KR102015982B1 - 고밀도 지단백 기능과 관련된 심혈관 질환 치료 표적 및 이를 이용하여 심혈관 질환을 진단하는 방법 - Google Patents

고밀도 지단백 기능과 관련된 심혈관 질환 치료 표적 및 이를 이용하여 심혈관 질환을 진단하는 방법 Download PDF

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Abstract

비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 심혈관 질환 치료 표적으로 하여 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써, 심혈관 질환을 진단하고, 심혈관 질환의 치료제를 스크리닝할 수 있다.

Description

고밀도 지단백 기능과 관련된 심혈관 질환 치료 표적 및 이를 이용하여 심혈관 질환을 진단하는 방법 {Therapeutic target for cardiovascular disease related to high-density lipoprotein function and method for diagnosis of cardiovascular disease using the same}
심혈관 질환 치료 표적 및 이를 이용하여 심혈관 질환을 진단하는 방법, 및 이를 이용하여 심혈관 질환 치료제를 스크리닝하는 방법 및 에 관한 것이다.
심혈관 질환(cardiovascular disease: CVD)은 세계 최고 사망률을 기록하고 있는 질병으로 세계보건기구의 보고에 의하면 2030년까지 2360만명이 심혈관 질환으로 사망할 것으로 예상하고 있다. 심혈관 질환 예방을 위하여, 저밀도 지단백-콜레스테롤(low-density lipoprotein-cholesterol: LDL-C)의 저하가 중요한 역할을 한다는 것이 입증되었다. 아울러, 최근에는 고밀도 지단백(high-density lipoprotein: HDL) 및/또는 고밀도 지단백-콜레스테롤(high-density lipoprotein-cholesterol: HDL-C)의 구조와 기능과의 관계에 대하여 관심이 높다. HDL-C의 수준이 높을수록 심혈관 질환의 발병률이 낮게 나타나, 고밀도 지단백-콜레스테롤 또한 독립적인 위험인자이고 치료 목표가 되어야 하는 것으로 알려져있다. 따라서, 심혈관 질환을 유발하는 메커니즘 및 경로가 다양하여, 심혈관 질환의 위험도를 예측하고 치료 효과를 반영할 수 있는 지표의 개발이 지속적으로 요구되고 있다. 이러한 연구는 새로운 심혈관 질환을 진단하고 치료제를 발굴하는 과정에서 유용하게 이용될 수 있다.
일 양상은 심혈관 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 심혈관 질환 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 심혈관 질환 치료제 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 개체의 심혈관 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 개체의 혈액에서 고밀도 지단백 시료를 수득하는 단계; 및 수득된 고밀도 지단백 시료에서 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 측정된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및
측정된 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 및 혈청 아밀로이드 A-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 낮은 경우, 및/또는 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 높은 경우, 상기 개체를 심혈관계 질환의 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
비트로넥틴(vitronectin: VTN 또는 TN)은 혈청, 세포외기질 및 뼈에서 다량으로 존재하는 헤모펙신(hemopexin) 패밀리의 당단백질로, 인테그린 알파-V 베타-3(ntegrin alpha-V beta-3)과 결합하여 세포 부착을 촉진한다. 비트로넥틴은, 예를 들면, NCBI Accession number NP_000629.3로 등록된 아미노산 서열, 또는 NM_000638.3로 등록된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 알파-1B-당단백질(alpha-1B-glycoprotein: A1BG)은 혈장 당단백질로서, 일부 췌장암 환자에서 과발현을 보이는 것으로 알려져 있다. 알파-1B-당단백질은, 예를 들면, NCBI Accession number NP_570602.2로 등록된 아미노산 서열, 또는NM_130786.3로 등록된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 티록신 결합 글로불린(thyroxine binding globulin: TBG 또는 serpin family A member: SERPINA7)는 순환계에서 갑상선 호르몬에 결합하는 글로불린으로, 혈액에서 갑상선 호르몬 티록신(T4) 및 트리요오드티로닌(triiodothyronine)(T3)를 운반하는 역할을 하는 운반 단백질 중 하나이다. 티록신 결합 글로불린은, 예를 들면, NCBI Accession number NP_000345.2로 등록된 아미노산 서열, 또는 NM_000354.5로 등록된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 혈장 세린 프로테아제 억제제(plasma serine protease inhibitor 또는 serpin family A member 5: SERPINA5)는 항응고제 단백질 C의 활성을 제한하는 세르핀(serpin) 타입의 세린 프로테아제 억제제이다. 혈장 세린 프로테아제 억제제는, 예를 들면, NCBI Accession number NP_000615.3로 등록된 아미노산 서열, 또는 NM_000624.5로 등록된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 안지오텐시노겐(angiotensinogen: AGT)은 주로 간에서 생성하여 순환계로 방출되는 α-2-글로불린으로서, 세르핀 패밀리의 구성원이며, 안지오텐신(angiotensin)의 전구체이고, 레닌(renin)의 기질로서 작용한다. 안지오텐시노겐은, 예를 들면, NCBI Accession number NP_000020.1로 등록된 아미노산 서열, 또는 NM_000029.3로 등록된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 혈청 아밀로이드 A-4(serum amyloid A-4: SAA4)는 아포지질단백질(apolipoprotein)로서, 다른 SAA 패밀리인 SAA1 및 SAA2와 달리 급성 반응 동안 발현이 변화가 거의 없다. 혈청 아밀로이드 A-4는, 예를 들면, NCBI Accession number NP_006503.2로 등록된 아미노산 서열, 또는 NM_006512.3로 등록된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보체 C4-A(complement C4-A: C4-A)는 단일 사슬 전구체로서 발현되어, 분비되기 전에 알파, 베타, 및 감마 사슬의 삼량체(trimer)로 분해되며, 염증을 매개한다. 보체 C4-A는, 예를 들면, NCBI Accession number NP_001239133.1로 등록된 아미노산 서열, 또는 NM_001252204.1로 등록된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 알파-2 매크로글로불린(alpha-2 macroglobulin: A2M)은 항-프로테아제로 작용하며, 플라스민(plasmin) 및 칼리크레인(kallikrein)을 억제하여 섬유소의 용해를 억제하고 트롬빈을 억제함으로써 응고 억제제로서 작용한다. 알파-2 매크로글로불린은, 예를 들면, NCBI Accession number NP_000005.2로 등록된 아미노산 서열, 또는 NM_000014.5 또는 NM_000014.4로 등록된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역(immunoglobulin mu chain C region: IGHM)은 면역 글로불린 중쇄에서 일정한 영역으로서, B 림프구에 의해 생성되고, 막과 결합하거나 분비되는 당단백질이다. 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역은, 예를 들면, UniProt Accession number P01871로 등록된 아미노산 서열, 또는 GRCh38: 14:105,851,965-105,856,216로 등록된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
서로 다른 생물로부터 유래하거나 또는 명칭이 상이하더라도, 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역 단백질과 동일 또는 유사한 활성을 나타내는 단백질(예를 들면, 동질효소(isoenzyme) 또는 동족체(homolog))을 상기 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역 단백질과 동일한 단백질로 적용할 수 있다. 상기 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역의 구조는 NCBI 등의 데이터 베이스를 통하여 얻을 수 있다. 알려진 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역의 구조의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드는 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역과 동일 또는 유사한 활성을 나타내는 단백질인 것일 수 있다. 여기에서, "상동성"은 두 개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 의미한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST [참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]이나 Pearson에 의한 FASTA [참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]을 사용하여 결정할 수 있다.
상기 방법은 개체의 혈액에서 고밀도 지단백 시료를 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 고밀도 지단백은 혈액, 구체적으로 혈청으로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 개체로부터 혈액, 혈청 또는 고밀도 지단백 시료를 수득하는 단계는 통상의 혈액 채취 및 분리 방법에 의하여 수행될 수 있다.
상기 개체는 인간을 포함한 포유동물인 것일 수 있다. 상기 개체는 심혈관 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 대상을 의미한다. 상기 개체는 척추동물, 포유동물, 또는 인간(Homo sapiens)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간은 아시아계 인, 또는 한국인일 수 있다. 상기 마커는 한국인의 심혈관 질환과 특이적으로 연관되어 있다.
상기 측정된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 수준과 비교하는 단계는 개체 또는 피검체가 심혈관 질환에 걸릴 위험성 또는 심혈관 질환을 나타내는 환자인지를 판별할 수 있다. 측정된 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 및 혈청 아밀로이드 A-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 낮은 경우, 및/또는 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 높은 경우, 상기 개체를 심혈관계 질환의 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판단할 수 있다. 이 경우, 상기 개체는 콜레스테롤 유출능이 건강한 군 또는 정상인 군에 비하여 감소된 것으로 판단할 수 있고, 심혈관 질환은 콜레스테롤 유출능 감소로 유발된 것일 수 있다. 측정된 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 및 혈청 아밀로이드 A-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 및 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 낮은 경우, 및/또는 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 높은 경우, 상기 개체를 콜레스테롤 유출능이 감소되어 심혈관계 질환의 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판단할 수 있다.
상기 방법은 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 분석하기 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 상기 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 것은 당업계에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
상기 유전자의 발현 수준은 서열 분석(sequencing), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 핵산 마이크로어레이, 노던 블롯(Northern blot), 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction: RT-PCR), 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 면역블롯(Immonoblot) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 측정하는 것일 수 있다. 이 때, 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 또는 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역의 뉴클레오티드 서열 또는 그 상보 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 이들의 안티센스 서열을 이용하여, 유전자의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사을 위한 중합 반응에서 중합 개시점으로 작용하는 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 핵산 증폭 반응에서 사용되는 것일 수 있다. 상기 증폭(amplification)은 표적 서열 또는 그의 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것을 나타낸다. 상기 핵산 증폭 반응은 당업계에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 프라이머는 10 내지 100 nt, 15 내지 100 nt, 10 내지 80 nt, 10 내지 50 nt, 10 내지 30 nt, 15 내지 80 nt, 15 내지 50 nt, 15 내지 30 nt, 20 내지 100 nt, 20 내지 80 nt, 20 내지 50 nt, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다. 상기 프로브는 표적 핵산 예를 들면, 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 또는 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어서 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 또는 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역의 존재 유무, 함량 및 발현량을 확인할 수 있다. 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 예를 들면, 상기 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 또는 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역의 DNA 또는 RNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 또는 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역 유전자의 발현량을 확인할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 프로브는 10 내지 100 nt, 15 내지 100 nt, 10 내지 80 nt, 10 내지 50 nt, 10 내지 30 nt, 15 내지 80 nt, 15 내지 50 nt, 15 내지 30 nt, 20 내지 100 nt, 20 내지 80 nt, 또는 30 내지 50 nt를 갖는 것일 수 있다.
상기 단백질의 발현 수준은 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE), 면역블롯, 면역형광법, 효소면역분석법, 질량분석, 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 측정하는 것일 수 있다. 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 것은 당업계에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
상기 방법은 수득된 고밀도 지단백 시료에서 세포외 기질 단백질 1(Extracellular matrix protein 1: ECM1), 카르복시펩티다제 B2(Carboxypeptidase B2: CPB2), 색소 상피 유도 인자 (pigment epithelium-derived factor: PEDF 또는 SERPINF1), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3(Insulin-like growth factor binding protein 3: IGBP3), 혈청 아밀로이드 A-1 단백질 (Serum amyloid A-1 protein: SAA1), 응고인자 X(Coagulation factor X: F10), 아포지질단백질 (Apolipoprotein(a): LPA), 알파 2 항플라스민(Alpha-2-antiplasmin: SERPINF2), 헤모글로빈 서브유닛 델타 (Hemoglobin subunit delta: HBD), C4b-결합 단백질 알파 사슬 (C4b-binding protein alpha chain: C4BPA), 아트락틴 (Attractin: ATRN), 카르복시펩티다아제 서브유닛 2(Carboxypeptidase N subunit 2: CPN2), Ig 카파 사슬 V-I 영역 WEA(Ig kappa chain V-I region WEA: IGKV1-17), 보체 C1r 서브컴포넌트(Complement C1r subcomponent: C1R), 보체 C1q 서브컴포넌트 서브유닛 B(Complement C1q subcomponent subunit B: C1QB), 프로테오글리칸 4(Proteoglycan 4: PRG4), 헤모글로빈 서브유닛 알파(Hemoglobin subunit alpha: HBA1), 보체 C5(Complement C5: C5), 및 Ig 알파-1 사슬 C 영역(Ig alpha-1 chain C region: IGHA1)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
측정된 세포외 세포외 기질 단백질 1, 카르복시펩티다제 B2, 색소 상피 유도 인자, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3, 혈청 아밀로이드 A-1 단백질, 응고인자 X, 아포지질단백질, 및 알파 2 항플라스민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 낮은 경우, 및/또는 헤모글로빈 서브유닛 델타, C4b-결합 단백질 알파 사슬, 아트락틴, 카르복시펩티다아제 서브유닛 2, Ig 카파 사슬 V-I 영역 WEA, 보체 C1r 서브컴포넌트, 보체 C1q 서브컴포넌트 서브유닛 B, 프로테오글리칸 4, 헤모글로빈 서브유닛 알파, 보체 C5, 및 Ig 알파-1 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 높은 경우, 상기 개체를 심혈관계 질환의 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상기 개체를 콜레스테롤 유출능이 억제되어 심혈관계 질환의 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 카르복시펩티다제 B2 (Carboxypeptidase B2: CPB2), 헤모글로빈 서브유닛 델타(Hemoglobin subunit delta: HBD), 술프하이드릴 옥시다제 1(Sulfhydryl oxidase 1: QSOX1), 및 리포폴리사카리드 결합 단백질(Lipopolysaccharide-binding protein: LBP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
측정된 카르복시펩티다제 B2, 헤모글로빈 서브유닛 델타, 술프하이드릴 옥시다제 1 및 리포폴리사카리드 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 높은 경우, 상기 개체를 심혈관계 질환의 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상기 개체를 NO 생성이 증가되어 심혈관계 질환의 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 심혈관 질환은 콜레스테롤 유출능 감소로 유발된 것일 수 있다.
상기 방법은 술프하이드릴 옥시다제 1(Sulfhydryl oxidase 1: QSOX1), 혈소판 당단백질 Ib 알파 사슬(Platelet glycoprotein Ib alpha chain: GP1BA), 응고인자 XIII B 사슬(Coagulation factor XIII B chain: F13B), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3(Insulin-like growth factor-binding protein 3: IGFBP3), 콜레스테릴 에스테르 전이 단백질(Cholesteryl ester transfer protein: CETP), HLA 클래스 I 조직 적합 항원 A-24 알파 사슬(HLA class I histocompatibility antigen, A-24 alpha chain: HLA-A), 색소 상피 유도 인자 (pigment epithelium-derived factor: PEDF), 및 세포외 기질 단백질 1(Extracellular matrix protein 1: ECM1)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
측정된 술프하이드릴 옥시다제 1, 혈소판 당단백질 Ib 알파 사슬, 및 응고인자 XIII B 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 높은 경우, 및/또는 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3, 콜레스테릴 에스테르 전이 단백질, HLA 클래스 I 조직 적합 항원 A-24 알파 사슬, 색소 상피 유도 인자, 및 세포외 기질 단백질 1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 낮은 경우, 상기 개체를 심혈관계 질환의 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상기 개체를 혈관 세포 부착 단백질 -1(vascular cell adhesion protein-1: VCAM-1)의 발현이 증가되어 심혈관계 질환의 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 심혈관 질환은 VCAM-1 발현 증가로 유발된 것일 수 있다.
상기 개체의 심혈관 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 것은 심혈관 질환의 발병의 상대적인 위험을 예측 또는 진단하기 위한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 위험은 건강한 군 또는 정상인 군에 비하여 심혈관 질환의 발병 가능성이 증가되어 있는지를 예측 또는 진단하기 위한 것일 수 있다.
상기 심혈관 질환은 관상동맥질환, 말초혈관질환, 죽상경화성 심혈관질환, 및 뇌혈관질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 심혈관 질환은 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화, 죽상동맥경화, 고혈압, 심근경색 및 협심증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
다른 양상은 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 조절하는 제제를 유효성분으로 함유하는 심혈관 질환 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 및 혈청 아밀로이드 A-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 단백질의 발현 촉진제, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인체, 동물 또는 세포에서 발현되는 선형 DNA 또는 벡터의 형태인 것일 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현 벡터, 또는 재조합 바이러스 벡터, 예를 들면 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus: AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터, 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 벡터는 숙주에서 목적 단백질을 발현할 수 있는, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 구조체를 의미한다. 상기 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있고, 자가 복제하거나 숙주의 DNA에 통합되는 것일 수 있다. 상기 단백질의 발현 촉진제는, 상기 유전자 또는 단백질에 직접적 또는 간접적으로 작용하여, 상기 유전자 또는 단백질의 발현을 조절, 자극 또는 증가시키는 물질을 의미한다. 상기 물질은 유기 화합물, 무기 화합물, 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 단백질의 발현 촉진제는 상기 유전자의 전사 및/또는 번역을 증대 또는 촉진시키는 것일 수 있다.
상기 조성물은 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 억제제를 포함하는 것일 수 있다.
상기 유전자 또는 단백질의 발현 억제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA), 리보자임(ribozyme) 또는 이들의 조합인 것일 수 있다 또한, 상기 유전자 또는 단백질의 발현 억제제는는 상기 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머, 항체 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
예를 들면, 심혈관계 질환 의심 개체에 상기 인자의 항체 등을 투여한 후에, 고밀도 지단백의 기능을 측정하거나, 또는 동맥경화 여부를 진단하여, 심혈관계 질환이 호전되는 것을 확인할 수 있다.
"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질환 범위의 감소, 질환 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질환 상태의 개선, 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로) 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 질환의 발병율과 비교하여 질환의 발병율을 감소시키는 것일 수 있다. "예방"은 질환의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 상기 "심혈관계 질환의 발병을 치료 또는 예방"하는 것은 관상동맥질환, 말초혈관질환, 죽상경화성 심혈관질환, 및 뇌혈관질환을 감소 또는 억제하는 것일 수 있다. 상기 "심혈관계 질환의 발병을 치료 또는 예방"하는 것은 콜레스테롤 유출능을 증가시키는 것일 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 부형제는 미정질 셀룰로오스, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분 글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구, 예를 들면, 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내, 또는 이들의 조합에 투여를 목적으로 제조되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 주사가능한 형태로 사용되는 것일 수 있다.
다른 양상은 심혈관 질환 치료제 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 심혈관계 질환 의심 개체의 분리된 혈액, 세포, 또는 심혈관계 질환을 가진 동물 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 및 상기 피검 물질이 처리된 혈액, 세포, 또는 동물 모델에서 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 측정된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및 측정된 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 및 혈청 아밀로이드 A-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 높은 경우, 및/또는 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 낮은 경우, 상기 피검 물질을 심혈관 질환 치료제 후보 물질로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 피검 물질이 처리된 혈액, 세포 또는 심혈관계 질환을 가진 동물 모델에서 세포외 기질 단백질 1, 카르복시펩티다제 B2, 색소 상피 유도 인자, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3, 혈청 아밀로이드 A-1 단백질, 응고인자 X, 아포지질단백질, 알파 2 항플라스민, 헤모글로빈 서브유닛 델타, C4b-결합 단백질 알파 사슬, 아트락틴, 카르복시펩티다아제 서브유닛 2, Ig 카파 사슬 V-I 영역 WEA, 보체 C1r 서브컴포넌트, 보체 C1q 서브컴포넌트 서브유닛 B, 프로테오글리칸 4, 헤모글로빈 서브유닛 알파, 보체 C5, 및 Ig 알파-1 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 측정된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및 측정된 세포외 기질 단백질 1, 카르복시펩티다제 B2, 색소 상피 유도 인자, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3, 혈청 아밀로이드 A-1 단백질, 응고인자 X, 아포지질단백질, 및 알파 2 항플라스민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 높은 경우, 및/또는 헤모글로빈 서브유닛 델타, C4b-결합 단백질 알파 사슬, 아트락틴, 카르복시펩티다아제 서브유닛 2, Ig 카파 사슬 V-I 영역 WEA, 보체 C1r 서브컴포넌트, 보체 C1q 서브컴포넌트 서브유닛 B, 프로테오글리칸 4, 헤모글로빈 서브유닛 알파, 보체 C5, 및 Ig 알파-1 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 낮은 경우, 상기 피검 물질을 심혈관 질환 치료제 후보 물질로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상기 피검 물질을 콜레스테롤 유출을 촉진하는 후보 물질로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 피검 물질이 처리된 혈액, 세포 또는 심혈관계 질환을 가진 동물 모델에서 카르복시펩티다제 B2, 헤모글로빈 서브유닛 델타, 술프하이드릴 옥시다제 1, 및 리포폴리사카리드 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 측정된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및 측정된 카르복시펩티다제 B2, 헤모글로빈 서브유닛 델타, 술프하이드릴 옥시다제 1 및 리포폴리사카리드 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 낮은 경우, 상기 피검 물질을 심혈관 질환 치료제 후보 물질로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상기 피검 물질을 NO 생성을 억제하는 후보 물질로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 피검 물질이 처리된 혈액, 세포 또는 심혈관계 질환을 가진 동물 모델에서 술프하이드릴 옥시다제 1, 혈소판 당단백질 Ib 알파 사슬, 응고인자 XIII B 사슬, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3, 콜레스테릴 에스테르 전이 단백질, HLA 클래스 I 조직 적합 항원 A-24 알파 사슬, 색소 상피 유도 인자, 및 세포외 기질 단백질 1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 측정된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및 측정된 술프하이드릴 옥시다제 1, 혈소판 당단백질 Ib 알파 사슬, 및 응고인자 XIII B 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 낮은 경우, 및/또는 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3, 콜레스테릴 에스테르 전이 단백질, HLA 클래스 I 조직 적합 항원 A-24 알파 사슬, 색소 상피 유도 인자, 및 세포외 기질 단백질 1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 높은 경우, 상기 피검 물질을 심혈관 질환 치료제 후보 물질로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상기 피검 물질을 VCAM-1의 발현을 억제하는 후보 물질로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 피검 물질을 혈액, 또는 세포와 접촉시키는 단계, 또는 피검 물질을 동물 모델에 투여하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 피검 물질은 심혈관 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 것으로 예상되는 임의의 물질인 것일 수 있다. 상기 접촉은 선택되는 물질에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 상기 접촉은, 예를 들면, 피검 물질을 세포를 배양하는 동안에 첨가하는 것일 수 있고 또는 피검 물질을 포함하는 배지에서 세포를 배양하는 것일 수 있다. 상기 투여는, 예를 들면, 피검 물질을 동물 모델에 경구 또는 비경구로 가하는 것일 수 있다.
상기 혈액, 세포 또는 동물 모델은 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 혈액, 세포 또는 동물 모델은 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 정상적으로 또는 자연적으로 본래의 세포 내에 가지고 있거나 생산하는 것일 수 있다. 또는 상기 세포 또는 동물 모델은 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 것일 수 있다. 용어 "외인성 핵산"은 정상적으로 또는 자연적으로 본래의 세포 또는 동물 모델 내에 존재하거나 그에 의해 생산되지 않는 핵산을 의미하며, 세포에 도입(예를 들면, 전기 천공법, 형질 전환, 형질 감염, 리포펙션, 또는 그 외 핵산을 세포 내에 도입하는 방법)된 것일 수 있다.
상기 혈액은 개체로부터 분리된 시료 내에 포함되는 것일 수 있다. 상기 혈액은 고밀도 지단백을 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포는 개체로부터 분리된 시료 내에 포함되는 것 또는 세포주인 것일 수 있다. 상기 세포는 개체로부터 분리된 혈액, 혈청, 뇨, 대변, 타액, 눈물, 뇌척수액, 혈장 또는 다른 조직에 포함된 것일 수 있다. 상기 세포는 단핵구, 혈관내피세포 또는 대식세포인 것일 수 있다. 상기 세포는 심혈관 질환이 의심되는 개체, 예를 들면 심혈관 질환 환자로부터 유래된 면역 세포, 예를 들면 단핵구, 혈관내피세포 또는 대식세포인 것일 수 있다.
상기 방법은 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 분석하기 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 항원과 항체의 결합을 측정하면서 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 검출할 수 있는, 단백질 칩, 질량분석, 및 효소결합면역법 등을 이용하여 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 결정할 수 있다.
상기 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 및 혈청 아밀로이드 A-4는 콜레스테롤 유출능이 높은 고밀도 지단백에서 발현 수준이 높은 단백질로서, 고밀도 지단백의 콜레스테롤 유출을 촉진하는 것일 수 있다. 상기 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역은 콜레스테롤 유출능이 높은 고밀도 지단백에서 발현 수준이 낮은 단백질로서, 고밀도 지단백의 콜레스테롤 유출을 억제하는 것일 수 있다.
상기 대조군은, 피검 물질과 접촉되지 않은 대상, 피검 물질에서 유효 성분이 제외된 물질과 접촉된 대상, 또는 피검 물질에서 유효 성분을 용해시키는 용매와 접촉된 대상인 것일 수 있다. 상기 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 낮은 것은, 대조군에서 유전자 또는 단백질이 발현되는 수준에 비하여 낮은 것, 또는 발현되더라도 그 활성 수준이 대조군에서 단백질의 활성 수준에 비하여 낮은 것을 의미하는 것일 수 있다. 이는 단백질의 활성이 없는 것, 또는 단백질의 기능을 하지 못하는 것을 포함한다. 상기 발현 수준 또는 활성 수준은 대조군의 수준에 비하여 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 낮은 것일 수 있다. 상기 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군의 수준에 비하여 높은 것은, 대조군에서 유전자 또는 단백질이 발현되는 수준에 비하여 높은 것, 또는 발현되더라도 그 활성 수준이 대조군에서 단백질의 활성 수준에 비하여 높은 것을 의미하는 것일 수 있다. 상기 발현 수준 또는 활성 수준은 대조군의 수준에 비하여 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 높은 것일 수 있다.
심혈관 질환을 예방 또는 치료하기 위하여, 콜레스테롤 유출을 촉진하고, 및/또는 염증 유발성 인자의 발현을 억제할 수 있는 약물의 개발이 요구된다. 따라서 상기 심혈관 질환 치료제 후보 물질은 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 조절하는 것일 수 있다. 상기 심혈관 질환 치료제 후보 물질은 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 또는 혈청 아밀로이드 A-4의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 촉진시키고, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 또는 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 억제시켜, 혈장 내 콜레스테롤 유출을 촉진하는 것일 수 있다.
상기 피검 물질은, 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA: siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA: shRNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질, 기타 추출물, 천연물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 심혈관 질환은 관상동맥질환, 말초혈관질환, 죽상경화성 심혈관질환, 및 뇌혈관질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 심혈관 질환은 콜레스테롤 조절 이상에 의해 혈관이 좁아지는 질환인 것일 수 있다. 상기 심혈관 질환은 콜레스테롤 조절 이상으로 면역 세포와 염증 반응이 활성화되어 야기된 질환인 것일 수 있다. 상기 심혈관 질환은 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화, 죽상동맥경화, 고혈압, 심근경색 및 협심증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 혈청 아밀로이드 A-4, 보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 심혈관 질환 치료 표적으로 하여 단백질의 발현 수준을 측정함으로써, 심혈관 질환을 진단하고, 심혈관 질환의 치료제를 높은 신뢰도와 정확도로 스크리닝할 수 있다.
도 1은 각각 콜레스테롤 유출능, NO 생성능, 및 VCAM-1 발현이 높은 HDL 샘플 및 낮은 샘플을 젤에 로딩한 후 단백질을 분리한 이미지이다.
도 2는 각각의 파라미터의 최고 사분위수 및 최저 사분위수 수치를 갖는 풀링된 HDL 샘플에서 동정된 단백질의 수를 밴 다이어그램으로 나타낸 것이다.
도 3 내지 5는 각각 콜레스테롤 유출능, NO 생성능, 및 VCAM-1 발현과 유의도가 높은 HDL 관련 단백질을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 심혈관계 질환 환자에서 고밀도 지단백의 기능 및 염증과 관련된 단백질 분석
1. 연구 대상 선정, 고밀도 지단백 채취
(1) 연구 대상 선정
본 연구를 위하여 다양한 심혈관계 질환의 위험을 갖고 있는 48명의 환자를 모집하였다. 본 연구의 프로토콜은 세프란스 병원의 심의위원회로부터 승인받았으며, 모든 참가자로부터 서면으로 동의를 받았다. 심혈관 질환으로 진단받지 않은 환자의 경우, 스타틴(statin)를 투여받은 적이 없거나 또는 3개월 이상 지질 강하제(lipid-lowering agent)를 중단한 상태임을 확인하였다. 본 연구에 참가하기 전 3개월 이내에 급성 심혈관 또는 뇌혈관 질환, 비조절성 고혈압(uncontrolled hypertension) 또는 당뇨병(diabetes mellitus), 갑상선 기능부전(thyroid dysfunction), 혈청 트랜스 아미나제(transaminase) > 정상의 상한치의 2배, 혈청 크레아티닌(creatinine) > 1.5 mg/dL, 급성 또는 만성 감염 또는 염증, 또는 암 병력의 이력이 있는 환자는 제외되었다. 본 연구에 참가시에, 환자들과 인터뷰하여 병력에 대한 정보를 얻은 후, 실험적인 평가를 수행하였다.
(2) 혈액 샘플 채취 및 고밀도 지단백 분리
환자들은 혈액 샘플을 채취하기 전에, 12시간 이상 금식하고 금주 또는 금연하였다. 채취된 혈액 샘플은 4시간 이내에 분석되었다. 지질 수준은 한국 임상 시험 학회에서 인증된 자동 분석기를 사용하여 분석하였다.
고밀도 지단백은 울트라 원심분리를 이용하여 다음과 같이 분리하였다. 혈청 샘플 2 ㎖를 12 ㎖ 울트라 원심분리기 튜브(Polyallomer, Beckman Coulter Korea Ltd, Seoul, Korea)에 옮기고, 포타슘 브로미드(potassium bromide: KBr) 0.12 g 및 수크로스(sucrose) 0.045 g을 첨가하여 용해하였다. 이어서, 용액 B(증류수 1 ㎖, 소듐 클로리드(NaCl) 0.012 g, 및 KBr 0.135 g) 2 ㎖, 용액 A(증류수 1 ㎖, NaCl 0.012 g, 및 KBr 0.318 g) 4 ㎖, 및 증류수 4 ㎖를 순차적으로 첨가하였다. 울트라 원심분리를 Beckman 고정-앵글(angle) 로터(SW41Ti)가 장착된 Beckman Coulter XL-100K Table Top 울트라 원심분리기를 이용하여, 35,000 rpm으로, 18시간 동안 수행하였다. 그 다음, 초저밀도 지단백(very low-density lipoprotein: vLDL) 및 저밀도 지단백(low-density lipoprotein: LDL)이 포함된 상층액을 제거하여 고밀도 지단백을 흡인하였다. 분리된 고밀도 지단백을 Amicon 3k 울트라 원심분리 필터 장치(Merck Millipore Korea, Seoul, Korea)를 이용하여, 4에서, 3,000 rpm으로 원심분리하여 순차적으로 탈염하고 농축하였다.
2. 고밀도 지단백의 기능 및 염증과 관련된 단백질 분석
(1) 고밀도 지단백에서 콜레스테롤 유출능 분석
콜레스테롤 유출능 분석을 다음과 같이 수행하였다.
J774 세포를 플레이트에 분주하고, 2 μCi의 3H-콜레스테롤/㎖를 첨가하고 24간 동안 반응시켜 세포에 방사성 표지(radiolabling) 하였다. 아데노신 트리포스페이트-결합 카세트 트랜스포터 서브패밀리 멤버 A1(adenosine triphosphate-binding cassette transporter subfamily member A1: ABCA1)을 증가시키기 위하여, 세포를 0.2%의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA) 및 0.3 mM의 시클릭 아데노신 모노포스페이트를 함유하는 배지에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 0.2%의 BSA 및 고밀도 지단백을 함유하는 배지로 교체하고 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포에 2 ㎍/㎖의 아실-조효소 A: 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 억제제를 첨가하였다. 콜레스테롤 유출 비율은 하기 식을 이용하여 계산하였다.
콜레스테롤 유출능(Cholesterol efflux capacity)(%)=[고밀도 지단백을 함유하는 배지 중의 3H-콜레스테롤(μCi) / 고밀도 지단백을 함유하는 배지 중의 3H-콜레스테롤 {μCi} + 세포 중의 3H-콜레스테롤 {μCi}의 μCi] x 100. 수치들을 각각의 플레이트에서 풀링된 혈청의 유출능에 기초하여 조정하였다. 모든 시료에 대하여 2회 이상 반복 실험하였다.
(2) 고밀도 지단백에서 산화질소 생성 분석
내피(endothelial)의 산화 질소(nitric oxide: NO)의 생성은 다음과 같이 분석하였다.
인간 제대 정맥 내피 세포(umbilical vein endothelial cell)를 Lnza에서 구입하고(Basel, Switzerland), 세포가 90%의 컨플루언시(confluency)에 도달할 때까지 증식시킨 후, 무혈청 배지에서 밤새 배양하였다. 50 ㎍/㎖의 고밀도 지단백을 가한 후, 세포를 세척하고 5 mM의 Tris 버퍼로 용해하였다. 세포 용해물을 원심분리한 후, 상층액을 Amicon 10 kDa-컷오프(cut off) 필터 튜브에 옮겼다. 그 다음, 추가로 원심분리하고, 통과액(flow-through)을 수집하고, 아질산염(nitrite)의 수준을 제조사의 지시에 따라 키트를 이용하여 측정하였다(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA).
(3) 고밀도 지단백에서 혈관 세포 부착 인자-1(vascular cell adhesion molecule-1: VCAM - 1)의 발현 분석
VCAM-1의 수준은 웨스턴 블롯(western blotting)으로 측정하였다. 인간 제대 정맥 내피 세포를 증식시키고, 50 ㎍/㎖의 고밀도 지단백을 가하고 18시간 인큐베이션 한 후, 종양 괴사 인자-α(tumour necrosis factor-α: TNF-α)를 가하고 5시간 동안 인큐베이션하였다(Han, Biochim Biophys Acta 2013). 이어서, 세포를 세척하고, 프로테아제 억제제 칵테일(Roche Applied Science, Penzberg, Germany)을 함유하는 방사성면역침전 분석 버퍼(radioimmunopreipitation assay buffer)로 용해하였다. 이어서, 세포 용해물 상층액의 총 단백질 농도를 측정하고, 단백질 7 ㎍을 10%의 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel)에 로딩한 후, 전기영동하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 이동시키고, 상기 막을 항-VCAM-1(Abcam, Cambridge, MA, USA) 및 마우스 항-β-액틴 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)와 인큐베이션시켰다. 단백질 백드를 SuperSignal West Pico 화학발광 기질(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 가시화하고, 밴드의 강도를 ImageJ 소프트웨어(National Institute of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량하였다. VCAM-1의 발현을 β-액틴의 강도로 정규화하고, 고밀도 지단백을 가한 세포의 발현 수준을 고밀도 지단백을 가하지 않은 세포에서의 수준에 대한 퍼센트로 나타내었다.
(4) 질량 분석을 위한 샘플 준비 및 젤 내 분해(In-gel digestion)
프로테옴 분석을 위해, 고밀도 지단백 샘플을 콜레스테롤 유출능, NO 생성, 및 VCAM-1 발현의 최대 및 최저 사분위수(quartile)에 따라, 각각의 파라미터의 수준이 높은 HDL 샘플 및 낮은 HDL 샘플로 나누고, 동일한 양으로 풀링(pooling)하였다. 질량 분석을 수행하기 전에, 풀링된 고밀도 지단백 샘플 각각에서 80 ㎍을 NuPAGE 젤(4 내지 12%의 Bis-Tris 겔, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 분자량에 따라 분리하였다. 이 때, 동일한 젤에 고밀도 지단백 샘플을 3회 로딩하여 분자량에 따라 분리하였다. 젤을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brillant Blue R-250)로 염색하였다. 풀링된 각각의 고밀도 지단백 샘플에 대하여, 염색된 젤을 20개의 조각(slice)으로 나누고, 각각의 젤 조각을 마이크로 원심분리 튜브에 옮겼다. 각각의 겔 조각에 함유된 단백질을 암 환경에서 환원 및 알킬화시키고, 트립신으로 밤새 분해하였다. 이어서, 67%의 아세토니트릴(acetonitrile: ACN) / 5%의 포름산(formic acid: FA)(Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan) 용액에서 펩티드를 추출하고 Speedvac에서 건조시킨 후 재현탁하였다.
(5) 질량 스펙트럼 분석
(4)에서 수득한 각각의 샘플 10 ㎕를 Eksigent MDLC 시스템(Eksigent Technologies Dublin, CA, USA) 상에서 역상 Magic C18AQ 컬럼(15 cm X 75 μm)에 주입하였다. 상기 컬럼을 95%의 버퍼 A(0.2%의 포름산을 함유하는 100%의 물)와 5%의 버퍼 B(0.2%의 포름산을 함유하는 100%의 ACN)를 혼합한 버퍼로 평형화시켰다. 작업 유속은 다음의 구배 조건에서 300 nL/분(min)으로 하였다: 0분 92% 버퍼 A 및 8% 버퍼 B, 0 내지 60분 8 내지 30 % B, 60 내지 70분 30 내지 40% B, 70 내지 75분 40 내지 80% B, 75 내지 80분 80% B, 80 내지 87분 80 내지 5% B, 87 내지 93분 5 내지 80% B, 93 내지 100분 80 내지 5% B, 100 내지 110분 5% B. 나노 HPLC 시스템을 LTQ XL-Orbitrap 질량 스펙트로미터(Thermo Scientific, San Jose, CA, USA)에 장착하였다. 분무 전압(spray voltage)은 2.0 kV로 설정하였으며, 가열된 모세관의 온도는 250 ℃로 설정하였다. 조사 전체-스캔 MS 스펙트라(Survey full-scan MS spectra)(300 내지 2,000 m/z)를 1 마이크로스캔(microscan) 및 100,000의 해상도(resolution)로 수득하여, 선도물질(precursor)을 선별하고 전하 상태 측정을 위한 미리보기 모드를 설정하였다. 미리보기 조사 스캔로부터 10 개의 가장 강력한 이온에 대한 MS/MS 스펙트라를 하기와 같은 옵션으로 전체 스캔에 대한 이온 트랩에서 수득하였다: 분리 간격(isolation width), 2 m/z(질량 대 전하); 표준화된 충돌 에너지(collision energy), 35%; 동적 배제 시간(dynamic exclusion duration), 240 초(sec). + 1 전하 및 전하 상태가 정해지지 않은 선도 물질은 데이터 종속(data-dependent)적으로 수득하는 동안 폐기하였다. 동적 배제의 반복 수는 1, 배제 시간은 4분, 및 반복 시간은 45초(s)로 설정하였다.
각각의 LC-MS/MS 파일을 프로테옴 Discoverer 1.4의 Sequest 알고리즘(Thermo Scientific Inc., San Jose, CA, USA)을 이용하여 분석하였다. MS 및 MS/MS 데이터를 20121과 SwissProt 인간 데이터 베이스(August 2016)와 비교 조사하였다. 조사는 두개의 미절단(missed cleavages) 트립신 분해된 펩티드(triptic peptide)를 허용하는 것으로 제한하였다. 시스테인(cysteine)의 카르보아미도메틸화(carboamidomethylation)를 고정된 수식화(+57.021 Da)로, 메티오닌 산화를 유동형 수식화(+15.995 Da)로 설정하였다. 질량 허용 범위(mass tolerance)를 MS/MS 데이터에 대하여 0.5 Da 및 MS 데이터에 대하여 15 ppm로 설정하였다. 펩티드 지정에 사용된 기준은 다음과 같다 : 1 내지 8 범위의 각각의 전하 상태에 대한 최소 XCorr 수치는 각각 1.50, 2.0, 2.25, 2.5, 2.75, 3.0, 3.2, 및 3.4이었다. 디코이(decoy) 데이터 베이스 조사를 위한 총 두개의 목표 수치, 0.01의 엄격한 오류 발견 비율(False Discovery Rate: FDR)과 0.05의 완화된 FDR을 적용하였다. 모든 단백질은 2개 이상의 일치하는 펩티드를 이용하여 동정하였다.
(6) 라벨 프리( Label-free) 정량 분석
콜레스테롤 유출능, NO 생성, 및 VCAM-1 발현에 있어서 가장 높은 사분위수 수치와 가장 낮은 사분위수 수치를 보여주는 HDL 샘플에 존재하는 단백질들의 상대적인 존재량을 표준화된 스펙트럼 존재 인자(normalized spectral abundance factor: NSAF)에 기초하여 계산하였다. 프로테옴 Discoverer 1.4 소프트웨어(Thermo Scientific Inc., San Jose, CA, USA)를 사용하여 스펙트럼 수(단백질과 일치하는 MS/MS 스펙트럼의 수)를 추출하였다. 이어서, 각각의 단백질에 대한 NSAF를 다음의 수식으로 계산하였다:
(NSAF) k =
Figure 112017092987063-pat00001
단백질 k(SpC)의 펩티드와 일치하는 MS/MS 스펙트럼의 총 수를 단백질의 길이(L)로 나눈 다음, 모든 N 단백질에 대한 SpC/L 의 합으로 나누었다. NSAF를 계산하기 전에, 동정된 단백질을 두 기준을 사용하여 분류하였다; 총 스펙트럼 수(단백질에 매칭된 MS/MS 스펙트럼의 수)가 6 이상이고, 적어도 최고 또는 최저 사분위수 샘플에서 반복적으로 존재하는 단백질만을 선별하였다. 그 다음, 단백질이 존재하지 않거나 또는 검출 한계 이하인 경우에도, 영점(null) 수치를 보상하고 최고 및 최저 사분위수 수치를 갖는 풀링된 샘플 사이의 배수 차이를 계산하기 위하여 모든 스펙트럼 카운트에 0.5의 수치를 더하였다. 통계적인 유의성은 각각의 파라미터의 가장 높은 사분위수 수치와 가장 낮은 사분위수 수치의 3회 반복으로부터 얻은 NSAF 수치에 대하여 student t-테스트를 사용하여 결정하였다. P 수치가 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
(7) 환자의 임상적인 특징과 콜레스테롤 유출능 , NO 생성 및 VCAM -1 발현과의 연관성 분석
연구 대상의 인구 통계학적 데이터를 표 1에 나타내었다. 48명의 환자 중 34명(71%)은 남성이며, 환자의 연령은 30 내지 80세이었다. 평균 HDL-C 수준은 45.7 ± 13.2 mg/dL이었고, 반면 평균 LDL-C 수준은 127 ± 32 mg/dL이었다. 콜레스테롤 유출의 가장 높은 4 분위수 값을 가진 환자는 연령이 비교적 낮았으며, 가장 낮은 4 분위수 수치를 갖은 환자보다 더 높은 총 콜레스테롤 수치와 LDL-C 수치를 보였다. NO 생성과 VCAM-1 발현에 있어서, 가장 높은 수치와 낮은 수치를 가진 환자들간에, 임상적인 특징과 지질 프로파일 사이에 유의한 차이는 없었다.
콜레스테롤 유출능 산화 질소(NO) 생성 혈관 세포 부착 분자(VCAM-1) 발현
높음
(n=12)		 낮음
(n=12)		 p 높음
(n=11)		 낮음
(n=11)		 p 높음
(n=8)		 낮음
(n=8)		 p
연령 53.9 ± 9.8 61.2 ± 7.0 0.046 58.1 ± 7.9 56.4 ± 12.6 0.70 57.0 ± 13.3 55.0 ± 10.7 0.75
남성 7(58) 8(67) 1.00 6(55) 10(91) 0.15 4(50) 8(100) 0.08
병력
고혈압 8(67) 3(25) 0.10 6(55) 6(55) 1.00 4(50) 4(50) 1.00
당뇨병 1(8) 0(0) 1.00 1(9) 2(18) 1.00 0(0) 0(0) 1.00
고콜레스테롤혈증
(Hypercholesterolemia)		 3(25) 0(0) 1.00 2(18) 2(18) 1.00 1(13) 2(25) 1.00
흡연 3(25) 2(17) 1.00 3(27) 5(46) 1.00 0(0) 4(50) 0.08
관상동맥질환 2(17) 9(75) 0.01 4(36) 3(27) 1.00 2(25) 5(63) 0.31
수치(mg/dL)
총 콜레스테롤 227 ± 42 192 ± 30 0.04 227 ± 41 208 ± 35 0.27 202 ± 37 225 ± 48 0.32
중성지방
(Triglyceride: TG)		 186
(111, 259)		 180
(101, 212)		 0.42 177
(95, 257)		 184
(155, 235)		 0.75 148
(112,
200)		 169
(113,
432)		 0.42
고밀도지단백 콜레스테롤
(HDL-C)		 48.0
(38.5, 52.5)		 43.7
(40.0, 49.0)		 0.34 48.0
(43.0, 56.0)		 36.0
(32.5, 46.2)		 0.12 54.0
(44.7, 54.5)		 45.5
(38.0,
50.0)		 0.12
저밀도지단백 콜레스테롤
(LDL-C)		 141 ± 33 114 ± 28 0.047 133 ± 36 131 ± 33 0.89 121 ± 29 127 ± 46 0.78
변수는 중간 수치(25번째 백분위수, 75번째 백분위수) 또는 수(%)로 표시하였음.
(8) 콜레스테롤 유출능 , NO 생성 및 VCAM -1 발현과 관련된 HDL 단백질의 동정
도 1은 각각 콜레스테롤 유출능, NO 생성능, 및 VCAM-1 발현이 높은 HDL 샘플 및 낮은 샘플을 젤에 로딩한 후 단백질을 분리한 이미지이다. 염색된 단백질 밴드에 대한 인-젤(in-gel) 트립신 분해 분석을 수행하여 단백질을 동정하였다. 추출된 펩타이드의 질량 스펙트럼 분석으로부터, 각각의 풀링된 HDL 샘플에서 총 213, 184 및 199 종의 단백질을 동정하였다. 도 2는 각각의 파라미터의 최고 사분위수 및 최저 사분위수 수치를 갖는 풀링된 HDL 샘플에서 동정된 단백질의 수를 밴 다이어그램으로 나타낸 것이다.
(9) 콜레스테롤 유출능과 관련된 HDL 단백질 분석
스펙트럼 계수에 근거한 라벨 프리 정량 분석을 수행하여, 기능적 파라미터에서 높은 수치를 갖는 샘플에서 차별적으로 발현된 HDL 관련 단백질을 동정하였다. 도 3은 콜레스테롤 유출능과 유의도가 높은 HDL 관련 단백질을 나타낸 것이다(p <0.05). 도 3에서 순위는 NSAF 비율로 결정하였다. 또한, 콜레스테롤 유출능과 관련된 HDL 샘플에서 차별적으로 발현된 단백질을 표 2에 나열하였다(상대적 존재 비율이 ≥2 또는 ≤0.5). 차별적으로 발현된 모든 단백질의 상대 존재 비율 및 스펙트럼 수를 하기 표 3에 나열하였다. 표에 나열된 단백질의 기능적 범주는 표 4에 나열하였다. 표 2 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 가장 낮은 4 분위수 수치을 가진 HDL과 비교했을 때, 가장 높은 4분위수 수치의 콜레스테롤 유출능을 갖는 HDL에서 통계적으로 27 종의 단백질은 존재량이 많았으며, 33종의 단백질은 존재량이 상대적으로 적었다. 14종의 단백질은 2 이상의 상대적 존재 비율을 나타내었다. 다중 검사를 통하여 p 수치를 조정한 경우, 6종의 단백질만이 기준에 부합하였다: 티록신 결합 글로불린(thyroxine binding globulin), 알파-1B-당단백질(alpha-1B-glycoprotein, plasma serine protease inhibitor), 비트로넥틴(vitronectin), 안지오텐시노겐(angiotensinogen), 및 혈청 아밀로이드 A-4(serum amyloid A-4: SAA4). 반대로, 14 종의 단백질은 0.5 이하의 상대적인 존재 비율을 나타내었다. 다중 검사를 통하여 p 수치를 조정한 경우, 3종의 단백질만이 기준에 부합하였다: 보체 C4-A(complement C4-A), 알파-2 매크로글로불린(alpha-2 macroglobulin), 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역(immunoglobulin mu chain C region). 표 4에 나타낸 바와 같이, 높은 콜레스테롤 유출능을 가진 HDL에서 존재량이 많은 단백질을 기능적 범주에 따라 분류한 결과, 다수의 단백질은 "지질 대사(lipid metabolism)"와 관련되어 있었다. 동일한 HDL 샘플에서 상대적으로 존재량이 적은 단백질은 "면역성(immunity)"와 관련되어 있었다.
유전자
명칭		 단백질 설명(Protein description) NSAF 비율 P 수치 조정된 P 수치
높은 콜레스테롤 유출능을 갖는 HDL에 많은 양으로 존재하는 단백질
(Proteins more abundant in HDL with high cholesterol efflux capacity)
ECM1 Extracellular matrix protein 1 38.05 0.01 0.07
CPB2 Carboxypeptidase B2 9.37 0.03 0.13
SERPINF1 Pigment epithelium-derived factor 9.03 0.02 0.12
IGFBP3 Insulin-like growth factor-binding protein 3 7.22 0.01 0.07
SERPINA7 Thyroxine-binding globulin 7.22 0.001 0.03
SAA1 Serum amyloid A-1 protein 6.78 0.02 0.12
A1BG Alpha-1B-glycoprotein 5.06 0.002 0.048
SERPINA5 Plasma serine protease inhibitor 3.94 0.003 0.045
F10 Coagulation factor X 3.60 0.03 0.14
VTN Vitronectin 3.29 0.01 0.048
LPA Apolipoprotein(a) 2.63 0.01 0.054
AGT Angiotensinogen 2.51 0.002 0.03
SAA4 Serum amyloid A-4 protein 2.32 0.004 0.048
SERPINF2 Alpha-2-antiplasmin 2.09 0.01 0.053
높은 콜레스테롤 유출능을 갖는 HDL에 적은 양으로 존재하는 단백질
(Proteins less abundant in HDL with high cholesterol efflux capacity)
C4A Complement C4-A <0.001 <0.001 0.03
A2M Alpha-2-macroglobulin 0.02 0.003 0.044
HBD Hemoglobin subunit delta 0.02 0.01 0.053
C4BPA C4b-binding protein alpha chain 0.07 0.04 0.15
ATRN Attractin 0.10 0.004 0.052
CPN2 Carboxypeptidase N subunit 2 0.13 0.01 0.06
IGKV1-17 Ig kappa chain V-I region WEA 0.17 0.02 0.11
IGHM Ig mu chain C region 0.20 0.002 0.048
C1R Complement C1r subcomponent 0.23 0.02 0.11
C1QB Complement C1q subcomponent subunit B 0.34 0.01 0.054
PRG4 Proteoglycan 4 0.39 0.04 0.15
HBA1 Hemoglobin subunit alpha 0.43 0.02 0.08
C5 Complement C5 0.44 0.02 0.11
IGHA1 Ig alpha-1 chain C region 0.45 0.01 0.09
Uniprot 접근
번호		 유전자
명칭		 단백질 설명 스펙트럼 수
(highest)		 스펙트럼 수
(lowest)		 NSAF
비율		 p
(1) (2) (3) (1) (2) (3)
P02763 ORM1 Alpha-1-acid glycoprotein 1 33 29 35 25 22 26 1.49 0.004
P01009 SERPINA1 Alpha-1-antitrypsin 293 291 292 384 358 342 0.91 0.03
P04217 A1BG Alpha-1B-glycoprotein 201 200 251 43 63 38 5.06 0.002
P08697 SERPINF2 Alpha-2-antiplasmin 51 42 57 21 31 28 2.09 0.01
P01023 A2M Alpha-2-macroglobulin 6 6 8 410 369 426 0.02 0.003
P01019 AGT Angiotensinogen 97 94 101 37 48 45 2.51 0.002
P02647 APOA1 Apolipoprotein A-I 708 700 678 633 591 597 1.29 0.004
P06727 APOA4 Apolipoprotein A-IV 162 188 164 141 130 133 1.44 0.04
P02656 APOC3 Apolipoprotein C-III 51 47 50 36 39 29 1.60 0.01
P05090 APOD Apolipoprotein D 128 132 130 97 99 101 1.48 <0.001
P02649 APOE Apolipoprotein E 454 431 433 275 321 270 1.72 0.001
O14791 APOL1 Apolipoprotein L1 116 122 148 89 90 77 1.70 0.02
P08519 LPA Apolipoprotein(a) 78 76 101 26 38 44 2.63 0.01
O75882 ATRN Attractin 0 0 0 5 6 5 0.10 0.004
P04003 C4BPA C4b-binding protein alpha chain 0 0 0 11 6 6 0.07 0.04
Q96IY4 CPB2 Carboxypeptidase B2 3 3 5 0 0 0 9.37 0.03
P22792 CPN2 Carboxypeptidase N subunit 2 0 0 4 13 19 13 0.13 0.01
P00450 CP Ceruloplasmin 110 122 177 248 255 267 0.60 0.03
P00742 F10 Coagulation factor X 16 19 26 6 5 7 3.60 0.03
P02746 C1QB Complement C1q subcomponent subunit B 12 7 4 26 30 23 0.34 0.01
P00736 C1R Complement C1r subcomponent 6 5 10 44 37 26 0.23 0.02
P0C0L4 C4A Complement C4-A 0 0 0 641 629 607 <0.001 <0.001
P0C0L5 C4B Complement C4-B 321 331 379 649 633 615 0.61 0.01
P01031 C5 Complement C5 39 37 68 127 125 122 0.44 0.02
P13671 C6 Complement component C6 84 57 67 52 35 37 1.88 0.03
P07360 C8G Complement component C8 gamma chain 28 32 20 55 46 42 0.64 0.04
Q16610 ECM1 Extracellular matrix protein 1 15 19 15 0 0 0 38.05 0.01
P02751 FN1 Fibronectin 117 103 124 263 229 273 0.51 0.01
P00738 HP Haptoglobin 99 119 105 237 207 211 0.56 0.001
P00739 HPR Haptoglobin-related protein 53 54 55 109 113 97 0.58 0.01
P69905 HBA1 Hemoglobin subunit alpha 13 13 12 36 29 38 0.43 0.02
P68871 HBB Hemoglobin subunit beta 20 23 15 36 41 51 0.52 0.03
P02042 HBD Hemoglobin subunit delta 0 0 0 24 27 31 0.02 0.01
P01876 IGHA1 Ig alpha-1 chain C region 27 24 28 77 64 59 0.45 0.01
P01857 IGHG1 Ig gamma-1 chain C region 283 268 278 422 402 400 0.76 <0.001
P01859 IGHG2 Ig gamma-2 chain C region 133 103 121 210 242 242 0.58 0.01
P01860 IGHG3 Ig gamma-3 chain C region 129 108 122 187 229 199 0.66 0.02
P01861 IGHG4 Ig gamma-4 chain C region 136 110 122 195 182 217 0.70 0.02
P01766 IGHV3-13 Ig heavy chain V-III region BRO 38 36 39 63 60 55 0.72 0.01
P01765 IGHV3-23 Ig heavy chain V-III region TIL 18 15 16 35 33 34 0.55 <0.001
P01834 IGKC Ig kappa chain C region 246 246 222 396 374 390 0.70 0.002
P01610 IGKV1-17 Ig kappa chain V-I region WEA 0 6 0 13 22 15 0.17 0.02
P01871 IGHM Ig mu chain C region 3 3 3 20 20 17 0.20 0.01
B9A064 IGLL5 Immunoglobulin lambda-like polypeptide 5 96 84 95 133 133 126 0.79 0.01
P17936 IGFBP3 Insulin-like growth factor-binding protein 3 11 6 10 3 0 0 7.22 0.01
P35858 IGFALS Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit 100 76 80 141 130 152 0.68 0.02
Q14624 ITIH4 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 269 245 328 205 204 186 1.59 0.04
P36955 SERPINF1 Pigment epithelium-derived factor 47 62 78 7 7 8 9.03 0.02
P05154 SERPINA5 Plasma serine protease inhibitor 19 15 15 6 4 3 3.94 0.003
P00747 PLG Plasminogen 222 222 266 203 189 175 1.41 0.02
Q9UK55 SERPINA10 Protein Z-dependent protease inhibitor 27 23 26 14 21 14 1.73 0.02
Q92954 PRG4 Proteoglycan 4 8 6 4 13 20 22 0.39 0.04
P02787 TF Serotransferrin 634 600 695 936 934 876 0.79 0.01
P0DJI8 SAA1 Serum amyloid A-1 protein 10 16 11 3 2 0 6.78 0.02
P35542 SAA4 Serum amyloid A-4 protein 147 165 172 76 58 100 2.32 0.004
P02743 APCS Serum amyloid P-component 11 9 12 28 19 22 0.54 0.04
P27169 PON1 Serum paraoxonase/arylesterase 1 74 75 75 70 72 69 1.20 0.002
P05543 SERPINA7 Thyroxine-binding globulin 16 13 17 4 2 0 7.22 0.001
P07225 PROS1 Vitamin K-dependent protein S 13 14 15 14 11 13 1.24 0.04
P04004 VTN Vitronectin 127 96 127 47 40 32 3.29 0.01
P 수치는 세번의 반복 실험에 대한 Student’s t-테스트에 의해 얻어졌음.
높은 콜레스테롤 유출능을 갖는 HDL에서 많은 단백질 기능적인 범주
약어 단백질 명칭 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ECM1 Extracellular matrix protein 1 o
CPB2 Carboxypeptidase B2 o
SERPINF1 Pigment epithelium-derived factor o
IGFBP3 Insulin-like growth factor-binding protein 3 o
SERPINA7 Thyroxine-binding globulin o
SAA1 Serum amyloid A-1 protein o
A1BG Alpha-1B-glycoprotein o
SERPINA5 Plasma serine protease inhibitor o
F10 Coagulation factor X o
VTN Vitronectin o
LPA Apolipoprotein(a) o
AGT Angiotensinogen o
SAA4 Serum amyloid A-4 o
SERPINF2 Alpha-2-antiplasmin o o
C6 Complement component C6 o
SERPINA10 Protein Z-dependent protease inhibitor o
APOE Apolipoprotein E o
APOL1 Apolipoprotein L1 o
APOC3 Apolipoprotein C-III o
ITIH4 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 o
ORM1 Alpha-1-acid glycoprotein 1 o o
APOD Apolipoprotein D o
APOA4 Apolipoprotein A-IV o o
PLG Plasminogen o o
APOA1 Apolipoprotein A-I o
PROS1 Vitamin K-dependent protein S o
PON1 Serum paraoxonase/arylesterase 1 o
높은 콜레스테롤 유출능을 갖는 HDL에서 적은 단백질 기능적인 범주
SERPINA1 Alpha-1-antitrypsin o
TF Serotransferrin o
IGLL5 Ig lambda like polypeptide 5 o
IGHG1 Ig gamma-1 chain C region o
IGHV3-13 Ig heavy chain V-III region BRO o
IGHG4 Ig gamma-4 chain C region o
IGKC Ig kappa chain C region o
IGFALS Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit o
IGHG3 Ig gamma-3 chain C region o
C8G Complement component C8 gamma chain o
C4B Complement C4-B o
CP Ceruloplasmin o
IGHG2 Ig gamma-2 chain C region o
HPR Haptoglobin-related protein o
HP Haptoglobin o
IGHV3-23 Ig heavy chain V-III region TIL o
APCS Serum amyloid P-component o
HBB Hemoglobin subunit beta o
FN1 Fibronectin o
IGHA1 Ig alpha-1 chain C region o
C5 Complement C5 o
HBA1 Hemoglobin subunit alpha o
PRG4 Proteoglycan 4 o
C1QB Complement C1q subcomponent subunit B o
C1R Complement C1r o
IGHM Ig mu chain C region o
IGKV1-17 Ig kappa chain V-I region WEA o
CPN2 Carboxypeptidase N subunit 2 o
ATRN Attractin o
C4BPA C4b-binding protein alpha chain o
HBD Hemoglobin subunit delta o
A2M Alpha-2-macroglobulin o
C4A Complement C4-A o
기능적인 범주: 1: 지질 대사 ; 2: 지혈 ; 3: 면역성 ; 4: 금속 결합 ; 5: 비타민 또는 호르몬 수송; 6: 급성 상 반응 ; 7: 단백질 분해 ; 8: 보체 ; 9: 기타 또는 알 수 없음
(9) NO 생성과 관련된 HDL 단백질 분석
도 4는 NO 생성과 유의도가 높은 HDL 관련 단백질을 나타낸 것이다(p <0.05). 도 4에서 순위는 NSAF 비율로 결정하였다. 19종의 단백질은 NO 생성의 높은 사분위수를 갖는 HDL에서 통계적으로 존재량이 많았으며, 7종의 단백질은 존재량이 상대적으로 적었다. 표 5 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 4종의 단백질은 상대적으로 존재 비율이 2 이상이었다. 반면, 상대적 존재 비율이 0.5 미만인 단백질들은 확인되지 않았다. 다중 검사를 통하여 p 수치를 조정한 경우, 기준에 부합하는 단백질은 확인되지 않았다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 높은 NO 생성을 갖는 HDL에서 존재량이 많거나 또는 적은 단백질의 기능적 범주는 다양하게 나타났다.
유전자 명칭 단백질 설명 NSAF 비율 P 수치 조정된
P 수치
높은 NO 생성능을 갖는 HDL에 많은 양으로 존재하는 단백질
(Proteins more abundant in HDL with high NO production)
CPB2 Carboxypeptidase B2 6.34 0.04 0.27
HBD Hemoglobin subunit delta 4.90 0.03 0.26
QSOX1 Sulfhydryl oxidase 1 4.52 0.03 0.26
LBP Lipopolysaccharide-binding protein 2.78 0.002 0.13
Uniprot 접근
번호		 유전자
명칭		 단백질 설명 스펙트럼 수
(highest)		 스펙트럼 수
(lowest)		 NSAF 비율 P
(1) (2) (3) (1) (2) (3)
P04217 A1BG Alpha-1B-glycoprotein 183 187 176 88 77 113 1.77 0.01
P01019 AGT Angiotensinogen 65 58 64 43 44 49 1.24 0.01
P01008 SERPINC1 Antithrombin-III 93 100 85 54 48 59 1.56 0.01
P02652 APOA2 Apolipoprotein A-II 34 35 39 49 50 60 0.62 0.02
P05090 APOD Apolipoprotein D 69 75 78 78 88 88 0.79 0.02
P02649 APOE Apolipoprotein E 395 409 422 316 342 328 1.13 0.02
P08519 LPA Apolipoprotein(a) 82 82 79 56 60 66 1.21 0.03
P02749 APOH Beta-2-glycoprotein 1 47 45 49 55 50 59 0.78 0.04
Q96IY4 CPB2 Carboxypeptidase B2 4 3 2 0 0 0 6.34 0.04
P0C0L5 C4B Complement C4-B 280 265 267 224 222 206 1.13 0.02
P13671 C6 Complement component C6 69 76 80 34 30 40 1.94 0.001
P00738 HP Haptoglobin 138 145 155 74 86 95 1.55 0.01
P68871 HBB Hemoglobin subunit beta 23 28 30 18 17 14 1.48 0.03
P02042 HBD Hemoglobin subunit delta 15 15 20 0 0 8 4.90 0.03
P35858 IGFALS Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit 90 91 107 125 119 128 0.70 0.01
P19827 ITIH1 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 217 223 245 230 258 234 0.86 0.04
P19823 ITIH2 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 210 228 229 241 223 227 0.87 0.03
Q14624 ITIH4 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 282 273 299 205 201 203 1.27 0.01
P18428 LBP Lipopolysaccharide-binding protein 12 13 15 4 3 5 2.78 0.002
P36955 SERPINF1 Pigment epithelium-derived factor 65 49 49 26 28 28 1.78 0.04
P00747 PLG Plasminogen 270 265 243 165 143 169 1.48 0.003
P00734 F2 Prothrombin 116 106 103 68 73 74 1.37 0.01
P02787 TF Serotransferrin 546 533 552 535 565 567 0.89 0.02
O00391 QSOX1 Sulfhydryl oxidase 1 15 15 11 0 0 7 4.52 0.03
P05543 SERPINA7 Thyroxine-binding globulin 18 13 20 9 6 8 1.94 0.03
P04004 VTN Vitronectin 114 115 120 74 65 76 1.47 0.01
높은 NO 생성을 갖는 HDL에서 많은 단백질 기능적인 범주
약어 단백질 명칭 1 2 3 4 5 6 7 8 9
CPB2 Carboxypeptidase B2 o
HBD Hemoglobin subunit delta o
QSOX1 Sulfhydryl oxidase 1 o
LBP Lipopolysaccharide-binding protein o o
C6 Complement component C6 o
SERPINA7 Thyroxine-binding globulin o
SERPINF1 Pigment epithelium-derived factor o
A1BG Alpha-1B-glycoprotein o
SERPINC1 Antithrombin-III o o
HP Haptoglobin o
HBB Hemoglobin subunit beta o
PLG Plasminogen o o
VTN Vitronectin o
F2 Prothrombin o o
ITIH4 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 o
AGT Angiotensinogen o
LPA Apolipoprotein(a) o
C4B Complement C4-B o
APOE Apolipoprotein E o
높은 NO 생성을 갖는 HDL에서 적은 단백질 기능적인 범주
TF Serotransferrin o
ITIH2 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 o
ITIH1 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 o
APOD Apolipoprotein D o
APOH Beta-2-glycoprotein 1 o
IGFALS Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit o
APOA2 Apolipoprotein A-II o
(10) VCAM -1 발현과 관련된 HDL 단백질의 분석
도 5는 VCAM-1 발현과 유의도가 높은 HDL 관련 단백질을 나타낸 것이다(p <0.05). 도 5에서 순위는 NSAF 비율로 결정하였다. VCAM-1 발현의 높은 사분위수를 갖는 HDL에서, 15종의 단백질은 통계적으로 존재량이 많았다. 표 8 및 표 9에 나타낸 바와 같이, 3종의 단백질은 상대적으로 존재 비율이 2 이상이었다. 6종의 단백질은 상대적으로 존재 비율이 0.5 미만이었다. 다중 검사를 통하여 p 수치를 조정한 경우, 기준에 부합하는 단백질은 확인되지 않았다. 표 10에 나타낸 바와 같이, 높은 VCAM-1 발현을 나타내는 HDL에서 존재량이 많은 단백질들을 기능적인 범주로 분류하였을 때, 다수의 단백질은 "면역성"와 관련되어 있었다.
유전자
명칭		 단백질 설명 NSAF 비율 P 수치 조정된 P 수치
높은 VCAM-1 발현을 갖는 HDL에 많은 양으로 존재하는 단백질
(Proteins more abundant in HDL with high VCAM-1 expression)
QSOX1 Sulfhydryl oxidase 1 22.91 0.02 0.26
GP1BA Platelet glycoprotein Ib alpha chain 9.16 0.02 0.69
F13B Coagulation factor XIII B chain 3.57 0.004 0.71
높은 VCAM-1 발현을 갖는 HDL에 적은 양으로 존재하는 단백질
(Proteins less abundant in HDL with high VCAM-1 expression)
IGFBP3 Insulin-like growth factor-binding protein 3 0.12 0.049 0.69
CETP Cholesteryl ester transfer protein 0.20 0.002 0.52
SERPINA7 Thyroxine-binding globulin 0.22 0.003 0.26
HLA-A HLA class I histocompatibility antigen, A-24 alpha chain 0.33 0.03 0.69
SERPINF1 Pigment epithelium-derived factor 0.35 0.01 0.31
ECM1 Extracellular matrix protein 1 0.35 0.001 0.69
Uniprot 접근
번호		 유전자
명칭		 단백질 설명 스펙트럼 수
(lowest)		 스펙트럼 수
(highest)		 NSAF p
(1) (2) (3) (1) (2) (3)
P05090 APOD Apolipoprotein D 62 54 56 72 71 74 0.81 0.01
Q96IY4 CPB2 Carboxypeptidase B2 4 6 4 7 8 8 0.64 0.02
P11597 CETP Cholesteryl ester transfer protein 0 3 3 15 11 12 0.20 0.002
P05160 F13B Coagulation factor XIII B chain 24 29 28 4 6 12 3.57 0.004
P02746 C1QB Complement C1q subcomponent subunit B 10 9 9 7 4 7 1.55 0.046
P0C0L5 C4B Complement C4-B 279 285 270 249 234 236 1.19 <0.001
P07358 C8B Complement component C8 beta chain 87 90 77 78 66 65 1.24 0.01
Q16610 ECM1 Extracellular matrix protein 1 4 6 4 14 14 16 0.35 0.001
P23142 FBLN1 Fibulin-1 28 21 21 17 13 16 1.54 0.045
P00739 HPR Haptoglobin-related protein 38 40 43 34 30 32 1.29 0.048
P05534 HLA-A HLA class I histocompatibility antigen, A-24 alpha chain 4 0 2 7 6 9 0.33 0.03
P01857 IGHG1 Ig gamma-1 chain C region 291 287 269 263 249 263 1.12 0.004
P01625 IGKV4-1 Ig kappa chain V-IV region Len 26 21 22 19 16 15 1.40 0.02
P0CG05 IGLC2 Ig lambda-2 chain C regions 85 68 73 61 46 64 1.35 0.044
P17936 IGFBP3 Insulin-like growth factor-binding protein 3 0 0 0 5 4 2 0.12 0.049
P35858 IGFALS Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit 121 126 113 99 95 92 1.28 0.001
P55058 PLTP Phospholipid transfer protein 16 18 17 13 12 12 1.40 0.01
P36955 SERPINF1 Pigment epithelium-derived factor 27 21 19 79 68 54 0.35 0.01
P05155 SERPING1 Plasma protease C1 inhibitor 312 333 301 312 261 256 1.17 0.04
P07359 GP1BA Platelet glycoprotein Ib alpha chain 4 5 3 0 0 0 9.16 0.02
P00734 F2 Prothrombin 128 118 105 90 83 103 1.30 0.02
O00391 QSOX1 Sulfhydryl oxidase 1 10 9 13 0 0 0 22.91 0.02
P05543 SERPINA7 Thyroxine-binding globulin 0 2 3 10 8 11 0.22 0.003
P04004 VTN Vitronectin 81 73 68 103 85 89 0.82 0.02
높은 VCAM-1 발현을 갖는 HDL에서 많은 단백질 기능적인 범주
약어 단백질 명칭 1 2 3 4 5 6 7 8 9
QSOX1 Sulfhydryl oxidase 1 o
GP1BA Platelet glycoprotein Ib alpha chain o
F13B Coagulation factor XIII B chain o
C1QB Complement C1q subcomponent subunit B o
FBLN1 Fibulin-1 o
IGKV4-1 Ig kappa chain V-IV region Len o
PLTP Phospholipid transfer protein o
IGLC2 Ig lambda-2 chain C regions o
F2 Prothrombin o o
HPR Haptoglobin-related protein o
IGFALS Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit o
C8B Complement component C8 beta chain o
C4B Complement C4-B o
SERPING1 Plasma protease C1 inhibitor o
IGHG1 Ig gamma-1 chain C region o
높은 VCAM-1 발현을 갖는 HDL에서 적은 단백질 기능적인 범주
VTN Vitronectin o
APOD Apolipoprotein D o
CPB2 Carboxypeptidase B2 o
ECM1 Extracellular matrix protein 1 o
SERPINF1 Pigment epithelium-derived factor o
HLA-A HLA class I histocompatibility antigen, A-24 alpha chain o
SERPINA7 Thyroxine-binding globulin o
CETP Cholesteryl ester transfer protein o
IGFBP3 Insulin-like growth factor-binding protein 3 o
위와 같이, HDL 샘플에서 가장 높은 수치와 낮은 수치를 비교하여 세가지 기능적인 파라미터와 연관된 HDL 단백질을 동정하고 순위를 확인하였다. 높은 콜레스테롤 유출능을 갖는 HDL에서 지질 대사 또는 면역성과 관련된 다양한 기능적인 범주에 속하는 단백질들이 차별적으로 발현되는 것을 알 수 있다.

Claims (9)

  1. 하기 단계를 포함하는 개체의 혈관 기능에 대한 정보를 제공하는 방법으로서,
    a) 개체의 혈액에서 고밀도 지단백 시료를 수득하는 단계;
    b) 수득된 고밀도 지단백 시료에서 비트로넥틴(vitronectin), 알파-1B-당단백질(alpha-1B-glycoprotein), 티록신 결합 글로불린(thyroxine binding globulin), 혈장 세린 프로테아제 억제제(plasma serine protease inhibitor), 안지오텐시노겐(angiotensinogen), 혈청 아밀로이드 A-4(serum amyloid A-4: SAA4), 보체 C4-A(complement C4-A), 알파-2 매크로글로불린(alpha-2 macroglobulin: A2M), 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역(immunoglobulin mu chain C region)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
    c) 측정된 단백질의 발현 수준을 측정된 개체의 평균 발현 수준과 비교하는 단계; 및
    d) 측정된 비트로넥틴, 알파-1B-당단백질, 티록신 결합 글로불린, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오텐시노겐, 및 혈청 아밀로이드 A-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준이 측정된 개체의 평균 발현 수준보다 높은 경우, 또는
    보체 C4-A, 알파-2 매크로글로불린, 및 면역글로불린 뮤 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준이 측정된 개체의 평균 발현 수준보다 낮은 경우,
    상기 개체를 개체 중 콜레스테롤 유출 능력이 높은 군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 b) 단계는, 수득된 고밀도 지단백 시료에서 세포외 기질 단백질 1(Extracellular matrix protein 1: ECM1), 카르복상기 b) 단계는, 수득된 고밀도 지단백 시료에서 세포외 기질 단백질 1(Extracellular matrix protein 1: ECM1), 카르복시펩티다제 B2(Carboxypeptidase B2: CPB2), 색소 상피 유도 인자 (pigment epithelium-derived factor: PEDF 또는 SERPINF1), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3(Insulin-like growth factor binding protein 3: IGBP3), 혈청 아밀로이드 A-1 단백질 (Serum amyloid A-1 protein: SAA1), 응고인자 X(Coagulation factor X: F10), 아포지질단백질 (Apolipoprotein(a): LPA), 알파 2 항플라스민(Alpha-2-antiplasmin: SERPINF2), 헤모글로빈 서브유닛 델타 (Hemoglobin subunit delta: HBD), C4b-결합 단백질 알파 사슬 (C4b-binding protein alpha chain: C4BPA), 아트락틴 (Attractin: ATRN), 카르복시펩티다아제 서브유닛 2(Carboxypeptidase N subunit 2: CPN2), Ig 카파 사슬 V-I 영역 WEA(Ig kappa chain V-I region WEA: IGKV1-17), 보체 C1r 서브컴포넌트(Complement C1r subcomponent: C1R), 보체 C1q 서브컴포넌트 서브유닛 B(Complement C1q subcomponent subunit B: C1QB), 프로테오글리칸 4(Proteoglycan 4: PRG4), 헤모글로빈 서브유닛 알파(Hemoglobin subunit alpha: HBA1), 보체 C5(Complement C5: C5), 및 Ig 알파-1 사슬 C 영역(Ig alpha-1 chain C region: IGHA1)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하고;
    상기 d)단계는, 측정된 세포외 기질 단백질 1, 카르복시펩티다제 B2, 색소 상피 유도 인자, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3, 혈청 아밀로이드 A-1 단백질, 응고인자 X, 및 아포지질단백질, 알파 2 항플라스민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준이 측정된 개체의 평균 발현 수준보다 높은 경우, 또는
    헤모글로빈 서브유닛 델타, C4b-결합 단백질 알파 사슬, 아트락틴, 카르복시펩티다아제 서브유닛 2, Ig 카파 사슬 V-I 영역 WEA, 보체 C1r 서브컴포넌트, 보체 C1q 서브컴포넌트 서브유닛 B, 프로테오글리칸 4, 헤모글로빈 서브유닛 알파, 보체 C5, 및 Ig 알파-1 사슬 C 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준이 측정된 개체의 평균 발현 수준보다 낮은 경우,
    상기 개체를 개체 중 콜레스테롤 유출 능력이 높은 군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 b) 단계는, 수득된 고밀도 지단백 시료에서 카르복시펩티다제 B2 (Carboxypeptidase B2: CPB2), 헤모글로빈 서브유닛 델타(Hemoglobin subunit delta: HBD), 술프하이드릴 옥시다제 1(Sulfhydryl oxidase 1: QSOX1), 및 리포폴리사카리드 결합 단백질(Lipopolysaccharide-binding protein: LBP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
    상기 d)단계는, 측정된 카르복시펩티다제 B2, 헤모글로빈 서브유닛 델타, 술프하이드릴 옥시다제 1 및 리포폴리사카리드 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준이 측정된 단백질의 발현 수준을 측정된 개체의 평균 발현 수준에 비하여 높은 경우,
    상기 개체를 개체의 산화 질소 생성능력이 높은 군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 b) 단계는, 수득된 고밀도 지단백 시료에서 술프하이드릴 옥시다제 1(Sulfhydryl oxidase 1: QSOX1), 혈소판 당단백질 Ib 알파 사슬(Platelet glycoprotein Ib alpha chain: GP1BA), 응고인자 XIII B 사슬(Coagulation factor XIII B chain: F13B), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3(Insulin-like growth factor-binding protein 3: IGFBP3), 콜레스테릴 에스테르 전이 단백질(Cholesteryl ester transfer protein: CETP), HLA 클래스 I 조직 적합 항원 A-24 알파 사슬(HLA class I histocompatibility antigen, A-24 alpha chain: HLA-A), 색소 상피 유도 인자 (pigment epithelium-derived factor: PEDF), 및 세포외 기질 단백질 1(Extracellular matrix protein 1: ECM1)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
    상기 d)단계는, 측정된 술프하이드릴 옥시다제 1, 혈소판 당단백질 Ib 알파 사슬, 및 응고인자 XIII B 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준이 측정된 개체의 평균 발현 수준에 비하여 높은 경우, 또는
    인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3, 콜레스테릴 에스테르 전이 단백질, HLA 클래스 I 조직 적합 항원 A-24 알파 사슬, 색소 상피 유도 인자, 및 세포외 기질 단백질 1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준이 측정된 개체의 평균 발현 수준에 비하여 낮은 경우,
    상기 개체를 개체의 혈관 세포 부착 단백질-1(vascular cell adhesion protein-1: VCAM-1)의 발현이 높은 군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 개체는 한국인인 것인 방법.
  9. 삭제
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