CN102382014A

CN102382014A - 氨肽酶n抑制剂及制备方法与应用

Info

Publication number: CN102382014A
Application number: CN2011102653687A
Authority: CN
Inventors: 徐文方; 宿莉
Original assignee: Weifang Bochuang International Biological Medical Research Institute
Current assignee: Weifang Bochuang International Biological Medical Research Institute
Priority date: 2011-09-08
Filing date: 2011-09-08
Publication date: 2012-03-21

Abstract

本发明属于药物技术领域，尤其涉及氨肽酶N抑制剂及制备方法和在抗肿瘤方面的用途。本发明的技术方案为：氨肽酶N抑制剂，化学名为：(S)-4-甲基-2-(3-萘基-1-基甲基-脲基)-戊酰基羟胺。化合物（I）结构式如下：

本发明氨肽酶N抑制剂的药效学作用通过体外APN抑酶实验、体外抗肿瘤细胞侵袭、抗血管生成和小鼠体内抗黑色素瘤人工转移和血管生成实验来评价。

Description

氨肽酶N抑制剂及制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，尤其涉及氨肽酶N抑制剂及制备方法和在抗肿瘤方面的用途。

背景技术

氨肽酶N(APN, CD13)是一族II型膜结合糖蛋白，分子量约为150 kDa，属于锌离子依赖性金属蛋白酶，以膜结合的同源二聚体形式存在，参与多种生物功能肽N-端中性氨基酸的降解。氨肽酶N广泛分布于人体内多种类型的细胞，包括造血器官的基质细胞，新生血管内皮细胞，各种上皮细胞包括肾脏近曲小管上皮细胞、胆管上皮细胞和小肠刷状缘上皮细胞等；也分布于成纤维细胞、白血病细胞、间叶细胞肿瘤细胞、卵巢癌细胞及多种高转移性肿瘤细胞的表面。APN参与机体的多种生理调节，尤其在肿瘤发生、发展、侵袭转移、凋亡、肿瘤血管生成以及病毒感染中发挥重要的作用。

1) 氨肽酶N在肿瘤细胞表面高水平表达。该酶可降解细胞外基质，从而促进肿瘤细胞侵袭与转移。细胞外基质是机体阻挡恶变细胞侵袭转移的天然屏障，在维持细胞连接的稳定性和细胞间信号传导中起着非常重要的作用。细胞外基质的降解还能通过促进存在于其中的生长因子的释放而促进肿瘤的生长增殖（Sato Y，Biol. Pharm. Bull., 2004, 27(6): 772-776； Saiki, I.; et al. Int. J. Cancer., 1993, 54, 137；Menrad A., Speicher D., Wacker J., et al. Cancer Res., 1993, 53(6): 1450-1455）。2) 氨肽酶N能够刺激血管内皮细胞释放肿瘤微血管形成相关因子，帮助增生的新生内皮细胞向细胞间基质侵袭并形成管腔结构，促进肿瘤血管生成。APN在新生血管内皮细胞高表达，血管生成是肿瘤生长和转移的第一步。3）APN作为血管内皮细胞表面的肿瘤细胞归巢模序NGR受体，可协助内皮细胞在肿瘤组织的诱导下归巢，从而促进肿瘤诱导的血管生成。4）APN在粒细胞及淋巴细胞表面大量表达，同时也参与了T淋巴细胞依赖的炎症反应，以及降低了细胞对其抗原的识别能力，削弱巨噬细胞和NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，抑制和屏蔽各种免疫细胞诱导的肿瘤细胞凋亡作用。5) 氨肽酶N参与内源性镇痛物质内啡肽和脑啡肽的降解，导致疼痛。6) 氨肽酶N降解血管紧张素III，在肾素-血管紧张素系统中发挥调节机体血压的作用 (Mitsui, T.; et al. Biol. Pharm. Bull.,2004, 27, 768.)

随着肿瘤早期诊断手段的不断进步，手术成为治疗肿瘤的重要手段，然而恶性肿瘤转移则成为手术治疗肿瘤的主要障碍和肿瘤患者复发及死亡的主要原因。近年来，随着各国专家对APN的研究逐年深入，人们发现，APN在降解细胞间基质、促进肿瘤侵袭转移和血管生成方面具有重要作用，因此，开发APN抑制剂作为抗肿瘤转移和抗血管生成药物越来越受到各方面的关注。十几年以来，对APN抑制剂的研究开发极为迅速，但至今为止只有唯一一个上市药物——乌苯美司。乌苯美司(Ubenimex)作为一个具有含β-氨基酸的类二肽结构，目前作为免疫增强剂用于白血病的治疗，是从橄榄网状链霉菌(Streptomyces olivorecticuli)的培养液中分离得到的，全合成代价昂贵，来源有限。因此，开发来源途径便利小分子APN抑制剂成为抗肿瘤药物变得非常有意义。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供了一种氨肽酶N抑制剂，该化合物在针对于氨肽酶N活性筛选、机制实验和体内药效学测试中发现，其活性优于目前唯一上市的乌苯美司。同时本发明还提供了氨肽酶N抑制剂的制备方法和在抗肿瘤治疗方面的用途。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：氨肽酶N抑制剂，化学名为：(S)-4-甲基-2-(3-萘基-1-基甲基-脲基)-戊酰基羟胺。化合物（I）结构式如下：

所述化合物的制备方法，反应步骤及反应式如下：

为萘甲基异氰酸酯与L-亮氨酸甲酯缩合形成相应的脲基中间体，其甲酯部分转化为异羟肟酸得到化合物（I）。反应式如下：

合成路线：

上述合成路线中的试剂为：(a) 三光气，甲苯，回流，3小时；(b) 亮氨酸甲酯盐酸盐，三乙胺，二氯甲烷，室温，一小时； (c) 盐酸羟胺，氢氧化钾，甲醇，一小时。

具体合成方法：

1）萘甲基异氰酸酯（1）：

向1-萘甲胺（1.57 g，10 mmol）的1,4-二氧六环溶液中加入三光气（1.50 g，5 mmol）后回流三个小时，蒸干溶剂，所得油状物萘甲基异氰酸酯无需分离纯化，可直接用于下一步

2）(S)-4-甲基-2-(3-萘基-1-基甲基-脲基)-戊酸甲酯（2）

向L-亮氨酸甲酯盐酸盐（1.31 g，10 mmol）和三乙胺（1.10 g，11 mmol）的二氯甲烷溶液中滴入1的二氯甲烷溶液，室温搅拌1个小时，蒸干溶剂，残渣溶于乙酸乙酯并用1N盐酸溶液和饱和食盐水洗涤，而后干燥有机相。产物2由重结晶得到，白色固体1.70 g，产率52%，ESI-MS m/z：328.1 [M+H⁺]，¹H-NMR (DMSO-d ₆)：δ 8.78-7.82 (m, 3H), 7.56-7.41 (m, 4H), 6.45 (t, 1H, J = 5.7 Hz), 6.11 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.74-4.60 (m, 2H), 4.17-4.10 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 1.60-1.51 (m, 1H), 1.37-1.32 (m, 2H), 0.89-0.87 (m, 6H)。

）(S)-4-甲基-2-(3-萘基-1-基甲基-脲基)-戊酰基羟胺，化合物（I）

将2溶于羟胺钾（是由盐酸羟胺和氢氧化钾生成的）的甲醇溶液中，室温搅拌一个小时，而后蒸干溶剂，残渣溶于1N盐酸中，以乙酸乙酯提取，干燥有机相。化合物（1）由重结晶得到，白色固体0.60 g，产率35%，ESI-MS m/z：329.1 [M+H⁺]，¹H-NMR (DMSO-d ₆): δ 10.68 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.78-7.82 (m, 3H), 7.56-7.41 (m, 4H), 6.45 (t, 1H, J = 5.7 Hz), 6.11 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.74-4.60 (m, 2H), 4.17-4.10 (m, 1H), 1.60-1.51 (m, 1H), 1.37-1.32 (m, 2H), 0.89-0.87 (m, 6H)。

本领域技术人员可以对上述步骤进行变动以提高收率，他们可据本领域的基本知识确定合成的路线，如选择反应物，溶剂和温度，可以通过使用各种常规保护基以避免副反应的发生从而提高收率。这些常规的保护方法可参见例如T. Greene, Protecting Groups in Organic Synthesis.

本发明的氨肽酶N抑制剂，实验证明它对种植于C57BL/6小鼠体内的B16BL6小鼠黑色素瘤高转移株具有显著的抗转移和抗肿瘤诱导血管生成的作用，有望成为一类新型的抗肿瘤药物。本发明氨肽酶N抑制剂的药效学作用通过体外APN抑酶实验、体外抗肿瘤细胞侵袭、抗血管生成和小鼠体内抗黑色素瘤人工转移和血管生成实验来评价。

附图说明

图1为化合物对肿瘤细胞侵袭能力的抑制率，

图2为化合物对HUVEC形成管腔能力的抑制，

图3为化合物对小鼠人工肺转移的抑制，

图4为化合物对小鼠肿瘤诱发血管生成的抑制。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明：

实施例1

氨肽酶N抑制剂，化学名为：(S)-4-甲基-2-(3-萘基-1-基甲基-脲基)-戊酰基羟胺。化合物（I）结构式如下：

所述化合物的制备方法，反应步骤及反应式如下：

为萘甲基异氰酸酯与L-亮氨酸甲酯缩合形成相应的脲基中间体，其甲酯部分转化为异羟肟酸得到化合物（I）。反应式如下：合成路线：

具体合成方法：

1）萘甲基异氰酸酯（1）：

2）(S)-4-甲基-2-(3-萘基-1-基甲基-脲基)-戊酸甲酯（2）

将2溶于羟胺钾的甲醇溶液中，室温搅拌一个小时，而后蒸干溶剂，残渣溶于1N盐酸中，以乙酸乙酯提取，干燥有机相。化合物（1）由重结晶得到，白色固体0.60 g，产率35%，ESI-MS m/z：329.1 [M+H⁺]，¹H-NMR (DMSO-d ₆): δ 10.68 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.78-7.82 (m, 3H), 7.56-7.41 (m, 4H), 6.45 (t, 1H, J = 5.7 Hz), 6.11 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.74-4.60 (m, 2H), 4.17-4.10 (m, 1H), 1.60-1.51 (m, 1H), 1.37-1.32 (m, 2H), 0.89-0.87 (m, 6H)。

实施例2

目标化合物抑制氨肽酶N的活性试验（In vitro）

1、原理：氨肽酶N与其底物（L-亮氨酰-p-硝基苯胺）相互作用，产生在405nm有吸收的对-硝基苯胺，并且对-硝基苯胺的浓度与酶活性的大小呈正相关。通过检测405nm处的吸收度确定对-硝基苯胺的含量，从而确定氨肽酶的活性，间接反映出抑制剂对酶活性抑制程度的大小。

2、材料与方法：

氨肽酶N与底物L-亮氨酰-p-硝基苯胺均购自Sigma公司

溶液的配制：

缓冲液，配制pH7.2，50mM磷酸盐缓冲液，室温放置备用。

氨肽酶N溶解在缓冲液中配成0.2mg/mL的溶液；

底物溶解在DMSO中配成0.5mg/mL溶液，各溶液冰箱放置备用。

3、氨肽酶活性分析：

96孔板中加入上述氨肽酶N溶液10uL，底物溶液，用缓冲液补足200 uL。室温放置1h，于405nm波长处测定吸收值。

空白组

空白组的吸收度与96孔板中的无试剂孔吸收度相差无几（无试剂孔吸收是0.035），说明空白组几乎无吸收。对照吸收度可以看出，在酶溶液固定时，底物溶液最好选15 uL更适宜，所以定底物为15 uL。

4、抑酶检测：

96孔板中分别加入上述氨肽酶N溶液10 uL，底物15 uL，不同梯度浓度的化合物20 uL，50mM磷酸盐缓冲液（pH7.2）补足200 uL。100%组不含抑制剂。空白组用失活的酶代替活性酶，均用缓冲液补足200 uL。室温放置1h,于405nm波长处测定吸收值，按照如下公式计算抑制率：

抑制率=（100%吸收度—化合物吸收度）/(100%吸收度—空白吸收度)

根据化合物的浓度与相应的抑制率,利用origin7.5软件拟合药效曲线，计算各化合物的IC₅₀。

实验结果见表1。

表1. 化合物的体外抑酶试验结果

^a表中数值为三次试验的平均值

Bestatin，商品名为Ubenmix（乌苯美司），目前上市作为免疫增强剂用于白血病的治疗，是从橄榄网状链霉菌(Streptomyces olivorecticuli)的培养液中分离得到的小分子类肽APN抑制剂。

上述测试结果表明，化合物（I）表现出对三种APN的抑制活性均优于阳性对照药Bestatin，具有良好的开发前景，并可作为发现新型高效氨肽酶N抑制剂的先导化合物。

实施例3

目标化合物体外抑制细胞侵袭的活性试验

化合物（I）进行体外抑制肿瘤细胞侵袭的活性试验，结果见图1。

术语说明：

ES-2为人卵巢透明细胞癌细胞株。

DMSO：二甲基亚砜。

Matrigel：提取自小鼠EHS肉瘤的细胞间基质

1.[材料] ES-2细胞株，预包被Matrigel的Transwell小室，结晶紫，含1%胎牛血清的RPMI-1640培养基，含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，24孔板

2.[方法]

细胞培养 ES-2细胞株采用常规培养。实验时使用对数生长期细胞。

抗肿瘤细胞侵袭检测 ES-2细胞悬浮于1%胎牛血清的RPMI-1640培养基调整至1×10⁵/400 μL，分别加入预包被Matrigel并经过无血清培养基水化的Transwell上室，同时在上室每孔中加入100 μL含不同浓度化合物的1%胎牛血清的培养基，使孔中化合物终浓度分别为：5和50 μg/ml，加细胞不加化合物的孔作阴性对照孔，Bestatin作化合物阳性对照。下室中加入750 μL10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃，5%二氧化碳中孵育8 h，弃去上室中的培养基，用棉签擦去非侵袭细胞，将上室放入甲醇中固定，并以结晶紫染色，而后于显微镜下观察和拍摄，随机选取五个视野对细胞进行计数，与阴性对照相比，计算抑制率，细胞侵袭抑制率按下式计算：

抑制率（%）=（1 - 实验小室细胞数/对照小室细胞数）×100%

见图1 ，图中柱形为三次试验的平均值及标准偏差，并且与阴性对照组相比，所有药物处理组效果经t检验具有统计学意义，P < 0.05。

图1测试数据表明，化合物（I）在体外抗肿瘤细胞侵袭的试验中显示出优于阳性对照Bestatin的活性，具有良好的开发前景。

实施例4

目标化合物体外抗血管生成的活性试验

化合物（I）进行体外抑制人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）成管腔的活性试验，结果见图2。

术语说明：

HUVEC为人脐静脉血管内皮细胞。

DMSO：二甲基亚砜。

Matrigel：提取自小鼠EHS肉瘤的细胞间基质

1.[材料] HUVEC细胞， Matrigel，无血清的RPMI-1640培养基，含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，24孔板

2.[方法]

细胞培养 原代分离的HUVEC细胞采用常规培养。

抗HUVEC成管腔检测HUVEC细胞悬浮于无血清的RPMI-1640培养基调整至1×10⁵/400 μL，分别加入预包被Matrigel并经过无血清培养基水化的24孔板，同时在每孔中加入100 μL含不同浓度化合物的无血清培养基，使孔中化合物终浓度为25 μg/ml，加细胞不加化合物的孔作阴性对照孔，Bestatin作化合物阳性对照，于37℃，5%二氧化碳中孵育8 h，而后于显微镜下观察和拍摄，随机选取五个视野对细胞-细胞连结点进行计数，与阴性对照相比。

见图2，图中柱形为三次试验的平均值及标准偏差，并且与阴性对照组相比，所有药物处理组效果经t检验具有统计学意义，P < 0.05，

图2测试数据表明，化合物（I）在体外抗血管生成的试验中显示出优于阳性对照Bestatin的活性，具有良好的开发前景。

实施例5

目标化合物小鼠体内抗小鼠黑色素瘤B16BL6人工肺转移实验

本发明对目标化合物分别进行体内抗小鼠黑色素瘤B16BL6人工肺转移实验（结果见图3）。

采用小鼠黑色素瘤B16BL6人工肺转移模型，对目标化合物进行腹腔注射（ip）给药观察，并与阳性药物Bestatin的抗转移作用进行比较。

实验分组及剂量设计：

受试药物：化合物（I）

阳性对照：Bestatin

阴性对照组：等量药物溶剂

瘤株：小鼠黑色素瘤B16BL6

动物：C57BL/6小鼠，雌雄各半，5～6周龄

实验过程：动物购买后，实验室平衡饲养1周，小鼠黑色素瘤B16BL6进行常规培养，1640培养液含10%FBS，5%CO2，37℃培养。小鼠5~6周大时接种细胞，5×10⁵个/只，尾静脉注射。当天对小鼠进行随机分组（每组8只）并开始给药。药物用DMSO溶解，SAHA组，受试药物组分别按下表所示剂量和给药方式给药，DMSO对照组，给予等体积溶剂，连续腹腔注射给药2周。实验结束时断颈椎处死小鼠，剥离肺脏，比较、计算转移结节数。t检验法比较各组动物肺部转移结节数平均值、标准偏差等指标的统计学差别。

见图3，图中柱形为三次试验的平均值及标准偏差，并且与阴性对照组相比，所有药物处理组效果经t检验具有统计学意义，P < 0.05。

上述图3测试结果表明，化合物（I）作为APN抑制剂具有较强的体内外抗转移活性，具有一定的开发应用前景。

实施例6

目标化合物小鼠体内抗小鼠黑色素瘤B16BL6诱导的血管生成实验

本发明对目标化合物分别进行体内抗小鼠黑色素瘤B16BL6诱导的血管生成实验（结果见图4）。

采用小鼠黑色素瘤B16BL6诱导的血管生成模型，对目标化合物进行腹腔注射（ip）给药观察，并与阳性药物Bestatin的抗血管生成作用进行比较。

实验分组及剂量设计：

受试药物：化合物（I）

阳性对照：Bestatin

阴性对照组：等量药物溶剂

瘤株：小鼠黑色素瘤B16BL6

动物：C57BL/6小鼠，雌雄各半，5～6周龄

实验过程：动物购买后，实验室平衡饲养1周，小鼠黑色素瘤B16BL6进行常规培养，1640培养液含10%FBS，5%CO2，37℃培养。小鼠5~6周大时接种细胞，5×10⁵个/只，背部双侧皮内注射。当天对小鼠进行随机分组（每组8只）并开始给药。药物用DMSO溶解，SAHA组，受试药物组分别按下表所示剂量和给药方式给药，DMSO对照组，给予等体积溶剂，连续腹腔注射给药5天。实验结束时断颈椎处死小鼠，分离背部表皮和皮下组织，比较、计数延伸向瘤块的血管数。t检验法比较各组动物延伸向瘤块的血管数平均值、标准偏差等指标的统计学差别。

见图4，图中柱形为三次试验的平均值及标准偏差，并且与阴性对照组相比，所有药物处理组效果经t检验具有统计学意义，P < 0.05。

上述图4测试结果表明，化合物（I）作为APN抑制剂具有较强的体内外抗血管生成活性，具有一定的开发应用前景。

Claims

1.氨肽酶N抑制剂，化学名为(S)-4-甲基-2-(3-萘基-1-基甲基-脲基)-戊酰基羟胺，具有结构式（I）的化合物：

。

2.氨肽酶N抑制剂的制备方法，其特征在于：以1-萘甲胺为原料，经三光气转化为萘甲基异氰酸酯，与L-亮氨酸甲酯缩合形成相应的脲基中间体，其甲酯部分转化为异羟肟酸得到化合物（I），反应式如下：

合成路线：

上述合成路线中的试剂和反应参数为：(a) 三光气，甲苯，回流，3小时；(b) 亮氨酸甲酯盐酸盐，三乙胺，二氯甲烷，室温，一小时； (c) 盐酸羟胺，氢氧化钾，甲醇，一小时。

3.氨肽酶N抑制剂的应用，用于制备和开发与氨肽酶N活性和表达异常相关的哺乳动物疾病的药物。

4.根据权利要求3所述的氨肽酶N抑制剂的应用，其特征在于：所述的与氨肽酶N活性异常表达的相关哺乳动物疾病包括：癌症、炎症、多发性硬化症、免疫抑制性疾病或组织溃疡、牙周病、大疱性表皮松懈症和白血病等。