BR112020015082A2 - Métodos de tratamento da atrofia muscular espinhal - Google Patents

Abstract

métodos de tratamento da atrofia muscular espinhal . a presente invenção refere-se a biomarcadores, por exemplo, para o diagnóstico e prognóstico da atrofia muscular espinhal ("spinal muscular atrophy" - sma), bem como para a identificação de agentes responsivos ao tratamento da sma. também são fornecidos métodos de tratamento de sujeitos com sma.

Description

"MÉTODOS DE TRATAMENTO DA ATROFIA MUSCULAR ESPINHAL". REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade ao Pedido Provisório U.S. 62/622,027, depositado em 25 de janeiro de 2018, Pedido Provisório U.S. 62/684,507, depositado em 13 de junho de 2018, e Pedido Provisório U.S. 62/738,134, depositado em 28 de setembro de 2018. O conteúdo dos pedidos anteriores é incorporado por referência neste documento em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[002] Esta descrição se refere em geral a biomarcadores de atrofia muscular espinhal.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] A atrofia muscular espinhal ("Spinal Muscular Atrophy" - SMA) é uma doença genética autossômica recessiva que resulta em uma deficiência na proteína SMN, que por sua vez leva à perda de neurônios motores do corno anterior, degradação axonal e um fenótipo de perda muscular progressiva, deficiência de mobilidade e respiração falha. A gravidade da doença é categorizada em cinco tipos (0-4) com os pacientes do tipo 0 tendo o fenótipo mais grave (letal neonatal) e os pacientes do tipo 4 tendo apenas os sintomas mais leves e tempo de vida normal.

[004] O tratamento oportuno e adequado de sujeitos com SMA requer a capacidade de selecionar sujeitos pré-sintomáticos que precisem de tratamento com uma terapia para tratar a SMA e determinar se a terapia contra a SMA é eficaz. Assim, há necessidade de biomarcadores de SMA.

SUMÁRIO

[005] Os neurofilamentos são o principal componente do citoesqueleto neuronal, particularmente nos axônios, onde são essenciais para o crescimento e manutenção. Estruturalmente, eles consistem em três subunidades centrais entrelaçadas: polipeptídeos de neurofilamentos pesado (NF-H), médio/intermediário (NF-M) e leve (NF- L) que formam o "tripleto de neurofilamentos". Esta descrição é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que os níveis de neurofilamentos servem como biomarcadores eficazes para atrofia muscular espinhal (SMA).

[006] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de tratamento contra a SMA em um sujeito humano em necessidade. O método envolve a administração ao sujeito humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia contra a SMA, em que o sujeito humano foi previamente determinado ter, em uma amostra biológica obtida do sujeito humano, um nível de neurofilamentos antes do início da terapia contra a SMA que é mais alto do que um controle. Este método pode ser usado, por exemplo, no tratamento de um sujeito que é pré-sintomático.

[007] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de tratamento contra a SMA em um sujeito humano em necessidade. O método envolve medir um nível de neurofilamentos em uma amostra biológica obtida do sujeito humano antes do início de uma terapia contra a SMA e administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da terapia contra a SMA ao sujeito humano.

[008] Em algumas modalidades dos dois aspectos acima, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível pesado de neurofilamento fosforilado (pNF-H)) na amostra biológica está acima de um nível de controle. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 300 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 400 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 500 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 600 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 700 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 800 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 900 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 1.000 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 1.100 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 1.200 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 1.300 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 1.400 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 1.500 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 2.000 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 3.000 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 4.000 pg/mL.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica está acima de 5.000 pg/mL.

Esses níveis de neurofilamentos podem ser obtidos usando os ensaios descritos na seção de exemplos deste pedido. Deve ser entendido que se um ensaio de neurofilamentos diferente for usado que forneça uma leitura diferente (por exemplo, O.D. ou Unidades Internacionais), os valores para os níveis de neurofilamentos podem ser diferentes.

[009] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de tratamento contra a SMA em um sujeito humano em necessidade. O método envolve: medir um nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) em uma primeira amostra biológica obtida de um sujeito humano antes do início de uma terapia contra a SMA; administrar uma terapia contra a SMA (por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz da terapia contra a SMA) ao sujeito humano; e medir um nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) em uma segunda amostra biológica obtida do sujeito humano após o início da terapia contra a SMA.

[0010] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de tratamento contra a SMA em um sujeito humano em necessidade. O método envolve: medir um nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) em uma primeira amostra biológica obtida do sujeito humano antes da administração de uma quantidade candidata de uma terapia contra a SMA; medir um nível de neurofilamento (por exemplo, nível de pNF-H) em uma segunda amostra biológica obtida do sujeito humano após a administração da quantidade candidata da terapia contra a SMA, em que o nível de neurofilamentos na segunda amostra biológica é inferior ao nível de neurofilamentos na primeira amostra biológica, indicando assim que a quantidade candidata da terapia contra a SMA é uma quantidade terapeuticamente eficaz; e administrar a quantidade terapeuticamente eficaz da terapia contra a SMA ao sujeito humano após ter medido o nível de neurofilamentos reduzido na segunda amostra biológica.

[0011] Em certas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) em uma primeira amostra biológica está acima de 300 pg/mL, acima de 400 pg/mL, acima de 500 pg/mL, acima de 600 pg/mL, acima de 700 pg/mL, acima de 800 pg/mL, acima de 900 pg/mL, acima de 1.000 pg/mL, acima de 1.500 pg/mL, acima de 2.000 pg / mL, acima de 3.000 pg/mL, acima de 4.000 pg/mL ou acima de

5.000 pg/mL. Em certas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) medido na segunda amostra biológica é menor do que o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) medido na segunda amostra biológica mostra um declínio superior a 30% em relação ao nível de neurofilamento medido na primeira amostra biológica. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) medido na segunda amostra biológica está entre 10% a 80% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) medido na segunda amostra biológica está entre 20% a 95% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) medido na segunda amostra biológica está entre 30% a 90% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) medido na segunda amostra biológica está entre 30% a 95% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica. Em tais casos, a administração da terapia contra a SMA é continuada. Em certas modalidades, o nível de neurofilamento (por exemplo, nível de pNF-H) medido na segunda amostra biológica é maior do que o nível de neurofilamento medido na primeira amostra biológica. Em tais casos, a administração da terapia contra a SMA é interrompida.

[0012] Em algumas modalidades, a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 40-90 dias após o início da terapia contra a SMA. Em algumas modalidades, a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 50-80 dias após o início da terapia contra a SMA. Em algumas modalidades, a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 60-70 dias após o início da terapia contra a SMA. Em algumas modalidades, a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano cerca de 64 dias após o início da terapia contra a SMA.

[0013] Em algumas modalidades em que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 40-90 dias, 50-80 dias, 60-70 dias ou cerca de 64 dias após o início da terapia contra a SMA, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 50% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica. Em algumas modalidades em que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 40-90 dias, 50-80 dias, 60-70 dias ou cerca de 64 dias após o início da terapia contra SMA, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 60% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica. Em algumas modalidades em que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 40-90 dias, 50-80 dias, 60-70 dias ou cerca de 64 dias após o início da terapia contra a SMA, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 70% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

[0014] Em algumas modalidades em que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 40-90 dias, 50-80 dias, 60-70 dias ou cerca de 64 dias após o início da terapia contra a SMA, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 50% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica. Em algumas modalidades em que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 40-90 dias, 50-80 dias, 60-70 dias ou cerca de 64 dias após o início da terapia contra a SMA, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 40% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

[0015] Em algumas modalidades em que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 40-90 dias, 50-80 dias, 60-70 dias ou cerca de 64 dias após o início da terapia contra a SMA, a dose da terapia contra a SMA é alterada para um administração subsequente ao sujeito humano com base na redução percentual no nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica, em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

[0016] Em outro aspecto, a descrição se refere a um método de previsão do prognóstico da SMA. O método envolve a medição de um nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) em uma amostra biológica obtida de um sujeito humano com mutações em ambas as cópias do gene SMN1 (as mutações podem ser homozigotas ou heterozigotas) que levam à deficiência de proteína SMN funcional. O método envolve adicionalmente a comparação do nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) medido na amostra biológica com um controle. O nível de neurofilamento (por exemplo, nível de pNF-H) medido na amostra biológica, em comparação com o controle, é preditivo da gravidade ou tipo de SMA que o sujeito irá desenvolver.

[0017] Em certas modalidades, a amostra biológica é obtida do sujeito humano antes do início de uma terapia contra a SMA, e o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) medido na amostra biológica, em comparação com o controle, é preditivo da gravidade ou tipo de SMA que o sujeito humano desenvolverá na ausência de tratamento.

[0018] Em algumas modalidades, a amostra biológica é obtida do sujeito humano após o início de uma terapia contra a SMA, e o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) medido na amostra biológica, em comparação com o controle, é preditivo da gravidade ou tipo de SMA que o sujeito desenvolverá ao receber a terapia contra a SMA. Em certos casos, a amostra biológica é obtida do sujeito humano pelo menos duas semanas após o início da terapia contra a SMA. Em certos casos, a amostra biológica é obtida do sujeito humano pelo menos quatro semanas após o início da terapia contra a SMA. Em certos casos, a amostra biológica é obtida do sujeito humano pelo menos seis semanas após o início da terapia contra a SMA. Em certos casos, a amostra biológica é obtida do sujeito humano pelo menos oito semanas após o início da terapia contra a SMA. Em certos casos, a amostra biológica é obtida do sujeito humano pelo menos dez semanas após o início da terapia contra a SMA. Em certos casos, a amostra biológica é obtida do sujeito humano pelo menos doze semanas após o início da terapia contra a SMA. Em certos casos, a amostra biológica é obtida do sujeito humano pelo menos dois meses após o início da terapia contra a SMA. Em certos casos, a amostra biológica é obtida do sujeito humano pelo menos três meses após o início da terapia contra a SMA. Em certos casos, a amostra biológica é obtida do sujeito humano pelo menos quatro meses após o início da terapia contra a SMA. Em certos casos, a amostra biológica é obtida do sujeito humano pelo menos cinco meses após o início da terapia contra a SMA. Em certos casos, a amostra biológica é obtida do sujeito humano pelo menos seis meses após o início da terapia contra a SMA.

[0019] Em outro aspecto, a descrição se refere a um método de previsão do prognóstico da SMA. O método envolve a medição antes da iniciação de uma terapia SMA de um nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) em uma primeira amostra biológica obtida de um sujeito humano com mutações em ambas as cópias do gene SMN1 (as mutações podem ser homozigotas ou heterozigotas) que levam à deficiência de proteína SMN funcional. O método envolve adicionalmente a medição de um nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) em uma segunda amostra biológica obtida do sujeito humano após o início da terapia contra a SMA. O método envolve adicionalmente a comparação do nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) medido na segunda amostra biológica com o nível de neurofilamento (por exemplo, nível de pNF-H) medido na primeira amostra biológica. O nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) medido na segunda amostra biológica, em comparação com o nível de neurofilamento (por exemplo, nível de pNF-H) medido na primeira amostra biológica, é preditivo da gravidade ou tipo de SMA que o sujeito irá se desenvolver. Em geral, quanto maior a redução percentual no nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na segunda amostra biológica, em comparação com o nível de neurofilamento (por exemplo, nível de pNF-H) medido na primeira amostra biológica, melhor será o prognóstico para função motora do sujeito humano no futuro.

[0020] Em algumas modalidades, a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 40-90 dias após o início da terapia contra a SMA. Em algumas modalidades, a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 50-80 dias após o início da terapia contra a SMA. Em algumas modalidades, a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 60-70 dias após o início da terapia contra a SMA. Em algumas modalidades, a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano cerca de 64 dias após o início da terapia contra a SMA.

[0021] Em algumas modalidades em que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 40-90 dias, 50-80 dias, 60-70 dias ou cerca de 64 dias após o início da terapia contra a SMA, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 50% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica. Em algumas modalidades em que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 40-90 dias, 50-80 dias, 60-70 dias ou cerca de 64 dias após o início da terapia contra SMA, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 60% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica. Em algumas modalidades em que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 40-90 dias, 50-80 dias, 60-70 dias ou cerca de 64 dias após o início da terapia contra a SMA, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 70% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

[0022] Em algumas modalidades em que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 40-90 dias, 50-80 dias, 60-70 dias ou cerca de 64 dias após o início da terapia contra a SMA, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 50% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica. Em algumas modalidades em que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano de 40-90 dias, 50-80 dias, 60-70 dias ou cerca de 64 dias após o início da terapia contra a SMA, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 40% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

[0023] As seguintes modalidades aplicam-se a quaisquer dos aspectos acima. Em certos casos, a terapia contra a SMA compreende nusinersen ou um sal de nusinersen. Em alguns casos, a terapia contra a SMA compreende nusinersen sódico. Em certos casos, o nusinersen sódico é administrado por injeção intratecal de 5 mL de uma solução de 2,4 mg/mL. Em certos casos, a terapia contra a SMA compreende um ou mais de SPINRAZA®, olesoxima, AVX-101, CK-2127107, RG7916, RG7800, RO7034067, LMI070 ou SRK-015. Em certos casos, a terapia contra a SMA compreende uma pequena molécula. Em certos casos, a terapia contra a SMA compreende terapia genética. Em certos casos, a terapia contra a SMA compreende um inibidor de p38aDMAPK. Em certos casos, a terapia contra a SMA compreende um inibidor de DcpS. Em certos casos, a terapia contra a SMA compreende um inibidor de JNK. Em certos casos, o controle é um valor de corte de neurofilamentos preestabelecido. Em alguns casos, o controle é o nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) em uma amostra biológica ou amostras biológicas obtidas de um ou mais sujeitos humanos que não têm SMA.

[0024] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de medição de um nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H). O método envolve o fornecer uma amostra biológica obtida de um sujeito humano com mutações em ambas as cópias do gene SMN1 que levam à deficiência da proteína SMN funcional; e a medição de um nível de neurofilamentos (por exemplo, nível de pNF-H) na amostra biológica.

[0025] Essas modalidades se aplicam a quaisquer dos aspectos acima. Em certos casos, o neurofilamento é uma cadeia pesada de neurofilamento (por exemplo, NF-H fosforilado). Em certos casos, o neurofilamento é uma cadeia média/intermediária de neurofilamento. Em certos casos, o neurofilamento é uma cadeia leve de neurofilamento. Em certos casos, o neurofilamento é internexina. Em certos casos, o neurofilamento é periferina. Em certos casos, a amostra biológica é sangue, soro, plasma ou líquido cefalorraquidiano. Em alguns casos, o NF-H é detectado usando um anticorpo policlonal anti- NF-H. Em alguns casos, NF-H é detectado usando um anticorpo policlonal anti-NF-H que detecta especificamente a forma hiperfosforilada de NF-H (por exemplo, Encor Biotechnology Cat # RPCA-NF-H; e/ou Cat # CPCA- NF-H). Em alguns casos, o NF-H é detectado usando um anticorpo monoclonal anti-NF-H. Em certas modalidades, o sujeito humano é um feto. Em certas modalidades, o sujeito humano é um bebê. Em certas modalidades, o sujeito humano tem menos de 6 meses de idade. Em certas modalidades, o sujeito humano tem mais de 6 meses de idade. Em certas modalidades, o sujeito humano é um bebê com menos de 12 anos de idade. Em certas modalidades, o sujeito humano é um bebê com menos de 18 anos de idade. Em certas modalidades, o sujeito humano é um adulto de 18 anos ou mais.

[0026] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de competência comum na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser utilizados na prática ou na testagem da presente invenção, os métodos e materiais exemplares são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas para referência em suas totalidades. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo definições, irá prevalecer. Os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas, e não são destinados a ser um fator limitante.

[0027] Outras características e vantagens da invenção ficarão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada, bem como das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] A Figura 1 mostra os níveis de níveis de cadeia pesada de neurofilamentos fosforilado (pNF-H) em amostras de plasma e LCR no mesmo momento e no mesmo sujeito de estudos clínicos EMBRACE e NURTURE.

[0029] A Figura 2 mostra os níveis de pNF-H em amostras de plasma em sujeitos de estudos clínicos NURTURE, ENDEAR, EMBRACE e CHERISH que têm duas, três ou quatro cópias de SMN2.

[0030] A Figura 3 é uma representação dos níveis de pNF-H em sujeitos que têm duas cópias de SMN2 com o aumento da idade.

[0031] A Figura 4 é uma representação dos níveis de pNF-H em sujeitos que têm três cópias de SMN2 com o aumento da idade.

[0032] A Figura 5 é uma representação dos níveis de pNF-H em sujeitos que têm duas, três ou quatro cópias de SMN2 e idade de surgimento dos sintomas.

[0033] A Figura 6 é uma tabela que fornece características de linha de base e histórico de SMA por nível de pNF-H de linha de base.

[0034] A Figura 7 é uma tabela que fornece as características da linha de base e o histórico de SMA por nível de pNF-H da linha de base.

[0035] A Figura 8 é uma tabela que fornece características de linha de base e histórico de SMA por nível de pNF-H de linha de base.

[0036] A Figura 9 mostra a correlação dos níveis de log da linha de base (pNF-H) e as pontuações CHOP INTEND da linha de base.

[0037] A Figura 10 é uma tabela que mostra a capacidade de correlacionar fenótipos na linha de base pelos níveis de pNF-H no ENDEAR.

[0038] A Figura 11 é uma representação gráfica dos níveis de pNF- H no ENDEAR.

[0039] A Figura 12 é uma representação gráfica da variação percentual nos níveis de NF-H no ENDEAR.

[0040] A Figura 13 é uma representação gráfica da terapia de drogas contra a SMA nos níveis de pNF-H no ENDEAR.

[0041] A Figura 14 é uma representação gráfica da terapia com drogas contra a SMA na variação percentual nos níveis de NF-H no ENDEAR.

[0042] A Figura 15 é uma representação da mudança nos níveis de pNF-H em vários momentos.

[0043] A Figura 16 é um gráfico que representa a associação da pontuação de HINE-2 no Dia 183 com os níveis de pNF-H no Dia 64.

[0044] A Figura 17 mostra a associação da pontuação HINE-2 no dia 183 com os níveis de pNF-H no dia 64 (com covariáveis).

[0045] A Figura 18 é um gráfico que representa a associação da pontuação de CHOP INTEND no Dia 183 com os níveis de pNF-H no Dia 64.

[0046] A Figura 19 mostra a associação da pontuação CHOP INTEND no dia 183 com os níveis de pNF-H no dia 64 (com covariáveis).

[0047] A Figura 20 é uma representação da categoria HINE-2 (Responsivo/Não Responsivo) versus os níveis de pNF-H no Dia 183.

[0048] A Figura 21 é uma representação gráfica da categoria HINE- 2 (Responsivo/Não Responsivo) versus a alteração percentual do Dia 183 nos níveis de pNF-H.

[0049] A Figura 22 é uma representação gráfica da categoria CHOP INTEND (Responsivo/Não Responsivo) versus os níveis de pNF- H no Dia 183.

[0050] A Figura 23 é uma representação gráfica da categoria CHOP INTEND (Responsivo/Não Responsivo) versus a alteração percentual do Dia 183 nos níveis de pNF-H.

[0051] A Figura 24 é uma representação gráfica da manutenção do efeito da droga com base nos níveis de pNF-H (pg/mL) em NURTURE.

[0052] A Figura 25 é uma representação gráfica da manutenção do efeito da droga com base nos níveis de pNF-H (pg /mL) em EMBRACE.

[0053] A Figura 26 é uma representação gráfica do efeito da droga na variação percentual dos níveis de pNF-H (pg/mL) na NUTURE.

[0054] A Figura 27 é uma representação gráfica do efeito da droga na alteração percentual nos níveis de pNF-H (pg/mL) em EMBRACE.

[0055] A Figura 28 são gráficos que representam a associação da pontuação de HINE-2 no Dia 183 com os níveis de pNF-H no Dia 64. Para o gráfico superior: Raiz MSE: 2,87069; R ao quadrado: 0,0184; R ao quadrado ajustado: 0,0002. Para o gráfico inferior: Raiz MSE: 1,70576; R-quadrado: 0,224; R-quadrado ajustado: 0,1831. DF = graus de liberdade; MSE = erro quadrado médio.

[0056] A Figura 29 são gráficos que representam a associação da pontuação CHOP INTEND no Dia 183 com os níveis de pNF-H no Dia

64. Para o gráfico superior: Raiz MSE: 10,09399; R ao quadrado: 0,0754; R ao quadrado ajustado: 0,0583. Para o gráfico inferior: Root MSE: 9,41166; R ao quadrado: 0,2176; R ao quadrado ajustado: 0,1764. DF = graus de liberdade; MSE = erro quadrado médio.

[0057] A Figura 30 é uma ilustração gráfica dos níveis de pNF-H ao longo do tempo em bebês sobreviventes com valores não perdidos no Dia 302.

[0058] A Figura 31 é uma representação gráfica da mudança percentual nos níveis de pNF-H ao longo do tempo em bebês sobreviventes com valores não ausentes no Dia 302.

[0059] A Figura 32 é uma representação gráfica da associação da Amplitude CMAP peroneal no Dia 183 com os níveis de pNF-H no Dia

64.

[0060] A Figura 33 são gráficos que representam a associação da Amplitude CMAP Peroneal no Dia 183 com os níveis de pNF-H no Dia

64. Para o gráfico superior: Raiz MSE: 0,56401; R ao quadrado: 0,0164; R ao quadrado ajustado: -0,0029. Para o gráfico inferior: Root MSE: 0,18933; R ao quadrado: 0,2906; R ao quadrado ajustado: 0,2512. DF = graus de liberdade; MSE = erro quadrado médio.

[0061] A Figura 34 é uma representação gráfica da associação da

Amplitude Ulnar CMAP (potencial de ação muscular do composto) no Dia 183 com os níveis de pNF-H no Dia 64. Raiz MSE: 0,24904; R ao quadrado: 0,1746; R ao quadrado ajustado: 0,1633. DF = graus de liberdade; MSE = erro quadrado médio.

[0062] A Figura 35 são gráficos que representam a associação da Amplitude CMAP Ulnar no Dia 183 com os níveis de pNF-H no Dia 64. Para o gráfico superior: Raiz MSE: 0,2824; R ao quadrado: 0,0517; R ao quadrado ajustado: 0,0338. Para o gráfico inferior: Raiz MSE: 0,11118; R ao quadrado: 0,2406; R ao quadrado ajustado: 0,1984. DF = graus de liberdade; MSE = erro quadrado médio.

[0063] As Figuras 36A-36C são gráficos de características de operação do receptor (ROC) que representam a eficácia da medição da mudança percentual nos níveis de pNF-H no Dia 29 (Figura 36A), Dia 64 (Figura 36B) e Dia 183 (Figura 36C) na previsão função motora no dia 302.

[0064] As Figuras 37A-37B são gráficos que representam a eficácia da medição da mudança percentual nos níveis de pNF-H como um preditor de responsivos CHOP INTEND (Figura 37A) e responsivos do marco do desenvolvimento motor (Figura 37B) no ENDEAR.

[0065] As Figuras 38A-38C são gráficos que representam a eficácia da medição da alteração percentual nos níveis de pNF-H como um preditor de responsivos HFMSE (Figura 38A), responsivos de RULM (Figura 38B) e responsivos OMS (Fig. 38C) em CHERISH.

[0066] As Figuras 39A-39B são gráficos que representam os níveis de pNF-H no líquido cefalorraquidiano versus a idade na primeira dose por população de pacientes (Figura 39A) e número de cópias de SMN2 (Figura 39B).

[0067] A Figura 40 é um gráfico que representa o declínio nos níveis de pNF-H no líquido cefalorraquidiano após o tratamento com nusinersen.

[0068] As Figuras 41A-41D são gráficos que representam a mudança percentual nos níveis de pNF-H e NF-L após o tratamento com nusinersen no LCR de sujeitos pré-sintomáticos (Figura 41A), LCR de sujeitos com surgimento precoce (Figura 41B), plasma de sujeitos com surgimento precoce (Figura 41C), e plasma de sujeitos com surgimento tardio (Figura 41D).

[0069] As Figuras 41E-41F são gráficos que representam a mudança do valor absoluto nos níveis de pNF-H e NF-L após o tratamento com nusinersen no plasma de sujeitos com surgimento precoce (Figura 41E) e plasma de sujeito com surgimento tardio (Figura 41F).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0070] Esta descrição é baseada, em parte, na surpreendente descoberta de que os níveis de neurofilamentos (NF) podem servir como um biomarcador eficaz para a SMA.

1. Atrofia Muscular Espinhal

[0071] Após a fibrose cística, a atrofia muscular espinhal (SMA) é o segundo distúrbio autossômico recessivo letal mais comum entre os caucasianos. Este distúrbio é caracterizado pela degeneração progressiva dos neurônios motores alfa no corno anterior da medula espinhal, o que leva à atrofia muscular, paralisia e às vezes até a morte. A forma mais comum de SMA é causada por mutações no gene de sobrevivência do neurônio motor (SMN1) do 5q13. Esse distúrbio afeta 1 em 6.000 a 10.000 bebês, com uma frequência carreadora de 1 em

40. Vários tipos clínicos foram descritos para a SMA, os quais agrupam o distúrbio de acordo com o surgimento da idade e a progressão dos sintomas.

[0072] De acordo com a classificação acima, existem cinco tipos de SMA: tipo 0 (forma embrionária), tipo I (Werdning – Hoffman), tipo II (intermediário), tipo III (Kugeleberg – Welander) e tipo IV (forma adulta).

O tipo 0, o mais grave, é caracterizado pelo movimento reduzido do feto entre 30–36 semanas de gravidez e uma expectativa de vida muito curta. O tipo I é a segunda forma mais grave, com surgimento antes dos 6 meses de idade e expectativa de vida de cerca de 2 anos. Os tipos II e III são conhecidos como formas crônicas e são menos graves, com início entre 6–18 meses (tipo II) e, respectivamente, após 18 meses (para tipo III). Em muitos casos, o tipo IV imita os sintomas do tipo III, mas o surgimento é após os 18 anos de idade (normalmente em torno dos 30 anos). Uma expectativa de vida normal é característica dessa forma adulta.

[0073] O gene determinante de SMA, SMN1, foi mapeado para a região 5q11.2-13.3. A deleção homozigótica do éxon 7 de SMN1 é a mutação mais comum encontrada em pacientes com SMA; no entanto, há vários casos de pacientes heterozigotos compostos nos quais deleções e diferentes mutações pontuais foram detectadas. Em humanos, existem duas formas do gene SMN em cada alelo: uma forma telomérica (SMN1) e uma forma centromérica (SMN2). A transcrição do gene SMN1 produz transcrições de RNA mensageiro de comprimento total (mRNA) que codificam a proteína SMN. O gene SMN2 é idêntico ao gene SMN1, com exceção de uma substituição de C por T na posição 840, a qual resulta na exclusão do éxon 7 durante a transcrição. A proteína truncada resultante não é funcional e é rapidamente degradada. É importante ressaltar que a exclusão do éxon 7 dos mRNAs de SMN2 não está completa e, portanto, uma pequena fração dos transcritos de mRNA totais (aproximadamente 10% a 15%) decorrentes do gene SMN2 contém o éxon 7, que codifica a proteína SMN normal. Mas a proteína SMN de comprimento total é sintetizada em uma quantidade tão pequena que é incapaz de sustentar a sobrevivência do neurônio motor.

[0074] Todos os pacientes com SMA não possuem um gene SMN1 funcional e, portanto, são dependentes de seu gene SMN2 para produzir a proteína SMN necessária para a sobrevivência. Assim, a SMA é causada por uma deficiência na proteína SMN que resulta na perda seletiva do neurônio motor. Diversas análises de genótipo/fenótipo mostraram uma correlação positiva entre o número de cópias SMN2 e um fenótipo SMA mais brando. Embora o número de cópias SMN2 seja um determinante primário da gravidade da SMA, claramente não é o único modificador fenotípico. A técnica descreveu pelo menos três pacientes adultos com fenótipos 3b leves e apenas 2 cópias de SMN2. Esse achado aparentemente incongruente foi explicado pelo fato de que esses sujeitos tinham uma mutação c.859G> C no éxon 7 que criou um elemento intensificador de splice de éxon que resultou no aumento da produção de proteína SMN de comprimento total e um fenótipo mais brando. Outros modificadores foram descritos e mais são esperados conforme o entendimento da patogênese molecular da SMA seja refinado. Essas descobertas mostram que o fenótipo SMA nem sempre pode ser deduzido exclusivamente a partir da determinação do número de cópias SMN2.

2. Terapias para a SMA

[0075] Uma terapia para o tratamento da SMA é SPINRAZA®, um composto contendo nusinersen (também conhecido como ASO-10-27 / ISIS 396443 / ISIS SMNRx / ISIS-396443 / ISIS-SMNRx). Nusinersen é um composto oligonucleotídeo antisense modificado (modificado no sentido de que os grupos 2'-hidroxi dos anéis de ribofuranosil são substituídos por grupos 2'-O-2-metoxietil e as ligações fosfato são substituídas por ligações fosforotioato) que se liga a uma sequência específica do transcrito SMN2 no íntron a jusante do éxon 7. O sal de sódio de nusinersen (nusinersen de sódio) é comercializado sob o nome comercial SPINRAZA®. Nusinersen é projetado para tratar de SMA causada por mutações no cromossomo 5q que levam à deficiência de proteína SMN. Usando ensaios e estudos in vitro em modelos animais transgênicos de SMA, o nusinersen demonstrou aumentar a inclusão do éxon 7 em transcritos de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) de SMN2 e a produção de proteína SMN de comprimento total. Nusinersen atua para neutralizar o déficit de proteína SMN que causa a SMA, aumentando a eficiência de splicing do pré-mRNA SMN2.

[0076] Nusinersen é um oligonucleotídeo antisense 18-mer 2'-MOE fosforotioato. Nusinersen foi projetado para emparelhar com uma sequência alvo específica no pré-mRNA SMN2 para deslocar ribonucleoproteínas heterogêneas (hnRNPs) no local 1 de silenciamento de splice intrônico (ISS-1) entre os éxons 7 e 8 para permitir uma tradução mais completa da proteína SMN do gene parálogo SMN2. A injeção intratecal de nusinersen no líquido cefalorraquidiano (LCR) permite que seja distribuído do LCR para os tecidos alvo do sistema nervoso central (SNC). A sequência completa de nusinersen é [2’-O-(2-metoxietil)](3’-5')(P-tio) (T-5mC-A-5mC-T-T-T- 5mC-A-T-A-A-T-G-5mC-T-G-G) (SEQ ID NO:4). O oligonucleotídeo antisense contém 2'-O-(2-metoxietil) (2'-MOE) -oligorribonucleotídeos para reduzir a degradação da nuclease e para aprimorar a afinidade de ligação para o RNA complementar.

[0077] Existem várias outras terapias para o tratamento da SMA. Estes incluem compostos que aumentam os níveis de SMN, como inibidores de histona desacetilase, aminoglicosídeos e derivados de quinazolina. Os inibidores da histona desacetilase, como ácido valproico, butirato de sódio, fenilbutirato e tricostatina A ativam o promotor SMN2, resultando no aumento da proteína SMN de comprimento total. Outras terapias incluem CK-2127107 (um ativador rápido da troponina do músculo esquelético), LMI070 (branaplan, anteriormente conhecido como NVS-SM1), olesoxima (um membro da família de colesterol oximas), RG7916 (um modificador de splicing),

terapia genética SMN (AAV9-SMN1 ; AVXS-101 (transgene SMN humano AAV)) e SRK-015 (anticorpo inibidor seletivo e local da forma latente da miostatina). Em alguns casos, um ou mais desses agentes são usados em combinação para o tratamento de SMA. Os presentes métodos pretendem abranger qualquer tratamento de SMA.

3. Biomarcadores para SMA

[0078] Para identificar sujeitos que se beneficiariam a partir do tratamento com uma terapia contra a SMA (como uma ou mais das terapias de SMA descritas acima) ou para determinar se uma terapia está funcionando, é útil ter um biomarcador. Um biomarcador é uma característica que pode ser medida e avaliada objetivamente como um indicador de processos biológicos normais, processos patológicos ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica. Os biomarcadores podem ser biológicos (por exemplo, pequenas moléculas, metabólitos, peptídeos, proteínas, RNA, DNA), fisiológicos (por exemplo, pressão arterial, eletromiografia, função respiratória) ou medidas estruturais (por exemplo, ultrassom, ressonância magnética ou avaliação histológica). Os biomarcadores podem ser biomarcadores prognósticos que predizem um futuro resultado clínico; biomarcadores de progressão da doença que são indicativos da gravidade do impacto da doença; biomarcadores preditivos que predizem uma resposta clínica à terapia no futuro e ajudam a estratificar as terapias; biomarcadores farmacodinâmicos que monitoram ou quantificam um efeito terapêutico; e biomarcadores de ponto final substitutos que predizem uma resposta clínica futura à terapia em que uma mudança no ponto final está associada a uma resposta clínica futura.

[0079] Existem vários biomarcadores conhecidos para SMA. Isso inclui biomarcadores de prognóstico, como o número de cópias SMN2, como um indicador da gravidade da doença; biomarcadores de progressão da doença, como a amplitude do Potencial de Ação

Muscular Composto (CMAP) que serve como um indicador da perda de neurônios motores; biomarcadores preditivos, como amplitude do CMAP reduzida que é indicativa de menos resposta a terapias de restauração de SMN; biomarcadores farmacodinâmicos, como aumento dos transcritos de SMN de comprimento total e/ou aumento da proteína de SMN como indicadores de indução eficaz do gene SMN2; e biomarcadores de ponto final substitutos, como estimativa do número da unidade motora aumentada (MUNE) como um indicador de função física aperfeiçoada.

[0080] Esta descrição ilustra o uso de níveis de neurofilamentos como um novo biomarcador para SMA. Os neurofilamentos (NFs) são os elementos cistoqueléticos predominantes nas células nervosas e desempenham um papel não apenas em conferir estabilidade mecânica, mas também na determinação do calibre axonal. Os NFs humanos são compostos por três subunidades de proteínas, NF-L, NF- M e NF-H. Essas proteínas compartilham a mesma arquitetura básica que outras proteínas da subunidade dos filamentos intermediários. Os neurofilamentos no sistema nervoso de mamíferos também contêm a proteína internexina e os neurofilamentos no sistema nervoso periférico podem também conter a proteína periférica. Assim, tal como utilizado neste documento, por "uma proteína de neurofilamentos" significa cadeia pesada de neurofilamentos (NF-H), cadeia média/intermediária de neurofilamentos (NF-M), cadeia leve de neurofilamentos (NF-L), internexina ou periferina. O biomarcador SMA pode ser um ou mais dentre NF-H, NF-M, NF-L, internexina e periferina. Em certos casos, o biomarcador SMA é um NF-H fosforilado (pNF-H). Em certos casos, o biomarcador SMA é um NF-L fosforilado. Os níveis do biomarcador neurofilamentos podem ser avaliados usando RNA (por exemplo, mRNA) ou proteína.

[0081] As sequências de aminoácidos de NF-H humano são fornecidas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 5 e em Lees et al., EMBO J, 7 (7); 1947-1955 (1988), UniProtKB - P12036, NCBI Sequência de referência: NG_008404.1, Sequência de referência NCBI: NP_066554.2. SEQ ID NO:1

MMSFGGADALLGAPFAPLHGGGSLHYALARKGGAGGTRSAAGSSS GFHSWTRTSVSSVSASPSRFRGAGAASSTDSLDTLSNGPEGCMVAV ATSRSEKEQLQALNDRFAGYIDKVRQLEAHNRSLEGEAAALRQQQA GRSAMGELYEREVREMRGAVLRLGAARGQLRLEQEHLLEDIAHVRQ RLDDEARQREEAEAAARALARFAQEAEAARVDLQKKAQALQEECGY LRRHHQEEVGELLGQIQGSGAAQAQMQAETRDALKCDVTSALREIR AQLEGHAVQSTLQSEEWFRVRLDRLSEAAKVNTDAMRSAQEEITEY RRQLQARTTELEALKSTKDSLERQRSELEDRHQADIASYQEAIQQLD AELRNTKWEMAAQLREYQDLLNVKMALDIEIAAYRKLLEGEECRIGF GPIPFSLPEGLPKIPSVSTHIKVKSEEKIKVVEKSEKETVIVEEQTEETQ VTEEVTEEEEKEAKEEEGKEEEGGEEEEAEGGEEETKSPPAEEAAS PEKEAKSPVKEEAKSPAEAKSPEKEEAKSPAEVKSPEKAKSPAKEEA KSPPEAKSPEKEEAKSPAEVKSPEKAKSPAKEEAKSPAEAKSPEKAK SPVKEEAKSPAEAKSPVKEEAKSPAEVKSPEKAKSPTKEEAKSPEKA KSPEKAKSPEKEEAKSPEKAKSPVKAEAKSPEKAKSPVKAEAKSPEK AKSPVKEEAKSPEKAKSPVKEEAKSPEKAKSPVKEEAKTPEKAKSPV KEEAKSPEKAKSPEKAKTLDVKSPEAKTPAKEEARSPADKFPEKAKS PVKEEVKSPEKAKSPLKEDAKAPEKEIPKKEEVKSPVKEEEKPQEVK VKEPPKKAEEEKAPATPKTEEKKDSKKEEAPKKEAPKPKVEEKKEPA VEKPKESKVEAKKEEAEDKKKVPTPEKEAPAKVEVKEDAKPKEKTEV AKKEPDDAKAKEPSKPAEKKEAAPEKKDTKEEKAKKPEEKPKTEAKA

KEDDKTLSKEPSKPKAEKAEKSSSTDQKDSKPPEKATEDKAAKGK SEQ ID NO:5

MMSFGGADALLGAPFAPLHGGGSLHYALARKGGAGGTRSAAGSSS GFHSWTRTSVSSVSASPSRFRGAGAASSTDSLDTLSNGPEGCMVAV ATSRSEKEQLQALNDRFAGYIDKVRQLEAHNRSLEGEAAALRQQQA GRSAMGELYEREVREMRGAVLRLGAARGQLRLEQEHLLEDIAHVRQ RLDDEARQREEAEAAARALARFAQEAEAARVDLQKKAQALQEECGY LRRHHQEEVGELLGQIQGSGAAQAQMQAETRDALKCDVTSALREIR AQLEGHAVQSTLQSEEWFRVRLDRLSEAAKVNTDAMRSAQEEITEY RRQLQARTTELEALKSTKDSLERQRSELEDRHQADIASYQEAIQQLD AELRNTKWEMAAQLREYQDLLNVKMALDIEIAAYRKLLEGEECRIGF GPIPFSLPEGLPKIPSVSTHIKVKSEEKIKVVEKSEKETVIVEEQTEETQ VTEEVTEEEEKEAKEEEGKEEEGGEEEEAEGGEEETKSPPAEEAAS PEKEAKSPVKEEAKSPAEAKSPEKEEAKSPAEVKSPEKAKSPAKEEA KSPPEAKSPEKEEAKSPAEVKSPEKAKSPAKEEAKSPAEAKSPEKAK SPVKEEAKSPAEAKSPVKEEAKSPAEVKSPEKAKSPTKEEAKSPEKA KSPEKEEAKSPEKAKSPVKAEAKSPEKAKSPVKAEAKSPEKAKSPVK EEAKSPEKAKSPVKEEAKSPEKAKSPVKEEAKTPEKAKSPVKEEAKS PEKAKSPEKAKTLDVKSPEAKTPAKEEARSPADKFPEKAKSPVKEEV KSPEKAKSPLKEDAKAPEKEIPKKEEVKSPVKEEEKPQEVKVKEPPK KAEEEKAPATPKTEEKKDSKKEEAPKKEAPKPKVEEKKEPAVEKPKE SKVEAKKEEAEDKKKVPTPEKEAPAKVEVKEDAKPKEKTEVAKKEPD DAKAKEPSKPAEKKEAAPEKKDTKEEKAKKPEEKPKTEAKAKEDDKT LSKEPSKPKAEKAEKSSSTDQKDSKPPEKATEDKAAKGK

[0082] A sequência de aminoácidos do NF-L humano é fornecida na SEQ ID NO: 2 e em Julien et al., Biochimica et Biohysica Acta, 909: 10- 20 (1987), UniProtKB - P07196, NCBI sequência de referência: NP_006149.2, e sequência de referência NCBI: NG_008492.1. SEQ ID NO: 2

MSSFSYEPYYSTSYKRRYVETPRVHISSVRSGYSTARSAYSSYSAPV SSSLSVRRSYSSSSGSLMPSLENLDLSQVAAISNDLKSIRTQEKAQLQ DLNDRFASFIERVHELEQQNKVLEAELLVLRQKHSEPSRFRALYEQEI RDLRLAAEDATNEKQALQGEREGLEETLRNLQARYEEEVLSREDAE GRLMEARKGADEAALARAELEKRIDSLMDEISFLKKVHEEEIAELQAQ IQYAQISVEMDVTKPDLSAALKDIRAQYEKLAAKNMQNAEEWFKSRF TVLTESAAKNTDAVRAAKDEVSESRRLLKAKTLEIEACRGMNEALEK QLQELEDKQNADISAMQDTINKLENELRTTKSEMARYLKEYQDLLNV KMALDIEIAAYRKLLEGEETRLSFTSVGSITSGYSQSSQVFGRSAYGG LQTSSYLMSTRSFPSYYTSHVQEEQIEVEETIEAAKAEEAKDEPPSEG EAEEEEKDKEEAEEEEAAEEEEAAKEESEEAKEEEEGGEGEEGEET KEAEEEEKKVEGAGEEQAAKKKD

[0083] As sequências de aminoácidos de NF-M humano são fornecidas em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 6 e em Myers et al., EMBO J., 6 (6): 1617-1626 (1987) e em UniProtKB - P07197. SEQ ID NO: 3

MSYTLDSLGNPSAYRRVTETRSSFSRVSGSPSSGFRSQSWSRGSPS TVSSSYKRSMLAPRLAYSSAMLSSAESSLDFSQSSSLLNGGSGPGG DYKLSRSNEKEQLQGLNDRFAGYIEKVHYLEQQNKEIEAEIQALRQK QASHAQLGDAYDQEIRELRATLEMVNHEKAQVQLDSDHLEEDIHRLK ERFEEEARLRDDTEAAIRALRKDIEEASLVKVELDKKVQSLQDEVAFL RSNHEEEVADLLAQIQASHITVERKDYLKTDISTALKEIRSQLESHSDQ NMHQAEEWFKCRYAKLTEAAEQNKEAIRSAKEEIAEYRRQLQSKSIE LESVRGTKESLERQLSDIEERHNHDLSSYQDTIQQLENELRGTKWEM ARHLREYQDLLNVKMALDIEIAAYRKLLEGEETRFSTFAGSITGPLYTH RPPITISSKIQKPKVEAPKLKVQHKFVEEIIEETKVEDEKSEMEEALTAI TEELAVSMKEEKKEAAEEKEEEPEAEEEEVAAKKSPVKATAPEVKEE EGEKEEEEGQEEEEEEDEGAKSDQAEEGGSEKEGSSEKEEGEQEE GETEAEAEGEEAEAKEEKKVEEKSEEVATKEELVADAKVEKPEKAKS PVPKSPVEEKGKSPVPKSPVEEKGKSPVPKSPVEEKGKSPVPKSPV EEKGKSPVSKSPVEEKAKSPVPKSPVEEAKSKAEVGKGEQKEEEEK EVKEAPKEEKVEKKEEKPKDVPEKKKAESPVKEEAVAEVVTITKSVKV HLEKETKEEGKPLQQEKEKEKAGGEGGSEEEGSDKGAKGSRKEDIA VNGEVEGKEEVEQETKEKGSGREEEKGVVTNGLDLSPADEKKGGD KSEEKVVVTKTVEKITSEGGDGATKYITKSVTVTQKVEEHEETFEEKL

VSTKKVEKVTSHAIVKEVTQSD SEQ ID NO:6

MARHLREYQDLLNVKMALDIEIAAYRKLLEGEETRFSTFAGSITGPLYT HRPPITISSKIQKPKVEAPKLKVQHKFVEEIIEETKVEDEKSEMEEALTA ITEELAVSMKEEKKEAAEEKEEEPEAEEEEVAAKKSPVKATAPEVKEE EGEKEEEEGQEEEEEEDEGAKSDQAEEGGSEKEGSSEKEEGEQEE GETEAEAEGEEAEAKEEKKVEEKSEEVATKEELVADAKVEKPEKAKS PVPKSPVEEKGKSPVPKSPVEEKGKSPVPKSPVEEKGKSPVPKSPV EEKGKSPVSKSPVEEKAKSPVPKSPVEEAKSKAEVGKGEQKEEEEK EVKEAPKEEKVEKKEEKPKDVPEKKKAESPVKEEAVAEVVTITKSVKV HLEKETKEEGKPLQQEKEKEKAGGEGGSEEEGSDKGAKGSRKEDIA VNGEVEGKEEVEQETKEKGSGREEEKGVVTNGLDLSPADEKKGGD KSEEKVVVTKTVEKITSEGGDGATKYITKSVTVTQKVEEHEETFEEKL VSTKKVEKVTSHAIVKEVTQSD

[0084] A sequência de aminoácidos da internexina humana é fornecida na SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO:7

MSFGSEHYLCSSSSYRKVFGDGSRLSARLSGAGGAGGFRSQSLSR SNVASSAACSSASSLGLGLAYRRPPASDGLDLSQAAARTNEYKIIRTN EKEQLQGLNDRFAVFIEKVHQLETQNRALEAELAALRQRHAEPSRVG ELFQRELRDLRAQLEEASSARSQALLERDGLAEEVQRLRARCEEES RGREGAERALKAQQRDVDGATLARLDLEKKVESLLDELAFVRQVHD EEVAELLATLQASSQAAAEVDVTVAKPDLTSALREIRAQYESLAAKNL QSAEEWYKSKFANLNEQAARSTEAIRASREEIHEYRRQLQARTIEIEG LRGANESLERQILELEERHSAEVAGYQDSIGQLENDLRNTKSEMARH LREYQDLLNVKMALDIEIAAYRKLLEGEETRFSTSGLSISGLNPLPNPS YLLPPRILSATTSKVSSTGLSLKKEEEEEEASKVASKKTSQIGESFEEI LEETVISTKKTEKSNIEETTISSQKI

[0085] A sequência de aminoácidos da periferina humana é fornecida na SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO:8

MSHHPSGLRAGFSSTSYRRTFGPPPSLSPGAFSYSSSSRFSSSRLL GSASPSSSVRLGSFRSPRAGAGALLRLPSERLDFSMAEALNQEFLAT RSNEKQELQELNDRFANFIEKVRFLEQQNAALRGELSQARGQEPAR ADQLCQQELRELRRELELLGRERDRVQVERDGLAEDLAALKQRLEE ETRKREDAEHNLVLFRKDVDDATLSRLELERKIESLMDEIEFLKKLHE EELRDLQVSVESQQVQQVEVEATVKPELTAALRDIRAQYESIAAKNL QEAEEWYKSKYADLSDAANRNHEALRQAKQEMNESRRQIQSLTCEV DGLRGTNEALLRQLRELEEQFALEAGGYQAGAARLEEELRQLKEEM ARHLREYQELLNVKMALDIEIATYRKLLEGEESRISVPVHSFASLNIKT TVPEVEPPQDSHSRKTVLIKTIETRNGEVVTESQKEQRSELDKSSAH SY

[0086] Em certos casos, o nível de NF (por exemplo, pNF-H) é usado em combinação com um ou mais outros biomarcadores de SMA.

4. Diagnosticando a SMA

[0087] A descrição apresenta métodos de diagnóstico se um sujeito (por exemplo, um sujeito pré-sintomático) tem doença biologicamente ativa (ou seja, se a SMA está ativa e sua gravidade). O método envolve a medição de um nível de neurofilamentos em uma amostra biológica obtida do sujeito. A SMA é diagnosticada se o nível de neurofilamentos no sujeito for superior ao nível de controle. O nível de neurofilamentos também prediz a gravidade da doença: quanto maior o nível de NF em relação a um controle, mais grave é a SMA.

[0088] Em alguns casos, o método envolve a medição de um nível de NF-H na amostra biológica obtida do sujeito. Em alguns casos, o método envolve a medição de um nível de pNF-H na amostra biológica obtida do sujeito. Em alguns casos, o método envolve a medição de um nível de NF-M na amostra biológica obtida do sujeito. Em alguns casos, o método envolve a medição de um nível de NF-L na amostra biológica obtida do sujeito.

[0089] A amostra biológica pode ser , por exemplo , sangue, soro, plasma ou líquido cefalorraquidiano. Em alguns casos, a amostra biológica é plasma.

[0090] Em certos casos, o sujeito é um feto humano. Em certos casos, o sujeito é um ser humano recém-nascido. Em certos casos, o sujeito é um ser humano tem idade menor ou igual a 6 meses (por exemplo, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas , 3 semanas de idade, 1 mês de idade, 2 meses de idade, 3 meses de idade, 4 meses de idade, 5 meses de idade ou 6 meses de idade). Em certos casos, o sujeito é um ser humano com mais de 6 meses de idade e menos do que igual a 18 meses de idade (por exemplo, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses ou 18 meses). Em alguns casos, o sujeito é um humano com mais de 18 meses de idade. Em alguns casos, o sujeito é um humano com mais de 18 anos de idade.

[0091] Em alguns casos, o nível de NF é medido avaliando o nível de RNA de NF (por exemplo, mRNA) na amostra biológica.

[0092] Em alguns casos, o nível de NF é medido pela avaliação do nível de uma proteína NF (proteína NF-H, NF-M ou NF-L) na amostra biológica. Em certos casos, a proteína NF é pNF-H. A concentração da proteína ou proteínas de interesse pode ser medida usando qualquer método conhecido na técnica, como um ensaio imunológico. Exemplos não limitativos de tais métodos incluem imunoensaio enzimático, rádio- imunoensaio, imunoensaio quimioluminescente, imunoensaio eletroquimioluminescente, imunoensaio turbidimétrico de látex, imunoensaio fotométrico de látex, imunoensaio fotométrico de látex, ensaio imunocromatográfico e western blotting. Em certas modalidades, a concentração da proteína ou proteínas de interesse é medida por espectrometria de massa.

[0093] Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos (por exemplo, pNF-H) na amostra biológica está acima de um nível de controle. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 300 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamento na amostra biológica é superior a 400 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 500 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 600 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 700 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 800 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 900 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 1.000 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 1.100 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 1.200 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 1.300 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica é superior a 1.400 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 1.500 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 2.000 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 3.000 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 4.000 pg/mL. Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos na amostra biológica está acima de 5.000 pg/mL.

[0094] Um sujeito humano que é diagnosticado com SMA pode receber qualquer terapia contra a SMA. Em certos casos, um sujeito humano que é previamente determinado com SMA (por exemplo,

medindo os níveis de NF em uma amostra biológica do sujeito) recebe uma terapia contra a SMA. Em alguns casos, a terapia é SPINRAZA®. Em alguns casos, SPINRAZA® é administrado por via intratecal na dose de 12 mg por administração. Em alguns casos, a terapia contra a SMA é uma terapia combinada.

[0095] Níveis exemplares de pNF-H em sujeitos com SMA são fornecidos na tabela abaixo: Ensaio clínico Idade Nível de pNF-H Nível de pNF-H (dias) (pg/mL) (pg/mL) (SMN2 = 2 cópias) (SMN2 = 3 cópias) NURTURE 3-42 1.498 – 52.943 959-7.950 ENDEAR 30-262 2.390 – 50.100 13.600

5. Responsividade ao tratamento

[0096] Os níveis de NF também podem ser usados para determinar se um sujeito que recebe uma terapia contra a SMA está respondendo ao tratamento. Isso pode ser avaliado através da obtenção de uma primeira amostra biológica do sujeito antes e uma segunda amostra biológica após a administração de uma terapia contra a SMA ao sujeito e medição do nível de NF (por exemplo, NF-H, NF-M ou NF-L) em tais amostras. Em um caso, o nível de NF é um nível de pNF-H. Em alguns casos, a terapia é SPINRAZA®. Em alguns casos, SPINRAZA® é administrado por via intratecal na dose de 12 mg por administração. Em alguns casos, a terapia contra a SMA é uma terapia combinada.

[0097] Em certos casos, a primeira amostra ou amostras biológicas podem ser coletadas do sujeito a qualquer momento antes do tratamento, por exemplo, uma semana antes, vários dias antes, um dia antes, várias horas antes, uma hora antes ou menos de uma hora antes, de administrar a terapia contra a SMA. Da mesma forma, a segunda amostra ou amostras biológicas podem ser coletadas do sujeito a qualquer momento após a administração do tratamento contra a SMA ,

por exemplo, menos de uma hora depois, uma hora depois, várias horas depois, um dia depois, vários dias depois, uma semana depois, várias semanas depois, um mês depois, dois meses depois, três meses depois, quatro meses depois, cinco meses depois, 6 meses depois, 7 meses depois ou 8 meses depois de administrar a terapia contra a SMA. Uma redução no nível de NF após começar a terapia contra a SMA é indicativa da eficácia da terapia contra a SMA. Nesses casos, a continuação da terapia contra a SMA é indicada. A falha em reduzir o nível de NF após começar uma terapia contra SMA é indicativa da necessidade de alterar a dose (por exemplo, aumentar a dose) da terapia contra a SMA ou a falta de eficácia dessa terapia contra a SMA específica. No último caso, a descontinuação dessa terapia contra a SMA particular pode ser sugerida e o uso de uma terapia ou terapias contra a SMA diferentes devem ser consideradas.

[0098] O nível de NF pode ser avaliado medindo os níveis de RNA ou proteína. Em alguns casos, o nível de pNF-H é determinado. A concentração da proteína NF ou proteínas de interesse pode ser medida usando qualquer método conhecido na técnica, como um ensaio imunológico. Exemplos não limitativos de tais métodos incluem imunoensaio enzimático, rádio-imunoensaio, imunoensaio quimioluminescente, imunoensaio eletroquimioluminescente, imunoensaio turbidimétrico de látex, imunoensaio fotométrico de látex, imunoensaio fotométrico de látex, ensaio imunocromatográfico e western blotting. Em certas modalidades, a concentração da proteína ou proteínas de interesse é medida por espectrometria de massa.

[0099] Em certos casos, um nível de neurofilamentos (por exemplo, pNF-H) na primeira amostra biológica está acima de 300 pg/mL, acima de 400 pg/mL, acima de 500 pg/mL, acima de 600 pg/mL, acima de 700 pg/mL, acima de 800 pg/mL, acima de 900 pg/mL, acima de 1.000 pg/mL, acima de 1.500 pg/mL, acima de 2.000 pg/mL, acima de 3.000 pg/mL, acima de 4.000 pg/mL ou acima de 5.000 pg/mL.

Em certas modalidades, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é inferior ao nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica mostra um valor superior a 30% (por exemplo, superior a 31%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95%) diminuem em relação ao nível do neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica está entre 10% a 80% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica está entre 20% a 80% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica está entre 20% a 85% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica está entre 20% a 90% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica está entre 20% a 95% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica está entre 30% a 80% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica está entre 30% a 85% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica está entre 30% a 90% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

Em algumas modalidades, o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica está entre 30% a 95% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

[00100] Em certos casos, o sujeito é um ser humano pré-sintomático. Em certos casos, o sujeito é um ser humano recém-nascido. Em certos casos, o sujeito é um ser humano com idade menor ou igual a 6 meses (por exemplo, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas de idade, 1 mês de idade, 2 meses de idade, 3 meses de idade, 4 meses de idade, 5 meses de idade ou 6 meses de idade). Em certos casos, o sujeito é um ser humano com mais de 6 meses de idade e menos do que igual a 18 meses de idade (por exemplo, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses ou 18 meses de idade). Em alguns casos, o sujeito é um humano com mais de 18 meses de idade. Em alguns casos, o sujeito é um humano com mais de 18 anos de idade.

6. Prevendo a progressão da doença

[00101] Os níveis de NF em uma amostra biológica de um sujeito também podem servir para prever fenótipos no futuro. Por exemplo, o nível de NF pode prever a função motora no futuro. A título de ilustração, o nível de pNF-H um a dois meses após o começo da terapia pode prever a função motora dez meses após o começo da terapia. Quanto mais baixo o nível de pNF-H um a dois meses após o início da terapia em relação a um controle, mais provavelmente o sujeito terá uma função motora melhorada em relação a um sujeito com níveis de pNF-H mais altos um a dois meses após o começo da terapia. Esta possibilidade preditiva permite que o profissional de saúde modifique ou ajuste a dosagem e o tratamento do sujeito.

7. Controles

[00102] Conforme descrito acima, os métodos da presente descrição podem envolver a medição do nível de expressão (por exemplo, concentração de mRNA ou de proteína) de um ou mais genes NF ou proteínas em uma amostra biológica de um sujeito (por exemplo, um sujeito humano pré-sintomático), em que o nível de expressão de um ou mais genes NF ou proteínas, em comparação com um controle, prevê se um sujeito tem SMA; a gravidade da SMA; fenótipos no futuro; e se um sujeito é ou não respondente a um tratamento que compreende uma terapia contra a SMA (por exemplo, SPINRAZA®).

[00103] Em certas modalidades, ao diagnosticar se um sujeito tem SMA, onde a concentração de uma proteína NF (por exemplo, pNF-H) em uma amostra biológica de um sujeito é maior do que o controle, o sujeito é identificado como provável de ter SMA. Neste contexto, o termo "controle" inclui uma amostra (da mesma fonte - por exemplo, sangue, plasma, soro, LCR) obtida de um sujeito da mesma ou idade semelhante que é conhecido por não ter SMA. Por exemplo, se um sujeito que é recém-nascido está sendo testado, então, o controle também é de um recém-nascido que não tem SMA; se um sujeito de 6 a 18 meses de idade estiver sendo testado, então, o controle também é de um sujeito de 6 a 18 meses de idade que não tem SMA. O termo "controle" também inclui uma amostra (do mesmo tecido) obtida no passado de um sujeito que é conhecido por não ter SMA e usada como uma referência para comparações no futuro com amostras de teste retiradas de sujeitos para os quais a SMA deve ser prevista. O nível/concentração de expressão de "controle" para uma determinada proteína NF também pode ser preestabelecido por uma análise da expressão da proteína em um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 ou mais) sujeitos humanos de idade semelhante que não tenham a SMA. Este valor de referência preestabelecido (que pode ser um nível de expressão/concentração médio ou mediano retirado de vários sujeitos que não têm a SMA) pode, então, ser usado para o nível de concentração/expressão de "controle" da proteína ou ácido nucleico na comparação com a amostra de teste. Nessa comparação, prevê-se que o sujeito tenha SMA se o nível de expressão da NF em análise for superior à referência pré-estabelecida.

[00104] Os métodos da presente descrição podem envolver a medição do nível de expressão (por exemplo, mRNA ou concentração de proteína) de um ou mais genes (por exemplo, um ou mais genes de NF) em uma amostra biológica de um sujeito que tem ou com ou suspeito de ter SMA, em que o nível de expressão de um ou mais genes de NF, em comparação com um controle, prevê a responsividade de um sujeito ao tratamento que compreende uma terapia contra a SMA (por exemplo, SPINRAZA®). Em certas modalidades, quando a concentração de uma proteína de NF (por exemplo, pNF-H) em uma amostra biológica de um sujeito que tem ou com suspeita de ter a SMA é menor do que o controle, o sujeito é identificado como suscetível de responder a uma terapia que compreende uma terapia contra a SMA. Neste contexto, o termo "controle" inclui uma amostra (da mesma fonte - por exemplo – por exemplo, plasma, soro, LCR) obtida de um sujeito da mesma ou idade semelhante que é conhecido por não ter a SMA. O termo "controle" também inclui uma amostra (do mesmo tecido) obtida no passado de um sujeito que é conhecido por não ter a SMA e usada como uma referência para comparações no futuro com amostras de teste retiradas de sujeitos para os quais a deve ser prevista. O nível/concentração de expressão de "controle" para uma determinada proteína de NF em um determinado tipo de célula ou tecido pode ser preestabelecido por uma análise da expressão da proteína em um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 ou mais) sujeitos humanos da mesma idade ou semelhante que não responderam ao tratamento com uma terapia contra a SMA (por exemplo, SPINRAZA®). Este valor de referência preestabelecido (que pode ser um nível de expressão/concentração médio ou mediano retirado de vários sujeitos que não responderam à terapia) pode, então, ser usado para o nível de concentração/expressão de "controle" da proteína ou ácido nucleico na comparação com a amostra de teste. Em tal comparação, prevê-se que o sujeito responda a uma terapia que inclua uma terapia contra a SMA (por exemplo, SPINRAZA®) se o nível de expressão do gene de NF analisado for inferior à referência pré-estabelecida.

[00105] A concentração de "controle" para uma determinada proteína (por exemplo, NF-H) em um determinado fluido biológico, tipo de célula ou tecido pode, alternativamente, ser pré-estabelecida por uma análise da expressão gênica em um ou mais sujeitos que responderam ao tratamento com uma terapia contra a SMA (por exemplo, SPINRAZA®). Esse valor de referência preestabelecido (que pode ser um nível de expressão médio ou mediano obtido de vários sujeitos que responderam à terapia) pode, então, ser usado como o nível de expressão "controle" na comparação com a amostra de teste. Em tal comparação, prevê-se que o sujeito responda a uma terapia contra a SMA (por exemplo, SPINRAZA®) se a concentração da proteína analisada for a mesma ou comparável à (pelo menos 85%, mas menos de 100% de) referência pré-estabelecida.

[00106] Em certas modalidades, o "controle" é um valor de corte pré- determinado.

[00107] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento incluem determinar se a concentração de uma(s) proteína(s) de NF de interesse se enquadra acima ou abaixo de um valor de corte predeterminado.

[00108] Um valor de corte é normalmente uma concentração de uma proteína acima ou abaixo da qual é considerada preditiva de algo - por exemplo, probabilidade de desenvolver SMA; ou responsividade de um sujeito a uma terapia de interesse. Assim, de acordo com os métodos descritos neste documento, uma concentração de referência de uma proteína NF (por exemplo, pNF-H) é identificada como um valor de corte, acima ou abaixo do qual é preditivo de um sujeito com SMA, ou de um sujeito que mostra capacidade de resposta a uma terapia contra a SMA (por exemplo, SPINRAZA®). Alguns valores de corte não são absolutos, pois as correlações clínicas ainda podem permanecer significativas sobre uma faixa valores em ambos os lados do corte; entretanto, é possível selecionar um valor de corte ideal (por exemplo, várias pontuações H) de concentração de proteínas NF para um tipo de amostra particular. Os valores de corte determinados para uso nos métodos descritos neste documento podem ser comparados com, por exemplo, faixas publicadas de concentrações de NF, mas podem ser individualizados para a metodologia usada e população de pacientes. Entende-se que melhorias nos valores de corte ideais podem ser determinadas dependendo da sofisticação dos métodos estatísticos usados e do número e da fonte de amostras usadas para determinar os valores de nível de referência para as diferentes proteínas, genes e tipos de amostra. Portanto, os valores de corte estabelecidos podem ser ajustados para cima ou para baixo, com base em reavaliações periódicas ou mudanças na metodologia ou distribuição da população.

[00109] A concentração de referência de uma ou mais proteínas NF pode ser determinada por uma variedade de métodos. O nível de referência pode ser determinado pela comparação da concentração de uma proteína NF de interesse em, por exemplo, populações de sujeitos (por exemplo, pacientes) que respondem a uma terapia contra a SMA (por exemplo, SPINRAZA®) ou não respondem a uma terapia contra a SMA. Isso pode ser realizado, por exemplo, por análise de histograma, em que uma coorte inteira de pacientes é apresentada graficamente, em que um primeiro eixo representa a concentração de uma proteína de interesse e um segundo eixo representa o número de sujeitos na coorte cuja amostra contém uma ou mais concentrações. A determinação da concentração de referência de uma proteína pode, então, ser feita com base na quantidade ou concentração que melhor distingue esses grupos separados. O nível de referência pode ser um único número, igualmente aplicável a todos os sujeitos, ou o nível de referência pode variar, de acordo com subpopulações específicas de sujeitos. Por exemplo, os sujeitos mais velhos podem ter um nível de referência diferente dos sujeitos mais jovens. Além disso, um sujeito com doença mais grave pode ter um valor de referência diferente daquele com uma forma mais branda da doença (por exemplo, Tipo I vs. SMA tipo IV; Tipo I vs. SMA Tipo III; Tipo I vs. SMA tipo II).

[00110] O valor de corte preestabelecido pode ser uma concentração de proteína NF (por exemplo, pNF-H) que é determinada com base na análise da característica de operação do receptor (ROC). As curvas da ROC são usadas para determinar um valor de corte para um teste clínico. Considere a situação em que há dois grupos de pacientes e, ao usar uma técnica padrão estabelecida, um grupo é conhecido por responder à terapia contra a SMA e o outro por não responder à terapia contra a SMA. Uma medição usando uma amostra biológica de todos os membros dos dois grupos é usada para testar a capacidade de resposta a uma terapia contra a SMA. O teste encontrará alguns, mas não todos, os respondentes para responder a uma terapia contra a SMA. A proporção entre os respondentes encontrados pelo teste e o número total de respondentes (conhecido pela técnica-padrão estabelecida) é a taxa positiva verdadeira (também conhecida como sensibilidade). O teste encontrará alguns, mas não todos, os respondentes para responder a uma terapia contra a SMA. A proporção de não respondentes encontrados pelo teste para o número total de não respondentes (conhecido pela técnica padrão estabelecida) é a taxa negativa verdadeira (também conhecida como especificidade). A esperança é que a análise da curva ROC do teste de responsividade à terapia contra a SMA encontre um valor de corte que minimize o número de falsos positivos e falsos negativos. Um ROC é um gráfico que ilustra o desempenho de um sistema estratificador de classe binária conforme seu limite de discriminação é variado. Ele é criado traçando a fração de verdadeiros positivos dos positivos versus a fração de falsos positivos dos negativos, em várias configurações de limite.

[00111] Em uma modalidade, a concentração de proteína NF é determinada com base na análise ROC que prevê a resposta a uma terapia contra a SMA com um valor preditivo positivo, em que uma concentração de uma proteína de interesse (por exemplo, pNF-H) igual ou abaixo do corte preestabelecido. O valor de corte é uma baixa concentração da proteína de interesse e um valor superior ao valor de corte preestabelecido é uma alta concentração da proteína de interesse. O valor preditivo positivo é a proporção de resultados de teste positivos que são verdadeiros positivos; ele reflete a probabilidade de que um teste positivo reflita a condição subjacente que está sendo testada. Métodos para construção de curvas ROC e determinação de valores preditivos positivos são bem conhecidos na técnica.

[00112] Em outra modalidade, o valor de corte preestabelecido pode ser uma concentração de proteína NF que é determinada com base em modelos de simulação que preveem capacidade de resposta à terapia contra SMA, e em que uma concentração da proteína de interesse (por exemplo, pNF-H) igual ou abaixo do valor de corte preestabelecido é uma baixa concentração da proteína de interesse e um valor maior do que o valor de corte preestabelecido é uma alta concentração da proteína de interesse.

8. Amostras biológicas

[00113] As amostras biológicas adequadas para os métodos descritos neste documento incluem qualquer fluido biológico, célula, tecido ou fração do mesmo, que inclui biomoléculas de analito de interesse, como proteína de NF ou ácido nucleico (por exemplo, RNA (mRNA)). Uma amostra biológica pode ser, por exemplo, um espécime obtido de um sujeito humano ou pode ser derivada de tal sujeito. Por exemplo, uma amostra pode ser uma seção de tecido obtida por biópsia, fluido biológico arquivado ou células que são alocadas ou adaptadas para cultura de tecidos. Em alguns casos, uma amostra biológica é um fluido biológico, como sangue, plasma, soro, líquido cefalorraquidiano (LCR), urina ou tal amostra absorvida em um substrato (por exemplo, vidro, polímero, papel). Uma amostra biológica pode ser posteriormente fracionada, se desejado, em uma fração contendo tipos de células particulares. Por exemplo, uma amostra de sangue pode ser fracionada em soro ou em frações contendo tipos específicos de células sanguíneas, como glóbulos vermelhos ou glóbulos brancos (leucócitos). Se desejado, uma amostra pode ser uma combinação de amostras de um sujeito, como uma combinação de uma amostra de tecido e fluido.

[00114] As amostras biológicas podem ser obtidas de um sujeito com suspeita de ter, ou em risco de desenvolver SMA. Em modalidades específicas, o sujeito é um feto humano. Em certas modalidades, o sujeito é um bebê humano pré-sintomático. Em certas modalidades, o sujeito é uma criança humana pré-sintomática. Em certas modalidades, o sujeito é um humano adulto pré-sintomático.

[00115] Quaisquer métodos adequados para obter as amostras biológicas podem ser empregados, embora métodos exemplares incluam, por exemplo, flebotomia, procedimento de biópsia aspirada com agulha fina. As amostras também podem ser coletadas, por exemplo, por microdissecção (por exemplo, microdissecção de captura a laser (LCM) ou microdissecção a laser (LMD)).

[00116] Os métodos para obter e/ou armazenar amostras que preservam a atividade ou integridade das moléculas (por exemplo, ácidos nucleicos ou proteínas) na amostra são bem conhecidos para a pessoa versada na técnica.

Por exemplo, uma amostra biológica pode ser posta em contato adicionalmente com um ou mais agentes adicionais, tais como tampões e/ou inibidores, incluindo um ou mais nuclease, protease e inibidores de fosfatase, que preservam ou minimizam as mudanças nas moléculas (por exemplo, ácidos nucleicos ou proteínas) na amostra.

Tais inibidores incluem, por exemplo, quelantes, tais como ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), bis(P- aminoetil éter) N, N, N1, ácido Nl-tetra-acético (EGTA), inibidores de protease, tais como fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), aprotinina, leupeptina, antipaina e semelhantes, e inibidores da fosfatase, tais como fosfato, fluoreto de sódio, vanadato e semelhantes.

Tampões e condições adequados para o isolamento de moléculas são bem conhecidos dos versados na técnica e podem ser variados dependendo, por exemplo, do tipo de molécula na amostra a ser caracterizada (ver, por exemplo, Ausubel et al.

Current Protocols in Molecular Biology (Suplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999); Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3ª ed.

Burtis e Ashwood, editores WB Saunders, Philadelphia, (1999)). Uma amostra também pode ser processada para eliminar ou minimizar a presença de substâncias interferentes.

Por exemplo, uma amostra biológica pode ser fracionada ou purificada para remover um ou mais materiais que não são de interesse.

Os métodos de fracionamento ou purificação de uma amostra biológica incluem, mas não estão limitados a, métodos cromatográficos, tais como cromatografia líquida, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão de tamanho ou cromatografia de afinidade.

Para uso nos métodos descritos neste documento, uma amostra pode estar em uma variedade de estados físicos.

Por exemplo, uma amostra pode ser um líquido ou sólido, pode ser dissolvida ou suspensa em um líquido, pode estar em uma emulsão ou gel, ou pode ser absorvida em um material.

9. Determinando os níveis de expressão/concentrações de biomarcadores

[00117] A expressão do gene pode ser detectada como, por exemplo, expressão de proteína ou RNA de um gene alvo. Ou seja, a presença ou o nível de expressão (quantidade) de um gene pode ser determinado pela detecção e/ou medição do nível de mRNA ou expressão de proteína do gene. Em algumas modalidades, a expressão gênica do pode ser detectada como a atividade de uma proteína codificada por um gene NF.

[00118] Em uma modalidade, a expressão de um gene pode ser determinada pela detecção e/ou medição da expressão ou concentração de uma proteína codificada pelo gene. Os métodos de determinação da expressão/concentração de proteínas são bem conhecidos na técnica. Um método geralmente usado envolve o uso de anticorpos específicos para a proteína alvo de interesse. Por exemplo, os métodos de determinação da expressão de proteínas incluem, mas não estão limitados a, análise de western blot ou dot blot, imunohistoquímica (por exemplo, imunohistoquímica quantitativa), imunocitoquímica, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), ponto de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISPOT; Coligan, JE, et al., Eds. (1995) Current Protocols in Immunology. Wiley, New York), radioimunoensaio, imunoensaio quimioluminescente, imunoensaio eletroquimioluminescente, imunoensaio turbidimétrico de látex, imunoensaio fotométrico de látex, ensaio imunocromatográfico e análise de matriz de anticorpos (ver, por exemplo, Publicação U.S. 2003/0013208 e 2004/171068, as descriçõesdescrições de cada um das quais são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade). Uma descrição adicional de muitos dos métodos acima e métodos adicionais para detectar a expressão de proteínas pode ser encontrada em, por exemplo, Sambrook et al. (supra).

[00119] Em um exemplo, a presença ou quantidade de expressão da proteína NF de um gene NF (por exemplo, NF-H) pode ser determinada usando uma técnica de Western blotting. Por exemplo, um lisado pode ser preparado a partir de uma amostra biológica, ou a própria amostra biológica pode ser colocada em contato com tampão Laemmli e submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). As proteínas resolvidas por SDS-PAGE, separadas por tamanho, podem então ser transferidas para uma membrana de filtro (por exemplo, nitrocelulose) e submetidas a técnicas de imunotransferência usando um anticorpo marcado de forma detectável específico para a proteína de interesse. A presença ou quantidade de anticorpo marcado detectável ligado indica a presença ou quantidade de proteína na amostra biológica.

[00120] Em uma modalidade, a plataforma SimplePlex é usada para medir os níveis de NF-H (por exemplo, NF-H fosforilado). SimplePlex está comercialmente disponível em Protein Simple (San Jose, CA, EUA) (Ver Dysinger M, et al. J. Immunol. Métodos. 451: 1-10, 2017).

[00121] Em uma modalidade, um ensaio para medir NF-L (por exemplo, NF-L fosforilado) é empregado. Ensaios para medir NF-L no soro foram descritos (ver, por exemplo, Gaiottino et al., PLoS ONE 8: e75091, 2013; Kuhle et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 86 (3): 273- 279, 2014). Em um exemplo, o soro sanguíneo de um sujeito é centrifugado a 1000g por 10 minutos em temperatura ambiente e armazenado a −80°C em 2 horas após a coleta. As concentrações séricas de NF-L podem ser medidas (por exemplo, em duplicado) usando ensaio imunoenzimático (ELISA) pronto para uso (Mabtech AB, Nacka Strand, Suécia) ou um imunoensaio de eletroquimioluminescência (ECL) descrito em Gaiottino et al., PLoS

ONE 8: e75091, 2013, ou uma matriz de molécula única (SIMOA) descrito em Disanto et al., Ann. Neurol. 81(6): 857-870, 2017. Os métodos de ensaio foram comparados em Kuhl et al., Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 54 (10): 1655-1661, 2016. O ensaio SIMOA (particularmente denominado kit Simoa NF-light Advantage) está disponível comercialmente na Quanterix Corp. (Lexington, MA, EUA).

[00122] Em outro exemplo, um imunoensaio pode ser usado para detectar e/ou medir a expressão da proteína de um gene (por exemplo, gene NF-H). Como acima, para fins de detecção, um imunoensaio pode ser realizado com um anticorpo que suporta uma porção de detecção (por exemplo, um agente fluorescente ou enzima). As proteínas de uma amostra biológica podem ser conjugadas diretamente a uma matriz de fase sólida (por exemplo, uma placa de ensaio de múltiplos poços, nitrocelulose, agarose, sepharose, partículas codificadas ou esferas magnéticas) ou pode ser conjugada a um primeiro membro de um par de ligação específico (por exemplo, biotina ou estreptavidina) que se conecta a uma matriz de fase sólida mediante ligação a um segundo membro do par de ligação específico (por exemplo, estreptavidina ou biotina). Tal conexão a uma matriz de fase sólida permite que as proteínas sejam purificadas de outros componentes interferentes ou irrelevantes da amostra biológica antes do contato com o anticorpo de detecção e também permite a lavagem subsequente do anticorpo não ligado. Aqui, como acima, a presença ou quantidade de anticorpo marcado detectável ligado indica a presença ou quantidade de proteína na amostra biológica.

[00123] Não há restrição específica quanto à forma do anticorpo e a presente descrição inclui anticorpos policlonais, bem como anticorpos monoclonais. O antissoro obtido pela imunização de animais, como coelhos com uma proteína ou fragmento da mesma da invenção (ou seja, uma proteína ou um fragmento imunológico desta de uma proteína

NF), bem como anticorpos policlonais e monoclonais de todas as classes, anticorpos humanos e anticorpos humanizados produzidos por recombinação genética, também estão incluídos.

[00124] Uma proteína intacta ou seu peptídeo parcial pode ser usado como o antígeno para imunização. Como peptídeos parciais das proteínas, por exemplo, podem ser dados o fragmento do terminal amino (N) da proteína e o fragmento do terminal carbóxi (C).

[00125] Um gene que codifica uma proteína de interesse ou um fragmento da mesma (por exemplo, um fragmento imunológico) é inserido em um vetor de expressão conhecido e, por transformação das células hospedeiras com o vetor descrito neste documento, a proteína desejada ou um fragmento do mesmo é recuperado de fora ou dentro das células hospedeiras usando métodos-padrão. Esta proteína pode ser usada como o antígeno sensibilizador. Além disso, as células que expressam a proteína, lisados de células ou uma proteína sintetizada quimicamente da invenção também podem ser usadas como um antígeno de sensibilização.

[00126] O mamífero que é imunizado pelo antígeno de sensibilização não é restringido; no entanto, é preferível selecionar animais considerando a compatibilidade com as células parentais usadas na fusão celular. Geralmente, animais pertencentes às ordens rodentia, lagomorpha ou primatas são usados. Exemplos de animais pertencentes à ordem dos rodentia que podem ser usados incluem, por exemplo, camundongos, ratos e hamsters. Exemplos de animais pertencentes à ordem de lagomorpha que podem ser utilizados incluem, por exemplo, coelhos. Exemplos de animais pertencentes à ordem dos primatas que podem ser utilizados incluem, por exemplo, macacos. Exemplos de macacos a serem usados incluem a infraordem catarrhini (macacos do velho mundo), por exemplo, Macaca fascicularis, macacos rhesus, babuínos sagrados e chimpanzés.

[00127] Métodos bem conhecidos podem ser usados para imunizar animais com o antígeno de sensibilização. Por exemplo, o antígeno de sensibilização é injetado intraperitoneal ou subcutaneamente em mamíferos. Especificamente, o antígeno de sensibilização é adequadamente diluído e suspenso em soro fisiológico, soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e assim por diante, e misturado com uma quantidade adequada de adjuvante geral se desejado, por exemplo, com o adjuvante completo de Freund. Em seguida, a solução é emulsificada e injetada no mamífero. Depois disso, o antígeno de sensibilização adequadamente misturado com o adjuvante incompleto de Freund é preferencialmente administrado várias vezes a cada 4 a 21 dias. Um carreador adequado também pode ser usado ao imunizar e animal com o antígeno de sensibilização. Após a imunização, a elevação do nível de anticorpos séricos é detectada por métodos usuais.

[00128] Os anticorpos policlonais contra as proteínas da presente descrição podem ser preparados como se segue. Depois de verificar se o nível de anticorpo sérico desejado foi atingido, o sangue é retirado do mamífero sensibilizado com antígeno. O soro é isolado desse sangue usando métodos convencionais. O soro contendo o anticorpo policlonal pode ser usado como o anticorpo policlonal ou, de acordo com as necessidades, a fração contendo o anticorpo policlonal pode ser ainda isolada do soro. Por exemplo, uma fração de anticorpos que reconhecem especificamente a proteína da invenção pode ser preparada usando uma coluna de afinidade à qual a proteína é acoplada. Em seguida, a fração pode ser purificada adicionalmente usando uma coluna de Proteína A ou Proteína G, a fim de preparar imunoglobulina G ou M.

[00129] Para obter anticorpos monoclonais, após verificação de que o nível de anticorpo sérico desejado foi alcançado no mamífero sensibilizado com o antígeno descrito acima, os imunócitos são retirados do mamífero e usados para a fusão celular. Para este propósito, os esplenócitos podem ser mencionados como imunócitos preferidos. Como células parentais fundidas com os imunócitos acima, as células de mieloma de mamífero são preferencialmente utilizadas. Mais preferencialmente, as células de mieloma que adquiriram o atributo, que podem ser usadas para distinguir células de fusão por agentes, são usadas como a célula parental.

[00130] A fusão celular entre os imunócitos acima e células de mieloma pode ser conduzida de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, o método de Milstein et al. (Galfre et al., Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981).

[00131] O hibridoma obtido da fusão celular é selecionado cultivando as células em um meio de seleção padrão, por exemplo, meio de cultura HAT (meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). A cultura neste meio HAT é continuada por um período suficiente para que as células (células não de fusão), exceto o hibridoma objetivo, morram, geralmente de alguns dias a algumas semanas. Em seguida, o método usual de diluição limitante é realizado e o hibridoma que produz o anticorpo objetivo é rastreado e clonado.

[00132] Além do método acima para obter hibridomas, imunizando um animal diferente de seres humanos com o antígeno, um hibridoma que produz os anticorpos humanos objetivos com atividade para se ligar a proteínas pode ser obtido pelo método de sensibilização de linfócitos humanos, por exemplo, linfócitos humanos infectado com o vírus EB, com proteínas, células que expressam proteínas ou lisados das mesmas in vitro e fundindo os linfócitos sensibilizados com células de mieloma derivadas de seres humanos, por exemplo, U266, tendo uma capacidade de divisão celular permanente.

[00133] Os anticorpos monoclonais obtidos por transplante dos hibridomas obtidos na cavidade abdominal de um camundongo e extração de ascite podem ser purificados, por exemplo, por precipitação com sulfato de amônio, proteína A ou coluna de proteína G, cromatografia de troca iônica DEAE, uma coluna de afinidade para a qual a proteína da presente descrição é acoplada e assim por diante.

[00134] Os anticorpos monoclonais também podem ser obtidos como anticorpos recombinantes produzidos usando a técnica de engenharia genética (ver, por exemplo, Borrebaeck CAK e Larrick, JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD (1990)). Os anticorpos recombinantes são produzidos por clonagem do DNA codificador de imunócitos, tais como hibridoma ou linfócitos sensibilizados produtores de anticorpos, incorporando em um vetor adequado e introduzindo este vetor em um hospedeiro para produzir o anticorpo. A presente descrição também abrange tais anticorpos recombinantes.

[00135] Anticorpos ou fragmentos de anticorpos específicos para uma proteína codificada por um ou mais biomarcadores também podem ser gerados por métodos in vitro, como exibição de fago.

[00136] Além disso, o anticorpo da presente descrição pode ser um fragmento de anticorpo ou anticorpo modificado, desde que se ligue a uma proteína codificada por um biomarcador da invenção. Por exemplo, Fab, F (ab')2, Fv ou Fv de cadeia simples (scFv) em que a cadeia H Fv e a cadeia L Fv estão adequadamente ligadas por um ligante (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883, (1988)) podem ser dados como fragmentos de anticorpo. Especificamente, os fragmentos de anticorpos são gerados tratando anticorpos com enzimas, por exemplo, papaína ou pepsina. Alternativamente, eles podem ser gerados pela construção de um gene que codifica um fragmento de anticorpo, introduzindo este em um vetor de expressão e expressando este vetor em células hospedeiras adequadas (ver, por exemplo, Co et al., J. Immunol., 152:2968-2976, 1994; Better et al., Methods Enzymol.,

178:476-496, 1989; Pluckthun et al., Methods Enzymol., 178:497-515, 1989; Lamoyi, Methods Enzymol., 121:652-663, 1986; Rousseaux et al., Methods Enzymol., 121:663-669, 1986; Bird et al., Trends Biotechnol., 9:132-137, 1991).

[00137] Os anticorpos podem ser conjugados a várias moléculas, tais como substâncias fluorescentes, substâncias radioativas e substâncias luminescentes. Métodos para anexar tais frações a um anticorpo já estão estabelecidos e são convencionais no campo (ver, por exemplo, US 5,057,313 e 5,156,840).

[00138] Exemplos de métodos que avaliam a atividade de ligação ao antígeno dos anticorpos incluem, por exemplo, medição de absorbância, ensaio imunoenzimático (ELISA), imunoensaio enzimático (EIA), radioimunoensaio (RIA) e/ou imunofluorescência. Por exemplo, ao usar ELISA, uma proteína codificada por um biomarcador da invenção é adicionada a uma placa revestida com os anticorpos da presente descrição e, em seguida, a amostra de anticorpo, por exemplo, sobrenadantes de cultura de células produtoras de anticorpos, ou purificadas anticorpos são adicionados. Em seguida, o anticorpo secundário que reconhece o anticorpo primário, que é marcado pela fosfatase alcalina e tais enzimas, é adicionado, a placa é incubada e lavada, e a absorção é medida para avaliar a atividade de ligação ao antígeno após a adição de um substrato de enzima, como p- nitrofenil fosfato. Como a proteína, um fragmento de proteína, por exemplo, um fragmento compreendendo um terminal C, ou um fragmento compreendendo um terminal N pode ser usado. Para avaliar a atividade do anticorpo da invenção, BIAcore (Pharmacia) pode ser usado.

[00139] Ao usar esses métodos, o anticorpo da invenção e uma amostra que presume-se que contém uma proteína da invenção são contatados e a proteína codificada por um biomarcador da invenção é detectada ou testada pela detecção ou análise do complexo imune formado entre os anticorpo mencionado e a proteína.

[00140] Métodos de ensaio de quantificação baseados em espectrometria de massa, por exemplo, mas não limitados a, abordagens baseadas em monitoramento de reação múltipla (MRM) em combinação com padrões internos marcados com isótopos estáveis, são uma alternativa aos imunoensaios para medição quantitativa de proteínas. Essas abordagens não requerem o uso de anticorpos e, portanto, a análise pode ser realizada de maneira eficiente em termos de custo e tempo (ver, por exemplo, Addona et al ., Nat. Biotechnol., 27: 633–641, 2009; Kuzyk et al., Mol. Cell Proteomics, 8: 1860-1877, 2009; Paulovich et al., Proteomics Clin. Appl., 2: 1386-1402, 2008). Além disso, o MRM oferece recursos de multiplexação superiores, permitindo a quantificação simultânea de várias proteínas em paralelo. A teoria básica desses métodos foi bem estabelecida e amplamente utilizada para o metabolismo de drogas e a análise farmacocinética de pequenas moléculas.

[00141] Em outra modalidade, o nível de expressão de um gene NF de interesse é determinado medindo os níveis de RNA. Uma variedade de métodos adequados pode ser empregada para detectar e/ou medir o nível de expressão de mRNA de um gene. Por exemplo, a expressão de mRNA pode ser determinada usando Northern blot ou análise dot blot, transcriptase reversa-PCR (RT-PCR; por exemplo, RT-PCR quantitativo), hibridização in situ (por exemplo, hibridização quantitativa in situ) ou matriz de ácido nucleico (por exemplo, matrizes de oligonucleotídeos ou chips de genes). Os detalhes de tais métodos são descritos abaixo e em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition vol. 1, 2 e 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nova York, EUA, novembro de 1989; Gibson et al. (1999) Genome Res., 6 (10):995-1001; e Zhang et al. (2005) Environ. Sci. Technol., 39(8): 2777-2785; Publicação U.S.

2004086915; Patente Europeia 0543942; e Patente U.S. 7,101,663; as descrições de cada uma das quais são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[00142] Em um exemplo, a presença ou quantidade de uma ou mais populações de mRNA discretas em uma amostra biológica pode ser determinada pelo isolamento de mRNA total da amostra biológica (ver, por exemplo, Sambrook et al. (Supra) e Patente U.S. 6,812,341) e submeter o mRNA isolado a eletroforese em gel de agarose para separar o mRNA por tamanho. Os mRNAs separados por tamanho são então transferidos (por exemplo, por difusão) para um suporte sólido, como uma membrana de nitrocelulose. A presença ou quantidade de uma ou mais populações de mRNA na amostra biológica pode então ser determinada usando uma ou mais sondas polinucleotídicas marcadas de forma detectável, complementares à sequência de mRNA de interesse, que se ligam e, assim, tornam detectáveis suas populações de mRNA correspondentes. Os marcadores detectáveis incluem por exemplo,, fluorescente (por exemplo, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansil, aloficocianina (APC) ou ficoeritrina), luminescente (por exemplo, európio, térbio, nanopartículas de Qdot ™ fornecido pela Quantumicles Dot Corporation, Palo Alto, CA), marcadores radiológicos (por exemplo, 125I, 131 I, 35 S, 32 P, 33 P, ou 3H), e enzimáticos (peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta- galactosidase ou acetilcolinesterase).

[00143] Em outro exemplo, a presença ou quantidade de populações discretas de mRNA (por exemplo, mRNA codificado por um ou mais genes NF) em uma amostra biológica pode ser determinada usando matrizes de ácido nucleico (ou oligonucleotídeo). Por exemplo, o mRNA isolado de uma amostra biológica pode ser amplificado usando RT-PCR com, por exemplo, hexâmero aleatório ou oligo(dT) -iniciador mediada pela síntese da primeira fita. Os amplicons podem ser fragmentados em segmentos mais curtos. A etapa de RT-PCR pode ser usada para marcar os amplicons de forma detectável ou, opcionalmente, os amplicons podem ser marcados de forma detectável após a etapa de RT-PCR. Por exemplo, o marcador detectável pode ser enzimaticamente (por exemplo, por nick-translation ou quinase, como polinucleotídeo quinase T4) ou quimicamente conjugado aos amplicons usando qualquer uma de uma variedade de técnicas adequadas (ver, por exemplo, Sambrook et al., Supra) Os amplicons marcados de forma detectável são, então, colocados em contato com uma pluralidade de conjuntos de sondas polinucleotídicas, cada conjunto contendo um ou mais de uma sonda polinucleotídica (por exemplo, um oligonucleotídeo) específica para (e seja capaz de se ligar a) um amplicon correspondente, e onde a pluralidade contém muitos conjuntos de sondas, cada um correspondendo a um amplicon diferente. Geralmente, os conjuntos de sondas são ligados a um suporte sólido e a posição de cada conjunto de sondas é predeterminada no suporte sólido. A ligação de um amplicon marcado de forma detectável a uma sonda correspondente de um conjunto de sondas indica a presença ou quantidade de um mRNA alvo na amostra biológica. Métodos adicionais para detectar a expressão de mRNA usando matrizes de ácido nucleico são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5,445,934; 6,027,880; 6,057,100; 6,156,501; 6,261,776; e 6,576,424; as descrições de cada uma das quais são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[00144] Os métodos de detecção e/ou quantificação de uma marcação detectável ou material gerador de sinal dependem da natureza da marcação. Os produtos de reações catalisadas por enzimas apropriadas (em que o marcador detectável é uma enzima; ver acima) podem ser, sem limitação, fluorescentes, luminescentes ou radioativas ou podem absorver luz visível ou ultravioleta. Exemplos de detectores adequados para detectar tais marcadores detectáveis incluem, sem limitação, filme de raios X, contadores de radioatividade, contadores de cintilação, espetrofotômetros, colorímetros, fluorômetros, luminômetros e densitômetros.

[00145] Métodos para detectar ou medir a expressão do gene (por exemplo, expressão de proteína ou mRNA) podem ser realizados opcionalmente em formatos que permitem a preparação, processamento e análise rápida de amostras múltiplas. Isso pode ser, por exemplo, em placas de ensaio de múltiplos poços (por exemplo, 96 poços ou 386 poços) ou matrizes (por exemplo, chips de ácido nucleico ou chips de proteína). Soluções de estoque para vários reagentes podem ser fornecidas manualmente ou roboticamente, e preparação de amostra subsequente (por exemplo, RT-PCR, marcação ou fixação de células), pipetagem, diluição, mistura, distribuição, lavagem, incubação (por exemplo, hibridização), leitura de amostra, coleta de dados (dados ópticos) e/ou análise (análise de imagem auxiliada por computador) pode ser feita roboticamente usando software de análise disponível comercialmente, robótica e instrumentação de detecção capaz de detectar o sinal gerado a partir do ensaio. Exemplos de tais detectores incluem, mas não estão limitados a, espectrofotômetros, luminômetros, fluorímetros e dispositivos que medem o decaimento do radioisótopo. Ensaios baseados em células exemplares de alto rendimento (por exemplo, detecção da presença ou nível de uma proteína alvo em uma célula) podem utilizar a tecnologia ArrayScan® VTI HCS Reader ou KineticScan® HCS Reader (Cellomics Inc., Pittsburg, PA).

[00146] Em algumas modalidades, o nível de expressão de um gene NF, dois genes NF ou três genes NF pode ser avaliado e/ou medido.

[00147] Para auxiliar na detecção da presença ou nível de expressão de um ou mais dos genes NF, qualquer parte da sequência de ácido nucleico dos genes pode ser usada, por exemplo, como sondas de polinucleotídeo de hibridização ou iniciadores (por exemplo, para amplificação ou transcrição reversa). As sondas e iniciadores podem ser oligonucleotídeos de comprimento suficiente para fornecer hibridização específica para um RNA, DNA, cDNA ou seus fragmentos isolados de uma amostra biológica. Dependendo da aplicação específica, várias condições de hibridização podem ser empregadas para atingir vários graus de seletividade de uma sonda ou iniciador para a sequência alvo. Os iniciadores e as sondas podem ser marcados de forma detectável com reagentes que facilitam a detecção (por exemplo, marcadores fluorescentes, marcadores químicos (ver, por exemplo, Patentes U.S. Nº 4,582,789 e 4,563,417) ou bases modificadas).

[00148] As condições de rigor padrão são descritas por Sambrook, et al. (supra) e Haymes, et al. Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Para uma molécula de ácido nucleico servir como um iniciador ou sonda tal molécula precisa apenas ser suficientemente complementar na sequência para ser capaz de formar uma estrutura de cadeia dupla estável sob as condições de hibridização específicas (por exemplo concentrações de solvente e sal) empregadas.

[00149] A hibridação pode ser usada para avaliar a homologia entre duas sequências de ácidos nucleicos. Uma sequência de ácidos nucleicos descrita neste documento, ou um fragmento desta, pode ser usada como uma sonda de hibridização de acordo com técnicas de hibridização padrão. A hibridização de uma sonda de interesse (por exemplo, uma sonda contendo uma porção de uma sequência de nucleotídeos descrita neste documento ou seu complemento) com DNA, RNA, cDNA ou fragmentos destes de uma fonte de teste é uma indicação da presença de DNA ou RNA correspondente à sonda na fonte de teste. Condições de Hibridização são conhecidas por aqueles versados na técnica e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991. Condições de hibridização moderadas são definidas como hibridização em 2X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a 30 °C, seguida por uma lavagem em 1 X SSC, SDS a 0,1% a 50 °C. Condições altamente rigorosas são definidas como hibridização em 6X SSC a 45 °C, seguida por uma lavagem em 0,2 X SSC, SDS a 0,1% a 65 °C.

[00150] Os iniciadores podem ser usados em uma variedade de métodos do tipo PCR. Por exemplo, técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) podem ser usadas para amplificar sequências específicas de DNA, bem como RNA, incluindo sequências de DNA genômico total ou RNA celular total. Os iniciadores de PCR são projetados para flanquear a região que se deseja amplificar. Os iniciadores podem estar localizados perto da extremidade 5', da extremidade 3' ou em qualquer lugar dentro da sequência de nucleotídeos que deve ser amplificada. O comprimento do amplicon é ditado pelos objetivos experimentais. Para qPCR, o comprimento do alvo está mais próximo de 100 pares de bases e para PCR padrão, está perto de 500 pares de bases. De forma geral, as informações de sequência das extremidades da região de interesse ou além são empregadas para projetar iniciadores de oligonucleotídeo que são idênticos ou semelhantes em sequência às fitas opostas do modelo a ser amplificado. Os iniciadores de PCR podem ser sintetizados quimicamente como uma única molécula de ácido nucleico (por exemplo, usando síntese automática de DNA na direção 3' para 5' usando tecnologia de fosforamidita) ou como uma série de oligonucleotídeos. Por exemplo, podem ser sintetizados um ou mais pares de oligonucleotídeos longos (por exemplo, >100 nucleotídeos) que contêm a sequência desejada, com cada par contendo um segmento de complementaridade curto (por exemplo, cerca de 15 nucleotídeos) de modo que um duplex é formado quando o par de oligonucleotídeos é anelado. A DNA polimerase é usada para estender os oligonucleotídeos, resultando em uma única molécula de ácido nucleico de fita dupla por par de oligonucleotídeos.

[00151] Além disso, as sequências de ácidos nucleicos ou fragmentos destas (por exemplo, sondas de oligonucleotídeos) podem ser usados em matrizes de ácidos nucleicos para detecção e/ou quantificação de expressão gênica.

10. Métodos de Tratamento

[00152] Os métodos divulgados neste documento permitem avaliar se um sujeito com SMA ou com suspeita de ter SMA tem probabilidade de responder a uma terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®). Um sujeito com SMA ou com suspeita de ter SMA que provavelmente responderá à terapia de SMA pode ser tratado com a terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®). Por outro lado, um sujeito com SMA ou com suspeita de ter SMA que provavelmente não responderá a uma terapia de SMA pode ser tratado com uma terapia de SMA diferente que seja adequada para o tratamento de SMA.

[00153] Os métodos desta descrição também permitem a estratificação de sujeitos com SMA ou com suspeita de ter SMA em grupos de sujeitos que são mais propensos a se beneficiar, e grupos de sujeitos que são menos propensos a se beneficiar, do tratamento que compreende uma terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®) A capacidade de selecionar tais sujeitos a partir de um grupo de sujeitos com SMA que estão sendo considerados para tratamento com uma terapia de SMA é benéfica para a administração de um tratamento eficaz ao sujeito.

[00154] Os sujeitos que são considerados para o tratamento que compreende uma terapia de SMA incluem, mas não estão limitados a, sujeitos com suspeita de ter SMA ou com probabilidade de desenvolver

SMA. Em uma modalidade, o sujeito a ser tratado com uma terapia de SMA tem, é suspeito de ter, ou tem probabilidade de desenvolver SMA Tipo 0. Em uma modalidade, o sujeito a ser tratado com uma terapia de SMA tem, é suspeito de ter, ou tem probabilidade de desenvolver SMA Tipo I. Em uma modalidade, o sujeito a ser tratado com uma terapia de SMA tem, é suspeito de ter, ou tem probabilidade de desenvolver SMA Tipo II. Em uma modalidade, o sujeito a ser tratado com uma terapia de SMA tem, é suspeito de ter, ou tem probabilidade de desenvolver SMA Tipo III. Em uma modalidade, o sujeito a ser tratado com uma terapia de SMA tem, é suspeito de ter, ou tem probabilidade de desenvolver SMA Tipo IV.

[00155] Se o sujeito com SMA tem maior probabilidade de responder a uma terapia de SMA (com base nas concentrações de um ou mais dos biomarcadores descritos acima (por exemplo, proteína pNF-H)), o sujeito pode então ser tratado com uma quantidade eficaz da terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®). Uma quantidade eficaz do composto pode ser determinada adequadamente por um profissional de saúde levando em consideração, por exemplo, as características do paciente (idade, sexo, peso, raça, etc.), a progressão da doença e a exposição anterior à droga. Se o sujeito tem menos probabilidade de responder a uma terapia de SMA, o sujeito pode, então, ser opcionalmente tratado com uma terapia de SMA diferente.

[00156] Sujeitos de todas as idades podem ser afetados por SMA. Portanto, uma amostra biológica usada em um método descrito neste documento pode ser obtida de um sujeito humano de qualquer idade, incluindo um feto, um bebê, uma criança, um adolescente ou um adulto, tal como um adulto com SMA ou suspeito de ter SMA.

[00157] Os métodos também podem ser aplicados a sujeitos em risco de desenvolver SMA tratável por uma terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®). Tais sujeitos incluem aqueles que possuem (i)

um histórico familiar de (uma predisposição genética para) tais distúrbios ou (ii) um ou mais fatores de risco para o desenvolvimento de tais distúrbios.

[00158] Após estratificar ou selecionar um sujeito com base em se o sujeito terá mais ou menos probabilidade de responder a uma terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®), um profissional de saúde (por exemplo, um médico) pode administrar a modalidade terapêutica apropriada ao sujeito. Métodos de administração de terapias de SMA são conhecidos na técnica.

[00159] Entende-se que qualquer terapia descrita neste documento (por exemplo, uma terapia que compreende SPINRAZA® ou uma terapia que não compreende SPINRAZA®) pode incluir um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Ou seja, qualquer terapia descrita neste documento pode ser coadministrada (administrada em combinação) com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tais como, mas não se limitando a, outras terapias de SMA descritas neste documento. Além disso, qualquer terapia descrita neste documento pode incluir um ou mais agentes para tratamento, ou mais efeitos colaterais de uma terapia que compreende a terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®).

[00160] Terapias de combinação (por exemplo, coadministração de uma terapia de SMA compreendendo (por exemplo, SPINRAZA®) e uma ou mais terapias de SMA adicionais ou agentes terapêuticos adicionais) podem ser, por exemplo, simultâneas ou sucessivas. Por exemplo, uma terapia de SMA e o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(is) podem ser administrados ao mesmo tempo ou em momentos diferentes. Em algumas modalidades, os um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados em primeiro lugar e a terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®) administrada em segundo lugar.

[00161] Nos casos em que o sujeito com SMA e com previsão de resposta a uma terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®) já foi tratado com a terapia de SMA anteriormente, a terapia pode substituir ou aprimorar uma terapia administrada anteriormente ou atualmente. Por exemplo, após o tratamento com SPINRAZA®, a administração de uma terapia não-SPINRAZA® pode cessar ou diminuir, por exemplo, ser administrada em níveis mais baixos. A administração da terapia anterior pode ser mantida enquanto a terapia que compreende SPINRAZA® é administrada. Em algumas modalidades, uma terapia anterior pode ser mantida até que o nível de SPINRAZA® atinja um nível suficiente para fornecer um efeito terapêutico.

[00162] Em alguns casos, o método de tratamento envolve o tratamento de um feto in utero. Determinou-se que o feto a ser tratado necessita de tratamento com uma terapia de SMA baseada em níveis elevados de NF (por exemplo, pNF-H ou NF-L) em comparação com um controle. Se, por exemplo, o feto foi identificado como portador de SMA com base em testes genéticos e foi identificado como tendo níveis elevados de NF, o feto pode ser tratado com uma terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®). Em alguns casos, o método de tratamento se refere a pacientes de Tipo 0. Se um feto for identificado com níveis muito altos de NF e uma cópia de SMN2, as chances são altas de que o feto tenha SMA Tipo 0. O tratamento desse feto no pré-natal com uma terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®) pode tratar esse feto com eficácia.

11. Kits

[00163] Essa descrição também fornece kits. Em certas modalidades, o kit pode incluir um anticorpo ou anticorpos que podem ser usados para detectar um ou mais dos biomarcadores divulgados neste documento ou sua concentração ou níveis de expressão. Por exemplo, o kit pode incluir um anticorpo que se liga especificamente a

NF-H (por exemplo, pNF-H). Os anticorpos no kit podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser ainda conjugados com um marcador detectável. Em algumas modalidades, o kit inclui sondas que podem ser usadas para identificar ou detectar qualquer um dos biomarcadores divulgados neste documento. Em algumas modalidades, o kit inclui qualquer uma das matrizes de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, o kit inclui sondas e anticorpos que podem ser usados para identificar ou detectar qualquer um dos biomarcadores divulgados neste documento ou sua expressão ou níveis de expressão. Os kits podem, opcionalmente, conter instruções para detectar e/ou medir a concentração de uma ou mais proteínas ou os níveis de mRNA em uma amostra biológica.

[00164] Os kits podem incluir opcionalmente, por exemplo, um controle (por exemplo, um padrão de concentração para a proteína sendo avaliada) ou conjunto de amplicon marcado por controle contendo quantidades conhecidas de um ou mais amplicons reconhecidos por sondas de ácido nucleico da matriz. Em alguns casos, o controle pode ser uma inserção (por exemplo, uma inserção de papel ou meio eletrônico, como um CD, DVD ou disquete) contendo um nível de expressão ou faixas de nível de expressão de uma ou mais proteínas (por exemplo, pNF-H) ou RNAs preditivos de SMA ou de responsividade a uma terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®).

[00165] Em algumas modalidades, os kits podem incluir um ou mais reagentes para processamento de uma amostra biológica (por exemplo, reagentes de calibração, tampões, diluentes, reagentes de cor, reagentes para interromper uma reação). Por exemplo, um kit pode incluir reagentes para isolar uma proteína de uma amostra biológica e/ou reagentes para detectar a presença e/ou quantidade de uma proteína em uma amostra biológica (por exemplo, um anticorpo que se liga à proteína que é o foco do ensaio de detecção e/ou um anticorpo que se liga ao anticorpo que se liga à proteína).

[00166] Em certas modalidades, o kit inclui pelo menos uma microplaca (por exemplo, uma placa de 96 poços; ou seja, 12 tiras de 8 poços). A microplaca pode ser fornecida com sua tampa de placa correspondente. A microplaca pode ser de poliestireno ou de qualquer outro material adequado. A microplaca pode possuir o anticorpo que é usado para identificar a presença de um determinado biomarcador revestido dentro de cada poço. O anticorpo pode ser conjugado a um marcador detectável. O kit também pode incluir pelo menos uma tira adesiva.

[00167] Em algumas modalidades, os kits podem incluir um pacote de software para analisar os resultados de, por exemplo, um perfil de expressão ou uma análise de microarranjos.

[00168] Os kits também podem incluir um ou mais anticorpos para detectar a expressão da proteína de qualquer um dos genes descritos neste documento (por exemplo, NF-H). Por exemplo, um kit pode incluir (ou em alguns casos consistir em) um ou uma pluralidade de anticorpos capazes de se ligarem especificamente a uma ou mais proteínas codificadas por qualquer um dos genes descritos neste documento e, opcionalmente, instruções para detectar e/ou medir a concentração de uma ou mais proteínas e/ou um anticorpo de detecção compreendendo um anticorpo marcado de forma detectável que é capaz de se ligar a pelo menos um anticorpo da pluralidade. Em algumas modalidades, os kits podem incluir anticorpos que reconhecem NF-H, NF-L e/ou NF-M. Em algumas modalidades, os kits podem incluir anticorpos que reconhecem pNF-H.

[00169] Em certas modalidades, o kit também pode incluir opcionalmente uma ou mais doses unitárias de uma terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®).

[00170] Os kits descritos neste documento também podem,

opcionalmente, incluir instruções para a administração de uma terapia de SMA, em que a concentração de uma ou mais proteínas ou o nível de expressão de um ou mais RNAs prevê que um sujeito com SMA ou suspeito de ter SMA responderá a uma terapia de SMA (por exemplo, SPINRAZA®).

[00171] Em uma modalidade específica, o kit compreende um ou mais dos seguintes: (i) uma microplaca (por exemplo, uma placa de 96 poços). A microplaca pode ser revestida com um anticorpo anti-NF-H que é conjugado com um marcador detectável. O anticorpo anti-NF-H pode ser monoclonal ou policlonal. O anticorpo pode ser , por exemplo, de camundongo, coelho, rato ou porquinho da índia. O marcador detectável pode ser, por exemplo, peroxidase de rábano, biotina, uma fração fluorescente, uma fração radioativa, uma tag de histidina ou uma tag de peptídeo. A microplaca pode ser fornecida com uma tampa e, opcionalmente, uma ou mais fitas adesivas. (ii) um frasco contendo anti-NF-H conjugado com um marcador detectável. O marcador detectável pode ser, por exemplo, peroxidase de rábano, biotina, uma fração fluorescente, uma tag de histidina, uma tag de peptídeo. O frasco também pode incluir um conservante. (iii) um frasco contendo um padrão NF-H de concentração conhecida. O NF-H pode ser um NF-H humano recombinante. (iv) um frasco contendo um diluente de ensaio. (v) um frasco contendo um diluente calibrador. (vi) um frasco contendo tampão de lavagem. O tampão pode ser fornecido como um concentrado. (vii) um ou mais frascos contendo reagentes coloridos. (viii) um frasco contendo uma solução de interrupção para interromper a reação colorimétrica.

[00172] Os exemplos seguintes são fornecidos para melhor ilustrar a invenção reivindicada e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção. No que diz respeito ao materiais específicos mencionados, estes são meramente para fins de ilustração e não se destinam a limitar a invenção. Uma pessoa versada na técnica podem desenvolver meios ou reagentes equivalentes sem o exercício da capacidade inventiva e sem se afastar do escopo da invenção.

EXEMPLOS

[00173] Os Exemplos abaixo referem-se a vários estudos clínicos designados: NURTURE, ENDEAR, EMBRACE e CHERISH.

[00174] ENDEAR, foi um estudo de Fase 3, multicêntrico, randomizado, duplo-cego, controlado por procedimento simulado de ISIS 396443 em sujeitos com SMA infantil sintomática. Os resultados da análise final para este estudo fornecem evidências claras de que os sujeitos tratados com ISIS 396443 intratecal (IT) alcançaram uma melhora estatisticamente significativa e clinicamente relevante na aquisição de marcos motores, bem como melhorias sustentadas e clinicamente relevantes na sobrevida sem eventos, na sobrevida geral, na função motora e na saúde do neurônio motor em comparação com um grupo de controle de sujeitos que receberam um procedimento simulado. A melhora em relação ao controle foi observada 2 meses após o início do tratamento (final do período de dose de ataque) com separação clara do controle 6 meses após o início do tratamento.

[00175] No momento da análise final, 121 sujeitos haviam recebido pelo menos 1 dose de ISIS 396443 administrada como injeção IT por punção lombar (LP) [n=80] ou procedimento simulado (n=41). Dentre esses sujeitos, 89 sujeitos (65 no grupo de ISIS 396443 e 24 no grupo de controle) haviam completado o estudo. Um total de 42 sujeitos (32 sujeitos no grupo de ISIS 396443 e 10 sujeitos no grupo de controle) permaneceram no estudo no momento em que o estudo foi encerrado e foram registrados como tendo descontinuado o tratamento devido ao encerramento precoce do estudo. Dois sujeitos no grupo de ISIS 396443 e 1 sujeito no grupo de controle retiraram-se voluntariamente do estudo antes da transição para o tratamento aberto, e 29 sujeitos (13 no grupo de ISIS 396443 e 16 no grupo de controle) morreram.

[00176] Os dados demográficos e o histórico de SMA dos 121 sujeitos neste Estudo foram consistentes com uma população com SMA Tipo I. • Havia 45% do sexo masculino e 55% do sexo feminino; 86% dos sujeitos eram brancos. • A maioria dos sujeitos (86%) teve surgimento dos sintomas com menos de 12 semanas de idade. A idade média foi de 8,0 semanas (intervalo: 1 a 20 semanas) no surgimento dos sintomas de SMA, 12,0 semanas (intervalo: 0 a 30 semanas) no diagnóstico de SMA e 166 dias (intervalo: 20 a 211 dias) na triagem. A duração mediana da doença no momento de ingresso no estudo foi de 13,1 semanas (intervalo: 0,0 a 25,86 semanas). • A maioria dos sujeitos (99%) tinha 2 cópias do gene SMN2 por teste de laboratório local no início do estudo. • Dentre os 80 sujeitos no grupo de ISIS 396443, 73 (91%) haviam recebido pelo menos 4 doses de ISIS 396443 (ou seja, completaram a fase de dose de ataque); 32 sujeitos (40%) receberam todas as 6 doses planejadas. Dos 41 sujeitos no grupo de controle, 34 sujeitos (83%) tiveram pelo menos 4 procedimentos simulados, com 14 sujeitos (34%) sendo submetidos a todos os 6 procedimentos.

[00177] CHERISH, foi um estudo de Fase 3, duplo-cego, randomizado e controlado por procedimento simulado de ISIS 396443 em sujeitos com SMA de surgimento tardio. Aproximadamente 117 sujeitos foram incluídos no estudo e alocados para tratamento com ISIS 396443 ou controle simulado em uma proporção de 2:1. ISIS 396443 foi administrado por via IT usando uma dose de carga (dosagem nos Dias 1, 29 e 85), seguido por uma dose de manutenção 6 meses depois (dosagem no dia 274).

[00178] Os resultados da análise interina fornecem evidências claras de que os sujeitos tratados com ISIS 396443 IT obtiveram ganhos estatisticamente significativos na função motora, bem como melhoras contínuas e clinicamente significativas nos marcos motores em comparação com um grupo de controle de sujeitos que receberam um procedimento simulado. Embora a melhora na função motora tenha sido observada em todos os momentos, a separação do grupo de controle ocorreu claramente 6 meses após o início do tratamento. Com base em uma avaliação de risco-benefício de ISIS 396443, o Patrocinador decidiu encerrar o estudo precocemente, e os sujeitos tiveram a oportunidade de ingressar em um estudo de extensão aberto.

[00179] A partir da análise interina, 126 sujeitos haviam recebido pelo menos 1 dose de ISIS 396443 (n=84) ou procedimento simulado (n=42). Nenhum sujeito interrompeu o tratamento ou abandonou o estudo. A partir da data de corte de dados, 49 dos 84 sujeitos (58%) no grupo de ISIS 396443 e 23 dos 42 sujeitos (55%) no grupo de controle continuavam no estudo. A análise primária da mudança da avaliação inicial na pontuação do HFMSE em 15 meses foi baseada no Conjunto ITT composto por 126 sujeitos, 84 tratados com ISIS 396443 e 42 que foram submetidos ao procedimento simulado. A análise principal de marcos motores da OMS foi realizada usando o Interim Efficacy Set, que era composto por 54 sujeitos (35 sujeitos tratados com ISIS 396443 e 19 sujeitos submetidos ao procedimento simulado) que tiveram a oportunidade de serem avaliados na Visita do Dia 456 (ou seja, Mês 15). Todas as outras análises de critério de avaliação secundário e terciário foram realizadas no Conjunto ITT.

[00180] Os dados demográficos e as características de avaliação inicial da doença, incluindo histórico de SMA e histórico médico, dos 126 sujeitos neste Estudo foram consistentes com uma população com alta probabilidade de desenvolver SMA Tipo II ou III. • Havia 47% do sexo masculino e 53% do sexo feminino; 75% eram brancos. • A idade mediana foi de 11 meses (intervalo: 6 a 20) no surgimento dos sintomas de SMA, 18 meses (intervalo: 0 a 48 meses) no diagnóstico de SMA e 3,0 anos (intervalo: 2 a 9 anos) na triagem. A duração mediana da doença no momento de ingresso no estudo foi de 35,7 meses (intervalo: 8 a 94 meses). • A maioria dos sujeitos (88%) tinha 3 cópias do gene SMN2 por testes de laboratório na entrada do estudo, e 8% dos sujeitos tinha 2 cópias. • Entre os 84 sujeitos do grupo de ISIS 396443, todos haviam recebido pelo menos 3 doses de ISIS 396443 (isto é, completaram as doses de ataque), 76 sujeitos (90%) receberam todas as 4 doses. Dos 42 sujeitos no grupo controle, todos os sujeitos haviam recebido pelo menos três procedimentos simulados, com 40 sujeitos (95%) sendo submetidos aos quatro procedimentos. • O tempo mediano no estudo foi semelhante entre os 2 grupos de tratamento (ou seja, 412,5 e 419,5 dias para os grupos de ISIS 396443 e os grupos de controle, respectivamente). O número total de anos no estudo dos sujeitos foi 134,06 (88,84 anos dos sujeitos no grupo de ISIS 396443 e 45,22 anos dos sujeitos no grupo de controle).

[00181] Os sujeitos tratados com ISIS 396443 atingiram benefícios clinicamente significativos em comparação com os sujeitos que receberam um procedimento simulado. Esses benefícios incluíram ganhos estatisticamente significativamente maiores na função motora conforme medido pela HFMSE, bem como uma melhora na capacidade funcional dos membros superiores.

[00182] NURTURE é um estudo de Fase 2, aberto, multicêntrico e de ramo único em andamento para avaliar a eficácia, segurança, tolerabilidade e farmacocinética (PK) de ISIS 396443 na SMA pré- sintomática. O estudo está sendo conduzido em sujeitos com ≤6 semanas de idade no momento de ingresso no estudo com documentação genética de 5q SMA, 2 ou 3 cópias do gene SMN2, CMAP ≥1 mV e ausência de sinais ou sintomas de SMA. Até 25 sujeitos são planejados. Os dados de eficácia disponíveis até o momento indicam que o desenvolvimento e a realização de marcos motores para a maioria dos sujeitos foram mais consistentes com o desenvolvimento normal do que com o histórico natural de SMA Tipo I.

[00183] No momento do corte de dados para NURTURE, 20 sujeitos haviam ingressado e receberam pelo menos 1 dose de ISIS 396443. Todos os sujeitos continuam no estudo. Dezoito sujeitos que receberam todas as 4 doses de ataque ou que tiveram a oportunidade de completar a visita do Dia 64 compreendem o conjunto de eficácia. • A maioria dos sujeitos são do sexo masculino (55%) e brancos (50%). • A idade na primeira dose variou de 3 a 42 dias, com uma mediana de 19 dias. • Dos 18 sujeitos, 13 sujeitos (72%) têm 2 cópias do gene SMN2 e 5 sujeitos (28%) têm 3 cópias.

[00184] Os dados de eficácia estavam disponíveis para 18 sujeitos no Dia 64, 16 sujeitos no Dia 183, 11 sujeitos no Dia 302, 9 sujeitos no Dia 365 e 5 sujeitos no Dia 421. Os resultados nas últimas visitas demonstram um desenvolvimento que é inconsistente com a SMA Tipo I e com a experiência dos irmãos afetados dos sujeitos e consistente com as expectativas correspondentes à idade para bebês saudáveis.

[00185] EMBRACE, é um estudo de Fase 2, randomizado, controlado por procedimento simulado, multicêntrico de ISIS 396443 em sujeitos com SMA que não são elegíveis para participar do ENDEAR ou CHERISH. Este estudo avaliou um conjunto único de sujeitos que exibiram sintomas de SMA de surgimento precoce, em uma idade muito jovem para serem elegíveis para o CHERISH, ou sujeitos que exibiram sintomas de SMA de surgimento tardio, em uma idade muito velha para serem elegíveis para o ENDEAR, e foram triados em uma idade muito velha ou tinham muitas cópias de SMN2 para serem elegíveis para o ENDEAR. Assim, a população neste estudo forneceu a oportunidade de explorar a segurança, a tolerabilidade e a eficácia de ISIS 396443 no contexto de SMA de surgimento precoce e de SMA de surgimento tardio em sujeitos com até 3 cópias de SMN2.

[00186] Este estudo foi inicialmente projetado como um estudo duplo-cego, mas evoluiu para um estudo de 2 partes, incluindo uma fase duplo-cega (Parte 1) e uma fase de extensão aberta (Parte 2) após serem observados os resultados de eficácia positiva e robusta de um estudo principal no programa de desenvolvimento clínico de ISIS

396443. A Parte 1 foi um estudo controlado randomizado, duplo-cego de procedimento simulado. Vinte e um sujeitos ingressaram no estudo em 7 locais nos Estados Unidos e na Alemanha. A randomização de sujeitos foi estratificada com base na idade de SMA (surgimento precoce [≤6 meses] vs. surgimento tardio [>6 meses]). Os sujeitos foram programados para receber um total de 6 injeções intratecais (IT) ou 6 procedimentos simulados durante o período de dosagem de aproximadamente 10 meses. No entanto, a Parte 1 do estudo foi encerrada precocemente devido aos resultados de eficácia positiva e robusta observados em uma análise interina de um dos estudos principais para o programa de desenvolvimento clínico de ISIS 396443. Como resultado da decisão do Patrocinador do estudo de encerrar a Parte 1 do estudo precocemente com base na avaliação de risco- benefício de ISIS 396443, todos os sujeitos foram convidados a completar as análises da Avaliação do Fim da Parte 1 antecipadamente e participar da Parte 2 do estudo. A duração total da participação do sujeito na Parte 1 foi planejada para ser de aproximadamente 15 meses, mas como a Parte 1 do estudo foi encerrada precocemente, os sujeitos elegíveis tiveram a oportunidade de ingressar na Parte 2 do estudo imediatamente após suas análises da Avaliação do Fim da Parte 1.

[00187] Um total de 21 sujeitos foram recrutados para esse estudo. Os sujeitos foram randomizados para ISIS 396443 ou controle (procedimento simulado) em uma proporção de 2:1. A randomização foi estratificada com base na idade de surgimento dos sinais e sintomas clínicos consistentes com SMA (≤6 meses [surgimento precoce] vs.> 6 meses [surgimento tardio]). Quatorze sujeitos receberam ISIS 396443 na Parte 1 do estudo e 7 sujeitos receberam o procedimento simulado.

[00188] Um total de 21 sujeitos foram triados e ingressaram na Parte 1 deste estudo. Todos os sujeitos foram randomizados em uma proporção de 2:1: 14 sujeitos receberam ISIS 396443 e 7 sujeitos receberam tratamento de controle (procedimento simulado). Além disso, a randomização foi estratificada com base na idade de surgimento dos sinais e sintomas clínicos consistentes com o surgimento precoce (≤6 meses) e o surgimento tardio (>6 meses) da SMA. O primeiro sujeito foi tratado em 19 de agosto de 2015, e o final do estudo (Parte 1) foi em 20 de dezembro de 2016. Todos os sujeitos receberam o tratamento do estudo de acordo com sua atribuição de randomização.

[00189] Os 21 sujeitos randomizados e dosados que compunham o conjunto ITT foram recrutados em 7 centros de estudo em 2 países. Dezesseis sujeitos (76%) foram inscritos em 6 locais nos Estados Unidos, e 5 sujeitos (24%) foram inscritos em 1 local na Alemanha. Os sujeitos foram randomizados em vários locais. Dos 21 sujeitos randomizados, 13 tiveram surgimento da SMA em ≤6 meses, e os 8 sujeitos restantes tiveram surgimento da SMA em >6 meses.

[00190] Vinte e um sujeitos receberam tratamento e, destes, 14 sujeitos completaram devido ao término precoce do estudo (6 sujeitos [86%] no grupo de controle e 8 sujeitos [57%] no grupo de ISIS 396443). Nove sujeitos (43%) completaram o tratamento até o Dia 302 (2 sujeitos [29%] no grupo de controle e 7 sujeitos [50%] no grupo de ISIS 396443). Seis sujeitos (29%), todos no grupo de ISIS 396443, completaram a Avaliação de Acompanhamento Final da Parte 1 (Dia 422). Um sujeito (5%) designado para o grupo de controle morreu devido a morte cerebral no Dia de Estudo 289.

[00191] Dados Demográficos e Características da Avaliação Inicial:

[00192] Dos 21 sujeitos no estudo, 11 (52%) eram do sexo masculino e 10 (48%) do sexo feminino. A idade na primeira dose variou de 7 a 53 meses (mediana: 17 meses). Onze sujeitos (52%) tinham entre 7 e 18 meses de idade, e 10 sujeitos (48%) tinham mais de 18 meses de idade. Nove sujeitos (43%) eram Brancos, 5 sujeitos (24%) eram Asiáticos e 2 sujeitos (10%) eram Outros. Eficácia e Farmacocinética • Os sujeitos no grupo de ISIS 396443 exigiram menos uso de ventilador do que os sujeitos no grupo de controle. • A proporção de respondentes de marco motor HINE foi maior no grupo de ISIS 396443 do que no grupo de controle e havia pelo menos 1 respondente em cada categoria de marco motor HINE do grupo de ISIS 396443, com o maior número de sujeitos mostrando melhora nas categorias de controle da cabeça, rolar e sentar. Segurança

[00193] Neste estudo, o ISIS 396443 foi bem tolerado quando administrado como múltiplas injeções IT (4 doses de ataque seguidas por doses de manutenção a cada 4 meses). Nenhuma nova questão de segurança foi identificada no perfil de segurança geral do ISIS 396443.

[00194] Os resultados da Parte 1 deste estudo de Fase 2,

randomizado e controlado por procedimento simulado de ISIS 396443 mostraram evidências claras de que a administração intratecal de ISIS 396443 é eficaz em uma população de sujeitos com SMA de surgimento precoce ou de surgimento tardio. Quando comparados com um grupo de controle de sujeitos de estudo que receberam apenas administração simulada, os sujeitos tratados com ISIS 396443 alcançaram e sustentaram ganhos em marcos motores e, com base nas análises do investigador e do cuidador, geralmente pareciam crescer e prosperar. Foi observada uma correlação positiva entre a concentração de ISIS 396443 no LCR e a pontuação total do marco motor HINE, que aumentou com o tempo. O regime de dosagem de ISIS 396443 foi seguro e bem tolerado neste estudo, uma vez que não foram identificados novas questões de segurança, e os resultados de segurança foram consistentes com resultados de outros estudos no programa de desenvolvimento clínico de ISIS 396443. Com base nos resultados observados em todos os parâmetros de segurança primária e eficácia exploratória, e, em contraste com os resultados observados no grupo de controle não tratado, o ISIS 396443 melhora a função motora em sujeitos com SMA de surgimento precoce e de surgimento tardio. Métodos

[00195] O plasma em momentos selecionados foi testado para detectar a concentração de pNF-H. Todas as amostras de plasma foram congeladas a -70 °C até estarem prontas para uso. As amostras de plasma no tempo do cronograma selecionado foram diluídas na diluição mínima necessária (MRD) usando tampão de diluição de ensaio.

[00196] O NF-H foi testado usando anticorpos policlonais anti-NF-H da Encor Biotechnology (Cat # RPCA-NF-H; e/ou Cat # CPCA-NF-H). Esses anticorpos detectam especificamente a forma hiperfosforilada de NF-H.

[00197] Um experimento de qualificação foi conduzido antes de qualquer amostra de paciente ser analisada. Tal experimento teve como objetivo avaliar a reprodutibilidade e variabilidade da concentração de pNF-H gerada pela plataforma de tecnologia Ella desenvolvida pela ProteinSimple®. A tecnologia Ella utiliza cartuchos microfluídicos que incluem reagentes pré-carregados para que apenas as amostras e o tampão de lavagem sejam carregados no cartucho. Assim que o cartucho estiver carregado, a plataforma calculará automaticamente a concentração de pNF-H ao usar sua curva padrão calibrada de fábrica.

[00198] Para avaliar a qualidade de cada cartucho, bem como quaisquer efeitos de confusão potenciais imprevistos em tempo real, 4 amostras de controle de qualidade (QC) são incluídas em cada cartucho: três QC com adição de tampão, alto, médio e baixo, e uma amostra de controle de qualidade endógeno (EQC) de um paciente com Esclerose Múltipla (MS) comercialmente disponível (Bioreclamation) é executada. Esses quatro QCs são usados para monitorar o desempenho do método bioanalítico e para analisar a integridade e a validade dos resultados das amostras desconhecidas analisadas em um lote individual.

[00199] Amostras dos mesmos sujeitos foram analisadas no mesmo cartucho. Duas alíquotas para cada amostra foram colocadas no mesmo cartucho em uma ordem aleatória para garantir que a análise das amostras levasse em consideração o possível efeito de colocação. Exemplo 1: Correlação de Níveis de pNF-H no LCR vs. Plasma

[00200] Amostras de plasma e LCR dos estudos clínicos NURTURE e EMBRACE foram analisadas no mesmo momento e no mesmo sujeito para determinar a correlação nos níveis de pNF-H. Foi identificada uma alta correlação (R=0,88) entre os níveis de pNF-H no LCR e no plasma (Fig. 1). Este resultado sugere que os níveis plasmáticos de pNF-H e outras subunidades do neurofilamento são altamente preditivos dos níveis no LCR dessas mesmas proteínas. Exemplo 2: Níveis Plasmáticos de pNF-H como Preditor de Doença e Gravidade

[00201] Amostras de plasma dos estudos clínicos NURTURE, ENDEAR, EMBRACE e CHERISH foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H na avaliação inicial (antes do tratamento com ISIS 396443 (NURTURE, ENDEAR, EMBRACE e CHERISH) ou do procedimento SHAM (ENDEAR, EMBRACE e CHERISH)). Amostras de plasma de voluntários saudáveis (idade 4-18 anos) também foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H.

[00202] Os resultados de voluntários de saúde demonstraram pNF- H <300 pg/mL para todas as idades. Os resultados de NURTURE, ENDEAR, EMBRACE, CHERISH demonstram que os níveis plasmáticos de pNF-H em sujeitos de ensaios clínicos com SMA são quase todos >300 pg/mL. Alguns sujeitos apresentam níveis de até aproximadamente 50.000 pg/mL. Em geral, sujeitos com duas cópias de SMN2 têm níveis mais altos do que sujeitos com três cópias de SMN2. Além disso, os sujeitos com surgimento dos sintomas em ≤6 meses de idade (ENDEAR) têm níveis mais elevados do que os sujeitos com surgimento dos sintomas em >6 meses de idade (CHERISH). Ver Fig.

2.

[00203] No entanto, exceções importantes são observadas. No NURTURE, um sujeito tem duas cópias de SMN2 e um nível de pNF-H mais consistente com sujeitos com 3 cópias de SMN2. Este sujeito tem um irmão que também possui duas cópias de SMN2 que desenvolveu SMA Tipo II. Portanto, embora este sujeito tenha um número de cópias de SMN2 que sugere que o sujeito deve desenvolver SMA Tipo I, o sujeito tem um histórico familiar que sugere que o sujeito desenvolverá SMA Tipo II. O nível de pNF-H pode fornecer perspicácia diagnóstica adicional além da deleção de SMN1 e do número de cópias de SMN2.

No ENDEAR, um sujeito possui três cópias de SMN2 e um nível de pNF- H mais consistente com sujeitos com 2 cópias de SMN2. Este sujeito teve surgimento dos sintomas em ≤6 meses de idade e, portanto, foi mais consistente com SMA Tipo I (mais frequentemente 2 cópias de SMN2) do que SMA Tipo II (mais frequentemente 3 cópias de SMN2).

[00204] No geral, os resultados demonstram que dentre os sujeitos com SMA, os níveis plasmáticos de pNF-H são significativamente elevados em comparação com voluntários saudáveis. E, dentre os sujeitos com SMA, os sujeitos com um fenótipo mais grave possuem níveis plasmáticos de pNF-H mais elevados do que os sujeitos com um fenótipo menos grave. Exemplo 3: Correlação de pNF-H Versus Idade (Número de Cópias de SMN2 = 2)

[00205] Amostras de plasma dos estudos clínicos NURTURE, ENDEAR, EMBRACE e CHERISH foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H na avaliação inicial (antes do tratamento com ISIS 396443 (NURTURE, ENDEAR, EMBRACE e CHERISH) ou do procedimento SHAM (ENDEAR, EMBRACE e CHERISH)). Para esta análise, os sujeitos foram limitados àqueles com duas cópias de SMN2. Os níveis de pNF-H transformados por log de avaliação inicial foram plotados versus idade na primeira dose (ou procedimento SHAM). Em geral, sujeitos mais jovens apresentaram níveis mais altos de pNF-H do que sujeitos mais velhos. Ver Fig. 3.

[00206] Este resultado sugere que os níveis de pNF-H diminuem com o aumento da idade entre os sujeitos com 2 cópias de SMN2. Exemplo 4: Correlação de pNF-H Versus Idade (Número de Cópias de SMN2 = 3)

[00207] Amostras de plasma dos estudos clínicos NURTURE, ENDEAR, EMBRACE e CHERISH foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H na avaliação inicial (antes do tratamento com ISIS 396443

(NURTURE, ENDEAR, EMBRACE e CHERISH) ou do procedimento SHAM (ENDEAR, EMBRACE e CHERISH)). Para esta análise, os sujeitos foram limitados àqueles com três cópias de SMN2. Os níveis de pNF-H transformados por log de avaliação inicial foram plotados versus idade na primeira dose (ou procedimento SHAM). Em geral, sujeitos mais jovens apresentaram níveis mais altos de pNF-H do que sujeitos mais velhos. Ver Fig. 4.

[00208] Este resultado sugere que os níveis de pNF-H diminuem com o aumento da idade entre os sujeitos com três cópias de SMN2. Exemplo 5: Correlação de pNF-H Versus Idade

[00209] Amostras de plasma dos estudos clínicos NURTURE, ENDEAR, EMBRACE e CHERISH foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H na avaliação inicial (antes do tratamento com ISIS 396443 (NURTURE, ENDEAR, EMBRACE e CHERISH) ou do procedimento SHAM (ENDEAR, EMBRACE e CHERISH)). Para esta análise, os sujeitos foram estratificados por idade de surgimento dos sintomas (pré- sintomático (NURTURE), <6 meses, ≥6 meses) e pelo número de cópias de SMN2 (2, 3, 4 ou NA). Em geral, os sujeitos mais jovens tinham níveis mais elevados de pNF-H do que os sujeitos mais velhos em cada classificação de idade de surgimento dos sintomas e número de cópias de SMN2. Ver Fig. 5.

[00210] Esse resultado sugere que os níveis de pNF-H diminuem quanto maior for a idade entre os sujeitos, independentemente da idade de surgimento dos sintomas ou do número de cópias de SMN2. Exemplo 6: Correlação de pNF-H Versus Idade

[00211] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H na avaliação inicial (antes do tratamento com ISIS 396443 ou do procedimento SHAM). Para esta análise, quartis de pNF-H foram identificados em toda a população do estudo. Os quartis foram definidos como 2.390 a 10.900 pg/mL; 10.900 a 15.400 pg/mL; 15.400 a 21.600 pg/mL; e 21.600 a 50.100 pg/mL. Em geral, os sujeitos com níveis mais elevados de pNF-H na avaliação inicial pareciam ser mais jovens na primeira dose, mais jovens no surgimento dos sintomas e mais jovens no diagnóstico de SMA. Além disso, os sujeitos com níveis mais elevados de pNF-H na avaliação inicial pareceram ter pontuações médias menores no CHOP INTEND (Teste Infantil de Doenças Neuromusculares do Hospital Infantil da Filadélfia) e amplitudes de CMAP peroneais na avaliação inicial. Ver Figs. 6-8.

[00212] Esses resultados sugerem que níveis mais elevados de pNF- H na primeira dose estão associados a um fenótipo mais grave, conforme demonstrado como uma idade mais jovem no surgimento dos sintomas; função motora inferior (CHOP INTEND); e pior saúde do neurônio motor (amplitude de CMAP). Exemplo 7: Níveis de pNF-H e Função Motora

[00213] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H na avaliação inicial (antes do tratamento com ISIS 396443 ou do procedimento SHAM). Para esta análise, os níveis de pNF-H transformado por log foram plotados em relação ao CHOP INTEND de avaliação inicial. Em geral, sujeitos com níveis mais altos de pNF-H tinham CHOP INTEND mais baixo, e os sujeitos com níveis mais baixos de pNF-H tinham CHOP INTEND mais alto com uma correlação de -0,3. Ver a Fig. 9.

[00214] Esse resultado sugere que os níveis de pNF-H estão inversamente associados à função motora. Essa relação parece ser linear. Exemplo 8: Predição da Função Motora com Base nos Níveis pNF-

H

[00215] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H na avaliação inicial (antes do tratamento com ISIS 396443 ou do procedimento SHAM). Para esta análise, um modelo de regressão linear foi construído para examinar a relação entre vários preditores potenciais de CHOP INTEND de avaliação inicial. Um modelo final foi identificado que incluiu apenas as variáveis que permaneceram estatisticamente significativas (NF-H de avaliação inicial; grupo de tratamento, duração da doença (semanas); sexo; idade na primeira dose (dias); idade no surgimento dos sintomas de SMA (semanas); idade no Diagnóstico de SMA (semanas); idade gestacional (semanas); peso de avaliação inicial (kg); (idade gestacional + idade na dose inicial) x (idade gestacional + idade no surgimento dos sintomas de SMA); (idade gestacional + idade no diagnóstico de SMA). Neste modelo final, os níveis de pNF-H transformados por log de avaliação inicial foram estatisticamente significativos. Ver Fig. 10.

[00216] Este resultado sugere que os níveis de pNF-H são um preditor significativo da função motora de avaliação inicial. Exemplo 9: Níveis de pNF-H (pg/mL) em ENDEAR

[00217] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H nos Dias de Estudo 1, 2, 29, 64, 183 e 302 (procedimento SHAM). Para esta análise, os valores absolutos de pNF-H foram transformados por log e plotados por dia de estudo. Com o tempo, os níveis médios de pNF-H diminuem quase linearmente de aproximadamente 18.000 pg/mL no Dia de Estudo 1 para aproximadamente 5.000 pg/mL no Dia de Estudo 302. Ver Fig. 11. Exemplo 10: Alteração Percentual nos Níveis de pNF-H (pg/mL) no

ENDEAR

[00218] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H nos Dias de Estudo 1, 2, 29, 64, 183 e 302 (procedimento SHAM). Para esta análise, a alteração percentual da avaliação inicial para valores absolutos de pNF-H foi plotada por dia de estudo. Com o tempo, a alteração percentual média nos níveis de pNF-H diminui quase linearmente de aproximadamente 0% no Dia de Estudo 1 para aproximadamente -60% no Dia de Estudo

302. Ver Fig. 12. Exemplo 11: Efeito da Droga nos Níveis de pNF-H (pg/mL) no

ENDEAR

[00219] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H nos Dias de Estudo 1, 2, 29, 64, 183 e 302 (ISIS 396443). Para esta análise, os valores absolutos de pNF-H foram transformados por log e plotados por dia de estudo. Com o tempo, os níveis médios de pNF-H diminuem de aproximadamente

18.000 pg/mL no Dia de Estudo 1 para aproximadamente 5.000 pg/mL no Dia de Estudo 64 e depois para aproximadamente 1.000 pg / mL no Dia de Estudo 302. Ver Fig. 13.

[00220] Este resultado sugere que sujeitos tratados com ISIS 396443 têm um padrão diferente no declínio dos níveis de pNF-H em comparação com sujeitos que receberam o controle SHAM. Exemplo 12: Efeito da Droga na Alteração Percentual nos Níveis de pNF-H (pg/mL) no ENDEAR

[00221] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H nos Dias de Estudo 1, 2, 29, 64, 183 e 302 (ISIS 396443). Para esta análise, a alteração percentual da avaliação inicial para valores absolutos de pNF-H foi plotada por dia de estudo. Com o tempo, a alteração percentual média nos níveis de pNF- H diminui quase linearmente de aproximadamente 0% no Dia de Estudo 1 para aproximadamente -70% no Dia de Estudo 64 e -90% no Dia de Estudo 302. Ver Fig. 14.

[00222] Este resultado sugere que sujeitos tratados com ISIS 396443 têm um padrão diferente no declínio dos níveis de pNF-H em comparação com sujeitos que receberam o controle SHAM. Exemplo 13: Mudança nos Níveis de pNF-H em Vários Momentos

[00223] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H nos Dias de Estudo 1, 2, 29, 64, 183 e 302 (ISIS 396443 e controle SHAM). Para esta análise, a porcentagem de sujeitos em cada dia de estudo que alcançou níveis específicos de mudança percentual da avaliação inicial para valores absolutos de pNF-H entre sujeitos que receberam ISIS 396443 foi comparada com sujeitos que receberam controle SHAM. A significância estatística (p<0,05) foi identificada primeiramente entre os dois grupos de estudo no dia de estudo 64. A maior diferença entre as porcentagens de cada grupo que alcançou uma alteração específica no pNF-H ocorreu no dia de estudo 183 para uma mudança de -80%. Ver Fig. 15.

[00224] Este resultado sugere que uma diferença nos grupos pode ser identificada já no dia de estudo 64, e a melhor separação entre os grupos ocorre usando -80% como o limiar de alteração. Exemplo 14: Associação da Pontuação de HINE-2 no Dia 183 com Níveis de pNF-H do Dia 64

[00225] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64, e a pontuação do marco motor total (HINE-2 (Exame Neurológico infantil de Hammersmith Seção 2)) foi avaliada no Dia de Estudo 183 (ISIS 396443 e controle SHAM). Para esta análise, um modelo de regressão linear foi construído para determinar se os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 estavam associados com a pontuação de HINE-2 total no Dia de Estudo

183. Os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 foram significativamente associados com as pontuações de HINE-2 totais no Dia de Estudo 183, p=0,0006. Ver Fig. 16.

[00226] Esse resultado sugere que os níveis atuais de pNF-H podem prever níveis futuros de marcos motores entre bebês com SMA de surgimento precoce. Exemplo 15: Associação da Pontuação de HINE-2 no Dia 183 com os Níveis de pNF-H no dia 64 (com Covariáveis)

[00227] As amostras de plasma do Estudo CS3B (ENDEAR) foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64, e a pontuação do marco motor total (HINE-2 (Exame Neurológico infantil de Hammersmith Seção 2)) foi avaliada no Dia de Estudo 183 (ISIS 396443 e controle SHAM). Para esta análise, um modelo de regressão linear foi construído para determinar se os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 estavam associados com a pontuação de HINE-2 total no Dia de Estudo 183 após contabilizar múltiplas variáveis de confusão potenciais. Depois de controlar várias variáveis de confusão potenciais, o modelo final incluiu pNF-H transformado por log do Dia 64 (p<0,0001) e duração da doença (p=0,0029). Ver Fig. 17.

[00228] Esse resultado sugere que os níveis atuais de pNF-H podem prever níveis futuros de marcos motores após o controle do tratamento e outras variáveis de confusão potenciais entre os bebês com SMA de surgimento precoce. Exemplo 16: Associação de CHOP INTEND do Dia 183 com Níveis de pNF-H no Dia 64

[00229] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64, e o CHOP INTEND foi avaliado no Dia de Estudo 183 (ISIS 396443 e controle SHAM). Para esta análise, um modelo de regressão linear foi construído para determinar se os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 estavam associados à pontuação de CHOP INTEND no Dia de Estudo 183. Os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 estavam significativamente associados às pontuações de CHOP INTEND no Dia de Estudo 183, p<0,0001. Ver Fig. 18.

[00230] Esse resultado sugere que os níveis atuais de pNF-H podem prever níveis futuros de funções motoras gerais entre bebês com SMA de surgimento precoce.

Exemplo 17: Associação da Pontuação de CHOP INTEND no Dia 183 com os Níveis de pNF-H no dia 64 (com Covariáveis)

[00231] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64, e a pontuação de CHOP INTEND foi avaliada no Dia de Estudo 183 (ISIS 396443 e controle SHAM). Para esta análise, um modelo de regressão linear foi construído para determinar se os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 estavam associados com a pontuação de CHOP INTEND total no Dia de Estudo 183 após contabilizar múltiplas variáveis de confusão potenciais. Após o controle de múltiplas variáveis de confusão potenciais, o modelo final incluiu o pNF-H transformado por log (p=0,0001) do Dia 64, o grupo de tratamento (p=0,005) e a duração da doença (p=0,0003). Ver Fig. 19.

[00232] Esse resultado sugere que os níveis atuais de pNF-H podem prever níveis futuros de funções motoras gerais após o controle do tratamento e outras variáveis de confusão potenciais entre os bebês com SMA de surgimento precoce. Exemplo 18: Categoria HINE-2 (Respondente/Não Respondente) Versus Níveis de pNF-H no Dia 183

[00233] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 183. e o status de respondente do HINE-2 (Exame Neurológico infantil de Hammersmith Seção 2) foi avaliado no Dia de Estudo 183; entre o Dia de Estudo 183 e o Dia de Estudo 302; após o Dia de Estudo 302 (ISIS 396443 e controle SHAM). Se um sujeito se tornou um respondente com base na definição de protocolo de um respondente de HINE-2, o momento dessa realização foi anotado. Se um sujeito não se tornou um respondente no Estudo CS3B, isso foi anotado. Nenhum sujeito no grupo de controle SHAM se tornou um respondente de HINE-2 durante o Estudo CS3B. A maioria dos sujeitos que recebeu ISIS 396443 que se tornou um respondente o fez no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos de controle SHAM, quase todos os sujeitos tinham níveis de pNF-H acima da mediana geral (2130 pg/mL). Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e se tornaram respondentes no Dia de Estudo 183, a maioria apresentou níveis de pNF-H abaixo da mediana de estudo no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e se tornaram respondentes entre os Dias de Estudo 183 e 302, a maioria apresentou níveis de pNF-H abaixo da mediana de estudo no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e se tornaram respondentes dentre os Dias de Estudo 302 e o fim do estudo, a maioria apresentou níveis de pNF-H abaixo da mediana de estudo no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e não se tornaram respondentes no ENDEAR, aproximadamente metade apresentou níveis de pNF-H abaixo da mediana de estudo (2130 pg/mL) no Dia de Estudo 183. Ver Fig. 20.

[00234] Esses resultados sugerem que atingir um certo limiar de pNF-H em 183 dias após o início do tratamento é capaz de diferenciar o tratamento do controle de SHAM e prever eventuais respondentes no tratamento. Exemplo 19: Categoria HINE-2 (Respondente/Não Respondente) Versus Níveis de pNF-H no Dia 183 Alterações Percentuais nos Níveis de pNF-H

[00235] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 183, e o status de respondente do HINE-2 foi avaliado no Dia de Estudo 183; entre o Dia de Estudo 183 e o Dia de Estudo 302; após o Dia de Estudo 302 (ISIS 396443 e controle SHAM). A variação percentual no pNF-H foi calculada entre a avaliação inicial e o Dia de Estudo 183. Se um sujeito se tornou um respondente com base na definição de protocolo de um respondente de HINE-2, o momento dessa realização foi anotado. Se um sujeito não se tornou um respondente no Estudo CS3B, isso foi anotado. Nenhum sujeito no grupo de controle SHAM se tornou um respondente de HINE-2 durante o Estudo CS3B. A maioria dos sujeitos que recebeu ISIS 396443 que se tornou um respondente o fez no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos de controle SHAM, todos os sujeitos tiveram um declínio nos níveis de pNF-H < 80%. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e se tornaram respondentes no Dia de Estudo 183, quase metade teve um declínio nos níveis de pNF-H > 80% no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e se tornaram respondentes entre os Dias de Estudo 183 e 302, a maioria teve uma alteração nos níveis de pNF-H > 80% no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e se tornaram respondentes entre os Dias de Estudo 302 e o final do estudo, a maioria teve uma alteração nos níveis de pNF-H > 80% no Dia de Estudo 183. Dentre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e não se tornaram respondentes no ENDEAR, aproximadamente metade teve uma alteração nos níveis de pNF-H >80% no Dia de Estudo 183. Ver Fig. 21.

[00236] Esses resultados sugerem que atingir um certo limiar de declínio em pNF-H em 183 dias após o início do tratamento pode diferenciar o tratamento do controle de SHAM e prever eventuais respondentes no tratamento. Exemplo 20: Categoria CHOP INTEND (Respondente/Não Respondente) Versus Níveis de pNF-H no Dia 183

[00237] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 183, e o status de respondente do CHOP INTEND foi avaliado no Dia de Estudo 183; entre o Dia de Estudo 183 e o Dia de Estudo 302; após o Dia de Estudo 302 (ISIS 396443 e controle SHAM). Se um sujeito se tornou um respondente com base na definição de protocolo de um respondente de CHOP INTEND, o momento dessa realização foi anotado. Se um sujeito não se tornou um respondente no Estudo CS3B, isso foi anotado. Um sujeito no grupo de controle SHAM se tornou um respondente de CHOP INTEND durante o Estudo CS3B. A maioria dos sujeitos que recebeu ISIS 396443 que se tornou um respondente o fez no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos de controle SHAM, quase todos os sujeitos tinham níveis de pNF-H acima da mediana geral. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e se tornaram respondentes no Dia de Estudo 183, a maioria apresentou níveis de pNF-H abaixo da mediana de estudo no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e se tornaram respondentes entre os Dias de Estudo 183 e 302, a maioria apresentou níveis de pNF-H abaixo da mediana de estudo no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e se tornaram respondentes dentre os Dias de Estudo 302 e o fim do estudo, a maioria apresentou níveis de pNF-H abaixo da mediana de estudo no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e não se tornaram respondentes no ENDEAR, aproximadamente metade apresentou níveis de pNF-H abaixo da mediana de estudo no Dia de Estudo 183. Ver Fig. 22.

[00238] Esses resultados sugerem que atingir um certo limiar de pNF-H em 183 dias após o início do tratamento pode diferenciar o tratamento do controle de SHAM e prever eventuais respondentes no tratamento. Exemplo 21: Categoria CHOP INTEND (Respondente/Não Respondente) Versus Níveis de pNF-H no Dia 183 Alterações Percentuais nos Níveis de pNF-H

[00239] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 183, e o status de respondente do CHOP INTEND foi avaliado no Dia de Estudo 183; entre o Dia de Estudo 183 e o Dia de Estudo 302; após o Dia de Estudo 302 (ISIS 396443 e controle SHAM). A variação percentual no pNF-H foi calculada entre a avaliação inicial e o Dia de Estudo 183. Se um sujeito se tornou um respondente com base na definição de protocolo de um respondente de HINE-2, o momento dessa realização foi anotado. Se um sujeito não se tornou um respondente no Estudo CS3B, isso foi anotado. Um sujeito no grupo de controle SHAM se tornou um respondente de CHOP INTEND durante o Estudo CS3B. A maioria dos sujeitos que recebeu ISIS 396443 que se tornou um respondente o fez no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos de controle SHAM, todos, exceto um sujeito, tiveram um declínio nos níveis de pNF-H < 80%. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e se tornaram respondentes no Dia de Estudo 183, quase metade teve um declínio nos níveis de pNF-H > 80% no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e se tornaram respondentes entre os Dias de Estudo 183 e 302, a maioria teve uma alteração nos níveis de pNF-H > 80% no Dia de Estudo 183. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e se tornaram respondentes entre os Dias de Estudo 302 e o final do estudo, a maioria teve uma alteração nos níveis de pNF-H > 80% no Dia de Estudo 183. Dentre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e não se tornaram respondentes no ENDEAR, aproximadamente metade teve uma alteração nos níveis de pNF-H >80% no Dia de Estudo 183. Ver Fig. 23.

[00240] Esses resultados sugerem que atingir um certo limiar de declínio em pNF-H em 183 dias após o início do tratamento pode diferenciar o tratamento do controle de SHAM e prever eventuais respondentes no tratamento. Exemplo 22: Manutenção do Efeito da Droga: Níveis de pNF-H (pg/mL) em NURTURE

[00241] As amostras de plasma do estudo clínico NURTURE foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H nos Dias de Estudo 1, 64, 183, 302 e 421 (ISIS 396443). Nesta análise, os níveis absolutos de pNF-H foram plotados por Dia de Estudo. Ver Fig. 24.

[00242] Os resultados desta análise sugerem que um declínio significativo ocorre no Dia de Estudo 64 e este novo nível parece estável no Dia de Estudo 421. Exemplo 23: Manutenção do Efeito da Droga: Níveis de pNF-H (pg/mL) em EMBRACE

[00243] As amostras de plasma do estudo clínico EMBRACE foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H nos Dias de Estudo 1, 64 e 183 (ISIS 396443). Nesta análise, os níveis absolutos de pNF-H foram plotados por Dia de Estudo. Ver Fig. 25.

[00244] Os resultados desta análise sugerem que um declínio significativo ocorre no Dia de Estudo 64 e este novo nível parece estável no Dia de Estudo 183. Exemplo 24: Manutenção do Efeito da Droga: Variação Percentual em pNF-H (pg/mL) em NURTURE

[00245] As amostras de plasma do Estudo 232SM201 (NURTURE) foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H nos Dias de Estudo 1, 64, 183, 302 e 421 (ISIS 396443). Nesta análise, os níveis de variação percentual no pNF-H de avaliação inicial foram plotados por Dia de Estudo. Ver Fig. 26.

[00246] Os resultados desta análise sugerem que um declínio significativo (-80%) ocorre no Dia de Estudo 64 e este novo nível parece estável no Dia de Estudo 421. Exemplo 25: Manutenção do Efeito da Droga: Níveis de pNF-H (pg/mL) em EMBRACE

[00247] As amostras de plasma do estudo clínico EMBRACE foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H nos Dias de Estudo 1, 64 e 183 (ISIS 396443). Nesta análise, os níveis absolutos de pNF-H foram plotados por Dia de Estudo. Ver Fig. 27.

[00248] Os resultados desta análise sugerem que um declínio significativo (-50%) ocorre no Dia de Estudo 64 e este novo nível parece estável no Dia de Estudo 183. Exemplo 26: Associação da Pontuação de HINE-2 no Dia 183 com Níveis de pNF-H no Dia 64

[00249] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64, e a pontuação do marco motor total (HINE-2) foi avaliada no Dia de Estudo 183 (ISIS 396443 e controle SHAM). Para esta análise, um modelo de regressão linear foi construído para determinar se os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 estavam associados com a pontuação de HINE-2 total no Dia de Estudo 183. Análises separadas foram realizadas entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e Controle SHAM. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443, os níveis de pNF-H transformado por log no Dia de Estudo 64 não foram estatisticamente significativamente associados às pontuações de HINE-2 totais no Dia de Estudo 183, p=0,3186, mas tenderam de forma que níveis mais altos de pNF-H foram associados a uma menor pontuação de HINE-2 total. Entre os sujeitos que receberam controle de SHAM, os níveis de pNF- H transformado por log no Dia de Estudo 64 foram estatisticamente significativamente associados às pontuações de HINE-2 totais no Dia de Estudo 183, p=0,0302, de forma que níveis mais altos de pNF-H foram associados a uma menor pontuação de HINE-2 total. Ver Fig. 28.

[00250] Esse resultado sugere que os níveis atuais de pNF-H podem prever níveis futuros de marcos motores entre bebês com SMA de surgimento precoce. Exemplo 27: Associação da Pontuação de CHOP INTEND no Dia 183 com Níveis de pNF-H no Dia 64

[00251] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64, e a pontuação de CHOP INTEND foi avaliada no Dia de Estudo 183 (ISIS

396443 e controle SHAM). Para esta análise, um modelo de regressão linear foi construído para determinar se os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 estavam associados com a pontuação de CHOP INTEND no Dia de Estudo 183. Análises separadas foram realizadas entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e Controle SHAM. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443, os níveis de pNF-H transformado por log no Dia de Estudo 64 foram estatisticamente significativamente associados às pontuações de CHOP INTEND no Dia de Estudo 183, p=0,0406, de forma que níveis mais altos de pNF-H foram associados a uma menor pontuação de CHOP INTEND total. Entre os sujeitos que receberam controle de SHAM, os níveis de pNF-H transformado por log no Dia de Estudo 64 foram estatisticamente significativamente associados às pontuações de CHOP INTEND no Dia de Estudo 183, p=0,0330, de forma que níveis mais altos de pNF-H foram associados a uma menor pontuação de CHOP INTEND. Ver Fig. 29.

[00252] Esse resultado sugere que os níveis atuais de pNF-H podem prever níveis futuros de funções motoras entre bebês com SMA de surgimento precoce. Exemplo 28: Níveis de pNF-H ao Longo do Tempo em Bebês Sobreviventes com Valores Não Ausentes no Dia 302

[00253] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H nos Dias de Estudo 1, 2, 29, 64, 183 e 302 (ISIS 396443 e procedimento SHAM). Para esta análise, a população foi limitada aos sujeitos que sobreviveram até o Dia de Estudo 302 e tiveram um nível de pNF-H medido no Dia de Estudo 302. Os valores absolutos de pNF-H foram plotados por dia de estudo. Com o tempo, dentre os sujeitos que receberam o procedimento SHAM, os níveis médios de pNF-H diminuem quase linearmente de aproximadamente 16.000 pg/mL no Dia de Estudo 1 para aproximadamente 7.000 pg/mL no Dia de Estudo 302. Ao longo do tempo, dentre os sujeitos que receberam ISIS 396443, o pNF-H médio diminuiu de aproximadamente 18.000 pg/mL no Dia de Estudo 1 para aproximadamente 4.000 no Dia de Estudo 64 e, em seguida, permaneceu estável em aproximadamente 1.000 pg/ML no Dia de Estudo 302. Ver Fig. 30.

[00254] Os resultados desta análise sugerem que o declínio em ambas as coortes é verdadeiro e não um viés de sobrevivência. Exemplo 29: Alteração Percentual em Níveis de pNF-H ao Longo do Tempo em Bebês Sobreviventes com Valores Não Ausentes no Dia 302

[00255] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H nos Dias de Estudo 1, 2, 29, 64, 183 e 302 (ISIS 396443 e procedimento SHAM). Para esta análise, a população foi limitada aos sujeitos que sobreviveram até o Dia de Estudo 302 e tiveram um nível de pNF-H medido no Dia de Estudo 302. A alteração da avaliação inicial foi plotada por dia de estudo. Com o tempo, entre os sujeitos que receberam o procedimento SHAM, a alteração nos níveis de pNF-H diminui quase linearmente para aproximadamente -50% no Dia de Estudo 302. Com o tempo, entre os sujeitos que receberam ISIS 396443, a alteração no pNF-H diminui para aproximadamente -70% no Dia de Estudo 64 e depois permanece estável em aproximadamente -90% no Dia de Estudo 302. Ver Fig. 31.

[00256] Os resultados desta análise sugerem que o declínio em ambas as coortes é verdadeiro e não um viés de sobrevivência. Exemplo 30: Associação da Amplitude de CMAP Peroneal no Dia 183 com os Níveis de pNF-H no Dia 64

[00257] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64, e a Amplitude de CMAP Peroneal foi avaliado no Dia de Estudo 183 (ISIS 396443 e controle SHAM). Para esta análise, um modelo de regressão linear foi construído para determinar se os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 estavam associados com a Amplitude de CMAP Peroneal no Dia de Estudo 183. Os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 foram significativamente associados com a Amplitude de CMAP Peroneal no Dia de Estudo 183, p=0,0021. Ver Fig. 32.

[00258] Esse resultado sugere que os níveis atuais de pNF-H podem prever níveis futuros de saúde de nervos motores gerais entre bebês com SMA de surgimento precoce. Exemplo 31: Associação da Amplitude de CMAP Peroneal no Dia 183 com os Níveis de pNF-H no Dia 64

[00259] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64, e a Amplitude de CMAP Peroneal foi avaliado no Dia de Estudo 183 (ISIS 396443 e controle SHAM). Para esta análise, um modelo de regressão linear foi construído para determinar se os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 estavam associados com a Amplitude de CMAP Peroneal no Dia de Estudo 183. Análises separadas foram realizadas entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e Controle SHAM. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443, os níveis de pNF-H transformados por log no Dia de Estudo 64 não foram associados estatisticamente significativamente à Amplitude de CMAP Peroneal no Dia de Estudo 183, p=0,3612, de modo que níveis mais altos de pNF-H foram associados a uma tendência a uma Amplitude de CMAP Peroneal mais baixa. Entre os sujeitos que receberam controle SHAM, os níveis de pNF-H transformados por log no Dia de Estudo 64 foram associados estatisticamente significativamente à Amplitude de CMAP Peroneal no Dia de Estudo 183, p=0,0142, de modo que níveis mais altos de pNF-H foram associados a uma Amplitude de CMAP Peroneal mais baixa. Ver Fig. 33.

[00260] Esse resultado sugere que os níveis atuais de pNF-H podem prever níveis futuros de saúde de neurônios motores gerais entre bebês com SMA de surgimento precoce. Exemplo 32: Associação da Amplitude de CMAP Ulnar no Dia 183 com os Níveis de pNF-H no Dia 64

[00261] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64, e a Amplitude de CMAP Peroneal foi avaliado no Dia de Estudo 183 (ISIS 396443 e controle SHAM). Para esta análise, um modelo de regressão linear foi construído para determinar se os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 estavam associados com a Amplitude de CMAP Ulnar no Dia de Estudo 183. Os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 foram significativamente associados com a Amplitude de CMAP Ulnar no Dia de Estudo 183, p=0,0002. Ver Fig. 34.

[00262] Esse resultado sugere que os níveis atuais de pNF-H podem prever níveis futuros de saúde de nervos motores gerais entre bebês com SMA de surgimento precoce. Exemplo 33: Associação da Amplitude de CMAP Ulnar no Dia 183 com os Níveis de pNF-H no Dia 64

[00263] As amostras de plasma do estudo clínico ENDEAR foram analisadas quanto aos níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64, e a Amplitude de CMAP Ulnar foi avaliado no Dia de Estudo 183 (ISIS 396443 e controle SHAM). Para esta análise, um modelo de regressão linear foi construído para determinar se os níveis de pNF-H no Dia de Estudo 64 estavam associados com a Amplitude de CMAP Ulnar no Dia de Estudo 183. Análises separadas foram realizadas entre os sujeitos que receberam ISIS 396443 e Controle SHAM. Entre os sujeitos que receberam ISIS 396443, os níveis de pNF-H transformados por log no Dia de Estudo 64 não foram associados estatisticamente significativamente à Amplitude de CMAP Ulnar no Dia de Estudo 183, p=0,0952, de modo que níveis mais altos de pNF-H foram associados a uma tendência a uma Amplitude de CMAP Ulnar mais baixa. Entre os sujeitos que receberam controle SHAM, os níveis de pNF-H transformados por log no Dia de Estudo 64 foram associados estatisticamente significativamente à Amplitude de CMAP Ulnar no Dia de Estudo 183, p=0,0281, de modo que níveis mais altos de pNF-H foram associados a uma Amplitude de CMAP Ulnar mais baixa. Ver Fig. 35.

[00264] Esse resultado sugere que os níveis atuais de pNF-H podem prever níveis futuros de saúde de neurônios motores gerais entre bebês com SMA de surgimento precoce. Exemplo 34: Características de Avaliação Inicial ENDEAR Dicotomizadas por Níveis Medianos de pNF-H

[00265] Abaixo está uma tabela que fornece as características de avaliação inicial dicotomizadas (<15.400 e ≥15.400 pg/mL) pelos níveis de pNF-H medianos do ensaio ENDEAR. pNF-H de plasma de avaliação P-valor b inicial (pg/mL) <15.400a ≥15.400a sujeitosc, n 58 59 Sexo feminino, n (%) 32 (55) 33 (56) 1,000 Idade média (intervalo) na primeira dose, 25,8 (7,4, 37,4) 22,6 (4,3, 33,6) ,0165 sem Idade média (intervalo) de surgimento 9,5 (3, 20) 7,3 (2, 19) ,0049 dos sintomas, sem Idade média (intervalo) no diagnóstico 16,02 (4, 29) 12,31 (0, 30) ,0046 de SMA, sem Duração média (intervalo) da doença, sem 13,8 (0,6, 25,9) 13,2 (0, 23,1) ,5723 Uso de suporte de ventilação, n (%) 14 (24) 13 (22) ,8290 Média ± SD pontuação de HINE-2 total 1,6 ± 1,30 1,2 ± 0,94 ,0593 Pontuação de CHOP INTEND total média 29,49 ± 7,125 25,11 ± 7,850 ,0020 ± SD Amplitude de CMAP peroneal média ± 0,40 ± 0,328 0,28 ± 0,244 ,0353

SD Amplitude de CMAP ulnar média ± SD 0,21 ± 0,162 0,23 ± 0,164 ,6259 CHOP INTEND = Teste Infantil de Doenças Neuromusculares do Hospital Infantil da Filadélfia;

CMAP = potencial de ação muscular composto; HINE-2 = Exame Neurológico infantil de Hammersmith Seção 2. aA mediana do pNF-H de avaliação inicial. bResultados para variáveis contínuas são do teste t de duas amostras de Student e os resultados para proporções são do teste exato de Fisher. cNúmero de participantes na tabela refere-se aos participantes que não possuem pNF-H de avaliação inicial não ausente em qualquer uma das categorias.

Exemplo 35: Correlações Entre as Características de Avaliação Inicial e os Níveis de Log(pNF-H) no ENDEAR

[00266] A tabela abaixo fornece correlações entre as características de avaliação inicial e os níveis de log(pNF-H) no ensaio ENDEAR. Coeficiente de Probabilidade correlação de > r sob H0: Pearson Rho=0 Peso (Kg), n=117 -0,11 ,2201 Idade de surgimento dos sintomas (semanas), -0,20 ,0344 n=117 Idade na primeira dose (semanas), n = 117 -0,24 ,0106 Idade no diagnóstico de SMA (semanas), n = 117 −0,25 ,0064 Idade gestacional (semanas), n = 117 0,01 ,9438 Duração da doença (semanas), n = 117 -0,09 ,3183 Pontuação do marco motor de HINE, n = 117 -0,13 ,1786 CHOP INTEND, n = 117 -0,30 ,0012 CMAP: amplitude do nervo peroneal, n = 108 -0,13 ,1842 CMAP: amplitude ulnar, n = 111 -0,16 ,1002 Exemplo 36: Características de Avaliação Inicial de CHERISH Dicotomizadas por Níveis Medianos de pNF-H

[00267] Abaixo está uma tabela que fornece as características de avaliação inicial dicotomizadas (<1.200 e ≥1.200 pg/mL) pelos níveis de pNF-H medianos do ensaio CHERISH.

pNF-H de plasma de avaliação inicial Valor P b (pg/mL) <1.200a ≥1.200a sujeitosc, n 62 64 Peso médio (intervalo), kg 16,77 (10,0, 36,4) 12,59 (8,5, 24,0) <,0001 Idade média (intervalo) de surgimento 48,57 (26,1, 78,2) 48,34 (26,1, 86,9) ,9306 dos sintomas (semanas) Idade média (intervalo) na primeira 269,10 (131,9, 167,45 (107,3, <,0001 dose (semanas) 482,1) 379,9) Idade média (intervalo) no diagnóstico 89,99 (43,5, 78,28 (0,0, 165,1) ,0542 de SMA (semanas) 208,6) Duração (semanas) média (intervalo) 217,49 (97,4, 116,10 (34,8, <,0001 da doença 408,9) 315,1) Pontuação de HFMSE total média ± SD 21,58 ± 8,231 21,53 ± 7,904 ,9726 Pontuação do teste de módulo de 20,81 ± 5,847 17,45 ± 5,741 ,0015 membro superior média ± SD HFMSE = Escala Motora Funcional de Hammersmith - Expandida. aA mediana do pNF-H de avaliação inicial. bResultados para variáveis contínuas são do teste t de duas amostras de Student e os resultados para proporções são do teste exato de Fisher. cNúmero de participantes na tabela refere-se aos participantes que não possuem pNF-H de avaliação inicial não ausente em qualquer uma das categorias.

Exemplo 37: Correlações Entre as Características de Avaliação Inicial e os Níveis de Log(pNF-H) no CHERISH

[00268] A tabela abaixo fornece correlações entre as características de avaliação inicial e os níveis de log(pNF-H) no ensaio CHERISH. Coeficiente Probabilidade de correlação > r sob H0: de Pearson Rho=0 Peso (Kg) N=126 -0,44 <,0001 Idade de surgimento dos sintomas (semanas), n=126 0,05 ,5469 Idade na primeira dose (semanas), n = 126 -0,63 <,0001 Idade no diagnóstico de SMA (semanas), n = 126 -0,03 ,7257 Duração da doença (semanas), n = 126 -0,64 <,0001 Pontuação de HFMSE, n=126 0,10 ,2436 Marcos motores da OMS, n=126 0,14 ,1154 Pontuação do Teste de Módulo de Membro -0,20 ,0280 Superior, n=126 HFMSE = Escala Motora Funcional de Hammersmith - Expandida. OMS = Organização Mundial da Saúde

Exemplo 38: Previsão da Função Motora Futura Medindo a Alteração Percentual nos Níveis de pNF-H Após o Tratamento

[00269] Curvas de características de operação de receptor (ROC) foram usadas para selecionar o período de tempo para medir a alteração percentual nos níveis de neurofilamento que melhor prediz a função motora futura em um sujeito tratado. No ENDEAR, a mudança percentual nos níveis de pNF-H foi medida em cada um dos dias 29, 64 e 183 e comparada com a função motora do sujeito tratado no Dia 302. As curvas de ROC revelaram que alteração percentual nos níveis de pNF-H no Dia 64 é melhor para prever a função motora no Dia 302 do que a mudança percentual nos níveis de pNF-H no Dia 29 ou Dia 183. Ver Figs. 36A-36C. No ENDEAR, mesmo depois de controlar para idade na primeira dose, a alteração percentual nos níveis de pNF-H no Dia 64 previu CHOP INTEND (≥ 4 pontos de melhoria) e marco motor (mais marcos motores de HINE-2 com melhora do que piora) respondentes no Dia 302. Ver Figs. 37A-B. No CHERISH, mesmo depois de controlar para a duração da doença, a alteração percentual nos níveis de pNF-H no Dia 85 previu respondentes de HFMSE (Hammersmith Functional Motor Scale - Expandida; ≥ 3 pontos de melhoria), RULM (Módulo de Membro Superior Revisado; ≥ 2 pontos de melhoria) e da OMS (Organização Mundial da Saúde; realização de ≥ 1 marco motor) no Dia 456. Ver Figs. 38A-38C. Exemplo 39: Níveis de pNF-H no Líquido Cefalorraquidiano na Avaliação Inicial e Após Tratamento com Nusinersen

[00270] Os níveis de pNF-H no líquido cefalorraquidiano (LCR) da avaliação inicial foram medidos em pacientes pré-sintomáticos, de surgimento precoce e de surgimento tardio, bem como em pacientes com 2 ou 3 cópias de SMN2. Os níveis de pNF-H de avaliação inicial no LCR foram mais elevados em bebês pré-sintomáticos e nos bebês mais jovens com 2 cópias de SMN2. Ver Figs. 39A-39B. No estudo

NURTURE, o tratamento com nusinersen foi associado a um rápido declínio nos níveis de pNF-H no LCR, seguido por estabilização. Ver Fig. 40. Exemplo 40: Comparação de Cadeia Pesada de Neurofilamento Fosforilado (pNF-H) e Cadeia Leve de Neurofilamento (NF-L) em Matrizes Diferentes Entre Populações de Atrofia Muscular Espinhal

[00271] As concentrações de pNF-H e NF-L foram comparadas no plasma e no líquido cefalorraquidiano (LCR) em sujeitos de testes clínicos nusinersen com SMA pré-sintomática (com maior probabilidade de desenvolver Tipo I/II), de surgimento precoce (desenvolveu ou com maior probabilidade de desenvolver Tipo I/II) ou de surgimento tardio (desenvolveu ou com maior probabilidade de desenvolver Tipo II/III). As concentrações de pNF-H no plasma e no LCR foram avaliadas usando o imunoensaio ProteinSimple™ SimplePlex ELLA. As concentrações de NF-L foram avaliadas usando o ensaio SIMOA (Quanterix™). Os resultados relatados abaixo estão em unidades de pg/mL.

[00272] Para cada população de SMA, as concentrações de pNF-H e NF-L foram semelhantes no LCR; entretanto, no plasma, as concentrações de NF-L foram menores do que as de pNF-H. A diferença entre as concentrações de NF-L e pNF-H no plasma foi mais pronunciada em bebês pré-sintomáticos do que naqueles com SMA de surgimento precoce. No LCR, as concentrações de pNF-H e NF-L diminuíram ao longo do tempo no tratamento com nusinersen em taxas semelhantes nas coortes de SMA pré-sintomático (redução percentual no Dia 183: Fig. 41A) e de surgimento precoce (redução percentual no Dia 302: Fig. 41B). Resultados comparáveis foram demonstrados nas concentrações de pNF-H e NF-L no plasma nas coortes de SMA de surgimento precoce (redução percentual no Dia 64: Fig. 41C) e de surgimento tardio (redução percentual no Dia 169: Fig. 41D). Os valores absolutos dos dados mostrados na Fig. 41C são apresentados na Fig.

41E, e os valores absolutos dos dados mostrados na Fig. 41D são apresentados na Fig. 41F. Além disso, as taxas de alteração nas concentrações de pNF-H no plasma e no LCR foram semelhantes nas coortes de SMA pré-sintomática e de surgimento precoce. Para NF-L, as concentrações no plasma e no LCR diminuíram em uma trajetória semelhante na coorte de surgimento precoce.

[00273] No geral, as concentrações médias geométricas de pNF-H e NF-L (CI a 95%) de avaliação inicial foram 20139 (10075-40257) e 7272 (3287-16090) pg/mL, respectivamente, entre bebês pré-sintomáticos com 2 cópias de SMN2 e 952 (367 -2470) e 519 (231-1164) pg/mL, respectivamente, entre aqueles com 3 cópias de SMN2. Em participantes de SMA de surgimento precoce, as concentrações médias geométricas de pNF-H e NF-L de avaliação inicial (CI a 95%) foram 3791 (2980-4823) e 3718 (2832-4882) pg/mL, respectivamente. Nos participantes de SMA de surgimento tardio, as concentrações médias geométricas de pNF-H e NF-L de avaliação inicial (CI a 95%) foram 381 (331-438) e 185 (154-222) pg/mL, respectivamente.

[00274] Assim, como os níveis de pNF-H no plasma, os níveis de pNF-H e NF-L no LCR aparecem mais altos em participantes de SMA pré-sintomático com 2 cópias de SMN2 e mais baixos naqueles com SMA de surgimento tardio.

OUTRAS MODALIDADES

[00275] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com sua descrição detalhada, a descrição anterior se destina a ilustrar e não a limitar o escopo da invenção, o qual está definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims (46)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de tratamento da atrofia muscular espinhal ("spinal muscular atrophy" - SMA) em um sujeito humano em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao sujeito humano, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia contra a SMA, em que o sujeito humano foi previamente determinado como tendo, em uma amostra biológica obtida do sujeito humano, um nível de neurofilamentos antes do início da terapia contra a SMA mais alto que um controle.

2. Método de tratamento da atrofia muscular espinhal (SMA) em um sujeito humano em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: medir um nível de neurofilamentos em uma amostra biológica obtida do sujeito humano antes do início de uma terapia contra a SMA; e administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da terapia contra a SMA ao sujeito humano.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos na amostra biológica é superior a 400 pg/mL.

4. Método de tratamento da atrofia muscular espinhal (SMA) em um sujeito humano em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: medir um nível de neurofilamentos em uma primeira amostra biológica obtida do sujeito humano antes do início de uma terapia contra a SMA; administrar uma terapia contra a SMA ao sujeito humano; e medir um nível de neurofilamentos em uma segunda amostra biológica obtida do sujeito humano após o início da terapia contra a SMA.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é inferior ao nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica está entre 10% a 95% do nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano 40-90 dias após o início da terapia contra a SMA.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano 50-80 dias após o início da terapia contra a SMA.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano 60-70 dias após o início da terapia contra a SMA.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano 64 dias após o início da terapia contra a SMA.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 50% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 60% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 70% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em menos de 50% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em menos de 40% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 15, caracterizado pelo fato de que a dose da terapia contra a SMA é alterada para uma administração subsequente ao sujeito humano com base na redução percentual no nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

17. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é superior ao nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 17, caracterizado pelo fato de que a administração da terapia contra a SMA é continuada.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a administração da terapia contra a SMA é descontinuada.

20. Método de tratamento da atrofia muscular espinhal (SMA) em um sujeito humano em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: medir um nível de neurofilamentos em uma primeira amostra biológica obtida do sujeito humano antes da administração de uma quantidade candidata de uma terapia contra a SMA; medir um nível de neurofilamentos em uma segunda amostra biológica obtida do sujeito humano após a administração da quantidade candidata da terapia contra a SMA, em que o nível de neurofilamentos na segunda amostra biológica é inferior ao nível de neurofilamentos na primeira amostra biológica, indicando, desse modo, que a quantidade candidata da terapia contra a SMA é uma quantidade terapeuticamente eficaz; administrar a quantidade terapeuticamente eficaz da terapia contra a SMA ao sujeito humano depois de ter medido o nível reduzido de neurofilamentos na segunda amostra biológica.

21. Método de previsão do prognóstico da atrofia muscular espinhal (SMA), caracterizado pelo fato de que compreende: medir um nível de neurofilamentos em uma amostra biológica obtida de um sujeito humano com mutações em ambas as cópias do gene SMN1 que levam à deficiência da proteína SMN funcional; e comparar o nível de neurofilamentos medido na amostra biológica com um controle, em que o nível de neurofilamentos medido na amostra biológica, em comparação com o controle, é preditivo da gravidade ou tipo de SMA que o sujeito desenvolverá.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é obtida do sujeito humano antes do início de uma terapia contra a SMA, e em que o nível de neurofilamentos medido na amostra biológica, em comparação com o controle, é preditivo da gravidade ou tipo de SMA que o sujeito humano desenvolverá na ausência de tratamento.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é obtida do sujeito humano após o início de uma terapia contra a SMA, e em que o nível de neurofilamentos medido na amostra biológica, em comparação com o controle, é preditivo da gravidade ou tipo de SMA que o sujeito desenvolverá enquanto receber a terapia contra a SMA.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é obtida do sujeito humano pelo menos duas semanas após o início da terapia contra a SMA.

25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é obtida do sujeito humano pelo menos dois meses após o início da terapia contra a SMA.

26. Método de previsão do prognóstico da atrofia muscular espinhal (SMA), caracterizado pelo fato de que compreende: medir, antes do início de uma terapia contra a SMA, um nível de neurofilamentos em uma primeira amostra biológica obtida de um sujeito humano com mutações em ambas as cópias do gene SMN1 que levam à deficiência da proteína SMN funcional; medir um nível de neurofilamentos em uma segunda amostra biológica obtida do sujeito humano após o início da terapia contra a SMA; e comparar o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica, em que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica, em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica, é preditivo da gravidade ou tipo de SMA que o sujeito desenvolverá.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano 40-90 dias após o início da terapia contra a SMA.

28. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano 50-80 dias após o início da terapia contra a SMA.

29. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano 60-70 dias após o início da terapia contra a SMA.

30. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra biológica é obtida do sujeito humano cerca de 64 dias após o início da terapia contra a SMA.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 50% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 60% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em pelo menos 70%

em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em menos de 50% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30, caracterizado pelo fato de que o nível de neurofilamentos medido na segunda amostra biológica é reduzido em menos de 40% em comparação com o nível de neurofilamentos medido na primeira amostra biológica.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a terapia contra a SMA é o nusinersen ou um sal de nusinersen.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que a terapia contra a SMA é o nusinersen sódico.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que a terapia contra a SMA é olesoxima, AVX-101, CK-2127107, RG7916, RG7800, RO7034067, LMI070, ou SRK-015.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o controle é um valor limite de neurofilamentos pré-estabelecido.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que o controle é o nível de neurofilamentos em uma amostra biológica ou em amostras biológicas obtidas de um ou mais sujeitos humanos que não possuem SMA.

41. Método de medição de um nível de neurofilamentos,

caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma amostra biológica obtida de um sujeito humano com mutações em ambas as cópias do gene SMN1 que levam à deficiência da proteína SMN funcional; e medir um nível de neurofilamentos na amostra biológica.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o neurofilamento é uma cadeia pesada de neurofilamento.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o neurofilamento é uma cadeia pesada de neurofilamento fosforilado.

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o neurofilamento é uma cadeia média/intermediária de neurofilamento.

45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o neurofilamento é uma cadeia leve de neurofilamento.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é sangue, soro, plasma ou líquido cefalorraquidiano.