KR20110088007A - 우루소데옥시콜린산을 유효성분으로 함유하는 위암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid; UDCA)을 유효성분으로 함유하는 위암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid:UDCA) 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 치료용 조성물, 아폽토시스 유도제 조성물 및 우루소데옥시콜린산(UDCA)을 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 위암의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 우루소데옥시콜린산은 위암 세포에서 카스파제(caspase)의 활성 촉진시키고, 세포사멸 수용체의 활성 또는 발현을 촉진시키며, PKC의 활성 촉진 및 활성산소종(ROS)의 생성을 촉진시켜 궁극적으로 위암 세포의 아폽토시스를 유도하는 활성이 우수하므로 위암을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

우루소데옥시콜린산을 유효성분으로 함유하는 위암의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising ursodeoxycholic acid for preventing or treating gastric cancer}

본 발명은 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid; UDCA)을 유효성분으로 함유하는 위암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

위암은 전세계적으로 암이환율 및 암사망율이 가장 높은 암이며, 한국을 비롯하여 일본, 중국, 러시아, 중유럽, 남중미, 홍콩, 스칸디나비아 등에서 암으로 인한 사망 중 가장 많은 원인을 차지하고 있다. 한국이나 일본 남성의 16% 이상이 위암으로 사망하고 있는 것으로 나타나고 있다.

특히, 한국이나 일본 등 아시아의 경우, 다른 대륙의 인종들에 비해 위암 발병율이 높은 것으로 보고되고 있는데, 이는 민족이나 인종의 차이로 보기는 어렵고, 암 발생에 제일 중요한 생활환경의 차이, 특히 식생활의 차이에서 오는 것으로 보고되고 있다. 한국인의 경우, 하루 소금 섭취량은 약 20g으로 서양인보다 두 배 가까이 많이 섭취하고 있으며, 특히 소금에 절인 생선을 먹는 습관이 있는 한국, 일본, 핀란드, 아이슬란드 등에서 위암의 발생률이 높은 것으로 보고되고 있다. 또한 위암의 발병원인으로 식습관 이 외에도 유전적인 원인이 관여하고 있는데, 위암환자의 1세대 자손들에게 위암의 발생률이 높은 것으로 알려져 있다.

또한, 위암의 증상은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 양상을 나타내고 있으며, 위암의 증상이 어떤 특성을 가지는 것이 아니라 일반적인 소화기 증상을 보이며, 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 증상이 있다고 하더라도 비교적 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하기 쉬어 위암의 사망률을 높이는 원인이 되기도 한다.

현재 위암을 포함하여 각종 암을 치료하는 주요한 치료법으로는 외과적인 수술, 방사선조사 및 화학요법 중 1 가지 또는 이들의 조합을 통한 치료법이 사용되고 있는데, 수술은 질병 조직을 대부분 제거하는 것을 포함하며, 이러한 외과적 수술은 종양조직 또는 이들 주변의 조직을 제거하는 데에는 효과적이지만 척추와 같이 수술하기 어려운 구역에 있는 종양을 치료하거나 백혈병과 같은 전신에 흩어져 있는 분산성 종양을 치료하는 데는 사용할 수 없다. 화학요법은 세포 복제 또는 세포 대사를 붕괴시켜 암을 치료하는 것으로서 각종 종양의 치료에 사용될 수 있으나, 정상세포에도 작용하므로 심각한 부작용을 일으킨다. 특히, 세포분열과 세포대사가 활발하게 일어나는 조혈기관에 작용하여 환자의 면역 체계를 약화시키는 심각한 부작용을 일으키기도 한다. 이러한 부작용은 환자의 생명에 큰 영향을 미치며, 또한, 약물의 투여시 주의해야 하는 주용량 제한 독성(DLT)이 있다. 이와 같이 화학치료제 및 방사선 치료에 의한 부작용들은 암 환자의 임상적 처치시 주요 문제가 되고 있으므로, 화학요법 치료제의 부작용을 감소시킬 수 있는 체내 안정성이 우수한 새로운 항암제의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid, 3α,7β-dihydroxy-5β-cholanoic acid, 이하 ‘UDCA’라 함)은 오래전부터 한국, 중국, 일본 등에서 간, 담도계 질환에 사용되어 왔던 소위 웅담의 주성분으로서, 담즙에서 발견되는 담즙산의 한 종류이고, 분자량은 392.58이며 분자식은 C₂₄H₄₀O₄이다. 이러한 UDCA는 생체내의 미세담도를 청소하는 작용을 가지고 있어 미세담도내 노폐물과 독성 담즙산을 배출하는 작용, 간세포막의 안정화와 간세포 보호작용, 간혈류량 증가작용, 콜레스테롤의 흡수와 생합성을 억제하는 작용, 담석을 용해시키고 생성을 억제시키는 작용 및 면역활성을 정상화시키는 약리 활성을 가지고 있어 담석증과 담도계 질환, 만성 간질환과 간기능 개선, 소장절제후의 소화불량과 지방간에 주요 임상 적응증을 가지고 사용되고 있는 약물이다. 특히, UDCA의 콜레스테롤 담석용해 효과에 대한 기전은 간에서 콜레스테롤 합성에 필요한 효소인 HMG CoA 환원효소의 활동을 저하시켜 담즙으로의 콜레스테롤 분비를 감소시키고, 7α-hydroxylase 활성도를 증가시키며 장에서의 콜레스테롤 흡수를 저하시키는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, UDCA를 투여하면 콜레스테롤이 과포화된 담즙을 불포화담즙으로 변화시키는데, UDCA 투여로 인해 생기는 담즙의 탈포화(Desaturation)는 콜레스테롤을 운반할 수 있는 능력을 증가시키며, 담즙에서 용해력이 높은 멀티라멜라 리포좀(multilamellar liposome(mesophase))을 형성하여 콜레스테롤로 포화된 담즙에서도 액상 결정(liquid crystal)을 형성한다. 따라서 액상 결정을 형성하는 이유로 UDCA를 사용 후 콜레스테롤로 과포화된 담즙에서도 담석이 용해된다.

그러므로 이러한 UDCA는 간과 관련된 질환들의 치료제로 널리 사용되고 있으며, 또한, 최근에는 UDCA가 직장암을 효과적으로 치료할 수 있다는 내용이 밝혀졌고(대한민국공개특허 제2008-0061327호), 다이옥신을 포함하여 환경 호르몬에 의해 유발되는 독성을 억제할 수 있는 효과가 있다는 내용도 보고된 바 있다(대한민국등록특허 제0368936호).

그러나 아직까지 UDCA에 대하여 위암을 예방하거나 치료할 수 있는 효과가 있다는 내용에 대해서는 전혀 보고된 바 없다.

따라서 본 발명의 목적은 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid:UDCA) 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 위암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 우루소데옥시콜린산(UDCA) 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 아폽토시스(apoptosis) 유도제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 우루소데옥시콜린산(UDCA)을 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 인간을 제외한 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 위암의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid:UDCA) 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 우루소데옥시콜린산(UDCA)은 위암 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도하여 세포사멸을 유발시킴으로써 항암활성을 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아폽토시스(apoptosis)는 우루소데옥시콜린산(UDCA)의 처리에 의해, 위암 세포에서 카스파제(caspase)의 활성 촉진; 세포사멸 수용체의 활성 또는 발현 촉진; 사이토졸(cytosol)에서 막(membrane)으로 PKC(protein kinase C) δ 단백질의 이동(translocation); 또는 활성산소종(ROS)의 생성에 의해 유도될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카스파제(caspase)는 카스파제-3, 카스파제-6, 카스파제-8 및 카스파제-9로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포 사멸 수용체는 DR3, DR4, DR5, DR6, FAS 및 TNFR로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포사멸 수용체의 활성 또는 발현 촉진은 FADD 또는 RIP1 단백질의 활성을 촉진시켜 위암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 활성산소종(ROS)의 생성 및 PKC(protein kinase C) δ 단백질의 활성은 세포막에 위치하고 있는 리피드 래프트(lipid raft)에 의해 조절되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 우루소데옥시콜린산은 조성물 총 중량에 대하여 250μM~1000μM로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 우루소데옥시콜린산(UDCA) 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 아폽토시스(apoptosis) 유도제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 위암 세포에서 아폽토시스를 유발할 수 있다.

또한, 본 발명은 우루소데옥시콜린산(UDCA)을 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 인간을 제외한 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 위암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 및 방부제로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 우루소데옥시콜린산은 위암 세포에서 카스파제(caspase)의 활성 촉진시키고, 세포사멸 수용체의 활성 또는 발현을 촉진시키며, PKC의 활성 촉진 및 활성산소종(ROS)의 생성을 촉진시켜 궁극적으로 위암 세포의 아폽토시스를 유도하는 활성이 우수하므로 위암을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

도 1a는 위암 세포주인 SNU-601, SNU-638, SNU-1 및 SNU-216의 각 세포주에 대해 농도별 UDCA(0, 250, 500, 1000μM)를 각각 처리한 후, MTT 어세이를 통해 세포 생존율, 아폽토시스된 핵의 퍼센트 및 LDH 방출정도를 각각 비교하여 나타낸 그래프이며, 도 1b는 상기 위암 세포주들에 대해 각 농도별 UDCA를 처리한 후, 플레이트에 형성된 콜로니를 육안으로 관찰한 사진을 나타낸 것이며, 1c는 형성된 콜로니의 수를 카운팅하여 나타낸 그래프이다.
도 2a 및 2b는 위암 세포주인 SNU-601 및 SNU-638에 대해 각 농도별 UDCA(0, 250, 500, 1000μM)를 처리한 후, HO/PI 이중 염색법을 통해 세포의 사멸정도를 형광현미경으로 관찰하고 사멸된 세포의 수를 그래프로 나타낸 것이며, 2c는 각 농도별도 UDCA가 처리된 위암 세포주들에 대해 LDH 방출정도를 LDH-독성 분석 키트를 사용하여 분석한 결과를 나타낸 것이고, 2d 및 2e는 UDCA가 처리된 위암 세포주들에서 잘려진 카스파제3, 6 및 PARP 및 LC3의 단백질의 양을 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 위암 세포주인 SNU-601 및 SNU-638에 대해 각 농도별 DCA(0, 250, 500, 1000μM)를 처리한 후, MTT 어세이를 통해 세포 생존율을 나타낸 그래프이고, 3b 및 3c는 HO/PI 이중 염색법을 통해 세포의 사멸정도를 형광현미경으로 관찰하고 사멸된 세포의 수를 그래프로 각각 나타낸 것이며, 3d는 LDH-독성 분석 키트를 사용하여 LDH 방출정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4a는 위암 세포주들에 대해 카스파제 3, 6, 7 및 8의 억제제들인 Z-DEVD-FMK, Z-VEID-FMK, Z-IETD-FMK, Z-LEHD-FMK 또는 Z-VAD-FMK을 20μM씩 먼저 처리한 후, 1000μM UDCA를 처리한 다음, HO/PI 이중 염색법을 통해 세포의 사멸정도(핵 절편화)를 측정한 결과를 나타낸 것이고, 4b는 1000μM UDCA를 위암 세포주에 처리한 후, FLICE/카스파제 8-비색 분석 키트를 이용하여 카스파제-8의 활성화를 측정한 결과를 나타낸 것이며, 4c는 20μM의 Z-IETD-FMK를 위암 세포주에 먼저 처리한 후, 1000μM UDCA를 처리한 다음, 웨스턴 블럿을 통해 잘려진 카스파제 3, 6 및 PARP의 단백질 양을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 위암 세포주인 SNU-601 및 SNU-638에 대해 siRNA FAS, siRNA DR4, siRNA DR5 또는 siRNA 컨트롤(Control)을 AMAXA 방법을 통해 형질도입 시킨 후, 1000μM UDCA를 처리한 다음, HO/PI 이중 염색법을 통해 세포의 사멸정도(핵 절편화)를 측정한 결과를 나타낸 것이고, 5b는 웨스턴 블럿을 통해 잘려진 카스파제 3, 6 및 PARP의 단백질 양을 확인한 결과를 나타낸 것이며, 5c는 FLICE/카스파제 8-비색 분석 키트를 이용하여 카스파제-8의 활성화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 위암 세포주인 SNU-601 및 SNU-638에 대해 siRNA FADD, siRNA RIP1 또는 siRNA Control을 AMAXA 방법을 통해 형질도입시킨 후, 1000μM UDCA를 처리한 다음, HO/PI 이중 염색법을 통해 세포의 사멸정도(핵 절편화 또는 핵의 응축)를 측정한 결과를 나타낸 것이고, 6b는 웨스턴 블럿을 통해 잘려진 카스파제 3, 6 및 PARP, FADD 및 RIP1의 단백질 양을 확인한 결과를 나타낸 것이며, 6c는 FLICE/카스파제 8-비색 분석 키트를 이용하여 카스파제-8의 활성화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 위암 세포주인 SNU-601 및 SNU-638에 대해 1000μM UDCA를 처리한 후, 시간별로 배양한 다음, 세포들로부터 사이토졸릭(cytosolic) 단백질 분획 및 기관/막 단백질 분획을 각각 분획화한 후, 웨스턴 블럿을 통해 PKC δ, PKC α, PKC θ, 및 PKC ε 단백질의 양을 확인한 결과를 나타낸 것이고, 7b는 HO/PI 이중 염색법을 통해 세포의 사멸정도(핵 절편화 또는 핵의 응축)를 나타낸 것이고, 7c는 웨스턴 블럿을 통해 잘려진 카스파제 3 및 6의 단백질 양을 확인한 결과를 나타낸 것이며, 7d는 각 위암 세포주에 대해 siRNA PKC δ 또는 siRNA Control을 AMAXA 방법을 통해 형질도입시킨 후, 1000μM UDCA를 처리한 다음 웨스턴 블럿을 통해 잘려진 카스파제 3, 6 및 PKC δ 단백질 양을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 위암 세포주인 SNU-601 및 SNU-638에 대해 로틀레린(rottlerin)을 각 농도별로 처리한 다음, 1000μM UDCA를 처리하고 DR5 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 것이고, 8b는 위암 세포주에 대해 siRNA PKC δ 또는 siRNA Control을 AMAXA 방법을 통해 형질도입시킨 후, 1000μM UDCA를 처리한 다음, PKC δ 및 DR5 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 위암 세포주인 SNU-601 및 SNU-638에 대해 1000μM UDCA를 처리하고, 3시간 또는 5시간 후에 각 세포당 DCFH-DA/HO의 비율을 계산하여 ROS의 생성정도를 측정한 결과를 나타낸 것이고, 9b는 위암 세포주에 대해 ROS 소제인 10mM NAC, 100BHA, 10mM Tiron, 2DPI 또는 1000U catalase를 각각 처리한 후, 1000μM UDCA를 처리하고 HO/PI 이중 염색법을 통해 세포의 사멸정도(핵 절편화 또는 핵의 응축)를 나타낸 것이고, 9c는 상기 9b와 같이 처리된 위암 세포주들에 대해 웨스턴 블럿을 통해 잘려진 카스파제-3, 6, 및 PARP 단백질의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 SNU-601 위암 세포주에 10mM NAC 또는 100BHA의 존재 또는 비존재 하에서 1000μM UDCA를 각각 처리한 다음, DR5의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 것을 나타낸 것이고, 10b는 SNU-638 위암 세포주에 10mM NAC 또는 100BHA의 존재 또는 비존재 하에서 1000μM UDCA를 각각 처리한 다음, DR5의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 11a는 SNU-601 위암 세포주에 10mM NAC를 미리 처리한 다음, 1000μM UDCA를 처리하고 세포로부터 사이토졸릭(cytosolic) 단백질 분획 및 기관/막 단백질 분획을 각각 분획화한 다음, 웨스턴 블럿을 통해 PKC δ의 발현정도를 측정한 것을 나타낸 것이고, 도 11b는 SNU-638 위암 세포주에 대해 상기 도 11a와 동일한 실험을 수행하여 PKC δ의 발현정도를 측정한 것을 나타낸 것이다.
도 12a는 1mM의 MBCD를 위암 세포주인 SNU-601 및 SNU-638에 미리 처리하고, 1000μM UDCA를 각각 처리한 다음, MTT 어세이를 통해 세포 생존율을 나타낸 그래프이고, 12b는 HO/PI 이중 염색법을 통해 세포의 사멸정도(핵 절편화 또는 핵의 응축)를 나타낸 것이며, 12c는 웨스턴 블럿을 통해 잘려진 카스파제-3, 6, 및 PARP 단백질의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이고, 12d는 FLICE/카스파제 8-비색 분석 키트를 이용하여 카스파제-8의 활성화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 1mM의 MBCD를 위암 세포주인 SNU-601 및 SNU-638에 미리 처리하고, 1000μM UDCA를 각각 처리한 다음, 웨스턴 블럿을 통해 DR5의 발현 정도를 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 14a는 1mM의 MBCD를 위암 세포주인 SNU-601 및 SNU-638에 미리 처리하고, 1000μM UDCA를 각각 처리한 다음, 세포로부터 사이토졸릭(cytosolic) 단백질 분획 및 기관/막 단백질 분획을 각각 분획화한 후, 웨스턴 블럿을 통해 PKC δ단백질의 양을 확인한 것이고, 14b는 1mM 또는 2mM의 MBCD를 위암 세포주인 SNU-601 및 SNU-638에 미리 처리하고, 1000μM UDCA를 각각 처리한 다음, 각 세포당 DCFH-DA/HO의 비율을 계산하여 ROS의 생성정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid:UDCA) 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 위암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에서 위암의 예방 또는 치료용 조성물의 약리학적 유효성분은 상기 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid:UDCA) 화합물 일 수 있으며, 상기 우루소데옥시콜린산 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있다.

상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 우루소데옥시콜린산은 일반적으로 동물의 담즙에 존재하는 성분으로서 동물의 담즙에서 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있으며, 시중에서 판매되고 있는 우루소데옥시콜린산이라면 모두 사용할 수 있다.

상기 동물의 담즙에서 분리된 우루소데옥시콜린산을 사용할 경우, 상기 분리는 종래의 물질을 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 담즙으로부터 우루소데옥시콜린산을 수득할 수 있다. 이때, 상기 추출은 당업계에 공지된 적절한 용매, 즉, 물 또는 유기용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 추출용매를 이용하여 추출된 우루소데옥시콜린산의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있으며, 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되지 않고 당업계에서 수행되고 있는 방법이라면 모두 사용 가능하다.

본 발명의 일실시예에서는 ICN 바이오메티칼사 또는 시그마에서 판매하는 우루소데옥시콜린산을 구입하여 사용하였다.

한편, 본 발명에서는 상기 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid:UDCA)이 위암을 예방 또는 치료할 수 있는 활성이 있음을 최초로 규명하였다는 특징이 있다.

특히, 본 발명의 우루소데옥시콜린산은 위암 세포에서 아폽토시스(apoptosis)을 유도함으로써 항암활성을 갖는다는 특징이 있다.

암을 치료하는 방법에 있어서, 암세포와 같이 조절되지 않은 세포의 병리적 성장을 차단시키기 위해 세포사멸 조절요법이 최근 들어 사용되고 있는데, 암과 같은 질병의 경우 기존의 광범위한 세포괴사(necrosis) 약물요법은 병리 세포를 죽임과 동시에 병리 세포의 세포막이 파괴됨으로써 유출되는 세포 독성을 지닌 효소들(예컨대, 리소자임)이 주변의 정상 세포에까지 세포 독성을 나타내어 과도한 염증 발현을 필연적으로 수반하게 되어 그 부작용이 크다는 단점이 있다. 그러나 아폽토시스(apoptosis)에 의한 세포사멸 조절요법은 병리 세포의 자발적인 사멸을 유도하거나 이러한 세포의 성장을 강하게 억제하기 때문에 암세포의 세포사멸에 의해 유도되는 염증성 부작용을 세포괴사에 비해 감소시킬 수 있는 장점이 있다.

아폽토시스(Apoptosis)란 유전적으로 조절되는 프로그램된 세포 사멸로서 능동적인 세포사멸을 의미하며, 아폽토시스 과정은 에너지를 필요로 하며 특징적인 세포 형태를 보인다. 즉, 세포사멸 신호가 전달되면 세포내에서는 세포사멸을 결정하고, 이를 실행되는 단계로 진행하여 실행 단계에서는 세포가 특징적인 생화학적, 형태학적 변화를 보이는데, 세포사멸이 진행되면 세포가 수축(shrinkage)되면서 접하고 있던 주변 세포와 떨어지게 되고 세포막이 기포 모양(블레빙; blebbing)으로 변하게 되며, 더 나아가 핵은 응축(condensation)되고 핵 내의 DNA가 작은 올리고뉴클레오타이드 절편으로 잘려지며 아폽토틱 바디를 형성한다. 이렇게 형성된 아폽토틱 바디가 매크로파지에 의해 파고사이토시스되는 일련의 과정을 거쳐 세포사멸이 일어나게 된다.

또한, 아폽토시스는 크게 두 가지 경로로 나누어질 수 있는데, 하나는 미토콘드리아 조절 내인성 경로이고 다른 하나는 외인성 경로이다. 외인성 경로에서는 리간드에 의하여 유도되는 사멸 수용체(예컨대, FADD)의 활성화로부터의 사멸 유도 신호전달 복합체(death inducing signaling complex: DISC)의 어셈블리 및 그로 인한 프로테아제인 카스파제(caspase)들의 활성화가 개입된다. 특히 카스파제 8 및 10의 활성화는 카스파제-3의 절단을 활성화하여 카스파제 연쇄반응 경로의 하류로 진행시킨다(U. Sartorius et al., Chembiochem 2 (2001) 20-29). 다른 세포 타입에서는, 활성화된 수용체로부터 오는 신호는 세포사멸이 단행될 정도로 강한 카스파제 신호전달 연쇄반응을 생성하지 않는다. 이 경우, 미토콘드리아 의존적 아폽토시스 경로를 통하여 신호가 증폭될 필요성이 있다. 이 경로에서 카스파제-8은 Bid를 활성화하여 미토콘드리아로 전위시켜 시토크롬 c를 세포질 내로 배출한다. 시토크롬 c는 Apaf-1과 상호작용하고 Apaf-1은 카스파제-9을 활성화시키며, 순서대로 카스파제 의존적 경로를 활성화시킨다(E. A. Slee et al, J. Cell Biol . 144 (1999) 281-292). 미토콘드리아는 내인성 아폽토시스 경로에서 조절자로서 핵심적인 역할을 하는데, 여기서는 세포 손상이 DNA 손상, 저산소증, 세포 스트레스 또는 화학치료제에 의하여 매개된 경우(A. Ashkenazi, Nature Reviews Cancer 2 (2002), 420-430) 미토콘드리아의 붕괴가 SMAC/DIABLO 및 시토크롬 c를 세포질 내로 배출하게 된다.

이에 본 발명자들은 위암 세포에 대해 우루소데옥시콜린산이 아폽토시스를 유도하는 효과가 있는지를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 위암 세포주인 SNU-601, SNU-638, SNU-1 및 SNU-216 세포주들에 대해 우루소데옥시콜린산(UDCA)를 각각 처리하고, MTT 어세이 분석, 콜로니 형성 분석, HO/PI 이중 염색법 등을 수행하여 아폽토시스가 유도되는지를 확인한 결과, 상기 위암 세포주들 모두에서 UDCA에 의해 아폽토시스가 유도되어 세포사멸이 발생한다는 사실을 확인할 수 있었고(도 1a 내지 1c 참조), UDCA의 농도 의존적으로 세포사멸을 증가하는 것으로 나타났으며, 특히, UDCA에 의한 세포사멸은 세포괴사(necrosis)가 아닌 아폽토시스(apoptosis)에 의해 유발되는 것임을 확인할 수 있었다(도 2a 및 2b 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 우루소데옥시콜린산(UDCA)에 의한 위암 세포 사멸은 세포괴사(necrosis)가 아닌 아폽토시스(apoptosis) 기작에 의한 것임을 알 수 있었다.

또한, 아폽토시스 과정에서 사멸 수용체의 활성화로부터 유도되는 세포사멸의 경우, 세포사멸 기작의 개시는 사멸 수용체(death receptor)와 리간드와의 반응으로부터 활성화되며, 이후 사멸 수용체에 세포사멸과 관련된 어뎁터(adaptor) 인자들이 유인(recruit)되고 올리고머화하는 과정이 수반된다(Krammer PH. CD95(APO-1/Fas)-mediated apoptosis: Live and let die. AdvImmunol.71:163-210,1999). 이러한 사멸 수용체 단백질들은 대부분 타입 I 트랜스막 단백질들로서, TNFR-1, CD95/Fas, TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL) 수용체-1(DR4), TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL) 수용체-2(DR5), 사멸 수용체 3 및 6을 포함하는 종양괴사인자(TNF) 수용체 수퍼 패밀리에 속하며, TRAIL이 DR4 또는 DR5에 결합하거나 또는 Fas 리간드가 CD95/Fas에 결합할 경우, 수용체로 Fas-관련 사멸 도메인(death domain)(FADD)을 유인(recruit)하게 되며, FADD는 다시 카스파제-8을 사멸 수용체로 유인하여 사멸 유인성 신호 복합체(DISC)를 형성하게 된다. 형성된 DISC는 카스파제-8을 활성화시키고 활성화된 8은 이의 하부 신호전달체계에 따라 세포내에서 아폽토시스를 유도하게 된다.

한편, PKC(protein kinase C)는 뇌, 비장, 심장 과 같은 동물의 조직 또는 기관에서 많이 존재하는 단백질로서, 신호 전달(signal transdution), 세포 성장, 유전자의 발현 및 종양 프로모터 (tumor promotor)의 기능을 가진 것으로 알려져 있다. 많은 동물세포의 경우, PKC의 인산화 및 Na+, H+의 농도변화에 의한 pH 변화는 세포의 활성에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 어떤 세포에서는 증식(proliferation)의 신호가 되기도 하는 것으로 알려져 있다. 또한, PKC는 특정 유전자의 전사를 증가시키기도 한다. 특히 포스파티딜리노시톨 (phosphatidylinositol)의 가수분해에 의해 생성되는 2차 전달자 중 DAG에 의한 PKC의 활성은 모노아실글리세롤(monoacylglycerol) 또는 포르볼 에스테르(phorbol ester)의 결합에 의해서도 유사하게 나타날 수 있다. 포르볼 에스테르는 동물세포에서 암 프로모터의 기능을 보유하고 있어 암 세포의 성장을 유도하는 것으로 알려져 있다. 또한, PKC는 세포 내의 활성산소(ROS)의 생성에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 세포 내에서 초과산소(superoxide) 음이온과 같은 활성산소의 생성은 플라보단백질(flavoprotein) 함유 효소인 NADPH oxidase, xanthine oxidase, NO synthase, 및 미토콘드리아 전자전달계를 통해 이루어지는 것으로 알려져 있다.

또한, 불활성화 형태의 PKC의 경우에는 세포내에서 대부분의 PKC가 사이토졸(cytosol)에 존재하며, PKC가 활성화가 될 경우에는 사이토졸에서 세포막, 핵 및 막과 연관된 세포골격(cytoskeleton)으로 이동(translocation)된다(Nishizuka Y. The molecular heterogeneity of protein kinase C and its implication for cellular regulation. Nature.334:661-665,1998). 또한, PKC는 3개의 상이한 서브패밀리로 세분화 되며 포유동물 세포에서는 12개 이상의 이성질 형태가 존재한다. 이러한 이성질 형태 중, 특히 PKC δ의 활성 및 세포막으로의 이동은 세포내에서 아폽토시스의 개시를 유도하는 작용을 하는데, 카스파제 3의 활성 및 아폽토시스 유도에 대한 하부 신호전달을 촉진하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Brodie C and Blumberg PM. Regulation of cell apoptosis by protein kinase c δ. Apoptosis. 8:19-27,2003).

이에 본 발명자들은 UDCA에 의한 아폽토시스 유도과정에서 세포사멸 인자들인 카스파제(caspase)들이 관련되어 있는지를 분석하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 위암 세포주를 대상으로 카스파제 억제제를 처리한 후, UDCA를 처리하고 세포들의 아폽토시스 유도를 확인한 결과, 카스파제 억제제를 처리한 경우, 처리하지 않은 경우에 비해 UDCA에 의한 아폽토시스가 억제되는 것으로 나타났으며(도 4a 참조), 반면, UDCA는 카스파제 8의 활성을 증가시키는 활성이 있는 것으로 나타났고(도 4b 참조), 카스파제 8의 억제제를 처리한 경우, 아폽토시스의 활성화에 의한 카스파제 3, 6 및 PARP의 절단 현상이 일어나지 않는다는 것을 알 수 있었다(도 4c 참조).

따라서 본 발명의 UDCA는 위암 세포 내에서 카스파제들을 활성화시켜 아폽토시스를 유도할 수 있으며, 상기 카스파제들로는 이에 제한되지는 않으나, 카스파제-3, 6, 8 및 9일 수 있고, 바람직하게는 카스파제-8을 활성화시켜 이의 다운 스트림에 존재하는 카스파제 3, 6 및 9를 연쇄적으로 활성화시킴으로써 아폽토시스를 유도할 수 있다.

또한, 본 발명의 UDCA는 위암 세포에서 세포 사멸 수용체의 발현 또는 활성을 촉진시키는 작용을 갖는 특징이 있는데, 상기 세포 사멸 수용체로는 이에 제한되지는 않으나, DR3, DR4, DR5, DR6, FAS 및 TNFR을 포함할 수 있다.

이러한 예로, 본 발명의 일실시예에 따르면, UDCA를 위암 세포에 처리하였을 경우, DR5의 발현이 증가되는 것으로 나타났고, 반면, siRNA를 사용하여 DR4, DR5 및 FAS의 발현을 위암 세포에서 억제한 후, UDCA를 처리한 결과 UDCA에 의한 아폽토시스가 억제되는 것으로 나타났다(도 5a 내지 5c 참조).

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 위암 세포에서 UDCA에 의해 아폽토시스가 유발될 때, UDCA가 세포사멸 인자들, 즉 FADD 및 RIP1의 발현 또는 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, siRNA를 사용하여 상기 유전자의 발현을 억제한 후, UDCA를 위암 세포에 처리한 결과, 아폽토시스가 대조군에 비해 감소된 것으로 나타났다(도 6a 및 6b 참조).

따라서 본 발명의 UDCA는 위암 세포에서 세포사멸 수용체의 발현 또는 활성을 촉진시키고, 이러한 세포사멸 수용체의 활성화는 세포사멸과 관련된 어뎁터(adaptor) 인자(예컨대, FADD 또는 RIP1)들의 활성을 촉진시켜 아폽토시스를 유도할 수 있다.

나아가 본 발명자들은 UDCA에 의한 위암 세포의 세포사멸 기작에서 UDCA가 PKC를 활성화 시킬 수 있는지를 조사한 결과, 본 발명의 일실시예에 따르면, 위암 세포주에 UDCA를 처리한 다음, 세포의 사이토졸릭 분획 및 막 분획을 각각 추출하고 웨스턴 블럿을 통해 PKC 이성질체들이 세포내에서 어떠한 위치 이동을 보이고 있는지 확인한 결과, PKC δ의 경우, UDCA에 의해 사이토졸에서 막으로 이동되어지는 현상을 확인할 수 있었고(도 7a 참조), 반면, PKC δ 억제제 또는 siRNA PKC δ 를 처리하여 PKC δ의 발현 또는 활성을 억제하였을 경우, 카스파제들의 활성이 억제될 뿐만 아니라 사멸 수용체인 DR5의 발현도 감소되어 아폽토시스가 억제되는 것으로 나타났다(도 7c 내지 7d 및 도 8a 내지 8b 참조).

따라서 본 발명자들은 UDCA에 의한 암 세포의 아폽토시스 과정에서 사멸 수용체인 DR5와 카스파제들의 활성은 PKC δ에 의해 조절된다는 사실을 통해, PKC δ는 UDCA에 의한 암 세포의 아폽토시스 개시 과정에서 매우 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

한편, 반응성 산소종(Reactive oxygen species, ROS), 즉 활성산소는 산소에 의해 파생되는 물질이라고 해서 oxygen-derived species라고도 일컬어지며 일부는 최외각에 단일 전자를 하나 가지고 있어 반응성이 매우 크기 때문에 라디칼 (radical) 이라고도 알려져 있다. ROS는 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical; O2-), 히드록실 라디칼(hydroxyl radical; OH.), 퍼옥실 라디칼(peroxyl radical; ROO.) 등과 같은 산소 라디칼(radical) 뿐만 아니라, singlet oxygen, hydrogen peroxide 등과 같은 비-라디칼(non-radical)을 모두 지칭하는 말로써 그 종류가 매우 다양하며, ROS의 반응시간은 매우 짧은 반면에 반응력은 매우 커서 생체 내에서 각종 단백질의 변성, 지질과산화, DNA의 변이 등과 같은 유해한 작용을 하는 것으로 알려져 있으며(Li W, Hill H.Z., Induced melanin reduces mutations and cell killing in mouse melanoma. Phytochem Photobiol. 65, pp.480-485, 1997), 궁극적으로 세포의 손상 및 세포사멸을 유도하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다(McCord JM. Human disease, free radicals and the oxidant/antioxidant balance. ClinBiochem. 26:351-357,1993).

이에 본 발명자들은 UDCA의 위암에 대한 항암활성 과정에서 이러한 ROS가 관여하는지 확인한 결과, 본 발명의 일실시예에 따르면, 위암 세포에 UDCA를 처리하였더니 ROS의 생성이 증가하여 세포사멸이 증가한 것으로 나타난 반면, ROS의 소거제를 처리한 경우에는 ROS의 생성이 감소되어 세포사멸 또한 감소되는 것으로 나타났고(도 9a 내지 9c 참조), UDCA에 의한 DR5의 발현 및 PKC δ의 활성(사이토졸에서 막으로의 이동)도 ROS 생성에 의해 조절된다는 것을 알 수 있었으며(도 10a 내지 10b 및 도 11a 내지 11b 참조), UDCA가 ROS의 생성을 유도하는 효과가 있다는 사실은 본 발명에서 최초로 규명하였다.

한편, 진핵 세포의 세포막에 존재하는 콜레스테롤은 막의 구성, 유지 및 유동성에 매우 중요한 역할을 하는 성분으로서, 이러한 콜레스테롤은 세포막에 균일한 형태로 존재하는 것이 아니라 특정 부위에 밀집된 형태로 형성되어 있는데, 세포막 상에서 이러한 부위를 "리피드 래프트(lipid raft)"라고 일컫는다. 따라서 이러한 리피드 래프트 도메인은 상대적으로 많은 양의 콜레스테롤과 glycosphingolipids가 밀집되어 있으며, Src-family kinase, hetero-trimeric G protein subunits, receptor tyrosine kinase들과 같은 신호 전달 단백질들이 포함되어 있어 인산화 연쇄 반응을 활성화하거나 억제하여 신호 전달을 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Simons K and Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol.1:31-9,2000; Dimanche-Boitrel MT, Meurette O, Rebillard A and Lacour S. Role of early plasma membrane events in chemotherapy-induced cell death. Drug Resist Updat .8:5-14,2005).

따라서 본 발명자들은 UDCA에 의한 암 세포의 사멸 신호 전달과정, 특히 아폽토시스 과정에서 리피드 래프트 도메인이 관여하고 있는지 조사하기 위해, 리피드 래프트에서 콜레스테롤을 제거하여 리피드 래프트의 구조를 손상시키는 시약인 MBCD를 위암 세포에 처리한 후, UDCA에 의한 아폽토시스를 관찰한 결과, MBCD를 처리한 경우, UDCA에 의한 카스파제들의 활성이 억제되었고, DR5의 발현도 감소되었으며 궁극적으로 아폽토시스가 억제되는 것으로 나타났다(도 12a 내지 12d 및 도 13a 내지 13b 참조).

또한 본 발명의 다른 일실시예를 통해, MBCD를 처리하여 리피드 래프트 도메인의 구조를 손상시킨 결과, UDCA에 의한 ROS의 생성 및 PKC δ의 활성도 억제되는 것으로 나타났다(도 14a 및 14b 참조).

따라서 본 발명자들은 본 발명의 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스 과정에서 세포막에 존재하는 리피드 래프트 도메인의 구조가 세포 사멸 신호 전달에 아주 중요한 조절인자로 작용한다는 사실을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명의 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid:UDCA)은 위암 세포에서 세포사멸을 유도함으로써 위암을 치료할 수 있는 효과가 있으며, 본 발명에서 상기 위암 세포는 어떠한 위암 세포라도 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 SNU-601, SNU-638, SNU-1 및 SNU-216일 수 있다.

이에 본 발명은 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid:UDCA) 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 위암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 위암의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 우루소데옥시콜린산 화합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 위암 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 우루소데옥시콜린산의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 위암 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 위암 증상의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 위암 예방 또는 치료용 조성물은 위암 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

그러므로 본 발명은 우루소데옥시콜린산을 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 인간을 제외한 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 위암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 담체로는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 및 방부제로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

나아가 본 발명은 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid:UDCA) 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 아폽토시스 유도제 조성물을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 아폽토시스 유도제 조성물은 위암 세포에 대해 아폽토시스를 유발할 수 있다.

일반적으로 암은 대부분 아폽토시스에 의한 세포사멸 및 세포내 신호전달 기전에 의한 세포증식 사이의 불균형에 의하여 발생하는 것으로서, 일반적으로 암조직에서는 세포 증식에 관련된 신호전달 기전은 활성화되는 반면, 아폽토시스에 관련된 세포 내 신호전달은 억제된다는 것이 당업계에 주지되어 있다. 따라서 아폽토시스 유도제는 암세포에서 아폽토시스를 활성화시켜, 암세포에서 계획된 세포사멸을 유도시킴으로써 암을 치료할 수 있는 효과가 있다.

본 발명에서 상기 아폽토시스(apoptosis)는 세포내에서 발생하는 모든 아폽토시스 활성 기작을 통해 유도될 수 있으며, 바람직하게는, 우루소데옥시콜린산(UDCA)의 처리에 의해, 위암 세포에서 카스파제(caspase)의 활성 촉진; 세포사멸 수용체의 활성 또는 발현 촉진; 사이토졸(cytosol)에서 막(membrane)으로 PKC(protein kinase C) δ 단백질의 이동(translocation); 또는 활성산소종(ROS)의 생성에 의해 유도될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid:UDCA) 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 치료용 조성물 및 아폽토시스 유도제 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 250μM~1000μM의 양으로 포함될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 >

(1) 실험재료

하기 실시예들의 실험에서 사용된 시약 및 항체들은 다음과 같다. 즉, 우루소데옥시콜린산(Ursodeoxycholic acid; UDCA)은 ICN 바이오메티칼사 또는 시그마사로부터 구입한 것을 사용하였고, 데옥시콜린산(Deoxycholic acid; DCA), Z-DEVD-FMK (caspase-3 inhibitor), Z-VEID-FMK (caspase-6 inhibitor), Z-IETD-FMK (caspase-8 inhibitor), Z-LEHD-FMK (caspase-9 inhibitor), Z-VAD-FMK (poly-caspase inhibitor) 및 Ac-LEVD-CHO (caspase-4 inhibitor)는 칼바이오켐(Calbiochem)사로부터 구입하여 사용하였으며, N-acetyl-L-cysteine (NAC), Butylated hydroxyanisole (BHA) 및 1,2-dihydroxybenzene-3,5-disulforic acid (Tiron)은 로체(Roche)사로부터 구입하여 사용하였고, Methyl-β-Cyclodextrin (MBCD), Catalase 및 DPI는 시그마 알드리치사로부터 구입한 것을 사용하였으며, UO126, PD98059, Rottlerin, 109203x 및 GO6976 시약은 에이지 사이언티픽(A.G. Scientific)사로부터 구입한 것을 사용하였다. 또한, 사용한 항체들의 경우, Cleaved caspase-3 (Asp175) 항체, Cleaved caspase-6 (Asp315) 항체, p-MEK1/2 항체, t-MEK1/2 항체, p-EGFR 항체 및 t-EGFR 항체는 세포 시그널링사(Cell signaling)로부터 구입한 것을 사용하였고, p-ERK1/2 항체, t-ERK1/2 항체, FADD 항체, Caveolin-1, Goat anti-mouse IgG-HRP 항체 및 Goat anti-rabbit IgG-HRP 항체는 산타그루즈 바이오테크놀러지사로부터 구입한 것을 사용하였으며, Anti-PARP 항체, RIP1 항체, PKC α, PKC δ, PKC θ 및 PKC ε는 BD 파민젠(BD pharmingen)사로부터 구입한 것을 사용하였고, DR4 항체 및 DR5 항체는 ProSic사로부터 구입한 것을 사용하였으며, Tubulin는 Biogenex Laboratories사로부터 구입한 것을 사용하였다.

(2) 세포 배양

또한, 하기 실시예들에서 사용된 세포는 인간 위암 세포주(SNU-601, SNU-638, SNU-1 및 SNU-216세포)를 사용하였고, 상기 세포들은 서울대학교의 한국세포주은행(대한민국)으로부터 입수하였으며, 이들 세포들은 열-불활성화 10% 소태아 혈청(FBS; 인비트로젠, CA) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(웰젠, 서울, 한국)이 첨가된 RPMI 1640 배지(인비트로젠, CA)에서 37℃의 온도 및 5%의 이산화탄소 조건하에서 배양하였다. 또한, 상기 세포들은 약물 노출 테스트를 위해 밤새도록 배양한 후, 5 x 10⁶cells/20cm²dish, 1.5x10⁶cells/10cm²dish, 5 x 10⁵cells/6 cm²dish, 2 x 10⁵cells/3.5cm²dish으로 각각 분주하였으며, 24웰 플레이트의 경우에는 5 x 10⁴cells/well의 세포수가 되도록 세포를 분주하여 사용하였다.

< 실시예 1>

인간 위암 세포에서 UDCA 의 아폽토시스 유도활성

<1-1> MTT 분석 및 콜로니 형성 분석을 통한 위암 세포에서 UDCA 의 아폽토시스 유도 측정

먼저 본 발명자들은 위암 세포주들에 대하여 우루소데옥시콜린산(UDCA)이 상기 암세포들의 아폽토시스를 유도하는 활성이 있는지를 조사하였는데, 이를 위해 암세포주로서 위암 세포주인 SNU-601, SNU-638, SNU-1 및 SNU-216 세포주를 사용하였고, 상기 세포들은 24웰 플레이트에 5 x 10⁴cells/웰이 되도록 각각 분주한 뒤, UDCA를 250, 500 및 1000μM의 농도로 처리한 다음, 12, 24, 36 및 48시간 동안 각각 배양하고, MTT 분석을 통해 세포들의 아폽토시스 정도를 분석하였다. 또한, UDCA가 위암 세포들의 콜로니 형성을 억제할 수 있는지를 확인하기 위해, 상기 위암 세포주들에 대해 UDCA를 250, 500 및 1000μM의 농도로 12시간 동안 각각 처리한 다음, 37℃온도에서 15시간 동안 배양하고 콜로니 형성 어세이를 통해 콜로니 형성 정도를 분석하였다. 이때, 상기 MTT 분석은 UDCA를 처리한 후 배양한 세포들에 대하여 0.5ug/ml의 MTT를 각 세포들에 처리하고 4시간 배양한 다음, 각 플레이트의 세포들을 모아서 5분 동안 상온에서 1000 rpm으로 원심분리 하였다. 이후, 배지를 제거하고, 750ul의 DMSO를 첨가하여 포르마진 크리스탈을 용해시켰고, ELISA 마이크로플레이트 리더(페킨-엘머)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포를 사용하였고 이를 100%로 기준하여 상기 세포들에 대한 세포 생존율을 측정하였다. 또한, 상기 콜로니 형성 정도의 측정은 플레이트에 형성된 콜로니들을 육안으로 관찰하였다.

그 결과, 도 1a 내지 1c에 나타낸 바와 같이, 인간의 위암 세포주를 대상으로 UDCA를 처리하였을 경우, MTT 분석 결과, 위암 세포들의 생존율은 감소하는 것으로 나타났고, 생존 감소 효과는 처리한 UDCA의 농도가 높을수록, 처리 시간이 길수록 더 생존율이 감소하는 것으로 나타났다(도 1a). 또한, 콜로니 형성도 UDCA의 처리 농도가 높을수록 형성된 콜로니의 수가 현저하게 감소되는 것으로 나타났으며, 특히 1000μM의 UDCA를 처리한 경우 콜로니는 거의 형성되지 않는 것으로 나타났다(도 1b 및 1c 참조).

<1-2> Hoechst 33342 및 PI ( Propidium Iodide ) 분석을 통한 위암 세포에서 UDCA 의 아폽토시스 유도 측정

UDCA에 의한 위암 세포들의 세포사멸 형태를 분석하기 위해, Hoechst 33342(HO) 및 PI(Propidium Iodide)를 이용한 이중 염색법을 수행하였는데, HO는 세포의 핵을 파란 형광색으로 염색하는 반면, PI는 손상된 세포의 세포막에 침투하여 형광을 띄는 특징이 있다. 따라서 HO/PI를 이용한 이중 염색법은 세포가 살아있을 경우, 파란색을 띄며, 초기 아폽토시스 단계의 경우에는 응축 및 절단되어 염색된 핵을 관찰할 수 있고, 후기 아폽토시스 단계(이차 네트로틱)의 경우에는 응축 및 절단된 핑크빛의 핵을 관찰할 수 있으며, 세포괴사(necrotic cell)일 경우에는 핵 전체가 핑크빛으로 관찰된다. 이러한 원리를 이용한 HO/PI 이중 염색법은 SNU-601, SNU-638, SNU-1 및 SNU-216 세포들을 2 x 10⁵cells/3.5cm²dish으로 각각 분주한 다음, 상기 실시예 <1-1>에 기재된 바와 같은 농도의 UDCA를 처리하고, 각 시간별로 상기 세포들을 1ug/ml의 Hoechst 33342 및 5ug/ml의 PI를 세포에 처리하고 37℃의 온도에서 5%의 이산화탄소 조건하에 15분간 배양하여 세포들을 염색하였다. 이후, 세포들은 트립신으로 처리하여 모은 다음, 4℃의 온도에서 10분 동안 1500rmp으로 원심분리 하였고, 바닥에 모아진 세포들을 1x의 차가운 PBS 용액으로 세척한 다음 다시 상기 조건과 같이 원심분리 하였다. 이후 세포들을 500ul의 3.7% 파라포름알데히드로 용해시키고 5분간 배양한 다음, 사이토스피너(cytospinner)에서 윈심분리 하였다. 이후 슬라이드를 마운티드 겔로 즉시 고정시키고 물로 세척한 다음, 건조시키고 글래스 커버 슬립으로 덮었다. 상기 슬라이를 흥분/방출 파장이 각각 340/425nm(HO) 및 580/425nm(PI)인 조건하에서 DM5000 형광 현미경(한일)으로 관찰하였다. 또한, 상기 UDCA를 처리한 세포들에서 Cleaved caspase-3, Cleaved caspase-6, Cleaved PARP, LC3 및 튜불린 단백질의 정도를 웨스턴 블럿 방법을 수행하여 관찰하였고, 상기 웨스턴 블럿은 앞서 기술한 상기 단백질들을 확인할 수 있는 항체들을 사용하여 당업계에 공지된 웨스턴 블럿 방법에 따라 수행하였다.

나아가, 본 발명자들은 UDCA가 위암 세포의 세포사멸을 유도하는 과정에 있어서, 세포괴사를 유도하는 과정에도 영향을 미치는지 확인하기 위해 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase:LDH) 방출 분석을 수행하였는데, 즉, 상기 분석은 세포막 손상에 의한 독성(cytotoxicity)정도를 측정하는데 사용되며, LDH는 비교적 안정한 효소로서 모든 세포 타입에 존재하며 세포막이 손상되었을 경우 세포 배지로 빠르게 방출되는 특성이 있다. 이를 위해, SNU-601, SNU-638, SNU-1 및 SNU-216 세포들을 24웰 플레이트에 5 x 10⁴cells/웰이 되도록 각각 분주한 뒤, 500ul의 RPMI 배지에서 배양하고, 상기 기술된 방법과 동일하게 각 농도별로 UDCA를 처리하였다. 이후, 50ul의 LDH lysis 버퍼를 각 세포의 일정배양 마침시간 30분 전에 첨가하여 세포들을 용해시켰다. 용해된 세포들은 10분 동안 600g로 원심분리 하였고, 각 상층액을 10ul씩 24웰 마이크로 분주 플레이트에 넣은 후, 100ul의 LDH 반응 혼합액(200ul의 WST 기질 혼합물과 10.5ml의 LDH 어세이 버퍼의 혼합물)을 첨가하여 혼합시켰다. 이후, 상기 플레이트를 상온에서 30분 동안 교반시키고, 플레이트 리더(바이오 래드사, 미국)기기를 이용하여 일차 파장으로 450nm 및 기준 파장 650nm 조건에서 측정하였다. 또한, 각 세포로부터 방출된 LDH의 방출 퍼센트 계산은 다음과 같은 수식을 통해 계산하였다.

퍼센트(%) 독성=[(실험에 의한 LDH 방출)-(효과기 또는 타겟에 의한 자발적 LDH 방출)/(LDH 방출 최대값)-(자발적 LDH 방출값)] × 100%

여기서 대조군 세포로부터 자발적으로 방출된 LDH 활성도는 완전히 용해된 세포로부터 측정된 LDH 방출 최대값은 2% 미만이었다.

그 결과, 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 위암 세포주들에 UDCA를 처리하고 HO/PI를 이용한 이중 염색법을 수행한 경우, 위암 세포들은 모두 아폽토시스에 의해 세포사멸이 유도된 것을 확인할 수 있었고, 반면, 위암 세포주 모두에서 세포괴사는 아폽토시스에 비해 거의 유도되지 않는 것으로 나타났다.

또한, 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase:LDH) 방출 분석 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, UDCA를 처리한 위암 세포주들의 경우, LDH의 활성은 거의 1% 이하인 것으로 나타났다. 일반적으로 세포괴사는 세포막 손상이 발생하였을 경우, 세포 사멸의 초기 단계에서 LDH의 방출이 발생하며, 이는 전형적인 세포괴사(necrotic cell death)의 특징이다. 반면, 본 발명의 UDCA에 의한 위암세포의 세포사멸은 LDH의 방출을 유도하지 않았음을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 UDCA에 의한 위암세포의 세포사멸은 세포괴사 아닌 아폽토시스에 의한 것임을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 도 2d 및 2e의 웨스턴 블럿 결과를 통해 보다 확실히 알 수 있다. 즉, 아폽토시스가 발생하게 되면, 카스파제는 활성화되며, PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)가 절단되어지는 특징이 있는데, 본 발명에 따른 UDCA를 위암 세포주에 처리한 결과, 카스파제-3, 카스파제-6 및 PARP의 절단된 절편들을 확인할 수 있었고, 나아가 LC-I에서 LC-II로의 전이가 유도되지 않음을 확인함으로써 UDCA는 위암 세포에서 자식작용(autophagy)을 유도하지 않는다는 사실을 알 수 있었다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 UDCA가 위암 세포에서 아폽토시스에 의한 세포사멸을 유도하는 반면, 세포괴사 또는 자식작용에 의한 세포사멸을 유도하지 않는다는 것을 알 수 있었다.

<1-3> 데옥시콜린산에 의한 위암 세포의 아폽토시스 유도 분석

데옥시콜린산(DCA)의 경우, 간세포 및 대장암 세포에서 아폽토시스를 유도시킨다는 내용이 개시된 바 있다. 그러나 데옥시콜린산의 경우, 위암 세포에서 아폽토시스를 유도시킨다는 내용에 대해서는 전혀 공지된 바 없어, 본 발명자들은 데옥시콜린산을 위암 세포주에 각각 처리한 다음, MTT 어세이, HO/PI 이중 염색법 및 LDH 방출 분석 실험을 수행하였으며, 상기 실험들은 상기 실시예 <1-1> 내지 <1-2>에서 UDCA 대신 DCA를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, UDCA를 위암 세포에 처리하였을 경우와 동일하게, DCA 역시 농도 의존적으로 위암 세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 나타났고(도 3a 참조), HO/PI 디중 염색법에 의한 분석 결과, UDCA와는 달리 DCA는 위암 세포에서 세포괴사를 유도하는 것으로 나타났다(도 3b 및 3c 참조). 또한, LDH 방출 분석 실험을 통해서도 DCA는 위암 세포에서 농도 의존적으로 세포막 밖으로 LDH의 방출량이 증가하는 것으로 나타났다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 DCA의 경우 위암 세포의 세포사멸을 유도하는 활성이 있으나, 세포사멸의 유도 기작이 UDCA와는 달리 세포괴사를 통해 이루어짐을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

위암 세포에서 UDCA 에 의한 아폽토시스 유도에서 카스파제들의 영향 분석

본 발명자들은 상기 실시예 1을 통해 UDCA가 위암 세포에서 아폽토시스를 유도하여 세포사멸을 일으킨다는 사실을 확인함에 따라 UDCA에 의한 아폽토시스 작용에서 카스파제들의 영향을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, 상기 실시예에서 사용한 위암 세포주인 SNU-601 및 SNU-638세포에 20μM의 카스파제 억제제(Z-DEVD-FMK, Z-VEID-FMK, Z-IETD-FMK, Z-LEHD-FMK 또는 Z-VAD-FMK)를 각각 1시간 동안 처리한 후, 1000μM의 UDCA를 처리한 다음, SNU-601 세포의 경우 24시간을 배양하였고, SNU-638 세포의 경우에는 36시간을 배양하였다. 이후 상기 세포들은 상기 실시예에서 수행한 HO/PI 이중 염색법 방법을 이용하여 아폽토시스가 유발된 세포들을 확인하였으며, 핵의 응집 또는 단편화된 정도를 측정하였다.

또한, UDCA 처리에 의한 위암 세포에서 카스파제 8의 활성화 정도를 IETD-pNA 기질 절단분석을 통해 관찰하였는데, 상기 분석은 FADD-유사 IL-1β-전환 효소(FLICE)/카스파제-8 비색 분석 키트(바이오비전)를 사용하여 상기 키트의 사용방법에 따라 실험을 수행하였다. 즉, 5 x 10⁵의 위암 세포에 1000μM의 UDCA를 처리한 후 12, 18, 27 및 48시간 동안 각각 배양한 다음, 세포들은 원심분리하여 수집하였다. 이후 수집한 세포들을 50ul의 차가운 세포 용해 버퍼로 세포들을 용해(lysis)시킨 후, 10분 동안 얼음에 배양하고 10,000g의 속도로 4℃에서 1분간 원심분리 하였다. 상등액을 새 튜브에 옮긴 후, 바이오 래드 단백질 분석키트를 사용하여 정량한 다음, 세포 용해 버퍼로 150ul~50ul의 부피로 희석시키고, 50ul의 2x 반응 버퍼(10mM의 DTT 함유) 및 5ul의 4mM IETD-pNA 기질을 첨가하여 최종 농도가 200μM가 되도록 하였다. 37℃에서 2시간 배양하고 405nm에서 플레이트 리더로 흡광도를 측정하였고, 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포를 사용하였다.

또한, 본 발명자들은 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스에서 카스파제 8의 중요도를 확인하기 위해, 카스파제 8의 억제제인 Z-IETD-FMK(20μM)를 상기 위암 세포주에 미리 1시간 동안 처리한 다음, 1000μM의 UDCA를 SNU-601(24시간 동안) 및 SNU-638 세포(36시간 동안)에 각각 처리하고, 절단된 카스파제 3, 절단된 카스파제 6, 절단된 PARP 및 튜불린의 단백질 양을 웨스턴 블럿을 수행하여 확인하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스 유도는 카스파제 억제제를 처리할 경우, 억제되는 것으로 나타났으며, 카스파제 8의 활성은 UDCA의 처리에 의해 활성도가 증가하는 것으로 나타났다(도 4b 참조). 또한, UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스의 경우, 카스파제 8가 중요한 역할을 하는지를 확인하기 위해 카스파제-8 억제제를 처리 후 웨스턴 블럿을 수행한 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 카스파제 3, 6, 및 PARP가 절단된 절편들이 관찰되지 않았다.

따라서 상기 결과를 통해, 본 발명자들은 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스 유도 과정에서 UDCA가 카스파제 8의 활성을 증가시키고, 따라서 카스파제 8의 다운 스트림에 관련된 신호 전달 체계에 의해 세포의 아폽토시스가 유도된다는 사실을 알 수 있었으며, 나아가 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스는 카스파제 8과 카스파제 3, 6 및 9가 관련되어 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

UDCA 에 의한 DR5 의 발현 유도 분석

암 세포에서 세포 사멸의 유도 과정에 있어서, DR4, DR5 및 FAS와 같은 세포표면 사멸 수용체가 중요한 역할을 하는 것은 잘 알려진 사실이다. 이에 본 발명자들은 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스 유도 과정에서 DR4, DR5 및 FAS와 같은 세포 표면 사멸 수용체가 관여하는지를 조사하였다. 이를 위해 하기 표 1 에 기재된 세포 표면 사멸 수용체들의 siRNA를 이용하여 세포내에서 이들 수용체들의 발현을 제거시켰는데, 즉, 각 수용체들의 siRNA(8ug)를 1x10⁶ 세포수의 위암 세포에 AMAXA 방법에 의해 형질도입 시켰고, siRNA가 도입된 세포들을 37℃ 온도 및 5%의 이산화탄소의 조건하에서 40시간 동안 배양한 다음, 1000μM의 UDCA를 상기 세포에 각각 처리하였고, 일정 시간 배양(24시간 또는 36시간)한 다음, 상기 실시예들에서 기술된 방법과 동일하게 카스파제-8 활성도, MTT 분석, HO/PI 이중 염색법 및 ROS 분석을 수행하였다. 이때 상기 ROS 분석은 24웰 플레이트에 5x10⁴ 세포수의 위암 세포들을 분주하고 500ul의 RPMI 배지로 배양한 다음, UDCA를 처리하고 다시 세포들을 상기 조건과 동일 조건하에서 배양하였다. 이후, 반응산소종(ROS)의 생성 확인을 위해 50μM의 2‘7’-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA, Molecular probe) 및 0.5ug의 HO를 각 세포에 첨가하고 1시간동안 배양하였다. 이후, 세척한 다음, DCFH-DA의 측정은 490nm의 흥분파장 및 530nm의 방출파장에서 플루오로카운트 모델 MQM200 플레이트 리더(Packard instrument, USA)기를 사용하여 측정하였고, HO의 측정은 340nm의 흥분파장 및 425nm의 방출파장에서 측정하였다. 또한 ROS의 생성량은 각 웰당 DCFH-DA/HO의 비율을 측정함으로써 계산하였다.

siRNA 서열

세포 표면 사멸 수용체	siRNA 서열	서열번호
siRNA FAS(S)	5'-GCUUAUACAUAGCAAUGGU(dtdt)-3'	1
siRNA FAS(AS)	5'-ACCAUUGCUAUGUAUAAGC(dtdt)-3'	2
siRNA RIP1(S)	5'-CACACAGUCUCAGAUUGAU(dtdt)-3'	3
siRNA RIP1(AS)	5'-AUCAAUCUGAGACUGUGUG(dtdt)-3'	4
siRNA FADD(S)	5'-CCAAGAUCGACAGCAUCGA(dtdt)-3'	5
siRNA FADD(AS)	5'-UCGAUGCUGUCGAUCUUGG(dtdt)-3'	6
siRNA DR4(S)	5'-CUGGAAAGUUCAUCUACUU(dtdt)-3'	7
siRNA DR4(AS)	5'-AAGUAGAUGAACUUUCCAG(dtdt)-3'	8
siRNA DR5(S)	5'-CAGACUUGGUGCCCUUUG(dtdt)-3'	9
siRNA DR5(AS)	5'-UCAAAGGGCACCAAGUCUG(dtdt)-3'	10
siRNA c-Jun(S)	5'-ACUGUAGAUUGCUUCUGUA(dtdt)-3'	11
siRNA c-Jun(AS)	5'-UACAGAAGCAAUCUACAGU(dtdt)-3'	12
siRNA NF-kB(p65)(S)	5'-CCUGAGCACCAUCAACUAU(dtdt)-3'	13
siRNA NF-kB(p65)(AS)	5'-AUAGUUGAUGGUGCUCAGG(dtdt)-3'	14
siRNA ERK1(S)	5'-CUCUCUAACCGGCCCAUCU(dtdt)-3'	15
siRNA ERK1(AS)	5'-AGAUGGGCCGGUUAGAGAG(dtdt)-3'	16
siRNA PKCd(S)	5'-CUCAUGGUACUUCCUCUGU(dtdt)-3'	17
siRNA PKCd(AS)	5'-ACAGAGGAAGUACCAUGAG(dtdt)-3'	18
siRNA 대조군(S)	5'-CCUACGCCACCAAUUUCGU(dtdt)-3'	19
siRNA 대조군(AS)	5'-ACGAAAUUGGUGGCGUAGG(dtdt)-3'	20

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, UDCA에 의한 세포의 아폽토시스는 SNU-601 세포에서 siRNA DR5 또는 siRNA FAS가 도입되었을 경우, 아폽토시스가 감소되는 것으로 나타났으며, 반면, siRNA DR4에 의해서는 아폽토시스가 감소되지 않는 것으로 나타났다. 또한, SNU-638 세포에서는 siRNA DR4 또는 siRNA DR5가 도입되었을 경우, 아폽토시스가 감소되는 것으로 나타났으며, 반면, siRNA FAS에 의해서는 아폽토시스가 감소되지 않는 것으로 나타났고, 이와 같은 결과는 카스파제-3, 6 및 PARP 활성도와도 같은 결과를 보였다(도 5b 참조). 또한, 카스파제 8의 활성도를 측정한 결과, UDCA에 의한 카스파제 8의 활성은 SNU-601 세포의 경우, siRNA DR5 또는 siRNA FAS에 의해 억제되는 것으로 나타난 반면, siRNA DR4에 의해서는 억제되지 않는 것으로 나타났고, SNU-638 세포의 경우, siRNA DR4 또는 siRNA DR5에 의해 카스파제 8의 활성이 감소되는 것으로 나타난 반면, siRNA FAS에 의해서는 감소되지 않는 것으로 나타났다(도 5c 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스 유도과정은 SNU-601 세포의 경우, DR5 및 FAS에 의해 조절되며, SNU-638 세포의 경우에는 DR4 또는 DR5에 의해 조절된다는 사실을 알 수 있었고, 특히 DR5는 두가지의 위암 세포 모두에서 조절작용, 즉 UDCA에 의한 아폽토시스의 개시를 유도한다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

위암 세포에서 FADD 및 RIP 을 통한 UDCA 의 아폽토시스 활성 유도

세포에서 아폽토시스가 유도될 경우, 일반적으로 TRAIL은 사멸 수용체인 DR4 및 DR5에 결합하고, FAS 리간드는 FAS에 결합하게 되면, FADD가 결합되도록 유도하는 특징이 있는데, 이들의 사멸 효과 도메인들을 통해 FADD는 카스파제 8이 결합되도록 유도하여 결국 수용체에 세포 사멸 유도 신호 복합체가 조립되도록 한다. 이에 본 발명자들은 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스가 세포사멸 인자들을 통해 매개되는지를 확인하기 위해 상기 실시예 3에 기재된 siRNA FADD, siRNA RIP1을 위암 세포에 형질도입한 후, 1000μM의 UDCA를 처리하고 배양한 다음, 상기 실시예에서 기술된 HO/PI 이중 염색법, 웨스턴 블럿 및 카스파제 8의 활성도 측정 방법을 각각 수행하였다.

그 결과, 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, SNU-601 및 SNU-638의 세포 모두에서 siRNA FADD 및 siRNA RIP1에 의해 UDCA에 의한 세포의 아폽토시스 정도가 대조군에 비해 감소된 것으로 나타났고, 또한, siRNA FADD 및 siRNA RIP1에 의해 카스파제 3, 6 및 PARP의 활성도 감소된 것으로 나타났다. 또한, siRNA FADD 및 siRNA RIP1에 의해 카스파제 8의 활성도 감소된 것으로 나타났다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스는 FADD 및 RIP1의 세포 사멸인자를 통해 이루어진다는 사실을 알 수 있었고, 이들은 카스파제 8을 사멸 수용체로 유도되는 작용을 하는데 중요한 역할을 한다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

UDCA 에 의해 발현 유도된 DR5 에 의한 아폽토시스 작용에서 PKC δ의 역할

PKCδ는 PKC 슈퍼 패밀리의 한 종류로서, 세포의 아폽토시스에 관여하는 것으로 알려져 있으며, PKCδ가 세포막, 미토콘드리아 및 핵으로 이동되면 특정 기작을 활성화시켜 카스파제 3를 활성화시키고 궁극적으로 아폽토시스를 유도하고, 따라서 PKC의 활성은 사이토졸 및 기타 세포 내 위치에서 카이네이즈(kinase)의 재분배(redistribution)에 의한 것으로 보고되고 있다. 이에 본 발명자들은 UDCA가 세포내 위치된 PKCδ를 활성화시키는지를 확인하기 위해, 위암 세포에 1000μM의 UDCA를 처리한 다음, 각 시간별(0, 1, 2, 4, 8 및 12시간)로 배양한 다음, Proteoextract subcellular proteome extraction kit를 이용하여 사이토졸릭 단백질(분획 1) 및 기관/막 단백질(분획 2)를 추출하였으며, 웨스턴 블럿을 이용하여 PKCδ, PKCα, PKCθ, PKCε의 사이토졸에서 막으로의 이동을 분석하였다.

그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, UDCA의 처리는 PKCδ를 사이토졸에서 막으로 이동하는 효과를 가져왔으며, 이러한 PKCδ의 세포막으로의 이동은 UDCA에 의한 세포의 아폽토시스 발생 이전에 유도됨을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 PKCδ의 억제제를 처리하여 UDCA에 의한 아폽토시스의 변화정도를 확인하기 위해, 위암 세포주에 대해 각각 1, 2 및 5μM의 로틀레린(rottlerin), 즉, PKCδ의 억제제를 처리하고, 1000μM의 UDCA를 처리한 다음, HO/PI의 이중 염색법 및 카스파제들의 항체들을 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였고, 나아가 siRNA PKCδ을 이용하여 위암 세포에 형질도입 시킨 후, 세포내에서 카스파제들의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 확인하였다.

그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, PKCδ의 억제제인 로틀레린을 처리한 경우, UDCA에 의한 세포의 아폽토시스는 억제되는 것으로 나타났으며, 억제 정도는 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 7c에 나타낸 바와 같이, 로틀레린을 처리한 경우, 세포 사멸인자들인 카스파제들의 활성이 억제되는 것으로 나타났으며, siRNA PKCδ에 의해 위암 세포에서 PKCδ의 발현을 억제할 경우, UDCA에 의한 세포의 아폽토시스는 감소되어 카스파제 3, 6 및 PARP의 활성도 억제되어 이들의 절단된 형태가 관찰되지 않았다(도 7d 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 위암 세포에 UDCA를 처리할 경우, UDCA에 의해 PKCδ는 세포막으로 이동됨과 동시에 세포사멸 인자들의 활성화를 통해 아폽토시스를 유도한다는 사실을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 앞서 수행한 실시예를 통해 UDCA가 위암 세포에서 DR5의 발현을 유도한다는 사실을 확인함으로써 UDCA에 의한 아폽토시스에서 DR5 및 PKCδ의 관련성을 분석하기 위해 위암 세포주에 1, 2 및 5μM의 로틀레린(rottlerin)을 1시간 동안 미리 처리한 다음, 1000μM의 UDCA를 처리한 다음, 웨스턴 블럿을 수행하여 DR5의 발현 정도를 조사하였고, 또한, siRNA PKCδ를 위암 세포주에 각각 형질도입 시킨 후, UDCA를 처리하고 웨스턴 블럿을 수행하여 DR5 및 PKCδ의 발현 정도를 조사하였다.

그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 위암 세포주에 PKCδ의 억제제인 로틀레린을 처리한 결과, UDCA에 의한 DR5의 발현은 감소되는 것으로 나타났으며, siRNA PKCδ를 사용하여 세포내에서 PKCδ의 발현을 억제한 경우, 역시 UDCA에 의한 DR5의 발현이 감소되는 것으로 나타났다(도 8b 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스 과정에서 DR5의 발현은 PKCδ에 의해 조절되어진다는 사실을 알 수 있었고, 따라서 PKCδ는 UDCA에 의한 DR5의 발현 및 위암 세포의 아폽토시스의 개시 과정에서 매우 중요한 역할을 한다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

UDCA 에 의한 DR5 의 발현 및 PKC δ의 이동에 의한 아폽토시스 작용에서 ROS 발생과의 관련성 분석

반응성 산소종(ROS)는 아폽토시스 및 세포괴사를 포함하는 세포사멸 과정에서 세포사 모드를 결정하는 주요 인자로 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스 과정에서 ROS가 관여하는지를 확인하기 위해 위암 세포주에 1000μM의 UDCA를 처리한 다음, 3시간 또는 5시간 배양 후, 상기 실시예 3에 기재된 방법과 같이 ROS의 생성 정도를 분석하였고, HO/PI의 이중 염색법을 수행하였으며, 카스파제들의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다. 또한, 이때 ROS의 소거제들인 NAC(10mM), BHA(100μM), Trion(10mM), DPI(2μM) 및 카탈라제(1000U)을 각각 첨가한 것들에 대해서도 상기와 같은 동일 방법들을 통해 위암 세포에서의 아폽토시스 정도를 측정하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 위암 세포를 대상으로 UDCA를 처리한 경우, 세포에서 ROS의 생성은 증가하는 것으로 나타났고(도 9a 참조), 다양한 종류의 ROS의 소거제들을 처리한 경우, 특히 NAC 및 BHA는 UDCA에 의한 아폽토시스를 통한 세포사멸을 억제하는 것으로 나타났다(도 9b 및 9c 참조).

따라서 상기 결과를 통해 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스는 ROS의 생성을 통해 조절된다는 사실을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 UDCA에 의해 발현이 유도되는 DR5의 경우, ROS의 생성이 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해, 위암 세포에 대해 UDCA 및 ROS의 소거제인 NAC 또는 BHA을 각각 첨가하고 웨스턴 블럿을 통해 DR5의 발현 정도를 조사하였다.

그 결과, 도 10a 및 10b에 나타낸 바와 같이, 위암 세포에서 UDCA에 의해 발현이 유도된 DR5는 NAC 및 BHA에 의해 발현이 감소되는 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과를 통해 UDCA에 의한 DR5의 발현은 ROS의 생성에 의해 조절된다는 사실을 알 수 있었으며, 나아가 UDCA에 의한 DR5의 발현에 있어서 ROS가 또 다른 중요한 조절자로 작용한다는 사실을 알 수 있었다.

한편, PKCδ는 ROS 생성 기작의 다운 스트림에 존재하는 인자로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스 과정에서 ROS의 생성이 PKCδ의 이동(trasnlocation)을 조절하는지를 확인하는 실험을 수행하였는데, 즉, 위암 세포주에 대해 10mM의 NAC를 1시간 처리하고, 각 시간별(2, 4, 및 8시간)로 세포로부터 사이토졸릭 단백질(분획1:C) 및 기관/막 단백질(분획2:M)을 각각 수득한 다음, 웨스턴 블럿을 통해 PKCδ의 양을 측정하였다.

그 결과, UDCA에 의한 PKCδ의 사이토졸에서 막으로의 이동은 ROS의 생성 소거제인 NAC을 처리하였을 경우, 막으로의 이동이 감소되는 것으로 나타났다(도 11a 및 11b 참조). 따라서 상기 결과를 통해, UDCA에 의한 PKCδ의 이동은 ROS의 생성에 의해 조절되어진다는 사실을 알 수 있었고, PKCδ는 위암 세포에서 UDCA에 의한 세포사멸 과정에서 ROS 생성기작의 다운 스트림에 존재하는 인자임을 확인하였다.

< 실시예 7>

UDCA 로 유도된 DR5 의 발현에 의한 아폽토시스 작용에서 리피드 래프트(lipid raft)의 역할

세포막에 있어서 콜레스테롤은 막의 구성 및 유지와 유동성에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 바 있다. 특히 콜레스테롤이 풍부한 마이크로도메인, 일명 리피드 래프트(lipid raft)로 불리우는 도메인은 아폽토시스의 신호 전달에 중요한 역할을 하며, FAS-FADD, DR4 또는 DR5-FADD 복합체의 형성 및 카스파제 8의 활성화와 관련된 플라즈마 콜레스테롤의 변화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스 및 리피드 래프트(lipid raft)간의 관련성을 규명하기 위해 리피드 래프트 결핍 시약인 MBCD를 사용하였는데, 즉, 위암 세포주에 1 또는 2mM의 MBCD을 1시간 동안 처리한 후, 1000μM의 UDCA를 처리한 다음, 24시간 및 36시간 동안 각각 배양하고, MTT 어세이, HO/PI 이중 염색법 및 카스파제 8 활성도 측정을 통해 세포의 사멸정도를 측정하였다. 또한, 웨스턴 블럿을 통해 DR5의 발현 정도를 측정하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스에 의한 세포 사멸은 MBCD을 처리한 경우, 억제되는 것으로 나타났다(도 12a 참조). 또한, HO/PI 염색 결과, MBCD을 처리한 경우, 위암 세포에서 아폽토시스를 나타내는 핵의 응축 및 단편화가 MBCD를 처리하지 않은 군에 비해 감소되는 것으로 나타났으며(도 12b 참조), 카스파제의 활성도 MBCD의 처리에 의해 억제되고(도 12c 참조), UDCA에 의한 카스파제 8의 활성도 MBCD의 처리에 의해 억제되는 것으로 나타났다(도 12d 참조).

또한, UDCA에 의해 발현이 유도된 DR5의 경우, MBCD의 처리에 의해 발현 정도에 변화가 있었는지를 확인한 결과, UDCA에 의한 DR5의 발현이 MBCD에 의해 억제되는 것으로 나타났다(도 13a 및 13b 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 UDCA에 의한 위암 세포의 아폽토시스는 리피드 래프트에 의해 조절된다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 8>

UDCA 로 활성화된 ROS / PKC δ 에서 리피드 래프트(lipid raft)의 역할

상기 실시예 7의 결과를 통해 UDCA에 의한 위암 세포의 세포사멸 기작에서 리피드 래프트가 매우 중요한 역할을 한다는 사실을 확인함에 따라 앞서 수행한 실시예를 통해 확인한 ROS/PKCδ의 활성에도 리피드 래프트가 관여하는지는 조사하였다. 이를 위해 위암 세포주에 1 또는 2mM의 MBCD을 1시간 동안 처리한 후, 1000μM의 UDCA를 처리한 다음, 24시간 및 36시간 동안 각각 배양하고, 상기 세포들로부터 사이토졸릭 분획 및 기관/막 분획을 각각 추출한 다음, 웨스턴 블럿을 통해 PKCδ의 발현 정도를 측정하였고, 상기 실시예에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 ROS 생성 정도를 측정하였다.

그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 위암 세포에서 UDCA에 의한 PKCδ의 사이토졸에서 막으로의 이동은 MBCD의 처리로 인해 억제되는 것으로 나타났고(도 14a 참조), 이러한 결과를 통해 PKCδ는 세포의 아폽토시스 과정에서 리피드 래프트의 다운 스트림 이벤트 임을 알 수 있었다. 또한, ROS 생성 분석 결과, 위암 세포에서 UDCA에 의한 ROS 생성은 MBCD의 처리로 인해 감소되는 것으로 나타났다(도 14b 참조).

따라서 상기 결과를 통해 UDCA에 의한 ROS/PKCδ의 활성은 리피드 래프트에 의해 조절된다는 사실을 알 수 있었고, 따라서 리피드 래프트는 UDCA에 의한 ROS의 생성 및 사이토졸에서 세포막으로의 PKCδ의 이동에 의한 DR5의 발현 등 위암 세포에서 아폽토시스 작용에 아주 중요한 조절인자로 작용한다는 사실을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chosun University <120> Composition comprising ursodeoxycholic acid for preventing or treating gastric cancer <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA FAS(S) <400> 1 gcuuauacau agcaauggu 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA FAS(AS) <400> 2 accauugcua uguauaagc 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA RIP1(S) <400> 3 cacacagucu cagauugau 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA RIP1(AS) <400> 4 aucaaucuga gacugugug 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA FADD(S) <400> 5 ccaagaucga cagcaucga 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA FADD(AS) <400> 6 ucgaugcugu cgaucuugg 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA DR4(S) <400> 7 cuggaaaguu caucuacuu 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA DR4(AS) <400> 8 aaguagauga acuuuccag 19 <210> 9 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA DR5(S) <400> 9 cagacuuggu gcccuuug 18 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA DR5(AS) <400> 10 ucaaagggca ccaagucug 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA c-Jun(S) <400> 11 acuguagauu gcuucugua 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA c-Jun(AS) <400> 12 uacagaagca aucuacagu 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA NF-kB(p65)(S) <400> 13 ccugagcacc aucaacuau 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA NF-kB(p65)(AS) <400> 14 auaguugaug gugcucagg 19 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA ERK1(S) <400> 15 cucucuaacc ggcccaucu 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA ERK1(AS) <400> 16 agaugggccg guuagagag 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA PKC delta (S) <400> 17 cucaugguac uuccucugu 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA PKC delta (AS) <400> 18 acagaggaag uaccaugag 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA control(S) <400> 19 ccuacgccac caauuucgu 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA control(AS) <400> 20 acgaaauugg uggcguagg 19

Claims (10)

1. 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid:UDCA) 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 우루소데옥시콜린산(UDCA)은 위암 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도하여 세포사멸을 유발시킴으로써 항암활성을 갖는 것을 특징으로 하는 위암 예방 또는 치료용 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 아폽토시스(apoptosis)는 우루소데옥시콜린산(UDCA)의 처리에 의해, 위암 세포에서 카스파제(caspase)의 활성 촉진; 세포사멸 수용체의 활성 또는 발현 촉진; 사이토졸(cytosol)에서 막(membrane)으로 PKC(protein kinase C) δ 단백질의 이동(translocation); 또는 활성산소종(ROS)의 생성에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 위암 예방 또는 치료용 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 카스파제(caspase)는 카스파제-3, 카스파제-6, 카스파제-8 및 카스파제-9로 이루어진 군 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 위암 예방 또는 치료용 조성물.
5. 제3항에 있어서,
   상기 세포 사멸 수용체는 DR3, DR4, DR5, DR6, FAS 및 TNFR로 이루어진 군 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 위암 예방 또는 치료용 조성물.
6. 제3항에 있어서,
   상기 세포사멸 수용체의 활성 또는 발현 촉진은 FADD 또는 RIP1 단백질의 활성을 촉진시켜 위암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 것을 특징으로 하는 위암 예방 또는 치료용 조성물.
7. 제3항에 있어서,
   상기 활성산소종(ROS)의 생성 및 PKC(protein kinase C) δ 단백질의 활성은 세포막에 위치하고 있는 리피드 래프트(lipid raft)에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 위암 예방 또는 치료용 조성물.
8. 제1항에 있어서,
   상기 우루소데옥시콜린산은 조성물 총 중량에 대하여 250μM~1000μM로 포함되는 것을 특징으로 하는 위암 예방 또는 치료용 조성물.
9. 우루소데옥시콜린산(UDCA) 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 아폽토시스(apoptosis) 유도제 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 위암 세포에서 아폽토시스를 유발함을 특징으로 하는 아폽토시스 유도제 조성물.

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