＫＴＫＴＬ（配列番号５１）
ＳＯＸ２＿１１９：ＬＭＫＫＤＫＹＴＬ（配列番号５２）
ＳＯＸ２＿１２４：ＫＹＴＬＰＧＧＬＬ（配列番号５３）
ＳＯＸ２＿１６５：ＧＷＳＮＧＳＹＳＭ（配列番号５４）
ＳＯＸ２＿１７０：ＳＹＳＭＭＱＤＱＬ（配列番号５５）
ＳＯＸ２＿１９６：ＰＭＨＲＹＤＶＳＡＬ（配列番号５６）
ＳＯＸ２＿２０９：ＳＭＴＳＳＱＴＹＭ（配列番号５７）
ＳＯＸ２＿２１６：ＹＭＮＧＳＰＴＹＳＭ（配列番号５８）
ＳＯＸ２＿２２６：ＳＹＳＱＱＧＴＰＧＭ（配列番号５９）

Ｔ２−Ａ２４細胞はヒトリンパ芽球様細胞Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を導入して発現させた細胞株である。この細胞の細胞表面には低レベルのＨＬＡ−Ａ２４分子が発現しており、ＨＬＡ−Ａ２４特異的モノクローナル抗体とフローサイトメーターを用いて検出することができる。発現レベルは平均蛍光強度(ＭＦＩ)として定量化される。この細胞に試験管内で合成ペプチドを添加すると、添加したペプチドがＨＬＡ−Ａ２４分子と結合する場合、結合親和性と相関して細胞表面ＨＬＡ−Ａ２４発現レベルが増加する。この実験系を用いて、本発明のＳＯＸ２由来癌抗原ペプチドのＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を解析した。
Ｔ２−Ａ２４細胞を、２６℃で一晩培養した。その後細胞をＰＢＳで洗浄し、ＳＯＸ２由来の合成ペプチド、ポジティブコントロールとしてヒト免疫不全ウィルス由来のペプチドであるＨＩＶペプチド（配列番号６０）、エプスタイン−バーウィルス由来のペプチドであるＥＢＶペプチド（配列番号６１）、およびネガティブコントロールとして卵白アルブミン由来のペプチドであるＳＬ８ペプチド（配列番号６３）を加えて、２６℃で３時間共培養した。温度を３７℃にしてさらに２．５時間共培養した後、遠心分離して上清を除き、細胞を単離した。単離した細胞にＨＬＡ−Ａ２４抗体（Ｃ７７０９Ａ２．６）を加え、４℃で１時間静置し、その後ＰＢＳで洗浄した。２次抗体として蛍光標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体を加え、４℃で３０分静置した後、１％ホルマリンを加えて細胞を固定した。固定した細胞を、フローサイトメーター（BD FACS Calibur）にて、ＦＩＴＣ蛍光強度を計測した。

結果は図１５に示されている。ポジティブコントロールと同等以上か、それに近い蛍光強度を示した８個のＳＯＸ２ペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチドと判定した。

実験例１７：ＣＴＬ誘導
インフォームドコンセントを得たＨＬＡ−Ａ２４陽性肺がん患者あるいはＨＬＡ−Ａ２４陽性健常者の末梢血５０ｍｌから、フィコール・コンレイ密度勾配中で遠心することにより、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離、回収した。続いてＣＤ８ ＭＡＣＳ ｂｅａｄｓを用いて、ＰＢＭＣよりＣＤ８陽性リンパ球とＣＤ８陰性リンパ球に分離した。
９６ウェルプレートで２０００００個／ウェルのＣＤ８陰性リンパ球と上記ＨＬＡ−Ａ２４結合性ＳＯＸ２ペプチドをそれぞれ混ぜ、室温で２時間静置後、１００Ｇｙ分放射線処理した。処理した細胞を２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（武田薬品工業）、１０００００個／ウェルのＣＤ８陽性リンパ球と共培養し、ＣＤ８陽性リンパ球刺激を週１回行い、計３回刺激してＣＴＬを誘導した。誘導したＣＴＬのペプチド特異的反応性を細胞傷害アッセイあるいはＥＬＩＳＰＯＴアッセイにて評価した。

実験例１８：細胞傷害アッセイ
Ｔ２Ａ２４にＣｒ^５１を加え、ＲＰＭＩ培地中で、３７℃で１時間培養して放射線標識した後、ＲＰＭＩ培地で4回洗浄した。Ｃｒ標識したＴ２Ａ２４にＳＯＸ２ペプチドあるいはコントロールペプチド（ＨＩＶペプチド）を混ぜ、室温で１時間静置した。ＳＯＸ２ペプチドあるいはコントロールペプチドをパルスした２０００個／ウェルのＴ２Ａ２４と、実施例２にて誘導した１４０００個／ウェルのＣＤ８陽性リンパ球をＲＰＭＩ培地中で、３７℃で４時間共培養した。その後上清を回収し、ガンマカウンターにてガンマ線量を測定した。
またＲＰＭＩ培地のみとペプチドパルスＴ２Ａ２４を培養した場合の線量を自然放出（ＳＰＲ）、細胞溶解液(２％のＮＰ４０)とペプチドパルスＴ２Ａ２４を培養した場合の線量を最大放出(ＭＸＲ)とし、細胞障害活性を(測定値−ＳＰＲ）／（ＭＸＲ−ＳＰＲ）×１００として算出した。

その結果、ＳＯＸ２＿１０９ペプチドをパルスしたＴ２Ａ２４に対して特異的に障害するＣＴＬを検出した。結果を図１６に示す。コントロールペプチドであるＨＩＶ由来ペプチドでは、傷害細胞由来の放射線がほとんど検出されないのに対して、ＳＯＸ２＿１０９ペプチドでは多く検出された。

実験例１９：ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
実験はHuman IFNγ ELISPOT set (BD)を使用して行った。ＥＬＩＳＰＯＴプレートに抗ＩＦＮγ抗体を４℃で一晩静置してコートした。Ｔ２Ａ２４にＳＯＸ２ペプチドあるいはコントロールペプチド(ＨＩＶペプチド)をそれぞれ加え、室温１時間静置した。５００００個のペプチドパルスしたＴ２Ａ２４と、実施例２にて誘導した１００００個のＣＴＬを抗ＩＦＮγ抗体をコートしたプレートで、３７℃で一晩共培養した。１×ＰＢＳと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄後、ビオチン標識抗ＩＦＮγ抗体を加え、室温で２時間静置した。１×ＰＢＳと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを加え、室温で１時間静置した。１×ＰＢＳと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄後、発色試薬を加え、スポット数を測定した。
結果を図１７に示す。ＳＯＸ２＿１０９ペプチドをパルスしたＴ２Ａ２４に対して特異的に反応するＣＴＬを検出した。コントロールペプチドであるＨＩＶ由来ペプチドでは、Ｔ細胞からのＩＦＮγの放出が検出されなかったが、ＳＯＸ２＿１０９ペプチドでは多くのＩＦＮγが放出されたことが確認できる。

実験例２０：ＳＭＣＰの過剰発現による、造腫瘍性の変化
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＳｍｃｐを強制発現した細胞（ＬＨＫ２−ＳＭＣＰ細胞）およびＬＨＫ２−ｍｏｃｋ細胞をそれぞれ１００００個および１０００個ずつ１００μＬの細胞マトリゲル混合液として左右の背部皮下に接種し、腫瘍を形成し始めたら長径・短径の長さを測り、回転楕円体に近似して体積を算出して比較した。結果を図１８に示す。
考察
ＳＭＣＰを過剰発現する細胞は、モックトランスフェクトした細胞に比べ、早く大型の腫瘍を形成した。特に少数の細胞においても、顕著に高い造腫瘍性を有し、このことは、ＳＭＣＰががん幹細胞の腫瘍形成能力と関連した遺伝子であることを示唆している。

実験例２１：ＳＭＣＰの発現抑制
ｓｉ−ＲＮＡは、Stealth Select RNAi（登録商標）siRNA (Catalog# 1299003)（invitrogen）を使用した。ＳＭＣＰ１はOligoID HSS142897のもの、ＳＭＣＰ３はOligoID HSS142899のものを指す。ネガティブコントロールとしてStealth RNA（登録商標） siRNA Negative Control Hi GC (12935-400)を使用した。ｓｉ−ＲＮＡ １００ｐｍｏｌとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ ４μｌを混合し、ＤＭＥＭ培養液で３７℃、２日間培養し、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現レベルを測定した。結果を図１９ａ）に示す。また遺伝子導入１日後から４日後までのそれぞれの細胞数の増加を測定した。結果を図１９ｂ）に示す。遺伝子導入の２日後に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＳＭＣＰ１を導入した細胞（ＬＨＫ２−ｓｉ−ＳＭＣＰ１細胞）またはＳＭＣＰ３を導入した細胞（ＬＨＫ２−ｓｉ−ＳＭＣＰ３細胞）、およびネガティブコントロールを導入した細胞（ＬＨＫ２−ｓｉ−ｃｏｎｔｒｏｌ細胞）をそれぞれ２０００００個ずつ１００μＬの細胞マトリゲル混合液として左右の背部皮下に接種し、腫瘍を形成し始めたら長径・短径の長さを測り、回転楕円体に近似して体積を算出して比較した。結果を図２０に示す。

考察
ＳＭＣＰ遺伝子の発現を抑制した細胞は、有意に細胞増殖能および腫瘍形成能が低下していた。配列の一部が異なるｓｉ−ＳＭＣＰ１およびｓｉ−ＳＭＣＰ３の間においても、増殖能および腫瘍形成能の低下に有意に差ができた。これらの結果は、ＳＭＣＰ遺伝子の発現を抑制することで、がんの治療が可能であることを示唆している。

実験例２２：ＤＮＡＪＢ８のＲＴ−ＰＣＲ
ＤＮＡＪＢ８はＤＮＡＪ／ＨＳＰ４０ファミリーの一員で２６ＫＤのタンパクをコードする遺伝子であるが、精巣に高発現を認める以外、その局在、機能については詳細な報告はなされていない。ＤＮＡＪ／ＨＳＰ４０ファミリーは、その多くがＮ末端にＪドメインを有し、そのＪドメインがＨＳＰ７０と結合することによりＡＴＰの加水分解を促し、ＨＳＰ７０の基質結合領域の構造的変化をもたらすことで、ＨＳＰ７０の活性を制御していると考えられている。ＨＳＰ４０自身もペプチド結合領域を有し、ＨＳＰ７０へのペプチドの受け渡しの機能を有するものも存在する。

Human Multiple Tissue cDNA Panels I, II (Clontech) を正常組織のｃＤＮＡとして使用し、培養癌細胞株のＲＮＡはRNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて抽出した。培養癌細胞株として、腎癌細胞株のＡＣＨＮ、Ｃａｋｉ−１、ＳＭＫＴＲ２、ＳＭＫＴＲ３、マウス腎癌細胞株のＲｅｎＣａ、膀胱癌細胞株のＳＷ７８０、ＬＢ９０５−ＢＬＣ、ＵＭ−ＵＣ３、Ｔ２４、前立腺癌細胞株のＤＵ１４５、ＬＮ−ＣａＰ、乳癌細胞株のＭＣＦ７をそれぞれ用いた。抽出したＲＮＡ２μｇからSuperscript III逆転写酵素とオリゴ（ｄＴ）プライマー (Invitrogen)を用いてｃＤＮＡを精製した。ＰＣＲはｃＤＮＡ０．２５μｇとTaq DNA polymerase (Qiagen)０．１μｇとプライマー１２ｐｍｏｌを含む計２０μｌで行った。ＰＣＲ条件は、実験例４ｂ）の表２に記載の条件で、３５サイクルで行った。マウスＤＮＡＪＢ８を検出するためのプライマー配列は、TGACAGATGGAGAGCAGGTG（配列番号６４）、アンチセンスプライマーがCCCTCATGAGCTTCTCCTTG（配列番号６５）で行った。ＰＣＲ産物の大きさはヒトＤＮＡＪＢ８が４０８ｂｐ、マウスＤＮＡＪＢ８が４６３ｂｐであった。対照のＧ３ＰＤＨのプライマー配列はACCACAGTCCATGCCATCAC（配列番号６６）、アンチセンスプライマーがTCCACCACCCTGTTGCTGTA（配列番号６７）でＰＣＲ産物の大きさは４５２ｂｐであった。
結果を図２１に示す。精巣において強く発現している以外、ヒトの正常細胞においてＤＮＡＪＢ８の発現はほとんど見られなかった。一方、上記培養癌細胞株においては、発現レベルの多少の違いはあるものの、全ての細胞株において発現が認められた。

実験例２３：フローサイトメトリー解析
ＡＣＨＮ、ＭＣＦ７、ＲｅｎＣａ細胞を８０％の密度まで培養し、実験例１と同様にフローサイトメトリーで解析した。結果を図２２に示す。
３種の細胞株いずれにおいてもＳＰ画分が単離され、ＭＰ画分と比較して強いＤＮＡＪＢ８の発現が確認された。

実験例２４：造腫瘍能の検定
実験例２と同様の方法で、ＲｅｎＣａ細胞をｂａｌｂ／ｃマウス（メス、６週）の背部下皮の左右へそれぞれ１０^４、１０^３、１０^２、１０^１づつ接種し、１週ごとに腫瘍径を測定した。腫瘍の体積は以下の近似式で計算した。
腫瘍容積(ｍｍ^３)＝長径(ｍｍ)×短径(ｍｍ)^２×１／２。
結果を図２３に示す。ＲｅｎＣａのＳＰ細胞はＭＰ細胞や細胞を分離する前の細胞と比較して強い造腫瘍能を認めた。

実験例２５：ＤＮＡワクチン免疫・予防実験
ａ）ＤＮＡプラスミドの作成
ＤＮＡＪＢ８、Ｓｕｒｖｉｖｉｎを発現するプラスミドを作成するためにＲｅｎＣａ ｃＤＮＡからクローニングを行い、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター(Invitrogen)のＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩの制限酵素部位へ挿入した。抗原の５’側へ免疫グロブリンκ鎖のシグナル配列５’-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC-３’をＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素部位へ挿入し、抗原の３’側へＦＬＡＧ配列５’-GATTACAAGGATGACGACGATAAG-３’をＸｂａＩ、ＰｍｅＩの制限酵素部位で挿入した。ＤＮＡプラスミドはEndoFree Plasmid Giga kit (Qiagen)で増幅、精製し、ＤＮＡの濃度は２６０ｎｍの吸光度により測定した。

ｂ）ウェスタンブロッティング
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を７０％の密度まで培養した。抗原を含むプラスミドをFuGENE HD (Roche)を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ遺伝子導入した。３７℃で４８時間培養後、培養上清を回収し、１５００ｒｐｍで５分遠心し、その上清を採取した。上清に０．１ＭのＤＴＴを総量の１０％加え、１００℃で５分加熱した。
サンプルは１２％のゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ニトロセルロースメンブレンへ転写した。メンブレンをブロッキングし、５０００倍希釈した一次抗体を加え３０分、室温で反応後、５０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識２次抗体で３０分、室温で反応した。ECL Western blotting detection reagents (Amersham)を用いて化学発光法により抗原を同定した。
結果を図２４に示す。図２４ａ）はプラスミド構築物のマップを表わし、該プラスミド構築物は分泌型のＤＮＡＪＢ８をコードする。さらに３’末端側にＦＬＡＧタグ配列を有している。図２４ｂ）はウェスタンブロッティングの結果を示す。これにより、このプラスミド構築物は、分泌型のＤＮＡＪＢ８およびＳｕｒｖｉｖｉｎを発現することが分かった。

ｃ）ワクチン免疫・予防実験
ＤＮＡプラスミドワクチンは、各群５匹づつｂａｌｂ／ｃマウス（６週、メス）の足へ２００μｇ／匹、１週毎に計４回接種し、最終接種日の１週後にＲｅｎＣａを１０^５／匹づつ背部皮下へ接種した。１週毎に腫瘍径を測定し、ＤＮＡワクチンの免疫原性を検討した。
結果を図２５に示す。ＤＮＡＪＢ８を免疫したマウスは、ｓｕｒｖｉｖｉｎを免疫したマウスよりさらに有意に腫瘍の増大抑制効果を認めた。

実験例２６：ＤＮＡＪＢ８由来ペプチド断片によるペプチド結合アッセイ
ＢＩＭＡＳ(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)でＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＤＮＡＪＢ８にコードされる抗原ペプチド配列を予測し、４つ作成した。
ＤＮＡＪＢ８(２２−３０)：ＡＹＲＫＬＡＬＲＷ（配列番号６８）
ＤＮＡＪＢ８(９０−９９)：ＧＹＴＦＲＮＰＥＤＩ（配列番号６９）
ＤＮＡＪＢ８(９９−１０７)：ＩＦＲＥＦＦＧＧＬ（配列番号７０）
ＤＮＡＪＢ８(１４３−１５１)：ＡＦＭＥＡＦＳＳＦ（配列番号７１）
ペプチドトランスポーターを欠損したＴ２細胞にＨＬＡ−Ａ２４０２を遺伝子導入した細胞株Ｔ２Ａ２４をアッセイに使用し、実験例１６と同様に実験を行った。本実験例では、ネガティブコントロールとしてＳＬ−８を、ポジティブコントロールとしてｓｕｒｖｉｖｉｎ-２Ｂ（配列番号７２）を用いた。
結果を図２６に示す。図２６ａ）は蛍光の遷移を表わし、図２６ｂ）は平均蛍光強度を表わす。設計した４つのペプチドのうち３つがＨＬＡ−Ａ２４との結合を認めた。

実験例２７：ＤＮＡＪＢ８恒常発現株の作成
腎癌細胞株ＡＣＨＮを７０％まで培養し、レトロウイルスベクターにより抗原を遺伝子導入した。３７℃で４８時間培養後、ピューロマイシン１μｇ／ｍｌを加えて細胞を選択した。
結果を図２７に示す。ＤＮＡＪＢ８を恒常的に発現する細胞株では、ＳＰ画分の細胞数が有意に増大した。

実験例２８：ＯＲ７Ｃ１のＲＴ−ＰＣＲ
olfactory receptor family 7 subfamily C member 1（ＯＲ７Ｃ１）は、その構造からolfactory receptor familyに分類される、Ｇタンパク共役型タンパク質で7回膜貫通型タンパク質である。舌での発現が報告されている他は、現在までにそのリガンドについてなどの詳細な報告はない。
Human Multiple Tissue cDNA Panels I, II (Clontech) を正常組織のｃＤＮＡとして使用した。培養癌細胞株のRNAはRNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて抽出した。培養癌細胞株として、ヒト大腸癌細胞株Ｓｗ４８０、ＨＴ２９、ＨＣＴ１５、ＫＭ１２ＬＭ、ヒト肺癌細胞株ＬＨＫ２を用いた。抽出したＲＮＡ２μｇからSuperscript III逆転写酵素とoligo(dT) primer (Invitrogen)を用いてｃＤＮＡを精製した。ＰＣＲはｃＤＮＡ ０．２５μｇとTaq DNA polymerase (Qiagen) ０．１μｇとプライマー １２ｐｍｏｌを含む計２０μｌで行った。ＰＣＲ条件は、実験例４ｂ）の表２に記載の条件で、３５サイクルで行った。ＰＣＲ産物の大きさは２０１ｂｐであった。

結果を図２８に示す。ＯＲ７Ｃ１が検出されたのは、ヒト成熟正常細胞およびヒト胎児正常細胞中で、ヒト成熟正常細胞の精巣のみであった。一方、ＳＷ４８０培養癌細胞株においては、ＳＰ画分において特に強い発現が認められた。ＨＴ２９、ＨＣＴ１５、ＫＭ１２ＬＭ、ＬＨＫ２細胞においてもＳＰ画分に強い発現を認めた。

実験例２９：ｏｒ７ｃ１恒常発現株およびｏｒ７ｃ１ノックダウン株の作成
ＰＬＡＴ−Ａ細胞を、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン、１０μｇ／ｍｌのブラストシジンを添加した１０％のＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地中で、１０ｃｍディッシュにて５０％程度の密度まで培養した。ｏｒ７ｃ１が挿入されたレトロウイルスベクターｐＭＸｓ−Ｉｂ 10μg＋Opti-MEM(Invitrogen) １０００μｌと、５分間室温でインキュベートしたリポフェクタミン２０００(Invitrogen) ４０μｌ＋Opti-MEM １０００μｌとを混和し、さらに２０分間室温でインキュベートした。その後、前述のＰＬＡＴ−Ａ細胞の培地に混和し、３７℃で培養し、２４時間後に１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭに培地交換を行い、さらに２４時間後にウイルス液として上清を回収した。このウイルス液１．５ｍｌと８μｇ／ｍｌのポリブレンを２×１０^５個のＳｗ４８０細胞とともに６ウェルのプレートで３７℃で培養し、８時間後に新鮮な１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭを１ｍｌ添加し、３７℃で培養した。４８時間後からピューロマイシン２μｇ／ｍｌを加え、細胞を選択して恒常発現株を得た。

ｓｉＲＮＡはInvitrogen社に受託作成（OR7C1 Stealth Select 3 RNAi (HSS120191; HSS178215; HSS178216)、Stealth RNAi Negative control kit）した。ｓｉＲＮＡ １００ｐｍｏｌ＋Opti-MEM(Invitrogen) ２５０μｌと、５分間室温でインキュベートしたリポフェクタミンRNAiMAX(Invitrogen) ５μｌ＋Opti-MEM ２５０μｌとを混和し、さらに20分間室温でインキュベートした。その後、６ウェルプレートに２０％の密度で培養したＳｗ４８０に添加し、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ中で３７℃で培養し、４８時間後の細胞をｏｒ７ｃ１ノックダウン株として使用した。
ｏｒ７ｃ１恒常発現株、ｏｒ７ｃ１ノックダウン株および比較対象としてモックトランスフェクションしたＳｗ４８０細胞株の位相差顕微鏡画像およびＲＴ−ＰＣＲ結果を図２９に示す。細胞形態においては、モックトランスフェクションしたＳｗ４８０と恒常発現株の間には特徴の差は見られなかったが、ノックダウン細胞株では細胞個々の接着性が失われていた。また、ＲＴ−ＰＣＲの結果から、ｏｒ７ｃ１が恒常発現株では強く発現しており、ノックダウン株ではほとんど発現していないことが確認された。
実験例１と同様にして、ｏｒ７ｃ１ノックダウン株のＳＰ画分の変化を検討した。結果を図３０に示す。ノックダウン細胞株では、ＳＰ細胞は消失した。

実験例３０：造腫瘍能の検定
実験例２と同様の方法で、腫瘍細胞（SW480細胞株のor7c1恒常発現株）およびネガティブコントロールとしてモックトランスフェクションしたＳＷ４８０細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（メス、５週）の背部皮下の左右へそれぞれ１０^４、１０^３、１０^２、１０^１ずつ接種し、１週毎に腫瘍径を測定した。同様にｏｒ７ｃ１ノックダウン細胞およびネガティブコントロールとしてネガティブｓｉＲＮＡ株を１０^４ずつ接種し、１週毎に腫瘍径を測定した。
結果を図３１に示す。モックトランスフェクションしたＳｗ４８０とｏｒ７ｃ１恒常発現株の比較では、１０^４および１０^３では顕著な差が見られなかったが１０^２および１０^１では恒常発現株で腫瘍形成能が高かった。ネガティブｓｉＲＮＡとｏｒ７ｃ１ノックダウン株では、１０^４においてｏｒ７ｃ１ノックダウン株は腫瘍形成能が顕著に低かった。

実験例３１：ｏｒ７ｃ１由来ペプチド断片によるペプチド結合アッセイ
実験例２６と同様にして、以下のペプチドを作成し、結合アッセイを行った。
ｏｒ７ｃ１＿３４（１０)：ＭＹＬＶＴＦＴＧＮＬ（配列番号７３）
ｏｒ７ｃ１＿５９（１０)：ＭＹＦＦｌＳＮＬＳＦ（配列番号７４）
ｏｒ７ｃ１＿９３（１０)：ＴＹＡＧＣＬＳＱＩＦ（配列番号７５）
ｏｒ７ｃ１＿１３１（１０)：ＨＹＴＶｉＭＮＰＱＬ（配列番号７６）
ｏｒ７ｃ１＿２１７（１０)：ＳＹＹＫｉＶＦＳＩＬ（配列番号７７）
ｏｒ７ｃ１＿２５１（１０)：ＦＹＧＴＧＦＧＶＹＬ（配列番号７８）
ｏｒ７ｃ１＿２７７（９)：ＭＹＴＭＶＴＰＭＬ（配列番号７９）
結果を図３２に示す。この結果、２７７（９）、３４（１０）、２５１（１０）、１３１（１０）および９３（１０）でＨＬＡ−Ａ２４０２との結合が認められた。

実験例３２：ＣＴＬの誘導
被験者から採血した全血（ヘパリン加）から、Lymphoprep (Nycomed)を用いてＰＢＭＣを分離した。ＰＢＭＣを３７℃で２４時間培養後、非付着細胞を用いて実験した。この非付着細胞からＣＤ８陽性細胞を得るためにmagnetic cell separation system（Miltenyi Biotech）を用いてＣＤ８陽性細胞と陰性細胞に分離した。ＣＤ８陰性細胞はＡＩＭ−Ｖ培地(Life Technologies)に１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｐを加え、ＰＨＡ−ｂｌａｓｔとした。ＣＤ８陽性細胞はＡＩＭ−Ｖ培地で３７℃で培養し、１週間ごと３回（０日目、７日目、１４日目）に１／５量のＰＨＡ−ｂｌａｓｔで刺激した。８日目からＩＬ−２ ５０Ｕ／ｍｌを培地に添加し、以降３〜４日毎に培地交換とともにＩＬ−２ ５０Ｕ／ｍｌを加えた。この細胞はＣＴＬとして、２１日目にＥＬＩＳＰＯＴ、２８日目に^５１Ｃｒリリースアッセイを施行した。

実験例３３：ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＥＬＩＳＰＯＴを施行するために、エフェクター細胞として前述の誘導したＣＴＬ５×１０^５／ｍｌを使用した。またターゲットとしてＴ２Ａ２４およびＫ５６２細胞（Ｋ５６２はネガティブコントロール）を使用した。Ｔ２Ａ２４細胞は、前述したペプチド結合アッセイでＨＬＡ−Ａ２４に提示されることが判明したペプチド各５μｇ／ｍｌを用いて、室温で２時間インキュベートした。ターゲット細胞は５×１０^５／ｍｌで細胞調整した。９６ウェルのmultiscreen plate(Millipore)に５μｇ／ｍｌのＩＦＮ−γキャプチャー抗体（PharMingen）を１００μｌ／ウェルで加え、ＰＢＳに浸して４℃で一晩静置した。その後、２００μｌ／ウェルのRPMI1640(Sigma Chemical Co)で１回洗浄し、RPMI1640で２時間固定した。前述のエフェクター／ターゲット細胞をそれぞれ１００μｌずつウェルに加え、４０時間インキュベーションし、洗浄により細胞を除去した後、検出用のサイトカイン抗体を添加した。さらに、酵素標識ストレプトアビジンを添加し、エリスポットリーダーでカウントした。
結果を図３３に示す。９３（１０）のペプチドにおいてＩＦＮ−γの放出が確認された。

実験例３４： ^５１ Ｃｒリリースアッセイ
細胞障害活性を測定する為のアッセイで、放射活性を持った^５１Ｃｒにて細胞を標識し、ＣＴＬによる細胞障害活性を測定した。エフェクター細胞としてＣＴＬを用い、ターゲット細胞としてＴ２Ａ２４、Ｋ５６２、Ｓｗ４８０、ｏｒ７ｃ１恒常発現Ｓｗ４８０を用いた。まず、１×１０^６のターゲット細胞を回収し、１０〜１００μｌの^５１Ｃｒを加え、３７℃で１時間インキュベートし、細胞を^５１Ｃｒで標識した。標識終了した細胞を、ＲＰＭＩ１６４０で４回洗浄し、１×１０^５／ｍｌ（最終的にターゲット細胞２０００／ウェルで使用）になるようにＲＰＭＩ１６４０で溶解した。Ｔ２Ａ２４は５μｇ／ｍｌのペプチドでパルスし、室温で１時間インキュベートした。一方、ＣＴＬは９６ウェルプレートにぞれぞれ、Ｅ／Ｔ比にあわせて１００μｌのＡＭＩ−Ｖで溶解して蒔いた。また、データの解析のため、自然放出を測定するためのウェルには１００μｌのＡＩＭ−Ｖを、最大放出を測定するためのウェルには１００μｌの２％ＮＰ−４０をあらかじめウェルに入れておいた。ターゲット細胞をエフェクターの入った９６ウェルプレートに各ウェル１００μＬずつ加え、３７℃で４時間培養した。その後、培養上清をそれぞれ回収し、ガンマカウンターにて測定した。解析には以下の式を用いた。
殺傷％=(計測放出−自然放出)×１００／(最大放出−自然放出)
結果を図３４に示す。Ｓｗ４８０と比較し、ｏｒ７ｃ１恒常発現Ｓｗ４８０でより細胞障害活性が高かった。Ｔ２Ａ２４に関しては、Ｅ／Ｔ比２０および６において、ペプチド９３（１０）でパルスした方が細胞障害活性が高かった。

本発明が提供する判別法に利用される分子マーカーは、通常成人正常細胞にほとんど発現していないものであり、また多くのがん幹細胞に発現しているものであるため、体内または組織中の腫瘍細胞だけを特異的に認識することで、従来のがん診断技術よりもはるかに高い精度の診断を可能にする。また特にがん幹細胞を特異的に認識するため、がん免疫治療・分子標的治療・遺伝子導入治療の発展など、医療産業に広く貢献することが期待出来る。

Claims (24)

1. （１）ＴＹＡＧＣＬＳＱＩＦ（配列番号７５）からなるペプチド、および／または
   （２）（１）のペプチドにおいて、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニンもしくはメチオニンに置換され、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、トリプトファンもしくはメチオニンに置換されたペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導活性を有するペプチド
   を有効成分として含有するＣＴＬ誘導剤。
2. ＴＹＡＧＣＬＳＱＩＦ（配列番号７５）からなるペプチドをコードする核酸、および／または、
   前記ペプチドにおいて、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニンもしくはメチオニンに置換され、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、トリプトファンもしくはメチオニンに置換されたペプチドであって、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチドをコードする核酸
   を有効成分として含有するＣＴＬ誘導剤。
3. がん治療用またはがん予防用である、請求項１または２に記載の剤。
4. Ｏｒ７ｃ１＿９３： ＴＹＡＧＣＬＳＱＩＦ （配列番号７５）のアミノ酸配列からなるペプチド。
5. 請求項４に記載のペプチドを有効成分として含有する、がんの治療または予防剤。
6. ＴＹＡＧＣＬＳＱＩＦ（配列番号７５）からなるペプチド、および／または
   前記ペプチドにおいて、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニンもしくはメチオニンに置換され、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、トリプトファンもしくはメチオニンに置換されたペプチドであって、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチド
   を有効成分として含有する、がん幹細胞を死滅させるための医薬組成物。
7. ＴＹＡＧＣＬＳＱＩＦ（配列番号７５）からなるペプチドをコードする核酸、および／または、
   前記ペプチドにおいて、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニンもしくはメチオニンに置換され、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、トリプトファンもしくはメチオニンに置換されたペプチドであって、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチドをコードする核酸
   を有効成分として含有する、がん幹細胞を死滅させるための医薬組成物。
8. Ｏｒ７ｃ１および／またはＤｎａｊｂ８の発現産物由来のエピトープと特異的に反応する抗体を含む、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、胃、骨髄、大腸および末梢血単核球からなる群から選択される１または２以上の細胞または組織由来のがん幹細胞を死滅させるための医薬組成物。
9. Ｏｒ７ｃ１および／またはＤｎａｊｂ８の発現を抑制する核酸を含む、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、胃、骨髄、大腸および末梢血単核球からなる群から選択される１または２以上の細胞または組織由来のがん幹細胞を死滅させるための医薬組成物。
10. がんの治療用または予防用である、請求項６〜９に記載の医薬組成物。
11. Ｏｒ７ｃ１またはＤｎａｊｂ８によりコードされるポリペプチドを含む、がんワクチン。
12. Ｏｒ７ｃ１またはＤｎａｊｂ８をコードする核酸を含む、がんワクチン。
13. Ｏｒ７ｃ１およびＤｎａｊｂ８からなる群から選択される遺伝子の発現産物を検出する試薬を含む、がん幹細胞を検出するための組成物。
14. 遺伝子の発現産物が、ｍＲＮＡおよび／または内在性ポリペプチドである、請求項１３に記載の組成物。
15. 判定対象の細胞集団において、Ｏｒ７ｃ１およびＤｎａｊｂ８からなる群から選択される遺伝子の発現産物を指標として、がん幹細胞の有無を判定する方法であって、前記遺伝子の発現産物が検出された場合、がん幹細胞が存在すると決定される前記方法。
16. 細胞集団が、正常細胞および／またはがん幹細胞でないがん細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 遺伝子の発現産物がｍＲＮＡであり、ＲＴ−ＰＣＲ法により検出することを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 遺伝子の発現産物が内在性ポリペプチドであり、該内在性ポリペプチドと特異的に反応する試薬により検出することを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
19. 試薬が抗体である、請求項１８に記載の方法。
20. ｉ）Ｏｒ７ｃ１およびＤｎａｊｂ８からなる群から選択される遺伝子の発現産物の、候補化合物を細胞集団に投与する前の検出量Ａを測定する工程、
    ｉｉ）候補化合物を細胞集団に投与する工程、
    ｉｉｉ）ｉ）において測定した遺伝子の発現産物の、候補化合物を細胞集団に投与した後の検出量Ｂを測定する工程、および
    ｉｖ）ＡとＢを比較し、ＡがＢより有意に大きい場合に、候補化合物をがん幹細胞を含むがんの治療薬候補であると判定する工程、
    を含む、がん幹細胞を含むがんの治療薬のスクリーニング方法。
21. がん幹細胞の有無を判定するためのキットであって、Ｏｒ７ｃ１およびＤｎａｊｂ８からなる群から選択される遺伝子の発現産物を検出するための試薬を少なくとも含む、前記キット。
22. 検出するための試薬が、Ｏｒ７ｃ１およびＤｎａｊｂ８からなる群から選択される遺伝子の発現産物であるｍＲＮＡを検出するための前記遺伝子に相補的な塩基配列を有するプローブおよび／またはプライマーである、請求項２１に記載のキット。
23. 検出するための試薬が、Ｏｒ７ｃ１およびＤｎａｊｂ８からなる群から選択される遺伝子の発現産物であるポリペプチドを検出するための抗体である、請求項２１に記載のキット。
24. ｉ）目的ポリペプチドのアミノ酸配列に含まれる配列のうち、所定のＭＨＣクラスＩ分子結合モチーフを有する配列を有する候補ペプチドを作製する工程、
    ｉｉ）ｉ）で得られた候補ペプチドを提示する抗原提示細胞で、エフェクター細胞を刺激する工程、
    ｉｉｉ）ｉｉ）で得られたエフェクター細胞と、目的ポリペプチドを発現する、および／またはｉ）で得られた候補ペプチドを提示するターゲット細胞とを共に培養する工程、
    ｉｖ）エフェクター細胞の活性化の度合いを測定する工程、
    ｖ）ｉｖ）においてエフェクター細胞を活性化した候補ペプチドを選別する工程、
    を含む、がん幹細胞に対するＣＴＬ誘導活性を有するペプチドのスクリーニング方法であって、目的ポリペプチドが、以下の（１）または（２）：
    （１）Ｏｒ７ｃ１またはＤｎａｊｂ８によりコードされるポリペプチド、
    （２）（１）のポリペプチドにおいて、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチド、
    のいずれかである、前記方法。