CN103554266A - 一种具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽（41肽）及其制备方法和应用。本发明所述的肿瘤抑素融合肽的氨基酸序列为SEQ No.1，编码所述肿瘤抑素融合肽的核苷酸序列为SEQ No.2。本发明在肿瘤抑素42肽的基础上，使得21肽和19肽的连接不再依赖柔性连接片段，改由RGD序列承担，本发明抗肿瘤活性比肿瘤抑素42肽更强。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽及其制备方法和应用，属于生物制药领域。
背景技术
人肿瘤抑素（tumstatin）来源于人胶原IVα3链，由244个氨基酸残基组成。肿瘤抑素第75至95位氨基酸残基组成的21肽具有抑制血管内皮细胞增殖，阻止肿瘤组织新生血管生成的活性。第185至203位氨基酸残基组成的19肽能直接抑制肿瘤细胞的增殖与迁移。本课题组用小鼠H22肝癌细胞腹水制作小鼠肝癌动物模型，检测21肽和19肽的抗肿瘤活性，结果21肽的抑瘤率为40.08%，19肽的抑瘤率为42.41%，21肽和19肽半量联合用药的抑瘤率为57.55%。将21肽中第18位的N改为G，与其前面的R和后面的D组成一个RGD序列。在21肽的羧基端添加两个甘氨酸，使与前后的小分子氨基酸一起组成柔性连接片段，再与19肽组合成42个氨基酸的融合肽。42肽的抑瘤率为50.52%，好于21肽和19肽单独用药，不如21肽、19肽联合用药。
RGD序列广泛分布在细胞外基质蛋白中。细胞外基质蛋白通过RGD序列与细胞膜上的整合素受体识别、结合，介导细胞与细胞外基质之间，细胞与细胞之间的相互作用，参与血管新生，肿瘤的发生、发展、浸润及转移等病理过程。在可溶性多肽或蛋白中引入RGD序列，可使可溶性多肽或蛋白与整合素结合，竞争性阻止细胞外基质蛋白与整合素的结合，抑制或逆转上述病理过程，产生所谓的“去整合素效应”。不管RGD序列插在蛋白质的什么位置，在形成立体结构时RGD序列都会以β-转角的二级结构形式位于蛋白质的表面。为了不让引入的RGD序列影响蛋白质原来的立体结构，一般都将RGD序列加在蛋白质或多肽的两端。本课题组在内皮抑素的内部发现了与串联的RGD序列相似的RGIRGAD序列。经软件预测，将RGIRGAD改为RGDRGD序列不影响内皮抑素的立体结构，开创了在蛋白质的内部引入RGD序列的先例并获得发明专利（专利号：ZL2004.10013621.X）。
将两种蛋白或多肽融合在一起并保持两种蛋白或多肽各自的活性，必须保证在融合蛋白中两种蛋白或多肽各自的立体结构不变。为此需在两种蛋白或多肽之间引入柔性连接片段。所谓柔性连接片段是指连续的小分子氨基酸序列，如甘氨酸、丙氨酸等。在融合蛋白中柔性连接片段自身易于形成β-转角二级结构，因而不参与两边蛋白或多肽二级结构的形成，使两边的多肽或蛋白能保持原来的立体结构和生物学活性。
肿瘤抑素42肽引入的RGD序列位于21肽的羧基端，目的是通过“去整合素效应”增强21肽的生物学活性。21肽和19肽的连接需要依赖于额外添加的两个甘氨酸及与其前后小分子氨基酸间形成的柔性连接片段。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是在肿瘤抑素42肽的基础上，提供具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽（41肽），其中21肽和19肽的连接不再依赖柔性连接片段，改由RGD序列承担；其抗肿瘤活性比肿瘤抑素42肽更强。
本发明具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽的氨基酸序列见SEQ No.1，编码所述融合肽的优选核苷酸序列见SEQ No.2。
制备上述具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽的方法，包括以下步骤：
1、用DNA合成仪合成本发明的DNA序列，SEQ No.2；
2、在编码链的5′端增加1个T碱基，模板链5′端增加ACG3个碱基，且退火成双链后使5′端磷酸化；
3、用Nde1和Sap1双酶切pTYB1质粒，酶切后与步骤2获得的DNA片段连接重组；
4、将步骤3获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21或其他含有DE3基因的受体菌；
5、培养、收集步骤4中获得的基因工程菌，并用超声波破菌制备裂解液；
6、离心收集裂解液上清，经几丁质亲和层析纯化，即得具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽。
相应的，含有本发明核苷酸序列的载体，以及含有该载体的宿主细胞都在本发明保护的范围内。
本发明的抗肿瘤融合肽全长41个氨基酸（41肽），由肿瘤抑素的21肽和19肽融合而成。21肽的第18位天冬酰胺（N）改为甘氨酸（G），与其前面的R和后面的D形成一个RGD序列。用另一个RGD序列取代第20、21位的Y和S。21肽经过上述改造成为羧基端有串联RGD序列的22肽。改造后的22肽羧基端直接与19肽的氨基端融合，去除了原42肽中添加的2个甘氨酸而成为41肽。
本发明的肿瘤抑素融合肽（41肽）在结构设计上的最显著创新性体现在利用RGD序列作连接片段，直接连接21肽和19肽，去除了原42肽中的柔性连接片段。柔性连接片段因其本身易于形成β-转角二级结构而不参与其两侧多肽二级结构的形成。RGD序列总是以β-转角的结构突出在蛋白质的表面，推测RGD序列也不会参与其两侧多肽二级结构的形成。41肽在结构上设计的成功赋予RGD序列新的功能，除了发挥“去整合素效应”外，RGD序列还可作为连接片段连结两个多肽或蛋白。本发明将42肽中单个的RGD序列改为RGDRGD串联序列，增强了其“去整合素效应”，41肽的抑瘤率从42肽的50.54%提高到69.14%。
本发明进一步将21肽中第14位的F改为W，以方便在生产过程中用紫外检查、监测融合肽的浓度和产量。F和W都是芳香族氨基酸，芳香环外都没有羟基。它们的PαPβPt分别为113、138、60和108、137、96，形成二级结构的倾向相同，能力相似。用W取代F不影响蛋白质或多肽的二级结构和功能。
本发明的肿瘤抑素融合肽（41肽）具有抑制肿瘤组织新生血管生成，限制肿瘤的血液供应和直接抑制肿瘤细胞增殖和迁移的双重抗肿瘤活性。动物实验抑瘤率不仅高于单独应用21肽和19肽试验组，也高于42肽试验组。因此本发明还进一步提出了所述融合肽及其编码的核苷酸序列在制备抗肿瘤药物的应用。
附图说明
图1为本发明肿瘤抑素融合肽（41肽）在动物实验中的抗肿瘤作用，其中，上一行为PBS缓冲液（PBS缓冲液：0.1-0.2mol/L磷酸钠缓冲液,pH为7.4）对照组，下一行为本发明肿瘤抑素41肽试验组；
图2为本发明肿瘤抑素融合肽（41肽）抑制人SGC-7901胃癌迁移实验结果，其中，A为划线后，B为PBS缓冲液（PBS缓冲液：0.1-0.2mol/L磷酸钠缓冲液,pH为7.4）对照组，C为肿瘤抑素21肽对照组，D为本发明肿瘤抑素41肽试验组；
图3为本发明肿瘤抑素融合肽（41肽）抑制HUVEC脐血管内皮细胞和SGC-7901胃癌细胞增殖实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1制备本发明具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽（41肽）
1、用DNA合成仪合成本发明的DNA序列，SEQ No.2；
2、在编码链的5′端增加1个T碱基，模板链5′端增加ACG3个碱基，且退火成双链后使5′端磷酸化；
3、用Nde1和Sap1双酶切pTYB1质粒，酶切后与步骤2获得的DNA片段连接重组；
4、将步骤3获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21或其他含有DE3基因的受体菌；
5、培养、收集步骤4中获得的基因工程菌，并用超声波破菌制备裂解液；
6、离心收集裂解液上清，经几丁质亲和层析纯化，即得具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽。
本基因重组方法将41肽基因置于内含肽的氨基端，41肽的蛋氨酸密码作为翻译的起始密码，内含肽的自动断裂点正好位于41肽最后一个氨基酸丝氨酸羧基形成的肽键上。这样用基因工程方法得到的41肽与化学合成的41肽序列完全相同，通过化学合成和基因工程两种方法都能生产41肽。
试验例1检测本发明肿瘤抑素融合肽（41肽）的抗肿瘤活性
将冻存的H22小鼠肝癌细胞（哈尔滨医科大学附属第三医院，黑龙江省肿瘤研究所保存）置于37℃水浴1-2min，待细胞融化后，给每只昆明种小鼠（哈尔滨医科大学附属第二医院动物室提供）腹腔注射0.2mL，10天左右接种小鼠的腹腔长满腹水。无菌条件下抽取腹水作为瘤源，用生理盐水调整细胞浓度为3×107个/mL。取体重为18-22g的雄性昆明种小鼠，每只于肩胛腋窝处皮下接种肿瘤细胞0.2mL。待能触及接种部位的肿瘤结节后，试验组肿瘤组织内注射本发明肿瘤抑素融合肽（41肽）5mg/kg/d（用PBS缓冲液（PBS缓冲液：0.1-0.2mol/L磷酸钠缓冲液,pH为7.4）溶解），连续用药10天，处死小鼠，剥离肿瘤结节，称重，计算抑瘤率。对照组注射等体积的PBS缓冲液（PBS缓冲液：0.1-0.2mol/L磷酸钠缓冲液,pH为7.4）。试验结果见表1、图1，本发明肿瘤抑素融合肽（41肽）的抑瘤率为69.14%。
表1肿瘤抑素融合肽（41肽）抑瘤率
试验例2细胞实验检测本发明肿瘤抑素融合肽（41肽）抑制肿瘤细胞运动作用
将人SGC-7901胃癌细胞（哈尔滨医科大学遗传学教研室保存）接种至24孔板，待细胞的生长覆盖率达到90%以后，用移液器枪头在孔板底部划痕，形成约4mm宽的无细胞区，用PBS缓冲液（PBS缓冲液：0.1-0.2mol/L磷酸钠缓冲液,pH为7.4）以及培养基反复冲洗，除去漂浮的细胞和细胞碎片。试验组培养液中加入本发明肿瘤抑素融合肽（41肽）40ug/mL。对照组加等体积的PBS缓冲液（PBS缓冲液：0.1-0.2mol/L磷酸钠缓冲液,pH为7.4）。培养48小时后在倒置显微镜下观察孔内细胞迁移能力变化。结果显示，PBS缓冲液（PBS缓冲液：0.1-0.2mol/L磷酸钠缓冲液,pH为7.4）对细胞运动能力几乎没有抑制作用，由于细胞向无细胞区运动，使无细胞区的宽度变窄，边界不规则，在无细胞区可见侵入的细胞团（见图2B）；与PBS缓冲液（PBS缓冲液：0.1-0.2mol/L磷酸钠缓冲液,pH为7.4）比较，肿瘤抑素21肽具有一定的抑制细胞运动的作用，无细胞区的宽度明显变窄，但边界清晰，无细胞区内未见侵入的细胞（见图2C）；本发明肿瘤抑素41肽对细胞运动具有明显的抑制作用，无细胞区的宽度几乎与刚划线后的宽度相同，边界规整，无细胞区内没有侵入的细胞（见图2D）。
试验例3细胞实验检测本发明肿瘤抑素融合肽（41肽）抗细胞增殖活性
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人SGC-7901胃癌细胞（哈尔滨医科大学遗传学教研室保存）用含10%小牛血清的RPMI1640培养基培养至对数生长期，用质量分数为0.25%的胰酶消化制备细胞悬液，调整细胞浓度至5×104个/mL，接种96孔板，每孔100μL细胞悬液。培养24h细胞贴壁后加入终浓度分别为20,40,60,80,100μg·mL-1的肿瘤抑素41肽，再培养24h更换新的含10%小牛血清的RPMI1640培养基，加入MTT(5mg/mL)20uL，继续培养4小时弃掉培养液，各孔加100μLDMSO震荡10～20min。酶联仪490nm波长测每孔吸光度值，按下式计算细胞存活率（SR）:SR=给药组A/对照组A×100%。结果见图3，肿瘤抑素41肽对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人SGC-7901胃癌细胞的半数存活率分别约为45ug/mL和40ug/mL。
Claims (6)
1.一种具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽，其特征在于，所述的肿瘤抑素融合肽的氨基酸序列为SEQ No.1。
2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽，其特征在于，编码所述肿瘤抑素融合肽的核苷酸序列为SEQ No.2。
3.制备权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽的方法，包括以下步骤：
（1）用DNA合成仪合成本发明的DNA序列，即SEQ No.2；
（2）在编码链的5′端增加1个T碱基，模板链5′端增加ACG3个碱基，且退火成双链后使5′端磷酸化；
（3）用Nde1和Sap1双酶切TYB1质粒，酶切后与步骤（2）获得的DNA片段连接重组；
（4）将步骤（3）获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21或其他含有DE3基因的受体菌；
（5）培养、收集步骤（4）中获得的基因工程菌，并用超声波破菌制备裂解液；
（6）离心收集裂解液上清，经几丁质亲和层析纯化，即得具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽。
4.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求2所述的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求4所述的载体。
6.权利要求1或2所述的具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
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