KR20100015883A - 자궁내막암 및 전암을 진단，분류 및 치료하는 방법 - Google Patents
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Abstract
자궁내막암에 대한 진단적 및 치료적 적용이 개시된다. 진단적 및 치료적 적용은 FGFR2 유전자 및 이의 발현 생성물에서 특정 활성화 돌연변이에 기초한다. 본 발명은 FGFR2 활성화 돌연변이체와 관련된 누클레오티드 서열, 아미노산 서열, 프로브 및 프라이머, 및 피검체에서 자궁내막암을 진단 및 분류하기 위해 이러한 돌연변이체를 포함하는 키트에 관한 것이다.
Description
관련 특허 출원의 교차-참조
본 특허 출원은 2007년 3월 23일자 미국 가출원 60/896,884호 및 2007년 10월 23일자 미국 가출원 60/982,093호의 계속 출원이며, 이들의 내용이 그 전체로서 본원에 참조로서 포함된다.
전자 파일 자료의 참조에 의한 포함
본원에 동시에 제출되고 하기와 같이 규명된 컴퓨터로 읽을 수 있는 누클레오티드/아미노산 서열 목록이 그 전체로서 본원에 참조로서 포함된다: 2008년 3월 24일자 생성된 "Seq-list"라는 명칭의 One 27,110 byte ASCII (텍스트) 파일.
본 발명은 자궁내막암을 진단, 분류 및 치료하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.
자궁내막암은 미국 여성의 생식관에서 가장 일반적으로 진단되는 암이다. 미국에서는 2007년에 39,080건의 새로운 자궁체암이 진단되고 7,400명의 여성이 이 질병으로 사망할 것으로 추정하였다 (Jemal A, Siegel R, Ward E, Murray T, Xu J, Thun MJ. CA Cancer J Clin 2007 Jan-Feb;57(l):43-66). 자궁내막암을 지닌 여성 의 대부분은 자궁절제술에 의해 수술적으로 치유된다; 그러나, 여성의 약 15%는 현행의 화학요법에 반응하지 않는 계속되거나 재발되는 종양을 나타낸다. 진행된 단계의 진행성이거나 재발성인 질병을 지닌 이러한 여성의 경우, 효과적인 것으로 입증된 어떠한 애주번트 요법도 없으므로 생존률이 저조하다. 재발 후 평균 수명은 10개월이며 (Jereczek-Fossa B, Badzio A, Jassem J., Int J Gynecol Cancer 1999 Jul;9(4):285-94) 재발된 환자의 5년 생존율은 단지 13%이다 (Creutzberg CL, van Putten WL, Koper PC, et al., Lancet 2000 Apr 22;355(9213): 1404-11).
악성 암종은 종종 다발 종양원에서 돌연변이를 나타내며 종양 억제 유전자는 수 백개의 유전자의 발현에서 변경을 나타내고 다양한 염색체 비정상성(abnormality)을 함유한다. 이러한 게놈의 복잡성에도 불구하고, 특이적 분자 비정상성을 표적화하는 것은 선택적인 티로신 키나아제 억제제 이마티닙 (Gleevec) 및 제피티닙 (Iressa)에서 보여지는 바와 같이 인간 종양의 신속한 퇴행을 제공하는 것으로 나타났다. 이러한 현상을 설명하기 위해, 베르나르 와인스타인(Bernard Weinstein)은 "종양원 중독(addiction)"이라는 용어를 도입하였다. 그는 종양 세포의 시그널링 회로가, 종양 세포가 세포 생존 및 성장을 위하여 종양원성 활성에 의존적이도록 종양원성 활성의 존재하에 재프로그래밍된다고 제안하였다 (Weinstein IB. Science 2002 Jul 5;297(5578):63-4). 실제로, 실험 및 임상 데이터는 종양원 중독의 이러한 개념을 지지하고, 더욱이 돌연변이, 재발 및 과발현을 포함하는 종양원 활성화의 다중 메카니즘이 종양원 중독에 관여할 수 있다고 제안한다 (Weinstein IB, Joe AK., Nat Clin Pract Oncol 2006 Aug;3(8):448-57).
다양한 신체 유전자 결합이 자궁내막 암종에서 보고되었다. 충분히 또는 알맞게 분화된 자궁내막유사 자궁내막 암종은 자궁암의 대략 80%를 설명한다. 이들은 높은 빈도의 PTEN에서의 비활성화 돌연변이 (26-80%), 활성화 KRAS2 돌연변이 (13-26%), 및 β-카테닌 기능 획득 돌연변이(gain-of-fuction mutations) (25-38%)를 특징으로 한다 (Hecht JL, Mutter GL., J Clin Oncol 2006 Oct 10;24(29):4783-91, Shiozawa T, Konishi I., Int J Clin Oncol 2006 Feb;ll(l):13-21). FGFR1, 2 및 3에서의 생식세포 기능 획득 돌연변이가 다양한 두개골조기유합 증후군 및 연골형성장애 증후군에서 보고되었다. 이러한 질병에서의 유전형/표현형 상관관계는 3개의 수용체 중 하나에서의 돌연변이와 연관된 14개를 초과하는 별개의 임상적 증후군 및 상이한 수용체에서의 돌연변이와 연관된 페이퍼(Pfeiffer) 및 크로우존(Crouzon) 증후군과 같은 여러 임상적 증후군을 지니며 복잡하다 (Passos-Bueno MR, Wilcox WR, Jabs EW, Sertie AL, Alonso LG and Kitoh H. (1999), Hum Mutat 14: 115-125, Wilkie AO, Patey SJ, Kan SH, van den Ouweland AM and Hamel BC. (2002), Am J Med Genet 112: 266-278.).
암의 생물학적 토대를 이해하기 위해 진단 및 치료에 있어서 많은 진보가 이루어졌으나, 이것은 여전히 미국에서 사망의 주된 원인 중 하나이다. 암의 진단 및 치료에 있어서 본질적인 어려움은 다른 무엇보다도 긍정적인 환자의 성과 가능성을 최대화하기 위해 적합한 치료 전략에 있어서 암이 수많은 상이한 서브그룹으로 존재하고 변이가 수반된다는 것이다. 더욱이, 질병의 진행에 있어서 광범한 범위의 자궁내막암 서브그룹 및 변이가 존재한다. 자궁내막암을 적절하게 치료하고 성공적인 치료 기회를 최대화하기 위해, 자궁내막암의 유형 또는 아형이 가능한 한 조기에 규명되는 것이 중요하다.
따라서, 적합한 최적의 치료 섭생을 선택하기 위해 자궁내막암을 검출하고 분류하는 방법이 현재 요구된다. 일단 검출 및 분류되면, 성공적으로 치료할 기회를 최대화하거나 피검체에서 질병의 재발을 억제하기 위해 자궁내막암의 유형에 기초하여 자궁내막암을 치료하는 개선된 방법이 또한 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 자궁내막암을 진단, 분류 및 치료하는 방법을 제공한다. 섬유모세포 성장 인자 수용체 2(FGFR2) 활성화 돌연변이를 규명하고 자궁내막암과 대응시킴에 의해, 본 발명자들은 본원에서 피검체의 자궁내막암을 진단, 분류 및 치료하기 위한 유용한 도구를 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 피검체, 바람직하게는 인간 피검체에서 자궁내막암 또는 전암을 검출 및 진단하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 바람직하게는 자궁내막 세포를 함유하는 생물학적 샘플에서 FGFR2의 수용체 돌연변이를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 돌연변이는 FGFR2 수용체 활성화와 관련된다. FGFR2에서 하나 이상의 활성화 돌연변이의 존재는 피검체의 자궁내막암 또는 전암의 징후(diagnostic)이다. 활성화 돌연변이는 미스센스 돌연변이, 결실, 삽입 및 결실과 삽입 둘 모두일 수 있고 종종 개선된 리간드 결합, 무차별적(promiscuous) 리간드 결합 (예컨대, 수용체가 보통은 야생형 수용체에 결합될 수 없는 리간드에 결합되어 활성화되게 한다), 항시적인 수용체 이량체화, 시그널링의 증대를 초래하는 손상된 수용체 재순환, 지연 분해, 과발현 또는 키나아제 활성화를 초래한다. 바람직한 구체예에서, FGFR2는 최적의 시그널링을 위해 여전히 리간드 자극을 요구할 수 있는 항시적으로 활성인 돌연변이체이다.
바람직하게는, 검출하는 단계는, 게놈 DNA, RNA 또는 cDNA의 하나 이상의 핵산에 있는 하나 이상의 누클레오티드 FGFR2 돌연변이에 대해 생물학적 샘플을 스크리닝하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 활성화 돌연변이는 FGFR2에서 하나 이상의 아미노산 치환을 초래한다.
바람직한 구체예에서, FGFR2 활성화 돌연변이는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다: 면역글로불린-유사 (Ig) 도메인 II 및 III 사이에 있는 접합부(junction)에서의 돌연변이 (예컨대, 위치 252에서 S에서 W, F, 또는 L로의 돌연변이; 위치 253에서 P에서 R로의 돌연변이; 위치 263에서 P에서 L로의 돌연변이; 위치 267에서 S에서 P로의 돌연변이, 모두 서열번호 2 또는 3); IgIII 도메인에서의 돌연변이 (예컨대, 위치 276에서 F에서 V로의 돌연변이; 위치 278에서 C에서 Y 또는 F로의 돌연변이; 위치 281에서 Y에서 C로의 돌연변이; 위치 288에서 I에서 S로의 돌연변이; 위치 289에서 Q에서 P로의 돌연변이; 위치 290에서 Y에서 C, G. 또는 R로의 돌연변이; 위치 292에서 K에서 E로의 돌연변이; 위치 310에서 K에서 R로의 돌연변이; 위치 315에서 A에서 T로의 돌연변이; 위치 321에서 D에서 A로의 돌연변이; 위치 328에서 Y에서 C로의 돌연변이, 모두 서열번호 2 또는 3); IgIII 도메인 및 트랜스멤브레인(TM) 도메인 사이에 있는 접합부에서의 돌연변이 (예컨대, 위치 354 또는 353에서 S에서 C 또는 T로의 돌연변이; 위치 359 또는 358에서 V에서 F로의 돌연변이; 위치 362 또는 361에서 A에서 S로의 돌연변이; 위치 372 또는 371에서 S에서 C로의 돌연변이; 위치 375 또는 374에서 Y에서 C로의 돌연변이; 위치 373 또는 372에서 S에서 C로의 돌연변이; 위치 376 또는 375에서 Y에서 C로의 돌연변이, 모두 각각 서열번호 2 또는 3); TM 도메인의 돌연변이 (예컨대, 위치 380 또는 379에서 G에서 R로의 돌연변이; 위치 383 또는 382에서 C에서 R로의 돌연변이; 위치 384 또는 383에서 G에서 R로의 돌연변이; 위치 392 또는 391에서 M에서 R로의 돌연변이, 모두 각각 서열번호 2 또는 3); TM 도메인 및 티로신 키나아제 도메인 I 사이에 있는 접합부에서의 돌연변이 (예컨대, IVS10+2A>C 스플라이싱 돌연변이); 티로신 키나아제 도메인 I에서의 돌연변이 (예컨대, 위치 538 또는 537에서 I에서 V로의 돌연변이; 위치 540에서 N에서 K로의 돌연변이; 위치 548 또는 547에서 I에서 V로의 돌연변이; 위치 549 또는 548에서 N에서 H로의 돌연변이; 위치 550 또는 549에서 N에서 K로의 돌연변이; 위치 565 또는 564에서 E에서 G로의 돌연변이, 모두 각각 서열번호 2 또는 3); 또는 티로신 키나아제 도메인 II에서의 돌연변이 (예컨대, 위치 641 또는 640에서 K에서 R로의 돌연변이; 위치 650 또는 649에서 K에서 E로의 돌연변이; 위치 659 또는 658에서 K에서 N으로의 돌연변이; 위치 660 또는 659에서 K에서 E로의 돌연변이; 위치 663 또는 662에서 G에서 E로의 돌연변이; 위치 678 또는 677에서 R에서 G로의 돌연변이, 모두 각각 서열번호 2 또는 3; 서열번호 1의 위치 2290-91에서 누클레오티드 C 및 T의 결실에 의해 야기된 프레임 변위 돌연변이).
IgIII 도메인의 바람직한 활성화 돌연변이의 다른 예로는, 예를 들어 위치 331에서 N에서 I로의 돌연변이; 위치 337에서 A에서 P로의 돌연변이, 위치 338에서 G에서 P 또는 R로의 돌연변이; 위치 340에서 Y에서 C 또는 H로의 돌연변이; 위치 341에서 T에서 P로의 돌연변이; 위치 342에서 C에서 F, G, R, S, W 또는 Y로의 돌연변이; 위치 344에서 A에서 G 또는 P로의 돌연변이; 위치 347에서 S에서 C로의 돌연변이; 위치 351에서 S에서 C로의 돌연변이 (모두 서열번호 2, 및 서열번호 3에서의 동등한 돌연변이)가 있다.
하나를 초과하는 FGFR2 활성화 돌연변이가 생물학적 샘플에서 검출될 수 있고, 예를 들어 2개 이상의 FGFR2 수용체 활성화 돌연변이가 특정 구체예에서 검출됨을 주목하는 것이 중요하다.
검출된 자궁내막암은 임의의 아형, 예를 들어 장액, 점액 및 자궁내막유사 조직학적 아형일 수 있다. 그러나, 바람직한 구체예에서,검출된 암은 자궁내막유사 조직학적 아형이다.
또한, 본 발명은 시험 피검체에서 FGFR2 시그널 형질도입 경로의 활성 수준을 평가하고 이것을 대조군 피검체의 활성 수준과 비교하는 것을 포함하여, 피검체에서 자궁내막암을 진단 또는 분류하는 방법을 제공하고, 여기서 대조군 피검체에 비해 시험 피검체의 FGFR2 경로의 증가된 활성은 자궁내막암을 표시한다. 경로의 활성 수준은, 예를 들어 FGFR2 단백질의 발현 또는 활성 수준의 증가를 평가함에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로 발현 또는 활성 수준은, 예를 들어 수용체 활성화를 초래하는 FGFR2, 바람직하게는 돌연변이된 FGFR2를 엔코딩하는 mRNA의 양을 결정함에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 자궁내막암은 게놈 증폭으로 인해 FGFR2의 과발현과 관련되고, 검정은 구체적으로 FGFR2의 과발현을 검출하기 위해 고안된다.
본 발명은 또한 유전자에 의해 엔코딩되는 FGFR2 단백질의 증가된 활성을 초래하는 FGFR2 유전자의 돌연변이 부위 또는 이의 부근에 특이적으로 하이브리드화되는 올리고누클레오티드, 및 자궁내막암을 진단하는데 사용되는 지침서를 포함하는, 자궁내막암을 진단 또는 분류하기 위한 키트에 관한 것이다. 돌연변이 부위는, 예를 들어 서열번호 1의 누클레오티드 755, 929, 943, 1118, 1147, 1642, 1650, 1978, 및 2290-91 및 서열번호 7의 동등한 누클레오티드로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 키트는 돌연변이 부위를 포함하는 하나 이상의 프로브를 포함한다.
본 발명은 추가로 FGFR2 단백질의 돌연변이를 특이적으로 인식하는 항체 및 사용 지침서를 포함하는 자궁내막암을 진단하거나 분류하기 위한 키트에 관한 것이다. 임의로, 돌연변이는 서열번호 2 및 3과 같이, 비-돌연변이된 FGFR2 단백질에 비해 증가된 활성을 초래한다. 바람직하게는, 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 특이적인 FGFR2 단백질 돌연변이에 대해 유도된다: 면역글로불린-유사 (Ig) 도메인 II 및 III 사이에 있는 접합부에서의 돌연변이; IgIII 도메인에서의 돌연변이; IgIII 도메인 및 트랜스멤브레인 (TM) 도메인 사이에 있는 접합부에서의 돌연변이; TM 도메인에서의 돌연변이; TM 도메인 및 티로신 키나아제 도메인 I 사이에 있는 접합부에서의 돌연변이; 티로신 키나아제 도메인 I에서의 돌연변이, 또는 티로신 키나아제 도메인 II에서의 돌연변이. 보다 바람직하게는, 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 돌연변이에 관한 것이다: (a) 서열번호 2(NP_075259.2) 또는 3(NP_000132.1)의 위치 252에서 S에서 W로의 돌연변이; (b) 서열번호 2 또는 3의 위치 310에서 K에서 R로의 돌연변이; (c) 서열번호 2 또는 3의 위치 315에서 A에서 T로의 돌연변이; (d) 서열번호 2의 위치 373 또는 서열번호 3의 위치 372에서 S에서 C로의 돌연변이; (e) 서열번호 2의 위치 376 또는 서열번호 3의 위치 375에서 Y에서 C로의 돌연변이; (f) 서열번호 2의 위치 383 또는 서열번호 3의 위치 382에서 C에서 R로의 돌연변이; (g) 서열번호 2의 위치 392 또는 서열번호 3의 위치 391에서 M에서 R로의 돌연변이; (h) 서열번호 2의 위치 548 또는 서열번호 3의 위치 547에서 I에서 V로의 돌연변이; (i) 서열번호 2의 위치 550 또는 서열번호 3의 위치 549에서 N에서 K로의 돌연변이; 또는 (j) 서열번호 2의 위치 660 또는 서열번호 3의 위치 659에서 K에서 E로의 돌연변이.
본 발명은 추가로 피검체에서 자궁내막암 또는 전암을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 피검체가 자궁내막암 (예컨대, 장액, 점액 및 자궁내막유사 조직학적 아형)에 걸린 인간이다. 상기 방법은 바람직하게는 유효량의 FGFR2 억제제를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 FGFR2 활성화, 예를 들어 리간드-독립적이거나 리간드-의존적인 방식으로 항시적으로 활성인 FGFR2 돌연변이된 형태를 특징으로 하는 자궁내막암 또는 전암을 지닌 피검체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 FGFR2 억제제가 FGFR2 발현 또는 활성을 억제함으로써 피검체에서 자궁내막암의 성장 또는 증식이 효과적으로 억제된다. FGFR2 억제제는 자궁내막암 세포의 세포 주기 정지 및/또는 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 것이 바람직하다. 일 구체예에서, FGFR2 억제제를 수술 후 자궁내막암의 재발을 막기 위해 자궁내막암의 수술 처치를 받은 피검체엑 투여한다. 또 다른 구체예에서, 억제제는 수술적 제거로 치유될 수 없는 지속성 또는 재발성 자궁내막암을 지닌 환자에게 투여된다.
사용된 FGFR2 억제제는 FGFR2 유전자 또는 FGFR2 발현 생성물의 발현을 방해할 수 있다. 일 구체예에서, 제제는 FGFR2 안티센스 핵산이고, 바람직하게는 위치 929에서 A에서 G로의 치환; 위치 1650에서 T에서 G로의 치환; 위치 943에서 G에서 A로의 치환; 위치 755에서 C에서 G로의 치환; 위치 1650에서 T에서 A 또는 G로의 치환; 위치 1127에서 A에서 G로의 치환; 위치 1175에서 C에서 G로의 치환; 위치 1642에서 A에서 G로의 치환; 위치 1978에서 A에서 G로의 치환; 인트론10 A>C+2; 또는 위치 2290-91에서 CT의 결실, 및 서열번호 7의 동등한 치환으로부터 선택된 하나 이상의 누클레오티드 치환을 포함하는 서열번호 1의 세그먼트에 하이브리드화되는 안티센스 핵산이다.
또 다른 구체예에서, FGFR2 억제제는 FGFR2 도메인을 차단함에 의해 FGFR2 활성을 억제한다. 예를 들어, FGFR2 억제제는 FGFR2의 면역글로불린-유사 (Ig) 도메인 II 및 III 사이에 있는 링커 영역; FGFR2의 IgIII 도메인; FGFR2의 IgIII 도메인 및 트랜스멤브레인 (TM) 도메인 사이에 있는 접합부; TM 도메인; FGFR2의 TM 도메인 및 티로신 키나아제 도메인 I 사이에 있는 접합부; FGFR2의 티로신 키나아제 도메인 I, 또는 FGFR2의 티로신 키나아제 도메인 II에 대해 유도된 항-FGFR2 억제 항체이다. 예를 들어, 일 구체예에서, FGFR2 억제제는 FGFR2 폴딩(folding), FGFR2의 3차원 구조, 리간드 결합 또는 ATP와 같은 기질 결합을 방해한다.
바람직한 예는 하기로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 FGFR2 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는 항체를 포함한다: (a) 서열번호 2(NP_075259.2) 또는 3(NP_000132.1)의 위치 252에서 S에서 W로의 돌연변이; (b) 서열번호 2 또는 3의 위치 310에서 K에서 R로의 돌연변이; (c) 서열번호 2 또는 3의 위치 315에서 A에서 T로의 돌연변이; (d) 서열번호 2의 위치 373 또는 서열번호 3의 위치 372에서 S에서 C로의 돌연변이; (e) 서열번호 2의 위치 376 또는 서열번호 3의 위치 375에서 Y에서 C로의 돌연변이; (f) 서열번호 2의 위치 383 또는 서열번호 3의 위치 382에서 C에서 R로의 돌연변이; (g) 서열번호 2의 위치 392 또는 서열번호 3의 위치 391에서 M에서 R로의 돌연변이; (h) 서열번호 2의 위치 548 또는 서열번호 3의 위치 547에서 I에서 V로의 돌연변이; (i) 서열번호 2의 위치 550 또는 서열번호 3의 위치 549에서 N에서 K로의 돌연변이; 또는 (j) 서열번호 2의 위치 660 또는 서열번호 3의 위치 659에서 K에서 E로의 돌연변이.
바람직한 구체예에서, 항체는 서열번호 2 또는 3의 위치 252에서 S에서 W로의 돌연변이에 대해 유도된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 인간화된 항체이고 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
대안적인 구체예에서, FGFR2 억제제는 소형 억제 RNA (siRNA), 소형 헤어핀(hairpin) RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA), 또는 리보자임이다. 바람직한 구체예에서, FGFR2 억제제는 shRNA, 바람직하게는 FGFR2의 엑손 2 (서열번호 4) 및/또는 FGFR2의 엑손 15 (서열번호 5)를 표적화하는 shRNA이다. 또 다른 구체적인 비제한적 구체예에서, FGFR2 억제제는 PD173074이다.
본 발명은 추가로 자궁내막암을 분류하는 방법을 제공한다. 이 방법은 사용자가 자궁내막암의 유형을 분류하게 함으로써 특수하고 적절한 치료가 피검체가 지닌 자궁내막암의 유형에 기초하여 수행될 수 있게 한다. 상기 방법은 자궁내막암 세포에서 FGFR2 돌연변이를 스크리닝하고; 자궁내막암 세포에서의 FGFR2 활성화 돌연변이의 발견에 따라 자궁내막암의 유형을 FGFR2 활성화 유도된 자궁내막암으로 분류하는 것을 포함한다. 바람직하게는, FGFR2 활성화 돌연변이가 상기 규명된 FGFR2 돌연변이 중 하나 이상이다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 FGFR2 돌연변이가 FGFR2 활성화를 유도하는지를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1A-E는 자궁내막 세포에서 세포 치사를 초래하는, ANC3A 및 MFE296 세포에서 FGFR2의 shRNA 매개된 녹다운(knockdown)의 결과를 도시한다. 도 1A 및 1B는 자궁내막암 세포의 세포 증식에 대한 FGFR2 shRNA의 효과를 도시한다. AN3CA (도 1A) 또는 MFE296 (도 1B) 세포를 빈(empty) 벡터, 비침묵화(nonsilencing) 또는 FGFR2의 두 상이한 엑손 (X2 또는 X15)을 표적화하는 두 독립적인 FGFR2 shRNA 구성물로 형질도입시키고 세포 증식에 대한 효과를 SRB 검정을 이용하여 평가하였다. FGFR2 shRNA로의 치료는 두 세포주 모두의 증식을 억제하였다. 비침묵화 대조군 shRNA는 세포 증식에 아무런 영향이 없었다. 도 1C. ERK1/2 및 AKT의 활성화에 대한 FGFR2 녹다운의 효과. shRNA 형질도입 후, AN3CA 세포를 0.2% FBS에서 18시간 동안 혈청 결핍시키거나 10% FBS를 함유하는 충분한 성장 배지에서 유지하였다. 용해물을 수집하고 FGFR2 발현 및 ERK1/2 및 AKT의 활성화에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. FGFR2의 녹다운은 0.2% 및 10% FBS에서 감소된 ERK1/2 활성화, 10% FBS에서 AKT 인산화의 온당한 감소를 초래하였고, 0.2% FBS에서 AKT 활성화에는 영향을 미치지 않았다. 도 1D. FGFR2의 녹다운 이후 세포 치사. AN3CA 세포를 비침묵화 siRNA (NS) 대조군 또는 FGFR2 siRNA X2로 리포펙타민 2000 트랜스펙션 시약을 이용하여 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 48시간 후, 세포를 수집하고, 500 ng/mL의 아넥신(Annexin) V-FITC 및 1 ㎍/mL의 요오드화 프로피듐으로 염색하고, 흐름 세포측정에 의해 아넥신-FITC 포지티브 세포에 대해 분석하였다. FGFR2의 녹다운은 아폽토시스의 표시인 아넥신 V 포지티브 세포의 증가를 초래하였다. 30 ㎍의 총 단백질 용해물을 웨스턴 블롯 분석으로 분석하여 FGFR2 녹다운을 확인하였다. 이러한 녹다운은 shRNA 구성물 보다 siRNA로 달성되었는데, 그 이유는 shRNA가 FITC와 중복되는 방출 스펙트럼을 지니는 GFP도 발현시켰기 때문이다. 도 1E는 자궁내막암 세포 주에서 PTEN 발현을 도시한다. 자궁암 세포 용해물을 수집하고 PTEN 발현에 대해 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다.
도 2A-B. 활성화된 FGFR2를 발현시키는 자궁내막암 세포는 pan-FGFR 억제제인 PD173074에 민감하다. 6개의 자궁내막암 세포주에 대한 용량 반응 곡선. 세포 생존력(viability)은 PD173074를 첨가한 지 72시간 후에 SRB 검정으로 측정된다. AN3CA 및 MFE296 세포는 N550K FGFR2 돌연변이를 지닌다. HEClA, 이시가와(Ishikawa), KLE, 및 RL952는 FGFR2의 야생형이다. PD173074는 야생형 FGFR2를 발현시키는 것들에 비해 돌연변이체 FGFR2를 발현시키는 세포주의 세포 생존력에 대한 깊은 네거티브 효과를 지녔다. PD173074 IC50 값: AN3CA = 61.7nM; MFE296 = 284.3nM; HEClA > 300OnM; 이시가와 = 2920.7nM; KLE > 100OnM; RL952 > 100OnM. 도 2B는 PD173074 처리 후 PLCg의 활성화 상태를 도시한다.
세포를 0.2% FBS에서 18시간 동안 혈청-결핍시킨 다음, 증가된 농도의 PD173074로 3시간 동안 처리하였다. 용해물을 수집하고 PLCg의 활성화에 대해 웨스턴 블롯 분석으로 평가하였다. 도 2C는 FGF2의 부재하에 및 이에 반응하는 세포 증식을 도시한다. 항시적으로 활성인 FGFR2 키나아제 도메인 돌연변이 N550K는 외인성 FGF2 리간드의 부재 (-FGF2) 및 존재 (+FGF2)의 두 경우 모두에서 야생형 수용체 (WT)에 의해 유도된 것보다 큰 증식의 증가를 초래한다. 이러한 데이터는, N550K 돌연변이가 항시적으로 활성인 한편 완전한 활성을 위해 리간드를 요구한다는 것을 시사한다.
도 3A-B. PD173074를 통한 FGFR2 억제는 활성화된 FGFR2를 지니는 자궁내막암 세포에서 세포 치사 및 세포 주기 정지를 유도한다 (도 3A). 아넥신 염색은 pan-FGFR 억제제인 PD173074로 처리한 후 AN3CA 세포의 세포 치사를 나타낸다. 2.5xlO5개 세포/웰의 밀도로 플레이팅된 AN3CA 세포를 DMSO (비히클 대조군) 또는 1 μM의 PD173074로 처리하였다. 48, 72, 또는 96시간 후에, 세포를 수집하고, 500 ng/mL의 아넥신-FITC 및 1 ㎍/mL의 요오드화 프로피듐으로 염색하고, 흐름 세포측정에 의해 아넥신 포지티브 세포에 대해 삼중으로 분석하였다. PD173074 처리된 세포는 DMSO만으로 처리된 세포에 비해 아넥신-V 염색의 증가를 나타내었고 이것은 아폽토시스를 나타낸다. (도 3B) PD173074는 AN3CA 세포에서 Gl 세포 주기 정지를 유도한다. 세포를 6웰 플레이트에 삼중으로 플레이팅하고 1 μM의 PD173074로 처리하였다. 세포 주기를 PD173074 첨가 72시간 후에 요오드화 피로피듐 염색 및 흐름 세포측정에 의해 결정하였다.
도 4. 증가된 농도의 PD173074로 처리한 후 중요한 시그널링 분자의 활성화 상태. 세포를 10% FBS 중 증가된 농도의 PD173074로 3시간 동안 처리하였다. 용해물을 수집하고 ERK1/2, AKT, STAT3, 및 p38의 활성화에 대해 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다. PD173074 처리는 ERK1/2 활성화의 억제, AKT 인산화의 온당한 억제를 초래하였으나, AN3CA 및 MFE296 세포에서 STAT3 또는 p38 활성화에 대해서는 아무런 영향이 없었다. PD173074는 HEClA 세포에서, ERK1/2, AKT, STAT3, 또는 p38 활성화에 아무런 영향을 미치지 않았다.
도 5A-B. PD173074 처리 후 시간에 따른 중요한 시그널링 분자의 활성화 상태. (도 5A) 세포를 10% FSB 중 1 μM의 PD173074로 0 내지 72시간의 지시된 시간 동안 처리하였다. 용해물을 수집하고 ERK1/2, AKT, STAT3, 및 p38의 활성화에 대해 웨스턴 블롯 분석으로 평가하였다. PD173074 처리는 ERK1/2 활성화의 억제 및 AKT 인산화의 부분 억제를 초래하였으나, AN3CA 및 MFE296 세포에서 STAT3 또는 p38 활성화에 대해서는 아무런 영향이 없었다. PD173074는 HEClA 세포에서, ERK1/2, AKT, STAT3, 또는 p38 활성화에 아무런 영향을 미치지 않았다. (도 5B) 세포를 0.2% FBS에서 밤새 기아시킨 다음 0.2% FBS 중 1 μM의 PD173074으로 0 내지 72시간의 지시된 시간 동안 처리하였다. 용해물을 수집하고 ERK1/2, AKT, STAT3, 및 p38의 활성화에 대해 웨스턴 블롯 분석으로 평가하였다. PD173074 처리는 AN3CA 및 MFE296 세포에서 ERK1/2 활성화의 억제 및 AKT 인산화의 온당한 억제를 초래하였다. PD173074는 HEClA 세포에서, ERK1/2 또는 AKT 활성화에 아무런 영향을 미치지 않았다.
도 6은 FGFR2 돌연변이의 도식적인 묘사이다. FGFR2 돌연변이를 기능성 도메인으로 맵핑하였다. 일차 자궁내막암 및 세포주에서 동정된 신체 돌연변이가 단백질의 상기 도식적인 묘사에 제공되고 FGFR2b에 대해 넘버링된다 (서열번호 2; NP_075259.2). 생식세포 돌연변이는 다양한 두개골조기유합 증후군과 관련되며 FGFR2c에 대해 넘버링된다 (서열번호 3 NP_000132.1). 생식세포에서 이전에 보고되지 않은 네 개의 신체 FGFR2 자궁내막 돌연변이는 뼈대 연골형성장애에서 FGFR3c의 파라로고스(paralogous) 위치에서 보고된 동일한 미스센스 변화를 지닌다 (**로 표시됨). 신규한 돌연변이를 밑줄로 표시한다. aIVS10+2A>C 돌연변이는 +VT 스플라이스폼에 비례하여 상대적인 증가를 초래하는 것 같다. bFS는 프레임변위 및 미숙 트렁케이션을 초래하는 2bp 결실 2290-91 CT를 언급한다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 이제 설명만을 목적으로 하는 본 발명의 바람직한 구체예를 참조로 기술될 것이다. 다양한 변형 또는 변경이 본 발명의 정신 및 범위내에서 이를 벗어나지 않으며 예시된 구체예로 수행될 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다.
본 발명은 수용체 활성화를 유도하는 FGFR2 수용체에서의 돌연변이가 피검체의 자궁내막암 또는 전암을 효과적으로 검출 및 분류하는데 이용될 수 있다는 발견에 일부 기초한다. 본 발명은 또한 FGFR2 유전자 또는 이의 발현 생성물의 억제가 자궁내막암을 치료하는데 효과적이라는 발견에 기초한다.
본원에서 사용된 "자궁내막암"이라는 용어는, 예를 들어 장액, 점액, 및 자궁내막유사 조직학적 아형을 포함하는 질병의 모든 형태 및 아형을 포함한다. 자궁내막암은 자궁(womb)의 내층(lining)인 자궁내막에서 시작되는 암이다.
본 발명과 관련하여, FGFR2 유전자는 바람직하게는 인간 기원의 유전자, 서열번호 1, 7 또는 대립유전자 변이체 및 오르솔로그(ortholog)를 포함하는 호몰로그(homolog)에 제시된 코딩 누클레오티드 서열을 포함한다. FGFR2 단백질은 서열번호 2 또는 3에 제시된 아미노산 서열을 지니는, 역시 바람직하게는 인간 기원의 단백질, 또는 이의 오르솔로그를 포함하는 호몰로그를 포함한다. 도 6은 FGFR2 단백질의 FGFR2 도메인의 기능성 도메인 및 기능성 도메인에 대해 맵핑된 FGFR2 돌연변이를 나타낸다.
FGFR2는 네 개의 상이한 유전자에 의해 엔코딩되는 구조적으로 관련된 티로신 키나아제 수용체 (FGFR 1-4)의 패밀리에 속한다. FGFR2는 세 개의 세포외 면역글로불린-유사 (Ig) 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 및 스플리트(split) 티로신 키나아제 도메인으로 구성된 당단백질이다. IgIII 도메인에서의 대안적인 스플라이싱은 FGF/FGFR 결합 및 시그널링에 있어서 중복성(redundany) 및 특이성 패턴 둘 모두의 주요한 결정인자이다. 이러한 스플라이싱 사건은 조직 특이적이며 별개의 리간드 특이성을 소유하는 FGFR1-FGFR3에 대해 IHb 및 IIIc 수용체 이소형을 발생시킨다 (Mohammadi M, Olsen SK and Ibrahimi OA. (2005), Cytokine Growth Factor Rev 16: 107-137, Ornitz DM and Itoh N. (2001). Genome Biol 2: REVIEWS3005). FGFR2의 경우, 상피 계통의 세포는 엑손 8에 의해 엔코딩된 "IHb" 이소형만을 발현시키는 한편 (FGFR2b; 서열번호 2; NP_07529.2), 중간엽에 의해 유래된 세포는 엑손 9를 이용하는 "IIIc" 이소형만을 발현시킨다 (FGFR2c; 서열번호 3; NP_000132.1) (Scotet E and Houssaint E. (1995). Biochim Biophys Acta 1264: 238-242). FGFR2b 이소형은 FGF1, FGF3, FGF7 및 FGF1O에 우세하게 결합되는 한편, FGFR2c는 FGF7 및 FGF10에 결합되지 않으나 FGF1, FGF2, FGF4, FGF6, 및 FGF8에 높은 친화력으로 결합된다 (Ibrahimi OA, Zhang F, Eliseenkova AV, Itoh N, Linhardt RJ and Mohammadi M. (2004), Hum Mol Genet 13: 2313-2324).
시험 피검체 또는 생물학적 샘플에서 FGFR2의 "증가된 활성" 또는 "활성화 돌연변이"는 대조군, 예컨대 건강한 피검체 또는 표준 샘플에 비해 시험 피검체 또는 생물학적 샘플에서의 보다 높은 총 FGFR2 활성을 언급한다. 바람직하게는, 필수적인 것은 아니나, 시험 피검체 또는 샘플에서의 활성이 대조군에 비해 10% 이상 더 높고, 보다 바람직하게는 50% 이상 더 높으며, 심지어 보다 바람직하게는 100% 이상 더 높고, 여전히 보다 바람직하게는 150% 이상 더 높다. 예를 들어, 증가된 활성은, 예컨대 개선된 리간드 결합, 무차별적이거나 적합하지 않은 리간드 결합, 항시적인 수용체 이량체화, 시그널링의 증대를 초래하는 손상된 재순환, 지연 분해 또는 키나아제 활성화로 인해 증가된 기저 FGFR2 활성, 지속 자극, 지연 분해, 또는 과발현으로부터 초래될 수 있다.
FGFR2의 더 높은 발현 수준은, 예를 들어 FGFR2 유전자의 비-코딩 영역에서의 돌연변이 또는 FGFR2 전사 또는 번역에 수반된 코딩 또는 비-코딩 유전자에서의 돌연변이로부터 초래될 수 있다. FGFR2의 발현 수준은, 예를 들어 시험 피검체 중 FGFR2 mRNA 또는 FGFR2 단백질 수준을 대조군과 비교함에 의해, 예를 들어 종양을 정상 자궁내막 (예컨대, 자궁내막 부근의 정상 샘플)과 비교함에 의해 결정될 수 있다.
"기능-항시적인 변이체"는 단백질 또는 효소 중의 주어진 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 전체적인 형태 및 기능을 변경시키지 않으며 변화된 것이고, 그러한 변화로는 이로 제한되지 않으나 유사한 특성(예컨대, 예를 들어 극성, 수소 결합 가능성, 산성, 염기성, 소수성, 방향족 등)을 지니는 것으로의 아미노산의 교체가 있다. 유사한 특성을 지니는 아미노산이 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 아르기닌, 히스티딘 및 라이신은 친수성-염기성 아미노산이고 상호교환될 수 있다. 유사하게, 소수성 아미노산인 이소류신은 류신, 메티오닌 또는 발린으로 교체될 수 있다. 이러한 변화는 단백질 또는 폴리펩티드의 겉보기 분자량 또는 등전점에 거의 또는 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다.
보존되는 것으로 지적된 것들 이외의 아미노산은 단백질 또는 효소에 있어서 상이할 수 있어서 유사한 기능의 임의의 두 단백질간에 단백질 또는 아미노산의 서열 유사성 퍼센트는 다양할 수 있고, 예를 들어 클러스터(Cluster) 방법과 같은 정렬 도식에 따라 결정될 때 70% 내지 99%일 수 있으며, 여기서 유사성은 MEGALIGN 알고리듬에 기초한다. "변이체"도 BLAST 또는 FASTA 알고리듬에 의해 측정시 60% 이상의 아미노산 동일성, 바람직하게는 75% 이상, 가장 바람직하게는 85% 이상, 심지어 더욱 바람직하게는 90% 이상, 여전히 보다 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 동일성을 지니고, 비교되는 원시 또는 부모 단백질 또는 효소와 동일하거나 실질적으로 유사한 특성 또는 기능을 지니는 폴리펩티드 또는 효소를 포함한다. 특정 변이체는 "기능 획득(gain-of-fuction)" 변이체인데, 이는 단백질 또는 효소 중 하나 이상의 주어진 아미노산 잔기의 변화가 단백질 활성을 포함하나 이로 제한되지 않는 폴리펩티드의 특정 기능을 개선시키는 폴리펩티드 변이체를 의미한다. 아미노산 잔기의 변화는 유사한 특성을 지니는 것으로의 아미노산의 교체일 수 있다.
본원에서 사용된 "상동" 및 "유사한"이라는 용어는 슈퍼패밀리 (예컨대, 면역글로불린 슈퍼패밀리)로부터의 단백질 및 상이한 종으로부터의 상동 단백질을 포함하는, "공통의 진화 기원"을 소유하는 단백질간에 관계를 언급한다. 이러한 단백질 (및 이들의 엔코딩 유전자)은 유사성 퍼센트 또는 보존된 위치로서 특정 잔기 또는 모티프의 존재든지 간에, 이들의 서열 유사성에 의해 반영된 서열 상동성을 지닌다.
특정 구체예에서, BLAST, FASTA, DNA 스트라이더(Strider) 등과 같은 서열 비교 알고리듬에 의해 결정시 DNA 서열의 규정된 길이에 걸쳐 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상 또는 95% 이상의 누클레오티드가 매칭될 때, 두 DNA 서열은 "실질적으로 상동이거나 유사하다."
"돌연변이체" 및 "돌연변이"는 DNA와 같은 유전자 물질에서의 임의의 검출될 수 있는 변화, 또는 임의의 공정 메카니즘, 또는 그러한 변화의 결과를 의미한다. 대조군 물질과 비교시, 이러한 변화는 "비정상성(abnormality)"으로서 언급될 수 있다. 이것은 구조(예컨대, 유전자의 DNA 서열)가 변경된 유전자 돌연변이, 임의의 돌연변이 공정으로부터 발생한 임의의 유전자 또는 DNA, 및 변형된 유전자 또는 DNA 서열에 의해 발현된 임의의 발현 생성물 (예컨대, 단백질)을 포함한다. "변이체"라는 용어도 변형되거나 변경된 유전자, DNA 서열, 효소, 세포 등, 즉 임의의 종류의 돌연변이체를 나타내는데 이용될 수 있다.
본원에서 사용된 "서열-특이적 올리고누클레오티드"는 FGFR2 유전자의 특정 변이 또는 돌연변이, 바람직하게는 FGFR2 활성화 돌연변이를 검출하는데 이용될 수 있는 올리고누클레오티드의 관련 세트를 언급한다.
"프로브"는 피검체의 표적 단백질에 있는 서열을 지니는 프로브의 하나 이상의 서열 상보성으로 인해 표적 영역의 서열과 하이브리드 구조를 형성하는 핵산 또는 올리고누클레오티드를 언급한다.
본 발명은 FGFR2의 발현을 억제하는데 사용될 수 있는 안티센스 핵산 (리보자임 포함)을 제공한다. "안티센스 핵산"은 바람직하게는 단일 가닥 핵산 분자인데, 이는 세포질 조건하에 RNA 또는 DNA 분자의 상보적인 염기와 하이브리드화될 때 후자의 역할을 억제한다. RNA가 메신저 RNA 전사체일 때, 안티센스 핵산은 역전사체(countertranscript) 또는 mRNA-간섭 상보적인 핵산이다. 여기에 사용된 "안티센스"는 넓게 RNA-RNA 상호작용, RNA-DNA 상호작용, 리보자임, RNA-유도된 침묵화 복합체, 및 RNASe-II 매개된 정지를 포함한다. 안티센스 핵산 분자는 세포에서의 발현을 위해 재조합 유전자에 의해 엔코딩될 수 있고 (예컨대, 미국특허 5,814,500호; 미국특허 5,811,234호), 또는 대안적으로 합성에 의해 제조될 수 있다 (예컨대, 미국특허 5,780,607호). 합성 올리고누클레오티드가 안티센스 용도에 적합하다.
진단 방법
본 발명에 따르면, 수용체 활성화를 유도하고, 과발현 및 지연 분해를 포함하는 FGFR2 수용체의 돌연변이가 피검체의 자궁내막암 또는 전암을 진단 또는 분류하기 위해 검출될 수 있다.
본원에서 사용된 "피검체"는 인간 또는 비-인간 포유동물, 예컨대 자궁내막암이 발생될 것 같은 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류이다. 모든 구체예에서, 인간 피검체가 바람직하다. 바람직하게는 피검체가 자궁내막암을 지니는 것으로 의심되거나, 자궁내막암으로 진단되었거나, 자궁내막암의 가족력이 있는 인간이다. 자궁내막암을 지니는 것으로 의심되는 피검체를 규명하는 방법은 물리적 조사, 피검체의 가족 병력, 피검체의 병력, 자궁내막 생검, 또는 초음파촬영술, 컴퓨터 단층촬영법, 자기공명 영상, 자기공명 분광법, 또는 양전자 방출 단층촬영법과 같은 다수의 영상 기술을 포함할 수 있다. 자궁내막암의 진단 방법 및 자궁내막암 진단의 임상적 설계는 의학 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다.
따라서, 진단 방법은, 예를 들어 FGFR2 유전자에서 증가된 FGFR2 수용체 활성을 초래하는 돌연변이를 검출하는 것을 포함할 수 있다. FGFR2 돌연변이, 예를 들어 FGFR2 유전자의 IgII 또는 IgIII 도메인에서의 돌연변이는 FGFR2 유전자의 코딩 영역에 특히 영향을 줄 수 있다. 돌연변이는 미스센스 돌연변이, 바람직하게는 핵산 치환, 또는 결실, 또는 둘 모두의 조합을 초래하는 미스센스 돌연변이일 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이가 하나 및 때로 이를 초과하는 아미노산 치환 또는 결실을 초래하며, 예컨대 하기 표 2를 참조한다.
본 발명의 진단 방법은 FGFR2 단백질의 돌연변이를 검출하는 것도 포함하며, 특히 FGFR2 단백질의 증가된 활성을 초래하는 돌연변이이다. 바람직하게는, 돌연변이가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 FGFR2에서의 하나 이상의 돌연변이이다: 면역글로불린-유사 (Ig) 도메인 II 및 III 사이에 있는 접합부에서의 돌연변이; IgIII 도메인에서의 돌연변이; IgIII 도메인 및 트랜스멤브레인 (TM) 도메인 사이에 있는 접합부에서의 돌연변이; TM 도메인에서의 돌연변이; TM 도메인 및 티로신 키나아제 도메인 I 사이에 있는 접합부에서의 돌연변이; 티로신 키나아제 도메인 I에서의 돌연변이, 또는 티로신 키나아제 도메인 II에서의 돌연변이. 가장 바람직하게는, 돌연변이가 FGFR2에서 아미노산 치환을 유도하고, 예를 들어 서열번호 2 또는 3의 위치 252에서 S에서 W로의 돌연변이 또는 서열번호 2의 위치 550 또는 서열번호 3의 위치 549에서 N에서 K로의 돌연변이가 있다. 또 다른 구체예에서, FGFR2에서의 아미노산 치환은 서열번호 2 또는 3의 위치 310에서 K에서 R로의 돌연변이; 또는 서열번호 2의 위치 392 또는 서열번호 3의 위치 391에서 M에서 R로의 돌연변이이다. 비제한적인 일 구체예에서, 돌연변이는 서열번호 1 (NM-02297.2); 서열번호 7의 위치 2290-91에서 누클레오티드 C 및 T의 결실; 또는 IVS10+2A>C 스플라이싱 돌연변이로 구성된다.
통상적으로, 검출된 FGFR2 수용체 활성화 돌연변이는, 예를 들어 리간드 결합의 개선, 변경된 (무차별적) 리간드 친화력, 항시적인 수용체 이량체화, 지연 분해, 세포 막으로부터 손상된 재순환, 과발현, 또는 키나아제 활성화에 의해 수용체의 활성화를 증가시켜 FGFR2 수용체를 활성화시킨다.
본원에서 사용된 "진단"이라는 용어는 질환 발생의 임의의 단계에서 질환을 규명하는 것을 의미하고, 또한 질병을 진행시키거나 재발시키는 피검체의 소인을 결정하는 것을 포함한다. 본 발명은 자궁내막암의 유형을 확인 및 분류하는 수단을 추가로 제공한다.
"생물학적 샘플"이라는 용어는 DNA가 수득될 수 있는 임의의 세포원을 언급한다. 바람직하게는, 생물학적 샘플이 자궁범위 또는 그 근방에서 수득되어 자궁을 라이닝하는 자궁내막 세포가 생물학적 샘플에 확실히 존재하게 한다. 일 구체예에서, 생물학적 샘플은 혈액 형태이고, 예를 들어 월경 또는 폐경 후 스폿팅(spotting)으로부터의 자궁혈이다.
추가의 구체예에서, 피검체에서 자궁내막암의 진단은 시험 피검체의 자궁내막 세포에서 FGFR2 단백질의 발현 수준, 지연 분해, 또는 활성을 측정하고 이를 대조군 피검체의 자궁내막 세포에서의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 대조군 피검체에 비해 시험 피검체에서 FGFR2 단백질의 증가된 발현 및/또는 활성은 자궁내막암 또는 전암을 나타낸다.
FGFR2의 발현 수준 또는 지연 분해는 생물학적 샘플에서 FGFR2 단백질을 엔코딩하는 mRNA의 양을 측정하거나, 생물학적 샘플에서 FGFR2 단백질의 농도를 결정함에 의해 평가될 수 있다. FGFR2 활성의 수준은 FGFR2 시그널링 경로의 시그널링 유량에서 활성 수준을 측정함에 의해, 예컨대 본원에 개시된 대로 샘플 또는 피검체에서 FGFR2 활성을 측정함에 의해 평가될 수 있다.
핵산 기재 검정
본 발명에 따르면, 즉 FGFR2 DNA 또는 이의 전사체에서 FGFR2 핵산의 돌연변이된 형태 뿐만 아니라 FGFR2 또는 FGFR2 경로의 다른 성분들의 탈조절된 발현, 예컨대 과발현이 다양한 적합한 방법에 의해 검출될 수 있다.
생물학적 샘플에 함유된 핵산을 분석하고 서열화하며 유전자 질병을 진단하는 표준 방법이 적용될 수 있고, 유전형 분석을 위한 많은 전략이 당업자에게 공지되어 있다.
바람직한 구체예에서, FGFR2 유전자의 돌연변이의 결정은 생물학적 샘플 중 FGFR2 게놈 DNA 또는 mRNA의 돌연변이를 검출하기 위한 특정 올리고누클레오티드와 같은 핵산 서열의 이용을 포함한다. 이러한 올리고누클레오티드는 FGFR2 핵산에 존재하는 돌연변이 부위 또는 이러한 돌연변이 부위에 인접한 영역에 특이적으로 하이브리드화될 수 있다. 당업자는 FGFR2의 전부 또는 일부의 증폭을 허락하는 프라이머도 적용시킬 수 있다. 대안적으로 또는 상기 기술과 조합하여, 본원에 개시되거나 당업자에게 공지된 올리고누클레오티드 서열화를 FGFR2 돌연변이를 검출하는데 적용시킬 수 있다.
당업자는 하이브리드화 프로브를 용해 상태로 및 고체-상 절차를 적용시키는 구체예에서 이용할 수 있다. 고체-상 절차를 수반하는 구체예에서, 시험 핵산은 선택된 매트릭스 또는 표면으로 흡착되거나 달리 고정된다. 이후 고정된 단일-가닥 핵산을 선택된 프로브와 특이적 하이브리드화시킨다.
또 다른 구체예에서, 당업자는 PCR 또는 역-PCR ("역 중합효소 연쇄 반응")과 같은 증폭 기술에서 올리고누클레오티드 프라이머를 이용하여 생물학적 샘플에 존재할 수 있는 표적 DNA 또는 mRNA를 각각 특이적으로 증폭시킬 수 있다.
유용한 올리고누클레오티드는 FGFR2 엑손의 증폭을 허락하는 프라이머를 포함한다.
본 발명은 보다 특히 하기 단계를 포함하여, 자궁내막암 또는 전암을 시험관내 진단하는 방법에 관한 것이다:
a) DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 FGFR2 유전자의 전부 또는 일부의 증폭을 가능하게 하는 특정 올리고누클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 샘플에 함유된 DNA가, 적합한 경우, 프라이머가 생물학적 샘플에 함유된 DNA와 하이브리드화될 수 있는 조건하에 하이브리드화되게 하는 단계;
b) 상기 DNA를 증폭시키는 단계;
c) 증폭 생성물을 검출하는 단계;
d) 수득된 증폭 생성물을 정상적인 대조군 생물학적 샘플로 수득된 증폭된 생성물과 비교하여, FGFR2 유전자에서의 가능한 비정상성을 검출하는 단계.
특정 구체예에서, DNA 생물학적 샘플을 증폭에 대한 요구 없이 직접 서열화한다. 이러한 구체예에서, 서열화된 DNA를 대조군 서열과 비교하여 FGFR2 유전자에서의 가능한 비정상성을 검출한다.
본 발명의 방법은 또한 FGFR2 유전자의 전사체에서의 비정상성을 검출하기 위해, 예를 들어 생물학적 샘플에 함유된 mRNA를 예를 들어 RT-PCR에 의해 증폭시킴에 의해 적용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 주제는 하기 단계를 포함하여, 앞서 정의된 대로 자궁내막암을 시험관내 진단하는 방법이다:
a) cDNA를 생물학적 샘플에 함유된 mRNA로부터 생성하는 단계;
b) 상기 cDNA를 FGFR2 유전자 전사체의 전부 또는 일부의 증폭을 허락하는 특정 올리고누클레오티드와, 프라이머와 상기 cDNA의 하이브리드화를 가능하게 하는 조건하에 접촉시키는 단계;
c) 상기 cDNA를 증폭시키는 단계;
d) 증폭 생성물을 검출하는 단계;
e) 수득된 증폭 생성물을 정상적인 대조군 생물학적 샘플로 수득된 증폭된 생성물과 비교하여, FGFR2 유전자의 전사체에서의 가능한 비정상성을 검출하는 단계.
대조군은 당업자에게 공지된 임의의 정상적인 자궁내막 대조군 샘플, 예를 들어 혈액 또는 구강 면봉으로 수득된 정상에 근접한 자궁내막 샘플 또는 정상 DNA일 수 있다. RNA 분석의 경우, 생물학적 샘플은 상기 기술된 임의의 세포원, 예컨대 구아니듐 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출과 같은 당업자에게 널리 공지된 표준 방법을 이용하여 RNA가 단리된 생검 조직일 수 있다 (Chomocyznski et al., Anal. Biochem., 1987, 162:156). 이후 단리된 RNA를 선택된 부위에 특이적인 특정 올리고누클레오티드 프라이머를 이용하여 커플링(coupled)된 역전사 및 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)으로 증폭시킨다. 프라이머 어닐링을 위한 조건은 특정 역전사 및 증폭을 확보하도록 선택되므로; 증폭 생성물의 외관은 특정 유전자 변이의 존재의 진단학이다. 또 다른 구체예에서, RNA는 역-전사되고 증폭되며, 그 증폭된 서열을 예컨대 직접 서열화에 의해 동정한다. 여전히 또 다른 구체예에서, RNA로부터 수득된 cDNA를 클로닝하고 서열화하여 돌연변이를 동정한다.
본 발명의 FGFR2 핵산도 예컨대 치료 및 진단 검정에서 프로브로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 실질적으로 정제된 올리고누클레오티드를 포함하는 프로브를 제공하며, 올리고누클레오티드는 야생형 유전자 (서열번호 1 및 7)와 상이한 FGFR2 유전자의 영역, 예컨대 돌연변이 또는 다형 영역에 특이적으로 하이브리드화될 수 있는 누클레오티드 서열을 지니는 영역을 포함한다. 이후 이러한 프로브는 FGFR2 유전자의 돌연변이가 피검체로부터 수득된 샘플에 존재하는 지를 특이적으로 검출하는데 이용될 수 있다. 돌연변이 또는 다형 영역은 프로모터, 엑손 또는 FGFR2 유전자의 인트론 서열에 위치할 수 있다.
특히 바람직한 본 발명의 프로브는 표적 누클레오티드 서열로 특수하게 하이브리드화되기에 충분한 다수의 누클레오티드 서열을 지닌다. 따라서, 서열번호 1-3에 기초하고 본원에 제공된 돌연변이체 서열에 상보적인 적합한 길이의 프로브를 작제할 수 있고 당업자는 의도된 적용에 따라서 특이성의 적합한 수준을 시험할 수 있다. 표적 누클레오티드 서열이 DNA의 큰 단편, 예컨대 수 십 또는 수 백 킬로베이스의 게놈 DNA 단편에 존재하는 경우, 프로브의 크기는 충분히 특수한 하이브리드화를 제공하기 위해 더 짧은 단편의 DNA에 존재하는 표적 서열을 검출하는데 이용되는 프로브에 비해 더 길어질 수 있다. 예를 들어, 일부 진단 방법에서, FGFR2 유전자의 일부를 먼저 증폭시켜 염색체 DNA의 나머지로부터 단리시킨 다음 프로브에 하이브리드화할 수 있다. 이러한 경우, 더 짧은 프로브가 충분한 특이성의 하이브리드화를 제공할 것 같다. 예를 들어, 약 15개의 누클레오티드, 심지어 더욱 바람직하게는 20개의 누클레오티드의 프로브가 바람직하나, 약 10개의 누클레오티드의 누클레오티드 서열을 갖는 프로브가 충분할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 프로브 또는 프라이머는 바람직하게는 검출될 수 있는, 이에 부착된 표지를 추가로 포함한다. 표지는, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 및 효소 보조-인자로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 예컨대 프로브 또는 프라이머로서 사용된 단리된 핵산을 예컨대 더욱 안정해지도록 변형시킨다. 변형된 예시적인 핵산 분자로는 DNA의 포스포르아미데이트, 포스포티오에이트 및 메틸포스포네이트 유사체가 있다 (미국특허 5,176,996호; 5,264,564호; 및 5,256,775호도 참조).
또 다른 구체예에서, 당업자는 FGFR2 핵산을 분석하기 위해 HPLC 또는 변성 HPLC (DHPLC) 기술을 이용할 수 있다. DHPLC는, HPLC 분석이 부분적으로 변성 온도, 즉 염기쌍 미스매치의 부위에서 헤테로듀플렉스(heteroduplex)를 변성시키기에 충분한 온도에서 수행될 때, 호모듀플렉스가 동일한 염기쌍 길이를 지닌 헤테로듀플레스로부터 분리될 수 있다는 발견에서 발전되었다 (Hayward-Lester, et al., Genome Research, 1995, 5:494; Underhill, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1996, 93: 193; Doris, et al., DHPLC Workshop, 1997, Stanford University). 따라서, DHPLC의 이용을 돌연변이 검출에 적용시켰다 (Underhill, et al., Genome Research, 1997, 7:996; Liu, et al., Nucleic Acid Res., 1998, 26; 1396). DHPLC는 1개의 염기쌍만큼 약간 상이한 헤테로듀플레스를 분리시킬 수 있다. 미국특허 6,287,822호 또는 6,024,878호에 개시된 "매칭된 이온 폴리누클레오티드 크로마토그래피(Matched Ion Polynucleotide Chromatography)"(MIPC), 또는 변성 "매칭된 이온 폴리누클레오티드 크로마토그래피"(DMIPC)도 본 발명에서 유용할 수 있는 분리 방법이다.
대안적으로, 당업자는 FGFR2 유전자의 비정상성을 검출하기 위해 DGGE 방법 (변성 구배 겔 전기영동), 또는 SSCP 방법 (단일 가닥 형태 다형성)을 이용할 수 있다. DGGE는 다양한 농도의 변성제를 함유하는 겔을 통한 전기영동을 이용하여, 단일 염기쌍 변화만큼 적은 서열 차이에 기초한 동일한 길이의 두 DNA 단편을 분석하는 방법이다 (Guldberg et al., Nuc. Acids Res. 1994, 22:880). SSCP는 두 종의 하이브리드화에 후속하는 겔 전기영동에 의한 미스매치 검출을 포함하여, 두 DNA간 서열 차이를 검출하는 방법이다 (Ravnik-Glavac et al., Hum. Mol. Genet. 1994, 3:801). 두 종의 하이브리드화에 후속하는 화학적 절단에 의한 미스매치 검출을 포함하여, 두 DNA간 서열 차이를 검출하는 방법인 "HOT 절단" (Cotton, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85:4397)도 이용될 수 있다. 이러한 방법 이후에 직접 서열화시키는 것이 바람직하다. 유리하게는, RT-PCR 방법을 FGFR2 전사체의 비정상성을 검출하는데 이용할 수 있는데, 그 이유는 이것이 잠재 부위의 활성화로 인해 엑손 스키핑(skipping) 또는 비정상적인 스플라이싱과 같은 스플라이싱 돌연변이의 결과를 가시화할 수 있기 때문이다. 바람직하게는 상기 방법 이후에 역시 직접 서열화가 수행된다.
마이크로어레이, 바람직하게는 고-처리량 스크리닝이 가능한 마이크로어레이 기술을 이용한 기술도 FGFR2 유전자의 비정상성을 검출하거나 FGFR2 유전자 또는 본원에 개시된 증가된 시그널링을 초래하는 FGFR2 경로에서의 또 다른 성분의 유전자의 발현을 검정하기 위해 유리하게 수행될 수 있다. 마이크로어레이는 동일한 올리고누클레오티드의 같은 세트가 어레이의 둘 이상의 선택된 분리된 영역에 부착되도록 하여 당업자가 어레이의 상기 선택된 영역 중 하나에 접촉된 정상적인 샘플을 상기 또 다른 선택된 영역에 접촉된 시험 샘플과 용이하게 비교할 수 있도록 설계될 수 있다. 이러한 어레이는 미세유체관을 이용하여, 정상 샘플과 시험 샘플의 혼합을 피한다. 유용한 마이크로어레이 기술은 Nanogen, Inc (San Diego, Calif.)에 의해 개발된 것들과 Affymetrix에 의해 개발된 것들을 포함한다. 그러나, "유전자 칩" 또는 "DNA 칩"이라고도 불리는 모든 유형의 마이크로어레이가 돌연변이의 동정을 위해 적용될 수 있다. 이러한 마이크로어레이는 당 분야에 널리 공지되어 있다.
올리고누클레오티드가 부착된 고체 지지체는 유리, 실리콘, 플라스틱 (예컨대, 폴리프로필렌, 나일론), 폴리아크릴아미드, 니트로셀룰로오스, 또는 기타 물질로부터 제조될 수 있다. 핵산을 표면에 부착시키는 한 방법은 문헌[Schena et al., Science 1995, 270:467-470]에 일반적으로 개시된 대로 유리 플레이트 위로 프린팅시키는 것이다. 이 방법은 cDNA의 마이크로어레이를 제조할 때 특히 유용하다. 문헌[DeRisi et al., Nature Genetics 1996, 14:457-460; Shalon et al., Genome Res. 1996, 6:639-645; and Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 93:10539-11286] 참조.
예컨대, 차폐(masking)(Maskos and Southern, Nuc. Acids Res. 1992, 20:1679-1684)에 의해 마이크로어레이를 제조하는 다른 방법도 이용할 수 있다. 당업자가 인식하는 대로, 매우 소형 어레이가 하이브리드화 부피가 더 적을 것이므로 바람직할 것이나, 대개 임의의 유형의 어레이, 예를 들어 나일론 하이브리드화 막 상에서의 도트 블롯 (참조, Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989)이 이용될 수 있었다. 이러한 검정을 위해 핵산 하이브리드화 및 세척 조건은, 부착된 올리고누클레오티드가 시험 샘플에 존재하는 FGFR2 유전자의 적어도 일부에 "특이적으로 결합"되거나 "특이적으로 하이브리드화"되도록, 즉 프로브가 상보적인 핵산 서열을 지니는 FGFR2 유전자좌에는 하이브리드, 중복(duplex) 또는 결합되나 비-상보적인 핵산 서열을 지닌 부위에는 하이브리드화되지 않도록 선택된다. 본원에서 사용된 대로, 하나의 폴리누클레오티드 서열이 다른 하나에 상보적인 것으로 고려될 때는, 더 짧은 폴리누클레오티드가 25개 이하의 염기인 경우, 표준 염기-페어링 규칙을 이용하여 미스매치가 없거나, 더 짧은 폴리누클레오티드가 25개 보다 긴 염기일 경우, 5% 이하의 미스매치가 있을 때이다. 바람직하게는, 폴리누클레오티드가 완전히 상보적이다 (미스매치 없음). 특정 하이브리드화 조건이 네거티브 대조군을 포함하는 하이브리드화 검정을 수행함에 의해 특수한 하이브리드화를 초래하는 지는 용이하게 입증될 수 있다 (참조, 예컨대 Shalon et al., supra, and Chee et al., Science 1996, 274:610-614).
다양한 방법을 하이브리드화 사건의 검출 및 분석에 이용할 수 있다. DNA 프로브를 표지하는데 이용된 리포터 그룹 (플루오로포어, 효소, 방사성 동위원소 등)에 따라서, 검출 및 검정이 형광측정, 비색측정 또는 방사선 자동사진에 의해 수행된다. 방출된 방사능, 예컨대 형광 방사능 또는 입자 방출을 관찰하고 측정함에 의해, 하이브리드화 사건에 대한 정보가 수득될 수 있다.
형광 표지된 프로브를 이용할 때, 전사체 어레이의 각 부위에서의 형광성 방출은, 바람직하게는 공초점 레이져 현미경을 스캔함에 의해 검출될 수 있다. 일 구체예에서, 적합한 여기(excitation) 라인을 이용한 분리된 스캔을 이용된 두 개의 플루오로포어 각각에 대해 수행한다. 대안적으로, 두 플루오로포어에 특이적인 파장에서 동시 견본 조명이 가능한 레이저를 이용하여 두 플루오로포어로부터의 방출을 동시에 분석할 수 있다 (참조 Shalon et al. Genome Res. 1996, 6:639-695).
단백질 기재 검정
FGFR2 핵산을 분석하는 것의 대안으로서, 당업자는 단백질의 돌연변이, 또는 단백질의 조절장애 생성, 예컨대 과생성에 기초하여 FGFR2를 평가할 수 있다.
바람직한 구체예에서, FGFR2는 면역검정에 의해 검출된다. 예를 들어, 웨스턴 블롯팅으로 특정 변이체, 또는 FGFR2의 존재 또는 부재의 검출이 가능하다. 특히, 면역검정은 FGFR2 단백질에서 특정 (야생형 또는 돌연변이체) 아미노산 서열을 검출할 수 있다. 다른 면역검정 포맷도 하기 개시된 대로 항체의 생성을 위해 웨스턴 블롯팅 대신 이용될 수 있다. 이러한 것들 중 하나가 ELSIA 검정이다.
ELISA 검정에서, FGFR2의 에피토프 단편인 FGFR2에 대한 항체는 선택된 표면, 예를 들어 폴리스티렌 미세역가 프레이트의 웰과 같은 단백질에 결합될 수 있는 표면 위로 고정된다. 불완전하게 흡착된 폴리펩티드를 제거하기 위한 세척 후에, 소 혈청 알부민(BSA)의 용액과 같은 비특이적 단백질을 선택된 표면에 결합시킬 수 있다. 이것은 고정 표면에 대한 비특이적 흡착 부위를 차단시킬 수 있어서 표면으로의 항혈청의 비특이적 결합에 의해 야기된 백그라운드를 감소시킨다. 이후 고정 표면을 샘플과 접촉시키고 면역 복합체 (항원/항체) 형성을 수행하는 방식으로 시험한다. 이것은 BSA 용액, 소 감마 글로불린(BGG) 및/또는 포스페이트 완충된 염수 (PBS)/트윈과 같은 희석제로 샘플을 희석시키는 것을 포함할 수 있다. 이후 샘플이 2 내지 4시간 동안 약 25 내지 37℃의 온도로 인큐베이션되게 한다. 인큐베이션 후, 샘플-접촉된 표면을 세척하여 비-면역복합체화된 물질을 제거한다. 세척 절차는 PBS/트윈 또는 보레이트 완충액과 같은 용액으로 세척하는 것을 포함할 수 있다. 시험 샘플과 결합된 항체간 특이적 면역복합체의 형성 및 후속적인 세척 이후에, 발생(occurrence), 및 같은 양의 면역복합체의 형성이, 면역복합체를 단백질 상의 돌연변이된 에피토프를 인식하는 FRFG2 돌연변이체에 대한 제2 항체로 처리함에 의해 결정될 수 있다. 검출 수단을 제공하기 위해, 제2 항체는 적합한 색원 기질과 인큐베이션시에, 예를 들어 색 전개를 발생시킬 효소적 활성과 같은 관련 활성을 지닐 수 있다. 이후, 예를 들어 가시 스펙트럼 분광광도계를 이용하여 발색 정도를 측정함에 의해 정량할 수 있다.
통상적으로, 검출 항체는 과산화효소와 같은 효소에 컨주게이션되고 단백질은 테트라메틸벤지딘과 같은 가용성 발색단 과산화효소 기질에 이어 1 M 황산의 첨가에 의해 검출된다. 시험 단백질 농도는 표준 곡선과의 비교에 의해 결정된다.
이러한 프로토콜은 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, V. 2 Ch. 11 and Antibodies, a Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) pp 579-593]에 상세히 기재되어 있다.
대안적으로, 생화학적 검정을 이용하여 FGFR2의 발현 또는 축적을 검출할 수 있는데, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석되는 샘플에서 밴드의 존재 또는 부재를 검출하거나, 역상, 이온 교환 및 겔 투과를 포함하는 고성능 액체 크로마토그래피의 다양한 임의의 방법에 의해 분석되는 샘플에서 크로마토그래피 피크의 존재 또는 부재를 검출하거나, 분석적인 모세관 전기영동 크로마토그래피에서 FGFR2의 존재 또는 부재를 검출하거나, 당 분야에 공지된 임의의 다른 정량 또는 정성적인 생화학적 기술에 의해 검출한다.
상기 논의된 면역검정은 FGFR2 단백질 또는 이의 단편에 대해 유도된 항체를 이용하는 것을 포함한다. 이러한 항체의 생성은 하기에 기재된다.
항-FGFR2 항체
상기 항체는 이로 제한되는 것은 아니나 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 단쇄, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리, 및 예를 들어 인간화된 항체를 포함한다.
당 분야에 공지된 다양한 절차를 FGFR2 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 유사체에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 제조하는데 이용할 수 있다. 항체의 제조에 있어서, 다양한 숙주 동물에 항원성 폴리펩티드를 주사하여 면역시킬 수 있고, 이로 제한되는 것은 아니나 토끼, 마우스, 래트, 양, 염소 등을 포함한다.
FGFR2 폴리펩티드에 대해 유도된 모노클로날 항체의 제조를 위해, 배양액에서 연속적인 세포주에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기술을 이용할 수 있다. 이것은 콜러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)에 의해 최초로 개발된 하이브리도마 기술 (Nature 256:495-497, 1975) 뿐만 아니라 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030, 1983), 및 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985)을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 모노클로날 항체는 무균(germ-free) 동물에서 생성될 수 있다 (국제 특허 공개 WO 89/12690, published Dec. 28, 1989).
본 발명에 따르면, 단쇄 항체의 생성을 위해 개시된 기술은 (미국특허 5,476,786 및 5,132,405 to Huston; 미국특허 4,946,778) FGFR2 폴리펩티드-특이적인 단쇄 항체를 생성하기 위해 적용될 수 있다. 실제로, 이러한 유전자는 생체내에서 발현을 위해 전달될 수 있다. 본 발명의 추가의 구체예는 Fab 발현 라이브러리의 작제를 위해 개시된 기술을 이용하며 (Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989) 이는 FGFR2 폴리펩티드에 대해 요망되는 특이성을 지니는 모노클로날 Fab 단편 또는 이의 유도체 또는 유사체의 신속하고 용이한 동정을 가능하게 한다.
항체 분자의 유전형을 함유하는 항체 단편이 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 상기 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab').sub.2 단편; F(ab').sub.2 단편의 이황화 브릿지를 환원시킴에 의해 생성될 수 있는 Fab' 단편, 및 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리함에 의해 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
항체의 생성에 있어서, 요망되는 항체의 스크리닝은 방사성면역검정, ELISA (효소-결합된 면역흡수 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역방사법 검정, 겔 확산 침전소 반응, 면역확산 검정, 동일반응계내(in situ) 면역검정 (예를 들어, 콜로이드 골드, 효소 또는 방사성 동위원소 표지 이용), 웨스턴 블롯, 침전 반응, 응집 검정 (예컨대, 겔 응집 검정, 헤마글루틴화 검정), 보체(complement) 고정 검정, 면역형광 검정, 단백질 A 검정 및 면역전기영동 검정 등과 같은 당 분야에 공지된 기술에 의해 수립될 수 있다. 일 구체예에서, 항체 결합은 일차 항체 상의 표지를 검출함에 의해 검출된다. 또 다른 구체예에서, 일차 항체는 일차 항체에 대한 이차 항체 또는 시약의 결합을 검출함에 의해 검출된다. 추가의 구체예에서, 이차 항체는 표지된다. 수많은 방법이 면역검정에서의 결합을 검출하기 위해 당 분야에 공지되어 있고 본 발명의 범위 내에 있다.
진단 키트
본 발명은 자궁내막암을 진단 또는 분류하기 위해 피검체의 FGFR2 유전자 내에 있는 서열을 결정하기 위한 키트를 추가로 제공한다. 키트는 변이 위치에서의 서열을 결정하기 위한 수단을 포함하고, 돌연변이 분석을 위한 데이터를 임의로 포함할 수 있다. 서열 결정을 위한 수단은 적합한 핵산-기재 및 면역학적 시약을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 적합한 완충액, 적합한 경우 대조군 시약, 및 변이 위치에서의 서열을 결정하고 피검체의 자궁내막암을 진단 또는 분류하기 위한 사용 설명서도 포함한다.
핵산 기재 진단 키트
본 발명은 생물학적 샘플에서 FGFR2의 유전자 변이를 검출하기 위한 핵산-기재 방법을 제공한다. FGFR2 유전자의 특정 위치에서의 서열은 당 분야에 공지된 임의의 적합한 수단을 이용하여 결정되고, PCR 증폭을 위해 특이적 프로브와의 하이브리드화, 제한 단편화, 직접 서열화, SSCP 및 당 분야에 공지된 다른 기술 중 하나 이상을 제한 없이 포함한다.
일 구체예에서, 진단 키트는 하기 구성성분을 포함한다:
a) 프로브 DNA: 프로브 DNA는 미리-표지될 수 있다; 대안적으로, 프로브 DNA는 비표지될 수 있고 표지를 위한 성분이 키트에 분리된 컨테이너에 포함될 수 있다; 및
b) 하이브리드화 시약: 키트는, 적용가능한 경우, 고체-상 매트릭스를 포함하는 특정 하이브리드화 프로토콜에 필요한 적합하게 패키징된 다른 시약 및 물질, 및 스탠다드(standards)도 함유할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 진단 키트는 하기를 포함한다:
a) 서열 결정 프라이머: 서열화 프라이머는 미리-표지될 수 있거나 친화력 정제 또는 부착 부분을 함유할 수 있다; 및
b) 서열 결정 시약: 키트는 특정 서열화 프로토콜에 요구되는 적합하게 패키징된 다른 시약 및 물질도 함유할 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 키트는 서열화 프라이머의 패널을 포함하며, 이의 서열은 변이 위치에 인접한 서열에 해당된다.
항체 기재 진단 키트
본 발명은 또한 생물학적 샘플에서 돌연변이체 (또는 야생형) FGFR2 단백질을 검출하는 항체-기재 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 샘플을 하나 이상의 항체 제조물과 접촉시키는 단계로서, 각각의 항체 제조물은, 안정한 항원-항체 복합체가 항체와 생물학적 샘플의 FGFR2간에 형성될 수 있는 조건하에 돌연변이체 (또는 야생형) FGFR2에 특이적인 단계; 및 (ii) 당 분야에 공지된 임의의 적합한 수단을 이용하여 단계 (i)에서 형성된 임의의 항원-항체 복합체를 검출하는 단계로서, 복합체의 검출은 돌연변이체 (또는 야생형) FGFR2의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함한다.
통상적으로, 면역검정은 표지된 항체 또는 표지된 항원성 성분 (예컨대, 항체와의 결합에 대해 샘플 중의 항원과 경쟁하는)을 이용한다. 적합한 표지는 제한 없이 효소-기재, 형광성, 화학발광, 방사성 또는 염료 분자를 포함한다. 프로브로부터 시그널을 증폭시키는 검정도 공지되어 있고, 예를 들어 비오틴 및 아비딘, 및 효소-표지된 면역검정, 예컨대 ELISA 검정을 이용하는 것들이다.
진단 키트는 통상적으로 하기 구성성분 중 하나 이상을 포함한다:
(i) FGFR2-특이적 항체: 항체는 미리-표지될 수 있다; 대안적으로, 항체는 비표지될 수 있고 표지를 위한 성분이 키트에 분리된 컨테이너에 포함되거나 제2의 표지된 항체가 제공된다; 및
(ii) 시약 성분: 키트는, 적용가능한 경우, 고체-상 매트릭스를 포함하는 특정 면역검정 프로토콜에 필요한 적합하게 패키징된 다른 시약 및 물질, 및 스탠다드도 함유할 수 있다.
상기 언급된 키트는 자궁내막암을 진단 또는 분류하기 위해 시험을 수행하고 판독하기 위한 지침서를 포함한다. 더욱이, 바람직한 구체예에서, 진단 키트는 고-처리량 및/또는 자동화 작동으로 개작될 수 있다.
자궁내막암을 치료하는 방법
본 발명은 추가로 FGFR2 활성화를 특징으로 하는 자궁내막암을 치료하는 방법을 제공한다. 치료 방법은 바람직하게는 피검체에서 FGFR2 활성을 억제하는 것을 포함한다. 일반적으로 이 방법은 치료가 필요한 환자에게 FGFR2 발현 또는 활성을 조절하는 유효량의 제제를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 치료제는 FGFR2 안티센스 핵산, 항-FGFR2 세포내 억제 항체 또는 소분자 억제제일 수 있다.
치료 조성물은 주 활성 제제로서 FGFR2 억제제를 포함한다. 적합한 억제제의 예로는 FGFR2 DNA 합성 및 이의 발현 생성물 (예컨대, FGFR2 RNA 또는 단백질)을 억제하는 억제제를 포함한다. 예시적인 일 구체예에서, 억제제는 소분자 FGFR2 억제제, 예컨대 PD173074이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, RNA 방해를 이용하며, 여기서 억제제는 RNA 합성 및/또는 번역을 억제하는 시약, 예컨대 소형 억제 RNA (siRNA), 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA), 또는 리보자임이다.
또 다른 구체예에서, 억제제는 FGFR2, 바람직하게는 돌연변이된 FGFR2, 및 특히 이의 하나 이상의 Ig 도메인에 대해 유도된 항체를 포함한다. 바람직하게는, 항체가 FGFR2의 IgII 및 IgIII 도메인 사이에 있는 돌연변이된 링커 영역, 예컨대 S252W 돌연변이에 대해 특이적이다. 일반적으로, 바람직한 항체는 모노클로날 항체이고, 특히 인간 피검체에서 면역원성 반응을 유도하지 않도록 변형된 항체이다 (예컨대, 인간화된 항체). FGFR2의 활성을 차단하는 항체는 진단 적용과 관련하여 상기 개시된 것들과 같이, 당업자에게 널리 공지된 임의의 표준 방법에 따라 생성되고 선택될 수 있다.
세포내 항체 (때로 "인트라보디(intrabodies)"로서 언급됨)가 바이러스 감염 (Marasco et al., Hum. Gene Ther. 1998, 9:1627) 및 기타 감염성 질환 (Rondon et al., Annu. Rev. Microbiol. 1997, 51:257), 및 종양원, 예컨대 p21 (Cardinale et al., FEBS Lett. 1998, 439:197-202; Cochet et al., Cancer Res. 1998, 58: 1170-6), myb (Kasono et al., Biochem Biophys Res Commun. 1998, 251:124-30), erbB-2 (Graus-Porta et al., Mol Cell Biol. 1995, 15:1182-91) 등과 같은 다수의 시스템에서 세포내 단백질의 활성을 조절하기 위해 이용되어 왔다 (참조, Marasco, Gene Ther. 1997, 4:11; Chen et al., Hum. Gene Ther. 1994, 5:595). 이 기술이 항-FGFR2 세포내 항체의 발현에 의해 FGFR2 활성을 억제하는데 적용될 수 있다.
적합할 다른 억제제로는 FGFR2에 대해 유도된 안티센스 올리고누클레오티드, 보다 바람직하게는 돌연변이된 FGFR2 이소형이 있다. 본 발명에 따른 안티센스 핵산을 엔코딩하는 서열을 포함하는 벡터를, 당 분야에서 이용될 수 있는 유전자 요법을 위한 방법과 같은 임의의 공지된 방법에 의해 투여할 수 있다. 유전자 요법의 일반적인 재고는 문헌[Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3:87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1993, 32:573-596; Mulligan, Science 1993, 260:926-932; and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 1993, 62: 191-217; May, TIBTECH 1993, 11:155-215]을 참조한다. 이용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 분야에서 일반적으로 공지된 방법이 문헌[Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al., (eds.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY]에 개시되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료"는 피검체에서 자궁내막암의 진행 또는 발달에 치료적으로 개재하는 것이다. "치료"라는 용어는 공지된 FGFR2 활성화 돌연변이를 지니는 것으로 진단된 피검체에서 자궁내막암의 진행 또는 재발을 막는 것도 포함한다.
"치료적 유효량"이라는 용어는 FGFR2 활성의 수준을 조절하기에 충분한 양 또는 용량, 예컨대 약 10% 만큼, 바람직하게는 약 50% 만큼, 보다 바람직하게는 약 90% 만큼 감소시키는 양 또는 용량을 의미하기 위해 본원에서 이용된다. 바람직하게는, 치료적 유효량은 피검체의 활성, 기능 및 반응을 개선시키거나 여기에서 임상적으로 유의한 감소를 제공할 수 있다. 대안적으로, 치료적 유효량은 피검체에서 임상적으로 유의한 조건의 개선을 초래하기에 충분하다.
FGFR2 억제제는 FGFR2 활성 또는 발현을 억제하고, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제학적 조성물로 제형화되는 것이 유리하다. 이러한 물질을 이후 자궁내막암에 대한 활성 성분 또는 치료제라고 부를 수 있다.
활성 성분의 농도 또는 양은 하기 논의되는 대로 요망되는 투여량 및 투여 섭생에 의존적이다. 적합한 용량은 주로 사용되는 FGFR2 억제제에 따라 다르나, 단지 예시를 목적으로 매일 체중 kg 당 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 다른 생물학적으로 활성인 화합물도 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용된다"라는 것은 인간에게 투여시 생리적으로 관용될 수 있고 통상적으로 알레르기 또는 유사한 성가신 반응, 예컨대 배탈, 현기증 등을 일으키지 않는 분자체 및 조성물을 언급한다. 바람직하게는, 본원에 이용된 대로, "약제학학적으로 허용된다"라는 것은 연방 또는 주립 정부의 관리청에 의해 승인되거나 동물 및 보다 바람직하게는 인간에 이용되는 미국 약전 또는 다른 일반적으로 승인된 약전에 나열된 것을 의미한다. "담체"라는 용어는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애주번트, 부형제 또는 비히클을 나타낸다. 이러한 약제학적 담체는 살균 액체, 예컨대 물 및 오일일 수 있고, 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함한다. 물 또는 염수 수용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 바람직하게 담체로서, 특히 주사될 수 있는 용액으로서 이용된다. 적합한 약제학적 담체가 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 개시되어 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구, 경점막, 예컨대 경구 (per os), 비내, 질내, 또는 직장 또는 경피에 의해 도입될 수 있다. 비경구 경로는 정맥내, 세동맥내, 근내, 진피내, 피하, 복막내, 뇌실내 및 두개내 투여를 포함한다. 자궁 또는 자궁 내층으로의 직접 투여와 같이 자궁을 직접 표적화하는 것이 유리할 수 있다.
일 구체예에서, 치료 화합물은 제어된 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 폴리락트산/글루탐산 (PLGA)과 같은 폴리머 매트릭스에서 연속 펌프를 이용한 정맥내 주입, 피하 이식된 활성 성분 및 콜레스테롤의 혼합물을 함유하는 펠렛 (SilasticR.TM.; Dow Coming, Midland, Mich.; 미국특허 5,554,601호 참조), 이식될 수 있는 삼투 펌프, 경피 패치, 리포좀, 또는 다른 투여 방식을 이용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 실시예를 제공하며, 이는 단지 예시를 위한 것으로 이해되고 본 발명의 범위 또는 첨부된 청구범위를 제한하지 않는다. 당업자는 청구범위 및 본원의 설명에 따라 임의의 형태로 본 발명이 실시될 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 1
자궁내막암에서 활성화
FGFR2
돌연변이의 검출
본원의 발견은 FGFR2의 활성화 및 과발현이 자궁내막 종양발생에서 역할을 담당함을 나타낸다. 엑손 8은 엑소 9 보다 3개의 누클레오티드만큼 더 길기 때문에, FGFR2b 이소형은 FGFR2c 이소형 보다 1개의 코돈만큼 더 길다. 시그널링의 특이성도 수용체, 리간드 및 헤어핀 설페이트 프로테오글리칸의 조직 특이적 발현에 의해 제공된다 (Allen et al., 2001; Fiore, 2001). FGFR2 "b" 및 "c" 이소형의 길이에서의 차이로 인해, 모든 돌연변이는 상피에 의해 발현된 FGFR2b 이소형 (서열번호 2; NP_075259.2)에 대해 넘버링될 것이다. 엑손 8의 발생 다운스트림에 대하여, 본 발명자들은 FGFR2c 이소형 (서열번호 3; NP_000132.1)에 대해 넘버링된 동등한 돌연변이를 본원에 괄호로 표시하여 표 2에 제공한다. 자궁내막 세포주 중 2개에서 동정된 N550K (N549K) 변이체가 크로우존 증후군 (Kan et al., 2002) 및 연골형성저하증 (Bellus et al., 1995)을 지닌 환자에서 FGFR2 및 FGFR3에서 보고되었던 것과 동등하거나 유사한 생식세포 미스센스 변화로서 수용체 활성화를 야기할 것이라고 생각하였다 (도 1).
다음으로, 본 발명자들은 일차 자궁암에서 활성화 FGFR2 돌연변이의 빈도 및 스펙트럼을 측정하고자 하였다. FGFR2 및 FGFR3의 활성화 돌연변이가 생식세포에서 이전에 동정되었던 엑손(엑손 7, 8, 10, 13 및 15)의 직접 서열화를 187건의 일차 자궁암에 대해 수행하였고, 이는 모든 등급 및 단계의 종양 및 자궁내막 암종의 주요 조직학적 아형을 나타내었다 (표 1).
표 1. 자궁암 환자 인구학, 질병 특성 및 FGFR2 돌연변이 상태
*평균±표준 편차
†장액 및 투명 세포를 지닌 모든 암종은 암육종에 따른 특징을 나타내고 육종은 등급 3으로 분류되었다.
중간엽에 의해 발현된 이소형 (FGFR2c)에서 발생된 자궁내막 기질 육종 및 모든 암육종 (악성 상피 및 기질 엘리먼트 둘 모두를 지니는 종양)으로부터 유래된 ESS-1에서 보고된 A315T도 엑손 9 (NM_000141)에서의 돌연변이에 대해 스크리닝되었음이 주목되어야 한다. 종양의 서브셋에 대하여 (32개의 자궁내막유사 자궁내막암 플러스 17개의 암육종), 제2 및 제3 면역글로불린 도메인 (이하, D2 및 D3으로서 언급됨), 트랜스멤브레인 도메인 및 전체 키나아제 도메인을 포함하는 엑손 5-18을 서열화하여 신규한 신체 돌연변이의 상대적인 발생을 측정하였다. 엑손 7, 10, 13 및 15에서 발견된 돌연변이에 추가하여, 이렇게 보다 광역적인 돌연변이 스크린에서 하나의 추가적인 돌연변이가 동정되었고, 엑손 18에서의 2bp 결실이다. 돌연변이는 19건의 경우에서 동정되었다 (10%). 115건의 자궁내막유사 자궁내막암 중 18건이 (16%) 돌연변이를 지녔고 단일 장액 암종 (45건 중 1건, 2%)이 돌연변이를 포함하였다. 암육종 또는 투명 세포 암에서 돌연변이는 나타나지 않았다.
표 2. 일차 자궁내막암에서 FGFR2 돌연변이의 스펙트럼
aNM_022970.2에 대한 넘버링 bP_075259.2에 대한 넘버링 cNP_000132.1에 대한 넘버링 d한 샘플에서 두 개의 돌연변이 eESS-1이 FGFR2c 이소형을 발현시키는 기질 육종으로부터 유래됨에 따라 NM_000141에 대한 넘버링. fFGFR2b의 동등한 위치에 알 라닌이 없다.
모든 돌연변이의 경우, 항시적인 DNA를 서열화하여 돌연변이가 신체적으로 발생하였음을 확인하였다. 자궁내막유사 경우 중에서, 미스매치 복구 결함이 있는 경우에 (49건 중 11건, 22%) 정상적으로 미스매치 복구되는 경우에 비해 (61건 중 6건, 10%) 과량의 FGFR2 돌연변이가 존재하였으나, 통계적 유의성에는 도달하지 못했다 (p=0.10). 마이크로위성(microsatellite) 불안정 (MSI) 상태가 5건의 종양에서 측정되지 않았음에 주목하여야 한다. 본 발명자들은 MSI 포지티브의 경우에 2bp 결실을 포함시키지 않았는데, 그 이유는 이것이 활성화되지 않아서 방관(bystander) 돌연변이를 나타낼 수 있을 것 같았기 때문이다. 마이크로위성 불안정성을 입증한 종양에서 과량의 돌연변이가 존재하나, 본 발명자들은, 동일한 돌연변이가 MSI 포지티브 및 마이크로위성 안정한 (MSS) 일차 종양 둘 모두에서 관찰되고 돌연변이의 대부분이 생식세포에서 동정된 활성화 돌연변이와 동일하다는 사실로부터 (이들이 마이크로위성 불안정성과 관련된 방관 돌연변이였다면, 당업자가 예상하지 못할 동시 사건), FGFR2에서의 이러한 돌연변이가 병원성인 것으로 주장할 것이다.
본 발명자들이 동정한 11개의 상이한 돌연변이 중 7개는 두개골조기유합증 또는 뼈대 형성장애 증후군과 관련하여 이미 보고되었고, 하나 (A315T)는 유사한 미스센스 돌연변이가 보고되었던 (A315S) FGFR2c 잔기에서 발생하였고, 4개의 돌연변이는 신규하였다 (도 1). 종양 히스토타입(histotype)에 따른 돌연변이의 분포가 종양 등급 및 FGFR2 돌연변이를 포함하는 단계에 따라 표 2에 개요되어 있다. S252W 돌연변이는 8개의 독립적인 종양에서 보여지는 동정된 가장 일반적인 돌연변이였다. 이러한 돌연변이는 D2 및 D3의 사이에 있는 링커 영역에서 발생하며 FGF 리간드와의 중요한 접촉을 제공한다. S252W 및 인접한 P253R 돌연변이는 아퍼트(Apert) 증후군, 두개골조기유합을 특징으로 하는 가장 심각한 두개골조기유합 증후군 및 심각한 손발가락유합증을 야기한다 (Park et al., 1995).
생화학적, 구조적 및 생물학적 검정을 이용한 연구의 조합은, S252W 돌연변이가 증가된 리간드 결합 및 리간드 무차별성(promiscuity)을 입증함을 나타낸다 (Ibrahimi et al., 2001; Ibrahimi et al., 2004; Yu et al., 2000). 광범한 시험관내 친화력 연구를 S252W FGFR2c 및 S252W FGFR2b 돌연변이 수용체 둘 모두로 수행하였고, 이는 상기 돌연변이가 대안적으로 스플라이싱된 이소형에 기인한 리간드 결합 특이성을 방해하는 것에 추가하여 다중 FGF에 대한 수용체의 결합 친화력을 2-8배로 증가시킴을 나타낸다 (Ibrahimi et al., 2004).
이러한 종양 패널에서 S252W 돌연변이의 보급은 자궁내막유사 자궁내막암에서 이러한 돌연변이에 대한 적극적인 선택을 제안한다. 모든 FGF 리간드의 발현이 정상적인 순환 자궁내막 및 자궁내막암에서 조사되지 않았으나, 관 및 샘 상피의 기저 부분에서 FGF2의 발현을 현저하게 보고하는 여러 연구가 있다 (Moller et al., 2001; Sangha et al., 1997). 여러 연구가 또한 복잡한 과다형성 및 샘암종과 관련된 샘 상피에서 FGF2 발현의 증가를 나타내었다 (Gold et al., 1994). 자궁내막 상피 세포는 정상적으로 FGF2에 결합될 수 없는 FGFR2b 이소형만을 발현시킨다. 그러나, 이러한 세포에서 S252W 돌연변이의 획득은 S252W FGFR2b 수용체의 오토크린(autocrine) 활성화의 결과로 예상될 것이다. S252W 돌연변이도 돌연변이 수용체가 자궁내막 기질에서 고도로 발현되는 FGF9에 결합하도록 할 수 있다 (Tsai et al., 2002). S252W 돌연변이의 보급은 상이한 FGFR2 이소형이 자궁내막에서 지향성 상피-중간엽 시그널링을 매개함에 있어서 중요한 역할을 담당함을 시사한다.
세포주에서 K310R 및 A315T 및 일차 종양에서 S373C (S372C) 및 Y376C (Y375C)의 네 개의 추가적인 세포외 도메인 돌연변이를 동정하였고, 후자 돌연변이는 두 개의 독립적인 종양에서 나타났다 (도 1, 표 2). 추가적인 시스테인 잔기의 손실 또는 획득을 초래하는 FGFR2c (또는 파라로고스 FGFR3)의 세포외 돌연변이에 대해 수행된 기능성 연구는 이러한 미스센스 변화가 분자내 이황화 결합이라기 보다 분자간 이황화 결합의 형성으로 인해 항시적인 수용체 이량체화를 초래한다는 것을 입증하였다 (Naski et al., 1996). 생식세포에서, 세포외 막곁(juxtamembrane) FGFR2c 돌연변이 S372C 및 Y375C가 광범한 범위의 추가적인 임상적 특징을 갖는 두개골조기유착 증후군인 베어-스티븐슨(Beare-Stevenson) 이랑 피부(cutis gyrata) 증후군을 지닌 여러 개체에서 보고되었다 (Przylepa et al., 1996). FGFR3c에서의 파라로고스 돌연변이 (G370C 및 Y373C)도 심각한 연골형성저하증, 치사성 이형성증 I과 관련된다 (Rousseau et al., 1996). A315S 돌연변이와 유사하게, A315T 돌연변이가 FGFlO에 변칙적으로 결합되는 능력을 FGFR2c에 부여하는 듯 하다 (Ibrahimi et al., 2004).
본 발명자들은 트랜스멤브레인 도메인 내에서 C383R (C382C) 및 M392R (M391E)의 두 개의 돌연변이를 동정하였다. 본 발명자들이 동정한 C383R 돌연변이 는 연골무형성 환자의 95%가 넘는 환자를 설명하는 FGFR3의 파라로고스 위치에서의 비보존적인 미스센스 돌연변이(G380R)와 유사하다 (Shiang et al., 1994). FGFR3 G380R 돌연변이는 수용체 반감기를 증가시키고, 수용체가 리간드-유도된 내재화 (internalization)에 내성을 지니도록 하는 것으로 보고되었다 (Monsonego-Ornan et al., 2000). 최근의 연구로부터 야생형 수용체는 리간드 자극 후에 리소좀 분해되는 반면, 돌연변이체 G380R 수용체는 리소좀으로부터 혈장 막으로 재순환됨으로서 FGF 시그널링을 증대시킴이 지적되었다 (Cho et al., 2004). 신규한 M392R 돌연변이는 흑색가시 세포증을 지닌 크로우존 증후군과 관련된 널리-연구된 FGFR3 A391E 돌연변이에 인접한 두 잔기이다 (Meyers et al., 1995). A391E 돌연변이의 생물물리학적 분석은 이량체의 안정화와 일치하는 FGFR3 트랜스멤브레인 도메인의 이량체화 유리 에너지의 변화를 입증하였다 (Li et al., 2006). 비록 FGFR2c의 C382R 돌연변이가 항시적인 수용체 인산화 및 NIH3T3 세포의 형질전환을 초래하는 것으로 이전에 지적되었으나 (Li et al., 1997), 이러한 트랜스멤브레인 FGFR2b 돌연변이에 의한 수용체 활성화의 정확한 메카니즘의 설명은 여전히 조사되고 있다.
세포외 및 트랜스멤브레인 도메인 돌연변이에 추가하여, FGFR2 키나아제 도메인에서 상이한 네 개의 돌연변이가 동정되었다. 이들 중 2개인 N550K (N549K) 및 K660E (K659E)가 여하한 두개골조기유합 증후군에서 생식세포 돌연변이로서 동정되지는 않았으나, FGFR2c에서 유사한 N549H 돌연변이가 크로우존 증후군과 관련이 있었고 (Kan et al., 2002) 파라로고스 위치에서의 동일한 돌연변이가 연골형성저하증 (N540K) 및 치사성 이형성증 II (K650E)와 관련하여 FGFR3에서 확인되었다 (Naski et al., 1996). N549H 및 K650N 돌연변이체 FGFR2c 키나아제의 결정 구조는, 이러한 돌연변이가 키나아제 힌지 영역에서 신규한 자가억제 분자 브레이크를 느슨하게 함에 의해 키나아제를 활성화시킴을 나타낸다 (M. Mohammadi, unpublished results).
신규한 IVS10+2A>C 스플라이싱 돌연변이의 병리적 결과는 알려져 있지 않으나, 이것이 증가된 수용체 시그널링을 초래한다고 추측하게끔 한다. FGFR1-3의 세포내 막곁 영역에는 엑손 10의 다운스트림에 두 개의 아미노산인 발린 및 트레오닌 (VT)의 포함 또는 배제를 유도하는 대안적인 스플라이싱이 존재한다. IVS10+2A>C 돌연변이는 GCAAGT 비-정준(canonical) 스플라이스 공여체 부위를 초래하고 비-정준 GC-AG 공여체/수용체 쌍이 GA-AG 공여체/수용체 쌍에 비해 게놈에서 15-30x 보다 빈번하게 관찰되는 경우 (Burset et al., 2000; Chong et al., 2004) IVS10+2A>C 돌연변이는 +VT 이소형의 상대적인 비율의 증가를 초래할 수 있다. FGFR을 MAPK 및 PI3K 경로에 연결시키는 FRS2 어댑터(adaptor) 시그널링 단백질은 대안적으로 스플라이싱 VT를 포함하는 뮤린 FGFR1의 막곁 도메인의 서열에 결합된다 (Burgar et al., 2002). 이와 같이, IVS10+2A>C 돌연변이는 +VT 전사체의 수준을 증가시키는 더욱 효율적인 스플라이스 공여체 부위를 초래하는 듯하며, 이는 다시 증가된 FRS2a 매개된 시그널링을 야기할 것이다.
하나의 자궁내막 종양이 신규한 2bp 결실 2287-88 CT를 지니는 것으로 나타났는데, 이는 프레임변위 및 LTTNE으로부터 엑손 18의 마지막 코돈인 코돈 766에 미숙 트렁케이션(truncation)을 지니는 LTHNQStop으로의 변화를 야기한다. 이러한 2bp 결실은 FGFR2의 유사하게 트렁케이션된 C3 전사체와 유사한 방식으로 항시적으로 활성화된 트렁케이션된 FGFR2 수용체를 초래할 수 있거나 (Moffa et al., 2004) 대안적으로 단순히 방관 돌연변이를 나타낼 수 있다.
두 자궁내막 샘플이 두 개의 돌연변이를 지니는 것으로 나타났는데, N550K (N549K) 및 K310R을 지니는 AN3 CA MSI 포지티브 세포주와 S252W 및 Y376C (Y375C)를 지니는 MSI 네거티브 종양 1492이다. 동일한 종양에서 두 개의 추측상 우세한 활성화 돌연변이의 발견은 예상되지 않았다. 각 경우에 리간드-독립적인 S252W 또는 비특성화된 K310R을 따라 항시적인 리간드-독립적인 수용체 활성화를 야기하는 것으로 공지된 돌연변이가 존재함을 주목하는 것이 흥미로운데, 이는 추가의 선택적인 압력이 자궁내막 상피의 증가된 FGFR2 활성화를 위해 존재할 수 있음을 시사한다.
실시예 2
FGFR2
의 억제에 의한 자궁내막암의 치료
재료 및 방법
서열 분석
앞서 개시된 대로 돌연변이 분석을 수행하였다 (8). PCR 프라이머 서열을 M13 테일링(tailed)하고 두 방향으로 서열화를 수행하였다. 프라이머 서열은 제작자로부터 요청에 의해 이용가능하다.
세포 배양 및 시약
인간 자궁내막 MFE296 세포주를 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(European Collection of Cell Cultures)(Salisbury, Wiltshire, UK)로부터 구입하였다. 인간 자궁내막 세포주 AN3CA, HEClA, 이시가와, RL952, 및 KLE는 폴 굿페로우 박사(Dr. Paul Goodfellow)로부터 제공받았다 (Washington University, St. Louis, MO). MFE296 세포를 10% 우태아 혈청 (FBS), 2mM L-글루타민, 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 MEM에서 성장시켰다. AN3CA 세포를 10% FBS, 비필수 아미노산, 2mM L-글루타민, 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양하였다. HEClA 세포를 10% FBS 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 50% DMEM 및 50% RPMI 1640에서 배양하였다. 이시가와 및 RL952 세포를 10% FBS, 비필수 아미노산, 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 성장시켰다. KLE 세포를 10% FBS 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 50% DMEM 및 50% F-12 배지에서 성장시켰다. 모든 배지, FBS, 및 보충물을 인비트로겐(Invitrogen)(Carlsbad, CA)에서 구입하였다. 모든 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤된 대기에서 성장시켰다. PD173074를 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(St. Louis, MO)로부터 구입하고, DMSO에서 1 mM의 원액 농도로 재구성하고, -20℃에서 저장하였다. KHl-LV 렌티벡터 플라스미드를 고맙게도 마리아 에스, 소엔가스 박사(Dr. Maria S. Soengas)(University of Michigan, Ann Arbor, MI)로부터 받았고, pNHP, pVSV-G, 및 pTAT 렌티바이러스 패키징 플라스미드를 고맙게도 매튜 휴엔텔만 박사 (Dr. Matthew Huentelman) (Translational Genomics Research Institute, Phoenix, AZ)로부터 제공받았다.
shRNA 설계
FGFR2의 두 상이한 엑손 (엑손 2 및 엑손 15)을 표적화하는 두 독립적인 shRNA 구성물을 하기 서열에 대해 설계하였다: shRNA 표적화 엑손 2: TTAGTTGAGGATACCACATTA (서열번호 4; 누클레오티드 79-99, NM_022970); shRNA 표적화 엑손 15: ATGTATTCATCGAGATTTA (서열번호 5; 누클레오티드 1866-1884, NM_022970). 비침묵화 shRNA 구성물도 퀴아겐(Qiagen)으로부터의 비침묵화 siRNA sequence 서열 (서열번호 6; AATTCTCCGAACGTGTCACGT)에 기초하여 설계하였고 네거티브 대조군으로서 이용하였다. 상응하는 올리고누클레오티드를 어닐링하고 KHl-LV 렌티벡터로 클로닝시켰다. KHl-LV 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터는 H1 프로모터의 조절하에 짧은 헤어핀 서열과 인간 유비퀴틴-C 프로모터의 조절하에 GFP를 발현시킬 수 있고, 이는 형질도입 효율을 용이하게 모니터링할 수 있게 한다. 클로닝 전략은 요청시에 제작자로부터 이용가능하다.
렌티바이러스 생성
75-cm2 배양 플라스크를 50 mg/ml의 폴리-D-라이신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 플라스크 당 8 X 106개 세포의 밀도로 시딩된 HEK293FT 세포 (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 코팅하였다. 다음날, 세포를 7.1 ㎍의 pNHP, 2.8 ㎍의 pVSV-G, 0.5 ㎍의 pTAT, 및 3.5 ㎍의 KHl-LV로 슈퍼펙트(SuperFect) 트랜스펙션 시약 (Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 4:1의 슈퍼펙트 (㎕) 대 DNA (㎍)의 비로 제조자의 프로토콜에 따라 트랜스펙션시켰다. 바이러스를 함유하는 배지를 24시간 및 40시간 후에 수집하고, 합치고, 0.45-mm의 저(low)-단백질-결합 듀라포어(Durapore) 필터 (Millipore Corporation, Billerica, MA)를 통해 여과시켜 세포 데브리스를 제거하고, 바이러스 제조물을 등분하고, 사용시까지 -80℃에서 저장하였다.
렌티바이러스 형질도입
세포를 6웰 플레이트에 웰 당 4xlO5개 세포 밀도로 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 6 ㎍/ml의 폴리브렌 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 존재하에 렌티바이러스 원액으로 감염시켰다. 빈(empty) 벡터 및 비침묵화 shRNA 감염물을 각 실험의 대조군으로서 이용하였다. eGFP 가시화에 의해 측정시, 90%를 초과하는 형질도입 효율이 각 shRNA 실험에서 달성되었다 (데이터는 제시되지 않음).
성장 억제 검정
감염시킨 지 24시간 후에, 세포를 트립신처리하고 완전한 성장 배지의 96웰 플레이트에 웰 당 5,000개의 세포 밀도로 삼중으로 플레이팅하고, 증식을 설포르로다민 B (SRB) 검정 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 이용하여 평가하였다. 지시된 시점에서, 웰을 10% (wt/vol) 트리클로로아세트산으로 고정시키고, SRB로 30분 동안 염색하고, 1% (vol/vol) 아세트산으로 세척하였다. 단백질-결합된 안료를 10 mM Tris 염기 용액에 용해시키고, 흡광도를 510 nm에서 측정하였다. PD173074 약물 연구의 경우, 세포를 완전한 성장 배지에 96웰 플레이트의 웰 당 5,000개 세포 밀도로 플레이팅하였다. 다음날, 증가된 농도의 PD173074를 첨가하고 증식을 72시 간 후에 SRB 검정으로 평가하였다.
아폽토틱 세포의 아넥신 V-FITC 표지
아넥신 V-FITC 염색을 이용하여 제조자의 지시에 따라 아폽토시스를 진행하는 세포에 대한 포스파티딜세린 노출을 측정하였다 (BioVision, Inc. Mountain View, CA). 녹다운을 shRNA 구성물보다 siRNA를 이용하여 달성하였는데, 이는 shRNA도 FITC와 중복된 방출 스펙트럼을 지니는 GFP를 발현시키기 때문이다. 2.5x105개 세포를 6웰 플레이트의 웰 당 플레이팅하였다. 24시간 후에, 세포를 25nM의 비침묵화 (NS) siRNA 또는 FGFR2 siRNA X2로 리포펙타민 2000 트랜스펙션 시약을 이용하여 트랜스펙션시켰다. siRNA 듀플렉스가 실온에서 20분 동안 리포펙타민 2000과 복합체를 형성하게 하였고, 트랜스펙션을 37℃에서 24시간 동안 수행하였다. 트랜스펙션 48시간 후에, 부유 및 부착된 세포를 수집하고, 찬 PBS에서 세척하고, 아넥신 결합 완충액 (1OmM Hepes (pH 7.4), 140 mM NaCl, 2.5 mM CaC12)에 재현탁시키고, 500 ng/mL의 아넥신 V-FITC 및 1 ㎍/mL의 요오드화 프로피듐 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 염색하고, 아넥신 포지티브 세포에 대해 CyAn ADP 흐름 세포측정기 및 써미트(Summit) 소프트웨어 (버젼 4.3)(Dako Cytomation, Carpinteria, CA)를 이용하여 분석하였다. PD173074 연구의 경우, 세포를 6웰 플레이트의 웰 당 1x1O5개 세포 밀도로 플레이팅하였다. 24시간 후, 세포를 1 μM의 PD173074 또는 DMSO (비히클 대조군)로 처리하고, 지시된 시점에 아넥신 V-FITC로 염색하고, 흐름 세포측정에 의해 분석하였다.
세포 주기 분석
세포를 6웰 플레이트의 웰 당 1x1O5개 세포 밀도로 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 1 μM의 PD173074 또는 DMSO (비히클 대조군)로 처리하였다. 72시간 후, 세포를 개시된 대로 요오드화 프로피듐으로 염색하고 {Krishan, 1975 #28} 및 흐름 세포측정에 의해 분석하였다. 세포 주기 분석을 ModFit 소프트웨어 (Verity Software House, Inc. Topsham, ME)를 이용하여 수행하였다.
웨스턴 블롯 분석
세포를 60 mm2 디시에 디시 당 2x106개 세포 밀도로 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 밤새 18시간 동안 0.2% FBS에서 기아시키거나 완전한 성장 배지에 유지한 다음, 증가된 농도의 PD173074와 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 빙냉 PBS에서 세척하고, 키나아제 완충액 [2OmM Hepes pH7.4, 2mM EGTA, 1% 트리톤 XlOO, 10% 글리세롤, 1mM Na3VO4, 1mM NaF, lOOuM AEBSF, 및 1 정제/10 mL의 미니 컴플리트 프로테아제 억제제(Mini Complete Protease Inhibitor)(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)]에 용해시키고, 간단히 얼음 위에서 초음파처리하고, 단백질 농도를 소 감마글로불린 스탠다드를 지닌 퀵 스타트 브래드포드 시약(Quick Start Bradford Reagent) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 이용하여 산정하였다. 동등한 양의 단백질을 4-12% 구배 겔 상에서 SDS-PAGE에 의해 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 옮겼다 (Invitrogen, Carlsbad, CA). 막을 인산화된 총 AKT, ERK1/2, p38, STAT-3 및 STAT-5, PLCγ 및 총 PTEN으 로 항체로 면역블롯팅시켰다 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). FGFR2 발현을 BekC17 항체로 검출하였다 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). 호스래디쉬 과산화효소-컨주게이션된 염소 항-마우스 또는 항-토끼 이차 항체를 (Biomeda, Foster City, CA) 이용한 다음, 화학발광 염색하였다. shRNA 연구의 경우, 용해물을 shRNA 형질도입 48시간 후에 수집하고 상기 개시된 대로 프로세싱하였다.
통계적 분석
통계적 분석을 매킨토시의 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) 버젼 4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA)을 이용하여 수행하였다. IC50 값을 가변적인 기울기를 지니는 S자형 용량 반응의 비선형 회귀를 이용하여 용량-반응 분석에 의해 계산하였다. 아폽토시스 데이터를 일원 ANOVA에 의해 분석하였다. 처리 그룹간에 유의적인 차이가 스튜던트 t 테스트를 이용하여 측정되었다. 모든 P 값은 P<0.05일 때 유의적인 것으로 고려된다. 데이터를 평균±SE로 표시하였다.
결과
일차 자궁내막암에서 FGFR2, PTEN 및 KRAS2 돌연변이의 패턴:
동반 FGFR2 및 PTEN 돌연변이 및 상호 배타적인 FGFR2 및 KRAS2 돌연변이
PTEN 및 KRAS2 돌연변이가 자궁내막유사 자궁내막암에서 공통인 경우, 본 발명자들은 먼저 FGFR2 활성화가 PTEN의 기능-손실 돌연변이 및/또는 KRAS의 기능-획득 돌연변이를 포함하는 종양에서 발생하였는지를 결정하고자 하였다. 본 발명자들은 FGFR2 돌연변이 상태를 알기 위해 116개의 자궁내막 종양에서 PTEN의 모든 9 개 엑손 및 KRAS의 엑손 1을 서열화하였다. 이용가능한 제한적인 양의 DNA로 인해, 본 발명자들은 KRAS의 엑손 1만을 서열화하였는데, 엑손 1에서의 돌연변이가 자궁내막유사 자궁내막암의 KRAS 돌연변이 중 96%를 초과하는 돌연변이를 설명하기 때문이다 (The Catalog of Somatic Mutations in Cancer, http://www.sanger.ac. uk/genetics/CGP/cosmic). 돌연변이 분석은 종양의 70% (82/116)에서 PTEN 돌연변이를 나타내었다. FGFR2 돌연변이를 지니는 그러한 종양 중에서, 77% (14/18)가 또한 PTEN 돌연변이를 지니는데, 이는 FGFR2에서의 돌연변이가 종종 자궁내막유사 자궁내막 종양에서 PTEN 돌연변이와 나란히 발생함을 입증한다. KRAS 돌연변이는 종양의 12% (15/116)에서 동정되었다. GFR2 및 KRAS의 활성화 돌연변이는 상호 배타적이다. 뚜렷하게는, 하나의 종양이 FGFR2 (2290-91 del CT)에서 프레임변위 돌연변이를 소유하고 KRAS 돌연변이를 함유하였다. 그러나, 이러한 FGFR2 돌연변이의 병원성 특징이 알려져 있지 않으므로, 본 발명자들은 FGFR2의 활성화 돌연변이가 KRAS의 활성화 돌연변이와 상호 배타적인 것으로 결론내렸다. PTEN 비활성화 돌연변이는 KRAS 및 FGFR2 돌연변이 둘 모두와 나란히 발생하였다 (표 3).
FGFR2 단백질 서열 NP_075259.2; KRAS 단백질 서열 NP_203524.1; PTEN 단백질 서열 NP_000305.3에 대한 넘버링.
PTEN 비활성화에도 불구하고, 자궁내막암 세포에서
세포 치사를 유도하는 FGFR2의 shRNA 녹다운
자궁내막암에서 PTEN 비활성화의 배경 내에서 활성화 FGFR2 돌연변이의 발생 및 세포 생존을 증진시킴에 있어서 PI3K/AKT 경로의 공지된 역할이 주어지면, 본 발명자들은 다음으로 FGFR2의 억제가 PTEN 비활성화의 존재하에 세포 치사를 유도할 수 있었는지를 결정하고자 하였다. 세포 증식에 대한 FGFR2 발현의 shRNA 녹다운의 영향을 AN3CA 및 MFE296 자궁내막암 세포 둘 모두에서 평가하였는데, 둘 모두는 활성화 FGFR2 돌연변이를 지닌다. 또한, AN3CA는 PTEN 대립유전자 둘 모두에서 돌연변이를 지니고 PTEN을 발현시키지 않는다 (도 1E). 반면, MFE296은 PTEN 및 PIK3CA에 대한 야생형이다 (The Catalog of Somatic Mutations in Cancer, http://www.sanger.ac.uk/genelics/CGP/cosmic). AN3CA 및 MFE296 세포를 FGFR2를 표적화하는 두 독립적인 shRNAs로 렌티바이러스에 의해 형질도입시켰다. 세포 증식 및 생존력을 다수의 시점에 측정하였다. FGFR2의 녹다운은 AN3CA 및 MFE296 세포 둘 모두에서 세포 증식을 억제하였는데 (도 1A, B), 이는 표적화의 유효성이 심지어 PTEN 비활성화의 존재시에도 FGFR2를 활성화시켰음을 입증한다. FGFR2 발현의 녹다운을 확인하였고 ERK1/2 및 AKT의 인산화를 shRNA 형질도입 48시간 후에 웨스턴 블롯으로 조사하였다. 도 1C에 도시된 대로, FGFR2 shRNA 구성물 둘 모두는 90%를 초과하는 FGFR2 단백질의 녹다운을 초래하였다. 포스포-ERKl/2 수준의 감소가 FGFR2 녹다운 후 AN3CA 세포에서 나타났다. 세포를 0.2% FBS에서 성장시켰을 때, 효과는 더욱 현저하였다. 그러나, 세포주의 PTEN 돌연변이 상태와 일관되게, 세린 473에서 AKT 인산화의 변화는 관찰되지 않았다 (도 1C).
FGFR2 녹다운 후 관찰된 세포 치사가 아폽토시스의 유도로 인한 것임을 확인하기 위해, AN3CA 세포를 FGFR2에 대해 표적화된 siRNA로 트랜스펙션시키고 아넥신 V-FITC로 표지시켜 흐름 세포측정에 의해 노출된 포스파티딜세린을 검출하였다. FGFR2 siRNA로 트랜스펙션시킨 지 48시간 후에 비침묵화 siRNA 대조군에 비해 아넥신 V-FITC 포지티브 염색의 증가가 입증되었으며, 이는 이러한 세포가 아폽토시스를 진행하였음을 나타낸다 (도 1D). FGFR2의 녹다운 후 관찰된 세포 생존력의 극적인 억제는 이러한 세포가 종양원 중독을 입증할 수 있음을 시사한다. 활성화된 FGFR2는 따라서 자궁내막암의 가능한 치료 표적이다.
활성화된 FGFR2를 발현시키는 자궁내막암 세포는
pan-FGFR 억제제인 PD173074에 민감하다
6개의 자궁내막암 세포주 (2개는 돌연변이 N55OK FGFR2, 및 4개는 야생형 FGFR2)를 증가된 농도의 PD173074, pan-FGFR 티로신 키나아제 억제제로 처리하였다. 이 억제제는 FGFR (FGFRl, IC50=~25nM) 및 VEGF (VEGFR2, IC50=~100nM)에 대한 높은 선택성이 입증되어 있고 FGFR3에서의 활성화 돌연변이 및 활성화 t(4;14) 전위를 지니는 골수종 세포에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 나타났다 (10). 도 2A에 도시된 대로, 돌연변이체 FGFR2를 지니는 두 자궁내막암 세포주는 PD173074로의 억제에 대해 야생형 FGFR2를 지닌 세포주보다 10-40x 더 민감하였다. PTEN 대립유전자 둘 모두에 대해 기능-손실 돌연변이를 갖는 AN3CA 주는 가장 민감한 세포주였다. 아넥신 V-FITC 표지는, AN3CA 세포의 ~70%가 약물 처리한 지 96시간 후에 아폽토시스를 진행하고 있었음을 나타내었다 (도 3A). 또한, 세포 주기 분석은 PD173074 처리가 AN3CA 세포의 G1 정지를 유도하였음을 나타내었다 (도 3B). 도 2C에 도시된 대로, 항시적으로 활성인 FGFR2 키나아제 도메인 돌연변이 N550K는 외인성 FGF2 리간드의 부재 (-FGF2) 및 존재 (+FGF2)의 두 경우 모두에, 야생형 수용체 (WT)에 의해 유도된 것보다 높은 증식의 증가를 초래한다. 이러한 데이터는, N550K 돌연변이가 항시적으로 활성인 한편, 이것이 또한 완전한 활성을 위해 리간드를 요구함을 나타낸다. 뮤린 인터루킨-의존적인 프로-B BaF3 세포주를 보통 수용체 티로신 키나아제 기능을 위한 모델 시스템으로서 이용한다. BaF3 세포 증식 및 생존이 일반적으로 IL-3에 의존적이긴 하지만, 활성화된 수용체 티로신 키나아제 시그널링은 세포 생존력 및 증식을 유지하기 위해 IL-3을 대신할 수 있다. 증식 검정을 IL-3의 부재 및 1 nM의 FGF2 및 lO ㎍/ml의 헤어핀의 존재하에 수행하고, 5일 후에 바이어라이트 플러스 셀 프로리퍼레이션/시토톡시서티 키트(ViaLight Plus Cell Proliferation/Cytotoxicity Kit) (Lonza Rockland Inc)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 증식을 검정하였다.
pan-FGFR 억제 후 세포 치사는 ERK의 억제, AKT의 부분적인 억제와
관련되나, STAT3의 억제 또는 p38의 활성화와는 관련이 없다
p38의 지연 활성화와 결부된 ERK1/2, AKT, 및 STAT3/5의 인산화의 억제가 종양원 중독을 입증하는 세포에서 세포 치사의 유도와 관련된 공통적인 특징으로 보고되었다 (17). PD173074 처리가 이러한 경로에서 유사한 억제를 초래하는 지를 결정하기 위해, ERK1/2, AKT, STAT3/5, 및 p38 인산화 수준을 세 개의 세포주에서 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다 (2개는 PD173074에 민감하고 1개는 내성을 지님). STAT5 발현은 이러한 세 개의 세포주에서 웨스턴 블롯에 의해 검출될 수 없었다 (데이터는 제시되지 않음). 도 4에 도시된 대로, 3시간 동안 PD173074를 이용한 처리는 AN3CA 및 MFE296 세포의 ERK1/2 인산화에서 농도 의존적인 감소를 초래하였다. 야생형 FGFR2를 발현시키고 PD173074에 내성인 HEC1A 세포는 ERK1/2 인산화의 감소를 나타내지 않았다. 이것은 KRAS2 G12D 돌연변이로 인해, 세포주에서 MAPK 경로의 다운스트림 활성화와 일치한다 (The Catalog of Somatic Mutations in Cancer, http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic).
PD173074 처리도 AN3CA 및 MFE296 세포의 트레오닌 308 및 세린 473에서 AKT 인산화의 보통의 감소를 초래하였다. AKT의 활성화에 아무런 감소가 없었음이 HEClA 세포에서 입증되었다. 주목할만하게도, PD173074 처리는 시험된 임의의 세포주에서 STAT3 또는 p38 인산화에 영향을 미치지 않았다 (도 4). 본 발명자들은 또한 PLCγ 활성화를 조사하였는데, FGFR이 이 경로를 통해 시그널을 나타내었기 때문이다 (18); PD173074 처리 후 PLCγ 활성화에 있어서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
PD173074로 처리한 지 3시간 후에 STAT3 또는 p38 활성화에 대한 어떠한 변화도 입증되지 않았으나, 종양원 중독의 이전 모델은 p38의 활성화가 자연되어 종양원 억제 후 8-24시간에 최고에 도달함을 나타내었다 {Sharma, 2006 #17}. 따라서, 본 발명자들은 PD173074 처리 후 0 내지 72시간의 다양한 시점에 ERK1/2, AKT, STAT3, 및 p38 활성화를 평가하였다. 도 4에 제시된 데이터와 일관되게, PD173074 처리는 MFE296 및 AN3CA 세포에서 ERK1/2 활성화의 금속한 감소를 초래하였으나 HEClA 세포에서는 그렇지 않았다 (도 5A). 인산화된 ERK1/2는 PD173074로 처리한 지 24-48시간 후에 회복되기 시작했으나, 72시간까지 활성화 기준선에 도달하지 못했다. 인산화된 AKT의 감소도 MFE296 및 AN3CA 세포에서 검출되었고, 세린 473 보다 트레오닌 308에서 더욱 뚜렷하였다 (도 5A). AKT 활성화의 감소는 MAPK 인산화의 신속한 억제에 비해 지연되었고, AKT 인산화의 가장 큰 감소는 PD173074 처리 8시간 및 24시간 후에 검출되었다.
주목할만하게, AN3CA 및 MFE296 세포에서 시간 추이 동안 STAT3 또는 p38 활 성화의 변화가 검출되지 않았다 (도 5A). 세포를 0.2% FBS 배지에서 성장시켰을 때, PD173074의 처리는 완전한 성장 배지에서 관찰된 것과 유사하게, AN3CA 및 MFE296 둘 모두에서 MAPK 활성화의 감소를 초래하였다 (도 5B). 흥미롭게도, 0.2% FBS 배지 중 PD173074 처리는 AN3CA 및 MFE296 세포에서 트레오닌 308에서 포스포-AKT의 온당한 감소 및 세린 473에서 약간의 감소를 초래하였다. 0.2% FBS 중 AN3CA 세포주에서의 AKT의 항시적인 활성화는 아마도 PTEN 대립유전자 둘 모두의 비활성화때문일 것이다; 항시적인 AKT 활성화의 메카니즘은 이들이 야생형 PTEN 및 PIK3CA를 발현시키기 때문에, MFE296 세포에서 알려져 있지 않다.
논의
종양 진행의 분자적 기초를 이해하는 것은 다양한 암 유형에서 표적화된 요법의 개발 및 성공을 초래하였다 {Pickering, 2008 #27}. 다양한 시그널링 경로에 수반된 유전자에서의 활성화 돌연변이가 이러한 경로에 대한 종양의 "중독"을 초래할 수 있다는 입증이 증가되고 있다 {Sharma, 2007 #31}. 더욱이, 이러한 활성화 돌연변이는 잠재적인 치료 표적을 규명하도록 기능할 뿐만 아니라 이들의 존재는 경로 억제에 대한 임상적 반응도 예보할 수 있다 {Lynch, 2004 #30}. 그러나, 표적 억제에 대한 반응이 이러한 돌연변이가 발생하는 분자 환경에 의해 영향을 받음이 점점 뚜렷해지고 있다. 본 발명자들이 자궁내막유사 자궁내막 종양의 ~16%에서 FGFR2의 활성화 돌연변이를 이미 동정하였기 때문에, 본 발명자들은 본원에서 FGFR2 돌연변이가 자궁내막암에서 발생하는 유전적 환경을 조사하고자 하였다. 본 발명자들은 또한 FGFR2에 활성화 돌연변이를 소유하는 자궁내막암 세포에서 FGFR2 억제의 생물학적 결과를 조사함에 의해, 활성화된 FGFR2를 표적화하는 것의 치료적 잠재력을 평가하고자 하였다.
본 연구에서, 본 발명자들은 공지된 FGFR2 돌연변이 상태를 지니는 자궁내막유사 자궁내막 종양의 KRAS 및 PTEN 돌연변이 상태를 평가하였다. KRAS 및 FGFR2 돌연변이의 활성화는 동일한 종양에서 함께 발생하지 않았는데, 이것은 MAPK 경로를 통해 종양발생을 유도하는 FGFR2와 일관된다. PTEN 비활성화와 나란히 발생한 FGFR2 활성화는, 적어도 자궁내막 세포에서 FGFR2가 PI3K/AKT를 통해 이의 생물학적 효과를 매개하지 않음을 시사한다. 이것은 자궁내막 세포의 FGF7 또는 FGFlO 자극이 ERK1/2 활성화는 초래하나 AKT 활성화는 초래하지 않는다는 이전의 한 보고에 의해 뒷받침된다 (19). PTEN 및 KRAS 돌연변이는 이전 보고와 일관되게 동일한 종양 내에서 발생하였다 (20).
본 발명자들은 또한 FGFR2 시그널링이 AN3CA 및 MFE296 자궁내막암 세포주의 생존 및 증식에 필수적임을 지적하였는데, 이것은 종양원 중독을 고도로 시사한다. 이것은, 본 발명자들이 활성화된 FGFR2를 지니는 두 세포주가 선택적으로 pan-FGFR 억제제인 PD173074에 민감함을 입증한 PD173074 IC50 연구에 의해 뒷받침된다. AN3CA 세포가 PD173074에 가장 민감하였고 PTEN에 대한 돌연변이체라는 것이 주목할만하다. 자궁내막유사 자궁내막암에서 PTEN 돌연변이의 높은 발생률만 제공된다면, 이것은 특히 중요하다. PTEN 비활성화가 활성화된 수용체 경로로부터 항시적으로 활성화된 PI3K-AKT 시그널링으로 세포의 "종양원 중독"을 이동시켜서 수용체 억제에 대한 내성을 초래하다는 것이 제안되어 왔다 (21). 실제로, 감소된 PTEN 또는 PTEN이 없는 ErbB2-과발현 유방 종양은 비교적 트라스투주맵-함유 화학요법에 내성을 지닌다 (22, 23). 뚜렷이, PTEN의 손실에도 불구하고, pan-FGFR 억제제를 이용한 FGFR2의 억제는 AN3CA 세포에서 세포 치사 및 세포 주기 정지를 유도하였다. 따라서 AN3CA 세포는 여전히 FGFR2의 종양원성 시그널에 중독되어 있다. 흥미롭게도, PD173074 처리는 세포 주기 정지를 유도하였으나 MFE296 세포에서 개선된 아넥신 V 염색을 초래하지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 세포 주기 정지만이 MFE296 세포에서 PD173074의 효율을 책임지는지, 또는 알려지지 않은 메카니즘을 통한 아넥신 V 네거티브 세포 치사의 유도도 수반되는 지는 결정되어야 하는 채로 남아 있다.
Src, BCR-ABL 및 EGFR 활성화로부터 초래된 종양원 중독은 공통의 시그널링 캐스캐이드를 공유하는데, 그 이유는 종양원 비활성화가 인산화된 ERK, AKT 및 STAT3/5의 급속한 손실 및 p38의 지연 활성화와 관련되기 때문인 것으로 제안되어 왔다 (17). 본 발명자들은 완전한 성장 배지에서 FGFR2의 억제가 인산화된 ERK의 손실 및 AKT의 부분적인 억제와 관련되나 STAT3 또는 p38의 인산화 상태와는 아무런 영향이 없다고 본원에서 보고한다. 따라서, AN3CA 및 MFE296 세포에서 활성화된 FGFR2에 대한 중독의 기초가 되는 메카니즘은 종양원 중독의 다른 모델과 별개이다.
PD173074을 이용한 pan-FGFR 억제에 의해 유도된 세포 치사는 10% FBS 및 0.2% FBS 둘 모두가 보충된 배지에서 ERK1/2 활성화의 완전한 억제와 관련이 있다. 예상할 수 없게도, AN3CA 세포에서 돌연변이체 PTEN 상태가 주어지면, PD173074 처리는 10% FBS를 함유하는 배지에서 AKT 인산화의 부분적인 손실을 초래하였다. 따라서, FGFR2가 PTEN의 KAT 인산화 다운스트림을 매개할 수 있다. 실제로, 마우스 각질세포에서, 인슐린-유사 성장 인자-I는 단백질 키나아제 C-매개된 단백질 포스파타아제 조절을 수반하는 PI3K-독립적인 메카니즘을 통해 AKT 인산화를 변경시키는 것으로 나타났다 (24). AN3CA 및 MFE296 세포의 PD173074 처리 이후에 관찰된 감소된 AKT 인산화의 원인이 되는 메카니즘은 여전히 밝혀져야 한다. 그러나, AN3CA 세포에서 관찰된 PD173074 유도된 세포 치사는 AKT의 이러한 탈인산화와 무관한 것 같다. 0.2% FBS에서 실행된 농도-반응 곡선은 AN3CA 세포에 대해 10% FBS에서 생성된 것과 유사한 IC50을 생성하였다 (데이터는 제시되지 않음). 0.2% FBS에서 성장한 AN3CA 세포가 AKT의 뚜렷한 탈인산화를 나타내지 않았기 때문에, 이러한 데이터는 함께 AKT의 탈인산화가 이러한 세포주에서 PD173074 유도된 세포 치사에 요구되지 않음을 시사한다.
요약해 보면, 본 발명자들은 FGFR2 돌연변이가 일차 자궁내막유사 자궁내막암에서 PTEN 비활성화와 동시에 일어나고 KRAS2 돌연변이와 상호 배타적임을 지적하였다.
shRNA 녹다운에 의한 FGFR2 시그널링의 봉쇄 또는 pan-FGFR 억제제인 PD173074로의 치료는 활성화된 FGFR2를 발현시키는 자궁내막암 세포의 세포 주기 정지 및 세포 치사를 초래하였다. 그러나, FGFR2의 억제 이후에 변경된 세포 경로 는 종양원 중독이 입증된 다른 종양원의 억제 이후에 관찰된 것들과 별개이다. 자궁내막암에서 FGFR2 활성화와 관련된 종양원 중독의 신규한 메카니즘이 나올 듯하다. 이러한 데이터는 함께 항시적으로 활성인 돌연변이체 FGFR2의 억제가 이러한 유형의 암에서 PTEN의 빈번한 비활성화에도 불구하고 자궁내막암 환자에게 치료적으로 이로움을 시사한다.
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본 출원을 통해 인용된 모든 특허, 특허 출원, 공개문헌, 생성물 설명 및 프로토콜이 모든 목적을 위해 그 전체로서 본원에 참조로 포함된다.
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ggcgagggag cgcgcgcggc cgccacaaag ctcgggcgcc gcggggctgc atgcggcgta 120
cctggcccgg cgcggcgact gctctccggg ctggcggggg ccggccgcga gccccggggg 180
ccccgaggcc gcagcttgcc tgcgcgctct gagccttcgc aactcgcgag caaagtttgg 240
tggaggcaac gccaagcctg agtcctttct tcctctcgtt ccccaaatcc gagggcagcc 300
cgcgggcgtc atgcccgcgc tcctccgcag cctggggtac gcgtgaagcc cgggaggctt 360
ggcgccggcg aagacccaag gaccactctt ctgcgtttgg agttgctccc cgcaaccccg 420
ggctcgtcgc tttctccatc ccgacccacg cggggcgcgg ggacaacaca ggtcgcggag 480
gagcgttgcc attcaagtga ctgcagcagc agcggcagcg cctcggttcc tgagcccacc 540
gcaggctgaa ggcattgcgc gtagtccatg cccgtagagg aagtgtgcag atgggattaa 600
cgtccacatg gagatatgga agaggaccgg ggattggtac cgtaaccatg gtcagctggg 660
gtcgtttcat ctgcctggtc gtggtcacca tggcaacctt gtccctggcc cggccctcct 720
tcagtttagt tgaggatacc acattagagc cagaagagcc accaaccaaa taccaaatct 780
ctcaaccaga agtgtacgtg gctgcgccag gggagtcgct agaggtgcgc tgcctgttga 840
aagatgccgc cgtgatcagt tggactaagg atggggtgca cttggggccc aacaatagga 900
cagtgcttat tggggagtac ttgcagataa agggcgccac gcctagagac tccggcctct 960
atgcttgtac tgccagtagg actgtagaca gtgaaacttg gtacttcatg gtgaatgtca 1020
cagatgccat ctcatccgga gatgatgagg atgacaccga tggtgcggaa gattttgtca 1080
gtgagaacag taacaacaag agagcaccat actggaccaa cacagaaaag atggaaaagc 1140
ggctccatgc tgtgcctgcg gccaacactg tcaagtttcg ctgcccagcc ggggggaacc 1200
caatgccaac catgcggtgg ctgaaaaacg ggaaggagtt taagcaggag catcgcattg 1260
gaggctacaa ggtacgaaac cagcactgga gcctcattat ggaaagtgtg gtcccatctg 1320
acaagggaaa ttatacctgt gtagtggaga atgaatacgg gtccatcaat cacacgtacc 1380
acctggatgt tgtggagcga tcgcctcacc ggcccatcct ccaagccgga ctgccggcaa 1440
atgcctccac agtggtcgga ggagacgtag agtttgtctg caaggtttac agtgatgccc 1500
agccccacat ccagtggatc aagcacgtgg aaaagaacgg cagtaaatac gggcccgacg 1560
ggctgcccta cctcaaggtt ctcaagcact cggggataaa tagttccaat gcagaagtgc 1620
tggctctgtt caatgtgacc gaggcggatg ctggggaata tatatgtaag gtctccaatt 1680
atatagggca ggccaaccag tctgcctggc tcactgtcct gccaaaacag caagcgcctg 1740
gaagagaaaa ggagattaca gcttccccag actacctgga gatagccatt tactgcatag 1800
gggtcttctt aatcgcctgt atggtggtaa cagtcatcct gtgccgaatg aagaacacga 1860
ccaagaagcc agacttcagc agccagccgg ctgtgcacaa gctgaccaaa cgtatccccc 1920
tgcggagaca ggtaacagtt tcggctgagt ccagctcctc catgaactcc aacaccccgc 1980
tggtgaggat aacaacacgc ctctcttcaa cggcagacac ccccatgctg gcaggggtct 2040
ccgagtatga acttccagag gacccaaaat gggagtttcc aagagataag ctgacactgg 2100
gcaagcccct gggagaaggt tgctttgggc aagtggtcat ggcggaagca gtgggaattg 2160
acaaagacaa gcccaaggag gcggtcaccg tggccgtgaa gatgttgaaa gatgatgcca 2220
cagagaaaga cctttctgat ctggtgtcag agatggagat gatgaagatg attgggaaac 2280
acaagaatat cataaatctt cttggagcct gcacacagga tgggcctctc tatgtcatag 2340
ttgagtatgc ctctaaaggc aacctccgag aatacctccg agcccggagg ccacccggga 2400
tggagtactc ctatgacatt aaccgtgttc ctgaggagca gatgaccttc aaggacttgg 2460
tgtcatgcac ctaccagctg gccagaggca tggagtactt ggcttcccaa aaatgtattc 2520
atcgagattt agcagccaga aatgttttgg taacagaaaa caatgtgatg aaaatagcag 2580
actttggact cgccagagat atcaacaata tagactatta caaaaagacc accaatgggc 2640
ggcttccagt caagtggatg gctccagaag ccctgtttga tagagtatac actcatcaga 2700
gtgatgtctg gtccttcggg gtgttaatgt gggagatctt cactttaggg ggctcgccct 2760
acccagggat tcccgtggag gaacttttta agctgctgaa ggaaggacac agaatggata 2820
agccagccaa ctgcaccaac gaactgtaca tgatgatgag ggactgttgg catgcagtgc 2880
cctcccagag accaacgttc aagcagttgg tagaagactt ggatcgaatt ctcactctca 2940
caaccaatga ggaatacttg gacctcagcc aacctctcga acagtattca cctagttacc 3000
ctgacacaag aagttcttgt tcttcaggag atgattctgt tttttctcca gaccccatgc 3060
cttacgaacc atgccttcct cagtatccac acataaacgg cagtgttaaa acatgaatga 3120
ctgtgtctgc ctgtccccaa acaggacagc actgggaacc tagctacact gagcagggag 3180
accatgcctc ccagagcttg ttgtctccac ttgtatatat ggatcagagg agtaaataat 3240
tggaaaagta atcagcatat gtgtaaagat ttatacagtt gaaaacttgt aatcttcccc 3300
aggaggagaa gaaggtttct ggagcagtgg actgccacaa gccaccatgt aacccctctc 3360
acctgccgtg cgtactggct gtggaccagt aggactcaag gtggacgtgc gttctgcctt 3420
ccttgttaat tttgtaataa ttggagaaga tttatgtcag cacacactta cagagcacaa 3480
atgcagtata taggtgctgg atgtatgtaa atatattcaa attatgtata aatatatatt 3540
atatatttac aaggagttat tttttgtatt gattttaaat ggatgtccca atgcacctag 3600
aaaattggtc tctctttttt taatagctat ttgctaaatg ctgttcttac acataatttc 3660
ttaattttca ccgagcagag gtggaaaaat acttttgctt tcagggaaaa tggtataacg 3720
ttaatttatt aataaattgg taatatacaa aacaattaat catttatagt tttttttgta 3780
atttaagtgg catttctatg caggcagcac agcagactag ttaatctatt gcttggactt 3840
aactagttat cagatccttt gaaaagagaa tatttacaat atatgactaa tttggggaaa 3900
atgaagtttt gatttatttg tgtttaaatg ctgctgtcag acgattgttc ttagacctcc 3960
taaatgcccc atattaaaag aactcattca taggaaggtg tttcattttg gtgtgcaacc 4020
ctgtcattac gtcaacgcaa cgtctaactg gacttcccaa gataaatggt accagcgtcc 4080
tcttaaaaga tgccttaatc cattccttga ggacagacct tagttgaaat gatagcagaa 4140
tgtgcttctc tctggcagct ggccttctgc ttctgagttg cacattaatc agattagcct 4200
gtattctctt cagtgaattt tgataatggc ttccagactc tttggcgttg gagacgcctg 4260
ttaggatctt caagtcccat catagaaaat tgaaacacag agttgttctg ctgatagttt 4320
tggggatacg tccatctttt taagggattg ctttcatcta attctggcag gacctcacca 4380
aaagatccag cctcatacct acatcagaca aaatatcgcc gttgttcctt ctgtactaaa 4440
gtattgtgtt ttgctttgga aacacccact cactttgcaa tagccgtgca agatgaatgc 4500
agattacact gatcttatgt gttacaaaat tggagaaagt atttaataaa acctgttaat 4560
ttttatactg acaataaaaa tgtttctaca gatattaatg ttaacaagac aaaataaatg 4620
tcacgcaact taaaaaaaaa aaaaaaa 4647
<210> 2
<211> 822
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Val Ser Trp Gly Arg Phe Ile Cys Leu Val Val Val Thr Met Ala
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Ala Arg Pro Ser Phe Ser Leu Val Glu Asp Thr Thr
20 25 30
Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Thr Lys Tyr Gln Ile Ser Gln Pro Glu
35 40 45
Val Tyr Val Ala Ala Pro Gly Glu Ser Leu Glu Val Arg Cys Leu Leu
50 55 60
Lys Asp Ala Ala Val Ile Ser Trp Thr Lys Asp Gly Val His Leu Gly
65 70 75 80
Pro Asn Asn Arg Thr Val Leu Ile Gly Glu Tyr Leu Gln Ile Lys Gly
85 90 95
Ala Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Ala Cys Thr Ala Ser Arg Thr
100 105 110
Val Asp Ser Glu Thr Trp Tyr Phe Met Val Asn Val Thr Asp Ala Ile
115 120 125
Ser Ser Gly Asp Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Ala Glu Asp Phe Val
130 135 140
Ser Glu Asn Ser Asn Asn Lys Arg Ala Pro Tyr Trp Thr Asn Thr Glu
145 150 155 160
Lys Met Glu Lys Arg Leu His Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Lys
165 170 175
Phe Arg Cys Pro Ala Gly Gly Asn Pro Met Pro Thr Met Arg Trp Leu
180 185 190
Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Gln Glu His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys
195 200 205
Val Arg Asn Gln His Trp Ser Leu Ile Met Glu Ser Val Val Pro Ser
210 215 220
Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile
225 230 235 240
Asn His Thr Tyr His Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Pro His Arg Pro
245 250 255
Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn Ala Ser Thr Val Val Gly Gly
260 265 270
Asp Val Glu Phe Val Cys Lys Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile
275 280 285
Gln Trp Ile Lys His Val Glu Lys Asn Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Asp
290 295 300
Gly Leu Pro Tyr Leu Lys Val Leu Lys His Ser Gly Ile Asn Ser Ser
305 310 315 320
Asn Ala Glu Val Leu Ala Leu Phe Asn Val Thr Glu Ala Asp Ala Gly
325 330 335
Glu Tyr Ile Cys Lys Val Ser Asn Tyr Ile Gly Gln Ala Asn Gln Ser
340 345 350
Ala Trp Leu Thr Val Leu Pro Lys Gln Gln Ala Pro Gly Arg Glu Lys
355 360 365
Glu Ile Thr Ala Ser Pro Asp Tyr Leu Glu Ile Ala Ile Tyr Cys Ile
370 375 380
Gly Val Phe Leu Ile Ala Cys Met Val Val Thr Val Ile Leu Cys Arg
385 390 395 400
Met Lys Asn Thr Thr Lys Lys Pro Asp Phe Ser Ser Gln Pro Ala Val
405 410 415
His Lys Leu Thr Lys Arg Ile Pro Leu Arg Arg Gln Val Thr Val Ser
420 425 430
Ala Glu Ser Ser Ser Ser Met Asn Ser Asn Thr Pro Leu Val Arg Ile
435 440 445
Thr Thr Arg Leu Ser Ser Thr Ala Asp Thr Pro Met Leu Ala Gly Val
450 455 460
Ser Glu Tyr Glu Leu Pro Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp
465 470 475 480
Lys Leu Thr Leu Gly Lys Pro Leu Gly Glu Gly Cys Phe Gly Gln Val
485 490 495
Val Met Ala Glu Ala Val Gly Ile Asp Lys Asp Lys Pro Lys Glu Ala
500 505 510
Val Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Asp Asp Ala Thr Glu Lys Asp
515 520 525
Leu Ser Asp Leu Val Ser Glu Met Glu Met Met Lys Met Ile Gly Lys
530 535 540
His Lys Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Gln Asp Gly Pro
545 550 555 560
Leu Tyr Val Ile Val Glu Tyr Ala Ser Lys Gly Asn Leu Arg Glu Tyr
565 570 575
Leu Arg Ala Arg Arg Pro Pro Gly Met Glu Tyr Ser Tyr Asp Ile Asn
580 585 590
Arg Val Pro Glu Glu Gln Met Thr Phe Lys Asp Leu Val Ser Cys Thr
595 600 605
Tyr Gln Leu Ala Arg Gly Met Glu Tyr Leu Ala Ser Gln Lys Cys Ile
610 615 620
His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Thr Glu Asn Asn Val
625 630 635 640
Met Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Asn Asn Ile Asp
645 650 655
Tyr Tyr Lys Lys Thr Thr Asn Gly Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala
660 665 670
Pro Glu Ala Leu Phe Asp Arg Val Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp
675 680 685
Ser Phe Gly Val Leu Met Trp Glu Ile Phe Thr Leu Gly Gly Ser Pro
690 695 700
Tyr Pro Gly Ile Pro Val Glu Glu Leu Phe Lys Leu Leu Lys Glu Gly
705 710 715 720
His Arg Met Asp Lys Pro Ala Asn Cys Thr Asn Glu Leu Tyr Met Met
725 730 735
Met Arg Asp Cys Trp His Ala Val Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Lys
740 745 750
Gln Leu Val Glu Asp Leu Asp Arg Ile Leu Thr Leu Thr Thr Asn Glu
755 760 765
Glu Tyr Leu Asp Leu Ser Gln Pro Leu Glu Gln Tyr Ser Pro Ser Tyr
770 775 780
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Pro Asp Pro Met Pro Tyr Glu Pro Cys Leu Pro Gln Tyr Pro His Ile
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Asn Gly Ser Val Lys Thr
820
<210> 3
<211> 821
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Val Ser Trp Gly Arg Phe Ile Cys Leu Val Val Val Thr Met Ala
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Ala Arg Pro Ser Phe Ser Leu Val Glu Asp Thr Thr
20 25 30
Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Thr Lys Tyr Gln Ile Ser Gln Pro Glu
35 40 45
Val Tyr Val Ala Ala Pro Gly Glu Ser Leu Glu Val Arg Cys Leu Leu
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Lys Asp Ala Ala Val Ile Ser Trp Thr Lys Asp Gly Val His Leu Gly
65 70 75 80
Pro Asn Asn Arg Thr Val Leu Ile Gly Glu Tyr Leu Gln Ile Lys Gly
85 90 95
Ala Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Ala Cys Thr Ala Ser Arg Thr
100 105 110
Val Asp Ser Glu Thr Trp Tyr Phe Met Val Asn Val Thr Asp Ala Ile
115 120 125
Ser Ser Gly Asp Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Ala Glu Asp Phe Val
130 135 140
Ser Glu Asn Ser Asn Asn Lys Arg Ala Pro Tyr Trp Thr Asn Thr Glu
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Lys Met Glu Lys Arg Leu His Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Lys
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180 185 190
Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Gln Glu His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys
195 200 205
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Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile
225 230 235 240
Asn His Thr Tyr His Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Pro His Arg Pro
245 250 255
Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn Ala Ser Thr Val Val Gly Gly
260 265 270
Asp Val Glu Phe Val Cys Lys Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile
275 280 285
Gln Trp Ile Lys His Val Glu Lys Asn Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Asp
290 295 300
Gly Leu Pro Tyr Leu Lys Val Leu Lys Ala Ala Gly Val Asn Thr Thr
305 310 315 320
Asp Lys Glu Ile Glu Val Leu Tyr Ile Arg Asn Val Thr Phe Glu Asp
325 330 335
Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly Ile Ser Phe
340 345 350
His Ser Ala Trp Leu Thr Val Leu Pro Ala Pro Gly Arg Glu Lys Glu
355 360 365
Ile Thr Ala Ser Pro Asp Tyr Leu Glu Ile Ala Ile Tyr Cys Ile Gly
370 375 380
Val Phe Leu Ile Ala Cys Met Val Val Thr Val Ile Leu Cys Arg Met
385 390 395 400
Lys Asn Thr Thr Lys Lys Pro Asp Phe Ser Ser Gln Pro Ala Val His
405 410 415
Lys Leu Thr Lys Arg Ile Pro Leu Arg Arg Gln Val Thr Val Ser Ala
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Glu Tyr Glu Leu Pro Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Lys
465 470 475 480
Leu Thr Leu Gly Lys Pro Leu Gly Glu Gly Cys Phe Gly Gln Val Val
485 490 495
Met Ala Glu Ala Val Gly Ile Asp Lys Asp Lys Pro Lys Glu Ala Val
500 505 510
Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Asp Asp Ala Thr Glu Lys Asp Leu
515 520 525
Ser Asp Leu Val Ser Glu Met Glu Met Met Lys Met Ile Gly Lys His
530 535 540
Lys Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Gln Asp Gly Pro Leu
545 550 555 560
Tyr Val Ile Val Glu Tyr Ala Ser Lys Gly Asn Leu Arg Glu Tyr Leu
565 570 575
Arg Ala Arg Arg Pro Pro Gly Met Glu Tyr Ser Tyr Asp Ile Asn Arg
580 585 590
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595 600 605
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Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Thr Glu Asn Asn Val Met
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Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Asn Asn Ile Asp Tyr
645 650 655
Tyr Lys Lys Thr Thr Asn Gly Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro
660 665 670
Glu Ala Leu Phe Asp Arg Val Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser
675 680 685
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Pro Gly Ile Pro Val Glu Glu Leu Phe Lys Leu Leu Lys Glu Gly His
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725 730 735
Arg Asp Cys Trp His Ala Val Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Lys Gln
740 745 750
Leu Val Glu Asp Leu Asp Arg Ile Leu Thr Leu Thr Thr Asn Glu Glu
755 760 765
Tyr Leu Asp Leu Ser Gln Pro Leu Glu Gln Tyr Ser Pro Ser Tyr Pro
770 775 780
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence shRNA targeting exon 2 of FGFR2
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ttagttgagg ataccacatt a 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence shRNA targeting exon 15 of FGFR2
<400> 5
atgtattcat cgagattta 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence A non-silencing shRNA
<400> 6
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<211> 4644
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
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ggcgagggag cgcgcgcggc cgccacaaag ctcgggcgcc gcggggctgc atgcggcgta 120
cctggcccgg cgcggcgact gctctccggg ctggcggggg ccggccgcga gccccggggg 180
ccccgaggcc gcagcttgcc tgcgcgctct gagccttcgc aactcgcgag caaagtttgg 240
tggaggcaac gccaagcctg agtcctttct tcctctcgtt ccccaaatcc gagggcagcc 300
cgcgggcgtc atgcccgcgc tcctccgcag cctggggtac gcgtgaagcc cgggaggctt 360
ggcgccggcg aagacccaag gaccactctt ctgcgtttgg agttgctccc cgcaaccccg 420
ggctcgtcgc tttctccatc ccgacccacg cggggcgcgg ggacaacaca ggtcgcggag 480
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gcaggctgaa ggcattgcgc gtagtccatg cccgtagagg aagtgtgcag atgggattaa 600
cgtccacatg gagatatgga agaggaccgg ggattggtac cgtaaccatg gtcagctggg 660
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tcagtttagt tgaggatacc acattagagc cagaagagcc accaaccaaa taccaaatct 780
ctcaaccaga agtgtacgtg gctgcgccag gggagtcgct agaggtgcgc tgcctgttga 840
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agtatgaact tccagaggac ccaaaatggg agtttccaag agataagctg acactgggca 2100
agcccctggg agaaggttgc tttgggcaag tggtcatggc ggaagcagtg ggaattgaca 2160
aagacaagcc caaggaggcg gtcaccgtgg ccgtgaagat gttgaaagat gatgccacag 2220
agaaagacct ttctgatctg gtgtcagaga tggagatgat gaagatgatt gggaaacaca 2280
agaatatcat aaatcttctt ggagcctgca cacaggatgg gcctctctat gtcatagttg 2340
agtatgcctc taaaggcaac ctccgagaat acctccgagc ccggaggcca cccgggatgg 2400
agtactccta tgacattaac cgtgttcctg aggagcagat gaccttcaag gacttggtgt 2460
catgcaccta ccagctggcc agaggcatgg agtacttggc ttcccaaaaa tgtattcatc 2520
gagatttagc agccagaaat gttttggtaa cagaaaacaa tgtgatgaaa atagcagact 2580
ttggactcgc cagagatatc aacaatatag actattacaa aaagaccacc aatgggcggc 2640
ttccagtcaa gtggatggct ccagaagccc tgtttgatag agtatacact catcagagtg 2700
atgtctggtc cttcggggtg ttaatgtggg agatcttcac tttagggggc tcgccctacc 2760
cagggattcc cgtggaggaa ctttttaagc tgctgaagga aggacacaga atggataagc 2820
cagccaactg caccaacgaa ctgtacatga tgatgaggga ctgttggcat gcagtgccct 2880
cccagagacc aacgttcaag cagttggtag aagacttgga tcgaattctc actctcacaa 2940
ccaatgagga atacttggac ctcagccaac ctctcgaaca gtattcacct agttaccctg 3000
acacaagaag ttcttgttct tcaggagatg attctgtttt ttctccagac cccatgcctt 3060
acgaaccatg ccttcctcag tatccacaca taaacggcag tgttaaaaca tgaatgactg 3120
tgtctgcctg tccccaaaca ggacagcact gggaacctag ctacactgag cagggagacc 3180
atgcctccca gagcttgttg tctccacttg tatatatgga tcagaggagt aaataattgg 3240
aaaagtaatc agcatatgtg taaagattta tacagttgaa aacttgtaat cttccccagg 3300
aggagaagaa ggtttctgga gcagtggact gccacaagcc accatgtaac ccctctcacc 3360
tgccgtgcgt actggctgtg gaccagtagg actcaaggtg gacgtgcgtt ctgccttcct 3420
tgttaatttt gtaataattg gagaagattt atgtcagcac acacttacag agcacaaatg 3480
cagtatatag gtgctggatg tatgtaaata tattcaaatt atgtataaat atatattata 3540
tatttacaag gagttatttt ttgtattgat tttaaatgga tgtcccaatg cacctagaaa 3600
attggtctct ctttttttaa tagctatttg ctaaatgctg ttcttacaca taatttctta 3660
attttcaccg agcagaggtg gaaaaatact tttgctttca gggaaaatgg tataacgtta 3720
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taagtggcat ttctatgcag gcagcacagc agactagtta atctattgct tggacttaac 3840
tagttatcag atcctttgaa aagagaatat ttacaatata tgactaattt ggggaaaatg 3900
aagttttgat ttatttgtgt ttaaatgctg ctgtcagacg attgttctta gacctcctaa 3960
atgccccata ttaaaagaac tcattcatag gaaggtgttt cattttggtg tgcaaccctg 4020
tcattacgtc aacgcaacgt ctaactggac ttcccaagat aaatggtacc agcgtcctct 4080
taaaagatgc cttaatccat tccttgagga cagaccttag ttgaaatgat agcagaatgt 4140
gcttctctct ggcagctggc cttctgcttc tgagttgcac attaatcaga ttagcctgta 4200
ttctcttcag tgaattttga taatggcttc cagactcttt ggcgttggag acgcctgtta 4260
ggatcttcaa gtcccatcat agaaaattga aacacagagt tgttctgctg atagttttgg 4320
ggatacgtcc atctttttaa gggattgctt tcatctaatt ctggcaggac ctcaccaaaa 4380
gatccagcct catacctaca tcagacaaaa tatcgccgtt gttccttctg tactaaagta 4440
ttgtgttttg ctttggaaac acccactcac tttgcaatag ccgtgcaaga tgaatgcaga 4500
ttacactgat cttatgtgtt acaaaattgg agaaagtatt taataaaacc tgttaatttt 4560
tatactgaca ataaaaatgt ttctacagat attaatgtta acaagacaaa ataaatgtca 4620
cgcaacttaa aaaaaaaaaa aaaa 4644
Claims (36)
- 자궁내막 세포를 함유하는 생물학적 샘플에서 섬유모세포 성장 인자 수용체 2 (FGFR2)의 수용체 돌연변이를 검출하는 것을 포함하여, 피검체에서 자궁내막암 또는 전암을 검출하는 방법으로서, 상기 돌연변이가 FGFR2 수용체 활성화와 관련이 있고, 자궁내막암 세포 중 FGFR2의 상기 돌연변이의 존재가 피검체에서 자궁내막암 또는 전암을 진단하는 것(diagnostic)인, 피검체에서 자궁내막암 또는 전암을 검출하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 검출이 게놈 DNA, RNA 및 cDNA로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산에서 하나 이상의 누클레오티드 FGFR2 돌연변이를 스크리닝하는 것을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 FGFR2 수용체 활성화 돌연변이의 검출이 하기로 구성된 군으로부터 선택된 FGFR2의 하나 이상의 돌연변이를 검출하는 것인 방법:면역글로불린-유사 (Ig) 도메인 II 및 III 사이에 있는 접합부(junction)에서의 돌연변이; IgIII 도메인에서의 돌연변이; IgIII 도메인 및 트랜스멤브레인 (TM) 도메인 사이에 있는 접합부에서의 돌연변이; TM 도메인에서의 돌연변이; TM 도메인 및 티로신 키나아제 도메인 I 사이에 있는 접합부에서의 돌연변이; 티로신 키나아제 도메인 I에서의 돌연변이, 또는 티로신 키나아제 도메인 II에서의 돌연변 이.
- 제 1항에 있어서, 상기 돌연변이가 FGFR2에서 하나 이상의 아미노산 치환을 초래하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 FGFR2에서의 아미노산 치환이 (a) 서열번호 2(NP_075259.2) 또는 3(NP_000132.1)의 위치 252에서 S에서 W로의 돌연변이; (b) 서열번호 2 또는 3의 위치 310에서 K에서 R로의 돌연변이; (c) 서열번호 2 또는 3의 위치 315에서 A에서 T로의 돌연변이; (d) 서열번호 2의 위치 373 또는 서열번호 3의 위치 372에서 S에서 C로의 돌연변이; (e) 서열번호 2의 위치 376 또는 서열번호 3의 위치 375에서 Y에서 C로의 돌연변이; (f) 서열번호 2의 위치 383 또는 서열번호 3의 위치 382에서 C에서 R로의 돌연변이; (g) 서열번호 2의 위치 392 또는 서열번호 3의 위치 391에서 M에서 R로의 돌연변이; (h) 서열번호 2의 위치 548 또는 서열번호 3의 위치 547에서 I에서 V로의 돌연변이; (i) 서열번호 2의 위치 550 또는 서열번호 3의 위치 549에서 N에서 K로의 돌연변이; 또는 (j) 서열번호 2의 위치 660 또는 서열번호 3의 위치 659에서 K에서 E로의 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 돌연변이가 서열번호 2 및 3의 위치 252에서 S에서 W로의 돌연변이인 방법.
- 제 1항에 있어서, 둘 이상의 FGFR2 수용체 활성화 돌연변이가 검출되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 돌연변이가 개선된 리간드 결합, 무차별적(promiscuous) 리간드 친화력, 항시적인 수용체 이량체화, 손상된 재순환, 지연 분해, 또는 키나아제 활성화를 야기함으로써 FGFR2 수용체를 활성화시키는 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 돌연변이가 서열번호 1의 위치 2290-91에서 누클레오티드 C 및 T의 결실 또는 IVS10+2A>C 스플라이싱 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 1항에 있어서, PTEN 비활성화 돌연변이가 추가로 검출되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 암이 자궁내막유사 조직학적 아형인 방법.
- 제 1항에 있어서, 피검체가 인간이고, FGFR2가 항시적으로 활성인 돌연변이체인 방법.
- 유효량의 FGFR2 억제제를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 FGFR2 활성화 를 특징으로 하는 자궁내막암 또는 전암을 지닌 피검체에게 투여하는 것을 포함하여, 이 질환에 걸린 피검체에서 자궁내막암 또는 전암을 치료하는 방법으로서, 상기 FGFR2 억제제가 FGFR2 발현 또는 활성을 억제함으로써 피검체에서 자궁내막암의 성장 또는 증식을 효과적으로 억제하는 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 FGFR2 억제제가 FGFR2 유전자 또는 FGFR2 발현 생성물의 발현을 억제하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 FGFR2 억제제가 PD173074인 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 FGFR2 억제제가 소형 억제 RNA (siRNA), 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA) 또는 리보자임인 방법.
- 제 16항에 있어서, 상기 억제제가 shRNA인 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 shRNA가 FGFR2의 엑손 2 (서열번호 4) 및/또는 FGFR2의 엑손 15 (서열번호 5)를 표적으로 하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 억제제가 FGFR2에 대해 유도된 항체를 포함하는 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 항체가 FGFR2의 면역글로불린-유사 (Ig) 도메인 II 및 III 사이에 있는 링커 영역; FGFR2의 IgIII 도메인; FGFR2의 IgIII 도메인 및 트랜스멤브레인 (TM) 도메인 사이에 있는 접합부; FGFR2의 TM 도메인에서의 돌연변이; FGFR2의 TM 도메인 및 티로신 키나아제 도메인 I의 사이에 있는 접합부; FGFR2의 티로신 키나아제 도메인 I, 또는 FGFR2의 티로신 키나아제 도메인 II에 대해 유도되는 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 2 또는 3의 위치 252에서 S에서 W로의 돌연변이에 대해 유도되는 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 항체가 인간화된 항체인 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 억제제가 자궁내막암 세포에서 세포 주기 정지 또는 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 FGFR2가 항시적으로 활성인 돌연변이체인 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 FGFR2 억제제가 자궁내막암의 수술적 처치 후에 피검체에게 투여되어 수술 후 피검체에서 자궁내막암의 재발을 억제하는 방법.
- 자궁내막암 세포에서 FGFR2 돌연변이를 스크리닝하고자궁내막암 세포에서 FGFR2 활성화 돌연변이의 발견시에 자궁내막암의 유형을 FGFR2 활성화 유도된 자궁내막암으로 분류하는 것을 포함하여, 자궁내막암을 분류하는 방법.
- 제 26항에 있어서, 상기 분류가 자궁내막암을 지닌 피검체에 대한 치료법을 개발하는데 이용되고, 상기 방법이 FGFR2 돌연변이가 FGFR2 활성화를 유도하는 지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 26항에 있어서, 상기 FGFR2에서의 돌연변이가 면역글로불린-유사 (Ig) 도메인 II 및 III 사이에 있는 접합부에서의 돌연변이; IgIII 도메인에서의 돌연변이; IgIII 도메인 및 트랜스멤브레인 (TM) 도메인 사이에 있는 접합부에서의 돌연변이; TM 도메인에서의 돌연변이; TM 도메인 및 티로신 키나아제 도메인 I 사이에 있는 접합부에서의 돌연변이; 티로신 키나아제 도메인 I에서의 돌연변이, 또는 티로신 키나아제 도메인 II에서의 돌연변이인 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 돌연변이가 FGFR2에서 하나 이상의 아미노산 치환을 초래하는 방법.
- 제 29항에 있어서, 상기 FGFR2에서의 아미노산 치환이 (a) 서열번호 2(NP_075259.2) 또는 3(NP_000132.1)의 위치 252에서 S에서 W로의 돌연변이; (b) 서열번호 2 또는 3의 위치 310에서 K에서 R로의 돌연변이; (c) 서열번호 2 또는 3의 위치 315에서 A에서 T로의 돌연변이; (d) 서열번호 2의 위치 373 또는 서열번호 3의 위치 372에서 S에서 C로의 돌연변이; (e) 서열번호 2의 위치 376 또는 서열번호 3의 위치 375에서 Y에서 C로의 돌연변이; (f) 서열번호 2의 위치 383 또는 서열번호 3의 위치 382에서 C에서 R로의 돌연변이; (g) 서열번호 2의 위치 392 또는 서열번호 3의 위치 391에서 M에서 R로의 돌연변이; (h) 서열번호 2의 위치 548 또는 서열번호 3의 위치 547에서 I에서 V로의 돌연변이; (i) 서열번호 2의 위치 550 또는 서열번호 3의 위치 549에서 N에서 K로의 돌연변이; 또는 (j) 서열번호 2의 위치 660 또는 서열번호 3의 위치 659에서 K에서 E로의 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 26항에 있어서, 상기 돌연변이가 개선된 리간드 결합, 무차별적 리간드 친화력, 항시적인 수용체 이량체화, 지연 분해, 손상된 재순환, 또는 키나아제 활성화를 야기함으로써 FGFR2 수용체를 활성화시키는 방법.
- 제 26항에 있어서, 상기 돌연변이가 서열번호 1의 위치 2290-91에서 누클레오티드 C 및 T의 결실 또는 IVS10+2A>C 스플라이싱 돌연변이인 방법.
- 제 26항에 있어서, 상기 암이 자궁내막유사 조직학적 아형인 방법.
- 제 26항에 있어서, 상기 피검체가 인간이고, FGFR2가 항시적으로 활성인 돌연변이체인 방법.
- FGFR2 유전자의 돌연변이 부위 또는 이의 부근에 특이적으로 하이브리드화되는 올리고누클레오티드 또는 FGFR2 단백질의 돌연변이를 특이적으로 인식하는 항체; 및 자궁내막암을 진단하는데 사용되는 지침서를 포함하는 자궁내막암을 진단 또는 분류하기 위한 키트로서, 상기 돌연변이는 자궁내막 세포에서 FGFR2 단백질의 증가된 활성 또는 발현을 초래하는 것인, 자궁내막암을 진단 또는 분류하기 위한 키트.
- 제 35항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 2 또는 3의 위치 252에서 S에서 W로의 돌연변이에 대해 표적화되는 키트.
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