CN117441104A - 诊断和预测肾功能下降的方法 - Google Patents

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CN117441104A CN202280040174.3A CN202280040174A CN117441104A CN 117441104 A CN117441104 A CN 117441104A CN 202280040174 A CN202280040174 A CN 202280040174A CN 117441104 A CN117441104 A CN 117441104A
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Abstract

本公开提供了用于鉴定处于发展进行性肾功能下降风险的人受试者的方法,所述方法通过检查来自所述受试者的样品中的一种或多种保护性蛋白质的一个或多个水平来进行。本公开中鉴定的一种或多种蛋白质的一个或多个水平与针对进行性肾衰竭和终末期肾病(ESKD)的保护相关。此类保护性蛋白质的实例包括FGF20、ANGPT1和TNFSF12。

Description

诊断和预测肾功能下降的方法
相关申请
本申请要求2021年4月8日提交的美国临时申请号63/172,541的优先权,并且要求2021年6月25日提交的美国临时申请号63/215,150的优先权。前述优先权申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
政府利益
本发明根据美国国家卫生研究所(National Institutes of Health)授予的授权号DK041526-27下的政府资助产生。政府可拥有本发明中的某些权利。
序列表
本申请含有序列表,所述序列表已以ASCII格式以电子方式提交并且特此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2022年4月5日,名称为J103021_1090WO_SL.txt并且大小为24,798字节。
背景技术
慢性肾病(CKD)是患者一生中肾功能的缓慢且进行性丧失。进行性肾功能下降的结果是永久性肾衰竭,最终导致终末期肾病(end-stage renal disease)(ESRD;也称为终末期肾病(end-stage kidney disease)ESKD)。
慢性肾病很普遍,通常与患者患有的其他疾患有关,诸如高血压或糖尿病。不幸的是,肾功能下降(RD)常常未被检测和未被诊断,直到疾病发展到晚期为止。随着肾功能衰竭进展,肾脏的功能变得严重受损,从而导致患者体内废物堆积达到有毒水平。慢性肾病的治疗旨在阻止或减缓疾病的进展。慢性肾功能下降对患者来说可能是毁灭性的,并且可能最终导致ESKD,其将需要透析和肾移植。鉴定有肾功能下降风险的患者将改善早期治疗并减缓这种破坏性疾病的进展。
发明内容
鉴于慢性肾病的进行性特性及其严重程度,鉴定有进行性肾功能下降风险的患者将是有益的。
本公开至少部分基于某些保护性蛋白质的发现,所述蛋白质的水平可用于鉴定将进展为终末期肾病(ESKD;在本文中也称为终末期肾病或ESRD)的患者/受试者以及将受到保护的患者/受试者。
在第一方面,本公开提供了一种鉴定处于发展进行性肾功能下降风险的人受试者的方法,其中所述方法包括以下步骤:检测来自有需要的受试者的样品中的至少一种保护性蛋白质的水平,其中所述保护性蛋白质选自由以下组成的组:成纤维细胞生长因子20(FGF20)、血管生成素-2(ANGPT1)和肿瘤坏死因子配体超家族成员12(TNFSF12);以及将所述保护性蛋白质的水平与所述保护性蛋白质的参考水平进行比较,其中所述参考水平是非进展者人受试者中的保护性蛋白质的水平。在某些实施方案中,保护性蛋白质是睾丸蛋白聚糖-2。在一些实施方案中,与参考水平相比保护性蛋白质的更低水平表明人受试者处于发展进行性肾功能下降的风险,或者与参考水平相比保护性蛋白质的同等或更高水平表明人受试者不处于发展进行性肾功能下降的风险。
在前述方面的一些实施方案中,检测保护性蛋白质的组合的水平,其中所述保护性蛋白质的组合选自由以下组成的组:FGF20和TNFSF12;FGF20和ANGPT1;以及TNFSF12和ANGPT1;或者其中所述保护性蛋白质的组合包括FGF20、TNFSF12和ANGPT1。在某些实施方案中,检测到的保护性蛋白质的组合包括睾丸蛋白聚糖-2。
在另一方面,本公开提供了一种鉴定处于发展进行性肾功能下降风险的人受试者的方法,其中所述方法包括以下步骤:检测来自有需要的受试者的样品中的至少一种保护性蛋白质的水平,其中所述保护性蛋白质选自由以下组成的组:(i)来自选自由富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(SPARC)、C-C基序趋化因子5(CCL5)、淀粉样βA4蛋白(APP)、血小板因子-4(PF4)和ANGPT1组成的组的第一组保护性蛋白质的保护性蛋白质,和/或(ii)来自选自由DNAJC19和TNFSF12以及FGF20组成的组的第二组保护性蛋白质的保护性蛋白质;以及将所述保护性蛋白质的水平与所述保护性蛋白质的参考水平进行比较,其中所述参考水平是非进展者人受试者中的保护性蛋白质的水平。在某些实施方案中,保护性蛋白质是与本文所述的一种或多种保护性蛋白质组合的睾丸蛋白聚糖-2。在一些实施方案中,与参考水平相比保护性蛋白质的更低水平表明人受试者处于发展进行性肾功能下降的风险,或者与参考水平相比保护性蛋白质的同等或更高水平表明人受试者不处于发展进行性肾功能下降的风险。
在前述方面的一些实施方案中,检测保护性蛋白质的组合的水平,其中保护性蛋白质的组合选自由以下组成的组:FGF20和第1组保护性蛋白质;FGF20和第2组保护性蛋白质;第1组保护性蛋白质和第2组保护性蛋白质;以及FGF20、第1组保护性蛋白质和第2组保护性蛋白质。在某些实施方案中,保护性蛋白质是与本文所述的一种或多种保护性蛋白质组合的睾丸蛋白聚糖-2。在某些实施方案中,非进展者是非糖尿病人受试者。
在任何上述方面的一些实施方案中,所述方法还包括如果受试者被鉴定为具有进行性肾功能下降的风险,则施用疗法以改善肾功能。在一个实施方案中,如果患者被鉴定为处于风险中,则向所述患者施用SGLT2抑制剂。在一些实施方案中,疗法包括FGF20(例如重组FGF20)。在一些实施方案中,如果受试者被鉴定为具有进行性肾功能下降的风险,则疗法包括向所述受试者施用FGF20、FGF20的活性片段、FGF20模拟物或编码FGF20的核酸或其活性片段。在其他实施方案中,疗法包括TNFSF12(例如重组TNFSF12)。在一些实施方案中,如果受试者被鉴定为具有进行性肾功能下降的风险,则疗法包括向所述受试者施用TNFSF12、TNFSF12的活性片段、TNFSF12模拟物或编码TNFSF12的核酸或其活性片段。在其他实施方案中,疗法包括ANGPT1(例如重组ANGPT1)。在一些实施方案中,如果受试者被鉴定为具有进行性肾功能下降的风险,则疗法包括向所述受试者施用ANGPT1、ANGPT1的活性片段、ANGPT1模拟物或编码ANGPT1的核酸或其活性片段。在一些实施方案中,如果受试者被鉴定为具有进行性肾功能下降的风险,则疗法包括向所述受试者施用睾丸蛋白聚糖-2、睾丸蛋白聚糖-2的活性片段、睾丸蛋白聚糖-2模拟物或编码睾丸蛋白聚糖-2的核酸或其活性片段。
在一些实施方案中,人受试者患有肾功能受损、糖尿病或两者。在某些实施方案中,糖尿病是I型糖尿病或II型糖尿病。在其他实施方案中,人类受试者是非糖尿病的。
在任何上述方面的一些实施方案中,样品是血浆样品。在一些实施方案中,使用免疫测定、质谱法、液相色谱(LC)分级分离、SOMAscam、Mesoscale平台或电化学发光检测来测定保护性蛋白质的水平。在一些实施方案中,免疫测定是ELISA或蛋白质印迹分析。在一些实施方案中,质谱法是基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、偏移触发的多路复用精确质量、高分辨率和绝对定量(TOMAHAQ)、实时质谱直接分析(DART-MS)或二次离子质谱(SIMS)。在一些实施方案中,样品是血液样品、血清样品、血浆样品、淋巴样品、尿液样品、唾液样品、泪液样品、汗液样品、精液样品、阴道样品、支气管样品、粘膜样品或脑脊液(CSF)样品。
在另一方面,本公开提供了一种用于鉴定或监测人受试者的进行性肾功能下降的蛋白质阵列,其中所述蛋白质阵列包含对人FGF20、人TNFSF12和人ANGPT1具有特异性的抗体或其抗原结合片段。
在另一方面,本文提供了一种用于鉴定或监测人受试者的进行性肾功能下降的蛋白质阵列,其中所述蛋白质阵列包含对人FGF20、人TNFSF12和人ANGPT1、人SPARC、人CCL5、人APP、人PF4、人ANGPT1、人DNAJC19、人TNFSF12、睾丸蛋白聚糖-2或其组合具有特异性的抗体或其抗原结合片段。
在另一方面,本文提供了一种包含用于特异性地结合蛋白质生物标志物的多个探针的阵列,其中所述蛋白质生物标志物是人FGF20、人TNFSF12和人ANGPT1中的至少一者或多者。
在另一方面,本文提供了一种包含用于特异性地结合蛋白质生物标志物的多个探针的阵列,其中所述蛋白质生物标志物是人FGF20、人TNFSF12和人ANGPT1、人SPARC、人CCL5、人APP、人PF4、人睾丸蛋白聚糖-2和人DNAJC19中的至少一者或多者。
在另一方面,本公开提供了一种包含如本文公开的蛋白质阵列的测试面板。
在另一方面,本公开提供了一种包含如本文公开的测试面板的药盒或测定装置。
在另一方面,本公开提供了一种抑制人受试者的进行性肾功能下降的进展的方法,所述方法包括向受试者施用有效量的至少一种保护性蛋白质和/或保护性蛋白质的至少一种激动剂。
在另一方面,本公开提供了一种预防人受试者的肾功能下降的方法,所述方法包括向受试者施用有效量的至少一种保护性蛋白质的激动剂和/或保护性蛋白质的至少一种激动剂。
在另一方面,本公开提供了一种预防治疗人受试者的肾功能下降的方法,所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种保护性蛋白质的激动剂和/或至少一种保护性蛋白质的激动剂。
在另一方面,本文提供了一种确定人类受试者是否具有增加的发展进行性肾病的风险的方法,所述方法包括从处于其风险的人受试者获得样品;检测所述受试者样品中至少一种保护性蛋白质的存在并测量其水平;将所述保护性蛋白质的受试者水平与所述保护性蛋白质的参考水平进行比较;基于所述受试者水平与所述参考水平的比较来确定所述受试者是否具有增加的发展进行性肾病的风险,其中所述受试者样品中所述保护性蛋白质以显著低于所述参考水平的水平存在表明所述受试者具有增加的发展进行性肾病的风险;以及向被鉴定为具有发展进行性肾病的风险的受试者施用疗法。所述方法还可包括监测所鉴定的受试者的保护性蛋白质的增加。
在任何上述方面的一些实施方案中,至少一种保护性蛋白质是FGF20、TNFSF12、ANGPT1、SPARC、CCL5、APP、PF4、睾丸蛋白聚糖-2和DNAJC19中的一者或多者。在其他实施方案中,至少一种保护性蛋白质是FGF20、FGF20的活性片段、FGF20模拟物或编码FGF20的核酸或其活性片段。在各种其他实施方案中,至少一种保护性蛋白质是TNFSF12、TNFS12的活性片段、TNFSF12模拟物或编码TNFSF12的核酸或其活性片段。在某些其他实施方案中,至少一种保护性蛋白质是ANGPT1、ANGPT1的活性片段、ANGPT1模拟物或编码ANGPT1的核酸或其活性片段。在其他实施方案中,至少一种保护性蛋白质是SPARC、SPARC的活性片段、SPARC模拟物或编码SPARC的核酸或其活性片段。在其他实施方案中,至少一种保护性蛋白质是CCL5、CCL5的活性片段、CCL5模拟物或编码CCL5的核酸或其活性片段。在某些其他实施方案中,至少一种保护性蛋白质是APP、APP的活性片段、APP模拟物或编码APP的核酸或其活性片段。在其他实施方案中,至少一种保护性蛋白质是PF4、PF4的活性片段、PF4模拟物或编码PF4的核酸或其活性片段。在其他实施方案中,至少一种保护性蛋白质是DNAJC19、DNAJC19的活性片段、DNAJC19模拟物或编码DNAJC19的核酸或其活性片段。在某些实施方案中,至少一种保护性蛋白质是睾丸蛋白聚糖-2、睾丸蛋白聚糖-2的活性片段、睾丸蛋白聚糖-2模拟物或编码睾丸蛋白聚糖-2的核酸或其活性片段。
在其他实施方案中,核酸是在载体中。在其他实施方案中,人受试者先前被鉴定为处于发展进行性肾功能下降风险的进展者。
在另一方面,本公开提供了一种确定人受试者在限定时间段内肾功能下降的大致风险的方法,所述方法包括:a)从所述人受试者获得生物样品;b)检测所述生物样品中至少一种保护性蛋白质的水平,其中所述至少一种保护性蛋白质选自由FGF20、TNFSF12、ANGPT1、SPARC、CCL5、APP、PF4、睾丸蛋白聚糖-2和DNAJC19组成的组;c)将关于所述保护性蛋白质的水平的数据与所述人受试者的临床数据特征(诸如eGFR、uACR、临床化学实验室测量值、生命体征、患者人口统计学)相结合,以及d)如使用机器学习或统计建模的预后风险评分算法(例如KidneyIntelX测试平台)所确定,确定所述人受试者的肾功能下降(RD)的大致风险。在某些实施方案中,使来自人受试者的样品与特异性地结合至保护性蛋白质的抗体或其抗原结合片段接触,并测量所述抗体与所述保护性蛋白质的结合以确定所述保护性蛋白质与所述抗体之间的结合水平。
在任何上述方面的一些实施方案中,所述方法进一步包括将生物样品中至少一种保护性蛋白质的水平与非进展者对照水平或正常白蛋白尿对照水平进行比较。在一些实施方案中,生物样品在第一时间点和第二时间点从人受试者获得。在其他实施方案中,第二时间点是在第二时间点之后约6个月、约12个月、约18个月、约24个月、约3年、约4年、约5年、约10年或约15年从人受试者获得。在某些其他实施方案中,所述方法进一步包括将在第一时间点从人受试者获得的生物样品中的至少一种保护性蛋白质的水平与在第二时间点从所述人受试者获得的生物样品进行比较。
附图说明
图1A-1B提供了显示log10转化后排名前3的保护性蛋白质候选物FGF20、TNFSF12和ANGPT1的分布的直方图。图1A提供了显示在组合的T1D发现和T2D复制群组中log10转化后FGF20、TNFSF12和ANGPT1的分布的直方图。图1B提供了显示在T1D验证群组中log10转化后FGF20、TNFSF12和ANGPT1的分布的直方图。
图2是显示具有T1D和T2D的Joslin肾脏研究群组中eGFR斜率(ml/min/1.73m2/年)的分布的图。缓慢下降者被定义为eGFR损失<3.0ml/min/1.73m2/年,并且快速下降者被定义为eGFR损失≥3.0ml/min/1.73m2/年或ESKD进展者。在每个群组中,本研究中仅考虑研究进入后前10年期间发展的ESKD病例。虚线指示eGFR损失等于3.0ml/min/1.73m2/年。
图3是研究设计的示意性图示,显示探索性和复制群组中的研究参与者以及如何选择候选保护性蛋白质。
图4A-4B提供显示与防止快速进行性肾功能下降相关的候选循环蛋白质的图。图4A是显示具有T1D(N=214)和T2D(N=144)的Joslin群组中19种血浆蛋白质的基线浓度与eGFR斜率之间的斯皮尔曼(Spearman)秩相关系数(rS)的图。阴影条形是效应大小的图形表示。已提供了相应的双侧P值。*所使用的显著性阈值:T1D探索群组中的FDR调整的P<0.005,和T2D复制群组中的标称P<0.05。图4B是显示单变量和调整逻辑回归模型中具有T1D和T2D的组合群组中19种候选保护性蛋白质和快速进行性肾功能下降(eGFR损失≥3.0ml/min/年)的优势比(95% CI)的图。效应显示为特定蛋白质的循环基线浓度每增加一个四分位数的优势比(95% CI)。最终模型针对基线eGFR、HbA1c和ACR进行调整,并按糖尿病类型进行分层。8种选定标志物呈红色。分析中包括的PKM2是基于之前的出版物。
图5A-5C提供显示8种经证实的保护性蛋白质与临床协变量以及与快速进行性肾功能下降风险的关联的图。图5A是显示8种候选保护性蛋白质与TNF-R1之间的斯皮尔曼秩相关矩阵以及针对糖尿病类型调整的两个群组中的重要临床协变量的图。相关系数(rs)以红色(正;用#标记)和蓝色(负;用##标记)阴影呈现,其对应于效应大小的大小。图5B是显示组合的Joslin群组中的分层聚类分析的图。图5C是显示使用显著性标准α=0.1从协变量的后向选择中选择的协变量的优势比(95% CI)的图。eGFR和HbA1c对快速进行性肾功能下降的影响分别按每10ml/min/1.73m2增加和每1%增加进行估计。ACR对快速进行性肾功能下降的影响估计为log10 ACR增加一个单位。每种蛋白质的效应显示为相关蛋白质的循环基线浓度每增加一个四分位数的优势比(95% CI)。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001;ns,不显著。
图6是在11种候选保护性蛋白质中斯皮尔曼秩相关矩阵的图,其中ACR针对糖尿病类型进行调整。相关系数(rs)以红色(正)和蓝色(负;用#标记)阴影呈现,其对应于效应大小的大小。
图7A-7D提供了显示保护性蛋白质(FGF20、TNFSF12和ANGPT1)对快速进行性肾功能下降和进展为ESKD的风险的组合作用的图。图7A是显示根据保护指数的快速进行性肾功能下降的优势比的图,所述保护指数被认为是具有两种类型的糖尿病和肾功能(kidneyfunction)(也称为“肾功能(renal function)”)受损的组合的探索和复制群组(N=358)中的离散协变量。图7B是显示根据组合的探索和复制群组中保护指数的离散值的ESKD累积发生率(%)的图。图7C是显示根据被视为具有正常肾功能的T1D受试者的验证群组(N=294)中的离散协变量的保护指数的快速进行性肾功能下降的优势比的图。图7D是显示根据验证群组中保护指数的离散值的ESKD累积发生率(%)的图。保护指数:每种蛋白质的高于中值的值评分为1,并且低于中值的值评分为0;通过总结这些评分,受试者的总保护指数可在0(所有蛋白质低于中值)与3(所有蛋白质高于中值)之间变化。*P<0.05;****P<0.0001;ns,不显著。
图8是FGF20胰蛋白酶肽GGPGAAQLAHLHGILR(SEQ ID NO:9)(氨基酸50-65)的提取离子色谱图。在重组FGF20存在(顶部)或不存在(底部)的情况下,FGF20 SOMAmer血浆下拉。
图9提供显示与非糖尿病患者相比,在组合的Joslin群组中非进展者和进展者的示例性保护性蛋白质ANGPT1(左图)、TNFSF12(中图)、FGF20(右图)的血浆浓度的图。条形描绘平均值±标准偏差。采用邓恩(Dunn)多重比较检验的单因素ANOVA。**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001;ns,不显著。
图10是显示非ESKD进展者与ESKD进展者之间睾丸蛋白聚糖-2(SPOCK2)血浆水平(RFU)的比较数据的直方图。
具体实施方式
I.定义
在详细阐述本发明之前,提供待在本文中使用的某些术语的定义。除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常所理解的含义相同的含义。
如本文中可互换使用的术语“受试者”或“患者”是指人。
如本文所用的术语“样品”是指从受试者获得的血浆、血清、细胞或组织。组织或细胞样品的来源可以是实体组织(如来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活检物或抽吸物);全血或任何血液成分;或体液,诸如血清、血浆、尿液、唾液、汗液或滑液。在一个实施方案中,样品是从人受试者获得的血浆样品。
如本文所用,术语生物标志物的“水平”或“量”是指生物标志物(例如生物标志物的蛋白质水平)的可测量量。所述量可以是(a)以每单位体积或细胞的分子、摩尔或重量为单位测量的绝对量,或(b)例如通过密度评分析测量的相对量。
如本文所用,可互换使用的术语“已知标准水平”、“参考水平”或“对照水平”是指生物标志物的接受的或预定的水平,其用于比较源自患者样品的生物标志物水平。在一个实施方案中,当与某一生物标志物(保护性蛋白质)的参考水平相比时,与参考水平的偏差通常指示疾病状态或未来疾病状态的改善或恶化。在一个实施方案中,当与保护性蛋白质的参考水平相比时,与参考水平的偏差通常指示受试者中疾病进展的可能性增加或减少。参考水平可从取自健康(例如,非糖尿病)个体或已知具有ESKD倾向的个体的样品产生。在一个实施方案中,本文所述的保护性蛋白质的参考水平是非糖尿病受试者中的蛋白质水平。
如本文所用,术语“可比较水平”是指一种生物标志物的水平与另一种生物标志物的水平(例如对照水平)基本相似。在一个实施方案中,如果两种生物标志物的水平在对照生物标志物水平的一个标准偏差之内,则所述生物标志物具有可比较的水平。在另一个实施方案中,如果两种生物标志物的水平在对照生物标志物水平的20%或更少之内,则所述生物标志物具有可比较的水平。
如本文所用,术语“估计肾小球滤过率”或“eGFR”是指用于估计肾功能的手段。在一个实施方案中,eGFR可基于血清肌酸酐水平的测量来确定。在另一个实施方案中,eGFR可基于血清胱抑素C水平的测量来确定。在又一个实施方案中,可使用CKD-EPI肌酸酐方程来确定eGFR。
如本文所用,术语“与慢性肾病相关的病症”或“与慢性肾病相关的病症”是指与肾功能受损相关的疾病或疾患,其可随时间推移导致肾损伤。与慢性肾病相关的病症的实例包括但不限于1型糖尿病、2型糖尿病、高血压、肾小球肾炎、间质性肾炎、多囊肾病、尿路长期阻塞(例如来自诸如前列腺增生、肾结石和一些癌症的疾患)、膀胱输尿管返流和复发性肾脏感染。慢性肾病及其阶段(CKD 1-5)通常可相应地进行表征或分类,诸如基于是否存在肾脏损伤(白蛋白尿)或估计肾小球滤过率受损(GFR<60[ml/min/1.73m2],有或没有肾损伤)。
如本文所用,术语“ESKD进展者”、“进展者”或“快速进展者”是指患有与慢性肾病相关的病症的受试者,所述受试者已被鉴定为具有升高的发展ESKD(本文中也称为ESRD)的风险。虽然ESKD进展者患有与慢性肾病相关的病症,所述病症可能使受试者处于发展ESKD的风险,但所述术语旨在包括具有鉴定的高于通常与慢性肾病相关的病症相关的风险的那些受试者。在一个实施方案中,进展者具有统计学上显著低于非进展者对照水平或正常白蛋白尿对照的FGF20、TNFSF12、ANGPT1、SPARC、CCL5、APP、PF4、睾丸蛋白聚糖-2和/或DNAJC19中的任一者或多者的水平,并且因此具有增加的发展ESKD的风险。在另一个实施方案中,进展者具有统计学上显著低于非进展者对照水平或正常白蛋白尿对照的FGF20、TNFSF12和/或ANGPT1中的任一者或多者的水平,并且因此具有增加的发展ESKD的风险。
如本文所用,术语“非进展者”是指患有与慢性肾病相关的病症且具有降低的发展ESKD的风险的受试者。在一个实施方案中,非进展者是患有与慢性肾病相关的病症的受试者,其处于1期或2期CKD(慢性肾病),但至少部分地由于升高或相当水平的保护性蛋白质(例如,与正常白蛋白尿对照相比)而具有较低的进展值ESKD的风险。在一个实施方案中,非进展者被定义为具有统计学上显著高于进展者对照水平或高于或相当于正常白蛋白尿对照的FGF20、TNFSF12、ANGPT1、SPARC、CCL5、APP、PF4、睾丸蛋白聚糖-2和/或DNAJC19中的任一者或多者的水平的受试者。在另一个实施方案中,非进展者被定义为具有统计学上显著高于进展者对照水平或高于或相当于正常白蛋白尿对照的FGF20、TNFSF12和/或ANGPT1中的任一者或多者的水平的受试者。在另一个实施方案中,非进展者被定义为具有统计学上显著高于进展者对照水平或高于或相当于正常白蛋白尿对照的睾丸蛋白聚糖-2水平的受试者。在一个实施方案中,非进展者是非糖尿病人受试者。非糖尿病是指尚未被诊断患有糖尿病(II型)的人。
如本文所用,术语“保护性蛋白质”是指其在人受试者中的水平与肾功能下降和/或与进展至ESKD的风险增加或减少相关的蛋白质。如本文所用,保护性蛋白质是其存在或增加的水平提供针对进行性肾功能降低的明显保护的蛋白质。保护性蛋白质的实例包括FGF20、TNFSF12、ANGPT1、SPARC、CCL5、APP、PF4、睾丸蛋白聚糖-2和/或DNAJC19。
如本文所用,术语“肾功能下降(renal decline)”或“RD”(本文也称为“肾功能下降(kidney decline)”(KD))是指与肾功能受损相关的疾患。在一个实施方案中,肾功能下降被定义为至少-3ml/min/年的估计肾小球滤过率(eGFR)变化(即,eGFR损失≥3.0ml/min/年)。在一个实施方案中,肾功能下降被定义为至少-5ml/min/年的估计肾小球滤过率(eGFR)变化(即,eGFR损失≥5.0ml/min/年)。在一个实施方案中,肾功能下降被定义为eGFR相对于基线持续下降≥40%(确认持续至少3个月)。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指当施用至活受试者时,对活受试者实现所需效果的量。确切的量将取决于治疗的目的,并且可由本领域技术人员使用已知技术确定。如本领域中所已知,可能必须针对全身性递送对比局部递送、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和疾患严重程度进行调整,并且将可由本领域技术人员用常规实验来确定。例如,本文所述的用于施用至活受试者的剂的有效量是预防和/或治疗ESKD的量。例如,对于肾脏保护剂,治疗有效量可以是与慢性肾病的基线临床可观察体征和症状相比已显示提供可观察到的治疗益处的量。
如本文所用,术语“肾保护剂”是指可预防或延迟具有中度增加的白蛋白尿或糖尿病性肾病的受试者中的肾病进展的剂。肾保护剂的实例包括但不限于血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和血管紧张素-II受体阻断剂(ARB)。在一个实施方案中,肾保护剂是本文描述的保护性蛋白质,或其等同物,例如活性片段。
II.保护性蛋白质
本公开至少部分地基于某些生物标志物的发现,所述生物标志物的蛋白质水平可用于鉴定将进展为ESKD(在本文中也称为ESRD)的受试者/患者以及将受到保护的受试者/患者。
本文公开了用于鉴定人受试者是否处于发展进行性肾功能下降的风险的方法。所述方法包括检测来自有需要的受试者的样品中的至少一种保护性蛋白质的水平。富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(SPARC)、C-C基序趋化因子5(CCL5)、淀粉样βA4蛋白(APP)、血小板因子-4(PF4)、DNAJC19、血管生成素-2(ANGPT1)、肿瘤坏死因子配体超家族成员12(TNFSF12)、成纤维细胞生长因子20(FGF20)和睾丸蛋白聚糖-2(SPOCK2)已通过本文的研究鉴定为保护性蛋白质,其水平与肾病的非进展相关。这些水平高于表现出进行性疾病的患者,并且这些蛋白质的水平较低。
可将来自受试者的一个或多个样品中的一种或多种保护性蛋白质的水平可与具有保护性蛋白质的参考水平的蛋白质上的保护性蛋白质的水平进行比较,以确定患者发展进行性肾功能下降并最终发展ESKD(在本文中也称为ESRD)的风险。
至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或全部八种保护性蛋白质的水平可用于本文公开的方法中。
在一个实施方案中,将成纤维细胞生长因子20(FGF20)、血管生成素-2(ANGPT1)和肿瘤坏死因子配体超家族成员12(TNFSF12)或其组合中的每一者的水平与参考水平进行比较,以便确定患者发展或持续患有进行性肾功能下降的风险。在一个实施方案中,将睾丸蛋白聚糖-2的水平与参考水平进行比较,以确定患者发展或持续患有进行性肾功能下降的风险。在另一个实施方案中,FGF20和TNFSF12;FGF20和ANGPT1;TNFSF12和ANGPT1;以及FGF20、TNFSF12和ANGPT1、FGF20和睾丸蛋白聚糖-2;ANGPT1和睾丸蛋白聚糖-2;TNFSF12和睾丸蛋白聚糖-2;FGF20、ANGPT1和睾丸蛋白聚糖-2;ANGPT1、TNFSF12和睾丸蛋白聚糖-2;FGF20、TNFSF12和睾丸蛋白聚糖-2;或FGF20、ANGPT1、TNFSF12和睾丸蛋白聚糖-2中的每一者的水平用于本文公开的方法中。
在一个实施方案中,将成纤维细胞生长因子20(FGF20);来自包括SPARC、CCL5、APP、PF4和ANGPT1(第1组保护性蛋白质)的第一组保护性蛋白质的保护性蛋白质;来自包括DNAJC19和TNFSF12(第2组保护性蛋白质)的第二组保护性蛋白质的保护性蛋白质,或其组合,例如第1组和第2组保护性蛋白质,或FGF20和第1组或第2组保护性蛋白质中的每一者的水平与参考水平进行比较,以确定患者发展或持续患有进行性肾功能下降的风险。
下文提供了描述本文鉴定的九种保护性蛋白质的表:
保护性蛋白质全名 UniProt ID 基因符号
肿瘤坏死因子配体超家族成员12 O43508 TNFSF12
富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白 P09486 SPARC
C-C基序趋化因子5 P13501 CCL5
淀粉样βA4蛋白 P05067 APP
血小板因子4 P02776 PF4
成纤维细胞生长因子20 Q9NP95 FGF20
血管生成素-1 Q15389 ANGPT1
DnaJ热休克蛋白家族成员C19 Q96DA6 DNAJC19
睾丸蛋白聚糖-2 Q92563 SPOCK2
一旦在来自受试者的样品中检测到保护性蛋白质水平,则将所述水平与参考水平进行比较,以确定所述水平是否与进展者概况(风险)或非进展者(保护)一致。
进行性肾功能下降的起始在患者具有正常肾功能时开始,并且其几乎线性进展为ESKD,尽管以估计肾小球滤过率(eGFR)的斜率表示的下降速率在那些个体之间在-72至3.0ml/min/年的范围内变化。
在一个实施方案中,保护性蛋白质的参考水平是非糖尿病人受试者的水平,其中与参考水平相比保护性蛋白质的更低水平表明人受试者处于发展进行性肾功能下降的风险。或者,与参考水平相比保护性蛋白质的同等或更高水平表明人受试者不处于发展进行性肾功能下降的风险。
在一个实施方案中,提供用于测试的样品的人受试者是患有与进行性肾功能下降相关的疾患(诸如糖尿病或高血压)的受试者。在另一个实施方案中,受试者可能具有受损的肾功能,其中将需要确定进一步肾功能下降的风险以减轻肾破坏。在一个实施方案中,受试者患有I型糖尿病或II型糖尿病。
对于患有糖尿病的患者来说,尽管过去20年在预防和治疗DKD方面血糖控制有所改善并且肾脏保护疗法取得了进展,但慢性肾病和ESKD的风险仍然相对较高(Rosolowsky等人,J Am Soc Nephrol 22:545-553(2011);de Boer等人,JAMA 305:2532-2539(2011))。来自Joslin肾脏研究(一项针对3000多名糖尿病患者的纵向研究)的结果证明,进行性肾功能下降是DKD的主要临床表现,是进展为ESKD的基础(Perkins等人,N Engl J Med 348:2285-2293(2003);Perkins等人,J Am Soc Nephrol 18:1353-1361(2007);Krolewski,Diabetes Care 38,954-962(2015);Krolewski等人,Kidney International 91:1300-1311(2017))。
尽管血糖控制有所改善并且肾脏保护疗法取得了进展,并且几乎得到普遍实施,但糖尿病患者中ESKD的发病率仍在持续增加。
糖尿病性肾病(DKD)及其重要的临床表现,即导致终末期肾病(ESKD;本文中也称为ESRD)的进行性肾功能下降是患有糖尿病的受试者的主要健康负担。作为进行性肾功能下降的基础的疾病过程包括增加此结果风险的因素/途径以及防止进行性肾功能下降的因素/途径。使用对来自随访7-15年的患有长期1型和2型糖尿病以及不同阶段的DKD的三个独立群组的受试者的循环蛋白质的非靶向蛋白质组学谱分析,已鉴定了3种升高的血浆蛋白质,即成纤维细胞生长因子20(FGF20;OR=0.69;95% Ci:0.54-0.88)、血管生成素-1(ANGPT1;OR=0.72;95% Ci:0.57-0.91)和肿瘤坏死因子配体超家族成员12(TNFSF12;OR=0.75;95% CI:0.59-0.95),它们与防止进行性肾功能下降和进展至ESKD相关。这3种保护性蛋白质的组合作用通过具有所有3种蛋白质的高基线浓度(高于中值)的受试者中ESKD的非常低的累积风险得到了良好的证明,而ESKD的累积风险在随访开始时具有低浓度(低于中值)的这些蛋白质的受试者中较高。这种保护作用强烈且独立于循环炎性蛋白质和重要的临床协变量表现,并在具有正常肾功能的糖尿病受试者的独立群组中得到证实。三种保护性蛋白质可充当生物标志物,以根据进展至ESKD的风险对糖尿病受试者进行分层。
在一个实施方案中,从受试者测试的样品是血浆样品。多个样品可用于测试一种或多种保护性蛋白质。或者,可使用一个样品来测试一种或多种保护性蛋白质。
保护性蛋白质的检测可根据标准免疫测定来确定。例如,ELISA或电化学发光检测(例如,Meso Sector S600(Meso Scale Diagnostics))。
本文还包括用于鉴定或监测人受试者的进行性肾功能下降的蛋白质阵列。在一个实施方案中,所述蛋白质阵列包含对人FGF20、人TNFSF12、人ANGPT1和/或人睾丸蛋白聚糖-2具有特异性的抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中,本公开提供了一种用于鉴定或监测人受试者的进行性肾功能下降的蛋白质阵列,所述蛋白质阵列包含对人FGF20、人TNFSF12和人ANGPT1、人SPARC、人CCL5、人APP、人PF4、人DNAJC19、人睾丸蛋白聚糖-2或其组合具有特异性的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中,阵列包含用于特异性地结合蛋白质生物标志物的多个探针,其中所述蛋白质生物标志物是人FGF20、人TNFSF12和人ANGPT1中的至少一者或多者。
在一个实施方案中,阵列包含用于特异性地结合蛋白质生物标志物的多个探针,其中所述蛋白质生物标志物是人FGF20、人TNFSF12、人ANGPT1、人SPARC、人CCL5、人APP、人PF4、人DNAJC19、人睾丸蛋白聚糖-2中的至少一者或多者。
本文所述的研究鉴定了九种保护性蛋白质(即,富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(CYP)、C-C基序趋化因子5(CCL5)、淀粉样βA4蛋白(APP)、血小板因子-4(PF4)、DNAJC19、血管生成素-2(ANGPT1)、肿瘤坏死因子配体超家族成员12(TNFSF12)、成纤维细胞生长因子20(FGF20)和睾丸蛋白聚糖-2),其可用于根据样品中的水平鉴定可能发展ESKD或患有导致ESKD的持续进行性肾病或将受到保护以免进展至ESKD的患者。
SPARC
本公开的保护性蛋白质是富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(SPARC)。
术语“富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白”基因或“SPARC”基因,也称为“骨粘连蛋白”、“ONT”、“基底膜蛋白40”、“BM-40和OI17”是指在正在经历形态发生、重塑和伤口修复的组织中以高水平表达的基因。SPARC基因编码称为SPARC的蛋白质。SPARC是32-35kD Ca2+结合基质细胞糖蛋白,其模块组构在系统发育上是保守的(Martinek等人Dev.GenesEvol.212:124-133.)。SPARC与细胞外空间中的I型胶原蛋白结合(Mendozo-Londono等人AmJ Hum Genet.2015年6月4日;96(6):979–985。)生物化学研究表明,SPARC与多种胶原蛋白和非胶原蛋白ECM分子结合,包括与形成网络的IV型胶原蛋白的Ca2+依赖性相互作用。SPARC蛋白包含三个结构域:卵泡抑素(Follistin)样结构域、Kazal样结构域和EF手结构域,并且包含两个钙结合位点。Follistin样酸性结构域以低亲和力结合5至8个Ca2+,并且EF手环以高亲和力结合Ca2+离子。在骨骼中,SPARC由成骨细胞表达。由于骨形成缺陷,SPARC缺失小鼠发展进行性骨质疏松症(Delany等人J.Clin.Invest.2000;105:915–923)。
SPARC多态性,特别是3'UTR中的多态性影响骨中的SPARC累积,并与骨形成的变化、骨量的变化相关,并且可能在成人骨质疏松症的发病机制中发挥作用(Delany等人(2016)Osteoporos.Int.2008;19:969–978;Dole等人(2016)J.Bone Miner.Res.2015;30:723–732)。SPARC中的纯合突变可导致人中的严重骨脆性(Mendozo-Londono等人Am J HumGenet.2015年6月4日;96(6):979–985。)
含有SPARC基因的人染色体的基因组区域的核苷酸序列可在例如GenBank上可获得的Genome Reference Consortium Human Build 38(也称为Human Genome build 38或GRCh38)中找到。含有SPARC基因的人5号染色体的基因组区域的核苷酸序列也可在例如GenBank登录号NC_000005.10中找到,对应于人5号染色体的核苷酸151,661,096-151,686,975。已发现此基因的编码不同同种型的三种转录物变体。SPARC的示例性核苷酸和氨基酸序列可例如在GenBank登录号NM_003118.4(智人SPARC转录物变体1)中找到。下面提供了人SPARC转录物变体1的氨基酸序列:
MRAWIFFLLCLAGRALAAPQQEALPDETEVVEETVAEVTEVSVGANPVQVEVGEFDDGAEETEEEVVAENPCQNHHCKHGKVCELDENNTPMCVCQDPTSCPAPIGEFEKVCSNDNKTFDSSCHFFATKCTLEGTKKGHKLHLDYIGPCKYIPPCLDSELTEFPLRMRDWLKNVLVTLYERDEDNNLLTEKQKLRVKKIHENEKRLEAGDHPVELLARDFEKNYNMYIFPVHWQFGQLDQHPIDGYLSHTELAPLRAPLIPMEHCTTRFFETCDLDNDKYIALDEWAGCFGIKQKDIDKDLVI(SEQ ID NO:1)
SPARC序列的另外实例可在公开数据库中找到,例如GenBank、OMIM和UniProt(P09486)。关于SPARC的附加信息可例如在涉及基因6678的NCBI网站上找到。如本文所用的术语SPARC还指SPARC基因的变异,包括临床变体数据库中,例如在涉及术语NM_003118.4的NCBI临床变体网站提供的变体。
CCL5
本公开的保护性蛋白是C-C基序趋化因子配体5(CCL5)。
术语“C-C基序趋化因子配体5”基因或“CCL5”基因,也称为“RANTES”、“SCYA5”、“SISd”、“EoCP”和“D17S136E”是指编码CCL5蛋白的基因,CCL5蛋白是T细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的趋化剂,在将白细胞募集到炎症部位方面发挥着积极作用。CCL5蛋白是具有单一结构域的8kD蛋白。CCL5是血液单核细胞、记忆性T辅助细胞和嗜酸性粒细胞的化学引诱物。CCL5引起从嗜碱性粒细胞释放组胺并激活嗜酸性粒细胞,并且已知可激活若干趋化因子受体,包括CCR1、CCR3、CCR4和CCR5。CCL5及其同源受体之一CCR5是由CD8+T细胞产生的主要HIV抑制因子之一,并且重组CCL5蛋白诱导对HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的不同毒株的剂量依赖性抑制。CCL5在高浓度时通过酪氨酸激酶途径激活T细胞(Wong等人J Biol Chem 273:309–314(1998);Bacon等人Science 269:1727–1730(1995)),导致T细胞产生IFNγ(Appay等人Int Immunol 12:1173–1182(2000))并且被认为诱导树突细胞的成熟(Fischer等人J Immunol 167:1637–1643(2001))。在滑膜CD8+T细胞中证实了高水平的CCL5蛋白,其在T细胞受体触发时迅速释放(Pharoah等人Arthritis Res Ther 8(2):R50(2006))CCL5信号直接作用于癌细胞以促进存活、侵袭和干细胞更新。在乳腺癌中,由MSC表达的CCL5作用于乳腺癌细胞以促进侵袭和转移(Karnoub等人Nature 449(7162):557-63(2007))。
携带CCL5基因的人染色体的基因组区域的核苷酸序列可在例如GenBank上可获得的Genome Reference Consortium Human Build 38中找到。CCL5基因是聚集在17号染色体q臂上的若干趋化因子基因之一。携带CCL5基因的人17号染色体的基因组区域的核苷酸序列也可在例如GenBank登录号NC_000017.11中找到,对应于人17号染色体的核苷酸35871491-35880360。已发现此基因的编码不同同种型的四种转录物变体。CCL5的示例性核苷酸和氨基酸序列可例如在GenBank登录号NM_002985.3(智人CCL5转录物变体1)中找到。下面提供了人CCL5转录物变体1的氨基酸序列:
MKVSAAALAVILIATALCAPASASPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKE YFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS(SEQ ID NO:2)
CCL5序列的另外实例可在公开获得的数据库中找到,例如GenBank、OMIM和UniProt(P13501)。关于CCL5的附加信息可例如在涉及基因6352的NCBI网站上找到。如本文所用的术语CCL5还指CCL5基因的变异,包括临床变体数据库中,例如在涉及术语NM_002985.3的NCBI临床变体网站提供的变体。
APP
本公开的另一种保护性蛋白质是淀粉样β前体蛋白(APP)。
术语“淀粉样β前体蛋白”基因或“APP”基因,也称为“ABPP”、“A4”、“AD1”、“肽酶微管连接蛋白-II”和“PreA4”是指编码淀粉样βA4蛋白的基因。APP是具有短胞质尾部和大胞外结构域的I型跨膜蛋白,包括其E1和E2结构域中的铜结合位点(Kong等人Eur Biophys J37(3):269-79(2008);Dahms等人J Mol Biol 416(3):438-52(2012))。APP蛋白在阿尔茨海默病发病机制中发挥核心作用(Masters等人Brain 129(Pt 11):2823-39(2006))。APP在突触过程中也至关重要,包括作为细胞表面受体的跨细胞突触粘附、神经突生长、神经元粘附、轴突发生、突触发生、通过蛋白质-蛋白质相互作用促进细胞运动性和转录调控(Müller等人Cold Spring Harb Perspect Med 2(2):a006288(2012))。App通过铜离子还原参与铜内稳态/氧化应激。在体外,铜金属化APP直接诱导神经元死亡或通过Cu2+介导的低密度脂蛋白氧化而增强(White等人J Neurosci 19(21):9170-9(1999);Maynard等人J Biol Chem277(47):44670-6(2002))。APP敲除小鼠表现出认知缺陷,并且突触前或突触后区室中APLP2敲除背景上的APP失活导致神经肌肉突触缺陷(Müller等人Cold Spring HarbPerspect Med 2(2):a006288(2012))。
携带APP基因的人染色体的基因组区域的核苷酸序列可在例如GenBank上可获得的Genome Reference Consortium Human Build 38中找到。携带APP基因的人21号染色体的基因组区域的核苷酸序列也可在例如GenBank登录号NC_000021.9中找到,对应于人21号染色体的核苷酸25880550-26171128。已发现此基因的编码不同同种型的多种转录物变体。APP的示例性核苷酸和氨基酸序列可例如在GenBank登录号NM_000484.4(智人APP转录物变体1)中找到。下面提供了人APP转录物变体1的氨基酸序列:
MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHMNVQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESD NVDSADAEEDDSDVWWGGADTDYADGSEDKVVEVAEEEEVAEVEEEEADDDEDDEDGDEVEEEAEEPYEEATERTTSIATTTTTTTESVEEVVREVCSEQAETGPCRAMISRWYFDVTEGKCAPFFYGGCGGNRNNFDTEEYCMAVCGSAMSQSLLKTTQEPLARDPVKLPTTAASTPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRERMSQVMREWEEAERQAKNLPKADKKAVIQHFQEKVESLEQEAANERQQLVETHMARVEAMLNDRRRLALENYITALQAVPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHLRVIYERMNQSLSLLYNVPAVAEEIQDEVDELLQKEQNYSDDVLANMISEPRISYGNDALMPSLTETKTTVELLPVNGEFSLDDLQPWHSFGADSVPANTENEVEPVDARPAADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQYTSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN(SEQ ID NO:3)
APP序列的另外实例可在公开数据库中找到,例如GenBank、OMIM和UniProt(P05067)。关于APP的附加信息可例如在涉及基因351的NCBI网站上找到。如本文所用的术语APP还指APP基因的变异,包括临床变体数据库中,例如在涉及术语NM_000484.4的NCBI临床变体网站提供的变体。
PF4
本公开的保护性蛋白质是血小板因子-4(PF4)。
术语“血小板因子-4”基因或“PF4”基因,也称为“CXCL4”、“趋化因子(C-X-C基序)配体4”、“制瘤素-A”、“SCYB4”和“伊罗普拉(Iroplact)”是指编码PF4蛋白的基因。PF4是一种趋化因子,主要以同源四聚体形式从激活的血小板的α颗粒中释放,其对肝素具有高亲和力并参与血小板聚集。已知PF4由多种免疫细胞分泌(Levine等人J Biol Chem 251(2):324-8(1976);Bon等人N Engl J Med 370(5):433-43(2014))。PF4对许多其他细胞类型具有趋化作用,并且还可充当造血、血管生成和T细胞功能的抑制剂。所述蛋白质还表现出针对恶性疟原虫的抗微生物活性。PF4还参与多种炎性疾病的病理学中,包括骨髓增生异常综合征、疟疾、HIV-1、动脉粥样硬化、炎性肠病和类风湿性关节炎(Affandi等人Eur JImmunol 48(3):522-531(2018);Yeo等人Ann Rheum Dis 75(4):763-71(2016))。
携带APP基因的人染色体的基因组区域的核苷酸序列可在例如GenBank上可获得的Genome Reference Consortium Human Build 38中找到。携带PF4基因的人4号染色体的基因组区域的核苷酸序列也可在例如GenBank登录号NC_000004.12中找到,对应于人4号染色体的核苷酸73,980,811-73,982,027。该基因具有一种鉴定的转录物。PF4的示例性核苷酸和氨基酸序列可例如在GenBank登录号NM_002619.4(智人PF4转录物变体1)中找到。下面提供了人PF4转录物变体1的氨基酸序列:
MSSAAGFCASRPGLLFLGLLLLPLVVAFASAEAEEDGDLQCLCVKTT SQVRPRHITSLEVIKAGPHCPTAQLIATLKNGRKICLDLQAPLYKKIIKKLL ES(SEQ ID NO:4)
PF4序列的另外实例可在公开数据库中找到,例如GenBank、OMIM和UniProt(P02776)。关于PF4的附加信息可例如在涉及基因5196的NCBI网站上找到。如本文所用的术语PF4还指PF4基因的变异,包括临床变体数据库中,例如在涉及术语NM_002619.4的NCBI临床变体网站提供的变体。
DNAJC19
本公开的保护性蛋白质是DnaJ热休克蛋白家族(Hsp40)成员C19(DNAJC19)。
术语“DnaJ热休克蛋白家族(Hsp40)成员C19”基因或“DNAJC19”基因,也称为“TIMM14”、“TIM14”、“PAM18”和“线粒体输入内膜易位酶亚基TIM14”是指编码DNAJC19蛋白的基因。DNAJC19蛋白是由59个氨基酸组成的6.29kDa蛋白质,与DNAJ蛋白家族的剩余蛋白质相比具有不寻常的结构。DNAJC19的DNAJ结构域位于C末端而不是N末端,并且跨膜结构域赋予DNAJC19膜结合定位,而其他DNAJ蛋白则位于胞质中(Zong等人Circulation Research113(9):1043–53)。DNAJC19是线粒体前蛋白ATP依赖性输入线粒体基质所必需的。DNAJC19的J结构域刺激mtHsp70 ATP酶活性,以为这种运输提供动力(Mokranjac等人EMBO J 22(19):4945–56)。DNAJC19的缺陷与扩张型心肌病伴共济失调(DCMA)、生长不足、小细胞性贫血和男性生殖器异常相关。DNAJC19在关于近亲哈特派群体的研究中首次牵涉于DCMA中,此后其已在其他欧洲群体中得到证实(Ojala等人Pediatric Research 72(4):432–7)。在临床上,通过筛查3-甲基戊烯二酸水平升高、线粒体窘迫、扩张型心肌病、心电图QT间期延长和小脑性共济失调来检测DNAJC19突变(Ojala等人Pediatric Research 72(4):432–7;Koutras等人Frontiers in Cellular Neuroscience 8:191)。
携带DNAJC19基因的人染色体的基因组区域的核苷酸序列可在例如GenBank上可获得的Genome Reference Consortium Human Build 38中找到。携带DNAJC19基因的人3号染色体的基因组区域的核苷酸序列也可在例如GenBank登录号NC_000003.12中找到,对应于人3号染色体的核苷酸180983709-180989838。DNAJC19的示例性核苷酸和氨基酸序列可例如在GenBank登录号NM_145261.4(智人DnaJ热休克蛋白家族(Hsp40)成员C19(DNAJC19)转录变体1)中找到。下面提供了人DNAJC19的氨基酸序列:
MASTVVAVGLTIAAAGFAGRYVLQAMKHMEPQVKQVFQSLPKSAFS GGYYRGGFEPKMTKREAALILGVSPTANKGKIRDAHRRIMLLNHPDKGGS PYIAAKINEAKDLLEGQAKK(SEQ ID NO:5)
DNAJC19序列的另外实例可在公开数据库中找到,例如GenBank、OMIM和UniProt(Q96DA6)。关于DNAJC19的附加信息可例如在涉及基因131118的NCBI网站上找到。如本文所用的术语DNAJC19还指DNAJC19基因的变异,包括临床变体数据库中,例如在涉及术语NM_145261.4的NCBI临床变体网站提供的变体。
ANGPT1
本公开的保护性蛋白质是血管生成素1(ANGPT1)。
术语“血管生成素1”基因或“ANGPT1”基因,也称为“KIAA0003”、“ANG-1”、“AGP1”和“AGPT”是指编码ANGPT1蛋白的基因。ANGPT1是分泌型70-kDa糖蛋白,并且是生长因子的血管生成素家族的成员。ANGPT1是主要存在于内皮细胞上的酪氨酸激酶受体Tek的主要激动剂。ANGPT1由脉管系统支持细胞和特化周细胞(如肾脏中的足细胞和肝脏中的ITO细胞)产生(Satchell等人J Am Soc Nephrol 13(2):544-550(2002))。ANGPT1在调控血管生成、内皮细胞存活、增殖、迁移、粘附和细胞扩散、肌动蛋白细胞骨架重组以及维持血管静止方面发挥着重要作用(Jeansson等人J Clin Invest 121(6):2278–2289(2011))。ANGPT1/Tek途径对于正常发育至关重要,因为常规ANGPT1或Tek敲除小鼠在E9.5和E12.5之间表现出致死性,具有类似的异常血管表型和心脏小梁损失(Suri等人Cell 87(7):1171-80(1996);Tachibana等人Mol Cell Biol 25(11):4693-702(2005))。
携带ANGPT1基因的人染色体的基因组区域的核苷酸序列可在例如GenBank上可获得的Genome Reference Consortium Human Build 38中找到。携带ANGPT1基因的人8号染色体的基因组区域的核苷酸序列也可在例如GenBank登录号NC_000008.11中找到,对应于人8号染色体的核苷酸107249482-107497918。ANGPT1的示例性核苷酸和氨基酸序列可例如在GenBank登录号NM_001146.5(智人血管生成素1(ANGPT1),转录物变体1)中找到。下面提供了人ANGPT1的氨基酸序列:
MTVFLSFAFLAAILTHIGCSNQRRSPENSGRRYNRIQHGQCAYTFILPEHDGNCRESTTDQYNTNALQRDAPHVEPDFSSQKLQHLEHVMENYTQWLQKLENYIVENMKSEMAQIQQNAVQNHTATMLEIGTSLLSQTAEQTRKLTDVETQVLNQTSRLEIQLLENSLSTYKLEKQLLQQTNEILKIHEKNSLLEHKILEMEGKHKEELDTLKEEKENLQGLVTRQTYIIQELEKQLNRATTNNSVLQKQQLELMDTVHNLVNLCTKEGVLLKGGKREEEKPFRDCADVYQAGFNKSGIYTIYINNMPEPKKVFCNMDVNGGGWTVIQHREDGSLDFQRGWKEYKMGFGNPSGEYWLGNEFIFAITSQRQYMLRIELMDWEGNRAYSQYDRFHIGNEKQNYRLYLKGHTGTAGKQSSLILHGADFSTKDADNDNCMCKCALMLTGGWWFDACGPSNLNGMFYTAGQNHGKLNGIKWHYFKGPSYSLRSTTMMIRPLDF(SEQ ID NO:6)
ANGPT1序列的另外实例可在公开获得的数据库中找到,例如GenBank、OMIM和UniProt(Q15389)。关于ANGPT1的附加信息可例如在涉及基因284的NCBI网站上找到。如本文所用的术语ANGPT1还指ANGPT1基因的变异,包括临床变体数据库中,例如在涉及术语NM_001146.5的NCBI临床变体网站提供的变体。
TNFSF12
本公开的保护性蛋白质是肿瘤坏死因子超家族成员12(TNFSF12)。
术语“肿瘤坏死因子超家族成员12”基因或“TNFSF12”基因,也称为“APO3L”、“DR3LG”、“TWEAK”和“TNLG4A”是指编码TNFSF12蛋白的基因。TNFSF12是肿瘤坏死因子(TNF)蛋白家族的成员,在免疫系统的调控中发挥着关键作用。TNFSF12在许多组织中广泛表达并在许多细胞系中诱导白介素-8合成(Chicheportiche等人Cell Biology and Metabolism272(51):32401-32410(1997))。人腺癌细胞系HT29在TNFSF12和干扰素-γ两者存在下经历细胞凋亡。白细胞是TNFSF12的主要来源,包括人静息和激活的单核细胞、树突细胞和自然杀伤细胞(Maecker等人Cell 123(5):931–44)。TNFSF12抑制IFN-γ和IL-12的产生,从而限制先天响应及其向适应性TH1免疫的转变。TNFSF12还促进内皮细胞的增殖和迁移,充当血管生成的调控因子。
含有TNFSF12基因的人染色体的基因组区域的核苷酸序列可在例如GenBank上可获得的Genome Reference Consortium Human Build 38中找到。含有TNFSF12基因的人17号染色体的基因组区域的核苷酸序列也可在例如GenBank登录号NC_000017.11中找到,对应于人17号染色体的核苷酸7549058-7557881。TNFSF12的示例性核苷酸和氨基酸序列可例如在GenBank登录号NM_003809.3(智人TNF超家族成员12(TNFSF12),转录物变体1)中找到。下面提供了人TNFSF12的氨基酸序列:
MAARRSQRRRGRRGEPGTALLVPLALGLGLALACLGLLLAVVSLGSRASLSAQEPAQEELVAEEDQDPSELNPQTEESQDPAPFLNRLVRPRRSAPKGRKTRARRAIAAHYEVHPRPGQDGAQAGVDGTVSGWEEARINSSSPLRY NRQIGEFIVTRAGLYYLYCQVHFDEGKAVYLKLDLLVDGVLALRCLEEFSATAASSLGPQLRLCQVSGLLALRPGSSLRIRTLPWAHLKAAPFLTYFGLFQVH(SEQ ID NO:7)
TNFSF12序列的另外实例可在公开数据库中找到,例如GenBank、OMIM和UniProt(O43508)。关于TNFSF12的附加信息可例如在涉及基因8742的NCBI网站上找到。如本文所用的术语TNFSF12还指TNFSF12基因的变异,包括临床变体数据库中,例如在涉及术语NM_003809.3的NCBI临床变体网站提供的变体。
FGF20
本公开的另一种保护性蛋白质是成纤维细胞生长因子20(FGF20)。
术语“成纤维细胞生长因子20”基因或“FGF20”基因,也称为“RHDA2”是指编码FGF20蛋白的基因。FGF20主要在正常脑,特别是小脑中表达。大鼠同源物优先在脑中表达,并且能够在体外增强中脑多巴胺能神经元的存活。FGF20是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的成员,具有广泛的有丝分裂和细胞存活活性,并且参与多种生物过程,包括细胞生长、形态发生、组织修复、肿瘤生长、侵袭和胚胎发育(Koga等人Biochemical and BiophysicalResearch Communications 261(3):756–65)。FGF20的基因多态性牵涉于与帕金森病中(Zhao等人Neurol Sci 37(7):1119-26(2016);Zhu等人Neurol Sci35(12)(2014))。
含有FGF20基因的人染色体的基因组区域的核苷酸序列可在例如GenBank上可获得的Genome Reference Consortium Human Build 38中找到。携带FGF20基因的人8号染色体的基因组区域的核苷酸序列也可在例如GenBank登录号NC_000008.11中找到,对应于人8号染色体的核苷酸16992181-17002345。FGF20的示例性核苷酸和氨基酸序列可例如在GenBank登录号NM_019851.3(智人成纤维细胞生长因子20(FGF20))中找到。下面提供了人FGF20的氨基酸序列:
MAPLAEVGGFLGGLEGLGQQVGSHFLLPPAGERPPLLGERRSAAERS ARGGPGAAQLAHLHGILRRRQLYCRTGFHLQILPDGSVQGTRQDHSLFGILEFISVAVGLVSIRGVDSGLYLGMNDKGELYGSEKLTSECIFREQFEENWYNTYSSNIYKHGDTGRRYFVALNKDGTPRDGARSKRHQKFTHFLPRPVDPERVPELYKDLLMYT(SEQ IDNO:8)
FGF20序列的另外实例可在公开获得的数据库中找到,例如GenBank、OMIM和UniProt(Q9NP95)中找到。关于FGF20的附加信息可例如在涉及基因26281的NCBI网站上找到。如本文所用的术语FGF20还指FGF20基因的变异,包括临床变体数据库中,例如在涉及术语NM_019851.3的NCBI临床变体网站提供的变体。
睾丸蛋白聚糖-2
可用作本文所述的方法和组合物中的标志物的另一种保护性蛋白质是睾丸蛋白聚糖-2。
人睾丸蛋白聚糖-2蛋白由SPOCK2基因编码,也称为TICN2或KIAA0275。睾丸蛋白聚糖-2与糖胺聚糖结合以形成细胞外基质的一部分。所述蛋白质含有1型甲状腺球蛋白、卵泡抑素样和钙结合结构域,并在酸性C末端区域中具有糖胺聚糖附着位点。SPOCK(SPARC/骨粘连蛋白CWCV和Kazal样结构域)编码具有三种已知同源物SPOCK1、-2和-3的分泌型蛋白聚糖。SPOCK最初被表征为精浆GAG承载肽的祖细胞形式,并且后来被克隆并鉴定为软骨素/硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)。SPOCK1和-2蛋白聚糖抑制神经元细胞附着和神经突延伸。此外,SPOCK2的多态性最近被鉴定为与支气管肺发育不良易感性相关的遗传特征,支气管肺发育不良是早产儿中常见的慢性呼吸道疾病(Hadchouel等人,Am J Respir Crit CareMed.,2011,184(10):1164-70),并充当针对肺上皮细胞的病毒感染的保护屏障(Ahn等人,JVirol.,2019,93(20):e00662-19)。
含有睾丸蛋白聚糖-2基因(SPOCK2)的人染色体的基因组区域的核苷酸序列可在例如GenBank上可获得的Genome Reference Consortium Human Build 38中找到。含有睾丸蛋白聚糖-2基因的人10号染色体的基因组区域的核苷酸序列也可在例如GenBank登录号NC_000010.11中找到,对应于人10号染色体的核苷酸72059034-72095313。睾丸蛋白聚糖-2的示例性核苷酸和氨基酸序列可例如在GenBank登录号NM_001244950.2(智人SPARC/骨粘连蛋白,cwcv和kazal样结构域蛋白聚糖2(SPOCK2),转录物变体3)中找到。下面提供了人睾丸蛋白聚糖-2(同种型2前体)的氨基酸序列:
MRAPGCGRLVLPLLLLAAAALAEGDAKGLKEGETPGNFMEDEQWLSSISQYSGKIKHWNRFRDEVEDDYIKSWEDNQQGDEALDTTKDPCQKVKCSRHKVCIAQGYQRAMCISRKKLEHRIKQPTVKLHGNKDSICKPCHMAQLASVCGSDGHTYSSVCKLEQQACLSSKQLAVRCEGPCPCPTEQAATSTADGKPETCTGQDLADLGDRLRDWFQLLHENSKQNGSASSVAGPASGLDKSLGASCKDSIGWMFSKLDTSADLFLDQTELAAINLDKYEVCIRPFFNSCDTYKDGRVSTAEWCFCFWREKPPCLAELERIQIQEAAKKKPGIFIPSCDEDGYYRKMQCDQSSGDCWCVDQLGLELTGTRTHGSPDCDDIVGFSGDFGSGVGWEDEEEKETEEAGEEAEEEEGEAGEADDGGYIW(SEQ ID NO:11)
睾丸蛋白聚糖-2序列也可在公开数据库中找到,例如GenBank、OMIM和UniProt(Q92563)。关于睾丸蛋白聚糖-2(SPOCK2)的附加信息可例如在涉及基因9806的NCBI网站上找到。如本文所用的术语睾丸蛋白聚糖-2还指SPOCK2基因的变异,包括在临床变体数据库中,例如在NCBI临床变体网站上提供的变体,其指术语NM_001244950.2。
截至提交本申请之日,上述每个GenBank登录号和基因数据库号的全部内容通过引用并入本文。
III.基于保护性蛋白质确定RD和ESRD风险的方法和组合物
本公开至少部分地基于以下发现:某些保护性蛋白质的水平可用于鉴定处于进行性肾病或进展至终末期肾病风险的人受试者。相对于未患有进行性肾功能下降的人,本文鉴定的保护性蛋白质的低水平表明谁将被保护免于进展至终末期肾病,而谁则不会。本文描述的另一个实施方案是对被鉴定为处于ESKD风险的人患者的治疗,其中例如施用保护性蛋白或其组合降低患者患进行性肾病的风险。
本文提供了可用于本文所述的方法和组合物中的保护性蛋白质的实例。如本文所述,术语保护性蛋白质旨在包括保护性蛋白质及其功能片段。例如,功能片段将保留归因于相应全长(或非片段)等效物的能力。
可测定源自受试者的生物样品中一种或多种保护性蛋白质的表达水平。源自受试者的样品是源自受试者并从受试者获得的样品。这样的样品可在从受试者获得之后进行进一步加工。例如,可从样品中分离蛋白质。在一个实施方案中,从样品中分离的蛋白质也是源自受试者的样品。可用于测定一种或多种保护性蛋白质水平的生物样品可从基本上任何来源获得,因为已报道蛋白质在整个身体的细胞、组织和流体中表达。然而,在本公开的一个方面,可在非侵入性地从受试者获得的样品中检测指示受试者患有肾功能下降和/或ESKD或者患有肾功能下降和/或发展ESKD的风险的一种或多种保护性蛋白质的水平。
在某些实施方案中,用于测定一种或多种保护性蛋白质的水平的生物样品是含有循环蛋白质生物标志物的样品。细胞外蛋白质生物标志物在多种生物材料,包括体液,诸如来自循环系统的流体,例如血液样品或淋巴样品,或来自另一种体液如脑脊液(CSF)、尿液或唾液中自由循环。因此,在一些实施方案中,用于测定一种或多种保护性蛋白质的水平的生物样品是体液,例如血液、其级分、血清、血浆、尿液、唾液、泪液、汗液、精液、阴道分泌物、淋巴液、支气管分泌物、CSF等。在一些实施方案中,样品是非侵入性获得的样品。在特定实施方案中,样品是尿液样品。在另一个实施方案中,样品是血浆样品。在另一个实施方案中,样品是血清样品。
在一些实施方案中,用于测定一种或多种保护性蛋白质的水平的生物样品可含有细胞。在其他实施方案中,生物样品可不含或基本上不含细胞(例如血清样品)。在一些实施方案中,含有循环蛋白质生物标志物的样品是血液来源的样品。示例性血液来源的样品类型包括例如血液样品、血浆样品、血清样品等。在其他实施方案中,含有循环蛋白质生物标志物的样品是淋巴液样品。循环蛋白质生物标志物也存在于尿液和唾液中,并且源自这些来源的生物样品同样适合于测定一种或多种保护性蛋白质的水平。
用于测定保护性蛋白质水平的组合物
本文还公开了包含对FGF20、TNFSF12、ANGPT1、SPARC、CCL5、APP、PF4、DNAJC19和睾丸蛋白聚糖-2中的任一者或多者具有特异性的抗体或其抗原结合片段的阵列(例如,蛋白质阵列)或组合物,以用于执行本文所述的方法。此类阵列可包括用于附着任何一种或多种抗体或其抗原结合片段的支持物或基底,所述抗体或其抗原结合片段对FGF20、TNFSF12、ANGPT1、SPARC、CCL5、APP、PF4、DNAJC19和睾丸蛋白聚糖-2中的任一者或多者具有特异性。此类支持物和基底是本领域已知的并且包括共价和非共价相互作用。例如,施加的蛋白质(例如,抗体或其抗原结合片段)扩散至多孔表面(如水凝胶)中允许未修饰的蛋白质在水凝胶结构内非共价结合。共价偶联方法提供了稳定的键联,并且可应用于一系列蛋白质。利用蛋白质(例如生物标志物)上的标签(例如六组氨酸(SEQ ID NO:10)/Ni-NTA或生物素/抗生物素蛋白)和固定在基底表面上的配偶体试剂的生物捕获方法提供了稳定的键联并以可重复的取向特异性地结合蛋白质(例如,生物标志物)。
在一个实施方案中,将对本文所述的FGF20、TNFSF12、ANGPT1、SPARC、CCL5、APP、PF4、DNAJC19和睾丸蛋白聚糖-2中的任一者或多者具有特异性的抗体或其抗原结合片段包被或点样到支持物或基底上,例如化学衍生玻璃,或用蛋白质结合剂(如但不限于硝酸纤维素)包被的玻璃板。
在另一个实施方案中,对FGF20、TNFSF12、ANGPT1、SPARC、CCL5、APP、PF4、DNAJC19和睾丸蛋白聚糖-2中的任一者或多者具有特异性的抗体或其抗原结合片段以阵列(如微阵列)的形式提供。蛋白质微阵列是本领域已知的并且例如由Hall等人(2007)Mech AgeingDev 128:161-167和Stoevesandt等人(2009)Expert Rev Proteomics 6:145-157等人综述,其公开内容通过引用并入本文。可通过使用接触式点样器或非接触式点样微喷头将纯化的抗原固定在基底(如经处理的显微镜载玻片)上来制备微阵列。微阵列也可直接从相应的DNA阵列通过原位无细胞合成来产生。微阵列可包含在用于执行本文公开的方法的测试面板中。在某些情况下,微阵列的产生是使用市售的印刷缓冲液进行的,所述缓冲液旨在维持抗原的三维形状。在一个实施方案中,微阵列的基底是硝酸纤维素包被的载玻片。
通过本领域已知的方法进行测定,其中将对FGF20、TNFSF12、ANGPT1、SPARC、CCL5、APP、PF4、DNAJC19和睾丸蛋白聚糖-2中的任一者或多者具有特异性的一种或多种抗体或其抗原结合片段在允许抗体与FGF20、TNFSF12、ANGPT1、SPARC、CCL5、APP、PF4、DNAJC19和睾丸蛋白聚糖-2中的任一者或多者形成免疫复合物的条件下与生物样品接触,以用于检测免疫复合物。免疫复合物的存在和量可通过本领域已知的方法来检测,包括基于标记和无标记的检测。例如,基于标记的检测方法包括添加与包含信号产生化合物的指示试剂偶联的第二抗体。第二抗体可以是抗人IgG抗体。指示试剂包括显色剂、催化剂(如酶缀合物)、荧光化合物(如荧光素和罗丹明)、化学发光化合物(如二氧杂环丁烷、吖啶鎓、菲啶鎓、钌和鲁米诺)、放射性元素、直接可视标记以及辅因子、抑制剂和磁性粒子。酶缀合物的实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶。无标记检测方法包括表面等离子体共振、碳纳米管和纳米线以及干涉测量法。基于标记和无标记的检测方法是本领域已知的并且例如由Hall等人(2007)和Ray等人(2010)Proteomics10:731-748公开。检测可通过本领域已知的并且适合于所使用的标记的扫描方法以及相关的分析软件来完成。
如本文所述,公开了指示肾功能下降和/或ESKD的保护性蛋白质和/或指示肾功能下降的风险增加和/或进展至ESKD的风险增加的保护性蛋白质。因此,预期可从来自受试者的样品测定保护性蛋白质水平,所述受试者如测试受试者(例如,疑似患有肾功能下降和/或ESKD的受试者,或处于增加的罹患肾功能下降和/或ESKD的风险的受试者),以便确定所述测试受试者是否患有肾功能下降和/或ESKD,或者所述测试受试者是否处于增加的肾功能下降的风险和/或增加的进展至ESKD的风险。在某些实施方案中,通过以下方式来鉴定保护性蛋白质:比较例如来自发展了肾功能下降和/或ESKD的受试者的样品或来自处于肾功能下降和快速进展至ESKD风险的患有糖尿病(T1D、T2D)的受试者的样品中的某些蛋白质(例如,循环蛋白质)的水平,并与例如来自未发展肾功能下降和/或ESKD的受试者的样品或来自被确定具有稳定肾功能的患有糖尿病(T1D、T2D)的受试者(即非进展者)的样品或来自健康对照受试者的样品或标准对照水平或参考水平的样品中的某些蛋白质(例如循环蛋白质)的水平进行比较。在其他实施方案中,通过以下方式来鉴定保护性蛋白质:比较例如来自发展了肾功能下降和/或ESKD的受试者的样品或来自处于肾功能下降和快速进展至ESKD的风险的患有糖尿病(T1D、T2D)的受试者的样品中的某些蛋白质(例如,循环蛋白质)的水平,并与例如通过蛋白质组学平台(例如,SOMAscan平台和/或OLINK平台)已知或测量的蛋白质(例如,循环蛋白质或血浆蛋白质)的已知基线浓度进行比较。以这种方式鉴定了许多差异存在的蛋白质生物标志物,并确定为指示受试者患有肾功能下降和/或ESKD,指示肾功能下降和/或进展至ESKD的风险增加,其包括但不限于FGF20、TNFSF12、ANGPT1、SPARC、CCL5、APP、PF4、DNAJC19和/或睾丸蛋白聚糖-2。
本文鉴定的保护性蛋白质可用于确定受试者,例如患有T1D或T2D的受试者是否患有肾功能下降和/或ESKD或处于发展肾功能下降和/或ESKD的风险,并且其发展肾功能下降和/或ESKD的风险先前未知。这可通过测定源自受试者的生物样品中FGF20、TNFSF12、ANGPT1、SPARC、CCL5、APP、PF4、DNAJC19和/或睾丸蛋白聚糖-2或其组合中的一者或多者的水平来实现。与源自正常受试者(即,已知未患肾功能下降和/或ESKD的受试者;或正常白蛋白尿对照水平,或健康对照水平或标准对照水平)的生物样品中相比,这些保护性蛋白质中的一者或多者的水平的差异可预测受试者是否具有发展肾功能下降和/或ESKD的风险。
生物样品中一种或多种保护性蛋白质的水平可通过任何合适的方法来确定。可使用用于测量或检测样品中蛋白质的水平或量的任何可靠的方法。因此,实践本文公开的方法可利用分子生物学领域中的常规技术。公开了在本公开中使用的一般方法的基础文章包括Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版2001);Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990);和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人,编辑,1994))。
本公开涉及测量或检测受试者的细胞、组织或样品(例如血浆样品或血清样品)中发现的某些蛋白质水平的量的方法(例如体外方法),作为检测肾功能下降和/或ESKD的存在,评估发展肾功能下降和/或ESKD的风险,诊断、预测和/或监测肾功能下降和/或ESKD的进展和/或监测用于肾功能下降和/或ESKD的治疗的功效的手段。因此,在某些实施方案中,实践本公开的方法(例如,使用某些鉴定的生物标志物进行肾功能下降和/或ESKD的诊断、预后和/或监测的体外方法)的第一步骤是获得来自测试受试者的细胞、组织或样品(例如尿液样品或血浆样品或血清样品)并从所述样品中提取蛋白质。
样品可根据本领域已知的方法制备。来自受试者的细胞、组织或血液样品(例如,血浆样品或血清样品)适合于本公开并且可使用众所周知的方法并如本文所述获得。在本公开的某些实施方案中,血浆样品是优选的样品类型。在本公开的其他实施方案中,血清样品是优选的样品类型。
在一些实施方案中,生物样品(例如,细胞、组织、血浆样品或血清样品)获自待测试或监测肾功能下降和/或ESKD的受试者,如本文所述。相同类型的生物样品应取自测试受试者(例如,疑似患有肾功能下降和/或ESKD的受试者和/或处于发展肾功能下降和/或ESKD的风险的受试者)和对照受试者(例如,未患肾功能下降和/或ESKD的受试者;例如,来自正常白蛋白尿对照受试者的样品,或来自健康对照受试者的样品,或具有已知/标准对照水平的样品))。从受试者(如测试受试者)收集生物样品可根据医院或诊所通常遵循的标准方案进行。收集适量的生物样品(例如,细胞、组织或血浆样品)并且可在进一步制备之前根据标准程序储存。
在某些实施方案中,可使用例如细胞、组织、尿液样品、血浆样品或血清样品进行根据本文公开的方法在受试者(例如测试受试者)的生物样品中发现的如本文所述的某些保护性蛋白质的分析。用于制备用于蛋白质提取的生物样品的方法是本领域技术人员众所周知的。例如,应首先处理受试者(例如测试受试者)的细胞群体或组织样品以破坏细胞膜,从而释放细胞内所含的蛋白质。
为了检测本文公开的某些保护性蛋白质的存在或评估测试受试者是否患有肾功能下降和/或ESKD或处于发展肾功能下降和/或ESKD的风险,可从所述受试者收集生物样品并且可测量本文公开的某些保护性蛋白质的水平,然后与这些相同的某些保护性蛋白质的正常水平进行比较(例如,与在肾功能下降和/或ESKD发作之前受试者中相同类型的生物样品中本文公开的某些保护性蛋白质的水平进行比较,和/或与来自健康对照受试者(例如,未患T1D或T2D的受试者)的相同类型生物样品中本文公开的某些保护性蛋白质的水平进行比较,和/或与本文公开的某些保护性蛋白质的基线水平的已知对照标准进行比较)。如果当与本文公开的一种或多种某些保护性蛋白质的正常水平相比时,本文公开的一种或多种某些保护性蛋白质的水平在统计学上显著较低,则测试受试者被认为患有肾功能下降和/或ESKD或具有增加的发展肾功能下降和/或ESKD的风险。为了监测疾病进展或评估肾功能下降和/或ESKD患者中的治疗有效性,可在不同时间点采集来自测试受试者的生物样品,使得可随时间推移(即连续测试)测量本文公开的某些保护性蛋白质的水平以提供指示疾病状态的信息。例如,当来自测试受试者的本文公开的某些保护性蛋白质的水平显示随时间推移增加或稳定至正常水平的总体趋势时,所述测试受试者被认为在肾功能下降和/或ESRD的严重性方面正在改善或稳定,或患者正在接受的疗法被认为是有效的。来自测试受试者的本文公开的某些保护性蛋白质的水平缺乏增加或稳定,或者来自测试受试者的本文公开的某些保护性蛋白质的水平持续降低的趋势将表明疾患恶化和给予患者的疗法无效。一般而言,在测试受试者中观察到的本文公开的某些保护性蛋白质的相对较低水平表明所述测试受试者患有肾功能下降和/或ESKD和/或所述测试受试者的肾功能下降和/或ESKD疾患正在恶化或肾功能下降和/或ESKD正在进展。
任何特定身份的蛋白质,如本文公开的保护性蛋白质,可使用多种免疫学测定来检测。在一些实施方案中,可通过用对保护性蛋白质具有特异性结合亲和力的抗体(或多种抗体)从测试样品中捕获保护性蛋白质来进行夹心测定。随后可使用例如对保护性蛋白质具有特异性结合亲和力的标记抗体来检测保护性蛋白质。一种常见的检测方法是使用通过使用用放射性同位素(例如3H、125I、35S、14C或32P、99mTc等)标记的放射性标记的检测剂(例如放射性标记的抗保护性蛋白质特异性抗体)进行的放射自显影。由于所选同位素的合成容易性、稳定性和半衰期,放射性同位素的选择取决于研究偏好。可用于标记检测剂(例如,用于标记抗生物标志物特异性抗体)的其他标记包括化合物(例如,生物素和地高辛),其与用荧光团、化学发光剂、荧光团和酶(例如,HRP)标记的抗配体或抗体结合。此类免疫学测定可使用微流体装置如微阵列蛋白质芯片来进行。目标蛋白质(例如,如本文公开的保护性蛋白质)还可通过凝胶电泳(如二维凝胶电泳)和使用特异性抗体(例如,抗保护性蛋白质特异性抗体)的蛋白质印迹分析来检测。在一些实施方案中,标准ELISA技术可用于使用适当的抗体(或多种抗体)(例如抗保护性蛋白质特异性抗体)来检测给定蛋白质(例如本文公开的保护性蛋白质)。在其他实施方案中,标准蛋白质印迹分析技术可用于使用适当的抗体,检测给定蛋白质(例如,本文公开的保护性蛋白质)。或者,标准免疫组织化学(IHC)技术可用于使用适当的抗体(或多种抗体)(例如,抗保护蛋白特异性抗体)检测给定保护性蛋白质。单克隆抗体和多克隆抗体(包括具有所需结合特异性的抗体片段)均可用于保护性蛋白质的特异性检测。此类抗体及其对特定蛋白质(例如本文公开的保护性蛋白质)具有特异性结合亲和力的结合片段可通过已知技术产生。
在一些实施方案中,如本文公开的保护性蛋白质可用结合至保护性蛋白质的抗体(如抗保护性蛋白特异性抗体或其抗原结合片段)来检测(例如,可在检测测定中检测)。在某些实施方案中,抗保护性蛋白质特异性抗体用作检测剂,如结合如本文公开的保护性蛋白质并检测保护性蛋白(例如来自生物样品),如在检测测定中(例如,在蛋白质印迹分析、免疫组织化学分析、放射自显影分析和/或ELISA中)检测保护性蛋白质的检测抗体。在某些实施方案中,抗保护性蛋白质特异性抗体用作检测捕获剂,所述捕获剂结合至保护性蛋白质并检测保护性蛋白(例如来自生物样品),如在检测测定中(例如,在蛋白质印迹分析、免疫组织化学分析、放射自显影分析和/或ELISA中)检测保护性蛋白质。在一些实施方案中,抗保护性蛋白质特异性抗体或其抗原结合片段被标记以便于检测。在一些实施方案中,将抗保护性蛋白质特异性抗体或其抗原结合片段进行放射性标记(例如,用放射性同位素标记,如用3H、125I、35S、14C或32P、99mTc等标记)、酶标记(例如,用酶标记,如用辣根过氧化物酶(HRP)标记)、荧光标记(例如,用荧光团标记)、用化学发光剂标记和/或用化合物(例如,用生物素和地高辛)标记。
在实践本公开时,也可采用其他方法来测量或检测如本文公开的保护性蛋白质的水平。例如,基于质谱技术开发了多种方法,即使在大量样品中也可快速且准确地定量目标蛋白质。这些方法涉及高度复杂的设备,如使用多反应监测(MRM)技术的三重四极(tripleQ)仪器、基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱仪(MALDI TOF/TOF)、使用选择性离子监测SIM)模式的离子阱仪器以及基于电喷雾电离(ESI)的QTOP质谱仪。参见例如,Pan等人,J Proteome Res 2009年2月;8(2):787-797。
在其他实施方案中,通过评估如本文公开的保护性蛋白质来评价如本文公开的保护性蛋白质的表达。在一些实施方案中,抗保护性蛋白质特异性抗体或其片段可用于评估保护性蛋白质。此类方法可涉及使用IHC、蛋白质印迹分析、ELISA、免疫沉淀、放射自显影或抗体阵列。在特定实施方案中,使用IHC评估保护性蛋白质。IHC的使用可允许对保护性蛋白质进行定量和表征。IHC还可对待确定保护性蛋白质的表达的样品进行免疫反应性评分。术语“免疫反应性评分”(IRS)是指基于反映阳性细胞百分比的量度(按1-4的标度,其中0=0%,1=<10%,2=10%-50%,3=50%-80%,并且4=>80%)乘以染色强度(按1-3的标度,其中1=弱,2=中度,3=强)计算的数字。IRS可在0-12的范围内。
在某些其他实施方案中,SOMAscan-基于适体的蛋白质组学平台可用于测定如本文公开的保护性蛋白质的水平。该平台技术是基于以下认识:DNA和RNA的独特单链序列(称为适体)能够以高亲和力和特异性识别折叠的蛋白质表位。通过使用SOMAscan平台以测定蛋白质浓度(每蛋白质使用一个适体),这一性质得到了进一步进展。该平台具有高通量能力(一个样品中超过1000种蛋白质),具有重现性和灵敏度。
在某些其他实施方案中,基于OLINK-邻近扩展测定的蛋白质组学平台可用于测定如本文公开的保护性蛋白质的水平。OLINK邻近扩展测定是一种分子技术,它将基于抗体的免疫测定与PCR和定量实时PCR(qPCR)的强大特性相结合,从而形成可多重且高度特异性的方法(例如,每个蛋白质使用两种抗体)。仅使用1μL血浆/血清即可同时定量众多保护性蛋白质。这些测定经过彻底验证并分组为专门针对特定疾病或生物过程而设计的组,并针对临床样品中目标蛋白浓度的预期动态范围进行了优化。
如本文所用,估计肾小球滤过率(eGFR)是指用于估计肾功能的手段。在一些实施方案中,本文描述的方法包括测量人受试者的估计肾小球功能率(eGFR)斜率并确定人受试者的eGFR斜率是否指示人受试者患有肾功能下降或处于发展肾功能下降的风险。在一些实施方案中,eGFR是基于血清肌酸酐水平的测量而确定。在其他实施方案中,eGFR是基于血清胱抑素C水平的测量而确定。在其他实施方案中,使用普通最小二乘法来确定eGFR,假设具有至少3个可用的血清肌酸酐值的线性回归,并且测量间隔至少6个月。在其他实施方案中,使用普通最小二乘法来确定eGFR,假设具有至少3个可用的血清肌酸酐值的线性回归,并且间隔至少1年测量。在又其他实施方案中,使用普通最小二乘法来确定eGFR,假设具有至少3个可用的血清肌酸酐值的线性回归,并且间隔至少2年或更多年测量。在其他实施方案中,eGFR通过目视检查来估计。
在一些实施方案中,至少<-3ml/min/年的eGFR斜率(即,eGFR损失≥3.0ml/min/年)指示人受试者患有肾功能下降或处于发展肾功能下降的风险。在其他实施方案中,至少<-5ml/min/年的eGFR斜率指示人受试者患有肾功能下降或处于发展肾功能下降的风险。在其他实施方案中,至少<-10ml/min/年的eGFR斜率指示人受试者患有肾功能下降或处于发展肾功能下降的风险。在又一个实施方案中,至少<-15ml/min/年的eGFR斜率指示人受试者患有肾功能下降或处于发展肾功能下降的风险。在其他实施方案中,eGFR相对于基线持续下降≥40%(确认持续至少3个月)指示人受试者患有肾功能下降或处于发展肾功能下降的风险。
在又一个实施方案中,可使用CKD-EPI肌酸酐方程来确定eGFR。在一些实施方案中,GFR斜率的估计可取决于受试者的种族、性别和血清肌酸酐水平。例如,在一个实施方案中,血清肌酸酐浓度(μmol/dL)≤62(≤0.7)的非洲后裔女性的eGFR斜率使用以下表达式确定:GFR=166×(Scr/0.7)-0.329×(0.993)年龄。在另一个实施方案中,血清肌酸酐浓度(μmol/dL)>62(>0.7)的非洲后裔女性的eGFR斜率使用以下表达式确定:GFR=166×(Scr/0.7)-1.209×(0.993)年龄。在另一个实施方案中,血清肌酸酐浓度(μmol/dL)≤80(≤0.9)的非洲后裔男性的eGFR斜率使用以下表达式确定:GFR=163×(Scr/0.9)-0.411×(0.993)年龄。在另一个实施方案中,血清肌酸酐浓度(μmol/dL)>80(>0.9)的非洲后裔男性的eGFR斜率使用以下表达式确定:GFR=163×(Scr/0.9)-1.209×(0.993)年龄。在另一个实施方案中,血清肌酸酐浓度(μmol/dL)≤62(≤0.7)的非非洲后裔女性的eGFR斜率使用以下表达式确定:GFR=144×(Scr/0.7)-0.329×(0.993)年龄。在另一个实施方案中,血清肌酸酐浓度(μmol/dL)>62(>0.7)的非非洲后裔女性的eGFR斜率使用以下表达式确定:GFR=144×(Scr/0.7)-1.209×(0.993)年龄。在另一个实施方案中,血清肌酸酐浓度(μmol/dL)≤80(≤0.9)的非非洲后裔男性的eGFR斜率使用以下表达式确定:GFR=141×(Scr/0.9)-0.411×(0.993)年龄。在另一个实施方案中,血清肌酸酐浓度(μmol/dL)>80(>0.9)的非洲后裔男性的eGFR斜率使用以下表达式确定:GFR=141×(Scr/0.9)-1.209×(0.993)年龄
用于确定估计肾小球滤过率的另外方法是本领域技术人员已知的。
本文描述的方法可进一步包括通过使用机器学习的预后风险评分测定作为体外诊断方法来组合电子健康记录(EHR)和生物标志物(例如SPARC、CCL5、APP、PF4、DNAJC19、ANGPT1、TNFSF12、FGF20和睾丸蛋白聚糖-2中的一者或多者),以能够准确预测进行性肾功能下降的风险。
在一些实施方案中,机器学习的预后风险评分测定是KIDNEYINTELXTM。为此,可训练随机森林模型,并且可将性能(例如,曲线下面积(AUC)、阳性和阴性预测值(PPV/NPV)以及净重新分类指数(NRI))与临床模型和KDIG O类别进行比较,以用于预测估计肾小球滤过率(eGFR)下降≥5ml/min/年、持续下降≥40%或5年内肾功能衰竭的复合结果。在一些实施方案中,可使用患有流行性糖尿病肾病(DKD)的患者/来自两个HER关联生物库的血浆库的观察性群组研究。KIDNEYINTELXTM可为患有早期DKD的个体提供比KDI GO(肾病:改善全局结果)指南和临床模型更好的肾脏结果预测。在一些实施方案中,如PCT申请号PCT/US2021/018030(公布号WO/2021/163619;其方法和组合物通过引用并入本文)中描述的机器学习模型用于本文描述的方法中。
可使用Mesoscale平台(MesoScale Diagnostics,Gaithersburg,Maryland,USA)以专有的、经过分析验证的多重格式测量8种保护性蛋白质生物标志物,所述平台采用电化学发光检测方法与图案化阵列相结合,以允许测定的多路复用。每个样品可与每个板上具有已知低、中等和高浓度的每种生物标志物的质量控制样品一起一式两份运行。可使用一组跨越测量范围的参考样品来评估测定精度。可采用Levey-Jennings图,并且可遵循Westguard规则来重新运行样品。进行生物标志物测定的实验室人员可能对所有临床信息不知情。
eGFR可使用CKD-EPI肌酐方程来确定,例如,如Levey等人(Ann Intern Med 150(9):604-61221(2009))中所述。线性混合模型可与非结构化方差-协方差矩阵一起使用,并且随机截距/斜率可用于每个个体来估计eGFR斜率,例如,如Leffondre等人(Nephrol DialTransplant 30(8):1237-1243(2015))中所述。主要复合结果(即肾功能进行性下降)可包括以下:RKFD定义为eGFR斜率下降5ml/min/1.73m2/年;相对于基线eGFR持续下降(至少3个月后确认)≥40%;或由至少30天后确认持续eGFR<15ml/min/1.73m2定义的“肾衰竭”;或接受长期维持性透析或接受肾移植(KDIGO,Kidney Int Suppl 3:1-163(2012);Levey等人AmJ Kidney Dis 64(6):821-835(2014))。此外,肾病学家(SC/GNN)可用于独立判定所有结果,检查每位个体患者的纵向病程,并解释eGFR变化(确保年化下降≥5ml/min或≥40%持续下降),相应的ICD/CPT代码和药物,以确保结果代表真正的下降,而不是依赖于环境的临时变化(例如,由于药物/住院)。失访后、复合肾脏终点的非斜率成分达到日期后或基线后5年,可对随访时间进行审查。
数据集可随机分为推导集(60%)和验证集(40%)。验证数据集可完全设盲并与总推导数据集隔离。仅使用推导集,可评价组合生物标志物和所有结构化EHR特征的监督随机森林算法,而无需先验特征选择,并且可鉴定候选特征集。然后可将推导集随机分为二次训练和测试集,以进行模型优化,具有70%-30%喷溅和AUC的10倍交叉验证。可考虑生物标志物的原始值和比率两者。缺失的uACR值可估算为10mg/g(Nelson等人JAMA(2019)),缺失的血压(BP)值可使用多个预测因子(年龄、性别、种族和抗高血压药物)进行估算(De Silva等人BMC Med Res Methodol 17(1):114(2017)),并且中值可用于缺失率<30%的其他特征。
可通过调整各个超参数来进行模型的进一步迭代。超参数是用于控制学习过程的参数(例如,RF树的数量),而不是在训练期间学习权重的参数(例如,变量的权重)。调整超参数是指在设置参数权重后对模型架构进行迭代,以达到理想的性能。可使用网格搜索方法来执行超参数优化。可针对基于K折交叉验证的AUC的所有可能的超参数组合进行评价。可选择优化模型构建的AUC的超参数的组合。可考虑以下超参数进行优化:随机选择作为节点分裂候选物的变量数量;终端节点中独特案例(数据点)的森林平均数量;树应生长的最大深度。
此外,超参数优化的代码可存放在github存储库(https://github.com/girish-nadkarni/KidneyIntelX_hyperparameter_tuning)中,以提高可重复性和透明度。最终模型可根据AUC性能来选择。
复合肾脏终点的风险概率可使用推导集中的最终模型生成,并按5的增量缩放以与5-100的连续评分对齐,并且该评分可应用于验证集。可在推导集中选择风险截止值,以将前15%视为高风险(评分90-100),将底部45%视为低风险(评分5-45),并且将中间的40%视为中等风险组(评分50-85)。主要性能标准可以是AUC、高风险组的阳性预测值和低风险组的阴性预测值(分别为PPV和NPV)(在预定的截断值处)。然后,选定的模型和相关的截止值可通过隔离验证群组中的独立生物统计学家(MK)进行验证。
除了这些传统的测试统计数据之外,还可通过检查KIDNEYINTELX评分的观察结果与预期结果图对比仅观察结果的斜率来评估校准。此外,可使用Cox比例风险方法构建Kaplan Meier曲线,以计算40%下降和肾衰竭的时间依赖性结果以及风险比。KIDNEYINTELX模型的辨别力可与最近验证的综合临床模型进行比较,所述模型包括年龄、性别、种族、eGFR、心血管疾病、吸烟、高血压、BMI、UACR、胰岛素、糖尿病药物和HbA1c,并且被开发来预测T2D中eGFR的40%eGFR下降(Nelson等人JAMA(2019))。效用指标(PPV、NPV)可与综合临床模型和KDIGO风险层两者进行比较。
最后,可计算与KDIGO风险层相比的事件和非事件的净再分类指数(NR I)(Pencina等人Stat Med 27(2):157-172(2008);Pencina等人Stat Med 30(1):11-21(2010))。所有先验显著性水平均可<0.05。所有假设检验都可以是双侧的。95%置信区间可通过自展(bootstrapping)计算。所有分析都可使用R软件(www.rproject.org)、dplyr包、随机森林SRC和CARET包来执行(Hadle y等人(2020)dplyr:A Grammar of DataManipulation.R包0.7.6版可从cra n.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html获取);Hemant Ishwaran UBK(2020)随机森林SRC:用于存活、回归和分类的快速统一随机森林(RF-SRC)。可从cran.rproject.org/web/packages/randomForestSRC/index获取)。
利用来自两个生物库的T2D患者的血浆样品和关联的EHR数据,可通过随机森林算法结合临床数据和血浆生物标志物来开发和验证风险评分,以预测复合肾脏结果、肾功能的进行性下降,包括RKFD、eGFR持续下降40%以及在5年内的肾衰竭。仅使用标准临床变量(包括KDIGO风险类别)即可证明KIDNEYINTELX优于模型(KDIGO,Kidney Int Suppl 3:1-163(2012))。与KDIGO风险类别相比,如通过AUC、NRI以及PPV的改善所测量,可在临床模型的区分中观察到显著改善。此外,KIDNEYINTELX可准确鉴定比KDIGO风险层多40%以上的经历事件的患者。最后,KIDNEYINTELX可为公认的FDA终点(即eGFR持续下降40%或肾衰竭)提供良好的风险分层,在这种临床和客观终点的高风险层与低风险层之间的风险存在15倍差异。
DKD是日益复杂且常见的问题,对现代医疗保健系统提出了挑战。在现实世界的实践中,预测DKD进展具有挑战性,特别是在肾功能保留的早期疾病中,并且因此实施改进的预后测试至关重要。综合风险评分具有近期临床意义,特别是与临床决策支持(CDS)和嵌入式护理途径相关时。目前的临床风险分层标准(KDIGO风险层)(KDIGO KDIGO,Kidney IntSuppl 3:1-163(2012))具有三个风险层,所述风险层与可纳入KIDNEYINTELX研究中的DKD患者群体重叠。通过合并KDIGO分类组分(eGFR和uACR)以及添加其他临床变量和三种基于血液的生物标志物,可创建具有三个风险层(低、中等和高)的风险评分。通过这种方式,可增强对DKD患者进行准确风险分层的能力,从而能够改善患者管理。
对低风险DKD患者的护理可由现有的PCP或糖尿病专家继续进行,并且需要较低强度的治疗,除非重复检测、临床状态的变化或有关转诊至专科护理的当地安排另有说明。对于具有高风险评分的那些患者,监督可包括更多转诊至肾病科(Smart等人The Cochranedatabase of systematic reviews(6):CD007333(2014);Smart和Titus,Am J Med 124(11):1073-1080e1072(2011))、增加监测间隔、提高肾脏健康意识、转诊至营养师、加强肾素血管紧张素醛固酮系统拮抗剂的使用以及增加开始使用最近批准的药物(包括SGLT2抑制剂和GLP-1受体激动剂)以减缓进展的动力(Kristensen等人Lancet DiabetesEndocrinol 7(10):776-785(2019);Sarafidis等人Nephrol Dial Transplant 34(2):208-230(2019))。这些新疗法的采用是滞后的,特别是在按照规范标准被认为是“低风险”的患者中,其中治疗成本和不良事件的存在是限制因素。如果更积极的治疗不能最终阻止DKD的进展,那么尽早与肾病学家接触也可能有更多的时间向患者提供关于家庭透析和优先购买的或早期肾移植作为以患者为中心的肾脏替代选项的建议和教育。在未来的RCT中,使用风险评分作为入组过程的一部分,可能会丰富试验参与者的事件发生可能性,从而减少2型错误的可能性,或者最大限度地减少检测治疗与对照之间的统计显著性差异所需的样本量。预防或减缓DKD进展并促进以患者为中心的肾脏替代方式的干预措施支持美国卫生与公众服务部推进美国肾脏健康倡议的目标(Mehrotra,Clin J Am Soc Nephrol 14(12):1788(2019))。
KIDNEYINTELX纳入了来自在多种环境下(包括DKD患者)检查的生物标志物的输入。可溶性TNFR1和2以及血浆KIM-1已证明对于肾功能下降和ESKD具有可靠的独立预后信号(Niewczas等人J Am Soc Nephrol 23(3):507-515(2012);Coca等人J Am Soc Nephrol28(9):2786-2793(2017);Nadkarni等人Kidney Int 93(6):1409-1416(2018);Tummalapalli等人Curr Opin Nephrol Hypertens 25(6):480-486(2016);Gohda等人J AmSoc Nephrol 23(3):516-524(2012);Krolewski等人Diabetes care 37(1):226-234(2014);Bhatraju等人J Am Soc Nephrol 29(11):2713-2721(2018))。在之前的一项研究中,发现将生物标志物纳入源自单中心的EHR的临床数据比单独临床模型具有更好的预测性能(Chauhan等人Kidney360(2020))。然而,所述研究纳入了少数患有普遍CKD的患者(在具有T2D的群组中大约1/3患有CKD,并且在APOL1高风险群组中大约1/4患有CKD)。然而,在上文描述的方法中,通过将生物标志物浓度和EHR数据合并到机器学习算法中,可提供DKD患者风险的多维表示,并且可生成对未来进展的改进的预后估计(Tangri等人JAMA 315(2):164-174(2016);Tangri等人JAMA 305(15):1553-1559(2011))。其他结合多种血浆生物标志物和有限临床数据特征的综合测试已被证明可准确预测患有T2D的个体中的CKD事件,尽管预测肾功能的进行性下降是持续的挑战(Peters等人J Clin Med 9(10)(2020);Peters et al.J Diabetes Complicat 33(12)(2019))。然而,KIDNEYINTELX测试的目的是确定哪些患有已确立的DKD的患者处于肾功能的进行性下降或肾衰竭的最高风险,以及哪些患有CKD的患者不太可能随时间推移进展。
因此,与来自大型学术医疗中心的T2 DKD患者的标准临床模型相比,结合血浆生物标志物和EHR数据的机器学习模型可显著改善对肾功能的进行性下降的预测。
可使用与当前方法一起使用的机器学习的预后风险评分测定,如例如美国专利申请号62/976,767、美国专利申请好62/976,761和美国专利申请号63/016,868中所描述,其各自通过引用整体并入本文。
IV.治疗或预防的方法
用于治疗或预防有需要的受试者的肾功能下降和/或ESRD(本文中也称为ESRD)的方法和组合物也是本公开的特征。在一个实施方案中,本公开提供了治疗患有肾功能下降和/或ESKD的受试者、疑似患有肾功能下降和/或ESKD的受试者或处于发展肾功能下降和/或ESKD的风险的受试者的方法。在其他实施方案中,患有与肾功能下降和/或ESKD相关的病症的受试者可使用本文所述的方法进行治疗,而无需通过本公开的预测方法进行鉴定。在某些实施方案中,本文公开的治疗方法改善此类受试者的肾功能(kidney function)(本文也称为“肾功能(renal function)”)。
在一些实施方案中,本文所述的治疗方法包括向受试者施用本公开的疗法。本公开的疗法可包含治疗有效量的蛋白质或核酸分子,所述蛋白质或核酸分子增加上文所述的一种或多种保护性蛋白质的表达和/或功能。例如,本公开的疗法可包含治疗有效量的一种或多种保护性蛋白质(例如,治疗有效量的重组SPARC、重组CCL5、重组APP、重组PF4、重组DNAJC19、重组ANGPT1、重组TNFSF12、重组FGF20和/或重组睾丸蛋白聚糖-2)。或者,本公开的疗法可包含治疗有效量的一种或多种保护性蛋白质的类似物(例如,治疗有效量的SPARC类似物、CCL5类似物、APP类似物、PF4类似物、DNAJC19类似物、ANGPT1类似物、TNFSF12类似物、FGF20类似物和/或睾丸蛋白聚糖-2类似物)。保护性蛋白质的类似物可以是突变型多肽(例如,突变型SPARC多肽、突变型CCL5多肽、突变型APP多肽、突变型PF4多肽、突变型DNAJC19多肽、突变型ANGPT1多肽、突变型TNFSF12多肽、突变型FGF20多肽和/或突变型睾丸蛋白聚糖-2多肽)。或者,保护性蛋白质的类似物可以是融合蛋白,如含有保护性蛋白质(例如,SPARC多肽、CCL5多肽、APP多肽、PF4多肽、DNAJC19多肽、ANGPT1多肽、TNFSF12多肽、FGF20多肽和/或睾丸蛋白聚糖-2多肽)以及增强体内稳定性、体内半衰期和/或摄取/施用的一个或多个多肽部分的嵌合蛋白。或者,保护性蛋白质的类似物可以是一种或多种保护性蛋白质的模拟物(例如,非肽模拟物)(例如,SPARC、CCL5、APP、PF4、DNAJC19、ANGPT1、TNFSF12、FGF20和/或睾丸蛋白聚糖-2的模拟物)。在其他情况下,保护性蛋白质的类似物可以是一种或多种保护性蛋白质的激动剂(例如,SPARC激动剂、CCL5激动剂、APP激动剂、PF4激动剂、DNAJC19激动剂、ANGPT1激动剂、TNFSF12激动剂、FGF20激动剂和/或睾丸蛋白聚糖-2激动剂)。用于本公开的激动剂可以是激动性抗体,如针对保护性蛋白质的受体的抗体(例如,激动性SPARC受体抗体、激动性CCL5受体抗体、激动性APP受体抗体、激动性PF4受体抗体、激动性DNAJC19受体抗体、激动性ANGPT1受体抗体、激动性TNFSF12受体抗体、激动性FGF20受体抗体和/或激动性睾丸蛋白聚糖-2受体抗体。在其他实施方案中,本公开的疗法可包含治疗有效量的编码一种或多种蛋白质的核酸分子(例如,编码SPARC、CCL5、APP、PF4、DNAJC19、ANGPT1、TNFSF12、FGF20和/或睾丸蛋白聚糖-2中的一者或多者的DNA或RNA分子)。
ANGPT1
在一些实施方案中,本文所述的治疗方法包括ANGPT1的治疗用途,如向受试者施用治疗有效量的增加ANGPT1的表达和/或功能的蛋白质或核酸分子。例如,本文所述的治疗方法可包括向受试者施用治疗有效量的重组ANGPT1(例如,人或小鼠来源的)、ANGPT1类似物(例如,突变型ANGPT1多肽或ANGPT1融合蛋白,如含有ANGPT1多肽和增强体内稳定性、体内半衰期和/或摄取/施用的一个或多个多肽部分的嵌合蛋白)、ANGPT1模拟物(例如,ANGPT1的非肽模拟物)、ANGPT1激动剂(例如,激动性ANGPT1受体抗体)和/或编码ANGPT1的核酸分子。
ANGPT1的这种治疗用途可包括如例如WO2018067991A1中所描述的治疗用途。WO2018067991A1描述了调节T细胞功能障碍的方法,所述方法用于治疗例如癌症和慢性感染的病症,所述方法通过使功能障碍性T细胞与促进血管生成素或血管生成素样蛋白质(例如ANGPT1)的表达、活性和/或功能的一种或多种调节剂接触而进行。
或者,ANGPT1的治疗用途可包括如例如US20090304680A1中所描述的治疗用途。US20090304680A1描述了用于治疗、预防或诊断个体的川崎病的药物组合物,所述组合物包含含有ANGPT1或其调节剂的分子。
TNFSF12
在一些实施方案中,本文所述的治疗方法包括TNFSF12或TWEAK的治疗用途,如向受试者施用治疗有效量的增加TNFSF12的表达和/或功能的蛋白质或核酸分子。例如,本文所述的治疗方法可包括向受试者施用治疗有效量的重组TNFSF12(例如,人或小鼠来源的)、TNFSF12类似物(例如,突变型TNFSF12多肽或TNFSF12融合蛋白,如含有TNFSF12多肽和增强体内稳定性、体内半衰期和/或摄取/施用的一个或多个多肽部分的嵌合蛋白)、TNFSF12模拟物(例如,TNFSF12的非肽模拟物)、TNFSF12激动剂(例如,激动性TNFSF12受体抗体)和/或编码TNFSF12的核酸分子。
TNFSF12的此类治疗用途可包括如例如WO2010088534A1中所描述的治疗用途。如WO2010088534A1中所述,TNFSF12能够扩增人和啮齿动物胰腺细胞群体并诱导胰腺中内分泌谱系定向祖细胞的出现。因此,TNFSF12受体(TNFSF12-R)的激动剂可用于体内和体外再生胰腺组织和扩增胰腺细胞群体的方法中。这些方法可用于治疗需要增强胰腺祖细胞以进行细胞替代疗法的疾病或疾患,包括例如糖尿病和导致全部或部分胰腺丧失的疾患。对于在此类方法中使用,TNFSF12-R激动剂可以是TNFSF12(例如,人或小鼠来源的TNFSF12(多肽))、TNFSF12类似物(例如,突变型TNFSF12多肽或TNFSF12融合蛋白,如含有TNFSF12多肽和增强体内稳定性、体内半衰期和/或摄取/施用的一个或多个多肽部分的嵌合蛋白)、TNFSF12模拟物(例如,TNFSF12的非肽模拟物)和激动性TNFSF12-R抗体。
或者,TNFSF12的治疗用途可包括如例如WO2001085193A2中所描述的治疗用途。WO2001085193A2描述了在用于增强血管生成活性以促进新血管形成的方法中使用协同有效量的TNFSF12激动剂和血管生成因子。此类TNFSF12激动剂包括可溶性重组TNFSF12蛋白以及WO98/05783、WO98/35061和WO99/19490中教导的TNFSF12激动剂。
FGF20
在一些实施方案中,本文所述的治疗方法包括FGF20的治疗用途,如向受试者施用治疗有效量的增加FGF20的表达和/或功能的蛋白质或核酸分子。例如,本文所述的治疗方法可包括向受试者施用治疗有效量的重组FGF20(例如,人或小鼠来源的)、FGF20类似物(例如,突变型FGF20多肽或FGF20融合蛋白,如含有FGF20多肽和增强体内稳定性、体内半衰期和/或摄取/施用的一个或多个多肽部分的嵌合蛋白)、FGF20模拟物(例如,FGF20的非肽模拟物)、FGF20激动剂(例如,激动性FGF20受体抗体)和/或编码FGF20的核酸分子。
FGF20的这种治疗用途可包括如例如WO2005019427A2中所描述的治疗用途。WO2005019427A2描述了通过施用治疗有效量的分离的FGF20多肽(例如,具有赋予FGF20多肽增加的稳定性的突变的FGF20多肽)来治疗高磷血症疾患的方法。WO2005019427A2中还描述了通过施用治疗有效量的增加FGF20多肽水平的试剂来治疗高磷血症疾患的方法。WO2005019427A2中还描述了通过向受试者施用治疗有效量的FGF20或增加FGF20多肽水平的试剂来治疗涉及受试者的动脉或软组织中钙和磷酸盐沉积的疾患的方法。
或者,FGF20的治疗用途可包括如例如WO2020160468A1中所描述的治疗用途。WO2020160468A1描述了通过向患者提供一种或多种剂来治疗被诊断为患有神经认知障碍(NCD)的患者的方法,所述剂共同增加选自包括FGF20的组的两种或更多种蛋白质的表达和/或活性。
SPARC
在一些实施方案中,本文所述的治疗方法包括SPARC的治疗用途,如向受试者施用治疗有效量的增加SPARC的表达和/或功能的蛋白质或核酸分子。例如,本文所述的治疗方法可包括向受试者施用治疗有效量的重组SPARC(例如,人或小鼠来源的)、SPARC类似物(例如,突变型SPARC多肽或SPARC融合蛋白,如含有SPARC多肽和增强体内稳定性、体内半衰期和/或摄取/施用的一个或多个多肽部分的嵌合蛋白)、SPARC模拟物(例如,SPARC的非肽模拟物)、SPARC激动剂(例如,激动性SPARC受体抗体)和/或编码SPARC的核酸分子。
SPARC的这种治疗用途可包括如例如WO2008128169A1中所描述的治疗用途。WO2008128169A1描述了在不存在或存在血管生成抑制剂的情况下用于治疗哺乳动物肿瘤的组合物,所述组合物包含治疗有效量的SPARC多肽和治疗有效量的疏水性化学治疗剂(例如微管抑制剂,如紫杉烷)。WO2008128169A1的组合物中使用的SPARC多肽是外源野生型SPARC或外源突变体SPARC(具有对应于成熟形式的人SPARC蛋白中第三个谷氨酰胺缺失的突变)。
SPARC的治疗用途还可包括如例如WO2013170365A1中所描述的治疗用途。WO2013170365A1公开了通过施用SPARC多肽和GRP78来进行癌细胞致敏的方法。WO2013170365A1的方法中使用的SPARC多肽是指本领域已知的全长303个氨基酸的SPARC蛋白序列及其保留化学敏化活性的任何片段或变体,包括Rahman等人(PLOS ONE 10.1371/journal.pone.0026390 2011年11月1日公布)所描述的许多SPARC多肽以及在WO/2008/000079中测试的SPARC片段。
或者,SPARC的治疗用途可包括如例如Chlenski等人(Mol Cancer 9:138(2010))中所描述的治疗用途。Chlenski等人描述了对应于蛋白质(FS-E)的卵泡抑素结构域的SPARC肽,特别是对应于FS-E的C末端环的肽FSEC,在神经母细胞瘤中具有有效的抗血管生成和抗肿瘤生成作用。
CCL5
在一些实施方案中,本文所述的治疗方法包括CCL5的治疗用途,如向受试者施用治疗有效量的增加CCL5的表达和/或功能的蛋白质或核酸分子。例如,本文所述的治疗方法可包括向受试者施用治疗有效量的重组CCL5(例如,人或小鼠来源的)、CCL5类似物(例如,突变型CCL5多肽或CCL5融合蛋白,如含有CCL5多肽和增强体内稳定性、体内半衰期和/或摄取/施用的一个或多个多肽部分的嵌合蛋白)、CCL5模拟物(例如,CCL5的非肽模拟物)、CCL5激动剂(例如,激动性CCL5受体抗体)和/或编码CCL5的核酸分子。
CCL5的这种治疗用途可包括如例如Bhat等人(Front Immunol,11:1849(2020))和/或Xie等人(PNAS118(9)e2017282118(2021))中所描述的治疗用途。Bhat等人描述了沙粒病毒淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)治疗后的强烈CCL5产生。Xie等人显示睫状神经营养因子(CNTF)基因治疗后趋化因子CCL5的广泛表达。
或者,CCL5的治疗用途可包括如例如WO2020068261A1中所描述的治疗用途。WO2020068261A1描述了包含可操作地连接至免疫调节结构域的胶原蛋白结合结构域的免疫调节融合蛋白,其中所述免疫调节结构域包含一种或多种趋化因子如CCL5,以及使用其例如来治疗癌症的方法。
在其他实例中,CCL5的治疗用途可包括如例如WO2020146857A1中所描述的治疗用途。WO2020146857A1描述了蛋白酶释放的趋化因子蛋白(PAR K),其包含前趋化因子部分,所述前趋化因子部分包含与趋化因子部分融合的前肽部分,其中所述趋化因子部分包含N末端和C末端,并且其中所述趋化因子部分包含与CCL5具有至少90%相似性的趋化因子氨基酸序列;和与前趋化因子部分连接的靶向部分,其中所述靶向部分对肿瘤、纤维化或阿尔茨海默病相关抗原或受体具有结合特异性。
APP
在一些实施方案中,本文所述的治疗方法包括APP的治疗用途,如向受试者施用治疗有效量的增加APP的表达和/或功能的蛋白质或核酸分子。例如,本文所述的治疗方法可包括向受试者施用治疗有效量的重组APP(例如,人或小鼠来源的)、APP类似物(例如,突变型APP多肽或APP融合蛋白,如含有APP多肽和增强体内稳定性、体内半衰期和/或摄取/施用的一个或多个多肽部分的嵌合蛋白)、APP模拟物(例如,APP的非肽模拟物)、APP激动剂(例如,激动性APP受体抗体)和/或编码APP的核酸分子。
APP的这种治疗用途可包括如例如WO2020201471A1中所描述的治疗用途。WO2020201471A1描述了用于治疗或预防肝病的化合物,其中所述化合物是淀粉样β相关蛋白,所述淀粉样β相关蛋白选自由淀粉样β蛋白、源自其的淀粉样β肽、淀粉样前体蛋白(APP)组成的组;参与从APP产生淀粉样β肽的化合物或抑制淀粉样β蛋白或源自其的淀粉样肽的降解的化合物。淀粉样前体蛋白或“APP”是指在许多组织中表达并集中在神经元突触中的整合膜蛋白。APP被称为前体分子,其蛋白水解产生β淀粉样蛋白(Ab)。特别地,衍生自淀粉样β蛋白的淀粉样β肽选自由淀粉样β40、淀粉样β42和淀粉样β38组成的组。此外,参与从APP产生淀粉样β肽的化合物可以是选自α-、β-(BACE1)、γ-分泌酶的酶,优选早老蛋白。
可替代地,APP的治疗用途可包括如例如WO2020160468A1中所描述的治疗用途。WO2020160468A1描述了用于治疗患有神经认知障碍或处于发展神经认知障碍风险的患者的组合物和方法,所述神经认知障碍诸如阿尔茨海默病、帕金森病和/或额颞叶痴呆,所述方法通过向患者提供一种或多种共同增加选自包括APP的组的两种或更多种蛋白质的表达和/或活性的剂。APP和淀粉样-βA4蛋白包括APP基因或蛋白质的野生型形式,以及野生型APP蛋白和编码其的核酸的变体(例如剪接变体、截短、串联体和融合构建体等)相同。
PF4
在一些实施方案中,本文所述的治疗方法包括PF4的治疗用途,诸如向受试者施用治疗有效量的增加PF4的表达和/或功能的蛋白质或核酸分子。例如,本文所述的治疗方法可包括向受试者施用治疗有效量的重组PF4(例如,人或小鼠来源的)、PF4类似物(例如,突变型PF4多肽或PF4融合蛋白,如含有PF4多肽和增强体内稳定性、体内半衰期和/或摄取/施用的一个或多个多肽部分的嵌合蛋白)、PF4模拟物(例如,PF4的非肽模拟物)、PF4激动剂(例如,激动性PF4受体抗体)和/或编码PF4的核酸分子。
PF4的这种治疗用途可包括如例如WO2009117710A2中所描述的治疗用途。WO2009117710A2描述了通过向受试者施用活性剂来治疗MIF介导的病症的方法,所述活性剂抑制(i)MIF与CXCR2和CXCR4的结合和/或(ii)CXCR2和CXCR4的MIF激活;(iii)MIF形成同源多聚体的能力;或其组合,其中所述活性剂可以是重组PF4。
或者,PF4的治疗用途可包括如例如WO1994013321A1中所描述的治疗用途。WO1994013321A1描述了通过施用抑制骨髓细胞的趋化因子的协同组合来抑制骨髓细胞的方法,其中所述协同组合包括至少一种选自由PF4组成的组的趋化因子。WO1994013321A1的方法和组合物中使用的PF4是天然人PF4。
DNAJC19
在一些实施方案中,本文所述的治疗方法包括DNAJC19的治疗用途,诸如向受试者施用治疗有效量的增加DNAJC19的表达和/或功能的蛋白质或核酸分子。例如,本文所述的治疗方法可包括向受试者施用治疗有效量的重组DNAJC19(例如,人或小鼠来源的)、DNAJC19类似物(例如,突变型DNAJC19多肽或DNAJC19融合蛋白,诸如含有DNAJC19多肽和增强体内稳定性、体内半衰期和/或摄取/施用的一个或多个多肽部分的嵌合蛋白)、DNAJC19模拟物(例如,DNAJC19的非肽模拟物)、DNAJC19激动剂(例如,激动性DNAJC19受体抗体)和/或编码DNAJC19的核酸分子。
DNAJC19的这种治疗用途可包括如例如WO2016170348A2中所描述的治疗用途。WO2016170348A2描述了用于调节靶基因表达以达到治疗目的的小激活RNA,其中靶基因可以是DNAJC19。
或者,DNAJC19的治疗用途可包括如例如WO2017191274A2中所描述的治疗用途。WO2017191274A2描述了包含编码序列的RNA,其可用于制备用作在疾病、病症或疾患(例如代谢或内分泌病症、癌症、感染性疾病或免疫缺陷)的基因疗法中使用的药物的组合物,其中所编码的肽或蛋白质包含选自包括但不限于DNAJC19的组的治疗性蛋白质或其片段或其变体。
睾丸蛋白聚糖-2
在一些实施方案中,本文所述的治疗方法包括睾丸蛋白聚糖-2的治疗用途,如向受试者施用治疗有效量的增加睾丸蛋白聚糖-2的表达和/或功能的蛋白质或核酸分子。例如,本文所述的治疗方法可包括向受试者施用治疗有效量的重组睾丸蛋白聚糖-2、睾丸蛋白聚糖-2类似物(例如,突变型睾丸蛋白聚糖-2多肽或睾丸蛋白聚糖-2融合蛋白,如含有睾丸蛋白聚糖-2多肽和增强体内稳定性、体内半衰期和/或摄取/施用的一个或多个多肽部分的嵌合蛋白)、睾丸蛋白聚糖-2模拟物(例如,睾丸蛋白聚糖-2的非肽模拟物)、睾丸蛋白聚糖-2激动剂(例如,激动性睾丸蛋白聚糖-2受体抗体)和/或编码睾丸蛋白聚糖-2的核酸分子。
在某些实施方案中,本文公开的方法和组合物用于鉴定处于发展进行性肾功能下降的风险的人类受试者(受试者可能已经患有肾功能下降,在这种情况下,关于甚至进一步进展来评估风险),其中向被鉴定为处于风险的人受试者施用改善肾功能(即减缓肾病进展)的疗法。疗法的实例包括但不限于减肥、控制高血压的剂和/或控制高胆固醇水平的剂。此类剂可用于治疗可能导致进行性肾病及其可能导致的并发症(例如高血压)的问题。在某些实施方案中,本文公开的方法还包括向受试者施用另外的剂,例如抗纤维化剂。示例性剂包括但不限于血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素II受体1型阻断剂(ARB)、肾素抑制剂(阿利吉仑(aliskiren)、依那吉仑(enalkiren)、扎吉仑(zalkiren))、盐皮质激素受体阻断剂(螺内酯、依普利酮)、血管肽酶抑制剂(例如AVE7688、奥马屈拉(omapatrilat)。在某些实施方案中,施用他汀,例如阿托伐他汀或辛伐他汀,以降低人受试者的胆固醇水平。
此外,可用于本文所述的治疗方法的核酸分子(例如,DNA和/或mRNA核酸分子)可以是合成的。术语“合成的”是指核酸分子经分离并且在序列(整个序列)和/或化学结构上与天然存在的核酸分子(如内源性前体mRNA分子)不同。虽然在一些实施方案中,本发明的核酸不具有与天然存在的核酸的序列相同的完整序列,但此类分子可涵盖天然存在的序列的全部或部分。然而,预期施用至细胞的合成核酸随后可在细胞中经修饰或改变,使得其结构或序列与非合成或天然存在的核酸(如成熟mRNA序列)相同。例如,合成核酸可具有与前体mRNA的序列不同的序列,但是所述序列一旦进入细胞就可改变为与内源性的加工的mRNA相同。术语“分离的”意指本公开的核酸分子最初与不同的(在序列或结构方面)和不想要的核酸分子分离,使得分离的核酸群体至少约90%同质,并且可相对于其他多核苷酸分子至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同质。在本公开的许多实施方案中,核酸是通过其与细胞中的内源性核酸分开体外合成而分离的。然而,应当理解,分离的核酸可随后混合或汇集在一起。
可通过本领域普通技术人员已知的任何技术,例如化学合成、酶法生产或生物性生产来制备核酸。
核酸合成根据标准方法进行。参见例如,Itakura和Riggs(1980)。此外,美国专利号4,704,362、美国专利号5,221,619和美国专利号5,583,013各自描述了制备合成核酸的各种方法。合成核酸(例如,合成寡核苷酸)的非限制性实例包括使用磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学和固相技术通过体外化学合成制备的核酸,如以引用的方式并入本文的EP266,032中所述;或者通过脱氧核苷H-膦酸酯中间体制备的核酸,如Froehler等人,1986和美国专利号5,705,629所述,其各自以引用的方式并入本文。在本发明的方法中,可使用一种或多种寡核苷酸。寡核苷酸合成的各种不同机制已经公开于例如美国专利号4,659,774、4,816,571、5,141,813、5,264,566、4,959,463、5,428,148、5,554,744、5,574,146、5,602,244中,其各自以引用的方式并入本文。
酶促产生的核酸的非限制性实例包括在扩增反应如PCR中由酶产生的核酸(参见例如,美国专利号4,683,202和美国专利号4,682,195,各自通过引用并入本文),或描述于通过引用并入本文的美国专利号5,645,897中的寡核苷酸的合成。
寡核苷酸合成是本领域的技术人员众所周知的。寡核苷酸合成的各种不同机制已公开于例如美国专利号4,659,774、4,816,571、5,141,813、5,264,566、4,959,463、5,428,148、5,554,744、5,574,146、5,602,244中,其各自通过引用并入本文。
用于在细胞中产生核酸的重组方法是本领域技术人员众所周知的。这些包括使用载体、质粒、粘粒和其他媒介物来将核酸递送至细胞,所述细胞可以是靶细胞或仅仅是宿主细胞(以产生大量的所需RNA分子)。或者,只要存在用于生成RNA分子的试剂,此类媒介物就可在无细胞系统的背景下使用。此类方法包括Sambrook,2003、Sambrook,2001和Sambrook,1989中描述的那些,其在此通过引用并入。
在某些实施方案中,本公开的核酸分子不是合成的。在一些实施方案中,核酸分子具有天然存在的核酸的化学结构和天然存在的核酸的序列。除了使用重组技术之外,此类非合成核酸还可以化学方式产生,如通过采用用于产生寡核苷酸的技术。
根据本公开的治疗剂(例如,保护性蛋白质)的施用或递送可经由任何途径,只要靶组织可经由所述途径获得即可。例如,施用可通过皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射,或通过直接注射至靶组织(例如,心脏组织)中。包含多肽或多核苷酸或包含多肽或多核苷酸序列的表达构建体的药物组合物还可通过导管系统或隔离冠状循环以将治疗剂递送至心脏的系统施用。用于将治疗剂递送至心脏和冠状脉管系统的各种导管系统是本领域已知的。适用于本发明的基于导管的递送方法或冠状动脉隔离方法的一些非限制性实例公开于美国专利号6,416,510;美国专利号6,716,196;美国专利号6,953,466、WO 2005/082440、WO 2006/089340、美国专利公布号2007/0203445、美国专利公布号2006/0148742和美国专利公布号2007/0060907中,其全部通过引用整体并入本文中。
治疗剂(例如,保护性蛋白质)还可肠胃外或腹膜内施用。作为说明,可在与表面活性剂如羟丙基纤维素适当混合的水中制备呈游离碱或药理学上可接受的盐形式的缀合物的溶液。分散液也可在甘油液体聚乙二醇和其混合物以及油中制备。在普通的储存和使用条件下,这些制剂通常含有防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射用途或导管递送的治疗剂(例如,保护性蛋白质)包括例如无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。一般来说,这些制剂是无菌的并且在存在容易注射性的程度上是流动的。制剂应该在制造和储存条件下稳定且必须被保藏以防诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。适当的溶剂或分散介质可含有例如水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物以及植物油。例如,通过使用例如卵磷脂的包衣,在分散体的情况下通过保持所需的颗粒大小,和通过使用表面活性剂,可保持适当的流动性。可通过多种抗细菌剂、抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等)来预防微生物的作用。在许多情况下,将优选包括等渗剂,例如糖或氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂,例如单硬脂酸铝和明胶来达成。
本公开通过以下实施例进一步说明,所述实施例不应理解为限制。
实施例
本文描述了鉴定可用于诊断、预后和鉴定患有或疑似患有或可能发展进行性肾功能下降和/或ESKD的受试者的生物标志物的研究。以下实施例仅出于说明的目的包括并且不旨在是限制性的。
在过去的几十年里,大量的研究工作致力于了解患有1型糖尿病(T1D)以及2型糖尿病(T2D)的人的糖尿病性肾病(DKD)的机制。在所述研究中,主要关注的是与发展DKD的各种表现的高风险相关的因素和标志物(Parving等人,Diabetic Nephropathy.于:BrennerBM,编辑Brenner and Rector's The Kidney.第7版Philadelphia.(Elsevier,2004);JAMA290:2159-2167(2003);Lancet 352:837-853(1998);Nowak等人,Kidney International93:1198-1206(2018);Niewczas等人,Nat Med 25:805-813(2019);Ahluwalia等人,Editorial:Novel Biomarkers for Type 2Diabetes.Front Endocrinol(Lausanne)10:649(2019))中。最近的注意力集中于寻找与预防DKD相关的因素和生物标志物。据推测,尽管糖尿病病程较长但仍未出现晚期并发症的受试者,即所谓的糖尿病病程较长的幸存者,可富含此类保护性因子/生物标志物。这种方法已经提供了一些发现,所述发现不仅导致了关于DKD的新假说的发展,而且鉴定丙酮酸激酶M2(PKM2)作为预防DKD的新治疗靶靶标(Qi等人,Nat Med 23:753-762(2017))。
材料和方法
本文所述研究的受试者选自Joslin肾脏研究(JKS)的参与者。Joslin糖尿病中心人类研究委员会(Joslin Diabetes Center Committee on Human Studies)批准了JKS的知情同意书、招募和检查方案,这是一项纵向观察性研究,旨在调查两种类型糖尿病的肾功能下降的决定因素和自然史。
Joslin肾脏研究(JKS)
简言之,JKS包括两个组成部分:1型糖尿病(T1D)和2型糖尿病(T2D)。T1D组成部分的受试者是从1991年与2009年之间就诊于Joslin Clinic的3,500名18-64岁患有T1D的成人中连续招募的。根据入组前2年期间获得的ACR中位值(基线检查),将受试者分为三个亚组:患有大量白蛋白尿(ACR≥300μg/mg)的那些、患有微量白蛋白尿(30≤ACR<300μg/mg)的那些和患有正常白蛋白尿(ACR<30μg/mg)的那些。目的是将所有具有大量和微量白蛋白尿的患者以及类似数量的正常白蛋白尿的受试者招募至JKS中。总共招募了1884名受试者:526名具有大量白蛋白尿,563名具有微量白蛋白尿,并且795名具有正常白蛋白尿。
T2D群组中的受试者是从2003年与2009年之间就诊于Joslin Clinic的4500名35-64岁患有T2D的成人中连续招募的。根据入组前2年期间获得的ACR中位值(基线检查),将受试者分为如上文针对T1D所述的三个亚组中。目的是将所有具有大量和微量白蛋白尿的患者以及类似数量的正常白蛋白尿的受试者招募至JKS中。总共招募了1,476名受试者:261名具有大量白蛋白尿,482名具有微量白蛋白尿,并且733名具有正常白蛋白尿。
所有参加JKS的受试者每年两次进行检查,或者在常规诊所就诊期间进行检查,或者被邀请进行特别检查,或者在家里进行检查。进行这些检查一直持续到他们发展终末期肾病(ESKD)、死亡、失访或直至2015年随访结束。检查时获得的生物样本储存在-85℃。血清肌酐用于确定基线肾功能及其在随访期间的变化。使用Skupien等人(Kidneyinternational 82:589-597(2012))描述的方案随时间推移校准血清肌酐测量值。肾小球滤过率(GFR)的估值是使用慢性肾病流行病学协作公式获得的,如Levey等人(Ann InternMed 150:604-612(2009))所描述。
为了对随访期间肾功能变化的轨迹模式进行分类,第一步是确定它们是线性还是非线性的。尽管大多数估计的肾小球滤过率(eGFR)轨迹在检查时看起来是线性的,但通过将线性模型和样条模型拟合至每位患者的肾功能轨迹,这种印象得到了统计验证。施加由Jones和Molitoris(Anal Biochem 141:287-290(1984))描述并由Shah和Levey(J Am SocNephrol 2:1186-1191(1992))使用的方法以检查随访期间个体的连续肾功能变化。研究中的参与者在7-15年的随访中进行了5次或更多次eGFR测定。所述方法将每个参与者的肾功能轨迹表示为简单的线性模型和具有在单独确定的点处连接的线性区段的样条模型。比较了线性模型和样条模型,并且线性模型在0.05的标称显著性和通过样条区段数目(n-1)确定的自由度下被拒绝。大多数具有线性斜率。为了确定eGFR下降的斜率,提取每个个体轨迹的线性分量,以生成随访期间整体eGFR变化的斜率分布。这种方法的详细信息如下所述,并且在Skupien等人(Kidney international 82:589-597(2012))中也有描述。
JKS中包括的所有受试者每两年根据美国肾脏数据系统(USRDS)和国家死亡指数(NDI)名册进行查询,以确定发展ESKD或死亡的患者。最后一次查询是在2015年进行的。USRDS维护接受肾脏替代疗法的美国患者名册,其包括透析和移植的日期。
探索性群组、复制群组和验证群组
目前的研究包括三个JKS群组;214名T1D受试者的探索性群组和144名T2D受试者的复制群组,他们之前参与了我们的研究,以确定血清TNF-R1浓度的切点值,以用于预测T1D和T2D中ESKD的发展(Yamanouchi等人,Kidney International 92:258-266(2017))。与之前的研究包括患有慢性肾病(CKD)3期和4期的受试者相比,本研究包括在JKS中在基线检查时患有CKD 3期的受试者。验证群组由294名在基线时患有CKD 1期和2期的T1D受试者组成,并且用于检查在患有早期DKD的受试者的晚期糖尿病性肾病(DKD)群组中观察到的三种示例性保护性蛋白质的重要性。主要目标是不仅在肾功能受损的T1D患者中,而且在处于任何DKD阶段的任何糖尿病患者中,寻找针对进行性肾功能下降和进展至ESKD的保护性蛋白质。因此,为了证明研究结果的稳健性,选择了具有不同基线特征的三个非常不同的群组;T1D探索群组(患有晚期DKD的T1D患者)、T2D复制群组(患有晚期DKD的T2D患者)和T1D验证群组(患有早期DKD的T1D患者)。
患有T1D和T2D的受试者具有大量白蛋白尿(ACR≥300μg/mg)和微量白蛋白尿(ACR≥30μg/mg)。对这些受试者进行7-15年的随访,以确定eGFR下降的速率(eGFR斜率)并确定ESKD的发作。来自这些受试者的所有临床数据和血浆样本均可用于当前研究。例如,Niewczas等人(Nat Med 25:805-813(2019))和Yamanouchi等人(Kidney International92:258-266(2017))中描述了这些群组的详述、临床特征的测量、通过血清肌酐的系列测量确定eGFR斜率以及ESKD发作的确定。在所有3个群组中,选择eGFR损失<3.0ml/min/年作为阈值来定义具有缓慢(非进展者)或快速(进展者)进行性肾功能下降的那些。这种阈值的基本原理在之前的出版物中有详细记录和使用(Perkins等人,J Am Soc Nephrol 18:1353-1361(2007);Krolewski等人,Diabetes Care 37:226-234(2014))并且对应于一般群体中每年肾功能损失的分布的第2.5个百分位数(Lindeman等人,J Am Geriatr Soc 33:278-285(1985))。
T1D受试者的健康非糖尿病父母
在Joslin肾脏研究期间,还对患有T1D的患者的在世父母进行了检查。T1D受试者的非糖尿病父母组源自对T1D中DKD的决定因素的遗传学研究。父母根据与JKS所有参与者相同的方案进行基线检查。检查时获得的生物样本储存在-85℃。出于本研究的目的,选择了79名基线检查时年龄为50-69岁的非糖尿病白人父母作为非糖尿病对照。40名父母的孩子尽管患有长期糖尿病,但仍没有出现肾脏并发症,并且39名父母的孩子患有晚期DKD(肾功能受损或ESKD)。非糖尿病父母的T1D后代的临床表型是正常白蛋白尿(n=40),或是ESKD或蛋白尿(n=39)。对基线检查时获得的血浆样本进行SOMAscan分析。
SOMAscan蛋白质组学分析
SOMAscan蛋白质组学平台使用单链DNA适体,其测量仅50μl血浆、血清或同等少量的各种其他生物基质中的1129种蛋白质浓度。表1中提供了蛋白质的完整列表。SOMAscan平台由新一代慢解离速率修饰的适体(SOMAMER)试剂推动,所述试剂受益于过去20年开发的适体技术(Tuerk等人,Science 249:505-510(1990);Ellington等人,Nature 346:818-822(1990))。SOMAmer试剂针对呈其天然折叠构象的蛋白质进行选择,并与折叠蛋白质结合,并且由此结合三维形状表位而不是线性肽序列。SOMAscan平台提供了显著动态范围,并且这种大动态范围是由每种SOMAMER试剂的检测范围与目标样品的三个系列稀释相结合而产生的。稀释度分为三个池:40%(检测最不丰富蛋白质的最高浓缩样品-100%样品中的fM至pM)、1%(中间范围)和0.005%(检测最丰富蛋白质的最低浓缩样品设计–100%样品中约μM)。测定读数以相对荧光单位(RFU)报告,并与原始样品中的靶蛋白量成正比。SOMAscan蛋白质组学平台的详细信息在其他地方描述(Gold等人,PLoS One 5:e15004(2010);Hathout等人,Proc Natl Acad Sci U S A 112:7153-7158(2015))。
使用设在SomaLogic实验室(Boulder,CO)的SOMAscan平台进行蛋白质组学谱分析。按照制造商推荐的方案使用带有一组校准和归一化样品的人类血浆SOMAscan 1.1k试剂盒。根据SOMAscan平台数据质量控制方案进行数据标准化。为了标准化SOMAscan测定结果,首先对原始SOMAscan测定数据进行归一化,以消除运行中的杂交变异(杂交归一化),然后对所有样品进行中值信号归一化,以消除运行中的其他测定偏差,并且最后进行校准以消除运行之间的测定差异。杂交和中值信号归一化比例因子的接受标准预期在0.4-2.5的范围内。校准比例因子的中值预计在1.0±0.2的范围内,并且整个阵列中至少95%的单独SOMAmer试剂必须在中值的±0.4范围内。所有样品的SOMAscan数据均通过了质量控制标准,并且适合用于分析。
通过LC-MS/MS对SOMAmer特异性的技术验证
为了系统地评估SOMAscan平台特异性,开发了使用SOMAmer的方案以用于完整蛋白质的亲和力下拉,然后消化为肽并通过非靶向质谱进行分析。将FGF20 SOMAmer试剂解冻,涡旋并离心2分钟(min),在PCR机中加热至100℃5分钟,然后在25℃水浴中缓慢冷却。将FGF20 SOMAmer稀释至50mM AB缓冲液(40mM HEPES、100mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2、0.05% Tween-20,pH 7.5),然后在水浴中冷却至25℃持续20分钟。将链霉亲和素琼脂糖珠从50mM稀释至7.5%,然后以1000xg旋转2分钟。用AB缓冲液洗涤7.5%链霉亲和素琼脂糖珠,涡旋并以1000xg离心2分钟。将液体真空抽出并再次重复洗涤,总共两次。将SOMAmer添加至珠中并在25℃下振荡孵育20分钟。将管以1000xg旋转2分钟,并通过真空除去液体。将珠用0-W缓冲液洗涤两次,然后用AB缓冲液洗涤两次。将AB缓冲液、血浆和血清样品以及重组蛋白连同30μl的SOMAmer结合珠添加至适当的管中。将这些管在室温下振荡1.5小时。孵育完成后,将管旋转1分钟并除去液体。将样品用1-B阻断剂洗涤一次,以800rpm振荡5分钟,并且除去液体。将样品用AB缓冲液洗涤6次,然后在-80℃下冷冻。在-20℃下向每个管中添加四倍样品体积的丙酮。将管快速涡旋并在-20℃下孵育1小时。将管以13,000xg离心10分钟,并真空抽出上清液。
将等体积的0.5M碳酸铵(pH 10.5)添加至每组经洗涤的珠中。然后将另一份等体积的还原/烷基化混合物添加至每个样品中,所述混合物由97.5%乙腈中的2%(v/v)碘乙醇和0.5%(v/v)三乙基膦组成。将溶液加盖并在37℃下孵育1小时,然后快速抽真空至干燥。然后将所得团粒重新溶解在胰蛋白酶溶液中(Pierce胰蛋白酶MS级,在100mM Tris-HCl,pH 8.0中)。消化在37℃下进行过夜,然后使用μC18 ZipTips(Millipore)对溶液进行脱盐。使用Thermo EASY-nLC HPLC系统,使用Thermo Q-Exactive质谱仪对经消化的样品进行分析。使用75μm x 15cm Thermo EASY-Spray C18柱进行分离。MS数据以数据相关采集模式收集,其中进行全高分辨率MS扫描,然后对前10个最强母离子(质量范围为350-2000m/z)进行MS/MS扫描。
表1.SOMAscan平台上测量的所有蛋白质(n=1,129)的完整列表。
统计学分析
所有统计学分析均使用SSAS for Windows,9.4版(SAS Institute,Cary,NC)进行。所有数据均以平均值和标准偏差、中值(第25个和第75个百分位数)或计数(比例)度量(如果适用)的形式呈现。使用斯皮尔曼秩相关(rs)评估循环血浆浓度与eGFR斜率、TNF-R1和临床协变量之间的相关性。使用层次聚类分析(Ward方法)鉴定保护性蛋白质簇。将基线蛋白质RFU浓度(n=1,129)进行自然对数转换,然后在关联测试之前将其分类为其分布的四分位数。自然对数转换后,组合的发现和复制群组以及验证群组中排名前3的保护性蛋白质的分布显示于图1A-1B中。使用单变量和多变量逻辑回归模型来测试基线时测量的相关循环血浆蛋白与结果量度的关联(如果eGFR损失≥3.0ml/min/年或进展至ESKD,则为进展者),并表示为每相关蛋白质的循环血浆浓度增加一个四分位数的优势比与相应的95%置信区间。使用SAS软件中的PROC LIFETEST分析根据保护指数(三种示例性保护性蛋白质的组合效应)的ESKD累积发生率。使用采用邓恩多重比较检验的单因素ANOVA检查非糖尿病患者、非进展者和进展者的血浆蛋白浓度之间的比较。显著性被定义为*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,和****P<0.0001。
实施例1.Joslin肾脏研究探索性和复制群组的特征
本文公开的研究包括参与正在进行的Joslin肾脏研究的受试者。汇集了两个独立的患有糖尿病和肾功能受损(CKD 3期)的受试者群组;214名患有T1D的受试者的探索性Joslin群组和144名患有T2D的受试者的复制Joslin群组。对这些群组随访7-15年,以确定eGFR斜率并确定ESKD的发作时间。这些群组的临床特征显示在表2中。Joslin T1D群组中的所有研究参与者和T2D群组中92%的研究参与者都是白种人。在基线时,与患有T1D的受试者相比,患有T2D的那些受试者年龄较大、糖尿病病程较短、体重指数(BMI)较高、血红蛋白A1c(HbA1c)较低并且尿白蛋白与肌酐比(ACR)较低,但eGFR类似地受损。
在7-15年的随访期间,两个群组中的大多数受试者均具有进行性肾功能下降。然而,受试者之间的eGFR斜率差异很大,其中患有T1D的受试者中的斜率比患有T2D的受试者中稍陡一些。图2描述在患有T1D和T2D的Joslin群组中的eGFR斜率的分布。定义为eGFR损失<3.0ml/min/年的缓慢下降者(称为非进展者)的数量在T1D探索性群组和T2D复制群组中分别为71(33%)和69(48%)(表2)。这些非进展者(本研究的重点)的eGFR斜率非常浅,在T1D和T2D群组中中值(第25个、第75个百分位数)分别为-1.6ml/min/年(-2.3,-1.0)和-0.9ml/min/年(-2.0,0.4)。在7-15年的随访期间,这些受试者均未进展至ESKD。相比之下,很大一部分(组合群组的61%)的定义为eGFR损失≥3.0ml/min/年的快速下降者(称为进展者)在随访10年内进展至ESKD,如表2所示。
表2.患有T1D和T2D的Joslin肾脏研究群组的人口统计学和临床特征。
T1D,1型糖尿病;T2D,2型糖尿病;DM,糖尿病;BMI,身体质量指数;BP,血压;Rx,治疗;肾脏保护,血管紧张素转换酶抑制剂(ACE-I)或血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)处方;HbA1c,血红蛋白A1c;ACR,白蛋白与肌酐比;eGFR,估计肾小球滤过率;ESKD,终末期肾病。
a非进展者被定义为eGFR损失<3.0ml/min/1.73m2/年,并且进展者被定义为eGFR损失≥3.0ml/min/1.73m2/年。
数据以中值(第25个、第75个百分位数)或计数(比例)度量形式呈现。
使用连续变量的Wilcoxon秩和检验和分类变量的χ2检验来测试两个群组之间的差异。
实施例2.对防止进行性肾功能下降的血浆蛋白进行谱分析
SOMAscan蛋白质组平台用于测量1129种血浆蛋白,如上表1所示。检查这些血浆蛋白在基线时在非进展者中的升高浓度。本研究的示意性表示概述于图3中。在Joslin探索性T1D群组中,73种蛋白质的基线血浆浓度与eGFR斜率呈显著正相关,错误发现率(FDR)调整的P<0.005(表3),因此,这些蛋白质的基线浓度升高与随访期间缓慢或最小的肾功能下降相关。这些蛋白质可被认为是针对进行性肾功能下降的候选保护因子/生物标志物。与eGFR斜率负相关的蛋白质可被认为是增加进行性肾功能下降和进展至ESKD的风险的候选因素/生物标志物。相反,另一项研究使用相同的SOMAscan蛋白质组学平台公开了这两个Joslin群组中的194种炎症循环蛋白与进展至ESKD的风险的关联(Niewczas等人,Nat Med 25:805-813(2019))。
在患有T2D的受试者的复制群组中进一步分析了与患有T1D的受试者中的eGFR斜率正相关的73种血浆蛋白。发现18种蛋白质在标称P<0.05下与eGFR斜率呈正相关(表3)。正如本文所论述的,肾组织和血浆中PKM2浓度升高最近被证明是新的生物标志物和潜在的治疗靶点,可在患有长期T1D的受试者中预防DKD(Qi等人,Nat Med 23:753-762(2017))。为了确定这种蛋白质是否也可参与预防肾功能受损的受试者的进行性肾功能下降,PKM2以及18种候选蛋白被纳入进一步分析中,尽管它与患有T2D的受试者的eGFR斜率不显著相关。T1D和T2D群组中19种血浆蛋白的名称、与eGFR斜率呈正相关的每种蛋白质的相关系数和P值分别呈现于图4A中。患有T2D的患者中的相关性通常稍弱,但所有18种蛋白质均与eGFR斜率呈显著正相关。
表3. 214名T1D受试者的探索群组和144名T2D受试者的复制群组中循环血浆蛋白的整体蛋白质组学谱分析数据。73种蛋白质的基线浓度与eGFR斜率之间的斯皮尔曼秩相关系数(rS)。
*具有T1D的群组中使用的显著性阈值:在探索性T1D群组中FDR调整的P值<0.005和在复制T2D群组中标称P值<0.05下文列出了系数(rs),并提供了相应的双侧P值。在本研究中检查了以粗体表示的基因符号。
实施例3.预防进行性肾功能下降的血浆蛋白
由于两个Joslin群组在基线时均具有肾功能受损(CKD 3期),并且与eGFR斜率的关联强度相同,因此将来自两个群组的SOMAscan结果合并。使用逻辑回归分析来分析19种蛋白质中每种蛋白质的基线血浆浓度与进行性肾功能下降速率的关联。来自组合Joslin群组的受试者被分为具有以下的那些:(1)快速肾功能下降(eGFR损失≥3.0ml/min/年)或进展至ESKD,称为进展者;或(2)具有缓慢或轻微肾功能下降的受试者(eGFR损失<3.0ml/min/年),称为非进展者。为了评估保护效应与进行性肾功能下降相关的临床特征和风险因素的统计独立性,首先进行单变量逻辑模型,然后进行针对基线临床协变量调整的多变量逻辑模型。潜在混杂因素的列表包括年龄、性别、民族/种族、糖尿病病程、胰岛素治疗、肾脏保护治疗、BMI、收缩压和舒张压、HbA1c、eGFR和ACR。由HbA1c、eGFR和ACR组成的关键协变量包含在最终的逻辑模型中。表4中提供有关逻辑模型的协变量选择的信息。单变量和多变量分析的结果显示于图4B中。所有模型均针对糖尿病类型进行了调整。效应显示为特定蛋白质的基线血浆浓度每增加一个四分位数的优势比(OR)和95%置信区间(95% CI)。在单变量模型中,包括PKM2(图4B-用##标记)在内的所有19种蛋白质都可保护(OR<1.0)免受进行性肾功能下降。在针对基线临床协变量(包括eGFR、HbA1c、ACR和糖尿病类型)进行调整的最终模型中,8种蛋白质的升高的血浆浓度仍然与保护免受进行性肾功能下降相关(图4B和表5)。这8种血浆蛋白被称为“证实的”保护性蛋白质,包括TNFSF12、SPARC、CCL5、APP、PF4、DNAJC19、ANGPT1和FGF20(图4B–用#标记)。在通过临床协变量进一步调整后,PKM2的基线浓度与保护免受进行性肾功能下降无关。
尽管在单变量分析中具有显著性(P<0.05),但在针对临床协变量调整后,PKM2的影响在统计上变得不显著。
表4.选择逻辑回归模型中的潜在协变量。
BMI,身体质量指数;BP,血压;Rx,治疗;肾脏保护,血管紧张素转换酶抑制剂(ACE-I)或血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)处方;HbA1c,血红蛋白A1c;ACR,白蛋白与肌酐比;eGFR,估计肾小球滤过率。
在最终模型中保留协变量的标准是标称P<0.05时的统计显著性,并通过检查β估值,使得20%或更高的β变化被认为是不可忽略的。
表5.检查患有T1D和T2D的组合Joslin群组中的19种循环血浆蛋白与进行性肾功能下降的关联的逻辑回归模型。
模型1 模型2
蛋白质的基因符号 OR(95%CI) OR(95%CI)
ALB 0.71(0.58,0.87) 0.83(0.66,1.05)
TNFSF12 0.61(0.50,0.75) 0.75(0.59,0.95)*
SPARC 0.66(0.54,0.81) 0.75(0.59,0.95)*
AK1 0.72(0.59,0.87) 0.89(0.70,1.02)
PPBPⅢ 0.70(0.57,0.85) 0.83(0.65,1.04)
PPBP2 0.69(0.56,0.84) 0.81(0.64,1.02)
CCL5 0.70(0.58,0.86) 0.75(0.60,0.95)*
THBS1 0.75(0.62,0.92) 0.88(0.70,1.11)
APP 0.70(0.58,0.86) 0.78(0.61,0.98)*
PF4 0.69(0.56,0.84) 0.78(0.62,0.99)*
FGF20 0.66(0.54,0.81) 0.69(0.54,0.88)*
ANGPT1 0.68(0.56,0.83) 0.72(0.57,0.91)*
DNAJC19 0.68(0.55,0.83) 0.78(0.62,0.99)*
PLA2G10 0.63(0.52,0.78) 0.80(0.63,1.01)
PPID 0.70(0.58,0.86) 0.88(0.70,1.10)
SERPINE1 0.75(0.62,0.92) 0.92(0.73,1.17)
RAN 0.73(0.60,0.88) 0.90(0.71,1.15)
PRDX1 0.79(0.65,0.96) 1.03(0.82,1.30)
PKM2 0.74(0.61,0.90) 0.91(0.72,1.15)
效应显示为相关蛋白质的循环浓度每增加一个四分位数的优势比(95%CI)。模型1:未调整;模型2:针对基线eGFR、HbA1c和ACR进行调整。所有模型均根据糖尿病类型进行调整。*呈粗体的蛋白质在两种模型中均显著(P<0.05)。
为了检查哪些已确认的保护性蛋白质独立地有助于防止进行性肾功能下降,首先,使用斯皮尔曼秩相关性在8种蛋白质和重要临床协变量之间分析了基线时的关系。图5A中显示的相关性矩阵表明,基线HbA1c的变化对8种保护性蛋白质的变化没有影响,而基线eGFR的变化与TNFSF12和FGF20相关性较弱。相比之下,基线ACR与除FGF20之外的所有蛋白质(图5A和图6)相关性较弱。此外,所有保护性蛋白质均与血浆肿瘤坏死因子受体1(TNF-R1)浓度呈负相关,我们之前报道称,血浆肿瘤坏死因子受体1(TNF-R1)是与ESKD进展风险增加相关的循环炎性蛋白之一(Niewczas等人,Nat Med25:805-813(2019)),表明随着保护性蛋白质的浓度增加,血浆TNF-R1浓度降低。已确认的保护性蛋白质根据与彼此的相关系数分为三个亚组(图5A)。亚组(A)包含5种高度相互相关的蛋白质;SPARC、CCL5、APP、PF4和ANGPT1。亚组(B)包含2种蛋白质;DNAJC19和TNFSF12,它们之间以及与亚组(A)中的蛋白质具有中等相关性。亚组(C)包含FGF20,其是一种与任何其他蛋白质均不相关的蛋白质,除了与TNFSF12具有中等相关性外。这种蛋白质分组模式在层次聚类分析中得以保留并得到证实,如图5B所示。这一发现表明这三个蛋白质亚组的血浆浓度受到不同机制的调控。这与亚组(A)中的5种蛋白质形成鲜明对比,亚组(A)中的5种蛋白质显示出如此强的相互相关性,以至于人们可假设它们受到相同机制的调控。
为了进一步测试这8种蛋白质(3个亚组)中哪些独立地促进防止进行性肾功能下降,进行了多变量逻辑回归分析,反向消除蛋白质和临床协变量,所述协变量无作用或具有弱作用(α>0.1)(表6)。所有相关的临床特征和8种已确认的保护性蛋白质均包括在分析中。在最终模型中,三个基线临床变量eGFR、HbA1c和ACR显著增加了进行性肾功能下降的风险,并且三种基线血浆蛋白ANGPT1(亚组A的示例)、TNFSF12(亚组B的示例)和FGF20(亚组C)可显著防止进行性肾功能下降。从临床协变量和示例性保护性蛋白质的多变量逻辑回归分析中获得的优势比(95% CI)显示于图5C中。
表6.使用反向消除程序从多变量逻辑回归分析中消除的蛋白质/临床协变量的排序。从最终逻辑回归模型中消除α>0.1的蛋白质。
实施例4.三种示例性保护性蛋白质的组合效应
为了评估三种示例性保护性蛋白质对进行性肾功能下降和进展至ESKD的风险的组合效应,开发了“保护指数”。对每个受试者中的三种示例性保护型蛋白质(ANGPT1、TNFSF12和FGF20)的血浆浓度进行了评价。每种蛋白质的高于中值的值评分为1,并且低于中值的值评分为0;通过总结所述评分,受试者的总保护指数可在0(所有蛋白质低于中值)与3(所有蛋白质高于中值)之间变化。保护指数与进行性肾功能下降之间的关联显示于图7A中。当与保护指数值为0的受试者相比时,对于总保护指数为1、2和3的受试者,进行性肾功能下降的优势比(95% CI)分别为0.69(0.28,1.69)、0.34(0.14,0.83)和0.19(0.1,0.52)。为了可视化三种保护性蛋白质的组合效应,根据保护指数分析了组合研究群组中进展至ESKD的累积风险。图7B示出根据保护指数的值在7.5年的随访期间ESKD的累积发生率。所有3种保护性蛋白质值均高于中值的受试者发展ESKD的风险非常低,在7.5年随访期间的累积发生率为16%。相比之下,保护指数值为0的那些受试者(例如所有三种保护性蛋白质值均低于中值)的ESKD累积发生率非常高,为80%。高度统计显著的P值(P=2.7x10-10)指示有力的证据表明四个亚组之间ESKD的累积发生率存在显著差异。
为了检查图7A中所示的结果是否可能被炎性循环蛋白(例如高TNF-R1血浆浓度)或临床协变量混淆,在组合Joslin群组(T1D和T2D)中进行了逻辑回归分析。在该分析中,保护指数被视为连续变量,而不是如图7A中的离散变量。如表7所示,保护指数的效应非常显著(P<0.0001),优势比是0.47(95%CI:0.32-0.60)。通过将我们之前报道的一种炎性蛋白TNF-R1纳入模型中(5),所述指数的保护效应减弱,优势比增加至0.60(95% CI:0.45-0.78),但仍保持高度统计显著性(P<0.0002)。具有启发性的是,在模型中添加许多临床协变量并没有显著改变保护指数的优势比。
表7.在组合的两个Joslin群组中,在单变量和多变量逻辑回归模型中,以保护指数(FGF20、TNFSF12和ANGPT1)对进行性肾功能下降的风险的优势比(95% CI)测量的效应估值。
SE,标准误差;CI,置信区间;TNF-R1,肿瘤坏死因子受体1;HbA1c,血红蛋白A1c;ACR,白蛋白与肌酐比;eGFR,估计肾小球滤过率。
将模型1与存在TNF-R1时具有相同保护指数的模型(模型2)以及存在重要临床协变量时具有相同保护指数和TNF-R1的模型(模型3)进行了比较。
实施例5.早期CKD中三种示例性保护性蛋白质的验证
为了证明研究结果的稳健性,在294名患有T1D的受试者的独立Joslin群组中进行了验证研究,所述受试者在基线时具有白蛋白尿,但肾功能正常。对该群组随访7-15年,以确定eGFR斜率并确定ESKD的发作时间。使用相同的SOMAscan平台对来自294名T1D受试者的验证研究的血浆样品进行了目标蛋白质的谱分析。与基线时肾功能受损(CKD 3期)的探索性群组和复制群组相比,验证群组肾功能正常(CKD 1期和2期;在基线时中值eGFR(第25个、第75个百分位数):100(82,114)ml/min/1.73m2)。验证群组的临床特征显示于表8中。
表8.具有正常肾功能的T1D受试者的独立验证群组的人口统计学和临床特征。
T1D,1型糖尿病;CKD,慢性肾病;HbA1c,血红蛋白A1c;eGFR,估计肾小球滤过率;ACR,白蛋白与肌酐比;ESKD,终末期肾病。非进展者被定义为eGFR损失<3.0ml/min/1.73m2/年,并且进展者被定义为eGFR损失≥3.0ml/min/1.73m2/年。数据以中值(第25个、第75个百分位数)或计数(比例)度量形式呈现。
对每个受试者中的三种示例性保护型蛋白质(ANGPT1、TNFSF12和FGF20)的血浆浓度进行了评价并开发了保护指数。保护指数与进行性肾功能下降之间的关联显示于图7C中。当与保护指数值为0的受试者相比时,总保护指数为1、2和3的受试者发生进行性肾功能下降的优势比(95% CI)分别为0.48(0.24,0.95)、0.46(0.24,0.89)和0.11(0.05,0.27)。根据保护指数,还在验证群组中分析了进展至ESKD的累积风险。图7D示出根据保护指数的值在7.5年的随访期间ESKD的累积发生率。在7.5年的随访期间,所有3种保护性蛋白质值均高于中值的受试者均未进展至ESKD。观察到保护指数值为1和2的受试者的ESKD的累积发生率较低;当与保护指数值为0的受试者相比时,累积发生率分别为14%和11%,在7.5年随访期间的累积发生率为33%。高度统计显著的P值(P=1.7x10-5)指示有力的证据表明四个亚组之间ESKD的累积发生率存在显著差异。
此外,三种示例性保护性蛋白质中的两种(ANGPT1和FGF20)使用不同的平台进行了验证。根据制造商的方案,使用人Ang-1 MSD R-Plex测定(F21YQ-3,Meso ScaleDiagnostics)在样品子集中验证了ANGPT1测量值(n=32)。简言之,将MSD GOLD小斑点链霉亲和素板在包被稀释液100中用100μl生物素化Ang-1捕获抗体包被,并在室温下孵育1小时。用150μl/孔的洗涤缓冲液(1X PBS-Tween 20)洗涤板,并将25μl从100,000pg至24pg/ml的连续稀释标准品的重复样品和来自我们的研究的32个血浆样品全部负载到同一板上。在室温下振荡孵育1小时后,将板洗涤并与50μl缀合检测抗体(MSD GOLD SULFO-TAGTM)在室温下孵育1小时,然后洗涤,并且最后将150μl/孔的读取缓冲液添加至板上。将板负载到MSD仪器中,在板电极上施加电压以测量发射光的强度,并提供样品中分析物的定量测量。
基于抗体(MSD)的测量值与基于适体(SOMAscan)的结果之间的相关性极其好。SOMAscan与MSD ANGPT1测量值之间的斯皮尔曼秩相关系数为rs=0.76,P<0.0001。为了分析验证SOMAmer特异性,开发了将完整蛋白质的基于DNA的亲和力下拉与质谱整合的方案。在加标有重组FGF20的FGF20SOMAmer血浆下拉中鉴定了跨越FGF20蛋白序列的氨基酸(a.a.)50-211的14个FGF20胰蛋白酶肽,而在未加标有重组FGF20的FGF20 SOMAmer血浆下拉中未鉴定出FGF20肽。FGF20胰蛋白酶肽GGPGAAQLAHLHGILR(a.a.50-65;SEQ ID NO:9)的提取离子色谱图的实例显示于图8中。该FGF20肽在加标有重组FGF20的血浆下拉中被鉴定,但在未掺有重组FGF20的血浆下拉中未检测到,从而验证了SOMAscan平台上的FGF20SOMAmer特异性。
实施例6.非糖尿病和糖尿病受试者中保护性蛋白质的血浆浓度
关于如何解释与进入研究时处于进行性肾功能下降风险的人相比,非进展者中的保护性蛋白质的浓度升高的问题,存在两种可能性。第一种可能性是糖尿病和相关的肾脏损伤可能导致推定保护性蛋白质的血浆浓度降低。因此,由于更广泛的潜在肾脏损伤,进展者的蛋白质浓度低于非进展者,而通过临床协变量并未认识到这一点,并且在多变量模型中也没有考虑到这一点。如果这是真的,人们将假设与缓慢下降的糖尿病患者相比,非糖尿病患者中的保护性蛋白质进一步升高。第二种可能性是,糖尿病可能不是决定推定保护性蛋白质的浓度的因素,然而,这些蛋白质在基线时浓度升高可防止进行性肾功能下降。因此,这些蛋白质的血浆浓度升高的受试者将主要包括非进展者,而这些蛋白质的浓度低的那些受试者将处于进行性肾功能下降的风险。如果这是真的,人们将假设,与非糖尿病患者相比,非进展者应该具有更高浓度的推定保护性蛋白质,而进展者的蛋白质浓度将低于或类似于对照。
为了区分上述两种可能性,使用相同的基于适体的SOMAscan平台,对T1D受试者的健康非糖尿病父母、患有T1D和T2D的非进展者和进展者之间的保护性蛋白质的血浆浓度进行了比较。三个研究亚组之间的基线临床特征和保护性蛋白质的基线值显示于表9中。与糖尿病受试者相比,非糖尿病患者年龄较大,HbA1c正常,ACR正常,并且eGFR几乎正常。按照设计,非进展者和进展者在基线时肾功能受损相似,但在7-15年的随访期间eGFR斜率显著不同。关于8种已确认的保护性蛋白质,在非糖尿病患者中观察到最低基线浓度,并且在非进展者中观察到最高值,而进展者的浓度落在两个其他亚组之间。图9示出3个亚组中3种示例性保护性蛋白质的比较,支持这些保护性蛋白质主要对抗进行性肾功能下降的作用。
表9.T1D受试者的非糖尿病父母以及非进展者和进展者的组合Joslin群组中8种经确认的保护性蛋白质的临床特征和血浆浓度。
BMI,身体质量指数;BP,血压;Rx,治疗;肾脏保护,血管紧张素转换酶抑制剂(ACE-I)或血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)处方;HbA1c,血红蛋白A1c;eGFR,估计肾小球滤过率;ACR,白蛋白与肌酐比;RFU,相对荧光单位。数据以中值(第25个、第75个百分位数)或计数(比例)度量形式呈现。
为了检查保护性蛋白质的血浆浓度是否先于糖尿病状态和早期肾功能下降的发展,对两类T1D先证者(正常白蛋白尿)或ESKD(或蛋白尿)的非糖尿病父母中的3种示例性保护性蛋白质(ANGPT1、TNFSF12和FGF20)的血浆浓度进行了比较分析。两类T1D先证者的非糖尿病父母中3种保护性蛋白质的基线特征和基线值显示于表10中。令人感兴趣地,如表10所描绘,患有肾脏并发症(ESKD或蛋白尿)的儿童的父母的循环FGF20浓度显著低于尽管糖尿病病程长但仍没有肾脏并发症的儿童的父母。
表10.两类T1D先证者的非糖尿病父母中前3种保护性蛋白质的循环血浆浓度。
ESKD,终末期肾病;HbA1c,血红蛋白A1c;ACR,白蛋白与肌酐比;eGFR估计肾小球滤过率;RFU,相对荧光单位。
数据以平均值±标准偏差、中值(第25个、第75个百分位数)或计数(比例)度量形式呈现。使用连续变量的Wilcoxon秩和检验来测试两个组之间的差异。**P<0.01。
实施例1至6的论述
通过无偏倚的蛋白质组学谱分析,上述实施例中描述的本研究在患有糖尿病和肾功能中度受损的受试者的两个独立群组中鉴定了与防止进行性肾功能下降和进展至ESKD特别相关的循环血浆蛋白。鉴定了八种循环蛋白,它们对进行性肾功能下降具有保护作用,独立于诸如基线eGFR、HbA1c、ACR和糖尿病类型的临床协变量。这些蛋白质可分为三个亚组:(A)SPARC、CCL5、APP、PF4、ANGPT1,(B)DNAJC19、TNFSF12和(C)FGF20。值得注意的是,当一起考虑8种已确认的保护性蛋白质时,只有代表每个亚组的3种蛋白质(例如ANGPT1、TNFSF12和FGF20)显示出针对进行性肾功能下降的强大的独立保护作用。在随访开始时所有3种蛋白质的值均高于中值的受试者中,ESKD的累积风险非常低,很好地证明了这3种示例性保护性蛋白质的组合作用。此外,这些保护性蛋白质在非进展者中的浓度比非糖尿病患者中高得多,这一事实提供了强有力的证据,表明这些蛋白质或它们所代表的途径与防止进行性肾功能下降有因果关系。这些研究发现具有高度概括性,因为这3种示例性保护性蛋白质的重要性在前瞻性地跟踪了十年的患有不同类型的糖尿病(T1D和T2D)以及处于DKD不同阶段(患有早期和晚期DKD的那些)的三个独立研究参与者群组中得到了证实。
血管生成素(ANGPT)是参与血管生成和血管炎症的生长因子。在ANGPT家族成员中,血管生成素-1(ANGPT1)和血管生成素-2(ANGPT2)均是Tie-2受体的配体(Suri等人,Cell 87:1171-1180(1996);Maisonpierre等人,Science277:55-60(1997))。ANGPT1是Tie-2受体的主要配体和激活剂,通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)途径来维持血管完整性(Brindle等人,Circ Res 98:1014-1023(2006)),因此保护内皮免受生长因子和细胞因子的过度激活(Fiedler等人,Trends Immunol 27:552-558(2006))。在另一方面,ANGPT2被认为是ANGPT1的天然拮抗剂,通过阻止ANGPT1与Tie-2受体结合,从而减少ANGPT1/Tie-2途径激活并促进血管壁不稳定和血管渗漏(Maisonpierre等人,Science277:55-60(1997);Fiedler等人,Trends Immunol 27:552-558(2006))。由于ANGPT1和ANGPT2彼此竞争Tie-2受体并具有相反的作用,因此测量两种血管生成素以评估正在进行的血管生成过程的平衡可能是有益的,从而破坏ANGPT1与ANGPT2之间的平衡(例如有利于ANGPT2)导致糖尿病介导的血管生成素失衡,例如血管壁不稳定,促进炎症和纤维化(Gnudi,Diabetologia 59:1616-1620(2016))。由于ANGPT2是在SOMAscan平台上测量的,并且结果可供本研究使用,因此将ANGPT1的保护作用与ANGPT2的风险效应以及ANGPT1/ANGPT2的比率(有利于ANGPT1)对进行性肾功能下降的风险的影响进行比较。不幸的是,这些分析的结果并没有显示两种血管生成素的比率与单独ANGPT1的保护作用相比具有更强的保护作用(表11),从而支持单独的ANGPT1而不是两种血管生成素的比率针对进行性肾功能下降的保护作用。
表11.比较ANGPT1的保护作用、ANGPT2的风险效应以及ANGPT1/ANGPT2比率对组合Joslin群组中的进行性肾功能下降的风险的影响的逻辑回归模型。
模型1 模型2
蛋白质 OR(95%CI) OR(95%CI)
ANGPT1 0.68(0.56,0.83) 0.72(0.57,0.91)
ANGPT2 1.48(1.21,1.81) 1.19(0.95,1.51)
ANGPT1/ANGPT2比率 0.68(0.55,0.82) 0.79(0.63,1.01)
ANGPT1,血管生成素-1;ANGPT2,血管生成素-2。模型1:未调整;模型2:针对基线eGFR、HbA1c和ACR进行调整。所有模型均根据糖尿病类型进行调整。
关于ANGPT1的保护作用已经进行了更多研究。ANGPT1已被证明发挥抗炎作用并保护内皮细胞渗透性免受炎症因子的影响(Pizurki等人,Br J Pharmacol 139:329-336(2003))。开发了一种ANGPT1变体,称为软骨寡聚基质蛋白血管生成素-1(COMP-Ang1)以研究COMP-Ang1在单侧输尿管梗阻引起的肾纤维化和糖尿病性肾病动物模型中的保护作用(Kim等人,J Am Soc Nephrol 17:2474-2483(2006);Lee等人,Nephrol Dial Transplant22:396-408(2007))。用COMP-Ang1治疗的糖尿病db/db小鼠的蛋白尿和空腹血糖浓度降低,系膜扩张减少,肾小球基底膜增厚,并且足细胞足突变宽(Lee等人,Nephrol DialTransplant 22:396-408(2007))。使用经遗传修饰的小鼠的研究进一步证实了ANGPT1表达浓度在糖尿病性肾小球疾病中的重要性。在糖尿病小鼠中,特别是肾小球中ANGPT1的过表达或补充导致白蛋白排泄减少,伴随着糖尿病诱导的去氧肾上腺素磷酸化减少(Dessapt-Baradez等人,J Am Soc Nephrol 25:33-42(2014)),导致去氧肾上腺素降解减少和足细胞足突变宽,从而导致更稳定和功能性的肾小球滤过屏障(Zhu等人,Kidney International73:556-566(2008))。将所有这些观察结果与我们在人类中的强有力的发现相结合,表明升高的血浆ANGPT1浓度防止了进行性肾功能下降,很明显ANGPT1可能是预防或降低糖尿病中进行性肾功能下降的风险的潜在治疗靶标。
本研究证明,ANGPT1与四种其他已确认的保护性蛋白质(PF4、SPARC、APP和CCL5)显著且高度相关,表明这些蛋白质可能具有相似的生理相关性、是共同途径的一部分或处于相同的遗传调控之下。这些蛋白质的所有5种表达和分泌的共同途径与血小板功能有关。已知凝血酶诱导从血小板释放ANGPT1以帮助血管修复过程中的内皮细胞稳定(Li等人,Thromb Haemost 85:204-206(2001))。血小板因子-4(PF4)从激活血小板的α颗粒中释放出来,并以高亲和力结合至肝素。它是嗜中性粒细胞、成纤维细胞和单核细胞的强化学引诱物(Lord等人,J Biol Chem 292:4054-4063(2017))。富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(SPARC)也是人血小板的α颗粒组分,并且在血小板激活过程中分泌。此外,它也由成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和脂肪细胞产生。SPARC参与细胞增殖、组织损伤修复、胶原基质形成和成骨细胞分化(Yun等人,Biomed Res Int 2016:9060143(2016))。血小板是血液循环中淀粉样βA4蛋白(APP)的主要来源(Li等人,Blood 84:133-142(1994))。C-C基序趋化因子5(CCL-5),也称为RANTES,也由激活的血小板α颗粒释放,沉积在发炎的内皮上,并介导单核细胞迁移至激活的内皮上。低血浆CCL-5浓度是转诊进行冠状动脉造影的患者中心脏死亡率的独立预测因子(Nomura等人,Clin Exp Immunol 121:437-443(2000))。先前的研究已经报道,激活的血小板在糖尿病性肾病的发展中发挥作用(Omoto等人,Nephron 81:271-277(1999);Zhang等人,J Am Soc Nephrol 29:2671-2695(2018))。这项研究的结果进一步指出了血小板分泌型蛋白质在糖尿病性肾病的进展中的重要性。血小板激活蛋白分泌可防止与白细胞运输相关的血管损伤,从而防止糖尿病性肾病的更快进展。这些蛋白质与防止进行性肾功能下降的相关性需要进一步研究。
肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族成员12(TNFSF12),也称为TWEAK,是配体和受体的大TNF超家族的成员(Chicheportiche等人,J Biol Chem 272:32401-32410(1997))。来自体外和体内模型的结果表明,施用TNFSF12增加肾小管细胞中的炎性细胞因子产生,例如增加单核细胞趋化蛋白-1和白介素-6(IL-6)的mRNA和蛋白质表达,而TNFSF12的阻断阻止小鼠中肾小管趋化因子和IL-6表达、间质炎症和巨噬细胞浸润(Sanz等人,J Am Soc Nephrol19:695-703(2008))。TNFSF12在DKD的发展/进展中的作用仍不清楚。到目前为止,专门讨论这个主题的文献还很少;一些横断面研究调查了循环TNFSF12浓度与DKD之间的关系。一项研究报道了T2D和ESKD受试者中循环TNFSF12浓度降低(Kralisch等人,Atherosclerosis199:440-444(2008))。TNFSF12在其他肾脏疾病和其他形式的糖尿病中的作用也已有报道(Sanz等人,J Cell Mol Med 13:3329-3342(2009);Dereke等人,PLoS One 14:e0216728(2019);Bernardi等人,Clin Sci(Lond):133,1145-1166(2019))。在实验性叶酸诱导的急性肾损伤中,TNFSF12缺乏减轻了肾脏细胞凋亡和炎症,并改善了肾功能。一项涉及患有和不患有妊娠期糖尿病(GBM)的女性的病例对照研究报告称,与没有GBM的怀孕志愿者相比,患有GBM的女性的TNFSF12浓度降低。本研究是唯一的随访观察,其中非常有力的发现表明TNFSF12是针对进行性肾功能下降的保护性蛋白质,这与上述研究的结果相反。这一发现需要在人类和动物研究中进一步探索。
成纤维细胞生长因子20(FGF20)是22种成纤维细胞生长因子(FGF)的大家族中的成员,所述家族包括由分泌型信号传导蛋白和细胞内非信号传导蛋白组成的7个亚家族(Itoh等人,J Biochem 149:121-130(2011))。在SOMAscan蛋白质组学平台上测量了22种FGF中的17种,并且只有FGF20与防止进行性肾功能下降密切相关。FGF20是一种新型神经营养因子,其最初在大鼠脑中被鉴定,并被认为在多巴胺能神经元的发育中发挥重要作用(Ohmachi等人,Biochem Biophys Res Commun 277:355-360(2000);Correia等人,FrontNeuroanat 1:4(2007);Shimada等人,J Biosci Bioeng 107:447-454(2009))。此外,许多研究报道了不同种族的帕金森病易感性与FGF20基因多态性之间的相关性,尽管一些研究报道没有证据表明FGF20与帕金森病之间存在关联(Pan等人,Parkinsonism Relat Disord18:629-631(2012);Sadhukhan等人,Neurosci Lett 675:68-73(2018);van der Walt等人,Am J Hum Genet 74:1121-1127(2004);Clarimon等人,BMC Neurol 5:11(2005);Wider等人,Mov Disord 24:455-459(2009))。令人感兴趣地,之前的研究证明了FGF20/Fgf20通过维持人类和小鼠的肾元祖细胞的干性而在肾脏发育中发挥重要作用(Barak等人,DevCell 22:1191-1207(2012))。FGF20仅在肾脏的肾元祖细胞中表达。人类和小鼠中FGF20/Fgf20的损失导致肾发育不全,这是其中一个或两个胎儿肾脏无法发育并且因此新生儿缺失一个或两个肾脏的疾患。
FGF20由Jeffers和他的同事于2001年首次发现,他们将FGF20鉴定为新的致癌基因,可能代表治疗人类恶性肿瘤的潜在靶标(Jeffers等人,Cancer Research 61:3131-3138(2001))。随后,同一作者证明FGF-20(CG53135-05)具有治疗实验性肠道炎症的治疗活性(Jeffers等人,Gastroenterology 123:1151-1162(2002)),而另一项研究报道了FGF20作为新型药物放射防护剂,使得在潜在致命的全身放射性之前在小鼠中施用单剂量的FGF20减轻了急性辐射暴露的致命影响,并导致总体存活率大幅增加(Maclachlan等人,IntJ Radiat Biol 81:567-579(2005))。基于这些发现,CG53135-05(重新命名为维拉弗明)在癌症患者的II期临床试验中作为预防出现口腔粘膜炎(化疗的副作用)的保护性药物进行了评价(Schuster等人,Support Care Cancer 16:477-483(2008))。该试验的结果表明,维拉弗明具有良好的安全性和耐受性特征,但在添加至口腔粘膜炎的治疗时并未表现出足够的功效。
本研究证明,FGF20是已证实的保护性蛋白质之一,在患有T1D和T2D的组合群组中,它与针对进行性肾功能下降和进展至ESKD的保护作用最密切相关。所述关联独立于循环炎性蛋白质和相关临床协变量。基线时FGF20的高血浆浓度预示着7-15年随访期间肾功能下降较少。这种关联表明FGF20的参与及其延迟或降低进行性肾功能下降和ESKD发展风险的独立作用。因此,FGF20可能是用于预防或延迟糖尿病中进行性肾功能下降和ESKD发作的有用靶标。我们研究的另一个令人感兴趣的发现是在两类T1D先证者(正常白蛋白尿或ESKD/蛋白尿)的非糖尿病父母的血浆谱中观察到的。出人意料地,患有ESKD/蛋白尿的T1D后代的非糖尿病父母的FGF20血浆浓度显著低于没有肾脏并发症的具有T1D后代的那些父母。这些发现引发了问题和/或猜测,即从父母遗传的遗传倾向或组分是否可调节其后代的相应蛋白质浓度,并且如果在更大规模的研究中得到证实,可能对未来关于T1D(以及还有T2D)中的进行性肾功能下降的决定因素的研究产生深远的影响。
最近,Joslin Medalist Study引发了人们对针对晚期糖尿病并发症(包括DKD)的保护因素的研究的兴趣。这项横断面研究招募了全国范围内T1D存活至少50年的受试者。没有晚期糖尿病并发症的那些人已经关于大量特征(包括生物标本的各种组学特征)与非糖尿病配偶以及与在糖尿病病程中非常晚期发展并发症的那些人进行了比较。比较从三个亚组中的受试者获得的肾组织的蛋白质组学谱,在肾小球中鉴定了若干葡萄糖代谢酶/蛋白质(包括PKM2),所述葡萄糖代谢酶/蛋白质在尽管糖尿病病程极长、但没有DKD的那些患者中高度升高。通过遵循一系列功能研究的这一发现,作者得出结论,PKM2的上调可能是一种预防DKD发展的方式(Qi等人,Nat Med 23:753-762(2017))。
本研究也寻找保护因素,但与Medalist研究有很大不同。后者是横断面的并且寻找要在细胞和动物研究中调查的候选保护性蛋白质,本研究是Joslin诊所基于群体的前瞻性观察,其调查了防止进行性肾功能下降的基线循环血浆蛋白与在7-15年随访期间快速进展至ESKD之间的关联。此外,两项研究是基于两个不同的前提。Medalist研究的目的是寻找针对晚期糖尿病并发症的发作/发展的保护性蛋白质,而本研究的目的是在已经存在轻度肾功能损害的受试者中鉴定针对进行性肾功能下降的保护性蛋白质。这很可能是我们无法以统计显著性确认在Joslin Medalist研究中获得的PKM2结果的原因。
这项研究的优势包括其前瞻性设计、对三个独立研究群组的长期随访观察、T1D和T2D中数据的一致性以及使用SOMAscan蛋白质组学平台来测量所有Joslin群组中的蛋白质浓度。此外,在本研究中,对关键潜在混杂因素和糖尿病类型的研究结果进行了调整。然而,与任何研究一样,本研究也必须考虑潜在的局限性。首先,这是一项观察性研究,并且虽然这些蛋白质可能直接防止肾功能下降的进展,但它们也可能是保护过程的间接报告基因。我们的研究结果的因果解释需要通过动物模型和临床试验来确立,以确认它们具有直接保护作用。其次,所述研究结果仅限于患有慢性肾病和肾功能受损的白种人糖尿病个体,因此所述结果可能无法推广至其他群体和患有其他肾病的个体。第三,基线血浆样品不是在糖尿病发作时采集的,因此缓慢或快速进行性肾功能下降与采血时间有关,但与疾病发作无关。本研究包括在21世纪初招募至JKS的一部分参与者,并且跟踪至2012-13年。在入组之前,这些个体已在Joslin诊所进行了多年的护理(在糖尿病发作之初就跟踪这些个体是不切实际的),并且他们纳入我们的前瞻性研究与他们在后续随访期间未知的未来结果无关。因此,这些研究结果反映了患有糖尿病的个体中CKD的无偏倚的当代自然史和ESKD的发展。尽管如此,ESKD的保护性蛋白质及其进展的鉴定仍然是引人注目的,并且为诊断和治疗均提供了充足的机会,以解决对任何患者来说都是毁灭性的诊断。
实施例7.睾丸蛋白聚糖-2的循环水平与针对T1D患者中的ESKD的保护独立相关
我们使用SOMAscan在患有T1D的小型Joslin群组中寻找其他保护性蛋白质。表12显示随访10年内进展至ESKD的患者和仍然未患ESKD的患者的特征。非进展者中睾丸蛋白聚糖-2(SPOCK2)的循环水平显著高于进展者中。这种差异在图10中说明。如以上实施例中所述,对于三种保护性蛋白质FGF20、TNFSF12和ANGPT1观察到类似的差异。
表12.113名Joslin T1D晚期DKD患者的临床特征。
T1D,1型糖尿病;DKD,糖尿病性肾病;HbA1c,血红蛋白A1c;eGFR,估计肾小球滤过率;ACR,白蛋白与肌酐比;ESKD,终末期肾病;RFU,相对荧光单位;SPOCK2,睾丸蛋白聚糖-2;FGF20,成纤维细胞生长因子20;TNFSF12,肿瘤坏死因子超家族配体12;ANGPT1,血管生成素-1。
为了测试循环SPOCK2(睾丸蛋白聚糖-2)针对进展至ESKD的保护作用,我们进行了逻辑回归分析。结果在以下表13中示出。在单变量逻辑回归(模型1)中,所有保护性蛋白质针对进展至ESKD具有强保护作用(OR低于1指示保护作用)。当相关临床变量和所有保护性蛋白质一起分析时,在多变量逻辑回归分析(模型2)中也观察到了SPOCK2(睾丸蛋白聚糖-2)的保护作用。
总之,SPOCK2(睾丸蛋白聚糖-2)的循环水平与针对ESKD的保护独立相关,并且可与先前报道的三种保护性蛋白质(FGF20、ANG1和TNFSF12)一起使用,以开发所谓的“保护指数”。
表13.患有T1D的Joslin群组中4种保护性蛋白质与ESKD发展的相关性。
效应显示为特定蛋白质的循环浓度每一个四分位数变化的优势比(OR)与相应的95% CI。OR低于1指示保护。
模型1:协变量的OR,没有调整
模型2;SPOCK2的OR针对FGF20、ANG1、TNFSF12、eGFR、ACR和HbA1c进行了调整
T1D,1型糖尿病;ESKD,终末期肾病;OR,优势比;CI,置信区间;HbA1c,血红蛋白A1c;GFR,肾小球滤过率;ACR,白蛋白与肌酐比;SPOCK2,睾丸蛋白聚糖-2;FGF20,成纤维细胞生长因子20;TNFSF12,肿瘤坏死因子超家族配体12;ANGPT1,血管生成素-1。
x:数据不可获得
表14.序列表
通过引用并入
本申请通篇引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请的全部内容特此通过引用整体并入。

Claims (44)

1.一种鉴定处于发展进行性肾功能下降风险的人受试者的方法,所述方法包括
检测来自有需要的受试者的样品中的至少一种保护性蛋白质的水平,其中所述保护性蛋白质选自由以下组成的组:成纤维细胞生长因子20(FGF20)、血管生成素-2(ANGPT1)和肿瘤坏死因子配体超家族成员12(TNFSF12),
将所述保护性蛋白质的水平与所述保护性蛋白质的参考水平进行比较,其中所述参考水平是非进展者人受试者中的所述保护性蛋白质的水平,
其中与所述非进展者参考水平相比所述保护性蛋白质的更低水平表明所述人受试者处于发展进行性肾功能下降的风险,或者
其中与所述参考水平相比所述保护性蛋白质的同等或更高水平表明所述人受试者不处于发展进行性肾功能下降的风险。
2.如权利要求1所述的方法,其中检测保护性蛋白质的组合的水平,
其中所述保护性蛋白质的组合选自由以下组成的组:FGF20和TNFSF12;FGF20和ANGPT1;以及TNFSF12和ANGPT1;或者
其中所述保护性蛋白质的组合包括FGF20、TNFSF12和ANGPT1。
3.一种鉴定处于发展进行性肾功能下降风险的人受试者的方法,所述方法包括
检测来自有需要的受试者的样品中的至少一种保护性蛋白质的水平,其中所述保护性蛋白质选自由以下组成的组:
来自选自由睾丸蛋白聚糖-2、富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(SPARC)、C-C基序趋化因子5(CCL5)、淀粉样βA4蛋白(APP)、血小板因子-4(PF4)和ANGPT1组成的组的第一组保护性蛋白质的保护性蛋白质,
来自选自由DNAJC19和TNFSF12组成的组的第二组保护性蛋白质的保护性蛋白质,和
FGF20,
将所述保护性蛋白质的水平与所述保护性蛋白质的参考水平进行比较,其中所述参考水平是非进展者人受试者中的所述保护性蛋白质的水平,
其中与所述参考水平相比所述保护性蛋白质的更低水平表明所述人受试者处于发展进行性肾功能下降的风险,或者
其中与所述参考水平相比所述保护性蛋白质的同等或更高水平表明所述人受试者不处于发展进行性肾功能下降的风险。
4.如权利要求3所述的方法,其中检测保护性蛋白质的组合的水平,其中所述保护性蛋白质的组合选自由以下组成的组:FGF20和第1组保护性蛋白质;FGF20和第2组保护性蛋白质;第1组保护性蛋白质和第2组保护性蛋白质;以及FGF20、第1组保护性蛋白质和第2组保护性蛋白质。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述非进展者是非糖尿病人受试者。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,所述方法还包括如果所述受试者被鉴定为具有进行性肾功能下降的风险,则施用疗法以改善肾功能。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法,所述方法还包括如果所述受试者被鉴定为具有进行性肾功能下降的风险,则向所述受试者施用FGF20、FGF20的活性片段、FGF20模拟物或编码FGF20的核酸或其活性片段。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法,所述方法还包括如果所述受试者被鉴定为具有进行性肾功能下降的风险,则向所述受试者施用ANGPT1、ANGPT1的活性片段、ANGPT1模拟物或编码ANGPT1的核酸或其活性片段。
9.如权利要求1-5中任一项所述的方法,所述方法还包括如果所述受试者被鉴定为具有进行性肾功能下降的风险,则向所述受试者施用TNFSF12、TNFSF12的活性片段、TNFSF12模拟物或编码TNFSF12的核酸或其活性片段。
10.如权利要求1-5中任一项所述的方法,所述方法还包括如果所述受试者被鉴定为具有进行性肾功能下降的风险,则向所述受试者施用SPARC、SPARC的活性片段、SPARC的模拟物或编码SPARC的核酸或其活性片段。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述人受试者患有肾功能受损、糖尿病或两者。
12.如权利要求11所述的方法,其中所述糖尿病是I型糖尿病或II型糖尿病。
13.如权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述人受试者是非糖尿病的。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法,其中所述样品是血浆样品。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法,其中使用免疫测定、质谱法、液相色谱(LC)分级分离、SOMAscam、Mesoscale平台或电化学发光检测来测定所述保护性蛋白质的水平。
16.如权利要求15所述的方法,其中所述免疫测定是ELISA或蛋白质印迹分析。
17.如权利要求15所述的方法,其中所述质谱法是基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、偏移触发的多路复用精确质量、高分辨率和绝对定量(TOMAHAQ)、实时质谱直接分析(DART-MS)或二次离子质谱(SIMS)。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法,其中所述样品是血液样品、血清样品、血浆样品、淋巴样品、尿液样品、唾液样品、泪液样品、汗液样品、精液样品、阴道样品、支气管样品、粘膜样品或脑脊液(CSF)样品。
19.一种用于鉴定或监测人受试者的进行性肾功能下降的蛋白质阵列,所述蛋白质阵列包含对人FGF20、人TNFSF12和人ANGPT1具有特异性的抗体或其抗原结合片段。
20.一种用于鉴定或监测人受试者的进行性肾功能下降的蛋白质阵列,所述蛋白质阵列包含对人FGF20、人TNFSF12、人ANGPT1、人睾丸蛋白聚糖-2、人SPARC、人CCL5、人APP、人PF4、人ANGPT1、人DNAJC19、人TNFSF12或其组合具有特异性的抗体或其抗原结合片段。
21.一种包含用于特异性地结合蛋白质生物标志物的多个探针的阵列,其中所述蛋白质生物标志物是人FGF20、人TNFSF12和人ANGPT1中的至少一者或多者。
22.一种包含用于特异性地结合蛋白质生物标志物的多个探针的阵列,其中所述蛋白质生物标志物是人FGF20、人TNFSF12、人ANGPT1、人睾丸蛋白聚糖-2、人SPARC、人CCL5、人APP、人PF4、人DNAJC19和人TNFSF12中的至少一者或多者。
23.一种测试面板,所述测试面板包含如权利要求19-22中任一项所述的蛋白质阵列。
24.一种药盒或测定装置,所述药盒或测定装置包括如权利要求23所述的测试面板。
25.一种抑制人受试者的进行性肾功能下降的进展的方法,所述方法包括
向受试者施用有效量的至少一种保护性蛋白质和/或保护性蛋白质的至少一种激动剂。
26.一种预防人受试者的肾功能下降的方法,所述方法包括
向受试者施用有效量的至少一种保护性蛋白质和/或保护性蛋白质的至少一种激动剂。
27.一种治疗人受试者的肾功能下降的方法,所述方法包括
向受试者施用治疗有效量的至少一种保护性蛋白质和/或至少一种保护性蛋白质的激动剂。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法,其中所述至少一种保护性蛋白质是FGF20、TNFSF12、ANGPT1、睾丸蛋白聚糖-2、SPARC、CCL5、APP、PF4和DNAJC19中的一者或多者。
29.如权利要求28所述的方法,其中所述至少一种保护性蛋白质是FGF20、FGF20的活性片段、FGF20模拟物或编码FGF20的核酸或其活性片段。
30.如权利要求28所述的方法,其中所述至少一种保护性蛋白质是TNFSF12、TNFSF12的活性片段、TNFSF12模拟物或编码TNFSF12的核酸或其活性片段。
31.如权利要求28所述的方法,其中所述至少一种保护性蛋白质是ANGPT1、ANGPT1的活性片段、ANGPT1模拟物或编码ANGPT1的核酸或其活性片段。
32.如权利要求28所述的方法,其中所述至少一种保护性蛋白质是SPARC、SPARC的活性片段、SPARC模拟物或编码SPARC的核酸或其活性片段。
33.如权利要求28所述的方法,其中所述至少一种保护性蛋白质是CCL5、CCL5的活性片段、CCL5模拟物或编码CCL5的核酸或其活性片段。
34.如权利要求28所述的方法,其中所述至少一种保护性蛋白质是APP、APP的活性片段、APP模拟物或编码APP的核酸或其活性片段。
35.如权利要求28所述的方法,其中所述至少一种保护性蛋白质是PF4、PF4的活性片段、PF4模拟物或编码PF4的核酸或其活性片段。
36.如权利要求28所述的方法,其中所述至少一种保护性蛋白质是DNAJC19、DNAJC19的活性片段、DNAJC19模拟物或编码DNAJC19的核酸或其活性片段。
37.如权利要求28所述的方法,其中所述至少一种保护性蛋白质是睾丸蛋白聚糖-2、睾丸蛋白聚糖-2的活性片段、睾丸蛋白聚糖-2模拟物或编码睾丸蛋白聚糖-2的核酸或其活性片段。
38.如权利要求28-37中任一项所述的方法,其中所述核酸是在载体中。
39.如权利要求25-38中任一项所述的方法,其中所述人受试者先前被鉴定为处于发展进行性肾功能下降风险的进展者。
40.一种确定人受试者在限定时间段内肾功能下降的大致风险的方法,所述方法包括:
a)从所述人受试者获得生物样品;
b)检测所述生物样品中至少一种保护性蛋白质的水平,其中所述至少一种保护性蛋白质选自由FGF20、TNFSF12、ANGPT1、睾丸蛋白聚糖-2、SPARC、CCL5、APP、PF4和DNAJC19组成的组;
c)将关于所述保护性蛋白质的水平的数据与所述人受试者的临床数据特征(诸如eGFR、uACR、临床化学实验室测量值、生命体征、患者人口统计学)相结合;以及
d)如使用机器学习或统计建模的预后风险评分算法(例如KidneyIntelX测试平台)所确定,确定所述人受试者的肾功能下降(RD)的大致风险。
41.如权利要求40所述的方法,所述方法进一步包括将所述生物样品中的所述至少一种保护性蛋白质的水平与非进展者对照水平或正常白蛋白尿对照水平进行比较。
42.如权利要求40所述的方法,其中所述生物样品在第一时间点和第二时间点从所述人受试者获得。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述第二时间点是在第一时间点之后约6个月、约12个月、约18个月、约24个月、约3年、约4年、约5年、约10年或约15年从所述人受试者获得的。
44.如权利要求42或43所述的方法,其还包括将在第一时间点从所述人受试者获得的所述生物样品中的所述至少一种保护性蛋白质的水平与在第二时间点从所述人受试者获得的所述生物样品进行比较。
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