CN103450329B

CN103450329B - 3h-咪唑并吡啶-6-甲酰氨基酸苄酯、其合成、抗肿瘤活性和应用

Info

Publication number: CN103450329B
Application number: CN201210173686.5A
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 王玉记; 吴建辉; 敖仕松
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2032-05-29
Also published as: CN103450329A

Abstract

本发明公开了通式I代表的14种3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯(式中AA选自L-Ser残基，L-Glu(OBzl)残基，L-Phe残基，L-Val残基，L-Arg残基，L-Tyr残基，L-Ala残基，L-Trp残基，L-Asn残基，L-Met残基，L-Ile残基，Gly残基，L-Asp(OBzl)残基和L-Leu残基)、公开了它们的制备方法、公开了它们对HT-29、K562、A549、HL60四株肿瘤细胞增殖的抑制作用，进一步公开了它们对荷S180小鼠肿瘤增长的抑制作用，因而本发明公开了它们作为抗肿瘤药物的应用。

Description

3H-咪唑并吡啶-6-甲酰氨基酸苄酯、其合成、抗肿瘤活性和应用

发明领域

本发明涉及通式I代表的15种3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯(式中AA选自L-Ser残基，L-Glu(OBzl)残基，L-Phe残基，L-Val残基，L-Arg(NO₂)残基，L-Tyr残基，L-Ala残基，L-Trp残基，L-Asn残基，L-Met残基，L-Ile残基，Gly残基，L-Asp(OBzl)残基，L-His残基和L-Leu残基)、涉及它们的制备方法、涉及它们对HT-29、K562、A549、HL60四株肿瘤细胞增殖的抑制作用，进一步涉及它们对荷S180小鼠肿瘤增长的抑制作用，因而本发明涉及它们作为抗肿瘤药物的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

世界卫生组织(WHO)的官员在2009年初美国亚特兰大召丌的“国际肿瘤学”年会上声明，恶性肿瘤正严重威胁着人类的生命与健康，到2010年癌症将超过心血管病成为世界死亡人数最多的疾病。根据WHO的数据，2007年全球新确诊的肿瘤病人数已经达到1200万，而全球每年死于癌症的患者高达700万人以上。

治疗肿瘤方法主要有外科治疗、放射治疗和化学治疗，其中化学治疗因为抗肿瘤药的深入而被广泛的研究，现在已成为这三种手段中发展最快最有前景的治疗方法。临床应用的抗肿瘤药物存在的疗效不理想和毒性高等缺陷，使得研究疗效好和毒副作用低的新型抗肿瘤药物一直是药物研究的热点之一。在天然产物中骆驼蓬碱被广泛用作抗肿瘤先导结构。发明人披露，用氨基酸苄酯修饰骆驼蓬碱不仅可以提高活性，而且可以降低毒副作用。

近年来，人们对于含有咪唑并吡啶杂环类衍生物的结构、生物活性以及结构与活性相互关系有了广泛的研究和较为深入的认识。例如发明人发现，3H-咪唑并吡啶-6-甲酸是抗肿瘤活性确切的先导结构。根据氨基酸苄酯修饰骆驼蓬碱不仅可以提高活性而且可以降低毒副作用的经验，发明人认识到往3H-咪唑并吡啶-6-甲酸的羧基引入天然氨基酸苄酯可产生更为优秀的抗肿瘤活性。按照这些发现与认识，发明人提出与3H-咪唑并吡啶-6-甲酰氨基酸苄酯相关的发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供通式I代表的15种3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯，式中AA选自L-Ser残基，L-Glu(OBzl)残基，L-Phe残基，L-Val残基，L-Arg(NO₂)残基，L-Tyr残基，L-Ala残基，L-Trp残基，L-Asn残基，L-Met残基，L-Ile残基，Gly残基，L-Asp(OBzl)残基，L-His残基和L-Leu残基。

本发明的第二个内容是提供制备通式I的15种3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯的合方法，该方法包括：

(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸；

(2)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸转化为6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(3)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酯用高锰酸钾氧化为3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(4)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在NaOH溶液(1.5N)中皂化成3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸；

(5)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸与15种氨基酸苄酯(L-Ser-OBzl，L-Glu(OBzl)-OBzl，L-Phe-OBzl，L-Val-OBzl，L-Arg-OBzl，L-Tyr-OBzl，L-Ala-OBzl，L-Trp-OBzl，L-Asn-OBzl，L-Met-OBzl，L-Ile-OBzl，Gly-OBzl，L-Asp(OBzl)-OBzl，L-His-OBzl和L-Leu-OBzl)偶联得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰氨基酸苄酯。

本发明的第三个内容是评价通式I的15种3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯对HT-29、K562、A549、HL60四株肿瘤细胞增殖的抑制作用。

本发明的第四个内容是评价通式I的15种3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯对荷S180小鼠肿瘤增长的抑制作用。

本发明的第五个内容是阐述通式I的15种3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯作为抗肿瘤药物的应用。

附图说明

图1.3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯的合成路线.i)HCHO，H₂O，H₂SO₄，65℃；ii)MeOH，SOCl₂，0℃；iii)DMF，NMM，KMnO₄；iv)NaOH，H₂O，0℃；v)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，DMF.6a中AA＝L-Ser残基，6b中AA＝L-Glu(OBzl)残基，6c中AA＝L-Phe残基，6d中AA＝L-Val残基，6e中AA＝L-Arg(NO₂)残基，6f中AA＝L-Tyr残基，6g中AA＝L-Ala残基，6h中AA＝L-Trp残基，6i中AA＝L-Asn残基，6j中AA＝L-Met残基，6k中AA＝L-Ile残基，6l中AA＝Gly残基，6m中AA＝L-Asp(OBzl)残基，6n中AA＝L-His残基，6o中AA＝L-Leu残基.

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1 制备6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)

将10.0g(0.064mol)L-组氨酸在冰浴下置于250mL圆底烧瓶中，加入30mL蒸馏水，再逐滴加入2mL浓硫酸，搅拌均匀，完全溶解后加入10mL甲醛溶液(40％)，60℃反应8小时。反应物冷却至室温，用浓氨水在冰浴下调pH至6，有大量白色沉淀析出.过滤。滤饼用水洗并干燥，得到9.10g(91％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)167[M+H]⁺。

实施例2 制备6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)

冰浴下在500mL茄瓶里加100mL甲醇，用恒压漏斗缓慢滴加10mL二氯亚砜，1小时后加入5g(30mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)，室温反应3天后，TLC监测反应完全，反应混合物减压浓缩，残留物加甲醇溶解并减压浓缩。该操作重复3次得白色泡状固体，再加乙醚抽干重复3次得无色粉末，最后用甲醇/乙醚重结晶得4.2g(55％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)181[M+H]⁺。

实施例3 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(4)

冰浴下往100mL茄瓶里加2g(7.9mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯，加DMF使溶解。往该溶液滴加1mL三乙胺调pH到8，分三次加入1.5g(9.4mmol)高锰酸钾。反应6小时后，TLC监测反应完毕。反应物减压浓缩至干，得到的黑色固体用1N HCl溶液溶解，冰浴下滴加2NNaOH溶液调pH到7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，0.93g(66.4％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)177[M+H]⁺。

实施例4 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(5)

冰浴下在100mL茄瓶里加3mL NaOH溶液(1.5N)，10min后加入0.93g(5.3mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(4)，反应1小时后TLC显示反应完毕，冰浴下向反应液中滴加2N HCl溶液调pH到7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，得0.56g(65％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)163[M+H]⁺.Mp 286-287℃.[α]_D ²⁵＝32.2(c＝0.06，甲醇).IR(KBr)3253，1662，1602，1481，1354，1163，896，540.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝8.987(s，1H)，8.566(s，1H)，8.309(s，1H).

实施例5 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-丝氨酸苄酯(6a)

称取212mg(1.3mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸于100mL茄形瓶中，加入20mLDMF。在冰浴和搅拌下依次加入211mg(1.6mmol)HOBt及333mg(1.6mmol)DCC，活化30min。称取361mg(1.6mmol)HCl·Ser-OBzl于25mL小三角瓶中，用DMF溶解后，用NMM调pH至7，然后将该溶液滴加至茄形瓶的反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8。室温应过夜，TLC显示反应完毕后，反应混合物减压浓缩至干，残留物加50mL二氯甲烷溶解，过滤除去二环己基脲(DCU)，滤液层依次用饱和NaHCO₃溶液(20mL×3)和饱和NaCl溶液(20mL×3)各洗三遍，有机层用无水CaCl₂干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂)，得到的淡黄色固体，经二氯甲烷/石油醚重结晶得248mg(57％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)340[M-H]^-.Mp 117-118℃.[α]_D ²⁵＝14.1(c＝0.45，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝13.20(s，1H)，9.05(s，1H)，8.95(dd，J＝5.0Hz，J＝25.0Hz，1H)，8.56(s，1H)，8.26(s，1H)，7.37(m，5H)，5.40(t，J＝5.0Hz，1H)，5.19(s，2H)，4.70(m，1H)3.99(m，1H)，3.81(m，1H).

实施例6 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-谷氨酸双苄酯(6b)

按照实施例5的方法，从212mg(1.3mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和779mg(1.6mmol)Tos·Glu(OBzl)-OBzl得到356mg(58％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)472[M-H]^-.Mp 146-147℃.[α]_D ²⁵＝-16.9(c＝0.60，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝13.19(s，1H)，9.08(s，1H)，9.02(s，1H)，8.57(s，1H)，8.26(s，1H)，7.25(m，10H)，5.16(dd，J＝10Hz，J＝20Hz，2H)，5.08(s，2H)，4.74(m，1H)，2.50(m，2H)，2.27(m，2H).

实施例7 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-苯丙氨酸苄酯(6c)

按照实施例5的方法，从224mg(1.4mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和708mg(1.7mmol)Tos·Phe-OBzl，得380mg(69％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)400[M-H]^-.Mp 169-170℃.[α]_D ²⁵＝-4.8(c＝0.85，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝13.18(s，1H)，8.99(s，1H)8.94(d，J＝10.0Hz，1H)，8.56(s，1H)，8.23(s，1H)，7.36(m，5H)，7.22(m，5H)，5.17(s，2H)，4.90(dd，J＝5.0Hz，J＝15.0Hz，1H)，3.27(m，2H).

实施例8 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-缬氨酸苄酯(6d)

按照实施例5的方法，从163mg(1.0mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和455mg(1.2mmol)Tos·Val-OBzl得210mg(61％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)352[M-H]^-.Mp 145-146℃.[α]_D ²⁵＝-10.9(c＝0.65，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝9.22(s，1H)，8.80(d，J＝10.0Hz，1H)，8.62(s，1H)，8.29(s，1H)，7.36(m，5H)，5.20(dd，J＝10.0Hz，J＝15.0Hz，2H)，4.53(dd，J＝5.0Hz，J＝10.0Hz，1H)，2.29(m，1H)，0.94(d，J＝10.0Hz，6H).

实施例9 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-精氨酸(侧链硝基)苄酯(6e)

按照实施例5的方法，从194mg(1.2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和676mg(1.4mmol)Tos·Arg(NO₂)-OBzl得200mg(37％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)454[M-H]^-.Mp 184-186℃.[α]_D ²⁵＝12.2(c＝0.12，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝13.19(s，1H)，9.04(s，2H)，8.57(s，1H)，8.52(s，1H)，8.26(s，1H)，7.44(m，5H)，5.18(d，J＝15.0Hz，2H)4.63(dd，J＝5Hz，J＝15Hz，1H)，3.16(m，2H)，1.95(m，2H)，1.59(s，2H).

实施例10 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-酪氨酸苄酯(6f)

按照实施例5的方法，从163mg(1.0mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和532mg(1.2mmol)Tos·Tyr-OBzl得110mg(32％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)416[M-H]^-.Mp 113-115℃.[α]_D ²⁵＝-12.4(c＝0.14，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝13.20(s，1H)，9.25(s，1H)，8.99(s，1H)，8.82(s，1H)，8.56(s，1H)，8.23(s，1H)，7.36(m，5H)，6.99(d，J＝10.0Hz，2H)，6.44(d，J＝10.0Hz，2H)，5.16(s，2H)，4.82(dd，J＝5.0Hz，J＝15.0Hz，2H)，3.14(m，2H)，1.10(t，J＝5.0Hz，1H).

实施例11 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-丙氨酸苄酯(6g)

按照实施例5的方法，从22g mg(1.4mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和591mg(1.7mmol)Tos·Ala-OBzl得250mg(55％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)324[M-H]^-.Mp 159-160℃.[α]_D ²⁵＝-3.0(c＝0.4，甲醇).¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝11.221(s，1H)，8.929(s，1H)，8.755(d，J＝7.5Hz，1H)，8.403(s，1H)，8.270(s，1H)，7.295(m，5H)，5.222(t，J＝13.8Hz，2H)，4.851(m，1H)，1.628(d，J＝7.2Hz，3H).

实施例12 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-色氨酸苄酯(6h)

按照实施例5的方法，从242mg(1.5mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和596mg(1.8mmol)HCl·Trp-OBzl得320mg(49％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)439[M-H]^-.Mp 160-162℃.[α]_D ²⁵＝19.2(c＝0.04，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝13.18(s，1H)，10.90(s，1H)，8.96(s，1H)，8.89(s，1H)，8.56(s，1H)，8.23(s，1H)，7.53(d，J＝5.0Hz，1H)，7.32(m，5H)，7.28(s，1H)，7.15(s，1H)，7.07(t，J＝10.0Hz，1H)，6.96(t，J＝10.0Hz，1H)，5.14(dd，J＝10.0Hz，J＝20.0Hz，2H)，4.93(dd，J＝5.0Hz，J＝10.0Hz，1H)，3.41(m，2H).

实施例13 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-天冬酰胺苄酯(6i)

按照实施例5的方法，从335mg(2.0mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和622mg(2.4mmol)HCl·Asn-OBzl得362mg(48％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)367[M-H]^-.Mp 213-214℃.[α]_D ²⁵＝9.1(c＝0.75，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝9.1205(d，J＝8.5Hz，1H)，9.0059(s，1H)，8.5690(s，1H)，8.2793(s，1H)，7.3448(m，5H)，5.1176(s，2H)，4.9951(m，1H)，2.9106(d，J＝5.5Hz，1H)，2.8781(d，J＝5.5Hz，1H)，2.7520(d，J＝4.8Hz，1H)，2.7203(d，J＝4.6Hz，1H).

实施例14 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-蛋氨酸苄酯(6j)

按照实施例5的方法，从282mg(1.7mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和563mg(2.0mmol)HCl·Met-OBzl得280mg(42％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)384[M-H]^-.Mp 160-161℃.[α]_D ²⁵＝-17.5(c＝0.16，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝13.20(s，1H)，9.09(d，J＝5.0Hz，1H)，9.02(s，1H)8.57(s，1H)，8.26(s，1H)，7.35(m，5H)，5.19(dd，J＝5.0Hz，J＝20.0Hz，2H)，4.77(m，1H)，2.53(m，2H)，2.20(m，2H)，2.03(s，3H).¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝172.04，165.21，146.62，142.63，136.42，128.89，128.52，128.27，66.60，51.88，46.17，30.82，30.26，15.04，9.08.

实施例15 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-异亮氨酸苄酯(6k)

按照实施例5的方法，从193mg(1.2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和552mg(1.4mmol)Tos·Ile-OBzl得295mg(68％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)366[M-H]^-.Mp 139-140C.[α]_D ²⁵＝-8.5(c＝0.65，甲醇).¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝8.971(s，1H)，8.808(d，J＝8.7Hz，1H)，8.447(s，1H)，8.274(s，1H)，7.331(m，5H)，5.227(dd，J＝9.9Hz，J＝22.2Hz，2H)，4.819(dd，J＝3.3Hz，J＝8.7Hz，1H)，2.116(m，1H)，1.565(m，1H)，1.336(m，1H)，0.962(m，6H).

实施例16 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-甘氨酸苄酯(6l)

按照实施例5的方法，从258mg(1.6mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和649mg(1.9mmol)Tos·Gly-OBzl得314mg(64％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)310[M-H]^-.Mp 199-200℃.[α]_D ²⁵＝105.6(c＝0.50，甲醇).¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝13.139(s，1H)，9.175(s，1H)，9.015(s，1H)，8.571(s，1H)，8.293(s，1H)，7.346(m，5H)，5.175(s，2H)，4.185(s，2H).

实施例17 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-天冬氨酸双苄酯(6m)

按照实施例5的方法，从623mg(3.8mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1596mg(4.6mmol)HCl·Asp(OBzl)-OBzl得910mg(52％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)458[M-H]^-.Mp 172-173℃.[α]_D ²⁵＝1.2(c＝0.70，甲醇).¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝9.247(d，J＝8.7Hz，1H)，9.002(s，1H)，8.572(s，1H)，8.285(s，1H)，7.306(m，10H)，5.120(m，1H)，5.152(s，2H)，5.082(s，2H)，3.104(m，2H).

实施例18 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-组氨酸苄酯(6n)

按照实施例5的方法，从163mg(1.0mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和302mg(1.2mmol)HCl·His-OBzl得103mg(37％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)390[M-H]^-.Mp 135-136℃.[α]_D ²⁵＝19.4(c＝0.12，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝11.92(t，J＝40.0Hz，1H)，9.20(s，1H)8.99(s，1H)，8.55(s，1H)，8.25(s，1H)，7.61(s，1H)，7.34(m，5H)，6.82(s，1H)，5.14(s，2H)4.89(dd，J＝5.0Hz，J＝15.0Hz，1H)，3.16(m，2H).

实施例19 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-亮氨酸苄酯(6o)

按照实施例5的方法，从230mg(1.4mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和662mg(1.7mmol)Tos·Leu-OBzl得264mg(51％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)366[M-H]^-.Mp 168-169℃.[α]_D ²⁵＝-15.1(c＝0.65，甲醇).¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝8.946(s，1H)，8.674(d，J＝8.1Hz，1H)，8.433(s，1H)，8.262(s，1H)，7.275(m，5H)，5.258(s，2H)，4.887(dd，J＝6.9Hz，J＝14.7Hz，1H)，1.838(d，J＝6.6Hz，3H)，0.991(d，J＝5.7Hz，6H).

实验例1 6a-o抗肿瘤细胞增殖活性评价

本发明的化合物6a-o均用含1％DMSO的PBS配制成所需浓度。共使用了A549(人非小细胞肺癌细胞)，HT-29(人结肠癌细胞)，HL60(人早幼粒细胞白血病细胞)，K562(人白血病慢性粒细胞)4株肿瘤细胞。

将生长状态良好并处于对数生长期的A549和HT-29细胞以3×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl。在37℃、5％CO₂培养箱中培养4小时，按预设的浓度梯度400μM，40μM，10μM，5μM，1μM，100nM，5nM和1nM加入经灭菌处理的本发明的化合物，采用阿霉素作对照。继续培养48小时后，每孔加25μl浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4小时，小心除去上清液(悬浮细胞经离心后除去上清液)后每孔加入100μl DMSO(二甲基亚砜)，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定O.D.(吸光度)值。计算抑瘤率及IC₅₀。结果列入表1。

或分别将生长状态良好，处于对数生长期的HL60和K562细胞按照5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl。在37℃、5％CO₂培养箱中培养4小时，按预设的浓度梯度400μM，40μM，10μM，5μM，1μM，100nM，5nM和1nM加入经灭菌处理的本发明的化合物，采用阿霉素作对照。继续培养48小时后，每孔加25μl浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4小时，小心除去上清液(悬浮细胞经离心后除去上清液)后每孔加入100μl DMSO(二甲基亚砜)，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定O.D.(吸光度)值。计算抑瘤率及IC₅₀。结果也列入表1。结果表明本发明的化合物对四种肿瘤细胞都没有明显的细胞毒作用。

表1 6a-o的体外抗肿瘤细胞增殖活性(IC₅₀，μM)

实验例2 6a-o体内抗肿瘤活性评价

测定前将本发明的6a-o加吐温80助溶，溶于生理盐水。无菌条件下取接种于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为2×10⁷/mL，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2ml。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射0.2ml 6a-o的水溶液，连续给药7天，剂量为1μmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2ml生理盐水。以阿霉素(剂量为2μmol/kg)作阳性对照。实验进行至第8天，称小鼠体重，并剖取各组小鼠的肿瘤称重，最后统计各组动物的抑瘤率。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率％＝(1-给药组瘤重/空白组瘤重)×100％。以瘤重或百分抑瘤率表示化合物的活性，数据列入表2。

实验观察到，在低于2μmol/kg剂量下，阿霉素不显示抗肿瘤作用。在2μmol/kg剂量下，阿霉素虽然显示抗肿瘤作用，但是在治疗的第四天小鼠即丌始死亡，第五天没有小鼠存活，显示致命性毒性。在存活的4-5天内，小鼠显示躁动和不安等神经毒性症状。相反，1μmol/kg剂量下6a-o全部显示优秀的抗肿瘤作用。其中9个化合物的活性与阿霉素没有显著性差异，也就是说这9个化合物的抗肿瘤活性比阿霉素强2倍。在治疗的8天内，6a-o既没有引起任何小鼠死亡，即没有致命性毒性，也没有引起小鼠出现躁动和不安等神经毒性症状。因而在体内抗肿瘤方面，6a-o的活性高。在致命性毒性和神经毒性方面，6a-o比阿霉素低很多。

表2 化合物6a-o对S180荷瘤小鼠的瘤重的影响

n＝12；瘤重表示为均值±SD g；a)与生理盐水组比较p＜0.01；b)与生理盐水组比较p＜0.05；c)与生理盐水组比较p＜0.01，与阿霉素比p＞0.05。

Claims

1.通式I的15种3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯，式中AA选自L-Ser残基，L-Glu(OBzl)残基，L-Phe残基，L-Val残基，L-Arg(NO₂)残基，L-Tyr残基，L-Ala残基，L-Trp残基，L-Asn残基，L-Met残基，L-Ile残基，Gly残基，L-Asp(OBzl)残基，L-His残基和L-Leu残基

2.制备权利要求1的通式I的15种3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯的方法，该方法包括：

(4)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在1.5N的NaOH溶液中皂化成3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸；

(5)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸与15种氨基酸苄酯偶联得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰氨基酸苄酯：

其中所述15种氨基酸苄酯为L-Ser-OBzl，L-Glu(OBzl)-OBzl，L-Phe-OBzl，L-Val-OBzl，L-Arg(NO₂)-OBzl，L-Tyr-OBzl，L-Ala-OBzl，L-Trp-OBzl，L-Asn-OBzl，L-Met-OBzl，L-Ile-OBzl，Gly-OBzl，L-Asp(OBzl)-OBzl，L-His-OBzl和L-Leu-OBzl。

3.权利要求1的通式I的15种3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰氨基酸苄酯对HT-29、K562、A549、HL60四株肿瘤细胞增殖的抑制作用。

4.权利要求1的通式I的15种3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰氨基酸苄酯在制备抗肿瘤药物中的应用。