CN108864250A - 一种FAPα酶敏感的吉西他滨前体药物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种FAPα酶敏感的吉西他滨前体药物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有肿瘤微环境FAPα酶敏感可断裂特性的吉西他滨前体药物及其制备方法和应用。利用肿瘤微环境中由肿瘤相关成纤维细胞(TAFs)分泌的FAPα酶响应断裂性特点的二肽，设计并合成了二肽与吉西他滨结合的FAPα酶激活前体药物。该吉西他滨前体药物具有FAPα酶响应性断裂的特征，能够增加吉西他滨的肿瘤组织靶向性，与原药相比具有更优的肿瘤蓄积作用，并可延长吉西他滨在体内的半衰期，降低毒性和耐药性，具有更优于原药的体内抗肿瘤活性。

Description

一种FAPα酶敏感的吉西他滨前体药物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物，特别涉及一种对FAPα酶敏感的二肽与吉西他滨连接的前体药物，及其制备方法和应用。
背景技术
吉西他滨(gemcitabine，Gem)是一种新型嘧啶类脱氧核苷类似物，常用其盐酸盐，其化学名称为(+)2′-脱氧-2′2′-二氟胞嘧啶盐酸盐，通过抗代谢作用来发挥抗肿瘤效应，主要作用于DNA合成期，并可在一定条件下阻止细胞由G1期向S期进展。临床上常与其他药物合用或单独给药，作为乳腺癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，胰腺癌的一线用药。但在吉西他滨的临床使用中，经常因为其非特异性体内药物分布而产生较大的毒副作用。吉西他滨对血液和淋巴系统、胃肠系统、生殖-泌尿系统、呼吸系统、心血管系统等均具有毒性，限制了其在临床上的使用。其次，吉西他滨血浆半衰期较短，临床上通常采用静脉滴注的给药方式。吉西他滨的代谢失活主要由胞苷脱氨酶(CDA)催化胞苷及脱氧胞苷等水解脱氨基，生成代谢产物尿苷和脱氧尿苷引起的。吉西他滨的CDA代谢物为2′，2′-二脱氧尿苷(dFdU)，主要分布在血浆和肝脏中，导致吉西他滨半衰期较短。吉西他滨的人血浆中半衰期只有8-17min，鼠血浆半衰期只有9min，Bender等在研究中报道吉西他滨在血浆中的半衰期为70min(Bender D M，et al.Synthesis，crystallization，and biological evaluation of anorally active prodrug of gemcitabine[J].J Med Chem，2009，52(22)：6958-61.)。另外，吉西他滨摄取入胞主要依赖于核苷转运体进行摄取，导致吉西他滨在人类平衡型核苷转运蛋白1(hENT1)缺乏的细胞中摄取量大大降低，这也导致在这类转运蛋白缺失的患者中容易对吉西他滨产生耐药现象。上述这些缺陷的存在均不利于吉西他滨抗肿瘤作用的发挥及安全性的保证。因此，设计半衰期长且具有肿瘤靶向蓄积能力的的吉西他滨前药具有重要的临床意义。
FAPα是由761个氨基酸组成的II型跨膜蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族。FAPα在90％的上皮肿瘤基质中均有表达，尤其在结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌和胰腺癌等肿瘤组织相关的成纤维细胞(TAFs)中均高表达。除了在产生胰高血糖素的胰岛α细胞和胚胎发生过程中的胎儿间充质组织以外，健康成年组织中则几乎不表达FAPα。FAPα的主要功能是参与肿瘤的重塑，在肿瘤的侵袭和转移中起重要调节作用。FAPα具有外肽酶、内肽酶、凝胶酶和胶原酶活性，其中内肽酶活性和外肽酶活性均为针对脯氨酰的结构特异活性。FAPα酶的外肽酶活性底物为倒数第二个氨基酸是脯氨酸的肽或蛋白，切割位点为脯氨酸的N-端。近年来，发现神经肽Y(NPY)、B型利钠肽、P物质和YY肽是FAPα外肽酶活性的天然底物；而其内肽酶活性底物为含Gly-Pro片段的肽链或蛋白，切割位点在脯氨酸的N-端。α2AP为FAPα内肽酶活性的天然底物。
我们课题组在先前的研究工作中曾经设计合成了一种共轭亚油酸与吉西他滨的4’-氨基通过酰胺键连接而成的前体药物CLA-GEM，试验结果证实了该前体药物具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤效果。该研究成果已获得中国专利授权[王坚成，张强，陶小妹，张烜，一种共轭亚油酸与吉西他滨连接的前体药物制备方法及其应用，专利号：ZL201210064883.3]。基于已开展研究中CLA-GEM前药所表现出来的良好生物学活性，本发明将具有FAPα酶敏感断裂特性的Z-GP二肽片段与吉西他滨连接，制备成前体药物，意外的发现对水溶性吉西他滨的4-NH2用Z-GP二肽进行结构修饰，可以减少脱氧胞苷脱氨酶对吉西他滨的降解失活，通过血液循环到达肿瘤组织中的前药具有肿瘤微环境FAPα酶敏感断裂的响应特性，断裂释放出游离的吉西他滨原药，并且该前药还可以由于其脂溶性增强而改变其跨细胞膜转运机制，以达到降低吉西他滨对核苷转运体缺乏引起的耐药性。
因此，在本发明设计合成Z-AP二肽片段与吉西他滨相连的前体药物，以达到靶向肿瘤组织，延长吉西他滨半衰期，增加吉西他滨脂溶性和透膜性，提高吉西他滨抗肿瘤疗效，减少并降低耐药性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种吉西他滨的FAPα酶激活前药，用于肿瘤治疗。本发明利用肿瘤微环境中由肿瘤相关成纤维细胞(TAFs)分泌的FAPα酶响应断裂性特点的二肽，设计并合成二肽与吉西他滨结合的前体药物，以达到前体药物在血液中稳定性优于Gem，而在肿瘤组织中的FAPα作用下特异性断裂，释放出原药Gem，并可通过非hENT依赖的自由扩散的方式进入细胞，降低系统毒性，提高吉西他滨抗肿瘤效应。
本发明的技术方案如下：
一种吉西他滨的前体药物，是二肽与吉西他滨相连接形成的前体药物，其中所述二肽可被FAPα酶进行特异性的识别和响应性剪切。
进一步的，所述二肽为N-末端封闭的Gly-Pro二肽，例如苄氧羰基(Z)封闭N端的Gly-Pro二肽，该二肽的结构至少包括两种同分异构体；式I所示的苄氧羰基封闭N端的甘氨酰脯氨酸二肽，和，式II所示的苄氧羰基封闭N端的脯氨酰甘氨酸二肽，在本发明中均称为Z-GP。
封闭N端保护基团不限于苄氧羰基，也可以是其他保护基，如叔丁氧羰基、芴甲氧羰基、烯丙基氧基羰基等，如下所示：
优选的，所述二肽通过酰胺键连接吉西他滨，如下式III和式IV所示：
除了4-NH2，吉西他滨的3’-OH和5’-OH也可以作为修饰位点连接所述二肽，下面给出了在吉西他滨的不同修饰位点，通过酰胺键、酯键和/或氨基甲酸酯键连接进行单位点或多位点修饰形成的一些吉西他滨前体药物的结构式：
本发明还提供了吉西他滨的前体药物Z-GP-Gem的一种制备方法，包括以下步骤：
1)密闭条件下，将吉西他滨溶解于溶剂中，0～40℃搅拌下加入保护试剂，将吉西他滨的羟基进行保护，形成氨基游离的保护产物；
2)将苄氧羰基保护的甘氨酸溶解在溶剂中，室温下加入活化试剂活化，然后加入脯氨酸，室温下搅拌反应，得到二肽产物；
3)将步骤2)得到的二肽溶解于溶剂中，室温下加入活化试剂进行活化，然后逐量加入步骤1)制备的羟基保护的吉西他滨产物，室温搅拌反应，得到的产物经过氟离子脱保护，得到终产物。
上述步骤1)、2)和3)中所用溶剂为有机溶剂，可以是N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃、三乙胺中的一种或多种的混合溶液。
上述步骤1)中，所述保护试剂例如TBDMSCl(叔丁基二甲基氯硅烷)、TMSCl(三甲基氯硅烷)、TBDPSCl(叔丁基二苯基氯硅烷)等。
上述步骤2)中，所述活化试剂例如N-乙酰基琥珀酸酯(NHS)。活化试剂与脯氨酸的投料摩尔比优选为1∶1。
上述步骤3)中，所述活化试剂例如DCC(二环己基碳二亚胺)、HOBt(1-羟基苯并三氮唑)、CDI(N，N-羰基二咪唑)、HBTU(苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯)、TBTU(2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯)、DIC(二异丙基碳二亚胺)、EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)等。脱保护所用试剂为四丁基氟化铵(TBAF)等。活化试剂与二肽的投料摩尔比优选为1∶1。吉西他滨与二肽的投料摩尔比优选为1∶1.05。
本发明提供的吉西他滨前体药物具有响应FAPα酶的特征，能够增加吉西他滨的肿瘤组织靶向性，与吉西他滨原形药物(Gem)相比具有更优的肿瘤蓄积作用，并可延长吉西他滨在体内的半衰期，降低毒性和耐药性，具有更优于原形药物的体内抗肿瘤活性。
在本发明的实施例中，通过在吉西他滨的4-NH2端引入肿瘤微环境中高表达的FAPα酶敏感断裂的特异性二肽片段Z-GP(N-carbobenzoxy-glycyl-proline)，得到吉西他滨的前药Z-GP-Gem。该前药化合物通过Z-GP片段的引入，(1)使得Z-GP-Gem在肿瘤微环境中特异性断裂，增加在肿瘤部位的靶向性蓄积；(2)对4-NH2的修饰，可有效保护吉西他滨免受CDA酶的代谢，延长药物在血液中的半衰期；(3)引入的二肽Z-GP具有一定的疏水性，可有效改善吉西他滨的脂溶性，使其改变摄取入胞的途径，增加药物的摄取。
本发明的吉西他滨前体药物可用于肿瘤的治疗，所述肿瘤包括但不限于胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等。
本发明还包括含有所述吉西他滨前体药物的药物组合物。根据需要，所述药物组合物还可含有药学上可接受的载体。
所述的物组合物可采用口服给药或非肠道给药。口服给药可以将药物组合物制备成合适的口服固体或液体制剂，优选为口服胶囊。非肠道给药可以将药物组合物制备成合适的注射剂，优选为静脉注射剂。
本发明的技术优势主要体现在：
本发明将N端封闭的的二肽与吉西他滨结合制备成前体药物，发现其不仅可以解决脱氧胞苷脱氨酶对药物的降解作用，延长药物的半衰期，还能够增加吉西他滨在肿瘤部位的蓄积作用，增加药物的生物利用度和药效。与此同时，经过修饰的吉西他滨，水溶性发生了改变，解决了吉西他滨对于核酸转运载体(hENT)缺乏带来的耐药性问题，并且其对肿瘤相关的成纤维细胞具有一定的损伤作用。基于该前体药物更好的抗肿瘤效应、更长的半衰期和更好的安全性，具有很大的临床应用价值，有希望成为用于肿瘤治疗的有效前药。
附图说明
图1.Z-GP-Gem的1H NMR(400MHz，d6-DMSO)谱图。
图2.Z-GP-Gem的13C NMR(101MHz，d6-DMSO)谱图。
图3.Z-GP-Gem的ESI-MS图谱。
图4.Z-GP-Gem在肿瘤匀浆、血浆和PBS三种不同介质中的稳定性测试结果。
图5.吉西他滨的前体药物(Z-GP-Gem)与原形药物(Gem)在肿瘤组织中吉西他滨的蓄积量比较。**p＜0.01。
图6.Z-GP-Gem在细胞水平的细胞毒作用实验结果，其中：(1)在4T1细胞系上，给药48h，Z-GP-Gem，Gem和Z-GP-Gem(+FAPα)的细胞毒作用；(2)在PC-3细胞系上，给药48h，Z-GP-Gem，Gem和Z-GP-Gem(+FAPα)的细胞毒作用。
图7.划痕实验验证Z-GP-Gem在4T1细胞系上的抗迁移能力实验结果，其中：(1)抗迁移能力实物图；(2)抗迁移能力定量图(n＝3)，*p＜0.05。
图8.Z-GP-Gem和Gem在大鼠体内的药物浓度时间曲线，给药剂量为28.5μmol/kg，尾静脉注射(Mean±SD)(n＝5)。
图9.4T1细胞系上，Z-GP-Gem和Gem的摄取量及摄取方式(n＝3)实验结果，其中DP代表双嘧达莫，在给药前，以20μg/mL预处理30min；*p＜0.05***p＜0.001。
图10.Z-GP-Gem的抑瘤效应考察结果，其中：(1)抑瘤曲线；(2)离体肿瘤实物图；(3)肿瘤质量图。
图11.Z-GP-Gem在肿瘤中的抗转移能力考察结果，其中：(1)肺部转移实物图；(2)肺部转移点定量图，*p＜0.05。
具体实施方式
以下通过实例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1、二肽与吉西他滨连接的前体药物(Z-GP-Gem)合成
密闭条件下，将1g吉西他滨溶解于N，N二甲基甲酰胺(DMF)中，10℃搅拌下加入2.3g TBDMSCl，室温反应48h，得到氨基游离的保护产物2.3g(Gem-Si)。将2.0g苄氧羰基保护的甘氨酸(Z-G)溶解在15mL 1，4-二氧六环中，室温加入1.32g N-乙酰基琥珀酸酯(NHS)，活化1h后得到4.7g活化产物(Z-G-NHS)。取2.2g脯氨酸，室温下搅拌下加入4.7g活化产物的二氯甲烷(DCM)溶液，再经过酰胺化反应得到1.0g二肽产物(Z-GP)。将0.67g Z-GP溶解于二氯甲烷中，室温下加入0.49g DCC进行活化，后逐量加入0.98g Gem-Si，室温搅拌反应24h。得到的产物经过1N的四丁基氟化铵(TBAF)的四氢呋喃溶液脱保护，得到0.55g白色固体产物。
实施例2、二肽与吉西他滨连接的前体药物(Z-GP-Gem)的结构确证
通过1H NMR、13C NMR及ESI-MS对实施例1合成的产物进行结构表征。
实施例1合成产物Z-GP-Gem的1H NMR(400MHz，d6-DMSO)谱图如图1所示：δ11.20(s，1H)，8.30(d，1H)，7.38(m，4H)，7.35(d，1H)，6.35(m，1H)，6.21(m，1H)，5.34(m，1H)，5.04(s，2H)，4.22(m，1H)，3.71(m，1H)，3.59(m，2H)，3.21(m，2H)，1.96(m，3H)，1.65(m，2H)，1.35(m，2H)，0.98(t，3H)。
实施例1合成产物Z-GP-Gem的13C NMR(101MHz，d6-DMSO)谱图如图2所示：δ173.98，173.80，167.89，167.57，160.89，156.91，137.57，128.80，128.22，128.13，99.97，96.07，95.06，72.40，65.80，59.04，47.70，45.86，44.66，43.04，42.87，29.05，24.81，22.29。
实施例1合成产物Z-GP-Gem的ESI-MS图谱如图3所示，Z-GP-Gem的分子量为551.5，图中550.22为分子离子峰。
实施例3、前体药物(Z-GP-Gem)响应FAPα酶的特征
采用HPLC法考察生理温度和pH条件下，Z-GP-Gem在乳腺癌细胞4T1肿瘤组织匀浆、空白血浆和PBS中的稳定性。
Sprague Dawley大鼠眼眶静脉丛取血，1500g离心10min，收取血浆，-20℃保存备用。称取1.50g肿瘤组织，加入6mL的生理盐水，冰浴条件下匀浆器匀浆得到肿瘤组织匀浆液，-20℃保存备用。精密称取适量Z-GP-Gem溶于含10％乙醇的生理盐水中，得浓度为1mg/mL的Z-GP-Gem溶液。取20μL Z-GP-Gem溶液(1mg/mL)，分别加至1980μL肿瘤匀浆、大鼠血浆和PBS中。将三种混合液置于恒温摇床中，37℃孵育。在指定时间点(0.5、2、4、8、24、48h)取出100μL样品。取100μL样品，加900μL乙腈，快速涡旋2min；4℃条件下1500g离心10min，取上清液于10mL具塞离心管中；55℃恒温氮气吹干，100μL流动相溶解，涡旋混匀2min，1500g离心10min，取上清液20μL进样，HPLC测定含量。HPLC的条件为：温度：25℃；波长：250nm；流速：1mL/min；流动相比例：0.1％CF3COOH水溶液∶乙腈(V/V)＝70∶30。以0h为对照，计算Z-GP-Gem在三种不同介质中不同时间点未断裂Z-GP-Gem的比例，计算公式为Ct/C0×100％。
结果如图4所示，表明在不含FAPα酶的PBS溶液中，Z-GP-Gem降解速率最慢；该前药化合物在血浆中的降解速率有增强的趋势，而在富含FAPα酶的4T1肿瘤组织中的发生了显著的降解变化，这些结果表明该前药化合物具有良好的酶敏感裂解性能。
实施例4、前体药物(Z-GP-Gem)与吉西他滨原形药物(Gem)肿瘤蓄积作用的比较
以BALB/c小鼠4T1乳腺癌原位瘤为模型，考察Z-GP-Gem和Gem等摩尔剂量给药时，游离Gem在肿瘤组织中的蓄积。
将8只BALB/c小鼠分为两组：Z-GP-Gem组和Gem组。分别以2×106细胞数量于第四乳垫下原位接种4T1细胞，待肿瘤体积达到300mm3，分别注射Gem当量为20mg/kg的药物。于4h时解剖小鼠，取出肿瘤组织，每10mg肿瘤组织加入50μL生理盐水，冰浴下匀浆器匀浆得肿瘤组织匀浆液，精密吸取匀浆液100μL，加入900μL乙腈，快速涡旋混合2min；4℃条件下1500g离心10min，取上清液于10mL具塞离心管中；55℃恒温水浴中氮气吹干，100μL流动相溶解，涡旋混匀2min，1500g离心10min，取上清液20μL进样，HPLC测定含量。HPLC的条件为：温度：25℃；波长：268nm；流速：1mL/min；流动相比例：0.05M CH3COONH4水溶液∶甲醇(V/V)＝9∶91。分别计算Z-GP-Gem组和Gem组中肿瘤中吉西他滨的蓄积量。BALB/c荷瘤小鼠体内分别单剂量静脉注射Z-GP-Gem和Gem(等摩尔量)给药后，采用HPLC方法测定肿瘤组织中的Gem含量。
实验结果显示Z-GP-Gem前药给药组的肿瘤组织中Gem含量显著高于原药给药组，如图5所示，这一结果表明Z-GP-Gem能够在肿瘤部位有效蓄积并在FAPα酶作用下发生断裂，产生更多的Gem原药，有利于发挥抗肿瘤药效。
实施例5、前体药物(Z-GP-Gem)具有较好的酶敏感的细胞毒效应和抗转移效应
在4T1和PC-3细胞系上，采用MTT法检测Z-GP-Gem和Gem的细胞毒效应。在4T1细胞系上，采用划痕愈合实验考察Z-GP-Gem和Gem的抗迁移能力。
(1)以4000/孔细胞密度接种PC-3、4T1细胞于96孔板中，于孵箱中37℃培养24h。取1mL 10mM Z-GP-Gem储备液和1mL肿瘤组织匀浆在37℃恒温摇床共孵育4h，离心取上清，得5mM Z-GP-Gem(+FAPα)。细胞贴壁培养24h后给药：分别将Z-GP-Gem和Gem溶解在含10％乙醇的生理盐水或生理盐水中配置成5mM的储备液，用1640完全培养基将Z-GP-Gem(+FAPα)、Z-GP-Gem和Gem分别稀释到100、50、10、1、0.5、0.1、0.01和0.001μM，每孔给药200μL，于孵箱中37℃培养48h。48h后，弃去培养基，PBS洗两遍，每孔加5mg/mL MTT 20μL，于孵箱中37℃孵育4h。弃去培养基，PBS洗两次，加150μL DMSO，摇床上摇15min，溶解沉淀后，用酶标仪检测490nm处吸光度OD值，计算细胞存活率。细胞存活率％＝(给药孔OD值-溶剂对照孔OD值)/(空白参比孔OD值-溶剂对照孔OD值)×100。考察比较Z-GP-Gem和Gem两种药物在4T1和PC-3两种细胞中的细胞毒性，实验结果如图6所示，表明Z-GP-Gem相比Gem具有更小的细胞毒性，而经过4T1肿瘤组织匀浆液孵育后Z-GP-Gem药液则表现出与原药Gem相当的细胞毒性。
(2)以25万/孔细胞密度接种4T1细胞于6孔板中，于孵箱中37℃培养24h。于显微镜下拍摄，记为0时刻，划痕面积为A0。取1mL 10mM Z-GP-Gem储备液和1mL肿瘤组织匀浆在37℃恒温摇床共孵育4h，离心取上清，得5mM Z-GP-Gem(+FAPα)。给药分组分为4组，分别为Control组，Z-GP-Gem组，Gem组及Z-GP-Gem(+FAPα)组，每组3个复孔。培养24h后给药，Control组，Gem组，Z-GP-Gem组和Z-GP-Gem(+FAPα)组分别加入培养基、5μM Gem、5μM Z-GP-Gem及5μM Z-GP-Gem(+FAPα)各2mL。培养24h后，于显微镜下进行拍摄。并通过Imagine J软件对数据进行分析。计算迁移指数Migration index＝(At-A0)/A0。以4T1细胞为评价模型，采用细胞划痕愈合实验考察了Z-GP-Gem在细胞水平的侵袭转移抑制能力，实验结果如图7所示，表明Z-GP-Gem相比Gem具有更弱的抗侵袭转移能力，而经过4T1肿瘤组织匀浆液孵育后Z-GP-Gem药液则表现出相比原药Gem相当的抗侵袭转移能力。
实施例6、前体药物(Z-GP-Gem)及吉西他滨原药(Gem)在体内的半衰期
以Sprague Dawley大鼠为动物模型，考察单剂量静脉给药情况下，Z-GP-Gem和Gem在血液中的药代动力学过程，考察Z-GP-Gem和Gem在血液中的半衰期和生物利用度。
注射用药液的配制：A注射用Gem溶液剂采用生理盐水配制5mg/mL的Gem溶液，37℃水浴中搅拌溶解，0.45μm微孔滤膜趁热过滤后，37℃恒温水浴中放置，备用。B注射用Z-GP-Gem溶液，采用含10％乙醇的生理盐水配制为10.47mg/mL Z-GP-Gem溶液，37℃恒温水浴中放置，0.45μm微孔滤膜趁热过滤后，备用。雄性Sprague Dawley大鼠(200g左右)随机分为两组，每组5只，实验前禁食12小时。分静脉给予Gem溶液剂(将Gem溶于生理盐水)和Z-GP-Gem溶液(将Z-GP-Gem溶于用10％的乙醇的生理盐水溶液中)，换算成Gem剂量均为7.5mg/kg。给药后于0.25、0.5、1、2、4、6、8和24h，大鼠眼静脉丛取血。精密吸取血浆样品100μL，加入900μL乙腈涡旋混合2min；4℃条件下1500g离心10min，取上清液置于10mL具塞离心管中；55℃恒温下氮气吹干，100μL流动相复溶，涡旋混匀2min，1500g离心5min，取上清液20μL进样测定。以Sprague Dawley大鼠为模型，采用单剂量静脉注射给药，评价比较了Z-GP-Gem和Gem两种药物在血液中的药物动力学行为。
表1.SD大鼠单剂量尾静脉注射Z-GP-Gem(28.5μmol/kg)和Gem(28.5μmol/kg)的药动学参数(n＝5)
参数 Z-GP-Gem组 Gem组
t1/2α(h) 1.53 0.76
t1/2β(h) 5.13 3.12
AUC0-24(μmol/L*h) 169.2 98.9
CL(mL/h) 33.71 57.67
实验结果如表1和图8所示，表明Z-GP-Gem相比Gem具有更长的半衰期，延长药物在血液循环中的滞留时间，有利于提高药物在肿瘤组织中的蓄积。
实施例7、前体药物(Z-GP-Gem)除hENT以外可通过自由扩散方式进入胞内
在4T1细胞系上，通过HPLC法测定在含与不含hENT抑制剂的情况下Z-GP-Gem和Gem的摄取量，验证Z-GP-Gem和Gem的摄取方式。
以25万/孔细胞密度接种4T1细胞于6孔板中，置于37℃孵箱培养24h。分为4组，Z-GP-Gem组、Gem组、Z-GP-Gem(+DP)组和Gem(+DP)组，每组3个复孔。24h后，Z-GP-Gem(+DP)组和Gem(+DP)组用20μg/mL双嘧达莫(DP)预处理30min。给药，4组均按给药浓度为Gem当量100μg/mL(381μmol/L)给药。4h后，每孔加入100μL RIPA裂解液，室温裂解15min，细胞刮刀刮下细胞于1.5mL离心管中，100μL甲醇润洗，将润洗液加入离心管中。4℃ 12000rpm离心30min，取100μL上清液，加入1800μL乙腈，速涡旋混合2min；4℃条件下1500g离心10min，取上清液于10mL具塞离心管中；55℃恒温氮气吹干，100μL流动相复溶，涡旋混匀2min，1500g离心10min，取上清液20μL进样，HPLC测定Gem和Z-GP-Gem含量。Gem的HPLC的条件为：温度：25℃；波长：268nm；流速：1mL/min；流动相比例：0.05M CH3COONH4水溶液∶甲醇(V/V)＝9∶91。Z-GP-Gem的HPLC条件为：温度：25℃；波长：250nm；流速：1mL/min；流动相比例：0.1％CF3COOH水溶液∶乙腈(V/V)＝70∶30。根据回归曲线计算Z-GP-Gem和Gem在4T1细胞系上的摄取。
4T1细胞摄取实验结果如图9所示，表明Z-GP-Gem在含或不含hENT受体抑制剂的情况下，细胞摄取量差异不大，而原药Gem则在两种不同情况下表现出显著差异的摄取量，这些结果说明Z-GP-Gem相比Gem可以通过除hENT受体介导途径以外的细胞膜自由扩散方式发生摄取。
实施例8、前体药物(Z-GP-Gem)的体内抗肿瘤活性
采用4T1乳腺癌原位荷瘤小鼠模型，考察Gem和低、中、高剂量的Z-GP-Gem在动物水平的抑瘤效应，抗转移能力及安全性并考察了Z-GP-Gem对CAF的损伤及对其在肿瘤组织中密度的影响。
前体药物(Z-GP-Gem)具有更优于原形药物的体内抗肿瘤及抗迁移活性，并发现其具有对CAF具有一定的损伤作用。构建BALB/c小鼠4T1原位乳腺瘤模型。待细胞长至足够数目，使用0.25％EDTA-胰酶消化，离心，去除上清，将细胞悬浮于无血清RPMI 1640培养基中，细胞浓度约为107个/mL。30只雌性BALB/c小白鼠，5～6周龄，以2×106细胞/只小鼠的数量接种于BALB/c小鼠第四乳垫下(200μL细胞悬液)。小鼠接种后，需每天观察。直至肿瘤模型成功建立。当小鼠的肿瘤体积达到100-200mm3，将肿瘤小鼠随机分配为5组：①生理盐水组②Gem组(20mg/kg)③Z-GP-Gem低剂量组(Gem当量10mg/kg)(20.95mg/kg)，④Z-Z-GP-Gem中剂量组(Gem当量20mg/kg)(41.9mg/kg)⑤Z-GP-Gem高剂量组(Gem当量30mg/kg)(62.85mg/kg)。每组6只，采用尾静脉注射的方式给药，给药间隔为2天，总共给药4次。从给药前一天起，每天观察肿瘤生长情况，使用游标卡尺测量肿瘤的长径L(mm)和短径W(mm)，计算瘤体积，肿瘤体积计算公式为：V＝0.5×L×W2，绘制肿瘤体积-时间变化图。荷瘤小白鼠于给药后的第12天处死，解剖获得肿瘤组织，称量瘤重。解剖各组小鼠，取出肺组织，置于5mL EP管中，加入Bouin’s固定液浸泡10min，对肺组织上的转移点进行计数(n＝6)，并将每组的肺组织置于A4白纸上，拍摄(n＝3)。通过免疫荧光实验考察肿瘤组织中CAF的多少，取Saline组、Gem组和M-Z-GP-Gem组三组的肿瘤组织，制备为冷冻切片。4％的多聚甲醛室温固定15min；PBS洗3次，5％的BSA固定30min；PBS洗3次，α-SMA兔源单克隆一抗(1∶200稀释)4℃孵育过夜。PBS洗3次，Texas Red标记的山羊抗鼠二抗(1∶100稀释)37℃避光孵育2h。PBS洗3次，5μg/mL Hoechst 33342室温染核15min；PBS洗3次，甘油-PBS(V/V＝9∶1)封片，避光保存。采用STED激光共聚焦显微镜进行观察。通过免疫荧光实验考察肿瘤组织中CAF的多少，取Saline组、Gem组和M-Z-GP-Gem组三组的肿瘤组织，制备为冷冻切片。4％的多聚甲醛室温固定15min；PBS洗3次，5％的BSA固定30min；PBS洗3次，α-SMA兔源单克隆一抗(1∶200稀释)4℃孵育过夜。PBS洗3次，Texas Red标记的山羊抗鼠二抗(1∶100稀释)37℃避光孵育2h。PBS洗3次，5μg/mL Hoechst 33342室温染核15min；PBS洗3次，甘油-PBS(V/V＝9∶1)封片，避光保存。采用STED激光共聚焦显微镜进行观察。以接种4T1肿瘤的BALB/c小鼠为评价模型，考察比较了Z-GP-Gem和Gem两种药物的抗肿瘤治疗效应。
实验结果表明，在等摩尔量的剂量情况下，Z-GP-Gem相比Gem具有更强的肿瘤生长抑制效应，并发现Z-GP-Gem随剂量升高而增强抗肿瘤效应(图10)；在肺组织转移灶的检查结果中发现Z-GP-Gem相比Gem具有更强的抑制肿瘤转移能力(图11)。通过免疫荧光实验验证了与Gem相比，等摩尔量的Z-GP-Gem具有更强的CAF损伤能力。在整个给药过程中，Z-GP-Gem相比Gem具有更好的安全性。

Claims (10)

1.一种吉西他滨前体药物，是二肽与吉西他滨相连接形成的前体药物，其中所述二肽具有被FAPα酶进行特异性识别和响应性剪切的特性。
2.如权利要求1所述的吉西他滨前体药物，其特征在于，所述二肽为N-末端封闭的Gly-Pro二肽。
3.如权利要求2所述的吉西他滨前体药物，其特征在于，封闭二肽N-末端的保护基团选自下列基团中的一种：苄氧羰基、叔丁氧羰基、芴甲氧羰基和烯丙基氧基羰基。
4.如权利要求3所述的吉西他滨前体药物，其特征在于，所述二肽为式I所示的苄氧羰基封闭N端的甘氨酰脯氨酸二肽或式II所示的苄氧羰基封闭N端的脯氨酰甘氨酸二肽：
5.如权利要求1所述的吉西他滨前体药物，其特征在于，一个或多个所述二肽通过酰胺键、酯键和/或氨基甲酸酯键连接吉西他滨的4-NH2、3’-OH和/或5’-OH位点。
6.如权利要求1所述的吉西他滨前体药物，其特征在于，所述吉西他滨前体药物选自下列分子中的一种或多种：
7.一种吉西他滨前体药物Z-GP-Gem的制备方法，包括以下步骤：
1)密闭条件下，将吉西他滨溶解于溶剂中，0～40℃搅拌下加入保护试剂，将吉西他滨的羟基进行保护，形成氨基游离的保护产物；
2)将苄氧羰基保护的甘氨酸溶解在溶剂中，室温下加入活化试剂活化，然后加入脯氨酸，室温下搅拌反应，得到二肽产物；
3)将步骤2)得到的二肽溶解于溶剂中，室温下加入活化试剂进行活化，然后逐量加入步骤1)制备的羟基保护的吉西他滨产物，室温搅拌反应，得到的产物经过氟离子脱保护，得到终产物。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1)、2)和3)中所用溶剂选自下列有机溶剂中的一种或多种：N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃和三乙胺；步骤1)中所述保护试剂为叔丁基二甲基氯硅烷、三甲基氯硅烷或叔丁基二苯基氯硅烷；步骤2)中所述活化试剂为N-乙酰基琥珀酸酯；步骤3)中所述活化试剂为二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三氮唑、N，N-羰基二咪唑、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯、二异丙基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，脱保护所用试剂为四丁基氟化铵。
9.权利要求1～6任一所述的吉西他滨前体药物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
10.一种药物组合物，包含权利要求1～6任一所述的吉西他滨前体药物。
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