KR20210074904A - 세르브론을 이용한 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 방법 - Google Patents

세르브론을 이용한 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세르브론을 이용한 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CRBN의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물, 키트, 이를 이용한 건선의 진단을 위한 정보제공방법, 및 이를 이용한 건선 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

세르브론을 이용한 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 방법 {Composition and method for diagnosing psoriasis disease using cereblon}
본 발명은 세르브론을 이용한 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CRBN의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물, 키트, 이를 이용한 건선의 진단을 위한 정보제공방법, 및 이를 이용한 건선 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
건선은 전세계 인구의 2-3%에 영향을 미치는 흔한 만선 염증성 피부 질환이며, 면역계 매개 염증성 질환으로 간주된다. 조직학적으로, 건선의 특징은 각질세포의 저-증식(hypo-proliferation) 및 비정상적인 분화, 혈관의 확장 및 면역세포의 진피로의 침투이다. 건선의 표현형은 신체 전체에 나타나는 홍반, 가려움증, 통증, 피부 당김, 또는 비늘을 포함한다. 정확한 병인 메커니즘은 밝혀지지 않았으며, 건선의 발병은 사이토카인, 케모카인 및 성장인자를 생성하는 각질 세포와 면역 세포 사이의 혼란으로 간주된다. 그 중 Th1/Th2 항상성, Th17/Treg 균형 및 IL-23/Th17이 중심축으로 관련된다. 건선의 5가지 보고된 유형으로는 판상형 건선 (plaque psoriasis), 물방울 건선 (guttate psoriasis), 간찰부 건선 (inverse psoriasis), 농포건선 (pustular psoriasis) 및 홍피성 건선 (erythrodermic psoriasis)이 있다. 판상형 건선은 가장 흔한 형태의 질환으로, 약 90% 경우를 차지한다. 전형적인 병변은 은색의 층판성 비늘 (silvery lamellar scales)로 덮힌 단형의 뚜렷하게 표시되는 홍반 플라크이다. 건선 병변은 다음과 같은 특징을 갖는다: (i) 각질세포의 급격한 증식으로 인해 표피가 두꺼워짐, (ii) 각질세포의 비정상적인 분화로 인해 저과립증이 감소됨, (iii) 진피 혈관 확장으로 홍반이 유도됨, (iv) 먼로 미세농양 (Munro's microabscesses)에서 호중구가 축적됨, (v) 진피 또는 CD8+ T 세포, CD4+ T-보조 세포 및 수지상 세포의 침투. 이러한 변화는 TNF-α 및 IL-17 A, C와 같은 염증성 사이토카인과 관련이 있다.
건선과 유사한 모델을 확립하기 위해 다양한 방법이 사용되어 왔다. 첫 번째로, 정상 인간 표피 각질세포 (NHEK) 또는 인간 각질세포 (HaCaT)가 생체 외 (in vitro) 건선 연구에 사용된다. 3D 모델 또한 가능하며, 최근 연구에 따르면 3D 조직-공학 인간 피부 유사 물질도 도입되었다. 주식회사 MatTek (MatTek Corporation, Ashland, MA, USA)에서 제공하는 건선 3D 조직 모델은 형태 및 사이토카인 발현 특면에서 인간의 건선 조직과 매우 유사하며, IL-6, IL-8, 염증성 사이토카인과 같이 다수의 건선 표현형을 나타낸다. 생체 내 (in vivo)에서, 동물 모델은 주로 건선과 관련된 사이토카인 및 케모카인을 넉아웃시키는 다양한 상호작용 및 신호전달 경로를 연구하기 위한 좋은 모델이다. 많은 건선 유사 병변은 알다라 크림 (5% 이미퀴모드)을 마우스 피부에 직접 적용하여 생성되었기 때문에, 본 발명에서 사용된 건선 유사 모델은 또한 널리 사용된다. 이미퀴모드 (IMQ)는 면역 반응의 조절제 중 하나로, 선천성/적응성 면역 반응을 자극하고 사이토카인 생성을 유도하는 것으로 알려졌다. IMQ의 분자식은 C14H16N이고 합성식은 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-C] 퀴놀린-4-아민이다. 1997년에, IMQ는 외부 생식기 및 항문 사마귀에 대한 치료제로 최초 승인되었고, 이후 광선각화증 (AK) 및 표면 기저세포암종 (BCC)에 대해 승인을 받았다. 또한, IMQ는 항바이러스, 항종양 효과를 나타낸다. IMQ는 TNF-α, IFN-α, IL-6 또는 IL-8과 같은 사이토카인을 유도하고 이러한 사이토카인을 이용하여 선천성 면역계를 자극한다. IMQ는 TLR-7 (Toll-like receptor)/ MyD88-의존적 경로를 통해 면역계를 활성화시킬 수 있다. TLR 도메인을 함유하는 단백질인 MyD88은 TLR에 결합하여 TLR에서 IL-1 수용체-관련 키나아제 (IRAK) 및 TNF 수용체 관련 인자 TRAF6을 보충하는 어댑터로 작용한다. IMQ-활성화 수지상 세포 (DC)는 CD80 및 CD87의 발현 조절, 특정 사이토카인 (IFN-α, TNF-α, IL-12)의 생산 및 방출을 통해 Th 세포를 유도한다. IFN 및 다른 사이토카인을 생성하는 것 이외에도, IMQ는 IFN-γ의 생성을 간접적으로 자극하여 적응성 면역성을 향상시킬 수 있다.
다기능성 세르브론 (CRBN)은 DNA 손상-결합 단백질 1 (DDB1), 컬린-4A (CUL4A) 및 컬린 조절자 (ROC) 조절 인자와 함께 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체를 형성하며, 최초로 정신지체 관련 유전자로 알려졌다. 뇌, 세포질, 핵, 소포체를 포함하는 기관에서 주로 발견된다. CRBN은 또한 탈리도마이드의 표적 단백질이며, 이는 다발성 골수종에 대한 치료제로 사용된다. 기형을 유발하는 것으로 알려진 탈리도마이드는 CRBN의 DDB1에 결합하여 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체의 기능을 억제할 수 있다. 실제로, CRBN 발현 정도는 다발성 골수종 환자에서 현저하게 낮다. CRBN은 또한 면역조절 약물이 면역 및 항암 효과를 조절하는데 도움을 주는 중간 역할을 하는 것으로 나타났다. CRBN은 AMPK-결합 단백질로도 알려져 있다. CRBN은 AMPK a1-서브유닛과 직접 상호작용하여, 서브유닛의 인산화를 억제하고 AMPK의 효소 활성을 감소시킨다. 최근 연구에 따르면, CRBN이 CD4+ T 세포 활성화에 음성 조절 역할을 하는 것으로 나타났다. CRBN은 CD4+ T 세포 활성화 및 IL-2 분비를 억제함으로써, CD4+ T 세포가 Th17로 분화되는 것을 억제한다. 또한, CRBN의 T-세포 특이적 결실은 IL-17A 및 IFN-γ 사이토카인의 생성을 증가시켰다. 그러나, 주로 IL-17에 의해 조절되는 건선에서의 CRBN 단백질과의 연관성은 아직까지 보고된바 없다.
한편, 대한민국 공개특허 제10-2014-0024914호에는 예측인자로 세레브론 (CRBN)을 사용하는 암 및 염증성 질환의 치료를 위한 방법을 개시하고 있으나, CRBN-DDB1 및/또는 CRBN E3 유비퀴틴-리가아제 복합체에 직접적으로 결합하여 CRBN이 제대로 기능하지 못하도록하는 (malfunction) 화합물을 이용한 치료방법만을 제시하고 있을 뿐, CRBN 단백질의 발현 수준을 검출하여 건선을 진단하는 방법에 대해서는 언급한 바가 없다.
본 발명의 목적은 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물 및/또는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 건선 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 건선 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 CRBN의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 CRBN 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 CRBN 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 조성물을 포함하는 건선 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 건선 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 개체의 피부 병변 및 비병변으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 CRBN의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 피부 병변으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 정상 대조군 또는 상기 (a) 단계의 피부 비병변으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 방법은 (c) 상기 (a) 단계의 피부 병변으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상 대조군 또는 상기 (a) 단계의 피부 비병변으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준보다 낮은 경우, 건선으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 건선 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 건선 치료 후보물질을 건선이 발병된 개체의 피부 병변으로부터 분리된 생물학적 시료에 처리하여 CRBN mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 측정한 발현 수준을 상기 후보물질을 처리하기 전의 발현 수준과 비교하는 단계;
(c) 후보물질을 처리하기 전보다 CRBN mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준이 증가하는 경우, 상기 후보물질을 건선 치료제로 판단하는 단계.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 피부 세포, 피부 조직 및 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 CRBN을 이용한 건선 진단 방법은 CRBN 발현 수준의 측정을 통해 3-4시간 안에 신속하고 정확하게 건선을 진단할 수 있어, 기존의 주요 사이토카인 발현 수준을 측정함으로써 건선을 진단하는 방법에 비해 진단 시간이 획기적으로 단축되는 이점이 있다. 또한, CRBN 단백질 발현 수준을 측정할 수 있는 단일클론 항체를 개발하여 추후 진단 키트로서 활용 가능하며, CRBN 단백질의 발현 수준을 증가시키는 물질의 스크리닝을 통해 잠재적인 건선 치료제 개발이 가능하다.
도 1은 인간 건선 환자에서의 사이토카인 발현 수준을 나타낸 그래프이다. 건선 환자의 건강한 대조군 피부 (n=64), 및 건선 환자의 비병변 피부 (n=58) 또는 병변 피부 (n=58)로부터의 피부 생검 샘플로 염증성 사이토카인 발현에 대해 평가하였다 (평균±SEM). 정상 대조군 피부 (검정색 기호), 건선 환자의 비병변 피부 (파란색 기호) 또는 건선 병변 (빨간색 기호)을 포함하는 피부 샘플에서 각각 IL-23, CRBN, TNF-α, IL-6, IL-17 및 MCP-1를 나타낸다.
도 2의 A에서 a는 8-10주령의 C57BL/6 암컷 마우스를 건선 마우스 모델로 사용하여, 유전형 분석으로 WT 및 CRBN KO를 입증한 것이고, b는 뇌 용해로 CRBN의 부재를 입증한 것이다. 도 2의 B에서 a 및 b는 알다라 크림 (5% IMQ) 처리 마우스의 등 피부 및 비장으로부터의 단백질 추출물을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과로, 비처리군에서의 CRBN 수준이 알다라 크림 처리군과 비교하여 증가되었음을 나타낸다.
도 3a 내지 3c는 WT 및 CRBN KO 마우스의 건선 유사 모델을 나타내며, 마우스는 83.3mg IMQ로 일주일간 처리되었다. 도 3a는 실험 일정 및 기간을 나타낸 것이고, 3b는 시간 경과에 따른 마우스 등 피부와 귀의 변화를 나타낸다. 마우스의 귀와 등 피부에서 염증의 중증도를 평가하기 위해, 임상 건선 영역 및 중증도 지수 (PASI)에 기초한 객관적인 점수 체계 32를 사용하였다. 도 3c는 IMQ-유도 건선의 PASI 점수를 나타나며, 홍반 (E), 경화 (I), 비늘 (S)을 독립적으로 0 내지 4의 범위로 점수화하였다: 0, 없음; 1, 약간; 2, 중간; 3, 뚜렷함; 4, 매우 뚜렷함. PASI 점수에 대한 P 값 점수는 t-테스트로 계산되었다. 평균±SD 값으로 나타냈다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.0001).
도 4a 내지 4d는 IMQ 처리가 각질세포 증식 및 분화를 변경한다는 것을 나타낸 것으로, IMQ 처리 후의 표피 과형성을 보여준다. 도 4a는 포르말린-고정, 파라핀 포매 조직 박편을 H&E 염색으로 검사한 결과를 나타낸다. 100ⅹ배율 (눈금 바 = 15μm). 마지막 날에 각 그룹에서 대조군 및 알다라 크림 (5% IMQ) 처리된 마우스의 피부를 염색하였다. 많은 단핵구가 표피에 침투하였음을 나타낸다. 도 4b는 IMQ 처리된 귀의 두께를 나타내는 그래프이고, 도 4c는 표피 두께를 측정한 결과이며, 도 4d는 표피를 침투한 단핵구를 측정한 결과이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.0001). 통계적 테스트는 표피 두께의 경우 t-테스트 후 일원 ANOVA를 포함한다. 평균±SD 값으로 나타냈다 (*P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001).
도 5는 대식세포가 CRBN에 의해 조절된다는 것을 보여주는 것으로, 티오글리콜레이트 1ml의 주사 후, WT 마우스 및 CRBN KO 마우스의 복막 대식세포를 추출한다. 도 5의 A는 Raw 264.7 세포 사진이고, B는 복막 대식세포 생존을 MTT 분석으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이며, C는 산화질소 어세이 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 병변 피부의 사이토카인 수준을 나타낸 것으로, 병변에서 건선 관련 유전자의 전사 mRNA 발현을 보여주며, IMQ로 처리된 CRBN KO 마우스/WT 마우스에서 IL-1β, IL-6, IL-17, 및 TNF-α의 상대적인 피부 mRNA 발현을 분석하고 정량하여 각각 그래프로 나타내었다.
도 7은 이미퀴모드가 다양한 사이토카인을 유도한다는 것을 나타낸 표로, 알다라 크림 처리군과 대조군에 대한 사이토카인의 변화를 체크한다. 등 피부 및 혈청의 사이토카인이 분석되었고, 데이터는 각 군의 비교이다: (i) CRBN KO-대조군 및 WT-대조군, (ii) CRBN KO-알다라 크림 (5% IMQ) 처리군 및 WT-알다라 크림 (5% IMQ) 처리군, (iii) WT-알다라 크림 (5% IMQ) 및 WT-대조군, (vi) CRBN KO-알다라 크림 (5% IMQ) 처리군 및 CRBN KO 대조군.
도 8a 내지 8c는 IMQ에 의해 유도된 건선의 비장에서 iNOS의 발현이 염증 악화를 유도할 수 있다는 것을 보여주는 결과이다. 비장은 IMQ 처리 3시간 후에 추출되었다. 도 8a는 조직학적 분석을 위한 H&E 염색 결과이고, 도 8b는 웨스턴 블랏에 의한 CRBN KO 마우스 및 WT 마우스에 대한 정량적 iNOS 변화를 나타낸 것이며, 도 8c는 WT 및 CRBN KO 마우스의 비장 중량 변화를 나타낸 것이다. 비장 무게의 경우 통계적 테스트는 t-테스트를 포함한다. 평균±SD 값으로 나타냈다 (*P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001).
전염증성 사이토카인 (IL-17, TNF-α, 및 IL-6)은 건선의 발병에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 정확한 원인은 밝혀지지 않았다. 이에, 본 발명자들은 알다라 크림 (5% 이미퀴모드 (IMQ))으로 피부를 자극하여 건선과 유사한 반응을 나타내는 야생형 (WT) 및 CRBN 넉아웃 (KO) 마우스 모델을 이용하여 건선의 병인, 및 세르브론 및 건선 사이의 관계를 조사하였다. 그 결과, CRBN이 IL-17 및 대식세포 활성화를 조절하여 건선의 염증 반응을 완화시킬 수 있다는 것을 확인함에 따라, CRBN이 건선의 새로운 치료제로서 핵심 분자가 될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 알다라 크림 (5% 이미퀴모드 (IMQ))으로 피부를 자극하여 건선과 유사한 반응을 나타내는 야생형 (WT) 및 CRBN 넉아웃 (KO) 마우스 모델을 이용하여 건선의 병인, 및 세르브론 및 건선 사이의 관계를 조사하였다. CRBN KO 마우스는 특히 조직학적으로 WT와 비교하여 유의적으로 더 높은 염증 반응을 나타냈다. 표피에 침투된 대식세포 및 T 세포와 같은 면역 세포의 수가 증가하였고 등 및 귀를 비롯한 표피의 두께가 훨씬 두꺼워졌다. 등 피부에서, IL-6 및 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 발현 수준이 WT보다 CRBN KO 마우스에서 현저하게 높았다. 더욱이, 건선 병인의 중요한 인자로 알려진 IL-17은 CRBN 결핍 마우스에서 더 높았다. IMQ를 처리하였을 때, 피부에서 CRBN의 RNA 및 단백질 발현 수준은 감소하였으며, 이는 건선 병변에서 CRBN이 감소된 임상 결과와 일치하였다.
따라서, 본 발명은 CRBN의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "CRBN"은 "세르브론"을 지칭한다. CRBN 단백질은 CRBN 유전자에 의해 코딩되며, CRBN 단백질 및 이를 코딩하는 유전자는 진단하고자 하는 개체에서 발생할 수 있는 모든 형태의 CRBN 단백질 및 CRBN 유전자를 각각 포함한다. 구체적으로, 본 발명에서 용어 "CRBN 단백질"은 공지된 442개의 아미노산으로 이루어진 비변이 형태 또는 특정 아미노산의 치환, 삽입, 결실 등이 발생한 변이된 형태의 CRBN 단백질을 포함할 수 있고, 상기 비변이 또는 변이된 CRBN 단백질의 일부분을 포함할 수도 있다. 또한, 용어 "CRBN 유전자"는 상기 모든 형태의 CRBN 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함한다. 탈리도마이드의 표적 단백질로 알려진 CRBN 단백질은 뉴런 및 면역세포에서 발현되는 것으로 알려져 있지만, 각질세포에서 발현된다는 것은 아직까지 보고된 바가 없다.
본 발명에서 용어, "CRBN의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 제제"란 본 발명의 CRBN 유전자 또는 이들 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현수준을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 CRBN 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드이거나, 또는 CRBN 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 용어, "앱타머"란 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 상기 CRBN에 결합 활성을 갖는 앱타머는 각각의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 카피를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 정도를 통해 건선의 진단 또는 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 CRBN 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 건선의 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명은 또한, 전술한 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는 건선 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 CRBN 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 확인함으로써 건선의 진단 및 예후를 예측하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, CRBN 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 CRBN을 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 CRBN에 의해 코딩된 단백질의 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있으며, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 건선 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 개체의 피부 병변 및 비병변으로부터 분리된 생물학적 시료로부터 CRBN의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 피부 병변으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 정상 대조군 또는 상기 (a) 단계의 피부 비병변으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계.
본 발명의 건선 진단을 위한 정보제공방법은, (c) 상기 (a) 단계의 피부 병변으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상 대조군 또는 상기 (a) 단계의 피부 비병변으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준보다 낮은 경우, 건선으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "mRNA 발현수준 측정"이란 생물학적 시료에서 CRBN 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 DNA 칩(DNA chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어, "단백질 발현수준 측정"이란 생물학적 시료에서 CRBN 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자에서 발현된 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "생물학적 시료"란 이에 제한되는 것은 아니나, 개체의 피부 병변 및 비병변으로부터 분리된 피부 세포, 피부 조직 또는 혈청일 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란, 건선이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "정상 대조군"이란, 건선이 발병하지 않았거나, 발병이 의심되지 않는 개체를 의미한다.
본 발명의 건선의 진단을 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 CRBN 유전자의 발현수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다. mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법 및 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법은 상기에서 설명한 바와 같다.
대식세포에 의해 생성된 TNF-α는 건선의 염증성 반응에 영향을 미친다. 따라서, 본 발명자들은 건선 반응의 변화가 대식세포와 CRBN의 변화와 관련이 있는지 조사하였다. WT 및 CRBN KO 마우스의 대식세포에 알다라 크림 (5% IMQ)을 직접 투여하였고, CRBN이 없는 경우, 산화질소 수준이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 대식세포가 CRBN의 존재 또는 부재에 따라 면역 반응을 변경할 수 있음을 입증한다. 결국, CRBN은 IL-17 및 대식세포 활성화를 조절하여 건선의 염증 반응을 완화시킬 수 있다. 또한, CRBN의 이러한 역할은 건선의 새로운 치료제로서 핵심 분자가 될 수 있다.
따라서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 건선 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 건선 치료 후보물질을 건선이 발병된 개체의 피부 병변으로부터 분리된 생물학적 시료에 처리하여 CRBN mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 측정한 발현 수준을 상기 후보물질을 처리하기 전의 발현 수준과 비교하는 단계;
(c) 후보물질을 처리하기 전보다 CRBN mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준이 증가하는 경우, 상기 후보물질을 건선 치료제로 판단하는 단계.
본 발명의 용어 "치료후보 물질"이란, CRBN의 발현 또는 활성을 증가시킬 수 있는 물질로, 단백질, 화합물 등을 제한없이 포함한다.
본 발명의 건선 질환 치료제 스크리닝 방법에 있어서, 다른 이외의 구성은 전술한 바와 동일하므로 그 기재를 생략한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[준비예]
재료
DMEM, FBS (fetal bovine serum), 및 다른 조직 배양 시약은 Gibco/ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)로부터 구입하였다. CRBN 항체 (단일클론)은 SIGMA (HPA045910; St. Louis, MO)로부터 입수하였다. ECL (enhanced chemiluminescence) 웨스턴 블랏 검출 시약은 Supersignal West Pico 화학발광 기질 (34080; Piercem Rockford IL)로부터 구입하였다. LSP (lipopolysaccharide; Rockford IL)을 비롯한 다른 모든 시약은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.
프라이머
하기 실시예에서 RT-PCR에 사용된 프라이머 서열 (증폭 온도)은 다음과 같다: 마우스 S18 센스 (60℃), 5'-TTTGCGAGTACTCAACACCAACA-3', 및 안티센스, 5'-CCTCTTGGTGAGGTCAATGTCTG-3'; 마우스 CRBN 센스 (60℃), 5'-AGCATGGTGCGGAACTTAATC-3', 및 안티센스, 5'-ATCTCTGCTGTTGTCCCAAAC-3'; 마우스 TNF-α 센스 (61℃) 5'-GCCTCTTCTCATTCCTGCTTG-3' 및 안티센스 5'-CTGATGAGAGGGAGGCCATT-3'; 마우스 iNOS 센스 (65℃) 5'-GGGCTGTCACGGAGATCA-3' 및 안티센스 5'-CCATGATGGTCACATTCTGC-3'; 인간 TNF-α 센스, 5'-CCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3' 및 안티센스 5'-GCTACAGGCTTGTCACTCGG-3'; 인간 MCP-1 센스, 5'-CATTGTGGCCAAGGAGATCTG-3' 및 안티센스 5'-CTTCGGAGTTTGGGTTTGCTT-3', 인간 IL-6 센스 5'-GGTACATCCTCGACGGCATCT-3' 및 안티센스 5'-GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC-3'.
건선의 임상 징후와 관련된 CRBN 및 다양한 염증성 사이토카인의 평가
건선의 임상 징후와 관련된 CRBN 및 다른 염증성 사이토카인을 평가하기 위해, 건선 환자의 비병변 피부, 병변 피부 및 정상 대조군 피부에서 CRBN, IL-17A, MCP-1, TNF-α의 유전자 발현 수준을 비교하였다. 대조군 (n=64)과 건선 환자군을 분석을 위해 비병변 피부 (n=58) 및 병변 피부 (n=58)로 나누었고, 인간 건선에서의 유전자 발현은 공개 기탁된 데이터세트 (GDS4602)에서 데이터를 발굴함으로써 조사되었다.
도 1에 나타난 바와 같이 건선 환자에서 CRBN 발현수준은 대조군 보다 유의성 있게 낮았고 더 많은 CRBN이 병변보다 비병변 피부에서 발현되었다. 즉, 건선 유도 피부에서 CRBN 발현은 현저하게 감소되었다. 염증성 사이토카인인 IL-17A는 대조군 보다 건선 환자에서 현저하게 높은 발현 수준을 나타내었고, 비병변보다 병변 피부에서 더 많이 발현되었다. 이는 건선의 염증 반응이 IL-17A에 의해 발생하며, Th-17이 건선과 관련이 있음을 의미한다. 요약하면, IL-17A, IL-23, MCP-1, IL-6, 및 TNF-α를 포함한 다양한 염증성 사이토카인은 건선 염증반응을 유발할 수 있다.
CRBN KO 마우스 모델 및 CRBN 단백질의 발현
2-1. CRBN KO 마우스 모델 확립
C57BL/6N 백그라운드에 대한 CRBN-결핍 (CRBN KO) 및 WT 마우스의 생성은 문헌 [Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice, Diabetes, 62 (2013) 1855-1864.]에 설명된 바와 같다.
2-2. 건선에서 반응하는 CRBN 단백질의 발현
먼저, 상기 CRBN KO 마우스 (8-10주령의 C57BL/6 암컷 마우스)와 WT 마우스의 유전형 분석을 통해 도 2의 A의 a에 나타난 바와 같이 WT 및 CRBN KO를 입증하였다. 또한, 도 2의 A의 b에 나타난 바와 뇌에서 고도로 발현되는 것으로 알려진 CRBN은 용해된 뇌에 의해 CRBN이 없다는 것이 확인되었다.
그 다음, 생체 내 (in vivo)에서, WT 마우스를 매일 약 7일 동안 알다라 크림 (5% IMQ)으로 처리하였고, 수득된 등 피부 샘플의 단백질 추출물을 웨스턴 블랏으로 분석하였다.
구체적으로, 등 피부 샘플을 pro prep (인트론 바이오, 성남, 대한민국)을 사용하여 4℃에서 1시간 동안 용해시키고 13,000rpm에서 원심분리하여 맑아지게 했다. 단백질 분취액을 각 웰에 로딩시켰고, 8% SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동으로 분리하였으며, 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인의 차단은 5% BSA (바이오세상, 성남, 대한민국)를 사용하여 30분 동안 수행하였고 블랏은 CRBN에 대한 항체 (HPA045910; SIGMA, St.Louis, MO), 및 β-액틴 (sc47778 HRP; santa cruz(Santa Cruz, CA)에 대한 항체와 함께 배양하였다. 블랏은 Supersignal West Pico 화학발광 기질 (34080; Piercem Rockford IL)을 사용하여 발달시켰다. 동일한 로딩을 위해 멤브레인은 항-β-액틴으로 재블랏팅하였다.
그 결과, 도 2의 B의 a 및 b에 나타난 바와 같이 알다라 크림이 처리되지 않은 군은 처리된 군보다 더 높은 CRBN 발현을 나타냈고, 이는 도 1에 도시된 건선 환자의 CRBN 발현 데이터와 일치한다.
마우스 및 알다라에 의한 피부 염증 유도
본 실시예에서는 CRBN KO 마우스의 건선 환경에서 동일한 조건의 WT와의 임상적 그리고 조직학적 차이를 비교하기 위해 건선 유사 모델을 제작하였다.
동물은 정상적인 실험 조건, 즉, 12시간 명/암 주기 하에 21-24℃ 및 40-60% 상대 습도의 조건에서 표준 설치류 먹이와 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 모든 동물은 특정 병원체가 없는 조건에서 사육되었고, 실험 프로토콜 (2017-12-28)은 아산병원 동물실험윤리위원회 (대한민국, 서울)에서 검토 및 승인받았다. 도 3a에 나타난 바와 같이 8-10주령의 CRBN KO 마우스 (n=7) 및 야생형 마우스 (n=7)의 등 피부를 면도한 후, 매일 5% 이미퀴모드를 함유한 상업용 크림 (AldaraTM, MEDA Pharm) 83.3mg을 국소 투여량으로 등 피부 및 왼쪽 귀에 연속 5일 동안 처리하였다. 알다라 크림 (5% IMQ)은 Vspharm (3M Health care Limited, England)으로부터 구입하였다.
피부 병변의 중증도를 평가하기 위해, 다음의 파라미터로 이루어진 임상적 건선 영역 및 심각도 지수 (PASI)를 기반으로 하는 점수 체계를 사용하였다: 홍반, 스케일링 및 피부 두께. 이러한 파라미터는 독립적으로 (0 내지 4 범위: 0, 없음; 1, 약간; 2, 중간; 3, 뚜렷함; 및 4, 매우 뚜렷함) 그리고 누적하여 PASI로 점수가 매겨졌다. 마우스의 귀 두께, 등 및 귀 홍반, 그리고 등 피부 스케일링에 대한 임상 결과를 측정하기 위해, 실험은 5일째에 종료되었다.
도 3b에 나타난 바와 같이, 알다라 크림을 바르기 시작한지 3일 후, 마우스의 배면 피부는 홍반과 비늘의 징후를 보이기 시작했다. 4일째부터는 염증이 관찰되었고, 그 후 계속해서 염증반응이 증가하였다. 병변의 염증반응은 WT에서보다 CRBN KO에서 더욱 두드러졌고, 귀 두께는 유사했다. 귀 두께는 지속적으로 유의하게 증가했다. 또, 도 3c에 나타난 바와 같이, 홍반, 스케일링 및 피부 두께에 대한 PASI 점수도 WT에서보다 CRBN KO에서 높게 나타났다.
상기와 같은 결과를 통해 IMQ-유도 건선 피부염은 CRBN KO 마우스에서 악화된다는 것을 확인하였다.
IMQ 처리에 따른 병변 표피 분석
표피의 과발현 및 농축은 건선의 특징이다. 따라서, IMQ 처리 후 병변 표피의 임상적 및 조직학적 변화를 평가하기 위해, 건선의 유도 후 WT 및 CRBN KO 마우스에서 H&E 염색을 사용하였다. 구체적으로, 마지막 날에 각 그룹에서 대조군 및 알다라 크림 (5% IMQ) 처리된 마우스를 희생시키고 조직 검사를 위해 등쪽 병변 피부를 수집하였다. 포르말린-고정, 파라핀-포매 박편을 헤마톡실린&에오신 (H&E)으로 염색하고 검사하였다. 건선의 조직병리학적 특징으로 과각화증(hyperkeratosis), 부전각화증 (parakeratosis), 미세농양 호중구가 평가되었다.
알다라 크림 (5% IMQ)으로 처리된 WT 및 CRBN KO 마우스의 병변 표피 H&E 염색 분석은 도 4a에서 확인되는 바와 같이 표피가 대조군과 비교하여 상대적으로 비대화된 것으로 나타났다. 또한, 도 4b 및 4c에 나타난 바와 같이 IMQ 처리 후 귀 및 표피의 두께가 두꺼워졌음을 확인하였다. 도 4d는 표피를 침투한 단핵구를 측정한 것으로 IMQ 처리 후 CRBN KO 마우스에서 많은 단핵구가 표피에 침투하였음을 나타낸다.
이는 IMQ 처리가 각질세포의 증식 및 분화를 변경한다는 것을 의미하며, IMQ 처리 후에 표피가 과형성되었음을 의미한다. 결과적으로, IMQ 처리는 건선의 전형적인 조직학적 패턴과 일치하며, 조직학적으로, IMQ는 상피의 두께를 적어도 3배, 특히 CRBN KO 마우스에서 9배 증가시켰다.
CRBN에 의한 대식세포의 조절
대식세포는 건선의 염증반응에 기여하는 또 다른 경로이며, TNF-α를 비롯한 다양한 사이토카인을 생성한다. 따라서 본 실시예에서는 CRBN이 대식세포를 조절할 수 있는지 확인하였다.
5-1. 복막 대식세포의 준비 및 세포 배양
10 ml RPMI 1640 배지로 복막 세척 3일 전에 2ml의 4% 유체 티오클리콜레이트 배지를 복강 내 주사한 마우스로부터 복막 대식세포를 분리하였다. 수집된 세포를 RPMI 1640으로 세척하고 10% FBS, 2mM l-글루타민, 100U/ml 페니실린 및 100mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. 세포를 평평한 바닥 배양 플레이트 상에 도말한 후, 37℃, 5% CO2 가습 배양기에서 배양하였다.
5-2. MTT 및 NO 분석
상기와 같이 제조된 세포 (1×106 세포/ml)를 24웰 플레이트에서 배양하였다. 생체 외 (in vitro) 연구를 위해, LPS (1μg) 및 알다라 크림 (각각 5μM, 10μM, 25μM 및 50μM 농도)이 세포에 처리되었다. 24시간 처리 후 세포 생존을 MTT 분석으로 계산하였다. 모든 단백질 농도는 3번 테스트되었다.
또한, 배양 24시간 후 배양 상층액에서 분자상 산소를 갖는 NO의 안정한 반응 산물인 아질산염을 Griess 시약 [5% H3PO4 상의 1% 설파닐아미드 및 0.1% 나프틸에틸렌디아민 디하이드로클로라이드 1:1 혼합물 (v/v)]을 사용하여 측정하였다. 아질산염 수준은 540nm에서 비색적으로 측정하였다.
도 5에서 확인되는 바와 같이, WT 마우스에서, 대조군의 약 5배의 산화질소가 생성되었으나, KO 마우스에서 NO는 약 20배의 양으로 생성되었다. 이러한 결과는 CRBN KO 마우스에서 더 높은 수준의 염증 및 면역반응이 활성화되었음을 입증하며, 이는 생체 내 (in vivo) 실험과 일치한다.
IMQ-유도 건선 병변에서 관련 유전자의 mRNA 발현
건선에 영향을 미치는 사이토카인이 알다라 크림 (5 % IMQ)과 CRBN의 존재 차이에 의해 어떻게 변경되는지 조사하기 위해, 건선 피부 염증을 조절하는 것으로 알려진 주요 염증 유전자의 mRNA 발현을 측정하였다. 구체적으로, 알다라 크림 (5% IMQ) 처리군 및 대조군의 등 피부 및 혈청에서의 사이토카인의 변화를 조사하였다. TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. RNA는 IScript cDNA 합성 키트 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 역전사시켰다. 실시간 PCR은 iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories)를 포함하는 iCycler iQ 시스템 (Bio-Rad Laboratories) 상에서 수행하였으며, 프라이머는 상기 준비예에 기재된 프라이머를 사용하였다.
그 결과, 도 6에서 확인되는 바와 같이, 건선에서 가장 중요한 것으로 생각되는 IL-17은 알다라 크림 (5% IMQ)으로 처리된 CRBN KO 마우스에서 약 2배 증가했다.
IMQ-유도 건선 병변에서 관련 유전자의 전염증성 사이토카인
7-1. 사이토카인 분석
마우스의 혈청 및 등 피부 조직에서 IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-6, IL-10 및 IL-17의 농도를 제조사의 지시에 따라 ELISA 키트 (eBioscience)로 검출하였다. ELISA 판독기 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 20분 내에 450nm에서 흡광도를 판독하였다.
7-2. ELISA
세포 상층액 및 균질화된 조직 샘플에서 사이토카인 농도는 제조사의 프로토콜 (BioLegend, R&D Systems)에 따라 ELISA로 측정하였다.
그 결과, 도 7에서 확인되는 바와 같이 건선에 관여하는 전염증성 사이토카인 IL-6는 약 2.5 배 증가하였다. 대식세포의 활성화로 간주되는 TNF-α는 또한 알 다라 크림 (5% IMQ)으로 처리된 CRBN KO에서 유의하게 증가되었다. 따라서, CRBN은 IL-17 및 IL-6과 같은 중요한 전염증성 사이토카인 유전자를 조절함으로써 피부 염증 변화에 영향을 미친다.
CRBN KO 마우스의 IMQ -처리 피부에서 비장의 변화
8-1. IMQ 처리 후 비장의 임상적 및 조직학적 변화
IMQ 처리 후 비장의 임상적 및 조직학적 변화를 평가하기 위해, 건선의 유도 후 WT 및 CRBN KO 마우스에서 H&E 염색을 사용하였다. H&E 염색은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 8a에서 확인되는 바와 같이 IMQ-처리된 비장에서 산발적인 염색이 관찰되었다.
8-2. iNOS 발현 수준 확인
상기 실시예 2-2에 기재된 바와 같이 생체 내 (in vivo)에서, WT 마우스를 매일 약 7일 동안 알다라 크림 (5% IMQ)으로 처리하였고, 수득된 비장 샘플의 단백질 추출물을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. iNOS에 대한 항체 (61042; BD biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 iNOS 발현 수준을 측정한 결과, 도 8b에 나타난 바와 같이 흥미롭게도 IMQ-처리된 CRBN KO 마우스에서 iNOS의 발현 수준은 IMQ-처리된 WT 마우스보다 유의하게 더 높았다 (P<0.01). 이러한 데이터는 건선 모델에서 CRBN의 존재로 피부염증 반응이 억제되었음을 시사한다.
상기 실시예의 결과들을 통해, 피부에 국소적인 이미퀴모드 처리는 인간 표현형에서 그리고 조직학적으로 건선 유사 반응을 생성한다는 것이 확인되었고, 이 마우스 모델은 표피 과다증식 및 증가된 두께, 비늘, 홍반 및 단핵구의 높은 침투 수준을 나타냈다. IMQ 처리 동안 체내 염증성 사이토카인의 변화가 있었다. IL-17/23을 비롯하여, IL-6, TNF-α와 같은 사이토카인은 대략 일주일 동안 IMQ로 처리한 후 측정하였다. 이들 염증성 사이토카인은 건선 병변에서 높은 수준으로 발현되었으며, 이러한 결과는 건선 환자의 임상 데이터와 일치하였다.
또한, 건선 마우스 모델의 등 피부와 혈청에서의 염증성 사이토카인 수준은 CRBN KO 마우스의 병변 피부에서 증가되었다. 결과적으로, CRBN KO 마우스는 WT 마우스보다 현저하게 높은 염증성 반응을 나타냈다. 반면, CRBN 발현 수준은 WT의 병변 피부에서 현저하게 감소되었다. 이러한 반응은 건선 환자의 정상 피부에서 CRBN의 높은 발현을 제시하는 임상 데이터와 일치한다. 요약하면, CRBN은 염증성 사이토카인과 관련이 있고, 서로 음의 상관관계이다. 대식세포에서 주로 생성되는 TNF-α는 건선의 염증을 유발하여 대식세포에서 산화질소를 생성하도록 하는 사이토카인 중 하나이다. 티오글리콜레이트를 주사한 WT 및 CRBN KO 마우스로부터 추출된 대식세포를 상이한 농도의 IMQ로 처리하였다. 놀랍게도, CRBN KO 마우스의 대식세포는 높은 수준의 산화질소를 생성하였다. 즉, CRBN은 TNF-α의 생성을 억제하고 비교적 약한 염증 관련 현상을 유발한다. 이전의 연구에서 IMQ-자극 대식세포는 TNF-α 및 IL-6을 분비하고 각질세포의 활성화 및 증식을 유도하며, IL-23을 비롯한 다양한 사이토카인을 유도한다는 것을 보고하였다 (Chan JR et al., J Exp Med. 2006 Nov 27;203(12):2577-87.). 이 과정에서, Th-17은 각질세포의 염증성 루프에 관여하는 케모카인의 과발현과 염증성 사이토카인의 생성을 증폭시키는 것과 관련이 있었다 (Flutter B. et al., Eur J Immunol. 2013 Dec;43(12):3138-46.) IL-17은 Th-17에 의해 생산된 대표적인 사이토카인이며, 많은 연구에서 건선의 염증성 경로는 IL-23/IL-17로 인한 것임이 제시되었다. IL-17은 대조군보다 건선 마우스 모델의 등 피부에서 유의적으로 더 높은 수준으로 발현되었다. 그 중에서도, IMQ로 처리된 CRBN KO 마우스 모델은 동일한 조건의 WT 마우스 모델과 비교하여 약 3배의 IL-17 발현 수준을 나타냈다. IL-17 이외에도, CRBN KO 마우스 모델은 WT 마우스보다 TNF-α, IL-6, 및 MCP-1의 발현이 적어도 1.5배 더 높았다. 이러한 결과는 CRBN이 염증성 사이토카인을 억제하면서 염증반응에 관여한다는 것을 입증한다.
통계
결과는 평균±SD로 나타내었다. 그룹 간의 차이는 t-테스트 (두 개의 샘플 사이의 비교를 위해) 또는 GraphPad Prism 버전 5 소프트웨어 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 이용한 ANOVA (one-way analysis of variance)로 평가하였다. *P<0.05, **P<0.01은 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 것으로 간주되었다.
SEQUENCE LISTING <110> THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Composition and method for diagnosing psoriasis disease using cereblon <130> 1066526 <160> 14 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse S18 sense primer <400> 1 tttgcgagta ctcaacacca aca 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse S18 antisense primer <400> 2 cctcttggtg aggtcaatgt ctg 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse CRBN sense primer <400> 3 agcatggtgc ggaacttaat c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse CRBN antisense primer <400> 4 atctctgctg ttgtcccaaa c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse TNF-α sense primer <400> 5 gcctcttctc attcctgctt g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse TNF-α antisense primer <400> 6 ctgatgagag ggaggccatt 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse iNOS sense primer <400> 7 gggctgtcac ggagatca 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse iNOS antisense primer <400> 8 ccatgatggt cacattctgc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human TNF-α sense primer <400> 9 cccagggacc tctctctaat c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hunman TNF-α antisense primer <400> 10 gctacaggct tgtcactcgg 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human MCP-1 sense primer <400> 11 cattgtggcc aaggagatct g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human MCP-1 antisense primer <400> 12 cttcggagtt tgggtttgct t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human IL-6 sense primer <400> 13 ggtacatcct cgacggcatc t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human IL-6 antisense primer <400> 14 gtgcctcttt gctgctttca c 21

Claims (10)

  1. CRBN의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 CRBN 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는, 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 CRBN 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함하는 건선 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 건선 진단 또는 예후 예측용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인, 건선 또는 예후 예측용 키트.
  6. (a) 개체의 피부 병변 및 비병변으로부터 분리된 생물학적 시료에서 CRBN의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 피부 병변으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 정상 대조군 또는 상기 (a) 단계의 피부 비병변으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계; 를 포함하는 건선 진단을 위한 정보제공방법.
  7. 제6항에 있어서, (c) 상기 (a) 단계의 피부 병변으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상 대조군 또는 상기 (a) 단계의 피부 비병변으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준보다 낮은 경우, 건선으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 건선 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 피부 세포, 피부 조직 및 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 건선 진단을 위한 정보제공방법.
  9. (a) 건선 치료 후보물질을 건선이 발병된 개체의 피부 병변으로부터 분리된 생물학적 시료에 처리하여 CRBN mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 측정한 발현 수준을 상기 후보물질을 처리하기 전의 발현 수준과 비교하는 단계;
    (c) 후보물질을 처리하기 전보다 CRBN mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준이 증가하는 경우, 상기 후보물질을 건선 치료제로 판단하는 단계;를 포함하는 건선 질환 치료제 스크리닝 방법.
  10. 제9항에 있어서, 생물학적 시료는 피부 세포, 피부 조직 및 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 건선 질환 치료제 스크리닝 방법.
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