JP2013508458A - Ftsとhdac阻害剤との組合せを用いたがん治療 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その開示を引用することにより本明細書の一部をなすものとする2009年10月26日出願の米国仮特許出願第61/254,872号の出願日の権益を主張する。
Rasタンパク質、たとえば、H−Ras、N−RasおよびK−Rasは、細胞成長、分化、および生存を制御するシグナル伝達経路を調節する入切スイッチとして働く[Reutherら、Curr.Opin.Cell Biol.12:157〜65(2000)]。Rasタンパク質は、形質膜の内側小葉状部分にアンカリングされ、そこで、受容体チロシンキナーゼなどの細胞表面受容体が活性化されて、Ras上でのグアノシン二リン酸(GDP)のグアノシン三リン酸(GTP)との交換、および不活性Ras−GDPの活性Ras−GTPへの変換が誘発される[Scheffzekら、Science 277:333〜7(1997)]。これらのシグナルの停止には、Ras−GTPをRas−GDPにする加水分解が必要となる[Scheffzekら、Science 277:333〜338(1997)]。Rasのいくつかの変異型は、そのGTP加水分解の受けやすさに欠陥があり、したがって構成的活性型である[Barbacid、Biochem.56:779〜827(1987)、Box、Eur.J.Cancer 31:1051〜1054(1995)]。多くのがんタイプで見られるこうした発がん性Rasタンパク質は、悪性腫瘍の一因となり、したがって指向型治療の好適なターゲットとみなされる[Bos、Cancer Res.49:4682〜4689(1989)]。活性Rasタンパク質は、細胞成長、分化の調節解除、ならびに生存、遊走、および浸潤の増進に寄与する複数のRasエフェクターの活性化を通して発がんを促進する[たとえば、Downward,J.、Nat.Rev.Cancer 3:11〜22(2003)、Shields,J.M.ら、Trends Cell Biol.10:147〜541(2000)、およびMitin,N.ら、Curr.Biol.15:R563〜74(2005)]を参照のこと]。
真核細胞中のDNAは、タンパク質と密な複合体をなして、クロマチンを形成する。ヒストンは、DNAと複合体をなす小さなタンパク質である。H2A、H2B、H3およびH4として知られるヒストンそれぞれ2分子ずつが、通常は約150塩基対の量のDNAと密な複合体をなして、ヌクレオソームを形成する。この構造は、リンカーDNAによってさらに連結されて、ソレノイドとなる。ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)およびヒストンデアセチラーゼ(HDAC)は、ヌクレオソームコアヒストンのリシン残基のアセチル基をそれぞれ付加および除去することによりヒストン尾部のアセチル化レベルを制御する、2種の酵素ファミリーである。ヌクレオソームコアから伸びるヒストンが、こうして酵素的な修飾を受け、クロマチン構造および遺伝子発現に影響を及ぼす。アセチル化されたヒストンは、転写因子および他のコアクチベータータンパク質を補充することができるので、HATは、ヒストンのアセチル化によって、転写および遺伝子発現を可能にする。HDACは通常、DNAの過剰メチル化および遺伝子サイレンシングと関連付けられる。
RasアンタゴニストとHDAC阻害剤は共投与されるが、共投与は、本明細書では、これらの抗がん剤が、その複合治療効果の恩恵を得るために、両方の薬剤および/またはその代謝産物が患者において同時に存在するように、同じまたは異なる時間に(すなわち、事実上同時にまたは逐次に)、同じまたは異なる投与経路で、がん患者に投与される治療計画を包含する。すなわち、共投与には、別個の組成物での同時投与、別個の組成物での異なる時間での投与、および/または両方の薬剤を含有する組成物での投与が含まれる。したがって、一部の実施形態では、RasアンタゴニストとHDAC阻害剤は、単一組成物において投与される。
−細胞系−
発がん性K−Rasを発現するヒトA549非小細胞肺癌細胞(CCL−185、ATCC)は、1.5g/Lの炭酸水素ナトリウム、10%のウシ胎児血清(FCS)、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンで補充したKaighn変法ハムF12培地(Sigma)で維持した。
FTSは、Rotbalt、Meth.Enzymol.439:467〜89(2008)に従前から記載されているとおりに調製した。
細胞の生存を判定するために、A549細胞、DLD1細胞、SW−480細胞、およびARO細胞を、24ウェルプレートに1ウェルあたり8×103細胞の密度で播いた。24時間後、0.1%Me2SO4(Concordia Pharmaceuticals、フロリダ州フォートローダーデール)に溶解させたVPA(Sigma)、SAHA(Alexis)、もしくはFTS、またはFTSとVPAの組合せ、またはFTSとSAHAの組合せで、細胞を指定の時間処理した。対照細胞は、0.1%Me2SO4で処理した。3日より長いインキュベート時間の場合、細胞を分離し、カウントし、10cmプレートあたり3×105細胞の密度で播き直した。以下は、異なる細胞系で使用したVPA、SAHA、およびFTSの濃度である。
A549細胞、DLD1細胞、およびARO細胞(10cmプレートあたり4×105細胞)を24時間播いておき、次いで、10%のFCSを含有する培地においてVPAおよびFTSと共にさらに72時間インキュベートした。次いで細胞を収集し、ヨウ化プロピジウム(50μg/mL、Sigma)、0.1%のクエン酸ナトリウム、および0.1%のTriton x−100(BDH、英国プール)を含有するPBSに再懸濁し、暗所にて4℃で一晩インキュベートした。
FTSが培養細胞のタンパク質レベルに与える効果を調べるために、A549細胞、DLD1細胞、およびARO細胞を10cmプレートあたり4×105細胞の密度で播き、24時間成長させた。次いで、0.1%Me2SO4(対照)、FTS、VPA、SAHA、VPAとFTSの組合せ処理、またはFTSとSAHAの組合せ処理により、細胞を72時間処理した。次に、300μlのホモジナイズ緩衝液(50mmol/LのTris−HCl(pH7.6)、20mMのMgCl2、200mMのNaCl、0.5%のNP40、1mMのDTT、およびプロテアーゼ阻害剤)に細胞を溶解させ、4℃で10分間14,000rpmで遠心分離し、上清を集めた。等しい量のタンパク質(1レーンあたり50〜100μg)をSDS−PAGEにかけた後、ウサギ抗サイクリンD1(1:1,000)、マウス抗pan−Ras抗体Ab(Calbiochem)、ウサギ抗サバイビンAb(Santa Cruz、カリフォルニア州)、およびウサギ抗β−チューブリンAb(Sigma)を用いた免疫ブロットにかけた。次いでブロットを適切なペルオキシダーゼ結合二次IgG(1:5,000)に暴露し、強化化学発光にかけた。Zundelevichら、Mol.Cancer Ther.31:31(2007)。TINA2.0ソフトウェア(Ray Tests)を使用する濃度測定によって、タンパク質バンドを定量化した。
10cmプレートに配置されたガラスカバースリップ上にA549細胞を4×105細胞/プレートの密度で24時間播いておいた後に、0.1%のMe2SO4、75μMのFTSもしくはVPAを0.8mM、またはVPA+FTSを加えてさらに24時間または72時間おいた。その後、細胞を室温で30分間ホルムアルデヒド固定し、次いで0.2%のTriton X−100で処理した。リン酸緩衝溶液(PBS)で3回洗浄した後、スライドを、200μg/mLの無処置ヤギIgG(Jackson ImmunoResearch)を含有する1%ウシ血清アルブミン(BSA)に30分間浸漬し、次いで、ウサギ抗オーロラA(1:50、Cell Signaling、マサチューセッツ州ダンヴァーズ)、抗オーロラB(1:50、Bethyl Labs、テキサス州Montgomery)、またはマウス抗ホスホ−H3(1:50、Upstate、バージニア州シャーロッツヴィル)と共に4℃で一晩インキュベートした。PBSでさらに3回洗浄した後、細胞をヤギ抗マウスCy3結合Abまたはロバ抗ウサギCy2結合Ab(1:200、Jackson ImmunoResearch)と共に暗所で1時間インキュベートした。次いで細胞をPBS中で2回洗浄し、抗α−チューブリンFITC Ab(1:50、sigma、F2168)と共に室温で1時間さらにインキュベートした。最後に、細胞をHoechst 33258(Fluka AG、CH9470)で対比染色し、LSM 510 META顕微鏡を用いた拡大率60倍での蛍光顕微鏡観察によって調べた。
A549細胞を75μMのFTS、0.8mMのVPA、0.1%のビヒクル(対照)、または75μMのFTSプラス0.8mMのVPAのいずれかで72時間処理した。RNeasy Plus Mini Kit(Qiagene)に収められているプロトコールおよび試薬を使用して、培養細胞から全RNAを単離した。分光光度計において260nm(A260)で吸光度を測定することにより、RNAサンプルの濃度を決定した。精製したRNAをRNase−free水中にて−70℃で貯蔵した。この精製RNAをリアルタイムPCRに使用した。
Verso(商標)RT−PCRキット(ABgene)を使用して、全RNA(1μg)の抽出物を総体積20μLで逆転写した。次いで、1μLのcDNAサンプルをリアルタイムPCR(QPCR SYBR Green Mix Plus ROX Vial、ABgene)に使用した。使用したプライマーは、サバイビン、AurK−A、およびNuSap遺伝子、ならびにハウスキーピング遺伝子GAPDHをターゲットとするものとした。これら実験に使用するプライマー配列を以下の表に示す。
データは、平均±SDとして表示する。平均値の差の統計的有意性を、一方向ANOVAに続き、Tukey事後検定で評価した。P値≦0.05を有意であるとみなした。
VPAおよびFTSは、Ras経路が活発な細胞の成長を相乗的に抑制する。
次に、本発明者らは、RasおよびRasの既知の下流ターゲットに対するVPAとFTSの併用効果について調べた。A549細胞およびDLD1細胞を、VPAまたはFTS単独で、または両方の薬物で72時間処理した。次いで、Ras、サイクリンD1、およびサバイビンタンパク質のレベルにこの処理が与える影響を、特異的Abを用いるウエスタン免疫ブロット法によって明らかにした。サバイビンは、いくつかのカスパーゼに対する阻害作用を通して抗アポトーシス性の因子として、ならびに紡錘体との関連を通して細胞周期の進行に重要な因子として作用することがわかっている。Blumら、Mol.Cancer Ther.5:2337〜47(2006)、Delacour−Laroseら、Med.Sci(Paris)24:828〜32(2008)。サバイビンは、オーロラB、INCENP、およびボレアリンも含んでいる染色体パッセンジャー複合体(CPC)の重要なサブユニットであるとみなされる。Ruchaudら、Mol.Cell Biol.8:798〜812(2007)。CPC複合体は、有糸分裂における重要な側面を制御する。Vagnarelli、Chromosoma 113:211〜22(2004)。サイクリンD1は、細胞が細胞周期のS期に入るのに不可欠である。サイクリンD1は、活発に増殖する細胞において細胞周期の調節スイッチとして働く。Stacey、Curr Opin Cell Biol.15(2):158〜63(2003)。
サバイビンのレベルにおいてVPAとFTSの非常に強力な相乗効果が検出された。2種の薬物の存在下では、細胞系のいずれにおいてもサバイビンタンパク質を検出することができなかった(図3A)。実際に、サバイビンmRNAを測定するRT−PCRでは、サバイビン転写物のレベルの低減においてVPAとFTSの強力な相乗作用が示された(図3B)。これは、サバイビン転写の阻害、または小分子RNAにより媒介されるmRNA安定性の低下の結果であるとすることができるであろう。
オーロラBは、分裂中期の間、動原体に局在化し、異常なオーロラB発現は、有糸分裂に不可欠であるホスホヒストン−H3(ser10)レベルの低下と同時に起こる。Vader、Biochim.Biophys.Acta.1786:60〜72(2008)。FTS処理したA549細胞(75μMのFTSで72時間)における本発明者らの以前の遺伝子プロファイリング分析(Blumら、Cancer Res.67:3320〜8(2007))では、オーロラB発現の減少が示されている。他の研究では、HDAC阻害剤が、オーロラBのレベルを低下させたことが示されている。Zhangら、Cancer Biol.Ther.7:1388〜97(2008)。したがって、本発明者らは次に、A549細胞においてVPAおよびFTSがオーロラBおよびホスホヒストンH3(ser10)レベルに与える合算した影響について調べた。三重蛍光共焦点顕微鏡法を使用して、染色体(Hoechstで標識、青色蛍光)、オーロラB(抗オーロラB AbおよびCy3標識Ab、赤色蛍光)、およびホスホヒストンH3(ser 10)(抗ホスホヒストンH3(ser 10)AbおよびCy2標識Abで標識、緑色蛍光)を検出した(写真は示さず)。本発明者らは、24時間の処理の後、VPAによってオーロラB(30%±8の阻害)およびホスホヒストンH3が減少し、FTSによってオーロラBが30%±7阻害されたことを見出した。予想外に、併用処理によって、オーロラBが完全に消失した(90%±5の阻害)。先の研究と合致して、オーロラBレベルの低下には、染色体濃度の低下が伴った。Shannon、Curr.Biol.12:R458〜60(2002)、Vasら、Cell Cycle 7:293〜6(2008)。
次に、本発明者らは、薬物により長い時間(72時間)暴露したA549細胞において、FTSがオーロラBに与える影響を調べた。細胞を上記に詳述したように標識し、次いで三重蛍光共焦点顕微鏡法を使用して画像処理した。上記で指摘したように、M期細胞で検出したとき、薬物で24時間処理した細胞において、FTSは、オーロラBに対して30%の効果を示した(写真は示さず)。本発明者らは、FTS 72時間後のM期細胞を調べた際、以前の遺伝子プロファイリング分析と一致する、オーロラBの激しい減少(60%±7、示さない)を見出した。Blumら、Cancer Res.67:3320〜8(2007)。さらに、本発明者らは、細胞質分裂の間のオーロラBの局在化に対するFTSの強力な効果を検出した。従前の実験(Terada、Cell Struct.Funct.26:653〜7(2001))と一致して、分裂終期の対照細胞は、α−チューブリンを標識とする紡錘中央体を示し、そこにオーロラBも局在化していた。それに著しく反して、FTS処理した細胞では、オーロラBが中央体からは完全に誤った場所に局在化した(写真は示さず)。これらの結果から、FTSの長期間の効果は、オーロラBが誤った場所に局在化して正しく完了し得ない、細胞質分裂の欠陥としても現れることがまた示された。Kollareddyら、Bomed.Pap.Med.Fac.Univ.Palacky Olomouc Czech Repub.152:27〜33(2008)。対照M期細胞の正常な紡錘構造とは異なり、FTS処理したM期細胞の紡錘体は、不完全であった(図示せず)。さらに、G2期のFTS処理細胞では、ビヒクル処理した対照の正常な二極紡錘構造とは対照的に、三極の紡錘体が検出された(図示せず)。こうした条件下(FTSで72時間)では、細胞が完全に成長を阻止されたので、本発明者らは、VPAとFTSの複合効果を検出することができなかった。
本発明者らは、A549およびSW−480細胞でSAHAプラスFTS処理の組合せについて調べた。細胞を、これらの薬剤それぞれと共に、または薬剤なしで、またこれらの組合せと共に72時間インキュベートし、次いで画像処理し、直接カウントした(写真は示さず)。阻害剤それぞれにより、細胞数が有意に減少した。組合せにより、SAHAまたはFTS単独よりも、細胞数がはるかに大きく減少した。これらの結果は、FTSの相乗効果が、他の異なるHDAC阻害剤とでも実現できることを示唆している。
FTS活性医薬成分(2.0kg)、バルプロ酸ナトリウム活性医薬成分(2.3kg)、微結晶性セルロース(2.0kg)、クロスカルメロースナトリウム(0.2kg)、およびステアリン酸マグネシウム(0.1kg)を均質に混和し、打錠機で錠剤に圧縮する。材料の移動、ならびに打錠機の始動、調整、および停止での5%の損失を想定し、FTS(200mg)およびバルプロ酸ナトリウム(230mg)を含有する、およそ9,500錠が得られる。
FTS活性医薬成分(1.0kg)、バルプロ酸ナトリウム(2.3kg)、微結晶性セルロース(2.0kg)、クロスカルメロースナトリウム(0.2kg)、およびステアリン酸マグネシウム(0.1kg)を均質に混和し、カプセル化装置で硬ゼラチンカプセルに充填する。材料の移動、ならびにカプセル化装置の始動、調整、および停止での5%の損失を想定し、およそ9,500カプセルが得られる。
FTS活性医薬成分(2.0kg)、ボリノスタット活性医薬成分(2.0kg)、微結晶性セルロース(2.0kg)、クロスカルメロースナトリウム(0.2kg)、およびステアリン酸マグネシウム(0.1kg)を均質に混和し、カプセル化装置で硬ゼラチンカプセルに充填する。材料の移動、ならびにカプセル化装置の始動、調整、および停止での5%の損失を想定し、およそ19,000カプセルが得られる。
FTS活性医薬成分(2.0kg)およびVPA活性医薬成分(2.0kg)をトウモロコシ油(4.0kg)に溶解させ、撹拌して均質な溶液とした。製袋−充填−シールカプセル化機で軟ゼラチンカプセルに溶液を充填する。材料の移動、ならびに軟ゼラチンカプセル化装置の始動、調整、および停止での5%の損失を想定し、FTS(100mg)およびVPA(100mg)を含有する、およそ19,000カプセルが得られる。
Claims (34)
- 式
ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)の阻害剤と、
薬学的に許容可能な担体とを含み、
前記Rasアンタゴニストおよび前記HDAC阻害剤は組成物中に治療有効量で存在する、がん患者を治療するための組成物。 - 前記RasアンタゴニストがFTSである、請求項1に記載の組成物。
- 前記Rasアンタゴニストが、5−クロロ−FTS、5−フルオロ−FTS、FTS−メチルエステル、FTS−アミド、FTS−メチルアミド、FTS−ジメチルアミド、S−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、S−ゲラニルゲラニルチオサリチル酸メトキシメチル、5−フルオロ−S−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、およびS−ファルネシルチオサリチル酸エトキシメチルからなる群から選択されるFTSアナログである、請求項1に記載の組成物。
- 前記HDAC阻害剤がバルプロ酸である、請求項1から3のいずれかに記載の組成物。
- 前記HDAC阻害剤がボリノスタットである、請求項1から3のいずれかに記載の組成物。
- 前記HDAC阻害剤がSNDX−275である、請求項1から3のいずれかに記載の組成物。
- 前記薬学的に許容可能な担体が液体である、請求項1から6のいずれかに記載の組成物。
- 前記薬学的に許容可能な担体が固体である、請求項1から7のいずれかに記載の組成物。
- 錠剤またはカプセル剤の形態である、請求項8に記載の組成物。
- がん患者を治療するための方法であって、前記患者に、治療有効量の、式
ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)の阻害剤とを共投与するステップを含む方法。 - 前記Rasアンタゴニストと前記HDAC阻害剤とを同一剤形で投与する、請求項10に記載の方法。
- 前記共投与が経口送達によるものである、請求項10に記載の方法。
- 前記がんが、腎癌、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、NSCLC、卵巣がん、肝がん、甲状腺がん、精上皮腫、皮膚がん、子宮内膜がん、黒色腫、白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、前立腺がん、膀胱および泌尿器のがん、乳がん、ならびに前記がんおよび癌腫の脳転移、原発性脳がん、および頭頸部がんからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記がんが甲状腺がんである、請求項10に記載の方法。
- 前記がんが結腸がんである、請求項10に記載の方法。
- 前記がんが肺がんである、請求項10に記載の方法。
- 前記RasアンタゴニストがFTSである、請求項10から16のいずれかに記載の方法。
- 前記Rasアンタゴニストが、5−クロロ−FTS、5−フルオロ−FTS、FTS−メチルエステル、FTS−アミド、FTS−メチルアミド、FTS−ジメチルアミド、S−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、S−ゲラニルゲラニルチオサリチル酸メトキシメチル、5−フルオロ−S−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、およびS−ファルネシルチオサリチル酸エトキシメチルからなる群から選択されるFTSアナログである、請求項10から16のいずれかに記載の方法。
- 前記HDAC阻害剤がバルプロ酸である、請求項10から18のいずれかに記載の方法。
- 前記HDAC阻害剤がボリノスタットである、請求項10から18のいずれかに記載の方法。
- 前記HDAC阻害剤がSNDX−275である、請求項10から18のいずれかに記載の方法。
- 治療有効量の、本明細書の式により規定されるRasアンタゴニストおよびHDAC阻害剤を含有する第一の剤形、または、RasアンタゴニストおよびHDAC阻害剤をそれぞれ含有する別々の剤形と、任意選択的に、1つまたは複数の剤形を使用してがん患者を治療するための取扱説明書とを含む、がん治療において使用するためのキット。
- 有効量の、式
ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)の阻害剤との、
がん患者におけるがんの治療において使用するための活性薬剤の組合せ。 - 前記Rasアンタゴニストおよび前記HDAC阻害剤が、同一剤形で共投与されるためのものである、請求項23に記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
- 前記Rasアンタゴニストおよび前記HDAC阻害剤が経口共投与のためのものである、請求項23に記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
- 前記がんが、腎癌、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、NSCLC、卵巣がん、肝がん、甲状腺がん、精上皮腫、皮膚がん、子宮内膜がん、黒色腫、白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、前立腺がん、膀胱および泌尿器のがん、乳がん、ならびに前記がんおよび癌腫の脳転移、原発性脳がん、および頭頸部がんからなる群から選択される、請求項23に記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
- 前記がんが甲状腺がんである、請求項23に記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
- 前記がんが結腸がんである、請求項23に記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
- 前記がんが肺がんである、請求項23に記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
- 前記RasアンタゴニストがFTSである、請求項23から29のいずれかに記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
- 前記Rasアンタゴニストが、5−クロロ−FTS、5−フルオロ−FTS、FTS−メチルエステル、FTS−アミド、FTS−メチルアミド、FTS−ジメチルアミド、S−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、S−ゲラニルゲラニルチオサリチル酸メトキシメチル、5−フルオロ−S−ファルネシルチオサリチル酸メトキシメチル、およびS−ファルネシルチオサリチル酸エトキシメチルからなる群から選択されるFTSアナログである、請求項23から29のいずれかに記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
- 前記HDAC阻害剤がバルプロ酸である、請求項23から31のいずれかに記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
- 前記HDAC阻害剤がボリノスタットである、請求項23から31のいずれかに記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
- 前記HDAC阻害剤がSNDX−275である、請求項23から31のいずれかに記載の使用のための活性薬剤の組合せ。
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