CN105175492A

CN105175492A - 咪唑并吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl，其合成，活性和应用

Info

Publication number: CN105175492A
Application number: CN201410261277.XA
Authority: CN
Inventors: 赵明; 彭师奇; 吴建辉; 王玉记; 张薪; 赵欣尉; 李骏
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明公开了下式的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-苄酯。公开了它的制备方法，公开了它的抗肿瘤，抗血栓以及抗炎三重活性，因而本发明公开了它在制备具有抗肿瘤，抗血栓和抗炎三重作用的药物中的应用。

Description

咪唑并吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl，其合成，活性和应用

发明领域

本发明涉及3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl，涉及它的制备方法、涉及它们对MCF-7、HL60、K562、U₂OS、SH-Sy5y、HaCaT六株肿瘤细胞增殖的抑制作用，进一步涉及它对荷S180小鼠肿瘤增长的抑制作用、抗血栓活性和抗炎活性，因而本发明涉及它作为抗肿瘤药物的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

癌症是一组可影响身体任何部位的多种疾病的通称。使用的其它术语为恶性肿瘤和赘生物。据世界卫生组织统计，癌症是世界上的头号死因之一，尤其是在发展中国家。而全世界癌症死亡人数预计将继续上升，到2030年将超过1310万。因此，开发新的高效，低毒，毒副作用小的抗肿瘤药物一直是新药研究的重要课题之一。

随着对肿瘤特性和发病本质的认识，发明人曾经公开下式代表的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表甘氨基酸或其它L-氨基酸残基)在1μmol/kg剂量下显示良好的抗肿瘤活性。通过进一步研究发明人认识到，在3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl的6-甲酰基和AA-OBzl基之间插入Met残基，不仅可以延缓它的代谢达到提高抗肿瘤活性的目的，而且可以增加抗炎症和抗血栓活性。炎症好血栓是危害肿瘤患者预后的并发症。通过这种修饰，获得具有抗肿瘤，抗炎症和抗血栓三重活性的化合物，具有良好的临床应用前景。根据这些认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl。

本发明的第二个内容是提供3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl的合成方法，该方法包括：

(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸；

(2)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸转化为6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(3)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酯用高锰酸钾氧化为3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(4)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在NaOH溶液(2N)中皂化成3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸；

(5)Boc-Met与Pro-OBzl偶联得到Boc-Met-Pro-OBzl；

(6)Boc-Met-AA-OBzl在4N氯化氢的乙酸乙酯溶液中托Boc保护基得到Met-Pro-OBzl；

(7)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸与Met-Pro-OBzl偶联得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl。

本发明的第三个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

本发明的第四个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl对肿瘤增长的抑制作用。

本发明第五个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl的抗血栓作用。

本发明第六个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl对炎症的抑制作用。

附图说明

图1.3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl的合成路线.i)HCHO，H₂O，H₂SO₄，65℃；ii)MeOH，SOCl₂，0℃；iii)DMF，三乙胺，KMnO₄；iv)NaOH，H₂O，0℃；v)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，四氢呋喃(THF)；vi)4N氯化氢的乙酸乙酯溶液，O℃；vii)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，DMF。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1化合物6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(1)的制备

10.00g(64.5mmol)L-组氨酸，30mL水混合于100mL茄瓶中，冰浴下，用恒压漏斗逐滴加入2mL浓硫酸，随浓硫酸的加入，原料逐渐溶解，待其完全溶解后，向反应液中加入40％的甲醛溶液10mL，在微波加速反应仪65℃下反应5小时。反应完毕后，冰浴下缓慢滴加浓氨水调溶液pH6-7，有大量无色沉淀析出，减压过滤，得到10.76g(99.2％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：168[M+H]⁺。

实施例2化合物6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(2)的制备

冰浴下在100mL茄瓶里加15.6mL甲醇，冰浴下，用恒压漏斗缓慢滴加1.56mL二氯亚砜，30min后加入1.00g(6mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)，室温反应3天后，TLC监测反应完全，反应混合物减压浓缩，残留物加甲醇溶解并减压浓缩。该操作重复3次得无色泡状固体，再加乙醚抽干重复3次得无色粉末，最后用甲醇/乙醚重结晶得0.58g(53％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)181[M+H]⁺。

实施例3化合物3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)的制备

冰浴下在100mL茄瓶里加1.1g(6.1mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)，加DMF使溶解。向该溶液中滴加1mL三乙胺调pH到8，分三次加入1.2g(7.6mmol)高锰酸钾。反应6小时后，TLC监测反应完毕。反应物吹干，得到的黑色固体用1NHCl溶液溶解，冰浴下滴加2NNaOH溶液调pH到7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，得0.68g(63.2％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)177[M+H]⁺。

实施例4化合物3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(4)的制备

冰浴下在100mL茄瓶里加40mLNaOH溶液(2N)，10min后加入5.30g(29.9mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(4)，反应1小时后TLC显示反应完毕，冰浴下向反应液中滴加2NHCl溶液调pH到7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，得1.50g(30％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)162[M-H]^-。

实施例5化合物Boc-Met-Pro-OBzl的制备

称取1.00g(4.0mmol)Boc-Met于100mL茄形瓶中，加入50mLTHF。在冰浴和搅拌下依次加入690mg(5.11mmol)HOBt及990mg(4.8mmo1)DCC，活化30min。称取1.1g(4.6mmol)TosPro-OBzl于50mL小三角瓶中，用THF溶解后，用NMM调pH至7，然后将该溶液滴加至茄形瓶的反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8。室温反应过夜，TLC显示反应完毕后，反应混合物减压浓缩至干，残留物加20mL二氯甲烷溶解，过滤除去二环己基脲(DCU)，滤液层依次用饱和NaHCO₃水溶液(20mL×3)和饱和NaCl水溶液(20mL×3)各洗三遍，有机层用无水CaCl₂干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂)，得到的淡黄色固体，经二氯甲烷/石油醚重结晶得0.91g(52％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：437[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝7.70(m，1H)，7.35(m，5H)，5.57(d，J＝6Hz，1H)，5.10(s，2H)，4.40(m，1H)，4.33(m，1H)，3.69(m，1H)，3.57(m，1H)，2.24(m，2H)，2.00(s，3H)，1.74(m，6H)，1.62(m，2H)，1.36(s，9H)。

实施例6化合物HCI·Met-Pro-OBzl的制备

称取482mg(0.75mmol)Boc-Met-Pro-OBzl于100mL茄形瓶中，加入10mL浓度为4M的氯化氢的乙酸乙酯溶液并在冰浴下搅拌，在瓶口安装干燥管，室温下反应，TLC显示反应完毕后，减压抽干溶剂，依次加入乙酸乙酯，减压抽干，重复两次，加入无水乙醚磨洗，减压抽干，重复三次。得326mg(79％)标题化合物。ESI-MS(m/z)：373[M+H]^-。

实施例7化合物3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl(5)的制备

称取144mg(0.88mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸于100mL茄形瓶中，加入50mLDMF。在冰浴和搅拌下依次加入150mg(1.11mmol)HOBt及216mg(1.05mmol)DCC，活化30min。称取326mg(0.80mmol)HClMet-Pro-OBzl于25mL小三角瓶中，用DMF溶解后，用NMM调pH至7，然后将该溶液滴加至茄形瓶的反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8。室温反应过夜，TLC显示反应完毕后，反应混合物减压浓缩至干，残留物加20mL二氯甲烷溶解，过滤除去二环己基脲(DCU)，滤液层依次用饱和NaHCO₃水溶液(20mL×3)和饱和NaCl水溶液(20mL×3)各洗三遍，有机层用无水CaCl₂干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂)，得到的淡黄色固体，经二氯甲烷/石油醚重结晶得33mg(7.9％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：482[M+H]^-；Mp：112-114℃；[α]_D ²⁵＝-8.33(c＝0.10，甲醇)；IR(KBr)：3313，3078，2345，1744，1651，1574，1520，1462，1450，1269，922，802，777，636；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.11(s，1H)，8.99(s，1H)，8.78(d，J＝9Hz，1H)，8.67(d，J＝9Hz，1H)，8.55(s，2H)，8.24(s，1H)，7.36(m，5H)，5.14(s，2H)，4.97(m，1H)，4.45(m，1H)，3.84(m，1H)，3.72(m，1H)，2.52(m，2H)，1.97(m，9H)。

实验例1评价化合物5抑制肿瘤细胞增殖活性

本发明的化合物5用含1％DMSO的PBS配制成所需浓度。共使用了MCF-7(人乳腺癌细胞)，U₂OS(人骨肉瘤细胞)，SH-Sy5y(神经母细胞瘤细胞)，HaCaT(人永生化表皮细胞)，HL60(人早幼粒细胞白血病细胞)，K562(人白血病慢性粒细胞)6株肿瘤细胞。

将生长状态良好，处于对数生长期的细胞按照5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl。在37℃、5％CO₂培养箱中培养4小时，按预设的浓度梯度100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，加入经灭菌处理的化合物5，采用阿霉素作对照。继续培养48小时后，每孔加25μl浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4小时，小心除去上清液(悬浮细胞经离心后除去上清液)后每孔加入100μlDMSO(二甲基亚砜)，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定O.D.(吸光度)值。计算抑瘤率及IC50。结果也列入表1。结果表明，化合物5对6种肿瘤细胞增殖的IC₅₀几乎都超过100μM，没有显示细胞毒作用。

表1化合物5的体外抗肿瘤细胞增殖活性(IC₅₀，μM)

实施例2评价化合物5抑制肿瘤生长的活性

测定前将本发明的化合物5加吐温80助溶，溶于生理盐水。无菌条件下取接种于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为2×10⁷/mL，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2ml。肿瘤接种24h后，治疗组15只小鼠每日腹腔注射0.2ml化合物5的水溶液，连续给药7天，剂量为100nmol/kg和20nmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2ml生理盐水。以阿霉素(剂量为2μmol/kg)作阳性对照。实验进行至第8天，称小鼠体重，并剖取各组小鼠的肿瘤称重，最后统计各组动物的抑瘤率。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率％＝(空白组瘤重-给药组瘤重/空白组瘤重)×100％。以瘤重或百分抑瘤率表示化合物的活性，数据列入表2。

由表2可以看出，在100nmol/kg和20nmol/kg的剂量下，化合物5治疗小鼠的瘤重都明显小于含吐温80的生理盐水治疗小鼠的瘤重，说明化合物5的有效剂量低达20nmol/kg。这个有效剂量比发明人曾经公开的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表甘氨基酸或其它L-氨基酸残基)的有效剂量1μmol/kg低50倍。

表2化合物5对S180荷瘤小鼠的瘤重的影响

瘤重表示为均值±SDg；生理盐水是含吐温80的生理盐水；a)与含吐温80的生理盐水组比p＜0.01；b)与含吐温80的生理盐水组比p＜0.01组比p＜0.01，与20nmol/kg化合物5组比p＜0.05。

实验例3评价化合物5的抗血栓活性

将聚乙烯管拉成一端为斜口的细管，定长为10.0cm，分别为右经静脉(管径较粗)及左颈动脉(管径较细)插管；中段聚乙烯管定长为8.0cm，血栓线压在颈动脉插管方向，插管前需在管中充满肝素。

化合物5加吐温80助溶，溶于生理盐水，以20nmol/kg的剂量给大鼠灌胃，30分钟后腹腔注射20％的乌拉坦麻醉。仰卧位将大鼠固定于鼠板上，剪开颈部皮肤，分离右颈总动脉及左颈静脉，血管下压线，结扎远心端，静脉靠远心端处剪一小口，进行静脉端插管，注射肝素，系线固定，再用动脉夹夹住动脉近心端，靠近远心端方向剪一小口，进行动脉端结扎，系线固定后松开动脉夹，建立体外循环旁路。循环15分钟后先剪断静脉端观察血液循环是否正常，若正常从动脉端取出血栓线，在纸上沾干浮血后称量并记录其湿重，大鼠断颈处死。每组大鼠10只，最后进行数据统计并评价化合物活性。数据列入表3。

表3.化合物5抗栓活性评价

n＝10；生理盐水是含吐温80的生理盐水；a)与含吐温80的生理盐水组比p＜0.01，与阿司匹林比p＞0.05。

实验例4评价化合物5的抗炎活性

化合物5加吐温80助溶，溶于生理盐水，以20nmol/kg的剂量给小鼠灌胃。20±2gICR雄性小鼠随机分为含吐温80的生理盐水组，阿司匹林组及化合物5组.小鼠使用前静息1天，操作间保持室内温度22℃，每组小鼠10只。一次给药30分钟后往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.03mL)，2小时后将小白鼠乙醚麻醉，颈椎脱臼处死。将小鼠的左，右耳剪下，用直径7mm的打孔器在两耳的相同位置，取圆形耳片，分别称重，求出两圆耳片的重量差作为肿胀度，代表炎症水平。肿胀度＝左耳原片重量-右耳原片重量。

2)给药方法和剂量

给药方式为灌胃。空白对照为含吐温80的生理盐水，给药剂量为0.2mL/20g；阳性对照为阿司匹林，给药剂量为1.11mmol/kg；化合物5的给药剂量为20nmol/kg.

3)统计方法

本实验数据统计均采用t检验和方差分析，肿胀度以表示。

4)实验结果见表4。

从表4可以看出，化合物5治疗组的小鼠耳肿胀度显著小于生理盐水组小鼠耳肿胀度，化合物5在20nmol/kg剂量下具有抗炎作用，表明化合物5在发挥抗肿瘤作用的剂量下，还具有抗炎症作用。

表4化合物5的体内抗炎活性评价

n＝10；a)与含吐温80的生理盐水组比p＜0.01。

Claims

1.下式的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl。

2.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl的制备方法，该方法包括：

(5)Boc-Met与Pro-OBzl偶联得到Boc-Met-Pro-OBzl；

(6)Boc-Met-Pro-OBzl在4N氯化氢的乙酸乙酯溶液中脱Boc得到Met-Pro-OBzl；

(7)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸与7种Met-Pro-OBzl残基偶联得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl。

3.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl在制备抗肿瘤药物的应用。

4.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl在制备抗血栓药物中的应用。

5.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl在制备抗炎药物中的应用。

6.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Pro-OBzl在制备具有抗肿瘤，抗血栓和抗炎三重疾病作用的药物中的应用。