KR102436506B1 - 건선 환자에서 심혈관 동반질환을 선별하기 위한 바이오마커 또는 이의 용도 - Google Patents

건선 환자에서 심혈관 동반질환을 선별하기 위한 바이오마커 또는 이의 용도 Download PDF

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Abstract

건선 환자에서 심혈관 동반질환을 진단하기 위한 바이오마커로서, MPIG6B (Megakaryocyte and platelet inhibitory receptor G6b); MAPRE2 (Microtubule-associated protein RP/EB family member 2); TUBA1A (Tubulin alpha-1A chain); CRKL (Crk-like protein); CSRP1 (Cysteine and glycine-rich protein 1); FYB1 (FYN-binding protein 1); RAB27B (Ras-related protein Rab-27B); CDHR2 (Cadherin-related family member 2); RAB7A (Ras-related protein Rab-7a); FERMT3 (Fermitin family homolog 3); CAVIN2 (Caveolae-associated protein 2); GMFG (Glia maturation factor gamma); EIF5A (Eukaryotic translation initiation factor 5A-1); PRDX5 (Peroxiredoxin-5, mitochondrial); LEI (Leukocyte elastase inhibitor); RAD23B (UV excision repair protein RAD23 homolog B); PEBP1 (Phosphatidylethanolamine-binding protein 1); PF4V1 (Platelet factor 4 variant); PKM (Pyruvate kinase PKM); MMRN1 (Multimerin-1); APP (Amyloid-beta precursor protein); 및 GLG1 (Golgi apparatus protein 1)와 이의 용도를 제공한다. 이에 따르면, 건선 환자에서 심혈관 동반질환의 발병 가능성 및 예후를 객관적이고, 신속하고, 높은 정확도 및 특이도로 검출하는데 이용할 수 있다.

Description

건선 환자에서 심혈관 동반질환을 선별하기 위한 바이오마커 또는 이의 용도 {Biomarker for screening cardiovascular comorbidities in a psoriasis patient and use thereof}
건선 환자에서 심혈관 동반질환을 진단하기 위한 바이오마커, 이를 이용한 건선 환자에서 심혈관 동반질환 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 정보 제공방법에 관한 것이다.
피부질환의 대표적인 만성 염증성 질환으로 알려져 있는 건선 (psoriasis)은 우리나라를 포함한 아시아인에서 1% 내외, 전 세계적으로 1~3%의 유병율을 가지고 있다. 임상적으로는 은백색의 인설을 가지는 홍반성 판이 전신에 발생할 수 있고, 호전과 악화를 보이며 만성적으로 진행하여 장기적인 관리를 요한다. 또한, 건선은 단순한 피부질환에서 벗어나 전신적인 염증성 질환 (systemic inflammatory disease)으로서의 중요성이 대두되고 있는데, 건선의 병리생리에 관여하는 Th-1, Th-17 세포 및 염증성 사이토카인은 죽상경화증, 혈전증, 뇌졸중 등의 심혈관질환에도 중요한 역할을 한다.
심혈관계 질환은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환을 말한다. 심혈관계 질환은 심장 주변의 혈관 중간층에 섬유화가 일어나거나 혈관벽에 콜레스테롤이 쌓여 혈관의 안쪽이 점점 비좁아지게 되면서, 혈액순환 장애와 고혈압을 일으키게 되고 심장을 비롯한 각종 장기에 산소와 영양분이 적절히 전달되지 못해 발생하는 것으로 알려져 있다. 상기 심혈관계 질환은 암에 이어 두번째로 사망률이 높은 질병으로 알려져 있다.
특히, 중증의 건선 환자에서는 혈관 염증이 현저히 증가하게 되고, 이러한 혈관 염증은 여러가지 심혈관계 동반질환을 일으킬 수 있어 심장마비와 뇌졸중과 같은 더 큰 주요 심혈관계 사건 (major adverse cardiac event)의 위험으로 이어질 수 있다. 심혈관 사건을 예측하고 심혈관 동반질환을 신속하게 진단할 수 있는 바이오마커의 발굴이 지속적으로 요구되고 있다.
따라서, 건선 환자에서 심혈관 동반질환을 예측할 수 있는 바이오마커의 발굴이 지속적으로 요구되고 있다.
일 양상은 건선 환자에서 심혈관 동반질환을 진단하기 위한 바이오마커 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 환자에서 심혈관 동반질환을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 진단용 조성물을 포함하는 건선 환자에서 심혈관 동반질환을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 건선 환자에서 심혈관 동반질환을 진단하기 위한 정보제공 방법을 제공한다.
일 양상은 MPIG6B (Megakaryocyte and platelet inhibitory receptor G6b); MAPRE2 (Microtubule-associated protein RP/EB family member 2); TUBA1A (Tubulin alpha-1A chain); CRKL (Crk-like protein); CSRP1 (Cysteine and glycine-rich protein 1); FYB1 (FYN-binding protein 1); RAB27B (Ras-related protein Rab-27B); CDHR2 (Cadherin-related family member 2); RAB7A (Ras-related protein Rab-7a); FERMT3 (Fermitin family homolog 3); CAVIN2 (Caveolae-associated protein 2); GMFG (Glia maturation factor gamma); EIF5A (Eukaryotic translation initiation factor 5A-1); PRDX5 (Peroxiredoxin-5, mitochondrial); LEI (Leukocyte elastase inhibitor); RAD23B (UV excision repair protein RAD23 homolog B); PEBP1 (Phosphatidylethanolamine-binding protein 1); PF4V1 (Platelet factor 4 variant); PKM (Pyruvate kinase PKM); MMRN1 (Multimerin-1); APP (Amyloid-beta precursor protein); 및 GLG1 (Golgi apparatus protein 1) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 건선 환자에서 심혈관 동반질환 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "건선(psoriasis)"은 피부가 붉어지는 증상인 홍반과 하얀 각질이 일어나는 증상인 인설을 주증상으로 두꺼워진 피부에 홍반과 인설이 같이 있는 것을 특징으로 하는 질환을 말한다. 건선은 만성피부질환으로, 질환의 원인이 면역 이상일 수 있다. 상기 건선의 병변은 판상 건선, 간찰부 건선, 물방울양 건선, 농포성 건선, 건선 홍피증, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 건선은 건선 관절염을 동반할 수 있다. 상기 건선의 경우, 대사증후군, 급성심근경색, 뇌졸중 등 심혈관계 질환의 발병율이 일반인보다 높을 수 있다.
상기 건선 환자는 건선의 병변을 갖는 개체를 말한다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 건선을 앓고 있거나 건선에 걸린 것으로 의심되는 개체일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "심혈관 동반질환(cardiovascular comorbidity)"은 심장과 주요 혈관에 발생하는 의학적 문제로 인해, 다른 질환과 공존하거나 관련되어 발견되는 질환을 의미한다. 상기 심혈관 동반질환은 보다 넓은 범위의 심혈관 질환을 의미하는 것으로서, 일반적인 심혈관 질환 및 심혈관계 질환과 통계학적으로 관련이 있는 심혈관 위험 인자를 포함한다. 심혈관 질환은 우리나라의 식생활 습관이 서구화되고, 고혈압 비만과 같은 만성질환의 발병률이 급속하게 증가하면서, 심혈관 질환의 빈도도 급하게 증가하고 있다. 상기 심혈관 동반질환은 고혈압, 이상지질혈증, 허혈성 심장 질환, 관상동맥질환, 협십증, 심근경색증, 동맥경화증, 죽상경화증, 뇌혈관 질환, 뇌졸중, 부정맥 또는 이들이 조합을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "바이오마커(biomarker)"는 일반적으로 생물학적 시료에서 검출 가능한 물질로서 생체의 변화를 알아낼 수 있는 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질, 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다.
본 명세서에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인 또는 예측하는 것을 의미하며, 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics) (예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.
상기 바이오마커 조성물은 건선 환자에서 심혈관 동반질환을 진단할 수 있는 것으로서, 구체적으로 건선 환자에서 심혈관 동반질환의 발병할 가능성을 판별/예측하거나, 예후를 예측하는 것을 의미하는 것일 수 있다.
MPIG6B (Megakaryocyte and platelet inhibitory receptor G6b)은 조혈 계통 분화, 거핵구 기능 및 혈소판 생성의 중요한 조절자 역할을 하는 억제 수용체로서, ADP 및 콜라겐 관련 펩티드와 같은 작용제에 의한 혈소판 응집 및 활성화를 억제한다. MPIG6B은 MPIG6B 유전자에 의해 코딩될 수 있다. MPIG6B은 인간에서 Uniprot 번호 O95866의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
MAPRE2 (Microtubule-associated protein RP/EB family member 2)은 미세소관 중합에 관여할 수 있으며, 미세소관을 안정화하고 중심체에 고정하여 스핀들 기능을 수행하는 데에 연관이 있다. 또한, 세포 이동에서 역할을 할 수 있다. MAPRE2은 MAPRE2 유전자에 의해 코딩될 수 있다. MAPRE2은 인간에서 Uniprot 번호 Q15555의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
TUBA1A (Tubulin alpha-1A chain)은 미세소관의 주요 구성 요소로서, 2 몰의 GTP를 결합하는데, 하나는 베타 사슬의 교환 가능한 부위에 하나는 알파 사슬의 교환 불가능한 부위에 결합한다. TUBA1A은 TUBA1A 유전자에 의해 코딩될 수 있다. TUBA1A은 인간에서 Uniprot 번호 Q71U36의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
CRKL (Crk-like protein)은 RAS 및 JUN 키나아제 신호전달 경로를 활성화하고 RAS 의존적 방식으로 섬유 아세포를 변형시킬 수 있다. 또한, BCR-ABL 티로신 키나아제의 기질이며 BCR-ABL에 의한 섬유 아세포 변형에 관련이 있다. CRKL은 CRKL 유전자에 의해 코딩될 수 있다. CRKL은 인간에서 Uniprot 번호 P46109의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
CSRP1 (Cysteine and glycine-rich protein 1)은 LIM 도메인 단백질 그룹을 암호화하는 유전자인 CSRP 패밀리의 구성원으로, 발달 및 세포 분화에 중요한 조절 과정에 관여할 수 있다. CSRP1에서 발견되는 LIM/이중 아연-핑거 모티프는 유전자 조절, 세포 성장 및 체세포 분화에 중요한 기능을 가진 단백질 그룹에서 발견된다. 다른 패밀리 유전자로는 CSRP2 및 CSRP3이 있다. CSRP1은 CSRP1 유전자에 의해 코딩될 수 있다. CSRP1은 인간에서 Uniprot 번호 P21291의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
FYB1 (FYN-binding protein 1)은 T 세포에서 FYN 및 LCP2 신호 전달 캐스케이드의 어댑터 단백질 역할을 하며, T 세포 신호 전달을 액틴 세포 골격의 리모델링에 연결시키는 역할을 할 수 있다. 또한 IL2의 발현을 조절할 수 있다. FYB1은 FYB1 유전자에 의해 코딩될 수 있다. FYB1은 인간에서 Uniprot 번호 O15117의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
RAB27B (Ras-related protein Rab-27B)은 활성 GTP 결합 상태와 비활성 GDP 결합 상태 사이를 순환하는 작은 GTPase이다. 활성 상태에서 다양한 이펙터 단백질에 결합하여 엔도좀 포지셔닝, 성숙 및 분비를 포함하는 후기 식작용 경로의 항상성을 조절한다. 또한, NTRK2/TRKB와 KLC1의 연관을 촉진하여 NTRK2/TRKB 축삭 전방 수송에서 역할을 한다. RAB27B은 RAB27B 유전자에 의해 코딩될 수 있다. RAB27B은 인간에서 Uniprot 번호 O00194의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
CDHR2 (Cadherin-related family member 2)은 세포 외 도메인을 통해 인접한 미세 융모에서 CDHR5와 칼슘 의존성 이종성 복합체를 형성하는 미세융모간 접착 분자로서, 상피 세포의 정단막에서 미세 융돔의 패킹을 조절한다. 세포질 도메인을 통해 미세융모 세포질 단백질과 상호 작용하여 미세융모간 접착 복합체/IMAC를 형성한다. 이 복합체는 상피 세포에서 세포-세포 부착 및 접촉 억제에 역할을 한다. CDHR2은 CDHR2 유전자에 의해 코딩될 수 있다. CDHR2은 인간에서 Uniprot 번호 Q9BYE9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
RAB7A (Ras-related protein Rab-7a)은 엔도-리소좀의 트래픽킹의 중요 조절자로서, 초기-후기의 엔도좀 성숙, 엔도좀 이동 및 포지셔닝에 관여한다. 이외에도, 성장인자-매개 세포신호 전달, 영양전달-매개 영양 섭취, 뉴런 축삭에서의 뉴로트로핀 수송 및 지질 대사와 같은 다양한 생리학적 작용에서도 중심 역할을 한다. RAB7A은 RAB7A 유전자에 의해 코딩될 수 있다. RAB7A은 인간에서 Uniprot 번호 P51149의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
FERMT3 (Fermitin family homolog 3)은 조혈 세포에서 세포 접착에서 중심 역할을 하며, 인테그린 베타-1-3 (ITGB1, ITGB2 및 ITGB3)을 활성화시킨다. 또한, 내피세포에 대해 인테그린-매개 혈소판 부착 및 백혈구 부착에 필요하다. FERMT3은 FERMT3 유전자에 의해 코딩될 수 있다. FERMT3은 인간에서 Uniprot 번호 Q86UX7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
CAVIN2 (Caveolae-associated protein 2)은 캐비올레(caveolae)의 생물발생에 중요한 역할을 하며, 캐비올레 내에서 막 곡률을 유도하여 케비올레의 형태를 조절한다. 또한, 조직-특이적 방식으로 케비올레 형성에 관여하며 구체적으로 폐 및 지방 내비에서의 케비올레 형성에 필요하다. CAVIN2은 CAVIN2 유전자에 의해 코딩될 수 있다. CAVIN2은 인간에서 Uniprot 번호 O95810의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
GMFG (Glia maturation factor gamma)는 NF-카파B 패밀리 경로 및 cAMP-의존적 PKA의 활성화에 관여한다. 또한, 에리스로포이에틴 유도 및 GCSF(granulocyte-colony stimulating factor) 유도 조혈 계통 발달에서 사이토카인-반응성 단백질이다. GMFG은 GMFG 유전자에 의해 코딩될 수 있다. GMFG은 인간에서 Uniprot 번호 O60234의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
EIF5A (Eukaryotic translation initiation factor 5A-1)는 번역 신장에 관여하는 mRNA 결합 단백질로서, mRNA 턴-오버 수준에서 중요한 역할을 하며, 구체적으로 외피 제거(decapping)의 하류에 작용한다. 또한, 액틴 역학, 세포주기 진행, mRNA 붕괴 및 스트레스 반응 및 세포벽 완전성 유지와 관련된 경로에 관여한다. EIF5A은 EIF5A 유전자에 의해 코딩될 수 있다. EIF5A은 인간에서 Uniprot 번호 P63241의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
PRDX5 (Peroxiredoxin-5, mitochondrial)는 과산화수소 및 유기 하이드로퍼옥사이드류를 각각 물 및 알코올로 환원시키는 것을 촉매하는 싸이올-특이적 과산화효소로서, 과산화물을 해독하여 산화적 스트레스에 대해 세포를 보호하고 과산화수소-매개 신호전달 발생의 센서로서의 중요한 역할을 한다. PRDX5은 PRDX5 유전자에 의해 코딩될 수 있다. PRDX5은 인간에서 Uniprot 번호 P30044의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
LEI (Leukocyte elastase inhibitor)는 선천성 면역 반응, 염증 및 세포 항상성 조절에 필수적인 역할을 하는 호중구 세린 프로테아제 억제제로서, 주로 스트레스 또는 감염 중에 세포질에서 방출되는 프로테아제로부터 세포를 보호하는 역할을 한다. 또한, 호중구 프로테아제 엘라스테아제, 카텝신 G, 프로테이나아제-3, 키마아제, 키모트립신 및 칼리크레인-3의 활성을 조절한다. LEI는 SERPINB1 유전자에 의해 코딩될 수 있다. LEI는 인간에서 Uniprot 번호 P30740의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
RAD23B (UV excision repair protein RAD23 homolog B)는 프로테아좀 분해의 조절에 관여하는 멀티유비퀴틴 사슬 수용체로서, 폴리유비퀴틴 사슬에 결합한다. 26S 프로테아좀 및 폴리유비퀴틴화된 기질에 동시에 결합하고 유비퀴틴화된 단백질을 프로테아좀에 전달할 수 있다. 또한, PNGase와 결합하고 데글리코실화 단백질을 프로테오좀에 전달함으로써 잘못접힌 당 단백질의 소포체 관련 분해 (ndoplasmic reticulum-associated degradation, ERAD)에서 역할을 할 수 있다. RAD23B는 RAD23B 유전자에 의해 코딩될 수 있다. RAD23B는 인간에서 Uniprot 번호 P54727의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
PEBP1 (Phosphatidylethanolamine-binding protein 1)는 트롬빈, 뉴로프 신 및 키모트립신은 억제하지만 트립신, 조직형 플라스미노겐 활성화제 및 엘라 스타아제는 억제하지 않는 세린 프로테아제 억제제로서, ATP, 오피오이드 및 포스파티딜에탄올아민와 결합하며, 포스파티딜이노시톨 및 포스파티딜콜린에 대한 친화성은 낮다. 또한, RAF1의 활성화를 억제하고 RAF1/MEK 복합체를 해리하고, MEK 인산화의 경쟁적 억제제로 작용하는 기전으로 RAF1의 키나제 활성을 억제한다. PEBP1는 PEBP1 유전자에 의해 코딩될 수 있다. PEBP1는 인간에서 Uniprot 번호 P30086의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
PF4V1 (Platelet factor 4 variant)는 혈소판 인자 4와 매우 유사한 케모카인으로서, 강력한 항-혈관 형성 기능을 나타내며 케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 3에 의해 조절된다. 또한, 종양 성장을 악화시키고 당뇨병 환자의 혈액 망막 장벽 파괴를 예방할 수 있다. PF4V1는 PF4V1 유전자에 의해 코딩될 수 있다. PF4V1는 인간에서 Uniprot 번호 P10720의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
PKM (Pyruvate kinase PKM)는 포스포에놀피루베이트(PEP)에서 ADP로 포스포릴기의 이동을 촉매하여 ATP를 생성하는 당분해 효소로서, 고활성 사량체 형태와 거의 비활성인 이량체 형태 사이의 비율은 글루코스 탄소가 생합성 과정으로 전달되는지 또는 해당 ATP 생산에 사용되는지 여부를 결정한다. 상기 두 가지 형태 사이의 전이는 해당 과정의 조절에 기여하며 종양 세포 증식 및 생존에 중요하다. PKM은 PKM 유전자에 의해 코딩될 수 있다. PKM는 인간에서 Uniprot 번호 P14618의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
MMRN1 (Multimerin-1)는 혈소판 인자 V/Va에 대한 운반 단백질로서, 혈소판에서 인자 V의 저장 및 안정화에 중요한 역할을 한다. 혈소판 활성화 후 방출되면, 혈소판 및 혈장 인자 Va 의존적 트롬빈 생성을 제한할 수 있다. 또한, 활성화된 혈소판의 인테그린 알파 -IIb/베타-3 및 인테그린 알파-V/베타-3에 대한 리간드이며 세포 외 기질 또는 접착 단백질로 기능할 수 있다. MMRN1은 MMRN1 유전자에 의해 코딩될 수 있다. MMRN1는 인간에서 Uniprot 번호 Q13201의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
APP (Amyloid-beta precursor protein)는 세포 표면 수용체로서의 역할을 하며 신경 돌기 성장, 신경 세포 부착 및 축삭 형성과 관련된 신경 세포 표면에서 생리적 기능을 수행한다. 인접한 세포에서 APP 분자 간의 상호 작용은 시냅스 생성을 촉진한다. 또한, 단백질-단백질 상호 작용을 통한 세포 이동성과 전사 조절에 관여한다. APP는 APP 유전자에 의해 코딩될 수 있다. APP는 인간에서 Uniprot 번호 P05067의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
GLG1 (Golgi apparatus protein 1)는 섬유아세포 성장 인자와 E-셀렉틴 (호중구의 결합을 매개하는 내피 세포상의 세포 접착 렉틴)에 결합하며, 농창(Ecthyma) 및 선모충병(richinosis)과 관련되어 있다. 또한, 혈관벽에서의 세포 표면 상호 작용과 활막 섬유아세포의 세포 자멸 경로와 관련이 있다. GLG1 는 GLG1 유전자에 의해 코딩될 수 있다. GLG1는 인간에서 Uniprot 번호 Q92896의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 단편(fragment)은 상기 단백질의 일부로서, 면역원성 폴리펩티드일 수 있다.
상기 유전자는 MPIG6B, MAPRE2, TUBA1A, CRKL, CSRP1, FYB1, RAB27B, CDHR2, RAB7A, FERMT3, CAVIN2, GMFG, EIF5A, PRDX5, LEI, RAD23B, PEBP1, PF4V1, PKM, MMRN1, APP, 및 GLG1로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 코딩하는 핵산을 말한다.
다른 양상은 MPIG6B, MAPRE2, TUBA1A, CRKL, CSRP1, FYB1, RAB27B, CDHR2, RAB7A, FERMT3, CAVIN2, GMFG, EIF5A, PRDX5, LEI, RAD23B, PEBP1, PF4V1, PKM, MMRN1, APP, 및 GLG1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 건선 환자에서 심혈관 동반질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
본 명세서에서 용어, "발현 수준의 측정"은 특정 단백질(펩타이드) 또는 이의 단편, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 여부 또는 발현 정도를 측정하는 것을 의미한다. 상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준은 상기 단백질 또는 이의 단편의 상대적 양 또는 절대적인 양일 수 있다.
상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 것은 상기 단백질 또는 이의 단편의 양을 측정하는 것일 수 있다. 상기 유전자의 발현 수준은 상기 단백질들을 암호화하는 mRNA의 발현 수준일 수 있다. mRNA의 발현 수준은 mRNA의 상대적 양 또는 절대적인 양일 수 있다. 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 것은 mRNA의 양을 측정하는 것일 수 있다.
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏팅 (Western blotting), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radical immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동 (rocket immunoeletrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining), 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complenent Fixation Assay), 면역형광법 (immunofluorescence), 면역크로마토그래피법 (immunochromatography), FACS 분석법 (fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법 (protein chip technology)인 것일 수 있다.
상기 mRNA 또는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응 (competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응 (real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응 (quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection method), 노던 블랏팅 (Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법 (DNA chip technology)인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "발현 수준을 측정하는 제제"는 특정 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 구체적으로 상기 단백질 또는 상기 유전자를 검출 및/또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있다.
상기 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머(aptamer)일 수 있다. 용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 폴리 클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 전장 항체일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, F(ab'), F(ab')2 또는 Fv일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어, 금속 칩, 플레이트, 또는 웰(well)의 표면이다. 상기 앱타머는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 단일 가닥의 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이나 펩티드일 수 있다.
상기 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 말단 또는 내부에 형광 물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "프라이머(primer)"는 자유 3-말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 특정 염기 서열에 대해 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 바이오마커를 암호화하는 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 프라이머로서 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 건선이 발병된 개체의 심혈관 동반질환 발병 가능성을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다. 상기 프라이머는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 15 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "프로브(probe)"란 표적 핵산 예를 들면, mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 특정 mRNA의 존재 유무, 함량 및 발현량을 확인할 수 있도록 라벨링(labeling)되어 있을 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA (single strand DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 바이오마커를 암호화하는 유전자의 mRNA와 상보적인 핵산 서열을 갖는 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현량을 측정함으로써 건선이 발병된 개체의 심혈관 동반질환 발병 가능성을 예측할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 프로브는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 15 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.
또한, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 (phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한 이러한 핵산 서열은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 또는 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출 가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형될 수 있다. 상기 표지의 예는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 또는 바이오틴을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 건선 환자에서 심혈관 동반질환 진단용 조성물을 포함하는 건선 환자에서 심혈관 동반질환 진단용 키트를 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 키트에도 공히 적용된다.
상기 키트는 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정함으로써, 건선 환자에서 심혈관 동반질환의 발병 가능성 및 예후 등을 진단 또는 예측할 수 있는 효과가 있다. 상기 키트는 건선 환자에서 심혈관 동반질환의 발병을 예측하는데 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 고체 지지체, 항체 또는 항원 결합 단편의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소, 형광물질로 표지된 2 차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 키트는 핵산 검출을 위하여, 중합효소, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 중합 효소는 예를 들어 Taq 중합효소이다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 MPIG6B, MAPRE2, TUBA1A, CRKL, CSRP1, FYB1, RAB27B, CDHR2, RAB7A, FERMT3, CAVIN2, GMFG, EIF5A, PRDX5, LEI, RAD23B, PEBP1, PF4V1, PKM, MMRN1, APP, 및 GLG1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 건선 환자에서 심혈관 동반질환을 진단하기 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
본 명세서에서 용어, "개체"는 심혈관 동반질환이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 모든 생물체를 의미하며, 구체적인 예로, 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 상기 개체로부터 수득된 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 예를 들면 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 시료로부터 수득된 단백질 시료 또는 핵산 시료를 포함한다.
상기 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머를 인큐베이션시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 전자현미경법(electron microscopy), 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 상기 전기영동은 SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 2차원 전기영동, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, 상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드와 인큐베이션시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 측정하는 단계는 노던 블로팅(Northern blotting) 또는 폴리머라제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR)으로 수행될 수 있다. 상기 PCR은 실시간 PCR 또는 역전사 PCR일 수 있다.
상기 방법은 상기 측정된 개체의 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 대조군은 건선 환자에서 심혈관 위험 인자를 보유하지 않거나 심혈관 동반질환을 갖지 않은 개체일 수 있다.
상기 방법은 상기 개체에서 측정된 발현 수준이 대조군의 발현 수준과 비교하여 증가된 경우, 상기 개체를 심혈관 동반질환이 발병한 것으로 판정하거나 발병 위험을 높은 수준으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
건선 환자 중 심혈관 동반질환이 발병할 가능성이 높은 것으로 예측된 개체에 생활요법 또는 약물 치료를 수행할 수 있다. 상기 생활 요법은 정상 체중 유지, 규칙적인 운동, 금연, 금주, 소금 섭취 제한, 저지방 식사, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 약물은 안지오텐신 전환효소 저해제(Angiotensinconverting enzyme(ACE) inhibitor), 안지오텐신 II 수용체 차단제(Angiotensin II receptor blocker), 베타 차단제(Beta blocker), 칼슘 채널 차단제(Calcium channel blocker), 이뇨제(Diuretics), 알파 차단제(Alpha blocker), 알파-베타 차 단제(Alpha-beta blocker), 혈관 확장제(Vasodilator), HMG-CoA 환원효소 억제제 (statin), 담즙산 결합수지, 피브릭산 및 그의 유도체, 니코틴산 및 그의 유도체, 오메가-3, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 양상에 따른 건선 환자에서 심혈관 동반질환을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 건선 환자에서 심혈관 동반질환을 진단하기 위한 정보제공 방법에 따르면, 건선 환자에서 심혈관 동반질환의 발병 여부 및 예후를 객관적이고, 신속하고, 높은 정확도 및 특이도로 검출하는데 이용할 수 있다.
도 1은 감손된 혈장 시료의 액체 크로마토 그래피 분석 결과를 나타낸 도면이다(x 축: 시간(분), y 축: 질량 흡광도 단위(milli Absorbance Unit: mAU)).
도 2는 본 발명에서 혈청 시료를 분석하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 건선 환자 및 심혈관 동반질환을 갖는 건선 환자에서 2배 이상 차등 발현되는 단백질들에 대한 hierarchical clustering 분석을 통해서 얻어진 히트맵(heatmap)을 나타낸 도면이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 시료 수집
한양대학교로부터 고혈압, 이상지질혈증 등의 심혈관 동반질환을 갖는 건선 환자 7명, 심혈관 동반질환이 없는 건선 환자 4명으로부터 혈청 시료를 수집하였고, 피부질환이나 심혈관 동반질환 없이 성별, 연령이 질환군과 매칭된 건강한 성인 3명으로부터의 혈청 시료를 음성대조군으로서 수득하였다. 혈청 시료의 단백질 분해 또는 변형을 막기 위해, 혈청을 수득한 직후에 수득된 혈청에 단백질 분해효소 저해제로서 complete, Mini EDTA-free 프로테아제 저해제 칵테일(Roche) 및 포스파타아제 저해제로서 PhosSTOP(Roche)을 첨가하였다. 상기 저해제는 제조자의 프로토콜에 따라 1개의 정제를 200 ㎕의 인산완충식염수(phosphate buffered saline: PBS)에 녹여 50X로 만든 후, 각 시료에 저해제의 최종 농도 1.5 X가 되도록 첨가하였다. 저해제를 첨가한 혈청 시료를 정량하고, 실험에 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예 2: 혈청 시료의 감손 (depletion)
알부민이나 면역글로불린 G와 같이 혈청에 다량 존재한 단백질을 제거하기 위해, 수득된 혈청 시료를 감손하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 혈청 시료를 시료별 정량 값에 따라 각각 10 mg을 준비하고, 동일한 조건에서 실험을 수행하였다. 준비된 혈청 시료를 제조사에서 제공하는 완충액으로 6배 희석하고, 희석된 시료를 0.22 ㎛ 스핀 필터에 여과하였다. 여과된 100 ㎕의 시료를 Multiple Affinity Removal System(MARS) 14 컬럼(Agilent)에 주입하고, 제조자의 메뉴얼에 따라 고성능 액체 크로마토그래피를 수행하여 시료를 감손하였다. 14종의 다량 존재하는 단백질들 (알부민, 면역글로불린 G, 알파-1-항트립신, 면역글로불린 A, 트랜스페린, 합토글로빈, 피브리노겐, 알파-2-마크로글로불린, 알파-1-산성당단백질, 면역글로불린 M, 아포지질단백질 A-I, 아포지질단백질 A-II, 보체 단백질 C3, 트란스타이레틴)이 제거된 여과물을 각각 수집하였다. 혈청 시료마다 수집된 여과물들에서 단백질의 양이 비슷한지 확인하기 위해, 수득된 여과물에 대해 실시간으로 자외선 흡광도를 측정하였고, 그 중의 하나의 시료에서 감소된 혈청 시료 결과를 도 1에 나타내었다(초록색 선: 여과물의 수집이 시작되는 시점을 나타냄. 빨간색 선: 여과물의 수집이 끝나는 시점을 나타냄).
실시예 3: 감손된 혈청 시료의 농축 및 정량
3k 원심분리 필터(Amicon Ultra, Millipore)에 400 ㎕의 물(HPLC 등급, J.T Baker)로 2회 및 400 ㎕의 10 mM HEPES 완충액(pH 8.0)을 2회 가하여 필터를 준비하였다.
상기 실시예 2에서 감손된 혈청 시료를 10 mM HEPES 완충액을 1.5배 부피를 넣어서 희석하였다. 희석된 시료를 준비된 필터에 가한 후, 14000x g의 속도로 10
Figure 112021022978814-pat00001
에서 10분 동안 원심분리하여 시료를 농축하였다. 그 후 시료가 포함된 필터를 10 mM HEPES 완충액으로 5회 세척하였다. 새로운 튜브에 세척 후 농축된 시료가 함유된 필터를 뒤집어서 끼운 후, 3000x g의 속도로 10℃에서 2분 동안 원심분리하여 농축된 시료를 회수(recovery)하였다.
회수된 시료를 비신크로니닉산 (bicinchoninic acid: BCA) 분석법으로 정량하였다.
실시예 4: 질량 분석을 위한 시료 준비 및 용액 상태에서 분해 (In-solution digestion)
프로테옴 분석을 위해, 실시예 3에서 수득된 각 시료를 300ug씩을 용액 상태에서 분해하였다. 구체적으로, 300ug 시료를 준비하고 시료의 부피는 100ul으로 25mM 탄산수소 암모늄 (ammonium bicarbonate)를 사용하여 희석하였다. 우레아(UREA) 가루를 사용해서 8M 우레아(UREA)가 되게 시료에 넣어 주었다. 0.5 μmol의 TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine) 사용해서 37℃에서 이황화 결합을 환원시킨 후, 1 μmol의 IAA (2-Iodoacetamide)를 사용하여 25℃의 어두운 환경에서 알킬화시켰다. 그 후 8M 우레아 (UREA) 를 25mM 탄산수소 암모늄 (ammonium bicarbonate)을 더 넣어주어 1M 우레가(UREA) 가 되도록 만들었다. 엔도프로테아제인 LysC 를 넣어 30℃에서 2시간 분해 후, 트립신으로 37℃에서 밤새 분해하였다. 이어서 SepPak® tC18 카트리지 (Sep-Pak tC18 1cc Vac Cartrige, 100mg, Waters)를 이용해 정제한 후 SpeedVac으로 진공건조방식으로 말렸다. 말려진 펩타이드를 100 mM 테트라에틸암모늄 브로마이드(Tetraethylammonium bromide: TEAB)에 녹인 후 펩타이드를 정량하였다.
실시예 5: 펩타이드 시료의 TMT(Tandem Mass Tag) 라벨링
TMT 라벨링 시약 (Thermo Fisher Scientific)을 60 ㎕의 아세토니트릴에 용해시키고, 실시예 4에 준비된 각 시료들에서 30 ㎍의 펩타이드 시료에 30ul의 TMT 라벨링 시약을 가하였다. 반응물을 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 펩타이드를 라벨링한 후, 5 ㎕의 5%(w/v) 히드록시아민(hydroxylamine)을 가하고 20℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 라벨링 반응을 종결시켰다. TMT 라벨링한 시료들을 하나의 튜브로 합치고, SepPak® tC18 카트리지로 정제한 후 SpeedVac을 사용하여 진공건조시켰다.
건조된 시료는 10 mM 포름산 암모늄(ammonium formate)에 녹이고, Pierce?? High pH Reversed-phase Peptide Fractionation Kit를 사용하여 96개의 분획으로 펩티드를 분획하였다. 96개의 분획을 24개의 분획으로 합쳐준 후 분획물을 SpeedVac을 사용하여 진공건조시켰다 (도 2).
실시예 6: 펩타이드 질량 스펙트럼 분석
수득한 각각의 시료 3 ㎕를 Ultimate 3000 시스템 상에서 역상 PepMap RSLC C18 컬럼 (50 cm X 75 ㎛)에 주입하였다. 상기 컬럼을 100%의 버퍼 A(0.1%(v/v)의 포름산을 함유하는 100%의 물)로 평형화시켰다. 버퍼 B는 0.1%(v/v)의 포름산을 함유하는 100%의 아세토니트릴이다. 작업 유속은 다음의 구배 조건에서 300 nL/분으로 하였다:
- 0분: 95% 버퍼 A 및 5% 버퍼 B
- 0분 내지 4분: 5% 버퍼 B
- 4분 내지 13분: 5% 내지10% 버퍼 B
- 13분 내지 150분: 10% 내지 25% 버퍼 B
- 150분 내지 155분: 25% 내지 28% 버퍼 B
- 155분 내지 160분: 28% 내지 40% 버퍼 B
- 160분 내지 165분: 40% 내지 80% 버퍼 B
- 165분 내지 170분: 80% 버퍼 B
- 170분 내지 170.1분: 80% 내지 5% 버퍼 B
- 170.1분 내지 180분: 5% 버퍼 B
Nano LC 시스템을 Tribrid Orbitrap Eclipse 에 장착하였다. 전체-스캔 MS 스펙트라(Survey full-scan MS spectra, 350 ~ 2,000 m/z)를 1 마이크로스캔(microscan) 및 120,000의 해상도(resolution)로 수득하여, 선도물질 (precursor)을 선별하고 전하 상태 측정을 위한 미리보기 모드를 설정하였다. 미리보기 조사 스캔으로부터 20 개의 가장 강력한 이온에 대한 MS/MS 스펙트라를 하기와 같은 옵션으로 전체 스캔에 대한 이온 트랩에서 수득하였다:
- 분리 간격(isolation width), 0.5 m/z; CID 충돌 에너지(collision energy), 35%; 동적 배제 시간(dynamic exclusion duration), 30초(sec).
그 후에 MS/MS 스펙트라에서 단편 이온(fragment ion)들을 아래의 조건들로 분리하였다. MS/MS 스펙트라(Survey full-scan MS spectra)를 1 마이크로스캔(microscan) 으로 수득하여, SPC(synchronous precursor selection) 방식에 의해서 intact mass tag을 포함하는 최대 10 개의 단편 이온들에 대해서 MS3 스펙트라를 하기와 같은 옵션으로 수득하였다:
- 분리 간격(isolation width), 0.4 m/z; HCD 충돌 에너지(collision energy), 55%, scan range (m/z), 100-1000.
실시예 7: 단백질 동정 및 라벨 기반의 정량 분석을 위한 데이터 프로세싱
각각의 LC-MS/MS 파일을 Proteome Discoverer 2.4의 SEQUEST 알고리즘을 이용하여 분석하였다. MS 및 MS/MS 데이터를 SwissProt 인간 데이터 베이스(20376개의 단백질 포함, 2020년 5월 업데이트됨)와 비교 조사하였다. 조사는 두개의 미절단(missed cleavages) 트립신 분해된 펩티드 (tryptic peptide)를 허용하는 것으로 제한하였다. 시스테인(cysteine)의 카르보아미도메틸화(carboamidomethylation, +57.021 Da)과 라이신(Lysine) 및 펩티드 N-말단의 TMT 라벨링(+304.207 Da) 고정된 수식화로, 메티오닌 산화를 유동형 수식화 (+15.995 Da)로 설정하였다. 질량 허용 범위(mass tolerance)를 MS/MS 데이터에 대하여 0.6 Da 및 MS 데이터에 대하여 10 ppm으로 설정하였다. 디코이(decoy) 데이터 베이스 조사를 위해, 0.01의 엄격한 오류 발견 비율(False Discovery Rate: FDR)과 0.05의 완화된 FDR의 총 두 개의 목표 수치를 적용하였다.
심혈관 동반질환이 있는 건선환자 시료 (7개), 심혈관 동반질환이 없는 건선환자 시료 (4개), 음성대조군 시료 (3개)들의 3그룹에 존재하는 단백질들의 상대적인 양을 각 시료들에 유래한 펩티드에 표지된 라벨의 신호 대 잡음(signal to noise) 값에 기초하여 산출하였다. Proteome Discoverer 2.4를 사용하여 각 펩타이드들의 리포터 이온(reporter ion)들의 신호 대 잡음값들을 추출하였다. 통계적으로 유의한 단백질들을 찾아내기 위해서 신호 대 잡음에 기반한 abundance 값들에 대해서 3개의 군 (심혈관 동반질환이 있는 건선, 동반질환이 없는 건선, 정상 대조군)을 대상으로 ANOVA 검정을 수행하였다 (IBM SPSS Statistics 25.0 software). 이후 Scheffe 사후검정을 통해 각 군 사이의 통계적 유의성을 확인하였으며, p-값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 8: 건선 및 심혈관 동반질환을 갖는 건선 환자에서 차등 발현되는 단백질의 동정
실시예 7에 기재된 바와 같이 수행된 심혈관 동반질환을 갖는 건선 환자와 동반질환이 없는 건선 환자 및 정상 대조군 샘플에 존재하는 3 그룹의 단백질들의 동정에 대한 결과로부터, 총 1079 종의 단백질들이 unique peptide 2개 이상으로 동정된 것을 확인하였다. 동정된 단백질들 중에서, 1041종의 단백질들이 레이블링 기반의 정량 분석이 가능한 신호 대 잡음값들을 가지고 있었다. 통계적으로 유의한 단백질들을 찾아내기 위해서 1041종의 단백질들에 신호 대 잡음값에 기반한 abundance 값들에 대해서 3개의 군 (심혈관 동반질환이 있는 건선, 동반질환이 없는 건선, 음성 대조군)을 대상으로 ANOVA 검정을 수행하여 p-값이 0.05 미만인 단백질 184종을 얻을 수 있었고, 각 군간의 비교를 위해 Scheffe method를 이용한 사후검정을 통해 심혈관 동반질환이 있는 건선군과 없는 건선 군 사이의 발현 수준의 차이가 통계적으로 유의한 단백질 142종을 표 1로 나타내었다.
UniProt Accession No. 단백질 명칭 p-값 (ANOVA 검정)
Q92854 Semaphorin-4D 1.65E-06
O00754 Lysosomal alpha-mannosidase 6.72E-06
P08514 Integrin alpha-IIb 1.16E-05
P07996 Thrombospondin-1 5.05E-05
O60234 Glia maturation factor gamma 5.45E-05
Q9HCN6 Platelet glycoprotein VI 6.16E-05
P21926 CD9 antigen 1.20E-04
Q6ZRP7 Sulfhydryl oxidase 2 1.25E-04
Q5SQ64 Lymphocyte antigen 6 complex locus protein G6f 1.41E-04
P16278 Beta-galactosidase 1.52E-04
P08648 Integrin alpha-5 1.54E-04
Q15942 Zyxin 1.77E-04
Q86YW5 Trem-like transcript 1 protein 2.15E-04
P16109 P-selectin 2.22E-04
P35590 Tyrosine-protein kinase receptor Tie-1 2.54E-04
P29122 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 6 2.55E-04
Q8NI99 Angiopoietin-related protein 6 3.24E-04
P01008 Antithrombin-III 3.68E-04
Q14847 LIM and SH3 domain protein 1 3.71E-04
P02671 Fibrinogen alpha chain 5.40E-04
P30044 Peroxiredoxin-5, mitochondrial 6.09E-04
Q9UJU6 Drebrin-like protein 6.09E-04
P46109 Crk-like protein 6.38E-04
P40197 Platelet glycoprotein V 8.43E-04
P31431 Syndecan-4 9.26E-04
P05106 Integrin beta-3 9.58E-04
Q05682 Caldesmon 1.01E-03
P08581 Hepatocyte growth factor receptor 1.12E-03
P04275 von Willebrand factor 1.13E-03
Q9Y251 Heparanase 1.17E-03
P54727 UV excision repair protein RAD23 homolog B 1.50E-03
Q06481 Amyloid-like protein 2 1.56E-03
Q9NRW1 Ras-related protein Rab-6B 1.66E-03
Q9H1B5 Xylosyltransferase 2 1.79E-03
P06702 Protein S100-A9 1.96E-03
P10619 Lysosomal protective protein 1.99E-03
P23528 Cofilin-1 2.05E-03
Q15166 Serum paraoxonase/lactonase 3 2.18E-03
P58215 Lysyl oxidase homolog 3 2.21E-03
Q15555 Microtubule-associated protein RP/EB family member 2 2.40E-03
P10586 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase F 2.45E-03
Q9UKU6 Thyrotropin-releasing hormone-degrading ectoenzyme 2.57E-03
P21291 Cysteine and glycine-rich protein 1 2.58E-03
P04424 Argininosuccinate lyase 2.61E-03
P51149 Ras-related protein Rab-7a 2.62E-03
P19021 Peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase 3.26E-03
P10599 Thioredoxin 3.30E-03
Q15389 Angiopoietin-1 3.88E-03
O43852 Calumenin 3.92E-03
Q14247 Src substrate cortactin 3.99E-03
Q02763 Angiopoietin-1 receptor 4.30E-03
Q99439 Calponin-2 4.64E-03
P62491 Ras-related protein Rab-11A 4.66E-03
O75563 Src kinase-associated phosphoprotein 2 5.29E-03
O95866 Megakaryocyte and platelet inhibitory receptor G6b 5.37E-03
Q76LX8 A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 13 5.40E-03
Q13201 Multimerin-1 5.53E-03
O75368 SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein 5.57E-03
O43505 Beta-1,4-glucuronyltransferase 1 5.59E-03
P23381 Tryptophan--tRNA ligase, cytoplasmic 5.67E-03
P14543 Nidogen-1 5.99E-03
Q3ZCW2 Galectin-related protein 6.25E-03
P33241 Lymphocyte-specific protein 1 6.38E-03
Q8IWL2 Pulmonary surfactant-associated protein A1 6.52E-03
O14773 Tripeptidyl-peptidase 1 6.53E-03
P06681 Complement C2 6.63E-03
P58546 Myotrophin 6.74E-03
Q9NZN3 EH domain-containing protein 3 7.07E-03
P30740 Leukocyte elastase inhibitor 7.31E-03
Q6YHK3 CD109 antigen 8.09E-03
P63241 Eukaryotic translation initiation factor 5A-1 8.42E-03
P50552 Vasodilator-stimulated phosphoprotein 8.69E-03
Q08380 Galectin-3-binding protein 8.71E-03
P29279 CCN family member 2 8.76E-03
P14618 Pyruvate kinase PKM 9.06E-03
Q14019 Coactosin-like protein 9.20E-03
O14960 Leukocyte cell-derived chemotaxin-2 9.27E-03
P80303 Nucleobindin-2 9.47E-03
O15117 FYN-binding protein 1 9.50E-03
P04278 Sex hormone-binding globulin 9.58E-03
Q08830 Fibrinogen-like protein 1 9.68E-03
O15335 Chondroadherin 9.73E-03
Q71U36 Tubulin alpha-1A chain 9.81E-03
P36871 Phosphoglucomutase-1 9.86E-03
Q9UJC5 SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein 2 1.02E-02
Q9ULZ3 Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD 1.06E-02
Q9BYE9 Cadherin-related family member 2 1.09E-02
P23284 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B 1.10E-02
P68036 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 L3 1.18E-02
P37802 Transgelin-2 1.18E-02
P52907 F-actin-capping protein subunit alpha-1 1.21E-02
Q8WZA1 Protein O-linked-mannose beta-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase 1 1.25E-02
P62993 Growth factor receptor-bound protein 2 1.26E-02
P52566 Rho GDP-dissociation inhibitor 2 1.28E-02
P10720 Platelet factor 4 variant 1.30E-02
P04004 Vitronectin 1.34E-02
P60660 Myosin light polypeptide 6 1.34E-02
P20160 Azurocidin 1.42E-02
P26641 Elongation factor 1-gamma 1.50E-02
O14950 Myosin regulatory light chain 12B 1.51E-02
P00568 Adenylate kinase isoenzyme 1 1.53E-02
P02766 Transthyretin 1.55E-02
P68366 Tubulin alpha-4A chain 1.60E-02
Q96PD5 N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase 1.61E-02
P29350 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 1.68E-02
P05109 Protein S100-A8 1.75E-02
O00194 Ras-related protein Rab-27B 1.83E-02
O43157 Plexin-B1 1.86E-02
P06733 Alpha-enolase 1.89E-02
Q9BYH1 Seizure 6-like protein 2.04E-02
O95810 Caveolae-associated protein 2 2.05E-02
P61960 Ubiquitin-fold modifier 1 2.07E-02
Q92896 Golgi apparatus protein 1 2.15E-02
P04080 Cystatin-B 2.18E-02
O00299 Chloride intracellular channel protein 1 2.19E-02
P05067 Amyloid-beta precursor protein 2.20E-02
Q9H4M9 EH domain-containing protein 1 2.25E-02
Q13822 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2 2.27E-02
O00151 PDZ and LIM domain protein 1 2.47E-02
P06753 Tropomyosin alpha-3 chain 2.53E-02
Q9BUN1 Protein MENT 2.60E-02
P01019 Angiotensinogen 2.64E-02
Q13418 Integrin-linked protein kinase 2.69E-02
Q9Y6R7 IgGFc-binding protein 2.84E-02
Q86UX7 Fermitin family homolog 3 2.85E-02
P09493 Tropomyosin alpha-1 chain 2.86E-02
P30086 Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 2.95E-02
P35579 Myosin-9 3.00E-02
Q8IWV2 Contactin-4 3.01E-02
P12111 Collagen alpha-3(VI) chain 3.06E-02
Q9Y490 Talin-1 3.30E-02
P28906 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 3.35E-02
P41218 Myeloid cell nuclear differentiation antigen 3.58E-02
P37840 Alpha-synuclein 3.64E-02
P60842 Eukaryotic initiation factor 4A-I 3.71E-02
P07437 Tubulin beta chain 3.72E-02
Q86U17 Serpin A11 3.77E-02
Q92859 Neogenin 3.89E-02
P07339 Cathepsin D 3.91E-02
Q00013 55 kDa erythrocyte membrane protein 3.99E-02
P67936 Tropomyosin alpha-4 chain 4.04E-02
Q9NY97 N-acetyllactosaminide beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2 4.67E-02
다음으로, 통계적으로 유의미한 142 종의 단백질에서 건선 대비 심혈관 동반질환을 갖는 건선군에서 2배 이상 차등 발현을 나타내는 단백질을 추가로 선별하였다. 상기 선별된 단백질들에 대한 계층적 군집화 분석(hierarchical clustering analysis)에 대한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 것과 같이, 건선 대비 심혈관 동반질환을 보유한 건선군에서 2배 이상 차등 발현된 97종의 단백질을 확인하였다.
97종 단백질들 중에서, 심혈관 동반질환을 갖는 건선군에서 심혈관 동반질환을 갖지 않는 건선군에 비해 2배 이상 높게 발현되는 바이오마커를 확인하고 추가 선별하여, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
UniProt Accession No. 단백질 명칭 비율
(심혈관 동반질환을 갖는 건선군/ 없는 건선군)		 p-값: Scheffe method (심혈관 동반질환을 갖는 건선군/ 없는 건선군)
O95866 Megakaryocyte and platelet inhibitory receptor G6b (MPIG6B) 7.59 0.015
Q15555 Microtubule-associated protein RP/EB family member 2 (MAPRE2) 5.18 0.005
Q71U36 Tubulin alpha-1A chain (TUBA1A) 4.92 0.010
P46109 Crk-like protein (CRKL) 4.52 0.001
P21291 Cysteine and glycine-rich protein 1 (CSRP1) 4.38 0.008
O15117 FYN-binding protein 1 (FYB1) 4.24 0.014
O00194 Ras-related protein Rab-27B (RAB27B) 4.20 0.032
Q9BYE9 Cadherin-related family member 2 (CDHR2) 4.11 0.014
P51149 Ras-related protein Rab-7a(RAB7A) 3.72 0.006
Q86UX7 Fermitin family homolog 3 (FERMT3) 3.60 0.041
O95810 Caveolae-associated protein 2 (CAVIN2) 3.55 0.026
O60234 Glia maturation factor gamma (GMFG) 3.44 0.000
P63241 Eukaryotic translation initiation factor 5A-1 (EIF5A) 3.08 0.045
P30044 Peroxiredoxin-5, mitochondrial (PRDX5) 3.01 0.013
P30740 Leukocyte elastase inhibitor (LEI) 2.90 0.001
P54727 UV excision repair protein RAD23 homolog B (RAD23B) 2.57 0.011
P30086 Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 (PEBP1) 2.46 0.007
P10720 Platelet factor 4 variant (PF4V1) 2.43 0.032
P14618 Pyruvate kinase PKM (PKM) 2.33 0.024
Q13201 Multimerin-1 (MMRN1) 2.11 0.016
P05067 Amyloid-beta precursor protein (APP) 2.05 0.015
Q92896 Golgi apparatus protein 1 (GLG1) 2.03 0.044
따라서, 표 2에 기재된 바이오마커는 건선 환자에서 심혈관 동반질환을 예측하는 유의한 바이오마커임을 알 수 있다.
또한, 피부질환이나 심혈관 동반질환이 없는 음성대조군과 심혈관 동반질환을 갖지 않은 건선군과에서의 차이를 보이는 바이오마커를 사후분석을 통해 확인하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 그 결과, 하기 표 3에 기재된 MPIG6B, MAPRE2, CSRP1, RAB7A, 및 APP는 건선 및 심혈관 동반 질환이 없는 음성대조군과 심혈관 동반 질환이 없는 건선군 사이에서 통계적으로 유의미한 발현 수준 차이가 있는 것으로 확인되며, 구체적으로, 상기 바이오마커는 음성대조군-심혈관 동반질환이 없는 건선 환자-심혈관 동반질환이 있는 건선 환자 순으로 발현 수준이 증가되는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 바이오마커들을 이용하면 심혈관 동반질환의 발병 가능성이 건선에서 특이적으로 증가하는지를 보다 명확히 확인할 수 있다.
UniProt Accession No. 단백질 명칭 비율
(음성대조군/심혈관 동반질환 없는 건선군)		 p-값
(음성대조군/심혈관 동반질환 없는 건선군)
O95866 Megakaryocyte and platelet inhibitory receptor G6b (MPIG6B) 0.34 0.025
Q15555 Microtubule-associated protein RP/EB family member 2 (MAPRE2) 0.68 0.021
P21291 Cysteine and glycine-rich protein 1 (CSRP1) 0.81 0.014
P51149 Ras-related protein Rab-7a(RAB7A) 0.97 0.019
P05067 Amyloid-beta precursor protein (APP) 0.96 0.027
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (14)

  1. MPIG6B (Megakaryocyte and platelet inhibitory receptor G6b); MAPRE2 (Microtubule-associated protein RP/EB family member 2); TUBA1A (Tubulin alpha-1A chain); CRKL (Crk-like protein); CSRP1 (Cysteine and glycine-rich protein 1); FYB1 (FYN-binding protein 1); RAB27B (Ras-related protein Rab-27B); CDHR2 (Cadherin-related family member 2); RAB7A (Ras-related protein Rab-7a); FERMT3 (Fermitin family homolog 3); CAVIN2 (Caveolae-associated protein 2); GMFG (Glia maturation factor gamma); EIF5A (Eukaryotic translation initiation factor 5A-1); PRDX5 (Peroxiredoxin-5, mitochondrial); LEI (Leukocyte elastase inhibitor); RAD23B (UV excision repair protein RAD23 homolog B); PEBP1 (Phosphatidylethanolamine-binding protein 1); PF4V1 (Platelet factor 4 variant); PKM (Pyruvate kinase PKM); MMRN1 (Multimerin-1); APP (Amyloid-beta precursor protein); 및 GLG1 (Golgi apparatus protein 1) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 건선 환자에서 심혈관 동반질환 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 심혈관 동반질환은 고혈압, 이상지질혈증, 또는 이들의 조합인 것인, 조성물.
  3. MPIG6B, MAPRE2, TUBA1A, CRKL, CSRP1, FYB1, RAB27B, CDHR2, RAB7A, FERMT3, CAVIN2, GMFG, EIF5A, PRDX5, LEI, RAD23B, PEBP1, PF4V1, PKM, MMRN1, APP, 및 GLG1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 건선 환자에서 심혈관 동반질환 진단용 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 제제는
    상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머; 또는
    상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산인 것인, 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체인 것인, 조성물.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 핵산은 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인 조성물.
  7. 청구항 3 내지 6 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 건선 환자에서 심혈관 동반질환 진단용 키트.
  8. 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 MPIG6B, MAPRE2, TUBA1A, CRKL, CSRP1, FYB1, RAB27B, CDHR2, RAB7A, FERMT3, CAVIN2, GMFG, EIF5A, PRDX5, LEI, RAD23B, PEBP1, PF4V1, PKM, MMRN1, APP, 및 GLG1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 건선 환자에서 심혈관 동반질환을 진단하기 위한 정보제공 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합인 것인, 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, 상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드와 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 전자현미경법(electron microscopy), 또는 이들의 조합으로 수행되는 것인, 방법.
  13. 청구항 8에 있어서, 상기 방법은 상기 측정된 개체의 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 방법은 상기 개체에서 측정된 발현 수준이 대조군의 발현 수준과 비교하여 증가된 경우, 상기 개체를 심혈관 동반질환이 발병한 것으로 판정하거나 발병 위험을 높은 수준으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
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