WO2018147624A1 - 인슐린의 a 사슬로부터 유래된 펩타이드 단편 및 이를 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병성 창상의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

인슐린의 a 사슬로부터 유래된 펩타이드 단편 및 이를 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병성 창상의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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한장희
김창겸
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강원대학교산학협력단
(주) 수파드엘릭사
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Definitions

  • the present invention relates to a peptide fragment derived from insulin A-chain (insulin A-chain) and a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes or diabetic wounds comprising the same as an active ingredient.
  • Insulin is a peptide hormone produced by beta cells in pancreatic islets. Insulin regulates the metabolism of carbohydrates, fats and proteins by promoting the uptake of glucose from the blood into fat, liver and skeletal muscle cells.
  • Human insulin protein consists of 51 amino acids and has a molecular weight of 5808 Da. Insulin is a dimer of the A and B chains and is connected to each other by disulfide bonds.
  • Diabetes is a metabolic disease characterized by high blood glucose resulting from decreased insulin secretion, decreased glucose use, or increased glucose production. Diabetes causes various complications, for example diabetic wounds such as diabetic foot ulcers and the like.
  • human insulin preparations or recombinant insulin preparations are used in the clinic.
  • a recombinant insulin formulations have been used Hugh bite R TM (Humulin R TM) injection, Hugh bite N TM (Humulin N TM) injections.
  • the conventional insulin preparation is a high molecular weight protein preparation, it is used in the form of an injection, which is inconvenient in use, and requires attention to storage and handling of the preparation.
  • the conventional insulin preparation is a high molecular weight protein preparation, it is used in the form of an injection, which is inconvenient in use, and requires attention to storage and handling of the preparation.
  • the inventors have designed various peptide fragments having three or four amino acids from insulin and evaluated their activity. Surprisingly, the inventors have found that certain peptide fragments having three or four amino acids derived from the 11-17th amino acid sequence in the insulin A-chain of insulin have insulin-like activity. In particular, the inventors have found that the specific peptide fragment induces endocytosis of the insulin receptor and increases glucose uptake of cells by translocation of glucose transporters to the cell membrane, and also increases cell migration and proliferation. It was.
  • the present invention aims to provide specific peptide fragments derived from the A chain of insulin.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes or diabetic wounds comprising a specific peptide fragment derived from the A chain of the insulin as an active ingredient.
  • A is serine (Ser) or glutamine (Gln);
  • X is hydrogen, tyrosine (Tyr) or cysteine (Cys);
  • Y is hydrogen, tyrosine (Tyr) or glutamic acid (Glu);
  • X and Y may not be hydrogen at the same time; -Is a peptide bond.
  • the peptide of the present invention may be a peptide represented by Formula 1a:
  • X 1 is hydrogen or cysteine (Cys); Y 1 is hydrogen or tyrosine (Tyr); X1 and Y1 may not be hydrogen at the same time; -Is a peptide bond.
  • the peptide of the present invention may be a peptide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 3, and 4, preferably may be a peptide of SEQ ID NO: 3.
  • the peptide of the present invention may be a peptide represented by Formula 1b:
  • X2 is hydrogen or tyrosine (Tyr); Y2 is hydrogen or glutamic acid (Glu); X2 and Y2 may not be hydrogen at the same time; -Is a peptide bond.
  • the peptide of the present invention may be a peptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, and 6.
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes or diabetic wounds comprising a peptide consisting of the three or four amino acids as an active ingredient.
  • the peptide may be a peptide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 6, preferably may be a peptide of SEQ ID NO: 3.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may have a dosage form of transdermal delivery system.
  • the present invention it has been found by the present invention that certain peptide fragments or small peptides derived from the A chain of insulin have insulin-like activity.
  • the specific peptide fragments induce endocytosis through the insulin receptor and increase the glucose influx of cells by translocation of the glucose transporter to the cell membrane, and also increase the migration and proliferation of the cells.
  • the peptide of the present invention can be usefully applied for the prevention or treatment of diabetes and diabetic wounds.
  • the peptide of the present invention is a small molecule material of 500 Da or less, it can be used not only as an injection but also in the form of a transdermal delivery system.
  • the peptide of the present invention is a stable molecule formed through covalent bonds, the peptide can be stored without being influenced by temperature, and is easy to handle and store because the shelf life is very long.
  • the peptide of the present invention can be prepared simply and at a lower cost than conventional insulin preparations.
  • Figure 1 shows the results of evaluating insulin-like activity by measuring the physical binding of Grb2 and SOS1 through a PLA (proximity ligation assay) method after the peptide of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of immunofluorescence (immunofluorescence) analysis (RNA of Figure 2) and RNA interference (RNA interference) analysis results to confirm whether the peptide of the present invention binds to the insulin receptor inducing endocytosis Indicates.
  • FIG. 3 and 4 show cell migration test results (FIG. 3) and proliferation test results (FIG. 4) to confirm whether the peptides of the present invention promote cell migration and proliferation.
  • Figure 5 shows the results of 2-NBDG Glucose uptake assay to evaluate the activity of the peptide of the present invention on glucose influx.
  • Figure 6 shows the results of the 2-NBDG glucose influx test after inhibiting the expression of the insulin receptor using siRNA to confirm whether the peptide of the present invention mediates the insulin receptor mediated insulin.
  • Figure 7 shows the results of evaluating the cell membrane potential of the glucose transporter in HaCaT cells by immunofluorescence analysis.
  • the present invention provides three or four obtained from the 11-17th amino acid sequence of the insulin A-chain (ie, Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu). tetramer), that is, the present invention provides a peptide consisting of three or four amino acids represented by the following general formula (1):
  • A is serine (Ser) or glutamine (Gln);
  • X is hydrogen, tyrosine (Tyr) or cysteine (Cys);
  • Y is hydrogen, tyrosine (Tyr) or glutamic acid (Glu);
  • X and Y may not be hydrogen at the same time; -Is a peptide bond.
  • a peptide in which X is "hydrogen” means a peptide in which no peptide bond exists at a corresponding position, and thus A, that is, serine or glutamine (Gln) is an N-terminal amino acid of the peptide. do.
  • the peptide Y is "hydrogen” refers to a peptide that does not have a peptide bond in the position, thus means that leucine (Leu) is the C-terminal amino acid of the peptide.
  • the peptides of the present invention have insulin-like activity, in particular induce endocytosis through insulin receptors, increase glucose uptake of cells by translocation of glucose transporters to cell membranes, and also promote cell migration and proliferation. Increase.
  • the peptide of the present invention may be a peptide represented by Formula 1a:
  • X 1 is hydrogen or cysteine (Cys); Y 1 is hydrogen or tyrosine (Tyr); X1 and Y1 may not be hydrogen at the same time; -Is a peptide bond.
  • a peptide in which X1 is “hydrogen” means a peptide in which no peptide bond exists at a corresponding position, and therefore, serine (Ser) means an N-terminal amino acid of the peptide.
  • the peptide Y1 is "hydrogen” means a peptide that does not have a peptide bond in the position, thus means that leucine (Leu) is the C-terminal amino acid of the peptide.
  • the peptide represented by Formula 1a may be preferably a peptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, and 4, and more preferably, a peptide of SEQ ID NO: 3.
  • the peptide of the present invention may be a peptide represented by Formula 1b:
  • X2 is hydrogen or tyrosine (Tyr); Y2 is hydrogen or glutamic acid (Glu); X2 and Y2 may not be hydrogen at the same time; -Is a peptide bond.
  • a peptide in which X 2 is “hydrogen” means a peptide having no peptide bond at a corresponding position, and thus glutamine (Gln) is an N-terminal amino acid of the peptide.
  • the peptide Y2 is "hydrogen” means a peptide that does not have a peptide bond in the position, thus means that leucine (Leu) is the C-terminal amino acid of the peptide.
  • the peptide represented by Formula 1b may be a peptide preferably selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, and 6.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes or diabetic wounds comprising a peptide consisting of three or four amino acids represented by the formula (1) as an active ingredient.
  • the diabetic wounds are typical of diabetic foot ulcers.
  • the peptide may be a peptide consisting of three or four amino acids represented by Formula 1a or 1b, which are as described above.
  • the peptide may be a peptide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 6, preferably may be a peptide of SEQ ID NO: 3.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, and may include, for example, excipients such as lactose and corn starch, lubricants such as magnesium stearate, known and usable emulsifiers, suspensions, buffers, and isotonic agents. Topics, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in an oral dosage form or parenteral dosage form, preferably in a dosage form such as a transdermal delivery system. It can have a dosage form.
  • a sterile solution of the active ingredient is usually prepared and may include a buffer that can appropriately adjust the pH of the solution, and for intravenous administration Isotonic agents can be included to impart isotonicity to the formulation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of an aqueous solution containing a pharmaceutically acceptable carrier such as saline having a pH of 7.4, and may be locally introduced into the patient's intramuscular blood flow in the form of a solution. have.
  • transdermal formulations include forms of external preparations, emulsions, ointments, patches, and the like, which may be formulated according to conventional pharmaceutical methods.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to a diabetic and / or diabetic wound patient at a dose of about 1 to 10 mg / kg per day. Appropriate dosages will generally vary depending on the age, weight and symptoms of the patient.
  • Peptides of SEQ ID NOS: 1 to 6 were synthesized by the FMOC solid-phase method using an automated synthesizer (PeptrEx-R48, Peptron, Daejeon, Korea). The synthesized peptide was purified and analyzed by reverse-phase HPLC using a C18 analytical RP column (Shiseido capcell pak) (Prominence LC-20AB, Shimadzu, Japan), and mass spectrometer (HP 1100 Series). LC / MSD, Hewlett-Packard, Roseville, USA).
  • Peptides of SEQ ID NO: 1 to 6 were each dissolved in PBS to prepare a concentration of 1 M.
  • the obtained protein solution was used in the following test example.
  • the control group was not treated.
  • Cells in each well were washed with PBS and fixed by treatment with 2% formaldehyde for 15 minutes, followed by treatment with 0.1% TritonX-100 for 5 minutes to increase antibody permeability into cells.
  • Add Grb2 antibody (Santa cruz, CA, USA) and SOS1 antibody (Santa cruz, CA, USA) add PLA probe according to manufacturer's instructions using In situ PLA kit (Sigma-Aldrich), and then hybridi Hybridization, ligation, amplification and mounting steps were performed.
  • Plasma signals detected in each cell were measured by confocal laser microscopy (Olympus fluoview FW1000; Olympus, Tokyo, Japan) to quantify the physical interaction of Grb2 and SOS1 antibodies.
  • Immunofluorescence analysis was performed to confirm whether the peptides of the present invention bind to insulin receptors, such as insulin, to induce endocytosis. It was prepared by binding a fluorescent material (FITC) to the peptide of SEQ ID NO: 3. After pretreatment of HaCaT cells (CLS 300493) in the same manner as in Test Example 1, a peptide solution of SEQ ID NO: 3 bound to fluorescent substance was added to a final concentration of 1 ⁇ M, followed by 5, 15, 30, and 60 minutes. Treatment was for minutes.
  • FITC fluorescent material
  • RNA interference analysis was performed to confirm whether the effect of the peptide of the present invention on endocytosis is mediated by the insulin receptor.
  • HaCaT cells CLS 300493 were cultured in DMEM serum medium to 50-60% confluency, followed by insulin receptor siRNA (Santa cruz, CA, USA) (untreated, 10 nM treated, or 30 nM treated).
  • insulin receptor siRNA Santa cruz, CA, USA
  • Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen
  • Treatment was carried out at a concentration of 5 minutes.
  • the cell migration test was performed using Culture insert 2 Well (ibidi TM ) divided into two culture spaces.
  • the cells are cultured on the plate, an empty space is formed in the center, the cells are attached to both sides, and the insert wells are separated and further cultured to move both cells to the empty space of the plate.
  • the insert wells were isolated and the peptide of SEQ ID NO: 3 (0.01 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M) or humulin R (1 ⁇ M) After treatment for 5 minutes, washed with PBS and replaced with cell culture medium (DMEM serum medium) after 10 hours and 13 hours to observe the movement of the cells through a phase contrast microscope.
  • DMEM serum medium cell culture medium
  • the cell proliferation test was performed by dispensing 5 ⁇ 10 3 HaCaT cells (CLS 300493) per well into each well of a 96-well plate and then peptides of SEQ ID NO: 3 so that the concentrations in serum free media were 0.1, 1 and 10 ⁇ M. The added solution (total volume: 90 ⁇ l) was treated. Cell proliferation was observed using a microplate reader (Versa Max, USA) for 24, 48 and 72 hours, 10 ⁇ l of CCK-8 (cell counting kit-8) solution for 2 hours at the same time each day for measurement. Treated.
  • FIGS. 3 and 4 The cell migration and proliferation test results are shown in FIGS. 3 and 4, respectively. 3 and 4, similar to humulin R used as a positive control group, it can be seen that the concentration and cell migration and proliferation increased, so that the peptide of the present invention is used for diabetic wounds. It can be found useful for treatment.
  • Glucose transporter (GLUT4) is translocation to the cell membrane by insulin stimulation to increase the glucose influx of cells.
  • 2-NBDG Glucose uptake assay and immunofluorescence assay were performed.
  • 2-NBDG Glucose is a fluorescent deoxyglucose analogue that, like glucose, is introduced into cells by glucose transporters but accumulates without metabolism, so the amount of fluorescence accumulated can confirm the influx of glucose. .
  • 2-NBDG glucose influx assay was performed using the 2-NBDG Glucose uptake kit (Biovision).
  • a solution containing 2-NBDG Reagent and Glucose Uptake Enhancer was prepared and treated for 1 hour, and then washed with the enclosed cold 1X Analysis solution, followed by confocal laser microscopy (Olympus fluoview FW1000; Olympus, Tokyo, Japan), and the results are shown in FIG. 5. From the results of FIG. 5, it can be seen that glucose influx is increased in a concentration-dependent manner similar to Humulin R used as a positive control group, which means that the peptide of the present invention transfers the glucose transporter to the cell membrane, similar to insulin, to the cell glucose. Increase influx.
  • a solution containing 2-NBDG Reagent and Glucose Uptake Enhancer was prepared and treated for 1 hour, and then washed with the enclosed cold 1X Analysis solution, followed by confocal laser microscopy (Olympus fluoview FW1000; Olympus, Tokyo, Japan), and the results are shown in FIG. 6. From the results of FIG. 6, it can be seen that glucose influx is decreased in the test group transiently transfected with insulin receptor siRNA, which indicates that the peptide of the present invention affects glucose influx through the insulin receptor similarly to insulin. Indicates.
  • HaCaT cells (CLS 300493) were treated for 5 minutes in serum-free DMEM medium at the concentrations of 0.001, 0.01 and 0.1 ⁇ M, respectively, with the peptides of SEQ ID NO: 3 and the humulin R (positive control).
  • Cells were washed with PBS solution and treated with GLUT4 antibody (Santa cruz, CA, USA) for 1 hour, followed by 40 minutes of rhodamine red followed by confocal laser microscopy (Olympus fluoview FW1000; Olympus, Tokyo, Japan), and the results are shown in FIG. 7. From the results of FIG. 7, it can be seen that glucose transporter (GLUT4) is increased in the cell membrane in a concentration-dependent manner similar to humulin R used as a positive control group, which indicates that the peptide according to the present invention functions similar to insulin. Indicates.

Abstract

본 발명은 인슐린의 A 사슬로부터 유래된 펩타이드 단편 및 이를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병성 창상의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 인슐린 수용체를 통하여 엔도사이토시스를 유도하고, 포도당 수송체를 세포막에 전위함으로써 세포의 포도당 유입을 증가시키는 활성을 가지며, 세포의 이동 및 증식이 증가시키는 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 당뇨병 및 당뇨병성 창상의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

인슐린의 A 사슬로부터 유래된 펩타이드 단편 및 이를 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병성 창상의 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 인슐린의 A 사슬(insulin A-chain)로부터 유래된 펩타이드 단편 및 이를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병성 창상의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
인슐린은 췌장 소도(pancreatic islets)의 베타 세포에 의해 생성되는 펩타이드 호르몬이다. 인슐린은 혈액으로부터 지방, 간, 및 골격근세포로의 글루코오즈의 흡수를 촉진함으로써, 탄수화물, 지방, 단백질의 대사를 조절한다. 인간의 인슐린 단백질은 51개 아미노산으로 구성되어 있으며, 5808 Da의 분자량을 갖는다. 인슐린은 A 사슬과 B 사슬의 이량체(dimer)이며, 이황화 결합에 의해 서로 연결되어 있다.
당뇨병(diabetes)은 인슐린 분비 감소, 글루코오즈 사용 감소 또는 글루코오즈 생성 증가로부터 야기되는 높은 혈중 글루코오즈에 의해 특징되는 대사성 질환이다. 당뇨병은 다양한 합병증을 야기하며, 예를 들어 당뇨병성 족부궤양(diabetic foot ulcers) 등과 같은 당뇨병성 창상(diabetic wounds)을 야기한다. 현재 인슐린 요법이 요구되는 당뇨병의 치료를 위하여, 인간 인슐린(human insulin) 제제 또는 재조합 인슐린(recombinant insulin) 제제가 임상에서 사용되고 있다. 예를 들어, 재조합 인슐린 제제로서, 휴물린 RTM (Humulin RTM) 주사제, 휴물린 NTM (Humulin NTM) 주사제가 사용되고 있다.
한편, 종래의 인슐린 제제는 높은 분자량의 단백질 제제이므로 주사제의 형태로 사용되고 있어 사용상 불편함이 있고, 또한 제제의 보관 및 취급에 주의를 요한다. 또한, 고순도의 인슐린을 제조하기 위해서는 생산 및 정제 과정에서 고비용이 소요될 뿐만 아니라 긴 시간이 소요되는 문제점이 있다.
본 발명자들은 인슐린으로부터 3개(trimer) 또는 4개(tetramer)의 아미노산을 갖는 다양한 펩타이드 단편을 설계하고 이들의 활성을 평가하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 인슐린의 A 사슬(insulin A-chain) 중 11∼17 번째 아미노산 서열로부터 유래한 3개 또는 4개의 아미노산을 갖는 특정 펩타이드 단편이 인슐린-유사 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 상기 특정 펩타이드 단편이 인슐린 수용체의 엔도사이토시스를 유도하며, 포도당 수송체를 세포막에 전위(translocation)함으로써 세포의 포도당 유입을 증가시키고, 또한 세포의 이동 및 증식을 증가시킨다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 인슐린의 A 사슬로부터 유래된 특정 펩타이드 단편을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 인슐린의 A 사슬로부터 유래된 특정 펩타이드 단편을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병성 창상의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 하기 화학식 1로 표시되는 3개 또는 4개의 아미노산으로 구성된 펩타이드가 제공된다:
<화학식 1>
X-A-Leu-Y
식 중, A는 세린(Ser) 또는 글루타민(Gln)이고; X는 수소, 타이로신(Tyr) 또는 시스테인(Cys)이고; Y는 수소, 타이로신(Tyr) 또는 글루탐산(Glu)이고; X 및 Y가 동시에 수소일 수 없고; -는 펩타이드 결합이다.
일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 하기 화학식 1a로 표시되는 펩타이드일 수 있다:
<화학식 1a>
X1-Ser-Leu-Y1
식 중, X1은 수소 또는 시스테인(Cys)이고; Y1은 수소 또는 타이로신(Tyr)이고; X1 및 Y1이 동시에 수소일 수 없고; -는 펩타이드 결합이다. 상기 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1, 3, 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3의 펩타이드일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 하기 화학식 1b로 표시되는 펩타이드일 수 있다:
<화학식 1b>
X2-Gln-Leu-Y2
식 중, X2은 수소 또는 타이로신(Tyr)이고; Y2은 수소 또는 글루탐산(Glu)이고; X2 및 Y2가 동시에 수소일 수 없고; -는 펩타이드 결합이다. 상기 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 2, 5, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 3개 또는 4개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병성 창상의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3의 펩타이드일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 경피투여제제(transdermal delivery system)의 투여 형태를 가질 수 있다.
인슐린의 A 사슬로부터 유래된 특정 펩타이드 단편(peptide fragments 또는 small peptides)이 인슐린-유사 활성을 가진다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 특히, 상기 특정 펩타이드 단편이 인슐린 수용체를 통하여 엔도사이토시스를 유도하며, 포도당 수송체를 세포막에 전위(translocation)함으로써 세포의 포도당 유입을 증가시키고, 또한 세포의 이동 및 증식을 증가시킨다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 당뇨병 및 당뇨병성 창상(diabetic wounds)의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 500 Da 이하의 소분자 물질이므로, 주사제로서 뿐만 아니라 경피투여제제(transdermal delivery system) 형태로도 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명의 펩타이드는 공유결합을 통해 형성된 안정한 분자이므로 온도의 영향을 받지 않고 보관이 가능하며 보존기간도 매우 길기 때문에 취급 및 보관이 용이하다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 종래의 인슐린 제제에 비하여 저비용으로 간단하게 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 펩타이드를 세포에 처리한 후, PLA(proximity ligation assay) 방법을 통하여 Grb2와 SOS1의 물리적 결합을 측정함으로써 인슐린-유사 활성을 평가한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 펩타이드가 인슐린 수용체에 결합하여 엔도사이토시스를 유도하는지 확인하기 위한 면역형광(immunofluorescence) 분석 결과(도 2의 A) 및 RNA 간섭(RNA interference) 분석 결과(도 2의 B)를 나타낸다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 펩타이드가 세포의 이동과 증식을 촉진하는지 확인하기 위한 세포 이동 시험 결과(도 3) 및 증식 시험 결과(도 4)를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 펩타이드의 포도당 유입에 대한 활성을 평가하기 위한 2-NBDG 포도당 유입(2-NBDG Glucose uptake) 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 펩타이드가 인슐린 수용체를 매개하여 포도당 유입을 증가시키는지 확인하기 위하여, siRNA를 이용하여 인슐린 수용체의 발현을 억제시킨 후 2-NBDG 포도당 유입 시험을 수행한 결과를 나타낸다.
도 7은 면역형광(immunofluorescence) 분석을 통하여 HaCaT 세포에서의 포도당 수송체의 세포막 전위를 평가한 결과를 나타낸다.
본 발명은 인슐린의 A 사슬(insulin A-chain) 중 11∼17 번째 아미노산 서열(즉, Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu)로부터 제작된 얻어진 3개(trimer) 또는 4개(tetramer)의 아미노산을 갖는 펩타이드를 제공한다, 즉, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 3개 또는 4개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 제공한다:
<화학식 1>
X-A-Leu-Y
식 중, A는 세린(Ser) 또는 글루타민(Gln)이고; X는 수소, 타이로신(Tyr) 또는 시스테인(Cys)이고; Y는 수소, 타이로신(Tyr) 또는 글루탐산(Glu)이고; X 및 Y가 동시에 수소일 수 없고; -는 펩타이드 결합이다.
상기 화학식 1에서, X가 "수소"인 펩타이드는 해당 위치에 펩타이드 결합이 존재하지 않는 펩타이드를 의미하며, 따라서 A, 즉 세린(Ser) 또는 글루타민(Gln)이 해당 펩타이드의 N-말단 아미노산임을 의미한다. 또한, Y가 "수소"인 펩타이드는 해당 위치에 펩타이드 결합이 존재하지 않는 펩타이드를 의미하며, 따라서 류신(Leu)이 해당 펩타이드의 C-말단 아미노산임을 의미한다.
본 발명의 펩타이드는 인슐린-유사 활성을 가지며, 특히 인슐린 수용체를 통하여 엔도사이토시스를 유도하며, 포도당 수송체를 세포막에 전위(translocation)함으로써 세포의 포도당 유입을 증가시키고, 또한 세포의 이동 및 증식을 증가시킨다.
일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 하기 화학식 1a로 표시되는 펩타이드일 수 있다:
<화학식 1a>
X1-Ser-Leu-Y1
식 중, X1은 수소 또는 시스테인(Cys)이고; Y1은 수소 또는 타이로신(Tyr)이고; X1 및 Y1이 동시에 수소일 수 없고; -는 펩타이드 결합이다.
상기 화학식 1a에서, X1이 "수소"인 펩타이드는 해당 위치에 펩타이드 결합이 존재하지 않는 펩타이드를 의미하며, 따라서 세린(Ser)이 해당 펩타이드의 N-말단 아미노산임을 의미한다. 또한, Y1이 "수소"인 펩타이드는 해당 위치에 펩타이드 결합이 존재하지 않는 펩타이드를 의미하며, 따라서 류신(Leu)이 해당 펩타이드의 C-말단 아미노산임을 의미한다.
상기 화학식 1a로 표시되는 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 1, 3, 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 3의 펩타이드일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 하기 화학식 1b로 표시되는 펩타이드일 수 있다:
<화학식 1b>
X2-Gln-Leu-Y2
식 중, X2은 수소 또는 타이로신(Tyr)이고; Y2은 수소 또는 글루탐산(Glu)이고; X2 및 Y2가 동시에 수소일 수 없고; -는 펩타이드 결합이다.
상기 화학식 1b에서, X2가 "수소"인 펩타이드는 해당 위치에 펩타이드 결합이 존재하지 않는 펩타이드를 의미하며, 따라서 글루타민(Gln)이 해당 펩타이드의 N-말단 아미노산임을 의미한다. 또한, Y2가 "수소"인 펩타이드는 해당 위치에 펩타이드 결합이 존재하지 않는 펩타이드를 의미하며, 따라서 류신(Leu)이 해당 펩타이드의 C-말단 아미노산임을 의미한다.
상기 화학식 1b로 표시되는 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 2, 5, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 3개 또는 4개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병성 창상의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 당뇨병성 창상(diabetic wounds)은 당뇨병성 족부궤양(diabetic foot ulcers)이 대표적이다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 펩타이드는 화학식 1a 또는 1b로 표시되는 3개 또는 4개의 아미노산으로 구성된 펩타이드일 수 있으며, 이들은 각각 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3의 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 공지되어 사용가능한 유화제, 현탁제, 완충제, 등장화제 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 경구투여 제제 형태(oral dosage form) 또는 비경구투여 제제 형태(parenteral dosage form) 형태로 제제화될 수 있으며, 바람직하게는 경피투여제제(transdermal delivery system) 등의 투여 형태(dosage form)를 가질 수 있다. 예를 들어, 근육내, 복강내, 피하 및 정맥 내 투여 형태의 경우, 통상 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태가 될 수 있으며, 용액제의 형태로 국소적으로 환자의 근육내 혈류에 도입할 수 있다. 또한, 경피투여제제는 외용액제, 에멀젼, 연고제, 패치 등의 형태를 포함하며, 이는 통상의 제제학적 방법에 따라 제제화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 당뇨병 및/또는 당뇨병성 창상 환자에게 1일 약 1 내지 10 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 환자의 연령, 체중 및 증상에 따라 일반적으로 변경될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 펩타이드의 합성
서열번호 1 내지 6의 펩타이드(하기 표 1 참조)는 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)를 이용하여 FMOC 고체-상 방법(FMOC solid-phase method)으로 합성하였다. 합성된 펩타이드는 C18 분석용 RP 컬럼(Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.
펩타이드명칭 서열번호 아미노산 서열
IDP1 서열번호 1 Cys-Ser-Leu-Tyr
IDP2 서열번호 2 Tyr-Gln-Leu-Glu
IDP3 서열번호 3 Cys-Ser-Leu
IDP4 서열번호 4 Ser-Leu-Tyr
IDP5 서열번호 5 Tyr-Gln-Leu
IDP6 서열번호 6 Gln-Leu-Glu
실시예 2. 펩타이드를 포함하는 조성물의 제조
서열번호 1 내지 6의 펩타이드를 PBS에 각각 용해시켜, 1 M의 농도가 되도록 제조하였다. 얻어진 단백질 용액을 하기 시험예에서 사용하였다.
시험예 1. 인슐린-유사 활성 평가
인슐린 신호가 세포 안으로 전달되면 Grb2와 SOS1의 물리적 결합이 증가하게 된다. 본 발명의 펩타이드를 세포에 처리한 후, PLA(proximity ligation assay) 방법을 통하여 Grb2와 SOS1의 물리적 결합을 측정함으로써 인슐린-유사 활성을 평가하였다. 24-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 4.5 X 104 개의 HaCaT 세포(CLS 300493)를 DMEM 혈청배지에 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 배지 중 서열번호 1 내지 6의 펩타이드의 농도가 1 μM이 되도록 실시예 2의 펩타이드 용액을 가한 다음, 5분간 동일한 조건에서 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로는 휴물린 R(Humulin R)을 동일한 농도로 처리하였다. 대조군은 아무 처리를 하지 않았다. 각 웰의 세포를 PBS로 세정하고 2% 포름알데히드로 15분 동안 처리하여 고정시킨 후, 0.1% TritonX-100을 5분간 처리하여 세포 안으로의 항체 투과성을 높였다. Grb2 항체(Santa cruz, CA, USA) 및 SOS1 항체(Santa cruz, CA, USA)를 첨가하고, In situ PLA 키트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 PLA 프로브를 가한 다음, 하이브리디제이션(hybridization), 라이게이션(ligation), 증폭(amplification) 및 마운팅 단계를 수행하였다. 각각의 세포에서 검출되는 발광 신호(PLA signals)를 공초점 레이져 현미경(Olympus fluoview FW1000; Olympus, Tokyo, Japan)으로 측정하여 Grb2 및 SOS1 항체의 물리적인 상호작용을 정량하였다. 그 결과는 도 1과 같다. 도 1의 결과로부터, 본 발명의 펩타이드는 미-처리 대조군에 비하여 항체의 상호작용이 현저하게 증가하였으며, 따라서 인슐린-유사 활성을 가짐을 확인할 수 있다. 특히, 서열번호 3의 펩타이드를 처리한 군은 인슐린 제제인 휴물린 R(Humulin R)을 처리한 양성 대조군에 비해 유의성 있게 더 높은 항체의 상호작용을 나타내었다.
시험예 2. 면역형광(immunofluorescence) 분석
본 발명의 펩타이드가 인슐린과 같이 인슐린 수용체에 결합하여 엔도사이토시스(endocytosis)를 유도하는지 확인하기 위하여 면역형광(immunofluorescence) 분석을 수행하였다. 서열번호 3의 펩타이드에 형광물질(FITC)을 결합시켜 준비하였다. 시험예 1과 동일한 방법으로 HaCaT 세포(CLS 300493)를 전처리한 후에 최종 농도가 1 μM이 되도록 형광 물질을 결합시킨 서열번호 3의 펩타이드 용액을 가한 다음, 5분, 15분, 30분, 및 60분 동안 처리하였다. 세포를 PBS 용액으로 3번 세정한 후 슬라이드에 마운팅하여 표본을 제조한 다음, 공초점 레이저 현미경(Olympus fluoview FW1000; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였으며, 그 결과는 도 2의 A와 같다. 도 2의 A의 결과로부터, 처리후 5분에 가장 높은 엔도사이토시스를 나타내었다. 세포내에서 인슐린이 인슐린 수용체에 결합한 후 엔도사이토시스(endocytosis, internalization)되고 이후 분해(degradation)되게 된다. 따라서, 상기 결과는 펩타이드 처리 5분 후에 가장 높은 수준으로 형광이 나타나며, 이후에 분해되어 형광이 감소한다는 것을 의미한다.
상기 시험결과에 근거하여, 엔도사이토시스에 대한 본 발명의 펩타이드의 효과가 인슐린 수용체에 의해 매개되는지 확인하기 위하여 RNA 간섭(RNA interference) 분석을 수행하였다. HaCaT 세포(CLS 300493)를 DMEM 혈청배지에서 50∼60% 콘플루언시(confluency)까지 배양한 후, 인슐린 수용체 siRNA(Santa cruz, CA, USA)(무처리, 10 nM 처리, 또는 30 nM 처리) 및 리포펙타민 RNAiMAX(Lipofectamine RNAiMAX)(Invitrogen)를 사용하여 제조사 지침에 따라 일시적으로 형질감염(transfection)시켜 인슐린 수용체의 발현을 억제시킨 다음, 형광물질을 결합시킨 서열번호 3의 펩타이드를 1 μM의 농도로 5분 동안 처리하였다. 각군의 형광강도를 공초점 레이저 현미경(Olympus fluoview FW1000; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였으며, 그 결과는 도 2의 B와 같다. 도 2의 B의 결과로부터, 인슐린 수용체 siRNA를 일시적으로 형질감염시킨 시험군에서 엔도사이토시스가 감소하는 것을 알 수 있으며, 이는 본 발명의 펩타이드가 인슐린과 마찬가지로 인슐린 수용체를 통하여 엔도사이토시스가 유도된다는 것을 나타낸다.
시험예 3. 세포의 이동 및 증식 활성 평가
본 발명의 펩타이드가 세포의 이동(migration)과 증식(proliferation)을 촉진하는지 확인하기 위하여 세포 이동 및 증식 시험을 수행하였다.
세포 이동 시험은 배양 공간이 두개로 나뉘어진 Culture insert 2 Well(ibidiTM)를 사용하였다. 세포를 상기 플레이트에 배양하면 가운데에 빈 공간이 생기고 양쪽으로 세포가 부착되고 인서트 웰(insert well)을 분리하여 추가로 배양하면 양쪽의 세포들이 플레이트의 빈 공간으로 이동하게 된다. HaCaT 세포(CLS 300493)를 이 플레이트에 90% 콘플루언시까지 배양한 후 인서트 웰을 분리하고, 서열번호 3의 펩타이드(0.01 μM, 0.1 μM, 1 μM) 또는 휴물린 R(1 μM)을 5분 동안 처리한 후, PBS로 세정하고 세포배양 배지(DMEM 혈청배지)로 교체하여 10 시간 및 13 시간 후 위상차 현미경을 통하여 세포의 이동을 관찰하였다.
세포 증식 시험은 96-웰 플레이트의 각 웰에 웰당 5x103 개의 HaCaT 세포(CLS 300493)를 분주한 후 무혈청 배지(serum free media) 중의 농도가 0.1, 1 및 10 μM이 되도록 서열번호 3의 펩타이드를 첨가한 용액(총 부피: 90 μl)을 처리하였다. 24, 48 및 72시간 동안 세포의 증식을 마이크로플레이트 리더(Versa Max, USA)를 사용하여 관찰하였으며, 측정을 위하여 매일 동일한 시간에 CCK-8 (cell counting kit-8) 용액 10 μl를 2시간 동안 처리하였다.
상기 세포의 이동 및 증식 시험결과는 각각 도 3 및 도 4와 같다. 도 3 및 도 4의 결과로부터, 양성대조군으로 사용한 휴물린 R과 유사하게, 농도의존적으로 세포의 이동 및 증식이 증가함을 확인할 수 있으며, 따라서 본 발명의 펩타이드가 당뇨병성 창상(diabetic wounds)의 치료에 유용함을 확인할 수 있다.
시험예 4. 포도당 유입 활성 평가
포도당 수송체(GLUT4)는 인슐린 자극에 의해 세포막으로 전위(translocation)하여 세포의 포도당 유입을 증가시키게 된다. 본 발명의 펩타이드가 이러한 포도당 유입에 기여하는지 확인하기 위하여 2-NBDG 포도당 유입(2-NBDG Glucose uptake) 분석 및 면역형광분석을 수행하였다.
2-NBDG 포도당은 형광을 띠는 데옥시글루코오즈 유사체로서, 포도당과 마찬가지로 포도당 수송체에 의해 세포 내로 유입되지만 실제 대사가 일어나지 않고 축적되므로, 축적된 형광의 양으로 포도당의 유입 정도를 확인할 수 있다. 2-NBDG 포도당 유입 분석은 2-NBDG Glucose uptake 키트(Biovision)를 사용하였다. 구체적으로, 24-웰플레이트의 각 웰에 3x104 개의 HaCaT 세포(CLS 300493)를 분주하고 DMEM 혈청배지와 함께 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, PBS로 세정하고 서열번호 3의 펩타이드 및 휴물린 R을 무혈청 배지 중의 농도가 각각 0.001μM, 0.01 μM, 및 0.1 μM이 되도록 처리하여 5분 동안 인큐베이션하였다. 제조사의 지침에 따라 2-NBDG Reagent 및 Glucose Uptake Enhancer가 혼합된 용액을 제조하여 1시간 동안 처리한 후, 동봉되어 있는 차가운 1X Analysis 용액으로 세정 후 공초점 레이저 현미경(Olympus fluoview FW1000; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였으며, 그 결과는 도 5와 같다. 도 5의 결과로부터, 양성대조군으로 사용된 Humulin R과 유사하게 농도 의존적으로 포도당 유입이 증가하는 것을 알 수 있으며, 이는 본 발명의 펩타이드가 인슐린과 유사하게 포도당 수송체를 세포막으로 전위하여 세포의 포도당 유입을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
상기 시험결과에 근거하여, 본 발명의 펩타이드가 인슐린처럼 인슐린 수용체를 매개하여 포도당 유입을 증가시키는지 확인하기 위하여, siRNA를 이용하여 인슐린 수용체의 발현을 억제시킨 후 2-NBDG 포도당 유입 시험을 수행하였다. HaCaT 세포(CLS 300493)를 DMEM 혈청배지에서 50∼60% 콘플루언시까지 배양한 후, 인슐린 수용체 siRNA(Santa cruz, CA, USA)(무처리, 10 nM 처리, 또는 30 nM 처리) 및 리포펙타민 RNAiMAX(Lipofectamine RNAiMAX)(Invitrogen)를 사용하여 제조사 지침에 따라 일시적으로 형질감염(transfection)시켜 인슐린 수용체의 발현을 억제시킨 다음, 서열번호 3의 펩타이드를 1 μM의 농도로 5분 동안 처리하였다. 제조사의 지침에 따라 2-NBDG Reagent 및 Glucose Uptake Enhancer가 혼합된 용액을 제조하여 1시간 동안 처리한 후, 동봉되어 있는 차가운 1X Analysis 용액으로 세정 후 공초점 레이저 현미경(Olympus fluoview FW1000; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였으며, 그 결과는 도 6과 같다. 도 6의 결과로부터, 인슐린 수용체 siRNA를 일시적으로 형질감염시킨 시험군에서 포도당 유입이 감소하는 것을 알 수 있으며, 이는 본 발명의 펩타이드가 인슐린과 유사하게 인슐린 수용체를 통하여 포도당 유입에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
또한, 면역형광(immunofluorescence) 분석을 통하여 HaCaT 세포에서의 포도당 수송체의 세포막 전위를 평가하였다. 구체적으로, HaCaT 세포(CLS 300493)를 무혈청 DMEM 배지에서 서열번호 3의 페타이드 및 휴물린 R(양성대조군)을 각각 0.001, 0.01 및 0.1 μM의 농도로 5분 동안 처리하였다. 세포를 PBS 용액으로 세정하고 GLUT4 항체(Santa cruz, CA, USA)를 1시간 동안 처리한 다음, 로다민 레드(rhodamine red)를 40분 동안 처리한 후 공초점 레이저 현미경(Olympus fluoview FW1000; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였으며, 그 결과는 도 7과 같다. 도 7의 결과로부터, 양성대조군으로 사용된 휴물린 R과 유사하게 농도 의존적으로 세포막에 포도당 수송체(GLUT4)가 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 펩타이드가 인슐린과 유사한 기능을 한다는 것을 나타낸다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 3개 또는 4개의 아미노산으로 구성된 펩타이드:
    <화학식 1>
    X-A-Leu-Y
    식 중,
    A는 세린(Ser) 또는 글루타민(Gln)이고;
    X는 수소, 타이로신(Tyr) 또는 시스테인(Cys)이고;
    Y는 수소, 타이로신(Tyr) 또는 글루탐산(Glu)이고;
    X 및 Y가 동시에 수소일 수 없고;
    -는 펩타이드 결합이다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 1a로 표시되는 펩타이드:
    <화학식 1a>
    X1-Ser-Leu-Y1
    식 중,
    X1은 수소 또는 시스테인(Cys)이고;
    Y1은 수소 또는 타이로신(Tyr)이고;
    X1 및 Y1이 동시에 수소일 수 없고;
    -는 펩타이드 결합이다.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 1, 3, 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드.
  4. 제2항에 있어서, 서열번호 3의 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 하기 화학식 1b로 표시되는 펩타이드:
    <화학식 1b>
    X2-Gln-Leu-Y2
    식 중,
    X2은 수소 또는 타이로신(Tyr)이고;
    Y2은 수소 또는 글루탐산(Glu)이고;
    X2 및 Y2가 동시에 수소일 수 없고;
    -는 펩타이드 결합이다.
  6. 제5항에 있어서, 서열번호 2, 5, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 3개 또는 4개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병성 창상의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 펩타이드가 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 펩타이드가 서열번호 3의 펩타이드인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 경피투여제제의 투여 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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