WO2013123861A1 - 一种能与egfr、her2、vegf高效结合的融合蛋白、其编码序列及用途 - Google Patents

一种能与egfr、her2、vegf高效结合的融合蛋白、其编码序列及用途 Download PDF

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WO2013123861A1
WO2013123861A1 PCT/CN2013/071516 CN2013071516W WO2013123861A1 WO 2013123861 A1 WO2013123861 A1 WO 2013123861A1 CN 2013071516 W CN2013071516 W CN 2013071516W WO 2013123861 A1 WO2013123861 A1 WO 2013123861A1
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fusion protein
seq
cancer
polypeptide
amino acid
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PCT/CN2013/071516
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钱其军
金华君
左明辉
黎江
丁娜
李林芳
吴孟超
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上海白泽生物科技有限公司
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    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • Fusion protein coding sequence thereof and use thereof
  • the invention relates to a fusion protein and its use. More specifically, the present invention relates to a fusion protein capable of efficiently binding to EGFR, HER2, VEGF, a nucleic acid encoding the same, and use in the preparation of a medicament or gene therapy for treating a malignant tumor. Background technique
  • Monoclonal antibody targets are clear, clinical application is safe and effective.
  • a total of 10 tumor monoclonal antibodies have been approved for marketing by the US FDA, and have become the first-line drugs for the treatment of various types of malignant tumors.
  • the full-length antibody has a large molecular weight and is difficult to enter the solid tumor tissue, and it is difficult to achieve an effective therapeutic concentration inside the tumor, thereby exerting an anti-tumor effect.
  • tumors are composed of heterogeneous cell populations. The treatment of a single defect is only effective for a part of tumor cells, while other tumor cells may escape treatment and become the root cause of tumor recurrence. Therefore, it is highly necessary to develop a small molecular weight, multi-target antibody-like protein drug.
  • the epidermal growth factor receptor (EGFR) family and vascular endothelial growth factor (VEGF) are often overexpressed in malignant tumor cells and are important targets for tumor therapy.
  • the EGFR family consists of four members, EGFR (HER1), HER2, HER3, and HER4, which are abnormally overexpressed in various types of tumor cells and are closely related to tumor proliferation and metastasis (Nature. 2001; 411 (6835): 355-65).
  • VEGF has the function of promoting angiogenesis. Tumor cells can secrete VEGF in a large amount, induce the formation of new blood vessels in tumor tissues, and rapidly expand the tumor volume (Nat Med. 1999; 5(12): 1359-64).
  • Herstatin is a natural inhibitor of the EGFR family signaling pathway and is encoded by an isoform of HER2 mRNA that is alternatively spliced during post-transcriptional processing.
  • the protein sequence consists of the first two domains of the HER2 extracellular domain and the eighth of the Her2 gene.
  • the intron is composed of 79 amino acids (Proc Natl Acad Sci US A. 1999; 96(19): 10869-74).
  • Herstatin binds with high affinity to EGFR and HER2 and inhibits EGFR family membership Heterogeneous or homodimers reduce receptor tyrosine phosphorylation and inhibit tumor cell growth.
  • VEGFR1 Vascular endothelial growth factor receptor 1, also known as FLT-1
  • VEGFR2 Vascular endothelial growth factor receptor 2, also known as KDR
  • extracellular domain polypeptides of Flt-1 or KDR block VEGF signaling pathway in vitro and inhibit the growth of vascular endothelial cells (Cancer Res. 2002; 9(8): 633-40).
  • the Flt-1 and KDR specific immunity in the extracellular segment (Ig-like) domains of immunoglobulin-like (e.g., Flt-1-like domain of Fltl-D2, KDR of 2 I g of 3 Ig-like domain KDR-D4) fusion can also effectively block cellular VEGF signaling pathway (Proc Natl Acad Sci US A. 2002; 99(17): 11393-8. Gene Ther. 2009; 16(l):10 -6).
  • VEGF extracellular segment
  • the present invention relates to a fusion protein capable of efficiently binding to EGFR, HER2, VEGF, a nucleic acid encoding the same, and use thereof in the preparation of a medicament or gene therapy for treating a malignant tumor.
  • the invention includes the following:
  • a first aspect of the invention relates to a fusion protein characterized by comprising three peptides of X, ⁇ , ⁇ , wherein:
  • X is a single copy or multiple copies of a polypeptide comprising the amino acid sequence encoded by Herrin, the eighth intron of the human gene, as shown in SEQ ID NO: 1 and capable of efficiently binding EGFR and HER2; preferably, the multiple copies are Double copy
  • Y is a peptide sequence comprising the first immunoglobulin-like domain of the extracellular region of the VEGF receptor FLT-1 represented by SEQ ID NO: 3 or/and the KDR extracellular domain of SEQ ID NO: a peptide sequence of three immunoglobulin-like domains and capable of efficiently binding to a polypeptide of VEGF;
  • Z is a polypeptide comprising an Fc segment of a human immunoglobulin.
  • the fusion protein according to the first aspect of the invention characterized in that the X, ⁇ , ⁇
  • the connection order is X, Y, ⁇ connected in sequence, or connected in the order of ⁇ , X, ⁇ , and the connections are connected in the order of the ends of the ⁇ to the C end;
  • the X, ⁇ of the fusion protein may be homologous in series or repeated in series.
  • the fusion protein according to the first aspect of the present invention characterized in that X, ⁇ , ⁇ of the fusion protein may be directly linked or connected by one or more spacers.
  • the fusion protein of the first aspect of the invention wherein the amino acid sequence comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 24.
  • polypeptide X is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and capable of efficiently binding EGFR and HER2, or comprises SEQ ID NO: 1
  • amino acid sequence formed by substitution and/or deletion and/or addition of one or several amino acid residues is shown and the polypeptide of EGFR and HER2 can be efficiently bound.
  • polypeptide Y is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or/and SEQ ID NO: 5 and capable of efficiently binding to VEGF, or comprises SEQ ID NO: 3 or a polypeptide of SEQ ID NO: 5 which has an amino acid sequence formed by substitution and/or deletion and/or addition of one or several amino acid residues and which is capable of efficiently binding to VEGF.
  • polypeptide Z is selected from the human immunoglobulin IgG subtypes IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 or IgM, the full-length Fc segment of IgA, or the Fc hinge region , CH2, part of CH3.
  • the fusion protein according to the first aspect of the present invention wherein the polypeptide Z is selected from human immunoglobulin IgG subtypes IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 or IgM, and the Fc of IgA is one or more amino acids. Residues are substituted and/or deleted and/or added to form peptide fragments.
  • a second aspect of the invention relates to a nucleic acid characterized by encoding a fusion protein of the invention.
  • the nucleic acid according to the second aspect of the present invention characterized in that the sequence comprises a nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 25 to SEQ ID NO: 34 or a homologous sequence thereof.
  • a third aspect of the invention relates to a carrier operatively coupled to the invention Nucleic acid.
  • the vector is selected from the group consisting of a plasmid, a recombinant virus (for example, a recombinant adenovirus or a recombinant adeno-associated virus), a phage, preferably, wherein the plasmid is a eukaryotic expression plasmid or a prokaryotic Expression plasmids such as pCDNA3.1, pDC315, pAAV-MCS.
  • a recombinant virus for example, a recombinant adenovirus or a recombinant adeno-associated virus
  • a phage preferably, wherein the plasmid is a eukaryotic expression plasmid or a prokaryotic Expression plasmids such as pCDNA3.1, pDC315, pAAV-MCS.
  • a fourth aspect of the invention relates to a method of preparing a fusion protein of the invention, comprising the steps of:
  • a synthesizing the expression cassette according to the amino acid sequence and coding sequence of each peptide of the fusion protein; b. inserting the expression cassette obtained in step a into a suitable vector, transforming into a suitable host cell, and extracting and purifying the plasmid;
  • the suitable vector described in step b is selected from the group consisting of a plasmid, a recombinant virus (for example, a recombinant adenovirus or a recombinant adeno-associated virus), a phage, preferably, wherein the plasmid is a eukaryotic expression plasmid or a prokaryotic expression plasmid, For example, pCDNA3.1, pDC315, pAAV-MCS;
  • the suitable host cell described in step b is a bacterium or a fungus, such as E. coli (eg DH5a);
  • the appropriate cells described in step c are eukaryotic expression host cells, such as 293 cells (embryonic kidney cells, purchased from the American Type Collection, ATCC).
  • eukaryotic expression host cells such as 293 cells (embryonic kidney cells, purchased from the American Type Collection, ATCC).
  • a fifth aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the fusion protein of the invention or the nucleic acid, optionally further comprising a pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant or excipient.
  • a sixth aspect of the invention relates to the use of said fusion protein or nucleic acid or vector or pharmaceutical composition for the preparation of an anti-tumor drug or a transgenic therapeutic drug.
  • the tumor is lung cancer, hepatocellular carcinoma, lymphoma, colon cancer, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, gastric cancer, cholangiocarcinoma, biliary cancer, esophageal cancer, renal cancer, glial Tumor, melanoma, pancreatic cancer or prostate cancer.
  • the structural schematic of the fusion protein is shown in Figure 1. Show. They were constructed by genetic engineering techniques from the coding DNA of Herstatin, Flt-1, KDR, and human IgG1 Fc segments. Spl and Sp2 are the cylinder writes of Spacerl and Spacer2 respectively. among them:
  • EVP1 The HERIN, Fltl-D2, and human IgGl Fc segments are sequentially linked by a protein Spacer.
  • EVP2 is composed of Fltl-D2, HERIN, and human IgGl Fc segments in turn via protein Spacer.
  • EVP3 is composed of HERIN, KDR-D3, and human IgGl Fc segments in turn via protein Spacer.
  • EVP4 is composed of KDR-D3, HERIN, and human IgG1 Fc segments in turn via protein Spacer.
  • EVP5 The human IgGl Fc segment is composed of HERIN, Fltl-D2, and HERIN.
  • EVP6 consists of Fltl-D2, HERIN, KDR-D3, human IgGl Fc segments in turn via the Protein Spacer linkage.
  • EVP7 The HERIN, HERIN, Fltl-D2, and human IgGl Fc segments are sequentially linked by a protein Spacer.
  • EVP8 The human IgGl Fc segment is composed of HERIN, Fltl-D2, KDR-D3, and the human IgGl Fc segment in turn.
  • EVP9 The HERIN, KDR-D3, HERIN, ⁇ -D2, and human IgGl Fc segments are sequentially linked by a protein Spacer.
  • EVP10 The HERIN, HERIN. KDR-D3, Fltl-D2, and human IgGl Fc segments are sequentially linked by a protein Spacer.
  • the fusion proteins EVP1, EVP3, EVP7, EVP9 are used to treat liver cancer xenografts in mice or to prepare a medicament for treating liver cancer xenografts.
  • the fusion proteins EVP1, EVP3, EVP7, EVP9 are used to treat ovarian cancer xenografts in mice, or to prepare a medicament for treating ovarian cancer xenografts.
  • the present invention relates to a fusion protein capable of efficiently binding to EGFR, HER2, VEGF, a nucleotide sequence encoding the same, and its use in the preparation of a medicament or gene therapy for treating a malignant tumor.
  • EGFR refers to the human epidermal growth factor receptor, also referred to as ERBB1 or HER1, and the official ID number of the NCBI gene bank is 1956, and the corresponding protein sequence number is NP-005219.2, NP- 958439.1, NP-958440.1, NP-958441.1.
  • HER2 in the present invention refers to the second member of the human epidermal growth factor receptor family (v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2), the official abbreviation for NCBI is ERBB2, and the gene ID number is 2064, corresponding protein.
  • the serial number is NP-004439.2, NP-001005862.1.
  • VEGF refers to human vascular endothelial growth factor A
  • NCBI official tube is called VEGFA
  • gene ID number is 7422
  • the corresponding protein number is 00 001020537.2, ⁇ 003367.4
  • Flt-l refers to human vascular growth factor receptor 1
  • NCBI officially refers to fms-related tyrosine kinase 1 (vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor receptor), and is also called VEGFR1, gene ID number.
  • the corresponding protein numbers are NP-002010.2, NP-001153392.1, NP-001153502.1, NP-001153503.1.
  • KDR refers to human vascular growth factor receptor 2
  • NCBI officially refers to the kinase insert domain receptor (a type III receptor tyrosine kinase), which is also referred to as VEGFR2, and the gene ID number is 3791, and the corresponding protein number is NP—002244.1.
  • Herin refers to the coding in the eighth intron of human Her2.
  • extracellular region means a segment in which a membrane protein is located outside the cell.
  • domain in the present invention refers to a region having a specific structure and an independent function in a protein biomacromolecule.
  • the number of amino acid residues in a common domain is between 100 and 400, and the smallest domain is only 40 to 50 amino acids. Residues, large domains can exceed 400 amino acid residues.
  • immunoglobulin-like domain means that the domain forms a spatial structure similar to immunoglobulin.
  • homologous tandem repeat in the present invention means repeating one or more times in units of one amino acid residue polypeptide.
  • spaced tandem repeat in the present invention means an amino acid residue polypeptide which is linked to another amino acid residue polypeptide, or is repeated one or more times in this unit.
  • Spacer refers to a polypeptide which functions to spatially interfere with two adjacent sequences of peptides.
  • tubularity in the present invention means a phenomenon in which the same amino acid has two or more cryptograms.
  • the "highly binding EGFR, HER2, VEGF" means that the affinity constant Kd is less than 9.9 X 10 7 mol/L, preferably less than 9.0 x 10 8 mol/L, further preferably less than 2.0 X 10 8 mol/L, more It is further preferably 5.0 10 9 mol/L, particularly preferably less than 7.0 x 10 10 mol/L, and most preferably less than 6.0 X 10 10 mol/L.
  • the X constituting the fusion protein is a single HERIN (the C-terminal 79 amino acids of Herstatin encoded by the 8th intron of human Her2).
  • the Y constituting the fusion protein is a Flt-1 single second domain peptide (Fltl-D2).
  • the Y constituting the fusion protein is a KDR single third domain peptide (KDR-D3).
  • the X constituting the fusion protein is HERIN, and Repeat 2 times.
  • Y constituting the fusion protein is a heterologous combination of a single Flt-1 second domain peptide segment and a single KDR third domain peptide segment.
  • X and Y constituting the fusion protein are homologous tandem repeats.
  • the X and Y constituting the fusion protein are repeated in series at intervals.
  • X, Y, Z constituting the fusion protein are linked to Spacer2 (SEQ ID NO: 13) via the protein Spacerl (SEQ ID NO: 11), respectively.
  • the X, Y, Z moieties constituting the fusion protein are linked by a protein Spacerl (SEQ ID NO: 11), Spacer2 (SEQ ID NO: 13), and are partially ligated directly.
  • fusion proteins are also exemplarily disclosed in the present invention.
  • it is used to treat liver cancer SMMC-7721 and ovarian cancer SK-OV3 subcutaneous xenografts in mice.
  • fusion protein coding sequences for gene therapy is also exemplarily disclosed in the present invention.
  • a plasmid, a recombinant adenovirus, and a recombinant adeno-associated virus are respectively used as vectors to carry a fusion protein-encoding gene for treating liver cancer Hep3B, lung cancer NCI-H460, and breast cancer Bcap-37 subcutaneous transplantation tumor in mice.
  • the plasmid is an eukaryotic expression plasmid.
  • the fusion protein of the present invention can be produced by the following method, which comprises the steps of: a. synthesizing an expression cassette according to the amino acid sequence and coding sequence of each peptide of the fusion protein; b. inserting the expression cassette obtained in step a into a suitable vector, Transform into a suitable host cell, extract and purify the plasmid;
  • the method specifically includes the following steps:
  • a synthesizing the expression cassette according to the amino acid sequence and coding sequence of each peptide of the fusion protein; b. inserting the expression cassette obtained in step a into the coR site of the pCDNA3.1 (+) vector, Convert to . co// ( DH5 ) , extract and purify the plasmid;
  • the purified plasmid was transfected into 293 cells, the transfected cells were cultured, the culture supernatant was collected, and the fusion protein was obtained by purification.
  • step c the plasmid obtained in step b is transfected into 293 cells using Lipofectamine 2000.
  • step c after transfection, preferably after 1 to 4 days of transfection, and more preferably 2 or 3 days after transfection, the transfected 293 cells are transferred to DMEM medium with neomycin. Medium, and the cells were cloned by limiting dilution method.
  • the above cloned cells are screened to establish a cell line stably transfected with the corresponding expression vector having neomycin resistance. Then, the stably transfected cells were expanded in a large amount by shaking flask culture, and the culture supernatant was collected. Preferably, wherein the screening is carried out for a period of from 18 to 24 days, preferably from 19 to 22 days, further preferably 21 days.
  • step c wherein the purification is carried out by gel filtration affinity chromatography.
  • the present invention Compared with the existing fusion protein, the present invention has the following beneficial effects:
  • the present invention combines a polypeptide having high ability to bind EGFR and HER2, and a polypeptide having high ability to bind VEGF, so that the fusion protein can simultaneously bind to EGFR, HER2 and VEGF, and simultaneously block three pathways of EGFR, HER2 and VEGF which are activated by tumor cells. It inhibits tumor cell growth and promotes its death. Simultaneous fusion of the antibody Fc peptide helps to prolong the in vivo half-life of the fusion protein, increase the antibody-antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, and enhance the anti-tumor effect of the fusion protein.
  • the fusion protein of the invention can be used for preparing antitumor drugs for preparing lung cancer, hepatocellular carcinoma, lymphoma, colon cancer, colorectal cancer, breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, gastric cancer, cholangiocarcinoma, biliary cancer, esophagus Drugs for cancer, kidney cancer, glioma, melanoma, pancreatic cancer or prostate cancer.
  • antitumor drugs for preparing lung cancer, hepatocellular carcinoma, lymphoma, colon cancer, colorectal cancer, breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, gastric cancer, cholangiocarcinoma, biliary cancer, esophagus Drugs for cancer, kidney cancer, glioma, melanoma, pancreatic cancer or prostate cancer.
  • FIG. 1 Schematic diagram of the fusion proteins EVP1, EVP2, EVP3, EVP4, EVP5, EVP6, EVP7, EVP8, EVP9, EVPIO. They were constructed by genetic engineering techniques from the coding DNA of Herstatin, Flt-1, KDR, and human IgGl Fc segments. Spl and Sp2 are shorthand for Spacerl and Spacer2 respectively.
  • Figure 2 Affinity of fusion proteins EVP1, EVP2, EVP3, EVP4, EVP5, EVP6, EVP7, EVP8, EVP9, EVPIO and control HERI peptides with VEGF.
  • FIG. 3 Fusion proteins EVP1, EVP2, EVP3, EVP4, EVP5, EVP6, EVP7, EVP8, EVP9, EVPIO and control The affinity of the HERI polypeptide to the extracellular domain of EGFR.
  • FIG. 4 Fusion proteins EVP1, EVP2, EVP3, EVP4, EVP5, EVP6, EVP7, EVP8, EVP9, EVPIO and control Affinity of the HERIN polypeptide to the extracellular domain of HER2.
  • Figure 5 Statistical analysis of the volume of SMMC-7721 xenografts in the control group (PBS, HERIN peptide) and the treatment group (EVP1, EVP3, EVP7, EVP9) at different time points.
  • Figure 6 Statistical analysis of the volume of SK-OV3 xenografts in the control group (PBS, HERIN peptide) and the treatment groups EVP1, EVP3, EVP7, EVP9 at different time points.
  • Figure 7 shows the results of the efficacy of the plasmid carrying the fusion protein (EVP1, EVP5) coding sequence in the treatment of hepatoma Hep3B xenografts in mice.
  • Figure 8 Statistical results showing the efficacy of recombinant adenovirus (EVP5, EVP9) carrying the fusion protein coding sequence for the treatment of NCI-H460 xenografts in mice.
  • Figure 9 Statistical analysis of the efficacy of recombinant adeno-associated virus carrying the fusion protein (EVP1, EVP5) coding sequence in the treatment of breast cancer Bcap-37 xenografts in mice. detailed description
  • Example 1 Synthesis of fusion protein expression cassette and construction of expression vector
  • the entire fusion amino acid sequence and the coding DNA expression frame are spliced, wherein:
  • amino acid residue sequence of HERIN is:
  • the amino acid residue sequence of Fltl-D2 is:
  • the coding sequence of Fltl-D2 is:
  • the amino acid residue sequence of KDR-D3 is:
  • ⁇ 3V3XDDVV30VDVX L3 1D311D11D3L3DD3YDD31DYDD1;
  • the fusion protein EVP3 is composed of the signal peptide -HERIN-Spacerl-KDRD3- Spacer2-Fc, and its amino acid sequence is:
  • the fusion protein EVP4 is composed of the signal peptide -KDRD3-Spacerl-HERIN-Spacer2-Fc in turn, and its amino acid sequence is:
  • the fusion protein EVP5 is composed of the signal peptide -HERIN-Spacerl-FltlD2-Spacer2-HERIN-Fc, and its amino acid sequence
  • the fusion protein EVP9 is composed of a signal peptide-HERIN-KDRD3-Spacerl-HERIN-Spacer2-FltlD2-Fc fusion, which
  • the fusion protein EVP10 is composed of a signal peptide -HERIN-Spacerl-HERIN-KDRD3-Spacer2-FltlD2-Fc fusion, and its ammonia
  • EVP1 SEQ ID NO: 25
  • EVP2 SEQ ID NO: 26
  • EVP3 DNA coding sequence of EVP3
  • EVP4 SEQ ID NO: 28
  • EVP5 SEQ ID NO: 29
  • EVP6 DNA coding sequence of EVP6
  • EVP7 SEQ ID NO: 31
  • EVP8 SEQ ID NO: 32
  • EVP9 SEQ ID NO: 33
  • DNA coding sequence of EVP10 SEQ ID NO: 34
  • the plasmid purification kit extracts and purifies the plasmid to obtain a high quality plasmid of each recombinant expression vector.
  • the coding sequence of each fusion protein is as follows:
  • the high quality plasmid of each recombinant expression vector obtained in Example 1 was constructed and purified, and transfected into 293 cells (embryo kidney cells, purchased from the American Type Collection, ATCC) using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Two days later, the transfected 293 cells were transferred to DMEM medium with neomycin, and the cells were cloned by limiting dilution. After 21 days of screening, a cell line stably transfected with the corresponding expression vector with neomycin resistance was established. Thereafter, a large number of stably transfected cells were cultured by shaking flask culture, and the culture supernatant was collected, and each fusion protein was purified by gel filtration affinity chromatography.
  • EVP1, EVP2, EVP3, EVP4, EVP5, EVP6, EVP7, EVP8, EVP9, and EVP10 are 48.7 KD, 48.7 KD, 47.8 KD, 47.8 KD, 57.0 KD, 58.6 KD, 57.0 KD, 58.6 KD, and 66.9 KD, respectively.
  • 66.9KD purified fusion protein was determined by ELISA method.
  • Example 3 Affinity determination of fusion protein and VEGF
  • Recombinant human VEGF165 protein (Sino Biological Inc.) was embedded in 96 wells (10 pmol per well), incubated at 4 °C for 24 hours, and non-specific binding sites were blocked with 1% BSA solution. Then different concentrations (0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 1, 5, 10, 50, 100 pM) of the fusion protein to be tested (the fusion protein EVP1-EVP10 prepared in Example 2) and the control HERIN (trusted Shanghai Botai Biotechnology) Technology Co., Ltd. synthesized) was added to the wells ( ⁇ per well) and incubated at 37 °C for 2 hours.
  • Example 4 Affinity determination of fusion protein and EGFR
  • Recombinant human EGFR protein (Sino Biological Inc.) was embedded in 96 wells and incubated at 4 °C for 24 hours, blocking non-specific binding sites with 1% BSA solution. Then, the fusion protein to be tested (the fusion protein EVP1-EVP10 prepared in Example 2) and the control peptide HERIN (combined by Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.) were added to the wells ( ⁇ per well). After incubating for 2 hours at 37 ° C, the unbound protein was washed away with PBS, and the amount of fusion protein bound to EGFR was quantitatively determined by Herstatin's ELISA assay kit (Upstate Biotechnology). The results showed that the fusion proteins EVP1, EVP2, EVP3.
  • EVP4, EVP5, EVP6, EVP7, EVP8, EVP9, EVP10 all bind efficiently to EGFR, and the binding ability is not significantly different from that of the control HERIN.
  • HER2 protein Recombinant human HER2 protein (Sino Biological Inc.) was embedded in 96 wells and incubated at 4 °C for 24 hours, blocking non-specific binding sites with 1% BSA solution. Then, the fusion protein to be tested (the fusion protein EVP1-EVP10 prepared in Example 2) and the control peptide HERIN (combined by Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.) were added to the wells ( ⁇ per well). Incubate for 2 hours at 37 ° C, wash away unbound protein in PBS, and quantify the amount of fusion protein bound to HER2 by Herstatin's ELISA assay kit (Upstate Biotechnology). The results showed that the fusion proteins EVP1, EVP2, EVP3.
  • EVP4, EVP5, EVP6, EVP7, EVP8, EVP9, EVP10 could efficiently bind to HER2, and the binding ability was not significantly different from that of the control HERIN.
  • Example 6 Affinity constant measurement of fusion protein with EGFR, HER2, VEGF
  • the fusion proteins EVP1 and EVP2 prepared in Example 2 were separately added to a 96-well plate (10 ⁇ ⁇ / ⁇ 1, 200 ⁇ 1) and then loaded to anti-human IgG Fc capture.
  • Recombinant humans with different concentrations 800nM, 400nM, 200nM, 100nM, 50nM, 25nM
  • bio-molecular interaction instrument Octet Red 96
  • biosensor Anti-Human IgG Fc Capture biosensor, Octet
  • Example 7 Fusion protein for treating liver cancer in mice SMMC-7721 xenografts 4-5 week old nude mice were subcutaneously inoculated with liver cancer SMMC-7721 cell line (purchased from Shanghai Life Science Research Institute of Biochemistry and Cell Biology) IxlO 7 , two weeks later, the tumor-bearing mice were given weekly intravenous injection of the control peptide HERIN (commissioned by Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd., injection dose of 2.5mg/kg) or fusion proteins EVP1, EVP3, EVP7, EVP9 (injection dose was 2.5 mg/kg, respectively), and the blank control group was injected with the same volume of PBS to calculate the change of tumor volume with time.
  • the control peptide HERIN commissioned by Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd., injection dose of 2.5mg/kg
  • fusion proteins EVP1, EVP3, EVP7, EVP9 injection dose was 2.5 mg/kg, respectively
  • the mouse tail vein was injected with the control peptide HERIN (commissioned by Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd., injected at a dose of 2.5 mg/kg) or the fusion proteins EVP1, EVP3, EVP7, EVP9 (injection dose was 2.5 mg/kg, respectively), blank control
  • the same volume of PBS was injected into the group to calculate the change of tumor volume with time.
  • the results showed that the tumor volume increased by more than 8 times after 3 weeks in the control group, but the tumor size of the fusion proteins EVP1, EVP3, EVP7 and EVP9 was not obvious. Change, the effect is significantly better than
  • the control peptide was treated with the HERIN treatment group (see Figure 6).
  • Example 9 A plasmid carrying a fusion protein coding sequence for treating liver cancer in mice Hep3B xenografts
  • mice Four-week-old nude mice were subcutaneously inoculated with liver cancer Hep3B (purchased from ATCC) cell line l xlO 7 . Four weeks later, the tumor-bearing mice were given a nano-plasmid DNA solution (150 ⁇ l each) containing pCDNA3.1-EVP1 and pCDNA3.1-EVP5 in the tail vein, and the control group was injected with the same volume of nano-plasmid wrapped with pCDNA3.1. DNA, statistics of changes in tumor volume over time. The results showed that the tumor volume increased by more than 4 times after 3 weeks in the control group, while the size of the tumor in the treatment group did not change significantly (see Figure 7).
  • Example 10 Recombinant adenovirus carrying fusion protein coding sequence for treatment of lung cancer in vivo NCI-H460 xenograft tumor
  • the fusion protein £ ⁇ 5 coding sequence (8£0 10 0:29) and EVP9 (SEQ ID NO: 33) synthesized in Example 1 were inserted into the pRI315 vector (Zhongyuan Zhengyang Gene Technology Co., Ltd.) RI site, and transformed into E. coli (DH5a), after sequencing, the plasmid was extracted using Qiagen's Plasmid Purification Kit. Using Lipofectamine (Invitrogen), it was co-transfected with pBHGlox (delta) El, 3Cre (Microbix Biosystems Inc) to 293 strain (ATCC), and adenovirus plaques appeared 9-14 days after co-transfection.
  • the plaque was purified and packaged to obtain the adenovirus Ad5-EVP5 and Ad5-EVP9 D adenovirus carrying the EVP1 or EVP5 fusion protein coding cassette.
  • the adenovirus was multiplied in 293 cells, and the adenovirus was purified by cesium chloride gradient centrifugation. TCID50 was applied. Method to detect adenovirus titer.
  • mice 4-5 weeks old mice were subcutaneously inoculated with lung cancer NCI-H460 (purchased from ATCC) cell line 5xl0 6 .
  • NCI-H460 purchased from ATCC
  • tumor-bearing mice were given a tail vein injection of Ad5-EVP5, Ad5-EVP9 (lxl0 9 pfu). , ⁇ ) , the control group injected the same volume of PBS, statistics The change in tumor volume over time. The results showed that the tumor volume increased by more than 5 times after 3 weeks in the control group, while the size of the tumor in the treatment group did not change significantly (see Figure 8).
  • Example 11 Recombinant adeno-associated virus carrying the fusion protein coding sequence for treatment of breast cancer in mice Bcap-37 transplanted tumor
  • the fusion protein EVP1 (SEQ ID NO: 25) and EVP5 coding sequence (SEQ ID NO: 29) synthesized in Example 1 were inserted into the pAAV-MCS vector ( Stratagene ) EcoRI site and transformed into . ( DH5 « ). Thereafter, the plasmid was extracted using Qiagen's plasmid purification kit.
  • the recombinant adeno-associated viruses rAAV-EVP1 and rAAV-EVP5 were obtained by co-transfection with pAAV-RC and pHelper ( Stratagene) from 293 cells (ATCC) by calcium phosphate transfection.
  • mice 4-5 weeks old mice were subcutaneously inoculated with breast cancer Bcap-37 (purchased from ATCC) cell line 5xl0 6 .
  • tumor-bearing mice were given a tail vein injection of rAAV-EVP1, rAAV-EVP5 ( 2xlO n Vg, ⁇ ), the control group was injected with the same volume of PBS, and the change of tumor volume with time was counted.
  • the results showed that the tumor volume increased by more than 10 times after 5 weeks in the control group, while the size of the tumor in the treatment group did not change significantly (see Figure 9).

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Abstract

本发明公开了一种能与EGFR、HER2、VEGF高效结合的融合蛋白、其编码核苷酸序列及在治疗恶性肿瘤中的应用。

Description

一种能与 EGFR、 HER2、 VEGF高效结合的
融合蛋白、 其编码序列及用途 技术领域
本发明涉及一种融合蛋白及其用途。 更具体地说， 本发明涉及一 种能与 EGFR、 HER2、 VEGF 高效结合的融合蛋白、 其编码核酸及 在制备用于治疗恶性肿瘤的药物或基因治疗药物中的应用。 背景技术
单克隆抗体靶标明确， 临床应用安全性好、 疗效明显， 目前共有 10 个肿瘤单克隆抗体经美国 FDA批准上市销售， 已成为多种类型恶性肿 瘤治疗的一线药物。 然而， 全长抗体分子量大， 不易进入实体瘤组织， 难以在肿瘤内部达到有效治疗浓度， 从而发挥抗肿瘤疗效。 另一方面， 肿瘤是由异质性细胞群体组成， 单一耙点的治疗只针对一部分肿瘤细胞 发挥疗效， 而其它肿瘤细胞则可能逃脱治疗， 成为肿瘤复发的根源。 因 而， 非常必要研制分子量小、 多靶点的类抗体蛋白药物。
表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 家 族、 血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor, VEGF ) 常 在恶性肿瘤细胞中过表达， 是肿瘤治疗的重要耙标。 EGFR家族包括 4 个成员， 分别为 EGFR (HER1)、 HER2、 HER3、 HER4, 它们在多种 类型肿瘤细胞中异常过量表达， 与肿瘤的增殖与转移紧密相关（Nature. 2001; 411(6835):355-65 ) 。 VEGF有促进血管生成的作用， 肿瘤细胞可 大量分泌 VEGF, 诱导肿瘤组织新生血管的生成， 使肿瘤体积快速扩张 ( Nat Med. 1999; 5(12): 1359-64 ) 。
Herstatin 是 EGFR 家族信号通路的天然抑制因子， 由 HER2 mRNA在转录后加工过程中选择性剪接形成的异构体所编码，其蛋白序 列由 HER2胞外区前两个结构域及 Her2基因的第 8个内含子所编码 79 个氨基酸所构成 ( Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96(19): 10869-74 ) 。 Herstatin 能与 EGFR和 HER2高亲和力结合，抑制 EGFR家族成员形 成异源或同源二聚体，降低受体酪氨酸磷酸化水平，抑制肿瘤细胞生长。 研究表明， Herstatin C末端的 79个氨基酸（ HERIN )也具有与 EGFR 及 HER2 高效特异结合的特性 ( FEBS Lett. 2004;568(1-3):163-6 ) 。 VEGFR1 (Vascular endothelial growth factor receptor 1, 也称作 FLT-1), VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2， 也称 作 KDR) 是 VEGF的受体。 研究表明， Flt-1或 KDR的胞外区多肽可 在体外阻断 VEGF信号通路， 抑制血管内皮细胞的生长（Cancer Res. 2002; 9(8):633-40 ) 。 通过基因工程技术， 将 Flt-1与 KDR胞外区段中 的某些特定免疫球蛋白样（ Ig样）结构域（如 Flt-1的第 2 Ig样结构域 Fltl-D2, KDR的第 3 Ig样结构域 KDR-D4 ) 融合， 也可有效阻断细胞 VEGF信号通路（ Proc Natl Acad Sci US A. 2002; 99(17):11393-8. Gene Ther. 2009; 16(l):10-6 )。然而，目前仍不存在能同时抑制 EGFR、HER2、 VEGF 三条信号通路的蛋白类抑制分子。 发明内容
本发明涉及一种能与 EGFR、 HER2、 VEGF高效结合的融合蛋白、 其编码核酸及其在制备用于治疗恶性肿瘤的药物或基因治疗药物中的 应用。 具体而言， 本发明包括以下内容：
本发明的第一方面涉及一种融合蛋白， 其特征在于包含 X、 Υ、 Ζ 三个来源的肽段， 其中：
X为单拷贝或多拷贝的如 SEQ ID NO: 1所示的包含人类 基因第 8个内含子 Herin编码的氨基酸序列且能高效结合 EGFR与 HER2的多肽； 优选地， 所述的多拷贝为双拷贝；
Y为 SEQ ID NO: 3所示的包含 VEGF受体 FLT-1的胞外区第 1 个免疫球蛋白样结构域的肽段序列或 /和 SEQ ID NO: 5所示的 KDR 胞外区第 3个免疫球蛋白样结构域的肽段序列且能高效结合 VEGF的 多肽；
Z为包含人类免疫球蛋白的 Fc段的多肽。
本发明第一方面所述的融合蛋白， 其特征在于， 所述的 X、 Υ、 Ζ 的连接顺序为 X、 Y、 Ζ依次连接， 或者按照¥、 X、 Ζ的顺序连接， 所述的连接是按照 Ν末端向 C末端的次序连接；
优选地， 所述融合蛋白的 X、 Υ可同源串联重复或间隔串联重复。 本发明第一方面所述的融合蛋白， 其特征在于， 所述融合蛋白的 X、 Υ、 Ζ可直接相连， 或通过 1个或多个 spacer 相连。
本发明第一方面所述的融合蛋白，其氨基酸序列包含选自 SEQ ID NO: 15至 SEQ ID NO: 24的氨基酸序列。
本发明第一方面所述的融合蛋白， 其特征在于， 所述多肽 X为包 含 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列且能高效结合 EGFR与 HER2 的多肽， 或者为包含 SEQ ID NO: 1所示的经过 1个或数个氨基酸残 基取代和 /或缺失和 /或添加形成的氨基酸序列且能高效结合 EGFR与 HER2的多肽。
本发明第一方面所述的融合蛋白， 其特征在于， 所述多肽 Y为包 含 SEQ ID NO: 3或 /和 SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列且能高效结 合 VEGF的多肽， 或者为包含 SEQ ID NO: 3或 /和 SEQ ID NO: 5 所示的经过 1 个或数个氨基酸残基取代和 /或缺失和 /或添加形成的氨 基酸序列且能高效结合 VEGF的多肽。
本发明第一方面所述的融合蛋白， 其特征在于， 所述多肽 Z选自 人类免疫球蛋白 IgG各亚型 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4或者 IgM、 IgA 的全长 Fc段， 或者 Fc铰链区、 CH2、 CH3中的部分区段。
本发明第一方面所述的融合蛋白， 其特征在于， 所述多肽 Z可选 自人类免疫球蛋白 IgG各亚型 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4或者 IgM、 IgA的 Fc经过 1个或数个氨基酸残基取代和 /或缺失和 /或添加形成的 肽段。
本发明的第二方面涉及一种核酸， 其特征在于编码本发明所述融 合蛋白。
本发明第二方面所述的核酸，其特征在于其序列包含选自 SEQ ID NO: 25至 SEQ ID NO: 34的核苷酸序列或其筒并性序列。
本发明的第三方面涉及一种载体， 其可操作地连接有本发明所述 的核酸。
本发明第三方面所述的载体， 其中所述的载体选自质粒、 重组病 毒（例如重组腺病毒或重组腺相关病毒） 、 噬菌体， 优选地， 其中所 述的质粒为真核表达质粒或原核表达质粒，例如 pCDNA3.1、 pDC315、 pAAV-MCS。
本发明的第四方面涉及一种制备本发明所述的融合蛋白的方法， 包括以下步骤：
a. 根据融合蛋白各肽段的氨基酸序列与编码序列， 合成表达框； b. 将步骤 a获得的表达框插入合适的载体，转化到合适的宿主细 胞中， 提取并纯化质粒；
c. 将纯化后的质粒转染至合适的细胞， 培养扩增转染细胞， 收集 培养物上清， 经纯化获得融合蛋白；
优选地， 步骤 b中所述的合适的载体选自质粒、 重组病毒（例如 重组腺病毒或重组腺相关病毒） 、 噬菌体， 优选地， 其中所述的质粒 为真核表达质粒或原核表达质粒， 例如 pCDNA3.1、 pDC315、 pAAV-MCS;
优选地， 步骤 b 中所述的合适的宿主细胞为细菌或真菌， 例如 E.coli (例如 DH5a ) ；
优选地， 步骤 c中所述的合适的细胞为真核表达宿主细胞， 例如 293细胞 （胚肾细胞， 购自美国典型物保藏中心， ATCC ) 。
本发明的第五方面涉及一种药物组合物， 其包含本发明所述的融 合蛋白或所述的核酸，任选地，该组合物还含有药学上可接受的载体、 辅料或赋形剂。
本发明第六方面涉及所述的融合蛋白或核酸或载体或药物组合物 用于制备抗肿瘤药物或转基因治疗药物的用途。
上述用途中， 所述的肿瘤为肺癌、 肝细胞癌、 淋巴瘤、 结肠癌、 大肠癌、 乳腺癌、 卵巢癌、 宫颈癌、 胃癌、 胆管癌、 胆嚢癌、 食管癌、 腎癌、 神经胶质瘤、 黑色素瘤、 胰腺癌或前列腺癌。
在一个具体的实施方案中， 所述融合蛋白的结构示意图如图 1 所 示。 它们由 Herstatin、 Flt-1, KDR、 人 IgGl Fc段的编码 DNA通过 基因工程技术构建获得。 其中 Spl、 Sp2分别是 Spacerl与 Spacer2的 筒写。 其中：
EVP1: 由 HERIN、 Fltl-D2、 人 IgGl Fc段依次通过蛋白 Spacer 连接构成。
EVP2 由 Fltl-D2、 HERIN、 人 IgGl Fc段依次通过蛋白 Spacer 连接构成。
EVP3 由 HERIN、 KDR-D3, 人 IgGl Fc段依次通过蛋白 Spacer 连接构成。
EVP4 由 KDR-D3、 HERIN、 人 IgGl Fc段依次通过蛋白 Spacer 连接构成。
EVP5: 由 HERIN、 Fltl-D2、 HERIN. 人 IgGl Fc段依次通过蛋 白 Spacer连接构成。
EVP6: 由 Fltl-D2、 HERIN、 KDR-D3, 人 IgGl Fc段依次通过蛋 白 Spacer连接构成。
EVP7: 由 HERIN、 HERIN、 Fltl-D2、 人 IgGl Fc段依次通过蛋 白 Spacer连接构成。
EVP8: 由 HERIN、 Fltl-D2、 KDR-D3, 人 IgGl Fc段依次通过蛋 白 Spacer连接构成。
EVP9: 由 HERIN、 KDR-D3、 HERIN、 匪 -D2、 人 IgGl Fc段依 次通过蛋白 Spacer连接构成。
EVP10: 由 HERIN、 HERIN. KDR-D3、 Fltl-D2、 人 IgGl Fc段 依次通过蛋白 Spacer连接构成。
在一个具体的实施方案中， 所述融合蛋白 EVP1, EVP3, EVP7, EVP9用于治疗小鼠体内的肝癌移植瘤或用于制备治疗肝癌移植瘤的药 物。
在一个具体的实施方案中， 所述融合蛋白 EVP1， EVP3, EVP7, EVP9用于治疗小鼠体内的卵巢癌移植瘤， 或用于制备治疗卵巢癌移植 瘤的药物。 发明详述
如上文所述， 本发明涉及一种能与 EGFR、 HER2、 VEGF高效结 合的融合蛋白、 其编码核苷酸序列及其在制备用于治疗恶性肿瘤的药物 或基因治疗药物中的应用。
本发明中术语 "EGFR"是指人类表皮生长因子受体 （ epidermal growth factor receptor ) ， 又简称为 ERBB1或 HERl , NCBI基因库 的官方 ID 号为 1956 , 对应蛋白序列编号有 NP— 005219.2 , NP— 958439.1 , NP— 958440.1 , NP— 958441.1。
本发明中术语 "HER2"是指人类表皮生长因子受体家族的第 2 个 成员 ( v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 ) ， NCBI的官方简称为 ERBB2, gene ID号为 2064, 对应蛋白序列编号 有 NP— 004439.2, NP— 001005862.1。
本发明中术语 "VEGF，，是指人类血管生长因子 A (vascular endothelial growth factor A) , NCBI官方筒称为 VEGFA, gene ID号 为 7422 , 对应蛋白编号有 ΝΡ 001020537.2、 ΝΡ 003367.4 、
ΝΡ 001020538.2 、 NP 001020539.2 、 NP 001020540.2
ΝΡ_ 001020541.2 、 NP _001028928.1 、 NP —001165093.1
ΝΡ_ 001165094.1 、 NP— 001165095.1 、 NP— 001165096.1
NP 001165097.1 、 NP 001165098.1 、 NP 001165099.1
NP 001165100.1 、 NP 001165101.1 、 NP 001191313.1
NP 001191314.1。
本发明中术语 "Flt-l" 是指人类血管生长因子受体 1 , NCBI官方 全称为 fms-related tyrosine kinase 1 (vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor receptor)， 又筒称为 VEGFRl ,基 因 ID号为 2321 , 对应蛋白编号有 NP— 002010.2、 NP— 001153392.1、 NP— 001153502.1、 NP— 001153503.1。
本发明中术语 "KDR"是指人类血管生长因子受体 2, NCBI 官方 全称为 kinase insert domain receptor (a type III receptor tyrosine kinase), 又简称为 VEGFR2, 基因 ID 号为 3791， 对应蛋白编号有 NP— 002244.1。
本发明中术语 "Herin"是指人类 Her2 的第 8 个内含子中编码
Herstatin的 C末端 79个氨基酸的 DNA序列。
本发明中术语"胞外区 "是指膜蛋白位于细胞外的区段。
本发明中术语 "结构域"是指蛋白质生物大分子中具有特异结构和 独立功能的区域， 常见结构域的氨基酸残基数在 100 - 400个之间， 最 小的结构域只有 40 ~ 50个氨基酸残基，大的结构域可超过 400个氨基 酸残基。
本发明中术语"免疫球蛋白样结构域，，是指该结构域可形成类似于 免疫球蛋白的空间结构。
本发明中术语"同源串联重复，，是指以一个氨基酸残基多肽为单元 重复 1次以上。
本发明中术语"间隔串联重复"是指一种氨基酸残基多肽后连接另 一种氨基酸残基多肽， 或以此为单元重复 1次以上。
本发明中术语" Spacer"是指一段多肽， 其作用是使两段相邻的肽 段序列在空间结构上互不干扰。
本发明术语 "筒并性" 是指， 同一种氨基酸具有两个或更多个密 码子的现象。
本发明所述的 "高效结合 EGFR、 HER2、 VEGF" 是指亲和力常 数 Kd小于 9.9 X 10 7mol/L, 优选小于 9.0 x 10 8 mol/L, 进一步优选小于 2.0 X 108 mol/L,更进一步优选 5.0 10 9 mol/L,特别优选小于 7.0 x 10 10 mol/L, 最优选小于 6.0 X 10 10 mol/L。
在本发明的一个实施方案中， 构成融合蛋白的 X为单个 HERIN (人类 Her2的第 8个内含子编码的 Herstatin的 C末端 79个氨基酸）。
在本发明的一个实施方案中，构成融合蛋白的 Y为 Flt-1单个第 2 结构域肽段（Fltl-D2 ) 。
在本发明的一个实施方案中， 构成融合蛋白的 Y为 KDR单个第 3结构域肽段 ( KDR-D3 ) 。
在本发明的一个实施方案中， 构成融合蛋白的 X为 HERIN, 且 重复 2次。
在本发明的一个实施方案中，构成融合蛋白的 Y为单个 Flt-1第 2 结构域肽段与单个 KDR第 3结构域肽段的异源组合。
在本发明的一个实施方案中，构成融合蛋白的 X与 Y为同源串联 重复。
在本发明的一个实施方案中，构成融合蛋白的 X与 Y为间隔串联 重复。
在本发明的一个实施方案中， 构成融合蛋白的 X， Y, Z分别通 过蛋白 Spacerl ( SEQ ID NO: 11 ) 与 Spacer2 ( SEQ ID NO: 13 ) 连接。
在本发明的一个实施方案中， 构成融合蛋白的 X， Y, Z部分通 过蛋白 Spacerl ( SEQ ID NO: 11 ) 、 Spacer2 ( SEQ ID NO: 13 ) 连接， 部分直接相连。
在本发明中还例示性地公开了融合蛋白的实际用途。 例如， 用于 治疗小鼠体内的肝癌 SMMC-7721与卵巢癌 SK-OV3皮下移植瘤。
在本发明中还例示性地公开了融合蛋白编码序列用于基因治疗的 实际用途。 例如， 分别利用质粒、 重组腺病毒、 重组腺相关病毒作为 载体携带融合蛋白编码基因， 用于治疗小鼠体内的肝癌 Hep3B、 肺癌 NCI-H460. 乳腺癌 Bcap-37皮下移植瘤。 优选地， 其中所述的质粒为 真核表达质粒。
本发明的融合蛋白可以通过以下方法制备，该方法包括以下步骤： a. 根据融合蛋白各肽段的氨基酸序列与编码序列， 合成表达框； b. 将步骤 a获得的表达框插入合适的载体，转化到合适的宿主细 胞中， 提取并纯化质粒；
c 将純化后的质粒转染至合适的细胞， 培养扩增转染细胞， 收集 培养物上清， 经纯化获得融合蛋白；
在一个具体的实施例中， 该方法具体地包括以下步骤：
a. 根据融合蛋白各肽段的氨基酸序列与编码序列， 合成表达框； b. 将步骤 a获得的表达框插入 pCDNA3.1 ( + )载体 coRI位点， 转化到 . co// ( DH5 ) , 提取并純化质粒；
c 将纯化后的质粒转染至 293细胞， 培养扩增转染细胞， 收集培 养物上清， 经纯化获得融合蛋白。
在一个具体的实施例中， 步骤 c中是利用 Lipofectamine 2000将 步骤 b获得的质粒转染至 293细胞中。
在一个具体的实施例中，步骤 c中，转染后，优选转染 1 ~ 4天后， 进一步优选转染 2或 3天后， 将转染后的 293细胞转移到具有新霉素 的 DMEM培养基中， 并通过有限稀释法将细胞克隆化。
在一个具体的实施例中， 将上述克隆细胞， 经筛选后， 建立具有 新霉素抗性的稳定转染相应表达载体的细胞株。 而后， 通过摇瓶培养 大量扩增稳定转染细胞， 收集培养物上清。 优选地， 其中所述的筛选， 时间为 18 - 24天， 优选为 19 - 22天， 进一步优选为 21天。
在一个具体的实施例中， 步骤 c中， 其中所述的纯化采用凝胶过 滤亲和层析法。 发明的有益效果
与现有融合蛋白相比， 本发明具有如下有益效果：
本发明将具有高效结合 EGFR与 HER2能力的多肽，与具有高效 结合 VEGF能力的多肽融合， 使融合蛋白能同时与 EGFR、 HER2、 VEGF结合， 同时封闭肿瘤细胞过活化的 EGFR、 HER2、 VEGF三 条通路，抑制肿瘤细胞生长，并促进其死亡。同时融合了抗体 Fc肽段， 有助于延长融合蛋白的体内半衰期，增加抗体的"抗体依赖细胞介导的 细胞毒性作用 "(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 提高 融合蛋白的抗肿瘤效果。
本发明的融合蛋白可以用于制备抗肿瘤药物，用于制备治疗肺癌、 肝细胞癌、 淋巴瘤、 结肠癌、 大肠癌、 乳腺癌、 卵巢癌、 宫颈癌、 胃 癌、 胆管癌、 胆嚢癌、 食管癌、 肾癌、 神经胶质瘤、 黑色素瘤、 胰腺 癌或前列腺癌的药物。 附图说明
图 1: 融合蛋白 EVP1、 EVP2、 EVP3、 EVP4、 EVP5、 EVP6、 EVP7、 EVP8、 EVP9、 EVPIO的结构示意图。它们由 Herstatin、 Flt-1、 KDR、 人 IgGl Fc段的编码 DNA通过基因工程技术构建获得。 Spl、 Sp2分别是 Spacerl与 Spacer2的简写。
图 2: 融合蛋白 EVP1、 EVP2、 EVP3、 EVP4、 EVP5、 EVP6、 EVP7、 EVP8、 EVP9、 EVPIO以及对照組 HERI 多肽与 VEGF的 亲和力。
图 3: 融合蛋白 EVP1、 EVP2、 EVP3、 EVP4、 EVP5、 EVP6、 EVP7、 EVP8、 EVP9、 EVPIO以及对照组 HERI 多肽与 EGFR胞 外区的亲和力。
图 4: 融合蛋白 EVP1、 EVP2、 EVP3、 EVP4、 EVP5、 EVP6、 EVP7、 EVP8、 EVP9、 EVPIO以及对照组 HERIN多肽与 HER2胞外 区的亲和力。
图 5: 表示对照组（ PBS、 HERIN多肽）与治疗组（ EVP1、 EVP3、 EVP7、 EVP9 ) 不同时间段肝癌 SMMC-7721移植瘤体积统计分析结 果。
图 6: 表示对照组（PBS、 HERIN多肽）与治疗组 EVP1、 EVP3、 EVP7、 EVP9不同时间段卵巢癌 SK-OV3移植瘤体积统计分析结果。
图 7: 表示携带融合蛋白 （EVP1、 EVP5 ) 编码序列的质粒用于 治疗小鼠体内肝癌 Hep3B移植瘤的疗效统计结果。
图 8: 表示携带融合蛋白编码序列的重组腺病毒（EVP5、 EVP9 ) 用于治疗小鼠体内 NCI-H460移植瘤的疗效统计结果。
图 9: 表示携带融合蛋白 （EVP1、 EVP5 ) 编码序列的重组腺相 关病毒用于治疗小鼠体内乳腺癌 Bcap-37移植瘤的疗效统计结果。 具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领 域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于例示性说明本发明的具体实 施方案， 其不限制本申请的保护范围， 任何本领域技术人员可以根据 现有技术进行的等价的改良都包含在本申请的保护范围之内。 实施例 中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造商建议的条件进行。 所用 试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例 1: 融合蛋白表达框的合成与表达载体的构建
根据融合蛋白各组分的氨基酸序列与编码序列， 拼接成整个融合 的氨基酸序列与编码 DNA表达框， 其中：
HERIN的氨基酸残基序列为：
RGPDPDAHVAVDLSRYEG (SEQ ID NO: 1)
Figure imgf000013_0001
(SEQ ID NO: 2)
Fltl-D2的氨基酸残基序列为:
GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIIS NATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTH QT (SEQ ID NO: 3)
Fltl-D2的编码序列为：
Figure imgf000013_0002
ATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACC (SEQ ID NO: 4)
KDR-D3的氨基酸残基序列为：
SVGEKLVLNCTARTELNVGIDF WEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDG VTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVH (SEQ ID NO: 5)
Figure imgf000013_0003
AAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCAT (SEQ ID NO: 6)
Figure imgf000013_0004
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 7)
Figure imgf000013_0005
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□3V3XDDVV30VDVX L3: 1D311D11D3L3DD3YDD31DYDD1;
Figure imgf000014_0003
9lSl.0/CT0ZN3/X3d ΐ98εζΐ/ειοζ OAV HSHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 16)
融合蛋白 EVP3 依次由信号肽 -HERIN-Spacerl-KDRD3- Spacer2-Fc融合构成， 其氨基酸序列为：
Figure imgf000015_0001
HYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 17)
融合蛋白 EVP4 依次由信号肽 -KDRD3-Spacerl-HERIN- Spacer2-Fc融合构成， 其氨基酸序列为：
Figure imgf000015_0002
HYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 18)
融 合 蛋 白 EVP5 依 次 由 信 号 肽 -HERIN-Spacerl-FltlD2-Spacer2-HERIN-Fc 融合构成， 其氨基酸序
Figure imgf000015_0003
RWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 19)
^ 节 Hi 令 ¥l 3HdH(i¾-2;j33Bds-z;aiMI-IJ3:Bds-NIHaH- 备 毕 "^ 8dA3 菁 令 ¥1
Figure imgf000016_0001
^^-fl- f ' ^令 3naiMI-Z:J33Bds-Mi aH-IJ33Bds-MiaaH- ^ 备 ^ 毕 ίάΑΆ 令 ¥1
:OJM ai Das) Mi SisiSMOiAHSinvaHiAs^sdAJsraC^A asxaAi HS入
Figure imgf000016_0002
r ^ ^ ^ 9dA3 令 ¥1
9lSl.0/CT0ZN3/X3d ΐ98εζΐ/ειοζ OAV FFLYSKLTVDKS WQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 22)
融 合 蛋 白 EVP9 依 次 由 信 号 肽 -HERIN-KDRD3-Spacerl-HERIN-Spacer2-FltlD2 -Fc 融合构成， 其
Figure imgf000017_0001
(SEQ ID NO: 23)
融 合 蛋 白 EVP10 依 次 由 信 号 肽 -HERIN-Spacerl-HERIN-KDRD3-Spacer2-FltlD2-Fc融合构成，其氨
Figure imgf000017_0002
Q ID NO: 24)
分别按 EVPl的 DNA编码序列 （SEQ ID NO: 25)， EVP2的 DNA 编码序列 （SEQ ID NO: 26), EVP3的 DNA编码序列 （SEQ ID NO: 27), EVP4的 DNA编码序列 （SEQ ID NO: 28), EVP5的 DNA编码 序列 (SEQ ID NO: 29), EVP6的 DNA编码序列 (SEQ ID NO: 30), EVP7的 DNA编码序列 （SEQ ID NO: 31), EVP8的 DNA编码序列 (SEQ ID NO: 32), EVP9的 DNA编码序列 （SEQ ID NO: 33), EVP10 的 DNA编码序列 （SEQIDNO: 34), 委托生工⑧生物工程（上海）有 限公司合成其整个表达框， 插入 pCDNA3.1 ( + ) 载体（Invitrogen) coRI位点， 转化到 . coli ( DH5« ) ， 经测序正确后， 使用 Qiagen 公司的质粒純化试剂盒提取并纯化质粒， 获得各重組表达载体的高品 质质粒。 各融合蛋白编码序列如下：
Figure imgf000018_0001
EVP2编码序列：
Figure imgf000019_0001
EVP3编码序列：
Figure imgf000020_0001
GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO: 27)
EVP4编码序列：
Figure imgf000021_0001
AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO: 28)
EVP5编码序列：
Figure imgf000021_0002
EVP6编码序列：
TCTCCCTGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID NO: 30)
EVP7编码序列：
Figure imgf000023_0001
21
TCTCCCTGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID NO: 32)
EVP9编码序列：
TCTCCCTGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID NO: 33)
EVP10编码序列：
TCTCCCTGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID NO: 34)
实施例 2: 融合蛋白的表达与纯化
将实施例 1中构建并纯化获得的各重组表达载体的高品质质粒， 利用 Lipofectamine 2000 ( Invitrogen ) 转染至 293细胞 (胚肾细胞, 购自美国典型物保藏中心， ATCC )。 2天后， 将转染后的 293细胞转 移到具有新霉素的 DMEM培养基中， 并通过有限稀释法将细胞克隆 化。经 21天的筛选， 建立具有新霉素抗性的稳定转染相应表达载体的 细胞林。 而后， 通过摇瓶培养大量扩增稳定转染细胞， 收集培养物上 清， 经凝胶过滤亲和层析法纯化各融合蛋白。 EVP1、 EVP2、 EVP3、 EVP4、 EVP5、 EVP6、 EVP7、 EVP8、 EVP9、 EVP10的分子量分别 为 48.7 KD、 48.7 KD、 47.8 KD、 47.8 KD、 57.0 KD、 58.6 KD、 57.0 KD、 58.6 KD、 66.9KD、 66.9KD, 纯化好的融合蛋白经 ELISA方法确定浓 度。
实施例 3: 融合蛋白与 VEGF的亲和力测定
重组人 VEGF 165蛋白（ Sino Biological Inc. )被包埋在 96孔中（每 孔 lOpmol ) ， 4°C孵育 24小时， 利用 1%的 BSA溶液封闭非特异性的 结合位点。 然后分别将不同浓度 （0.001， 0.005, 0.01， 0.05, 1， 5， 10， 50, 100pM) 的待测融合蛋白 (实施例 2制备的融合蛋白 EVP1-EVP10 ) 与对照 HERIN (委托上海波泰生物科技有限公司合成）加入到孔中（每 孔 ΙΟΟμΙ ) ， 37°C孵育 2小时。 利用人 Quantikine VEGF ELISA试剂 盒 (R&D Systems)检测未结合的 VEGF含量。 结果显示随着融合蛋白浓 度的提高， 未结合的 VEGF逐渐减少， 表明融合蛋白 EVP1、 EVP2、 EVP3. EVP4、 EVP5、 EVP6、 EVP7、 EVP8、 EVP9、 EVP10均能与 VEGF高效结合， 且同时包含 F1U-D2与 KDR-D3的融合蛋白 EVP6、 EVP8、 EVP9、 EVP10与 VEGF的亲和力相对较高， 对照 HERIN不能 与 VEGF结合（见图 2 ) 。
实施例 4: 融合蛋白与 EGFR的亲和力测定
重组人 EGFR蛋白 ( Sino Biological Inc. )被包埋在 96孔中, 4°C 孵育 24小时， 利用 1%的 BSA溶液封闭非特异性的结合位点。 然后将 浓度为 ΙΟΟηΜ或 500nM的待测融合蛋白 （实施例 2制备的融合蛋白 EVP1-EVP10 )与对照肽段 HERIN (委托上海波泰生物科技有限公司合 成）加入到孔中 （每孔 ΙΟΟμΙ ) ， 37°C孵育 2小时， PBS洗掉未结合蛋 白， 通过 Herstatin 的 ELISA检测试剂盒 ( Upstate Biotechnology )定 量测定与 EGFR结合的融合蛋白量。结果表明，融合蛋白 EVP1、EVP2、 EVP3. EVP4、 EVP5、 EVP6、 EVP7、 EVP8、 EVP9、 EVP10均能与 EGFR高效结合， 结合能力与对照 HERIN无显著差异， 包含两个拷贝 HERIN的融合蛋白 EVP5、 EVP7、 EVP9、 EVP10与 EGFR的结合能 力相对较高 （见图 3 ) 。
实施例 5: 融合蛋白与 HER2的亲和力测定
重组人 HER2蛋白 ( Sino Biological Inc. )被包埋在 96孔中， 4°C 孵育 24小时， 利用 1%的 BSA溶液封闭非特异性的结合位点。 然后将 浓度为 ΙΟΟηΜ或 500nM的待测融合蛋白 （实施例 2制备的融合蛋白 EVP1-EVP10 )与对照肽段 HERIN (委托上海波泰生物科技有限公司合 成）加入到孔中 （每孔 ΙΟΟμΙ ) , 37°C孵育 2小时， PBS洗掉未结合蛋 白， 通过 Herstatin 的 ELISA检测试剂盒 ( Upstate Biotechnology )定 量测定与 HER2结合的融合蛋白量。结果表明，融合蛋白 EVP1、 EVP2、 EVP3. EVP4、 EVP5、 EVP6、 EVP7、 EVP8、 EVP9、 EVP10均能与 HER2高效结合， 结合能力与对照 HERIN无显著差异， 包含两个拷贝 HERIN的融合蛋白 EVP5、 EVP7、 EVP9、 EVP10与 HER2的结合能 力相对较高 （见图 4 ) 。
实施例 6: 融合蛋白与 EGFR、 HER2、 VEGF的亲和力常数测定 实施例 2 制备的融合蛋白 EVP1、 EVP2 分别加入 96 孔板中 ( 10μ§/ιη1， 200μ1 ) 中， 然后负载至抗人 IgG Fc 捕获生物传感器上 (Anti-Human IgG Fc Capture biosensor, Octet), 再应用生物大分子 相互作用仪 ( Octet Red 96 )分别测定其与不同浓度（ 800nM、 400nM、 200nM、 100nM、 50nM、 25nM ) 的重组人 EGFR、 HER2、 VEGF 蛋白 （ 200μ1, Sino Biological Inc. ) 的亲和力， 测得 EVP1与 EGFR、 HER2、 VEGF 的亲和力常数 Kd 分别为 4.55 x l(T9mol/L， 1.87 x 10"8 mol/L, 6.28 x 10 10mol/L; EVP2与 EGFR、 HER2、 VEGF的亲和力常 数 Kd分别为 8.47 x 10 8 mol/L, 9.53 10 7mol/L, 5.75 x 10-1 mol/L。
实施例 7: 融合蛋白用于治疗小鼠体内肝癌 SMMC-7721移植瘤 将 4-5周龄的裸鼠皮下接种肝癌 SMMC-7721细胞株（购自上海 生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所） IxlO7, 两周后， 每周 给予荷瘤小鼠尾静脉注射对照多肽 HERIN (委托上海波泰生物科技有 限公司合成，注射剂量为 2.5mg/kg )或融合蛋白 EVP1、 EVP3、 EVP7、 EVP9 (注射剂量分别为 2.5mg/kg ),空白对照组注射相同体积的 PBS, 统计肿瘤体积的随时间的变化情况。 结果发现， 其对照组 3周后肿瘤 体积增加 5倍以上， 而融合蛋白 EVP1、 EVP3、 EVP7、 EVP9治疗组 肿瘤大小无明显变化， 疗效显著优于对照多肽 HERIN治疗组 （见图 实施例 8: 融合蛋白用于治疗小鼠体内卵巢癌 SK-OV3移植瘤 将 4-5周龄的裸鼠皮下接种卵巢癌 SK-OV3 (购自 ATCC ) 细胞 株 lxl07，两周后，每周给予荷瘤小鼠尾静脉注射对照多肽 HERIN (委 托上海波泰生物科技有限公司合成， 注射剂量为 2.5mg/kg )或融合蛋 白 EVP1、 EVP3、 EVP7、 EVP9 (注射剂量分别为 2.5mg/kg ) , 空白 对照组注射相同体积的 PBS, 统计肿瘤体积的随时间的变化情况。 结 果发现， 其对照组 3周后肿瘤体积增加 8倍以上， 而融合蛋白 EVP1、 EVP3, EVP7、 EVP9 治疗组肿瘤的大小无明显变化， 疗效显著优于 对照肽段 HERIN治疗组 （见图 6 ) 。
实施实例 9: 携带融合蛋白编码序列的质粒用于治疗小鼠体内肝 癌 Hep3B移植瘤
应用 EntransterTM— /w Wvo转染试剂盒 ( Engreen Biosystem Co, Ltd ) ， 制备包裹实施实例 1获得的融合蛋白 EVP1、 EVP5表达质粒 pCDNA3.1-EVPl , pCDNA3.1-EVP5 , 以及空载体 pCDNA3.1 的纳 米颗粒溶液（按说明书步骤） , 最终 150 μΐ的纳米颗粒溶液中含有质 粒 50 g。
将 4-5 周龄的裸鼠皮下接种肝癌 Hep3B (购自 ATCC ) 细胞株 l xlO7。 四周后 ， 一次性给予荷瘤 小 鼠尾静脉注射 包裹 pCDNA3.1-EVPl、 pCDNA3.1-EVP5 的纳米 -质粒 DNA 溶液 （各 150μ1 ) , 对照组注射相同体积的包裹 pCDNA3.1的纳米 -质粒 DNA, 统计肿瘤体积的随时间的变化情况。 结果发现， 其对照组 3周后肿瘤 体积增加 4倍以上， 而治疗组肿瘤的大小无明显变化 （见图 7 ) 。
实施实例 10: 携带融合蛋白编码序列的重组腺病毒用于治疗小鼠 体内肺癌 NCI-H460移植瘤
将实施实例 1合成的融合蛋白 £¥ 5编码序列（8£0 10 0: 29 )、 EVP9 ( SEQ ID NO: 33 )插入 pDC315载体（本元正阳基因技术有限 公司） RI位点， 转化到 E. coli ( DH5a ) , 经测序正确后， 使用 Qiagen 公司的质粒纯化试剂盒提取质粒。 利用 Lipofectamine ( Invitrogen ) 夺其分别 与 pBHGlox(delta)El,3Cre ( Microbix Biosystems Inc )共转染至 293细株（ATCC )， 共转染后 9-14天出现 腺病毒空斑，经过三次腺病毒空斑纯化， 包装获得携带 EVP1或 EVP5 融合蛋白编码框的重组腺病毒 Ad5-EVP5、 Ad5-EVP9D 腺病毒在 293 细胞中大量繁殖， 应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒， 应用 TCID50法来检测腺病毒滴度。
将 4-5周龄的棵鼠皮下接种肺癌 NCI-H460 (购自 ATCC )细胞株 5xl06 , 二周后， 一次性给予荷瘤小鼠尾静脉注射 Ad5-EVP5、 Ad5-EVP9 ( lxl09pfu, ΙΟΟμΙ ) , 对照组注射相同体积的 PBS , 统计 肿瘤体积的随时间的变化情况。 结果发现， 其对照组 3周后肿瘤体积 增加 5倍以上， 而治疗组肿瘤的大小无明显变化 （见图 8 ) 。
实施实例 11 : 携带融合蛋白编码序列的重组腺相关病毒用于治疗 小鼠体内乳腺癌 Bcap-37移植瘤
将实施实例 1合成的融合蛋白 EVP1 ( SEQ ID NO: 25 ) 、 EVP5 编码序列（ SEQ ID NO: 29 )插入 pAAV-MCS载体（ Stratagene )EcoRI 位点， 转化到 . ( DH5« ) , 经测序正确后， 使用 Qiagen公司的 质粒纯化试剂盒提取质粒。 利用磷酸钙转染法将其分别与 pAAV-RC 及 pHelper ( Stratagene )共转染自 293细胞（ ATCC ) , 包装获得重 组腺相关病毒 rAAV-EVPl、 rAAV-EVP5。
将 4-5周龄的棵鼠皮下接种乳腺癌 Bcap-37 (购自 ATCC ) 细胞 株 5xl06, 三周后， 一次性给予荷瘤小鼠尾静脉注射 rAAV-EVPl、 rAAV-EVP5 ( 2xlOnvg , ΙΟΟμΙ ) , 对照组注射相同体积的 PBS , 统计 肿瘤体积的随时间的变化情况。 结果发现， 其对照组 5周后肿瘤体积 增加 10倍以上， 而治疗组肿瘤的大小无明显变化 （见图 9 ) 。

Claims

权 利 要 求
1、 一种融合蛋白， 其特征在于包含 X、 Υ、 Ζ三个来源的肽段， 其中：
X为单拷贝或多拷贝的如 SEQ ID NO: 1所示的包含人类 基因第 8个内含子 Herin编码的氨基酸序列且能高效结合 EGFR与 HER2的多肽； 优选地， 所述的多拷贝为双拷贝；
Y为 SEQ ID NO: 3所示的包含 VEGF受体 FLT-1的胞外区第 2 个免疫球蛋白样结构域的肽段序列或 /和 SEQ ID NO: 5所示的 KDR 胞外区第 3个免疫球蛋白样结构域的肽段序列且能高效结合 VEGF的 多肽；
Z为包含人类免疫球蛋白的 Fc段的多肽。
2、 权利要求 1所述融合蛋白， 其特征在于， 所述的 X、 Y、 Z的 连接顺序为 X、 Υ、 Ζ依次连接， 或者按照¥、 X、 Ζ的顺序连接； 优选地， 所述融合蛋白的 X、 Υ可同源串联重复或间隔串联重复。
3、 权利要求 1所述融合蛋白， 其特征在于， 所述融合蛋白的 X、 Υ、 Ζ可直接相连， 或通过 1个或多个 spacer相连。
4、权利要求 1所述融合蛋白，其氨基酸序列包含选自 SEQ ID NO: 15至 SEQ ID NO: 24的氨基酸序列。
5、 权利要求 1所述融合蛋白， 其特征在于， 所述多肽 X为包含 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列且能高效结合 EGFR与 HER2的多 肽， 或者为包含 SEQ ID NO: 1所示的经过 1个或数个氨基酸残基取 代和 /或缺失和 /或添加形成的氨基酸序列且能高效结合 EGFR 与 HER2的多肽。
6、 权利要求 1所述融合蛋白， 其特征在于， 所述多肽 Y为包含 SEQ ID NO: 3或 /和 SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列且能高效结合 VEGF的多肽， 或者为包含 SEQ ID NO: 3或 /和 SEQ ID NO: 5所示 的经过 1 个或数个氨基酸残基取代和 /或缺失和 /或添加形成的氨基酸 序列且能高效结合 VEGF的多肽。
7、 权利要求 1所述融合蛋白， 其特征在于， 所述多肽 Z选自人 类免疫球蛋白 IgG各亚型 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4或者 IgM、 IgA 的全长 Fc段， 或者 Fc铰链区、 CH2、 CH3中的部分区段。
8、 权利要求 1所述融合蛋白， 其特征在于， 所述多肽 Z可选自 人类免疫球蛋白 IgG各亚型 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4或者 IgM、 IgA 的 Fc 经过 1 个或数个氨基酸残基取代和 /或缺失和 /或添加形成的肽 段。
9、一种核酸， 其特征在于编码权利要求 1至 8任一项中所述融合 蛋白。
10、权利要求 9所述的核酸，其特征在于其序列包含选自 SEQ ID NO: 25至 SEQ ID NO: 34的核苷酸序列或其筒并性序列。
11、 载体， 其可操作地连接有权利要求 9或 10所述的核酸。
12、 权利要求 11所述的载体， 其中所述的载体选自质粒、 重组病 毒（例如重组腺病毒或重组腺相关病毒） 、 噬菌体， 优选地， 其中所 述的质粒为真核表达质粒或原核表达质粒，例如 pCDNA3.1、 pDC315、 pAAV-MCS0
13、 制备权利要求 1至 8任一项所述的融合蛋白的方法， 包括以 下步骤：
a. 根据融合蛋白各肽段的氨基酸序列与编码序列， 合成表达框； b. 将步骤 a获得的表达框插入合适的载体，转化到合适的宿主细 胞种， 提取并纯化质粒；
c 将纯化后的质粒转染至合适的细胞， 培养扩增转染细胞， 收集 培养物上清， 经純化获得融合蛋白；
优选地， 步骤 b中所述的合适的载体选自质粒、 重组病毒（例如 重组腺病毒或重组腺相关病毒） 、 噬菌体， 优选地， 其中所述的质粒 为真核表达质粒或原核表达质粒， 例如 pCDNA3.1、 pDC315、 pAAV-MCS;
优选地， 步骤 b 中所述的合适的宿主细胞为细菌或真菌， 例如 E.coli (例如 DH5a ) ； 优选地， 步骤 C中所述的合适的细胞为真核表达宿主细胞， 例如
293细胞。
14、 药物组合物， 其包含权利要求 1至 8任一项中所述的融合蛋 白或权利要求 9或 10中所述的核酸，任选地，该组合物还含有药学上 可接受的载体、 辅料或赋形剂。
15、 权利要求 1至 8任一项中所述融合蛋白或权利要求 9至 10 任一项所述的核酸或权利要求 11至 12任一项所述的载体或权利要求 15所述的药物组合物用于制备抗肿瘤药物或转基因治疗药物的用途。
16、权利要求 15所述的用途，其中所述的肿瘤为肺癌、肝细胞癌、 淋巴瘤、 结肠癌、 大肠癌、 乳腺癌、 卵巢癌、 宫颈癌、 胃癌、 胆管癌、 胆嚢癌、 食管癌、 肾癌、 神经胶质瘤、 黑色素瘤、 胰腺癌或前列腺癌。
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