KR20200112906A - 척추 근위축증의 치료 방법 - Google Patents

척추 근위축증의 치료 방법 Download PDF

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윌던 파웰
존 스타로폴리
구올린 자오
알렉산더 맥캠벨
크리스토퍼 코디 스테빈스
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바이오젠 엠에이 인코포레이티드
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Abstract

예를 들어, 척추 근위축증(SMA)의 진단 및 예후뿐만 아니라 SMA 치료에 대한 반응자의 식별을 위한 바이오마커를 특징으로 한다. SMA를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 또한 제공된다.

Description

척추 근위축증의 치료 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2018년 1월 25일에 출원된 미국 가출원 제62/622,027호, 2018년 6월 13일에 출원된 미국 가출원 제62/684,507호, 및 2018년 9월 28일에 출원된 미국 가출원 제62/738,134호의 이익을 주장한다. 이전 출원의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
기술 분야
본 개시내용은 일반적으로 척추 근위축증의 바이오마커에 관한 것이다.
척추 근위축증(spinal muscular atrophy, SMA)은 SMN 단백질의 결핍을 초래하는 상염색체 열성 유전적 장애로서, 이는 결국 전각 운동 뉴런(anterior horn motor neuron)의 상실, 축색돌기 분해, 및 진행성 근육 소모, 이동성 장애(mobility impairment), 및 호흡 부전(respiratory failure)의 표현형으로 이어진다. 질환 중증도는 5가지 유형(0-4)으로 분류되며, 유형 0 환자는 가장 중증(신생아 치명적)인 표현형을 갖고, 유형 4 환자는 가장 경증인 증상 및 정상적인 수명만을 갖는다.
SMA를 갖는 대상체의 적시의 적절한 치료는 SMA 치료 요법을 이용한 치료가 필요한 전증상(pre-symptomatic) 대상체를 선택하고 SMA 요법이 효과적인지 여부를 결정하는 능력이 필요하다. 따라서, SMA의 바이오마커가 필요하다.
개요
신경필라멘트(neurofilament)는 뉴런 세포골격, 특히 축색돌기에서 주요 구성요소이며, 축색돌기에서 이들은 성장 및 유지에 필수적이다. 구조적으로, 이들은 "신경필라멘트 삼중항"을 형성하는 3개의 얽힌 코어 서브유닛인 신경필라멘트 중쇄(neurofilament heavy, NF-H), 중간/중급 쇄(neurofilament medium/intermediate)(NF-M) 및 경쇄(neurofilament light, NF-L) 폴리펩타이드로 구성된다. 본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 신경필라멘트 수준이 척추 근위축증(SMA)에 대한 효과적인 바이오마커로서 작용한다는 발견에 기초한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 SMA를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 상기 SMA 요법의 치료적 유효량을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 인간 대상체는 이전에 인간 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 대조군보다 더 높은 SMA 요법의 개시 전의 신경필라멘트 수준을 갖는 것으로 결정되었다. 이 방법은 예를 들어 전증상 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 SMA를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 SMA 요법의 개시 전에 인간 대상체로부터 수득된 상기 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준을 측정하는 단계 및 상기 SMA 요법의 치료적 유효량을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 두 양태의 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, 인산화된 신경필라멘트 중쇄(pNF-H) 수준)은 대조군 수준 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 300 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 400 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 500 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 600 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 700 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 800 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 900 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 1000 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 1,100 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 1,200 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 1,300 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 1,400 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 1,500 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 2,000 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 3,000 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 4,000 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 5,000 pg/mL 초과이다. 이들 신경필라멘트 수준은 본원의 실시예 섹션에 기재된 분석을 사용하여 수득될 수 있다. 상이한 판독값(예를 들어, O.D. 또는 국제 단위)을 제공하는 상이한 신경필라멘트 분석이 사용되는 경우, 신경필라멘트 수준의 값은 상이할 수 있음이 이해되어야 한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 SMA를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 SMA 요법의 개시 전에 인간 대상체로부터 수득된 제1 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)을 측정하는 단계; SMA 요법(예를 들어, SMA 요법의 치료적 유효량)을 인간 대상체에게 투여하는 단계; 및 상기 SMA 요법의 개시 후에 상기 인간 대상체로부터 수득된 제2 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)을 측정하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 SMA를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 SMA 요법의 후보 양의 투여 전에 인간 대상체로부터 수득된 제1 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)을 측정하는 단계; 상기 SMA 요법의 후보 양의 투여 후에 인간 대상체로부터 수득된 제2 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)을 측정하는 단계로서, 상기 제2 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 제1 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준보다 낮으므로 SMA 요법의 후보 양이 치료적 유효량임을 나타내는 것인 단계; 및 상기 제2 생물학적 샘플에서 낮아진 신경필라멘트 수준을 측정한 후 상기 SMA 요법의 치료적 유효량을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 300 pg/mL 초과, 400 pg/mL 초과, 500 pg/mL 초과, 600 pg/mL 초과, 700 pg/mL 초과, 800 pg/mL 초과, 900 pg/mL 초과, 1000 pg/mL 초과, 1,500 pg/mL 초과, 2,000 pg/mL 초과, 3,000 pg/mL 초과, 4,000 pg/mL 초과, 또는 5,000 pg/mL 초과이다. 특정 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준보다 낮다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준에 비해 30% 초과의 감소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 10% 내지 80%이다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 20% 내지 95%이다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 30% 내지 90%이다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 30% 내지 95%이다. 이러한 경우, SMA 요법의 투여는 계속된다. 특정 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준보다 더 높다. 이러한 경우, SMA 요법의 투여는 중단된다.
일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 40 내지 90일 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 50 내지 80일 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 60 내지 70일 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 약 64일 후에 인간 대상체로부터 수득된다.
제2 생물학적 샘플이 SMA 요법의 개시 40 내지 90일, 50 내지 80일, 60 내지 70일, 또는 약 64일 후에 인간 대상체로부터 수득되는 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 50% 감소된다. 제2 생물학적 샘플이 SMA 요법의 개시 40 내지 90일, 50 내지 80일, 60 내지 70일, 또는 약 64일 후에 인간 대상체로부터 수득되는 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 60% 감소된다. 제2 생물학적 샘플이 SMA 요법의 개시 40 내지 90일, 50 내지 80일, 60 내지 70일, 또는 약 64일 후에 인간 대상체로부터 수득되는 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 70% 감소된다.
제2 생물학적 샘플이 SMA 요법의 개시 40 내지 90일, 50 내지 80일, 60 내지 70일, 또는 약 64일 후에 인간 대상체로부터 수득되는 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 50% 미만으로 감소된다. 제2 생물학적 샘플이 SMA 요법의 개시 40 내지 90일, 50 내지 80일, 60 내지 70일, 또는 약 64일 후에 인간 대상체로부터 수득되는 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 40% 미만으로 감소된다.
제2 생물학적 샘플이 SMA 요법의 개시 40 내지 90일, 50 내지 80일, 60 내지 70일, 또는 약 64일 후에 인간 대상체로부터 수득되는 일부 구현예에서, SMA 요법의 용량은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 퍼센트 감소에 기초하여 인간 대상체에게 후속 투여를 위해 변화된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 SMA의 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 기능적 SMN 단백질 결핍으로 이어지는 SMN1 유전자의 카피 둘 모두에서의 돌연변이(돌연변이는 동종접합성 또는 이종접합성일 수 있음)를 갖는 인간 대상체으로부터 수득된 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)을 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 대조군과 비교하여 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 상기 대상체가 발생시킬 SMA의 중증도 또는 유형을 예측한다.
특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 전에 인간 대상체로부터 수득되고, 그리고 대조군과 비교하여 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 인간 대상체가 치료의 부재하에 발생할 SMA의 중증도 또는 유형을 예측한다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 전에 인간 대상체로부터 수득되고, 대조군과 비교하여 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 대상체가 SMA 요법을 받는 동안 발생시킬 SMA의 중증도 또는 유형을 예측한다. 특정 경우, 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 적어도 2주 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 특정 경우, 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 적어도 4주 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 특정 경우, 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 적어도 6주 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 특정 경우, 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 적어도 8주 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 특정 경우, 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 적어도 10주 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 특정 경우, 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 적어도 12주 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 특정 경우, 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 적어도 2개월 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 특정 경우, 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 적어도 3개월 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 특정 경우, 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 적어도 4개월 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 특정 경우, 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 적어도 5개월 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 특정 경우, 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 적어도 6개월 후에 인간 대상체로부터 수득된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 SMA의 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 SMA 요법의 개시 전에 기능적 SMN 단백질 결핍으로 이어지는 SMN1 유전자의 카피 둘 모두에서의 돌연변이(돌연변이는 동종접합성 또는 이종접합성일 수 있음)를 갖는 인간 대상체로부터 수득된 제1 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 상기 SMA 요법의 개시 후에 상기 인간 대상체로부터 수득된 제2 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)을 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)과 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)과 비교하여 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)은 대상체가 발생시킬 SMA의 중증도 또는 유형을 예측한다. 일반적으로, 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)과 비교하여 제2 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)의 퍼센트 감소가 클수록, 인간 대상체의 미래 운동 기능에 대한 예후가 더 양호하다.
일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 40 내지 90일 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 50 내지 80일 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 60 내지 70일 후에 인간 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 약 64일 후에 인간 대상체로부터 수득된다.
제2 생물학적 샘플이 SMA 요법의 개시 40 내지 90일, 50 내지 80일, 60 내지 70일, 또는 약 64일 후에 인간 대상체로부터 수득되는 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 50% 감소된다. 제2 생물학적 샘플이 SMA 요법의 개시 40 내지 90일, 50 내지 80일, 60 내지 70일, 또는 약 64일 후에 인간 대상체로부터 수득되는 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 60% 감소된다. 제2 생물학적 샘플이 SMA 요법의 개시 40 내지 90일, 50 내지 80일, 60 내지 70일, 또는 약 64일 후에 인간 대상체로부터 수득되는 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 70% 감소된다.
제2 생물학적 샘플이 SMA 요법의 개시 40 내지 90일, 50 내지 80일, 60 내지 70일, 또는 약 64일 후에 인간 대상체로부터 수득되는 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 50% 미만으로 감소된다. 제2 생물학적 샘플이 SMA 요법의 개시 40 내지 90일, 50 내지 80일, 60 내지 70일, 또는 약 64일 후에 인간 대상체로부터 수득되는 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 40% 미만으로 감소된다.
하기 구현예는 상기 양태 중 임의의 것에 적용된다. 특정 경우, SMA 요법은 누시네르센(nusinersen) 또는 누시네르센 염을 포함한다. 일부 경우, SMA 요법은 누시네르센 나트륨을 포함한다. 특정 경우, 누시네르센 나트륨은 5 mL의 2.4 mg/mL 용액의 척추강내 주사에 의해 투여된다. 특정 경우, SMA 요법은 SPINRAZA®, 올레속심(olesoxime), AVX-101, CK-2127107, RG7916, RG7800, RO7034067, LMI070, 또는 SRK-015 중 하나 이상을 포함한다. 특정 경우, SMA 요법은 소분자를 포함한다. 특정 경우, SMA 요법은 유전자 요법을 포함한다. 특정 경우, SMA 요법은 p38aDMAPK 억제제를 포함한다. 특정 경우, SMA 요법은 DcpS 억제제를 포함한다. 특정 경우, SMA 요법은 JNK 억제제를 포함한다. 특정 경우, 대조군은 미리 확립된 신경필라멘트 컷-오프 값이다. 일부 경우, 대조군은 SMA를 갖지 않는 하나 이상의 인간 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플들에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)을 측정하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 기능적 SMN 단백질 결핍으로 이어지는, SMN1 유전자의 카피 둘 모두에서의 돌연변이를 갖는 인간 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H 수준)을 측정하는 단계를 포함한다.
이들 구현예는 상기 양태 중 임의의 것에 적용된다. 특정 경우, 신경필라멘트는 신경필라멘트 중쇄(예를 들어, 인산화된 NF-H)이다. 특정 경우, 신경필라멘트는 신경필라멘트 중간/중급 쇄(neurofilament medium/intermediate chain)이다. 특정 경우, 신경필라멘트는 신경필라멘트 경쇄이다. 특정 경우, 신경필라멘트는 인터넥신(internexin)이다. 특정 경우, 신경필라멘트는 페리페린(peripherin)이다. 특정 경우, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 또는 뇌척수액이다. 일부 경우, NF-H는 다클론성 항-NF-H 항체를 사용하여 검출된다. 일부 경우, NF-H는 NF-H의 과인산화된 형태를 특이적으로 검출하는 다클론성 항-NF-H 항체(예를 들어, Encor Biotechnology Cat # RPCA-NF-H; 및/또는 Cat # CPCA-NF-H)를 사용하여 검출된다. 일부 경우, NF-H는 단클론성 항-NF-H 항체를 사용하여 검출된다. 특정 구현예에서, 인간 대상체는 태아이다. 특정 구현예에서, 인간 대상체는 유아이다. 특정 구현예에서, 인간 대상체는 6개월령 미만이다. 특정 구현예에서, 인간 대상체는 6개월령 초과이다. 특정 구현예에서, 인간 대상체는 12세 미만의 어린이이다. 특정 구현예에서, 인간 대상체는 18세 미만의 어린이이다. 특정 구현예에서, 인간 대상체는 성인 18세 이상이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 물질이 아래에 기재되어 있다. 본원에 언급된 모든 공개, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 상충하는 경우에, 정의를 포함하는 본 출원이 제어할 것이다. 물질, 방법, 및 예는 단지 예시적인 것이며 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 EMBRACE 및 NURTURE 임상 연구로부터 동일한 시점에 그리고 동일한 대상체에서 혈장 및 CSF 샘플에서의 인산화된 신경필라멘트 중쇄(pNF-H) 수준을 보여준다.
도 2는 SMN2의 2, 3, 또는 4개의 카피를 갖는 NURTURE, ENDEAR, EMBRACE 및 CHERISH 임상 연구로부터의 대상체에서 혈장 샘플에서의 pNF-H의 수준의 수준을 보여준다.
도 3은 연령이 증가함에 따라 2개의 SMN2 카피를 갖는 대상체에서의 pNF-H의 수준을 도시한 것이다.
도 4는 연령이 증가함에 따라 3개의 SMN2 카피를 갖는 대상체에서의 pNF-H의 수준의 도시한 것이다.
도 5는 2, 3, 또는 4개의 SMN2 카피 및 증상 개시 연령을 갖는 대상체에서의 pNF-H의 수준의 도시한 것이다.
도 6은 기저 pNF-H 수준에 의한 기저 특성 및 SMA 이력을 제공하는 표이다.
도 7은 기저 pNF-H 수준에 의한 기저 특성 및 SMA 이력을 제공하는 표이다.
도 8은 기저 pNF-H 수준에 의한 기저 특성 및 SMA 이력을 제공하는 표이다.
도 9는 기저 로그(pNF-H) 수준 및 기저 CHOP INTEND 점수의 상관관계를 나타낸다.
도 10은 ENDEAR에서 pNF-H 수준에 의해 기준선에서의 표현형을 상관시키는 능력을 나타내는 표이다.
도 11은 ENDEAR에서의 pNF-H 수준을 그래프로 도시한 것이다.
도 12는 ENDEAR에서의 NF-H 수준의 백분율 변화를 그래프로 도시한 것이다.
도 13은 ENDEAR에서의 pNF-H 수준에 대한 SMA 약물 요법을 그래프로 도시한 것이다.
도 14는 ENDEAR에서의 NF-H 수준의 백분율 변화에 대한 SMA 약물 요법을 그래프로 도시한 것이다.
도 15는 다양한 시점에 pNF-H 수준의 변화를 도시한 것이다.
도 16은 183일의 HINE-2 점수와 64일의 pNF-H 수준과의 연관성을 묘사하는 그래프이다. .
도 17은 183일의 HINE-2 점수와 64일의 pNF-H 수준과의 연관성을 보여준다(공변량을 가짐).
도 18은 183일의 CHOP INTEND 점수와 64일의 pNF-H 수준과의 연관성을 묘사하는 그래프이다.
도 19는 183일의 CHOP INTEND 점수와 64일의 pNF-H 수준과의 연관성을 보여준다(공변량을 가짐).
도 20은 HINE-2(반응자/비-반응자) 카테고리 대 183일의 pNF-H 수준의 묘사이다.
도 21은 HINE-2(반응자/비-반응자) 카테고리 대 183일 pNF-H 수준의 백분율 변화를 그래프로 도시한 것이다.
도 22는 CHOP INTEND(반응자/비-반응자) 카테고리 대 183일의 pNF-H 수준을 그래프로 도시한 것이다.
도 23은 CHOP INTEND(반응자/비-반응자) 카테고리 대 183일 pNF-H 수준의 백분율 변화를 그래프로 도시한 것이다.
도 24는 NURTURE에서의 pNF-H(pg/mL) 수준에 기초한 약물 효과의 유지를 그래프로 도시한 것이다.
도 25는 EMBRACE에서의 pNF-H(pg/mL) 수준에 기초한 약물 효과의 유지를 그래프로 도시한 것이다.
도 26은 NURTURE에서의 pNF-H(pg/mL) 수준의 백분율 변화에 대한 약물 효과를 그래프로 도시한 것이다.
도 27은 EMBRACE에서의 pNF-H(pg/mL) 수준의 백분율 변화에 대한 약물 효과를 그래프로 도시한 것이다.
도 28은 183일의 HINE-2 점수와 64일의 pNF-H 수준과의 연관성을 도시하는 그래프이다. 상부 그래프의 경우: 루트 MSE: 2.87069; R-제곱: 0.0184; 조정된 R-제곱: 0.0002. 하부 그래프의 경우: 루트 MSE: 1.70576; R-제곱: 0.224; 조정된 R-제곱: 0.1831. DF = 자유도; MSE = 평균 제곱 오차.
도 29는 183일의 CHOP INTEND 점수와 64일의 pNF-H 수준과의 연관성을 도시하는 그래프이다. 상부 그래프의 경우: 루트 MSE: 10.09399; R-제곱: 0.0754; 조정된 R-제곱: 0.0583. 하부 그래프의 경우: 루트 MSE: 9.41166; R-제곱: 0.2176; 조정된 R-제곱: 0.1764. DF = 자유도; MSE = 평균 제곱 오차.
도 30은 302일에 비-결측 값(non-missing value)을 갖는 생존한 유아에서 시간 경과에 따른 pNF-H 수준을 그래프로 예시한 것이다.
도 31은 302일에 비-결측 값을 갖는 생존한 유아에서 시간 경과에 따른 pNF-H 수준의 백분율 변화를 그래프로 도시한 것이다.
도 32는 183일의 비골(peroneal) CMAP 진폭과 64일의 pNF-H 수준과의 연관성을 그래프로 도시한 것이다.
도 33은 183일의 비골 CMAP 진폭과 64일의 pNF-H 수준과의 연관성을 도시하는 그래프이다. 상부 그래프의 경우: 루트 MSE: 0.56401; R-제곱: 0.0164; 조정된 R-제곱: -0.0029. 하부 그래프의 경우: 루트 MSE: 0.18933; R-제곱: 0.2906; 조정된 R-제곱: 0.2512. DF = 자유도; MSE = 평균 제곱 오차.
도 34는 183일의 척골(Ulnar) CMAP(복합 근육 활동 전위(compound muscle action potential)) 진폭과 64일의 pNF-H 수준과의 연관성을 그래프로 도시한 것이다. 루트 MSE: 0.24904; R-제곱: 0.1746; 조정된 R-제곱: 0.1633. DF = 자유도; MSE = 평균 제곱 오차.
도 35는 183일의 척골 CMAP 진폭과 64일의 pNF-H 수준과의 연관성을 도시하는 그래프이다. 상부 그래프의 경우: 루트 MSE: 0.2824; R-제곱: 0.0517; 조정된 R-제곱: 0.0338. 하부 그래프의 경우: 루트 MSE: 0.11118; R-제곱: 0.2406; 조정된 R-제곱: 0.1984. DF = 자유도; MSE = 평균 제곱 오차.
도 36a-36c는 302일에 운동 기능의 예측시 29일(도 36a), 64일(도　36b), 및 183일(도 36c)에 pNF-H 수준의 퍼센트 변화를 측정하는 유효성을 도시하는 수신자 조작 특성(receiver operating characteristic, ROC) 그래프이다.
도 37a-37b는 ENDEAR에서 CHOP INTEND 반응자(도 37a) 및 운동 이정표(motor milestone) 반응자(도 37b)의 예측변수로서 pNF-H 수준의 퍼센트 변화를 측정하는 유효성을 도시하는 그래프이다.
도 38a-38c는 CHERISH에서 HFMSE 반응자(도 38a), RULM 반응자(도 38b), 및 WHO 반응자(도 38c)의 예측변수로서 pNF-H 수준의 퍼센트 변화를 측정하는 유효성을 도시하는 그래프이다.
도 39a-39b는 환자 집단(도 39a) 및 SMN2 카피 수(도 39b)에 의한 기저 뇌척수액 pNF-H 수준 대 첫 번째 용량시의 연령을 도시하는 그래프이다.
도 40은 누시네르센으로 처리 후 뇌척수액 pNF-H 수준의 감소를 도시하는 그래프이다.
도 41a-41d는 전증상 대상체의 CSF(도 41a), 유아 발병 대상체의 CSF(도 41b), 유아 발병 대상체의 혈장(도 41c), 및 후기 발병 대상체의 혈장(도 41d)에서 누시네르센으로 처리 후 pNF-H 및 NF-L 수준의 퍼센트 변화를 도시하는 그래프이다.
도 41e-41f는 유아 발병 대상체의 혈장(도 41e) 및 후기 발병 대상체의 혈장(도 41f)에서 누시네르센으로 처리 후 pNF-H 및 NF-L 수준의 절대값 변화를 도시하는 그래프이다.
본 개시내용은, 부분적으로, 신경필라멘트(NF) 수준이 SMA에 대한 효과적인 바이오마커로서 작용할 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다.
1. 척추 근위축증(Spinal Muscular Atrophy)
낭포성 섬유증 다음으로, 척추 근위축증(SMA)은 백인에서 두 번째로 가장 흔한 치명적인 상염색체 열성 장애이다. 이 질환은 척수의 전각에서의 알파 운동뉴런의 점진적인 퇴행을 특징으로 하며, 이는 근위축, 마비, 및 때때로 사망으로도 이어진다. SMA의 가장 흔한 형태는 5q13 생존 운동 뉴런(survival of the motor neuron, SMN1) 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다. 이 장애는 6,000명 내지 10,000명 유아 중 1명에게 영향을 미치며, 40명 중 1명의 보유 빈도를 갖는다. SMA에 대해 여러 임상 유형이 설명되었으며, 이는 연령 발병 및 증상의 진행에 따라 장애를 분류한다.
상기 분류에 따르면, 5가지 유형의 SMA가 있다: 유형 0(배아 형태), 유형 I(베르디니히-호프만(Werdning-Hoffman)), 유형 II(중간), 유형 III(쿠겔베리그-벨란더(Kugeleberg-Welander)), 및 유형 IV(성인 형태). 가장 중증인 유형 0은 임신 30 내지 36주 사이에 태아의 움직임 감소 및 매우 짧은 기대 수명을 특징으로 한다. 유형 I은 다음으로 가장 중증인 형태이며, 6개월령 전의 발병 및 약 2년의 수명 기대를 갖는다. 유형 II 및 III은 만성 형태로 알려져 있으며, 덜 심각하고, 6-18개월(유형 II) 및 각각 18개월 이후(유형 III의 경우) 발병을 갖는다. 많은 경우, 유형 IV는 유형 III의 증상을 모방하지만, 발병은 18세 이후(전형적으로 약 30세)이다. 정상적인 기대 수명은 이 성인 형태의 특징이다
SMA 결정 유전자인 SMN1은 5q11.2-13.3 영역에 대해 맵핑되었다. SMN1 엑손 7의 동종접합성 결실이 SMA 환자에서 발견되는 가장 흔한 돌연변이지만; 결실 및 상이한 점 돌연변이가 검출된 복합 이종접합성 환자의 몇 가지 사례가 있다. 인간에서, SMN 유전자의 2개의 형태인 텔로미어(telomeric) 형태(SMN1) 및 동원체(centromeric) 형태(SMN2)가 각각의 대립유전자 상에 존재한다. SMN1 유전자의 전사는 SMN 단백질을 코딩하는 전장 메신저 RNA(mRNA) 전사체를 생산한다. SMN2 유전자는 전사 동안 엑손 7의 배제를 초래하는 위치 840의 C에서 T로의 치환을 제외하면 SMN1 유전자와 동일하다. 생성된 절단된 단백질은 기능적이지 않으며, 빠르게 분해된다. 중요하게도, SMN2 mRNA로부터 엑손 7의 배제는 완전하지 않으며, 따라서 SMN2 유전자로부터 발생하는 총 mRNA 전사체(대략　10% 내지 15%)의 작은 분획은 엑손 7을 함유하고, 이는 정상 SMN 단백질을 코딩한다. 하지만, 전장 SMN 단백질은 소량으로 합성되므로 운동 뉴런 생존을 유지할 수 없다.
SMA를 갖는 모든 환자는 기능성 SMN1 유전자가 부족하므로 생존에 필요한 SMN 단백질을 생산하는 그들의 SMN2 유전자에 의존한다. 따라서, SMA는 선택적인 운동 뉴런 손실을 초래하는 SMN 단백질의 결핍에 의해 유발된다. 몇 개의 유전자형/표현형 분석은 SMN2 카피 수 및 더 경증인 SMA 표현형 사이의 양의 상관관계를 보여주었다. SMN2 카피 수는 SMA 중증도의 일차 결정인자이지만, 그것은 분명히 유일한 표현형 변경인자는 아니다. 당해 기술분야는 경증인 3b 표현형 및 오직 2개의 카피의 SMN2를 갖는 적어도 3명의 성인 환자를 기술하였다. 이러한 겉보기에 어울리지 않는 발견은 이들 개체가 엑손 스플라이스 향상 요소를 생성하여 증가된 전장 SMN 단백질 생산 및 더 경증인 표현형을 초래하는 c.859G>C 엑손 7 돌연변이를 가지고 있었다는 사실에 의해 설명되었다. 다른 변경인자가 설명되었고, SMA의 분자 발병의 이해가 개선됨에 따라 더 많은 것이 기대된다. 이들 발견은 SMA 표현형이 항상 SMN2 카피 수 결정으로부터만 추론될 수 없다는 것을 보여준다.
2. SMA를 위한 요법
SMA를 치료하기 위한 한 가지 요법은 누시네르센(ASO-10-27 / ISIS 396443 / ISIS SMNRx / ISIS-396443 / ISIS-SMNRx로도 알려져 있음)을 함유하는 화합물인 SPINRAZA®이다. 누시네르센은 엑손 7의 다운스트림에 있는 인트론 내의 SMN2 전사체의 특정 서열에 결합하는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 화합물(리보푸라노실 고리의 2'-하이드록시기가 2'-O-2-메톡시에틸기로 대체되고, 포스페이트 연결이 포스포로티오에이트 연결로 대체되는 점에서 변형된)이다. 누시네르센의 나트륨 염(누시네르센 나트륨)은 상표명 SPINRAZA® 하에 시판된다. 누시네르센은 SMN 단백질 결핍으로 이어지는 염색체 5q에서의 돌연변이에 의해 유발된 SMA를 치료하기 위해 설계된다. 시험관내 분석 및 SMA의 형질전환 동물 모델에서의 연구를 사용하여, 누시네르센은 SMN2 메신저 리보핵산(mRNA) 전사체에서 엑손 7 포함 및 전장 SMN 단백질의 생산을 증가시키는 것으로 나타났다. 누시네르센은 SMN2 전구-mRNA의 스플라이싱 효율을 증가시킴으로써, SMA를 유발하는 SMN 단백질 결손에 대항하는 작용을 한다.
누시네르센은 18-머(mer) 2'-MOE 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 누시네르센은 SMN2 전구-mRNA 상의 특정 표적 서열과 쌍을 형성하여 엑손 7 및 8 사이의 인트론 스플라이스 침묵화 부위-1(intronic splice silencing site-1, ISS-1)에 있는 이종 리보핵단백질(hnRNP)을 대체하여 유사 유전자(paralogous gene) SMN2로부터 SMN 단백질의 보다 완전한 번역을 허용하도록 설계되었다. 누시네르센을 뇌척수액(CSF) 내로 척추강내 주사하는 것은 누시네르센을 CSF로부터 표적 중추신경계(CNS) 조직까지 분포시킨다. 누시네르센의 전체 서열은 [2'-O-(2-메톡시에틸)](3'-5')(P-티오)(T-5mC-A-5mC-T-T-T-5mC-A-T-A-A-T-G-5mC-T-G-G)(서열번호:4)이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-MOE)-올리고리보뉴클레오타이드를 함유하여 뉴클레아제 분해를 감소시키고 상보성 RNA에 대한 결합 친화도를 향상시킨다.
SMA의 치료를 위한 몇 가지 다른 요법이 있다. 이들은, SMN 수준을 증가시키는 화합물, 예컨대 히스톤 탈아세틸화효소 억제제, 아미노글리코시드, 및 퀴나졸린 유도체를 포함한다. 히스톤 탈아세틸화효소 억제제, 예컨대 발프로산, 나트륨 부티레이트, 페닐부티레이트, 및 트리코스타틴 A는 SMN2 프로모터를 활성화시켜, 전장 SMN 단백질을 증가시킨다. 다른 요법은 CK-2127107(빠른 골격 근육 트로포닌 활성제), LMI070(브라나플란(branaplan), 예전에 NVS-SM1로도 알려짐), 올레속심(콜레스테롤 옥심 패밀리 구성원), RG7916(스플라이싱 변형제), SMN 유전자 요법(AAV9-SMN1; AVXS-101(AAV-인간 SMN 이식유전자)), 및 SRK-015(마이오스타틴의 잠재적 형태의 선택적 및 국소 억제제 항체)를 포함한다. 일부 경우, 이들 제제들 중 하나 이상은 SMA의 치료를 위해 조합으로 사용된다. 본 방법은 SMA의 임의의 치료를 포함하는 것으로 의도된다.
3. SMA에 대한 바이오마커
SMA 요법(예컨대, 상기 기재된 SMA 요법 중 하나 이상)을 이용한 치료로부터 이익을 얻을 대상체를 식별하거나 또는 요법이 작동하고 있는지를 결정하기 위해, 바이오마커를 갖는 것이 도움이 된다. 바이오마커는 정상적인 생물학적 과정, 병리적 과정, 또는 치료적 개입에 대한 약리학적 반응의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가될 수 있는 특징이다. 바이오마커는 생물학적(예를 들어, 소분자, 대사물, 펩타이드, 단백질, RNA, DNA), 생리적(예를 들어, 혈압, 근전도검사, 호흡 기능), 또는 구조적 측정(예를 들어, 초음파, 자기 공명 영상, 또는 조직학적 평가)일 수 있다. 바이오마커는 미래 임상 결과를 예측하는 예후 바이오마커; 질환 영향의 중증도를 나타내는 질환 진행 바이오마커; 요법에 대한 미래 임상 반응을 예측하고 요법을 계층화하는 것을 돕는 예측 바이오마커; 치료적 효과를 모니터링하고 정량화하는 약력학적 바이오마커; 및 종점에서의 변화가 미래 임상 반응과 관련된, 요법에 대한 미래 임상 반응을 예측하는 대리 종점 바이오마커(surrogate end point biomarker)일 수 있다.
SMA에 대한 몇 개의 알려진 바이오마커가 있다. 이들은 예후 바이오마커, 예컨대 질환 중증도의 지표로서 SMN2 카피 수; 질환 진행 바이오마커, 예컨대 운동 뉴런 손실의 지표로서 작용하는 복합 근육 활동 전위(CMAP) 진폭; 예측 바이오마커, 예컨대 SMN 복원 요법에 대해 적은 반응을 나타내는 감소된 CMAP 진폭; 약력학적 바이오마커, 예컨대 SMN2 유전자의 효과적인 유도의 지표로서 증가된 전장 SMN 전사체 및/또는 증가된 SMN 단백질; 및 대리 종점 바이오마커, 예컨대 개선된 신체 기능의 지표로서 증가된 운동 단위 수 추정(Motor unit number estimation, MUNE)을 포함한다.
본 개시내용은 SMA에 대한 신규한 바이오마커로서 신경필라멘트 수준의 용도를 예시한다. 신경필라멘트(NF)는 신경 세포에서 우세한 세포골격 요소이며, 기계적 안정성을 부여할 뿐만 아니라 축색 구경(axonal caliber)을 결정하는 역할을 한다. 인간 NF는 3개의 단백질 서브유닛인 NF-L, NF-M, 및 NF-H로 구성된다. 이들 단백질은 다른 중간 필라멘트 서브유닛 단백질과 동일한 기본 구조를 공유한다. 포유동물 신경계에서의 신경필라멘트는 또한 단백질 인터넥신을 함유하고, 말초 신경계에서의 신경필라멘트는 또한 단백질 페리페린을 함유할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "신경필라멘트 단백질"은 신경필라멘트 중쇄(NF-H), 신경필라멘트 중간/중급 쇄(NF-M), 신경필라멘트 경쇄(NF-L), 인터넥신, 또는 페리페린을 의미한다. SMA 바이오마커는 NF-H, NF-M, NF-L, 인터넥신, 및 페리페린 중 하나 이상일 수 있다. 특정 경우, SMA 바이오마커는 인산화된 NF-H(pNF-H)이다. 특정 경우, SMA 바이오마커는 인산화된 NF-L이다. 신경필라멘트 바이오마커의 수준은 RNA(예를 들어, mRNA) 또는 단백질을 사용하여 평가될 수 있다.
인간 NF-H의 아미노산 서열이 서열번호:1 및 서열번호:5 및 Lees et al., EMBO J, 7(7);1947-1955 (1988), UniProtKB - P12036, NCBI 참조 서열: NG_008404.1, NCBI 참조 서열: NP_066554.2에 제공되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
인간 NF-L의 아미노산 서열이 서열번호:2 및 Julien et al., Biochimica et Biohysica Acta, 909:10-20 (1987), UniProtKB - P07196, NCBI 참조 서열: NP_006149.2, 및 NCBI 참조 서열: NG_008492.1에 제공되어 있다.
Figure pct00003
인간 NF-M의 아미노산 서열이 서열번호:3 및 서열번호:6 및 Myers et al., EMBO J., 6(6):1617-1626 (1987) 및 UniProtKB - P07197에 제공되어 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
인간 인터넥신의 아미노산 서열이 서열번호:7에 제공되어 있다.
Figure pct00006
인간 페리페린의 아미노산 서열이 서열번호:8에 제공되어 있다.
Figure pct00007
특정 경우, NF(예를 들어, pNF-H)의 수준은 하나 이상의 다른 SMA 바이오마커와 조합하여 사용된다.
4. SMA 진단
본 개시내용은 대상체(예를 들어, 전증상 대상체)가 생물학적 활성 질환을 갖는지 여부(즉, SMA가 활성인지 여부 및 그것의 중증도)를 진단하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 대상체로부터 수득된 상기 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 대상체에서의 신경필라멘트 수준이 대조군 수준보다 높으면 SMA이 진단된다. 신경필라멘트 수준은 또한 질환의 중증도를 예측하며: 대조군에 비해 NF 수준이 더 높을수록 SMA는 더 심각하다.
일부 경우, 상기 방법은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 NF-H 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 경우, 상기 방법은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 pNF-H 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 경우, 상기 방법은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 NF-M 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 경우, 상기 방법은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 NF-L 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
생물학적 샘플은 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 또는 뇌척수액일 수 있다. 일부 경우, 생물학적 샘플은 혈장이다.
특정 경우, 대상체는 인간 태아이다. 특정 경우, 대상체는 신생아이다. 특정 경우, 대상체는 6개월 이하(예를 들어, 2일령, 3일령, 4일령, 5일령, 6일령, 1주령, 2주령, 3주령, 1개월령, 2개월령, 3개월령, 4개월령, 5개월령, 또는 6개월령)인 인간이다. 특정 경우, 대상체는 6개월 초과 및 18개월 이하(예를 들어, 7개월령, 8개월령, 9개월령, 10개월령, 11개월령, 12개월령, 13개월령, 14개월령, 15개월령, 16개월령, 17개월령, 또는 18개월령)인 인간이다. 일부 경우, 대상체는 18개월 초과인 인간이다. 일부 경우, 대상체는 18세 초과인 인간이다.
일부 경우, NF 수준은 생물학적 샘플에서 NF RNA(예를 들어, mRNA)의 수준을 평가함으로써 측정된다.
일부 경우, NF 수준은 생물학적 샘플에서 NF 단백질(NF-H, NF-M, 또는 NF-L 단백질)의 수준을 평가함으로써 측정된다. 특정 경우, NF 단백질은 pNF-H이다. 관심있는 단백질 또는 단백질들의 농도는 당해 분야에 알려진 임의의 방법, 예컨대 면역학적 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 방법의 비제한적인 예는 효소 면역분석, 방사선면역분석, 화학발광 면역분석, 전기화학발광 면역분석, 라텍스 비탁 면역분석, 라텍스 광학 면역분석, 면역-크로마토그래피 분석, 및 웨스턴 블랏팅을 포함한다. 특정 구현예에서, 관심있는 단백질 또는 단백질들의 농도는 질량 분광분석법에 의해 측정된다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H)은 대조군 수준 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 300 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 400 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 500 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 600 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 700 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 800 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 900 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 1000 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 1,100 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 1,200 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 1,300 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 1,400 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 1,500 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 2,000 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 3,000 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 4,000 pg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 5,000 pg/mL 초과이다.
SMA를 갖는 것으로 진단된 인간 대상체에게 임의의 SMA 요법이 투여될 수 있다. 특정 경우에, 이전에(previously) SMA를 갖는 것으로 결정된(예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 NF 수준을 측정함으로써) 인간 대상체에게 SMA 요법이 투여된다. 일부 경우, 요법은 SPINRAZA®이다. 일부 경우에, SPINRAZA®는 투여당 12 mg의 용량으로 척추강내로 투여된다. 일부 경우에, SMA 요법은 조합 요법이다.
SMA를 갖는 대상체에서의 pNF-H의 예시적인 수준이 하기 표에 제공되어 있다:
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5. 치료에 대한 반응성
NF의 수준은 또한 SMA 요법을 받는 대상체가 치료에 반응하고 있는지 결정하는 데 사용될 수 있다. 이것은 SMA 요법을 대상체에게 투여하기 전에 대상체로부터 제1 생물학적 샘플을 수득하고 SMA 요법을 대상체에게 투여한 후에 대상체로부터 제2 생물학적 샘플을 수득하고, 이러한 샘플들에서 NF(예를 들어, NF-H, NF-M, 또는 NF-L)의 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 하나의 경우, NF의 수준은 pNF-H의 수준이다. 일부 경우, 요법은 SPINRAZA®이다. 일부 경우, SPINRAZA®는 투여당 12 mg의 용량으로 척추강내로 투여된다. 일부 경우, SMA 요법은 조합 요법이다.
특정 경우에, 제1 생물학적 샘플 또는 샘플들은 치료하기 임의의 시간 전, 예를 들어, SMA 요법을 투여하기 1주 전, 며칠 전, 1일 전, 몇 시간 전, 1시간 전, 또는 1시간 미만 전에, 대상체로부터 수집될 수 있다. 유사하게, 제2 생물학적 샘플 또는 샘플들은 SMA 치료의 임의의 시간 후에, 예를 들어, SMA 요법을 투여 1시간 미만 후, 1시간 후, 몇 시간 후, 1일 후, 며칠 후, 1주 후, 몇 주 후, 1개월 후, 2개월 후, 3개월 후, 4개월 후, 5개월 후, 6개월 후, 7개월 후, 또는 8개월 후 대상체로부터 수집될 수 있다. SMA 요법을 시작한 후 NF 수준의 감소는 SMA 요법의 유효성을 나타낸다. 이러한 경우, SMA 요법의 계속이 표시된다. SMA 요법을 시작한 후 NF 수준의 감소 실패는 SMA 요법의 용량을 변경시킬(예를 들어, 용량을 증가시킬) 필요성, 또는 상기 특정 SMA 요법의 유효성의 결여를 나타낸다. 후자의 경우, 상기 특정 SMA 요법의 중단이 제안될 수 있고, 상이한 SMA 요법 또는 요법들의 사용이 고려되어야 한다.
NF의 수준은 RNA 또는 단백질 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 일부 경우, pNF-H의 수준이 결정된다. 관심있는 NF 단백질 또는 단백질들의 농도는 당해 분야에 알려진 임의의 방법, 예컨대 면역학적 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 방법의 비제한적인 예는 효소 면역분석, 방사선면역분석, 화학발광 면역분석, 전기화학발광면역분석, 라텍스 비탁 면역분석, 라텍스 광학 면역분석, 면역-크로마토그래피 분석, 및 웨스턴 블랏팅을 포함한다. 특정 구현예에서, 관심있는 단백질 또는 단백질들의 농도는 질량 분광분석법에 의해 측정된다.
특정 경우, 제1 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준(예를 들어, pNF-H)은 300 pg/mL 초과, 400 pg/mL 초과, 500 pg/mL 초과, 600 pg/mL 초과, 700 pg/mL 초과, 800 pg/mL 초과, 900 pg/mL 초과, 1000 pg/mL 초과, 1,500 pg/mL 초과, 2,000 pg/mL 초과, 3,000 pg/mL 초과, 4,000 pg/mL 초과, 또는 5,000 pg/mL 초과이다. 특정 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준보다 낮다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준에 비해 30% 초과(예를 들어, 31%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 초과)의 감소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 10% 내지 80%이다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 20% 내지 80%이다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 20% 내지 85%이다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 20% 내지 90%이다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 20% 내지 95%이다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 30% 내지 80%이다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 30% 내지 85%이다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 30% 내지 90%이다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 샘플에서 측정된 상기 신경필라멘트 수준은 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 30% 내지 95%이다.
특정 경우, 대상체는 전증상 인간이다. 특정 경우, 대상체는 신생아이다. 특정 경우, 대상체는 6개월 이하(예를 들어, 2일령, 3일령, 4일령, 5일령, 6일령, 1주령, 2주령, 3주령, 1개월령, 2개월령, 3개월령, 4개월령, 5개월령, 또는 6개월령)인 인간이다. 특정 경우, 대상체는 6개월 초과 및 18개월 이하(예를 들어, 7개월령, 8개월령, 9개월령, 10개월령, 11개월령, 12개월령, 13개월령, 14개월령, 15개월령, 16개월령, 17개월령, 또는 18개월령)인 인간이다. 일부 경우, 대상체는 18개월 초과인 인간이다. 일부 경우, 대상체는 18세 초과인 인간이다.
6. 질환 진행의 예측
대상체로부터의 생물학적 샘플에서의 NF의 수준은 또한 미래 표현형을 예측하는 역할을 할 수 있다. 예를 들어, NF의 수준은 미래 운동 기능을 예측할 수 있다. 예시로서, 요법의 개시 1 내지 2개월 후의 pNF-H의 수준은 요법의 개시 10개월 후의 운동 기능을 예측할 수 있다. 대조군에 비해 요법의 개시 1 내지 2개월 후의 pNF-H 수준이 더 낮을수록, 대상체가 요법의 개시 1 내지 2개월 후에 더 높은 pNF-H 수준을 갖는 대상체에 비해 개선된 운동 기능을 가질 가능성이 더 높다. 이 예측의 가능성은 건강관리 종사자가 대상체의 투약 및 치료를 변형 또는 조정하게 해 준다.
7. 대조군
상기에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 방법은 대상체(예를 들어, 전증상 인간 대상체)로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 NF 유전자 또는 단백질의 발현 수준(예를 들어, mRNA 또는 단백질 농도)을 측정하는 단계를 포함할 수 있고, 대조군과 비교하여 NF 유전자 또는 단백질 중 하나 이상의 발현 수준은, 대상체가 SMA를 갖는지 여부; SMA의 중증도; 미래 표현형; 및 대상체가 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)을 포함하는 치료에 대한 반응자인지 여부를 예측한다.
특정 구현예에서, 대상체가 SMA를 갖는지 여부를 진단할 때, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서의 NF 단백질(예를 들어, pNF-H)의 농도가 대조군보다 더 높은 경우, 대상체는 SMA를 가질 가능성이 높은 것으로 식별된다. 이 문맥에서, 용어 "대조군"은 SMA를 갖지 않는 것으로 알려진 동일 또는 유사한 연령의 대상체로부터 수득된 샘플(동일한 공급원으로부터의 샘플 - 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, CSF)을 포함한다. 예를 들어, 신생아 대상체가 시험되는 경우, 대조군은 또한 SMA를 갖지 않는 신생아로부터 유래되고; 6-18개월인 대상체가 시험되는 경우, 대조군은 또한 SMA를 갖지 않는 6-18개월인 대상체로부터 유래된다. 용어 "대조군"은 또한 SMA를 갖지 않는 것으로 알려진 대상체로부터 과거에 수득되고 SMA가 예측될 대상체로부터 채취한 시험 샘플과의 미래 비교를 위한 참조로 사용되는 샘플(동일한 조직으로부터의 샘플)을 포함한다. 특정 NF 단백질에 대한 "대조군" 발현 수준/농도는 또한 SMA를 갖지 않는 유사한 연령의 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 또는 그 초과)의 인간 대상체에서의 단백질 발현의 분석에 의해 미리 확립될 수 있다. 이후, 이러한 미리 확립된 참조값(SMA를 갖지 않는 다수의 대상체로부터 채취한 평균 또는 중앙값 발현 수준/농도일 수 있음)은 시험 샘플과의 비교에서 단백질 또는 핵산의 "대조군" 농도/발현 수준에 사용될 수 있다. 이러한 비교에서, 대상체는 분석되는 NF의 발현 수준이 미리 확립된 참조보다 높은 경우 SMA를 갖는 것으로 예측된다.
본 개시내용의 방법은 SMA를 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 유전자(예를 들어, 하나 이상의 NF 유전자)의 발현 수준(예를 들어, mRNA 또는 단백질 농도)을 측정하는 단계를 포함할 수 있고, 대조군과 비교하여 하나 이상의 NF 유전자의 발현 수준은 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)을 포함하는 치료에 대한 대상체의 반응성을 예측한다. 특정 구현예에서, SMA를 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 NF 단백질(예를 들어, pNF-H)의 농도가 대조군보다 낮은 경우, 대상체는 SMA 요법을 포함하는 요법에 반응할 가능성이 높은 것으로 식별된다. 이 문맥에서, 용어 "대조군"은 상기 SMA 요법에 반응하지 않는 것으로 알려진 동일 또는 유사한 연령의 대상체로부터 수득된 샘플(동일한 공급원으로부터의 샘플 - 예를 들어, 혈장, 혈액, 혈청, CSF)을 포함한다. 용어 "대조군"은 또한 상기 SMA 요법에 반응하지 않는 것으로 알려진 대상체로부터 과거에 수득되고 치료 반응성이 예측되는 대상체로부터 채취한 시험 샘플과의 미래 비교를 위한 참조로서 사용되는 샘플(동일한 조직으로부터의 샘플)을 포함한다. 특정 세포 유형 또는 조직에서 특정 NF 단백질에 대한 "대조군" 발현 수준/농도는 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®) 치료에 반응하지 않은 동일 또는 유사한 연령의 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 또는 그 초과)의 인간 대상체에서의 단백질 발현의 분석에 의해 미리 확립될 수 있다. 이후, 이러한 미리 확립된 참조값(요법에 반응하지 않은 다수의 대상체로부터 얻은 평균 또는 중앙값 발현 수준/농도일 수 있음)은 시험 샘플과의 비교에서 단백질 또는 핵산의 "대조군" 농도/발현 수준에 사용될 수 있다. 이러한 비교에서, 대상체는 분석되는 NF 유전자의 발현 수준이 미리 확립된 참조보다 낮은 경우 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)을 포함하는 요법에 반응하는 것으로 예측된다.
특정 생체액, 세포 유형, 또는 조직에서 특정 단백질(예를 들어, NF-H)에 대한 "대조군" 농도는 대안적으로 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®) 치료에 반응한 하나 이상의 대상체에서의 유전자 발현의 분석에 의해 미리 확립될 수 있다. 이러한 미리 확립된 참조값(요법에 반응한 다수의 대상체로부터 얻은 평균 또는 중앙값 발현 수준일 수 있음)은 시험 샘플과의 비교에서 "대조군" 발현 수준으로서 사용될 수 있다. 이러한 비교에서, 대상체는 분석되는 단백질의 농도가 미리 확립된 참조와 동일하거나 대등한(적어도 85%이나 100% 미만) 경우 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)에 반응하는 것으로 예측된다.
특정 구현예에서, "대조군"은 미리 결정된 컷-오프 값이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 관심있는 NF 단백질(들)의 농도가 미리 결정된 컷-오프 값 초과 또는 미만인지 결정하는 단계를 포함한다.
컷-오프 값은 전형적으로 무엇 - 예컨대 SMA가 발생시킬 가능성 또는 관심있는 요법에 대한 대상체의 반응성을 예측하는 것으로 간주되는 높거나 낮은 단백질의 농도이다. 따라서, 본원에 기재된 방법에 따르면, NF 단백질(예를 들어, pNF-H)의 참조 농도는 SMA를 갖는 대상체 또는 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)에 대해 반응성을 보이는 대상체를 예측하는 높거나 낮은 컷-오프 값으로서 식별된다. 일부 컷-오프 값은 컷오프의 어느 한 쪽에 있는 값의 범위에 걸쳐 여전히 유의하게 유지될 수 있다는 점에서 절대적이지 않지만, 특정 샘플 유형에 대한 NF 단백질의 농도의 최적의 컷-오프 값(예를 들어, 다양한 H-점수)을 선택할 수 있다. 본원에 기재된 방법에 사용하기 위해 결정된 컷-오프 값은, 예를 들어, NF 농도의 공개된 범위와 비교될 수 있지만, 사용된 방법론 및 환자 집단에 개별화될 수 있다. 최적의 컷-오프 값의 개선은 사용된 통계적 방법의 정교성 및 상이한 단백질, 유전자, 및 샘플 유형에 대한 참조 수준값을 결정하기 위해 사용된 샘플의 수 및 공급원에 따라 결정될 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 확립된 컷-오프 값은 방법론 또는 집단 분포의 주기적 재평가 또는 변화에 따라 상향 또는 하향 조정될 수 있다.
하나 이상의 NF 단백질의 참조 농도는 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 참조 수준은, 예를 들어, SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)에 반응하거나 SMA 요법에 반응하지 않는 대상체(예를 들어, 환자)의 집단에서 관심있는 NF 단백질의 농도의 비교에 의해 결정될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 환자의 전체 코호트가 그래프로 제시되는 히스토그램 분석에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 제1 축은 관심있는 단백질의 농도를 나타내고, 제2 축은 샘플이 하나 이상의 농도를 함유하는 코호트에서의 대상체의 수를 나타낸다. 이후, 단백질의 참조 농도의 결정은 이들 개별 그룹을 가장 잘 구별하는 양 또는 농도에 기초하여 이뤄질 수 있다. 참조 수준은 모든 대상체에게 동일하게 적용될 수 있는 단일 수일 수 있거나, 참조 수준은 대상체의 특정 하위집단에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 나이가 많은 대상체는 나이가 어린 대상체와 다른 참조 수준을 가질 수 있다. 또한, 더 심각한 질환을 갖는 대상체는 더 경미한 형태의 질환을 갖는 대상체와 다른 참조 수준을 가질 수 있다(예를 들어, 유형 I 대 유형 IV SMA; 유형 I 대 유형 III SMA; 유형 I 대 유형 II SMA)
미리 확립된 컷-오프 값은 수신자 조작 특성(ROC) 분석에 기초하여 결정된 NF 단백질 농도(예를 들어, pNF-H)일 수 있다. ROC 곡선은 임상 시험을 위한 컷-오프 값을 결정하는 데 사용된다. 두 그룹의 환자가 있고 확립된 표준 기술을 사용하여 하나의 그룹은 SMA 요법에 반응하는 것으로 알려져 있고 다른 그룹은 SMA 요법에 반응하지 않는 것으로 알려진 상황을 고려한다. 두 그룹의 모든 구성원으로부터의 생물학적 샘플을 사용한 측정은 SMA 요법에 대한 반응성을 시험하는 데 사용된다. 시험은 SMA 요법에 반응하는 전부는 아닌 일부 반응자를 발견할 것이다. 시험에 의해 발견된 반응자 대 반응자(확립된 표준 기술에 의해 알려짐)의 총 수의 비율은 진양성 비율(민감도로도 알려짐)이다. 시험은 SMA 요법에 반응하지 않는 전부는 아닌 일부 비-반응자를 발견할 것이다. 시험에 의해 발견된 비-반응자 대 비-반응자(확립된 표준 기술에 의해 알려짐)의 총 수의 비율은 진음성 비율(특이도로도 알려짐)이다. SMA 요법-반응성 시험의 ROC 곡선 분석이 위양성 및 위음성의 수를 최소화할 컷-오프 값을 찾기를 희망한다. ROC는 그의 구별 역치가 변화함에 따라 2진 클래스 계층화 시스템의 성능을 설명하는 도표이다. 그것은 다양한 역치 설정에서 양성 중에서 진양성의 비율 대 음성 중에서 위양성의 비율을 플롯팅함으로써 생성된다.
일 구현예에서, NF 단백질 농도는 양성 예측값을 갖는 SMA 요법에 대한 반응을 예측하는 ROC 분석에 기초하여 결정되며, 미리 확립된 컷-오프 값 이하의 관심있는 단백질(예를 들어, pNF-H)의 농도는 관심있는 단백질의 저농도이고, 미리 확립된 컷-오프 값보다 높은 값은 관심있는 단백질의 고농도이다. 양성 예측값은 진양성인 양성 시험 결과의 비율이고, 그것은 양성 시험이 시험되고 있는 기본 조건을 반영할 가능성을 반영한다. ROC 곡선을 구축하고 양성 예측값을 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
또 다른 구현예에서, 미리 확립된 컷-오프 값은 SMA 요법에 대한 반응성을 예측하는 모의실험 모델에 기초하여 결정된 NF 단백질 농도일 수 있고, 미리 확립된 컷-오프 값 이하의 관심있는 단백질(예를 들어, pNF-H)의 농도는 관심있는 단백질의 저농도이고, 미리 확립된 컷-오프 값보다 높은 값은 관심있는 단백질의 고농도이다.
8. 생물학적 샘플
본원에 기재된 방법에 적합한 생물학적 샘플은 예컨대 NF 단백질 또는 핵산(예를 들어, RNA(mRNA))과 같은 관심있는 분석물 생체분자를 포함하는, 임의의 생물학적 유체, 세포, 조직, 또는 이의 분획을 포함한다. 생물학적 샘플은, 예를 들어, 인간 대상체로부터 수득된 검체일 수 있거나 이러한 대상체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 생검에 의해 수득된 조직 절편, 보관된 생물학적 유체, 또는 조직 배양에 놓여지거나 조직 배양에 적합한 세포일 수 있다. 일부 경우, 생물학적 샘플은 생물학적 유체, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액(CSF), 소변, 또는 기질(예를 들어, 유리, 폴리머, 종이)에 흡수된 이러한 샘플이다. 생물학적 샘플은 원하는 경우 특정 세포 유형을 함유하는 분획으로 추가로 분별될 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플은 혈청으로 또는 적혈구 또는 백혈구와 같은 특정 유형의 혈구를 함유하는 분획으로 분별될 수 있다. 원하는 경우, 샘플은 조직 및 유체 샘플의 조합과 같은 대상체로부터의 샘플의 조합일 수 있다.
생물학적 샘플은 SMA를 갖거나, 가질 것으로 의심되거나 또는 발생시킬 위험이 있는 대상체로부터 수득될 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간 태아이다. 특정 구현예에서, 대상체는 전증상 유아이다. 특정 구현예에서, 대상체는 전증상 인간 어린이이다. 특정 구현예에서, 대상체는 전증상 성인이다.
생물학적 샘플을 수득하기 위한 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있지만, 예시적인 방법은 예를 들어 정맥절개술(phlebotomy), 미세 바늘 흡인 생검(fine needle aspirate biopsy) 절차를 포함한다. 샘플은 또한 예를 들어, 미세해부(microdissection)(예를 들어, 레이저 캡처 미세해부(LCM) 또는 레이저 미세해부(LMD))에 의해 수집될 수 있다.
샘플에서의 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질)의 활성 또는 온전성을 보존하는 샘플을 수득 및/또는 저장하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 샘플 내의 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질)의 변화를 보존 또는 최소화하는 뉴클레아제, 프로테아제, 및 포스파타제 억제제 중 하나 이상을 포함하는 버퍼 및/또는 억제제와 같은 하나 이상의 추가 제제와 추가로 접촉될 수 있다. 이러한 억제제는 예를 들어 킬레이터, 예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글리콜 비스(P-아미노에틸 에테르) N,N,N1,Nl-테트라아세트산(EGTA), 프로테아제 억제제, 예컨대 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 아프로티닌(aprotinin), 류펩틴(leupeptin), 안티파인(antipain) 등, 및 포스파타제 억제제, 예컨대 포스페이트, 염화나트륨, 바나데이트 등을 포함한다. 분자를 단리하기 위한 적합한 버퍼 및 조건은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 특성화될 샘플 내의 분자의 유형에 따라 달라질 수 있다(예를 들어, Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. Burtis and Ashwood, eds. W.B. Saunders, Philadelphia, (1999) 참고). 샘플은 또한 간섭 물질의 존재를 제거하거나 최소화하기 위해 가공될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 관심없는 하나 이상의 물질을 제거하도록 분별되거나 정제될 수 있다. 생물학적 샘플을 분별화하거나 정제하는 방법은 비제한적으로, 크로마토그래피 방법, 예컨대 액체 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 또는 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 본원에 기재된 방법에 사용하기 위해, 샘플은 다양한 물리적 상태일 수 있다. 예를 들어, 샘플은 액체 또는 고체일 수 있거나, 액체에 용해되거나 현탁될 수 있거나, 에멀션 또는 겔에 있을 수 있거나, 또는 물질 상에 흡수될 수 있다.
9. 바이오마커의 발현 수준/농도의 결정
유전자 발현은 예를 들어 표적 유전자의 단백질 또는 RNA 발현으로서 검출될 수 있다. 즉, 유전자의 존재 또는 발현 수준(양)은 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현의 수준을 검출 및/또는 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 발현은 NF 유전자에 의해 코딩된 단백질의 활성으로서 검출될 수 있다.
일 구현예에서, 유전자의 발현은 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현 또는 농도를 검출 및/또는 측정함으로써 결정될 수 있다. 단백질 발현/농도를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로 사용된 방법은 관심있는 표적 단백질에 특이적인 항체의 사용을 수반한다. 예를 들어, 단백질 발현을 결정하는 방법은 비제한적으로, 웨스턴 블랏 또는 닷 블랏 분석, 면역조직화학(예를 들어, 정량적 면역조직화학), 면역세포화학, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 효소-결합 면역흡착 스팟(ELISPOT; Coligan, J. E., et al., eds. (1995) Current Protocols in Immunology. Wiley, New York), 방사선면역분석, 화학발광 면역분석, 전기화학발광면역분석, 라텍스 비탁 면역분석, 라텍스 광학 면역분석, 면역-크로마토그래피 분석, 및 항체 어레이 분석을 포함한다(예를 들어, 미국 공개 제2003/0013208호 및 제2004/171068호 참고, 이들 각각의 개시내용은 전체가 참고로 본원에 포함되어 있음). 단백질 발현을 검출하기 위한 많은 상기 방법 및 추가의 방법의 추가의 설명은 예를 들어, Sambrook et al.(상기)에서 발견될 수 있다.
일 예에서, NF 유전자(예를 들어, NF-H)의 NF 단백질 발현의 존재 또는 양은 웨스턴 블랏팅 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 용해물이 생물학적 샘플로부터 제조될 수 있거나, 생물학적 샘플 자체가 Laemmli 버퍼와 접촉되고 나트륨-도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 놓여질 수 있다. 이후, 크기에 의해 분리된 SDS-PAGE-분해된 단백질은 필터 막(예를 들어, 니트로셀룰로스)으로 옮겨지고 관심있는 단백질에 특이적인 검출가능하게 표지된 항체를 사용하여 면역블로팅 기술에 놓여질 수 있다. 결합된 검출가능하게 표지된 항체의 존재 또는 양은 생물학적 샘플에서의 단백질의 존재 또는 양을 나타낸다.
일 구현예에서, 심플플렉스(SimplePlex) 플랫폼이 NF-H(예를 들어, 인산화된 NF-H)의 수준을 측정하는 데 사용된다. 심플플렉스는 프로틴 심플(Protein Simple)(San Jose, CA, USA)로부터 상업적으로 이용가능하다(Dysinger M, et al. J. Immunol. Methods. 451:1-10, 2017 참고).
일 구현예에서, NF-L(예를 들어, 인산화된 NF-L)을 측정하기 위한 분석이 이용된다. 혈청에서 NF-L을 측정하는 분석이 설명되었다(예를 들어, Gaiottino et al., PLoS ONE 8: e75091, 2013; Kuhle et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 86(3): 273-279, 2014 참고). 일 예에서, 대상체로부터의 혈청은 실온에서 10분 동안 1000g에서 원심분리되고 수집 2시간 내에 -80℃에서 보관된다. 혈청 NF-L 농도는 즉시 사용가능한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)(Mabtech AB, Nacka Strand, Sweden) 또는 Gaiottino et al., PLoS ONE 8: e75091, 2013에 기재된 전기화학발광(ECL) 면역분석, 또는 Disanto et al., Ann. Neurol. 81(6): 857-870, 2017에 기재된 단일 분자 어레이(single molecule array, SIMOA) 방법을 사용하여 측정(예를 들어, 반복하여)될 수 있다. 분석 방법은 Kuhl et al., Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 54 (10): 1655-1661, 2016에서 비교되었다. SIMOA 분석(특히 Simoa NF-광 이점 키트로 불림)은 퀀테릭스사(Quanterix Corp.)(Lexington, MA, USA)로부터 상업적으로 이용가능하다.
또 다른 예에서, 면역분석은 유전자(예를 들어, NF-H 유전자)의 단백질 발현을 검출 및/또는 측정하는 데 사용될 수 있다. 상기와 같이, 검출을 위해, 면역분석은 검출 모이어티(예를 들어, 형광 제제 또는 효소)를 갖는 항체로 수행될 수 있다. 생물학적 샘플로부터의 단백질은 고체상 매트릭스(예를 들어, 다중-웰 분석 플레이트, 니트로셀룰로스, 아가로스, 세파로스, 코딩된 입자, 또는 자기 비드)에 직접 접합될 수 있거나 특이적 결합 쌍의 제2 구성원(예를 들어, 스트렙타비딘 또는 바이오틴)에 결합시 고체상 매트릭스에 부착하는 특이적 결합 쌍의 제1 구성원(예를 들어, 바이오틴 또는 스트렙타비딘)에 접합될 수 있다. 이러한 고체상 매트릭스에의 부착은 단백질을 검출 항체와 접촉하기 전에 생물학적 샘플의 다른 간섭하는 또는 무관한 구성요소로부터 정제시키고 또한 미결합된 항체의 후속 세척을 가능하게 한다. 여기에서, 상기와 같이, 결합된 검출가능하게 표지된 항체의 존재 또는 양은 생물학적 샘플에서의 단백질의 존재 또는 양을 나타낸다.
항체의 형태에 관해서는 특별한 제한이 없으며, 본 개시내용은 다클론성 항체뿐만 아니라 단클론성 항체를 포함한다. 동물, 예컨대 토끼를 본 발명의 단백질 또는 이의 단편(즉, NF 단백질의 단백질 또는 이의 면역학적 단편)뿐만 아니라 모든 부류의 다클론성 및 단클론성 항체, 인간 항체, 및 유전적 재조합에 의해 생산된 인간화된 항체로 면역화하여 수득된 항혈청이 또한 포함된다.
온전한 단백질 또는 그의 부분적인 펩타이드는 면역화를 위한 항원으로서 사용될 수 있다. 단백질의 부분적인 펩타이드로서, 예를 들어, 단백질의 아미노(N)-말단 단편 및 카복시(C)-말단 단편이 제공될 수 있다.
관심있는 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 면역학적 단편)을 코딩하는 유전자는 알려진 발현 벡터 내로 삽입되고, 숙주 세포를 본원에 기재된 벡터로 형질전환시킴으로써, 원하는 단백질 또는 이의 단편은 표준 방법을 사용하여 숙주 세포 외부 또는 내부로부터 회수된다. 이 단백질은 감작 항원으로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질, 세포 용해물, 또는 화학적으로 합성된 단백질을 발현하는 세포가 또한 감작 항원으로서 사용될 수 있다.
감작 항원에 의해 면역화된 포유동물은 제한되지 않으나; 세포 융합에 사용된 모 세포와의 양립성을 고려하여 동물을 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 설치목(order rodentia), 토끼목(order lagomorpha), 또는 영장목(order primate)에 속하는 동물이 사용된다. 사용될 수 있는 설치목에 속하는 동물의 예는, 예를 들어, 마우스, 랫트, 및 햄스터를 포함한다. 사용될 수 있는 토끼목에 속하는 동물의 예는, 예를 들어, 토끼를 포함한다. 사용될 수 있는 영장류 목에 속하는 동물의 예는, 예를 들어, 원숭이를 포함한다. 사용될 원숭이의 예는 협비원숭이 하목(infraorder catarrhini)(구대륙 원숭이), 예를 들어, 마카카 파스시컬라리스(Macaca fascicularis), 붉은털원숭이(rhesus monkey), 망토 개코원숭이(sacred baboon), 및 침팬지를 포함한다.
동물을 감작 항원으로 면역화하기 위해 널리 알려진 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 감작 항원은 포유동물에게 복강내로 또는 피하로 주사된다. 구체적으로, 감작 항원은 적합하게 희석되고, 생리적 염수, 포스페이트 완충 식염수(PBS), 등에 현탁되고, 원하는 경우 적합한 양의 일반적인 보조제, 예를 들어, 프로인트 완전 보조제와 혼합된다. 이후, 용액은 에멀션화되고 포유동물에게 주사된다. 이후, 프로인트 불완전 보조제와 적합하게 혼합된 감작 항원이 바람직하게는 4 내지 21일마다 몇 회 제공된다. 적합한 담체는 또한 동물을 감작 항원으로 면역화할 때 사용될 수 있다. 면역화 후, 혈청 항체 수준의 상승은 일반적인 방법에 의해 검출된다.
본 개시내용의 단백질에 대한 다클론성 항체는 하기와 같이 제조될 수 있다. 원하는 혈청 항체 수준에 도달되었음을 확인한 후, 항원으로 감작된 포유동물로부터 혈액을 채혈한다. 이 혈액으로부터 종래의 방법을 사용하여 혈청이 단리된다. 다클론성 항체를 함유하는 혈청은 다클론성 항체로서 사용될 수 있거나, 또는 필요에 따라, 다클론성 항체-함유 분획이 혈청으로부터 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질을 구체적으로 인식하는 항체의 분획이 단백질이 커플링된 친화성 칼럼을 사용하여 제조될 수 있다. 이후, 분획은 면역글로불린 G 또는 M을 제조하기 위해 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼을 사용하여 추가로 정제될 수 있다.
단클론성 항체를 수득하기 위해, 상기 기재된 항원으로 감작된 포유동물에서 원하는 혈청 항체 수준에 도달하였음을 확인한 후, 면역세포가 포유동물로부터 채취되고 세포 융합에 사용된다. 이러한 목적을 위해, 비장세포는 바람직한 면역세포로서 언급될 수 있다. 상기 면역세포와 융합된 모 세포로서, 포유동물 골수종 세포가 바람직하게 사용된다. 더 바람직하게는, 제제에 의해 융합 세포를 구별하는 데 사용될 수 있는 특징을 획득한 골수종 세포가 모 세포로서 사용된다.
상기 면역세포 및 골수종 세포 사이의 세포 융합은 알려진 방법, 예를 들어, Milstein et al. (Galfre et al., Methods Enzymol. 73:3-46, 1981)에 의한 방법에 따라 수행될 수 있다.
세포 융합으로부터 수득된 하이브리도마는 표준 선택 배지, 예를 들어, HAT 배양 배지(하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 함유하는 배지)에서 세포를 배양함으로써 선택된다. 이 HAT 배지에서의 배양은 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 죽기에 충분한 기간, 일반적으로 며칠 내지 몇 주 동안 계속된다. 이후, 일반적인 제한 희석 방법이 수행되고, 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마가 선별되고 클로닝된다.
인간 이외의 동물을 항원으로 면역화함으로써 하이브리도마를 수득하는 상기 방법 외에도, 단백질에 결합하는 활성을 갖는 목적하는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마는 인간 림프구, 예를 들어, EB 바이러스로 감염된 인간 림프구를 단백질, 단백질 발현 세포, 또는 이의 용해물로 시험관내에서 감작하고, 감작된 림프구를 인간으로부터 유래된 골수종 세포, 예를 들어 영구적인 세포 분열 능력을 갖는 U266과 융합하는 방법에 의해 수득될 수 있다.
수득된 하이브리도마를 마우스의 복강 내로 이식하고 복수를 추출함으로써 수득된 단클론성 항체는, 예를 들어, 황산암모늄 침전, 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피, 본 개시내용의 단백질이 결합된 친화도 칼럼 등에 의해 정제될 수 있다.
단클론성 항체는 또한 유전 공학 기술을 사용하여 생산된 재조합 항체로서 수득될 수 있다(예를 들어, Borrebaeck C.A.K. and Larrick, J.W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD (1990) 참고). 재조합 항체는 면역세포, 예컨대 하이브리도마 또는 항체 생산 감작된 림프구로부터의 코딩 DNA를 클로닝하고, 적합한 벡터 내로 혼입시키고, 이 벡터를 숙주에 도입하여 항체를 생산함으로써 생산된다. 본 개시내용은 또한 이러한 재조합 항체를 포함한다.
하나 이상의 바이오마커에 의해 코딩된 단백질에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 또한 파아지 디스플레이와 같은 시험관내 방법에 의해 생성될 수 있다.
또한, 본 개시내용의 항체는 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩된 단백질에 결합하는 한, 항체 단편 또는 변형된 항체일 수 있다. 예를 들어, H 사슬 Fv 및 L 사슬 Fv가 링커에 의해 적합하게 연결된 Fab, F(ab') 2, Fv, 또는 단일 사슬 Fv(scFv)(Huston et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 85:5879-5883,(1988))가 항체 단편으로서 제공될 수 있다. 구체적으로, 항체 단편은 항체를 효소, 예를 들어, 파파인 또는 펩신으로 처리함으로써 생성된다. 대안적으로, 이들은 항체 단편을 코딩하는 유전자를 제작하고, 이를 발현 벡터 내로 도입하고, 이 벡터를 적합한 숙주세포에서 발현함으로써 생성될 수 있다(예를 들어, Co et al., J. Immunol., 152:2968-2976, 1994; Better et al., Methods Enzymol., 178:476-496, 1989; Pluckthun et al., Methods Enzymol., 178:497-515, 1989; Lamoyi, Methods Enzymol., 121:652-663, 1986; Rousseaux et al., Methods Enzymol., 121:663-669, 1986; Bird et al., Trends Biotechnol., 9:132-137, 1991 참고).
항체는 다양한 분자, 예컨대 형광 물질, 방사성 물질, 및 발광 물질에 접합될 수 있다. 이러한 모이어티를 항체에 부착시키는 방법은 이미 확립되어 있으며 본 기술분야에서 일반적이다(예를 들어, US 제5,057,313호 및 제5,156,840호 참고).
항체의 항원-결합 활성을 분석하는 방법의 예는 예를 들어, 흡광도의 측정, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 효소 면역분석(EIA), 방사선면역분석(RIA), 및/또는 면역형광을 포함한다. 예를 들어, ELISA를 사용할 때, 본 발명의 바이오마커에 의해 코팅된 단백질이 본 개시내용의 항체가 코팅된 플레이트에 첨가된 다음, 항체 샘플, 예를 들어, 항체 생산 세포의 배양 상청액, 또는 정제된 항체가 첨가된다. 이후, 알칼리성 포스파타제 및 이러한 효소에 의해 표지된 일차 항체를 인식하는 이차 항체가 첨가되고, 플레이트는 인큐베이션되고 세척되며, 흡광도는 효소 기질, 예컨대 p-니트로페닐 포스페이트를 첨가한 후 항원-결합 활성을 평가하기 위해 측정된다. 단백질로서, 단백질 단편, 예를 들어, C-말단을 포함하는 단편, 또는 N-말단을 포함하는 단편이 사용될 수 있다. 본 발명의 항체의 활성을 평가하기 위해, BIAcore(Pharmacia)가 사용될 수 있다.
이들 방법을 사용하여, 본 발명의 항체 및 본 발명의 단백질을 함유할 것으로 추정된 샘플이 접촉되고, 상기 언급된 항체 및 단백질 사이에서 형성된 면역 착물을 검출 또는 분석함으로써 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩된 단백질이 검출 또는 분석된다.
질량 분광분석법 기반의 정량화 분석 방법, 예를 들어, 비제한적으로, 안정한 동위원소 표지된 내부 표준과 조합된 다중 반응 모니터링(MRM) 기반의 접근법은 단백질의 정량적 측정을 위한 면역분석의 대안이다. 이들 접근법은 항체의 사용을 요구하지 않으며, 따라서 분석은 비용 및 시간 효율적인 방식으로 수행될 수 있다(예를 들어, Addona et al., Nat. Biotechnol., 27:633-641, 2009; Kuzyk et al., Mol. Cell Proteomics, 8:1860-1877, 2009; Paulovich et al., Proteomics Clin. Appl., 2:1386-1402, 2008 참고). 또한, MRM는 우수한 멀티플렉싱 능력을 제공하여, 수많은 단백질을 병렬적으로 동시 정량화하는 것을 허용한다. 이들 방법의 기본 이론은 널리 확립되었고 소분자의 약물 대사 및 약동학 분석에 널리 이용되었다.
또 다른 구현예에서, 관심있는 NF 유전자의 발현 수준은 RNA 수준을 측정함으로써 결정된다. 유전자의 mRNA 발현의 수준을 검출 및/또는 측정하기 위해 다양한 적합한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, mRNA 발현은 노던 블랏 또는 닷 블랏 분석, 역전사효소-PCR(RT-PCR; 예를 들어, 정량적 RT-PCR), 원위치 혼성화(예를 들어, 정량적 원위치 혼성화) 또는 핵산 어레이(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 어레이 또는 유전자 칩) 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 방법의 세부사항은 하기에 그리고 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition vol. 1, 2 and 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, USA, Nov. 1989; Gibson et al. (1999) Genome Res., 6(10):995-1001; 및 Zhang et al. (2005) Environ. Sci. Technol., 39(8):2777-2785; 미국공개 제2004086915호; 유럽 특허 제0543942호; 및 미국 특허 제7,101,663호에 기재되어 있으며; 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
일 예에서, 생물학적 샘플에서 하나 이상의 별개의 mRNA 집단의 존재 또는 양은 생물학적 샘플로부터 총 mRNA를 단리시키고(예를 들어, Sambrook et al.(상기) 및 미국 특허 제6,812,341호 참고), 단리된 mRNA를 아가로스 겔 전기영동하여 mRNA를 크기에 의해 분리함으로써 결정될 수 있다. 이후, 크기 분리된 mRNA는 고형 지지체, 예컨대 니트로셀룰로스 막으로 옮겨진다(예를 들어, 확산에 의해). 이후, 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 mRNA 집단의 존재 또는 양은 관심있는 mRNA 서열에 상보적인 하나 이상의 검출가능하게 표지된 폴리뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 결정될 수 있고, 이는 이들의 상응하는 mRNA 집단에 결합하고 이를 검출가능하게 한다. 검출가능한 표지는, 예를 들어, 형광(예를 들어, 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드, 알로피코시아닌(APC), 또는 파이코에리트린), 발광(예를 들어, 유로퓸, 테르븀, 퀀텀 닷사(Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA)에 의해 공급된 Qdot™ 나노입자), 방사선학적(예를 들어, 125I, 131I, 35S, 32P, 33P, 또는 3H), 및 효소적(호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라제) 표지를 포함한다.
또 다른 예에서, 생물학적 샘플에서의 mRNA(예를 들어, 하나 이상의 NF 유전자에 의해 코딩된 mRNA)의 별개의 집단의 존재 또는 양은 핵산(또는 올리고뉴클레오타이드) 어레이를 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플로부터의 단리된 mRNA는, 예를 들어, 랜덤 육량체 또는 올리고(dT)-프라이머 매개된 제1 가닥 합성을 갖는 RT-PCR을 사용하여 증폭될 수 있다. 앰플리콘은 더 짧은 분절로 단편화될 수 있다. RT-PCR 단계는 앰플리콘을 검출가능하게 표지하는데 사용될 수 있거나, 선택적으로, 앰플리콘은 RT-PCR 단계 후 검출가능하게 표지될 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 표지는 임의의 다양한 적합한 기술(예를 들어, Sambrook et al.(상기) 참고)을 사용하여 앰플리콘에 효소적으로(예를 들어, 닉-번역 또는 키나제, 예컨대 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제에 의해) 또는 화학적으로 접합될 수 있다. 이후, 검출가능하게 표지된 앰플리콘은 복수의 폴리뉴클레오타이드 프로브 세트와 접촉되고, 각각의 세트는 상응하는 앰플리콘에 특이적인(및 결합할 수 있는) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드) 프로브를 함유하며, 복수는 각각 상이한 앰플리콘에 상응하는 많은 프로브 세트를 함유한다. 일반적으로, 프로브 세트는 고형 지지체에 결합되고, 각각의 프로브 세트의 위치는 고형 지지체 상에 미리 결정된다. 검출가능하게 표지된 앰플리콘이 프로브 세트의 상응하는 프로브에 결합하는 것은 생물학적 샘플에서 표적 mRNA의 존재 또는 양을 나타낸다. 핵산 어레이를 사용하여 mRNA 발현을 검출하기 위한 추가의 방법이, 예를 들어, 미국특허 제5,445,934호; 제6,027,880호; 제6,057,100호; 제6,156,501호; 제6,261,776호; 및 제6,576,424호에 기재되어 있으며; 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
검출가능한 표지를 검출 및/또는 정량하는 방법은 표지의 특성에 좌우된다. 적절한 효소(검출가능한 표지가 효소인 경우; 상기 참고)에 의해 촉매된 반응의 생성물은, 비제한적으로, 형광, 발광, 또는 방사성일 수 있거나 또는 이들은 가시광선 또는 자외선을 흡수할 수 있다. 이러한 검출가능한 표지를 검출하는데 적합한 검출기의 예는, 비제한적으로, x선 필름, 방사능 계수기, 섬광 계수기, 분광측정기, 비색계, 형광측정기, 발광분석기, 및 농도계를 포함한다.
유전자 발현(예를 들어, 단백질 또는 mRNA 발현)을 검출 또는 측정하기 위한 방법은 선택적으로 다수의 샘플의 신속한 제조, 처리, 및 분석을 허용하는 포맷으로 수행될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 다중-웰 분석 플레이트(예를 들어, 96 웰 또는 386 웰) 또는 어레이(예를 들어, 핵산 칩 또는 단백질 칩)에서 수행될 수 있다. 다양한 시약에 대한 스톡 용액은 수작업으로 또는 로봇으로 제공될 수 있고, 후속적인 샘플 제조(예를 들어, RT-PCR, 표지화, 또는 세포 고정), 피펫팅, 희석, 혼합, 분배, 세척, 인큐베이션(예를 들어, 혼성화), 샘플 판독, 데이터 수집(광학 데이터) 및/또는 분석(컴퓨터 도움의 이미지 분석)은 상업적으로 이용가능한 분석 소프트웨어, 로보트, 및 분석으로부터 생성된 신호를 검출할 수 있는 검출 기기를 사용하여 로봇으로 수행될 수 있다. 이러한 검출기의 예는 비제한적으로, 분광측정기, 발광분석기, 형광계, 및 방사성 동위원소 감쇠를 측정하는 장치를 포함한다. 예시적인 고-처리량 세포 기반 분석(예를 들어, 세포에서의 표적 단백질의 존재 또는 수준을 검출하는)은 ArrayScan® VTI HCS 판독기 또는 KineticScan® HCS 판독기 기술(Cellomics Inc., Pittsburg, PA)을 이용할 수 있다.
일부 구현예에서, 1개의 NF 유전자, 2개의 NF 유전자, 또는 3개의 NF 유전자의 발현 수준이 평가되고/거나 측정될 수 있다.
하나 이상의 NF 유전자의 존재 또는 발현 수준을 검출하는 것을 돕기 위해, 유전자의 핵산 서열의 임의의 일부가, 예컨대 혼성화 폴리뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머(예를 들어, 증폭 또는 역전사를 위한)로서 사용될 수 있다. 프로브 및 프라이머는 생물학적 샘플로부터 단리된 RNA, DNA, cDNA, 또는 이의 단편에 대한 특이적 혼성화를 제공하는 충분한 길이의 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 특정 응용에 따라, 표적 서열에 대한 프로브 또는 프라이머의 다양한 정도의 선택성을 달성하기 위해 다양한 혼성화 조건이 이용될 수 있다. 프라이머 및 프로브는 검출을 촉진하는 시약으로 검출가능하게 표지될 수 있다(예를 들어, 형광 표지, 화학 표지(예를 들어, 미국 특허 제4,582,789호 및 제4,563,417호), 또는 변형된 염기).
표준 엄격 조건은 Sambrook, et al.(상기) 및 Haymes, et al. Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 의해 기재되어 있다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로서 작용하기 위해, 이용된 특정한 혼성화 조건(예를 들어, 용매 및 염 농도) 하에서 안정한 이중-가닥 구조를 형성할 수 있도록 서열이 충분히 상보적인 것만이 필요하다.
혼성화는 2개의 핵산 서열 간의 상동성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 서열, 또는 이의 단편은 표준 혼성화 기술에 따라 혼성화 프로브 로서 사용될 수 있다. 관심있는 프로브(예를 들어, 본원에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 그의 보체를 함유하는 프로브)가 시험 공급원으로부터의 DNA, RNA, cDNA, 또는 이의 단편에 혼성화하는 것은 시험 공급원에서 프로브에 상응하는 DNA 또는 RNA의 존재를 나타낸다. 혼성화 조건은 당업자에게 알려져 있으며, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991에서 발견될 수 있다. 중간 혼성화 조건은 30℃에서 2X 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서의 혼성화 후 50℃에서 1 X SSC, 0.1% SDS에서의 세척으로서 정의된다. 매우 엄격한 조건은 45℃에서 6X SSC에서의 혼성화 후 65℃에서 0.2 X SSC, 0.1% SDS에서의 세척으로서 정의된다.
프라이머는 다양한 PCR 유형 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술은 총 게놈 DNA 또는 총 세포 RNA로부터의 서열을 포함하는, DNA 뿐만 아니라 RNA의 특정 서열을 증폭하는데 사용될 수 있다. PCR 프라이머는 증폭하는 데 관심있는 영역의 측면에 위치하도록 설계된다. 프라이머는 증폭될 뉴클레오타이드 서열 내의 5' 말단, 3' 말단 근처 또는 어디든지 위치할 수 있다. 앰플리콘 길이는 실험 목표에 의해 결정된다. qPCR의 경우, 표적 길이는 100 염기쌍에 가깝고, 표준 PCR의 경우, 표적 길이는 500 염기쌍에 가깝다. 일반적으로, 관심있는 영역의 끝 또는 이후로부터의 서열 정보는 증폭될 주형의 반대 가닥과 서열이 동일하거나 유사한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계하는 데 사용된다. PCR 프라이머는 단일 핵산 분자(예를 들어, 포스포르아미다이트 기술을 사용하여 3'에서 5' 방향으로 자동 DNA 합성을 사용하여)로서 또는 일련의 올리고뉴클레오타이드로서 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 긴 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, >100개의 뉴클레오타이드)의 하나 이상의 쌍은 원하는 서열을 함유하도록 합성될 수 있고, 각각의 쌍은 올리고뉴클레오타이드 쌍이 어닐링될 때 이합체가 형성되도록 상보성의 짧은 절편(예를 들어, 약 15개의 뉴클레오타이드)을 함유한다. DNA 중합효소는 올리고뉴클레오타이드를 연장시켜, 올리고뉴클레오타이드 쌍당 단일의 이중-가닥 핵산 분자를 생성하는 데 사용된다.
또한, 핵산 서열 또는 이의 단편(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 프로브)은 유전자 발현의 검출 및/또는 정량화를 위해 핵산 어레이에서 사용될 수 있다
10. 치료 방법
본원에 개시된 방법은 SMA를 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체가 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)에 반응할 가능성이 높은지 여부를 평가할 수 있다. SMA 요법에 반응할 가능성이 높은 SMA를 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체에게 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)이 투여될 수 있다. 반대로, SMA 요법에 반응할 가능성이 낮은 SMA를 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체에게 SMA의 치료에 적합한 상이한 SMA 요법이 투여될 수 있다.
본 개시내용의 방법은 또한 SMA를 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체를 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)을 포함하는 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 높은 대상체의 그룹 및 이익을 얻을 가능성이 낮은 대상체의 그룹으로 계층화하는 것을 가능하게 한다. SMA 요법을 이용한 치료에 고려되고 있는 SMA 대상체의 풀로부터 이러한 대상체를 선택하는 능력은 대상체에게 효과적인 치료를 투여하는 데 유익하다.
SMA 요법을 포함하는 치료에 고려되는 대상체는 비제한적으로, SMA를 갖는 대상체, SMA를 가질 것으로 의심되는 대상체, 또는 SMA가 발생시킬 가능성이 높은 대상체를 포함한다. 일 구현예에서, SMA 요법으로 치료될 대상체는 유형 0 SMA를 갖거나, 가질 것으로 의심되거나, 발생시킬 가능성이 높다. 일 구현예에서, SMA 요법으로 치료될 대상체는 유형 I SMA를 갖거나, 가질 것으로 의심되거나, 발생시킬 가능성이 높다. 일 구현예에서, SMA 요법으로 치료될 대상체는 유형 II SMA를 갖거나, 가질 것으로 의심되거나, 발생시킬 가능성이 높다. 일 구현예에서, SMA 요법으로 치료될 대상체는 유형 III SMA를 갖거나, 가질 것으로 의심되거나, 발생시킬 가능성이 높다. 일 구현예에서, SMA 요법으로 치료될 대상체는 유형 IV SMA를 갖거나, 가질 것으로 의심되거나, 발생시킬 가능성이 높다.
SMA를 갖는 대상체가 SMA 요법에 반응할 가능성이 높으면(상기 기재된 바이오마커 중 하나 이상(예를 들어, pNF-H 단백질)의 농도에 기초하여), 대상체에게 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)의 유효량이 투여될 수 있다. 화합물의 유효량은, 예를 들어, 환자의 특성(연령, 성별, 체중, 인종, 등), 질환의 진행, 및 약물에 대한 이전 노출을 고려하여 건강관리 종사자에 의해 적합하게 결정될 수 있다. 대상체가 하나의 SMA 요법에 반응할 가능성이 낮으면, 대상체에게 선택적으로 상이한 SMA 요법이 투여될 수 있다.
모든 연령의 대상체는 SMA에 의해 영향받을 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법에서 사용된 생물학적 샘플은 태아, 유아, 어린이, 청소년, 또는 성인, 예컨대 SMA를 갖거나 가질 것으로 의심되는 성인을 포함하는, 임의의 연령의 인간 대상체로부터 수득될 수 있다.
상기 방법은 또한 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)에 의해 치료가능한 SMA가 발생시킬 위험이 있는 개체에게 적용될 수 있다. 이러한 개체는 (i) 이러한 장애의 가족력(유전적 소인) 또는 (ii) 이러한 장애가 발생할 하나 이상의 위험 인자를 갖는 개체를 포함한다.
대상체가 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)에 반응할 가능성이 높을지 또는 낮을지 여부에 기초하여 대상체를 계층화하거나 선택한 후, 의료 종사자(예를 들어, 의사)는 적절한 치료적 양식을 대상체에게 투여할 수 있다. SMA 요법을 투여하는 방법은 당업계에 알려져 있다.
본원에 기재된 임의의 요법(예를 들어, SPINRAZA®을 포함하는 요법 또는 SPINRAZA®를 포함하지 않는 요법)은 하나 이상의 추가의 치료제를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 즉, 본원에 기재된 임의의 요법은 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대, 비제한적으로, 본원에 기재된 다른 SMA 요법과 공동 투여(조합 투여)될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 임의의 요법은 치료를 위한 하나 이상의 제제, 또는 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)을 포함하는 요법의 더 많은 부작용을 포함할 수 있다.
조합 요법(예를 들어, SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®) 및 하나 이상의 추가의 SMA 요법 또는 추가의 치료제의 공동 투여)은 예를 들어, 동시 또는 연속적일 수 있다. 예를 들어, SMA 요법 및 추가의 치료제(들)는 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 첫 번째로 투여될 수 있고, SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)는 두 번째로 투여될 수 있다.
SMA를 갖고 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)에 반응할 것으로 예상된 대상체에게 이전에 SMA 요법이 투여된 경우, 요법은 이전에 또는 현재 투여된 요법을 대체하거나 증강시킬 수 있다. 예를 들어, SPINRAZA®로 치료시, 비-SPINRAZA® 요법의 투여는 중단되거나 감소될 수 있으며, 예를 들어, 더 낮은 수준으로 투여될 수 있다. 이전의 요법의 투여는, SPINRAZA®을 포함하는 요법이 투여되는 동안 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 이전의 요법은 SPINRAZA®의 수준이 치료 효과를 제공하기에 충분한 수준에 도달할 때까지 유지될 수 있다.
일부 경우에, 치료 방법은 자궁 내의 태아를 치료하는 단계를 포함한다. 치료될 태아는 대조군에 비해 높은 NF 수준(예를 들어, pNF-H 또는 NF-L)에 기초하여 SMA 요법 치료를 필요로 하는 것으로 결정된다. 예를 들어, 태아가 유전자 검사에 기초하여 SMA를 갖는 것으로 식별되었고 상승된 NF 수준을 갖는 것으로 식별된 경우, 태아는 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)으로 치료될 수 있다. 일부 경우, 치료 방법은 유형 0 환자와 관련된다. 태아가 매우 높은 NF 수준 및 하나의 SMN2 카피를 갖는 것으로 식별되는 경우, 태아가 유형 0 SMA를 가질 가능성이 높다. 이러한 태아를 출생 전에 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)으로 치료하는 것은 상기 태아를 효과적으로 치료할 수 있다.
11. 키트
본 개시내용은 또한 키트를 제공한다. 특정 구현예에서, 키트는 본원에 개시된 하나 이상의 바이오마커 또는 이들의 농도 또는 발현 수준을 검출하는 데 사용될 수 있는 항체 또는 항체들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 NF-H(예를 들어, pNF-H)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 키트 내의 항체는 단클론성 또는 다클론성일 수 있고, 검출가능한 표지와 추가로 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 개시된 임의의 바이오마커를 식별하거나 검출하는 데 사용될 수 있는 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 임의의 핵산 어레이를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 개시된 임의의 바이오마커 또는 이들의 발현 또는 발현 수준을 식별하거나 검출하는 데 사용될 수 있는 프로브 및 항체를 포함한다. 키트는, 선택적으로, 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 단백질의 농도 또는 mRNA의 수준을 검출 및/또는 측정하기 위한 지침을 함유할 수 있다.
키트는 선택적으로, 예를 들어, 대조군(예를 들어, 평가되는 단백질에 대한 농도 표준) 또는 어레이의 핵산 프로브에 인식된 하나 이상의 앰플리콘의 알려진 양을 함유하는 대조군 표지된 앰플리콘 세트를 포함할 수 있다. 일부 경우, 대조군은 SMA를 예측하거나 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)에 대한 반응성을 예측하는 하나 이상의 단백질(예를 들어, pNF-H) 또는 RNA의 발현 수준 또는 발현 수준 범위를 함유하는 삽입물(예를 들어, 종이 삽입물 또는 전자 매체, 예컨대 CD, DVD, 또는 플로피 디스크)일 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 생물학적 샘플을 처리하기 위한 하나 이상의 시약(예를 들어, 보정 시약, 버퍼, 희석제, 발색 시약, 반응을 정지시키기 위한 시약)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 생물학적 샘플로부터 단백질을 단리시키기 위한 시약 및/또는 생물학적 샘플에서의 단백질의 존재 및/또는 양을 검출하기 위한 시약(예를 들어, 검출 분석 대상인 단백질에 결합하는 항체 및/또는 단백질에 결합하는 항체에 결합하는 항체)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 키트는 적어도 하나의 마이크로플레이트(예를 들어, 96 웰 플레이트; 즉, 8웰의 12 스트립)를 포함한다. 마이크로플레이트는 그의 상응하는 플레이트 커버와 함께 제공될 수 있다. 마이크로플레이트는 폴리스티렌 또는 임의의 다른 적합한 물질일 수 있다. 마이크로플레이트는 각각의 웰 내부에 코팅된 특정 바이오마커의 존재를 식별하는 데 사용되는 항체를 가질 수 있다. 항체는 검출가능한 표지에 접합될 수 있다. 키트는 또한, 적어도 하나의 접착성 스트립을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는, 예를 들어, 발현 프로파일 또는 마이크로어레이 분석의 결과를 분석하기 위한 소프트웨어 패키지를 포함할 수 있다.
키트는 또한 본원에 기재된 임의의 유전자(예를 들어, NF-H)의 단백질 발현을 검출하기 위한 하나 이상의 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 본원에 기재된 임의의 유전자에 의해 코딩된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 또는 복수의 항체 및 선택적으로, 복수 중 적어도 하나의 항체에 결합할 수 있는 검출가능하게 표지된 항체를 포함하는 하나 이상의 단백질 및/또는 검출 항체의 농도를 검출 및/또는 측정하기 위한 지침을 포함할 수 있다(또는 일부 경우에 구성될 수 있다). 일부 구현예에서, 키트는 NF-H, NF-L, 및/또는 NF-M을 인식하는 항체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 pNF-H를 인식하는 항체를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 키트는 또한 선택적으로 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)의 하나 이상의 단위 용량을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 키트는 또한, 선택적으로, SMA 요법을 투여하기 위한 지침을 포함할 수 있고, 여기서 하나 이상의 단백질의 농도 또는 하나 이상의 RNA의 발현 수준은 SMA를 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체가 SMA 요법(예를 들어, SPINRAZA®)에 반응할지 예측한다.
특정 구현예에서, 키트는 하기 중 하나 이상을 포함한다:
(i) 마이크로플레이트(예를 들어, 96 웰 플레이트). 마이크로플레이트는 검출가능한 표지와 접합된 항-NF-H 항체로 코팅될 수 있다. 항-NF-H 항체는 단클론성 또는 다클론성일 수 있다. 항체는 예를 들어, 마우스, 토끼, 랫트, 또는 기니아 피그로부터 유래될 수 있다. 검출가능한 표지는 예를 들어, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 바이오틴, 형광 모이어티, 방사성 모이어티, 히스티딘 태그, 또는 펩타이드 태그일 수 있다. 마이크로플레이트는 커버 및 선택적으로, 하나 이상의 접착성 스트립과 함께 제공될 수 있다.
(ii) 검출가능한 표지와 접합된 항-NF-H를 함유하는 바이알. 검출가능한 표지는 예를 들어, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 바이오틴, 형광 모이어티, 히스티딘 태그, 펩타이드 태그일 수 있다. 바이알은 또한 보존제를 포함할 수 있다.
(iii) 알려진 농도의 NF-H 표준을 함유하는 바이알. NF-H는 재조합 인간 NF-H일 수 있다.
(iv) 분석 희석제를 함유하는 바이알.
(v) 캘리브레이터 희석제를 함유하는 바이알.
(vi) 세정 버퍼를 함유하는 바이알. 상기 버퍼는 농축물로서 제공될 수 있음.
(vii) 발색 시약을 함유하는 하나 이상의 바이알.
(viii) 비색계 반응을 정지시키는 정지 용액을 함유하는 바이알.
하기 예는 청구된 발명을 더 잘 예시하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 특정 물질이 언급되는 한, 그것은 단지 예시하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 당업자는 독창적인 능력을 행사하지 않으면서 그리고 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 동등한 수단 및 반응물을 개발할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 NURTURE, ENDEAR, EMBRACE, 및 CHERISH로 지정된 몇 가지 임상 연구를 언급한다.
ENDEAR은 증상이 있는 유아 발병 SMA를 갖는 대상체에서 ISIS 396443의 3상, 다기관, 무작위화된, 이중맹검, 가짜 시술(sham procedure) 제어된 연구였다. 이 연구에 대한 최종 분석 결과는 척추강내(IT) ISIS 396443으로 처리된 대상체가 운동 이정표의 획득에서 통계적으로 유의하고 임상적으로 의미있는 개선뿐만 아니라 가짜 시술을 받은 대상체의 대조군과 비교하여 무사고 생존, 전체 생존, 운동 기능, 및 운동 뉴런 건강에서 지속적이고 임상적으로 유의미한 개선을 달성하였다는 명확한 증거를 제공한다. 대조군 대비 개선은 치료 개시(로딩 용량 기간 말기) 후 2개월만큼 일찍 관찰되었고, 치료의 개시 후 6개월에 대조군과 명확히 분리되었다.
최종 분석시에, 121명의 대상체는 요추 천자(LP)[n=80] 또는 가짜 시술(n=41)에 의해 IT 주입으로서 투여된 ISIS 396443의 적어도 1개의 용량을 받았다. 이들 대상체 중에서, 89명의 대상체(ISIS 396443 아암(arm) 내에 65명 및 대조군 아암 내에 24명)는 연구를 완료하였다. 총 42명의 대상체(ISIS 396443 아암 내의 32명의 대상체 및 대조군 아암(arm) 내의 10명의 대상체)는 연구가 종결될 때 연구에 남아있었고, 조기 연구 종결로 인해 치료가 중단된 것으로 기록되었다. ISIS 396443 그룹 내의 2명의 대상체 및 대조군 내의 1명의 대상체는 공개(open label) 치료로 전환하기 전에 연구로부터 자발적으로 탈퇴하였고, 29명의 대상체(ISIS 396443 그룹 내에 13명 및 대조군 내의 16명)는 사망하였다.
이 연구에서 121명의 대상체의 인구통계 및 SMA 이력은 유형 I SMA 집단과 일치하였다.
· 45% 남성 및 55% 여성이 있었고; 대상체의 86%는 백인이었다.
· 대부분의 대상체(86%)는 12주 미만에 증상 개시가 있었다. 중앙값 연령은 SMA 증상 개시시 8.0주(범위: 1 내지 20주), SMA 진단시 12.0주(범위: 0 내지 30 주), 및 스크리닝시 166일(범위: 20 내지 211일)이었다. 등록시 중앙값 질환 기간은 13.1주(범위: 0.0 내지 25.86주)였다.
· 대부분의 대상체(99%)는 연구 참가시 현지 실험실 검사에 의해 2개의 SMN2 유전자 카피를 가지고 있었다.
· ISIS 396443 그룹의 80명의 대상체 중에서, 73명(91%)은 적어도 4개 용량의 ISIS 396443을 받았고(즉, 로딩 용량 단계를 완료함); 32명의 대상체(40%)는 6개의 모든 계획된 용량을 받았다. 대조군의 41명의 대상체 중에서, 34명의 대상체(83%)는 적어도 4개의 가짜 시술을 받았고, 14명의 대상체(34%)는 6개의 모든 시술을 겪었다.
CHERISH는 후기 발병 SMA를 갖는 대상체에서 ISIS 396443의 3상, 이중맹검, 무작위화된, 가짜 시술 제어된 연구였다. 대략 117명의 대상체가 연구에 등록되었고 2:1의 비율로 ISIS 396443 또는 샴 대조군 처리에 배정되었다. ISIS 396443을 로딩 요법(1, 29, 및 85일에 투약) 후 6개월 후에 유지 용량(274일에 투약)을 IT 투여하였다.
중간 분석의 결과는 IT ISIS 396443로 처리된 대상체가 가짜 시술을 받은 대상체의 대조군과 비교하여 운동 기능에서 통계적으로 유의한 이익뿐만 아니라 운동 이정표에서 지속적이고 임상적으로 유의미한 개선을 달성하였다는 명백한 증거를 제공한다. 운동 기능의 개선은 모든 시점에 관찰되었지만, 대조군으로부터의 분리는 처리 개시 후 6개월에 명백하게 발생하였다. ISIS 396443의 위험-이점의 평가에 기초하여, 후원자는 연구를 조기에 종료하기로 결정하였고, 대상체들에게 개방 연장 연구에 등록할 수 있는 기회를 주었다.
중간 분석 시점에, 126명의 대상체는 적어도 1개의 용량의 ISIS 396443(n=84) 또는 가짜 시술(n=42)을 받았다. 어떤 대상체도 처리를 중단하거나 연구에서 철수하지 않았다. 데이터 컷오프 일자에, ISIS 396443 그룹의 84명의 대상체 중 49명(58%) 및 대조군의 42명의 대상체 중 23명(55%)은 연구를 계속하고 있었다. 15개월에 HFMSE 점수에서 기저로부터의 변화의 주요 분석은 ISIS 396443로 처리된 84명 및 가짜 시술을 겪은 42명인 126명의 대상체로 구성된 ITT 세트에 기초하였다. WHO 운동 이정표의 주요 분석을 456일 방문(즉, 15개월)에 평가될 기회를 가진 54명의 대상체(ISIS 396443로 처리된 35명의 대상체 및 가짜 시술을 겪은 19명의 대상체)로 구성된 중간 효능 세트(Interim Efficacy Set)를 사용하여 수행하였다. 모든 다른 이차 및 삼차 종점 분석은 ITT 세트에서 수행하였다.
이 연구에서 126명의 대상체의 SMA 및 병력을 포함하는 인구통계 및 기저 질환 특성은 유형 II 또는 III SMA이 발생시킬 가능성이 높은 집단과 일치하였다.
· 47% 남성 및 53% 여성이 있었고; 75%는 백인이었다.
· 중앙값 연령은 SMA 증상 개시시에 11개월(범위: 6 내지 20), SMA 진단시에 18개월(범위: 0 내지 48개월), 및 스크리닝시에 3.0년(범위: 2 내지 9년)이었다. 등록 시점에 중앙값 질환 기간은 35.7개월(범위: 8 내지 94개월)이었다.
· 대부분의 대상체(88%)는 연구 참가시에 실험실 검사에 의해 3개의 SMN2 유전자 카피를 가지고 있었고, 대상체의 8%는 2개의 카피를 가지고 있었다.
· ISIS 396443 그룹의 84명의 대상체 중에서, 모두는 적어도 3개의 용량의 ISIS 396443을 받았고(즉, 로딩 용량을 완료함), 76명의 대상체(90%)는 4개의 모든 용량을 받았다. 대조군의 42명의 대상체 중에서, 모든 대상체는 적어도 3개의 가짜 시술을 받았고, 40명의 대상체(95%)는 4개의 모든 절차를 겪었다.
· 연구의 중앙값 시간은 2개의 처리 그룹 사이에서 유사하였다(즉, ISIS 396443 및 대조군 각각에 대해 412.5 및 419.5일). 연구의 대상체 연령의 총 수는 134.06이었다(ISIS 396443 그룹에서 88.84 대상체-연령 및 대조군에서 45.22 대상체-연령).
ISIS 396443으로 처리된 대상체는 가짜 시술을 받은 대상체와 비교하여 임상적으로 유의미한 이점을 실현하였다. 이들 이점은 HFMSE에 의해 측정된 바와 같이 운동 기능의 통계적으로 유의하게 큰 이점뿐만 아니라 상지(upper limb) 기능 능력의 개선을 포함하였다.
NURTURE는 전증상 SMA에서 ISIS 396443의 효능, 안전성, 내성, 및 PK를 평가하기 위한 진행 중인 2상, 개방, 다기관, 단일-아암 연구이다. 연구는 5q SMA의 유전적 기록, SMN2 유전자의 2 또는 3 카피, CMAP ≥ 1 mV, 및 SMA의 징후 또는 증상의 부재와 함께 등록 시점에 ≤ 6주인 대상체에서 수행되고 있다. 최대 25명의 대상체가 계획된다. 현재까지 이용가능한 효능 데이터는 대부분의 대상체의 발달 및 운동 이정표의 달성이 유형 I SMA의 자연사(natural history)보다 정상적인 발달과 더 일치하였음을 나타낸다.
NURTURE에 대한 데이터 컷오프 시점에, 20명의 대상체가 등록되었고 적어도 1개의 용량의 ISIS 396443을 받았다. 모든 대상체는 연구를 계속하고 있다. 4개의 모든 로딩 용량을 받았거나 64일 방문을 완료할 기회를 가진 18명의 대상체는 효능 세트를 구성한다.
· 대부분의 대상체는 남성(55%)이고 백인(50%)이다.
· 첫 번째 용량시의 연령은 3 내지 42일의 범위였고, 중앙값은 19일이었다.
· 18명의 대상체 중에서, 13명의 대상체(72%)는 SMN2 유전자의 2개의 카피를 가지며, 5명의 대상체(28%)는 3개의 카피를 갖는다.
효능 데이터는 64일에 18명의 대상체, 183일에 16명의 대상체, 302일에 11명의 대상체, 365일에 9명의 대상체, 및 421일에 5명의 대상체에 대해 이용가능하였다. 이러한 방문 중 나중의 결과는 유형 I SMA 및 대상체의 영향을 받은 형제자매의 경험과 일치하지 않으며 건강한 유아에 대한 연령 매칭된 기대와 일치하는 발달을 입증한다.
EMBRACE는 ENDEAR 또는 CHERISH에 참여할 자격이 없는 SMA를 갖는 대상체에서 ISIS 396443의 2상, 무작위화된, 가짜 시술 제어된, 다기관 연구이다. 이 연구는 CHERISH 자격을 갖추기에 너무 어린 연령에 유아 발병 SMA의 증상을 나타낸 대상체, 또는 ENDEAR 자격을 갖추기에 너무 나이가 많은 연령에 SMA의 후기 발병 증상을 나타내거나 너무 나이가 많은 연령에서 선별되었거나 또는 너무 많은 SMN2의 카피를 가져서 ENDEAR 자격을 갖출 수 없는 대상체의 고유한 세트를 평가하였다. 따라서, 이 연구에서의 집단은 SMN2의 최대 3개의 카피를 가진 대상체에서 유아 발병 및 후기 발병 SMA 모두의 맥락에서 ISIS 396443의 안전성, 내성, 및 효능을 평가할 기회를 제공하였다.
이 연구는 처음에는 이중맹검 연구로서 설계되었지만, ISIS 396443 임상 개발 프로그램에서의 중추적인 연구로부터 양성 및 강력한 효능 결과가 관찰된 후에, 이중맹검 단계(파트 1) 및 개방 확장 단계(파트 2)를 포함하는 2-파트 연구로 발전하였다. 파트 1은 무작위화된, 이중맹검, 가짜 시술 제어된 연구였다. 21명의 대상체가 미국 및 독일의 7개 사이트에서 연구에 등록하였다. 대상체의 무작위화를 SMA의 연령(유아 발병 [≤ 6개월] 대 후기 발병 [> 6개월])에 기초하여 계층화하였다. 대상체는 대략 10개월의 투약 기간 동안 총 6회의 척추강내(IT) 주입 또는 6회의 가짜 시술을 받도록 계획되었다. 그러나, 연구 파트 1은 ISIS 396443 임상 개발 프로그램에 대한 하나의 중추적인 연구의 중간 분석에서 관찰된 양성 및 강력한 효능 결과으로 인해 조기에 종료되었다. ISIS 396443의 위험-이점의 평가에 기초하여 연구의 파트 1을 조기에 종료하는 연구 후원자에 의한 결정의 결과로서, 모든 대상체는 파트 1 평가의 종료 평가를 조기에 완료하고 연구의 파트 2에 참여하도록 요청받았다. 파트 1에서 대상체 참여의 총 기간은 대략 15개월로 계획되었지만, 연구의 파트 1이 조기에 종결되었기 때문에, 자격있는 대상체는 파트 1 평가의 종료 평가 직후에 연구의 파트 2에 등록할 기회를 받았다.
총 21명의 대상체가 연구에 등록되었다. 대상체를 2:1 비율로 ISIS 396443 또는 대조군(가짜 시술)으로 무작위 추출하였다. 무작위화를 SMA와 일치하는 임상 징후 및 증상의 발병 연령에 기초하여 계층화하였다(≤ 6개월 [유아 발병] 대 > 6개월 [후기 발병]). 14명의 대상체는 연구의 파트 1에서 ISIS 396443을 받았고, 7명의 대상체는 가짜 시술을 받았다.
총 21명의 대상체를 스크리닝하고, 이 연구의 파트 1에 등록하였다. 모든 대상체를 2:1 비율로 무작위 추출하였고, 14명의 대상체는 ISIS 396443을 받았고, 7명의 대상체는 대조군 처리(가짜 시술)를 받았다. 또한, 무작위화를 유아 발병(≤ 6개월) 및 후기 발병(> 6개월) SMA와 일치하는 임상 징후 및 증상의 발병 연령에 기초하여 계층화하였다. 첫 대상체는 2015년 8월 19일에 처리되었고, 연구(파트 1)는 2016년 12월 20일에 종료하였다. 모든 대상체는 그들의 무작위화 배정에 따라 연구 처리를 받았다.
ITT 세트를 구성한 무작위화되고 투약된 21명의 대상체를 2개의 국가의 7개의 연구 사이트에서 등록하였다. 16명의 대상체(76%)는 미국의 6개의 사이트에서 등록되었고, 5명의 대상체(24%)는 독일의 1개의 사이트에서 등록되었다. 대상체를 여러 사이트에서 무작위 추출하였다. 21명의 무작위화된 대상체 중에서, 13명은 ≤ 6개월에 SMA 발병이 있었고, 나머지 8명의 대상체는 > 6개월에 SMA 발병이 있었다.
21명의 대상체는 처리를 받았고, 이들 중에서, 14명의 대상체는 연구의 조기 종결로 인해 완료되었다(대조군의 6명의 대상체 [86%] 및 ISIS 396443 그룹의 8명의 대상체 [57%]). 9명의 대상체(43%)는 302일까지 치료를 완료하였다(대조군의 2명의 대상체 [29%] 및 ISIS 396443 그룹의 7명의 대상체 [50%]). ISIS 396443 그룹 내의 6명의 대상체(29%)는 파트 1 최종 후속조치 평가(422일)를 완료하였다. 대조군에 배정된 1명의 대상체(5%)는 연구 289일에 뇌사로 인해 사망하였다.
인구통계 및 기저 질환 특성:
연구에서의 21명의 대상체 중에서, 11명(52%)은 남성이었고, 10명(48%)은 여성이었다. 첫 번째 용량시 연령은 7 내지 53개월의 범위였다(중앙값: 17개월). 11명의 대상체(52%)는 7 내지 18개월이었고, 10명의 대상체(48%)는 18개월 초과였다. 9명의 대상체(43%)는 백인이었고, 5명의 대상체(24%)는 아시아인이었으며, 2명의 대상체(10%)는 기타였다.
효능 및 약동학
· ISIS 396443 그룹 내의 대상체는 대조군의 대상체보다 인공호흡기(ventilator) 사용이 덜 필요하였다.
· HINE 운동 이정표 반응자의 비율은 대조군보다 ISIS 396443 그룹에서 더 컸으며, ISIS 396443 그룹으로부터 각각의 HINE 운동 이정표 카테고리에 적어도 1명의 반응자가 있었고, 가장 많은 수의 대상체가 머리 제어, 구르기, 및 앉기의 카테고리의 개선을 나타내었다.
안전성
이 연구에서, ISIS 396443은 다수의 IT 주사(4개의 로딩 용량 후 4개월마다 유지 용량)로서 투여될 때 잘 용인되었다. ISIS 396443의 전체적인 안전성 프로파일에서 신규한 안전성 문제가 확인되지 않았다.
ISIS 396443의 이러한 2상, 무작위화된, 가짜 시술 제어된 연구의 파트 1로부터의 결과는 ISIS 396443의 척추강내 투여가 유아 발병 또는 후기 발병 SMA를 갖는 대상체의 집단에서 효과적이라는 명백한 증거를 보여주었다. 가짜 투여만을 받은 연구 대상체의 대조군과 비교할 때, ISIS 396443으로 처리된 대상체는 운동 이정표의 이익을 달성하였고 유지하였으며, 조사자 및 간병인 평가에 기초할 때, 일반적으로 성장하고 번성하는 것으로 보였다. CSF ISIS 396443 농도 및 HINE 운동 이정표 총 점수 사이에서 양의 상관관계가 관찰되었고, 이는 시간이 경과함에 따라 증가하였다. ISIS 396443의 투약 요법은 새로운 안전성 문제가 확인되지 않았으므로 안전하였고 이 연구에서 잘 용인되었으며, 안전성 결과는 ISIS 396443 임상 개발 프로그램 내의 다른 연구로부터의 결과와 일치하였다. 모든 일차 안전성 및 탐색 효능 파라미터에 걸쳐 관찰된 결과에 기초하여, 그리고 미처리된 대조군에서 관찰된 결과와 대조적으로, ISIS 396443은 유아 발병 및 후기 발병 SMA를 갖는 대상체에서 운동 기능을 개선한다.
방법
선택된 시점에서의 혈장을 분석하여 pNF-H 농도를 검출하였다. 모든 혈장 샘플을 사용할 준비가 될 때까지 -70℃에서 동결시켰다. 선택된 스케줄 시간에서의 혈장 샘플을 분석 희석 버퍼를 사용하여 최소 요구 희석(MRD)으로 희석하였다.
NF-H를 엔코르 바이오테크놀로지(Encor Biotechnology)로부터의 다클론성 항-NF-H 항체(Cat # RPCA-NF-H; 및/또는 Cat # CPCA-NF-H)를 사용하여 분석하였다. 이들 항체는 NF-H의 과인산화된 형태를 특이적으로 검출한다.
임의의 환자 샘플을 분석하기 전에 자격 실험을 수행하였다. 이러한 실험은 ProteinSimple®에 의해 개발된 Ella 기술 플랫폼에 의해 생성된 pNF-H 농도의 재현성 및 가변성을 평가하는 것을 목표로 하였다. Ella 기술은 미리 로딩된 시약을 포함하는 미세유체 카트리지를 이용하므로, 샘플 및 세척 버퍼만이 카트리지에 로딩된다. 카트리지가 로딩되면, 플랫폼은 그의 내장된 공장 보정된 표준 곡선을 사용하여 pNF-H 농도를 자동으로 계산할 것이다.
각각의 카트리지의 품질뿐만 아니라 임의의 예측할 수 없는 잠재적인 혼란 효과를 실시간으로 평가하기 위해, 4개의 품질관리(QC) 샘플이 각각의 카트리지에 포함되어 있다: 3개의 버퍼 스파이킹된 QC, 고, 중 및 저, 및 상업적으로 이용가능한 다발성 경화증(MS) 환자로부터의 내인성 품질관리(EQC) 샘플(Bioreclamation)이 실행된다. 이들 4개의 QC는 생체분석 방법의 성능을 모니터링하고 개별 배치(batch)에서 분석된 미지의 샘플의 결과의 온전성 및 유효성을 평가하는 데 사용된다.
동일한 대상체로부터의 샘플을 동일한 카트리지 상에서 분석하였다. 샘플 분석이 가능한 배치 효과를 고려하도록 각각의 샘플에 대해 2개의 분취액을 무작위 순서로 동일한 카트리지에 넣었다.
실시예 1: CSF 대 혈장 pNF -H 수준의 상관관계
임상 연구 NURTURE 및 EMBRACE로부터의 혈장 및 CSF 샘플을 동일한 시점 및 동일한 대상체에서 분석하여 pNF-H 수준의 상관관계를 결정하였다. CSF 및 혈장 pNF-H의 수준 사이에 높은 상관관계(R=0.88)가 확인되었다(도 1). 이 결과는 pNF-H의 혈장 수준 및 신경필라멘트의 다른 서브유닛이 이들 동일한 단백질의 CSF 수준을 고도로 예측한다는 것을 시사한다.
실시예 2: 질환 및 중증도의 예측변수로서 혈장 pNF -H의 수준
임상 연구 NURTURE, ENDEAR, EMBRACE, 및 CHERISH로부터의 혈장 샘플을 기준선(ISIS 396443(NURTURE, ENDEAR, EMBRACE, 및 CHERISH) 또는 가짜 시술(ENDEAR, EMBRACE, 및 CHERISH)로 처리하기 전)에서의 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다. 건강한 지원자(4-18세)로부터의 혈장 샘플을 또한 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다.
건강 지원자로부터의 결과는 모든 연령에 대해 pNF-H < 300 pg/mL을 입증하였다. NURTURE, ENDEAR, EMBRACE, CHERISH로부터의 결과는 SMA를 가진 임상시험 대상체에서의 혈장 pNF-H의 수준이 거의 모두 > 300 pg/mL임을 입증한다. 일부 대상체는 최대 대략 50,000 pg/mL의 수준을 갖는다. 일반적으로, 2개의 SMN2 카피를 갖는 대상은 3개의 SMN2 카피를 갖는 대상체보다 더 높은 수준을 갖는다. 또한, 증상 개시 ≤ 6개월(ENDEAR)을 갖는 대상체는 증상 개시 > 6개월(CHERISH)을 갖는 대상체보다 더 높은 수준을 갖는다. 도 2를 참고한다.
그러나, 중요한 예외가 관찰되었다. NURTURE 내에서, 1명의 대상체는 2개의 SMN2 카피를 가지며, 3개의 SMN2 카피를 갖는 대상체와 더 일치하는 pNF-H 수준을 갖는다. 이 대상체는 유형 II SMA가 발생한 또한 2개의 SMN2 카피를 갖는 형제자매를 갖는다. 따라서, 이 대상체는 유형 I SMA가 발생할 것임을 시사하는 SMN2 카피 수를 가지지만, 대상체는 유형 II SMA가 발생할 것임을 시사하는 가족력을 갖는다. pNF-H 수준은 SMN1 결실 및 SMN2 카피 수를 넘어서는 추가의 진단 통찰력을 제공할 수 있다. ENDEAR 내에서, 1명의 대상체는 3개의 SMN2 카피를 가지며, 2개의 SMN2 카피를 갖는 대상체와 더 일치하는 pNF-H 수준을 갖는다. 이 대상체는 증상 개시 ≤ 6개월을 가졌으며, 따라서 유형 II SMA(가장 흔히 3개의 SMN2 카피)보다 유형 I SMA(가장 흔히 2개의 SMN2 카피)와 더 일치하였다.
전반적으로, 결과는 SMA를 갖는 대상체 사이에서 혈장 pNF-H의 수준이 건강한 지원자와 비교하여 현저하게 상승된다는 것을 입증한다. 그리고, SMA를 갖는 대상체 사이에서, 더 심각한 표현형을 갖는 대상체가 덜 심각한 표현형을 갖는 대상체보다 더 높은 혈장 pNF-H 수준을 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 3: pNF -H 대 연령의 상관관계( SMN2 카피 수 =2)
임상 연구 NURTURE, ENDEAR, EMBRACE, 및 CHERISH로부터의 혈장 샘플을 기준선(ISIS 396443(NURTURE, ENDEAR, EMBRACE, 및 CHERISH) 또는 가짜 시술(ENDEAR, EMBRACE, 및 CHERISH)로 처리하기 전)에서의 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다. 이 분석을 위해, 대상체를 2개의 SMN2 카피를 갖는 대상체로 제한하였다. 기준선 로그 변환된 pNF-H 수준을 첫 번째 용량(또는 가짜 시술)시의 연령에 대해 플롯팅하였다. 일반적으로, 나이가 어린 대상체는 나이가 많은 대상체보다 더 높은 pNF-H 수준을 가지고 있었다. 도　3을 참고한다.
이 결과는 pNF-H 수준이 2개의 SMN2 카피를 갖는 대상체 사이에서 연령이 증가함에 따라 감소한다는 것을 시사한다.
실시예 4: pNF -H 대 연령의 상관관계( SMN2 카피 수 = 3)
임상 연구 NURTURE, ENDEAR, EMBRACE, 및 CHERISH로부터의 혈장 샘플을 기준선(ISIS 396443(NURTURE, ENDEAR, EMBRACE, 및 CHERISH) 또는 가짜 시술(ENDEAR, EMBRACE, 및 CHERISH)로 처리하기 전)에서의 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다. 이 분석을 위해, 대상체를 3개의 SMN2 카피를 갖는 대상체로 제한하였다. 기준선 로그 변환된 pNF-H 수준을 첫 번째 용량(또는 가짜 시술)시의 연령에 대해 플롯팅하였다. 일반적으로, 나이가 어린 대상체는 나이가 많은 대상체보다 더 높은 pNF-H 수준을 가지고 있었다. 도　4를 참고한다.
이 결과는 pNF-H 수준이 3개의 SMN2 카피를 갖는 대상체 사이에서 연령이 증가함에 따라 감소한다는 것을 시사한다.
실시예 5: pNF -H 대 연령의 상관관계
임상 연구 NURTURE, ENDEAR, EMBRACE, 및 CHERISH로부터의 혈장 샘플을 기준선(ISIS 396443(NURTURE, ENDEAR, EMBRACE, 및 CHERISH) 또는 가짜 시술(ENDEAR, EMBRACE, 및 CHERISH)로 처리하기 전)에서의 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다. 이 분석을 위해, 대상체를 증상 개시의 연령(전증상(NURTURE), < 6개월, ≥ 6개월) 및 SMN2 카피 수(2, 3, 4 또는 NA)에 의해 계층화하였다. 일반적으로, 나이가 어린 대상체는 증상 개시의 연령 및 SMN2 카피 수의 각각의 계층 내에서 나이가 많은 대상체보다 더 높은 pNF-H 수준을 가지고 있었다. 도 5를 참고한다.
이 결과는 pNF-H 수준이 증상 개시의 연령 또는 SMN2 카피 수와 독립적으로 대상체 사이에서 연령이 증가함에 따라 감소한다는 것을 시사한다.
실시예 6: pNF -H 대 연령의 상관관계
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 기준선(ISIS 396443 또는 가짜 시술 처리 전)에서의 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다. 이 분석을 위해, pNF-H의 사분위수(quartile)를 전체 연구 집단 내에서 확인하였다. 사분위수는 2390 내지 10,900 pg/mL; 10,900 내지 15,400 pg/mL; 15,400 내지 21,600 pg/mL; 및 21,600 내지 50,100 pg/mL로서 정의되었다. 일반적으로, 기준선에서 더 높은 pNF-H 수준을 갖는 대상체는 첫 번째 용량시 나이가 어리고, 증상 개시시 나이가 어리며, SMA 진단시 나이가 어린 것으로 보였다. 또한, 기준선에서 더 높은 pNF-H 수준을 갖는 대상체는 기준선에서 더 낮은 평균 CHOP INTEND(Children's Hospital of Philadelphia Infant Test of Neuromuscular Disorders) 점수 및 비골 CMAP 진폭을 갖는 것으로 보였다. 도 6-8을 참고한다
이들 결과는 첫 번째 용량시 더 높은 pNF-H 수준이 증상 개시시 나이가 어린 연령; 하부 운동 기능(CHOP INTEND); 및 더 나쁜 운동 뉴런 건강(CMAP 진폭)으로서 입증된 바와 같이 더 심각한 표현형과 관련된다는 것을 시사한다.
실시예 7: pNF -H 수준 및 운동 기능
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 기저(ISIS 396443 또는 가짜 시술로 처리하기 전)에서의 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다. 이 분석을 위해, 로그 변환된 pNF-H의 수준을 기저 CHOP INTEND에 대해 플롯팅하였다. 일반적으로, 더 높은 pNF-H 수준을 갖는 대상체는 더 낮은 CHOP INTEND를 가지고 있었고, 더 낮은 pNF-H 수준을 갖는 대상체는 -0.3의 상관관계로 더 높은 CHOP INTEND를 가지고 있었다. 도 9를 참고한다.
이 결과는 pNF-H 수준이 운동 기능과 반비례한다는 것을 시사한다. 이 관계는 선형인 것으로 보인다.
실시예 8: pNF -H 수준에 기초한 운동 기능의 예측
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 기준선(ISIS 396443 또는 가짜 시술로 처리하기 전)에서의 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다. 이 분석을 위해, 선형 회귀 모델을 생성하여 기준선 CHOP INTEND의 다양한 잠재적인 예측변수 사이의 관계를 조사하였다. 통계적으로 유의한 상태로 남아있는 변수만을 포함한 최종 모델이 확인되었다(기저 NF-H; 처리 그룹, 질환 기간(주); 성별; 첫 번째 용량의 연령(일); SMA 증상 개시의 연령(주); SMA 진단의 연령(주); 임신 연령(주); 기저 체중(kg);(임신 연령 + 첫 번째 용량의 연령) x (임신 연령 + SMA 증상 개시의 연령); (임신 연령 + SMA 진단의 연령). 이 최종 모델에서, 기준선 로그 변환된 pNF-H 수준은 통계적으로 유의하였다. 도 10을 참고한다.
이 결과는 pNF-H 수준이 기저 운동 기능의 유의한 예측변수임을 시사한다.
실시예 9: ENDEAR에서 pNF -H( pg /mL) 수준
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 1, 2, 29, 64, 183, 및 302일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다(가짜 시술). 이 분석을 위해, pNF-H의 절대값을 로그 변환하고, 연구일에 의해 플롯팅하였다. 시간이 경과함에 따라, 평균 pNF-H 수준은 연구 1일에 대략 18,000 pg/mL에서 연구 302일에 대략 5,000 pg/mL로 거의 선형으로 감소한다. 도 11을 참고한다.
실시예 10: ENDEAR에서 pNF -H( pg /mL) 수준의 퍼센트 변화
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 1, 2, 29, 64, 183, 및 302일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다(가짜 시술). 이 분석을 위해, pNF-H의 절대값에 대한 기준선으로부터의 퍼센트 변화를 연구일에 의해 플롯팅하였다. 시간이 경과함에 따라, pNF-H 수준의 평균 퍼센트 변화는 연구 1일에 대략 0%에서 연구 302일에 대략 -60%로 거의 선형으로 감소한다. 도 12를 참고한다.
실시예 11: ENDEAR에서 pNF -H ( pg /mL) 수준에 대한 약물 효과
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 일수 1, 2, 29, 64, 183, 및 302일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다(ISIS 396443). 이 분석을 위해, pNF-H의 절대값을 로그 변환하고 연구일에 의해 플롯팅하였다. 시간이 경과함에 따라, 평균 pNF-H 수준은 연구 1일에 대략 18,000 pg/mL에서 연구 64일에 대략 5,000 pg/mL 및 그 다음 연구 302일에 대략 1,000 pg/mL로 감소한다. 도 13을 참고한다.
이 결과는 ISIS 396443로 처리된 대상체가 샴 대조군을 받은 대상체와 비교하여 pNF-H 수준의 감소에서 상이한 패턴을 갖는다는 것을 시사한다.
실시예 12: ENDEAR에서 pNF -H ( pg /mL) 수준의 퍼센트 변화에 대한 약물 효과
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 1, 2, 29, 64, 183, 및 302일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다(ISIS 396443). 이 분석을 위해, pNF-H의 절대값에 대한 기준선으로부터의 퍼센트 변화를 연구일에 의해 플롯팅하였다. 시간이 경과함에 따라, pNF-H 수준의 평균 퍼센트 변화는 연구 1일에 대략 0%에서 연구 64일에 대략 -70% 및 연구 302일에 -90%로 거의 선형으로 감소한다. 도 14를 참고한다.
이 결과는 ISIS 396443으로 처리된 대상체가 샴 대조군을 받은 대상체와 비교하여 pNF-H 수준의 감소에서 상이한 패턴을 가진다는 것을 시사한다.
실시예 13: 다양한 시점에 pNF -H 수준의 변화
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 1, 2, 29, 64, 183, 및 302일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). 이 분석을 위해, ISIS 396443를 받은 대상체 사이에서 pNF-H의 절대값에 대한 기준선으로부터의 퍼센트 변화의 특정 수준을 달성한 각 연구일에 대상체의 퍼센트를 샴 대조군을 받은 대상체와 비교하였다. 연구 64일에 2개의 연구 그룹 사이에서 통계적 유의성(p<0.05)이 최초로 확인되었다. pNF-H의 특정 변화를 달성하는 각각의 아암의 백분율 사이에서의 가장 큰 차이는 연구 183일에 -80% 변화에 대해 발생하였다. 도 15를 참고한다.
이 결과는 그룹에서의 차이가 연구 64일과 같이 조기에 확인될 수 있고 그룹 사이의 최상의 분리가 변화의 역치로서 -80%를 사용하여 발생한다는 것을 시사한다.
실시예 14: 183일의 HINE -2 점수와 64일의 pNF -H 수준과의 연관성
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 64일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, 총 운동 이정표 점수(HINE-2(해머스미스 유아 신경 검사 섹션 2))를 연구 183일에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). 이 분석을 위해, 선형 회귀 모델을 구축하여 연구 64일의 pNF-H 수준이 연구 183일의 총 HINE-2 점수와 관련되었지 여부를 결정하였다. 연구 64일의 pNF-H 수준은 연구 183일의 총 HINE-2 점수와 유의하게 관련되었다, p=0.0006. 도 16을 참고한다.
이 결과는 현재의 pNF-H 수준이 유아 발병 SMA를 갖는 유아 사이에서 운동 이정표의 미래 수준을 예측할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 15: 183일의 HINE -2 점수와 64일의 pNF -H 수준과의 연관성( 공변량을 가짐)
연구 CS3B(ENDEAR)로부터의 혈장 샘플을 연구 64일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, 총 운동 이정표 점수(HINE-2(해머스미스 유아 신경 검사 섹션 2))를 연구 183일에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). 이 분석을 위해, 다수의 잠재적인 혼란변수(confounder)를 고려한 후 연구 64일의 pNF-H 수준이 연구 183일의 총 HINE-2 점수와 관련되었는지 결정하기 위해 선형 회귀 모델을 구축하였다. 다수의 잠재적인 혼란변수를 제어한 후, 최종 모델은 64일 로그 변환된 pNF-H(p<0.0001) 및 질환 기간(p=0.0029)을 포함하였다. 도 17을 참고한다.
이 결과는 현재의 pNF-H 수준이 유아 발병 SMA를 갖는 유아를 갖는 유아 사이에서 처리 및 다른 잠재적인 혼란변수를 제어한 후 운동 이정표의 미래 수준을 예측할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 16: 183일의 CHOP INTEND와 64일의 pNF -H 수준의 연관성
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 64일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, CHOP INTEND를 연구 183일에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). 이 분석을 위해, 선형 회귀 모델을 구축하여 연구 64일의 pNF-H 수준이 연구 183일의 CHOP INTEND 점수와 관련되었는지 여부를 결정하였다. 연구 64일의 pNF-H 수준은 연구 183일의 CHOP INTEND 점수와 유의하게 관련되었다, p<0.0001. 도 18을 참고한다.
이 결과는 현재의 pNF-H 수준이 유아 발병 SMA를 갖는 유아 사이에서 일반적인 운동 기능의 미래 수준을 예측할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 17: 183일의 CHOP INTEND 점수와 64일의 pNF -H 수준과의 연관성( 공변량을 가짐)
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 64일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, CHOP INTEND 점수를 연구 183일에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). 이 분석을 위해, 다수의 잠재적인 혼란변수를 고려한 후 연구 64일의 pNF-H 수준이 연구 183일의 CHOP INTEND 점수와 관련되었는지 여부를 결정하기 위해 선형 회귀 모델을 구축하였다. 다수의 잠재적인 혼란변수를 제어한 후, 최종 모델은 64일 로그 변환된 pNF-H(p=0.0001), 처리 그룹(p=0.005), 및 질환 기간(p=0.0003)을 포함하였다. 도 19를 참고한다.
이 결과는 현재의 pNF-H 수준이 유아 발병 SMA를 갖는 유아를 갖는 유아 사이에서 처리 및 다른 잠재적인 혼란변수를 제어한 후 일반적인 운동 기능의 미래 수준을 예측할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 18: HINE -2 ( 반응자/비-반응자) 카테고리 대 183일의 pNF -H 수준
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 183일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, HINE-2(해머스미스 유아 신경 검사 섹션 2) 반응자 상태를 연구 183일에; 연구 183일 및 연구 302일 사이에; 연구 302일에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). 대상체가 HINE-2 반응자의 프로토콜 정의에 기초하여 반응자가 된 경우, 이 달성 시간을 기록하였다. 대상체가 연구 CS3B 내에서 반응자가 되지 않은 경우, 이를 기록하였다. 샴 대조군에서의 어떤 대상체도 연구 CS3B 동안 HINE-2 반응자가 되지 않았다. 반응자가 된 ISIS 396443를 받은 대부분의 대상체는 연구 183일까지 그렇게 하였다. 샴 대조군 대상체 사이에서, 거의 모든 대상체는 전체적인 중앙값(2130 pg/mL)을 초과하는 pNF-H 수준을 가지고 있었다. ISIS 396443를 받고 연구 183일에 반응자가 된 대상체 사이에서, 대부분은 연구 183일에 연구 중앙값 미만의 pNF-H 수준을 가지고 있었다. ISIS 396443을 받고 연구 183일 및 302일 사이에 반응자가 된 대상체 사이에서, 대부분은 연구 183일에 연구 중앙값 미만의 pNF-H 수준을 가지고 있었다. ISIS 396443을 받고 연구 302일 및 연구 말기 사이에 반응자가 된 대상체 사이에서, 대부분은 연구 183일에 연구 중앙값 미만의 pNF-H 수준을 가지고 있었다. ISIS 396443을 받고 ENDEAR 내에서 반응자가 되지 않은 대상체 사이에서, 대략 절반은 연구 183일에 연구 중앙값(2130 pg/mL) 미만의 pNF-H 수준을 가지고 있었다. 도 20을 참고한다.
이들 결과는 처리 개시 후 183일까지 pNF-H의 특정 역치를 달성하는 것이 처리를 샴 대조군과 구별하고 처리에 대한 최종 반응자를 예측할 수 있음을 시사한다.
실시예 19: HINE -2 ( 반응자/비-반응자) 카테고리 대 183일의 pNF -H 수준 pNF -H 수준의 퍼센트 변화
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 183일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, HINE-2 반응자 상태를 연구 183일에; 연구 183일 및 연구 302일 사이에; 연구 302일 후에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). pNF-H의 퍼센트 변화를 기준선 및 연구 183일 사이에서 계산하였다. 대상체가 HINE-2 반응자의 프로토콜 정의에 기초하여 반응자가 된 경우, 이 달성 시간을 기록하였다. 대상체가 연구 CS3B 내에서 반응자가 되지 않은 경우, 이를 기록하였다. 샴 대조군에서의 어떤 대상체도 연구 CS3B 동안 HINE-2 반응자가 되지 않았다. 반응자가 된 ISIS 396443을 받은 대부분의 대상체는 연구 183일까지 그렇게 하였다. 샴 대조군 대상체 사이에서, 모든 대상체는 < 80%의 pNF-H 수준 감소를 가지고 있었다. ISIS 396443을 받고 연구 183일까지 반응자가 된 대상체 사이에서, 거의 절반은 연구 183일에 > 80%의 pNF-H 수준 감소를 가지고 있었다. ISIS 396443을 받고 연구 183일 및 302일 사이에 반응자가 된 대상체 사이에서, 대부분은 연구 183일에 > 80%의 pNF-H 수준 변화를 가지고 있었다. ISIS 396443을 받고 연구 302일 및 연구 말기 사이에 반응자가 된 대상체 사이에서, 대부분은 연구 183일에 > 80%의 pNF-H 수준 변화를 가지고 있었다. ISIS 396443를 받고 ENDEAR 내에서 반응자가 되지 않은 대상체 사이에서, 대략 절반은 연구 183일에 >80%의 pNF-H 수준 변화를 가지고 있었다. 도　21을 참고한다.
이들 결과는 처리 개시 후 183일까지 pNF-H의 감소의 특정 역치를 달성하는 것이 처리를 샴 대조군과 구별하고 처리에 대한 최종 반응자를 예측할 수 있음을 시사한다.
실시예 20: CHOP INTEND ( 반응자/비-반응자) 카테고리 대 183일의 pNF -H 수준
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 183일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, CHOP INTEND 반응자 상태를 연구 183일에; 연구 183일 및 연구 302일 사이에; 연구 302일 후에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). 대상체가 CHOP INTEND 반응자의 프로토콜 정의에 기초하여 반응자가 된 경우, 이 달성 시간을 기록하였다. 대상체가 연구 CS3B 내에 반응자가 되지 않은 경우, 이를 기록하였다. 샴 대조군에서의 1명의 대상체가 연구 CS3B 동안 CHOP INTEND 반응자가 되었다. 반응자가 된 ISIS 396443을 받은 대부분의 대상체는 연구 183일까지 그렇게 하였다. 샴 대조군 대상체 사이에서, 거의 모든 대상체는 전체적인 중앙값을 초과하는 pNF-H 수준을 가지고 있었다. ISIS 396443을 받고 연구 183일까지 반응자가 된 대상체 사이에서, 대부분은 연구 183일에 연구 중앙값 미만의 pNF-H 수준을 가지고 있었다. ISIS 396443을 받고 연구 183일 및 302일 사이에 반응자가 된 대상체 사이에서, 대부분은 연구 183일에 연구 중앙값 미만의 pNF-H 수준을 가지고 있었다. ISIS 396443을 받고 연구 302일 및 연구 말기 사이에 반응자가 된 대상체 사이에서, 대부분은 연구 183일에 연구 중앙값 미만의 pNF-H 수준을 가지고 있었다. ISIS 396443를 받고 ENDEAR 내에 반응자가 되지 않은 대상체 사이에서, 대략 절반은 연구 183일에 연구 중앙값 미만의 pNF-H 수준을 가지고 있었다. 도 22를 참고한다.
이들 결과는 처리 개시 후 183일까지 pNF-H의 특정 역치를 달성하는 것이 처리를 샴 대조군과 구별하고 처리에 대한 최종 반응자를 예측할 수 있음을 시사한다.
실시예 21: CHOP INTEND ( 반응자/비-반응자) 카테고리 대 183일의 pNF -H 수준 pNF-H 수준에서의 퍼센트 변화
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 183일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, CHOP INTEND 반응자 상태를 연구 183일에; 연구 183일 및 연구 302일 사이에; 연구 302일 후에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). pNF-H의 퍼센트 변화를 기준선 및 연구 183일 사이에서 계산하였다. 대상체가 HINE-2 반응자의 프로토콜 정의에 기초하여 반응자가 된 경우, 이 달성 시간을 기록하였다. 대상체가 연구 CS3B 내에 반응자가 되지 않은 경우, 이를 기록하였다. 샴 대조군에서의 1명의 대상체가 연구 CS3B 동안 CHOP INTEND 반응자가 되었다. 반응자가 된 ISIS 396443을 받은 대부분의 대상체는 연구 183일까지 그렇게 하였다. 샴 대조군 대상체 사이에서, 1명을 제외한 모든 대상체는 < 80%의 pNF-H 수준의 감소를 가지고 있었다. ISIS 396443을 받고 연구 183일까지 반응자가 된 대상체 사이에서, 거의 절반은 연구 183일에 > 80%의 pNF-H 수준의 감소를 가지고 있었다. ISIS 396443을 받고 연구 183일 및 302일 사이에 반응자가 된 대상체 사이에서, 대부분은 연구 183일에 > 80%의 pNF-H 수준의 변화를 가지고 있었다. ISIS 396443을 받고 연구 302일 및 연구 말기 사이에 반응자가 된 대상체 사이에서, 대부분은 연구 183일에 > 80%의 pNF-H 수준의 변화를 가지고 있었다. ISIS 396443을 받고 ENDEAR 내에 반응자가 되지 않은 대상체 중에서, 대략 절반은 연구 183일에 >80%의 pNF-H 수준의 변화를 가지고 있었다. 도 23을 참고한다.
이들 결과는 처리 개시 후 183일까지 pNF-H의 특정 역치를 달성하는 것이 처리를 샴 대조군과 구별하고 처리에 대한 최종 반응자를 예측할 수 있음을 시사한다.
실시예 22: 약물 효과의 유지: NURTURE에서 pNF -H( pg /mL) 수준
임상 연구 NURTURE로부터의 혈장 샘플을 연구 1, 64, 183, 302, 및 421일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다(ISIS 396443). 이 분석에서, pNF-H의 절대 수준을 연구일에 의해 플롯팅하였다. 도 24를 참고한다.
이 분석 결과는 유의한 감소가 연구 64일까지 발생하며 이 새로운 수준이 연구 421일에 안정해 보인다는 것을 시사한다.
실시예 23: 약물 효과의 유지: EMBRACE에서 pNF -H ( pg /mL) 수준
임상 연구 EMBRACE로부터의 혈장 샘플을 연구 1, 64, 및 183일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다(ISIS 396443). 이 분석에서, pNF-H의 절대 수준을 연구일에 의해 플롯팅하였다. 도 25를 참고한다.
이 분석 결과는 유의한 감소가 연구 64일까지 발생하며 이 새로운 수준이 연구 183일에 안정해 보인다는 것을 시사한다.
실시예 24: 약물 효과의 유지: NURTURE에서 pNF -H( pg /mL) 수준의 백분율 변화
연구 232SM201(NURTURE)로부터의 혈장 샘플을 연구 1, 64, 183, 302, 및 421일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다(ISIS 396443). 이 분석에서, 기준선으로부터 pNF-H의 퍼센트 변화의 수준을 연구일에 의해 플롯팅하였다. 도 26을 참고한다.
이 분석 결과는 유의한 감소(-80%)가 연구 64일까지 발생하고 이 새로운 수준이 연구 421일에 안정해 보인다는 것을 시사한다.
실시예 25: 약물 효과의 유지: EMBRACE에서 pNF -H( pg /mL) 수준
임상 연구 EMBRACE로부터의 혈장 샘플을 연구 1, 64, 및 183일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다(ISIS 396443). 이 분석에서, pNF-H의 절대적인 수준을 연구일에 의해 플롯팅하였다. 도 27을 참고한다.
이 분석 결과는 유의한 감소(-50%)가 연구 64일까지 발생하고 이 새로운 수준이 연구 183일에 안정해 보인다는 것을 시사한다.
실시예 26: 183일의 HINE -2 점수와 64일의 pNF -H 수준과의 연관성
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 64일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, 총 운동 이정표 점수(HINE-2)를 연구 183일에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). 이 분석을 위해, 선형 회귀 모델을 구축하여 연구 64일의 pNF-H 수준이 연구 183일의 총 HINE-2 점수와 관련되었는지 여부를 결정하였다. ISIS 396443 및 샴 대조군을 받은 대상체 사이에서 별도의 분석을 수행하였다. ISIS 396443을 받은 대상체 사이에서, 로그 변환된 연구 64일의 pNF-H 수준은 연구 183일의 총 HINE-2 점수와 통계적으로 유의하게 관련되지 않았으나, p=0.3186, 더 높은 pNF-H 수준이 더 낮은 총 HINE-2 점수와 관련되도록 추세를 보였다. 샴 대조군을 받은 대상체 사이에서, 로그 변환된 연구 64일의 pNF-H 수준은 연구 183일의 총 HINE-2 점수와 통계적으로 유의하게 관련되었으므로, p=0.0302, 더 높은 pNF-H 수준은 더 낮은 총 HINE-2 점수와 관련되었다. 도 28을 참고한다.
이 결과는 현재의 pNF-H 수준이 유아 발병 SMA를 갖는 유아 사이에서 운동 이정표의 미래 수준을 예측할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 27: 183일의 CHOP INTEND 점수와 64일의 pNF -H 수준과의 연관성
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 64일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, CHOP INTEND 점수를 연구 183일에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). 이 분석을 위해, 선형 회귀 모델을 구축하여 연구 64일의 pNF-H 수준이 연구 183일의 CHOP INTEND 점수와 관련되었는지 여부를 결정하였다. ISIS 396443 및 샴 대조군을 받은 대상체 사이에서 별도의 분석을 수행하였다. ISIS 396443을 받은 대상체 사이에서, 로그 변환된 연구 64일의 pNF-H 수준은 연구 183일의 CHOP INTEND 점수와 통계적으로 유의하게 관련되었으므로, p=0.0406, 더 높은 pNF-H 수준은 더 낮은 총 CHOP INTEND 점수와 관련되었다. 샴 대조군을 받은 대상체 사이에서, 로그 변환된 연구 64일의 pNF-H 수준은 연구 183일의 CHOP INTEND 점수와 통계적으로 유의하게 관련되었으므로, p=0.0330, 더 높은 pNF-H 수준은 더 낮은 CHOP INTEND 점수와 관련되었다. 도 29를 참고한다.
이 결과는 현재의 pNF-H 수준이 유아 발병 SMA를 갖는 유아 사이에서 운동 기능의 미래 수준을 예측할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 28: 302일에 비- 결측 값을 갖는 생존한 유아에서 시간 경과에 따른 pNF-H 수준
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 1, 2, 29, 64, 183, 및 302일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다(ISIS 396443 및 가짜 시술). 이 분석을 위해, 집단을 연구 302일까지 생존하고 연구 302일에 측정된 pNF-H 수준을 가진 대상체로 제한하였다. pNF-H의 절대값을 연구일에 의해 플롯팅하였다. 시간이 경과함에 따라 가짜 시술을 받은 대상체 사이에서, 평균 pNF-H 수준은 연구 1일에 대략 16,000 pg/mL에서 연구 302일에 대략 7,000 pg/mL로 거의 선형으로 감소한다. 시간이 경과함에 따라 ISIS 396443을 받은 대상체 사이에서, 평균 pNF-H는 연구 1일에 대략 18,000 pg/mL에서 연구 64일에 대략 4,000으로 감소한 다음 연구 302일에 대략 1,000 pg/ML에서 안정적으로 유지된다. 도 30을 참고한다.
이 분석 결과는 두 코호트에서 감소가 사실이며 생존 편향(survival bias)이 아니라는 것을 시사한다.
실시예 29: 302일에 비- 결측 값을 갖는 생존한 유아에서 시간 경과에 따른 pNF-H 수준의 백분율 변화
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 1, 2, 29, 64, 183, 및 302일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였다(ISIS 396443 및 가짜 시술). 이 분석을 위해, 집단을 연구 302일까지 생존하고 연구 302일에 측정된 pNF-H 수준을 가진 대상체로 제한하였다. 기준선으로부터의 변화를 연구일에 의해 플롯팅하였다. 시간이 경과함에 따라 가짜 시술을 받은 대상체 사이에서, pNF-H 수준의 변화는 연구 302일에 대략 -50%로 거의 선형으로 감소한다. 시간이 경과함에 따라 ISIS 396443을 받은 대상체 중에서, pNF-H의 변화는 연구 64일에 대략 -70%로 감소한 다음 연구 302일에 대략 -90%로 안정적으로 유지된다. 도 31을 참고한다.
이 분석 결과는 두 코호트에서의 감소가 사실이며 생존 편향이 아니라는 것을 시사한다.
실시예 30: 183일의 비골 CMAP 진폭과 64일의 pNF -H 수준과의 연관성
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 64일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, 비골 CMAP 진폭을 연구 183일에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). 이 분석을 위해, 선형 회귀 모델을 구축하여 연구 64일의 pNF-H 수준이 연구 183일의 비골 CMAP 진폭과 관련되었는지 여부를 결정하였다. 연구 64일의 pNF-H 수준은 연구 183일의 비골 CMAP 진폭과 유의하게 관련되었다, p=0.0021. 도 32를 참고한다.
이 결과는 현재의 pNF-H 수준이 유아 발병 SMA를 갖는 유아 사이에서 일반적인 운동 신경 건강의 미래 수준을 예측할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 31: 183일의 비골 CMAP 진폭과 64일의 pNF -H 수준과의 연관성
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 64일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, 비골 CMAP 진폭을 연구 183일에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). 이 분석을 위해, 선형 회귀 모델을 구축하여 연구 64일의 pNF-H 수준이 연구 183일의 비골 CMAP 진폭과 관련되었는지 여부를 결정하였다. ISIS 396443 및 샴 대조군을 받은 대상체 사이에서 별도의 분석을 수행하였다. ISIS 396443을 받은 대상체 사이에서, 로그 변환된 연구 64일의 pNF-H 수준은 연구 183일의 비골 CMAP 진폭과 통계적으로 유의하게 관련되지 않았으므로, p=0.3612, 더 높은 pNF-H 수준은 더 낮은 비골 CMAP 진폭으로의 추세와 관련되었다. 샴 대조군을 받은 대상체 사이에서, 로그 변환된 연구 64일의 pNF-H 수준은 연구 183일의 비골 CMAP 진폭과 통계적으로 유의하게 관련되었으므로, p=0.0142, 더 높은 pNF-H 수준은 더 낮은 비골 CMAP 진폭과 관련되었다. 도 33을 참고한다.
이 결과는 현재의 pNF-H 수준이 유아 발병 SMA를 갖는 유아 사이에서 일반적인 운동 뉴런 건강의 미래 수준을 예측할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 32: 183일의 척골 CMAP 진폭과 64일의 pNF -H 수준과의 연관성
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 64일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, 비골 CMAP 진폭을 연구 183일에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). 이 분석을 위해, 선형 회귀 모델을 구축하여 연구 64일의 pNF-H 수준이 연구 183일의 척골 CMAP 진폭과 관련되었는지 여부를 결정하였다. 연구 64일의 pNF-H 수준은 연구 183일의 척골 CMAP 진폭과 유의하게 관련되었다, p=0.0002. 도 34를 참고한다.
이 결과는 현재의 pNF-H 수준이 유아 발병 SMA를 갖는 유아 사이에서 일반적인 운동 신경 건강의 미래 수준을 예측할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 33: 183일의 척골 CMAP 진폭과 64일의 pNF -H 수준과의 연관성
임상 연구 ENDEAR로부터의 혈장 샘플을 연구 64일에 pNF-H의 수준에 대해 분석하였고, 척골 CMAP 진폭을 연구 183일에 평가하였다(ISIS 396443 및 샴 대조군). 이 분석을 위해, 선형 회귀 모델을 구축하여 연구 64일의 pNF-H 수준이 연구 183일의 척골 CMAP 진폭과 관련되었는지 여부를 결정하였다. ISIS 396443 및 샴 대조군을 받은 대상체 사이에서 별도의 분석을 수행하였다. ISIS 396443을 받은 대상체 사이에서, 로그 변환된 연구 64일의 pNF-H 수준은 연구 183일의 척골 CMAP 진폭과 통계적으로 유의하게 관련되지 않았으므로, p=0.0952, 더 높은 pNF-H 수준은 더 낮은 척골 CMAP 진폭으로의 추세와 관련되었다. 샴 대조군을 받은 대상체 사이에서, 로그 변환된 연구 64일의 pNF-H 수준은 연구 183일의 척골 CMAP 진폭과 통계적으로 유의하게 관련되었으므로, p=0.0281, 더 높은 pNF-H 수준은 더 낮은 척골 CMAP 진폭과 관련되었다. 도 35를 참고한다
이 결과는 현재의 pNF-H 수준이 유아 발병 SMA를 갖는 유아 사이에서 일반적인 운동 뉴런 건강의 미래 수준을 예측할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 34: 중앙값 pNF -H 수준에 의해 이분화된 ENDEAR 기저 특성
하기는 ENDEAR 시험으로부터 중앙값 pNF-H 수준에 의해 이분화된(<15,400 및 ≥ 15,400 pg/mL) 기저 특성을 제공하는 표이다.
Figure pct00009
CHOP INTEND = Children's Hospital of Philadelphia Infant Test of Neuromuscular Disorders;
CMAP = compound muscle action potential;
HINE-2 = Hammersmith Infant Neurological Examination Section 2.
a 기저 pNF-H의 중앙값.
b 연속 변수에 대한 결과는 스튜던트의 2-샘플 t-검정으로부터 수득된 것이고 비율에 대한 결과는 피셔의 정확한 검정으로부터 수득된 것이다.
c 표의 참가자 수는 어느 카테고리에서 비-결측 기저 pNF-H를 갖는 참가자를 지칭한다.
실시예 35: ENDEAR에서 기저 특성 및 로그( pNF -H) 수준 사이의 상관관계
하기 표는 ENDEAR 시험에서 기저 특성 및 로그(pNF-H) 수준 사이의 상관관계를 제공한다.
Figure pct00010
실시예 36: 중앙값 pNF -H 수준에 의해 이분화된 CHERISH 기저 특성
하기는 CHERISH 시험으로부터 중앙값 pNF-H 수준에 의해 이분화된(< 1,200 및 ≥ 1,200 pg/mL) 기저 특성을 제공하는 표이다.
Figure pct00011
HFMSE = Hammersmith Functional Motor Scale - Expanded.
a 기저 pNF-H의 중앙값.
b 연속 변수에 대한 결과는 스튜던트의 2-샘플 t-검정으로부터 수득된 것이고 비율에 대한 결과는 피셔의 정확한 검정으로부터 수득된 것이다.
c 표의 참가자 수는 어느 카테고리에서 비-결측 기저 pNF-H를 갖는 참가자를 지칭한다.
실시예 37: CHERISH에서 기저 특성 및 로그( pNF -H) 수준 사이의 상관관계
하기 표는 CHERISH 시험에서 기저 특성 및 로그(pNF-H) 수준 사이의 상관관계를 제공한다.
Figure pct00012
HFMSE = Hammersmith Functional Motor Scale - Expanded.
WHO = 세계보건기구
실시예 38: 처리 후 pNF -H 수준의 퍼센트 변화를 측정함으로써 미래 운동 기능 예측
처리된 개체에서 미래 운동 기능을 가장 잘 예측하는 신경필라멘트 수준의 퍼센트 변화를 측정하기 위한 시간을 선택하기 위해 수신자 조작 특성(ROC) 곡선을 사용하였다. ENDEAR에서, pNF-H 수준의 퍼센트 변화를 29일, 64일, 및 183일 각각에 측정하였고 302일에 처리된 대상체의 운동 기능과 비교하였다. ROC 곡선은 64일에 pNF-H 수준의 퍼센트 변화가 29일 또는 183일에 pNF-H 수준의 퍼센트 변화보다 302일에 운동 기능을 예측하는데 더 낫다는 것을 밝혀내었다. 도 36a-36c를 참고한다. ENDEAR에서, 첫 번째 용량의 연령을 제어한 후에도, 64일에 pNF-H 수준의 퍼센트 변화는 302일에 CHOP INTEND(≥ 4점 개선) 및 운동 이정표(악화보다 개선을 갖는 더 많은 HINE-2 운동 이정표) 반응자를 예측하였다. 도 37a-b를 참고한다. CHERISH에서, 질환 기간을 제어한 후에도, 85일에 pNF-H 수준의 퍼센트 변화는 456일에 HFMSE(Hammersmith Functional Motor Scale - Expanded; ≥ 3점 개선), RULM(Revised Upper Limb Module; ≥ 2점 개선), 및 WHO(세계보건기구; ≥ 1 운동 이정표의 달성) 반응자를 예측하였다. 도 38a-38c를 참고한다.
실시예 39: 기준선에서 및 누시네르센 치료 후 뇌 척수액 pNF -H 수준
기저 뇌 척수액(CSF) pNF-H 수준을 전증상, 유아 발병, 및 후기 발병 환자뿐만 아니라 SMN2의 2개 또는 3개 카피를 갖는 환자에서 측정하였다. CSF의 기저 pNF-H 수준은 전증상 유아 및 2개 카피의 SMN2를 갖는 가장 어린 유아에서 가장 높았다. 도 39a-39b를 참고한다. NURTURE 연구에서, 누시네르센 처리는 CSF에서의 pNF-H 수준의 신속한 감소 후 안정화와 관련되었다. 도 40을 참고한다.
실시예 40: 다수의 척추 근위축증 집단 사이에서 상이한 매트릭스에서 인산화된 신경필라멘트 중쇄 ( pNF -H) 및 신경필라멘트 경쇄 ( NF-L)의 비교
전증상(유형 I/II가 발생시킬 가능성이 가장 높음), 유아 발병(유형 I/II를 갖거나 발생시킬 가능성이 가장 높음) 또는 후기 발병 SMA(유형 II/III을 갖거나 발생시킬 가능성이 가장 높음)을 갖는 누시네르센 임상시험으로부터의 개체의 혈장 및 뇌척수액(CSF)에서 pNF-H 및 NF-L의 농도를 비교하였다. 혈장 및 CSF에서의 pNF-H 농도를 프로틴심플™ 심플플렉스 ELLA 면역분석을 사용하여 평가하였다. NF-L 농도를 시모아(SIMOA) 분석(Quanterix™)을 사용하여 평가하였다. 하기 보고된 결과는 pg/mL의 단위이다.
각각의 SMA 집단에 대해, pNF-H 및 NF-L 농도는 CSF에서 유사하였으나; 혈장에서, NF-L 농도는 pNF-H보다 낮았다. 혈장에서 NF-L 및 pNF-H 농도 사이의 차이는 전증상 유아 대 유아 발병 SMA를 갖는 유아에서 더 확연하였다. CSF에서, pNF-H 및 NF-L 농도는 전증상(183일에 백분율 감소: 도 41a) 및 유아 발병(302일에 백분율 감소: 도 41b) SMA 집단에서 유사한 백분율로 누시네르센 치료시 시간이 경과함에 따라 감소하였다. 유아 발병(64일에 백분율 감소: 도 41c) 및 후기 발병(169일에 백분율 감소: 도 41d) SMA 집단에서 혈장 pNF-H 및 NF-L 농도에서 대등한 결과가 입증되었다. 도 41c에 나타난 데이터의 절대값은 도 41e에 제시되어 있으며, 도　41d에 나타난 데이터의 절대값은 도 41f에 제시되어 있다. 추가로, 혈장 및 CSF에서 pNF-H 농도의 변화율은 전증상 및 유아 발병 SMA 집단 모두에서 유사하였다. NF-L의 경우, 혈장 및 CSF 농도는 유아 발병 코호트에서 유사한 궤적에 거쳐 감소하였다.
전반적으로, 기저 pNF-H 및 NF-L 기하 평균(95% CI) 농도는 2개의 SMN2 카피를 갖는 전증상 유아 사이에서 각각 20139(10075-40257) 및 7272(3287-16090) pg/mL이었고, 3개의 SMN2 카피를 갖는 전증상 유아 사이에서 각각 952(367-2470) 및 519(231-1164) pg/mL이었다. 유아 발병 SMA 참가자에서, 기저 pNF-H 및 NF-L 기하 평균(95% CI) 농도는 각각 3791(2980-4823) 및 3718(2832-4882) pg/mL이었다. 후기 발병 SMA 참가자에서, 기저 pNF-H 및 NF-L 기하 평균(95% CI) 농도는 각각 381(331-438) 및 185(154-222) pg/mL이었다.
따라서, 혈장 pNF-H 수준과 마찬가지로, CSF pNF-H 및 NF-L 수준은 2개의 SMN2 카피를 갖는 전증상 SMA 참가자에서 가장 높은 것으로 보이며 후기 발병 SMA를 갖는 참가자에서 가장 낮은 것으로 보인다.
다른 구현예
본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위의 범위에 의해 정의된 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것이며 제한하고자 하는 것이 아니다. 다른 양태, 이점, 및 변형은 하기 청구범위의 범위에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOGEN MA INC. <120> METHODS OF TREATING SPINAL MUSCULAR ATROPHY <130> 13751-0296WO1 <140> <141> <150> 62/738,134 <151> 2018-09-28 <150> 62/684,507 <151> 2018-06-13 <150> 62/622,027 <151> 2018-01-25 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1026 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Met Ser Phe Gly Gly Ala Asp Ala Leu Leu Gly Ala Pro Phe Ala 1 5 10 15 Pro Leu His Gly Gly Gly Ser Leu His Tyr Ala Leu Ala Arg Lys Gly 20 25 30 Gly Ala Gly Gly Thr Arg Ser Ala Ala Gly Ser Ser Ser Gly Phe His 35 40 45 Ser Trp Thr Arg Thr Ser Val Ser Ser Val Ser Ala Ser Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Arg Gly Ala Gly Ala Ala Ser Ser Thr Asp Ser Leu Asp Thr Leu 65 70 75 80 Ser Asn Gly Pro Glu Gly Cys Met Val Ala Val Ala Thr Ser Arg Ser 85 90 95 Glu Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Asn Asp Arg Phe Ala Gly Tyr Ile 100 105 110 Asp Lys Val Arg Gln Leu Glu Ala His Asn Arg Ser Leu Glu Gly Glu 115 120 125 Ala Ala Ala Leu Arg Gln Gln Gln Ala Gly Arg Ser Ala Met Gly Glu 130 135 140 Leu Tyr Glu Arg Glu Val Arg Glu Met Arg Gly Ala Val Leu Arg Leu 145 150 155 160 Gly Ala Ala Arg Gly Gln Leu Arg Leu Glu Gln Glu His Leu Leu Glu 165 170 175 Asp Ile Ala His Val Arg Gln Arg Leu Asp Asp Glu Ala Arg Gln Arg 180 185 190 Glu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala Leu Ala Arg Phe Ala Gln Glu 195 200 205 Ala Glu Ala Ala Arg Val Asp Leu Gln Lys Lys Ala Gln Ala Leu Gln 210 215 220 Glu Glu Cys Gly Tyr Leu Arg Arg His His Gln Glu Glu Val Gly Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gln Ile Gln Gly Ser Gly Ala Ala Gln Ala Gln Met Gln 245 250 255 Ala Glu Thr Arg Asp Ala Leu Lys Cys Asp Val Thr Ser Ala Leu Arg 260 265 270 Glu Ile Arg Ala Gln Leu Glu Gly His Ala Val Gln Ser Thr Leu Gln 275 280 285 Ser Glu Glu Trp Phe Arg Val Arg Leu Asp Arg Leu Ser Glu Ala Ala 290 295 300 Lys Val Asn Thr Asp Ala Met Arg Ser Ala Gln Glu Glu Ile Thr Glu 305 310 315 320 Tyr Arg Arg Gln Leu Gln Ala Arg Thr Thr Glu Leu Glu Ala Leu Lys 325 330 335 Ser Thr Lys Asp Ser Leu Glu Arg Gln Arg Ser Glu Leu Glu Asp Arg 340 345 350 His Gln Ala Asp Ile Ala Ser Tyr Gln Glu Ala Ile Gln Gln Leu Asp 355 360 365 Ala Glu Leu Arg Asn Thr Lys Trp Glu Met Ala Ala Gln Leu Arg Glu 370 375 380 Tyr Gln Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala 385 390 395 400 Ala Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Cys Arg Ile Gly Phe Gly 405 410 415 Pro Ile Pro Phe Ser Leu Pro Glu Gly Leu Pro Lys Ile Pro Ser Val 420 425 430 Ser Thr His Ile Lys Val Lys Ser Glu Glu Lys Ile Lys Val Val Glu 435 440 445 Lys Ser Glu Lys Glu Thr Val Ile Val Glu Glu Gln Thr Glu Glu Thr 450 455 460 Gln Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Glu Glu Glu Lys Glu Ala Lys Glu 465 470 475 480 Glu Glu Gly Lys Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Ala Glu Gly 485 490 495 Gly Glu Glu Glu Thr Lys Ser Pro Pro Ala Glu Glu Ala Ala Ser Pro 500 505 510 Glu Lys Glu Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala 515 520 525 Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala Glu Val 530 535 540 Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Ala Lys Glu Glu Ala Lys Ser 545 550 555 560 Pro Pro Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala 565 570 575 Glu Val Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Ala Lys Glu Glu Ala 580 585 590 Lys Ser Pro Ala Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val 595 600 605 Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala Glu Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu 610 615 620 Glu Ala Lys Ser Pro Ala Glu Val Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser 625 630 635 640 Pro Thr Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Glu 645 650 655 Lys Ala Lys Ser Pro Glu Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala 660 665 670 Lys Ser Pro Val Lys Ala Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser 675 680 685 Pro Val Lys Ala Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val 690 695 700 Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu 705 710 715 720 Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Ala 725 730 735 Lys Thr Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Ala Lys Ser 740 745 750 Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Thr Leu Asp Val Lys 755 760 765 Ser Pro Glu Ala Lys 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Lys Glu Asp Asp Lys Thr Leu Ser Lys Glu Pro 980 985 990 Ser Lys Pro Lys Ala Glu Lys Ala Glu Lys Ser Ser Ser Thr Asp Gln 995 1000 1005 Lys Asp Ser Lys Pro Pro Glu Lys Ala Thr Glu Asp Lys Ala Ala 1010 1015 1020 Lys Gly Lys 1025 <210> 2 <211> 543 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Ser Phe Ser Tyr Glu Pro Tyr Tyr Ser Thr Ser Tyr Lys Arg 1 5 10 15 Arg Tyr Val Glu Thr Pro Arg Val His Ile Ser Ser Val Arg Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Thr Ala Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Tyr Ser Ala Pro Val Ser 35 40 45 Ser Ser Leu Ser Val Arg Arg Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Gly Ser Leu 50 55 60 Met Pro Ser Leu Glu Asn Leu Asp Leu Ser Gln Val Ala Ala Ile Ser 65 70 75 80 Asn Asp Leu Lys Ser Ile Arg Thr Gln Glu Lys Ala Gln Leu Gln Asp 85 90 95 Leu Asn Asp Arg Phe Ala Ser Phe Ile Glu Arg Val His Glu Leu Glu 100 105 110 Gln Gln Asn Lys Val Leu Glu Ala Glu Leu Leu Val Leu Arg Gln Lys 115 120 125 His Ser Glu Pro Ser Arg Phe Arg Ala Leu Tyr Glu Gln Glu Ile Arg 130 135 140 Asp Leu Arg Leu Ala Ala Glu Asp Ala Thr Asn Glu 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Claims (46)

  1. 척추 근위축증(SMA)의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 척추 근위축증을 치료하는 방법으로서, SMA 요법의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 인간 대상체는 그 인간 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 대조군보다 더 높은, SMA 요법 개시 이전의 신경필라멘트 수준을 갖는 것으로 사전에 결정되어 있었던, 방법.
  2. 척추 근위축증(SMA)의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 척추 근위축증을 치료하는 방법으로서,
    SMA 요법의 개시 전에 상기 인간 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 SMA 요법의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 400 pg/mL 초과하는, 방법.
  4. 척추 근위축증(SMA)의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 척추 근위축증을 치료하는 방법으로서,
    SMA 요법의 개시 전에 인간 대상체로부터 수득된 제1 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준을 측정하는 단계;
    SMA 요법을 상기 인간 대상체에게 투여하는 단계; 및
    상기 SMA 요법의 개시 후에 상기 인간 대상체로부터 수득된 제2 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준보다 낮은, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 10% 내지 95%인, 방법.
  7. 청구항 4 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 SMA 요법의 개시 40 내지 90일 후에 상기 인간 대상체로부터 수득되는, 방법.
  8. 청구항 4 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 SMA 요법의 개시 50 내지 80일 후에 상기 인간 대상체로부터 수득되는, 방법.
  9. 청구항 4 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 SMA 요법의 개시 60 내지 70일 후에 상기 인간 대상체로부터 수득되는, 방법.
  10. 청구항 4 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 SMA 요법의 개시 약 64일 후에 상기 인간 대상체로부터 수득되는, 방법.
  11. 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 50% 감소되는, 방법.
  12. 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 60% 감소되는, 방법.
  13. 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 70% 감소되는, 방법.
  14. 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 50% 미만으로 감소되는, 방법.
  15. 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 40% 미만으로 감소되는, 방법.
  16. 청구항 7 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SMA 요법의 용량은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준의 퍼센트 감소에 기초하여 상기 인간 대상체에게 후속 투여를 위해 변화되는, 방법.
  17. 청구항 4에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준보다 더 높은, 방법.
  18. 청구항 4 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SMA 요법의 투여는 계속되는, 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 SMA 요법의 투여는 중단되는, 방법.
  20. 척추 근위축증(SMA)의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 척추 근위축증을 치료하는 방법으로서,
    SMA 요법의 후보 양의 투여 전에 상기 인간 대상체로부터 수득된 제1 상기 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준을 측정하는 단계;
    상기 SMA 요법의 후보 양의 투여 후에 상기 인간 대상체로부터 수득된 제2 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준을 측정하는 단계로서, 상기 제2 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서의 신경필라멘트 수준보다 낮고, 이에 의해 상기 SMA 요법의 후보 양이 치료적 유효량임을 나타내는 것인 단계;
    상기 제2 생물학적 샘플에서 낮아진 신경필라멘트 수준을 측정한 후 상기 SMA 요법의 치료적 유효량을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 척추 근위축증(SMA)의 예후를 예측하는 방법으로서,
    기능적 SMN 단백질 결핍으로 이어지는, SMN1 유전자의 카피 둘 모두에서의 돌연변이를 갖는 인간 대상체로부터 수득된 상기 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하고,
    대조군과 비교하여 상기 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 대상체가 발생시킬 SMA의 중증도 또는 유형을 예측하는, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 전에 상기 인간 대상체로부터 수득되고, 대조군과 비교하여 상기 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 치료의 부재하에 인간 대상체가 발생시킬 SMA의 중증도 또는 유형을 예측하는, 방법.
  23. 청구항 21에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 SMA 요법의 개시 후에 상기 인간 대상체로부터 수득되고, 대조군과 비교하여 상기 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 대상체가 상기 SMA 요법을 받는 동안 발생시킬 SMA의 중증도 또는 유형을 예측하는, 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 상기 SMA 요법의 개시 적어도 2주 후에 상기 인간 대상체로부터 수득되는, 방법.
  25. 청구항 23에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 상기 SMA 요법의 개시 적어도 2개월 후에 상기 인간 대상체로부터 수득되는, 방법.
  26. 척추 근위축증(SMA)의 예후를 예측하는 방법으로서,
    SMA 요법의 개시 전에, 기능적 SMN 단백질 결핍으로 이어지는, SMN1 유전자의 카피 둘 모두에서의 돌연변이를 갖는 인간 대상체로부터 수득된 제1 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준을 측정하는 단계;
    상기 SMA 요법의 개시 후에 상기 인간 대상체로부터 수득된 제2 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준을 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 대상체가 발생시킬 SMA의 중증도 또는 유형을 예측하는, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 SMA 요법의 개시 40 내지 90일 후에 상기 인간 대상체로부터 수득되는, 방법.
  28. 청구항 26에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 SMA 요법의 개시 50 내지 80일 후에 상기 인간 대상체로부터 수득되는, 방법.
  29. 청구항 26에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 SMA 요법의 개시 60 내지 70일 후에 상기 인간 대상체로부터 수득되는, 방법.
  30. 청구항 26에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 SMA 요법의 개시 약 64일 후에 상기 인간 대상체로부터 수득되는, 방법.
  31. 청구항 26 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 50% 감소되는, 방법.
  32. 청구항 26 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 60% 감소되는, 방법.
  33. 청구항 26 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 70% 감소되는, 방법.
  34. 청구항 26 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 50% 미만으로 감소되는, 방법.
  35. 청구항 26 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준은 상기 제1 생물학적 샘플에서 측정된 신경필라멘트 수준과 비교하여 적어도 40% 미만으로 감소되는, 방법.
  36. 청구항 1 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SMA 요법은 누시네르센(nusinersen) 또는 누시네르센 염인, 방법.
  37. 청구항 1 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SMA 요법은 누시네르센 나트륨인, 방법.
  38. 청구항 1 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SMA 요법은 올레속심(olesoxime), AVX-101, CK-2127107, RG7916, RG7800, RO7034067, LMI070, 또는 SRK-015인, 방법.
  39. 청구항 1 내지 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 미리 확립된 신경필라멘트 컷-오프 값인, 방법.
  40. 청구항 1 내지 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 SMA를 갖지 않는 하나 이상의 인간 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플들에서의 신경필라멘트 수준인, 방법.
  41. 신경필라멘트 수준을 측정하는 방법으로서,
    기능적 SMN 단백질 결핍으로 이어지는, SMN1 유전자의 카피 둘 모두에서의 돌연변이를 갖는 인간 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
    상기 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  42. 청구항 1 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경필라멘트는 신경필라멘트 중쇄인, 방법.
  43. 청구항 1 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경필라멘트는 인산화된 신경필라멘트 중쇄인, 방법.
  44. 청구항 1 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경필라멘트는 신경필라멘트 중간/중급 쇄(medium/intermediate chain)인, 방법.
  45. 청구항 1 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경필라멘트는 신경필라멘트 경쇄인, 방법.
  46. 청구항 1 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 또는 뇌척수액인, 방법.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA51678A (fr) 2018-01-25 2020-12-02 Biogen Ma Inc Méthodes de traitement de l'amyotrophie musculaire
MA62935B1 (fr) 2019-07-19 2023-11-30 Biogen Ma Inc Méthodes de traitement ou de prévention de l'amyotrophie spinale
WO2022261648A2 (en) * 2021-06-08 2022-12-15 Alector Llc Methods of use of anti-sortilin antibodies
WO2023240236A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5156840A (en) 1982-03-09 1992-10-20 Cytogen Corporation Amine-containing porphyrin derivatives
US4582789A (en) 1984-03-21 1986-04-15 Cetus Corporation Process for labeling nucleic acids using psoralen derivatives
US4563417A (en) 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
EP0834576B1 (en) 1990-12-06 2002-01-16 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Detection of nucleic acid sequences
US6027880A (en) 1995-08-02 2000-02-22 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes and methods of using the same for detecting cystic fibrosis
US6156501A (en) 1993-10-26 2000-12-05 Affymetrix, Inc. Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use
AU3568897A (en) 1996-06-07 1998-01-05 Eos Biotechnology, Inc. Immobilised linear oligonucleotide arrays
JP4808365B2 (ja) 2001-03-02 2011-11-02 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション Ｐｃｒ法
JP2004536290A (ja) 2001-04-19 2004-12-02 ゲゼルシャフト　フュア　バイオテクノロギッシェ　フォーシュンク　エム　ベー　ハー（ゲー　ベー　エフ） 安定した、再生可能な抗体アレイの作製方法
US6812341B1 (en) 2001-05-11 2004-11-02 Ambion, Inc. High efficiency mRNA isolation methods and compositions
US20030013208A1 (en) 2001-07-13 2003-01-16 Milagen, Inc. Information enhanced antibody arrays
US7252976B2 (en) 2002-08-28 2007-08-07 Board Of Regents The University Of Texas System Quantitative RT-PCR to AC133 to diagnose cancer and monitor angiogenic activity in a cell sample
PL3308788T3 (pl) 2005-06-23 2019-05-31 Biogen Ma Inc Kompozycje i sposoby modulacji splicingu smn2
WO2008127974A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Stem cell-based culture system for drug development
PT2424991T (pt) * 2009-05-02 2018-10-19 Genzyme Corp Terapia génica para distúrbios neurodegenerativos
NZ624712A (en) 2009-06-17 2015-10-30 Isis Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for modulation of smn2 splicing in a subject
US8465727B2 (en) 2009-10-06 2013-06-18 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Biomarkers for the diagnosis of ALS
EP2943225A4 (en) 2013-01-09 2016-07-13 Ionis Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING SMN2 DISTRIBUTION IN THE BODY OF A PATIENT
AU2015240761B2 (en) 2014-04-01 2019-09-12 Biogen Ma Inc. Compositions for modulating SOD-1 expression
US10024870B2 (en) 2014-04-02 2018-07-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Therapeutic and diagnostic methods and compositions for neurodegenerative diseases
EP4162940A1 (en) 2014-04-17 2023-04-12 Biogen MA Inc. Compositions and methods for modulation of smn2 splicing in a subject
US10436802B2 (en) 2014-09-12 2019-10-08 Biogen Ma Inc. Methods for treating spinal muscular atrophy
AU2017223706A1 (en) * 2016-02-23 2018-09-20 Indiana University Research & Technology Corporation Combination therapies for treatment of spinal muscular atrophy
WO2018218219A1 (en) * 2017-05-26 2018-11-29 University Of Miami Determining onset of amyotrophic lateral sclerosis
WO2019079240A1 (en) * 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
MA51678A (fr) 2018-01-25 2020-12-02 Biogen Ma Inc Méthodes de traitement de l'amyotrophie musculaire
EA201992364A1 (ru) * 2018-04-02 2020-03-23 Кохерус Байосайенсис Инк. АГОНИСТ PPARγ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПРОГРЕССИРУЮЩЕГО НАДЪЯДЕРНОГО ПАРАЛИЧА
WO2020061355A2 (en) 2018-09-20 2020-03-26 Biogen Ma Inc. Serum neurofilament protein for guiding therapeutic intervention in multiple sclerosis
MX2021006548A (es) 2018-12-06 2021-09-21 Biogen Ma Inc Proteina de neurofilamento para guiar la intervencion terapeutica en la esclerosis lateral amiotrofica.
TW202035694A (zh) 2018-12-14 2020-10-01 美商百健Ｍａ公司 用於治療及預防肌肉萎縮性脊髓側索硬化症之組合物及方法
EP3924739A1 (en) 2019-02-12 2021-12-22 Biogen MA Inc. Biomarkers of progressive multifocal leukoencephalopathy

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Publication number Publication date
MA51678A (fr) 2020-12-02
CL2020001936A1 (es) 2020-12-18
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JP2021511389A (ja) 2021-05-06
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CN112567246A (zh) 2021-03-26

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