CN103113274B - Ras和HDAC双重抑制剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Ras和HDAC双重抑制剂及其制备方法和用途，具有通式Ⅰ、Ⅱ的结构，可用于制备治疗慢性炎症和治疗肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、胃癌的肿瘤的药物。
Description
技术领域
本发明药物领域，具体涉及可作为Ras和HDAC双重抑制剂的羟肟酸类法尼基硫代水杨酸衍生物及其药学上可接受的盐，它们的制备方法，含有这些衍生物的药用组合物以及它们的医药用途，尤其涉及在预防、延缓或治疗Ras或HDAC单独或两者同时参与介导的疾病，特别是在肿瘤的药物中的应用。
背景技术
全反式法尼基硫代水杨酸（简称：FTA,商品名：Salirasib）作为新的基于法尼基转移酶的Ras蛋白抑制剂，与体内细胞膜上法尼基半胱氨酸相似，能够竞争性取代F-Ras和F-Ras突变蛋白与半乳凝素结合，抑制由Ras引发下游信号通路Z（包括Raf和PI3K信号通路）和mTOR（肿瘤发生的刺激器，它能够依靠或者独立地打开PI3K信号通路），从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的生长。研究表明，FTA可以抑制多种肿瘤（脑胶质瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌等）细胞增殖及迁移（Cancer Chemother Pharmacol,2008,61(1):89-96;CancerChemother Pharmacol,2009,65(2):235-241;J Thorac Oncol,2011,6(8):
1435-1437）。FTA虽已处于II期临床研究，但由于其无法强有力地阻止及逆转恶性肿瘤发展进程，且临床治疗效果不高，使用剂量大，临床上通常需要和其他具有细胞毒作用的抗肿瘤药联合治疗。究其原因，可能是单独对Ras蛋白靶点的抑制难以达到理想的阻断肿瘤细胞恶性增殖过程，且有可能引起肿瘤耐药。
法尼基硫代水杨酸（FTA，Salirasib）
基因转录的有序调控是机体细胞维持正常功能的前提，如果基因转录调控功能紊乱，细胞则可能发生癌变。组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）和组蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases，HATs）是真核细胞中控制染色质中组蛋白尾部乙酰化水平的两个家族，核心组蛋白氨基末端尾部包含的赖氨酸残基，是HAT和HDAC乙酰化和去乙酰化底物，赖氨酸残基的ε-氨基的乙酰化和去乙酰化，代表控制基因表达的主要分子表观遗传机制。在肿瘤细胞中，HDACs的过度表达导致组蛋白与DNA结合力增强，从而引起染色体异构，影响基因转录。与此同时，过度表达的HDACs能抑制细胞周期抑制因子p21CIP1或p27KIP1的表达，降低肿瘤抑制因子p53的稳定性，并且促进肿瘤细胞中的缺氧诱导因子（Hypoxia induciblefactor-l，HIF-l）和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）的表达。研究发现，HDACs抑制剂（HDACi）通过抑制HDACs的酶活性，阻碍组蛋白的去乙酰化，使染色体结构松弛，促进转录因子和DNA结合，能有效抑制肿瘤细胞增殖，导致细胞周期阻滞，诱导肿瘤细胞的分化和凋亡，提高放化疗的敏感性。因此，HDACs成为抗癌药物设计的新靶点，开发HDACs抑制剂（HDACi）被视为肿瘤治疗一个有效的策略。
另据临床研究表明，Ras抑制剂FTA在HDAC抑制剂丙戊酸作用下可显著阻滞肿瘤细胞生长周期，抑制Survivin（凋亡抑制蛋白）表达和Aurora A致癌基因转录，尤其对于存在K-ras基因突变型肺癌和肠癌，其疗效更加明确（Int.J.Cancer2011,128,691–701）；Ras抑制剂Sorafenib在HDAC抑制剂Vorinostat协同作用下不仅可以明显抑制Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt通路，还可以抑制抗凋亡蛋白表达，协同细胞杀伤效应通过Bax构型改变及向线粒体易位，刺激线粒体释放细胞色素C，从而促进细胞凋亡（Clin.Cancer Res.2008,14(17):5385–5399）。基于这些研究，我们考虑在Ras抑制剂FTA羧基上引入HDACs抑制剂结构片段，使其不仅具有Ras抑制活性，而且同时靶向HDACs治疗，有效抑制肿瘤细胞增殖，诱导其分化和凋亡，导致细胞周期阻滞，抑制Ras突变蛋白和下游Ras/Raf/MEK/ERK,PI3K/Akt信号通路，从而获得高效、低毒、具有协同效应的Ras和HDACs多靶点抗肿瘤药物。
为获得比FTA抗肿瘤活性更优的化合物，我们开展了FTA的结构修饰研究。本发明公开了一类具有药用价值的Ras和HDAC双重抑制活性的羟肟酸类FTA衍生物及其药学上可接受的盐，目前尚未见对此类化合物的任何报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有Ras和HDAC双重抑制活性的Ras和HDAC双重抑制剂及其制备方法和用途。
本发明的技术解决方案是：
一种Ras和HDAC双重抑制剂，其特征是：具有下述通式Ⅰ的结构：
通式Ⅰ中：-NH-A-CO-选自构型为甘氨酸残基、L-或D-型α-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、L-或D-型缬氨酸残基、L-或D-型亮氨酸残基、L-或D-型异亮氨酸残基、L-或D-型甲硫氨酸残基、L-或D-型半胱氨酸残基、L-或D-型苯丙氨酸残基、L-或D-型酪氨酸残基、L-或D-型色氨酸残基、L-或D-型精氨酸残基、L-或D-型脯氨酸残基、L-或D-型组氨酸残基；或者选自-NH(CH2)nCO-,n=3~7；或者选自
m=0~5，R=H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基；或者选自
或者选自o=0~5；或者选自
所述通式Ⅰ的结构中的-NH-A-CO-选自如下：
-NH-A-CO-=-NHCH2CO-；
或者-NH-A-CO-=-NH(CH2)2CO-；
或者-NH-A-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者-NH-A-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者-NH-A-CO-=-NH(CH2)5CO-；
或者
或者
或者
或者
或者
或者
或者
或者
一种Ras和HDAC双重抑制剂，其特征是：具有下述通式Ⅱ的结构：
通式Ⅱ中：-NH-A-CO-选自构型为甘氨酸残基、L-或D-型α-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、L-或D-型缬氨酸残基、L-或D-型亮氨酸残基、L-或D-型异亮氨酸残基、L-或D-型甲硫氨酸残基、L-或D-型半胱氨酸残基、L-或D-型苯丙氨酸残基、L-或D-型酪氨酸残基、L-或D-型色氨酸残基、L-或D-型精氨酸残基、L-或D-型脯氨酸残基、L-或D-型组氨酸残基；或者选自-NH(CH2)nCO-,n=3~7；或者选自
或者选自
o=0~5；或者选自X选自-O-，或者选自-NH-，或者选自-NCH3-；m=1~8。
所述通式Ⅱ的结构中的-NH-A-CO-、X和m选自如下组合：
-NH-A-CO-=-NHCH2CO-，X=NH，m=3；
或者
X=NH，m=2；
或者X=NH，m=1；
或者-NH-A-CO-=-NHCH2CO-，X=NH，m=1；
或者-NH-A-CO-=-NHCH2CO-，X=NH，m=2；
一种Ras和HDAC双重抑制剂的制备方法，其特征是：
所述通式Ⅰ制备方法包括以下步骤：
A．先将FTA在氯化亚砜作用下制备FTA酰氯（1）；
B．再与H2N-A-COOMe在三乙胺的二氯甲烷溶液中反应得到化合物（2）；
C．化合物（2）再与盐酸羟胺在氢氧化钾的甲醇溶液下反应制得通式Ⅰ；
通式Ⅰ反应路线如下所示：
其中，通式Ⅰ中：-NH-A-CO-选自构型为-NH-A-CO-选自构型为甘氨酸残基、L-或D-型α-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、L-或D-型缬氨酸残基、L-或D-型亮氨酸残基、L-或D-型异亮氨酸残基、L-或D-型甲硫氨酸残基、L-或D-型半胱氨酸残基、L-或D-型苯丙氨酸残基、L-或D-型酪氨酸残基、L-或D-型色氨酸残基、L-或D-型精氨酸残基、L-或D-型脯氨酸残基、L-或D-型组氨酸残基；或者选自-NH(CH2)nCO-,n=3~7；或者选自
m=0~5，R=H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基；或者选自或者选自o=0~5；或者选自
一种Ras和HDAC双重抑制剂的制备方法，其特征是：
所述通式Ⅱ制备方法包括以下步骤：
A．将化合物（2）在含有NaOH的甲醇溶液中水解得到化合物（3）；
B．化合物（3）在缩合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）作用下，与HX(CH2)mCOOMe反应生成化合物（4）；
C．最后化合物（4）与盐酸羟胺在氢氧化钾的甲醇溶液下反应制得通式Ⅱ；
通式Ⅱ反应路线如下所示：
其中，通式Ⅱ中：-NH-A-CO-选自构型为甘氨酸残基、L-或D-型α-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、L-或D-型缬氨酸残基、L-或D-型亮氨酸残基、L-或D-型异亮氨酸残基、L-或D-型甲硫氨酸残基、L-或D-型半胱氨酸残基、L-或D-型苯丙氨酸残基、L-或D-型酪氨酸残基、L-或D-型色氨酸残基、L-或D-型精氨酸残基、L-或D-型脯氨酸残基、L-或D-型组氨酸残基；或者选自-NH(CH2)nCO-,n=3~7；或者选自
或者选自
o=0~5；或者选自
X选自-O-，或者选自-NH-，或者选自-NCH3-；m=1~8。
一种药物组合物，其特征是：是含有通式Ⅰ或Ⅱ化合物的药物组合物。
一种Ras和HDAC双重抑制剂在制备治疗慢性炎症和治疗肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、胃癌的肿瘤药物中的应用。
一种Ras和HDAC双重抑制剂在制备治疗慢性炎症和治疗肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、胃癌的肿瘤药物中的应用。
具体的说，通式Ⅰ中所示的羟肟酸类FTA衍生物优选自下列化合物：
N-(2-(羟氨基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（化合物编号：Ⅰ1，下同）
N-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ2）
N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ3）
N-(5-(羟氨基)-5-氧杂戊基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ4）
N-(6-(羟氨基)-6-氧杂己基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ5）
(S)-N-(1-(羟氨基)-1-氧杂丙基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ6）
(S)-N-(1-(羟氨基)-3-甲基-1-氧杂丁基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ7）
(S)-N-(1-(羟氨基)-4-甲硫基-1-氧杂丁基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ8）
(S)-N-(1-(羟氨基)-4-甲基-1-氧杂戊基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ9）
(S)-N-(1-(羟氨基)-3-甲基-1-氧杂戊基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ10）
(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂-1-丙烯基)苯基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ11）
N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)苯基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ12）
N-(4-(羟氨基甲酰基)苯基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ13）
N-(4-(羟氨基甲酰基)苄基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ14）
通式Ⅱ中所示的羟肟酸类FTA衍生物优选自下列化合物：
N-(2-(4-(羟胺)-4-氧杂丁胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ1）
(S)-N-(1-(3-(羟胺)-3-氧杂丙胺基)-1-氧杂丙基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ2）
(S)-N-(1-(2-(羟胺)-2-氧杂乙胺基)-3-甲基-1-氧杂丁基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ3）
N-(2-(2-(羟胺)-2-氧杂乙胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ4）
N-(2-(3-(羟胺)-3-氧杂丙胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ5）
上述结构通式Ⅰ优选化合物代号及其对应的结构如表1所示
表1通式Ⅰ优选化合物代号及其对应的结构
上述结构通式Ⅱ优选化合物代号及其对应的结构如表2所示
表2通式Ⅱ优选化合物代号及其对应的结构
所述的化合物包括通式Ⅰ、Ⅱ化合物的所有构象异构体、旋光异构体以及外消旋体，非对映异构体以及互变异构体及立体异构体，以及上述形式的混合体。
本发明化合物可以单独或与一种或一种以上的药学上可接受的载体组合制成制剂以供给药。例如，溶剂、稀释剂等，可以用口服剂型给药，如片剂、胶囊、可分散粉末、颗粒剂等。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。这些药用制剂中可以含有与载体组合的例如0.05%~90%重量的活性成分，更常见约15%~60%之间重量的活性成分。本发明化合物剂量可以是0.005~5000mg/kg/天，也可根据疾病严重程度或剂型的不同使用剂量超出此剂量范围。
本发明化合物可以与其他抗肿瘤药物例如烷化剂（如环磷酰胺或顺铂）、抗代谢药（如5-氟尿嘧啶或羟基脲）、拓扑异构酶抑制剂（如喜树碱）、有丝分裂抑制剂（如紫杉醇或长春碱）、DNA插入剂（如阿霉素）联合应用，另外还可以与放射治疗联合应用。这些其他抗肿瘤药物或放射治疗可以与本发明化合物同时或在不同时间给予。这些联合治疗可以产生协同作用从而有助于改善治疗效果。
本发明化合物的部分药理试验结果如下：
（1）四甲基氮唑蓝比色法（MTT）体外抗肿瘤试验
药理实验结果表明：本发明化合物对人类肿瘤细胞的增殖具有不同程度的抑制作用，大部分化合物抗肿瘤活性均显著强于先导化合物FTA，多数化合物抗肿瘤活性比阳性对照药SAHA稍强或相当。经过一系列肿瘤细胞测试，发现这些化合物对胰腺癌细胞PANC-1、肝癌细胞SMMC-7721和人脑胶质瘤细胞U251作用较强，尤其表4中Ⅰ1-3，Ⅰ11-12和Ⅱ1-2化合物在25μmol/L浓度下抑制率均远远超过先导物FTA。
表3本发明部分化合物对肿瘤细胞增殖的抑制率%(25μmol/L)
ND:未检测.
（2）Ras下游的p-Raf、p-Akt、p-ERK抑制活性测试
实验结果发现：化合物Ⅰ1-Ⅰ14或化合物Ⅱ1-Ⅱ5均不同程度上对Ras下游p-Raf、p-Akt、p-ERK抑制活性，保留了母核FTA原有对Ras下游信号通路抑制活性，其中化合物Ⅰ1-Ⅰ3、Ⅰ11-Ⅰ14、Ⅱ2在6.125μM和12.5μM浓度下可以显著抑制Akt，ERK，Raf分子的磷酸化，提示新型羟肟酸类FTA衍生物仍保留了对Ras下游信号通路抑制活性。
（3）对HDACs抑制活性测试
实验结果发现：化合物Ⅰ1-Ⅰ14或化合物Ⅱ1-Ⅱ5均不同程度上对HDACs抑制活性，其中化合物Ⅰ1-Ⅰ3、Ⅰ6、Ⅰ11、Ⅰ14、Ⅱ2对HDACs抑制活性数据见表4，化合物Ⅰ1-Ⅰ3、Ⅰ11、Ⅰ14、Ⅱ2均显示出比阳性对照药SAHA稍强或相当的抑制活性，提示新型羟肟酸类FTA衍生物不仅具有对Ras下游信号通路抑制活性，而且具有HDACs抑制活性，从而获得具有协同效应的Ras和HDACs多靶点抗肿瘤效果。
表4本发明部分化合物体外酶抑制实验结果
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。本发明所用FTA为实验室制备，含量>98％。
实施例1N-(2-(羟氨基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ1）的制备法尼基硫代水杨酸酰氯（1）的制备
将0.36g(1.00mmol)FTA溶解于10mL无水CH2Cl2中，向其中加入0.40mL(5.51mmol)氯化亚砜，55℃下搅拌1小时，浓缩得黄色油状物法尼基硫代水杨酸酰氯（1）。
N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备
将0.09g(1.00mmol)甘氨酸甲酯和0.2mL(1.50mmol)三乙胺溶解于5mL无水CH2Cl2中，冰浴下滴加前面制得1的10mL无水CH2Cl2溶液，之后室温搅拌反应1.5h，反应液分别用10mL水和饱和NaCl溶液洗涤，CH2Cl2用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得0.37g黄色油状物，收率86%。
N-(2-(羟氨基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ1）的制备
将1.74g(25mmol)的盐酸羟胺溶解于10mL甲醇中，冰浴下缓慢加入1.40g(25mmol)氢氧化钾的10mL甲醇溶液，室温搅拌1h后过滤，冰浴下向滤液中加入0.21g(0.5mmol)化合物（2a）的5mL甲醇溶液，室温搅拌0.5h后加入0.06g(1.0mmol)氢氧化钾，再继续室温反应24h后，浓缩，柱层析得到油状物0.16g，收率69%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.80(d,1H,J=7.8Hz,Ar-H),7.24(m,2H,Ar-H),7.12(m,1H,Ar-H),5.22(m,1H,SCH2CH),5.01(m,2H,2×CH2CH=CCH3),4.56(m,2H,NHCH 2),3.82(d,2H,J＝7.2Hz,SCH 2),2.10-1.76(m,8H,2×CHCH 2CH 2CH),1.69-1.56(m,12H,4×CH3);ESI-MS(m/z):431[M+H]+.
实施例2N-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ2）的制备
N-(3-(甲氧基)-3-氧杂丙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2b）的制备
参照实施例1中N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备方法，由3-氨基丙酸甲酯替代方法中的甘氨酸甲酯，再与（1）反应制得黄色油状物（2b），收率85%。
N-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ2）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由2b替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅰ2），收率73%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.24(m,1H,NH),8.09(m,1H,NH),7.65(m,2H,ArH),7.37(m,2H,ArH),5.41(m,1H,SCH2CH),5.18(m,2H,2×CH2CH=CCH3),3.76(d,2H,J＝7.2Hz,SCH 2),3.18(m,4H,2×CH2),2.05-1.83(m,8H,2×CHCH 2CH 2CH),1.69-1.55(m,12H,4×CH3);ESI-MS(m/z):445[M+H]+.
实施例3N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ3）的制备
N-(4-(甲氧基)-4-氧杂丁基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2c）的制备
参照实施例1中N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备方法，由4-氨基丁酸甲酯替代方法中的甘氨酸甲酯，再与（1）反应制得黄色油状物（2c），收率83%。
N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ3）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由2c替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅰ3），收率70%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.98(d,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.60-7.57(m,2H,Ar-H),7.39(m,1H,Ar-H),5.46(m,1H,SCH2CH),5.20(m,2H,2×CH2CH=CCH3),3.78(d,2H,J＝7.2Hz,SCH 2),3.52(m,2H,NHCH 2),2.34(m,2H,CH 2CONH),2.21(m,2H,NHCH2CH 2),2.00-1.87(m,8H,2×CHCH 2CH 2CH),1.68-1.57(m,12H,4×CH3);ESI-MS(m/z):459[M+H]+.
实施例4N-(5-(羟氨基)-5-氧杂戊基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ4）的制备
N-(5-(甲氧基)-5-氧杂戊基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2d）的制备
参照实施例1中N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备方法，由5-氨基戊酸甲酯替代方法中的甘氨酸甲酯，再与（1）反应制得黄色油状物（2d），收率77%。
N-(5-(羟氨基)-5-氧杂戊基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ4）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由2d替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅰ4），收率71%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.88(d,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.67-7.58(m,2H,Ar-H),7.32(m,1H,Ar-H),5.34(m,1H,SCH2CH),5.28(m,2H,2×CH2CH=CCH3),3.81(d,2H,J＝7.2Hz,SCH 2),3.40(m,2H,NHCH 2),2.32(m,2H,CH 2CONH),2.01-1.89(m,8H,2×CHCH 2CH 2CH),1.59-1.70(m,12H,4×CH3),1.56(m,2H,NHCH2CH 2),1.53(m,2H,CH 2CH2CONH);ESI-MS(m/z):473[M+H]+.
实施例5N-(6-(羟氨基)-6-氧杂己基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ5）的制备
N-(6-(甲氧基)-6-氧杂己基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2e）的制备
参照实施例1中N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备方法，由6-氨基己酸甲酯替代方法中的甘氨酸甲酯，再与（1）反应制得黄色油状物（2e），收率72%。
N-(6-(羟氨基)-6-氧杂己基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ5）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由2e替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅰ5），收率73%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.11(d,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.60-7.58(m,2H,Ar-H),7.31(m,1H,Ar-H),5.90(m,1H,SCH2CH),5.15(m,2H,2×CH2CH=CCH3),3.74(d,2H,J＝7.2Hz,SCH 2),3.54(m,2H,NHCH 2),2.43(m,2H,CH 2CONH),2.13-1.82(m,8H,2×CHCH 2CH 2CH),1.70-1.59(m,12H,4×CH3),1.56(m,2H,NHCH2CH 2),1.32(m,2H,CH 2CH2CONH);ESI-MS(m/z):487[M+H]+.
实施例6(S)-N(1-(羟氨基)-1-氧杂丙基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ6）的制备
(S)-N-(1-(甲氧基)-1-氧杂丙基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2f）的制备
参照实施例1中N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备方法，由L-α丙氨酸甲酯替代方法中的甘氨酸甲酯，再与（1）反应制得黄色油状物（2f），收率70%。
(S)-N-(1-(羟氨基)-1-氧杂丙基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ6）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由2f替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅰ6），收率65%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.84(d,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.66-7.55(m,2H,Ar-H),7.35(m,1H,Ar-H),5.42(m,1H,SCH2CH),5.25(m,2H,2×CH2CH=CCH3),4.71(m,1H,NHCH),3.81(m,2H,SCH 2),2.01-1.87(m,8H,2×CHCH 2CH 2CH),1.78-1.46(m,12H,4×CH=CCH 3),1.48(m,3H,NHCHCH 3);ESI-MS m/z):445[M+H]+.
实施例7(S)-N-(1-(羟氨基)-3-甲基-1-氧杂丁基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ7）的制备
(S)-N-(1-(甲氧基)-3-甲基-1-氧杂丁基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2g）的制备
参照实施例1中N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备方法，由L-缬氨酸甲酯替代方法中的甘氨酸甲酯，再与（1）反应制得黄色油状物（2g），收率65%。
(S)-N-(1-(羟氨基)-3-甲基-1-氧杂丁基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ7）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由2g替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅰ7），收率68%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.02(d,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.78-7.40(m,2H,Ar-H),7.23(m,1H,Ar-H),5.44(m,1H,SCH2CH),5.04(m,2H,2×CH2CH=CCH3),4.53(m,1H,NHCH),3.80(d,2H,J＝7.2Hz,SCH 2),2.03-1.78(m,9H,2×CHCH 2CH 2CH,NHCHCH),1.71-1.60(m,12H,4×CH=CCH 3),0.94(m,6H,CH(CH 3)2);ESI-MS(m/z):473[M+H]+.
实施例8(S)-N-(1-(羟氨基)-4-甲硫基-1-氧杂丁基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ8）的制备
(S)-N-(1-(甲氧基)-4-甲硫基-1-氧杂丁基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2h）的制备
参照实施例1中N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备方法，由L-甲硫氨酸甲酯替代方法中的甘氨酸甲酯，再与（1）反应制得黄色油状物（2h），收率69%。
(S)-N-(1-(羟氨基)-4-甲硫基-1-氧杂丁基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ8）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由2h替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅰ8），收率72%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.95(d,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.70-7.54(m,2H,Ar-H),7.14(m,1H,Ar-H),5.60(m,1H,SCH2CH),5.32(m,2H,2×CH2CH=CCH3),4.81(m,1H,NHCH),3.91(m,2H,SCH 2CH=CCH3),2.46(t,2H,J＝7.6Hz,CH 2SCH3),2.13(s,3H,SCH3),2.08-1.80(m,10H,CHCH 2,2×CHCH 2CH 2CH),1.70-1.40(m,12H,4×CH=CCH 3);ESI-MS(m/z):505[M+H]+.
实施例9(S)-N-(1-(羟氨基)-4-甲基-1-氧杂戊基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ9）的制备
(S)-N-(1-(甲氧基)-4-甲基-1-氧杂戊基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2i）的制备
参照实施例1中N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备方法，由L-亮氨酸甲酯替代方法中的甘氨酸甲酯，再与（1）反应制得黄色油状物（2i），收率66%。
(S)-N-(1-(羟氨基)-4-甲基-1-氧杂戊基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ9）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由2i替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅰ9），收率71%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.05(d,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.82-7.52(m,2H,Ar-H),7.48(m,1H,Ar-H),5.39(m,1H,SCH2CH),5.13(m,2H,2×CH2CH=CCH3),4.26(m,1H,NHCH),3.95(d,2H,J＝7.2Hz,SCH 2),,2.21-1.80(m,10H,2×CHCH 2CH 2CH,NHCHCH 2),1.68-1.44(m,12H,4×CH=CCH 3),1.31(m,2H,CH 2CH3),0.84(t,3H,J＝7.4Hz,CH2CH 3);ESI-MS(m/z):487[M+H]+.
实施例10(S)-N-(1-(羟氨基)-3-甲基-1-氧杂戊基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ10）的制备
(S)-N-(1-(甲氧基)-3-甲基-1-氧杂戊基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2j）的制备
参照实施例1中N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备方法，由L-异亮氨酸甲酯替代方法中的甘氨酸甲酯，再与（1）反应制得黄色油状物（2j），收率69%。
(S)-N-(1-(羟氨基)-3-甲基-1-氧杂戊基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ10）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由2j替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅰ10），收率70%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.87(d,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.53-7.43(m,2H,Ar-H),7.31(m,1H,Ar-H),5.33(m,1H,SCH2CH),5.10(m,2H,2×CH2CH=CCH3),4.78(m,1H,NHCH),3.65(d,2H,J＝7.2Hz,SCH 2),2.66(m,1H,NHCHCH),2.05-1.72(m,8H,2×CHCH 2CH 2CH),1.63-1.41(m,12H,4×CH=CCH 3),1.03(m,6H,CH 3CHCH 3);ESI-MS(m/z):487[M+H]+.
实施例11(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯基)苯基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ11）的制备
(E)-N-(4-(3-(甲氧基)-3-氧杂丙基-1-烯基)苯基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2k）的制备
参照实施例1中N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备方法，由对氨基苯丙烯酸甲酯替代方法中的甘氨酸甲酯，再与（1）反应制得黄色油状物（2k），收率72%。
(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯基)苯基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ11）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由2k替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅰ11），收率72%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):7.90(m,1H,ArH),7.72(m,2H,ArH),7.55(m,2H,ArH,ArCH),7.40(m,2H,ArH),7.30(m,1H,ArH),5.23(m,1H,SCH2CH),5.04(m,2H,2×CH2CH＝CCH3),3.50(d,2H,J＝7.2Hz,SCH2),1.97-2.04(m,8H,CH2),1.55-1.69(m,12H,CH3);ESI-MS(m/z):519[M+H]+.
实施例12N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)苯基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ12）的制备
N-(4-(3-(甲氧基)-3-氧杂丙基)苯基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2l）的制备
参照实施例1中N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备方法，由对氨基苯丙酸甲酯替代方法中的甘氨酸甲酯，再与（1）反应制得黄色油状物（2l），收率66%。
N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)苯基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ12）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由2l替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅰ12），收率68%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):7.92(m,1H,ArH),7.75(m,2H,ArH),7.51(m,2H,ArH),7.44(m,2H,ArH),7.36(m,1H,ArH),5.26(m,1H,SCH2CH),5.06(m,2H,2×CH2CH＝CCH3),3.50(d,2H,J＝7.2Hz,SCH2),2.93(m,2H,ArCH2),2.74(m,2H,CH2CO),2.00(m,8H,CH2),1.54(m,12H,CH3);ESI-MS m/z):521[M+H]+.
实施例13N-(4-(羟胺基甲酰基)苯基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ13）的制备
N-(4-(甲氧基甲酰基)苯基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2m）的制备
参照实施例1中N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备方法，由对氨基苯甲酸甲酯替代方法中的甘氨酸甲酯，再与（1）反应制得黄色油状物（2m），收率69%。
N-(4-(羟胺基甲酰基)苯基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ13）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由2m替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅰ13），收率73%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):8.13(m,1H,Ar-H),7.97(d,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.78(m,2H,Ar-H),7.27-7.40(m,4H,Ar-H),5.24(m,1H,SCH2CH),5.09(m,2H,2×CH2CH＝CCH3),3.58(d,2H,J＝7.2Hz,SCH2),1.99-2.05(m,8H,4×CH2),1.45-1.68(m,12H,4×CH3);ESI-MS(m/z):493[M+H]+.
实施例14N-(4-(羟胺基甲酰基)苄基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ14）的制备
N-(4-(甲氧基甲酰基)苄基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2n）的制备
参照实施例1中N-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（2a）的制备方法，由对氨甲基苯甲酸甲酯替代方法中的甘氨酸甲酯，再与（1）反应制得黄色油状物（2n），收率65%。
N-(4-(羟胺基甲酰基)苄基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅰ14）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由2n替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅰ14），收率67%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):7.95(m,1H,ArH),7.78(m,2H,ArH),7.53(m,2H,ArH,ArCH),7.41(m,2H,ArH),7.28(m,1H,ArH),5.26(m,1H,SCH2CH),5.05(m,2H,2×CH2CH＝CCH3),4.39(s,2H,ArCH2),3.53(d,2H,J＝7.2Hz,SCH2),1.97-2.02(m,8H,CH2),1.51-1.67(m,12H,CH3);ESI-MS(m/z):507[M+H]+.
实施例15N-(2-(4-(羟胺)-4-氧杂丁胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ1）的制备
N-(2-(羟基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（3a）的制备
将0.43g(1.00mmol)2a溶解于10mL MeOH中，向其中加入2mL1M NaOH水溶液，60℃下搅拌1.5h，蒸除反应液中的甲醇，再向其中滴加2M盐酸溶液调节pH至3-4，后用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并有机层，将有机层用50mL饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到油状物0.36g，收率87%。
N-(2-(4-甲氧基-4-氧杂丁胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（4a）的制备
将0.42g(1.01mmol)3a与0.12g(1.00mmol)4-氨基丁酸甲酯溶解于10mL无水CH2Cl2中，向其中加入0.02g(0.16mmol)DMAP，后在冰浴下缓慢滴加0.20g(1.04mmol)EDC的5mL无水CH2Cl2溶液，室温反应24h，将反应液分别用20mL1M盐酸溶液，20mL饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥有机层，过滤，转干得到油状物，收率65%。
N-(2-(4-(羟胺)-4-氧杂丁胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ1）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由4a替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅱ1），收率68%。
H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.98(d,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.75-7.46(m,2H,Ar-H),7.31(m,1H,Ar-H),5.40(m,1H,SCH2CH),5.09(m,2H,2×CH2CH=CCH3),4.48(m,2H,NHCH 2CONH),3.77(d,2H,J＝7.2Hz,SCH2),3.20(m,2H,NHCH 2),2.33(t,2H,J＝7.6Hz,CH2CO),1.92-1.74(m,10H,2×CHCH 2CH 2CH,NHCH2CH 2),1.57-1.46(m,12H,4×CH3);ESI-MS(m/z):516[M+H]+.
实施例16(Ｓ)-N-(1-(3-(羟胺)-3-氧杂丙胺基)-1-氧杂丙基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ2）的制备
(S)-N-(1-(羟基)-1-氧杂丙基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（3b）的制备
参照实施例11中N-(2-(羟基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（3a）的制备方法，将2f替代方法中的2a，水解得到油状物（3b），收率80%。
(S)-N-(1-(3-(甲氧基)-3-氧杂丙胺基)-1-氧杂丙基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（4b）的制备
参照实施例11中N-(2-(4-甲氧基-4-氧杂丁胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（4a）的制备方法，将3b和3-氨基丙酸甲酯替代方法中的3a和4-氨基丁酸甲酯，缩合反应得到油状物（4b），收率66%。
(S)-N-(1-(3-(羟胺)-3-氧杂丙胺基)-1-氧杂丙基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ2）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由4b替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅱ2），收率68%。
H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.83(d,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.60-7.51(m,2H,Ar-H),7.40(m,1H,Ar-H),5.63(m,1H,SCH2CH),5.16(m,2H,2×CH2CH=CCH3),4.71(m,1H,NHCHCH3),3.62(d,2H,J＝7.2Hz,SCH2),2.28(m,2H,NHCH 2),2.23(t,2H,J＝7.6Hz,CH2CO),1.97-1.74(m,8H,2×CHCH 2CH 2CH),1.64-1.41(m,15H,4×CH=CCH 3,NHCHCH 3);ESI-MS(m/z):516[M+H]+.
实施例17(S)-N-(1-(2-(羟胺)-2-氧杂乙胺基)-3-甲基-1-氧杂丁基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ3）的制备
(S)-N-(1-(羟基)-3-甲基-1-氧杂丁基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（3c）的制备
参照实施例11中N-(2-(羟基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（3a）的制备方法，将2g替代方法中的2a，水解得到油状物（3c），收率77%。
(S)-N-(1-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙胺基)-3-甲基-1-氧杂丁基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（4c）的制备
参照实施例11中N-(2-(4-甲氧基-4-氧杂丁胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（4a）的制备方法，将3c和甘氨酸甲酯替代方法中的3a和4-氨基丁酸甲酯，缩合反应得到油状物（4c），收率61%。
(S)-N-(1-(2-(羟胺)-2-氧杂乙胺基)-3-甲基-1-氧杂丁基-2-基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ3）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由4c替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅱ3），收率72%。
H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.14(d,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.60-7.56(m,2H,Ar-H),7.36(m,1H,Ar-H),5.47(m,1H,SCH2CH),5.17(m,2H,2×CH2CH=CCH3),4.68(m,1H,NHCH),4.42(m,2H,NHCH 2CONH),3.72(d,2H,J＝7.2Hz,SCH 2),2.13-1.84(m,9H,2×CHCH 2CH 2CH,NHCHCH),1.66-1.49(m,12H,4×CH=CCH 3),1.02(m,6H,CH2(CH 3)2);ESI-MS(m/z):530[M+H]+.
实施例18N-(2-(2-(羟胺基)-2-氧杂乙胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ4）的制备
N-(2-(2-(甲氧基)-2-氧杂乙胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（4d）的制备
参照实施例11中N-(2-(4-甲氧基-4-氧杂丁胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（4a）的制备方法，将3a和甘氨酸甲酯替代方法中的3a和4-氨基丁酸甲酯，缩合反应得到油状物（4d），收率56%。
N-(2-(2-(羟胺基)-2-氧杂乙胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ4）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由4d替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅱ4），收率73%。
H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.90(d,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.60-7.53(m,2H,Ar-H),7.36(m,1H,Ar-H),5.43(m,1H,SCH2CH),5.22(m,2H,2×CH2CH=CCH3),4.66(m,1H,NHCH 2),3.77(d,2H,J＝7.2Hz,SCH 2),2.03-1.81(m,8H,2×CHCH 2CH 2CH),1.66-1.43(m,12H,4×CH=CCH 3);ESI-MS(m/z):488[M+H]+.
实施例19N-(2-(3-(羟胺基)-3-氧杂丙胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ5）的制备
N-(2-(3-(甲氧基)-3-氧杂丙胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（4e）的制备
参照实施例11中N-(2-(4-甲氧基-4-氧杂丁胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（4a）的制备方法，将3a和3-氨基丙酸甲酯替代方法中的3a和4-氨基丁酸甲酯，缩合反应得到油状物（4e），收率59%。
N-(2-(3-(羟胺基)-3-氧杂丙胺基)-2-氧杂乙基)-法尼基硫代水杨酸酰胺（Ⅱ5）的制备
参照实施例1中Ⅰ1的制备方法，由4e替代方法中的2a，再与盐酸羟胺反应制得油状物（Ⅱ5），收率71%。
H NMR(CDCl3,300MHz):8.01(d,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.70-7.39(m,4H,Ar-H),7.30-7.25(m,3H,Ar-H),5.68(m,1H,SCH2CH),5.27(m,2H,2×CH2CH=CCH3),4.73(m,1H,NHCH 2),3.79(d,2H,J＝7.4Hz,SCH 2),3.54(m,2H,NHCH 2),2.59(t,2H,J＝7.6Hz,CH 2CONH),2.04-1.78(m,8H,2×CHCH 2CH 2CH),1.68-1.50(m,12H,4×CH=CCH 3);ESI-MS(m/z):502[M+H]+.
实施例20
四甲基氮唑蓝比色法（MTT）体外抗肿瘤试验
采用四甲基氮唑蓝比色法（MTT）评价了本发明化合物对8种人癌细胞株的抗增殖活性。MTT法已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感测定等。选择FTA和SAHA作为阳性对照药。SAHA是目前临床上广泛使用的抗肿瘤药物，其作用靶标就是HDAC，因此选择它作为阳性对照药。
人癌细胞株：肝癌细胞SMMC-7721、胰腺癌细胞PANC-1、肺癌细胞H460、乳腺癌细胞MCF-7、脑癌细胞U251、卵巢癌细胞SKOV-3、膀胱癌细胞EJ、胃癌细胞SGC-7901。
实验方法如下：取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25%胰蛋白酶消化，使贴壁细胞脱落，制成每毫升含2×104~4×104个细胞的悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，每孔180μL，置恒温CO2培养箱中培养24小时。换液，加入受试化合物Ⅰ1-Ⅰ14或化合物Ⅱ1-Ⅱ5（化合物用DMSO溶解后用PBS稀释，受试化合物浓度分别为6.25×10-6，1.25×10-5，2.5×10-5，5×10-5mol/L），每孔20μL，培养48小时。将MTT加入96孔板中，每孔20μL，培养箱中反应4小时。吸去上清液，加入DMSO，每孔150μL，平板摇床上振摇5min。用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸收度，计算细胞抑制率。实验结果如表3所示。
细胞抑制率=（阴性对照组OD值–受试物组OD值）/阴性对照组OD值×100%。
实施例21
Ras下游的p-Raf、p-Akt、p-ERK抑制活性测试
采用Western印迹法检测受试化合物Ⅰ1-Ⅰ14或化合物Ⅱ1-Ⅱ5对肿瘤细胞PANC-1的Ras下游的p-Raf、p-Akt、p-ERK抑制活性测试。取处于指数生长期状态良好的细胞制成每毫升含1.5×105个细胞的悬液，接种于96孔板上，置恒温CO2培养箱中培养24h。换液，加入6.25μM，12.5μM受试化合物，阴性对照加等量PBS，继续培养8h。胰酶消化，PBS清洗两遍。样品重悬于PBS中，弃上清，细胞置于2mL EP管中加入蛋白质裂解液，200μL/管，反复吹打后于冰浴反应30min，离心取上清液2mL EP管中，采用SDS-PAGE（胶浓度为12%）分离并且转移到硝化纤维膜上。将膜放于现配的5%的脱脂奶粉封闭液中，封闭结束用少量Blot wash将残余奶粉漂洗干净，一抗用TBST稀释至工作浓度，500μL/条，室温摇床反应1h，其后可置4℃过夜。反应结束后剪开自封袋，废弃抗体，将各条膜置于皿中用TBST清洗4遍。用TBST稀释过氧化酶标记的二抗至工作液浓度，500μL/条。按前法封袋和摇床反应，反应结束后弃二抗，用TBST清洗4遍。PIERCE发光液A液+B液等体积混匀灌入制好的自封袋中，反应5min后将膜转移至在BIO-RAD凝胶成像仪暗盒中曝光成像。
实施例22
对HDACs抑制活性测试
采用ELISA酶联免疫测试化合物在体外对HDAC的抑制活性。EpiQuikTMHADC Activity/InhibitionAssay Kit购自Epigentek公司，将受试化合物均分别配置为1nM、10nM和100nM三个浓度的溶液，分别取10μL HDACs缓冲液与5μLHela细胞核提取物在37℃下共同孵育5min后，加入25μL HDAC荧光底物，在37℃下孵育45min，然后向反应孔中加入25μL HDAC Assay developer终止反应，并在37℃下孵育20min，使用酶标仪在405nm出测吸光度。每个化合物每一浓度下的化合物重复三次测试。
Hela细胞核提取物操作方法：取含10%小牛血清的培养液培养Hela细胞株，用移液器吹打下细胞，离心收集上清，留下细胞沉淀备用。每20μL细胞沉淀（约2×106细胞）加入200μL的添加了苯甲基磺酰氟（PMSF）细胞蛋白抽取试剂，高速旋涡使细胞完全悬浮并分散开，冰浴5-10min，加入细胞浆蛋白抽提试剂10μL，高速旋涡后在4℃下高速离心5min。完全吸除残余上清，再加入50μL的添加了PMSF的细胞核蛋白抽取试剂，重复高速旋涡和离心去除上清后，即可抽取得到的Hela细胞核蛋白。
数据分析方法：a.计算每个样本的平均信号值；b.每个样本浓度的信号值减去平均背景信号值；c.计算每个样本的抑制率。将100%活性孔数值分别减去每个待测化合物不同浓度对应孔数值后，除以100%活性孔数值，在乘以100分别得到每个受试化合物不同浓度的抑制率。抑制率=（100%活性孔数值-待测化合物对应孔数值）/100%活性孔数值×100。受试化合物的IC50在Excel中以浓度和对应抑制率，经非线性回归拟合而得。
Claims (5)
1.一种Ras和HDAC双重抑制剂，其特征是：具有下述通式Ⅰ的结构：
通式Ⅰ中：-NH-A-CO-选自构型为甘氨酸残基、L-或D-型α-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、L-或D-型缬氨酸残基、L-或D-型亮氨酸残基、L-或D-型异亮氨酸残基、L-或D-型甲硫氨酸残基、L-或D-型半胱氨酸残基、L-或D-型苯丙氨酸残基、L-或D-型酪氨酸残基、L-或D-型色氨酸残基、L-或D-型精氨酸残基、L-或D-型脯氨酸残基、L-或D-型组氨酸残基；或者选自-NH(CH2)nCO-,n=3～7；或者选自
m=0～5，R=H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基；或者选自
或者选自o=0～5；或者选自
2.根据权利要求1所述的Ras和HDAC双重抑制剂，其特征是：所述通式Ⅰ的结构中的-NH-A-CO-选自如下：
-NH-A-CO-=-NHCH2CO-；
或者-NH-A-CO-=-NH(CH2)2CO-；
或者-NH-A-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者-NH-A-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者-NH-A-CO-=-NH(CH2)5CO-；
或者-NH-A-CO-=
或者-NH-A-CO-=
或者-NH-A-CO-=
或者-NH-A-CO-=
或者-NH-A-CO-=
或者-NH-A-CO-=
或者-NH-A-CO-=
或者-NH-A-CO-=
3.一种权利要求1所述的Ras和HDAC双重抑制剂的制备方法，其特征是：
所述通式Ⅰ制备方法包括以下步骤：
A.先将FTA在氯化亚砜作用下制备FTA酰氯（1）；
B.再与H2N-A-COOMe在三乙胺的二氯甲烷溶液中反应得到化合物（2）；
C.化合物（2）再与盐酸羟胺在氢氧化钾的甲醇溶液下反应制得通式Ⅰ；
通式Ⅰ反应路线如下所示：
其中，通式Ⅰ中：-NH-A-CO-选自构型为-NH-A-CO-选自构型为甘氨酸残基、L-或D-型α-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、L-或D-型缬氨酸残基、L-或D-型亮氨酸残基、L-或D-型异亮氨酸残基、L-或D-型甲硫氨酸残基、L-或D-型半胱氨酸残基、L-或D-型苯丙氨酸残基、L-或D-型酪氨酸残基、L-或D-型色氨酸残基、L-或D-型精氨酸残基、L-或D-型脯氨酸残基、L-或D-型组氨酸残基；或者选自-NH(CH2)nCO-,n=3～7；或者选自
m=0～5，R=H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基；或者选自
或者选自
o=0～5；或者选自
4.一种药物组合物，其特征是：是含有通式Ⅰ化合物的药物组合物，
5.一种权利要求1所述的Ras和HDAC双重抑制剂在制备治疗肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、胃癌的肿瘤药物中的应用。
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