KR100896998B1 - Ｎ―〔2―（사이클로헥실옥실）―4―니트로페닐〕―메탄술폰아미드를 포함하는 세포 노화억제 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드를 포함하는 세포의 노화억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 실험에 사용한 3종의 선택적 COX-2 저해제 중 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드인 NS-398만이 세포노화를 억제하였고, 나머지 셀레콕시브와 니메설라이드는 세포노화를 촉진하였다. 또한 비선택적 COX 저해제 3종 (아스피린, 이부프로펜, 플루비프로펜)은 모두 세포노화를 촉진하였다.
세포노화가 진행되는 동안 COX-2의 발현은 감소한 반면 COX-2의 효소활성은 증가하였으며, 선택적 COX-2 저해제 3종의 세포노화 조절효과는 세포 내 활성 산소의 농도, NF-κB 활성, p53 및 p21 단백질의 양과는 무관하였다. 대신 선택적 COX-2 저해제 3종이 카베올린-1의 발현을 전사수준에서 조절하며 세포 내 총콜레스테롤 농도를 조절하는 것을 발견하였으며, 이 결과는 선택적 COX-2 저해제 3종의 세포노화 조절효과와 밀접한 관련이 있음을 발견하였다.
이와 함께 선택적 COX-2 저해제 3종 모두 세포에서 콜라겐 합성을 증진시키며, 기질분해효소(matrix metalloproteinases)인 MMP-2와 MMP-9의 활성을 억제함을 발견하였다.
이상의 결과들은 COX-2 효소활성이 세포노화 과정을 매개하고 있지 않으며, 본 발명의 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드는 COX-2 효소활성 억제가 아니라 카베올린-1 발현 조절과 관련된 기전을 통해 세포노화를 조절하 고 있음을 알 수 있으며, 이를 포함하는 조성물이 개체 노화를 조절할 가능성도 제시하고 있다.
Figure R1020070047015
COX-2 저해제, 노화, 카베올린, 콜라겐, MMP-2, MMP-9, N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드

Description

Ｎ―〔2―（사이클로헥실옥실）―4―니트로페닐〕―메탄술폰아미드를 포함하는 세포 노화억제 조성물{A Composition for Regulating Cellular Senescence Comprising Ｎ―〔2―（Cyclohexyloxyl）―4―nitrophenyl]―methanesulfonamide}
도 1의 A는 PD24인 세포에 DMSO (the vehicle), 선택적 COX-2 저해제인 NS-398 (20 μM), 셀레콕시브(celecoxib)(1 μM), 니메설라이드(nimesulide)(20 μM)를 처리한 후 세포분열횟수(PD)를 측정하여 나타낸 그래프이고, B는 A 세포를 35 mm dish에 깔고 SA-β-gal 염색을 시행한 후 찍은 사진이고, C는 이를 광학현미경 하에서 총 100개의 세포를 무작위로 센 후 이 중 SA-β-gal (+) 세포의 비율을 계산한 그래프이고, D는 비선택적 COX 저해제인 aspirin (1 mM), ibuprofen (20 μM), flurbiprofen (5 μM) 및 대조구 DMSO를 세포에 처리한 후 세포분열횟수(PD)를 측정하여 나타낸 그래프이고, E는 D 세포의 SA-β-gal 염색 사진이며, F는 E의 SA-β-gal (+) 세포의 비율을 그래프화 한 것이다. 이때 C 및 F의 오차막대는 이중 실험을 독립적으로 두 번 반복한 것의 평균 표준편차를 의미한다. *각 P < 0.05 (Mann-Whitney U-test, DMSO 처리 세포와 비교)
도 2의 A는 공여자(1)과 공여자(2)의 섬유아세포를 계대별로 모은 다음 총 단백질을 추출한 후 COX-1 및 COX-2의 웨스턴 블랏 분석을 시행한 결과로, β-actin은 로딩 컨트롤(loading control)로 사용한 것이고, B는 각 계대의 세포배양액을 모아 프로스타글란딘 E2의 농도를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것으로써, 프로스타글란딘 E2가 노화과정에서 증가한 결과를 보여주고 있으며 (*P < 0.05 (Mann-Whitney U-test, P15 세포와 비교)), C 및 D는 각각 선택적 COX-2 저해제 (C)와 비선택적 COX 저해제 (D)를 처리한 후 프로스타글란딘 E2의 농도를 측정한 결과를 그래프를 나타낸 것으로써, COX-2 저해제가 효율적으로 프로스타글란딘 E2의 생성을 억제하는 결과를 보여준다 (이때 프로스타글란딘 E2의 농도는 세포배양액을 모아 분석하였으며 이를 세포수로 보정하였다. 오차막대는 삼중 실험을 독립적으로 두 번 반복한 것의 평균값의 표준편차이며, *P는 < 0.05 (Mann-Whitney U-test, DMSO 처리 세포와 비교)이다.
도3 A는 각 계대의 세포에 DCFH-DA를 넣고 37℃에서 배양한 후 세포 추출물에서 형광을 분석한 후 활성산소종의 양이 노화과정에서 증가한 결과를 보여주는 그래프이며, 이때 오차막대는 이중 실험을 독립적으로 세 번 반복한 것의 평균값의 표준편차를 의미한다. *P < 0.05 (Mann-Whitney U-test, P15 세포와 비교). B는 P15 및 P29 세포에 선택적 COX-2 저해제를 처리한 후 활성산소종의 양의 변화를 측정한 그래프로서 P15에서는 아무변화가 없었으나, P29에서는 변화시켰다. 이때 오차막대는 이중 실험을 독립적으로 세 번 반복한 것의 평균ㅁ 표준편차를 의미한다. *P < 0.05 (Mann-Whitney U-test, DMSO 처리 세포와 비교). C및 D는 노화과정에서 항산화 효소인 카탈라아제, SOD-2 및 Gpx-1의 발현 정도를 western blot 분석하여 측정한 결과로서, C는 각 계대의 세포로부터, D는 P28 계대 세포에 선택적 COX-2 저해제 존재 하에서 배양된 세포로부터 웨스턴 블랏을 수행하였다.
도 4는 세포노화 과정에서 선택적 COX-2 저해제들이 NF-κB 활성에 미치는 효과에 대한 결과로서, A는 각 계대의 세포로부터 세포질 분획과 핵분획을 추출한 후 NF-κB p65 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과(위쪽 panel) 및 세포질 p65에 대한 핵 p65의 비율을 덴시토미터로 계산한 그래프(아래쪽 panel)이고, B는 저해제 존재 하에서 세포를 배양하고 P18에 수확한 다음 세포질 분획과 핵분획을 추출한 후 NF-κB p65의 양을 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과(위쪽 panel) 및 세포질 p65에 대한 핵 p65의 비율을 덴시토미터로 계산한 그래프(아래쪽 panel)이다.
도 5는 선택적 COX-2 저해제들이 p53과 p21의 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과로서, COX-2 저해제 존재 하에서 세포를 배양하고 각 계대에서 수확한 다음, 단백질을 추출한 후 p53 (A)와 p21 (B)의 양을 비교한 결과이다.
도 6은 세포노화 과정에서 선택적 COX-2 저해제들이 카베올린-1(caveolin-1)의 발현에 미치는 효과를 분석한 결과로서, COX-2 저해제 존재 하에서 세포를 배양하고 각 계대에서 수확한 다음, 단백질을 추출한 후 카베올린-1 양을 비교한 결과이고, B는 세포에 저해제를 각 시간별로 처리한 다음 카베올린-1 양을 비교한 결과이고, C는 NS-398과 DMSO (MG-132의 용매), 또는 NS-398과 50 uM MG-132 (proteasome 저해제)를 세포에 처리한 다음 카베올린-1 발현양을 비교한 결과이고, D는 세포에 각 시간별로 저해제를 처리한 후 총 RNA를 추출하고, caveolin-1과 GAPDH 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행한 사진이며, 이때 GAPDH는 각 조건별 세포에서 사용된 총 RNA 양을 확인한 대조구 (위쪽 panels)로서, caveolin-1 mRNA의 양(아래쪽 panel)을 GAPDH의 양으로 보정하였으며, E는 저해제 존재 하에서 세포를 배양하고 각 계대에서 수확한 다음 지방 성분을 추출하고 총콜레스테롤 농도를 측정한 결과를 그래프화 한 것으로, 이때 콜레스테롤 농도는 단백질 농도로 보정하였으며, 오차막대는 삼중 실험을 독립적으로 두 번 반복한 것의 평균±표준편차를 의미한다. *P < 0.05 (Mann-Whitney U-test, DMSO 처리 세포와 비교).
도 7의 A는 세포에 선택적 COX-2 저해제를 5일간 처리한 다음 콜라겐 합성 정도를 나타낸 그래프이며, 이때 콜라겐 값은 세포수로 보정하였으며, 오차막대는 이중 실험을 독립적으로 세 번 반복한 것의 평균ㅁ 표준편차를 의미하며 (*P < 0.05 (Mann-Whitney U-test, DMSO 처리 세포와 비교)), B는 세포에 저해제를 10일간 처리한 후 세포배양액에서 기질분해효소-2(MMP-2; 67 kDa)와 기질분해효소-9 (MMP-9;84 kDa)의 활성을 자이모그래피로 분석한 결과로서, 선택적 COX-2 저해제들이 섬유아세포에서 기질분해효소-2와 -9의 활성을 억제하여 콜라겐 분해를 감소시 킴을 시사한다.
본 발명은 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드를 포함하는 세포의 노화억제용 조성물에 관한 것이다.
세포의 노화는 발달, 성숙 및 종양 형성을 포함하는 복잡한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 하며, 세포노화의 기본적인 특징을 이해하기 위한 많은 시도가 이루어지고 있다. 그러나 노화의 기전이 무엇인지는 아직 완전하게 알려져 있지 않다. 한편, 호기성 대사과정에서 생기는 활성산소종이 세포를 손상시키고 이것이 노화의 중요한 요인이라는 가설이 설득력 있게 받아들여지고 있다 (1). 특히 최근에는 이와 관련하여 분자염증 가설이 제기되었는데, 이는 활성산소종이 전사인자 NF-κB의 활성을 증가시키고, 이로 인해 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2), iNOS와 같은 염증유발 유전자의 발현이 유도되고, 이들에 의해 다시 활성산소종 및 활성질소종이 생산됨으로써 세포 손상이 가속화되어 노화가 진행된다는 것이다 (2).
이를 뒷받침하는 증거로서, 노화된 쥐나 생쥐의 심장, 간, 신장, 뇌 등에서 NF-κB 활성이 증가되었다는 보고가 있으며(3), 사람 각질세포에서 NF-κB 유전자 를 발현시켰더니 세포노화가 일어났다는 보고가 있었다(4). 또한 NF-κB의 표적 유전자들 중 염증유발 유전자인 COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α의 발현이 노화된 쥐의 뇌, 신장, 비장 등에서 증가되어 있다는 보고도 있다 (5-9). DNA 마이크로어레이 연구에서도 COX-2, IL-1β, MCP-1, Gro-α, ICAM-1과 같은 염증유발 유전자들의 발현이 노화된 사람 피부섬유아세포에서 증가되어 있다는 것이 보고된 바 있다(10, 11).
COX-2는 분자염증 가설에서 핵심적인 분자이다. 이것은 아라키돈산과 산소로부터 프로스타글란딘 H2 (PGH2)를 만드는 효소인데, PGH2는 여러 프로스타글란딘 합성의 전구물질이 된다. COX의 두 가지 동위효소 중, COX-1은 대개 일정한 수준으로 발현되는 반면, COX-2는 여러 가지 자극에 의해 그 발현이 유도되어 다량의 다양한 종류의 프로스타글란딘을 합성하게 된다(12). COX의 최종 산물 중 특히 프로스타글란딘 E2 (PGE2)는 염증 반응을 일으키는 중요 물질이며, 지금까지 개발된 비스테로이드성 소염진통제들의 대부분이 COX의 효소 활성 부위를 억제한다. 비스테로이드성 소염진통제들 중 전통적으로 많이 사용되어 왔던 아스피린(aspirin), 이부프로펜(ibuprofen), 플루비프로펜(flurbiprofen) 및 인도메타신(indomethacin) 등은 COX-1과 COX-2를 구별하지 않고 효소 활성을 억제한다. 최근에는 COX-1과 COX-2를 선택적으로 억제할 수 있는 저해제들이 개발되었는데, 선택적 COX-1 저해제도 소염 활성을 갖고 있지만, 선택적 COX-2 저해제는 매우 강력한 소염 효과를 가지는 것으로 알려져 있다(13).
만약 분자염증이 노화를 일으키는 결정적인 원인이라면, COX-2 저해제들은 노화 과정을 지연시킬 수 있어야 할 것이다. 이와 관련하여 비특이적 COX 저해제가 노화 과정에 미치는 영향을 본 논문들이 있는데, 이부프로펜을 장기간 복용한 여성에서 노화에 따른 인지 기능 감퇴가 지연되었다(14). 그러나 초파리에서는 살리실산(salicylic acid), 아세틸 살리실산(acetylsalicylic acid), 인도메타신을 장기간 투여한 경우 평균수명이 감소되거나 아무런 영향이 없었다(15). 세포노화에 대해서는 아스피린(aspirin)이 사람의 혈관내피세포에서 노화를 억제시킨 반면, 인도메타신은 노화를 촉진시켰는데, 이 경우 저해제들은 COX 효소 활성 억제가 아니라 일산화질소와 활성산소종의 생성을 조절함으로써 노화를 조절하였다(16).
상술한 바와 같이, 최근 노화에 대한 다양한 이론들이 제안되고 있으나, COX-2의 염증유발 활성이 정말로 노화 과정에 관여하는지, 또한 COX-2 저해제가 노화를 예방할 수 있는지에 대해서는 아직 명확하지 않다.
이러한 노화 메커니즘을 명확히 하는 것은 노화를 역전시키고 정상적인 생리학적 기능의 회복이 필요한 노화 연관성 질병, 예컨대, 베르너 증후군 및 허친슨-길포드 증후군 등의 치료에 중요할 것으로 전망된다.
이에, 본 발명자들은 선택적 COX-2 저해제가 노화를 억제할 수 있는지를 알아보기 위하여 사람의 피부섬유아세포의 세포노화 모델에서 COX-2 저해제의 효과를 조사하고 연구한 결과, COX-2 저해제중에서 특히 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드가 COX-2 효소 활성과는 무관하게 세포노화를 조절하며, 카 베올린-1(caveolin-1) 발현 조절효과와 밀접하게 관련되어 있다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드를 포함하는 세포의 노화억제용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 명확하게 된다.
본 발명은 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드를 포함하는 세포의 노화억제용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드를 포함하는 세포의 노화억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 언급한, "N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드"은 하기 화학식 1로 표기되는, 술폰아닐라이드 화합물에 속하는 화합물로서, 선택적인 COX-2 저해제이다.
Figure 112007035709870-pat00001
본 발명에서,"세포 노화억제"는 세포내 카베올린의 합성을 억제하여 노화를 억제하거나, 카베올린 합성을 유도하여 노화를 유도하는 방법을 말하며, 여기에서 카베올린은 카베올린-1, 카베올린-2 및 카베올린-3의 단백질 및 mRNA를 모두 포함한다. 또한 세포내 콜라겐대사 경로를 통하여 세포의 노화를 억제하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 노화억제는 세포내 활성 산소종 경로, 산화 스트레스에 민감하게 반응하는 전사인자 NF-κB의 경로 및 세포내 p53 및 p21 경로와는 무관하게 세포노화를 조절하며, 카베올린-1의 경로를 통하여, 예컨대, 카베올린-1의 합성을 억제하여 세포의 노화를 억제할 수 있다. 또한 본 발명의 저해제에 의하여, 콜라겐 합성을 증진시키며, 기질분해효소인 MMP-2 및 MMP-9의 활성을 억제하여 노화를 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포는 동물세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바 람직하게는 인간의 세포, 가장 바람직하게는 인간의 섬유아세포를 의미한다.
본 발명의 조성물은 연구용 조성물로서 제조될 수 있으나, 약제학적 조성물로도 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우에는, siRNA 이외에 약제학으로 허용되는 담체도 포함한다. 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 바람직한 투여 형태는 전신 투여인 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 또는 경피 투여이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
또한, 본 발명은 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드의 유효량을 노화세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포의 노화 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 세포의 노화를 조절하는 것을 필요로 하는 환자의 세포 노화 조절 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 어떠한 세포에도 적용할 수 있으나, 치료의 목적에서 보다 중요한 세포는 중추 신경계에서 (a) 복제능 (replicative capacity)을 갖는 세포: 예컨대, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질활, 헌팅톤 질환 및 뇌졸중과 같은 노화-관련 질병에서 중요한 역할을 하는 아스트로사이트, 내피세포 및 섬유아세포; (b) 외피 (integument)에서 제환된 복제능을 갖는 세포: 예컨대, 피부 아트로피, 탄성섬유분 해 (elastolysis) 및 피부 주름, 피지선 과형성, 노인성 흑점, 모발 백화 및 모발 손실, 만성피부궤양 및 노화-관련 상처 치유능의 약화와 같은 외피의 노화-관련 질병에 중요한 역할을 하는 섬유아세포, 피지선 세포, 멜라노사이트, 케라티노사이트, 랑게르한스 세포 및 모낭세포; (c) 관절연골에서 제한된 복제능을 갖는 세포: 예컨대, 퇴행성 관절 질환에서 중요한 역할을 하는 연골세포, 및 음와 및 활 섬유아세포 (lacunal and synovial fibroblasts);(d) 뼈에서 제한된 복제능을 갖는 세포:예컨대, 골다공증에서 중요한 역할을 하는 조골세포, 골수 간질 (stromal) 섬유아세포 및 골전구 세포; (e) 면역계에서 제한된 복제능을 갖는 세포: 예컨대, 노화 관련 면역계 약화에 중요한 역할을 하는 B 및 T 림포사이트, 모노사이트, 중성구 (neutrophil), 호산구, 호염기성백혈구, NK 세포 및 이들 각각의 전구 세포; (f) 혈관계에서 제한적인 복제능을 갖는 세포: 예컨대, 동맥경화, 석회화, 혈전 및 동맥류와 같은 혈관계의 노화-관련 질환에 중요한 역할을 하는 표피 세포, 민무늬근 세포 및 외막 섬유아세포 (adventitial fibroblast) 및 (g) 눈에서 제한된 복제능을 갖는 세포: 예컨대, 황반변성에 중요한 역할을 하는 착색된 상피 및 혈관 내피 세포.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 세포는 인간 세포와 같은 포유류 세포에서 유래된다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 세포는 섬유아세포이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
I. 실시예
본 발명의 실험을 위해서 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드는 케이만 케미칼사의 NS-398을 사용하였다.
실시예 1. 세포 배양
사람의 피부섬유아세포는 보이스 및 함의 문헌(1983)에 따라 음경포피(foreskin)에서 분리한 후, 10% 우태아혈청 (라이프 테크날리지 Inc., 그랜드 아일랜드, NY), 페니실린(penicillin;100 units/ml), 스트렙토마이신 (streptomycin;100 units/ml)이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 일반적인 배양 세포는 계대수가 높아짐에 따라 성장 속도도 느려졌으며, 계대수 30 이상의 세포는 완전히 성장이 정지되어 기존에 보고된 복제적 노화 (replicative senescence)와 같은 특징적인 현상을 나타내기 시작하였다 (Yeo et al., 2000 a and b).
실시예 2. COX-2 저해제에 의한 성장속도 조절실험
COX-2 저해제가 세포노화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 선택적 COX-2 저해제 3종인 NS-398, 셀레콕시브(celecoxib), 니메설라이드(nimesulide) 및 COX-1 과 COX-2의 활성을 둘 다 억제하는 비선택적 COX 저해제 3종 아스피린(aspirin), 이부프로펜(ibuprofen), 프루비프로펜(flurbiprofen), 그리고 대조구로서 DMSO (vehicle)를 세포에 처리한 후 다음과 같이 일반적인 세포염색방법으로 염색하여 세포분열횟수(PD)를 측정하였다. 우선, PD24인 세포에 DMSO (대조구), NS-398 (20 μM), celecoxib (1 μM), nimesulide (20 μM), aspirin (1 mM), ibuprofen (20 μM), flurbiprofen (5 μM)를 각각 처리하여 배양 한 후 세포 염색법인 트리판 블루(trypan blue) 염색법에 의해 세포 수를 계산하였으며, 이때 세포분열횟수(PDs)는 하기 수학식 1에 의해 계산하였다.
세포분열횟수(PDs)=log(A/B)/log2
상기 A는 한 계대(passage)에서 수확한 세포 수이며, B는 상기 계대의 초기 세포 수이다.
실시예 3. 노화-관련 β-갈락토시다아제(SA-β-gal) 염색
COX-2 저해제가 세포노화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 선택적 COX-2 저해제 3종인 NS-398, 셀레콕시브(celecoxib), 니메설라이드(nimesulide) 및 COX-1과 COX-2의 활성을 둘 다 억제하는 비선택적 COX 저해제 3종 아스피린(aspirin), 이부프로펜(ibuprofen), 프루비프로펜(flurbiprofen), 그리고 대조구로서 DMSO (vehicle)를 세포에 처리한 후 노화-관련 β-갈락토시다아제(senescence-associated β-galactosidase(SA-β-gal)) 염색을 실시하였다. 이때 β-갈락토시다 아제(Senescence-associated β-galactosidase(SA-β-gal))활성 염색은 1995년 딤리 등에 의한 방법에 따라 다음과 같이 수행하였다(17). 우선, 세포에 DMSO (대조구), NS-398 (20 μM), celecoxib (1 μM), nimesulide (20 μM), aspirin (1 mM), ibuprofen (20 μM), flurbiprofen (5 μM)을 각각 처리하여 배양하였다. 배양한 세포는 35 mm dish에 시딩한 다음 안정화시킨 후, PBS로 2번 세척하고, 3% 포름알데하이드로 실온에서 5분 동안 고정한 다음 PBS로 다시 한번 세척하고, β-갈락토시다아제(SA-β-gal)활성 용액(1 mg/ml X-gal, 40mM 시트르산/소듐 포스페이트, pH 6.0, 5 mM 포타슘 페로사이아나이드, 5 mM 포타슘 페리사이아나이드, 150 mM 소듐 크로라이드, 2 mM 마그네슘 크로라이드)으로 37℃에서 24시간동안 염색하였으며, 반응이 진행되는 동안 빛을 차단하여 반응을 실시하였다. 최종적으로 염색된 세포들을 위상차 현미경(올림푸스, CK40)으로 발색정도를 확인한 다음 총 100개의 세포를 무작위로 세었으며 이 중 SA-β-gal (+) 세포의 비율을 계산하였다. 상기 실험은 독립적으로 두 번 반복 실험하였고, 각 값의 평균값 및 표준편차를 계산하였다.
실시예 4. 프로스타글란딘 E 2 (PGE 2 )분석
COX-2 저해제가 프로스타글란딘 E2(PGE2) 양에도 영향을 미치는지 분석하기 위하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 COX-2 저해제를 처리하여 배양한 다음 배양된 세포의 배양배지를 엘라이자(ELISA; Cayman Chemicals, Ann Aror, MI)를 이용하여 측정하여 배지로 분비되어 나온 PGE2의 양을 측정하고, 이 값을 세포수로 보정하였 다.
실시예 5. 활성산소종 측정
COX-2 저해제가 세포노화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 실시예 2와 동일하게 배양하고 처리한 후 활성산소종을 측정하였다. 배양된 세포는 5μM DCFH-DA(인비트로젠, 칼스버드, CA)를 처리하고 37℃에서 45분 동안 반응시킨 뒤 PBS로 세척하였다. 세포를 1 ml PBS에 모은 다음 초음파를 이용하여 분쇄하였다. 형광분광광도계(모레큘러 디바이스 캅스., 서니베일, CA)로 형광을 측정하고 이 값을 세포수로 보정하였다.
실시예 6. 웨스턴 블랏
COX-2 저해제가 세포노화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 실시예 2와 동일한 조건으로 배양하고 처리한 후 웨스턴 블랏을 실시하였다. 배양된 세포는 PBS로 세척하고 모은 다음, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 μg/ml 루펩틴(leupeptin), 10 μg/ml 어프로티닌(aprotinin), 10 μg/ml 펩스타틴(pepstatin)이 포함된 RIPA 완충용액(150 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 1% 트윈-20, 1% 소듐 디옥시콜레이트 및 0.1% SDS)에서 분쇄하고, 이를 원심분리하여 상등액만을 모은 세포추출물을 이용하여 세포내 단백질을 SDS-PAGE으로 분리하고, 니트로셀룰로스 막에 옮긴 다음 p53, p21, COX-1, COX-2 및 카베올린-1(caveolin-1) 항체와 각각 반응시키고, 니트로셀룰로스 막의 단백질-항체 복합체를 퍼옥시다아제-접합 항 마우스 또는 항-토끼 이 차 항체와 반응시킨 다음, 해당 밴드를 ECL 키트를 사용한 화학발광법(아머샴 바이오사이언스, 보스톤, MA)으로 시각화하여 확인하였다. 이때 사용한 p53, p21, COX-1에 대한 항체는 각각 온코진 사이언스(Oncogene Science; 캠브리지, MA), 셀 시그날링 테크날리지(Cell Signaling technology; 댄버스, MA), 산타 크루즈 바이오테크날리지(Santa Cruz, CA)로부터 구입하였으며, COX-2와 카베올린-1(cavelolin-1) 항체는 비디 바이오사이언스(BD Bioscience; San jose, CA)로부터 구입하였다. 또한 β-actin을 세포내 대조 단백질로 하여 세포내 전체 단백질 양을 보정하였다.
실시예 7. RT-PCR
COX-2 저해제가 세포노화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 실시예 2와 동일하게 배양하고 처리한 후 RT-PCR을 실시하였다. 세포의 총 RNA는 트리졸 리에이전트(TRIzol reagent; 라이프 테크날리지 Inc.,그랜드 아일랜드, NY)를 사용하여 추출한 다음 총 RNA 0.5 μg으로부터 역전사(RT)키트(퀴아젠, 발렌시아, CA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 카베올린-1 유전자는 센스 프라이머(5'-ACA TCT CTA CAC CGT TCC CAT-3')와 안티센스 프라이머 (5'-TGT GTG TCC CTT CTG GTT CTG -3')를 이용하여 증폭시켰고, GAPDH 유전자는 센스 프라이머 (5'-TGT TGC CAT CAA TGA CCC CTT-3')와 안티센스 프라이머 (5'-CTC CAC GAC GTA CTC AGC G-3')를 이용하여 증폭시켰다. 상기 중합 연쇄반응은 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 총 25회 반복 실시하여 실행하였고, 이때 얻은 DNA 산물은 EtBr이 포함된 2% 아가로스 겔에서 전기영동하였다.
실시예 8. 콜레스테롤 분석
COX-2 저해제가 세포노화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 실시예 2와 동일하게 배양하고 처리한 후 콜레스테롤 분석을 실시하였다. 2ㅧ 106 개의 세포로부터 클로로폼:메탄올=2:1 혼합물을 처리하여 지방성분을 추출한 다음, 바이오비전(BioVision, Mountain View, CA)사의 매뉴얼에 따른 착색방법으로 570 nm에서총 콜레스테롤 량을 측정하였으며, 이를 단백질 농도로 보정하였다.
실시예 9. 콜라겐 생합성 측정
COX-2 저해제가 세포노화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 실시예 2와 동일하게 배양하고 처리한 후 콜라겐 생합성 함량을 분석하였다. 콜라겐 생합성 분석은 Robert 등에 의한 방법에 따라 수행하였다(18). 이를 간단히 살펴보면, 먼저 세포에 L-[2,3-3H]-프롤린(아머샴 바이오사이언스, 보스톤, MA)을 5 μCi/ml 농도로 가하고 24시간 동안 배양하였다. 세포배양액과 세포를 각각 모은 후 세포는 100 mM NaCl과 10 mM proline이 포함된 50 mM Tris-HCl (pH 7.2)에서 초음파를 이용하여 분쇄하였다. 배양액 및 세포추출물 상층액에 각각 트리클로로아세틱 애시드(TCA)를 첨가하고, 침전물을 0.2 M NaOH에 녹인 후, 150 mM HCl 과 HEPES로 중화한 다음, 세균의 콜라게나아제(collagenase)를 용액에 첨가하였다. 원심분리 후에 각각의 상층액을 합한 후 방사능을 측정하였다.
실시예 10. 젤라틴 겔 자이모그라피
COX-2 저해제가 세포노화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 실시예 2와 동일하게 배양하고 처리한 후 젤라틴 겔 자이모그라피를 실시하였다. 세포배양액을 1 mg/ml 젤라틴이 포함된 SDS-PAGE에서 전기영동하였다. 2.5% 트리톤 X-100으로 겔을 세척한 후, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.02% NaN3가 포함된 용액에 담가 두었다가 0.1% 코마시 블루 용액으로 염색하였다.
II. 실시예 결과
1. COX-2 저해제들이 사람 섬유아세포에서 세포노화를 조절한다.
COX-2 저해제가 세포노화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 선택적 COX-2 저해제 3종(NS-398, 셀레콕시브(celecoxib), 니메설라이드(nimesulide)), COX-1과 COX-2의 활성을 둘 다 억제하는 비선택적 COX 저해제 3종 (아스피린(aspirin), 이부프로펜(ibuprofen), 플루비프로펜(flurbiprofen)) 및 대조구로서 DMSO (vehicle)를 세포에 처리하여 세포분열 횟수를 조사하였으며, 이때 DMSO 자체는 세포분열 횟수에 아무런 영향이 없었다.
상기 실험에서 3종의 선택적 COX-2 저해제 중의 하나인 NS-398은 DMSO에 비해 최대세포분열 횟수를 7번 증가시킨 반면, 셀레콕시브와 니메설라이드는 최대세포분열 횟수를 2번 감소시켰다 (도 1A). 또한 노화 마커인 SA-β-gal 양성 세포의 비율도 NS-398이 DMSO에 비해 2배 감소시킨 반면, 셀레콕시브와 니메설라이드는 이를 각각 1.5배, 1.3배 증가시켰다 (도 1B와 C).
비선택적 COX 저해제인 아스피린, 이부프로펜, 플루비프로펜은 DMSO에 비해 최대세포분열 횟수를 각각 7회, 5회, 4회 감소시켰으며 (도 1D), SA-β-gal 양성 세포의 비율도 각각 1.9배, 1.7배, 1.6배 증가시켰다 (도 1E와 F).
이러한 결과들은 NS-398이 사람 섬유아세포에서 세포노화를 강력하게 억제하는 반면, 다른 선택적 COX-2 저해제들과 비선택적 COX 저해제들은 세포노화를 촉진하고 있음을 보여준다.
2. COX-2 저해제들은 COX-2 효소활성 억제와 무관하게 사람 섬유아세포의 노화를 조절한다.
세포노화가 진행되는 동안 COX-1과 COX-2의 발현은 유의하게 감소하였으며 이것을 두 종류의 서로 다른 사람 섬유아세포에서 관찰하였다 (도 2A). 그러나 흥미롭게도 최종 산물인 프로스타글란딘 E2의 생성은 노화과정 동안 유의하게 증가하였는데 (도 2B), 이것은 COX의 발현이 감소함에도 불구하고 효소 활성은 증가한다는 것을 시사한다.
세포에 선택적 COX-2 저해제를 처리하면 프로스타글란딘 E2의 생성이 거의 완전하게 차단되는데 (도 2C), 이것은 노화에 따른 프로스타글란딘 E2의 증가가 주로 COX-2 효소 활성 증가에 기인한다는 것을 보여준다. 선택적 COX-2 저해제 뿐만 아니라 비선택적 COX 저해제도 거의 완전하게 프로스타글란딘 E2의 생성을 억제하였고 (도 2D), 이것은 본 실험에 사용된 저해제들이 각 농도에서 COX-2의 효소 활성을 효율적으로 차단하고 있음을 확인해 준다.
이상의 결과들은 COX-2 저해제들이 사람 섬유아세포에서 세포노화를 조절하는데, 이것이 COX-2 효소활성 억제와는 무관한 기전에 의한다는 것을 시사한다.
3. 선택적 COX-2 저해제에 의한 세포노화 조절은 활성산소종과는 무관하다
선택적 COX-2 저해제들이 세포노화를 조절하는 기전을 밝히기 위하여, 먼저 저해제들이 활성산소종의 발생과 NF-κB 활성에 미치는 영향을 조사해 보았다.
세포 내 활성산소종의 양은 기존에 보고된 것처럼 세포노화 과정 동안 점진적으로 증가하였다 (도 3A). 장기간 (65일) 저해제들을 처리한 경우, NS-398은 활성산소종의 양을 3배 감소시킨 반면, 셀레콕시브와 니메설라이드는 그 양을 1.2배 증가시켰다 (도 3B, P29). 그러나 단기간(7일) 저해제들을 처리한 경우에는 세 약물 모두 활성산소종의 양에 아무런 영향을 미치지 못하였다 (도 3B, P15). 이것은 선택적 COX-2 저해제들이 활성산소종의 발생 자체에는 영향을 미치지 못한다는 것을 시사한다. 저해제를 장기간 처리한 경우에 나타나는 활성산소종 조절 효과는 저해제들의 세포노화 조절효과에 따른 이차적인 현상인 것으로 생각된다.
세포노화 과정 동안 카탈라아제(catalase), SOD-2(superoxide dismutase-2), Gpx-1(glutathione peroxidase-1)과 같은 항산화 효소의 발현은 증가하는 것으로 관찰되었다 (도 3C). 이에 대해 NS-398은 카탈라아제, SOD-2의 발현은 감소시키고 Gpx-1의 발현은 증가시켰다. 셀레콕시브는 카탈라아제, SOD-2의 발현은 감소시키고 Gpx-1의 발현에는 영향이 없었다. 니메설라이드는 카탈라아제, SOD-2, Gpx-1의 발현을 모두 감소시켰다 (도 3D). 이처럼 저해제들이 항산화 효소들의 발현에 영향을 미치기는 하였지만, 이것이 저해제들의 노화조절 효과와는 일치하지 않았다. 이는 선택적 COX-2 저해제들이 활성산소종의 발생을 조절함으로써 세포노화를 조절하는 것은 아니라는 것을 다시 한번 시사한다.
4. 선택적 COX-2 저해제에 의한 세포노화 조절은 NF-κB 경로와는 무관하다
전사인자 NF-κB는 산화 스트레스에 민감하게 반응하며 노화 과정에서 그 활성이 증가된다는 것이 보고된 바 있다 (19). 그러나 사람 섬유아세포의 경우에는 노화된 세포에서 젊은 세포에 비해 오히려 NF-κB의 핵이동이 현저하게 감소되어 있었고 (도 4A), 선택적 COX-2 저해제들은 NF-κB의 핵이동에 영향을 미치지 못하였다 (도 4B). 이러한 결과는 NF-κB가 사람 섬유아세포의 세포노화 과정에서 결정적인 역할을 하지 않는다는 것과, 선택적 COX-2 저해제의 세포노화 조절효과도 NF-κB 경로와는 무관하다는 것을 의미한다.
5. 선택적 COX-2 저해제들에 의한 세포노화의 조절은 p53/p21 경로와는 무관하다.
p53/p21 경로는 사람 섬유아세포의 세포노화 과정에서 핵심적인 역할을 한다 는 것이 잘 알려져 있는 경로이다. 따라서 선택적 COX-2 저해제들이 p53과 p21의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.
p53과 p21의 발현은 세포노화 과정에서 증가하였으며 이는 기존에 보고된 바와 일치하였다 (도 5A와 B). 이에 대해 NS-398은 p53의 발현은 억제하지 않으면서도 p21의 발현을 억제하였다. 셀레콕시브는 p53과 p21의 발현을 동시에 억제하였다. 니메설라이드는 p53과 p21의 발현을 증가시켰다 (도 5A와 B). 이러한 결과들은 저해제들이 p53/p21 경로에 영향을 미치고 있음을 보여준다. 그러나 그 영향이 저해제들의 노화조절 효과와는 일치하지 않았다. 이것은 선택적 COX-2 저해제들이 p53/p21 경로를 통해 세포노화를 조절하는 것은 아니라는 것을 시사한다.
6. 선택적 COX-2 저해제들의 노화 조절효과는 카베올린-1(caveolin-1)의 발현과 밀접하게 연관되어 있다.
카베올린-1은 사람 섬유아세포의 세포노화 과정에서 핵심적인 역할을 한다는 것이 알려져 있는 또 다른 분자이다 (20). 선택적 COX-2 저해제가 세포노화를 조절하는 기전을 규명하기 위하여, 저해제가 카베올린-1의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.
카베올린-1의 발현은 기존에 보고된 것처럼 노화 과정에서 증가하였다 (도 6A). 이에 대해 NS-398은 모든 계대에서 그 발현을 억제하였으며, 반면에 셀레콕시브와 니메설라이드는 그 발현을 증가시켰다 (도 6A). NS-398은 4시간만 처리해도 카베올린-1의 발현을 뚜렷하게 억제하였다. 그러나 셀레콕시브와 니메설라이드는 단시간 처리에서는 카베올린-1의 발현을 유의하게 변화시키지 못하였다 (도 6B). 이러한 결과들은 선택적 COX-2 저해제들의 세포노화 조절효과와 일치하며, 따라서 선택적 COX-2 저해제들의 세포노화 조절 효과는 카베올린-1의 발현과 밀접한 연관이 있음을 시사한다.
NS-398이 카베올린-1의 발현을 억제하는 효과가 매우 빨랐기 때문에, NS-398이 프로테아좀(proteasome)에 의한 단백질 분해를 통해 카베올린-1의 발현을 감소시키는 것인지를 실험해 보았다. 도 6C에서 보인 바와 같이 카베올린-1의 발현에 대한 NS-398의 억제 효과는 프로테아좀 저해제인 MG132에 의해 회복되지 못했다. 이것은 NS-398이 프로테아좀에 의한 단백질 분해를 통해 카베올린-1의 발현을 억제하는 것은 아니라는 것을 의미한다.
그렇다면 카베올린-1의 발현은 전사 수준에서 조절될 가능성이 매우 높다. 이러한 가능성을 확인하기 위하여 카베올린-1의 mRNA의 양을 측정해 보았다. 실험 결과 NS-398이 카베올린-1의 mRNA의 양을 감소시킨 반면, 셀레콕시브와 니메설라이드는 그 양을 증가시켰다 (도 6D). 이것은 선택적 COX-2 저해제가 전사 수준에서 카베올린-1의 발현을 조절함으로써 세포 노화를 조절함을 강하게 시사한다.
콜레스테롤은 카베올린-1의 발현에 중요한 조절인자로 알려져 있다 (21). 따라서 선택적 COX-2 저해제가 세포 내 총콜레스테롤 농도에 미치는 영향을 조사해 보았다. 세포 내 총콜레스테롤 농도는 젊은 세포에 비해 노화된 세포에서 1.7배 증가하였으며 (도 6E), 이는 기존에 보고된 바와 같았다 (22). 한편 NS-398은 총콜레스테롤 농도를 감소시킨 반면, 셀레콕시브와 니메설라이드는 그 농도를 증가시켰다 (도 6E). 이러한 결과는 선택적 COX-2 저해제들이 세포 내 콜레스테롤 농도를 조절함으로써 카베올린-1의 발현을 조절하고 그로 인해 세포노화를 조절할 가능성이 크다는 것을 시사한다.
7. 선택적 COX-2 저해제들이 피부 섬유아세포에서 콜라겐 대사를 개선시킨다.
내인성 (intrinsic) 피부 노화는 진피층에 콜라겐 함량이 감소되어 있는 것과 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다. 생화학적으로 콜라겐 함량은 진피층 섬유아세포에 의한 콜라겐 합성 속도와, 섬유아세포 및 각질세포로부터 분비되는 기질분해효소 (matrix metalloproteinases)에 의한 콜라겐 분해 속도간의 균형에 의해서 결정된다. 개체 노화가 진행될수록 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 합성 속도는 감소되는 반면 기질분해효소에 의한 분해 속도는 증가됨으로써 피부 진피층의 콜라겐 함량이 감소된다 (23).
선택적 COX-2 저해제가 피부 섬유아세포의 노화를 조절함을 관찰하였기 때문에, 저해제들이 콜라겐 대사에는 어떤 영향을 미치는지를 조사해 보았다. 흥미롭게도 3종의 선택적 COX-2 저해제 모두 피부 섬유아세포에서 콜라겐 합성 속도를 2배 가량 증가시켰으며 (도 7A), 기질분해효소-2와 기질분해효소-9의 활성을 감소시켰다 (도 7B). 이러한 결과들은 콜라겐 대사에 COX-2 효소 활성이 관여하고 있으며, 선택적 COX-2 저해제들이 세포노화에 대해서는 서로 다른 효과를 보여주었지만 실제 피부 노화에 대해서는 3종 모두 억제할 가능성이 있다는 것을 시사한다.
III. 고찰
최근 COX-2가 염증 유발성 효소 활성을 통하여 개체 및 세포노화를 매개한다는 제안이 있었다 (2,24). 그러나 개체 및 세포노화 과정에 있어서 COX-2의 기능은 아직 명확하지 않다. 본 연구에서 우리는 2종의 선택적 COX-2 저해제와 3종의 비선택적 COX 저해제가 세포노화를 촉진한다는 것을 발견하였으며 (도 1), 이것은 COX-2의 효소 활성이 적어도 사람 섬유아세포에서는 세포노화를 매개하지 않는다는 것을 보여준다. 또한 3종의 선택적 COX-2 저해제들이 세포노화에 대해 각기 다른 효과를 보였는데 (도 1A), 이것은 COX-2 저해제들의 세포노화 조절효과가 효소 활성과는 무관한 기전에 기인한다는 것을 뜻한다. 이러한 결과들은 아스피린이 사람의 혈관내피세포에서 세포노화를 억제하는 반면 인도메타신(indomethacin)은 세포노화를 촉진하며, 이것이 COX 효소활성 억제에 의한 것이 아니라 일산화질소 및 활성산소종의 생성 조절에 기인한 것이라는 이전 보고와 일치한다 (16).
비선택적 COX 저해제 뿐만 아니라 선택적 COX-2 저해제들도 효소활성 억제와는 상관없는 다양한 생리활성을 가지고 있다는 것이 알려져 있다. 예를 들면 NS-398, 니메설라이드 등의 선택적 COX-2 저해제들은 사람의 프로모노사이트(promonocyte)에서 활성산소종을 제거한다 (25). 또한 NS-398과 셀레콕시브는 p21과 p27의 발현뿐만이 아니라 NF-κB, ERK, Akt의 활성을 조절한다 (26). 그러나 본 연구에서는 3종의 선택적 COX-2 저해제들이 섬유아세포에서 활성산소종의 발생이나 NF-κB의 활성에 영향을 준다는 증거는 찾지 못하였다 (도 3B와 4B). 또한 저 해제들이 비록 p53과 p21의 발현에 영향을 주기는 하였지만 그것이 저해제들의 세포노화 조절효과는 관련이 없었다 (도 5A와 B). 그 대신 우리는 선택적 COX-2 저해제들이 카베올린-1의 발현을 조절하며, 이것이 저해제들의 세포노화 조절효과와 밀접한 관련이 있음을 발견하였다 (도 6A).
카베올래(Caveolae)는 세포막에 움푹 들어간 부분인데 엔도사이토시스(endocytosis) 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 카베올린(Caveolin)은 카베올래를 구성하는 주요 단백질이며 카베올린-1, 카베올린-2, 카베올린-3 세 종류가 있다. 이중 카베올린-1은 대부분의 세포에서 발현되며 상피세포성장인자 수용체, G 단백질, 프로테인 키나아제 C(protein kinase C)와 같은 다양한 신호전달 분자와 상호작용을 하고 있다고 알려져 있다 (27). 최근에는 카베올린-1이 사람 섬유아세포에서 세포노화를 결정짓는 중요한 단백질임이 보고되었다. 카베올린-1의 발현이 노화된 세포에서 증가하며, 상피세포성장인자 수용체와 결합하여 성장신호를 약화시킨다 (20). 또한 노화된 섬유아세포에서 카베올린-1의 발현을 감소시키면 DNA 합성이 재개되고 세포의 모양이 젊은 세포와 같은 모양으로 되돌아간다 (28, 29).
본 연구에서 우리는 선택적 COX-2 저해제들이 카베올린-1의 발현 및 콜레스테롤 농도를 조절하는 것을 발견하였는데 (도 6A와 E), 이것은 다음 몇 가지 면에서 중요한 의미가 있다. 첫째, 본 발견은 세포수준에서 (아마도 개체수준에서도) 젊음을 유지하기 위해서는 세포막을 통한 수용체 매개성 신호전달이 중요하다는 것을 다시 한번 강조한다. 왜냐하면 카베올린-1 뿐만 아니라 콜레스테롤도 수용체 매 개성 신호전달에 강한 영향을 주기 때문이다 (30). 둘째, 본 발견은 카베올린-1을 선택적 COX-2 저해제의 새로운 표적으로 확립하였으며, 이로 인해 저해제들을 노화조절 약물로 개발할 때 새로운 분자기반을 제공할 수 있을 것이다.
전사인자 NF-κB는 노화의 분자염증 가설에서 핵심적인 분자이다 (2). 활성산소종에 의해 NF-κB가 활성화되면 COX-2와 같은 염증유발 유전자가 발현됨으로써 노화가 일어난다는 것이다. 그러나 본 연구에서 우리는 사람 섬유아세포의 경우 세포노화 과정에서 NF-κB의 활성 및 COX-2의 발현이 감소됨을 관찰하였으며, 이것은 적어도 사람 섬유아세포에서는 분자염증 가설이 맞지 않는다는 것을 나타낸다 (도 2A와 4A). 사람 섬유아세포의 노화과정에서 NF-κB의 활성이 변하지 않았거나 오히려 감소하였다는 이전 보고들은 우리의 결론을 지지한다 (3, 31).
본 연구에 따르면 섬유아세포의 노화 과정에서 COX-2 활성에 의해 프로스타글란딘 E2의 생성이 증가되었다 (도 2B와 C). 그러나 흥미롭게도 COX-2 단백질의 발현은 노화과정에서 감소하였으며 (도 2A), 이는 노화과정에서 COX-2의 효소활성 자체가 증가하였음을 의미한다. 효소활성이 증가한 데 대해서는 크게 두 가지 설명이 가능하다. 첫째, 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase) 반응이 일어나기 위해서는 알킬 프록사이드(alkyl peroxide) 또는 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)와 같은 하이드로퍼옥사이드(hydroperoxide)가 필요하다 (12). 세포노화 및 개체노화 과정에서 알킬 프록사이드와 퍼옥시니트라이트를 포함하는 활성산소종의 발생이 증가한다는 것이 보고된 바 있다 (32). 본 연구에서도 활성산소종의 발생이 세포노화 과정에서 증가되었음을 재확인하였다 (도 3A). 따라서 노화과정에서 활성산소종의 발생이 증가함에 따라 COX-2의 효소활성이 증가되었을 가능성이 있다. 둘째, 사람의 폐 섬유아세포의 경우 노화된 세포의 배양액에서 COX의 기질인 아라키돈산이 증가되어 있다는 보고가 있다 (33). 유리지방산은 세포 안팎에서 빠르게 평형에 도달하기 때문에, 배양액에 아라키돈산이 증가되었다는 것은 세포질에서도 아라키돈산이 증가되었다는 것을 의미한다. 따라서 세포노화 과정 동안 세포질 내에 기질인 아라키돈산의 농도가 증가됨으로 인해 COX-2의 효소활성이 증가되었을 가능성도 있다.
콜라겐 합성 감소와 기질분해효소 활성의 증가는 피부노화의 중요한 원인으로 생각되고 있는데 (23). 피부 섬유아세포와 각질세포의 세포노화는 피부노화 과정에서 콜라겐 대사가 이와 같이 바뀌는 데 대한 좋은 설명이 된다. 왜냐하면 세포노화가 진행될수록 섬유아세포에서 콜라겐 합성이 감소하고 (34), 섬유아세포 및 각질세포에서 기질분해효소의 활성이 증가되기 때문이다(24, 35). 본 연구에서 우리는 3종의 선택적 COX-2 저해제들 모두가 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 증가시키고 기질분해효소의 활성을 억제함을 발견하였다 (도 7). 이는 COX-2 효소활성이 콜라겐 대사와 연계되어 있음을 시사한다. 이전 연구에서도 간의 스텔라이트 세포(hepatic stellate cell)의 경우 COX-2에서 유래된 프로스타글란딘 E2가 콜라겐 발현을 억제하고, NS-398이 섬유아세포 및 간의 스텔라이트 세포에서 콜라겐 발현을 증가시킨다는 것이 보고된 바 있다 (24, 36). 피부노화에 있어서 콜라겐 대사의 중요성을 생각할 때 선택적 COX-2 저해제들이 피부노화를 억제할 가능성이 크다. 따라서 항피부 노화 약물로서 선택적 COX-2 저해제들의 효능을 시험할 가치가 충분 하다고 생각된다.
본 연구에서 우리는 선택적 COX-2 저해제들이 효소활성과 무관한 기전으로 세포 수준에서 노화를 조절한다는 것을 규명하였다. 그러나 노화과정에서 COX-2의 정확한 기능은 불분명하게 남아있다. 따라서 앞으로 노화과정에서 COX-2의 기능을 규명하고, COX-2 저해제들의 효능을 개체 수준에서 연구할 필요가 있다고 생각된다.
IV. 참고문헌
1. Finkel, T., and Holbrook, N. J. (2000) Nature 408, 239-247
2. Chung, H. Y., Kim, H. J., Kim, K. W., Choi, J. S., and Yu, B. P. (2002) Microsc. Res. Tech. 59, 264-272
3. Helenius, M., H?nninen, M., Lehtinen, S. K., and Salminen, A. (1996) Biochem. J. 318, 603-608
4. Bernard, D., Gosselin, K., Monte, D., Vercamer, C., Bouali, F., Pourtier, A., Vandenbunder, B., and Abbadie, C. (2004) Cancer Res. 64, 472-481
5. Kim, H. J., Kim, K. W., Yu, B. P., and Chung, H. Y. (2000) Free Radic. Biol. Med. 28, 683-692
6. Manev, H., Uz, T., and Qu, T. (2000) Exp. Gerontol. 35, 1201-1209
7. Kim, J. W., Baek, B. S., Kim, Y. K., Herlihy, J. T., Ikeno, Y., Yu, B. P., and Chung, H. Y. (2001) J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56, B350-355
8. Yang, B., Larson, D. F., and Watson, R. R. (2004) Life Sci. 75, 655-657
9. Gelinas, D. S., and McLaurin, J. (2005) Neurochem. Res. 30, 1369-1375
10. Shelton, D. N., Chang, E., Whittier, P. S., Choi, D. H., and Funk, W. D. (1999) Curr. Biol. 9, 939-945
11. Yoon, I. K., Kim, H. K., Kim, Y. K., Song, I. H., Kim, W. K., Kim, S. Y., Baek, S. H., Kim, J. H., and Kim, J. R. (2004) Exp. Gerontol. 39, 1369-1378
12. Smith, W. L., Garavito, M., and DeWitt, D. L. (1996) J. Biol. Chem. 271, 33157-33160
13. Flower, R. J. (2003) Nat. Rev. Drug Discov. 2, 179-191
14. Kang, H. J., and Grodstein, F. (2003) Neurology 60, 1591-1597
15. Massie, H. R., Williams, T. R., and Iodice, A. A. (1985) J. Gerontol. 40, 257-260
16. Bode-B?ger, S. M., Martens-Lobenhoffer, J., T?ger, M., Schr?der, H., and Scalera, F. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 334, 1226-1232
17. Dimri, G. P., Lee, X., Basile, G., Acosta, M., Scott, G., Roskelley, C., Medrano, E. E., Linskens, M., Rubelj, I., Pereira-Smith, O., Peacocke, M., and Campisi, J. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9363-9367
18. Robert, L., Fodil-Bourahla, I., Bizbiz, L., and Robert, A. M. (2004) Biomed. Pharmacother. 58, 65-70
19. Gosselin, K., and Abbadie, C. (2003) Exp. Gerontol. 38, 1271-1283
20. Park, W. Y., Park, J. S., Cho, K. A., Kim, D. I., Ko, Y. G., Seo, J. S., and Park, S. C. (2000) J. Biol. Chem. 275, 20847-20852
21. Hailstones, D., Sleer, L. S., Parton, R. G., and Stanley, K. K. (1998) J. Lipid Res. 39, 369-379
22. Nakamura, M., Kondo, H., Shimada, Y., Waheed, A. A., and Ohno-Iwashita, Y. (2003) Exp. Cell Res. 290, 381-390
23. Chung, J. H., Seo, J. Y., Choi, H. R., Lee, M. K., Youn, C. S., Rhie, G. E., Cho, K. H., Kim, K. H., Park, K. C., and Eun, H. C. (2001) J. Invest. Dermatol. 117, 1218-1224
24. Han, J. H., Roh, M. S., Park, C. H., Park, K. C., Cho, K. H., Kim, K. H., Eun, H. C., and Chung, J. H. (2004) Mech. Ageing Dev. 125, 359-366
25. Mouithys-Mickalad, A., Deby-Dupont, G., Dogne, J. M., Leval, X., Kohnen, S., Navet, R., Sluse, F., Hoebeke, M., Pirotte, B., and Lamy, M. (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 1122-1130
26. Tegeder, I., Pfeilschifter, J., and Geisslinger, G. (2001) FASEB J. 15, 2057-2072
27. Williams, T. M., and Lisanti, M. P. (2004) Genome Biol. 5, 214
28. Cho, K. A., Ryu, S. J., Park, J. S., Jang, I. S., Ahn, J. S., Kim K. T., and Park, S. C. (2003) J. Biol. Chem. 278, 27789-27795
29. Cho, K. A., Ryu, S. J., Oh, Y. S., Park, J. H., Lee, J. W., Kim, H. P., Kim, K. T., Jang, I. S., and Park, S. C. (2004) J. Biol. Chem. 279, 42270-42278
30. Burger, K., Gimpl, G., and Fahrenholz, F. (2000) Cell. Mol. Life Sci. 57, 1577-1592
31. Dimri, G. P., and Campisi, J. (1994) Exp. Cell Res. 212, 132-140
32. Reiter, R. J., Tan, D., and Burkhardt, S. (2002) Mech. Ageing Dev. 123, 1007-1019
33. Lorenzini, A., Hrelia, S., Bordoni, A., Biagi, P., Frisoni, L., Marinucci, T., and Cristofalo, V. J. (2001) Exp. Gerontol. 36, 65-78
34. Takeda, K., Gosiewska, A., and Peterkofsky, B. (1992) J. Cell. Physiol. 153, 450-459
35. Kang, M. K., Kameta, A., Shin, K. H., Baluda, M. A., Kim, H. R., and Park, N. H. (2003) Exp. Cell Res. 287, 272-281
36. Hui, A. Y., Dannenberg, A. J., Sung, J. J. Y., Subbaramaiah, K., Du, B., Olinga, P., and Friedman, S. L. (2004) J. Hepatology 41, 251-258
이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드를 포함하는 세포의 노화억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 실험에 사용한 3종의 선택적 COX-2 저해제 중 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드인 NS-398만이 세포노화를 억제하였고, 나머지 셀레콕시브와 니메설라이드는 세포노화를 촉진하였다. 또한 비선택적 COX 저해제 3종 (아스피린, 이부프로펜, 플루비프로펜)은 모두 세포노화를 촉진하였다.
세포노화가 진행되는 동안 COX-2의 발현은 감소한 반면 COX-2의 효소활성은 증가하였으며, 선택적 COX-2 저해제 3종의 세포노화 조절효과는 세포 내 활성 산소의 농도, NF-κB 활성, p53 및 p21 단백질의 양과는 무관하였다. 대신 선택적 COX-2 저해제 3종이 카베올린-1의 발현을 전사수준에서 조절하며 세포 내 총콜레스테롤 농도를 조절하는 것을 발견하였으며, 이 결과는 선택적 COX-2 저해제 3종의 세포노화 조절효과와 밀접한 관련이 있음을 발견하였다.
이와 함께 선택적 COX-2 저해제 3종 모두 세포에서 콜라겐 합성을 증진시키며, 기질분해효소 (matrix metalloproteinases)인 MMP-2와 MMP-9의 활성을 억제함을 발견하였다.
이상의 결과들은 COX-2 효소활성이 세포노화 과정을 매개하고 있지 않으며, 본 발명의 N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드는 COX-2 효소활성 억제가 아니라 카베올린-1 발현 조절과 관련된 기전을 통해 세포노화를 억제하고 있음을 알 수 있으며, 이를 포함하는 조성물이 개체 노화를 조절할 가능성도 제시하고 있다.
<110> Seoul National University Industry Foundation <120> A Composition for Regulating Cellular Senescence Comprising N-[2-(Cyclohexyloxyl)-4-nitrophenyl]-methanesulfonamide <130> dp-2007-0054 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> caveolin-1F <400> 1 acatctctac accgttccca t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> caveolin-1R <400> 2 tgtgtgtccc ttctggttct g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F <400> 3 tgttgccatc aatgacccct t 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R <400> 4 ctccacgacg tactcagcg 19

Claims (8)

  1. 삭제
  2. N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드를 포함하는 세포 노화억제용 조성물로서, 상기 세포 노화억제는 COX-2의 활성에는 상관없이 카베올린 단백질의 발현을 억제하여 노화를 억제하는 것을 특징으로 하는 세포 노화억제용 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 노화억제는 콜라겐 합성을 촉진하고, MMP-2 또는 MMP-9의 활성을 억제하여 노화를 억제하는 것을 더 포함하는 세포 노화억제용 조성물.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 세포는 피부섬유아세포인 것을 특징으로 하는 세포 노화억제용 조성물.
  5. 삭제
  6. N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드의 유효량을 노화 세포에 처리하는 단계; 및 상기 처리된 노화세포가 COX-2의 활성에는 상관없이 카베올린 단백질의 발현을 억제하여 노화를 억제하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물의 세포의 노화 억제 방법.
  7. N-[2-(사이클로헥실옥실)-4-니트로페닐]-메탄술폰아미드의 유효량을 환자에게 투여하는 단계; 및 상기 투여된 노화세포가 COX-2의 활성에는 상관없이 카베올린 단백질의 발현을 억제하여 노화를 억제하는 단계를 포함하는, 세포의 노화의 조절을 필요로 하는 인간을 제외한 포유동물의 세포노화 조절 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 환자는 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환 및 뇌졸중, 퇴행성 관절 질환, 피부 아트로피, 탄성섬유분해 (elastolysis), 피지선 과형성, 노인성 흑점, 모발 백화 및 모발 손실, 만성피부궤양증, 골다공증, 동맥경화, 석회화, 혈전, 동맥류, 황반변성을 가진 환자 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 세포노화 조절 방법.
KR1020070047015A 2007-05-15 2007-05-15 Ｎ―〔2―（사이클로헥실옥실）―4―니트로페닐〕―메탄술폰아미드를 포함하는 세포 노화억제 조성물 KR100896998B1 (ko)

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