CN106146615B - 咪唑并吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯,其合成,活性和应用 - Google Patents

咪唑并吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯,其合成,活性和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了下式的咪唑并吡啶‑6‑甲酰‑氨基酸苄酯,公开了它们的制备方法、公开了它们对肿瘤生长的抑制作用,公开了它们的抗炎活性。结果表明,它们具有抗肿瘤和抗炎症活性,具有良好的临床应用前景。
Figure DSA0000114940410000011

Description

咪唑并吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯,其合成,活性和应用
发明领域
本发明涉及下式的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA代表L-Pro,L-Gly,L-Ala,L-C(PMB),L-Phe,L-Ile,L-Leu,L-Met,L-Asn,L-Arg,L-Ser,L-Tyr,L-Val,L-Trp,L-Thr和L-Glu(OBzl)残基),涉及它的制备,涉及它对肿瘤细胞增殖的抑制作用,涉及它对肿瘤生长的抑制作用,进一步涉及它的抗炎活性。结果表明,3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)是具有抗肿瘤和抗炎双重活性的化合物。本发明属于生物医药领域。
Figure BSA0000114940440000011
背景技术
癌症是一组可影响身体任何部位的多种疾病的通称。使用的其它术语为恶性肿瘤和赘生物。据世界卫生组织统计,癌症是世界上的头号死因之一,尤其是在发展中国家。而全世界癌症死亡人数预计将继续上升,到2030年将超过1310万。因此,开发新的高效,低毒,毒副作用小的抗肿瘤药物一直是新药研究的重要课题之一。
随着对肿瘤特性和发病本质的认识,发明人曾经公开下式代表的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表L-氨基酸残基)在1μmol/kg剂量下显示一定的抗肿瘤活性。通过进一步研究发明人认识到,在3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl的6-甲酰基和AA-OBzl基之间插入Trp残基,不仅可以延缓它的代谢达到提高抗肿瘤活性的目的,而且可以获得抗炎症活性。炎症是危害肿瘤患者预后的并发症。通过这种修饰,获得的下面通式的具有抗肿瘤和抗炎症双重活性的化合物,具有良好的临床应用前景。根据这些认识,发明人提出了本发明。
Figure BSA0000114940440000012
发明内容
本发明的第一个内容是提供3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(1(式中AA代表L-Pro,L-Gly,L-Ala,L-C(PMB),L-Phe,L-Ile,L-Leu,L-Met,L-Asn,L-Arg,L-Ser,L-Tyr,L-Val,L-Trp,L-Thr和L-Glu(OBzl)残基)。
Figure BSA0000114940440000021
本发明的第二个内容是提供制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)的合成方法,该方法包括:
(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸;
(2)6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸转化为6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯;
(3)6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯用高锰酸钾氧化为3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯;
(4)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在NaOH溶液(2N)中皂化成3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸;
(5)Boc-Trp与氨基酸苄酯(选自L-Pro,L-Gly,L-Ala,L-C(PMB),L-Phe,L-Ile,L-Leu,L-Met,L-Asn,L-Arg,L-Ser,L-Tyr,L-Val,L-Trp,L-Thr和L-Glu(OBzl氨基酸苄酯)偶联得到Boc-Trp-AA-OBzl;
(6)Boc-Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)在4N氯化氢/乙酸乙酯中得到L-Trp-AA-OBzl;
(7)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸与L-Trp-AA-OBzl偶联得到3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl。
本发明的第三个内容是评价3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)对肿瘤细胞增殖的抑制作用。
本发明的第四个内容是评价3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)对S180小鼠肿瘤生长的抑制作用。
本发明的第五个内容是评价3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)对ICR雄性小鼠耳肿胀模型上的抗炎活性。
附图说明
图1.3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl的合成路线.i)HCHO,H2O,H2SO4,65℃;ii)MeOH,SOCl2,0℃;iii)DMF,三乙胺,KMnO4;iv)NaOH,H2O,0℃;v)二环己基碳二亚胺(DCC),1-羟基苯并三唑(HOBt),N-甲基吗啉(NMM),四氢呋喃(THF);vi)4N氯化氢/乙酸乙酯,0℃;vii)二环己基碳二亚胺(DCC),1-羟基苯并三唑(HOBt),N-甲基吗啉(NMM),DMF;viii)二环己基碳二亚胺(DCC),1-羟基苯并三唑(HOBt),N-甲基吗啉(NMM),DMF。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸(1)
10.00g(64.5mmol)L-组氨酸,30mL水混合于100mL茄瓶中,冰浴下用恒压漏斗逐滴加入2mL浓硫酸,随浓硫酸的加入,原料逐渐溶解,待其完全溶解后,向反应液中加入10mL40%的甲醛溶液,在微波加速反应仪65℃下反应5小时。反应完毕后,冰浴下缓慢滴加浓氨水调溶液pH 7,有大量无色沉淀析出,减压过滤,得到10.76g(99.2%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):168[M+H]+
实施例2制备6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(2)
冰浴下在100mL茄瓶里加15.6mL甲醇,用恒压漏斗缓慢滴加1.56mL二氯亚砜,30min后加入1.00g(6mmol)6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸(2),室温反应3天后,TLC监测反应完全,反应混合物减压浓缩,残留物加甲醇溶解并减压浓缩。该操作重复3次得白色泡状固体,再加乙醚抽干重复3次得无色粉末,最后用甲醇/乙醚重结晶得0.58g(53%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z)181[M+H]+
实施例3制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)
冰浴下在100mL茄瓶里加1.1g(6.1mmol)6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3),加DMF使溶解。向该溶液中滴加1mL三乙胺调pH 8,分3次加入1.2g(7.6mmol)高锰酸钾。反应6小时后,TLC监测反应完毕。反应物减压浓缩至干,得到的黑色固体用1N HCl溶液溶解,冰浴下滴加2N NaOH溶液调pH 7,析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化,得0.68g(63%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z)177[M+H]+
实施例4制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸(4)
冰浴下在100mL茄瓶里加40mL NaOH溶液(2N),10min后加入5.30g(29.9mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(4),反应1小时后TLC显示反应完毕,冰浴下向反应液中滴加2NHCl溶液调pH到7,析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化,得1.50g(30%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z)162[M-H]-
实施例5制备Boc-Trp-Asp(OBzl)-OBzl
称取4.54g(14.93mmol)Boc-Trp于250mL茄瓶中,加入50mL THF。在冰浴和搅拌下依次加入1.92g(14.93mmol)HOBt及3.52g(17.08mmol)DCC,活化30min。称取6.8g(14.24mmol)Tos·Asp(OBzl)-OBzl于100mL小三角瓶中,用THF溶解后,于冰浴下用NMM调pH至7,然后将该溶液滴加至茄形瓶的反应液中,最后用NMM调反应液pH值至8。室温反应过夜,TLC显示反应完毕后,反应混合物减压浓缩至于,残留物加60mL乙酸乙酯溶解,过滤除去二环己基脲(DCU),滤液层依次用饱和NaHCO3溶液(20mL×3)和饱和NaCl溶液(20mL×3)洗,有机层用无水Na2SO4干燥,过滤、滤液减压浓缩至干,得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂),得到4.7g(51.37%)标题化合物,为无色固体。
实施例6制备Boe-Trp-AA-OBzl(式中AA代表L-Pro,L-Gly,L-Ala,L-Cys(PMB),L-Phe,L-Ile,L-Leu,L-Met,L-Asn,L-Arg,L-Ser,L-Tyr,L-Val,L-Trp,L-Thr和L-Glu(OBzl)残基)
按照实施例5的方法,从912mg(3mmol)Boc-Trp和(3.6mmol)Tos·AA-OBzl得到标题化合物,为无色固体。收率为80-90%。
实施例7制备HCl·Trp-Asp(OBzl)-OBzl
将3g Boc-Trp-Asp(OBzl)-OBzl置于100mL茄瓶中,用15mL干燥乙酸乙酯将其完全溶解,于冰浴下搅拌并加入30mL 4N氯化氢/乙酸乙酯,于冰浴下搅拌1.5h,有无色固体析出。TLC显示反应完毕后,将反应液于37℃温水浴下减压浓缩。将残留物用无水乙醚(10mL×3)减压浓缩,得到1.997g(80%)标题化合物,为无色固体。
实施例8制备HCl·Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)
按照实施例7的方法,从1.202g Boc-Trpt-AA-OBzl得到标题化合物,为无色固体。收率为95-98%。
实施例9制备3H-眯唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Asp(OBzl)-OBzl(5a)
称取163mg(1mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸于100mL茄瓶中,加入15mLDMF。在冰浴和搅拌下加入380mg(1mmol)HATU,活化30min。称取531.5mg(1mmol)HCl·Trp-Asp(OBzl)-OBzl于50mL小三角瓶中,用DMF溶解后,然后将该溶液滴加至茄形瓶的反应液中,最后用NMM调反应液pH值至8。室温搅拌过夜,TLC显示反应完毕后,将反应混合物减压浓缩至干,残留物加60mL乙酸乙酯溶解,过滤除去不溶物,滤液层依次用饱和NaHCO3溶液(20mL×3)和饱和NaCl溶液(20mL×3)洗,有机层用无水Na2SO4干燥,过滤,滤液减压浓缩至干,得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂),得到40mg(9%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):644.94[M+H]+;Mp:90~92℃;[α]D 25=-110.00(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.15(s,1H),10.80(s,1H),8.93(s,1H),8.89(d,J=6.0Hz,1H),8.70(d,J=9.0Hz,1H),8.53(s,1H),8.20(s,1H),7.57(d,J=6.0Hz,1H),7.56-6.87(m,10H),7.13(s,1H),7.02(t,J=9.0Hz,J=18.0Hz,1H),6.88(t,J=9.0Hz,J=18.0Hz,1H),5.09(d,J=12.0Hz,4H),4.90(m,1H),4.80(m,1H),3.11-3.35(m,2H),2.96(dd,J=6.0Hz,J=15.0Hz,1H),2.80(dd,J=6.0Hz,J=15.0Hz,1H)。
实施例10制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Pro-OBzl(5b)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.026g(2.4mmol)HCl·Trp-Pro-OBzl得到107mg(10%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):537[M+H]+;Mp:187~189℃;[α]D 25=-106.66(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.13(s,1H),10.84(s,1H),8.95(s,1H),8.76(d,J=6.0Hz,1H),8.53(s,1H),8.20(s,1H),7.57(d,J=6.0Hz,1H),7.56-6.87(m,6H),7.24(s,1H),7.04(t,J=9.0Hz,J=18.0Hz,1H),6.94(t,J=9.0Hz,J=18.0Hz,1H),5.17(s,2H),5.04(m,1H),4.46(m,1H),3.65-3.75(m,1H),3.2(m,2H),2.2(m,1H),1.87(m,3H)。
实施例11制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Trp-OBzl(5c)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.196g(2.4mmol)HCl·Trp-Trp-OBzl得到37.5mg(3.0%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):625.94[M+H]+;Mp:109~111℃;[α]D 25=-110.00(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.12(s,1H),10.78(s,1H),8.94(s,1H),8.89(d,J=9Hz,1H),8.52(s,1H),8.24(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.31(m,6H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.06(m,1H),6.95(m,1H),5.13(q,J=15Hz,J=15Hz,2H),4.90(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.00(s,2H),3.30(m,2H)。
实施例12制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Val-OBzl(5d)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.031g(2.4mmol)HCl·Trp-Val-OBzl得到216mg(20%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):539.94[M+H]+;Mp:128~130℃;[α]D 25=-70.00(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.15(s,1H),10.80(s,1H),8.92(s,1H),8.73(d,J=9Hz,1H),8.58(d,J=6Hz,1H),8.53(s,1H),8.20(s,1H),7.51(d,J=6Hz,1H),7.31(m,6H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.04(t,J=9.0Hz,J=18.0Hz,1H),6.94(t,J=9.0Hz,J=18.0Hz,1H),5.13(q,J=15Hz,J=9Hz,2H),4.98(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.31(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),3.43(m,2H),2.11(m,1H),0.89(t,J=6.0Hz,J=12.0Hz,6H)。
实施例13制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Ala-OBzl(5e)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和0.963g(2.4mmol)HCl·Trp-Ala-OBzl得到255mg(25%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):510.94[M+H]+;Mp:68~71℃;[α]D 25=-11.00(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.12(s,1H),10.80(s,1H),8.94(s,1H),8.78(d,J=9Hz,1H),8.52(s,1H),8.24(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.31(m,6H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.06(m,1H),6.95(m,1H),5.13(q,J=15Hz,J=15Hz,2H),4.90(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.43(q,J=9Hz,J=6Hz,2H),3.26(m,2H),1.35(d,J=9Hz,3H)。
实施例14制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Met-OBzl(5f)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.107g(2.4mmol)HCl·Trp-Met-OBzl得到30mg(2.6%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):570.94[M+H]+;Mp:123~125℃;[α]D 25=-101.00(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.13(s,1H),10.80(s,1H),8.94(s,1H),8.78(d,J=9Hz,2H),8.53(s,1H),8.18(s,1H),7.60(d,J=9Hz,1H),7.31(m,6H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.04(t,J=9.0Hz,J=18.0Hz,1H),6.94(t,J=9.0Hz,J=18.0Hz,1H),5.13(s,2H),4.90(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.50(q,J=9Hz,J=6Hz,2H),3.26(m,2H),2.47(m,1H),2(m,5H)。
实施例15制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Ile-OBzl(5g)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.064g(2.4mmol)HCl·Trp-Ile-OBzl得到200mg(18%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):552.94[M+H]+;Mp:131~133℃;[α]D 25=-111.00(c=0.1,甲醇),1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.12(s,1H),10.80(s,1H),8.94(s,1H),8.78(d,J=9Hz,1H),8.52(s,1H),8.24(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.31(m,6H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.06(m,1H),6.95(m,1H),5.13(q,J=9Hz,J=15Hz,2H),4.98(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.35(q,J=9Hz,J=6Hz,2H),3.26(m,2H),1.85(m,1H),1.40(m,1H),1.18(m,1H),0.86(m,6H)。
实施例16制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Leu-OBzl(5h)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.064g(2.4mmol)HCl·Trp-Leu-OBzl得到200mg(18%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):552.94[M+H]+;Mp:68~71℃;[α]D 25=-11.00(c=0.1,甲醇),1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.12(s,1H),10.80(s,1H),8.94(s,1H),8.78(d,J=9Hz,1H),8.52(s,1H),8.24(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.31(m,6H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.06(m,1H),6.95(m,1H),5.13(q,J=9Hz,J=15Hz,2H),4.98(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.35(q,J=9Hz,J=6Hz,2H),3.2(m,2H),1.65(m,3H),0.9(d,J=9Hz,3H),0.85(d,J=9Hz,3H)。
实施例17制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Phe-OBzl(5i)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.189g(2.4mmol)HCl·Trp-Phe-OBzl得到23mg(2.0%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):586.94[M+H]+;Mp:141~143℃;[α]D 25=-70.00(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.12(s,1H),10.80(s,1H),8.94(s,1H),8.78(d,J=9Hz,1H),8.52(s,1H),8.24(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.31(m,11H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.06(m,1H),6.95(m,1H),5.13(q,J=15Hz,J=9Hz,4H),4.90(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.78(q,J=9Hz,J=6Hz,2H),3.26(m,4H)。
实施例18制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Gly-OBzl(5j)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和930g(2.4mmol)HCl·Trp-Gly-OBzl得到159mg(16%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):496.94[M+H]+;Mp:68~71℃;[α]D 25=-98.00(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.12(s,1H),10.78(s,1H),8.94(s,1H),8.89(d,J=9Hz,1H),8.52(s,1H),8.24(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.31(m,6H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.06(m,1H),6.95(m,1H),5.13(q,J=9Hz,J=15Hz,2H),4.90(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.00(s,2H),3.30(m,2H)。
实施例19制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Tyr-OBzl(5k)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.184g(2.4mmol)HCl·Trp-Tyr-OBzl得到60mg(2.6%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):602.94[M+H]+;Mp:100~101℃;[α]D 25=-120.00(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.12(s,1H),10.80(s,1H),9.2(s,1H),8.94(s,1H),8.78(d,J=9Hz,1H),8.52(s,1H),8.24(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.31(m,11H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.06(m,1H),6.95(m,1H),5.13(q,J=15Hz,J=15Hz,4H),4.90(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.78(q,J=9Hz,J=6Hz,2H),3.20(m,2H),2.95(m,2H)。
实施例20制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Ser-OBzl(5l)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.002g(2.4mmol)HCl·Trp-Ser-OBzl得到42mg(4.0%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):526.94[M+H]+;Mp:118~120℃;[α]D 25=-101.00(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.12(s,1H),10.78(s,1H),8.94(s,1H),8.89(d,J=9Hz,1H),8.52(s,1H),8.24(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.31(m,6H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.06(m,1H),6.95(m,1H),5.13(q,J=9Hz,J=15Hz,2H),4.90(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.50(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),3.75(m,2H),3.49(m,2H),3.22(m,2H)。
实施例21制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Cys(PMB)-OBzl(5m)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.808g(2.4mmol)HCl·Trp-Cys(PMB)-OBzl得到265mg(2.6%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):662.94[M+H]+;Mp:98~100℃;[α]D 25=-110.00(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.12(s,1H),10.78(s,1H),8.94(s,1H),8.89(d,J=9Hz,1H),8.52(s,1H),8.24(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.31(m,6H),7.13(d,J=3Hz,3H),7.06(m,3H),6.95(m,1H),5.13(q,J=9Hz,J=15Hz,2H),4.90(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.50(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),3.75(s,2H),3.21(m,2H),2.8(m,1H),2.68(m,1H),2.21(m,3H)。
实施例22制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-R(NO2)-OBzl(5n)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.275g(2.4mmol)HCl·Trp-R(NO2)-OBzl得到256mg(20%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):640.94[M+H]+;Mp:122~124℃;[α]D 25=-125.00(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.12(s,1H),10.78(s,1H),8.94(s,1H),8.89(d,J=9Hz,1H),8.52(s,1H),8.24(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.31(m,6H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.06(m,1H),6.95(m,1H),5.13(q,J=9Hz,J=15Hz,2H),4.90(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.50(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),3.25(m,4H),1.85(m,1H),1.65(m,1H),1.52(m,2H)。
实施例23制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Asn-OBzl(5o)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.064g(2.4mmol)HCl·Trp-Asn-OBzl得到200mg(18%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):553.94[M+H]+;Mp:111~113℃;[α]D 25=-114.00(c=0.1,甲醇),1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.12(s,1H),10.78(s,1H),8.94(s,1H),8.89(d,J=9Hz,1H),8.52(s,1H),8.24(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.43(s,1H),7.31(m,6H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.06(m,1H),6.96(s,1H),6.95(m,1H),5.13(q,J=9Hz,J=15Hz,2H),4.90(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.50(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),3.25(m,2H),2.6(m,2H)。
实施例24制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Glu(OBzl)-OBzl(5p)
按照实施例9,从1250mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.432g(2.4mmol)HCl·Trp-Glu(OBzl)-OBzl得到66mg(5%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):658[M+H]+;Mp:157~159℃;[α]D 25=-116.66(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.15(s,1H),10.80(s,1H),8.93(s,1H),8.89(d,J=6.0Hz,1H),8.70(d,J=9.0Hz,1H),8.53(s,1H),8.20(s,1H),7.57(d,J=6.0Hz,1H),7.56-6.87(m,10H),7.13(s,1H),7.02(t,J=9.0Hz,J=18.OHz,1H),6.88(t,J=9.0Hz,J=18.0Hz,1H),5.09(d,J=12.0Hz,4H),4.90(m,1H),4.80(m,1H),3.11-3.35(m,2H),2.49(m,2H),2.08(m,1H),1.94(m,1H)。
实施例25制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Thr-OBzl(5q)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和1.026g(2.4mmol)HCl·Trp-Thr-OBzl得到28mg(3%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):540.94[M+H]+;Mp:68~71℃;[α]D 25=-11.00(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.12(s,1H),10.78(s,1H),8.94(s,1H),8.89(d,J=9Hz,1H),8.52(s,1H),8.24(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.31(m,6H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.06(m,1H),6.95(m,1H),5.13(s,2H),5.02(m,2H),4.49(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),4.22(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),3.25(m,2H),1.10(d,J=9Hz,2H)。
实施例26制备3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-OBzl(6)
按照实施例9,从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸和793.2g(2.4mmol)HCl·Trp-OBzl得到263mg(30%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/z):440.04[M+H]+;Mp:68~71℃;[α]D 25=-11.00(c=0.1,甲醇);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=13.12(s,1H),10.88(s,1H),8.94(s,1H),8.86(d,J=9Hz,1H),8.55(s,1H),8.24(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.31(m,6H),7.13(d,J=3Hz,1H),7.06(m,1H),6.95(m,1H),5.13(s,2H),4.95(dd,J=9Hz,J=15Hz,1H),3.45(m,2H)。
实验例1测定化合物的细胞毒作用
1)本发明的化合物用含0.1%DMSO的培养基配制成所需浓度。
2)实验用的肿瘤细胞为MCF-7(人乳腺癌细胞),HL60(人早幼粒白血病细胞),K562(人白血病慢性粒细胞),A549(人肺癌细胞系),HaCa-T(人表皮永生化细胞),L02(人正常肝细胞)。
3)实验方法
MCF-7,HL-60,K562和S180细胞选用RPMI-1640培养基;培养基中含10%经灭活的胎牛血清和1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素。
贴壁细胞MCF-7、HaCa-T、L02和半贴壁细胞S180的培养:分别将生长状态良好,处于对数生长期的细胞以3×104个/mL的密度接种于96孔板,每孔100μL,置于37℃和5%CO2的细胞孵育箱中培养4小时,然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物5a,5b与含0.1%DMSO的培养基配制成的溶液,每孔25μL,对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后,每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液,置于37℃和5%CO2的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO,振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒),立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值,波长为570nm。
悬浮细胞HL60和K562的培养:分别将生长状态良好,处于对数生长期的细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板,每孔100μL,然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物5a,5b与含0.1%DMSO的培养基配制成的溶液,每孔25μL,对照组加入等体积的溶解样品的溶媒,置于37℃和5%CO2的细胞孵育箱中培养48小时后,每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液,继续置于条件为37℃和5%CO2的细胞孵育箱中培养4小时。2500rpm离心10min,小心吸出上清液,每孔加入100μLDMSO,振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒),立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值,波长为570nm。
按下式求出各个浓度下化合物抑制肿瘤细胞增殖的活性:
细胞增殖(%)=(化合物组平均O.D.值/对照组平均O.D.值)×100%,实验重复3次,以细胞增殖对药物浓度作图,按作图法求出IC50(半数有效抑制浓度)值。
4)结果见表1。结果表明,化合物抑制六种肿瘤细胞不显示细胞毒作用。
表1化合物的体外抗肿瘤细胞增殖活性(IC50,μM)
实验例2评价化合物抑制肿瘤生长的活性
1)本发明的化合物用含吐温80的生理盐水溶解,阿霉素用生理盐水溶解作为阳性对照,
Figure BSA0000114940440000101
含吐温80的生理盐水作为阴性对照;
2)化合物,含吐温80的生理盐水和阿霉素均为腹腔给药,化合物的给药剂量为100nmol/kg,含吐温80的生理盐水的给药剂量为0.2mL/20g,阿霉素给药剂量为2μmol/kg,连续给药10天,共给药10次。
3)实验动物为ICR雄性小鼠(清洁级),体重20±2g,每组12只小鼠。
4)瘤源为小鼠S180肉瘤,购自北京大学医学部动物实验中心,自行传代维持。
5)动物模型与治疗
无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液,用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合,将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2%台盼蓝染色,混匀后按白细胞计数方法计数,染蓝色者为死细胞,不染色者为活细胞,并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。
细胞浓度=4大方格内活细胞数/4×104×稀释倍数=细胞数/mL
细胞存活率=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%
将存活率大于90%的瘤液用匀浆法制备成2.0×107个/mL的细胞悬液,于鼠腋皮下接种,0.2mL/只,制造S180荷瘤小鼠。肿瘤接种24h后,治疗组小鼠每日腹腔注射化合物5a,5b,剂量为100nmol/kg和20nmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2mL含吐温80的生理盐水。阳性对照组小鼠每日腹腔注射阿霉素,剂量为2μmol/kg。实验进行至第10天,称小鼠体重,乙醚麻醉,脱颈椎处死小鼠,然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位,剪开皮肤,暴露肿瘤,钝性剥离,称重,按如下公式计算抑瘤率:抑瘤率%=(阴性对照组平均瘤重-化合物组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100%。实验数据采用t检验和方差分析,瘤重以
Figure BSA0000114940440000112
表示。结果见表2。由表2可以看出,在100nmol/kg的剂量下,化合物5a-n治疗的肿瘤小鼠的瘤重明显小于含吐温80的生理盐水治疗小鼠的瘤重,说明化合物5a-n的有效剂量低达100nmol/kg。这个有效剂量比发明人曾经公开的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表色氨基酸或其它L-氨基酸残基除脯氨酸)的有效剂量1μmol/kg低10倍。体现了明确的技术优势。
表2化合物对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响
Figure BSA0000114940440000111
Figure BSA0000114940440000121
n=10;生理盐水是含吐温80的生理盐水;a)与生理盐水组比p<0.05,b)与生理盐水组比p<0.01.
由表3可以看出,在20nmol/kg和1nmol/kg的剂量下,化合物5a-c,e治疗的肿瘤小鼠的瘤重明显小于含吐温80的生理盐水治疗小鼠的瘤重,说明化合物5a-c,e的有效剂量低达1nmol/kg。这个有效剂量比发明人曾经公开的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表色氨基酸或其它L-氨基酸残基)的有效剂量1μmol/kg低1000倍。
表3不同剂量5a-c,e对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响
Figure BSA0000114940440000122
N≥10;生理盐水是含吐温80的生理盐水;a)与生理盐水组比p<0.05,b)与生理盐水组比p<0.01.
实验例3评价化合物的抗炎活性
1)实验方法
18-22g ICR雄性小鼠随机分为空白对照组,阿司匹林阳性药组,化合物5a-c给药组,小鼠使用前静息1天,操作间保持室内温度22℃,每组小鼠10只。一次性给药30分钟后往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.03mL),2小时后将小鼠用乙醚麻醉之后颈椎脱臼处死。将小鼠的左,右耳剪下,用直径7mm的打孔器在两耳的相同位置,取圆形耳片,分别称重,求出两圆耳片的重量差作为肿胀度。肿胀度=左耳圆片重量-右耳圆片重量。
2)给药方法和剂量
给药方式为灌胃给药。空白对照:含吐温80的生理盐水,给药剂量为0.2mL/20g;阳性对照:阿司匹林,给药剂量为1.11mmol/kg;化合物的给药剂量为100nmol/kg.
3)统计方法
本实验数据统计均采用t检验和方差分析,肿胀度以
Figure BSA0000114940440000123
表示。
4)实验结果列入表4。
结果表明,化合物5a-c在100nmol/kg剂量下化合物治疗小鼠的耳肿胀度明显低于含吐温80的生理盐水治疗小鼠的耳肿胀度。说明化合物在发挥体内抗肿瘤作用的剂量下,还具有抗炎作用。
表4化合物5a-c的体内抗炎活性评价
Figure BSA0000114940440000131
n=10;生理盐水为含吐温80的生理盐水;a)与含吐温80的生理盐水组比p<0.01,b)与含吐温80的生理盐水组比p<0.05。

Claims (4)

1.下式的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl,式中AA代表L-Asp,L-Pro,L-Gly,L-Ala,L-C(PMB),L-Phe,L-Ile,L-Leu,L-Met,L-Asn,L-Arg,L-Ser,L-Tyr,L-Val,L-Trp,L-Thr或L-Glu(OBzl残基),
Figure FDA0003111258220000011
2.权利要求1所述的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl的制备方法,该方法包括:
(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸;
(2)6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸转化为6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯;
(3)6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯用高锰酸钾氧化为3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯;
(4)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在2N的NaOH溶液中皂化成3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸;
(5)Boc-Trp与氨基酸苄酯偶联得到Boc-Trp-AA-OBzl;
(6)Boc-Trp-AA-OBzl在4N氯化氢/乙酸乙酯中得到L-Trp-AA-OBzl;
(7)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸与L-Trp-AA-OBzl残基偶联得到3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl。
3.权利要求1所述的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.权利要求1所述的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl在制备抗炎药物中的应用,式中AA选自L-Asp、L-Pro或L-Trp。
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