CN107255693A - 基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法 - Google Patents

基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法，步骤包括，经预处理后的样品进行氨基酸提取和纯化：向样品中加入盐酸，水解后离心，上清液用强阳离子交换柱纯化，纯化后得到的液体通过氮吹法浓缩获得样品氨基酸；再采用N‑新戊酰基，O‑异丙醇酯(NPP)法，取氨基酸加入氯化亚砜‑异丙醇溶液，进行氨基酸衍生化，氮气吹干后用新戊酰氯酰化，过硅胶从层析柱，得到液体通过氮吹法浓缩得到衍生物，溶于乙酸乙酯中冷冻保存，进行氨基酸C稳定同位素测定：氨基酸酯样品经气相色谱质谱联用仪分析鉴定；通过比较不同海域样品间的氨基酸的δ13C值鉴别不同海域不同种类的水产品。

Description

基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法
技术领域
本发明属于食品安全领域，涉及基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法，主要用于对水产品的真实产地进行识别和溯源。
背景技术
我国是水产养殖大国，水产养殖产量约占全球总产量的80％以上，稳居世界首位。但是，食品安全问题一直阻碍着产业的发展和升级。水产品质量追溯体系建设有助于解决水产品的掺假售假问题，能够切实维护水产品生产企业、养殖户和广大消费者的切身利益。近几年，我国在水产品质量追溯方面相继实施了从养殖、加工到流通等环节的标识化管理，将物联网、二维码、RFID等信息产业技术应用于原产地认证和生产、加工、流通、检测、物流等各个环节，建立了从“鱼塘”到餐桌的全程可追溯的水产品质量安全检测系统，在水产品质量溯源技术和溯源平台建设方面已经取得了从无到有的巨大进步。但这些技术尚有一定缺陷，仅从水产品体表或产品外包装标志上做“表面文章”，长此以往，随着不法分子造假技术的提高，这些“表面文章”迟早会被攻破。生物体中的元素组成、含量水平、特征生化组分等面随着其生长环境的不同而存在差异，通过由生物自身的特性和生物与其特有生境的关系组成的水产品特有的“指纹”信息建立的指纹溯源技术已成为高精准溯源技术的发展方向。
稳定同位素作为生物自身组成物质，带有明显的生物特性。稳定同位素技术应用于农产品的产地溯源已得到了广泛的研究，目前对水产品产地溯源技术主要集中在样品全样的稳定同位素检测技术。对于样品全样的稳定同位素检测技术，由于该技术选取的是肌肉全样，会受到很多因素的影响，例如生物的不同生长阶段物质组成不同、对不同化合物的吸收转化效率差异及同位素分馏等，因此该技术有一定的局限性，使得鉴定结果不够准确，并不令人信服。脂肪酸、碳水化合物、氨基酸等特征化合物含量受到其摄食影响，具有不同的含量特征，对于水产品产地溯源技术，也有应用特征化合物组成含量分析技术，根据不同地区之间样品的特征化合物组成含量差异来对水产品进行产地鉴别，但是生物的特征化合物含量个体差异明显，且随季节的变化存在显著差异，也会使得鉴定结果不准确。
由于不同环境会对生物中脂肪酸、碳水化合物、氨基酸等特征化合物生物代谢合成途径造成不同的影响，导致这些特征化合物同位素分馏模式的不同，从而具有不同的稳定同位素特征。其中氨基酸含有生物体半数的碳，并且这些碳的主要来源皆为食物，有一半的氨基酸只能被细菌、真菌以及自养生物合成因此是生物合成不可或缺的，这些初级生产者的氨基酸合成代谢过程的高度多样性会产生其独特的稳定同位素特征标签，因而带有明显的地理信息，可以作为生物标志物来区分生物的不同地域来源。并且在不同营养级之间，氨基酸几乎没有同位素分馏现象发生，即上述的特征标签可以稳定在生物体内保留，这为利用氨基酸中的碳稳定同位素作为指标对水产品的产地进行识别和溯源提供了理论依据。
发明内容
为了克服传统稳定同位素技术上的缺陷，本发明利用氨基酸作为区分不同地域的生物标志物，通过对单一化合物氨基酸的碳稳定同位素进行检测和分析，应用于对水产品的产地进行识别和溯源，能够使鉴定结果更加准确、可靠。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法，包括以下步骤：
A、前处理：留取待检水产品的肌肉部分，-30～-20℃冷冻完全，在无稳定同位素干扰的情况下，进行冷冻干燥，再用将干燥样品研磨成粉末状；
本发明所述方法，针对各类水产品样品都适用，本发明实施例中分别选取了采集自福建、大连、山东的仿刺参海参样品和采集自河北、山东、辽宁、江苏的栉孔扇贝和虾夷扇贝的贝类样品为例进行了检测，验证了本发明所述方法的准确性。
上述步骤A中所述无稳定同位素干扰的情况，一般是采用无稳定同位素干扰的器具盛装，例如玻璃或陶瓷材质的器具；所述冷冻干燥的条件是：温度为-60～-50℃，冷冻干燥时间以样品完全干燥为止；优选方案是：所述的冷冻干燥温度为-50℃，冷冻干燥时间为24h。
B、氨基酸提取和纯化：取样品20～30mg置于水解管中，加入2mL 6N盐酸，将管密封，在氮气环境下，105～115℃水解20～24h，得到的水解液430g离心10min，取上清液加入到填充了200mg阳离子交换树脂的固相萃取柱中，流出的废液弃去，再向柱中加入2ml甲醇/蒸馏水混合液(体积比8:1)，弃去废液，最后向柱中加入2mL 4N氨水，收集流出的液体于80℃氮气吹干，得到的即为纯化的氨基酸；再对纯化的氨基酸衍生化后，进行氨基酸碳稳定同位素测定后分析。
所述样品为水产品的干燥磨细样品；步骤B中每次取样品为固定量，样品少会导致氨基酸提取量不够，样品过多没有意义，对检测过程不是必要的，取样量为20～30mg恰好是保证后续检测需要的浓度。本发明实施例中所用的阳离子交换树脂的固相萃取柱是从Agilent公司购买的SPE固相萃取小柱，规格为BOND ELUT-SCX。
对于上文所述的基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法中，所述的氨基酸衍生化方法为：采用的方法可最终将氨基酸衍生化成相对应的N-新戊酰基，O-异丙醇酯(NPP)，向B步骤得到的氨基酸中加入2mL 1N氯化亚砜-异丙醇溶液，将试管密封100℃酯化1h，60℃氮气吹干，干燥物加入200μl吡啶溶解，再加入200μl新戊酰氯于60℃水浴酰化30min，反应完全后待液体冷却，向其中加入2mL二氯甲烷，加入到6cm硅胶层析柱除去杂质和多余的酰化剂，收集到的液体在室温下用温和的氮气吹干即为纯化的衍生物NPP氨基酸酯，最后加入1～1.5mL乙酸乙酯溶解放入样品瓶中-20℃保存；具体的，上述步骤C的6cm硅胶层析柱为内径4mm，200-400目。
对于上文所述的基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法中，所述的氨基酸C稳定同位素测定方法为：氨基酸酯样品经气相色谱质谱联用仪(GC-MS)进行分析鉴定，同时，经稳定同位素比质谱仪(IRMS)测定单分子氨基酸的δ13C值。稳定C同位素的自然丰度表示为：
X＝([R样品/R标准]－1)×103
式中：X代表13C；R代表13C/12C。δ13C值是相对于VPDB标准的自然丰度。分析精度：
δ13C＜0.20‰。
所述的气相色谱仪为Trace GC Ultra，Thermo-Fisher；所述的质谱仪为ISQ，Thermo-Fisher；所述的稳定同位素比质谱仪为Delta V Advantage Isotope Ratio MS，Thermo-Fisher；
结果分析：对所获得的氨基酸酯样品的GC保留时间和MS谱图与氨基酸标准品的GC保留时间和MS谱图的标准谱库相比较，确定氨基酸种类，同时，结合IRMS所测得的氨基酸的δ13C值，确定各氨基酸组成的δ13C值，通过比较不同海域样品间的氨基酸的δ13C值，找出δ13C值差异显著的氨基酸种类，对差异最为显著的某种或者某些氨基酸作为指标建立不同海域不同种类水产品的δ13C值指纹库，用于鉴别不同海域不同种类的水产品。
具体的，本发明上述氨基酸C稳定同位素测定方法中所使用的各仪器的工作参数为：
(1)气相色谱仪：DB-5(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱。升温程序：初始温度70℃，保持1min；以3℃/min的速度升至220℃；再以10℃/min升至300℃保持8min；载气：高纯He，纯度≥99.999％，流速1.2mL/min恒流模式；进样口温度280℃；进样方式为无分流进样；进样量：1.0μL。
(2)质谱仪：传输线温度：250℃；离子源温度：230℃；电离方式：EI电子能量70eV。
(3)稳定同位素比质谱仪：分析柱温度为45℃，用USGS24即δ13CPDB＝-16.00‰标定CO2钢瓶，用标定的钢瓶作为标准。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)现有稳定同位素技术选取的是肌肉全样，成分复杂，且各物质含量随生物的不同生长阶段和季节变化差异显著，使得鉴定结果不够准确。本发明应用氨基酸单分子δ13C值作为鉴别指标，成分单一，能够使鉴定结果更加准确、可靠。
(2)现有的水产品产地溯源技术包括氨基酸组成分析，通过不同地区之间样品的氨基酸含量差异来对水产品进行产地鉴别，但是生物的氨基酸含量个体差异明显，且随季节的变化存在显著差异，使得鉴定结果不准确。氨基酸作为生物组成大分子，有些氨基酸基本完全来源于摄食食物，其C稳定同位素值主要受生存环境的影响，带有明显的地理信息，影响因素少，因此，本发明的鉴定结果能更准确地反映生物的原产地信息，达到准确溯源的目的。本发明所述方法在水产品产地溯源、建立不同海域不同种类水产品的δ13C值指纹库，可鉴别不同海域不同种类的水产品，在政府执法监管、企业品牌保护、消费者维权等方面具有极高的应用价值和前景，尤其是对保护和开发带有产地标志的优质水产品，提升水产品质量安全水平，维护良好的水产品市场秩序等方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明的流程图；
图2.利用两种特征氨基酸δ13C值作为指标区分各地仿刺参；
图3.根据所有氨基酸的δ13C值，利用线性判别分析法区分大连不同地区仿刺参；
图4.根据所有氨基酸的δ13C值，利用线性判别分析法区分山东不同地区仿刺参；
图5.根据所有氨基酸的δ13C值，利用线性判别分析法区分各地栉孔扇贝；
图6.根据所有氨基酸的δ13C值，利用线性判别分析法区分各地虾夷扇贝。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
图1为本发明的流程图；以下内容是对照图1所述流程，结合本发明下述具体实施例，对本申请的技术方案进行解释说明。
实施例1
本实验室于2016年4月分别采集福建、大连、山东仿刺参样品进行检测。将样品冷藏运输带回实验室后，立即进行解剖，去除内脏和石灰环，肌肉部分用超纯水洗净，然后放入-20℃冰箱冷冻24h。盛放于无稳定同位素干扰的器具中进行冷冻干燥，将完全冷冻的仿刺参肌肉-50℃冷冻干燥24h，再用无稳定同位素干扰的玻璃研钵研磨成粉末状，干燥保存。
将上述处理完毕的样品按照以下步骤进行检测：
1、氨基酸提取和纯化：取样品20mg置于水解管中，加入2mL 6N盐酸，向管中冲N2，待完全置换出其中的空气，将管密封，110°℃水解24h，得到的水解液430g离心10min，取上清液加入到填充了阳离子交换树脂的固相萃取柱(是从Agilent公司直接购买的SPE固相萃取小柱，规格为BOND ELUT-SCX,500mg 3ml)中，流出的废液弃去，再向柱中加入2ml以体积比8:1混合的甲醇/蒸馏水混合液，弃去废液，最后向柱中加入2mL 4N氨水，收集流出的液体于80℃氮气吹干，得到的即为纯化的氨基酸；
2、氨基酸衍生化：采用的方法可最终将氨基酸衍生化成相对应的N-新戊酰基，O-异丙醇酯(NPP)，向B步骤得到的氨基酸中加入2mL 1N氯化亚砜-异丙醇溶液，将试管密封100℃酯化1h，60℃氮气吹干，干燥物加入200μl吡啶溶解，再加入200μl新戊酰氯于60℃水浴酰化30min，反应完全后待液体冷却，向其中加入2mL二氯甲烷，加入到6cm硅胶层析柱(内径4mm，200-400目)除去杂质和多余的酰化剂，收集到的液体在室温下用温和的氮气吹干即为纯化的衍生物NPP氨基酸酯，最后加入1mL乙酸乙酯溶解放入样品瓶中-20℃保存；
3、氨基酸δ13C值测定：用微量进样器取1.0μL样品注射入进样口，样品经气相色谱质谱联用仪(GC-MS)进行测定，得到氨基酸指纹图谱；同时，经稳定同位素比质谱仪(IRMS)测定各氨基酸成分的δ13C值。
所述的气相色谱仪为Trace GC Ultra，Thermo-Fisher；所述的质谱仪为ISQ，Thermo-Fisher；所述的稳定同位素比质谱仪为Delta V Advantage Isotope Ratio MS，Thermo-Fisher；
上述仪器具体工作参数为：
1)气相色谱仪：DB-5(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱。升温程序：初始温度70℃，保持1min；以3℃/min的速度升至220℃；再以10℃/min升至300℃保持8min；载气：高纯He，纯度≥99.999％，流速1.2mL/min恒流模式；进样口温度280℃；进样方式为无分流进样；进样量：1.0μL。
(2)质谱仪：传输线温度：250℃；离子源温度：230℃；电离方式：EI电子能量70eV。
(3)稳定同位素比质谱仪：分析柱温度为45℃，用USGS24即13CPDB＝-16.00‰标定CO2钢瓶，用标定的钢瓶作为标准。
4、结果分析：
通过实验获得的几个地区仿刺参样品氨基酸的δ13C值如表1所示。在其中筛选出两种氨基酸(Ser、Try)的δ13C值的作为区分指标对各地区海参进行区分，得到结果如图2所示，通过此两种氨基酸可以将大连、山东、福建地区海参明显区分开。通过软件SPSS 19，应用判别分析法(LDA)，对表1中所有数据进行分析筛选，得到能够区分大连瓦房店、长海、皮口以及山东青岛、威海、烟台的判别函数，再将标准化的数据代入函数，结果如图3、图4所示，可见通过LDA法处理后的数据可分别将大连、山东各自地区的海参区分开。因此可通过氨基酸的13C值对不同地区仿刺参的真实产地进行鉴别和溯源
表1.各地区仿刺参氨基酸的13C值
实施例2
本实验室于2016年6月分别采集自河北、山东、辽宁、江苏的栉孔扇贝和虾夷扇贝样品进行检测。将样品冷藏运输带回实验室后，立即进行解剖，去除内脏和外壳，选取闭壳肌部分用超纯水洗净，然后放入-20℃冰箱冷冻24h。盛放于无稳定同位素干扰的器具中进行冷冻干燥，将完全冷冻的仿刺参肌肉-50℃冷冻干燥24h，再用无稳定同位素干扰的玻璃研钵研磨成粉末状，干燥保存。
将上述处理完毕的样品按照以下步骤进行检测：
1、氨基酸提取和纯化：取样品20mg置于水解管中，加入2mL 6N盐酸，向管中冲N2，待完全置换出其中的空气，将管密封，110°℃水解24h，得到的水解液430g离心10min，取上清液加入到填充了200mg阳离子交换树脂的固相萃取柱中，流出的废液弃去，再向柱中加入2ml以体积比8:1混合的甲醇/蒸馏水混合液，弃去废液，最后向柱中加入2mL 4N氨水，收集流出的液体于80℃氮气吹干，得到的即为纯化的氨基酸；
2、氨基酸衍生化：采用的方法可最终将氨基酸衍生化成相对应的N-新戊酰基，O-异丙醇酯(NPP)，向B步骤得到的氨基酸中加入2mL 1N氯化亚砜-异丙醇溶液，将试管密封100℃酯化1h，60℃氮气吹干，干燥物加入200μl吡啶溶解，再加入200μl新戊酰氯于60℃水浴酰化30min，反应完全后待液体冷却，向其中加入2mL二氯甲烷，加入到6cm硅胶层析柱(内径4mm，200-400目)除去杂质和多余的酰化剂，收集到的液体在室温下用温和的氮气吹干即为纯化的衍生物NPP氨基酸酯，最后加入1mL乙酸乙酯溶解放入样品瓶中-20℃保存；
3、氨基酸δ13C值测定：用微量进样器取1.0μL样品注射入进样口，样品经气相色谱质谱联用仪(GC-MS)进行测定，得到氨基酸指纹图谱；同时，经稳定同位素比质谱仪(IRMS)测定各氨基酸成分的δ13C值。
所述的气相色谱仪为Trace GC Ultra，Thermo-Fisher；所述的质谱仪为ISQ，Thermo-Fisher；所述的稳定同位素比质谱仪为Delta V Advantage Isotope Ratio MS，Thermo-Fisher；
上述仪器具体工作参数为：
1)气相色谱仪：DB-5(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱。升温程序：初始温度70℃，保持1min；以3℃/min的速度升至220℃；再以10℃/min升至300℃保持8min；载气：高纯He，纯度≥99.999％，流速1.2mL/min恒流模式；进样口温度280℃；进样方式为无分流进样；进样量：1.0μL。
(2)质谱仪：传输线温度：250℃；离子源温度：230℃；电离方式：EI电子能量70eV。
(3)稳定同位素比质谱仪：分析柱温度为45℃，用USGS24即13CPDB＝-16.00‰标定CO2钢瓶，用标定的钢瓶作为标准。
4、结果分析：
通过实验获得的几个地区栉孔扇贝和虾夷扇贝样品氨基酸的δ13C值如表2、3所示。通过软件SPSS 19，应用判别分析法(LDA)，分别对表2、3中所有数据进行分析筛选，得到能够区分，再将标准化的数据代入函数，结果如图5、图6所示，可见通过LDA法处理后的数据可将辽宁、山东、江苏各自地区的栉孔扇贝分开，可将辽宁、山东、江苏、河北各自地区的虾夷扇贝区分开，因此可通过氨基酸的δ13C值对不同地区的栉孔扇贝和虾夷扇贝的真实产地进行鉴别和溯源
表2.各地区栉孔扇贝氨基酸的δ13C值
表3.各地区虾夷扇贝氨基酸的δ13C值

Claims (10)

1.基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法，其特征在于，利用氨基酸的碳稳定同位素作为区分不同地域的生物标志物，通过对单一化合物氨基酸的碳稳定同位素进行检测和分析应用于对水产品的产地进行识别和溯源。
2.根据权利要求1所述的基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、前处理：留取待检水产品的肌肉部分，-30～-20℃冷冻完全，在无稳定同位素干扰的情况下，冷冻干燥后研磨成粉末状；
B、氨基酸提取和纯化：取步骤A得到的样品20～30mg，加入2mL 6M盐酸，在氮气环境下，105～115℃水解20～24h，得到的水解液在430g的离心力下离心10～20min，取上清液加入到阳离子交换固相萃取柱中，弃废液，再向柱中加入2ml甲醇/蒸馏水以体积比8:1混合的混合液，弃去废液，最后向柱中加入2mL 4M氨水，收集流出的液体于60℃以上环境用氮气吹干，得到的即为纯化的氨基酸；再对纯化的氨基酸衍生化后，进行氨基酸碳稳定同位素测定后分析。
3.根据权利要求2所述的基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法，其特征在于，所述的氨基酸衍生化方法为：向B步骤得到的氨基酸中加入2mL 1M氯化亚砜-异丙醇溶液，将试管密封100℃酯化1h，60℃氮气吹干，干燥物加入200μl吡啶溶解，再加入200μl新戊酰氯于60℃水浴酰化30min，反应完全后待液体冷却，向其中加入2mL二氯甲烷，加入到6cm硅胶层析柱除去杂质和多余的酰化剂，收集到的液体在室温下用氮气吹干即为纯化的衍生物NPP氨基酸酯，最后加入1～1.5ml乙酸乙酯溶解。
4.根据权利要求2所述的基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法，其特征在于，所述的氨基酸碳稳定同位素测定方法为：对纯化的氨基酸衍生化后获得的氨基酸酯样品，经气相色谱质谱联用仪进行分析鉴定，同时，经稳定同位素比质谱仪测定单分子氨基酸的δ13C值，稳定碳同位素的自然丰度表示为：
X＝([R样品/R标准]－1)×103
式中：X代表δ13C；R代表13C/12C。δ13C值是相对于VPDB标准的自然丰度，分析精度δ13C＜0.20‰；
结果分析：对所获得的氨基酸酯样品的GC保留时间和MS谱图与氨基酸标准品的GC保留时间和MS谱图的标准谱库相比较，确定氨基酸种类，同时，结合IRMS所测得的氨基酸的δ13C值，确定各氨基酸组成的δ13C值，通过比较不同海域样品间的氨基酸的δ13C值，找出δ13C值差异显著的氨基酸种类，或者根据所得数据建立数学模型对不同海域样品进行区分，对差异最为显著的某种或者某些氨基酸作为指标，建立不同海域不同种类水产品的13C值指纹库，用于鉴别不同海域不同种类的水产品。
5.根据权利要求2所述的基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法，其特征在于，所述步骤A的冷冻干燥温度为-60～-50℃，冷冻干燥时间以样品完全干燥为止。
6.根据权利要求3所述的基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法，其特征在于，所述6cm硅胶层析柱为内径4mm，200-400目。
7.根据权利要求4所述的基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法，其特征在于，所述的稳定同位素比质谱仪的工作参数为：分析柱温度为45℃，用USGS24即δ13CPDB＝-16.00‰标定CO2钢瓶，用标定的钢瓶作为标准。
8.根据权利要求4所述的基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法，其特征在于，所述的气相色谱仪的工作参数为：DB-5色谱柱；升温程序：初始温度70℃，保持1min；以3℃/min的速度升至220℃；再以10℃/min升至300℃保持8min；载气：高纯He，纯度≥99.999％，流速1.2mL/min恒流模式；进样口温度280℃；进样方式为无分流进样；进样量：1.0μL。
9.根据权利要求4所述的基于氨基酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法，其特征在于，所述的质谱仪的工作参数为：传输线温度：250℃；离子源温度：230℃；电离方式：EI电子能量70eV。
10.权利要求1或2所述方法在水产品产地溯源、建立不同海域不同种类水产品的δ13C值指纹库，鉴别不同海域不同种类的水产品，保护和开发带有产地标志的优质水产品，提升水产品质量安全水平中的应用。
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