RU2711085C1 - Полипептид для ингибирования миграции и инвазии рака предстательной железы - Google Patents
Полипептид для ингибирования миграции и инвазии рака предстательной железы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2711085C1 RU2711085C1 RU2019125564A RU2019125564A RU2711085C1 RU 2711085 C1 RU2711085 C1 RU 2711085C1 RU 2019125564 A RU2019125564 A RU 2019125564A RU 2019125564 A RU2019125564 A RU 2019125564A RU 2711085 C1 RU2711085 C1 RU 2711085C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- prostate cancer
- invasion
- endostatin
- mmp
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 28
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 37
- 238000013508 migration Methods 0.000 title claims description 22
- 230000009545 invasion Effects 0.000 title claims description 21
- 230000005012 migration Effects 0.000 title claims description 20
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 14
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 21
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 abstract description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 4
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001740 anti-invasion Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102100031162 Collagen alpha-1(XVIII) chain Human genes 0.000 abstract 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 abstract 1
- 230000002095 anti-migrative effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 10
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 8
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 7
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 5
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 5
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- CSHFHJNMIMPJST-HOTGVXAUSA-N methyl (2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoate Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 CSHFHJNMIMPJST-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 2
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 229950005008 abituzumab Drugs 0.000 description 2
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 2
- 108010080146 androgen receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 2
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- CXHCNOMGODVIKB-VWLOTQADSA-N (2s)-3-[[2,5-dimethyl-6-[4-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)piperidin-1-yl]pyrimidin-4-yl]amino]-2-[(4-methoxyphenyl)sulfonylamino]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(O)=O)CNC1=NC(C)=NC(N2CCC(CC2)C=2N=C3NCCCC3=CC=2)=C1C CXHCNOMGODVIKB-VWLOTQADSA-N 0.000 description 1
- 102100032187 Androgen receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000003727 Caveolin 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000026 Caveolin 1 Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 108010042918 Integrin alpha5beta1 Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 108700027855 PEP06 polypeptide Proteins 0.000 description 1
- 229940083963 Peptide antagonist Drugs 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 101100130647 Rattus norvegicus Mmp7 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 102000001307 androgen receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125798 integrin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006712 oncogenic signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к противораковым пептидным агентам на основе фрагмента эндостатина, и может быть использовано в медицине в терапии рака предстательной железы. Пептид получают в результате слияния гексапептида RGDRGD с участком NH2-конца эндостатина (с 1 по 24 аминокислотные остатки). Использование изобретения обеспечивает реализацию антимиграционного и антиинвазивного эффекта в отношении рака предстательной железы в результате антагонизма с αv интегриновыми рецепторами, подавления фосфорилирования FAK и снижения экспрессии ММР-7 и ММР-9 в опухолевых клетках. 12 ил.
Description
Изобретение относится к экспериментальной медицине и молекулярной биофармакологии и может быть использовано в качестве средства для ингибирования миграции и инвазии рака предстательной железы.
Описана анти-пролиферативная активность природного ингибитора ангиогенеза эндостатина в отношении рака предстательной железы, реализуемая посредством антагонистического воздействия на андрогеновые рецепторы опухолевых клеток [Lee J.H. et al. Endostatin: A novel inhibitor of androgen receptor function in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences, T. 112, №5, C. 1392-1397 (2015)]. В случае андроген-независимого рака простаты показана возможность блокирования опухолевого роста с помощью эндостатина за счет подавления оксидативного стресса [Lee J.H. et al. Endostatin inhibits androgen-independent prostate cancer growth by suppressing nuclear receptor-mediated oxidative stress. The FASEB Journal, T. 31, №4, C. 1608-1619 (2017)]. Примечательно, что основную терапевтическую ценность полноразмерной молекулы эндостатина несет в себе фрагмент из 27 аминокислотных остатков, соответствующий N-концевой последовательности белка [Sjin R.M.T.T. et al. A 27-amino-acid synthetic peptide corresponding to the NH2-terminal zinc-binding domain of endostatin is responsible for its antitumor activity. Cancer Research, T. 65, №9, C. 3656-3663 (2005)]. Несмотря на сравнительную доклиническую активность эндостатина и его фрагментов, монотерапия на основе ингибиторов ангиогенеза показала весьма ограниченную эффективность на этапе клинических испытаний. При этом отмечено, что терапевтический эффект, реализуемый эндостатином и его полипептидными фрагментами, достигается преимущественно за счет воздействия на эндотелиальные клетки кровеносных сосудов и подавления кровоснабжения в опухолевом очаге.
В известных работах данных о прямом ингибирующем воздействии эндостатина на миграцию и инвазию клеток рака предстательной железы не обнаружено. Вместе с тем показана способность RGD-производного эндостатина оказывать анти-миграционный и анти-инвазивный эффекты в отношении гепатоцеллюлярной карциномы путем воздействия на αvβ3 интегриновый сигнальный путь [Li S. et al. RGD-modified endostatin peptide 30 derived from endostatin suppresses invasion and migration of HepG2 through the αvβ3 pathway. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, T. 26, №5, C. 529-538 (2011)]. RGD трипептид представляет собой последовательность из аргинина, глицина и аспарагиновой кислоты, блокирующую связывание αv интегринов с компонентами внеклеточного матрикса и способную подавлять активацию интегрин-зависимых онкогенных сигнальных путей, обеспечивающих адгезию, миграцию и инвазию опухолевых клеток [Hatley R.J.D. et al. An alphav-RGD Integrin Inhibitor Toolbox: Drug Discovery Insight, Challenges and Opportunities. Angewandte Chemie, T. 57, C. 3298-3321 (2018)]. В частности, известен способ ингибирования роста опухолей головного мозга с помощью RGD-содержащих полипептидных антагонистов αv интегринов [патент RU 2255765, конвенционный приоритет 21.01.2000]. При раке предстательной железы описан способ подавления образования de novo, а также прогрессии костного метастазирования с помощью не пептидного антагониста αv интегриновых рецепторов GLPG0187 [van der Horst G. et al. Targeting of αv-Integrins in Stem/Progenitor Cells and Supportive Microenvironment Impairs Bone Metastasis in Human Prostate Cancer. Neoplasia, T. 13, №6, C. 516-525 (2011)]. Также показано использование моноклонального антитела против αv интегриновых рецепторов Абитузумаба (DI17E6, EMD 525797) с целью ингибирования прогрессии рака предстательной железы, в том числе за счет подавления миграции и инвазии опухолевых клеток [Jiang Y. et al. Abituzumab Targeting of αv-Class Integrins Inhibits Prostate Cancer Progression. Molecular Cancer Research, T. 15, №7, C. 875-883 (2017)].
Приведенные данные свидетельствуют о важности взаимодействия αv интегриновых рецепторов опухолевых клеток и внеклеточного матрикса в реализации инвазивного потенциала рака предстательной железы. Вместе с этим известно, что терапевтический эффект эндостатина связан с блокированием α5β1 интегринов эндотелиальных клеток кровеносных сосудов RGD-независимым образом [Wickstrom S.A. et al. Endostatin Associates with Integrin α5β1 and Caveolin-1, and Activates Src via a Tyrosyl Phosphatase-dependent Pathway in Human Endothelial Cells. Cancer Research, T. 62, C. 5580-5589 (2002)]. В имеющейся литературной базе работ по использованию RGD-производных полипептидных фрагментов эндостатина в качестве антагонистов αv интегриновых рецепторов, способных ингибировать миграцию и инвазию клеток рака предстательной железы, не обнаружено.
Наиболее близким аналогом изобретения является peptide 30, представляющий собой активный фрагмент N-концевой последовательности эндостатина, в котором аминокислотные остатки в положениях 25-30 заменены на RGDRGD гексапептид [Li S. et al. RGD-modified endostatin peptide 30 derived from endostatin suppresses invasion and migration of HepG2 through the αvβ3 pathway. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, T. 26, №5, C. 529-538 (2011)]. При этом в экспериментах in vitro с гепатоцеллюлярной карциномой Li и соавторы (2011) доказали способность peptide 30 подавлять активность интегрин-зависимых матриксных металлопротеиназ (ММР) -2 и -9, отвечающих за миграцию и инвазию опухоли.
Задачей настоящего изобретения является получение средства для ингибирования миграции и инвазии рака предстательной железы.
Технический результат - получение анти-миграционной и анти-инвазивной активности полипептидного фрагмента эндостатина в отношении рака предстательной железы в результате слияния гексапептида RGDRGD с участком NH2-конца эндостатина (с 1 по 24 аминокислотные остатки).
Сущность изобретения: применение полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, в качестве средства для ингибирования адгезии, миграции и инвазии рака предстательной железы, подавления активности αv интегринов и фосфорилирования FAK, снижения экспрессии ММР-7 и ММР-9 в опухолевых клетках.
Известно применение полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, в качестве ингибитора ангиогенеза и подавления прогрессии клеток рака желудка и шейки матки [патент CN 104530199А от 22.04.2015]. Также имеются данные о прямом ингибирующем воздействии полипептида на миграцию и метастазирование колоректальной карциномы в результате антагонизма с αvβ3 интегринами опухолевых клеток [Yu S. et al. РЕР06 polypeptide 30 exerts antitumour effect in colorectal carcinoma via inhibiting epithelial mesenchymal transition. British journal of pharmacology, T. 175, №11, C. 3111-3130(2018)].
Однако до настоящего времени ни в одном исследовании не было предложено применение полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, в качестве средства для ингибирования миграции и инвазии рака предстательной железы.
Оценку адгезивных свойств клеток рака предстательной железы в результате применения полипептида с аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 1, проводили с использованием фибронектинового матрикса. Характер воздействия полипептида на миграцию и инвазию раковых клеток изучали в ходе эксперимента «заживления раны» и Transwell инвазии, соответственно. Экспрессию белков исследовали с помощью Вестерн блот анализа.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 представлены результаты фотомикроскопии адгезивных LNCaP клеток, инкубированных с указанными разведениями веществ на фибронектиновом матриксе в течение 24 часов. Адгезивные клетки окрашены раствором кристального фиолетового.
На Фиг. 2 представлен график, показывающий число адгезивных LNCaP клеток в каждой из указанных групп при 24-часовой инкубации на фибронектине. *Р<0,05, ***Р<0,001, ****P<0,0001 по сравнению с буферным контролем.
На Фиг. 3 представлены результаты нативной фотомикроскопии, демонстрирующие динамику «заживления» экспериментальных царапин-ран на монослое LNCaP культур за счет клеточной миграции в каждой из указанных групп в течение 24 часов.
На Фиг. 4 представлен график, демонстрирующий сокращение просвета «экспериментальной раны» (нм) за счет миграции LNCaP клеток из краев царапин в каждой группе за 24 часа. *Р<0,05, **P<0,01 по сравнению с буферным контролем.
На Фиг. 5 представлены результаты фотомикроскопии мембран каждой из указанных групп в эксперименте Transwell инвазии. Инвазивные LNCaP клетки окрашены раствором кристального фиолетового.
На Фиг. 6 представлен график, демонстрирующий число инвазивных LNCaP клеток в каждой группе при 24-часовой инкубации в камерах Transwell с нанесенным матригелем. **Р<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001 по сравнению с буферным контролем.
На Фиг. 7 представлен результат сканирования нитроцеллюлозной мембраны, инкубированной с первичными антителами против αv интегрина, фосфорилированного (Tyr 397) и тотального FAK, а также GAPDH в эксперименте Вестерн блот.
На Фиг. 8 представлен количественный анализ относительной денситометрии для αv интегрина, фосфорилированного (Tyr 397) и тотального FAK в эксперименте Вестерн блот. ***P<0,001, ****P<0,0001 по сравнению с буферным контролем.
На Фиг. 9 изображен результат сканирования нитроцеллюлозной мембраны, инкубированной с первичными антителами против ММР-7 и GAPDH в эксперименте Вестерн блот.
На Фиг. 10 представлен количественный анализ относительной экспрессии ММР-7 в эксперименте Вестерн блот. *Р<0,05 по сравнению с буферным контролем.
На Фиг. 11 представлен результат сканирования нитроцеллюлозной мембраны, инкубированной с первичными антителами против ММР-9 и GAPDH в эксперименте Вестерн блот.
На Фиг. 12 представлен количественный анализ относительной экспрессии ММР-9 в эксперименте Вестерн блот. ***P<0,001 по сравнению с буферным контролем.
Стоковый раствор полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, с концентрацией 10 мг/мл получали путем растворения 20 мг сухого вещества полипептида в 2 мл 5% раствора глюкозы для инъекций, после чего фильтровали с помощью 0,22 мкм-микропоровой мембраны (EMD Millipore). Отфильтрованный стоковый раствор хранили при -20°С в защищенном от света месте. Рабочие растворы низкой (50 мкг/мл), средней (100 мкг/мл) и высокой (200 мкг/мл) концентрации полипептида готовили по мере необходимости путем разведения стокового раствора питательной средой DMEM (GE Healthcare HyClone).
Экспериментальные исследования in vitro проводили с культурами клеточной линии рака предстательной железы LNCaP (АТСС® CRL-1740™).
Открепление адгезивных культур рака предстательной железы в результате воздействия полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, изучали на фибронектиновом матриксе. Для этого 96-луночный планшет предварительно покрывали 5 мкг/мл раствором фибронектина (Sigma-Aldrich) на 3 часа при комнатной температуре. После двукратного промывания лунок раствором фосфатно-солевого буфера в каждую лунку инокулировали LNCaP клетки в количестве 3×104 в объеме 100 мкл бессывороточной питательной среды DMEM и оставляли в инкубаторе на ночь, ожидая их прикрепления. На следующий день питательную среду заменяли на соответствующие разведения полипептида в бессывороточной питательной среде, в группе буферного контроля добавляли 5% раствор глюкозы. После 24-часовой инкубации неприкрепленные LNCaP клетки удаляли осторожным промыванием лунок раствором фосфатно-солевого буфера. Адгезивные клетки на фибронектиновом матриксе фиксировали 4% раствором параформальдегида и окрашивали раствором кристаллического фиолетового в течение 20 минут. В каждой группе осуществляли съемку в трех произвольных полях зрения под 100-кратным увеличением светового микроскопа. Количественный анализ полученных результатов производили с помощью программного обеспечения Image J (U.S. National Institutes of Health).
Характер воздействия полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, на миграцию рака предстательной железы in vitro изучали в ходе эксперимента «заживления раны». Во-первых, LNCaP клетки выращивали в 6-луночковом планшете, ожидая достижения ими 100% конфлюэнтности. Далее на клеточном монослое каждой группы проводили «царапину» с помощью наконечника 200 мкл пипетки, после чего питательную среду заменяли на разведения полипептида низкой (50 мкг/мл), средней (100 мкг/мл) и высокой (200 мкг/мл) концентрации и продолжали инкубацию в течение 24 часов. В группе буферного контроля использовали 5% раствор глюкозы. Фотосъемку границ «царапины-раны» осуществляли под 40-кратным увеличением микроскопа в соответствующие отрезки времени: 0 ч и 24 ч. Среднее значение ширины экспериментальной раны определяли при помощи программного обеспечения Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics). Показатели миграционного расстояния в каждой группе получали как разность значений средней ширины экспериментальной раны в 0 ч и 24 ч относительно группы буферного контроля.
Исследование влияния полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, на инвазию клеток рака предстательной железы изучали в эксперименте Transwell инвазии. Для этого LNCaP культуры (1×105 клеток в 400 мкл бессывороточной питательной среды) высеивали в BioCoat™ Invasion Chambers (Corning) с нанесенным Matrigel® в соответствующих разведениях полипептида на 24 часа. В группе буферного контроля был использован 5% раствор глюкозы. Нижние камеры заполняли 600 мкл 10% раствора сывороточной питательной среды в качестве хемоаттрактанта. По истечении 24 часов не инвазивные опухолевые клетки удаляли со дна камер при помощи ватного тампона. Визуализацию клеток, приникших через матригель и мигрировавших через поры в мембране, осуществляли путем окрашивания раствором кристаллического фиолетового с предварительной фиксацией 4% раствором параформальдегида. В каждой из камер осуществляли съемку мембран в трех произвольных полях зрения под 200-кратным увеличением светового микроскопа. Подсчет инвазивных клеток производили с помощью программного обеспечения Image J.
Анализ влияния полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, на экспрессию αv интегрина, тотального и фосфорилированного FAK, ММР-9 и ММР-7 исследовали с помощью Вестерн блоттинга. Для этого LNCaP клетки предварительно инкубировали с разведениями полипептида низкой (50 мкг/мл), средней (100 мкг/мл) и высокой (200 мкг/мл) концентраций в течение 24 часов. Выделение тотального белка из опухолевых клеток осуществляли с помощью RIPA буфера (Thermo Scientific), концентрацию полученного лизата определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Протеиновые образцы каждой группы разделяли методом электрофореза, после чего осуществляли трансфер белковых фракций на нитроцеллюлозную мембрану. Для определения содержания искомых белков в образцах мембраны инкубировали при 4°С в течение 10-12 часов с первичными антителами против αv интегрина (Abeam), тотального FAK (Cell Signaling Technology), фосфорилированного FAK(Tyr397) (Cell Signaling Technology), MMP-7 (Abeam) и MMP-9 (Abeam). На следующий день мембраны промывали в фосфатно-солевом буфере с Твин-20 и проводили инкубацию с соответствующими вторичными антителами при комнатной температуре в течение 1 часа. После окончательного промывания в фосфатно-солевом буфере с Твин-20 проводили сканирование мембран с помощью аппарата Odyssey Imaging system (LI-COR Biosciences) с последующим денситометрическим анализом в программном обеспечении LI-COR Image Studio Software.
Статистический анализ результатов осуществляли с помощью программного обеспечения Graphpad Prism 6, используя однофакторный дисперсионный анализ One Way ANOVA. Значение Р<0,05 считали как статистически достоверное.
Анализ результатов эксперимента по изучению адгезивных свойств LNCaP культур выявил значительное открепление опухолевых клеток от фибронектинового матрикса при воздействии полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1 (Фигура №1). По истечении 24-часовой инкубации число адгезивных LNCaP клеток в группе буферного контроля составило 143,3±14,6, тогда как в группе полипептида с концентрацией 50 мкг/мл было 107,0±15,7 (Р<0,05), со 100 мкг/мл - 75,3±7,1 (Р<0,001), а в группе с максимальной концентрацией в 200 мкг/мл - 55,3±5,7 (Р<0,0001) (Фигура №2).
Изучение воздействия полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, в эксперименте «заживления раны» позволило установить значительное ингибирование миграции LNCaP клеток (Фигура №3). При этом статистически значимое сокращение миграционного расстояния было достигнуто в группах средней (Р<0,05) и максимальной (Р<0,01) концентраций полипептида (Фигура №4).
В ходе эксперимента Transwell инвазии было установлено, что инкубация культур LNCaP клеток с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, привела к значительной супрессии инвазивного потенциала рака предстательной железы in vitro (Фигура №5). Анализ полученных результатов показал статистически значимое уменьшение числа инвазивных клеток во всех группах с полипептидом (Фигура №6).
Сравнительный анализ результатов эксперимента Вестерн блоттинга с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, выявил подавление активности αv интегринов и FAK (Фигура №7). В группе с максимальной концентрацией полипептида зафиксировано статистически значимое снижение экспрессии αv интегрина до уровня 0,62±0,16 (Р<0,001) относительно значений буферного контроля (Фигура №8). При этом значительное подавление фосфорилирования FAK отмечалось во всех группах с полипептидом.
Кроме того, количественный анализ относительной денситометрии экспрессии ММР-7 показал статистически значимое (Р<0,05) уменьшение количества данного белка в группе с концентрацией полипептида 200 мкг/мл (Фигуры №9-10).
Как показали результаты Вестерн блот анализа, 24-часовая инкубация культур рака предстательной железы с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, привела к значительному ингибированию содержания ММР-9 в LNCaP клетках (Фигура №11). Так, в группе с концентрацией полипептида 100 мкг/мл зафиксирована экспрессия ММР-9 на уровне 0,58±0,03 (Р<0,001), а группе с максимальной концентрацией - 0,44±0,04 (Р<0,001) (Фигура №12).
В целом, результаты настоящего исследования свидетельствуют об ингибирующем действии полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, на миграцию и инвазию рака предстательной железы. Полученные данные об антагонизме полипептида настоящего исследования в отношении αv интегриновых рецепторов, а также его способность подавлять фосфорилирование FAK и снижать экспрессию ММР-7 и ММР-9 позволяют рассматривать данный полипептид в качестве потенциального противоопухолевого средства для терапии рака предстательной железы.
Claims (1)
- Применение полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, в качестве средства для ингибирования миграции и инвазии рака предстательной железы, подавления активности αv интегринов и фосфорилирования FAK, снижения экспрессии ММР-7 и ММР-9 в опухолевых клетках.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019125564A RU2711085C1 (ru) | 2019-08-12 | 2019-08-12 | Полипептид для ингибирования миграции и инвазии рака предстательной железы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019125564A RU2711085C1 (ru) | 2019-08-12 | 2019-08-12 | Полипептид для ингибирования миграции и инвазии рака предстательной железы |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2711085C1 true RU2711085C1 (ru) | 2020-01-15 |
Family
ID=69171535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019125564A RU2711085C1 (ru) | 2019-08-12 | 2019-08-12 | Полипептид для ингибирования миграции и инвазии рака предстательной железы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2711085C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7645735B2 (en) * | 2003-08-29 | 2010-01-12 | Children's Medical Center Corporation | Anti-angiogenic peptides for treating or preventing endometriosis |
| CN104530199A (zh) * | 2014-11-18 | 2015-04-22 | 哈尔滨医科大学 | 一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-08-12 RU RU2019125564A patent/RU2711085C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7645735B2 (en) * | 2003-08-29 | 2010-01-12 | Children's Medical Center Corporation | Anti-angiogenic peptides for treating or preventing endometriosis |
| CN104530199A (zh) * | 2014-11-18 | 2015-04-22 | 哈尔滨医科大学 | 一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LI S. et al., RGD-modified endostatin peptide 30 derived from endostatin suppresses invasion and migration of HepG2 through the avb3 pathway, Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, 2011, v. 26, n.5, p. 529-538. * |
| ДИГТЯРЬ А.В. и др. ЭНДОСТАТИН: СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ЕГО РОЛИ И МЕХАНИЗМАХ ДЕЙСТВИЯ, Обзор, БИОХИМИЯ, 2007, т. 72, в. 3, с. 291-305. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Boccalini et al. | Relaxin protects cardiac muscle cells from hypoxia/reoxygenation injury: involvement of the Notch‐1 pathway | |
| RU2705547C1 (ru) | Полипептид для ингибирования миграции и инвазии плоскоклеточного рака полости рта | |
| Liu et al. | Fibroblasts potentiate blood vessel formation partially through secreted factor TIMP-1 | |
| US9617311B2 (en) | Use of PEDF-derived polypeptides for promoting stem cells proliferation and wound healing | |
| Hocking et al. | Fibronectin matrix polymerization regulates small airway epithelial cell migration | |
| Ding et al. | Dimethyloxaloylglycine improves angiogenic activity of bone marrow stromal cells in the tissue-engineered bone | |
| Zhang et al. | C1q/tumor necrosis factor-related protein-3-engineered mesenchymal stromal cells attenuate cardiac impairment in mice with myocardial infarction | |
| Cambados et al. | Angiotensin-(1-7) counteracts the transforming effects triggered by angiotensin II in breast cancer cells | |
| Hendel et al. | Granzyme B cleavage of fibronectin disrupts endothelial cell adhesion, migration and capillary tube formation | |
| Rhett et al. | Mechanism of action of the anti-inflammatory connexin43 mimetic peptide JM2 | |
| EP3302557B1 (en) | Antagonist of collagen for enhancing the therapeutic activity of an immune checkpoint inhibitor in the treatment of melanoma | |
| Li et al. | VEGF gene transfected umbilical cord mesenchymal stem cells transplantation improve the lower limb vascular lesions of diabetic rats | |
| WO2006041205A1 (ja) | 血管形成促進剤 | |
| RU2711085C1 (ru) | Полипептид для ингибирования миграции и инвазии рака предстательной железы | |
| ES2330918T3 (es) | Inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos para usar en la modulacion de la angiogenesis y la cardiovascularizacion. | |
| EP1388013B1 (en) | Compositions and methods for the use of fibronectin fragments in the diagnosis of cancer | |
| US9556232B2 (en) | Anti-angiogenic molecules, nanostructures and uses thereof | |
| CN110325544B (zh) | 来源于胰岛素a链的肽片段及包含它的用于预防或治疗糖尿病或糖尿病伤口的药物组合物 | |
| Lee et al. | Engineered M13 nanofiber accelerates ischemic neovascularization by enhancing endothelial progenitor cells | |
| JP4406013B2 (ja) | 細胞の接着・伸展を促進するペプチド、その断片及びその誘導体 | |
| CN114605501B (zh) | 一种可拮抗fus蛋白rna结合活性的多肽fip-21及其应用 | |
| CN110357946B (zh) | 一种抑制肿瘤转移的多肽及其应用 | |
| Hofmann et al. | Protein p0071, a major plaque protein of non-desmosomal adhering junctions, is a selective cell-type marker | |
| Zhang et al. | Blocking follistatin-like 1 attenuates liver fibrosis in mice by regulating transforming growth factor-beta signaling | |
| Wang et al. | Inhibition of integrin alpha v/beta 5 mitigates the protective effect induced by irisin in hemorrhage |