KR20120089838A

KR20120089838A - 암 위험성 평가에 사용되는 방법 및 키트

Info

Publication number: KR20120089838A
Application number: KR1020127004297A
Authority: KR
Inventors: 파멜라 폴록; 폴 제이 굿펠로우
Original assignee: 더 트랜스내셔날 게노믹스 리서치 인스티튜트; 폴 제이 굿펠로우; 파멜라 폴록; 워싱턴 유니버시티
Priority date: 2009-07-17
Filing date: 2010-07-19
Publication date: 2012-08-14
Also published as: IL217565A0; WO2011009114A2; CA2768475A1; US20120289416A1; WO2011009114A3; JP2013507904A; AU2010273938A1; EP2454388A2

Abstract

본 발명은 FGFR2에서의 돌연변이 존재 또는 부재를 기초로 자궁내막암의 재발 위험성을 평가하는 방법에 관한 것이다.

Description

암 위험성 평가에 사용되는 방법 및 키트{METHODS AND KITS USED IN ASSESSING CANCER RISK}

자궁내막암은 가장 흔한 부인과 암이다. 자궁내막 암종은 제I형 및 제II형 질환으로 하위분류된다. 제I형 자궁내막양 자궁내막은 자궁내막암의 대략 80-85%를 차지하고 에스트로겐-의존성 및 고분화(well differentiated)로 분류된다. 제II형 자궁내막암은 저(poorly) 분화 자궁내막양, 명세포, 및 높은 생물학적 침략성을 나타내고 불충분한 예후와 연관있는 유두상 장액성 조직학적 아형을 포함한다. 대략 75%의 제I형 자궁내막양 종양은 병기(stage) I/II로서 진단된다. 이들 환자는 5년 총 생존률이 80-90%이고, 5년 암 특이적 생존율이 90-95%이며, 재발율은 4-8%이다(Creutzberg et al. 2000). 그러나, 재발되거나, 또는 후기 병기나 진행형 질환이 있는 것으로 나타나는 여성의 경우, 효과적인 것으로 검증된 보조 요법이 없기 때문에 그 생존률이 낮다. 재발 후 중앙치 생존은 10개월이고 재발된 환자의 5년 생존율은 겨우 13%이다. 재발 위험성이 있는 환자를 확인하기 위한 추가적인 예후 마커의 개발이 분명하게 요구되고 있다.

본 발명은 무엇보다도 자궁내막암으로 진단된 환자에서 질환 재발 위험성을 평가하는 방법을 제공한다.

본 발명의 목적은 FGFR2 돌연변이 상태를 기초로 자궁내막암의 재발 위험성이 높은 코호트로 피험체를 분류하는 것이다.

본 발명의 목적은 FGFR2 돌연변이 상태를 기초로 자궁내막암의 재발 위험성이 높은 코호트로 피험체를 분류하는데 사용되는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 다르게는 현존 임상병리적 위험 인자 예컨대 병기(stage), 등급(grade), 또는 인종 등을 기초로 예측하게 되는 질환 재발 위험성이 높은 자궁내막암 환자를 확인하는 것이다.

상기 목적 및 다른 목적은 피험체로부터 샘플을 얻는 단계 및 서열번호 1 또는 서열번호 2의 돌연변이체를 검출할 수 있는 조건을 샘플에 대해 적용하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 피험체는 자궁내막암을 갖고 있음이 알려져 있고, 샘플은 종양 세포를 포함한다. 코호트는 자궁내막암의 재발 위험성이 높은 2 이상의 개체를 포함한다. 돌연변이체는 1 이상의 하기 아미노산 변화를 일으키는 돌연변이를 포함하여, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 임의의 돌연변이를 포함할 수 있다: S252W, P253R, S373C, Y376C, C383R, G385R, I548V, N550K, N550H, K660E, M392R, V396D, L398M, 및 IVS 10+2A>C. 자궁내막암은 자궁내막양 아형일 수 있다. 병기는 병기 IA, 병기 IB, 병기 IC, 병기 IIA, 및 병기 IIB를 포함한, 임의 병기일 수 있다. 등급은 등급 1, 등급 2 및 등급 3을 포함한, 임의 등급일 수 있다. 조건은 서열번호 1의 돌연변이체를 검출할 수 있다. 이러한 예에서, 조건은 핵산 서열분석, 마이크로어레이 분석, PCR 증폭, 대립유전자 특이적 PCR 증폭, 제한효소 단편 길이 다형성, 대립유전자 특이적 혼성화, 대립유전자 특이적 프라이머 연장, 및/또는 서던 블랏으로 이루어진 군에서 선택되는 방법의 사용을 포함할 수 있다. 조건은 서열번호 2의 돌연변이체의 검출을 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 조건은 HPLC, 질량 분광분석, ELISA, 유세포측정법, 면역조직화학법 또는 방사면역측정법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법의 사용을 포함할 수 있다. 조건은 다르게는 FGFR2 단백질의 활성 측정을 포함할 수 있다.

상기 목적 및 다른 목적들은 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군에서 선택되는 군에서 선택되는 서열의 돌연변이체를 검출할 수 있는 제1 시약 및 코호트로 피험체의 분류를 표시하는 지시서를 포함하는 키트의 사용을 통해 달성될 수 있고, 여기서 코호트는 자궁내막암의 재발 위험성이 높은 2 이상의 개체를 포함한다. 돌연변이체는 1 이상의 하기 아미노산 변화를 일으키는 것을 포함하는, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 임의 돌연변이를 포함할 수 있다: S252W, P253R, S373C, Y376C, C383R, G385R, I548V, N550K, N550H, K660E, M392R, V396D, L398M, 및 IVS 10+2A>C. 제1 시약은 서열번호 1의 돌연변이체에 결합할 수 있다. 이러한 예에서, 키트는 핵산 서열분석, 마이크로어레이 분석, PCR 증폭, 대립유전자 특이적 PCR 증폭, 제한효소 단편 길이 다형성, 대립유전자 특이적 혼성화, 대립유전자 특이적 프라이머 연장, 및 서던 블랏으로 이루어진 군에서 선택되는 방법의 사용을 용이하게 하는 성분을 더 포함할 수 있다.

키트는 서열번호 2의 돌연변이체에 결합할 수 있는 제1 시약을 포함할 수 있다. 제1 시약은 제1 항체를 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 키트는 ELISA, 유세포측정법, 및 방사면역측정법로 이루어진 군에서 선택된 방법의 사용을 용이하게 하는 성분을 더 포함할 수 있다. 결과는 특정 핵산 서열 또는 광학 밀도 값을 포함하는 돌연변이체의 검출을 표시하는 결과일 수 있다. 지시서는 양성 대조군 또는 기록물(writing)을 포함하는 임의의 지시서일 수 있다. 기록물은 서면상의 기록물 또는 웹사이트를 통해 입수할 수 있는 기록물을 포함하는 임의 기록물일 수 있다. 기록물은 사진을 포함할 수 있다. 지시서는 또한 입력으로서 결과 및 출력으로서 피험체의 분류를 검출하도록 구성된 소프트웨어를 포함할 수도 있다. 이러한 소프트웨어는 돌연변이체를 검출하도록 구성된 기계에 도입될 수 있다.

도 1은 자궁내막양 자궁내막암에 FGFR2에서 동정된 돌연변이의 위치를 도시한 도면이다. 대부분의 돌연변이는 7개 핫스팟에 존재한다.
도 2는 FGFR2 돌연변이가 존재(Yes) 및 부재(No)하는 중간 위험도 환자에서의 무진행(progression free) 생존률 곡선을 도시한 도면이다.
도 3은 FGFR2 돌연변이가 존재(Yes) 및 부재(No)하는 중간 환자에서의 전체 생존률을 도시한 도면이다.
도면 내 성분 및 부분은 단순하게 나타내었고 임의의 특정 서열 또는 구체예에 따라 반드시 제시되는 것은 아니다.

자궁내막암은, 예를 들면, 장액성, 점액성, 및 자궁내막양 조직학적 아형 또는 자궁의 내벽을 포함한, 자궁내막에서 시작되는 임의의 다른 암을 포함하는, 질환의 모든 형태 및 아형을 포함한다. 자궁내막암은 데이타의 완전한 수술조직학적 평가를 강조하는, FICO(International Federation of Gynecology and Obstetrics) 시스템을 이용하여 현재는 수술적으로 병기구분된다. 진행형 또는 재발형 자궁내막암과 연관된 우울한 예후에 대하여, 질환 진행 및 재발에 대한 위험성이 있는 환자를 확인하기 위한 다수의 노력이 이루어졌다. 후기 자궁외 질환(병기 III/IV)이 있는 것으로 진단받은 환자는 재발 위험성이 높다. 자궁에 국한된 암(병기 I/II)을 갖는 환자에서, 높은 재발 위험성은 조직학적 세포 유형, 종양 등급, 자궁근층 침윤 깊이, 자궁경관으로의 잠재적 연장 및 림파관의 종양 세포 침윤(림프혈관 공간 침윤: LVSI)과 연관있다. 표 4는 재발 위험성이 낮거나, 중간이거나 또는 높은 것으로 여겨지는 환자의 병기 및 등급 분류를 설명하며, 여기서 중간 위험도는 환자를 저-중간 위험도 및 고-중간 위험도로 더욱 분류된다.

FGFR2 유전자의 개념은 서열번호 1에 기재된 코딩 뉴클레오티드 서열, 또는 대립유전자 변이체 및 오르쏘로그를 포함하는 상동체를 갖는, 인간 기원의 유전자를 포함한다. FGFR2 단백질은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 오르쏘로그를 포함하는 상동체를 갖는 단백질, 바람직하게는 인간 기원의 단백질을 포함한다.

도 1은 FGFR2 단백질의 다양한 도메인 및 그러한 도메인과 관련되어 맵핑된 FGFR2 돌연변이를 도시한 도면이다. FGFR2는 4개의 상이한 유전자에 의해 코딩되는 구조적으로 관련된 티로신 키나아제 수용체(FGFR 1-4)의 패밀리에 속한다. FGFR2는 3개의 세포외 면역글로불린-유사(Ig) 도메인, 경막 도메인, 및 스플릿 티로신 키나아제 도메인으로 구성된 당단백질이다. IgIII 도메인의 교차 스플라이싱은 FGF/FGFR 결합 및 신호전달의 중복성 및 특이성 패턴 둘 모두에 대한 주요 결정요인이다. 이러한 스플라이싱 사건은 조직 특이적이고 구별되는 리간드 특이성을 갖는 FGFR1-FGFR3에 대한 IIIb 및 IIIc 수용체 이소폼을 생성시킨다(Mohammadi M, Olsen SK and Ibrahimi OA. (2005), Cytokine Growth Factor Rev 16: 107-137, Ornitz DM and Itoh N. (2001). Genome Bioi 2: REVIEWS3005). FGFR2의 경우, 상피세포 계열의 세포는 오직 엑손 8(FGFR2b; SEQ ill NO:2; NP 07529.2)에 의해 코딩되는 "IIIb" 이소폼만을 발현하는 반면, 간엽 유래 세포는 엑손 9(FGFR2c; SEQ ill NO:3; NP 000132.1)를 활용하는 "IIIc" 이소폼만을 발현한다(Scotet E and Houssaint E. (1995). Biochim Biophys Acta 1264: 238-242). FGFR2b 이소폼은 주로 FGF1, FGF3, FGF7 및 FGF10에 결합하는 반면, FGFR2c는 FGF7 및 FGFlO에 결합하지 않지만, FGF1, FGF2, FGF4, FGF6 및 FGF8에 높은 친화성으로 결합된다(Ibrahimi OA, Zhang F, Eliseenkova AV, ltoh N, Linhardt RJ and Mohammadi M. (2004), Hum MoI Genet 13: 2313-2324).

테스트 피험체 또는 생물학적 샘플 중 높은 활성을 갖는 FGFR2 돌연변이는 또한 활성화 돌연변이라고 할 수 있다. 활성화 돌연변이는 대조군, 예를 들면 건강한 피험체 또는 표준 샘플과 비교하여 테스트 피험체 또는 생물학적 샘플 중에서 보다 높은 전체 FGFR2 활성을 나타낸다. 바람직하게는, 필수적이지는 않지만, 활성은 대조군 보다 테스트 피험체 또는 샘플에서 10% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 또는 150% 이상 높다. 고활성은 예를 들면, 리간드 부재시 기본 FGFR2 활성의 증가, 리간드 존재 시 활성화 수준 증가, 장기간 자극, 분해 지연 또는 과발현, 예를 들면 증가된 리간드 결합에 기인한, 불규칙적이거나 또는 부적절한 리간드 결합, 항상성 수용체 이량체화, 손상된 재순환으로 인한 신호전달 증가, 분해 지연, 또는 키나아제 활성화로 인해 초래될 수 있다.

FGFR2의 고발현 수준은, 예를 들면, FGFR2 전사 또는 변역에 관여하는 코딩 또는 비코딩 유전자에서의 돌연변이 또는 FGFR2 유전자의 비코딩 영역 내 돌연변이에 의해 일어날 수 있다. FGFR2의 발현 수준은 예를 들면 종양을 정상 자궁내막(예를 들면, 정상의 인접 자궁내막 샘플)과 비교하여, 대조군과 비교시 테스트 피험체에서의 FGFR2 mRNA 또는 FGFR2 단백질 수준을 비교함으로써 결정할 수 있다.

보존성 변이체는 아미노산을 유사한 특성(예컨대 극성, 수소 결합 가능성, 산성, 염기성, 소수성, 방향족 등)을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 단백질 또는 효소 내 소정의 아미노산 잔기를 폴리펩티드의 전반적인 입체구조 및 기능을 변경시키지 않고 변화시킨 임의의 돌연변이 또는 다른 변이체를 포함한다. 유사한 특성을 갖는 아미노산은 당분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 아르기닌, 히스티딘 및 리신은 친수성-염기성 아미노산이고 서료교환될 수 있다. 유사하게, 이소루신, 소수성 아미노산은 루신, 메티오닌 또는 발린으로 치환될 수 있다. 단백질 전반에서 돌연변이의 위치에 따라, 치환은 폴리펩티드 또는 단백질의 겉보기 분자량 또는 등전점에 영향이 거의 없거나 또는 전혀 없을 수 있다. 보존성 변이체는 여전히 다양한 기전에 의해 수용체 활성화를 일으킬 수 있다.

보존성으로 표시한 것 이외의 아미노산은 단백질 또는 효소에서 다를 수 있고 그에 따라 기능이 유사한 임의의 2 단백질 간 단백질 또는 아미노산 서열 유사도 비율이 다양할 수 있으며, 예를 들면 클러스터 방법 등과 같은 배열 체계에 따라 결정시 70%~99%일 수 있는데, 여기서 유사도는 MEGALIGN 알고리즘을 기반으로 한다. 변이체의 개념에는 BLAST 또는 FASTA 등과 같은 알고리즘으로 결정시 아미노산 동일성이 적어도 60%, 75%, 85%, 90% 또는 95%이고, 비교되는 천연 또는 모 단백질 또는 효소와 같거나 또는 실질적으로 유사한 특성 및/또는 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 효소가 더 포함된다.

그러한 변이체의 일례로는 기능획득(gain-of-function) 변이체가 있다. 폴리펩티드의 기능획득 변이체는 단백질 또는 효소 중 1 이상의 아미노산 잔기의 변화가 폴리펩티드의 활성을 개선시키는 것인 임의 변이체를 포함한다. 기능획득 변이체를 생성시키는 변화에 의해 개선될 수 있는 폴리펩티드 활성의 예에는 효소 활성, 결합 친화성, 인산화 또는 탈인산화 효율, 활성화, 탈활성화, 또는 현재 공지되었거나 또는 개시될 일부 방법에 의해 정량 측정될 수 있는 단백질의 임의의 다른 활성 또는 특성이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

공통 진화 기원을 보유하는 단백질은 서로 상동성이거나 또는 유사할 수 있다. 상동성 또는 유사 단백질의 예에는 수퍼패밀리(예를 들면, 면역글로불린 수퍼패밀리) 유래 단백질 및 상이한 종 유래의 상동성 단백질이 포함된다. 이러한 단백질 및 그들의 코딩 유전자는 서로 서열 상동성을 갖는다. 상동성은 보존된 위치의 특정 잔기 또는 모티프의 존재나 유사도 비율로서 나타낼 수 있다.

돌연변이는 유전 물질 예컨대 DNA에서의 검출가능한 임의의 변화이거나, 또는 유전 물질의 RNA 또는 단백질 생성물에서의 상응하는 변화일 수 있다. 돌연변이체는 대조군 물질과 비교시 1 이상의 돌연변이가 검출되는 임의의 생물학적 물질일 수 있다. 돌연변이의 예에는 유전자 돌연변이가 포함되는데, 이는 유전자의 DNA 서열 또는 유전자 주변의 임의의 제어 성분이 변경된 것이다. 제어 성분은 소정 유전자를 제어할 수 있는 프로모터, 인핸서, 서프레서 또는 침묵화 성분을 포함한다. 돌연변이의 다른 예에는 DNA에서의 상응하는 돌연변이에 의해 초래되는 DNA 발현 산물 예컨대 RNA 또는 단백질에서의 변화를 포함한다. 돌연변이체는 또한 상호교환적으로 변이체라고도 할 수 있다. 돌연변이체의 개념에는 중양 세포에 특이적인 DNA 서열(정상의, 비신생물성 조직에서 얻은 DNA에는 존재하지 않음) 내 임의 변화를 포함한다.

특정 질환 결과의 위험성 평가는 개체가 특정 질환, 질병, 증상, 증후군, 또는 건강이나 신체 상태와 관련된 임의 조건을 현재 갖거나, 또는 이후 발생할 수 있는 높거나 또는 낮은 확률과 상관있는 임의 유형의 테스트, 분석, 조사, 결과, 판독 또는 해석의 수행을 포함한다. 질환 결과의 예에는 생존, 사망, 현존 질환의 진행, 현존 질환의 차도, 달리 질환 없는 피험체에서 질환 발병의 개시, 또는 질환의 차도가 있었던 피험체에서 질환의 지속적 상실을 포함한다. 질환 결과의 위험성 평가는 또한 예후의 개념을 포함한다. 예후는 특정 질환이 진단된 개체에서 질환 결과의 위험성의 임의 평가일 수 있다.

샘플은 게놈, 체성, 및 배선 DNA를 포함하여, DNA를 얻을 수 있는 임의 세포 공급원일 수 있다. 자궁내막암에서, 생물학적 샘플은 흔히 자궁에서 얻으며 일반적으로 1 이상의 자궁내막 종양 세포를 포함한다. 순환성 종양 세포가 혈청에서 발견되어 그로부터 얻을 수 있다. 종양 세포는 예를 들면, 외과적 절제술, 레이저 캡처 현미해부법, 혈액, 또는 세척액을 포함하는 다른 체액으로부터의 단리법, 또는 자궁내막 종양 세포를 얻고, 필요하면 농축할 수 있는 임의의 다른 방법을 포함하는 당분야에 공지되었거나 또는 개시될 임의 방법으로 얻을 수 있다. 다르게, 샘플은 혈청에서 직접 추출한 종양 유래의 자유 DNA를 포함할 수 있다(참조문헌 32 참조).

피험체는 자궁내막암을 앓는 것으로 의심되거나, 또는 자궁내막암으로 진단받았거나, 또는 자궁내막암 가족력이 있는 인간 환자를 포함하여 자궁내막암이 발병할 수 있는, 임의의 인간 또는 예를 들면, 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 또는 설치류 등을 포함하는, 인간 이외의 포유동물을 포함한다. 자궁내막암을 앓는것으로 의심되는 피험체의 확인 방법은 신체 검사, 가족 의학력, 피험체 의학력, 자궁내막 검시, 또는 예컨대 초음파검사, 컴퓨터 단층활영법, 자기 공명 영상법, 자기 공명 분광법, 또는 양전자 방출 단층촬영법 등과 같은 수많은 영상화 기법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 자궁내막암의 진단과 자궁내막암의 병기판단, 등급판단, 또는 다른 임상적 기술에 대한 방법은 의학 분야의 숙련가에게 공지이다.

서열-특이적 올리고뉴클레오티드는 FGFR2 유전자의 특정 변이 또는 돌연변이를 검출하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 세트를 포함한다. 프로브는 피험체의 표적 단백질 내 서열과 프로브 내 1 이상의 핵산 염기의 상보성에 기인하여 표적 영역 내 서열과 하이브리드 구조를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

예후 방법은 FGFR2 단백질의 활성 증가를 일으키는 돌연변이를 포함하는 FGFR2 단백질 내 돌연변이를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 돌연변이의 예에는 면역글로불린-유사(Ig) 도메인 II 및 III 사이의 접합부에 발생된 돌연변이; IgIII 도메인에 발생된 돌연변이; IgIII 도메인과 경막(TM) 도메인 간 접합부에 발생된 돌연변이; TM 도메인에 발생된 돌연변이; TM 도메인과 티로신 키나아제 도메인 I 간 접합부에 발생된 돌연변이; 티로신 키나아제 도메인 I에 발생된 돌연변이, 또는 티로신 키나아제 도메인 II에 발생된 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이는 아마도 아미노산 치환을 유도한다. 돌연변이에 의해 유도된 그러한 아미노산 치환의 예에는 위치 252의 S에서 W로의 돌연변이, 위치 253의 P에서 R로의 돌연변이, 위치 373의 S에서 C로의 돌연변이, 위치 376의 Y에서 C로의 돌연변이, 위치 383의 C에서 R로의 돌연변이, 위치 392의 M에서 R로의 돌연변이, 위치 396의 V에서 D로의 돌연변이, 위치 398의 L에서 M으로의 돌연변이, 위치 548의 I에서 V로의 돌연변이, 위치 550의 N에서 K로의 돌연변이, 위치 550의 N에서 H로의 돌연변이, 및 위치 660의 K에서 E로의 돌연변이를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 여기서 위치 번호는 서열번호 2에 표시된 바와 같다. 비제한적인 일 구체예에서, 돌연변이는 뉴클레오티드 서열(NM-02297.2)의 위치 2290-91에서의 뉴클레오티드 C 및 T의 결실 또는 IVS10+2A>C 스플라이싱 돌연변이 또는 자궁내막 종양 세포에서 발견되는 임의의 다른 체성 돌연변이로 이루어지며, 여기서 위치 번호는 서열번호 1에 표시된 바와 같다.

검출된 FGFR2 수용체 활성화 돌연변이는 예를 들면, 리간드 결합 향상, 감소된 선택성으로 변경 또는 불규칙적 리간드 친화성 촉진, 항상항 수용체 이량체화, 분해 지연, 세포막으로부터의 재순환 손상, 세포내 막으로부터의 부적절한 신호전달, 과발현, 또는 키나아제 활성화 등에 의해 수용체의 활성화를 증가시킬 수 있다.

일 구체예에서, 피험체에서 자궁내막암의 예후는 테스트 피험체의 자궁내막암 세포에서 FGFR2 단백질의 활성 수준을 측정하고 대조군 피험체의 자궁내막 세포에서의 활성화 비교하여 평가할 수 있으며, 여기서 대조군 피험체와 비교한 테스트 피험체에서의 FGFR2 단백질의 활성 증가는 자궁내막암의 재발 위험성이 높음을 의미한다. FGFR2 활성의 수준은 현재 공지되어 있거나 또는 개발될 임의의 방법을 통해 FGFR2 신호전달 경로에서의 활성 수준을 측정하여 평가할 수 있다. 예로는, FGFR2 신호전달시 상향 또는 하향 조절되는 표적의 발현 평가법, FGFR2 신호전달시 인산화 또는 탈인사화된 단백질의 인산화 상태 평가법, 또는 FGFR2 활성 또는 리간드 무차별성의 증가를 검출할 수 있는 임의의 다른 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

FGFR2 핵산 예컨대 FGFR2 DNA 또는 임의의 전사체의 돌연변이된 형태(현재 공지되거나 또는 개시될 임의의 스플라이싱 변이체 포함)와 FGFR2 또는 FGFR2 경로의 다른 선분의 탈제어된 발현(과발현 또는 저발현 포함)은 적절한 다양한 임의의 방법으로 검출될 수 있다.

현재 공지되었거나 또는 개시될 생물학적 샘플 중 돌연변이된 핵산을 검출할 수 있는 임의 방법을 적용할 수 있고 많은 유전자형 분석 전략이 현재 당분야의 숙련가에게 공지이다. 이들 방법 중 일부는 생물학적 샘플 내 FGFR2 핵산의 돌연변이를 검출하는데 핵산 서열 예컨대 특이적 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 특정 돌연변이를 함유하는 핵산 서열에, 또는 돌연변이 부위에 인접한 영역에 특이적으로 혼성화될 수 있다. 다른 방법은 FGFR2 핵산의 전체 또는 일부를 증폭할 수 있게 하는 프라이머를 사용한다. 다르게, 또는 이러한 기술을 조합하여, 본원에 기술되거나 또는 당분야의 숙련가에게 공지된 올리고뉴클레오티드 서열분석법을 FGFR2 돌연변이를 검출하는데 적용할 수 있다. 당분야의 숙련가는 용액 중 혼성화 프로브를 사용할 수 있고 일 구체예에서는 고체상 방법을 사용할 수도 있다. 이러한 방법에서, 테스트 핵산은 선별된 매트릭스 또는 표면 상에 흡착되거나 아니면 고정될 수 있다. 이어서 고정된, 단일가닥 핵산에 대해 선별된 프로브와의 특이적 혼성화를 실시한다. 다르게, 당분야의 숙련가는 증폭 방법, 예컨대 각각 표적 DNA 또는 mRNA를 특이적으로 증폭시키기 위한, PCR 또는 역-PCR("역전사중합효소 연쇄 반응")에서 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 이러한 프라이머는 FGFR2 엑손의 증폭을 허용하는 프라이머를 포함한다.

이러한 방법의 일례는 이하의 단계를 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다: DNA를 포함하는 생물학적 샘플을 FGFR2 유전자의 전체 또는 일부의 증폭을 허용하는 특이적 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 샘플에 포함된 DNA는 적절한 경우, 혼성화에 접근가능하게되고, 생물학적 샘플에 포함된 DNA와 프라이머의 혼성화가 가능한 조건 하인 단계; 상기 DNA를 증폭시키는 단계; 증폭산물의 검출 단계; 및 정상 대조 생물학적 샘플에서 얻어진 증폭 산물에 대해 얻어진 증폭 산물을 비교하여, 이상이 존재하면 FGFR2 유전자에서 그러한 이상이 검출되고 이상이 존재하지 않으면 이상이 검출되지 않는 단계.

다르게, 샘플은 증폭없이 직접 서열분석될 수 있다. 이러한 방법에서, 서열분석된 DNA를 정상의 게놈 대조 서열과 비교한다. 대조 서열은 다른 피험체로부터 얻거나 또는 동일 피험체 유래의 비암성 샘플에서 얻을 수 있다. 이러한 서열분석 방법 중 하나는 대립유전자 특이적 프라이머 연장법으로서 여기서는 칩에 혼성화된 샘플 DNA는 프라이머로서 고정된 올리고뉴클레오티드와 함께 합성 주형으로서 사용된다. 오직 부가되는 dNTP만 표지화된다. 표지화된 dNTP가 도입되면 돌연변이의 존재를 표시하는 신호로서 작용한다. 형광발광 표지는 DNA 칩 상의 4개 이상의 상이한 형광발광 표지를 판독하도록 구성된 임의의 여러 장치를 통해 검출될 수 있다. 다른 방법에서, 올리고뉴클레오티드에 부가된 최종 dNTP의 정체는 질량분광분석법으로 확인할 수 있다. 이러한 방법에서, dNTP는 기지 분자량의 표지로 표지될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.

FGFR2에서 이상을 검출하는 다른 방법은 FGFR2 유전자의 전사체에서 이상을 검출하는 것을 포함한다. 그러한 방법은 예컨대 RT-PCR 등의 기술을 통해 생물학적 샘플에서 mRNA 전사체를 증폭시키는 것을 포함한다. 이러한 방법의 일례는 이하를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: 생물학적 샘플에 포함된 mRNA로부터 cDNA를 생성하는 단계; 상기 cDNA와 프라이머가 혼성화할 수 있는 조건 하에서, 상기 cDNA를, FGFR2 유전자의 전사체의 전부 또는 일부를 증폭할 수 있는 특이적 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계; 증폭 산물을 검출하는 단계; 얻어진 증폭 산물을 정상의 대조 생물학적 샘플에서 얻은 증폭 산물과 비교하여, 이상이 존재하면 FGFR2 유전자의 전사체에서 그러한 이상을 검출하고 이상이 존재하지 않으면 이상이 검출되지 않는 단계. 대조군은 당분야의 숙련가에게 비암성이라고 알려진 임의의 비암성 자궁내막 조직 대조군 샘플일 수 있으며, 예를 들면 혈액, 구강 면봉채취물 또는 다른 공급원에서 얻은, 정상의 FGFR2 mRNA 또는 DNA 또는 정상의 인접한 자궁내막 샘플일 수 있다.

mRNA 분석에 사용되는 샘플은 생검 조직을 포함하여, 상기 기술된 바와 같이, 임의의 세포 공급원에서 얻을 수 있다. RNA는 당분야의 숙련가에게 공지된 표준 방법을 사용해 샘플로부터 단리할 수 있다. 예로는 구아니듐 티오시아네이트-페놀클로로포름 추출법(Chomocyznski et al, Anal. Biochem., 1987, 162:156), 수지, Trizol® 또는 다른 시약을 이용한 단리법, 또는 임의의 다른 적절한 방법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 단리된 RNA에 대해 cDNA 서열의 선택 영역에 특이적인 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용해, 중합효소 연쇄 반응과 커플링된 역전사 및 증폭법(RT-PCR)을 수행한다. 프라이머 어닐링 조건은 특이적 역전사 및 증폭이 보장되도록 선택되며; 따라서 증폭 산물의 출현이 특정 유전자 변이의 존재에 대한 진단이다. 다른 구체예에서, RNA를 역전사 및 증폭시킨다. 증폭된 서열(존재하면) 내 돌연변이는 직접 서열분석, 제한효소 단편 길이 다형성, 증폭 서열에 대한 특이적 프로브의 혼성화, 또는 플라스미드 클로닝 후 서열분석을 포함하는 많은 임의의 방법을 통해 검출할 수 있다. 돌연변이가 존재하지 않는다면, 검출되지 않을 것이다.

FGFR2의 돌연변이체 형태와 혼성화하는 핵산은 예후 분석에서의 프로브로서 사용될 수 있으며 그러한 프로브는 돌연변이체이거나 또는 다형성일 수 있는 FGFR2 유전자의 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 영역을 더욱 포함하는 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그러한 프로브를 사용하여, 있다면, 피험체에서 채취한 샘플에 FGFR2 유전자의 돌연변이가 존재하는지를 특이적으로 검출할 수 있다. 돌연변이체 또는 다형성 영역은 FGFR2 유전자의 프로모터, 엑손, 또는 인트론 서열에 존재할 수 있다. 대체로, 그러한 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있도록 충분하게 많은 뉴클레오티드를 갖는다. 적절한 특이성으로 돌연변이체 서열에 상보적인 프로브는 당분야의 숙련가가 구성할 수 있다. 예를 들면, FGFR2 유전자의 일부분을 먼저 염색체 DNA로부터 증폭시키고 단리하여 프로브와 혼성화시킬 수 있다. 이러한 경우, 10, 15, 20, 30, 50, 또는 100개 뉴클레오티드의 프로브가 사용될 수 있다.

프로브 또는 프라이머는 표지를 포함할 수 있다. 표지는 대립유전자를 포함하지 않는 세포를 특정 대립유전자를 포함하는 서열과 구분하는데 있어서 기계, 검출기, 센서, 장치, 또는 강화 또는 미강화된 인간 눈을 보조할 수 있는 임의 물질일 수 있다. 표지의 예에는 방사성동위원소 또는 그의 킬레이트, 염료(형광발광성 또는 비형광발광성) 착색, 효소, 비방사성 금속을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 예로는 플루오레세인, 비오틴, 디그옥시게진, 알칼리 포스파타아제, 비오틴, 스트렙타비딘, 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 방사선을 방출할 수 있는 임의의 다른 화합물, 로다민, 4-(4'-디메틸아미노-페닐아조)벤조산 ("Dabcyl"); 4-(4'-디메틸아미노-페닐아조)설폰산(설포닐클로라이드) ("Dabcyl"); 5-((2-아미노에틸)-아미노)-나프탈렌-1-설폰산 ("EDANS"); 솔라렌 유도체, 햅텐, 시아닌, 아크리딘, 형광발광성 로돌 유도체, 콜레스테롤 유도체; 에틸렌디아민테트라아세트산 ("EDTA") 및 이의 유도체 또는 대립유전자에 결합된 리간드의 존재를 신호화하는 임의의 다른 화합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예에서, 표지는 유전자형분석 사용하는데 최적화된 1 이상의 염료를 포함한다. 이러한 염료의 예에는 dR110, 5-FAM, 6FAM, dR6G, JOE, HEX, VIC, TET, dTAMRA, TAMRA, NED, dROX, PET 및 LIZ가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

다르게, 프로브는 보다 안정화되도록 변형될 수 있다. 안정화를 증가시키도록 프로브를 변형시키는데 사용할 수 있는 예시적인 핵산 분자는 포스포르아미데이트, 포스포티오에이트 및 DNA의 메틸포스포네이트 유사체를 포함한다(예를 들면, 미국 특허 제5,176,996호; 제5,264,564호; 및 제5,256,775호 참조).

FGFR2 핵산을 분석하는데 HPLC 또는 변성 HPLC(DHPLC) 방법을 사용할 수 있다. DHPLC는, HPLC 분석이 부분적 변성 온도에서 수행될 때, 호모듀플렉스가 동일한 염기쌍 길이를 갖는 헤테로듀플렉스로부터 분리될 수 있다는 것이 관찰되었을 때 개발되었다(Hayward-Lester, et al., Genome Research, 1995,5:494; Underhill, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93:193; Doris, et al., DHPLC Workshop, 1997, Stanford University). 따라서, DHPLC의 사용은 돌연변이 검출에 적용되었다(Underhill, et al., Genome Research, 1997, 7:996; Liu, et al., Nuc. Acids Res., 1998, 26; 1396). DHPLC는 겨우 1개 염기쌍 만큼 차이나는 헤테로듀플렉스를 분리시킬 수 있다. 미국 특허 제6,287,822호 또는 제6,024,878호에 기술된 바와 같은 "MIPC(Matched Ion Polynucleotide Chromatography)", 또는 "DMIPC(Denaturing Matched Ion Polynucleotide Chromatography)가 부가적인 분리 방법이다.

다르게, FGFR2 유전자에서 이상을 검출하는데 DGGE 방법(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), 또는 SSCP 방법(Single Strand Conformation Polymorphism)을 사용할 수 있다. DGGE는 다양한 농도의 변성제를 함유하는 겔을 통한 전기영동을 사용하여, 단일 염기쌍 변화 정도의 작은 서열 차이를 기초로 동일한 길이의 복수개 DNA 단편을 분해(resolving)하는 방법이다(Guldberg et al., Nuc. Acids Res. 1994,22:880). SSCP는 2종의 혼성화와 겔 전기영동에 의한 후속 미스매치 검출을 포함하는, 2개 DNA 간 서열 차이를 검출하는 방법이다(Ravnik-Glavac et al., Hum. MoI. Genet. 1994, 3:801). 2종의 혼성화와 화학 절단에 의한 후속 미스매치 검출을 포함하는, 2개 DNA간 서열 차이를 검출하는 방법인, "HOT 절단법(cleavage)"(Cotton, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85:4397)도 사용할 수 있다.

부가적으로, RT-PCR은 암호 부위의 활성화에 기인한 엑손 스킵핑 또는 이상 스플라이싱 등과 같은 스플라이싱 돌연변이의 결과를 가시화할 수 있게 한다.

고속 대량 스크리닝을 활용하는 마이크로어레이를 포함하는 마이크로어레이를 이용한 방법이 또한 유전자 이상을 검출하거나 또는 유전자 발현을 측정하는데 유리하게 실시될 수 있다. 유전자 발현은 FGFR2 유전자의 발현이거나 또는 FGFR2가 성분인 경로의 상향 또는 하향의 다른 유전자의 발현이거나 또는 그 발현이 FGFR2 발현과 관련있는 임의의 다른 유전자의 발현일 수 있다. 마이크로어레이는 동일한 올리고뉴클레오티드의 동일 세트가 어레이의 2 이상의 선택된 개별 영역에 부착되어서, 어레이의 상기 선택된 영역중 하나와 접촉된, 정상 샘플을, 상기 선택 영역의 다른 영역과 접촉된, 테스트 샘플과 용이하게 비교할 수 있도록 디자인될 수 있다. 이들 어레이는 정상 샘플과 테스트 샘플의 혼합을 피하도록 미세 유체관을 사용한다.

마이크로어레이 기술의 예에는 Nanogen, Inc(San Diego, Calif.)에서 개발한 것과 Affymetrix에서 개발한 것이 포함된다. 그러나, "유전자 칩" 또는 "DNA 칩"이라고도 불리는, 모든 유형의 마이크로어레이는 돌연변이의 확인을 위해 조정될 수 있다. 그러한 어레이는 당분야에 공지이다.

올리고뉴클레오티드가 부착되는 고체 지지체는 유리, 실리콘, 플라스틱(예를 들면, 폴리프로필렌, 나일론), 폴리아크릴아미드, 니트로셀룰로스, 또는 당분야에 공지되거나 또는 개시될 다른 물질로 제조될 수 있다. 표면에 핵산을 부착시키는 방법 중 하나는 [Schena et al., Science 1995, 270:467-470]에 기술된 바와 같이, 유리 플레이트 상에 프린팅하는 것에 의한다. 이러한 방법은 cDNA의 마이크로어레이를 제조하는데 특히 유용하다. 예를 들면, [DeRisi et al., Nature Genetics 1996, 14:457-460; Shalon et al., Genome Res. 1996, 6:639645; 및 Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995,93:10539-11286]를 참조할 수 있다.

예를 들면, 마스킹(Maskos and Southern, Nuc. Acids Res. 1992,20:1679-1684)에 의한 마이크로어레이 제조의 다른 방법이 사용될 수 있다. 대체로, 당분야의 숙련가가 인지하는 바와 같이, 임의 유형의 어레이, 예를 들면 나이론 혼성화막 상의 도트 블랏(Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989)이 사용될 수 있다. 이들 어레이의 경우, 핵산 혼성화 및 세정 조건은 부착된 올리고뉴클레오티드가 테스트 샘플 서열에 존재하는 FGFR2 유전자의 적어도 일부분에 특이적으로 혼성화하지만 비상보성 핵산 서열 부위와는 혼성화하지 않도록 선택된다. 용어 "혼성화하다" 및 "결합하다"는 상호교환적으로 사용된다.

다르게, 돌연변이체를 검출하는데 대립유전자 특이적 혼성화를 사용할 수 있다. 대립유전자-특이적 혼성화에서, 다형성 부위에 모든 가능한 변이를 나타내는 올리고뉴클레오티드 서열을 DNA 침 상에 포함시킨다. 이러한 칩과 샘플에 대해 표지된 샘플 DNA가 정확한 서열 매치의 올리고뉴클레오티드에만 결합하게 되는 조건을 적용시킨다. 대립유전자-특이적 프라이머 연장법에서, 칩에 혼성화된 동일 DNA를 프라이머로서 고정된 올리고뉴클레오티드와 합성 주형으로서 사용할 수 있다. 이러한 방법에서, 오직 부가된 dNTP만 표지화된다. 표지화된 dNTP의 도입이 대립유전자의 존재를 표시하는 신호로서 작용한다. 형광발광 표지는 DNA 칩 상의 4 이상의 상이한 형광발광 표지를 판독하도록 구성된 임의의 많은 장치를 통해 검출될 수 있다. 다른 대체예에서, 올리고뉴클레오티드에 부가된 최종 dNTP의 정체는 질량 분광분석으로 측정한다. 이러한 대안법에서, dNTP는 기지 분자량의 표지로 표지될 수 있지만, 반드시 그러한 것은 아니다.

보다 짧은 폴리뉴클레오티드가 25 염기 이하인 경우, 표준 염기쌍 규칙을 사용해 미스매치가 존재하지 않거나, 또는 보다 짧은 폴리뉴클레오티드가 25 염기보다 긴 경우, 미스매치가 5%를 넘지 않을 때 한 폴리뉴클레오티드 서열은 다른 것과 상보성인 것으로 간주된다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 완벽하게 상보성이다(미스매치가 없음). 특이적 혼성화 조건은 음성 대조군을 포함하는 혼성화 분석을 수행하는 것에 의해 특이적 혼성화를 일으킨다는 것은 쉽게 증명될 수 있다(Shalon et al, supra, 및 Chee et al, Science 1996,274:610-614).

다양한 방법이 혼성화 이벤트의 검출 및 분석에 이용될 수 있다. 사용되는 표지에 따라서, 검출 및 분석은 예를 들면, 형광측정법, 비색측정법 또는 자기방사법에 의해 수행될 수 있다. 방출되는 방사선, 예컨대 형광발광 방사선 또는 입자 방출을 관찰하고 측정함으로써, 혼성화 이벤트에 대한 정보를 얻을 수 있다. 형광발광 표지화 프로브를 사용하는 경우, 전사체 어레이의 각 부위에서 형광발광 방출은 예를 들면, 주사 공초점 레이저 현미경으로 검출할 수 있다. 주사 공초점 레이저 현미경에서, 적절한 여기선을 이용하는 개별 주사를 프로브를 표지화하는데 사용된 2 이상의 형광단 각각에 대해 수행한다. 다르게, 2개 형광단에 특이적인 파장에서 동시적인 표본 조사 및 2개 형광단으로부터의 발광을 가능하게 하는 레이저를 사용할 수 있다(Shalon et al. Genome Res. 1996, 6:639-695).

또한 FGFR2 단백질에서의 돌연변이 검출, 또는 FGFR2 단백질의 이상조절 발현을 평가할 수 있다. FGFR2는 면역분석법으로 검출할 수 있다. 예를 들면, 웨스턴 블랏팅은 특정 변이체의 검출, 또는 FGFR2 발현 존재 유무를 검출할 수 있게 한다. 구체적으로, 면역분석은 FGFR2 단백질 중 특정 아미노산 서열을 검출할 수 있게 한다. 면역분석의 다른 예에는 ELISA가 포함된다. ELISA 분석에서, 전체 FGFR2, 또는 FGFR2의 단편, 또는 FGFR2의 임의 돌연변이체 형태에 대한 항체를 단백질이 비특이적으로 결합할 수 있는 고체 표면 상에 고정시킨다. 그러한 표면의 예에는 폴리스티렌이 있다. 다르게, 정제된 FGFR2 또는 FGFR2 돌연변이체, 또는 이의 임의 단편을 고체 표면에 직접 고정시킨다. 불완전하게 흡착된 폴리펩티드를 제거하기 위한 세정이 후, 블로킹 단백질 예컨대 소혈청 알부민(BSA) 용액 또는 전체 혈청을 선택된 표면에 부가할 수 있다. 이는 고정된 표면 상에서의 비특이적 흡착 부위를 블로킹시킬 수 있어서, 표면 상에 항체의 비특이적 결합에 의해 야기된 백그라운드를 감소시킨다. 고정된 항체를 갖는 표면을 이어 샘플과 접촉시키고 면역 복합체(항원/항체) 형성을 촉진하는 조건하에서 항온반응시킨다. 이러한 조건의 예에는 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 및/또는 인산염 완충 염수-세제 예컨대 PBS/Tween의 1 이상의 희석제 용액으로 샘플을 희석하고 샘플을 30분 내지 72시간 동안 4~37℃의 온도에서 항온반응시키는 것을 포함한다.

항온반응 후, 표면은 비면역복합체화 물질을 제거하기 위해 세정된다. 세정 과정은 예컨대 PBS/Tween 또는 보레이트 완충액 등의 용액을 사용한 세정을 포함할 수 있다. 테스트 샘플과 결합된 항체 간 특이적 면역복합체 형성과, 후속 세정 이후, 면역복합체 형성물의 존재, 및 그 양은 단백질 상의 돌연변이된 에피토프를 인식하는, FGFR2 돌연변이체에 대한 제2 항체와의 면역복합체화를 수행하여 확인될 수 있다. 대체로, 제2 항체는 예를 들면 적절한 발색성 기질과의 항온반응시 발색을 일으키는 효소 활성 등과 같은 연관된 활성을 가질 수 있다. 다르게, 제2 항체는 소형 분자 예컨대 비오틴 및 소형 분자에 대한 리간드와 연결된 효소 활성, 예컨대 스트렙타비딘으로 표지될 수 있다.

샘플 내 FGFR2의 정량화는 이후 예를 들면 가시분광광도법을 사용하여 발생도를 측정하여 수행할 수 있다. 제2 항체가 접합되는 효소의 예에는 퍼옥시다아제 및 알칼리 포스파타아제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 기질의 예에는 퍼옥시다아제 기질 예컨대 테트라메틸벤지딘 또는 특정 효소 존재에 반응하여 용액의 색상 또는 다른 특성을 변화시키는 임의의 다른 기질이 포함된다. 테스트 단백질의 농도는 표준 곡선과의 비교를 통해 결정될 수 있다. 이러한 프로토콜은 [Current Protocols in Molecular Biology, V. 2 Ch. 11 and Antibodies, a Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) pp 579-593]에 상세히 기술되어 있다.

FGFR2 단백질의 돌연변이체 형태를 검출하는데 사용될 수 있는 면역분석법의 다른 예에는 방사성면역측정법, 샌드위치 면역분석법, 방사면역측정법, 겔확산 침강소 반응법, 면역확산 분산법, 인 시츄 면역분석법 또는 면역조직화학 분석법(IHC), 침전 반응법, 응집 분석법, 보체 고정 분석법, 면역형광발광 분석법, 단백질 A 분석법, 면역전기영동 분석법, 유세포측정 기반 분석법 또는 돌연변이체 FGFR2를 검출하기 위해 특이적 항체를 이용하는 공지되거나 또는 개발될 임의의 다른 방법들이 포함된다.

FGFR2의 돌연변이체 형태 존재를 검출하는 면역분석법에 사용되는 항체는 이하 기술된 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 다수 방법으로 생성시킬 수 있다. 그러한 항체는 다클론, 단일클론, 키메라, 단쇄, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리, 및 예를 들면 인간화 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

당분야에 공지된 다양한 방법을 이용해 FGFR2 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 유사체에 대한 다클론 또는 단일클론 항체를 생성시킬 수 있다. 항체 생성을 위해, 다양한 숙주 동물을 항원성 폴리펩티드를 주사하여 면역화시킬 수 있는데, 예를 들면 토끼, 마우스, 래트, 양, 염소, 닭 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. FGFR2 폴리펩티드에 대한 단일클론 항체의 생성을 위해, 배양되는 연속 세포주에 의한 항체 분자 생성을 제공하는 임의 방법을 사용할 수 있다.

이들에는 [Kohler and Milstein(Nature 256:495497, 1975)]가 처음 개발한 하이브리도마 방법과, 트리오마 방법, 인간 B-세포 하이브리도마 방법(Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983; Cote et at, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030, 1983), 및 인간 단일클론 항체 셍성을 위한 EBV-하이브리도마 방법(Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 추가 구체예에서, 단일클론 항체는 무균 동물에서 생성될 수 있다(1989년 12월 28일 공개된, 국제 공개 특허 출원 WO 89/12690).

단쇄 항체의 생성에 대해 기술된 방법(미국 특허 제5,476,786호 및 제5,132,405호(Huston 저); 미국 특허 제4,946,778호)는 FGFR2 폴리펩티드-특이적 단쇄 항체 생성을 위해 조정될 수 있다. 다르게, Fab 발현 라이브러리의 제작에 대해 기술된 방법(Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989)을 사용하여 FGFR2 폴리펩티드, 또는 이의 유도체 또는 유사체에 대해 특이성을 갖는 단일클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 동정이 가능할 수 있다.

항체 분자의 이디오타입을 포함하는 항체 단편은 공지 방법으로 생성될 수 있다. 예를 들면, 그러한 단편은 항체 분자의 펩신 분해로 생성될 수 있는 F(ab')₂ 단편; F(ab')₂ 단편의 이황화결합을 환원시켜 생성될 수 있는 Fab' 단편, 및 파파인 및 환원제로 항체 분자를 처리하여 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

항체 생성에서, 목적 항체에 대한 스크리닝은 공지 방법, 예컨대 방사면역측정법, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay), "샌드위치" 면역분석법, 방사면역측정법, 겔 확산 침강소 반응법, 면역확산 분석법, 인시츄 면역분석법(예를 들면, 콜로이드성 금, 효소 또는 방사성동위원소 표지 등을 사용), 웨스턴 블랏, 침전 반응법, 응집 분석법(예를 들면, 겔 응집 분석법, 헤마글루틴화 분석법), 보체 고정 분석법, 면역형광발광 분석법, 단백질 A 분석법, 및 면역전기영동 분석법 등에 의해 수행될 수 있다.

임의의 생화학 분석법을 사용해 FGFR2 단백질의 발현, 또는 축적을 검출할 수 있는데, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 분석된 샘플 밴드의 존재 여부 검출에 의해; 역상, 이온 교환, 및 겔 투과를 포함한 고성능 액체 크로마토그래피의 다양한 임의 방법으로 분석된 샘플에서 크로마토그래피 피크의 존재 여부 검출에 의해; 분석용 모세관 전기영동 크로마토그래피에서 FGFR2의 존재 여부 검출에 의해, 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 정량 또는 정성 생화학 방법에 의해 검출될 수 있다.

돌연변이체 FGFR2의 존재 또는 부재를 사용하여 특정 생리학적 특성의 존재 또는 부재를 예측할 수 있다. 세포 또는 생리학적 특성의 예측은 마커의 발현을 평가하는 것에 의해 예측할 수 있는 임의의 세포 또는 생리학적 상태의 예측을 포함한다. 그 예에는 특정 정상 또는 암 세포 유형을 포함하는 특정 세포로서 세포의 정체, 1 이상의 질환이 존재하거나 또는 존재하지 않을 가능성, 존재하는 질환이 진행하거나, 변화없이 유지되거나, 또는 퇴화될 가능성, 질환이 특정 요법에 반응하거나 또는 반응하지 않을 가능성, 또는 임의의 다른 질환 결과가 포함된다. 추가 예에는 세포가, 임의의 상태에서 다른 상태로 이동, 성장, 아폽토시스, 분화, 전이, 또는 변화되거나 또는 그 현행 상태를 유지할 가능성이 포함된다.

한 유형의 세포 또는 생리학적 특징은 특정 질환 결과가 발생할 위험성이다. 이러한 위험성 평가는 개체가 특정 질환, 질병, 증상, 증후군, 또는 건강이나 신체 상태와 관련된 임의 병태를 현재 갖고 있거나, 또는 발생될 높거나 낮은 가능성과 상관되는 임의 유형의 테스트, 분석, 조사, 결과, 판독, 또는 해석의 수행을 포함한다. 질환 결과이 예에는, 생존, 사망, 현행 질환의 진행, 현행 질환의 차도, 달리 질환이 없는 환자에서 질환 발병의 개치, 또는 질환 차도가있었던 피험체에서 질환의 지속적 상실을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 질환 위험성의 평가는 피험체에게 영향을 미치는 질환 유형을 결정하는 진단을 포함한다. 질환 결과의 위험성 평가는 또한 예후 개념을 포함한다. 예후는 특정 질환이 진단된 개체에서 질환 결과의 위험성에 대한 임의 평가일 수 있다. 위험성 평가는 그러한 평가를 기초로 치료 계획이 선택된 요법에 대한 반응의 예측을 더 포함한다. 위험성 평가는 또한 진단 후 전체 생존성 예측을 포함한다.

FGFR2 돌연변이의 존재 또는 부재가 생리학적 또는 세포 특징을 의미하는지 여부에 대한 결정은 임의의 다수 방법으로 평가될 수 있다. 질환 결과 또는 치료 효과를 평가하는데 있어서, 모두가 질환 예컨대 암을 갖는, 환자 개체군을 일정 기간 동안 주시할 수 있다. 일정 기간이 만기된 후, 개체군을 2 이상의 그룹으로 분류할 수 있다. 예를 들면, 개체군은 그 질환이 특정 종료점까지 진행된 제1 환자 그룹 및 질환이 특정 종료점까지 진행되지 않은 제2 환자 그룹으로 분류될 수 있다. 종료점의 예에는 질환 재발, 사망, 전이 또는 질환이 진행될 수 있는 다른 상태가 포함된다. 샘플 내 FGFR2 돌연변이의 존재 또는 부재가 다른 그룹에 비해 한 그룹에서 마커의 사전결정된 발현과 보다 유사한 경우, 그 샘플은 보다 유사한 환자 그룹과 동일한 결과를 갖는 위험성으로 지정될 수 있다.

예를 들면, "ROC(Receiver Operating Characteristic)" 곡선은 2 개체군에서 그 상대 빈도에 대해 변수의 값을 플롯팅하여 산출될 수 있다. 임의의 특정 마커의 경우, 질환을 갖는 피험체 및 갖지 않는 피험체에 대한 마커 발현 수준 분포가 중복될 수 있다. 이는 테스트가 완전한 정확도를 가지고 2 개체군을 절대적으로 구별하지 못함을 의미한다. 중복 면적은 테스트가 2 그룹을 구별할 수 없는 것을 의미한다. 한계치를 선택한다. 한계치 위에서 샘플 내 마커의 발현은 샘플이 한 그룹과 유사함을 의미하고 한계치보다 낮은 마커의 발현은 샘플이 다른 그룹과 유사함을 의미한다. ROC 곡선 하 면적은 발현이 정확하게 적절한 그룹에 대한 샘플의 유사도를 나타낸 확률 측정치이다. 예를 들어, [Hanley et al, Radiology 143: 29-36 (1982)]를 참조하며, 참조하여 본원에 포함시킨다.

다른 방법을 사용하여 어떻게 정확하게 FGFR2 돌연변이의 존재 또는 부재가 특정 생리학적 또는 세포 특징을 나타내는지를 평가할 수 있다. 이러한 방법에는 양성 공산비(likelihood ratio), 음성 공산비, 오즈비(odds ratio), 및/또는 위험비(hazard ratio)가 포함된다. 공산비의 경우, 마커의 발현이 특정 세포 또는 생리학적 특징을 갖는 샘플에서 발견될 공산을 마커의 발현이 특정 세포 또는 생리학적 특징이 없는 샘플에서 발견될 공산과 비교한다. 오즈비는 효과 크기를 측정하고 2 그룹 간 비독립성 또는 연관성의 양을 의미한다. 오즈비는 다른 세트의 샘플에서 마커가 발현될 오즈 대비 한 세트의 샘플에서 마커가 발현될 오즈의 비율이다. 오즈비 1은 이벤트 또는 조건이 2 그룹에서 균등하게 일어날 수 있음을 의미한다. 오즈비가 1보다 크거나 또는 작다는 것은 마커의 발현이 오즈비 산출을 어떻게 설정하였는지에 따라 한 그룹이나 또는 다른 그룹에서 더 일어날 수 있음을 의미한다. 위험비는 상대적 위험의 추정에 의해 산출될 수 있다. 상대적 위험은 특정 이벤트가 일어날 수 있는 가능성이다. 예컨대 질환의 발병 또는 진행 등과 같은 이벤트가 마커 발현 수준의 한계치를 넘지 않는 샘플에서 일어날 확률에 대한, 상기 이벤트가 마커 발현 수준의 한계치를 넘는 샘플에서 일어날 확률의 비이다. 다르게, 위험비는 단위 시간당 이벤트 수의 제한치를 시간 간격이 감소함에 따른 위험 수로 나누어 계산할 수 있다. 위험비의 경우, 1의 값은 상대적 위험이 제1 그룹과 제2 그룹 둘 모두에서 동일함을 의미하고; 값이 1보다 크거나 또는 작다는 것은 위험이 산출시의 입력값에 딸, 한 그룹 또는 다른 그룹에서 더 큼을 의미한다.

부가적으로, 발현의 복수 한계치 수준을 결정할 수 있다. 이는 소위 "삼분위수" "사분위수" 또는 "5분위수" 분석이라고 한다. 이들 방법에서, 복수 그룹이 함께 단일 개체군으로서 간주되고, 동일수의 개체를 갖는 3 이상의 빈(bin)으로 나누어진다. 이들 "빈" 중 2간의 경계는 생리학적 또는 세포 상태를 의미하거나 또는 질환 발병 위험성의 특정 수준을 의미하는 발현 수준의 한계치로 간주될 수 있다. 위험성은 테스트 피험체가 속하게 되는 "빈"을 기반으로 지정될 수 있다.

본 발명은 자궁내막암을 진단하거나 또는 분류하기 위해 피험체의 FGFR2 유전자 내 서열을 결정하기 위한 키트를 더욱 제공한다. 키트는 분석의 수행을 촉진하는 성분의 임의 조합을 포함한다. 돌연변이체 FGFR2의 검출을 촉진하는 키트는 적절한 핵산-기반 및 면역학적 시약과 적절한 완충제, 대조군 시약, 및 인쇄된 프로토콜을 포함할 수 있다.

핵산 기반 방법을 촉진하는 키트는 특이적 핵산 프로브 또는 프라이머 예컨대 서열분석 프라이머, 표지화 시약, 및 혼성화 촉진 시약 중 1 이상을 더 포함할 수 있다.

돌연변이체 FGFR2 단백질을 검출하는 항체 기반 방법을 용이하게 하는 키트는 FGFR2 돌연변이체에 대한 특이성이 있는 표지화 또는 미표지화 항체, 표지화된 제2 항체, 및 효소 기질 중 1 이상을 더 포함할 수 있다.

키트는 또한 특정 생리학적 또는 세포 특징을 표시하는 결과의 지시서(indication)를 포함한다. 지시서는 지시서가 제공된 키트를 사용하여, 키트가 검출하도록 구성된, 임의의 생리학적 또는 세포 상태의 존재 또는 부재를 신호화하는 임의 결과를 포함한다. 지시서는 수치적으로, 핵산 또는 단백질 서열로 표현되거나 또는 색상으로 표현되거나, 표준 곡선에서 유도되거나 또는 대조군과 비교된, 밴드의 강도로서 표현될 수 있다. 지시서는 키트에 포함될 수 있는 기록물 상에 인쇄되거나 또는 인터넷 상에 포스팅되거나 또는 소프트웨어 팩키지에 삽입될 수 있다.

실시예

워싱턴 유니버시티의 의학 대학에서 수집된 476개의 냉동 자궁내막양 자궁내막 종양을 직접 서열분석을 통해 FGFR2의 돌연변이를 조사하였다. 전체 및 무진행 생존을 포함하여, 임상병리적 변수와 FGFR2 돌연변이 간 관련성을 Kaplan-Meier 생존분석법 및 Cox 프로포셔널 해저드 모델을 사용해 평가하였다.

FGFR2 돌연변이가 사례들 중 49/476(10%)에서 검출되었다. FGFR2 돌연변이는 FIGO 등급 3 종양에서 보다 FIGO 등급 1 및 2 종양에서 보다 일반적이었고(p<0.03), 미소부수체 불안정성과 관련있었다(P=O.01). FGFR2의 돌연변이는 진단 시 연령, 종양 병기, 또는 전체 생존성 또는 무진행성 생존과 유의하게 관련있지 않았다. 그러나, 초기 병기 여성에서, 중간 위험 질환(314 사례) 단일변량 분석은 FGFR2 돌연변이가 낮은 무진행성 생존(위험비[HR] = 2.51; 95% CI, 1.10~5.77; p=0.03) 및 낮은 전체 생존(HR 2.00; 95% CI 1.08~3.68; p=0.03;)과 관련됨이 확인되었다. 또한 다중변량 분석은 FGFR2 돌연변이가 중간 재발 위험성을 갖는 여성 코호트에서 독립적인 예후값(HR 3.04; 95% CI, 1.26~7.35; p=0.03)을 가짐을 보여주었다.

FGFR2 돌연변이는 초기 병기, 중간 위험성 자궁내막 종양을 앓는 환자에서 보다 좋지 않은 예후와 연관되어 있다.

1991년 이래, 워싱턴 유니버시티 의과대학 부인과 종양학 부서(St Louis, MO)에서는 자궁암으로 의심되는 자궁절제술을 받은 환자 유래의 종양 샘플을 미래를 위해 수집하였다. 모든 사례에 대해, 워싱턴 유니버시티 의과 대학/바네스-쥬이시 병원의 부인과 종양학자가 수술을 실시하였다. 외과적 병기 및 종양 등급은 숙련된 부인과 병리학자에 의한 FIGO(International Federation of Gynecology and Obstetrics) 1988 기준을 기초로 지정하였다. 이들 환자 중 그 누구도 수술전 방사선 또는 화학요법을 받지 않았다. 모든 참가자는 분자 분석 및 후속 모니터링에 동의하였다. 모든 수집된 임상 및 병리적 정보는 컴퓨터 데이타베이스에 저장하였다. 그들의 초기 치료 이후, 이들 환자는 대체로 처음 2년간 3개월 간격으로 추적한 후, 이어 2년 이상 동안 6개월 간격으로, 그 이후에는 매년 추적하였다. 질환 감시에는 신체 검사 및 주기적 질세포검사가 포함된다. 진단 영상법 및 조존 생검을 임상적으로 지시된 대로 수행하였다. 모든 재발의 조직학적 확인이 적절한 경우에 수행되었다. 추적 데이타를 임상 차트, 병원 기록, 및 바네스-쥬이시 병원/사이트만 암센터 종양 레지스트리 감시 데이타베이스에서 추출하였다.

이 코호트 내에 생존 분석에 유용한 정보를 제공하는 자궁내막양 자궁내막암을 앓는 476명의 환자가 존재한다. 이 그룹 중에서, 314 사례가 초기 병기, 중간 위험성으로서 분류되었다. 이러한 실험 목적을 위해, 중간 위험성은 병기 1(G3), 병기 IB, IC, IIA, IIB(G1-G3).

조직 표본 및 혈액은 수술시에 얻어서, 스냅 냉동시키고, -70℃에 보관하였다. 종양은 DNA 준비를 위해 > 66% 신생물 세포질을 갖는 조직을 선택하기 위해 평가하였다. DNA는 프로테이나아제 K 및 페놀 추출 또는 시판되는 키트를 사용해 단리하였다. DNA를 이전에 기술된 대로 말초 혈액 백혈구로부터 추출하였다. 혈액을 입수할 수 없을 경우, 정상 DNA를 미관여 자궁근층에서 추출하였다(참조문헌 10 및 11 참조).

FGFR2의 엑손 7, 8, 10, 13 및 15(도 1 참조)를 직접 DNA 서열분석을 통해 돌연변이에 대해 테스트하였다. 사용된 M13 테일링된 PCR 프라이머 및 조건은 필수적으로 이전에 기술된 바와 같다(참조문헌 8 참조). 서열은 Sequencher(Gene Codes)를 사용해 분석하였다. 모든 가능한 돌연변이는 대상 엑손의 반복적인 증폭 및 서열분석으로 확인하였다. 매치되는 정상 DNA를 분석하여 체성으로 발생된 돌연변이를 확인하였다.

FGFR2 돌연변이 상태와 공변량간 관계를 필요하다면 피셔 정확 검정법 또는 스튜던트 t-검정법을 사용해 수행하였다. 전체 생존율(OS)은 수술일로부터 임의 원인에 기인한 사망까지의 시간에 따라 정의하였다. 생존자는 마지막 접촉일에 검열하였다. 무질환 생존(DFS)은 수술로부터 재발이나 또는 진행까지의 시간으로서 정의하였다. Kaplan-Meier 생성 한계 방법을 사용해 OS 및 DFS를 추정하였다.

단일변량 및 다중변량 Cox 비례 위험 모델을 OS 및 DFS에 대한 공변량의 영향을 평가하는데 적합화시켰고, 비례 위험 추정은 스케일링된 쇤펠트 잔차를 이용해 체크하였다(참조문헌 12 참조). DFS의 분석시, Gray 경쟁 위험 방법이 또한 가능한 경쟁 사망 효과를 계산하는데 사용되었다(참조문헌 13 참조). 모든 분석은 양측으로 하였고 유의성은 0.05의 P-값으로 설정하였다. 통계 분석은 SAS(SAS Institutes, Cary, NC)와, 경쟁 위험 분석용 cmprsk R(http://biowww.dfci.harvard.edu/~gray) 통계 패키지를 사용해 수행하였다.

생존 분석에 유용한 정보를 제공하는 총 476의 수술적으로 병기확인된 자궁내막양 자궁내막암을 FGFR2 돌연변이에 대해 평가하였다(표 1). 진단시 평균 연령은 63.6세였고 평균 추적 시간은 68개월(0.7-176)이었다. 대부분의 환자가 초기 병기 질환으로 나타났다((394명 또는 83% 병기 I 또는 II). 이들 중, 314명은 병기 및 등급(IA G3; IB, IC, IIA, IIB, Gl-G3)를 기초로 중간 위험성을 갖는 것으로 간주되었다. 이 그룹은 진단 시 평균 연령이 64.7세였고, 모든 환자가 수술 후 > 2년이었고 평균 추적 시간이 72개월(0.7-176)이었다.

종합적으로, 본 발명자들은 이들 사례 중 116 사례에서 원래 보고된 것들(참조문헌 8 참조)을 포함하여, 자궁내막양 조직학(표 2)을 통해 49/476(10.3%) 자궁내막 종양에서 돌연변이를 동정하였다. 돌연변이로서 원래 보고된 한 FGFR2 서열 변경(프레임시프트)는, 서열 변화가 병원성인지 여부에 대한 불확실성때문에 배제시켰다. 가장 일반적인 돌연변이는 S252W(n=18; 37%) 및 N550K (n=12, 25%)였다. 모두 함께, 6개 코돈에 영향을 미치는 7 돌연변이(S252W, P253R, Y376C, C383R, N550K, N550H 및 K660E)가 동정된 돌연변이의 90%를 차지하였다. 본 발명자들은 이전에 보고되지 않은 경막 도메인 내 2개의 추가 신규 돌연변이(V396D 및 L398M)를 동정하였다.

진단시 연령 또는 병기(병기I, 9%, 병기 II, 18%, 병기 III/IV, 10%) 및 FGFR2 돌연변이 사이에 연관성은 없었다. FGFR2 돌연변이는 아프리카계 미국인 환자(2/56, 3%)에 비해 백인/아시아인 사례(45/420, 11%)에서 보다 일반적이었지만 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(p= 0.10). 그러나, FGFR2 돌연변이는 등급(grade)과 유의하게 연관있었다. 돌연변이는 저분화(등급 3) 종양(2/69; 3%)에 비하여 고(FIGO 등급 1) 및 중간 분화(등급 2) 종양(29/250 및 18/156; 11.5%)에서 보다 일반적이었다(p< 0.03). FGFR2 돌연변이는 결합성 DNA 미스매치 복구와 강력하게 연관있었다(종양 MSI). 159 MSI-양성 사례중 25가 FGFR2 돌연변이(15.7%)를 가진 반면, 316 MSI-안정 사례 중 24(7.6%)이 돌연변이를 가졌다(P=O.01).

전체 코호트에서, 단일변량 분석은 보다 짧은 무진행 생존(PFS)을 보였고 전체 생존(OS)은 후기 병기(III/IV)(p<0.0001) 및 저분화 종양-FIGO 등급 3(p<0.0001)과 연관되었다. FGFR2 돌연변이는 전체 또는 무진행 생존과 유의하게 연관되지 않았다(p<0.29). 다변량 분석은 연령, 병기 및 등급이 낮은 PFS 및 OS와 유의하게 연관됨을 보여주었다(표 3).

FGFR2 돌연변이는 우리 코호트의 66%를 포함하는 314 병기 IA(G3), IB, IC 또는 II 사례, 소위 중간 위험성 종양을 갖는 환자에서의 결과와 연관있었다. FGFR2 돌연변이는 이들 중간 위험성 사례 중 33/314(10.5%)에서 검출되었다. FGFR2 돌연변이는 재발되지 않은 환자(26/279; 9.3%) 대비 재발 환자(7/35; 20%)에서 보다 일반적이었다. 단일변량 분석은 FGFR2가 낮은 무진행 생존(HR=2.51; 95% CI 1.10-5.77; P=O.03) 및 낮은 전체 생존(HR=2.00; 95% CI 1.08-3.68; P=0.03)과 유의하게 연관됨을 보여주었다. FGFR2 돌연변이 상태에 따른 PFS 및 OS에 대한 Kaplan Meier 생존 그래프를 도 2에 나타내었다. 문헌과 일관되게, 저분화 조직구조는 낮은 PFS(p<0.0042) 및 OS(P<0.0002)와 연관되었다(참조문헌 1, 18 참조). 연령(p<0.06; p<0.06), 인종(p<0.26; p<0.11) 및 병기 II(p<0.16; p<0.06)를 포함하는, 몇몇 다른 임상병리적 변수는 각각 PFS 및 OS와 약한 연관성을 보였다.

다변량 분석은 중간 재발 위험성을 갖는 314명 환자 코호트에서 연령, 병기, 등급 및 인종(HR=3.04, C.I. 1.26-7.35)의 현존 임상병리적 특징에 의해 제공되는 것에 대한 독립적인 예후 값을 FGFR2가 입증함을 보여주었다

샘플 설명
	484 자궁내막양 자궁내막암의 전체 코호트(Wash U)	314 중간 위험성 자궁내막양 자궁내막암의 코호트(Wash U)
Dx 시 평균 연령( SD )	63.4(11.7)	64.7(11.2)
추적 시간(평균)	68개월(0.7-176)	72개월(0.7-176)
인종 백인/아시아 아프리카계 미국인	420(88%) 56(12%)	277(88%) 37(12%)
FIGO 병기
등급 1 2 3
재발 없음 있음
생존 상태 생존 사망
MSI 없음 있음

FGFR2 돌연변이를 갖는 자궁내막 종양의 임상병리학적 특징
사례 ID	병기	등급	재발	FGFR2b 뉴클레오티드^a	FGFR2

^a NM_022970.2에 대한 넘버링, ^b NP_075259.2에 대한 넘버링, ^c 이들 돌연변이는 이전에 보고됨(참조문헌 8 참조)

다변량 분석
	전체 중간 위험성 코호트 (n=315)
	무진행 생존	전체 생존
연령 FIGO 병기 II FIGO 등급 2 FIGO 등급 3 인종(흑인) FGFR2

FIGO 염색 분류 및 재발 위험성
병기	등급 1	등급 2	등급 3
IA - 종양이 자궁내막에 국한	저 위험	저 위험	고-중간 위험
IB - 1/2미만 자궁근층으로 침습	저-중간 위험	저-중간 위험	고-중간 위험
IC - 1/2초과 자궁근층으로 침습	저-중간 위험	저-중간 위험	고-중간 위험
IIA - 오직 자궁경관내 선 관여	저-중간 위험	저-중간 위험	고-중간 위험
IIB - 자궁경관 기질 침습	고-중간 위험	고-중간 위험	고-중간 위험
IIIA - 종양이 장막 및/또는 자궁부속기 및/또는 양성 복막 세포로 침습	고 위험	고 위험	고 위험
IIB - 골반 및/또는 주변대동맥 림프절로 전이	고 위험	고 위험	고 위험
IVA - 방광 및/또는 장 점막의 종양 침습	고 위험	고 위험	고 위험
IVB - 복부내 및/또는 서혜부 림프절 포함 원격 전이	고 위험	고 위험	고 위험

[서열]

서열번호 1:

서열번호 2:

[참조문헌]

본원에서 발명자들은 이하 문헌들 모두를 허용되는 최대한도로 본 명세서에 참조하여 포함시킨다:

Claims

피험체를 코호트로 분류하는 방법으로서,
피험체로부터 샘플을 얻는 단계; 및
샘플에 대해 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군에서 선택된 서열의 돌연변이체를 검출할 수 있는 조건을 적용하는 단계
를 포함하고, 여기서 피험체는 자궁내막암을 갖는 것이 알려져 있고, 코호트는 자궁내막암의 재발 위험성이 높은 2 이상의 개체를 포함하는 것인 분류 방법.
제1항에 있어서, 돌연변이체는 S252W, P253R, S373C, Y376C, C383R, G385R, I548V, N550K, N550H, K660E, M392R, V396D, L398M, 및 IVS 10+2A>C로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 변화를 일으키는 돌연변이를 포함하는 것인 분류 방법.
제2항에 있어서, 자궁내막 암은 자궁내막양 아형인 분류 방법.
제3항에 있어서, 샘플의 병기는 병기 IA, 병기 IB, 병기 IC, 병기 IIA, 병기 IIB로 이루어진 군에서 선택되는 것인 분류 방법.
제3항에 있어서, 샘플의 등급은 등급 1 및 등급 2 및 등급 3으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 분류 방법.
제1항에 있어서, 조건은 서열번호 1의 돌연변이체의 검출을 포함하는 것인 분류 방법.
제6항에 있어서, 조건은 핵산 서열분석, 마이크로어레이 분석, PCR 증폭, 대립유전자 특이적 PCR 증폭, 제한효소 단편 길이 다형성, 대립유전자 특이적 혼성화, 대립유전자 특이적 프라이머 연장, 및 서던 블랏으로 이루어진 군에서 선택되는 방법의 사용을 포함하는 것인 분류 방법.
제1항에 있어서, 조건은 서열번호 2의 돌연변이체의 검출을 포함하는 것인 분류 방법.
제8항에 있어서, 조건은 HPLC, 질량 분광분석법, ELISA, 유세포측정법, 면역조직화학법 및 방사면역측정법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법의 사용을 포함하는 것인 분류 방법.
제8항에 있어서, 돌연변이체는 FGFR2 단백질의 활성 수준을 평가하여 검출되는 것인 분류 방법.
서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군에서 선택되는 서열의 돌연변이체를 검출할 수 있는 제1 시약; 및
코호트로 피험체의 분류를 표시하는 결과의 지시서(indication)로서, 여기서 코호트는 자궁내막암의 재발 위험성이 높은 2 이상의 개체를 포함하는 것인 지시서
를 포함하는 피험체를 코호트로 분류하는데 사용되는 키트.
제11항에 있어서, 돌연변이체는 S252W, P253R, S373C, Y376C, C383R, G385R, I548V, N550K, N550H, K660E, M392R, V396D, L398M, 및 IVS 10+2A>C로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 변화를 일으키는 돌연변이를 포함하는 것인 키트.
제12항에 있어서, 제1 시약은 서열번호 1의 돌연변이체에 결합할 수 있는 것인 키트.
제13항에 있어서, 핵산 서열분석, 마이크로어레이 분석, PCR 증폭, 대립유전자 특이적 PCR 증폭, 제한효소 단편 길이 다형성, 대립유전자 특이적 혼성화, 대립유전자 특이적 프라이머 연장, 및 서던 블랏으로 이루어진 군에서 선택되는 방법의 사용을 용이하게 하는 성분을 더 포함하는 것인 키트.
제12항에 있어서, 제1 시약은 서열번호 2의 돌연변이체에 결합할 수 있는 것인 키트.
제15항에 있어서, 제1 시약은 제1 항체를 포함하는 것인 키트.
제16항에 있어서, ELISA, 유세포측정법 및 방사면역측정법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법의 사용을 용이하게 하는 성분을 더 포함하는 것인 키트.
제11항에 있어서, 결과는 핵산 서열을 포함하는 것인 키트.
제11항에 있어서, 결과는 광학 밀도 값을 포함하는 것인 키트.
제11항에 있어서, 지시서는 양성 대조군을 포함하는 것인 키트.
제11항에 있어서, 지시서는 기록물(writing)을 포함하는 것인 키트.
제21항에 있어서, 기록물은 서면상에 존재하는 것인 키트.
제21항에 있어서, 기록물은 웹사이트를 통해 입수할 수 있는 것인 키트.
제21항에 있어서, 기록물은 사진을 포함하는 것인 키트.
제11항에 있어서, 지시서는 입력값으로서 결과 및 출력값으로서 코호트로 피험체의 분류를 검출하도록 구성된 소프트웨어를 포함하는 것인 키트.
제25항에 있어서, 소프트웨어는 돌연변이체를 검출하도록 구성된 기계에 도입되는 것인 키트.