CN100556917C - Sip45基因及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及SIP45基因，该基因编码的SIP45蛋白，以及所述基因和蛋白在医学中的应用。

Description

SIP45基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明涉及SIP45基因，该基因编码的SIP45蛋白，以及所述基因和蛋白在医学中的应用。

背景技术

某些蛋白可以调控肿瘤细胞的生长和增殖，这种调控是通过细胞内复杂的蛋白分子间相互作用而实现的。通过探索与已知调控肿瘤生长的因子相互作用的新的蛋白，可以发现调节肿瘤生长的新途径，为肿瘤的治疗提供新的方法和手段。

发明内容

本发明发现了一种参与调控细胞生长增殖的新的蛋白，克隆了编码该蛋白的基因，构建了含有该基因的表达载体和含有该表达载体的宿主细胞，对该蛋白进行了真核细胞的表达和体外纯化，完成了其组织细胞表达谱的分析，并得到了特异性的多克隆抗体。

因此，在一个方面，本发明提供了可调控肿瘤细胞的生长和增殖的蛋白，尤其重组蛋白，该蛋白具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明提供了编码上述蛋白的基因，它是具有与SEQ ID No.1所示的DNA或者与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。

在另一个方面，本发明提供了含有上述基因或者编码上述蛋白的基因的表达载体。

在又一个方面，本发明提供了由上述表达载体转化的宿主细胞。

在另一个方面，本发明提供了生产本发明的重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤：

培养上述转化的宿主细胞，使转化细胞产生本发明的重组蛋白；和

从培养物中分离出重组蛋白。

在另一个方面，本发明提供了针对上述蛋白的抗体，它是使用所述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。它可以是单克隆或多克隆抗体。

在另一个方面，本发明提供了检测所述蛋白的试剂盒，它含有上述特异性抗体，可以进行抗原-抗体反应，用于检测具有序列表SEQ IDNo.2所示的蛋白。

此外，本发明提供了用于检测如序列表核苷酸序列SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的探针诊断试剂盒，它含有与序列表核苷酸序列SEQ ID No.1中的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。它可以是一个具有15-300个碱基的DNA片段。通过探针杂交的方法，用于检测含有所述核苷酸序列的mRNA的表达，该mRNA被翻译为含有序列SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列的蛋白。

此外，本发明提供了一个引物对，用于对进行PCR扩增，引物如下所示：

引物1：5’-GGA ATT CAT GTC CCT TGC TCG GGG CCA TGG AG-3’

引物2：5’-CGG GAT CCT CAG TAT TTC CGC TGC CGA GGG AAG-3’。

本发明还提供了上述基因、蛋白或抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明还提供了一种治疗肿瘤，尤其子宫癌的药物组合物，该药物组合物可以包含治疗有效量的蛋白以及药学可接受的载体或赋型剂，这样的载体包括但不限于：盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘醇，乙醇，或混合物，这些制剂应适合给药方式。

本发明的药物组合物可以以适当的方式给药，如通过局部、静脉内、腹腔内、肌内、皮下等途径给药。给药于患者的用量取决于许多因素，如给药方式，待治疗者的身体条件和诊断医生的判断。

SIP45(SRC-1 interacting protein，Molecular Weight 45kDa)是由p160家族成员之一的SRC-1通过酵母双杂交的方法筛选出来的新基因。为了得到全长的SIP45基因ORF，我们提取了人子宫内膜癌Ishkawa细胞的总mRNA，以其为模本，并前文所提供的相应于SIP45基因ORF起始及终止区的特异引物，进行RT-PCR反应。由于在上下游引物中分别含有EcoRI和BamHI的酶切位点，使得PCR产物可导入pCDNA3.1质粒载体中，经扩增，测序，从而确定得到正确的克隆。SIP45的ORF序列还被插入带有5’端Flag标签的pCDNA3.1质粒、原核表达载体pGEX4T3、及真核表达荧光融合蛋白所需的pEGFPC2质粒中。所有SIP45-质粒DNA均经测序确定其读码框架及编码序列的正确无误。

SIP45基因位于人16号染色体短臂16p11.2区，由3个外显子和2个内含子组成。其基因全长含有3607个碱基，其mRNA全长为1164个碱基。我们克隆到的SIP45的ORF有765个碱基，编码一个254个氨基酸的蛋白，预测分子量为30kDa(最终的SDS-PAGE实际电泳所得为45kDa)。用SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)蛋白分析工具对SIP45的蛋白序列进行的计算机模拟功能结构域分析显示，在其蛋白序列的第196位氨基酸至213位氨基酸存在着一段核定位信号(Bipartate nuclear localization signal)。在整个的ORF中，虽不存在明确的已知功能域，但在其中间及靠近C端处，有部分序列与一些DNA binding domain(包括SIP45NT、BASIC、以及BRLZ domain)具有一定同源性，提示该蛋白可能也有类似的功能。进化分析显示，SIP45在小鼠(Mus musculus)和棕色大鼠(Rattus norvegicus)均有高度同源的蛋白质(73％similarity)，这种进化保守性提示SIP45在体内具有较为重要的生理功能。

通过使用本发明的蛋白或者免疫学上等效的多肽，可以获得其抗体，抗体用于所述蛋白的检测和纯化。可以利用本发明的蛋白或其部分氨基酸序列作为免疫原来产生抗体。可以通过将抗体接种给宿主动物并回收血清的常规方法产生多克隆抗体。还可以通过常规杂交瘤方法产生单克隆抗体。

附图说明

图1.SIP45的基因结构。SIP45基因全长为3607bp。它包含3个外显子和2个内含子以及5’端和3’端的非翻译区。下方所示为SIP45的蛋白序列。图中下画线部分为核定位信号所在。

图2.克隆全长的SIP45的编码序列(ORF)。采用RT-PCR法由人子宫内膜癌Ishkawa细胞中提取总mRNA，以其为模本，设计相应于SIP45基因ORF起始及终止区的特异引物，进行RT-PCR反应。图中显示得到768bp的特异性扩增产物。图中最右列为阴性对照组。

图3.Western Blot分析图，为人乳腺癌MCF7细胞以Lipofectamine 2000^TM转染Flag-SIP45/pcDNA3.1质粒24小时后，提取总蛋白的Western Blot分析。以单克隆抗Flag抗体检测表达蛋白。如图所示，转染表达蛋白电泳位置相当于46kDa左右(Flag标签约为1kDa大小)。图中左列显示未转染细胞无特异性条带。

图4.在大肠杆菌BL21中表达SIP45-GST融合蛋白。

图5.SIP45基因的mRNA在人体内各组织的分布情况。图为以³²P标记SIP45的ORF全长为cDNA探针，与从Clontech公司购买的人体多组织总mRNA膜进行Northern Blot杂交。结果显示，SIP45在多种组织均有分布，在心脏、肝脏、骨骼肌及脾脏中含量尤为丰富。

图6.免疫荧光法对SIP45蛋白进行细胞内定位。

图7.多克隆抗体的Western Blot分析图。以体外纯化的SIP45-GST融合蛋白免疫实验兔，得到SIP45特异性的多克隆抗体。

图8.SIP45与SRC-1在细胞内存在相互作用。免疫共沉淀实验显示，在单独转染SIP45-Flag表达载体(左lane)或与SRC-1表达载体共转染(右lane)的MCF7细胞裂解液中，以Flag抗体沉淀蛋白复合体中，仅在共转染的细胞裂解液中可以检测到SRC-1蛋白。

实施例

实施例1：用RT-PCR方法从人子宫内膜癌细胞Ishkawa中克隆编码SIP45蛋白的基因

提取人子宫内膜癌细胞Ishkawa的总mRNA，以其为模本，并设计相应于SIP45基因ORF起始及终止区的特异引物，进行RT-PCR反应。用下列引物进行PCR扩增：

Primer1：5’-GGA ATT CAT GTC CCT TGC TCG GGG CCA TGG AG-3’

Primer2：5’-CGG GAT CCT CAG TAT TTC CGC TGC CGA GGG AAG-3’。

扩增反应的条件：在50μL的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl，(PH：8.5)，1.5mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTP，10pmol引物，0.25U的pfu DNA聚合酶(Takara公司产品)。按下列条件反应25个周期：94℃30sec；60℃30sec；72℃2min30sec。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用EcoRI及BamHI双酶切后，克隆到相同酶切的pcDNA3.1(-)真核表达载体中。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与预期相符。结果见图2。

实施例2：Northern Blot

探针的标记和杂交操作参照Clontech公司的Spotlight^TM RandomPrimer Labeling Kit试剂盒说明书。过程如下：

(1)探针标记：25ng-1μgDNA溶于20μL体积中，90-100℃2-3分钟，迅速冰浴5分钟，加5μL[α-³²P]dCTP标记的RandomPrimers and Reaction Buffer Mix，补水至50μL，37℃孵育5-10min。

(2)杂交：68℃预热杂交液，将吸附有核酸的尼龙膜放入含有杂交液的杂交瓶中，加入含有100μg/mL的鲑精DNA的杂交液0.1mL/cm²，68℃预杂交30min。20ng/mL探针混入杂交液，95℃2-5分钟，冰浴5分钟。加入杂交瓶，68℃杂交1小时。

(3)洗膜：用Wash Buffer 1室温洗膜30-40分钟，用Wash Buffer2 50℃洗膜40分钟。

(4)显色：用镊子取出膜，洗干Wash Buffer 2，用保鲜膜覆盖，-70℃曝光1-3天后显影，定影。

实施例3：SIP45在原核细胞中的表达及纯化

pGEX4T3-SIP45可以在大肠杆菌BL21菌株中30℃诱导表达GST-SIP45的融合蛋白，首先制备BL21的感受态细胞：挑取单克隆到适量培养基中，37℃250rpm培养至A₆₀₀ 0.4-0.5，2500g离心15分钟，备用。将1-50ng pGEX-4T-3-SIP45转化到上述制备的感受态细胞中，用Glutathione Sepharose 4B进行纯化，纯化的步骤如下：

(1)取单克隆到2-3mL 2YTA培养基中培养4-5小时。转接到100mL的锥形瓶中生长过夜。

(2)转接到500mL的锥形瓶中培养3-5小时。

(3)加0.5mL 1M IPTG 30℃，培养3-6小时。

(4)3000rpm 10分钟离心收集细胞。

(5)用25mL PBS重悬细胞。超声10分钟。

(6)加1.25mL 20％Triton X-100，混匀1小时。

(7)1000rpm 10分钟离心，加入0.5mL 50％slurry of GlutathioneSepharose 4B，室温30分钟。

(8)1000rpm 5分钟离心，PBS洗三遍。

(9)用0.5mL洗脱Buffer洗脱，短暂离心后收集上清。

图4示出了在大肠杆菌BL21中表达SIP45-GST融合蛋白。图为经考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶。图中1-3列均为纯化的SIP45-GST蛋白。第4列为表达该蛋白的细菌裂解液。图中第5-7列为纯化的GST蛋白，而第8列为其相应的细菌裂解液。

实施例4：制备多克隆抗体。

提纯足量的免疫实验兔所需的SIP45蛋白。在选定实验兔之前预先以Western Blot检查兔血清中所具有的背景抗体滴度(用抗兔的二抗孵育)，避免选用含有与SIP45相似分子量的背景抗体的实验兔。第1天和第3天各用300μg抗原加完全佐剂混匀后皮下注射实验兔，第37天用ELISA测抗体滴度。采用颈动脉取血法。取血后将其置于37℃，2小时，然后4℃过夜，吸取血清。用Western Blot检测所得的SIP45多克隆抗体的特异性及灵敏性。结果见图7，图中所示为使用该多克隆抗体检测MCF7细胞中所表达的SIP45蛋白。Lane1为未转染质粒的细胞，Lane2为转染了SIP45/pCDNA3.1质粒的细胞，Lane3为转染了SIP45/pEGFP质粒的细胞。

实施例5：SIP45在真核细胞中的表达

Western Blot是在蛋白质电泳和固相免疫测定的基础上发展起来的。其基本原理为抗原抗体反应。细胞蛋白提取物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到固相支持物上(本实验采用硝酸纤维素膜)。与特异的一抗反应(本实验用小鼠抗人Flag单克隆抗体，Sigma)，再与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(本实验室保存兔抗鼠二抗)孵育，显色，可以得到特异蛋白分子的免疫印迹图。该方法具有从混杂抗原中检测出特定的抗原的优点，因此本实验用于检测内源性SIP45或SIP45基因转染MCF-7细胞后的蛋白表达情况。

1)瞬时转染实验：

于转染前一天将MCF-7细胞接种于10cm培养板中，接种密度为2×10⁶个细胞/孔，每孔加入培养液10ml。24小时后，细胞长至覆盖培养孔底面积约50-60％时，可准备转染。在EP管中配制下述溶液：溶液A：12μg pcDNA3.1(-)-SIP45表达质粒，溶于1.5mL无血清无双抗DMEM培养液。溶液B：将30μL脂质体溶液(lipofectamine 2000reagent)加入到1.5mL无血清无双抗DMEM培养液中。室温静置5分钟。然后将溶液A、B混合，室温静置20分钟。用无血清和不含双抗的DMEM培养液洗涤细胞。将上述溶液A、B的混合液中加入12mL无血清无双抗的DMEM培养液，混匀后加至细胞表面。37℃，5％CO2条件下孵育4-6小时后，再用正常含10％胎牛血清的DMEM培养液取代前述培养液，继续培养细胞至48小时。

2)细胞总蛋白的提取：

培养的细胞经0.25％胰酶消化使之分散，4℃低速离心去上清，将沉淀置于冰上30min，再用预冷的PBS洗2次，每10⁶细胞加入裂解液100μL，使细胞充分裂解30min，再于4℃，20000×g离心15min，收集上清。

3)Bradford法测定细胞裂解液蛋白的浓度：

首先配制考马斯亮蓝染色液；将标准牛血清白蛋白(BSA)配制成1mg/ml的蛋白标准液，分别将10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg蛋白标准液和5μL待测蛋白质样品加入3mL考马斯亮蓝染液中，室温孵育10min，在595nm波长处测定吸收值。BSA标准样品测定标准曲线，在一定范围内OD₅₉₅与蛋白浓度成正比。样品蛋白质的浓度经标准曲线拟合方程来计算。4)电泳及免疫反应：流程如下：A、制胶(5％浓缩胶，10％分离胶)；B、50μg蛋白样品加入上样缓冲液，煮沸，上样；C、电泳，浓缩胶80V电压，分离胶120V电压；D、转膜，100V，1.5h；E、封闭，1h；F、一抗反应，4℃，过夜；G、TBST洗膜，三次，每次10min；H、二抗反应，1.5h；I、TBST洗膜，三次，每次10min；J、显色、曝光。结果见图3。

实施例6：SIP45在细胞内的定位

利用发明人实验室保存的pEGFP-C1载体构建了pEGFP-C1-SIP45质粒，它可以在真核细胞内表达GFP-SIP45的融合蛋白，将该载体用Lipofectamine 2000^TM的方法转染进MCF-7细胞中，转染的细胞进行爬片，24小时后，用PBS洗三遍，用4％多聚甲醛/PBS进行固定，室温15分钟，然后用PBS洗三遍。用0.1％Triton X-100/PBS透化15分钟，然后用PBS洗三遍，加入200μL 2.5mg/mL的DAPI，室温作用30分钟，然后用PBS洗三遍，在荧光显微镜下分别用常规荧光波长和DAPI波长进行观察，并进行拍照。结果见图6，(A)MCF7细胞转染Flag-SIP45/pCDNA3.1质粒24小时后，固定，透膜，以Flag抗体为一抗，Rhodamine标记的抗鼠抗体为二抗，进行荧光染色。在绝大多数的转染细胞中，SIP45表达于细胞质中，如图位于下方的两个细胞。在个别细胞中，SIP45则较多的位于细胞核中，如图最上方的细胞。(B)同A视野的DAPI染色显示细胞核所在的位置。(C)MCF7细胞转染SIP45-GFP表达载体24小时后的活细胞直接免疫荧光观察。绝大多数的转染细胞也显示表达蛋白位于细胞质内。(D)同C视野的DAPI染色显示细胞核所在位置。相应图中的白线代表5μm。在绝大多数的转染细胞中，SIP45表达于细胞质中，在个别细胞中，SIP45则较多的位于细胞核中。

实施例7：MTT法检测不同浓度的SIP45对乳腺癌细胞增殖的影响

MTT(四甲基偶氮唑兰)可被细胞摄取，并被活细胞内线粒体脱氢酶还原成一种不溶于水的蓝紫色产物甲瓒，并沉淀于细胞中，而死细胞没有这种功能。甲瓒可溶于二甲基亚砜(DMSO)，溶液在570nm处有最大吸收。故该波段处吸收值越大代表存活细胞量越多。MTT法广泛应用于细胞毒性实验、细胞生长测定等。本实验利用MTT法观察SIP45对MCF-7生长的影响。具体操作方法如下：

将培养到对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔板中，每孔接种细胞数为1×10⁴个。次日按照浓度梯度加入SIP45(25、50、100ng)，每浓度作用6孔细胞，37℃，5％CO2进行培养。分别培养1d、2d、3d、4d后，在每个细胞培养孔内加入50μl L1mg/mL的MTT溶液，同样培养条件下作用4小时后取出，小心吸出每孔内液体，每孔加入二甲基亚砜150μL，轻微振荡10分钟，使蓝紫色结晶充分溶解在二甲基亚砜中。用自动酶标仪测量96孔板中每孔在570nm处的吸光值。MTT实验表明SIP45对MCF-7细胞生长增殖起抑制作用，并且与剂量有关。

实施例8：瞬时转染及荧光素酶(Luciferase)实验：

应用荧光素酶作为报告基因，为分析基因的调控元件和测量基因转录活性提供了便利的方法。本实验就是将cyclinD1基因启动子与荧光素酶读码框共同构建到真核表达载体中，将该融合表达质粒转染细胞，通过测定荧光素酶的活性，从而研究转录因子、调节蛋白对cyclinD1基因启动子的作用。实验采用萤火虫荧光素酶(Firefly)为报告基因，海三色堇(Renillar)荧光素酶为内参照。用Promega公司出产的双荧光报告基因分析系统试剂盒，在同一试管中测量两种酶的活性。并应用化学发光仪进行检测。

2)瞬时转染实验：

于转染前一天将MCF-7细胞接种于24孔培养板中，接种密度为1-2×10⁵个细胞/孔，每孔加入培养液0.5mL。24小时后，细胞长至覆盖培养孔底面积约50-60％时，可准备转染。在EP管中配制下述溶液：溶液A：0.8μg DNA(cyclinD1报告基因质粒：200ng；内参Renillar质粒：10ng；SIP45表达质粒：600ng或pcDNA3.1(-)空载体质粒：600ng)，溶于50μL无血清无双抗DMEM培养液。溶液B：将2μL脂质体溶液(lipofectamine 2000reagent)加入到50μL无血清无双抗DMEM培养液中。室温静置5分钟。然后将溶液A、B混合，室温静置20分钟。用无血清和不含双抗的DMEM培养液洗涤细胞。将上述溶液A、B的混合液中加入400μL无血清无双抗的DMEM培养液，混匀后加至细胞表面。每个实验组重复3孔。37℃，5％CO₂条件下孵育4-6小时后，再用正常含10％胎牛血清的DMEM培养液取代前述培养液，继续培养细胞至48小时。裂解细胞，测量荧光素酶的活性。

2)用双荧光报告基因试剂盒测量双荧光素酶的活性：

(1)裂解细胞：

用冷PBS清洗细胞，将1×细胞裂解液(PLB)100μL加入每个细胞培养孔，室温孵育15分钟，使细胞充分裂解。所得到的细胞裂解液可直接用于荧光测量。

(2)荧光素酶底物的配制：

将萤火虫荧光素酶底物冷冻干粉溶于10mL荧光素酶分析缓冲液中，所得溶液为LARII，分装，-70℃保存。用Stop & Glo缓冲液将50×海三色堇荧光素酶底物稀释到1×，所得溶液为Stop& Glo，现用现配。

(3)测量过程：

将20μL细胞裂解液放入96孔荧光测量板，加入100μLLARII，测量萤火虫荧光素酶，测量条件为：延迟2秒，测量10秒。再加入100μLStop & Glo，测量海三色堇荧光素酶，测量条件同上。参看图6，SIP45对cyclinD1启动子启动荧光素酶表达起抑制作用。

SIP基因[1].ST25

<110>北京大学

<120>SIP45基因及其编码的蛋白和应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1164

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(16)..(777)

<223>

<400>1

ctgccctagt ggcct atg tcc ctt gct cgg ggc cat gga gac act gcg gcc    51

                 Met Ser Leu Ala Arg Gly His Gly Asp Thr Ala Ala

                 1               5                   10

agt acg gcg gcg cct ctg tct gaa gaa ggg gaa gtg acc tcc ggc ctc     99

Ser Thr Ala Ala Pro Leu Ser Glu Glu Gly Glu Val Thr Ser Gly Leu

        15                  20                  25

cag gct ctg gcc gtg gag gat acc gga ggc ccc tct gcc tcg gcc ggt    147

Gln Ala Leu Ala Val Glu Asp Thr Gly Gly Pro Ser Ala Ser Ala Gly

    30                  35                  40

aag gcc gag gac gag ggg gaa gga ggc cga gag gag acc gag cgt gag    195

Lys Ala Glu Asp Glu Gly Glu Gly Gly Arg Glu Glu Thr Glu Arg Glu

45                  50                  55                  60

ggg tcc ggg ggc gag gag gcg cag gga gaa gtc ccc agc gct ggg gga    243

Gly Ser Gly Gly Glu Glu Ala Gln Gly Glu Val Pro Ser Ala Gly Gly

                65                  70                  75

gaa gag cct gcc gag gag gac tcc gag gac tgg tgc gtg ccc tgc agc    291

Glu Glu Pro Ala Glu Glu Asp Ser Glu Asp Trp Cys Val Pro Cys Ser

            80                  85                  90

gac gag gag gtg gag ctg cct gcg gat ggg cag ccc tgg atg ccc ccg    339

Asp Glu Glu Val Glu Leu Pro Ala Asp Gly Gln Pro Trp Met Pro Pro

        95                  100                 105

ccc tcc gaa atc cag cgg ctc tat gaa ctg ctg gct gcc cac ggt act    387

Pro Ser Glu Ile Gln Arg Leu Tyr Glu Leu Leu Ala Ala His Gly Thr

    110                 115                 120

ctg gag ctg caa gcc gag arc ctg ccc cgc cgg cct ccc acg ccg gag    435

Leu Glu Leu Gln Ala Glu Ile Leu Pro Arg Arg Pro Pro Thr Pro Glu

125                 130                 135                 140

gcc cag agc gaa gag gag aga tcc gat gag gag ccg gag gcc aaa gaa    483

Ala Gln Ser Glu Glu Glu Arg Ser Asp Glu Glu Pro Glu Ala Lys Glu

                145                 150                 155

gag gaa gag gaa aaa cca cac atg ccc acg gaa ttt gat ttt gat gat    531

Glu Glu Glu Glu Lys Pro His Met Pro Thr Glu Phe Asp Phe Asp Asp

            160                 165                 170

gag cca gtg aca cca aag gac tcc ctg att gac cgg aga cgc acc cca    579

Glu Pro Val Thr Pro Lys Asp Ser Leu Ile Asp Arg Arg Arg Thr Pro

        175                 180                 185

gga agc tca gcc cgg agc cag aaa cgg gag gcc cgc ctg gac aag gtg    627

Gly Ser Ser Ala Arg Ser Gln Lys Arg Glu Ala Arg Leu Asp Lys Val

    190                 195                 200

ctg tcg gac atg aag aga cac aag aag ctg gag gag cag atc ctt cgt       675

Leu Ser Asp Met Lys Arg His Lys Lys Leu Glu Glu Gln Ile Leu Arg

205                 210                 215                 220

acc ggg agg gac ctc ttc agc ctg gac tcg gag gac ccc agc ccc gcc       723

Thr Gly Arg Asp Leu Phe Ser Leu Asp Ser Glu Asp Pro Ser Pro Ala

                225                 230                 235

agc ccc cca ctc cga tcc tcc ggg agt agt ctc ttc cct cgg cag cgg       771

Ser Pro Pro Leu Arg Ser Ser Gly Ser Ser Leu Phe Pro Arg Gln Arg

            240                 245                 250

aaa tac tgattcccac tgctcctgcc tctagggtgc agtgtccgta cctgctggag        827

Lys Tyr

cctgggccct ccttccccag cccagacatt gagaaacttg ggaagaagag agaaacctca     887

agctcccaaa cagcacgttg cgggaaagag gaagagagag tgtgagtgtg tgtgtgtgtt     947

ttttctattg aacacctgta gagtgtgtgt gtgtgttttc tattgaacac ctatagagag    1007

agtgtgtgtg ttttctattg aacatctata tagagagagt gtgtgagtgt gtgttttcta    1067

ttgaacacct attcagagac ctggactgaa ttttctgagt ctgaaataaa agatgcagag    1127

ctatcatctc ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa                             1164

<210>2

<211>254

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Ser Leu Ala Arg Gly His Gly Asp Thr Ala Ala Ser Thr Ala Ala

1               5                   10                  15

Pro Leu Ser Glu Glu Gly Glu Val Thr Ser Gly Leu Gln Ala Leu Ala

            20                  25                  30

Val Glu Asp Thr Gly Gly Pro Ser Ala Ser Ala Gly Lys Ala Glu Asp

        35                  40                  45

Glu Gly Glu Gly Gly Arg Glu Glu Thr Glu Arg Glu Gly Ser Gly Gly

    50                  55                  60

Glu Glu Ala Gln Gly Glu Val Pro Ser Ala Gly Gly Glu Glu Pro Ala

65                  70                  75                  80

Glu Glu Asp Ser Glu Asp Trp Cys Val Pro Cys Ser Asp Glu Glu Val

                85                  90                  95

Glu Leu Pro Ala Asp Gly Gln Pro Trp Met Pro Pro Pro Ser Glu Ile

            100                 105                 110

Gln Arg Leu Tyr Glu Leu Leu Ala Ala His Gly Thr Leu Glu Leu Gln

        115                 120                 125

Ala Glu Ile Leu Pro Arg Arg Pro Pro Thr Pro Glu Ala Gln Ser Glu

    130                 135                 140

Glu Glu Arg Ser Asp Glu Glu Pro Glu Ala Lys Glu Glu Glu Glu Glu

145                 150                 155                 160

Lys Pro His Met Pro Thr Glu Phe Asp Phe Asp Asp Glu Pro Val Thr

                165                 170                 175

Pro Lys Asp Ser Leu Ile Asp Arg Arg Arg Thr Pro Gly Ser Ser Ala

            180                 185                 190

Arg Ser Gln Lys Arg Glu Ala Arg Leu Asp Lys Val Leu Ser Asp Met

        195                 200                 205

Lys Arg His Lys Lys Leu Glu Glu Gln Ile Leu Arg Thr Gly Arg Asp

    210                 215                 220

Leu Phe Ser Leu Asp Ser Glu Asp Pro Ser Pro Ala Ser Pro Pro Leu

225                 230                 235                 240

Arg Ser Ser Gly Ser Ser Leu Phe Pro Arg Gln Arg Lys Tyr

                245                 250

Claims (2)

1、氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：2的蛋白或核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO：1的基因在制备治疗乳腺癌的药物中的用途。

2、一种治疗乳腺癌的药物组合物，包括氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：2的蛋白和药学可接受的载体。

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