KR20130009205A - 당뇨망막병증 진단용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당뇨망막병증 환자의 진단 및 진행 정도 판단을 위해 사용될 수 있는 유전자 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물, 키트, 및 이를 사용한 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

Description

당뇨망막병증 진단용 마커 및 이의 용도{Marker For Diagnosing Diabetic Retinopathy and Use Thereof}
본 발명은 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) 진단용 조성물 및 당뇨망막병증 진단용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석 방법에 관한 것이다.
당뇨병은 인슐린의 생성 혹은 이용 과정의 이상으로 혈당이 증가하고 그에 따른 다양한 급성, 만성 합병증을 동반하는 심각한 질환이다. 미국의 경우, 20 세 이상 인구의 9.6% (2000만 명 이상)가 당뇨를 가지고 있고, 발병 위험이 높은 당뇨 전단계(pre-diabetes) 환자가 5000만 명 이상으로 추정 된다(2005년 미국 national diabetes fact sheet). 2002년 직접, 간접적인 의료비용으로 1320억 달러가 당뇨와 관련되어 지출되었다.
우리나라의 경우, 2005년 질병관리본부에서 시행한 국민건강영양조사에 따르면 30세 이상 남자의 9.0%, 여자의 7.2% 가 당뇨병 환자로 나타났다. 대한 당뇨병학회가 발간한 '2007년 한국인 당뇨병 연구보고서'에 따르면, 당뇨의 유병률은 약 8%이고 매년 10%의 새로운 환자가 발생하고 있으며 당뇨 관련 의료비가 건강보험 비용의 약 20% (약 3조원)를 차지한다. 현재 400-500만 명으로 추산되는 당뇨 환자 수의 최근의 빠른 증가 속도를 고려할 때 10-20년 후 1000만 명에 이를 수 있다.
당뇨병의 이환 기간이 길어짐에 따라 전신의 다양한 합병증을 동반하게 되는데, 대표적으로 심혈관계 질환, 당뇨신증, 당뇨신경병증, 당뇨망막병증이 발생하게 된다. 당뇨망막병증 (Diabetic Retinopathy, DR) 은 당뇨 환자에게서 당뇨 진단 10년 내에 60% 이상에서, 20년 내에 90% 이상에서 나타난다.
당뇨망막병증은 당뇨병의 미세혈관 합병증 (microangiopathy)의 하나로 망막 혈관의 투과성 변화와 혈관 폐쇄, 허혈 변화(ischemia), 신생혈관 생성 (neovascularization), 그리고 이에 따른 섬유혈관 증식(fibrovascular proliferation) 이 특징이다.
당뇨망막병증은 성인의 최대의 후천적 실명 원인으로, 미국의 경우 매년 12,000명에서 24,000명이 당뇨로 인해 실명에 이르고 있다. 미국의 연구에서, 당뇨망막병증의 유병률은 당뇨 환자의 40% 정도로 추산되며 8% 정도는 실명에 이를 수 있는 심각한 상태인 것으로 보고되고 있다.
당뇨망막병증 진행 정도에 따라 초기의 비증식성 당뇨망병증(NPDR, non-proliferative diabetic retinopathy) 과 후기의 증식성 당뇨망막병증(PDR, proliferative diabetic retinopathy)으로 구분한다(도 1).
비증식성 당뇨망막병증(NPDR)은 망막 모세혈관의 폐쇄 및 투과성 변화 등으로 망막출혈, 미세혈관류(microaneurysm), 삼출물(exudate), 망막 부종(edema) 등이 나타나면서 조금씩 시력이 떨어지게 된다. 또한 황반부의 부종 (DME, 당뇨황반부종) 을 동반하게 되면 이 시기에서도 심각한 시력 저하를 보일 수 있다.
증식성 당뇨망막병증(PDR)은 망막의 광범위한 혈관 폐쇄에 따르는 허혈 (ischemia) 상태로 인해 신생혈관(neovascularization) 이 증식하는 단계이다. 이러한 증식은 망막에서 유리체로 진행되고 섬유혈관 증식이 일어나 견인막에 의해 유리체출혈(vitreous hemorrhage)이나 망막이 원래 부착 부위에서 떨어지는 견인망막박리(tractional retinal detachment), 신생혈관녹내장 등의 합병증이 발생해 실명이 진행되는 단계이다.
레이저 치료 혹은 유리체 수술적 치료에도 불구하고 병증이 계속 진행되어 실명에 이르는 환자가 아직도 많아, 당뇨망막의 조기발견과 진행 억제, 고위험군에 대한 조기 치료에 대한 필요성이 증가하고 있으나 당뇨망막병증의 병인은 아직 정확하게 밝혀지지는 않았고, 당뇨에 의한 망막증의 진행 정도를 판단하는 바이오마커도 매우 한정적이다.
현재까지 당뇨망막병증 연구는 유리체의 개별 단백질에 대한 생화학 및 분자생물학적 연구를 중심으로 주로 이루어지고 있다. 또한 당뇨망막병증의 단백질체 연구도 환자 유리체에서 단백질을 2-DE 및 Mass spcectrometry로 동정하는 유리체 단백질체의 Profiling(Discovery) 단계의 연구이다. 이들 유리체 단백질들이 혈액에서 발현이 되는지 혹은 이들을 임상적인 바이오마커로 이용할 수 있는 지에 대한 확인(verification) 및 검증(validation) 연구는 거의 이루어지지 않은 상태이다.
따라서, 임상적으로 특이성과 민감도가 높은 신규 진단 마커와 아울러 이를 검출할 수 있는 항체를 개발하여, 당뇨병성 망막증의 조기 진단 및 진행 정도를 손쉽게 미리 예측할 필요가 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 당뇨망막병증의 조기 진단에 유용한 마커를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 당뇨망막병증 특이 단백질을 발굴하고, LC-MS/MS 방법을 이용하여 당뇨망막병증 개체에서 증가 또는 감소하는 단백질을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 당뇨병성 망막증의 조기진단 및 진행 정도를 효과적으로 진단할 수 있는 새로운 당뇨망막병증 진단용 마커인 AGP 및 PEDF 중에서 1개 이상 선택되는 당뇨망막병증 진단용 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 당뇨망막병증 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 AGP 및 PEDF 중에서 선택되는 1개 이상의 당뇨망막병증 진단용 마커를 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 당뇨망막병증 발병 여부를 확인하는 것이다. 바람직하게는 당뇨망막병증 중 초기 단계인 비증식성 당뇨망막병증 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단용 마커"란 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체) 또는 증식성 당뇨망막병증 개체에 비하여 비증식성 당뇨망막병증을 가진 개체에서 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준의 유의적인 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 발명의 목적상 당뇨망막병증 진단용 마커는 AGP 또는 PEDF일 수 있다. 보다 바람직하게는 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(Ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
당뇨망막병증은 진행 정도에 따라 초기의 비증식성 당뇨망막병증(NPDR)과 후기의 증식성 당뇨망막병증(PDR)로 구분한다. 비증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하지 않는 특징이 있으며, 증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하는 등 그 기전에 있어서 상이하며, 비증식성 당뇨망막병증이 반드시 증식성 당뇨망막병증으로 진행되는 것이 아니어서, 증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 알려진 마커라도 반드시 비증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 사용될 수는 없다.
본 발명자들은 다음과 같은 입증을 통해 AGP 또는 PEDF가 당뇨망막병증 진단용 마커로 이용될 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 일 실시예에서, MH(황반원공), PDR(증식성 당뇨망막병증), 및 NPDR(비증식성 당뇨망막병증) 개체의 혈장 시료를 분석하여 당뇨망막병증에 과발현 또는 저발현하는 바이오마커를 발굴하였다. 구체적으로 PDR 및 MH 개체의 시료를 분석하여 PDR 특이적 후보 마커를 확인하고 이를 바탕으로 NPDR 특이적 마커 11종(AGP, PEDF, APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, 및 CFB)을 최종 발굴하였다.
본 발명의 또다른 실시예에서, 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체) 및 NPDR 개체의 혈장 시료를 분석하여 상기 발굴한 11종의 NPDR 특이적 마커의 유효성을 확립하였다.
하나의 양태로서, 본 발명은 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공한다.
AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)는 급성기 혈장 알파-글로블린 글라이코프로테인으로 두 개의 다형 유전자에 의해 조절되며, 유전자 존재론(Gene ontology) 분류에 따르면 면역 반응 및 섬유소 용해에 관여하는 단백질로서, 그 유전자 정보는 AGP(GeneBank Accession No. AAB33887, Uniprot: P02763)이다. 그러나, AGP의 당뇨망막병증과의 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다. AGP는 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체)과 비교하여 당뇨망막병증 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 증가하는 특징을 가진다. 이때 상기 당뇨망막병증 개체는 바람직하게 비증식성 당뇨망막병증 개체이다.
PEDF(Pigment epithelium-derived factor)는 안티-안지오제닉, 안티-튜머리제닉 및 뉴로트로픽 기능을 가지는 다기능 분비 단백질로서 유전자 존재론(Gene ontology) 분류에 따르면 망막아세포종 및 전활성 B-림포사이트(preactivated B-lymphocytes)에 관여하는 단백질이다. 그 유전자 정보는 PEDF(GeneBank Accession No.AAK92491, Uniprot: P36955)이다. 그러나, PEDF의 당뇨망막병증과의 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다. PEDF는 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체)과 비교하여 당뇨망막병증 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 증가하는 특징을 가진다. 이때 상기 당뇨망막병증 개체는 바람직하게 비증식성 당뇨망막병증 개체이다.
상기 조성물은 AGP 및 PEDF 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제에 추가로 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(Ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mPRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물일 수 있다.
상기 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), 및 APOC3(Apolipoprotein C3)는 모두 지질 대사에 관여하는 단백질이며, 상기 VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein)는 면역 반응 및 섬유소 용해에 관여하는 단백질이다. 또한, 상기 AFM(Afamin), CP(Ceruloplasmin)은 수송(transport)에 관여하는 단백질이다. 또한, 상기 CFB(Complement factor B)은 망막아세포종 및 전활성 B-림포사이트(preactivated B-lymphocytes)에 관여하는 단백질이다. 각각의 유전자 정보는 APOC1(GeneBank Accession No.AAD02506, Uniprot: P02654), APOB100(GeneBank Accession No.AAB04636, Uniprot: P04114), APOC3(GeneBank Accession No.AAS68230, Uniprot: P02656), VTN(GeneBank Accession No.AAH05046, Uniprot: P04004), PLG(GeneBank Accession No. AAA60113, Uniprot: P00747), HRP(GeneBank Accession No.AAI50592, Uniprot: P04196), AFM(GeneBank Accession No.AAI09021, Uniprot: P43652), CP(GeneBank Accession No. AAF02483, Uniprot: P00450), 및 CFB(GeneBank Accession No.AAA16820, Uniprot: P00751) 이다. 그러나, 각 유전자의 당뇨망막병증과의 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다. 상기 APOC1, APOB100, APOC3, PLG, HRP, AFM, CP, 및 CFB은 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체)과 비교하여 당뇨망막병증 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 감소하는 특징을 가진다. 이때 상기 당뇨망막병증 개체는 바람직하게 비증식성 당뇨망막병증 개체이다.
본 발명에 사용된 용어 "mRNA 발현수준 측정"이란 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 당뇨망막병증 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "단백질 발현수준 측정"이란 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 당뇨망막병증 진단용 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 바람직하게는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정한다.
상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어 "당뇨망막병증"이란 당뇨병에 의해 말초 순환 장애가 발생하여, 이 때 망막의 미세순환에 장애가 생겨 시력 감소가 발생하는 합병증을 의미하며, 바람직하게 비증식성 당뇨망막병증일 수 있다.
바람직하게 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 AGP 및 PEDF로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 및 추가적으로 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP 및 CFB 중에서 선택되는 1 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
바람직하게 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 AGP 및 PEDF로부터 선택되는 1개 이상의 단백질 및 추가적으로 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP 및 CFB 중에서 선택되는 1개 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 AGP, PEDF, APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP 및 CFB 중에서 선택되는 1 이상의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 당뇨망막병증 진단용 조성물을 포함하는 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
또한, 바람직하게, 상기 당뇨망막병증 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
바람직하게, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 당뇨망막병증 진단용 조성물 또는 상기 당뇨망막병증 진단용 키트를 이용한 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 정보 제공 방법은 당뇨망막병증 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 당뇨망막병증 발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 AGP 및 PEDF는 그 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군과 비교하여 증가하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 증가하면 당뇨망막병증으로 진단하여 정보제공 할 수 있다. 이때 바람직하게 상기 당뇨망막병증은 비증식성 당뇨망막병증이다.
바람직하게, 상기 측정하는 단계 및 비교하는 단계는 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(Ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, 및 CFB는 그 유전자의 발현 수준 및 단백질의 발현 수준이 정상 대조군과 비교하여 감소하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 감소하면 당뇨망막병증으로 진단하여 정보제공 할 수 있다. 이때 바람직하게 상기 당뇨망막병증은 비증식성 당뇨망막병증이다.
또한, 바람직하게 AGP 및 PEDF 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 증식성 당뇨망막병증 개체 시료의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준과 비교하여, 증가하면 비증식성 당뇨망막병증이라고 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 AGP 및 PEDF는 비증식성 당뇨망막병증에서 그 유전자 또는 단백질 발현 수준이 증가하므로 이를 증식성 당뇨망막병증(PDR) 개체의 유전자 또는 단백질 발현 수준과 비교하여 증가하면 당뇨망막병증 진행단계 중 NPDR 이라고 판정할 수 있다.
또한, 복합 마커로서 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, 및 CFB로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상은 비증식성 당뇨망막병증에서 그 유전자 또는 단백질 발현 수준이 감소하므로 이를 증식성 당뇨망막병증(PDR) 개체의 유전자 또는 단백질 발현 수준과 비교하여 감소하면 당뇨망막병증 진행단계 중 NPDR 이라고 판정할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준은 바람직하게 mRNA 발현 수준을 측정 및 비교할 수 있다.
상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 당뇨망막병증 환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 당뇨망막병증 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.
본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 유전자의 존재 또는 부존재를 확인하기 위한 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 상기 단백질 발현 수준 측정 및 비교는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정 및 비교하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, AGP, PEDF, APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, 또는 CFB의 단백질 발현 수준 자체를 측정 및 비교하기 위해서, LC-MRM 방법을 사용한다.
구체적으로 생물학적 시료 중의 단백질을 부피% 기준으로 5% 증류수, 95% 아세토니트릴, 0.1% 포름산의 용액으로 30분간 5%에서 85%까지 농도구배를 하면서 LC 분석 컬럼을 통과시킨다. 용액 혼합 비율에 따란 특정 물질에 대한 분해능이 달라질 수 있기 때문에 농도 구배를 실시하였고, 따라서 상기 범위는 다양한 단백질들을 동시에 분리하기 위한 최적 범위를 선정한 것이다.
질량 분석에서는 MS/MS 모드인 MRM(Multiple reaction monitoring)으로 정량을 실시한다. SIM(Selected Ion Monitoring)이 질량분석기의 소스 부분에서 한 번 충돌하여 생긴 이온을 이용하는 방법인 반면, MRM은 상기 한 번 깨진 이온 중에서 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 또 다른 MS의 소스를 한 번 더 통과시켜 충돌시킨 후 이 중에서 얻은 이온들을 이용하는 방법이다. 보다 구체적으로 SIM에서는 선택한 정량이온이 혈장에서도 검출되는 이온인 경우에 정량에 방해가 될 수 있다는 문제점이 있다. 반면, MRM을 이용하는 경우, 같은 질량을 가진 이온이라도 한 번 더 깨지면 분자구조가 달라지면서 차별화된 경향을 나타내므로, 이를 정량이온으로 사용하게 되면 백그라운드에서 방해되는 피크가 제거되어 한 층 더 깨끗한 베이스 라인을 얻을 수 있다. 따라서, 질량 분석시에 MRM 모드를 사용함으로써 보다 우수한 분석 감도에서 원하는 물질들을 동시에 분석할 수 있다.
상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 단백질 발현 수준과 당뇨망막병증 개체에서의 단백질 발현 수준을 비교할 수 있고, 당뇨망막병증 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 당뇨망막병증 발병 여부를 진단할 수 있다.
상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명은 당뇨망막병증을 진단할 수 있는 마커를 제공함으로서, 당뇨망막병증 환자에게서 발현이 증가 또는 감소한 유전자 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서 당뇨망막병증의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다. 아울러, 본 발명의 마커는 비침습성 진단을 가능하게 하여 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는 당뇨망막병증의 초기 진단을 할 수 있다.
도 1은 비증식성 당뇨망막병증 및 증식성 당뇨망막병증 환자의 안구 사진이고,
도 2는 실시예 1 내지 6의 실시 과정을 개략적으로 나타낸 플로우 차트이고,
도 3은 실시예 6에 따른 AGP의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이고,
도 4는 실시예 6에 따른 PEDF의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이고,
도 5는 실시예 6에 따른 APOC1의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이고,
도 6은 실시예 6에 따른 APOB100의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이고,
도 7은 실시예 6에 따른 APOC3의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이고,
도 8은 실시예 6에 따른 VTN의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이고,
도 9는 실시예 6에 따른 PLG의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이고,
도 10은 실시예 6에 따른 HRP의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이고,
도 11은 실시예 6에 따른 AFM의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이고,
도 12는 실시예 6에 따른 CP의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이고,
도 13은 실시예 6에 따른 CFB의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 당뇨망막병증 과발현 또는 저발현 단백질 발굴
1차로 증식성 당뇨망막병증(PDR) 환자와 황반원공(MH) 환자의 유리체 단백을 MRM 분석하여 발현 차이가 나는 단백질인 PDR 특이적 후보 마커를 발굴하였다.
상기 과정으로 얻어진 PDR 단백질 발현 정도를 기반으로 2차로 증식성 당뇨망막병증(PDR) 환자와 황반원공(MH) 환자 및 비증식성 당뇨망막병증 (NPDR) 환자의 유리체 및 대응하는 혈장시료 중의 단백의 발현 양상을 MRM으로 비교 분석하였다. 그 결과, 황반원공(MH) 및 당뇨망막병증 환자(PDR)와 비교하여 발현 차이를 나타내는 유전자들을 발견할 수 있었다(표 1). 이중 과발현과 저발현이 각각 2개 및 9개로 비증식 당뇨망막병증(NPDR)에 특이적으로 발현되는 단백질들을 최종 선발할 수 있었다.
서열번호 단백질명 발현양상 Gene accession Number Uniprot
1 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein) 발현 증가 AAB33887 P02763
2 EDF(Pigment epithelium-derived factor) 발현 증가 AAK92491 P36955
3 APOC1(Apolipoprotein C1) 발현 감소 AAD02506 P02654
4 APOB100(Apolipoprotein B100) 발현 감소 AAB04636 P04114
5 APOC3(Apolipoprotein C3) 발현 감소 AAS68230 P02656
6 VTN(Vitronectin) 발현 감소 AAH05046 P04004
7 PLG(Plasminogen) 발현 감소 AAA60113 P00747
8 HRP(Histidine-rich protein) 발현 감소 AAI50592 P04196
9 AFM(Afamin) 발현 감소 AAI09021 P43652
10 CP(Ceruloplasmin) 발현 감소 AAF02483 P00450
11 CFB(Complement factor B) 발현 감소 AAA16820 P00751
실시예 2: 환자 선정 및 혈장 채취
당뇨망막병증 초기인 비증식성 당뇨망막병증 환자(NPDR) 45명의 혈장시료 및 대조군 환자 혈장 시료(당뇨이지만 당뇨망막병증이 아닌 환자군, NoDR)로부터 LC-MS/MS 시험용 샘플을 얻었다. 상기 비증식성 당뇨망막병증 환자(NPDR) 45명 및 대조군 환자의 임상적 특징은 하기 표 2와 같다. 비증식성 당뇨망막병증 진행 단계 별로 mild, moderate 및 severe한 세 군으로 나누어 실시하였다.
군 성별
(여성/남성)		 나이 DM
경과기간(년)		 HbAlc(%) 혈장농도
(㎍/㎕)		 혈장 농도의 CV(%)
NoDR 7/8 63.8±9.5 7.9±5.4 7.5±1.6 63.8 9.1
MI NPDR 7/8 61.4±6.7 12.3±6.0 7.4±1.3 61.4 9.4
MO NPDR 8/7 60.6±9.9 15.9±7.7 7.4±1.1 60.6 7.9
SV NPDR 9/6 61.8±9.1 11.8±6.4 7.8±0.8 61.8 9.7
(NoDR: 당뇨망막병증이 없는 군, MI NPDR: Mild NPDR, MO NPDR: Moderate NPDR, SV NPDR: Severe NPDR)
실시예 3: 혈장 시료의 전처리
Plasma 시료를 Bradford를 이용하여 정량하여 이중 200㎍에 해당하는 혈장을 취해 요소(Urea)로 변성시키고 DTT 및 요오드아세트산(iodoacetic acid)를 사용하여 환원 및 알킬화시켰다. 여기에 트립신(Trypsin)을 50 : 1 (단백질 : 트립신, w/w)의 비율로 처리하여 변성된 단백질을 펩타이드로 만든 후 펩타이드를 C18 ZipTip을 사용하여 탈염을 하고 동결 건조하였다. 이를 용액 A (95% 증류수, 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)로 녹이고 여기에 내부 표준(internal standard)인 베타-갈락토시다아제 펩타이드(beta-galactosidase peptide) 100 fmol을 spiking 시키고 이를 MRM 분석하였다.
실시예 4: Transition 의 선정
상기 단백질들의 Transition을 선정하기 위해 발굴 연구에서 선정한 단백질들에 대해 각각 MS/MS 분석을 하였다. 이를 바탕으로 각 단백질에 대한 대표 펩타이드를 선정하고 (Q1 transition), 이 펩타이드를 전기적으로 깨서 발생하는 fragmentation ion 중 가장 강도가 높은 이온을 (Q3) 선정하였다. 각 단백질 당 2개의 펩타이드를 선정하고 각 펩타이드 당 2개의 fragmentation ion을 선정하여 Q1/Q3를 하나의 단백질에 대한 4개의 Transition으로 결정하였다. 일부 피크가 낮게 나와서 실험적으로 선정하기 어려운 Transition에 대해서는 MIDAS (MRM-Initiated Detection and Sequencing) workflow program (MRMPliot, version 2.0, Appliedbiosystems, USA)을 사용하여 Transition을 선정하였다. 그리고 MIDAS workflow program로도 잡히지 않은 transition은 Peptide Atlas database를 활용하여 observed number가 높은 펩타이드를 선별하여 transition을 선정하였다.
실시예 5: LC 및 MRM
LC는 MDS사의 MDLC nanoflow TempoLC를 사용하였다. 펩타이드의 분리를 위해 직경 3㎛, pore size 200 Å의 C18 resin을 길이 15cm, 내경 100㎛의 fused sillica capillary column을 사용하여 직접 충진하였다. 펩타이드 시료는 1.0㎕를 Trap column을 거치지 않고 analitical column으로 바로 주입되는 직접 주입 방법으로 주입하였으며 유속은 400 nl/min 으로 사용하였다. Column을 용액 A (95% 증류수, 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)으로 10분간 평형화한 후 용액 B (5% 증류수, 95% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)로 30분간 5%에서 85%까지, 5분간 85%의 농도구배를 통해 펩타이드를 용출하였다.
질량 분석법(Mass spectrometry)은 Applied Biosystems의 hybrid triple quadrupole/linear ion trap인 4000 QTrap 장비를 이용하여 선정 단백질들에 대한 Transition에 대해 MRM 모드로 모니터링을 하였다. Ion voltage는 2000 Volt를 사용하였으며 Quadruple 1(Q1)과 Quadruple 3 (Q3)에서의 resolution은 unit으로 설정하였다. Transition에 대한 Dwell time은 20 millisecond로 설정하여 total cycle time이 2.5초가 되도록 설정하였다. Neubulizing gas는 5 unit로 사용하였으며 히터 온도는 150℃로 설정하여 분석하였다. 배치(Batch) 간 variation을 증명하기 위해 각각의 샘플에 spiking된 50 fmole 베타-갈락토시다아제 펩타이드(beta-galactosidase peptide, Transition 542.3/636.3)도 동시에 모니터링하였다. MS run time은 LC와 시간 동조로 60분 동안 진행하며 MS 및 LC는 Analyst 2.1.2를 사용하여 구동하였다.
실시예 6 : 데이터 분석
상대 정량을 위해 베타-갈락토시다아제 펩타이드(beta-galatosidase peptide, Transition 542.3/636.3)를 사용하여 blank, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0, 100.0 fmol 총 8개의 농도 점에서 MRM 정량하여 Standard curve를 결정하였다. 각 개인별 MRM 결과는 MultiQuant (AppliedBiosystems, ver1.0)을 사용하여 해당 MRM transition의 이온 추출 크로마토그래피 (XIC, Extract ion chromatography)를 생성하였으며 각 transition의 피크 면적을 계산하고 이를 다시 시간 경과에 따라 도식화하였다. 각 XIC한 피크의 면적을 내부 표준(Internal standard)인 베타-갈락토시다아제 펩타이드(beta-galatosidase peptide, Transition 542.3/636.3)의 XIC된 피크 면적으로 정상화하고 이 값으로 상대 정량 분석을 각 단백질별로 수행하였다. 통계 분석을 위해서 MedCalc (MedCalc Software, Belgium, vesion 11.3.3)을 이용하여 ROC (Receiver Operating Characteristic) Curve 및 Interactive plot 등을 작성하였으며 ANOVA (Analysis of variance) 통계 분석을 수행하였다. 일부 도표 작성과 t-TEST분석을 위해 Sigma Plot (Systat Software Inc, USA,version 10.1)을 사용하였다.
상기 분석의 결과 발현 차이가 나는 단백질 중 유의적으로 차이를 보이는 11개의 단백질을 발굴하였고 각 단백질의 ROC curve와 interactive plot은 도 3 내지 13과 같다.
그 결과, 도 3 및 도 4는 각각 AGP 및 PEDF의 ROC curve와 interactive plot으로서 각각 NoDR 시료에 비해 발현이 증가하여, 비증식성 당뇨망막병증에 특이적인 진단용 마커로 이용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 도 5 내지 도 13은 각각 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(Ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B)의 ROC curve와 interactive plot로서 각각 NoDR 시료에 비해 발현이 감소하여 상기 AGP 및 PEDF와 함께 추가적인 비증식성 당뇨망막병증에 특이적인 진단용 마커로 이용할 수 있음을 확인하였다.

Claims (14)

  1. AGP(Alpha-1 acid glycoprotein) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(Ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mPRNA 또는 이의 단백질 수준을 추가로 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 당뇨망막병증은 비증식성 당뇨망막병증인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 당뇨망막병증 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immnosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는 당뇨망막병증 진단용 키트.
  8. 생물학적 시료로부터 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 측정하는 단계 및 비교하는 단계는 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(Ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 증식성 당뇨망막병증 개체 시료의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준과 비교하여, 증가하면 비증식성 당뇨망막병증이라고 판정하는 단계를 추가로 포함하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준인 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 mRNA 수준 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것인 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법
  14. 제8항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.


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