KR102627953B1 - 질량분석법 기반의 우울장애 및 양극성 장애 구분용 바이오마커 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
본원은 혈액 시료에서 대상체가 주요 우울장애인지 또는 양극성 장애인지를 질량분석법으로 검출할 수 있는 바이오마커 패널을 개시한다. 본원에 따른 패널은 혈액을 이용하여 정보를 제공할 수 있어 질환의 진행을 늦출 수 있어 환자의 삶의 질의 개선은 물론 병이 심화됨에 따라 추가될 수 있는 사회적 및 경제적 비용의 감소에 기여할 수 있다.
Description
본원은 주요 우울장애와 양극성장애를 구분할 수 있는 바이오마커에 관한 것이다.
주요 우울장애와 양극성장애는 흔한 정신질환이다. Disability-adjusted life year (DALY) 수치에 따르면 대한민국에서 우울장애와 양극성장애는 각각 1위, 4위의 순위에 오를 만큼 경제적 부담을 증대시키고 삶의 질을 악화시키는 질환이다.
우울장애와 양극성장애는 서로 비슷한 증상을 나타내기 때문에 두 증상을 정확하게 구분하는 것은 어렵고 아직까지는 증상 및 행동 관찰의 결과를 토대로 두 질환을 진단하고 있다. 구체적으로 우울 장애와 양극성장애의 경우 설문지 방식의 테스트 또는 환자와 임상의 간의 인터뷰를 통해 주로 진단이 수행된다. 하지만 사용되는 설문지의 종류가 다양하고 우울 장애와 양극성장애를 진단하는 기준이 통일되지 않아 설문지에 따라 서로 다른 진단 결과가 도출될 가능성이 있다.
이런 이유로 약 40%의 양극성장애 환자가 우울 장애 환자로 잘못 진단되고 있고 이는 잘못된 처방을 야기하여 질환의 증상을 더욱더 악화시키는 상황이 발생하고 있다.
따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해 두 질환을 정확하게 구분할 수 있는 방법의 필요성이 대두되고 있지만 증상 및 행동관찰 결과를 기반으로 하는 방법 이외에 정량적 수치를 기반으로 두 질환을 구별하는 기술이 개발된 사례는 없으며 이러한 기술의 개발이 필요하다.
선행기술
미국 특허출원 공개공보 2009-0297494
본원에서 질량분석법 기반의 주요 우울장애와 양극성 장애를 정확하게 진단할 수 있는 바이오마커 및 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 C1QB (Complement C1q subcomponent subunit B), DSG3(Desmoglein-3), FBLN1(Fibulin-1), FCGBP(IgGFc-binding protein), FHR3(Complement factor H-related protein 3), GPX3(Glutathione peroxidase 3), IGHM(Immunoglobulin heavy constant mu), ITIH2(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2) 및 PF4(Platelet factor 4) 조합의 바이오마커 발현 수준을 측정하기 위한 물질을 포함하는 주요 우울 장애와 양극성 장애 구분 진단용 바이오마커 조성물을 제고한다.
일 구현예에서 상기 발현량은 질량분석법으로 수행되며, 상기 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함한다.
일 구현예에서 상기 질량 분석법에 사용되는 모드는 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM) 또는 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM)이다.
일 구현예에서 상기 질량 분석법 모드는 MRM이고, 상기 MRM에 분석에 사용되는 상기 각 바이오마커의 펩타이드는 다음 표 1과 같다.
다른 양태에서 본원은 또한 주요 우울장애 또는 양극성 장애 여부 판단에 대한 정보를 제공하기 위해, 대상체로부터 분리된 혈액으로부터 본원 표 1에 기재된 바이오마커 조합의 각 바이오마커의 발현 수준을 질량분석법으로 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과를 정상 대조군의 혈액시료의 해당 마커의 상응하는 측정 결과와 비교하여 상기 대상체를 주요 우울 장애 또는 양극성 장애와 연관시키는 단계를 포함하는, 인비트로에서 주요 우울장애 또는 양극성 장애 구분하여 진단 또는 판단하기 위한 바이오마커 검출 방법을 제공한다.
일 구현예에서 상기 질량 분석법은 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함하며, 특히 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM)으로 수행되며, 이때 각 바이오마커별 펩타이드는 표 1과 같다.
본원에 따른 방법에서 연관시키는 단계에서, 상기 대상체의 측정 결과 그 발현 수준이 상기 대조군에 측정된 발현 수준과 상이한 경우 상기 대상체를 주요 우울장애 또는 양극성 장애로 판단하며, 상기 주요 우울장애는 대조군과 비교하여, DSG3, GPX3, ITIH2 및 PLF4는 발현이 증가하고, 그리고 C1QB, FBLN1, FCGBP, FHR3 및 FHR3는 발현이 감소하며, 상기 양극성 장애는 대조군과 비교하여, C1QB, FBLN1, FCGBP, FHR3, IGHM, 및 PLF4는 발현 증가하고 DSG3, GPX3, 및 ITIH2는 발현이 감소한다.
본원에 따른 바이오마커는 증상 및 행동관찰 결과를 기반으로 하는 현재의 주요 우울장애 및 양극성 장애를 진단하는 방법과 비교하여 단백질의 정량 수치를 기반으로 진단하므로, 기존의 진단 방식보다 객관적으로 두 질환을 구별할 수 있어 두 질환 간 오진율이 감소할 수 있어 정확한 진단 및 이에 따른 처방이 가능하게 한다.
도 1은 본원에 따른 바이오마커 발굴 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 질량분석기반 다중반응검지법을 수행하여 단백질 바이오마커 후보군 을 정량하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는 각각 발굴한 바이오마커를 조합하여 개발한 단백질 다중 마커 모델의 모델 개발에 사용한 Training set과 모델 평가에 사용한 Test set에서의 구별력을 나타낸다. Training set에서는 AUROC=0.84의 구별력 을 나타내었고 우울 장애 [major depressive disorder (MDD)] 및 양극성 장애 [bipolar disoder (BD)]를 84% 확률로 감별하는 것으로 나타났다. 또한 Test set에서는 AUROC=0.81의 구별력을 나타내었는데 이는 두 장애를 81% 확률로 감별하는 것을 나타낸다. 따라서 본원에서 개발한 모델은 두 데이터 셋 (본원의 Training 그리고 test set)에서 모두 우수한 성능 (AUROC>0.8)을 보였으며 두 데이터 셋간 비슷한 구분력이 도출되었으므로 본원에서 개발한 모델은 특정 데이터 셋에 과적합하지 않은 일반화 모델임을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4d는 본원에서 개발한 모델의 여러 하위 비교군에서의 구별력을 나타낸다. 도 4a는 우울장애 환자와 양극성 장애 환자 중 우울 장애상을 나타내는 환자의 구별력을 나타내며 AUROC=0.83 이다. 도 4b는 우울 장애 및 양극성 장애 환자들 중 약물 복용력이 없는 환자의 구별력을 나타내며 AUROC=0.96이다. 도 4c는 우울 장애 환자와 정상 대조군의 구별력을 나타내며 AUROC=0.87이다. 도 4d는 양극성 장애 환자와 정상 대조군의 구별력을 나타내며 AUROC=0.86이다. 따라서 본원에서 개발한 모델은 우울 장애 및 양극성 장애의 여러 하위 그룹에 대하여 좋은 성능 (AUROC>0.8)을 나타내며 또한 환자 그룹과 정상 대조군에 대해서도 우수한 성능 (AUROC>0.8)을 나타내었으며 이는 여러 조건의 비교 군에서 적용 가능 한 모델임을 나타낸다.
도 2는 질량분석기반 다중반응검지법을 수행하여 단백질 바이오마커 후보군 을 정량하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는 각각 발굴한 바이오마커를 조합하여 개발한 단백질 다중 마커 모델의 모델 개발에 사용한 Training set과 모델 평가에 사용한 Test set에서의 구별력을 나타낸다. Training set에서는 AUROC=0.84의 구별력 을 나타내었고 우울 장애 [major depressive disorder (MDD)] 및 양극성 장애 [bipolar disoder (BD)]를 84% 확률로 감별하는 것으로 나타났다. 또한 Test set에서는 AUROC=0.81의 구별력을 나타내었는데 이는 두 장애를 81% 확률로 감별하는 것을 나타낸다. 따라서 본원에서 개발한 모델은 두 데이터 셋 (본원의 Training 그리고 test set)에서 모두 우수한 성능 (AUROC>0.8)을 보였으며 두 데이터 셋간 비슷한 구분력이 도출되었으므로 본원에서 개발한 모델은 특정 데이터 셋에 과적합하지 않은 일반화 모델임을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4d는 본원에서 개발한 모델의 여러 하위 비교군에서의 구별력을 나타낸다. 도 4a는 우울장애 환자와 양극성 장애 환자 중 우울 장애상을 나타내는 환자의 구별력을 나타내며 AUROC=0.83 이다. 도 4b는 우울 장애 및 양극성 장애 환자들 중 약물 복용력이 없는 환자의 구별력을 나타내며 AUROC=0.96이다. 도 4c는 우울 장애 환자와 정상 대조군의 구별력을 나타내며 AUROC=0.87이다. 도 4d는 양극성 장애 환자와 정상 대조군의 구별력을 나타내며 AUROC=0.86이다. 따라서 본원에서 개발한 모델은 우울 장애 및 양극성 장애의 여러 하위 그룹에 대하여 좋은 성능 (AUROC>0.8)을 나타내며 또한 환자 그룹과 정상 대조군에 대해서도 우수한 성능 (AUROC>0.8)을 나타내었으며 이는 여러 조건의 비교 군에서 적용 가능 한 모델임을 나타낸다.
본원은 증상 및 행동관찰 결과를 기반으로 하는 현재의 주요 우울장애 [major depressive disorder (MDD)] 및 양극성 장애 [bipolar disoder (BD)]를 진단하는 방법과 비교하여 바이오마커 단백질 정량 기반의 객관적 수치를 기반으로 하는 주요 우울 장애와 양극성장애 환자를 구별하여 진단할 수 있는 혈액 패널의 발견에 기반한 것이다.
주요 우울장애는 감정 기복의 순환 (rapid cycling) 없이 일정한 우울 상태를 보이는 특성을 나타내며 의욕 저하와 우울감을 주요 증상으로 하여 다양한 인지 및 정신 신체적 증상을 일으켜 일상 기능의 저하를 가져오는 질환을 말한다. 진단은 미국 정신의학회(American Psychiatric Association)의 정신장애 진단 통계편람(DSM-Ⅳ-TR)의 기준에 따라 임상의의 면담 및 설문조사에 따라 진행된다.
양극성장애는 감정 기복이 있는 질환으로 감정 기복의 상태 변화에 따라 BD-1, BD-2 상태 또는 BD-not otherwise specified (NOS)를 나타낸다. BD-1은 우울한 상태와 강한 조증 (hypermanic symptom)의 상태를 나타내며 BD-2는 우울한 상태와 약한 조증 (hypomanic symptom) 상태를 나타내고, BD-NOS는 무증상 상태를 나타낸다.
양극성 장애 및 주요 우울장애 환자들의 진단은 정신질환 진단 및 통계 매뉴얼 제5판 [Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition (DSM-5)](Regier, D. A., Kuhl, E. A., & Kupfer, D. J. (2013). The DSM-5: Classification and criteria changes. World psychiatry, 12(2), 92-98; American Psychiatric Association, & American Psychiatric Association. (2013). Diagnostic and statistical manual of mental disorders: DSM-5. Arlington, VA)에 따라 수행하며 미니 국제 신경정신과 인터뷰 [Mini-International Neuropsychiatric Interview (MINI)]를 통해 최종 진단을 결정한다 (Lecrubier, Y., Sheehan, D. V., Weiller, E., Amorim, P., Bonora, I., Sheehan, K. H., ... & Dunbar, G. C. (1997). The Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI). A short diagnostic structured interview: reliability and validity according to the CIDI. European psychiatry, 12(5), 224-231; Sheehan, D. V., Lecrubier, Y., Sheehan, K. H., Amorim, P., Janavs, J., Weiller, E., ... & Dunbar, G. C. (1998). The Mini-International Neuropsychiatric Interview (MINI): the development and validation of a structured diagnostic psychiatric interview for DSM-IV and ICD-10. Journal of clinical psychiatry, 59(20), 22-33.).
본원에서는 혈액 시료를 사용하여 정상군 90례, 주요 우울 장애 90례, 그리고 양극성장애 총 90례 (BD-1: 43례, BD-2: 43례, 그리고 NOS 4례)로 구성하였으며 다중반응검지법을 사용하여 우울 장애 및 양극성장애 바이오마커 후보군을 정량하였다. 정량한 바이오마커를 대상으로 머신 러닝 기법을 사용하여 단백체 다중마커패널 (proteomic multimarker panel)을 구축하였고 본 패널의 구분 성능을 측정하였다.
본원에 바이오마커는 특히 다중반응검지법을 사용하여 분석될 수 있다. 이를 이용하면 한 번의 미량의 시료 주입으로 70분의 분석 시간 동안 최대 300개까지의 바이오마커의 정량을 수행할 수 있다. 이는 항체 (antibody)를 사용하는 정량법과 비교했을 때 정량 결과의 변동성이 비교적 적고 보다 경제적으로 정량을 수행 할 수 있다. 질량분석기 기반의 다중반응검지법이 구축되어있는 병원에서는, 본원에 따른 바이오마커를 적은 변동성, 높은 재현성 및 정확도로 혈액내 단백질 바이오마커를 정량하여 향상된 정확도로 우울 장애 또는 양극성장애인지의 구별 진단이 가능하다.
이에 한 양태에서 본원은 C1QB (Complement C1q subcomponent subunit B), DSG3(Desmoglein-3), FBLN1(Fibulin-1), FCGBP(IgGFc-binding protein), FHR3(Complement factor H-related protein 3), GPX3(Glutathione peroxidase 3), IGHM(Immunoglobulin heavy constant mu), ITIH2(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2) 및 PF4(Platelet factor 4) 바이오마커 또는 조합 바이오마커에 관한 것이다.
일 구현예에서 본원은 C1QB, DSG3, FBLN1, FCGBP, FHR3, GPX3, IGHM, ITIH2 또는 PF4 바이오마커 또는 상기 마커 조합의 바이오마커 발현 수준을 질량분석법으로 측정하기 위한 물질을 포함하는 주요 우울 장애와 양극성 장애 구분용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
본원에 따른 바이오마커 분석을 위한 질량 분석법은 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함한다.
일 구현예에서 본원에 따른 질량 분석법에 사용되는 모드는 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM) 또는 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM)이다.
본원에 따른 방법에 사용되는 질량분석법은 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 및/또는 비행시간 질량 분석법을 포함할 수 있다. 이때 사용되는 질량 분석법 모드는, 예를 들어 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM), 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM) 일 수 있다.
일 구현예에서는 특히 MRM 모드가 사용된다. MRM 질량분석법의 원리는 선정된 타겟 단백질들을 모두 펩타이드로 가수분해 시킨 후에, 각 타겟 단백질들에 특이적인 mass to charge (m/z)를 가지는 펩타이드(precursor ion, MS1)를 선택한다. 이 특이적인 펩타이드를 충돌시켰을 때(Quadruple 2, Q2), 발생하는 파편들 중에서 특징적인 m/z를 가지는 특이적 질량을 가진 단편(fragmentation ion, MS2)을 선택한다. MS1/MS2에서 각각 얻어지는 precursor ion/fragment ion의 쌍을 타겟 단백질의 특이적 transition(타겟 단백질의 특이적 질량 지문)이라 명명하며, 이 transition들을 모든 타겟 단백질(300 단백질 이상)에 대해서 측정하면 시료에 있는 모든 타겟 단백질의 양을 동시에 상대 혹은 절대 정량할 수 있다. 상대 혹은 절대 정량을 위해서는 SIS (동위원소 치환된 동일 아미노산 순서의) 펩타이드를 표준 물질로 사용하는데, 측정 시료의 input 표준 물질 (SIS 펩타이드) 양을 알고 있기 때문에 타겟 펩타이드 양을 비례적으로 계산할 수 있는 원리이다. MS2를 통과한 transition은 검출기에서 digital signal로 전환되어 peak chromatogram으로 전환되며 peak 면적을 계산하여 상대 및 절대 정량 분석을 수행할 수 있게 된다.
본원에 따른 바이오마커를 질량 분석법으로 수행하는 경우 각 바이오마커에서 검출되는 펩타이드 서열은 다음과 같다.
[표 1]
본원에 따른 바이오마커를 검출 수 있는 검체 또는 시료는 혈액, 전혈, 혈청 또는 혈장이다. 본원의 일 구현예에서 상기 시료는 혈액, 특히 혈장 시료이다. 시료로서 혈액을 이용하는 경우, 단백질 고갈 및 변성 후 단백질 분해 효소(예컨대, 트립신 및/또는 키모트립신)로 분해하여 사용할 수 있다.
본원에 따른 바이오마커 검출에 사용되는 검체 또는 시료는 포유류 특히 인간으로부터 수득된다. 인간 대상체는 기분장애 환자로서 주요 우울 장애와 양극성장애의 구분이 필요한 사람이다.
본원에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 트랜지션성 암 상태의 동정, 암의 단계 또는 진행상태 판별 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정을 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
다른 양태에서 본원은 주요 우울장애 또는 양극성 장애 여부 판단에 대한 정보를 제공하기 위해, 대상체로부터 분리된 혈액으로부터 본원에 따른 바이오마커 조합: C1QB, DSG3, FBLN1, FCGBP, FHR3, GPX3, IGHM, ITIH2 및 PF4의 각 바이오마커의 발현 수준을 질량분석법으로 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과를 정상 대조군의 혈액시료의 해당 마커의 상응하는 측정 결과와 비교하여 상기 대상체를 주요 우울 장애 또는 양극성 장애와 연관시키는 단계를 포함하는, 인비트로에서 주요 우울장애 또는 양극성 장애 여부를 판단하기 위한 바이오마커 검출 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법에 사용되는 질량분석법, 검체, 각 바이오마커의 펩타이드 서열은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.
본원에 따른 방법에서 상기 연관시키는 단계에서, 상기 대상체의 측정 결과 그 발현 수준이 상기 대조군에 측정된 발현 수준과 상이한 경우 상기 대상체를 주요 우울장애 또는 양극성 장애로 판단하며, 상기 주요 우울장애는 대조군과 비교하여, DSG3, GPX3, ITIH2 및 PLF4는 발현이 증가하고, 그리고 C1QB, FBLN1, FCGBP, FHR3 및 FHR3는 발현이 감소하며, 상기 양극성 장애는 대조군과 비교하여, C1QB, FBLN1, FCGBP, FHR3, IGHM, 및 PLF4는 발현 증가하고 DSG3, GPX3, 및 ITIH2는 발현이 감소한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 임상 시료 및 임상적 특징
우울 장애 및 양극성장애와 연관된 단백질 바이오마커 후보군의 검출 여부를 판단하기 위해 우울 장애 plasma 시료 50례, 양극성장애 plasma 시료 50례, 그리고 정상대조군 plasma 시료 50례를 풀링한 시료를 사용하였다. 특히 양극성장애는 BD-1 43례, BD-2 43례, BD-NOS 4례 로 구성되어 있다. 선정된 우울 장애 및 양극성장애 단백질 바이오마커 후보군의 정량을 위해 사용된 개별시료는 우울 장애 90례, 양극성장애 90례, 그리고 정상대조군 90례로 구성하여 실험을 진행하였다. 본원은 최신판의 헬싱키 선언을 기반으로 수행하였으며 서울대병원 기관심사위위원회(IRB no. 1806-106-951) 및 모든 참여 병원에 의해 검토되었다. 본원은 환자들의 참여 및 환자 시료 사용에 대한 사전 동의를 얻었다.
환자의 임상적 특징은 다음 표 2-1 및 2-2와 같다.
[표 2-1]
본 연구에 참여한 대상자의 인구학적 및 임상적 특징a
[표 2-2]
본 연구에 참여한 대상자의 인구학적 및 임상적 특징a
실시예 2. 단백질 바이오마커 후보 군 리스트 구축
문헌조사 및 데이터 마이닝을 통해 우울 장애 및 양극성장애와 관련된 단백질 바이오마커 후보군 리스트를 구축하였다. 우울 장애 및 양극성장애와 관련된 단백질 바이오 마커 후보군 선정은 다음과 같이 3가지 데이터 베이스에서 유래된 단백질 리스트를 통합하여 수행하였다. 1) 우울 장애 및 양극성장애 환자의 혈액 단백체 프로파일링 리스트, 2)선행 연구들에서 보고 된 우울 장애 및 양극성 장애 관련 단백질 리스트, 그리고 3) US Food and Drug Administration (FDA)에서 승인된 질병 관련 단백질 바이오마커 리스트를 통합하여 686개의 초기 바이오마커 후보 리스트를 결정하였다. 초기 686개의 바이오마커 후보들 중 질량 분석기에서 검출 가능성이 높은 단백질을 선정하기위해 3가지의 질량분석기반 스펙트라 라이브러리[the Institute for Systems Biology (https://www.systemsbiology.org), National Institute of Standards and Technology (https://www.nist.gov), and the SWATHAtlas database (www. SWATHAtlas.org)]를 사용하였다. 그 결과 648 단백질 (7369 unique 펩타이드)이 스펙트라 라이브러리와 매칭되어 선정되었다. 선정한 648개의 단백질이 실제 우울 장애 및 양극성 장애 환자의 혈액에서 검출되는지 여부를 확인하기 위해 우울 장애 및 양극성장애 환자 혈액시료 각 50례에서 질량분석기반 다중반응검지법을 수행하였고 검출 기준은 다음과 같다. 1) 각 단백질 당 최소한 5개의 fragmented ion (펩타이드 절편 이온) 검출, 2) 예측된 검출 시간 범위 (Predicted retention time range) 내에 포함된 단백질, 그리고 3) 스펙트라 라이브러리와의 상관관계가 0.8 이상 (dot product > 0.8)을 만족하는 단백질. 그 결과 검출 기준을 만족하는 412개 (1052 unique 펩타이드)의 단백질이 선정되었다. 검출된 412개의 단백질 (1052 unique 펩타이드)과 이 단백질에 상응하는 1052개의 내부 표준물질(합성 펩타이드)가 동시에 혈액에서 안정적으로 검출되는지 확인하기 위해 우울 장애 및 양극성장애 환자 혈액시료 각 50례에서 질량분석기반 다중반응검지법을 수행하였다. 검출 기준은 다음과 같다. 1) 단백질과 그에 상응하는 내부 표준물질이 동시에 용출 됨 (Co-elution), 2) Intensity (abundance)가 높은 순서로 최대 5개의 펩타이드를 포함하는 단백질, 그리고 3) Automated Detection of Inaccurate and Imprecise Transitions (AuDIT) 방법을 통해 통계적으로 신뢰도가 높고 internsity가 가장 높은 단백질. 그 결과 검출 기준을 만족하는 210개 단백질(671 unique 펩타이드)이 최종 바이오 마커 후보군으로 결정되었다.
실시예 3. MRM-MS를 사용한 단백질 바이오마커 분석
01. Protein depletion
혈액 시료에서 약 90%을 구성하고 있는 6가지의 high-abundant protein (albumin, IgG, IgA, haptoglobin, transferrin, alpha-1-antitrypsin)을 High performance liquid chromatogram (HPLC)와 MARS-6 column이 결합된 방식을 통해 제거 하였다. 대부분의 혈액 질병 바이오마커의 경우 혈액 내에 매우 낮은 농도로 존재하므로 high-abundant protein을 제거하여 혈액에서 low-abundant protein의 정량의 효율성을 높혔다.
02. SIS peptide spiking
단백질 바이오마커의 상대 정량을 위해 stable isotope standard (SIS) 펩타이드를 시료에 주입하여 정량을 진행하였다. SIS 펩타이드는 혈액 내의 단백질 바이오마커와는 화학적 특성은 같아서 같은 retention time에 두 종류의 펩타이드가 분석이 되고, 질량값에는 차이가 있어서 peak integration을 할 때 두 펩타이드의 peak를 각각 얻을 수 있다. 두 펩타이드의 peak intensitiy의 비율을 (혈액 단백질의 펩타이드 intensity)/(SIS 펩타이드 intensity)로 계산하여 상대 정량을 하면 단백질 정량 시에 생길 수 있는 감도의 차이 등을 보정할 수 있다.
03. 6490 Triple Quadrupole LC-MS/MS 분석 (multiple reaction monitoring-mass spectrometry)
다중반응검지법 (multiple reaction monitoring-mass spectrometry)은 한 번의 미량의 시료를 주입하는 것으로 70분의 분석 시간동안 최대 300개의 단백질을 정량할 수 있는 기술이다. 시료의 전처리 과정을 통해 단백질을 펩타이드 단위로 단편화하여 이온화시킨 후 질량분석기에 주입한다. 이온화된 펩타이드는 Triple quadrupole mass spectrometry에 주입되면 Q1, Q2, Q3을 거치면서 특정 질량값을 가진 이온이 정량된다. Q1에서는 특정 질량값을 가진 펩타이드 단백질이 mass filter 기능에 의해 선별되어 Q2로 전달되고, Q2에서는 전달받은 펩타이드 이온에 Collision energy를 가하여 fragmentation을 하여 product ion으로 만든다. 이를 Q3에 전달하면 Q3에서는 특정 질량값을 가진 product ion을 mass filter 기능으로 선별한다. 다중마커패널을 구성하고 있는 단백질의 종류가 다수이고, 분석해야 하는 시료의 수도 총 270례로 비교적 많기 때문에 한 번의 분석으로 대량의 단백질을 정량할 수 있는 MRM-MS 기법을 사용하였다. 총 270례의 혈액(plasma) 시료를 전처리 한 후에 6490 Triple Quadrupole 질량분석기를 사용하여 다중반응검지법 (multiple reaction monitoring-mass spectrometry)를 수행하였다. 질량분석 장비로 주입된 시료는 ACN gradient는 3%에서 40%로 증가시키면서 52분 동안 분획되었고, Q1에서 특정 질량값 (m/z)을 가진 peptide ion을 선별하여 Q2에서 product ion으로 fragmentation 했다. 이후 Q3에서 특정 질량값을 가진 product ion을 선별하였다. 분석 후 나온 raw data는 Skyline software을 사용하여 peak integration을 수행하였고 이를 통해 각 단백질 바이오마커 후보군의 상대 정량 값 (peak area ratio)를 산출하였다.
실시예 4. 머신러닝 기법을 통한 우울 장애 및 양극성장애 구분을 위한 다중마커패널의 제작 및 성능 측정
상기 정량한 단백질을 대상으로 머신러닝 기법 중 하나인 LASSO (Friedman, J., Hastie, T., & Tibshirani, R. (2010). Regularization paths for generalized linear models via coordinate descent. Journal of statistical software, 33(1), 1.)를 사용하여 다중마커패널을 구축하였다. 개발된 다중마커패널은 우울 장애와 양극성장애를 구분하고 우울 장애 및 양극성장애의 하위아형, 우울 장애 및 정상대조군, 그리고 양극성장애 및 정상대조군을 구별할 수 있다. 우울 장애 및 양극성장애의 경우 발병 요인이 가족력, 생활환경, 및 생활습관 등 복합적이기 때문에 이를 단일의 바이오마커를 사용하여 구별하기에는 적합하지 않다고 판단하여 다수의 단백질을 조합해서 진단 패널을 제작하였다.
총 180례 (우울 장애 및 양극성장애 각 90례)에 대한 MRM-MS 데이터를 8대 2의 비율로 training set과 test set으로 나눈 후 training set에서는 다중마커패널개발, 그리고 test set에서는 다중마커패널 성능의 평가를 수행하였다. Training set에서 총 210개의 단백질 정량 데이터를 대상으로 머신러닝 (LASSO)기반의 통계분석을 수행한 결과 9개의 단백질이 조합된 다중마커패널이 구축되었다. 구축된 다중마커패널은 두 질환에 대해 AUROC 0.84의 구분력을 보였으며 Test set에서 다중마커패널의 성능을 예측했을 때도 이와 비슷한 AUROC 0.81의 구분력을 보였다. (도 3 참조). 따라서 구축된 다중마커패널은 Training set과 Test set에서 두 질환의 구분 성능이 크지 않다는 것을 확인 할 수 있었고 이는 개발한 다중마커패널이 특정 데이터 셋에 치우치지 않는 일반화된 다중마커패널임을 나타낸다.
또한 개발한 다중마커패널은 우울 장애 90례 및 양극성장애 환자들 중 hypomanic/manic/mixed symtoms를 제외한 75례, 총 165례에 대하여도 Training set과 test set과 비슷한 AUROC=0.83의 구분 성능을 보였다. 또한 우울 장애 및 양극성장애 환자들 중 일정기간동안 약물투여여부가 없는 (drug-free) 환자들, 각 우울 장애 11례, 양극성 장애 10례를 대상으로 모델의 구분성능을 예측한 결과 AUROC=0.96의 높은 구분 성능을 보였다. (도 4 참조).
더욱이, 개발한 모델을 정상대조군(healthy control)과 질환군 (우울 장애 또는 양극성장애)간의 구분력을 예측한 결과 우울 장애와 정상대조군의 경우 AUROC=0.87, 양극성장애와 정상대조군의 경우 AUROC=0.87의 구분력을 보였다. 이는 개발한 다중마커패널이 질환 간 비교 분석 뿐만아니라 질환내의 특성에 따른 여러 가지 subgroups간의 비교분석 및 질환과 정상대조군과의 비교분석에서도 높은 구분 성능을 나타낸다. 따라서 개발한 모델은 여러 비교군 분석에서도 적용할 수 있는 일반화된 다중마커패널임을 나타낸다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
Seoul National University Hosptital
<120> Biomarker fo determining major depressive disorder and bipolar
disorder based on mass spectrometry and its use
<130> DP202111002P
<150> KR 10-2021-0035894
<151> 2021-03-19
<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(14)
<223> C1QB
<400> 1
Leu Glu Gln Gly Glu Asn Val Phe Leu Gln Ala Thr Asp Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(13)
<223> DSG3
<400> 2
Leu Ala Glu Ile Ser Leu Gly Val Asp Gly Glu Gly Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(16)
<223> FBLN1
<400> 3
Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Pro Pro Ala Glu Pro Cys Gly Lys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(12)
<223> FCGBP
<400> 4
Ala Ile Gly Tyr Ala Thr Ala Ala Asp Cys Gly Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(10)
<223> FHR3
<400> 5
Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Thr Glu Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(15)
<223> GPX3
<400> 6
Asn Ser Cys Pro Pro Thr Ser Glu Leu Leu Gly Thr Ser Asp Arg
1 5 10 15
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(16)
<223> IGHM
<400> 7
Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys
1 5 10 15
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(7)
<223> ITIH2
<400> 8
Ile Tyr Leu Gln Pro Gly Arg
1 5
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(11)
<223> PLF4
<400> 9
Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys
1 5 10
Claims (9)
- C1QB (Complement C1q subcomponent subunit B), DSG3(Desmoglein-3), FBLN1(Fibulin-1), FCGBP(IgGFc-binding protein), FHR3(Complement factor H-related protein 3), GPX3(Glutathione peroxidase 3), IGHM(Immunoglobulin heavy constant mu), ITIH2(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2) 및 PF4(Platelet factor 4)를 포함하는 바이오마커 발현 수준을 질량분석법으로 측정하기 위한 물질을 포함하는 주요 우울 장애와 양극성 장애 구분용 바이오마커 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함하는 것인, 주요 우울 장애와 양극성 장애 구분용 바이오마커 조성물.
- 제 2 항에 있어서,
상기 질량 분석법에 사용되는 모드는 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM) 또는 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM)인 것인, 주요 우울 장애와 양극성 장애 구분용 바이오마커 조성물. - 제 3 항에 있어서,
상기 질량 분석법 모드는 MRM이고, 상기 MRM에 분석에 사용되는 상기 각 바이오마커의 펩타이드는 다음 표와 같은 것인, 주요 우울 장애와 양극성 장애 구분용 바이오마커 조성물:
- 주요 우울장애 또는 양극성 장애 구분 판단에 대한 정보를 제공하기 위해,
대상체로부터 분리된 혈액으로부터 제 1 항에 따른 바이오마커의 발현 수준을 질량분석법으로 측정하는 단계; 및
상기 측정 결과를 정상 대조군의 혈액시료의 해당 마커의 상응하는 측정 결과와 비교하여 상기 대상체를 주요 우울 장애 또는 양극성 장애와 연관시키는 단계를 포함하는, 인비트로에서 주요 우울장애 또는 양극성 장애를 구분하여 판단하기 위한 바이오마커 검출 방법.
- 제 5 항에 있어서,
상기 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함하는 것인, 인비트로에서 주요 우울장애 또는 양극성 장애를 구분하여 판단하기 위한 바이오마커 검출 방법.
- 제 6 항에 있어서,
상기 질량 분석법에 사용되는 모드는 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM) 또는 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM)인 것인, 인비트로에서 주요 우울장애 또는 양극성 장애를 구분하여 판단하기 위한 바이오마커 검출 방법.
- 제 7 항에 있어서,
상기 질량 분석법 모드는 MRM이고, 상기 MRM에 분석에 사용되는 상기 바이오마커에 해당하는 각 단백질 별 펩타이드는 다음 표와 같은 것인, 인비트로에서 주요 우울장애 또는 양극성 장애를 구분하여 판단하기 위한 바이오마커 검출 방법:
.
- 제 5 항에 있어서,
상기 연관시키는 단계에서, 상기 대상체의 측정 결과 그 발현 수준이 상기 대조군에 측정된 발현 수준과 상이한 경우 상기 대상체를 주요 우울장애 또는 양극성 장애로 판단하며,
상기 주요 우울장애는 대조군과 비교하여, DSG3, GPX3, ITIH2 및 PLF4는 발현이 증가하고, 그리고 C1QB, FBLN1, FCGBP, FHR3 및 FHR3는 발현이 감소하며,
상기 양극성 장애는 대조군과 비교하여, C1QB, FBLN1, FCGBP, FHR3, IGHM, 및 PLF4는 발현 증가하고 DSG3, GPX3, 및 ITIH2는 발현이 감소하는 것인, 인비트로에서 주요 우울장애 또는 양극성 장애를 구분하여 판단하기 위한 바이오마커 검출 방법.
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| KR1020220009685A KR102627953B1 (ko) | 2021-03-19 | 2022-01-24 | 질량분석법 기반의 우울장애 및 양극성 장애 구분용 바이오마커 및 그 용도 |
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|---|---|---|---|---|
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-
2022
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