CN110325544B - 来源于胰岛素a链的肽片段及包含它的用于预防或治疗糖尿病或糖尿病伤口的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示一种来源于胰岛素A链的肽片段及将其作为活性成份予以包含的用于预防或治疗糖尿病或糖尿病伤口的药物组合物。本发明的肽通过胰岛素受体介导内吞作用，具有把葡萄糖转运体移位到细胞膜而增加细胞的葡萄糖摄取的活性，具有增加细胞移动及增殖的活性。因此，本发明的肽能够有益地应用于糖尿病及糖尿病伤口的预防或治疗。

Description

来源于胰岛素A链的肽片段及包含它的用于预防或治疗糖尿 病或糖尿病伤口的药物组合物
技术领域
本发明涉及揭示一种来源于胰岛素A链(insulin A-chain)的肽片段及将其作为活性成份予以包含的用于预防或治疗糖尿病或糖尿病伤口的药物组合物。
背景技术
胰岛素是由胰岛(pancreatic islets)的β细胞分泌的肽激素。胰岛素促进脂肪、肝及骨骼肌细胞从血液摄取葡萄糖而调节碳水化合物、脂肪、蛋白质的代谢。人的胰岛素蛋白质由51个氨基酸组成并且具有5808Da的分子量。胰岛素是A链与B链的二聚体(dimer)并且通过二硫键互相连接。
糖尿病(diabetes)是一种以胰岛素分泌减少、葡萄糖利用减少或葡萄糖生成增加导致血液中葡萄糖含量提高作为特征的代谢性疾病。糖尿病引起各种并发症，例如引起诸如糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcers)之类的糖尿病伤口(diabetic wounds)。目前为了针对需胰岛素疗法的糖尿病进行治疗而在临床使用人胰岛素(human insulin)制剂或重组胰岛素(recombinant insulin)制剂。例如，重组胰岛素制剂使用优泌林RTM(HumulinRTM)注射剂、优泌林NTM(Humulin NTM)注射剂。
另一方面，现有的胰岛素制剂因为是高分子量的蛋白质制剂而以注射剂形态使用，其使用较不方便，而且制剂的保管与处理也需要多加注意。而且，为了制备高纯度的胰岛素而需要在生产及精制过程中花费较高费用，还需要较长时间。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明人从胰岛素设计出具备3个(trimer)或4个(tetramer)氨基酸的各种肽片段后针对其活性进行评估。令人惊讶的是，本发明人发现来源于胰岛素A链(insulin A-chain)中第11～17位氨基酸序列的具备3个或4个氨基酸的特定肽片段具有胰岛素样活性。尤其是，本发明人发现所述特定肽片段诱导胰岛素受体的内吞作用并且把葡萄糖转运体移位(translocation)到细胞膜而增加细胞的葡萄糖摄取，还能增加细胞的移动及增殖。
因此，本发明的目的是提供来源于胰岛素A链的特定肽片段。
而且，本发明的另一个目的是提供一种把所述来源于胰岛素A链的特定肽片段作为活性成份予以包含的用于预防或治疗糖尿病或糖尿病伤口的药物组合物。
用于解决问题的方案
根据本发明的一个实施样态，揭示了一种以下述化学式1表示的3个或4个氨基酸所构成的肽：
<化学式1>
X-A-Leu-Y
式中，A是丝氨酸(Ser)或谷氨酰胺(Gln)；X是氢、酪氨酸(Tyr)或半胱氨酸(Cys)；Y是氢、酪氨酸(Tyr)或谷氨酸(Glu)；X及Y无法同时为氢；-是肽键。
在本发明的一个实施样态中，本发明的肽可以是以下述化学式1a表示的肽：
<化学式1a>
X1-Ser-Leu-Y1
式中，X1是氢或半胱氨酸(Cys)；Y1是氢或酪氨酸(Tyr)；X1及Y1无法同时为氢；-是肽键。在所述实施样态中，本发明的肽可以是选自SEQ ID NO：1、3及4所组成的群的肽，优选地，可以是SEQ ID NO：3的肽。
在本发明的另一个实施样态中，本发明的肽可以是以下述化学式1b表示的肽：
<化学式1b>
X2-Gln-Leu-Y2
式中，X2是氢或酪氨酸(Tyr)；Y2是氢或谷氨酸(Glu)；X2及Y2无法同时为氢；-是肽键。在所述实施样态中，本发明的肽可以是选自SEQ ID NO：2、5及6所组成的群的肽。
根据本发明的另一个实施样态，揭示了一种把所述3个或4个氨基酸所构成的肽作为活性成份予以包含的用于预防或治疗糖尿病或糖尿病伤口的药物组合物。
在本发明的药物组合物中，所述肽可以是选自SEQ ID NO：1至6所组成的群的肽，优选地，可以是SEQ ID NO：3的肽。在本发明的一个实施样态中，本发明的药物组合物可以具有透皮吸收制剂(transdermal delivery system)的剂型。
发明效果
本发明发现来源于胰岛素A链的特定肽片段(peptide fragments或smallpeptides)具备胰岛素样活性。尤其是，本发明发现所述特定肽片段通过胰岛素受体介导内吞作用并且把葡萄糖转运体移位(translocation)到细胞膜而增加细胞的葡萄糖摄取，还能增加细胞的移动及增殖。因此，本发明的肽能够有益地应用于糖尿病及糖尿病伤口(diabetic wounds)的预防或治疗。而且，本发明的肽是500Da以下的小分子物质，因此不仅能作为注射剂使用，还能以透皮吸收制剂(transdermal delivery system)形态使用。更进一步，本发明的肽是通过共价键形成的稳定分子而能够不受温度影响地保管，保存期也很长而容易保管及处理。而且本发明的肽能比现有胰岛素制剂低廉且简单地制备。
附图说明
图1示出把本发明的肽对细胞处理后通过PLA(proximity ligation assay)方法测量Grb2与SOS1的物理结合地评估胰岛素样活性的结果。
图2示出为为了确认本发明的肽是否结合到胰岛素受体并介导内吞作用而进行的免疫荧光(immunofluorescence)分析结果(图2的A)及RNA干扰(RNA interference)分析结果(图2的B)。
图3与图4示出为了确认本发明的肽是否促进细胞的移动与增殖而进行的细胞移动试验结果(图3)及增殖试验结果(图4)。
图5示出了用于评估本发明的肽对葡萄糖摄取的活性的2-NBDG葡萄糖摄取(2-NBDG Glucose uptake)分析结果。
图6示出为了确认本发明的肽是否介导胰岛素受体增加葡萄糖摄取而利用siRNA抑制胰岛素受体的表达后进行了2-NBDG葡萄糖摄取试验的结果。
图7示出通过免疫荧光(immunofluorescence)分析评估HaCaT细胞中葡萄糖转运体的细胞膜移位的结果。
具体实施方式
本发明揭示了由胰岛素A链(insulin A-chain)中第11～17位氨基酸序列(即，Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu)制备的具3个(trimer)或4个(tetramer)氨基酸的肽。即，本发明揭示了以下述化学式1表示的3个或4个氨基酸所构成的肽：
<化学式1>
X-A-Leu-Y
式中，A是丝氨酸(Ser)或谷氨酰胺(Gln)；X是氢、酪氨酸(Tyr)或半胱氨酸(Cys)；Y是氢、酪氨酸(Tyr)或谷氨酸(Glu)；X及Y无法同时为氢；-是肽键。
在所述化学式1中，X为“氢”的肽意味着该位置不存在肽键的肽，因此，表示A，即丝氨酸(Ser)或谷氨酰胺(Gln)是该肽的N-末端氨基酸。而且，Y为“氢”的肽意味着该位置不存在肽键的肽，因此表示亮氨酸(Leu)是该肽的C-末端氨基酸。
本发明的肽具有胰岛素样活性，尤其是通过胰岛素受体介导内吞作用，把葡萄糖转运体移位(translocation)到细胞膜而增加细胞的葡萄糖摄取，还能增加细胞的移动及增殖。
在本发明的一个实施样态中，本发明的肽可以是以下述化学式1a表示的肽：
<化学式1a>
X1-Ser-Leu-Y1
式中，X1是氢或半胱氨酸(Cys)；Y1是氢或酪氨酸(Tyr)；X1及Y1无法同时为氢；-是肽键。
在所述化学式1a中，X1为“氢”的肽意味着该位置不存在肽键的肽，因此表示丝氨酸(Ser)是该肽的N-末端氨基酸。而且，Y1为“氢”的肽意味着该位置不存在肽键的肽，因此表示亮氨酸(Leu)是该肽的C-末端氨基酸。
优选地，以所述化学式1a表示的肽可以是选自SEQ ID NO：1、3及4所组成的群的肽，更优选地，可以是SEQ ID NO：3的肽。
在本发明的另一个实施样态中，本发明的肽可以是以下述化学式1b表示的肽：
<化学式1b>
X2-Gln-Leu-Y2
式中，X2是氢或酪氨酸(Tyr)；Y2是氢或谷氨酸(Glu)；X2及Y2无法同时为氢；-是肽键。
在所述化学式1b中，X2为“氢”的肽意味着该位置不存在肽键的肽，因此表示谷氨酰胺(Gln)是该肽的N-末端氨基酸。而且，Y2为“氢”的肽意味着该位置不存在肽键的肽，因此表示亮氨酸(Leu)是该肽的C-末端氨基酸。
优选地，以所述化学式1b表示的肽可以是选自SEQ ID NO：2、5及6所组成的群的肽。
本发明还揭示了把所述化学式1表示的3个或4个氨基酸所构成的肽作为活性成份予以包含的用于预防或治疗糖尿病或糖尿病伤口的药物组合物。所述糖尿病伤口(diabetic wounds)以糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcers)为典型代表。
在本发明的药物组合物中，所述肽可以是以化学式1a或1b表示的3个或4个氨基酸所构成的肽，它们各自如前文所述。而且，在本发明的药物组合物中，所述肽可以是选自SEQID NO：1至6所组成的群的肽，优选地，可以是SEQ ID NO：3的肽。
本发明的药物组合物可以包含药学上允许的载体，例如，可以包括乳糖、玉米淀粉之类的赋型剂、硬脂酸镁之类的润滑剂、被公知而可使用的乳化剂、悬浮剂、缓冲剂、等渗剂等。而且，本发明的药物组合物能以透皮吸收制剂形态(oral dosage form)或非透皮吸收制剂形态(parenteral dosage form)形态进行制剂化，优选地，可以具有透皮吸收制剂(transdermal delivery system)之类的剂型(dosage form)。例如，如果是肌肉内、腹腔内、皮下及静脉内剂型的话，通常可以制备活性成分的灭菌溶液并且包含调节溶液pH的缓冲剂，如果是静脉内吸收的话可以在制剂包含等渗剂以便赋予等渗性。而且，本发明的药物组合物可以是水溶液剂的形态，其含有诸如pH为7.4的盐水之类的药学上允许的载体，能以溶液剂的形态局部性地导入患者的肌肉内血流中。而且，透皮吸收制剂包括外敷液剂、乳液、软膏剂、贴片之类的形态，可以由通常的制剂学方法制剂化。本发明的药物组合物能以每日大约1至10mg/kg的用量投药给糖尿病及/或糖尿病伤口患者。通常可以根据患者的年龄、体重及症状变更其适当剂量。
下面通过实施例与试验例更详细地说明本发明。但这些实施例及试验例只是为了例示本发明，本发明并不限定于这些实施例与试验例。
实施例1.肽的合成
SEQ ID NO：1至6的肽(请参阅下列表1)利用自动化合成仪(PeptrEx-R48,Peptron公司，大韩民国大田市)以FMOC固相法(FMOC solid-phase method)进行了合成。合成的肽则凭借着利用C18分析用RP柱(Shiseido capcell pak)的反向高速液相色谱(reverse-phase HPLC)(Prominence LC-20AB，Shimadzu公司，日本)进行了精制及分析，利用质量分析仪(HP 1100Series LC/MSD,Hewlett-Packard公司，Roseville，美国)进行了鉴定。
[表1]
肽名称 SEQ ID NO 氨基酸序列
IDP1 SEQ ID NO：1 Cys-Ser-Leu-Tyr
IDP2 SEQ ID NO：2 Tyr-Gln-Leu-Glu
IDP3 SEQ ID NO：3 Cys-Ser-Leu
IDP4 SEQ ID NO：4 Ser-Leu-Tyr
IDP5 SEQ ID NO：5 Tyr-Gln-Leu
IDP6 SEQ ID NO：6 Gln-Leu-Glu
实施例2.包含肽的组合物的制备
把SEQ ID NO：1至6的肽各自溶解到PBS并且让浓度成为1M地制备。所得到的蛋白质溶液则用于下述试验例。
试验例1.胰岛素样活性评估
胰岛素信号传递到细胞内的话，Grb2与SOS1的物理结合增加。把本发明的肽对细胞处理后通过PLA(proximity ligation assay)方法测量Grb2与SOS1的物理结合而评估了胰岛素样活性。在24-孔微板的各孔把4.5X 10 4个HaCaT细胞(CLS 300493)分株到DMEM含血清培养基，在37℃、5％CO2温育器(incubation)培养24小时后，添加实施例2的肽溶液让培养基中SEQ ID NO：1至6的肽的浓度成为1μM后，在同一条件下温育了5分钟。在阳性对照组方面，优泌林R(Humulin R)按照同一浓度进行了处理。对照组没有进行任何处理。以PBS清洗各孔的细胞并且以2％甲醛处理15分钟并予以固定后，0.1％TritonX-100处理5分钟提高了抗体往细胞内的穿透性。添加Grb2抗体(Santa cruz,CA,USA)及SOS1抗体(Santacruz，CA，USA)，使用In situ PLA试剂盒(Sigma-Aldrich)按照制造厂商的指南适用PLA探针后，进行了杂交(hybridization)、连接(ligation)、扩增(amplification)及封固(mounting)步骤。对于在各个细胞检测到的发光信号(PLA signals)，利用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus fluoview FW1000；日本东京奥林巴斯公司)测量而把Grb2及SOS1抗体的物理相互作用予以量化。其结果如图1所示。从图1的结果得知，相比于未处理的对照组，本发明的肽的抗体的相互作用显著增加，因此可以确认具有胰岛素样活性。尤其是，相比于进行了胰岛素制剂优泌林R(Humulin R)处理的阳性对照组，进行了SEQ ID NO：3的肽处理的组呈现出显著地更高的抗体的相互作用。
试验例2.免疫荧光(immunofluorescence)分析
为了确认本发明的肽是否和胰岛素一样地结合到胰岛素受体后介导内吞作用(endocytosis)而进行了免疫荧光(immunofluorescence)分析。把荧光物质(FITC)结合到SEQ ID NO：3的肽地做了准备。按照试验例1的方法对HaCaT细胞(CLS 300493)进行前处理后，让最终浓度成为1μM地添加了结合荧光物质的SEQ ID NO：3的肽溶液后，处理了5分钟、15分钟、30分钟及60分钟。利用PBS溶液清洗细胞3次后封到(mounting)载玻片制成样本，然后利用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus fluoview FW1000；日本东京奥林巴斯公司)观察，其结果如图2的A所示。从图2的A的结果得知，处理后5分钟时呈现出最高的内吞作用。胰岛素在细胞内结合到胰岛素受体后进行内吞作用(endocytosis，internalization)，之后则降解(degradation)。因此，所述结果表示肽处理后5分钟时以最高水平出现荧光并且之后降解而使得荧光减少。
根据所述试验结果，为了确认对于内吞作用的本发明的肽的效果是不是被胰岛素受体介导而进行了RNA干扰(RNA interference)分析。在DMEM含血清培养基把HaCaT细胞(CLS 300493)培养到50～60％融汇(confluency)为止后，使用胰岛素受体siRNA(Santacruz,CA,USA)(无处理、10nM处理或30nM处理)及脂质体RNAiMAX(Lipofectamine RNAiMAX)(Invitrogen)按照制造厂商的指南临时予以转染(transfection)抑制胰岛素受体的表达后，结合了荧光物质的SEQ ID NO：3的肽以1μM的浓度处理5分钟。利用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus fluoview FW1000；日本东京奥林巴斯公司)观察各组的荧光强度，其结果如图2的B所示。从图2的B的结果得知，在把胰岛素受体siRNA临时转染的试验组中内吞作用减少，其表示本发明的肽和胰岛素一样通过胰岛素受体介导内吞作用。
试验例3.细胞的移动及增殖活性评估
为了确认本发明的肽是否促进细胞的移动(migration)与增殖(proliferation)而进行了细胞移动及增殖试验。
细胞移动试验使用了把培养空间区分成两个的Culture insert 2Well(ibidiTM)。在所述平板培养细胞的话，中间出现中空空间并且细胞附接在两侧，分离套皿(insertwell)后进一步培养的话，两侧的细胞就会往平板的中空空间移动。把HaCaT细胞(CLS300493)在该平板培养到90％融汇为止后分离套皿，SEQ ID NO：3的肽(0.01μM、0.1μM、1μM)或优泌林R(1μM)处理5分钟后以PBS清洗，以细胞培养基(DMEM含血清培养基)更换并且在10小时及13小时后通过相差显微镜观察了细胞的移动。
细胞增殖试验如下进行，96-孔板的各孔以每一孔分株5x10 3个HaCaT细胞(CLS300493)后，让无血清培养基(serum free media)中的浓度成为0.1、1及10μM地以添加了SEQ ID NO：3的肽的溶液(总体积：90μl)处理。使用酶标仪(Versa Max，USA)观察了细胞增殖24、48及72小时，为了测量而每天在同一时间以CCK-8(cell counting kit-8)溶液10μl处理了2小时。
所述细胞的移动及增殖试验结果分别如图3与图4所示。从图3与图4的结果得知，和作为阳性对照组使用的优泌林R相似地，细胞的移动及增殖呈浓度依赖性地增加，因此可以确认本发明的肽有益于糖尿病伤口(diabetic wounds)的治疗。
试验例4.葡萄糖摄取活性评估
葡萄糖转运体(GLUT4)凭借着胰岛素的刺激移位(translocation)到细胞膜并增加细胞的葡萄糖摄取。为了确认本发明的肽是否对该葡萄糖摄取做出贡献而进行了2-NBDG葡萄糖摄取(2-NBDG Glucose uptake)分析及免疫荧光分析。
2-NBDG葡萄糖是具有荧光的去氧葡萄糖类似物，和葡萄糖一样地通过葡萄糖转运体被摄取到细胞内，但实际上不发生代谢而积蓄，因此可以通过所积蓄的荧光的量确认葡萄糖的摄取程度。2-NBDG葡萄糖摄取分析使用了2-NBDG Glucose uptake试剂盒(Biovision)。具体地说，在24-孔板的各孔分株3x104个HaCaT细胞(CLS 300493)，和DMEM含血清培养基仪器在37℃、5％CO2温育器(incubation)培养24小时后以PBS清洗，让无血清培养基中的浓度各自成为0.001μM、0.01μM及0.1μM地以SEQ ID NO：3的肽及优泌林R处理后温育(incubation)5分钟。按照制造厂商的指南制成了2-NBDG Reagent及葡萄糖摄入增强剂(Glucose Uptake Enhancer)混合的溶液并且处理1小时后，以同附的凉1X Analysis溶液清洗后利用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus fluoview FW1000；日本东京奥林巴斯公司)观察，其结果如图5所示。从图5的结果得知，和作为阳性对照组使用的Humulin R相似地，呈浓度依赖性地让葡萄糖摄取增加，其表示本发明的肽和胰岛素相似地把葡萄糖转运体移位到细胞膜而增加细胞的葡萄糖摄取。
根据所述试验结果，为了确认本发明的肽是否像胰岛素一样地介导胰岛素受体地增加葡萄糖摄取而利用siRNA抑制了胰岛素受体的表达后进行了2-NBDG葡萄糖摄取试验。在DMEM含血清培养基把HaCaT细胞(CLS 300493)培养到50～60％融汇为止后，使用胰岛素受体siRNA(Santa cruz，CA，USA)(无处理、10nM处理或30nM处理)及脂质体RNAiMAX(Lipofectamine RNAiMAX)(Invitrogen)按照制造厂商的指南临时予以转染(transfection)抑制胰岛素受体的表达后，SEQ ID NO：3的肽以1μM的浓度处理5分钟。按照制造厂商的指南制备了2-NBDG Reagent及葡萄糖摄入增强剂(Glucose Uptake Enhancer)混合的溶液并且处理1小时后，以同附的凉1X Analysis溶液清洗后利用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus fluoview FW1000；日本东京奥林巴斯公司)观察，其结果如图6所示。从图6的结果得知，在胰岛素受体siRNA临时转染的试验组中葡萄糖摄取减少，其表示本发明的肽和胰岛素相似地通过胰岛素受体影响葡萄糖摄取。
而且，通过免疫荧光(immunofluorescence)分析评估了HaCaT细胞中葡萄糖转运体的细胞膜移位。具体地说，针对HaCaT细胞(CLS 300493)，在无血清DMEM培养基各自以0.001、0.01及0.1μM的浓度进行SEQ ID NO：3的肽及优泌林R(阳性对照组)处理5分钟。以PBS溶液清洗细胞并且GLUT4抗体(Santa cruz,CA,USA)处理1小时后，玫瑰红(rhodaminered)处理40分钟，然后利用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus fluoview FW1000；日本东京奥林巴斯公司)观察，其结果如图7所示。从图7的结果可知，和作为阳性对照组使用的优泌林R相似地，在细胞膜上葡萄糖转运体(GLUT4)呈浓度依赖性地增加，其表示本发明的肽和胰岛素发挥出相似的功能。
<110> 舒帕得力克瑞股份有限公司
<120> 来源于胰岛素A链的肽片段及包含它的用于预防或治疗糖尿病或糖尿病伤口的药物组合物
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽片段
<400> 6
Gln Leu Glu
1

Claims (4)

1.一种肽在用于制备能够预防或治疗糖尿病或糖尿病伤口的药物中的用途，其中，所述肽以下述化学式1表示的3个或4个氨基酸所构成，
<化学式1>
X-A-Leu-Y
式中，
A是丝氨酸(Ser)或谷氨酰胺(Gln)；
X是氢、酪氨酸(Tyr)或半胱氨酸(Cys)；
Y是氢、酪氨酸(Tyr)或谷氨酸(Glu)；
X及Y无法同时为氢；
-是肽键，
其中，所述肽选自SEQ ID NO：1、3及4所组成的群的肽。
2.根据权利要求1所述的肽在用于制备能够预防或治疗糖尿病或糖尿病伤口的药物中的用途，其特征在于，
所述肽为SEQ ID NO：3的肽。
3.一种药物组合物在用于制备能够预防或治疗糖尿病或糖尿病伤口的药物中的用途，其特征在于，
所述药物组合物包含权利要求1或2所述的3个或4个氨基酸所构成的肽作为活性成份。
4.根据权利要求3所述的药物组合物在用于制备能够预防或治疗糖尿病或糖尿病伤口的药物中的用途，其特征在于，
所述药物组合物具有透皮吸收制剂的剂型。
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