KR20160125988A - 리신 22의 엡실론 위치에서의 a22k, desb27, b29r, des b30 아실화 사람 인슐린 유사체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당뇨병 관련 질병의 약물 치료 분야이다. 보다 구체적으로는 본 발명은 사람 인슐린 유사체의 신규한 아실화 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 인슐린 유사체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하고, 당뇨병 관련 질병의 치료 또는 예방을 위한 이러한 유도체의 사용에 관련된다.

Description

리신 22의 엡실론 위치에서의 A22K, DESB27, B29R, DES B30 아실화 사람 인슐린 유사체{AN A22K, DESB27, B29R, DES B30, AT EPSILON POSITION OF LYSINE 22 ACYLATED HUMAN INSULIN ANALOGUE}
본 발명은 당뇨병 관련 질병(medical conditions)의 약물 치료 분야이다. 보다 구체적으로는 본 발명은 사람 인슐린 유사체의 신규한 아실화 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 유도체화된 인슐린 유사체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하고, 당뇨병 관련 질병의 치료 또는 예방을 위한 이러한 유도체의 사용에 관한 것이다.
당뇨병 치료를 위한 인슐린 요법은 수십년간 사용되어 왔다. 인슐린 요법은 보통 매일 인슐린의 수회 주사를 투여하는 것을 수반한다. 이러한 치료법은 보통 매일 하루에 1회 또는 2회 오래 작용하는 기저 주사(basal injection)의 투여와, 식사 때에 속효성(fast-acting) 인슐린의 주사(즉, 식전 사용)를 수반한다. 인슐린 요법에 있어서의 주요 개선점 중의 하나는 초속효성(rapid-acting) 인슐린 유사체의 도입이었다. 하지만, 초속효성 인슐린 유사체로도, 전형적으로 주사후 50 내지 70분이 될 때까지 피크 인슐린 수준은 일어나지 못한다.
따라서 인슐린 주사는 인슐린의 자연적인 시간-작용 프로파일을 재현하지 못한다. 특히, 당뇨병이 없는 사람에 있어서 제1 단계 인슐린 방출의 자연적 스파이크는 식사로부터 포도당의 혈중 진입의 몇 분 내에 혈중 인슐린 수준 상승을 가져온다. 이와는 대조적으로, 주사된 인슐린은 혈액에 단지 서서히 들어가며, 피크 인슐린 수준은 정상적인 사람 인슐린의 주사 후 80 내지 100분 내에 일어난다.
초속효성 인슐린 유사체가 제1 단계 인슐린 방출을 적절하게 모방하지 않기 때문에, 인슐린 요법을 사용하는 당뇨병 환자는 식사의 개시시에 제공된 부적당한 수준의 인슐린을 계속해서 갖게 되고, 식간에는 너무 많은 인슐린이 존재하게 된다. 이러한 인슐린 송달의 지연은 식사 시작 후에 조기에 고혈당증을 초래할 수 있다.
인슐린은 자기 회합(self-association) 성질을 지니며, 그것의 농도는 자기 회합의 주요 요인을 나타낸다. 특히 약학적 제형에 있어서 고농도에서, 인슐린은 2합체, 6합체, 12합체, 및 결정으로 자기 회합할 것이다. 그러나, 인슐린의 생리학적으로 활성인 형태는 인슐린 수용체와 결합하고 생물학적 반응을 촉발하는 단량체이다 .
인슐린 작용의 속효성은 피하 조직으로부터 인슐린이 얼마나 빠르게 흡수되는지에 의존한다. 정상적인 사람 인슐린이 피하 주사될 때, 제형은 주로 2개의 아연 이온을 함유하는 6합체로 구성된다. 그것의 크기로 인해, 6합체 인슐린은 낮은 확산 속도를 가지며, 결과적으로 흡수속도가 더 작은 종보다 더 느리다.
6합체 내에는 화학적 및 물리적 분해에 대해 분자를 안정화시키는 2개의 아연 원자가 위치된다. 주사 후에, 농도 구동된 동적 평형이 피하 조직에서 일어나고, 6합체를 2합체로, 그리고 그 다음, 단량체로 해리를 야기시킨다. 역사적으로, 이들 정상적인 사람 인슐린 제형은 최대 혈장 농도 수준에 도달하려면 대략 120분을 요한다. 정상적인 사람 인슐린보다 더 빠르게 흡수되는 아연-인슐린 제제, 예를 들면, 인슐린 아스파르트 및 인슐린 리스프로가 상용화되어왔다.
무아연(zinc-free) 인슐린 제형은 더 빠른 피하 흡수가 가능하지만, 일반적으로 인슐린에 대해, 무아연 제형의 화학 및 물리적 안정성은 해결해야 할 도전 과제이다.
여러가지 인슐린 유도체가 다른 용도들을 위해 제안되어 왔다.
WO 1998 042749는 폐를 통한 투여를 위한 무아연 인슐린 결정을 기술한다.
US 6960561은 개선된 안정성을 가지는 무아연 및 저아연(low-zinc) 인슐린 제제를 기술한다.
WO 2007/096431은 특히 위치 A22에서 아실화 리신 잔기를 보유하고, 위치 B29에서 아르기닌 잔기를 보유하고, desB30인 유사체를 포함하여, 특정 사람 인슐린 유도체들을 기술하는데, 이 유도체는 생리학적 pH 값에서 가용성이고, 연장된 프로파일의 작용을 가지며, 오래 작용하는 인슐린으로서 사용하기 위한 것이다.
WO 2009/022013은 특히 위치 A22에서 아실화 리신 잔기를 보유하고, 위치 B29에서 아르기닌 잔기를 보유하고, desB30인 유사체를 포함하여, 특정 아실화 인슐린 유사체를 기술하는데, 더 높은 인슐린 수용체 결합 친화도를 갖고, 오래 작용하는 인슐린으로서 사용하기 위한 것이다.
WO 2009/112583은 위치 A22에서 리신 잔기를 보유하고, 위치 B29에서 아르기닌 잔기를 보유하고, desB30인 유사체를 포함하여, 특정 인슐린 유사체를 기술하는데, 개선된 프로테아제 안정성을 나타낸다.
WO 2011/161124 는 특히 위치 A22에서 리신 잔기를 보유하고, 위치 B29에서 아르기닌 잔기를 보유하고, desB30인 유사체를 포함하여, 개선된 안정성을 위해 추가의 이황화 결합을 함유하는 특정 아실화 인슐린 유사체를 기술한다.
WO 2012/171994는 연장된 생체내 활성을 위해, 특히 A22에서 아실화 리신 잔기를 보유하고, 위치 B29에서 아르기닌 잔기를 보유하고, desB30인, 2개 이상의 치환을 포함하는 특정 인슐린 유도체를 기술한다.
WO 2013 063572는 선택적으로 아연이 없는, 고도 농축된 초속효성 인슐린 유사체 제제를 기술한다 .
더욱이, 알부민 결합 부분으로 펩티드와 단백질의 아실화는 펩타이드와 단백질의 작용의 지속기간을 연장시키기 위해 사용되어 왔다.
그러나, 본 발명에 따르는 인슐린 유도체는 보고된 바가 없으며, 식전(prandial) 사용을 위한 속효성 인슐린 유도체로서의 그것의 사용 또한 제안된 적이 없다.
본 발명의 목적은 피하 투여 후에 식후 프로파일을 갖는 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 제형에서 화학적으로 안정적인 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 첨가된 아연 없이 제형에서 화학적으로 안정적인 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 네번째 목적은 제형에서 물리적으로 안정한 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯번째 목적은 첨가된 아연 없이 제형에서 물리적으로 안정한 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 여섯번째 목적은 제형에서 화학적으로 및 물리적으로 안정한 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 일곱번째 목적은 첨가된 아연 없이 제형에서 화학적으로 및 물리적으로 안정한 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 여덟번째 목적은 피하 투여 후에, 현재 시판되는 식전 인슐린에 비해, 간 선호적인(hepatopreferential) 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 아홉번째 목적은 피하 투여 후에, 현재 시판되는 식전 인슐린에 비해, 간 선택적인(hepatoselective) 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 열번째 목적은 식전 피하 투여 후에, 현재 시판되는 식전 인슐린에 비해, 저혈당증을 유발하는 경향이 적은 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 열한번째 목적은 식전 피하 투여 후에, 현재 시판되는 식전 인슐린에 비해, 체중 증가를 유발하는 경향이 적은 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 열두번째 목적은 식전 피하 투여 후에, 현재 시판되는 식전 인슐린에 비해, 저혈당증 및 체중 증가를 유발하는 경향이 적은 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기한 목적들 중 한가지 이상의 조합에 있으며, 구체적으로 특히 제형에 아연의 첨가 없이 제형에서 화학적으로 안정하면서 피하 투여 후에 식후 프로파일을 나타내는 인슐린 유사체의 제공이다.
본 발명자들은 본 발명의 A22K 아실화 인슐린 유도체가 종래 기술의 유사한 인슐린 유도체에 비해 상당히 개선된 성질을 갖는다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 특히 첨가된 아연 이온을 함유하지 않는 제형에서, 종래 기술의 유사한 유도체와 비교할 때, 본 발명의 인슐린 유도체가 더 작은 크기의 분자 응집체와 관련된다는 것을 발견하였다. 더 작은 종들은 더 큰 종들보다 더욱 신속하게 확산하고 결과적으로 더 빠른 흡수가 예상되는 것으로 알려져 있다. 이들 분자 응집체의 크기는 실시예 섹션에서 기술된 바와 같이 예를 들어서 X선 작은 각 산란(Small Angle X-ray Scattering: SAXS)에 의해서 및 SEC-HPLC (크기 배타 HPLC)로 일련의 희석을 수행함으로써 여기서 기술된 바와 같이 측정될 수 있다.
본 발명자들은 또한 본 발명의 인슐린 유도체가 첨가된 아연 이온을 함유하지 않는 제형에서, 종래 기술의 유사한 유도체에 비해, 돼지에의 피하 투여 후 보다 신속하게 흡수되어, 이로써 식전 사용을 위한 인슐린으로서 잠재적인 임상적 이용성을 보여준다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 본 발명의 인슐린 유도체가 첨가된 아연 이온을 함유하지 않는 제형에서, 종래 기술의 유사한 유도체에 비해, 돼지에의 피하 투여 후 더 적은 "테일링(tailing)"과 관련된다는 것을 발견하였다. 더 적은 테일링은 주사된 인슐린의 피하 데포(subcutaneous depot)가 유사한 종래 기술 유사체들보다 더 신속하게 흡수되어, 피하 투여 후 평균 체류 시간(MRT)이 종래 기술의 유사한 아실화 유도체와 비교할 때 본 발명의 인슐린 유도체가 더 짧게 된다는 것을 의미한다.
무아연 제형은 더 빠른 피하 흡수가 가능하나, 일반적으로 인슐린에 대해서, 무아연 제형의 화학적 및 물리적 안정성은 도전 과제이고, 지금까지 단지 바이알에 분배되었을 때 계면활성제의 존재에서만 단지, 인슐린 글루리신 (Apidra?; B3K, B29E 사람 인슐린)으로 가능한 것으로 나타났다.
본 발명자들은 이제 위치 B3에서 치환들을 갖는 본 발명의 A22K 아실화 인슐린 유도체의 서브세트는, 매우 예상외로 전례없이 첨가된 아연 이온이 없고 첨가된 계면활성제가 없는 제형에서 화학적으로 및 물리적으로 모두 안정하다는 것을 발견하였다.
식전 인슐린 요법으로서 아실화 인슐린 유도체를 사용함에 의한 이점은 인슐린 아스파르트, 인슐린 리스프로 또는 인슐린 글루리신과 같이 비아실화 식전 인슐린으로의 치료로 달성된 것들보다 더 높은 혈장 인슐린을 달성한다는 것이다.
본 발명에 따른 A22K 아실화 인슐린 유도체는 피하 투여 후 식후-유사 시간 작용 프로파일을 갖는다.
본 발명에 따라 테트라데칸디오산, 펜타데칸디오산, 또는 헥사테칸디오산 기제 알부민 바인더를 갖는 A22K 아실화 인슐린 유도체는 매우 높은 인슐린 수용체 결합 친화도, 1.5% 사람 혈청 알부민(HSA)의 존재하에 감소되는 친화도를 초래하는 것으로 나타났다.
본 발명에 따른 A22K 아실화 인슐린 유도체는 생리적 염 농도에서 감소된 용해도를 갖지 않는다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 신규한 인슐린 유도체를 제공하는데, 이 인슐린 유도체는 사람 인슐린 유사체의 아실화 유도체이고, 이 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A22K, desB27, B29R, desB30]이고; 이 인슐린 유사체는 Formula II
[Acyl]-[Linker]-
의 기로 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기의 아실화에 의해 유도체화되며, 여기서 Linker 기는 -gGlu- 및 -OEG-로부터 선택된 1 내지 10개 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 사슬이고; 여기서 gGlu는 감마 글루탐산 잔기를 나타내며; OEG는 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산의 잔기 (즉, 식 -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-의 기)를 나타내고; 이 아미노산 잔기는 어떤 순서로도 존재할 수 있으며; 이 아미노산 사슬은 적어도 하나의 gGlu 잔기를 포함하고; 그리고 여기서 Acyl 기는 1,14-테트라데칸디오산; 1,15-펜타데칸디오산; 및 1,16-헥사데칸디오산으로부터 선택된 α,ω-디-카르복실산의 잔기이고;
이 아실화 유사체는 추가로 A14E, 및/또는 B3E 또는 B3Q 치환들을 포함할 수도 있다.
또 다른 제1 양태에서, 본 발명은 본 발명의 인슐린 유도체 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 의약으로서 본 발명의 인슐린 유도체의 사용에 관련된다.
더욱 추가의 양태에서 본 발명은 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 이상지질혈증, 비만, 대사증후군(대사증후군 X, 인슐린 저항성 증후군), 고혈압, 인지 장애, 죽상동맥경화증, 심근경색증, 뇌졸중, 심혈관질환, 관상 동맥 질환, 염증성 장 증후군, 소화불량, 또는 위궤양과 관련된 질환, 질병 또는 상태의 치료, 예방 또는 완화를 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 인슐린 유도체의 치료학적 유효량을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 다음의 상세한 설명 및 실시예로부터 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명을 첨부 도면을 참고하여 더 예시하기로 한다.
도 1은 0 아연/6개 인슐린 분자(1 nmol/kg)로 조제된 실시예 1의 인슐린 유도체의 PK(pharmacokinetic, 약동학) 프로파일(인슐린 농도 대 시간)을, NovoRapid?/NovoLog? (인슐린 아스파르트, 상업적 제형), 3 아연/6개 인슐린 분자(0.5 및 1 nmol/kg)의 프로파일과 비교하여 나타낸다.
도 2는 도 1에서와 같은 데이터를 나타내나, 처음 2시간만을 나타낸다.
도 3a는 도 1에서와 같은 데이터를 나타내나, 0 아연/6개 인슐린 분자(1 nmol/kg)로 조제된 실시예 1의 인슐린에 대한 데이터만을, NovoRapid?/NovoLog? (인슐린 아스파르트, 상업적 제형), 3 아연/6개 인슐린 분자(1 nmol/kg)의 프로파일과 비교하여 나타낸다.
도 3b는 도 3a에서의 인슐린 프로파일에서 비롯되는 혈장 글루코스(plasma glucose)에서의 결과된 변화를 나타낸다
도 4a 및 4b는 0 아연/6개 인슐린 분자(1 nmol/kg)로 조제된 실시예 2의 인슐린의 PK(pharmacokinetic) 프로파일(인슐린 농도 대 시간)을, NovoRapid?/NovoLog? (인슐린 아스파르트, 상업적 제형), 3 아연/6개 인슐린 분자(0.5 및 1 nmol/kg)의 프로파일과 비교하여 나타내고, 혈장 글루코스(PG)에서 결과된 변화를 각각 나타낸다.
도 5a and 5b는 도 4a 및 4b에서와 같은 데이터를 나타내나, 0 아연/6개 인슐린 분자(1 nmol/kg)로 조제된 실시예 2의 인슐린에 대한 데이터만을, NovoRapid?/NovoLog? (인슐린 아스파르트, 상업적 제형), 3 아연/6개 인슐린 분자(1 nmol/kg)의 프로파일과 비교하여 나타내고, 혈장 글루코스에서 결과된 변화를 각각 나타낸다.
도 6 및 7은 0 아연/6개 인슐린 분자(1 nmol/kg)로 조제된 실시예 11의 인슐린의 PK(pharmacokinetic) 프로파일(인슐린 농도 대 시간)을 나타내며, 혈장 글루코스에서 결과된 변화를 각각 나타낸다.
도 8 및 9는 0 아연/6개 인슐린 분자(1 nmol/kg)로 조제된 실시예 44의 인슐린의 PK(pharmacokinetic) 프로파일(인슐린 농도 대 시간)을 나타내며, 혈장 글루코스에서 결과된 변화를 각각 나타낸다(1 nmol/kg).
도 10 및 11은 0 아연/6개 인슐린 분자(1 nmol/kg)로 조제된 종래 기술의 인슐린 A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 사람 인슐린(WO 2009/022013, 실시예 45)의 PK(pharmacokinetic) 프로파일(인슐린 농도 대 시간)을 나타내며, 혈장 글루코스에서 결과된 변화를 각각 나타낸다(1 nmol/kg).
도 12 및 13은 0 아연/6개 인슐린 분자(72 nmol/동물)로 조제된, 도 10 및 11에서 나타낸, 종래 기술(WO 2009/022013, 실시예 45)의 대표적인 테트라데칸디오산 유사체의 PK(pharmacokinetic) 프로파일(인슐린 농도 대 시간)을 나타내며, 혈장 글루코스에서 결과된 변화를 각각 나타낸다.
도 14A, 14B 및 14C는 형광 대 시간 플롯을 나타내며, 이로부터 지연시간은 지연 존(Lag Zone)의 선형 개략치 및 피브릴화 존(Fibrillation Zone) 사이의 절편으로서 추산될 수 있다.
도 15는 170 mM 니코틴아미드의 부재/존재하에 비만인 Zucker 래트에서 피하 주사 후 실시예 2의 인슐린 유도체의 PK/PD 프로파일을 나타낸다.
도 16-17은 170 mM 니코틴아미드의 부재/존재하에 비만인 Zucker 래트에서 피하 주사 후 실시예 7의 인슐린 유도체의 PK/PD 프로파일을 나타낸다.
도 18-19는 170 mM 니코틴아미드의 부재/존재하에 비만인 Zucker 래트에서 피하 주사 후 실시예 7의 인슐린 유도체의 PK/PD 프로파일을 나타낸다.
도 20-21은 170 mM 니코틴아미드의 부재/존재하에 비만인 Zucker 래트에서 피하 주사 후 실시예 4의 인슐린 유도체의 PK/PD 프로파일을 나타낸다.
인슐린 유도체
제1 양태에서, 본 발명은 신규한 인슐린 유도체를 제공하는데, 이 인슐린 유도체는 사람 인슐린의 아실화 유사체이다.
본 발명의 인슐린 유도체는 구체적으로 유사체가 사람 인슐린에 대하여 [A22K, desB27, B29R, desB30]인 사람 인슐린의 아실화 유사체를 특징으로 할 수 있고; 이 인슐린 유사체는 Formula II
[Acyl]-[Linker]-
의 기로 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기의 아실화에 의해 유도체화되며, 여기서 Linker 기는 -gGlu- 및 -OEG-로부터 선택된 1 내지 10개 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 사슬이고; 여기서 gGlu는 감마 글루탐산 잔기를 나타내며; OEG는 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산의 잔기 (즉, 식 -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-의 기)를 나타내고; 이 아미노산 잔기는 어떤 순서로도 존재할 수 있으며; 이 아미노산 사슬은 적어도 하나의 gGlu 잔기를 포함하고; 그리고
여기서 Acyl 기는 1,14-테트라데칸디오산; 1,15-펜타데칸디오산; 및 1,16-헥사데칸디오산으로부터 선택된 α,ω-디-카르복실산의 잔기이다.
본 발명의 인슐린 유도체는 추가로 A14E, 및/또는 B3E 또는 B3Q 치환들을 포함할 수도 있다.
한 구체예에서, 사람 인슐린의 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A14E, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30]; 또는 [A22K, desB27, B29R, desB30]이고; 그리고 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있다.
또 다른 구체예에서, 사람 인슐린의 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A22K, desB27, B29R, desB30]이고; 그리고 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있다.
세번째 구체예에서, 사람 인슐린의 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]이고; 그리고 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있다.
네번째 구체예에서, 사람 인슐린의 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30]이고; 그리고 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있다.
다섯번째 구체예에서, 사람 인슐린의 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30]이고; 그리고 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있다.
여섯번째 구체예에서, 사람 인슐린의 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A14E, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]이고; 그리고 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있다.
상기한 바와 같이, 인슐린 유사체는 상기한 바와 같이, Formula II의 기로, 즉, 연결기에 결합된 아실기을 보유하는 치환체로 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기의 아실화에 의해 유도체화된다.
본 발명의 내용에서 Formula II에 따른 연결기는 -gGlu- 및 -OEG-로부터 선택된 1 내지 10개 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 사슬이다.
한 구체예에서, Formula II에 따른 연결기는 1 내지 4 gGlu 잔기 및 0 내지 3 OEG 잔기를 포함하여, -gGlu- 및 -OEG-로부터 선택된 1 내지 7 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 사슬이다.
또 다른 구체예에서, Formula II에 따른 연결기는 -gGlu-; -2xgGlu-; -3xgGlu-; -4xgGlu-; -gGlu-2xOEG-; -gGlu-3x(OEG-gGlu)-; -4xgGlu-2xOEG-; -2xOEG-; 및 -2xOEG-gGlu-로부터 선택된다.
세번째 구체예에서, Formula II에 따른 연결기는 -gGlu-이다.
네번째 구체예에서, Formula II에 따른 연결기는 -2xgGlu-이다.
다섯번째 구체예에서, Formula II에 따른 연결기는 -3xgGlu-이다.
여섯번째 구체예에서, Formula II에 따른 연결기는 -4xgGlu-이다.
일곱번째 구체예에서, Formula II에 따른 연결기는 -gGlu-2xOEG-이다.
여덟번째 구체예에서, Formula II에 따른 연결기는 -gGlu-3x(OEG-gGlu)-이다.
아홉번째 구체예에서, Formula II에 따른 연결기는 -4xgGlu-2xOEG-이다.
열번째 구체예에서, Formula II에 따른 연결기는 -2xOEG-이다.
열한번째 구체예에서, Formula II에 따른 연결기는 -2xOEG-gGlu-이다.
본 발명의 내용에서 Formula II 에 따른 아실기는 1,14-테트라데칸디오산; 1,15-펜타데칸디오산; 또는 1,16-헥사데칸디오산으로부터 유도된다.
한 구체예에서, Formula II 에 따른 아실기는 1,14-테트라데칸디오산 (즉, 1,14-테트라데칸디오일)로부터 유도된다.
또 다른 구체예에서, Formula II 에 따른 아실기는 1,15-펜타데칸디오산 (즉, 1,15-펜타데칸디오일)로부터 유도된다.
세번째 구체예에서, Formula II 에 따른 아실기는 1,16-헥사데칸디오산 (즉, 1,16-헥사데칸디오일)로부터 유도된다.
추가의 구체예에서, Formula II의 기는, 상기한 바와 같이, 테트라데칸디오일-gGlu-; 테트라데칸디오일-2xgGlu-; 테트라데칸디오일-3xgGlu-; 테트라데칸디오일-4xgGlu-; 테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG-; 테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG-; 테트라데칸디오일-2xOEG-; 펜타데칸디오일-4xgGlu; 헥사데칸디오일-4xgGlu-; 헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG-; 또는 헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu-이다.
또 다른 구체예에서, Formula II의 기는 테트라데칸디오일-gGlu-이다.
세번째 구체예에서, Formula II의 기는 테트라데칸디오일-2xgGlu-이다.
네번째 구체예에서, Formula II의 기는 테트라데칸디오일-3xgGlu-이다.
다섯번째 구체예에서, Formula II의 기는 테트라데칸디오일-4xgGlu-이다.
여섯번째 구체예에서, Formula II의 기는 테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG-이다.
일곱번째 구체예에서, Formula II의 기는 테트라데칸디오일-2xOEG-이다.
여덟번째 구체예에서, Formula II의 기는 테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG-이다.
아홉번째 구체예에서, Formula II의 기는 펜타데칸디오일-4xgGlu-이다.
열번째 구체예에서, Formula II의 기는 헥사데칸디오일-4xgGlu-이다.
열한번째 구체예에서, Formula II의 기는 헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG-이다.
열두번째 구체예에서, Formula II의 기는 헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu-이다.
본 발명의 인슐린 유도체는 구체적으로 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 것일 수 있다:
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-2xgGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-2xOEG), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-펜타데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린; 및
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린.
본 발명 화합물의 바람직한 특징
본 발명은 또한 다음 특징들 중 한가지 이상의 언급을 특징으로 할 수 있다:
1. 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, 이 유사체는 [A22K, desB27, B29R, desB30]이고; 이 인슐린 유사체는 선택적으로 A14E, 및/또는 B3E 또는 B3Q로 치환되고; 그리고 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있다.
2. 항목 1에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, 이 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A22K, desB27, B29R, desB30]이고; 이 인슐린 유사체는 B3E, 또는 B3Q로 치환되고; 그리고 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있다.
3. 항목 1에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, 이 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]이고; 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있다.
4. 항목 1에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, 이 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30]이고; 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있다.
5. 항목 1에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, 이 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30]이고; 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있다.
6. 항목 1에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, 이 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30]이고; 이 인슐린 유사체는 B3E, 또는 B3Q로 치환되고; 그리고 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있다.
7. 항목 1에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, 이 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A14E, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]이고; 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있다.
8. 항목 1에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, 이 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A22K, desB27, B29R, desB30]이고; 이 인슐린 유사체는 Formula II
[Acyl]-[Linker]-
의 기로 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기의 아실화에 의해 유도체화되며, 여기서 Linker 기는 -gGlu- 및 -OEG-로부터 선택된 1 내지 10개 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 사슬이고; 여기서
gGlu는 감마 글루탐산 잔기를 나타내며;
OEG는 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산의 잔기 (즉, 식 -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-의 기)를 나타내고;
이 아미노산 잔기는 어떤 순서로도 존재할 수 있으며;
이 아미노산 사슬은 적어도 하나의 gGlu 잔기를 포함하고; 그리고
여기서 Acyl 기는 1,14-테트라데칸디오산; 1,15-펜타데칸디오산; 및 1,16-헥사데칸디오산으로부터 선택된 α,ω-디-카르복실산의 잔기이고,
이 아실화 유사체는 추가로 A14E, 및/또는 B3E 또는 B3Q 치환들을 포함할 수도 있다.
9. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Acyl 기는 1,14-테트라데칸디오산; 1,15-펜타데칸디오산; 또는 1,16-헥사데칸디오산으로부터 유도된 이산(diacid) 기이다.
10. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Acyl 기는 1,14-테트라데칸디오산 또는 1,16-헥사데칸디오산으로부터 유도된 이산 기이다.
11. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Acyl 기는 1,14-테트라데칸디오산으로부터 유도된 이산 기이다.
12. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Acyl 기는 1,16-헥사데칸디오산으로부터 유도된 이산 기이다.
13. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Acyl 기는 1,15-펜타데칸디오산으로부터 선택된 이산 기이다.
14. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 1-10 gGlu 잔기를 포함한다.
15. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 1-8 gGlu 잔기를 포함한다.
16. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 1-6 gGlu 잔기를 포함한다.
17. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 1-4 gGlu 잔기를 포함한다.
18. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 1-3 gGlu 잔기를 포함한다.
19. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 1-2 gGlu 잔기를 포함한다.
20. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 하나의 gGlu 잔기를 포함한다.
21. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 두개의 gGlu 잔기를 포함한다.
22. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 세개의 gGlu 잔기를 포함한다.
23. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 네개의 gGlu 잔기를 포함한다.
24. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 1-6 OEG 잔기를 포함한다.
25. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 1-4 OEG 잔기를 포함한다.
26. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 1-3 OEG 잔기를 포함한다.
27. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 하나의 OEG 잔기를 포함한다.
28. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 두개의 OEG 잔기를 포함한다.
29. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 세개의 OEG 잔기를 포함한다.
30. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 OEG 잔기를 포함하지 않는다.
31. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 -gGlu-; -2xgGlu-; -3xgGlu-; -gGlu-3x(OEG-Glu)-; -4xgGlu-; -2xOEG-; -4xgGlu-2xOEG-;-2xOEG-gGlu-; 및 -gGlu-2xOEG-로부터 선택된다.
32. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 -gGlu; -gGlu-3x(OEG-gGlu)-; 및 -gGlu-2xOEG-로부터 선택된다.
33. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Linker 기는 -gGlu-; -2xgGlu-; 및 -4xgGlu-로부터 선택된다.
34. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Formula II [Acyl]-[Linker]-의 기는 테트라데칸디오일-gGlu-; 테트라데칸디오일-2xgGlu-; 테트라데칸디오일-3xgGlu-; 테트라데칸디오일-4xgGlu-; 테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG-; 테트라데칸디오일-2xOEG-; 테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG-; 헥사데칸디오일-4xgGlu-; 헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG-; 또는 헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu-이다.
35. 항목 7에 따른 사람 인슐린의 아실화 유사체로서, Formula II [Acyl]-[Linker]-의 기는 테트라데칸디오일-gGlu-; 테트라데칸디오일-2xgGlu-; 테트라데칸디오일-4xgGlu-; 테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG-; 또는 테트라데칸디오일-2xOEG-; 헥사데칸디오일-4xgGlu-; 헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG-; 또는 헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu-이다
정의
명명법
본원에서, 인슐린의 이름 붙이기는 다음 원리에 따라 행해진다:
용어 "유사체"는 더욱 화학적 변형(유도체화), 및 구체적으로 아실화를 당하기 전에 해당 인슐린 단백질 또는 펩티드에 대해 빈번히 사용된다. 이러한 화학적 변형(유도체화)으로부터 결과되는 생성물은 보통 "유도체" 또는 "아실화 유사체"라 부른다. 그러나, 이 출원의 내용에서, 용어 "유사체"는 이러한 사람 인슐린 유사체의 (아실화) 유도체 뿐만 아니라 사람 인슐린의 유사체를 지칭한다.
이름들은 사람 인슐린에 대한 유사체, 유도체 및 변형(아실화)으로서 주어진다. 아실 모이어티(즉, Formula II의 [Acyl]-[Linker]- 기)의 이름 붙이기를 위해, 어떤 경우에는 IUPAC 명명법에 따라 이름 붙이기가 행해지고, 다른 경우에는 펩티드 명명법으로서 이름 붙이기가 행해진다.
예로서, 다음 구조의 아실 모이어티(Chem.1):
Figure pct00001
는 "테트라데칸디오일-4xgGlu", "테트라데칸디오일-4xγGlu" 또는, "1,14-테트라데칸디오일-4xgGlu" 등으로 이름 붙일 수 있는데, 여기서 γGlu (및 gGlu)는 L-구조의 아미노산 감마 글루탐산에 대한 약칭 표기이고, "4x"는 잔기가 4회 반복해서 이어진다는 것을 의미한다.
마찬가지로, 다음 구조의 아실 모이어티(Chem.2):
Figure pct00002
는 예를 들어서 "헥사데칸디오일-(gGlu-OEG)3-gGlu)", "헥사데칸디오일-(gGlu-OEG)3-gGlu)", "헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu)", "1,16-헥사데칸디오일-(gGlu-OEG)3-gGlu)", "1,16-헥사데칸디오일-(gGlu-OEG)3-gGlu)", "1,16-헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu)", "헥사데칸디오일-(γGlu-OEG)3-γGlu)", "헥사데칸디오일-(γGlu-OEG)3-γGlu)", 또는 "헥사데칸디오일-3x(γGlu-OEG)-γGlu)"로 이름 붙일 수 있고;
여기서 다음 구조의 모이어티(Chem.3):
Figure pct00003
는 예를 들어서 테트라데칸디오일, 1,14-테트라데칸디오일 또는 (약칭 표기) C14 이산으로 이름 붙일 수 있다. 유사한 표기가 15 및 16개 탄소 원자를 갖는 유사한 잔기들, 펜타데칸디오일, C15 이산, 및 헥사데칸디오일, C16 이산, 각각에 대해 적용된다.
γGlu (및 gGlu)는 L-구조의 아미노산 감마 글루탐산에 대한 약칭 표기이다.
OEG는 아미노산 잔기 8-아미노-3,6-디옥사-옥타노산, NH2(CH2)2O(CH2)2OCH2CO2H에 대한 약칭 표기이다.
"2x" 및 "3x"는 잔기가 각각 2회 및 3회 반복해서 이어진다는 것을 의미한다.
예를 들어서, 실시예 1의 인슐린 유도체는 사람 인슐린에서 21개 아미노산 잔기를 함유하는 A-사슬이 리신(K)으로 1 아미노산(위치 A22) 만큼 연장되고 또한 모이어티 테트라데칸디오일-4xgGlu에 의해 N ε (또는 N(eps))로 나타낸 A22의 리신 잔기에서의 엡실론 질소 상의 아실화에 의해 더욱 변형되며, 사람 인슐린에서 위치 B27에서의 아미노산 T가 결실되고, 사람 인슐린에서 위치 B29에서의 아미노산, K가 아르기닌, R로 치환되고, 사람 인슐린에서 위치 B30에서의 아미노산, 트레오닌, T가 결실된 것을 가리키기 위해 "A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린"으로 이름 붙여진다. 이하의 식에서 별표는 해당 잔기가 사람 인슐린과 비교하여 다른(즉, 치환된) 것을 가리킨다.
이 출원을 통하여, 본 발명의 바람직한 인슐린의 식과 이름이 모두 제공된다.
게다가, 본 발명의 인슐린은 또한 IUPAC 명명법(OpenEye, IUPAC 스타일)에 따라 이름 붙여진다. 이 명명법에 따르면, 실시예 1의 인슐린 유도체는 다음의 이름으로 정해진다: N{알파}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론} [(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노-부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
식은 리신 잔기 (아실화에 의해 변형됨)와 함께 기입될 수 있는데 확장된 리신 잔기(예를 들면 실시예 23에 나타낸 것과 같음)로 그려지거나 아니면 줄어든 리신 잔기(예를 들면 실시예 1에 나타낸 것과 같음)로 그려짐을 주목해야 한다. 모든 경우에서 아실기는 리신 잔기의 엡실론 질소에 부착되어 있다.
완성시키기 위해, 위치 B27에서 잔기의 결실(desB27)은 하나의 잔기에 의해 N-말단 단부를 향해 나머지 아미노산 잔기들의 (형식적) 이동을 가져온다고 말할 수 있다. 결과적으로, 이러한 유사체는 또한 B27P, B28R, desB29-30으로 이름 붙일 수 있는데, 위치 B28에서의 잔기가 프롤린이고 위치 B29에서의 잔기가 아르기닌이기 때문이다(예를 들면, 실시예 1의 화합물 참조). 이것은 B27을 결실시킴으로써, 서열에서 다음의 아미노산은 그때 자리를 이동하고 따라서 위치 B28에서의 아미노산(프롤린)이 B27 위치로 이동되기 때문이다.
물리적 안정성
본원에서 사용된 인슐린 제제의 "물리적 안정성"이라는 용어는 단백질이 소수성 표면 및 계면과 같은, 불안정화한 계면 및 표면과의 상호작용 및/또는 열기계 스트레스에 노출 결과로 단백질의 생물학적 불활성 및/또는 불용성 응집체를 형성하는 경향을 말한다. 수성 단백질 제제의 물리적 안정성은 적당한 용기(예를 들면 카트리지 또는 바이알)에 충전된 제제를 여러 시간 기간동안 다른 온도들에서 기계적/물리적 스트레스(예를 들면 교반)에 노출시킨 후 시각적 검사 및/또는 탁도 측정에 의해 평가한다. 제제의 시각적 검사는 검은 배경을 가지고 예리한 집중된 광에서 수행된다. 제제는 일광에서 시각적 탁도를 나타낼 때, 단백질 응집에 관하여 물리적으로 불안정한 것으로 분류된다. 또 다르게는, 제제의 탁도는 당업자에게 잘 알려진 간단한 탁도 측정에 의해 평가될 수 있다. 수성 단백질 제제의 물리적 안정성은 또한 단백질의 입체구조 상태의 분광학 작용제 또는 프로브를 사용함으로써 평가될 수 있다. 프로브는 바람직하게는 단백질의 비고유 형태이성질체에 선호적으로 결합하는 소분자이다. 단백직 구조의 소분자 분광학 프로브의 한가지 예는 Thioflavin T이다. Thioflavin T는 아밀로이드 피브릴의 검출을 위해 널리 사용된 형광 염료이다. 피브릴, 그리고 또한 아마도 다른 단백질 구성물의 존재하에, Thioflavin T는 피브릴 단백질 형태에 결합될 때 약 450 nm에서 새로운 여기 최대 그리고 약 482 nm에서 향상된 방출을 일으킨다. 미결합 Thioflavin T는 파장들에서 본질적으로 비형광성이다.
화학적 안정성
본원에서 사용된 단백질 제제의 "화학적 안정성"이라는 용어는 고유 단백질 구조와 비교하여 잠재적인 더 적은 생물학적 효능 및/또는 잠재적인 증가된 면역원 성질을 갖는 화학적 분해 생성물의 형성을 이끄는 공유결합 단백질 구조의 변화를 말한다. 고유 단백질의 유형 및 성질 그리고 단백질이 노출되는 환경에 따라 여러가지 화학적 분해 생성물이 형성될 수 있다. 증가하는 양의 화학적 분해 생성물이 종종 단백질 제제의 보관 및 사용 중에 보여진다. 대부분의 단백질은 탈아미드화하기 쉬운데, 이 공정에서 글루타미닐 또는 아스파라기닐 잔기에서 측쇄 아미드기가 가수분해되어 카르복실산 또는 아스파라기닐 잔기를 형성하여 isoAsp 유도체를 형성한다. 다른 분해 경로는 2개 이상의 단백질 분자가 트랜스아미드화 및/또는 이황화 상호작용을 통해 서로에 공유 결합되어 공유결합된 2합체, 올리고머 및 폴리머 분해 생성물의 형성을 이끄는 고분자량 생성물의 형성을 수반한다(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern TJ & Manning MG, Plenum Press, New York 1992). 산화(예를 들어서 메티오닌 잔기의 산화)는 화학적 분해의 또 다른 변형물로서 언급될 수 있다. 단백질 제제의 화학적 안정성은 화학적 분해의 또 다른 변형물로서 언급될 수 있다. 단백질 제제의 화학적 안정성은 다른 환경상의 조건들에의 노출 후 여러 시간 시점에서 화학적 분해 생성물의 양을 측정함으로써 평가될 수 있다(분해 생성물의 형성은 종종 예를 들어서 온도를 증가시킴으로써 촉진될 수 있다). 각각의 개개 분해 생성물의 양은 종종 여러가지 크로마토그라피 기술(예를 들면, SEC-HPLC 및/또는 RP-HPLC)을 사용하여 분자 크기, 소수성, 및/또는 전하에 따라 분해 생성물의 분리에 의해 결정된다. HMWP 생성물은 잠재적으로 면역원성이나 생물학적으로 활성은 아니기 때문에, 낮은 수준의 HMWP가 유리하다.
합성의 방법
본 발명의 인슐린 유도체는 인슐린, 인슐린 유사체 및 인슐린 유도체의 제조를 위한 종래의 방법, 그리고 구체적으로 작업예에서 기술된 방법에 의해 얻어질 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 테트라데칸디오일-4xgGlu인 Formula II의 기로 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기의 아실화에 의해 얻어진다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 테트라데칸디오일-4xgGlu인 Formula II의 기로 높은 pH에서, 구체적으로 9.5 내지 13의 범위의 pH에서 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기의 아실화에 의해 얻어진다.
보다 구체적으로는 본 발명의 인슐린 유도체는 화합물 (S)-2-((S)-4-카르복시-4-{(S)-4-카르복시-4-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시-트리데카노일아미노)-부티릴아미노]-부티릴아미노}-부티릴아미노)-펜탄디오산 5-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일)에스테르 (또는 다른 명칭으로, 테트라데칸디오일-4xgGlu-OSu) (Chem.4)로 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기의 아실화에 의해 얻어진다.
또 다른 구체예에서 본 발명의 인슐린 유도체는 화합물 14-[[(1S)-1-카르복시-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시-2-옥소에톡시]에톡시]-에틸-아미노]-2-옥소에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소부틸]아미노]-14-옥소테트라데카노산 (또는 다른 명칭으로, 테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG-OSu) (Chem.5)로 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기의 아실화에 의해 얻어진다.
본 발명 화합물의 합성을 위한 바람직한 특징
본 발명은 또한 다음 특징들 중 한가지 이상의 언급을 특징으로 할 수 있다:
1. 본 발명의 인슐린 유도체의 합성에서의 중간체로서 아실화 공정에서 사용을 위한, 화합물 (S)-2-((S)-4-카르복시-4-{(S)-4-카르복시-4-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시-트리데카노일아미노)-부티릴아미노]-부티릴아미노}-부티릴아미노)-펜탄디오산 5-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일) 에스테르 (또는 다른 명칭으로, 테트라데칸디오일-4xgGlu-OSu) (Chem.4).
2. 본 발명의 인슐린 유도체의 합성에서의 중간체로서 아실화 공정에서 사용을 위한, 화합물 14-[[(1S)-1-카르복시-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시-2-옥소에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소부틸]아미노]-14-옥소테트라데카노산 (또는 다른 명칭으로, 테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG-OSu) (Chem.5).
3. 인슐린 유도체의 합성에서의 중간체 화합물로서 사용을 위한 항목 1-2 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 이 인슐린 유도체는 사람 인슐린의 아실화 유사체이고, 이 유사체는 사람 인슐린에 대한 변이 A22K를 보유하고, 이 위치에 항목 1-2 중 어느 하나의 화합물이 아실화된다.
4. 인슐린 유도체의 합성에서 중간체 화합물로서 사용을 위한 항목 1-2 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 이 인슐린 유도체는 사람 인슐린의 아실화 유사체이고, 이 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A22K, desB27, B29R, desB30]이고, 이 유사체는 위치 A22K에서 항목 1-2 중 어느 하나의 화합물로 아실화된다.
5. 인슐린 유도체의 합성에서 중간체 화합물로서 사용을 위한 항목 1-2 중 어느 하나에 따른 화합물로서, 이 인슐린 유도체는 사람 인슐린의 아실화 유사체이고, 이 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A22K, desB27, B29R, desB30]이고, 아실화 유사체는 추가로 A14E, 및/또는 B3E 또는 B3Q 치환을 포함하고, 이 유사체는 위치 A22K에서 항목 1-2 중 어느 하나의 화합물로 아실화된다.
6. A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린; 또는
A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린의 합성에서 중간체 화합물로서 사용을 위한 항목 1에 따른 화합물.
생물학적 활성
또 다른 양태에서 본 발명은 의약으로서 사용을 위한, 또는 의약 또는 약학적 조성물의 제조에 사용을 위한 신규한 인슐린 유도체를 제공한다.
본 발명의 인슐린 유도체는 식전 사용에 잘 적합한 것으로 생각되는 단시간에 신속하게 작용하는 인슐린 유도체인 것으로 발견된다.
본 발명의 인슐린 유도체는 모두 필요한 혈당 반응을 제공하기 위하여, 즉 동물 및 사람에서 혈당을 낮출 수 있는 인슐린 수용체를 활성화시키기에 적당한 인슐린 수용체 친화도를 지닌다.
본 발명의 인슐린 유도체는 균형잡힌 인슐린 수용체 (IR) 대 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-1R) 친화도 비율 (IR / IGF-1R)을 갖는 것으로 발견된다.
한 양태에서, 본 발명의 A22K 아실화 인슐린은 IR / IGF-1R 비율이 0.3보다 위; 0.4보다 위; 0.5보다 위; 0.6보다 위; 0.7보다 위; 0.8보다 위; 0.9보다 위; 1보다 위; 1.5보다 위; 또는 2보다 위이다.
또 다른 양태에서, A22K 아실화 인슐린 유사체는 본 발명의 화합물이고, Formula II의 아실기는 1,14-테트라데칸디오산으로부터 유도되고, 이 아실화 인슐린 유사체는 돼지에, 1.6% (w/vol, 대략) 글리세롤 및 30 mM 페놀/m-크레졸, pH 7.4를 함유하는, 본 발명의 아실화 인슐린 유사체의 600μM(대략) 제형의 피하 주사 후, 250 분 미만; 200 분 미만; 175 분 미만; 150 분 미만; 125 분 미만의 평균 체류 시간(MRT)을 갖는다.
또 다른 구체예에서, A22K 아실화 인슐린 유사체는 본 발명의 화합물이고, Formula II의 아실기는 1,16-헥사데칸디오산으로부터 유도되고, 이 아실화 인슐린 유사체는 돼지에, 1.6% (w/vol, 대략) 글리세롤 및 30 mM 페놀/m-크레졸, pH 7.4를 함유하는, 본 발명의 아실화 인슐린 유사체의 600μM(대략) 제형의 피하 주사 후, 700 분 미만; 600 분 미만; 500 분 미만; 400 분 미만; 300 분 미만의 평균 체류 시간(MRT)을 갖는다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 아실화 인슐린 유사체의 의학적 용도에 관련되고, 구체적으로 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 이상지질혈증, 비만, 대사증후군(대사증후군 X, 인슐린 저항성 증후군), 고혈압, 인지 장애, 죽상동맥경화증, 심근경색증, 뇌졸중, 심혈관질환, 관상 동맥 질환, 염증성 장 증후군, 소화불량, 또는 위궤양과 관련된 질환, 질병 또는 상태의 치료, 예방 또는 완화를 위한 이러한 인슐린 유도체의 사용에 관련되는데, 이 방법은 본 발명의 인슐린 유도체의 치료학적 유효량을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 또는 내당능 장애와 관련된 질환, 질병 또는 상태의 치료, 예방 또는 완화를 위한 이러한 인슐린 유도체의 사용에 관련되는데, 이 방법은 본 발명의 인슐린 유도체의 치료학적 유효량을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
세번째 구체예에서, 본 발명은 당뇨병, 및 구체적으로 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병과 관련된 질환, 질병 또는 상태의 치료, 예방 또는 완화를 위한 이러한 인슐린 유도체의 사용에 관련된다.
약학적 조성물
본 발명은 의약으로서 유용한 아실화 인슐린 유사체에 관련된다.
그러므로, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인슐린 유도체의 치료학적 유효량을 포함하는 신규한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물에서 통상 사용되는 다른 부형제, 예를 들면, 보존제, 킬레이트제, 등장화제, 흡수향상제, 안정화제, 산화방지제, 폴리머, 계면활성제, 금속 이온, 유성 비히클(oleaginous vehicles) 및 단백질(예를 들면, 사람 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질)을 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 한 구체예에서 본 발명의 약학적 조성물은 수성 제제, 즉, 물을 포함하는 제제이다. 이러한 제제는 전형적으로 용액 또는 현탁액이다. 본 발명의 추가의 구체예에서 약학적 조성물은 수용액이다.
용어 "수성 제제"는 적어도 50% w/w 물을 포함하는 제제로서 정의된다. 마찬가지로, 용어 "수용액"은 적어도 50% w/w 물을 포함하는 용액으로서 정의되고, 용어 "수성 현탁액"은 적어도 50% w/w 물을 포함하는 현탁액으로서 정의된다. 수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조를 위해 적합한 부형제와의 혼합물로 활성 화합물을 함유할 수도 있다.
본 발명의 한 구체예에서 인슐린 제제는 본 발명의 인슐린 유도체의 수용액을 포함하는데, 여기서 상기 인슐린 화합물은 약 0.1 mM 내지 약 20.0 mM; 보다 구체적으로는 약 0.2 mM 내지 약 4.0 mM; 약 0.3 mM 내지 약 2.5 mM; 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM; 약 0.6 mM 내지 약 2.0 mM; 또는 약 0.6 mM 내지 약 1.2 mM의 농도로 존재한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 인슐린 제제는 본 발명의 인슐린 유도체의 수용액을 포함하고, 여기서 상기 인슐린 화합물은 약 0.1 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.6 mM, 약 0.9 mM, 약 1.2 mM, 약 1.5 mM, 또는 약 1.8 mM의 농도로 존재한다.
본 발명의 약학적 조성물은 완충액 시스템을 더 포함할 수도 있다. 완충액은 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 인산2수소나트륨, 인산수소2나트륨, 인산나트륨, 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 바이신, 트리신, 말산, 글리실-글리신, 에틸렌디아민, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다.
한 구체예에서 완충액은 인산염 완충액이다. 더욱 또 다른 구체예에서, 상기 인산염 완충액의 농도는 약 0.1 mM 내지 20 mM의 범위이다. 더욱 또 다른 구체예에서, 상기 인산염 완충액의 농도는 0.1 mM 내지 약 10 mM, 또는 약 0.1 mM 내지 약 8 mM, 약 1 mM 내지 약 8 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 8 mM, 또는 6 mM 내지 8 mM의 범위이다.
본 발명의 주사가능한 약학적 조성물의 pH는 3 내지 8.5의 범위이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 주사가능한 약학적 조성물은 약 6.8 내지 약 7.8의 범위의 pH를 갖는다.
한 구체예에서 pH는 약 7.0 내지 약 7.8, 또는 7.2 내지 7.6의 범위이다.
본 발명의 인슐린 제제는 등장화제를 더 포함할 수도 있다. 등장화제는 염(예를 들면 염화나트륨), 당 또는 당 알코올, 아미노산 (예를 들면 L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예를 들면 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판디올(프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올) 폴리에틸렌글리콜(예를 들면 PEG400), 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어서 프룩토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 크실로스, 말토스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 덱스트란, 펄룰란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분 및 카르복시메틸셀룰로스-Na를 포함하는 모노-, 디-. 또는 다당류, 또는 수용성 글루칸과 같은 어떤 당도 사용될 수 있다. 한 구체예에서 당 첨가제는 수크로스이다. 당 알코올은 예를 들어서, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 크실리톨, 및 아라비톨을 포함한다. 한 구체예에서 당 알코올 첨가제는 만니톨이다. 위에서 언급한 당 또는 당 알코올은 개별적으로 또는 조합해서 사용될 수도 있다. 이들 특정한 등장화제 또는 이들의 혼합물의 각각 한가지가 본 발명의 대안의 구체예를 구성한다.
본 발명의 한 구체예에서, 글리세롤 및/또는 만니톨 및/또는 염화나트륨은 0 내지 250 mM, 0 내지 200 mM, 또는 0 내지 100 mM의 농도에 해당하는 양으로 존재할 수 있다.
본 발명의 인슐린 제제는 약학적으로 허용가능한 보존제를 더 포함할 수도 있다. 보존제는 보존 효과를 얻기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에서 보존제의 양은 예를 들면 본 분야 문헌으로부터 결정될 수도 있고 및/또는 예를 들어서 시판 제품에서의 보존제의 공지된 양일 수도 있다. 이들 특정한 보존제 또는 이들의 혼합물의 각각 한가지가 본 발명의 대안의 구체예를 구성한다. 약학적 제제에서의 보존제의 사용은 예를 들면, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995에 기재되어 있다.
한 구체예에서, 주사가능한 약학적 조성물은 적어도 하나의 페놀계 화합물을 보존제로서 포함한다.
또 다른 구체예에서 본 발명에 따른 사용을 위한 페놀계 화합물은 최종 주사가능한 약학적 조성물의 약 6 mg/mL까지, 특히 최종 주사가능한 약학적 조성물의 약 4 mg/mL까지 존재할 수 있다.
또 다른 구체예에서 본 발명에 따른 사용을 위한 페놀계 화합물은 최종 주사가능한 약학적 조성물의 약 4.0 mg/mL까지; 특히 약 0.5 mg/mL 내지 약 4.0 mg/mL; 또는 약 0.6 mg/mL 내지 약 4.0 mg/mL의 양으로 존재할 수 있다.
또 다른 구체예에서 보존제는 페놀이다.
또 다른 구체예에서, 주사가능한 약학적 조성물은 보존제로서 페놀 및 m-크레졸의 혼합물을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 주사가능한 약학적 조성물은 약 16 mM 페놀(1.5 mg/mL) 및 약 16 mM m-크레졸(1.72 mg/mL)을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 킬레이트제를 더 포함할 수도 있다. 약학적 제제에서 킬레이트제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의를 위해, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참고한다.
본 발명의 약학적 조성물은 흡수 향상제를 더 포함할 수 있다. 흡수 향상제의 군은 니코틴 화합물을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 용어 니코틴 화합물은 니코틴아미드, 니코틴산, 나이아신, 나이아신 아미드 및 비타민 B3 및/또는 이들의 염 및/또는 이들의 어떤 조합을 포함한다.
한 구체예에서, 니코틴 화합물은 니코틴아미드, 및/또는 니코틴산, 및/또는 이들의 염이다. 또 다른 구체예에서 니코틴 화합물은 니코틴아미드이다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 니코틴 화합물은 구체적으로 N-메틸 니코틴아미드, N,N-디에틸니코틴아미드, N-에틸니코틴아미드, N,N-디메틸니코틴아미드, N-프로필 니코틴아미드 또는 N-부틸 니코틴아미드일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 니코틴 화합물은 약 5 mM 내지 약 200 mM의 양으로; 구체적으로 약 20 mM 내지 약 200 mM의 양으로; 약 100 mM 내지 약 170 mM의 양으로; 또는 약 130 mM 내지 약 170 mM, 예를 들면 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM 또는 약 170 mM의 양으로 존재한다.
본 발명의 약학적 조성물은 안정화제를 더 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "안정화제"는 펩티드를 안정화시키기 위해, 즉 약학적 제제의 저장 수명 및/또는 가용 기간을 증가시키기 위해, 폴리펩티드를 함유하는 약학적 제제에 첨가된 화학제를 말한다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참고한다.
본 발명의 약학적 조성물은 조성물의 저장 동안에 폴리펩티드 또는 단백질에 의한 응집체 형성을 감소시키기에 충분한 아미노산 염기의 양을 더 포함할 수 있다. 용어 "아미노산 염기"는 어떤 주어진 아미노산이 그것의 유리 염기 형태로 또는 그것의 염 형태로 존재하는 경우의 아미노산 또는 아미노산들의 조합을 말한다. 아미노산은 구체적으로 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 아미노구아니딘, 오르니틴 또는 N-모노에틸 L-아르기닌, 에티오닌 또는 부티오닌, 또는 S-메틸-L 시스테인일 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서 아미노산 염기는 1 내지 100 mM; 1 내지 50 mM; 또는 1 내지 30 mM의 농도에 해당하는 양으로 존재할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 계면활성제를 더 포함할 수도 있다. 본원에서 사용한 용어 "계면활성제"는 수용성(친수성) 부분, 헤드, 및 지용성(친유성) 세그먼트로 구성되는 어떤 분자 또는 이온을 말한다. 계면활성제는 바람직하게는 계면에서 축적되는데, 친수성 부분은 물(친수성 상)을 향해 배향하고 친유성 부분은 오일-또는 소수성 상(즉, 유리, 공기, 오일 등)을 향해 배향된다. 계면활성제가 미셀을 형성하기 시작하는 농도는 임계 미셀 농도 또는 CMC로 알려져 있다. 더욱이, 계면활성제는 액체의 표면 장력을 낮춘다. 계면활성제는 또한 양친매성 화합물로도 알려져 있다. 약학적 제제에 계면활성제의 사용은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참고한다.
본 발명은 또한 이러한 인슐린 제제의 제조방법에 관련된다. 본 발명의 인슐린 제제는 수많은 인정된 방법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어서, 제제는 부형제들의 수용액을 인슐린 유도체의 수용액과 혼합하고, 그 후 pH를 원하는 수준으로 조절하고 혼합물을 물로 최종 부피까지 만들고 이어서 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다.
무아연 약학적 조성물
인슐린 제제는 전통적으로 약학적 제제의 허용되는 안정성을 얻기 위해 예를 들면 염화물 또는 아세테이트로서 첨가된 아연을 포함한다. 그러나, 놀랍게도 본 발명의 이러한 인슐린 유도체가 충분한 화학적 및 물리적 안정성을 유지하면서, 아연의 첨가 없이 약학적 조성물로 조제될 수 있어서 충분한 화학적 및 물리적 안정성을 유지하기 위해 Zn2 + 이온을 필요로 하는 비교할만한 인슐린 유사체보다 더 빠른 작용 시작을 제공할 수 있다는 것이 발견되었다. 무아연 제형은 피하 조직으로부터 더 빠르게 흡수되고, 따라서 식전 사용을 허용한다.
이점에 있어서, 다소간의 극미량의 아연이 약학적 조성물의 제조에 종래에 사용된 부형제에, 및 구체적으로 의료용 용기에 사용된 고무 재료에 존재할 수 있기 때문에 무아연 인슐린 약학적 조성물은 참으로 얻어지기 어렵다는 것을 언급하는 것이 필요하다.
그러므로, 한 양태에서, 본 발명은 저아연 조성물로서 조제된, 즉 제제에 아연의 별도의 첨가 없는, 본 발명의 인슐린 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은 보통 "무아연 조성물"로도 언급되나, 그것들은 사실상 "저아연 조성물"로 생각될 수 있다.
그러나, 무아연 부형제가 제공될 수 있다면, 본 발명의 인슐린 유도체는 사실상 무아연 약학적 조성물의 제제를 허용한다. 그러므로, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 인슐린 유도체, 및 어떤 아연도 없는, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 무아연 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 더 나아가서 본 발명의 A22K 아실화 인슐린 유도체의 서브세트는, 위치 B3에서 치환을 보유하면서, 아연 이온의 첨가가 없고 첨가된 계면활성제가 없이 조제된 약학적 조성물의 화학적 및 물리적 안정성 둘다에 부가된다는 것을 발견하였다. 그러므로, 추가의 양태에서, 본 발명은 위치 B3에서 추가의 치환(즉, B3E 또는 B3Q)을 포함하는 본 발명의 인슐린 유도체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, 상기한 바와 같은 저아연 또는 무아연 약학적 조성물을 제공하는데, 그러나 이 약학적 조성물은 계면활성제가 첨가되지 않았다.
한 구체예에서 본 발명은 인슐린 유도체 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, 첨가된 아연을 갖지 않고, 저아연 조성물로서 조제된 약학적 조성물을 제공하며, 여기서 인슐린 유도체는 사람 인슐린의 아실화 유사체이고, 이 유사체는
사람 인슐린에 대하여 [A22K, B3E or B3Q, desB27, B29R, desB30]이고;
여기서 인슐린 유사체는 Formula II
[Acyl]-[Linker]-
의 기로 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기의 아실화에 의해 유도체화되며, 여기서 Linker 기는 -gGlu- 및 -OEG-로부터 선택된 1 내지 10개 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 사슬이고; 여기서
gGlu는 감마 글루탐산 잔기를 나타내며;
OEG는 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산의 잔기 (즉, 식 -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-의 기)를 나타내고;
이 아미노산 잔기는 어떤 순서로도 존재할 수 있으며;
이 아미노산 사슬은 적어도 하나의 gGlu 잔기를 포함하고; 그리고
여기서 Acyl 기는 1,14-테트라데칸디오산; 1,15-펜타데칸디오산; 및 1,16-헥사데칸디오산으로부터 선택된 α,ω-디-카르복실산의 잔기이고;
여기서 아실화 유사체는, 추가로 A14E 치환을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 위치 B3에서 추가의 치환은 B3E이다.
세번째 구체예에서, 위치 B3에서 추가의 치환은 B3Q이다.
네번째 구체예에서 본 발명은 다음으로부터 선택된 사람 인슐린의 아실화 유사체를 포함하는, 첨가된 아연을 갖지 않고, 저아연 조성물로서 조제된 약학적 조성물을 제공한다:
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-펜타데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린; 및
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린.
더욱 또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 저아연 약학적 조성물을 제공하며, 여기서 아연 이온은 6개의 인슐린 분자 당 0.2개 미만의 Zn2 + 이온; 6개의 인슐린 분자 당 0.15개 미만의 Zn2 + 이온; 6개의 인슐린 분자 당 0.12개 미만의 Zn2 + 이온; 6개의 인슐린 분자 당 0.1개의 Zn2 + 이온; 6개의 인슐린 분자 당 0.09개 미만의 Zn2 + 이온; 6개의 인슐린 분자 당 0.08개 미만의 Zn2 + 이온; 6개의 인슐린 분자 당 0.07개 미만의 Zn2 + 이온; 6개의 인슐린 분자 당 0.06개 미만의 Zn2 + 이온; 6개의 인슐린 분자 당 0.05개 미만의 Zn2 + 이온; 6개의 인슐린 분자 당 0.04개 미만의 Zn2 + 이온; 6개의 인슐린 분자 당 0.03개 미만의 Zn2 + 이온; 6개의 인슐린 분자 당 0.02개 미만의 Zn2 + 이온; 또는 6개의 인슐린 분자 당 0.01개 미만의 Zn2 + 이온의 농도에 해당하는 양으로 존재할 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 주사가능한 조성물로서 조제된, 상기한 바와 같은 저아연 또는 무아연 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 종래의 방법들을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들어서, 성분들을 수용액 형태로 함께 혼합할 수 있고, 그 후 pH를 원하는 수준으로 조절하고 혼합물을 물로 최종 부피까지 만들고 이어서 멸균 여과한다.
비경구 투여는 주사기, 선택적으로 펜형 주사기에 의해 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다. 대안으로는, 비경구 투여는 주입 펌프에 의해 수행될 수 있다. 추가의 옵션으로서, 본 발명의 인슐린 화합물을 함유하는 인슐린 제제는 또한, 예를 들어서 바늘 없는 주사기에 의해서 또는 마이크로니들 패치, 선택적으로 이온영동 패치로부터의 경피 투여, 또는 경점막, 예를 들면 구강(buccal) 투여에 적합시킬 수 있다.
본 발명에 따른 인슐린 제제는 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 몇몇 부위에서, 예를 들어서, 국소 부위들에서, 예를 들어서, 피부 및 점막 부위들에서, 흡수를 우회하는 부위들에서, 예를 들어서, 동맥내, 정맥내, 심장내 투여, 및 흡수를 수반하는 부위들에서, 예를 들어서, 피부에, 피부 아래에, 근육내 또는 복부에 투여될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 인슐린 제제는 주사에 의한 인슐린 요법에 사용되는 펜형 디바이스에의 적용에 적합하다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여에 의한 당뇨병의 치료에 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서 본 발명의 인슐린 제제는 또한 펌프의 사용에 의한 연속적 피하 인슐린 주입 요법을 포함하는 인슐린의 투여를 위해서, 및/또는 기저 인슐린 요법에서 적용을 위해, 보통 사용되는 여러가지 의료 디바이스에서의 사용을 위해 제조될 수 있다.
환자에게 투여할 본 발명의 인슐린 제제의 투여량은 의사에 의해 선택되는 것을 권장한다. 현재 본 발명에 따른 인슐린 유도체는 약 0.1 mM 내지 약 20.0 mM; 보다 구체적으로는 약 0.2 mM 내지 약 4.0 mM; 약 0.3 mM 내지 약 2.5 mM; 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM; 약 0.6 mM 내지 약 2.0 mM; 또는 약 0.6 mM 내지 약 1.2 mM의 양으로 최종 약학적 조성물에 존재할 것이라고 생각된다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 특징
본 발명은 또한 다음 특징들 중 한가지 이상의 언급을 특징으로 할 수 있다:
1. 본 발명의 사람 인슐린의 아실화 유사체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
2. 항목 1에 있어서, 첨가된 아연 이온이 없고, 저아연 조성물로서 조제된 약학적 조성물.
3. 항목 1에 있어서, 위치 B3에서 치환을 보유하는 사람 인슐린의 아실화 유사체를 포함하는, 첨가된 아연 이온이 없고, 저아연 조성물로서 조제된 약학적 조성물.
4. 항목 1에 있어서, 치환 B3E 또는 B3Q를 보유하는 사람 인슐린의 아실화 유사체를 포함하는, 첨가된 아연 이온이 없고, 저아연 조성물로서 조제된 약학적 조성물.
5. 항목 1에 있어서, 치환 B3E를 보유하는 사람 인슐린의 아실화 유사체를 포함하는, 첨가된 아연 이온이 없고, 저아연 조성물로서 조제된 약학적 조성물.
6. 항목 1에 있어서, 치환 B3Q를 보유하는 사람 인슐린의 아실화 유사체를 포함하는, 첨가된 아연 이온이 없고, 저아연 조성물로서 조제된 약학적 조성물.
7. 항목 1에 있어서, 다음으로부터 선택된 사람 인슐린의 아실화 유사체를 포함하는, 첨가된 아연을 갖지 않고, 저아연 조성물로서 조제된 약학적 조성물:
A22K(N(eps) 테트라데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-펜타데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린; 및
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린.
8. 항목 1에 있어서, 다음으로부터 선택된 사람 인슐린의 아실화 유사체를 포함하는, 첨가된 아연을 갖지 않고, 저아연 조성물로서 조제된 약학적 조성물:
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린; 및
A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린.
9. 항목 7-8 중 어느 하나에 있어서, 6개의 인슐린 분자 당 0.2개 미만의 Zn2 + 이온을 포함하는 약학적 조성물.
10. 항목 7-8 중 어느 하나에 있어서, 계면활성제를 첨가하지 않은, 약학적 조성물.
11. 항목 7-8 중 어느 하나에 있어서, 니코틴 화합물을 포함하는, 약학적 조성물.
12. 항목 7-8 중 어느 하나에 있어서, 약 20 mM 내지 약 170 mM의 총 농도로, 니코틴 화합물, 페닐알라닌 및/또는 그것의 염을 포함하는 약학적 조성물.
13. 항목 7-8 중 어느 하나에 있어서, 약 130 mM 내지 약 170 mM의 총 농도로, 니코틴 화합물, 페닐알라닌 및/또는 그것의 염을 포함하는 약학적 조성물.
14. 항목 7-8 중 어느 하나에 있어서, 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 및/또는 어주번트를 포함하는, 약학적 조성물.
치료법(Methods of therapy)
본 발명은 치료학적 용도를 위한 약물에 관련된다. 보다 구체적으로는 당뇨병 관련 질병의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 사람 인슐린 유사체의 아실화 유도체의 사용에 관련된다.
그러므로, 또 다른 양태에서, 본 발명은 사람을 포함하여, 살아있는 동물 신체의 질환, 질병 또는 상태의 치료 또는 완화를 위한 방법을 제공하는데, 이 질환, 질병 또는 상태는 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 이상지질혈증, 비만, 대사증후군(대사증후군 X, 인슐린 저항성 증후군), 고혈압, 인지 장애, 죽상동맥경화증, 심근경색증, 뇌졸중, 심혈관질환, 관상 동맥 질환, 염증성 장 증후군, 소화불량, 또는 위궤양과 관련된 질환, 질병 또는 상태로부터 선택될 수 있고, 이 방법은 본 발명의 사람 인슐린의 아실화 유사체의 치료학적 유효량을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서 본 발명은 사람을 포함하여, 살아있는 동물 신체의 질환, 질병 또는 상태의 치료 또는 완화를 위한 방법을 제공하는데, 이 질환, 질병 또는 상태는 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 이상지질혈증, 비만, 대사증후군(대사증후군 X, 인슐린 저항성 증후군), 고혈압, 인지 장애, 죽상동맥경화증, 심근경색증, 뇌졸중, 심혈관질환, 관상 동맥 질환, 염증성 장 증후군, 소화불량, 또는 위궤양과 관련된 질환, 질병 또는 상태로부터 선택될 수 있고, 이 방법은 본 발명의 사람 인슐린의 아실화 유사체의 치료학적 유효량을 필요로 하는 대상에의 투여를 포함한다.
세번째 구체예에서 본 발명은 사람을 포함하여, 살아있는 동물 신체의 질환, 질병 또는 상태의 치료 또는 완화를 위한 방법을 제공하는데, 이 질환, 질병 또는 상태는 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 이상지질혈증, 비만, 또는 대사증후군(대사증후군 X, 인슐린 저항성 증후군)으로부터 선택될 수 있다.
네번째 구체예에서 본 발명은 사람을 포함하여, 살아있는 동물 신체의 질환, 질병 또는 상태의 치료 또는 완화를 위한 방법을 제공하는데, 이 질환, 질병 또는 상태는 당뇨병, 구체적으로 1형 당뇨병, 또는 2형 당뇨병으로부터 선택될 수 있다.
실시예
본 발명을 다음의 실시예들을 참고하여 더 예시하는데, 이것들은 특허청구된 바와 같은 본 발명의 범위에 어떤 식으로든 제한하는 것을 의도하지 않는다.
인슐린 유사체 발현 및 정제
인슐린 유사체 발현
본 발명에 따라 사용하기 위한 인슐린 유사체, 즉, 2-사슬 비아실화 인슐린 유사체는, 예를 들면 US 6500645 에 개시된 바와 같이, 잘 공지된 기술에 의해 적합한 숙주 세포에서 해당 인슐린 유사체를 암호화하는 DNA 서열을 발현함으로써 재조합 생성된다. 인슐린 유사체는 직접 발현되거나 아니면 B-사슬에 N-말단 연장 및/또는 B-사슬과 A-사슬 사이에 연결 펩티드(C-펩티드)를 가질 수도 있는 전구체 분자로서 발현된다. 이 N-말단 연장 및 C-펩티드는 적합한 프로테아제, 예를 들면 아크로박터 리티커스(Achromobactor lyticus) 프로테아제 (ALP) 또는 트립신에 의해 시험관내에서 절단되고, 따라서 각각 위치 B1 및 A1 다음에 절단 부위를 가질 것이다. 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 유형의 N-말단 연장 및 C-펩티드는 예를 들면 US 5395922, EP 765395 및 WO 9828429에 개시되어 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 인슐린 유사체 전구체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 확립된 방법들, 예를 들면 Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22 1859-1869에 의해 기술된 포스포아미다이트 방법, 또는 Matthes et al. (1984) EMBO Journal 3 801-805에 의해 기술된 방법에 의해 합성에 의해 제조될 수 있다. 포스포아미다이트 방법에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어서 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 정제되고, 듀플렉스화하고, 라이게이션하여 합성 DNA 구조물을 형성한다. DNA 구조물을 제조하는 현재 바람직한 방법은 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해서이다.
재조합 방법은 전형적으로 본 발명에 따라 사용하기 위한 인슐린 유사체 전구체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지니는, 선택된 미생물 또는 숙주 세포에서 복제할 수 있는 벡터를 이용할 것이다. 재조합 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터, 즉, 염색체외(extra-chromosomal) 실재물로서 존재하는 벡터일 수 있고, 그것의 복제는 염색체 복제와 무관하며, 예를 들면 플라스미드, 염색체외 요소, 미니 염색체, 또는 인공 염색체가 될 수 있다. 벡터는 자기 복제를 보장하기 위해 어떤 수단도 함유할 수 있다. 또 다르게는, 벡터는 숙주 세포에 도입될 때 게놈에 통합되고 그것이 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는데 된다. 더욱이, 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주 세포의 게놈에 도입될 총 DNA를 함께 함유하는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포손이 사용될 수 있다. 벡터는 선형 또는 폐쇄된 원형 플라스미드일 수도 있고 바람직하게는 숙주 세포의 게놈으로 벡터의 안정한 통합 또는 게놈과 무관한 세포에서 벡터의 자율 복제를 허용하는 요소를 함유할 것이다.
재조합 발현 벡터는 효모에서 복제할 수 있는 것이 될 수 있다. 벡터로 하여금 효모에서 복제하는 것을 가능하게 하는 서열의 예들은 효모 플라스미드 2μm 복제 유전자 REP 1-3 및 복제 기점이다.
벡터는 형질전환된 세포의 용이한 선택을 허용하는, 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유할 수도 있다. 선택가능한 마커는 살생물제 또는 바이러스 저항성, 중금속에의 저항성, 영양 요구체에 원 영양성 등을 제공하는 생성물인 유전자이다. 세균성 선택가능한 마커의 예들은 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실루스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터의 dal 유전자이거나 또는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 저항성과 같은 항생제 저항성을 초래하는 마커이다. 필라멘트상 진균 숙주 세포에서 사용을 위한 선택가능한 마커는 amdS (아세트아미다제), argB (오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라제), pyrG (오로티딘-5'-포스페이트 디카르복실라제) 및 trpC (안트라닐레이트 신타제)를 포함한다. 효모 숙주 세포를 위한 적합한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3이다. 효모를 위한 잘 적합된 선택가능한 마커는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) TPI 유전자이다(Russell (1985) Gene 40 125-130).
벡터에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 변이체, 절두된, 및 하이브리드 프로모터를 포함하는 선택의 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 어떤 핵산 서열도 될 수 있고, 숙주 세포에 상동이거나 아니면 이종의 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 얻어질 수도 있다.
세균 숙주 세포에서 전사를 지시하는 적합한 프로모터의 예들은 이. 콜라이( E. coli) lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor) 아가라제 유전자(dagA), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라세 유전자(sacB), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 알파-아밀라제 유전자(amyL), 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus) 말토제닉 아밀라제 유전자(amyM), 바실루스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 알파-아밀라제 유전자(amyQ), 및 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 페니실리나제 유전자(penP)로부터 얻어진 프로모터들이다. 필라멘트상 진규 숙주 세포에서 전사를 지시하는 적합한 프로모터의 예들은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라제, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르틱 프로테이나제, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 중성 알파-아밀라제, 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 산 안정한 알파-아밀라제를 위한 유전자로부터 얻어진 프로모터들이다. 효모 숙주에서, 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) Ma1, TPI, ADH, TDH3 또는 PGK 프로모터이다.
본 발명에 따른 사용을 위한 인슐린 펩티드 백본을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 전형적으로 적합한 터미네이터에 작동가능하게 연결된다. 효모에서 적합한 터미네이터는 TPI 터미네이터이다(Alber et al. (1982) J. Mol . Appl . Genet. 1 419-434).
본 발명에 따라 사용하기 위한 인슐린 유사체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 프로모터 및 터미네이터 각각을 조합하고, 그것들을 선택된 숙주에서 복제를 위해 필요한 정보를 함유하는 적합한 벡터로 삽입하기 위해 사용되는 과정은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 벡터는 본 발명에 따라 사용하기 위한 인슐린 백본을 암호화하는 전체 DNA 서열을 함유하는 DNA 구조물을 먼저 제조하고, 이어서 이 단편을 적합한 발현 벡터로 삽입하거나, 아니면 개개 요소들(신호 및 프로-펩티드(B-사슬의 N-말단 연장), C- 펩티드, A- 및 B-사슬과 같은 것)에 대한 유전자 정보를 함유하는 DNA 단편을 연속 삽입하고, 이어서 라이게이션에 의해 제작될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 인슐린 유사체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 숙주 세포로 도입되어, 벡터가 염색체 통합물로서, 또는 자기 복제 염색체외 벡터로서 유지되도록 한다. 용어 "숙주 세포"는 복제 동안에 일어나는 변이로 인해 친세포(parent cell)와 동일하지 않은 친세포의 어떤 자손도 포함한다. 숙주 세포는 단세포 미생물, 예를 들면 원핵생물, 또는 단세포가 아닌 미생물, 예를 들면 진핵생물일 수 있다. 유용한 단세포는 바실루스(Bacillus) 세포, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 그램 양성 세균, 또는 이. 콜라이(E. coli) 및 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.)과 같은 그램 음성 세균과 같은 세균 세포이다. 진핵생물 세포는 포유동물, 곤충, 식물, 또는 진균 세포일 수 있다.
숙주 세포는 구체적으로 효모 세포일 수 있다. 효모 유기체는 배양시에 배지로 인슐린 펩티드 골격 또는 그것의 전구체를 분비하는 어떤 적합한 효모 유기체일 수 있다. 적합한 효모 유기체의 예들은 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 클루이베리(Pichia kluyveri), 야로위아 리포리티카(ahrrowia lipolytica), 칸디다 종(Candida sp.), 칸디다 우틸리스(Candida utilis), 칸디다 카카오이(Candida cacaoi), 게오트리큼 종(Geo트리chum sp.), 및 게오트리큼 페르멘탄스(Geo트리chum fermentans)로부터 선택된 균주를 포함한다.
효모 세포의 형질전환은 예를 들어서 공지의 방법에 의해 프로토플라스트 형성과 이어서 형질전환에 의해 실행될 수 있다. 세포를 배양하기 위해 사용된 배지는 효모 유기체를 성장시키기에 적합한 어떤 종래의 배지도 될 수 있다.
인슐린 유사체 정제
분비된 인슐린 유사체 또는 그것의 전구체는 원심분리에 의해, 여과에 의해 또는 인슐린 유사체 또는 그것의 전구체를 이온교환 매트릭스에 또는 역상 흡수 매트릭스에 포착 또는 흡착에 의해 배지로부터 효모 세포를 분리하는 단계, 염, 예를 들면 황산암모늄에 의한 상청액 또는 여액의 단백질 성분들을 침전시키는 단계, 이어서 여러가지 크로마토그라피 과정, 예를 들면 이온교환 크로마토그라피, 친화도 크로마토그라피, 등에 의한 정제 단계를 포함하는 종래의 과정들에 의해 배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 인슐린 펩티드 백본의 정제 및 소화는 다음과 같이 수행된다:
단일 사슬 인슐린 유사체 전구체는, B-사슬의 N-말단 연장 및 B-사슬과 A-사슬 사이의 변형된 C-펩티드를 함유할 수 있는데, 양이온 교환에 의해 효모 배양 상청액으로부터 정제 및 농축된다(Kjeldsen et al. (1998) Prot . Expr . Pur . 14 309-316).
단일 사슬 인슐린 유사체 전구체는 리신-특이적 고정화 ALP로 소화에 의해 (Kristensen et al. (1997) J. Biol . Chem . 20 12978-12983) 또는 존재한다면 B-사슬의 N-말단 연장, 그리고 C-펩티드를 절단하기 위해 트립신의 사용에 의해, 2-사슬 인슐린 펩티드 백본으로 성숙된다.
트립신 소화
인슐린 유사체 전구체를 함유하는 양이온 교환 크로마토그라피 단계로부터의 용출물을 물로 희석하여 15-20%의 에탄올 농도로 한다. 글리신을 첨가하여 50 mM의 농도로 하고 pH를 NaOH에 의해 9.0-9.5로 조절한다. 트립신을 1:300 (w:w)의 비율로 첨가하고 4도에서 소화가 진행되도록 허용한다.
소화가 완결될 때까지 매 20 분마다 소화를 분석에 의해 모니터한다. 3:100 (부피:부피)의 비율로 1 M 시트르산의 첨가로 소화를 종결한다.
소화 반응을 C18 컬럼을 사용하여 Waters Acquity 초성능 액체 크로마토그라피 시스템에서 분석용 LC에 의해 분석하고 분자량을 MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics Autoflex II TOF/TOF)에 의해 확인한다.
2-사슬 인슐린 유사체를 아세토니트릴 구배를 사용하는 C18 컬럼에서 역상 HPLC (Waters 600 시스템)에 의해 정제한다. 원하는 인슐린 유사체, 예를 들면 A22K, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린, 또는 A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린를 동결건조에 의해 회수한다.
순도는 C18 컬럼을 사용하는 Waters Acquity 초성능 액체 크로마토그라피 시스템에서 분석용 LC에 의해 결정되고 분자량은 MALDI-TOF MS에 의해 확인한다.
약어
ALP - 아크로모박터 리티커스(Achromobactor lyticus ) 프로테아제
C-펩티드 - 연결 펩티드
HPLC - 고성능 액체 크로마토그라피
IR - 인슐린 수용체
IGF-1R 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체
LC - 액체 크로마토그라피
MALDI-TOF - 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 타임-오브-플라잇
MS - 질량 분석법
PCR - 폴리머라제 사슬 반응
PD - 약력학 (혈액/혈장 글루코스 저하 효과)
PG - 혈장 글루코스
PK - 약동학(혈액/혈장 인슐린 농도 대 시간 프로파일)
tBu는 tert-부틸이고;
DCM은 디클로로메탄이고;
DIC는 디이소프로필카보디이미드이고;
DIPEA = DIEA는 N,N-디이소프로필에틸아민이고;
DMF는 N,N-디메틸포름아미드이고;
DMSO는 디메틸 술폭시드이고;
EtOAc는 에틸 아세테이트이고;
Fmoc는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐이고;
γGlu (gGlu)는 감마 L-글루타밀이고;
HCl은 염산이고;
HOBt는 1-히드록시벤조트리아졸이고;
NMP는 N-메틸피롤리돈이고;
MeCN는 아세토니트릴이고;
OEG는 [2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸카르보닐이고;
Su는 숙신이미딜-1-일 = 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일이고;
OSu는 숙신이미딜-1-일옥시 = 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시이고;
RPC는 역상 크로마토그라피이고;
RT는 실온이고;
TCTU는 O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N ',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트이고;
TFA는 트리플루오로아세트산이고;
THF는 테트라히드로푸란이고;
TNBS는 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산이고;
TRIS는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄이고; 그리고
TSTU는 O-(N-술신이미딜)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트이다.
일반 적요
다음의 실시예들 및 일반 과정들은 명세서에서 및 합성 스킴에서 확인된 중간화합물 및 최종 생성물을 말한다. 본 발명 화합물의 제조는 다음의 실시예들을 사용하여 상세히 기술하나, 기술된 화학 반응은 본 발명 화합물의 제조에 대한 일반적인 이용성에 관하여 개시된다.
경우에 따라서, 반응은 본 발명의 개시된 범위 내에 포함된 각 화합물에 대해 기술된 대로 이용되지 않을 수도 있다. 이것이 일어나는 화합물들은 당업자에 의해 쉽게 인식될 것이다. 이들 경우에 반응은 당업자에게 알려진 종래의 변형들에 의해, 즉, 방해 기들의 적당한 보호에 의해서, 다른 종래의 시약들로 바꿈으로써, 또는 반응 조건들의 일상적인 변형에 의해서 성공적으로 수행될 수 있다.
또 다르게는, 여기에 개시된 또는 달리 종래의 다른 반응들이 본 발명의 해당 화합물들의 제조에 이용가능할 것이다. 모든 제조 방법에서, 모든 출발물질은 공지이거나 공지의 출발물질로부터 쉽게 제조될 수 있다. 모든 온도는 섭씨 온도로 제시되고, 달리 표시되지 않으면, 모든 부 및 백분율은 수율을 언급할 때 중량에 의한 것이고 모든 부는 용매 및 용리액을 언급할 때 부피에 의한 것이다.
본 발명 화합물은 본 분야 내의 전형적인 다음 과정들 중 한가지 이상을 사용함으로써 정제될 수 있다. 이들 과정은 필요하면, 기울기, pH, 염, 농도, 유량, 컬럼, 등에 관하여 변형될 수 있다. 불순물 프로파일, 해당 인슐린의 용해도 등과 같은 요인들에 따라, 이들 변형은 쉽게 확인될 수 있고 당업자에 의해 행해질 수 있다.
산성 HPLC 또는 탈염 후에, 화합물들은 순수한 분획들의 동결건조에 의해 분리된다.
중성 HPLC 또는 음이온 교환 크로마토그라피 후에, 화합물을 탈염하거나, 등전 pH에서 침전시키거나, 또는 산성 HPLC에 의해 정제한다.
전형적인 정제 과정
RP- HPLC 시스템:
Gilson 시스템은 다음으로 구성된다: Liquid 핸들러 Model 215, Pump Model 322-H2 및 UV 검출기 Model 155 (UV 215 nm 및 280 nm).
음이온 교환 및 탈염 시스템:
Akta Explorer 시스템은 다음으로 구성된다: Pump Model P-900, UV 검출기 Model UV-900 (UV 214, 254 및 280 nm), pH 및 전도도 검출기 Model pH/C-900, Fraction 콜렉터 Model Frac-950.
산성 RP- HPLC :
컬럼: Phenomenex Gemini, 5μM 5u C18 110Å, 30x250mm
유량: 20 mL/분
완충액 A: 물 중의 0.1% TFA
완충액 B: 아세토니트릴 중의 0.1% TFA
중성 RP- HPLC :
컬럼: Phenomenex Gemini, 5μM 5u C18 110Å, 30x250mm
유량: 20 mL/분
완충액 A: 10 mM Tris, 15 mM (NH4)2SO4, pH = 7.3, milliQ중의 20% 아세토니트릴
완충액 B: 아세토니트릴 중의 20% milliQ
음이온 교환 크로마토그라피 :
컬럼-재료: Poros50HQ 또는 Source30Q
유량: 컬럼 의존
완충액 A: 15mM Tris, 25 mM NH4OAc, 50% EtOH, pH = 7.5.
완충액 B: 15 mM Tris, 500 mM NH4OAc, 50% EtOH, pH = 7.5.\
탈염:
컬럼: HiPrep 26/10
유량: 20 mL/분
완충액 A: 물 중의 0.1% TFA
완충액 B: 아세토니트릴 중의 0.1% TFA
아실화 시약을 용액에서 (이하 참조) 또는 예를 들면 WO 2009/115469에 기술된 바와 같은 고체상에서 합성하였다.
일반식 III의 아실화 시약의 고체상 합성을 위한 일반 과정
[Acyl]-[Linker]-Act
상기 식에서 Acyl 및 Linker 기는 위에서 정의한 바와 같고, Act는 N-히드록시숙신이미드(OSu), 또는 1-히드록시벤조트리아졸과 같은 활성 에스테르의 이탈기이고, 그리고
아실 모이어티의 Acyl 및 Linker 모이어티 내의 카르복실산은 tert-부틸 에스테르로서 보호된다.
일반식 III의 화합물은 당업자에게 공지된 고상 펩티드 합성의 분야에서의 과정들을 사용하여 고체 지지체에서 합성될 수 있다.
한가지 이러한 과정은 폴리스티렌 2-클로로트리틸클로라이드 수지에 Fmoc 보호된 아미노산의 부착을 포함한다. 부착은 트리에틸 아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민과 같은, 3차 아민의 존재하에 N-보호된 아미노산을 사용하여 달성될 수 있다(이하 참고문헌 참조). 이 아미노산의 C-말단 단부(이것은 수지에 부착되어 있음)는 본 발명의 모 인슐린에 커플링되어 있는 합성 서열의 단부에 있다.
Fmoc 아미노산의 수지에의 부착 후, Fmoc기는 예를 들면, 피페리딘 또는 디에틸 아민과 같은, 2차 아민을 사용하여 탈보호되고, 이어서 또 다른(또는 같은) Fmoc 보호된 아미노산의 커플링 및 탈보호된다. 합성 서열은 헥사데칸디오, 펜타데칸디오, 또는 테트라데칸디오산 모노-tert-부틸 에스테르와 같은, 모노-tert-부틸 보호된 지방(α, ω) 이산의 커플링에 의해 종결된다.
수지로부터 화합물의 절단은 DCM 중의 0.5-5% TFA/DCM (디클로로메탄 중의 트리플루오로아세트산), 아세트산(예를 들면 DCM 중의 10%, 또는 HOAc/트리플루오로에탄올/DCM 1:1:8), 또는 헤카플루오로이소프로판올과 같이 희석된 산을 사용하여 달성된다(예를 들면 F.Z. Dorwald: Organic Synthesis on Solid Phase; Wiley-VCH 2000, ISBN 3-527-29950-5; N. Sewald & H.-D. Jakubke: Peptides: Chemistry and Biology; Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3; 또는 The Combinatorial Cheemistry Catalog, 1999, Novabiochem AG, 및 거기에 인용된 문헌들 참조). 이것은 카르복실산 보호기로서 화합물에 존재하는 tert-부틸 에스테르가 탈보호되지 않는 것을 보장한다.
최종적으로, C-말단 카르복시기(수지로부터 유리됨)는, 예를 들어서, N-히드록시숙신이미드 에스테르(OSu)로서 활성화된다. 이 활성화된 에스테르는, 예를 들면 순 TFA를 사용하여 탈보호되고, 본 발명의 모 인슐린에의 부착에 커플링제로서 직접 사용되거나 아니면 정제(결정화) 후 사용된다. 이 과정을 이하에 예시한다.
고체상에서 아실화 시약의 합성을 위한 일반 과정을 예시하는 실시예:
테트라데칸디오일 - 4xgGlu - OSu ( Chem . 4)의 합성
Figure pct00004
2-클로로트리틸 수지 100-200 메시 1.5 mmol/g (15.79 g, 23.69 mmol)을 건조한 디클로로메탄(150 mL)에서 20분 동안 팽윤하도록 두었다. 건조한 디클로로메탄(120 mL) 중의 Fmoc-Glu-OtBu (6.72 g, 15.79 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(10.46 mL, 60.01 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 16시간 동안 진탕하였다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물(9:1, 150 mL, 5 분) 중의 N,N-디이소프로필에틸아민(5.5 mL, 31.59 mmol)의 용액으로 처리하였다. 다음에 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 150 mL), 디클로로메탄(2 x 150 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 150 mL)로 세척하였다.
Fmoc기를 N,N-디메틸-포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다(2 x 150 mL, 1 x 5분, 1 x 20분). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 150 mL), 2-프로판올(2 x 150 mL), 디클로로메탄(2 x 150 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 150 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(120 mL) 중의 Fmoc-Glu-OtBu (10.08 g, 23.69 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TCTU, 8.42 g, 23.69 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(7.43 mL, 42.64 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 16시간 동안 진탕하였다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물(9:1, 150 mL, 5분) 중의 N,N-디이소프로필에틸아민(5.5 mL, 31.59 mmol)의 용액으로 처리하였다. 다음에 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 150 mL), 디클로로메탄(2 x 150 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x150 mL)로 세척하였다.
Fmoc기를 N,N-디메틸-포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다(2 x 150 mL, 1 x 5분, 1 x 20분). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 150 mL), 2-프로판올(2 x 150 mL), 디클로로메탄(2 x 150 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 150 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(120 mL) 중의 Fmoc-Glu-OtBu (10.08 g, 23.69 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TCTU, 8.42 g, 23.69 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(7.43 mL, 42.64 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 16시간 동안 진탕하였다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물(9:1, 150 mL, 5분) 중의 N,N-디이소프로필에틸아민(5.5 mL, 31.59 mmol)의 용액으로 처리하였다. 다음에 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 150 mL), 디클로로메탄(2 x 150 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x150 mL)로 세척하였다.
Fmoc기를 N,N-디메틸-포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다(2 x 150 mL, 1 x 5분, 1 x 20분). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 150 mL), 2-프로판올(2 x 150 mL), 디클로로메탄(2 x 150 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 150 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(120 mL) 중의 Fmoc-Glu-OtBu (10.08 g, 23.69 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TCTU, 8.42 g, 23.69 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(7.43 mL, 42.64 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 16시간 동안 진탕하였다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물(9:1, 150 mL, 5분) 중의 N,N-디이소프로필에틸아민(5.5 mL, 31.59 mmol)의 용액으로 처리하였다. 다음에 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 150 mL), 디클로로메탄(2 x 150 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x150 mL)로 세척하였다.
Fmoc기를 N,N-디메틸-포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다(2 x 150 mL, 1 x 5분, 1 x 20분). 수지를 N,N-디메틸-포름아미드(2 x 150 mL), 2-프로판올(2 x 150 mL), 디클로로메탄(2 x 150 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 150 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 및 디클로로메탄(80 mL)의 혼합물 중의 테트라데칸디오산 모노-tert-부틸 에스테르 (7.45 g, 23.69 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N ',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TCTU, 8.42 g, 23.69 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(7.43 mL, 42.64 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 16시간 동안 진탕하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(2 x 150 mL), N,N-디메틸포름아미드(2 x 150 mL), 메탄올(2 x 150 mL) 및 디클로로메탄(10 x 150 mL)으로 세척하였다.
생성물을 밤새 트리플루오로에탄올(150 mL)로 처리에 의해 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(3 x 100 mL)으로 세척하였다. 용매를 감압하에 제거하였다. 잔기를 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그라피(기울기 용리 디클로로메탄/메탄올 100:0 내지 95:5)에 의해 정제하여 백색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다.
생성물을 진공에서 건조시켜 (S)-2-((S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-{(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-[(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-(13-tert-부톡시카르보닐-트리데카노일아미노)-부티릴아미노]-부티릴아미노}-부티릴아미노)-펜탄디오산 1-tert-부틸 에스테르를 수득하였다.
수율: 14.77 g (89%).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.22 (d, J=7.7 Hz, 1 H); 6.97 (d, J=7.9 Hz, 1 H); 6.72 (d, J=7.9 Hz, 1 H); 6.41 (d, J=7.9 Hz, 1 H); 4.59-4.43 (m, 4 H); 2.49-2.13 (m, 16 H); 2.06-1.72 (m, 4 H); 1.70-1.52 (m, 4 H); 1.52-1.38 (m, 45 H); 1.35-1.21 (m, 16 H).
LC-MS 순도: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Sunfire 4.6 mm x 100 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 7.39분.
LC-MS m/z: 1055.0 (M+H)+.
얻어진 tert-부틸 보호된 테트라데칸디오일-4xgGlu-OH ((S)-2-((S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-{(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-[(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-(13-tert-부톡시카르보닐-트리데카노일아미노)-부티릴아미노]-부티릴아미노}-부티릴아미노)-펜탄디오산 1-tert-부틸 에스테르)를 테트라히드로푸란에 용해시켰다. DIPEA를 첨가하고 이어서 아세토니트릴에 용해된 TSTU를 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 교반한 다음 진공에서 증발시키고, 에틸 아세테이트에 재용해시키고, 0.1M HCl (aq)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고 진공에서 증발시켰다. LC-MS (전기분무): m/z = 1174.7 (M+Na+). Calc: 1175.4.
보호되고 OSu-활성화된 화합물을 10 mL TFA에 용해시키고 실온에서 밤새 교반하였다. 디에틸에테르를 첨가하고 형성된 침전을 여과하고 밤새 진공에서 건조시켜 (S)-2-((S)-4-카르복시-4-{(S)-4-카르복시-4-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시-트리데카노일아미노)-부티릴아미노]-부티릴아미노}-부티릴아미노)-펜탄디오산 5-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일) 에스테르 (테트라데칸디오일-4xgGlu-OSu)을 제공하였다. LC-MS (전기분무): m/z = 872.2 (M+H+). Calc: 871.9.
고체상에서 아실화 시약의 합성을 위한 일반 과정을 예시하는 실시예:
테트라데칸디오일 - gGlu - 2xOEG - OSu ( Chem . 5)의 합성
Figure pct00005
13-{(S)-1- tert - 부톡시카르보닐 -3-[2-(2-{[2-(2- 카르복시메톡시 - 에톡시 )- 에틸카바모일 ]-메톡시}-에톡시)-에틸카바모일]-프로필카바모일}-트리데카노산 tert -부틸 에스테르
2-클로로트리틸 수지 100-200 메시 1.7 mmol/g (79.8 g, 135.6 mmol)을 건조한 디클로로메탄(450 mL)에서 20분 동안 팽윤하도록 두었다. 건조한 디클로로메탄(100 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-OEG-OH, 34.9 g, 90.4 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(59.9 mL, 343,6 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 4시간 동안 진탕하였다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물(4:1, 150 mL, 2 x 5분) 중의 N,N-디이소프로필에틸아민(31.5 mL, 180.8 mmol)의 용액으로 처리하였다. 다음에 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 300 mL), 디클로로메탄(2 x 300 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 300 mL)로 세척하였다. Fmoc기를 디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다(1 x 5분, 1 x 30분, 2 x 300 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 300 mL), 2-프로판올(2 x 300 mL) 및 디클로로메탄(350 mL, 2 x 300 mL)으로 세척하였다.
N,N-디메틸포름아미드(250 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산(Fmoc-OEG-OH, 52.3 g, 135.6 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 48.2 g, 135.6 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(42.5 mL, 244.1 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 진탕하였다. 닌히드린 시험이 여전히 포지티브이었기 때문에, 수지를 여과하고 같은 양의 시약으로 추가 30분 동안 처리하였다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 300 mL), 디클로로메탄(2 x 300 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 300 mL)로 세척하였다. Fmoc기를 디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다(1 x 5분, 1 x 30분, 2 x 300 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 300 mL), 2-프로판올(2 x 300 mL) 및 디클로로메탄(350 mL, 2 x 300 mL)으로 세척하였다.
N,N-디메틸포름아미드(250 mL) 중의 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-펜탄디오산 1-tert-부틸 에스테르 (Fmoc-LGlu-OtBu, 57.7 g, 135.6 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 48.2 g, 135.6 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(42.5 mL, 244.1 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 진탕하였다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 300 mL), 디클로로메탄(2 x 300 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 300 mL)로 세척하였다. Fmoc기를 디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다(1 x 5분, 1 x 30분, 2 x 300 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 300 mL), 2-프로판올(2 x 300 mL) 및 디클로로메탄(350 mL, 2 x 300 mL)으로 세척하였다.
디클로로메탄/N,N-디메틸포름아미드 혼합물(4:1, 300 mL) 중의 테트라데칸디오산 모노-tert-부틸 에스테르 (C14(OtBu)-OH, 42.7 g, 135.6 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TCTU, 48.2 g, 135.6 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(42.5 mL, 244.1 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1.5시간 동안 진탕하였다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(6 x 300 mL), 디클로로메탄(4 x 300 mL), 메탄올(4 x 300 mL) 및 디클로로메탄(7 x 600 mL)으로 세척하였다. 생성물을 2,2,2-트리플루오로에탄올(600 mL)로 18시간 동안 처리에 의해 수지로부터 절단하였다. 수지를 디클로로메탄(4 x 300 mL), 디클로로메탄/2-프로판올 혼합물(1:1, 4 x 300 mL), 2-프로판올(2 x 300 mL) 및 디클로로메탄(6 x 300 mL)으로 여과하고 세척하였다. 용액들을 합하고; 용매를 증발시키고 조 생성물을 컬럼 크로마토그라피에 의해 정제하였다(Silicagel 60A, 0.060-0.200 mm; 용리액: 디클로로메탄/메탄올 1:0-9:1).
순수한 13-{(S)-1-tert-부톡시카르보닐-3-[2-(2-{[2-(2-카르복시메톡시-에톡시)-에틸카바모일]-메톡시}-에톡시)-에틸카바모일]-프로필카바모일}-트리데카노산 tert-부틸 에스테르를 진공에서 건조시켰고 오렌지색 오일로서 얻어졌다.
수율: 55.2 g (77%).
RF (SiO2, 디클로로메탄/메탄올 9:1): 0.35.
1H NMR spectrum (300 MHz, CDCl3, δH): 7.37 (bs, 1 H); 7.02 (bs, 1 H); 6.53 (d, J=7.9 Hz, 1 H); 4.54-4.38 (m, 1 H); 4.17 (s, 2 H); 4.02 (s, 2 H); 3.82-3.40 (m, 16 H); 2.37-2.12 (m, 7 H); 2.02-1.82 (m, 1 H); 1.71-1.51 (m, 4 H); 1.47 (s, 9 H); 1.43 (s, 9 H); 1.25 (bs, 16 H).
LC-MS 순도: 100%.
LC-MS Rt (Sunfire 4.6 mm x 100 mm, 아세토니트릴/물 70:30 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.93분.
LC-MS m/z: 791.0 (M+H)+.
13-{(S)-1-tert-부톡시카르보닐-3-[2-(2-{[2-(2-카르복시메톡시-에톡시)-에틸카바모일]-메톡시}-에톡시)-에틸카바모일]-프로필카바모일}-트리데카노산 tert-부틸 에스테르(테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG-OH, 8.89 g, 11,3 mmol))를 100 mL의 아세토니트릴에 용해시켰고, TSTU(4.07 g, 13.5 mmol) 및 DIPEA(2.35 mL, 13.5 mmol)를 교반된 용액에 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔기를 디클로로메탄에 용해시키고 0.05M HCl로 2회 세척하였다.
유기 상을 건조시키고(MgSO4) 진공에서 증발시켰다. 이것은 9.98 g(100%)의 13-((S)-1-tert-부톡시카르보닐-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시카르보닐메톡시)-에톡시]-에틸카바모일}-메톡시)-에톡시]-에틸카바모일}-프로필카바모일)-트리데카노산 tert-부틸 에스테르를 오일로서 제공하였다.
13-((S)-1-tert-부톡시카르보닐-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시카르보닐메톡시)-에톡시]-에틸카바모일}-메톡시)-에톡시]-에틸카바모일}-프로필카바모일)-트리데카노산 tert-부틸 에스테르(4 g)를 트리플루오로아세트산(10 mL)에 용해시키고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 진공에서 증발시켰다. 잔기를 디클로로메탄(10 mL)에 용해시키고 진공에서 증발시켰다. 차거운 디에틸 에테르(10 mL)의 첨가는 백색의 지성의 고체 침전을 가져왔다. 이것은 디캔테이션에 의해 단리되었고 진공에서 건조시켰다. 이것은 3.4 g (quant.)의 14-[[(1S)-1-카르복시-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시-2-옥소에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소부틸]아미노]-14-옥소테트라데카노산 (테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG-OSu)을 제공하였고, 이것을 -18℃에서 보관하였다.
LC-MS (전기분무): m/z = 775,33; calc: 774,8.
아실화 및 인슐린 유도체의 정제
본 발명의 인슐린 유도체의 아실화 및 정제를 위한 일반 과정 (A)를 이하에, 실시예 1에 기술한다. 이 과정은 또한 이하에, 실시예 2-25의 화합물의 합성에도 적용되었다. 다른 방법들(위에서 기술된 바와 같음)을 사용하는 정제도 또한 일부 이들 유도체들에 대해 행해졌다.
실시예 1; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - 4xgGlu ), desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00006
A22K, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린(2.0 g)을 40 mL 0.1M Na2CO3 (aq)에 용해시키고, 1M NaOH (aq)로 pH를 11.2로 조절하였다. 테트라데칸디오일-4xgGlu-OSu(0.454 g)을 2 mL DMF에 용해시키고 1M NaOH (aq)로 pH를 일정하게 11.2로 유지하면서 인슐린 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 0.1M HCl (aq)을 사용하여 pH = 7.5로 중화시키고 1:1 EtOH/milliQ 물로 희석시켰다.
결과된 인슐린을 15 mM Tris, 50v/v% 에탄올, pH 7.5 (아세트산) 중의 25 내지 500 mM 아세트산 암모늄으로 용리하면서, Poros50HQ 74mL 컬럼 상에서 음이온 교환 크로마토그라피에 의해 정제하였다. 순수한 분획의 탈염을 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 milliQ 물 중의 아세토니트릴의 구배로 용리하면서 역상 컬럼 상에서 수행하였다. 결과된 순수한 인슐린을 동결건조하였다. LC-MS (전기분무): m/z = 1629.98 (M+4)/4. Calc: 1630.65.
아실화 시약, 테트라데칸디오일-4xgGlu-OSu는 위에서 기술된 바와 같이 합성하였다.
실시예 2; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - 4xgGlu ), B3E , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GluB3,ArgB29], des-ThrB27, ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00007
이 유사체는 실시예 1에 기술된 방법에 따라 제조하였다.
LC-MS (전기분무): m/z = 1633.9 (M+4H+). Calc: 1634.4
실시예 3; 일반 과정 (A)
A14E , A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - 4xgGlu ), desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GluA14,ArgB29], des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00008
LC-MS (전기분무): m/z = 1622.2 (M+4)/4. Calc: 1622.1
실시예 4; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 헥사데칸디오일 - 4xgGlu ), B3E , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GluB3,ArgB29], des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부타노일]아미노]부타노일] 아미노]부타노일]아미노]부타노일]-Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00009
LC-MS (전기분무): m/z = 1641.2 (M+4H+). Calc: 1641.4.
실시예 5; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 헥사데칸디오일 - gGlu - 2xOEG ), B3E , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GluB3,ArgB29], des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00010
LC-MS (전기분무): m/z = 1616.6 (M+4)/4. Calc: 1617.1
실시예 6; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 헥사데칸디오일 -3x( gGlu - OEG )- gGlu ), B3E , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}[GluB3,ArgB29], des-ThrB27, ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00011
LC-MS (전기분무): m/z = 1749.9 (M+4)/4. Calc: 1750.3
실시예 7; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - 4xgGlu ), B3Q , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GlnB3,ArgB29], des-ThrB27, ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]부타노일]아미노] 부타노일]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00012
LC-MS (전기분무): m/z = 1634.2 (M+4)/4. Calc: 1633.1
실시예 8; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 헥사데칸디오일 - gGlu - 2xOEG ), B3Q , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GlnB3,ArgB29], des-ThrB27, ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00013
LC-MS (전기분무): m/z = 1616.6 (M+4)/4. Calc: 1615.8.
실시예 9; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 헥사데칸디오일 -3x( gGlu - OEG )- gGlu ), B3Q , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GlnB3,ArgB29], des-ThrB27, ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부타노일] 아미노]에톡시]에톡시]아세틸] 아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸] 아미노]-부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00014
LC-MS (전기분무): m/z = 1749.8 (M+4)/4. Calc: 1748.5
실시예 10; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - 2xgGlu ), desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00015
LC-MS (전기분무): m/z = 1565.6 (M+4)/4. Calc: 1566.1
실시예 11; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 헥사데칸디오일 - 4xgGlu ), desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00016
LC-MS (전기분무): m/z = 1637.4 (M+4)/4. Calc: 1636.6
실시예 12; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 헥사데칸디오일 - gGlu - 2xOEG ), desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00017
LC-MS (전기분무): m/z = 1613.2 (M+4)/4. Calc: 1613.4
실시예 13; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 헥사데칸디오일 -3x( gGlu - OEG )- gGlu ), desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린;
IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00018
LC-MS (전기분무): m/z = 1746.4 (M+4)/4. Calc: 1746.5.
실시예 14; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - gGlu ), desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00019
LC-MS (전기분무): m/z = 1533.2 (M+4)/4. Calc: 1533.8
실시예 15; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - gGlu - 2xOEG ), B3E , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GluB3,ArgB29], des-ThrB27, ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00020
LC-MS (전기분무): m/z = 1610.7 (M+4)/4. Calc: 1610.1
실시예 16; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - gGlu - 2xOEG ), B3Q , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GlnB3,ArgB29], des-ThrB27, ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00021
LC-MS (전기분무): m/z = 1609.7 (M+4)/4. Calc: 1609.9
실시예 17; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - 2xOEG ), desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00022
LC-MS (전기분무): m/z = 1606.3 (M+4)/4. Calc: 1606.4
실시예 18; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 헥사데칸디오일 - 4xgGlu ), B3Q , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; UPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GlnB3,ArgB29], des-ThrB27, ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00023
LC-MS (전기분무): m/z = 1640.9 (M+4)/4. Calc: 1641.1
실시예 19; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 펜타데칸디오일 - 4xgGlu ), B3E , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GluB3,ArgB29], des-ThrB27, ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(14-카르복시테트라데카노일아미노)부타노일]아미노]부타노일] 아미노]부타노일]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00024
LC-MS (전기분무): m/z = 1637.63 (M+4)/4. Calc: 1636.76
실시예 20; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - 4xgGlu - 2xOEG ), desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]-에톡시]아세틸]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00025
LC-MS (전기분무): m/z = 1703.0 (M+4)/4. Calc: 1703.2
실시예 21; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - 4xgGlu - 2xOEG ), B3E , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GluB3,ArgB29], des-ThrB27, ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00026
LC-MS (전기분무): m/z = 1706.6 (M+4)/4. Calc: 1707.0
실시예 22; 일반 과정 (A)
A14E , A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - gGlu - 2xOEG ), B3E , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GluA14,GluB3,ArgB29], des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00027
LC-MS (전기분무): m/z = 1601.9 (M+4)/4. Calc: 1601.6
실시예 23; 일반 과정 (A)
A14E , A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - 4xgGlu ), B3E , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GluA14,GluB3,ArgB29], des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00028
LC-MS (전기분무): m/z = 1625.9 (M+4)/4. Calc: 1625.8
실시예 24; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - 2xgGlu ), B3E , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GluB3,ArgB29], des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노-아미노)부타노일]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00029
LC-MS (전기분무): m/z = 1537.7 (M+4)/4. Calc: 1537.5
실시예 25; 일반 과정 (A)
A22K ( N (eps)- 테트라데칸디오일 - gGlu ), B3E , desB27 , B29R , desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GluB3,ArgB29], des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00030
LC-MS (전기분무): m/z = 1537.7 (M+4)/4. Calc: 1537.5
실시예 26; 일반 과정 (A)
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린; IUPAC (OpenEye, IUPAC 스타일) 명칭: N{알파}([GluB3,ArgB29], des-ThrB27,ThrB30-인슐린(사람)-(A)-펩티딜)-N{엡실론}[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]부타노일]아미노]부타노일]Lys,(B)-펩티드.
Figure pct00031
이 유사체는 실시예 1에 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다.
실시예 27; 가용화된 수용체에 대해 측정된, 본 발명의 선택된 인슐린 유도체의 인슐린 수용체 친화도
사람 인슐린 수용체(IR)에 대한 본 발명의 인슐린 유사체의 상대적인 결합 친화도는 섬광 근접 측정법(SPA)(Glendorf T et al. (2008) Biochemistry 47 4743-4751에 따름)에서 경쟁 결합에 의해 결정된다.
간단히는, 사람 인슐린 표준 및 시험할 인슐린 유사체의 희석 시리즈를 96-웰 Optiplates (Perkin-Elmer Life Sciences)에서 수행하고 이어서 100 mM HEPES (pH 7.8), 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4, 및 0.025% (v/v) Tween 20으로 구성되는 결합 완충액 중의 [125I-A14Y]-사람 인슐린, 항-IR 마우스 항체 83-7, 가용화된 사람 IR-A (IR-A 홀로리셉터를 과발현하는 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포로부터 밀 배아 응집소 크로마토그라피에 의해 반정제됨), 및 SPA 비드(항-마우스 폴리비닐톨루엔 SPA 비드, GE Healthcare)를 첨가한다. 플레이트를 온화한 진탕으로 22℃에서 22-24시간 동안 인큐베이션하고, 2000 rpm에서 2분간 원심분리하고 TopCount NXT (Perkin-Elmer Life Sciences)에서 계수한다.
SPA로부터의 데이터를 4-파라미터 로지스틱 모델(Volund A (1978) Biometrics 34 357-365)에 따라 분석하고, 유사체의 결합 친화도를 같은 플레이트 내에서 측정된 사람 인슐린 표준의 결합 친화도에 대하여 계산한다.
관련 어세이가 또한 사용되는데 여기서 결합 완충액은 보다 생리학적 조건을 모사하기 위해 1.5% HSA (w/v) (Sigma A1887)를 함유한다.
본 발명의 선택된 인슐린 유사체의 인슐린 수용체 친화도 및 다른 시험관내 데이터가 이하에, 표 1에 제공된다.
실시예 28; 멤브레인 회합된 수용체 상에서 측정된, 본 발명의 선택된 인슐 린 유도체의 인슐린 및 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 친화도
멤브레인 회합된 사람 IR 및 IGF-1R은 사람 IR-A, IR-B 또는 IGF-IR 삽입물을 함유하는 pZem219B 벡터로 안정적으로 트랜스펙션된 BHK 세포로부터 정제된다. BHK 세포는 빙냉 완충액(25 mM HEPES pH 7.4, 25 mM CaCl2 및 1 mM MgCl2, 250 mg/L 바시트라신, 0.1 mM Pefablock)에서 수집 및 균질화된다. 균질물은 41% (w/v) 수크로스 쿠션 상에 층을 이루고 4℃에서 95000g에서 75분간 원심분리한다. 원형질 막을 수집하고, 완충액으로 1:5 희석하고(상기와 같음) 4℃에서 40000g에서 45분간 다시 원심분리한다. 펠릿을 최소한의 부피의 완충액에 재현탁시키고 니들(크기 23)을 통해 3회 끌어낸 후 사용시까지 -80℃에서 보관한다.
멤브레인 회합된 사람 IR-A, IR-B 또는 IGF-1R 중 어느 하나에 대한 상대적인 결합 친화도는 SPA 셋업에서 경쟁 결합에 의해 결정된다. IR 어세이는 96-웰 OptiPlates(Perkin-Elmer Life Sciences)에서 듀플리케이트로 수행된다. 멤브레인 단백질은 총 부피 200μL 어세이 완충액(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 0.01% Triton X-100, 0.1% (w/v) HSA (Sigma A1887), 완전 EDTA-없는 프로테아제 억제제) 중의 50 pM [125I-A14Y]-사람 인슐린, 50 μg의 밀 배아 응집소(WGA)-코팅된 PVT 미소구(GE Healthcare) 및 증가하는 농도의 리간드와 함께 인큐베이션한다. 어세이는 2000 rpm에서 2분간 플레이트의 원심분리에 의해 종결되고 결합된 방사능을 TopCount NXT (Perkin-Elmer Life Sciences)에서 계수함으로써 정량화한다.
IGF-1R 어세이는 본질적으로 IR 결합 어세이에 관해서 행해지나, 단 멤브레인 회합된 IGF-1R 및 50 pM [125I-Tyr31]-사람 IGF-1이 사용되었다. SPA로부터의 데이터를 4-파라미터 로지스틱 모델(Volund A (1978) Biometrics 34 357-365)에 따라 분석하고, 시험할 유사체의 결합 친화도를 같은 플레이트 내에서 측정된 사람 인슐린 표준의 결합 친화도에 대하여 계산한다.
본 발명의 선택된 인슐린 유사체의 IR (A 이소형) 및 IGF-1R 결합 데이터를 이하에, 표 1에 제공한다.
본 발명의 선택된 인슐린 유사체의 IR (A 이소형 ) 및 IGF -1 수용체 결합 데이터
실시예 No. 상대 IR-A 친화도*
(@ 0% HSA)
(%) 		상대 IR-A 친화도*
(@ 1.5% HSA)
(%) 		상대 IR-A 친화도**
(@ 0.1% HSA)
(%) 		상대 IGF-1R 친화도***
(@ 0.1% HSA)
(%) 		IR IGF1 비율****
1 218.4 106.2 150.4 233.8 0.64
2 144.0 69.2 131.4 137.0 0.96
3 150.2 95.6 111.0 127.8 0.87
4 176.8 10.9 37.8 66.4 0.57
5 178.5 17.0 39.0 184.2 0.21
6 128.0 17.7 54.6 126.5 0.43
7 193.8 111.6 126.3 194.7 0.65
8 169.2 27.6 33.6 197.4 0.17
9 209.0 29.9 19.3 130.9 0.15
10 166.8 91.4 237.6 241.3 0.98
11 277.4 15.8 39.3 108.8 0.36
12 167.6 35.5 46.4 309.7 0.15
13 291.3 29.2 79.9 208.9 0.38
14 211.9 76.7 173.9 325.9 0.59
15 203.0 89.4 98.4 228.5 0.43
16 223.5 92.5 107.3 415.7 0.26
17 241.7 117.9 117.3 546.4 0.21
18 166.2 17.8 36.8 89.8 0.41
19 166.9 52.8 75.8 118.0 0.64
20 184.4 127.8 130.5 260.1 0.50
21 99,0 132,6 74,9 151,7 0,49
22 64,9 54,5 43,6 143,3 0,30
23 84,4 44,3 38,9 90,9 0,43
24 183,5 76.6 84,3 184,3 0,46
25 188,7 68,8 65,2 225,7 0,29
*) 가용화된 클로닝된 사람 인슐린 수용체 A 이소형, 사람 인슐린에 대하여 %로 표시된 데이터, 실시예 27에 제공된 프로토콜.
**) 멤브레인 회합된 클로닝된 사람 인슐린 수용체 A 이소형, 사람 인슐린에 대한 %로 표시된 데이터, 실시예 28에 제공된 프로토콜.
***) 멤브레인 회합된 클로닝된 사람 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체, 사람 인슐린에 대하여 %로 표시된 데이터, 실시예 28에 제공된 프로토콜.
****) 멤브레인 회합된 수용체로부터의 IGF-1R 친화도에 대한 IR-A의 비율, 실시예 28에 제공된 프로토콜.
실시예 29; SEC- HPLC 희석에 의해 분석된 단량체- 2합체 평형
SEC-HPLC (크기 배타 HPLC)로 일련의 희석을 수행하여 아연 없는 인슐린의 단량체-2합체 평형을 산정하였다. Superose 12 10/300 GL 컬럼 상에서 시험할 여러 부피 (2.5-80 μL)의 0.6 mM의 인슐린 유사체를 주입하고, 140 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.7로 0.8 mL/분의 유량으로 용리함으로써, 샘플을 주입 부피에 실제적으로 비례하여 희석한다. 희석의 함수로서 체류 시간의 이동에 기초하여, 두가지 파라미터; 분자량의 증가(Mw-증가) 및 R-경사를 계산하였다.
R-경사는 체류 시간 대 log(주입 부피) 플롯의 경사로서 유도된 한편 Mw-증가는 최저 및 최고 주입 부피 간의 겉보기 분자량 증가로서 기준 샘플들의 세트를 통해 계산되었다. 두 파라미터들은 인슐린 유사체가 희석에 반응하여 해리하는 경향을 반영하고 따라서, sc 주사시에 단량체들로 신속한 해리를 얻기 위한 가능성을 반영한다.
이들 측정의 결과 및 종래 기술의 인슐린 유사체의 결과들을 이하에, 표 2-4에 제공한다.
분자량의 증가(Mw-증가), 본 발명의 화합물
화합물 실시 예 번호 R-경사 (min/μL) Mw-증가 (%)
1 -0.05 3.18
2 -0.06 4.29
3 -0.06 5.18
4 -0.02 1.69
7 -0.03 2.55
10 -0.08 6.01
11 -0.13 10.71
분자량의 증가(Mw-증가), 종래 기술의 화합물 (WO 2009/022013‡)
종래 기술
Ex.‡ 		R-경사
(min/μL) 		MW-증가
(%)
인슐린 아스파르트 -0.04 3.00
사람 인슐린 -0.65 56.0
1 -0.78 83.2
4 -0.66 68.2
5 -0.52 53.3
42 -0.74 75.8
44 -0.75 75.5
45 -0.73 71.6
주어진 실시예 번호들은 종래 기술(예를 들면 WO 2009/022013)에 기술된 공지의 B27Thr 잔기의 결실(desB27) 없는 A22K 아실화 유사체이다.
분자량의 증가(Mw-증가), 종래 기술의 화합물 (WO 2007/096431‡)
종래 기술
Ex No‡ . 		R-경사
(분/ μL ) 		MW-증가
(%)
11 * *
12 -0.66 74.4
*) pH 7.4에서 인슐린 유사체의 불량한 용해도로 인해 데이터가 얻어질 수 없었다.
주어진 실시예 번호들은 종래 기술(예를 들면 WO 2007/096431)에 기술된 공지의 B27Thr 잔기의 결실(desB27) 없는 A22K 아실화 유사체이다.
결론
desB27 유사체인, 본 발명의 A22K 아실화 인슐린은 희석에 반응하여 해리하기가 훨씬 더 쉽고, 따라서 종래 기술의 유사한 A22K 아실화 유사체(B27Thr 잔기의 결실 없음)보다 식전(prandial) 볼러스 투여에 훨씬 더 유용하다고 결론지을 수 있다. 이 어세이에서 본 발명의 인슐린은 사람 인슐린(식전 인슐린으로도 사용되나, 인슐린 아스파르트보다 더 느린 작용 프로파일을 가짐)보다 인슐린 아스파르트(NovoRapid? 또는 NovoLog?(Novo Nordisk A/S)로서 상업적으로 구입되며, 식전 인슐린으로서 사용됨)와 비슷하고 종래 기술에 비하여 본 발명의 유도체의 개선된 성질을 강조한다고 또한 결론지을 수 있다.
본 발명의 유사체는 모두 더 적은 네거티브 R-경사 -0.13 내지 -0.02 (표 2) 를 가지며 따라서 사람 인슐린 (R-경사 -0.65; 표 3 참조)보다 훨씬 더 인슐린 아스파르트(R-경사 -0.04; 표 3 참조)와 비슷하다. 반대로, 종래 기술의 모든 시험된 유사한 유사체는 사람 인슐린(-0.52 내지 -0.78; 표 3 및 4)과 비슷한 R-경사를 갖는다. 결론적으로, 본 발명의 모든 유사체는 종래 기술보다 더 적은 Mw-증가를 나타내었다(각각, 10.7% 이하 대 53-83%, (표 2, 3 및 4 참조).
이들 데이터는 본 발명 화합물이 종래 기술의 유사한 유사체보다 더 단량체성임을 가리킨다. 이런 점에서, 본 발명의 화합물은 인슐린 아스파르트와 비슷한 한편, 종래 기술의 유사한 유사체는 사람 인슐린과 비슷하다.
실시예 30; 작은 각 X-선 산란( SAXS )에 의해 측정된 자기 회합
피하주사 후 시험할 인슐린 유사체의 자기 회합 상태를 추산하기 위해 SAXS 데이터를 사용하였다. SAXS 데이터를 pH 7.4에서 0.6 mM의 시험할 인슐린 유사체 및 140 mM NaCl를 함유하는 Zn-없는 제형으로부터 수집하였다. SAXS 산란 프로파일이 다성분 혼합물에서 모든 개개 성분들로부터 강도 기여를 갖는다는 사실을 사용하여 각 유사체에 대해, 단량체, 2합체 및 더 큰 종들의 상대적인 양을 추산하였다. 각 성분으로부터의 강도(폼 팩터)를 사용함으로써 혼합물 중의 각 성분의 부피 분획 기여를 추산하는 것이 가능하다. 실험상 및 계산된 산란 곡선 사이의 차이를 최소화하기 위해 네거티브가 아닌 또는 구속되지 않은 최소제곱법의 알고리즘을 사용하는 선형 방정식 시스템을 사용한다. 폼 팩터(Form factors)를 단량체, 2합체, 6합체 등의 결정 구조로부터 계산한다. 부피 분율은 퍼센트(%)로 표시한다.
평균 분자량을 기지의 농도를 갖는 기준 샘플을 사용함으로써 개산하고 분자 질량의 비율이 제로 각도, I(0)에서 산란된 강도의 비율과 동일하다고 가정하여, 측정된 농도에 대해 정규화한다. 본 발명의 유도체와 종래 기술의 유도체로부터 얻어진 결과를 이하에, 표 5, 6 및 7에 나타낸다.
본 발명의 유도체의 SAXS 데이터
Ex. No. 회전 반경, Rg
(nm) 		Dmax**
(nm) 		단량체
(%) 		2합체
(%) 		더 큰 종
(%)
1 1.8 6.5 80 0 20
2 1.4 4.3 74 24 2
4 1.3 4.0 69 30 1
10 1.8 6.6 78 0 22
11 1.6 5.7 63 26 11
7 1.6 5.8 66 27 7
18 1.6 5.5 56 39 5
종래 기술의 유도체의 SAXS 데이터(WO 2009/022013‡)
Ex. No.‡
회전 반경, Rg
(nm) 		Dmax
(nm) 		단량체
(%) 		2합체
(%) 		더 큰 종
(%)
5 2.9 10 48 0 52
4 3.2 11.4 0 58 42
44 2.3 8.0 0 57 43
6 2.4 7.9 30 22 48
42 2.6 8.9 0 47 53
1 2.8 10.0 0 46 54
45 2.4 8.2 27 17 56
종래 기술의 유도체의 SAXS 데이터(WO 2007/096431‡)
Ex. No.‡
회전 반경, Rg
(nm) 		Dmax
(nm) 		단량체
(%) 		2합체
(%) 		더 큰 종
(%)
12 3.1 12.0 48 0 52
11* * * * * *
*) 어세이 완충액에서 침전된 유도체, 매우 큰 종 또는 응집물의 존재를 가리킨다. 데이터가 얻어질 수 없었다.
이들 연구로부터 본 발명의 유도체는 주사후 피하 조직에서의 상태를 모방하는 상태에서, 단량체로 훨씬 더 해리되기 쉽고 따라서 종래 기술의 유사체보다 피하 주사후 훨씬 더 빠르게 흡수될 것이라고 결론지을 수 있다. 단량체 함량은 본 발명의 유사체에 대해 63-83%, 대(versus) 종래 기술의 유사체에 대해 0-48%에 이른다. 종래 기술의 유사체에 대해서는, 관찰된 가장 큰 분자 종은 크기(Rg 및 Dmax)가 둘다 더 크고 뿐만 아니라 더 큰 양(42-62% 대 1-22% 본 발명 유사체)으로 발견된다. 이것은 종래 기술의 유사체와 비교해 식전 사용을 위한 유사체의 이용을 강조한다.
실시예 31; 약학적 제제의 제조
본 발명의 약학적 제제는 수용액으로서 조제될 수 있다. 수용액은 예를 들어서, 염화나트륨 및/또는 글리세롤로 등장성으로 만들어진다. 더욱이, 수성 매질은 완충액 및 보존제를 함유할 수도 있다. 제제의 pH 값은 원하는 값으로 조절되고 해당 인슐린 유사체의 등전점, pI에 따라, 약 3 내지 약 8.5, 약 3 내지 약 5, 또는 약 6.5, 또는 약 7.4, 또는 약 7.5일 수 있다.
무아연 인슐린 제형의 제조
무아연 인슐린 유사체를 수용액에 용해시켰는데, 최종 제형에서 0.6 mM 인슐린 유사체, 16 mM m-크레졸, 16 mM 페놀, 7 mM 인산수소2나트륨, 적당량의 니코틴 아미드 및 글리세롤을 함유하였고, pH는 1 N 염산/1 N NaOH를 사용하여 7.3-7.5(실온에서 측정됨)로 조절하였다. 물을 첨가하여 최종 부피로 하고 용액을 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과하였다. 제형을 2 ml 바이알에 충전하고 크림프 캡을 사용하여 실링하였다.
인슐린 제제의 예시 조성물
Ex. No 인슐린 유도체 (mM) 페놀
(mM) 		m-크레졸
(mM) 		니코틴아미드 (mM) 글리세롤
(% w/v) 		인산염 (mM) pH
A 2 0.6 16 16 - 1.8 7 7.4
B 2 0.6 16 16 80 1.3 7 7.4
C 2 0.6 16 16 170 0.7 7 7.4
D 7 0.6 16 16 - 1.8 7 7.4
E 7 0.6 16 16 80 1.3 7 7.4
F 7 0.6 16 16 170 0.7 7 7.4
G 4 0.6 16 16 - 1.8 7 7.4
H 4 0.6 16 16 80 1.3 7 7.4
I 4 0.6 16 16 170 0.7 7 7.4
J 180 0.6 16 16 170 0.7 7 7.4
실시예 32; 단백질 제형의 물리적 안정성의 산정을 위한 ThT 피브릴화 어세이
펩티드의 낮은 물리적 안정성은 샘플에서 잘 정돈된, 실(thread) 같은 거대분자 구조물로서 관찰되고 결국 겔 형성을 가져오는 아밀로이드 피브릴 형성을 이끌 수 있다. 티오플라빈(Thioflavin) T (ThT)는 피브릴에 결합할 때 뚜렷한 형광 표시를 갖는다[Naiki et al. (1989) Anal. Biochem . 177 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol . 309 274-284].
펩티드의 부분적으로 접힌 중간체의 형성은 피브릴화를 위한 일반적인 개시 메카니즘으로서 제안된다. 이들 중간체들의 소수가, 더 이상의 중간체가 조립되고 피브릴화가 진행하는 템플레이트를 형성하기 위해 응집한다. 지연시간(lag-time)은 핵의 임계 질량이 축적되는 간격에 해당하고 겉보기 속도 상수는 피브릴 자체가 형성되는 속도이다(도 1).
샘플 제조
샘플을 각 어세이 전에 새롭게 준비하였다. 각 조성물의 샘플들을 수성 ThT-용액(0.1 mM ThT)과 990:10의 부피 비율로 혼합하고 96 웰 마이크로타이터 플레이트(Packard Opti-Plate™-96, 백색 폴리스티렌)에 옮겼다. 보통, 각 샘플(한가지 시험 조건에 해당함)의 4개 또는 8개의 복제물을 한 컬럼의 웰들에 놓았다. 플레이트를 Scotch 15 Pad (Qiagen)로 밀봉하였다.
배양 및 형광 측정
주어진 온도에서의 인큐베이션, 진탕 및 ThT 형광 방출의 측정을 Fluoroskan Ascent FL 형광 플레이트 판독기 또는 Varioskan 플레이트 판독기(Thermo Labsystems)에서 행하였다. 온도를 37℃로 조절하였다. 회전식 진탕(orbital shaking)을 모든 제공된 데이터에 대해 1mm의 진폭으로 960rpm으로 조절하였다. 형광 측정을 444nm 필터를 통한 여기 및 485 nm 필터를 통한 방출의 측정을 사용하여 행하였다. 각 실행은 어세이 온도에서 10분 동안 플레이트를 인큐베이션함으로써 개시되었다. 플레이트를 매 20분 마다 45시간 동안까지 측정하였다. 각 측정 사이에, 플레이트를 진탕하고 기술된 바와 같이 가열하였다.
데이터 취급
형광 대 시간 플롯은 마이크로소프트 엑셀에서 만들고 지연시간은 도 14A, 14B 및 14C에서 예시된 바와 같이 (각각 예시 1A, 1B 및 1C), 지연 존(Lag Zone)의 선형 개략치 및 피브릴화 존(Fibrillation Zone) 사이의 절편으로서 추산되었다. 지연시간의 증가는 증가된 물리적 안정성에 해당한다. 데이터 지점들은 전형적으로 4개 또는 8개 샘플들의 평균이다.
본 발명의 A22K 아실화 유사체, 및 B27Thr 잔기의 결실(desB27) 없는 종래 기술의 유사한 A22K 아실화 유사체에 대해 얻은 결과들을 이하에, 표 8에 나타낸다.
표 8
무아연 제제의 ThT 지연시간으로서 측정된 물리적 안정성
Figure pct00032
* ThT 어세이의 시간범위 내에 피브릴화 없음
본 발명의 A22K 아실화 인슐린 유사체는 종래 기술의 유사한 유사체보다 첨가된 니코틴아미드를 가진 것과 없는 것 둘다의 무아연 제형에서 피브릴화에 대하여 더 양호하거나 또는 유사한 안정성을 나타낸다(즉, 증가된 물리적 안정성을 갖는다)고 결론지어진다. 이것은 SAXS 및 SEC-HPLC 희석 데이터가 본 발명의 인슐린 유사체가 크기가 더 작다(즉, 단량체 및 2합체들로 구성된다)는 것을 가리키는데, 당업자가 예상하게 되는 바 더 적은 물리적 안정성을 이끌 것이라는 것 때문에 매우 놀랍다.
실시예 33; 인슐린 화학적 안정성의 분석
크기 배타 크로마토그라피
사용된 제형: 실시예 31 참조
고분자량 단백질(HMWP) 및 단량체 인슐린 유사체의 정량적 측정은 55% (v/v) 아세토니트릴, 0.05% TFA를 함유하는 용리액으로 0.2 ml/분의 유량으로 및 40℃의 컬럼 온도에서 Waters Acquity BEH200 SEC 컬럼(150 x 2.4mm, part no. 186005225)에서 수행되었다. 검출은 조율가능한 흡광도 검출기(Waters Acquity TUV)로 215 nm에서 수행하였다. 주입 부피는 600 μM 인슐린 유사체 제형 및 600 μM 사람 인슐린 표준 둘다 1.5 μl이었다. 각 유사체 제제를 5, 25 및 37℃에서 2ml 바이알에서 인큐베이션하였다. 정해진 시간들에서 제제의 HMWP 및 함량을 측정하였다. 결과를 이하에, 표 9에 나타낸다.
37℃에서 보관에 의한 HMWP 함량
37℃에서 주수
실시예 No 2
실시예 No 4
실시예 No 7 		Ex. No 18 WO 2009/022013
Ex. No 5
A B C D E F G H I J -
0 0.5% 0.1% 0.1% 0.5% 0.2% 0.2% 1.9% 0.1% 0.1% 0.5% 3.3%
2 0.6% 0.2% 0.2% 0.7% 0.4% 0.4% 2.5% 0.5% 0.5% 1.1% 4.9%
4 0.8% 0.3% 0.3% 1.0% 0.5% 0.5% 4.1% 0.7% 0.7% * 13.1%
8 2.3% * * 2.2% * * 6.8% * * * 29.1%
* 측정 안됨
37℃에서 무아연 제형에서 보관에 의한 고분자량 단백질(HMWP)의 형성은 본 발명의 인슐린 유도체에 대해서 훨씬 적다고 결론지어진다(각각 실시예 2, 4 및 7의 본 발명의 인슐린에 대해 8주 보관 후 6.8%까지의 HMWP 형성인 반면에, 종래 기술의 유사한 인슐린 유도체는 29.1% HMWP의 형성을 가져온다). 본 발명의 인슐린 유도체는 37℃에서 보관했을 때 무아연 제형에서 및 니코틴아미드의 존재하에 낮은 수준의 HMWP를 형성한다고 또한 결론지어진다.
역상 크로마토그라피 ( UPLC )
인슐린 관련 불순물의 측정은 Phenomenex Kinetex C18 컬럼, 크기 2.1x150mm, 입자 크기 1.7 μm, 및 기공 크기 100 Å (Phenomenex part no. 00F-4475-AN)을 사용하는 UPLC 시스템에서, 0.3 ml/분의 유량으로 50℃에서 수행하였고 215 nm에서 UV 검출하였다. 용리는 다음으로 구성되는 이동상으로 수행하였다: A: 10% (v/v) 아세토니트릴, 0.09M 인산수소2암모늄, pH 3.6, 및 B: 80% (v/v) 아세토니트릴. 구배: 컬럼 세척에 대해 15% B로부터 26% B로 0-7분 선형 변화, 40% B로 7-34분 선형 변화, 80% B로 34-36분 선형 변화, 그후 39분 15% B에서 초기 조건으로 복귀함. 불순물의 양은 보존제의 용리후 측정된 총 흡광도 영역의 퍼센트로 측정된 흡광도 영역으로서 측정되었다. 각 유사체 제제는 5, 25 및 37℃에서 2ml 바이알에서 인큐베이션하였다. 정해진 시간에서 제제의 인슐린 관련 불순물을 측정하였다. 결과를 이하에, 표 10에 나타낸다.
37℃에서 보관에 의한 순도
37℃에서 주수
실시예 No 2
실시예 No 4
실시예 No 7
Ex. No 18 		WO 2009/022013 Ex No 5
제형 A B C D E F G H I J -
0 95.2% 98.1% 97.8% 92.0% 95.7% 95.4% 84.1% 98.13% 98.0% 92.9% 88.4%
2 93.8% 96.8% 96.6% 90.5% 94.8% 95.1% 79.7% 95.6% 95.5% 90.0% 36.3%
4 93.2% 94.4% 94.3% 89.3% 92.3% 92.1% 76.4% 93.2% 92.7% * 16.1%
8 87.5% * * 86.5% * * 69.1% * * * 4.1%
* 측정 안됨
본 발명의 인슐린 유도체는 종래 기술의 유사한 A22K 아실화 유사체보다 아연 없는 제형에서 훨씬 더 안정하다고 결론지어진다. 종래 기술의 유사체는 37℃에서 8주 보관후 유도체의 5% 미만이 그대로인(84% 포인트의 순도의 상실에 해당함) 정도로 불안정하다. 본 발명의 인슐린 유사체( 실시예 2, 4 및 7의 화합물로 표시됨)는 37℃에서 8주 보관후 각각 7.7 미만, 5.5 및 15% 포인트 순도 상실을 갖는다. 본 발명의 인슐린 유도체는 첨가된 니코틴아미드를 가진 무아연 제형에서 안정하다고 또한 결론지어진다.
실시예 34; LYD 돼지에서 피하 PK/PD 프로파일
본 발명의 인슐린 유도체는 돼지에 피하 투여에 의해, 예를 들어서 상업적 제형에서의 인슐린 아스파르트(NovoRapid)와 비교하거나 또는 이 프로토콜에 따른 종래 기술의 유사한 A22K 아실화 인슐린 유사체와 비교하여 시험할 수 있다. 유도체는 약동학(pharmacokinetic) 및/또는 약력학(pharmacodynamic) 파라미터에 대해 시험할 수 있다.
사용된 일반 방법
초음파 검사 및 주입 영역의 표시
영구 정맥내 카테테르의 배치를 위한 마취의 동안에, 돼지를 Esaote 초음파 스캔너 모델 "MyLabFive" 및 선형 프로브 타입 "LA435 6-18 MHz"을 가지고 초음파로 검사하였다. 귀와 어깨뼈 사이의 중간 목을, 오른쪽 또는 왼쪽에서(카테테르 반대쪽), (피하 주사에 적합한) 하부 근육 없는 2 x 2 cm의 면적을 확인하고 문신으로 표시한다.
급식 스케쥴
돼지들을 실험에 앞서 금식(아침 금식)시킨다.
돼지들을 전체 실험 동안에 정상적인 우리에 두고 그것들을 마취시키지 않는다. 돼지들을 12-시간 혈액 샘플이 수집될 때까지 금식시키나, 물은 자유 접근시켰다. 12-시간 혈액 샘플 후 돼지들을 음식과 사과를 먹였다.
투약(Dosing)
펜필(Penfill)을 NovoPen?4에 장치한다. 각 돼지마다 새 바늘을 사용한다. 상피 5mm 아래로 최대 피하(max sc) 침투를 확보하기 위해 바늘 스톱퍼를 사용한다. 각 돼지마다 용량(Dose) 부피(IU volume)를 계산하고 적어 놓는다.
용량 부피 (U) = ((체중 x 용량 nmol/kg) / 농도 nmol/mL) x 100 U/mL
돼지를 목의 오른쪽 또는 왼쪽에서(카테테르 반대쪽에서) 측면으로 피하조직에 투약하고 화합물의 침적을 확보하기 위해 주사후 최소 10초간 피하조직에 바늘을 유지시킨다.
저혈당증의 치료
피하 투약후, 저혈당증을 예방하기 위해 글루코스 용액을 정맥내(i.v.) 주사를 위해 준비해야 한다. 즉, 4-5개의 주사기(20 mL)를 멸균 20% 글루코스로 채우고, 사용할 준비를 한다. 저혈당증의 진단은 임상적 증상과 혈당측정기 (Glucocard X-meter)에서의 혈당(blood glouse) 측정치에 기초한다.
치료는 50-100 ml 20% 글루코스(10-20 g 글루코스)의 느린 정맥내 주사로 구성된다. 글루코스는 효과시까지 5-10분에 걸쳐 부분들로 제공한다.
혈액 샘플링
10 IU/mL 헤파린의 첨가 없이 멸균 0.9% NaCl로 실험에 앞서 경정맥 카테테르의 개방성을 점검한다.
투약 전과 후에, 혈액 샘플은 다음 시점들에서 중심 정맥 카테테르로부터 한정하게 취하게 될 것이다:
사전용량(Predose) (-10, 0), 3, 6, 9, 12, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540, 600 및 720 분
삼방콕으로 샘플들을 취한다. 4-5 ml의 폐기할 혈액을 끌어내고 버린 후 샘플을 취한다.
0.8 ml의 혈액 샘플들을 글루코스 및 인슐린 분석을 위해 EDTA로 코팅된 튜브들에 수집한다.
각 혈액 샘플 후 카테테르를 10 IU/mL 헤파린의 첨가 없이 5 ml의 멸균 0.9% NaCl로 플러싱한다.
튜브를 최소 10회 완만하게 기울여 혈액과 항응고제(EDTA)의 충분한 혼합을 확보하고 1분후 그것을 젖은 얼음에 둔다. 튜브를 샘플링 후 1시간 내에 3000 rpm 및 4℃에서 10분간 회전시킨다. 샘플들을 피펫팅할 때까지 젖은 얼음에 보관한다.
응고(clotting)의 증가된 위험과 함께 카테테르에서의 세균 성장을 피하기 위해 무균 기술이 요구된다.
실험 후 카테테르의 폐쇄
혈액 샘플링이 무균 기술을 사용하여 수행되지 않았다면, 혈액 샘플링에 사용된 카테테르를 통해 정맥내로 서서히 1 ml/10 kg Pentrexyl? (1 g의 암피실린이 10 ml 0.9% NaCl에 용해됨)로 단일 정맥내 처치가 투여될 수 있다. 이 처치에 이어서, 카테테르를 10 ml 0.9% NaCl로 플러싱한다.
카테테르를 헤파린(10 IU/mL) 첨가된 5 ml의 멸균 0.9% NaCl로 플러싱한다. 카테테르를 라텍스 주입 멤브레인을 갖는 새로운 루어록으로 폐쇄하고 1.0 ml의 TauroLockHep500을 카테테르를 위한 록으로서 멤브레인을 통해 주입한다.
혈액 샘플의 분석
혈장 글루코스: 10 μl의 혈장을, BIOSEN 자동분석기에서 혈장 내 글루코스 농도의 측정을 위해 500 μl의 완충액 용액으로 피펫팅한다.
혈장 인슐린: 1 x 50 μl의 혈장을, ELISA 또는 LC-MS을 사용하여, 분석을 위해 0.65 ml Micronic? 튜브(ELISA/LOCI/SPA 셋업)으로 피펫팅한다.
혈장을 -20℃에서 동결 보관한다.
실시예 35; LYD 돼지에서 실시예 1의 인슐린 유도체의 피하 PK/PD 프로파일
위의 일반 과정을 따라, 다음의 PK 및 PD 프로파일을 실시예 1의 인슐린 유도체에 대해 얻었다.
사용된 제형
실시예 1의 인슐린 유도체, pH=7.4; 609 μM; 1.6% (w/vol) 글리세롤; 30 mM 페놀(0 Zn/6합체).
인슐린 아스파르트, 상업적 제형, 600 μM; 1.6% (w/vol) 글리세롤; 7 mM 인산염; 10 mM 염화나트륨; 300 μM 아세트산 아연; 16 mM 페놀; 16 mM m-크레졸.
이들 측정의 결과를 첨부된 도 1-4 및 이하에, 표 11에 제공한다.
약동학 파라미터(평균±SD)
화합물 T max a
(분) 		Cmax/D
pM/
(nmol/kg) 		AUC/D
pM*분/
(pmol/kg) 		% extrap T ½ b
(분) 		MRT
(분)
실시예 1
0 Zn/6합체
1 nmol/kg (n=8)		 평균 11 1212 122 2 116 165
SD 456 25 10 20
NovoRapid?
0.5 nmol/kg (n=8)		 평균 11 1277 67 2 67 93
SD 788 26 16 19
NovoRapid?
1 nmol/kg (n=8)		 평균 14 880 64 2 75 110
SD 335 20 7 11
a Tmax 중앙값으로 주어짐
b T½ 조화평균±슈도 SD로 주어짐
c 생체이용성은 정맥내 데이터에 기초하여 계산됨(표시않음)
결론
아연 없는 제형에서 실시예 1의 인슐린 유도체는 인슐린 아스파르트 (NovoRapid?) 상업적 제형과 매우 유사한 PK/PD 프로파일을 갖는다고 결론지어진다. 또한, 이 인슐린 유도체의 평균 체류시간은 165 분이었다. 실시예 1의 인슐린 유도체는 초속효성(rapid acting)(식전) 인슐린으로서 유용하다고 결론지을 수 있다.
실시예 36; LYD 돼지에서 실시예 2의 인슐린 유도체의 피하 PK/PD 프로파일
위의 일반 과정을 따라, 다음의 PK 및 PD 프로파일을 실시예 2의 인슐린 유도체에 대해 얻었다.
사용된 제형
실시예 2의 인슐린 유도체, pH=7.367; 607 μM; 1.6% (w/vol) 글리세롤; 30 mM 페놀 (0 Zn/6합체).
인슐린 아스파르트, 상업적 제형, 600 μM; 1.6% (w/vol) 글리세롤; 7 mM 인산염; 10 mM 염화나트륨; 300 μM 아세트산 아연; 16 mM 페놀; 16 mM m-크레졸.
이들 측정의 결과를 첨부된 도 4-5 및 이하에, 표 12에 제공한다.
약동학 파라미터(평균±SD)
화합물 T max a
(분) 		C max /D
pM/
(nmol/kg) 		AUC/D
pM*분/
(pmol/kg) 		% extrap T ½ b
(분) 		MRT
(분)
실시예 2
0 Zn/6합체
1 nmol/kg (n=7)		 평균 45 762 68 5 64 111
SD 342 9 15 21
NovoRapid
0.5 nmol/kg (n=7)		 평균 30 923 60 2 53 92
SD 510 8 15 10
NovoRapid
1 nmol/kg (n=6)		 평균 25 771 64 1 53 98
SD 254 16 15 28
a Tmax 중앙값으로 주어짐
b T½ 조화평균±슈도 SD로 주어짐
c 생체이용성은 정맥내 데이터에 기초하여 계산됨(표시않음)
결론
아연 없는 제형에서 실시예 2의 인슐린 유도체는 인슐린 아스파르트와 매우 유사한 PK/PD 프로파일을 갖는다고 결론지어진다. 또한, 이 인슐린 유도체의 평균 체류시간은 111 분이었는데, NovoRapid? (인슐린 아스파르트)와 크게 다르지 않다. 실시예 2의 인슐린 유도체는 초속효성(식전) 인슐린으로서 유용하다고 결론지을 수 있다.
실시예 37; LYD 돼지에서 실시예 11의 인슐린 유도체의 피하 PK/PD 프로파일
위의 일반 과정을 따라, 다음의 PK 및 PD 프로파일을 실시예 11의 인슐린 유도체에 대해 얻었다.
사용된 제형
실시예 11의 인슐린 유도체, pH=7.44; 689 μM; 1.6% (w/vol) 글리세롤; 30 mM 페놀 (0 Zn/6합체).
이들 측정의 결과를 첨부된 도 6-7 및 이하에, 표 13에 제공한다.
도 6 및 7은 0 아연/6개 인슐린 분자(1 nmol/kg)로 조제된 실시예 11의 인슐린의 PK(pharmacokinetic) 프로파일(인슐린 농도 대 시간)을 나타내며, 혈장 글루코스에서 결과된 변화, 각각; 1 nmol/kg을 나타낸다.
약동학 파라미터(평균±SD)
화합물 T max a
(분) 		Cmax/D
pM / (nmol/kg) 		AUC/D
pM*분 / (pmol/kg) 		% extrap T ½ b
(분) 		MRT
(분)
실시예 11
1 nmol/kg (n=4)		 평균
SD		 38
 1207
330		 261
60		 12
 245
32		 334
46
a Tmax 중앙값으로 주어짐
b T½ 조화평균±슈도 SD로 주어짐
아연 없는 제형에서 실시예 11의 인슐린 유도체는 식전 인슐린으로서 품질을 갖는 PK 프로파일을 갖는다고 결론지어진다. 또한, 이 인슐린 유도체의 평균 체류시간은 334분이었는데, 종래 기술의 유사한(또한) 1,16-헥사데칸디오산 함유 인슐린 유도체, A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 사람 인슐린 (WO 2009/022013, 실시예 45, (MRT = 1287 분)에 대해서 얻은 프로파일보다 상당히 더 짧았다. 이하 참조. 실시예 11의 인슐린 유도체는 초속효성(식전) 인슐린으로서 유용하다고 결론지을 수 있다.
실시예 38; LYD 돼지에서 실시예 4의 인슐린 유도체의 피하 PK/PD 프로파일
위의 일반 과정을 따라, 다음의 PK 및 PD 프로파일을 실시예 4의 인슐린 유도체에 대해 얻었다.
사용된 제형
실시예 4의 인슐린 유도체, pH=7.43; 621 μM; 1.8% (w/vol) 글리세롤; 16 mM 페놀; 16 mM m-크레졸, 10 mM 염화나트륨 (0 Zn/6합체).
이들 측정의 결과를 첨부된 도 8-9 및 이하에, 표 14에 제공한다.
약동학 데이터
화합물 T max a
(분) 		C max /D
pM / (nmol/kg) 		AUC/D
pM*분 / (pmol/kg) 		% extrap T ½ b
(분) 		MRT
(분)
실시예 4
0 zn/6합체
1 nmol/kg		 평균
SD		 45
 1272
394		 255
41		 8
 160
26		 235
34
a) Tmax 중앙값으로 주어짐
b) T½ 조화평균±슈도 SD로 주어짐
아연 없는 제형에서 실시예 4의 인슐린 유도체는 식전 인슐린으로서 품질을 갖는 PK 프로파일을 갖는다고 결론지어진다. 또한, 이 인슐린 유도체의 평균 체류시간은 160분이었는데, 종래 기술의 유사한 1,16-헥사데칸디오산 함유 인슐린 유도체, A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 사람 인슐린 (WO 2009/022013, 실시예 45, (MRT = 1287분)에 대해서 얻은 프로파일보다 상당히 더 짧았다. 이하 참조. 실시예 4의 인슐린 유도체는 초속효성(식전) 인슐린으로서 유용하다고 결론지을 수 있다.
실시예 39; LYD 돼지에서 종래 기술의 인슐린 유도체의 피하 PK/PD 프로파일
위의 일반 과정을 따라, 다음의 PK 및 PD 프로파일을 종래 기술의 인슐린 유도체, A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 사람 인슐린 (WO 2009/022013, 실시예 45)에 대해 얻었다.
사용된 제형
WO 2009/022013의 화합물, 실시예 45, 588 μM; 1.6% (w/vol) 글리세롤; 30 mM 페놀; 7 mM Tris, pH=7.4 (0 Zn/6합체), 1 nmol/kg.
이들 측정들의 결과는 첨부된 도 10 및 11에, 그리고 이하에, 표 15에 제공된다.
도 10 및 11은 0 아연/6개 인슐린 분자(1 nmol/kg)로 조제된 종래 기술의 인슐린 유도체, 즉, A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 사람 인슐린(WO 2009/022013, 실시예 45)의 PK(pharmacokinetic) 프로파일(인슐린 농도 대 시간)을 나타내며, 혈장 글루코스에서 결과된 변화를 각각 나타낸다(1 nmol/kg).
WO 2009/0022013, 실시예 45의 화합물의 1 nmol /kg의 피하 투여 후의 약동학 파라미터
화합물 AUC/D
pM*분/( pmol /kg) 		T max a
(분) 		C max /D
pM/(nmol/kg) 		MRT
(분) 		T ½ b
(분)
WO 2009/022013
Ex. 45
0 Zn/6합체
(n=4)
1 nmol/kg		 평균
SD		 422
51		 45
17		 736
344		 1287
86		 987
36
a Tmax 중앙값±SD로 주어짐
b T½ 조화평균±슈도 SD로 주어짐
아연 없는 제형에서 종래 기술, WO 2009/022013, 실시예 45의 인슐린 유도체는 아마도 피하 저장소의 부분의 지연된 흡수에서 비롯되는, 오래 끈 테일링과 연관되어 있다고 결론지어진다. 24시간(1440분) 시점에서 이 인슐린의 혈장 농도는 98 pM이다. 또한, 혈당 저하 효과는 연장되어 적어도 8시간(480분) 동안 지속된다. 평균 체류 시간은 1287분으로서 거의 1일이었다. 이것은 종래 기술의 이 인슐린을 식전 사용에 부적절하게 만든다.
실시예 40; LYD 돼지에서 종래 기술의 인슐린 유도체의 유사 유도체의 피하 PK/PD 프로파일
위의 일반 과정을 따라, 다음의 PK 및 PD 프로파일을, WO 2009/022013에 기술된 바와 같은 종래 기술의 대표적인 A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 사람 인슐린 (구체적으로 실시예 45 (A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 사람 인슐린 참조)의 C14 이산 유사체에 대해 얻었다.
사용된 제형
A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 사람 인슐린 (WO 2009/022013, 실시예 45의 1,16-헥사데칸디오일 (C16 이산) 유사체의 1,14-테트라데칸디오일 (C14 이산) 유사체), 588 μM; 1.6% (w/vol) 글리세롤; 30 mM 페놀; 7 mM tris, pH=7.4 (0 Zn/6합체)
이들 측정의 결과를 첨부된 도 9 및 이하에, 표 16에 제공한다.
도 12 및 13은 0 아연/6개 인슐린 분자(1 nmol/kg)로 조제된 종래 기술의 대표적인 인슐린 유도체, 즉, A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 사람 인슐린(WO 2009/022013, 실시예 45)의 C14 이산 유사체의 PK(pharmacokinetic) 프로파일(인슐린 농도 대 시간)을 나타내며, 혈장 글루코스에서 결과된 변화를 각각 나타낸다(72 nmol/동물).
WO 2009/0022013, 실시예 45의 종래 기술 화합물의 C16 이산 유사체의 C14 이산 유사체의 1 nmol /kg의 피하 투여 후의 약동학 파라미터(72 nmol /동물)
동물 번호 용량
pmol/kg 		T max
분 		C max /D
pM/(nmol/kg) 		AUC/D
pM*분/( pmol /kg) 		% extrap
% 		T ½
분 		MRT
분
10107 713 50 450 128 6 182 310
10109 1714 20 241 40 9 148 226
10110 720 10 513 104 7 153 261
10111 706 50 363 81 8 158 255
10112 1735 20 344 41 10 219 305
N 5 5 5 5 5 5
평균 382 79 8 271
SD 19 104 39 1 35
중앙값 20
조화평균 168
슈도 SD 25
결론
아연 없는 제형에서 종래 기술, WO 2009/022013, 실시예 45의 인슐린 유도체의 C14 이산 변형물은 아마도 피하 저장소의 부분의 지연된 흡수에서 비롯되는, 오래 끈 테일링과 연관되어 있다고 결론지어진다. 10시간(600분) 시점에서 이 인슐린의 혈장 농도는 24 pM이다. 종래 기술의 C14 이산 유사체의 평균 체류 시간(MRT)은 271분인 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 실시예 1 및 2의 C14 이산 유사체로 얻은 대응하는 결과는 각각 165분 및 111분이었다. 또한, 혈당 저하 효과는 연장되어 적어도 11시간(660분) 동안 지속된다.
이것은 종래 기술의 이 인슐린을 식전 사용에 부적절하게 만든다.
실시예 41; 비만인 Zucker 래트에서 실시예 2의 인슐린 유도체의 피하 PK/PD 프로파일, 제형에 170 mM 니코틴아미드 를 가진 것과 없는 것의 프로파일들의 비교
위의 일반 과정을 따라, 다음의 PK 및 PD 프로파일을 실시예 2의 인슐린 유도체에 대해 얻었다.
사용된 제형
실시예 2의 인슐린 유도체, pH=7.43; 621 μM; 1.8% (w/vol) 글리세롤; 16 mM 페놀; 16 mM m-크레졸, 10 mM 염화나트륨 (0 Zn/6합체), 170 mM 니코틴아미드를 가진 것과 없는 것.
래트들에 투여용량은 40 nmol/kg이었다.
이들 측정의 결과를 첨부된 도 15에 제공한다.
Zucker 래트들에 피하 투여된, 실시예 2의 인슐린의 무아연 제형에 170 mM 니코틴아미드의 포함은 더욱더 초속효성이며, 더 초기의 Tmax를 갖는 PK 프로파일을 가져온다고 결론지어진다. 따라서 본 발명의 실시예 2의 인슐린 제형에 니코틴아미드의 포함은 식전 사용에 더욱더 적합한 인슐린 제형을 가져온다는 것을 보여준다.
실시예 42; 비만인 Zucker 래트에서 실시예 7의 인슐린 유도체의 피하 PK/PD 프로파일, 제형에 170 mM 니코틴아미드를 가진 것과 없는 것의 프로파일들의 비교
위의 일반 과정을 따라, 다음의 PK 및 PD 프로파일을 실시예 7의 인슐린 유도체에 대해 얻었다.
사용된 제형 :
실시예 7의 인슐린 유도체, pH=7.39; 604 μM; 1.6% (w/vol) 글리세롤; 16 mM 페놀; 16 mM m-크레졸, 7 mM 인산나트륨, 10 mM 염화나트륨 (0 Zn/6합체), 170 mM 니코틴아미드.
실시예 7의 인슐린 유도체, pH=7.39; 599 μM; 1.6% (w/vol) 글리세롤; 16 mM 페놀; 16 mM m-크레졸; 7 mM 인산나트륨; 10 mM 염화나트륨 (0 Zn/6합체).
래트들에 투여용량은 40 nmol/kg이었다.
이들 측정의 결과를 첨부된 도 16-17에 제공한다.
Zucker 래트들에 피하 투여된, 실시예 7의 인슐린의 무아연 제형에 170 mM 니코틴아미드의 포함은 더욱더 초속효성이며, 더 초기의 Tmax를 갖는 PK 프로파일을 가져온다고 결론지어진다. 따라서 본 발명의 실시예 7의 인슐린 제형에 니코틴아미드의 포함은 식전 사용에 더욱더 적합한 인슐린 제형을 가져온다는 것을 보여준다.
실시예 43; 비만인 Zucker 래트에서 실시예 16의 인슐린 유도체의 피하 PK/PD 프로파일, 제형에 170 mM 니코틴아미드를 가진 것과 없는 것의 프로파일들의 비교
위의 일반 과정을 따라, 다음의 PK 및 PD 프로파일을 실시예 16의 인슐린 유도체에 대해 얻었다.
실시예 16의 인슐린 유도체, pH=7.44; 599 μM; 1.6% (w/vol) 글리세롤; 16 mM 페놀; 16 mM m-크레졸; 7 mM 인산나트륨; 10 mM 염화나트륨 (0 Zn/6합체); 170 mM 니코틴아미드.
실시예 16의 인슐린 유도체, pH=7.40; 581 μM; 1.6% (w/vol) 글리세롤; 16 mM 페놀; 16 mM m-크레졸; 7 mM 인산나트륨; 10 mM 염화나트륨 (0 Zn/6합체).
래트들에 투여용량은 40 nmol/kg이었다.
이들 측정의 결과를 첨부된 도 18-19에 제공한다.
Zucker 래트들에 피하 투여된, 실시예 16의 인슐린의 무아연 제형에 170 mM 니코틴아미드의 포함은 더욱더 초속효성이며, 더 초기의 Tmax를 갖는 PK 프로파일을 가져온다고 결론지어진다. 따라서 본 발명의 실시예 16의 인슐린 제형에 니코틴아미드의 포함은 식전 사용에 더욱더 적합한 인슐린 제형을 가져온다는 것을 보여준다.
실시예 44; LYD 돼지에서 실시예 4의 인슐린 유도체의 피하 PK/PD 프로파일, 제형에 170 μM 니코틴아미드를 가진 것과 없는 것의 프로파일들의 비교
위의 일반 과정을 따라, 다음의 PK 및 PD 프로파일을 실시예 4의 인슐린 유도체에 대해 얻었다.
사용된 제형
실시예 4의 인슐린 유도체, pH=7.42; 0.604 mM 인슐린 유도체; 16 mM 페놀; 16 mM m-크레졸; 2 % (w/vol) 글리세롤; 7 mM 인산염 (0 Zn/6합체).
실시예 4의 인슐린 유도체, pH=7.43; 0.605 mM 인슐린 유도체; 170 mM 니코틴아미드; 16 mM 페놀; 16 mM m-크레졸; 0.6 % (w/vol) 글리세롤; 7 mM 인산염
돼지들에 투여용량은 1 nmol/kg이었다.
이들 측정의 결과를 첨부된 도 20에 제공한다.
돼지들에 피하 투여된, 실시예 4의 인슐린의 무아연 제형에 170 μM 니코틴아미드의 포함은 더욱더 초속효성이며, 더 초기의 Tmax를 갖는 PK 프로파일을 가져온다고 결론지어진다. 따라서 본 발명의 실시예 4의 인슐린 제형에 니코틴아미드의 포함은 식전 사용에 더욱더 적합한 인슐린 제형을 가져온다는 것을 보여준다.
실시예 45; LYD 돼지에서 실시예 2의 인슐린 유도체의 피하 PK/PD 프로파일, 제형에 170 μM 니코틴아미드를 가진 것과 없는 것의 프로파일들의 비교
위의 일반 과정을 따라, 다음의 PK 및 PD 프로파일을 실시예 2의 인슐린 유도체에 대해 얻었다.
사용된 제형
실시예 2의 인슐린 유도체, pH=7.4; 608 μM; 2% (w/vol) 글리세롤; 16 mM 페놀; 16 mM m-크레졸, 7 mM 인산나트륨 (0 Zn/6합체).
실시예 2의 인슐린 유도체, pH=7.4; 614 μM; 170 μM 니코틴아미드, 0.6% (w/vol) 글리세롤; 16 mM 페놀; 16 mM m-크레졸, 7 mM 인산나트륨 (0 Zn/6합체).
돼지들에 투여용량은 1 nmol/kg이었다.
이들 측정의 결과를 첨부된 도 21에 제공한다.
돼지들에 피하 투여된, 실시예 2의 인슐린의 무아연 제형에 170 μM 니코틴아미드의 포함은 더욱더 초속효성이며, 더 초기의 Tmax를 갖는 PK 프로파일을 가져온다고 결론지어진다. 따라서 본 발명의 실시예 2의 인슐린 제형에 니코틴아미드의 포함은 식전 사용에 더욱더 적합한 인슐린 제형을 가져온다는 것을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> NOVEL INSULIN DERIVATIVES AND THE MEDICAL USES HEREOF <130> 8702WO01 <140> PCT/EP2015/053989 <141> 2015-02-26 <150> EP 14157215.6 <151> 2014-02-28 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain of analogue of Human insulin of Examples 1-2, 4-21 and 24-26. <220> <221> CHAIN <222> (1)..(22) <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> ACETYLATION; (N(eps)-tetradecanedioyl-4xgGlu); (N(eps)-hexadecanedioyl-4xgGlu); (N(eps)-hexadecanedioyl-gGlu-2xOEG); (N(eps)-hexadecanedioyl-3x(gGlu-OEG)-gGlu); <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn Lys 20 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain of analogue of Human insulin of Examples 3, and 22-23. <220> <221> CHAIN <222> (1)..(22) <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> ACETYLATION; (N(eps)tetradecanedioyl-4xgGlu); (N(eps)-tetradecanedioyl-4xgGlu); (N(eps)-tetradecanedioyl-gGlu-2xOEG). <400> 2 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn Lys 20 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain of analogue of Human insulin of Examples 1, 3, 10-14, 17, and 20. <400> 3 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Pro Arg 20 25 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain of analogue of Human insulin of Examples 2, 4-6, 15, 19, and 21-26. <400> 4 Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Pro Arg 20 25 <210> 5 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain of analogue of Human insulin of Examples 7-9, 16 and 18. <400> 5 Phe Val Gln Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Pro Arg 20 25

Claims (15)

  1. 사람 인슐린의 아실화 유사체인 인슐린 유도체로서, 유사체가
    사람 인슐린에 대하여 [A22K, desB27, B29R, desB30]이고;
    이 인슐린 유사체는 Formula II
    [Acyl]-[Linker]-
    의 기로 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기의 아실화에 의해 유도체화되며,
    여기서 Linker 기는 -gGlu- 및 -OEG-로부터 선택된 1 내지 10개 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 사슬이고; 여기서
    gGlu는 감마 글루탐산 잔기를 나타내며;
    OEG는 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산의 잔기 (즉, 식 -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-의 기)를 나타내고;
    아미노산 잔기는 어떤 순서로도 존재할 수 있으며;
    아미노산 사슬은 적어도 하나의 gGlu 잔기를 포함하고; 그리고
    여기서 Acyl 기는 1,14-테트라데칸디오산; 1,15-펜타데칸디오산; 및 1,16-헥사데칸디오산으로부터 선택된 α,ω-디-카르복실산의 잔기이고;
    아실화 유사체는 추가로 A14E, 및/또는 B3E 또는 B3Q 치환들을 포함할 수도 있는, 인슐린 유도체.
  2. 제1항에 있어서, 유사체는 사람 인슐린에 대하여 [A14E, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30]; 또는 [A22K, desB27, B29R, desB30]이고; 그리고 이 인슐린 유사체는 A22 위치에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서 아실화되어 있는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Linker 기는 -gGlu-; -2xgGlu-; -3xgGlu-; -4xgGlu-; -gGlu-2xOEG-; -gGlu-3x(OEG-gGlu)-; -4xgGlu-2xOEG-; -2xOEG-; 및 -2xOEG-gGlu-로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Acyl 기는 1,14-테트라데칸디오산; 1,15-펜타데칸디오산; 또는 1,16-헥사데칸디오산으로부터 유도된 이산(diacid) 기인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Formula II (즉, [Acyl]-[Linker]-)의 기는 테트라데칸디오일-gGlu-; 테트라데칸디오일-2xgGlu-; 테트라데칸디오일-3xgGlu-; 테트라데칸디오일-4xgGlu-; 테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG-; 테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG-; 테트라데칸디오일-2xOEG-; 펜타데칸디오일-4xgGlu; 헥사데칸디오일-4xgGlu-; 헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG-; 또는 헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu-인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
  6. 제1항에 있어서,
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-2xgGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-2xOEG), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-펜타데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린; 또는
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유도체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 첨가된 아연 이온이 없이, 저아연 조성물로서 조제된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 첨가된 아연 이온이 없이 저아연 조성물로서 조제되고, 다음으로부터 선택된 사람 인슐린의 아실화 유사체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물:
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-펜타데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-헥사데칸디오일-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A14E, A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린;
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린; 및
    A22K(N(eps)-테트라데칸디오일-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 사람 인슐린.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 6개의 인슐린 분자 당 0.2개 미만의 Zn2 + 이온을 포함하는, 저아연 조성물로서 조제된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 첨가하지 않은 것을 특징으로 하는 저아연 약학적 조성물.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 니코틴 화합물, 및 구체적으로 니코틴아미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 저아연 약학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
  14. 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 이상지질혈증, 비만, 대사증후군(대사증후군 X, 인슐린 저항성 증후군), 고혈압, 인지 장애, 죽상동맥경화증, 심근경색증, 뇌졸중, 심혈관질환, 관상 동맥 질환, 염증성 장 증후군, 소화불량, 또는 위궤양의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유도체의 사용으로서, 방법은 본 발명의 인슐린 유도체의 치료학적 유효량을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 사용.
  15. 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 이상지질혈증, 비만, 대사증후군(대사증후군 X, 인슐린 저항성 증후군), 고혈압, 인지 장애, 죽상동맥경화증, 심근경색증, 뇌졸중, 심혈관질환, 관상 동맥 질환, 염증성 장 증후군, 소화불량, 또는 위궤양과 관련된 질환, 질병 또는 상태의 치료, 예방 또는 완화를 위한 방법으로서, 방법은 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유도체의 치료학적 유효량을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
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